CN100350972C - 含有铝佐剂和组氨酸的疫苗 - Google Patents

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Abstract

为了提高含铝盐疫苗的稳定性，本发明使用了氨基酸组氨酸。这可提高pH稳定性和佐剂吸附，并可减少抗原水解。组氨酸优选在吸附于铝盐的过程中存在。疫苗中的抗原可以是蛋白质或糖，优选得自脑膜炎奈瑟球菌。

Description

含有铝佐剂和组氨酸的疫苗
本文将文中所引用的所有文献纳入作为参考。
                          技术领域
本发明涉及疫苗制剂领域。
                          背景技术
除了含有抗原性物质外，疫苗还含有诸如稀释剂、赋形剂、防腐剂、稳定剂和缓冲剂之类的物质。通常，疫苗还含有佐剂，即一种能增强针对疫苗抗原的免疫应答反应的物质。
传统上用于人疫苗的佐剂为铝盐，如氢氧化铝和磷酸铝。还已知许多其它实验性佐剂，这些佐剂在如参考文献1中有评述。但是，吸附于铝盐仍然是最常用的疫苗佐剂剂型。
虽然铝盐已被广泛使用，但是它们并不总是与各种具体抗原相容。例如，已有人提出，氢氧化铝可能并不适合用于多价疫苗，包括乙型肝炎表面抗原[2]，或者不适合用于从流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)得到的荚膜多糖[3]。还有人提出，出于相容性考虑，应将同一疫苗制剂内的不同抗原吸附于不同的铝盐[4]。
除了抗原相容性外，还需要考虑使用铝盐时的疫苗稳定性。例如，已显示其蛋白质吸附能力在室温下随着时间而下降[5]，在高压灭菌时也如此[6]。铝盐还可能导致难以冻干。此外，已发现氢氧化铝甚至在低温时以及抗原偶联于载体蛋白时可水解多糖抗原[8]，从而导致疫苗效力下降。
通常，当人们将注意力转移到配制临床用的抗原时才会产生上述问题，在初始研究以及抗原本身开发期间，人们可能并不会对佐剂予以考虑。
本发明的一个目的是提高含有铝盐的疫苗的稳定性。具体而言，提高在各种温度条件下的pH稳定性(缓冲作用)和佐剂吸附作用，和/或提高抗原稳定性(如减少水解)。
                        发明公开的内容
本发明以氨基酸——组氨酸能提高含有铝盐佐剂的疫苗的稳定性的惊人发现为基础。这已见于糖抗原和蛋白质抗原。
因此，本发明提供一种组合物，该组合物含有抗原、铝盐和组氨酸。本发明还提供一种生产所述组合物的方法，该方法包括将抗原、铝盐和组氨酸混合的步骤。
抗原
抗原优选是蛋白质抗原或糖抗原(任选地偶联)。优选的抗原得自细菌，其中奈瑟氏球菌属(Neisseria)的细菌(如脑膜炎奈瑟球菌，N.meningitidis)特别优选。
·脑膜炎奈瑟球菌B血清群蛋白质抗原，如在参考文献9-15中所给出的抗原，其中，蛋白质′287′(见下文)及其衍生物(如ΔG287)特别优选；
·脑膜炎奈瑟球菌B血清群外膜囊(OMV)制品，如参考文献16-19等所公开的哪些制品；
·脑膜炎奈瑟球菌A、C、W135和/或Y血清群糖抗原，如参考文献20中公开的C血清群寡糖(还可参见参考文献21)；
·肺炎球菌(Streptococcus pneumococcus)糖抗原(参见参考文献22-24)；
·百日咳杆菌(Bordetella pertussis)抗原，如百日咳杆菌百日咳全毒素(PT)和丝状血凝集素(FHA)，任选地可与pertactin和/或凝集原2和凝集原3组合(如参考文献25和26)；
·白喉抗原，如白喉类毒素(如参考文献27的第3章)，如CRM197突变体)(如参考文献28)；
·破伤风抗原，如破伤风类毒素(如参考文献27的第4章)；
·幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)蛋白质抗原，如CagA(如参考文献29)、VacA(如参考文献29)、NAP(如参考文献30)、HopX(如参考文献31)、HopY(如参考文献31)和/或脲酶；
·流感嗜血杆菌糖抗原，优选寡糖；
·淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)抗原(如参考文献9-11)；
·肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原(如参考文献32-38)；
·砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原(如参考文献39)；
·牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原(如参考文献40)；
·粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)抗原(如参考文献41)；
·无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，链球菌B组)抗原(如参考文献42和43)；
·酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes，链球菌A组)抗原(如参考文献43-45)；
·金黄色葡萄球菌(Staphylococcis aureus)抗原(如参考文献46)；
·炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)抗原(如参考文献47-49)。
用于本发明的特殊的病毒抗原包括：
·甲型肝炎病毒抗原，如灭活的病毒(如参考文献50和51)；
·乙型肝炎病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原(如参考文献51和52)；
·丙型肝炎病毒抗原(如参考文献53)；
·脊髓灰质炎病毒抗原(polio antigen)(如参考文献54和55)，如IPV；
·狂犬病抗原(如参考文献56)，如冻干的灭活病毒(如参考文献57，RabAvertTM)；
·麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原(如参考文献27的第9-11章)；
·流感抗原(如参考文献27的第19章)，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白；
·黄病毒家族(黄病毒属)的病毒抗原，如从黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒的4种血清型、蜱传脑炎病毒、西尼罗河脑炎病毒得到的抗原；
·鼠疫病毒(pestivirus)抗原，如从传统的猪热病毒(porcine fever virus)、牛病毒性腹泻病毒和/或边界疾病病毒(border disease virus)获得的抗原；
·细小病毒抗原，如细小病毒B19的抗原。
该组合物可含有一种或多种这些细菌抗原和病毒抗原。该组合物可不含有病毒抗原。
可使用的其它抗原包括：
·朊病毒蛋白(如CJD朊病毒蛋白)；
·淀粉样蛋白，如β肽(参考文献58)；
·癌症抗原，如参考文献59的表1和参考文献60的表3和表4所列出的那些抗原。
当使用糖或碳水化合物抗原时，较佳将它们偶联于载体蛋白，以增强免疫原性(如参考文献61和70)。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。特别优选的是CRM197白喉类毒素。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(如参考文献71)、合成肽(如参考文献72和73)、热激蛋白(如参考文献74)、百日咳蛋白(如参考文献75和76)、从流感嗜血杆菌获得的蛋白D(如参考文献77)、从C.difficile获得的毒素A或毒素B(如参考文献78)，等等。当混合物含有从A和C血清群获得的荚膜糖时，较佳的是，MenA糖：MenC糖的比例大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。可将脑膜炎奈瑟球菌不同血清群获得的糖偶联于相同或不同的载体蛋白。
可采用任何合适的偶联反应，需要时可使用任何合适的接头。
需要时，可将毒性的蛋白质抗原脱毒(如采用化学和/或遗传方法将百日咳毒素脱毒，参见参考文献26)。
人乳头状瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)不是优选的抗原(参见WO00/45841、WO00/57906、WO01/28585)。
当该组合物中含有白喉抗原时，较佳的是，该组合物还含有破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当组合物中含有破伤风抗原时，组合物中较佳还含有白喉抗原和百日咳抗原。类似地，当组合物中含有百日咳抗原时，组合物较佳还含有白喉抗原和破伤风抗原。可使用百日咳全细胞抗原。
较佳是将抗原吸附于铝盐。
当存在HBsAg时，较佳的是，该抗原吸附于羟基磷酸铝，或者不吸附于任何盐。最好是避免将HBsAg吸附于氢氧化铝。
当存在流感嗜血杆菌糖抗原时，较佳的是，该抗原吸附于羟基磷酸铝，或者不吸附于任何盐。最好避免Hib糖吸附于氢氧化铝。
该组合物中的抗原各自通常以至少1μg/ml的浓度存在。通常，任何给定抗原的浓度应足以引起针对该抗原的免疫应答反应。
作为本发明组合物中所用蛋白质抗原的另一选择，也可使用编码该抗原的核酸(如参考文献79-87)。因而，本发明组合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸替换(较佳是DNA，如质粒形式)。
铝盐
铝盐较佳是氢氧化铝(如羟基氧化铝)或磷酸铝(如羟基磷酸铝或正磷酸铝)，但可使用任何其它合适的盐(如硫酸盐等，例如参见参考文献1的第8和第9章)。盐可以是任何适当的形式(如凝胶、晶体、无定形等)。优选的盐是(无定形的)羟基磷酸盐和(晶体)羟基氧化物(勃姆石)。
可通过沉淀获得羟基磷酸盐，沉淀反应过程中的反应条件和反应物浓度会影响盐当中磷酸盐被羟基取代的程度。羟基磷酸盐通常的PO4/Al摩尔比为0.3-0.99，较佳的盐的摩尔比为0.8-0.95(如0.88±0.05)。由于羟基的存在，可将羟基磷酸盐〔Al(OH)x(PO4)y，其中各阴离子化合价和乘以其摩尔分数是-3〕与AlPO4区别开来。例如，在3146cm-1的IR光谱带(如当加热到200℃时)表明结构性羟基的存在。
可采用IR光谱学将羟基氧化铝〔AlO(OH)〕与Al(OH)3区别开来，具体是村在1070cm-1的吸收带和3090-3100cm-1的强肩峰。
还可使用不同铝盐的混合物。但是，较佳的是，基本上使用单一的盐，如，当使用两种盐时，一种盐对另一种盐的重量比至少为5∶1，如至少为10∶1、100∶1、1000∶1等。
铝盐通常以Al3+的浓度至少为1μg/ml(如至少为10μg/ml、至少为100μg/ml等)的量存在。
使用组氨酸与磷酸铝(尤其是羟基磷酸盐)的组合对于酸性抗原特别有利。
组氨酸
组氨酸是一种标准的氨基酸，易于获得并用于本发明。由于它具有固有的生物相容性，因此是安全的、因而可有利地作为疫苗的一种组分。
所述组合物中组氨酸浓度通常至少为1μm，最多为1M。浓度较佳至少为1mM(如至少为2mM、3mM、4mM、5mM等)，较佳最多为250mM(如最多为200mM、150mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM等)。更佳的是，组合物中组氨酸的浓度为2-10mM(如5-8mM)。最佳浓度约为5mM。
组氨酸较佳是L-组氨酸。
组氨酸较佳作为缓冲剂。组氨酸缓冲剂是本领域熟练技术人员熟知的。因此，组氨酸可在本发明组合物中离子化。
当与组氨酸缓冲系统被替换成磷酸钠缓冲系统或者不含有缓冲系统的相当的组合物比较时，该组合物较佳的是能提高pH稳定性和/或减少抗原水解。减少抗原水解可能是pH稳定性提高的结果。
可以氨基酸本身形式或者以盐形式将组氨酸加到所述组合物中。典型的组氨酸盐是一盐水一水合物。
可以理解，关于本发明组合物中的组氨酸的描述指“游离”的组氨酸，而不是可能是该组合物中的多肽(如抗原)的一部分的任何组氨酸残基。
组合物的进一步特征
所述组合物较佳为液体形式，但可冻干(参见WO01/41800)。
所述组合物还可含有钠盐，如磷酸钠或氯化钠。钠盐的浓度较佳至少为1mM(如至少为2mM、3mM、4mM、5mM等)，较佳最多为10mM(如最多为10mM、9mM、8mM、7mM等)。更佳的是，组合物中钠盐的浓度为1-5mM(如2-3mM)。最佳的是，其浓度约为2.5mM。
本发明一个特别的优点是，该组合物使得能在含有高浓度游离磷酸盐离子的疫苗中良好控制pH和吸附，所述磷酸盐离子在该疫苗中可能是不可避免的，例如由于与佐剂中的磷酸盐交换，或者由于残留的磷酸缓冲液而致。例如，当残留磷酸盐离子的量为3-5mM时，将难以将pH控制在6.0-7.0，并且一些抗原倾向于与佐剂脱吸附。但是，加入5-10mM的组氨酸，可控制pH和吸附，包括在高温下保存过程中。
组氨酸与游离磷酸盐的摩尔比较佳至少为1.25∶1，如1.75∶1、2∶1、2.25∶1、2.5∶1、3∶1、4∶1等。
所述组合物的pH较佳为6-7(如6.3-7.0)。可使用缓冲液维持此pH。通常，可通过该组合物中组氨酸的固有作用维持该pH。
通常，该组合物不含有：血清(如胎牛血清等)或用于细胞培养的其它这类组分；宿主细胞DNA(其水平大于从细胞培养物中纯化得到的抗原的100pg/剂)；活细胞。
所述组合物通常是无菌的和/或是无致热原。
所述组合物可含有去污剂(如Tween，如Tween 80)，以将抗原吸附于容器的可能性减到最小。
所述组合物较佳不含有防腐剂。当存在防腐剂时，可使用汞防腐剂(如乙基汞硫代水杨酸钠)(参见WO98/34594)。可有或可无的防腐剂是2-苯氧基-乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苄醇(或它们的混合物)。
免疫原性组合物和药剂
本发明的组合物通常是一种疫苗组合物。
本发明还使用本发明的组合物作为药剂。此药剂较佳能提高哺乳动物中针对其抗原的免疫应答反应(即，它是一种免疫原性组合物)，且该药剂更佳是一种疫苗。
本发明还提供本发明组合物在制备用于提高哺乳动物中针对该抗原的免疫应答反应的药剂中的用途。该药剂较佳是疫苗。
本发明还提供一种提高哺乳动物免疫应答反应的方法，该方法包括给予有效量的本发明组合物的步骤。所述免疫应答反应较佳是保护性的。所述方法可引起增强的应答。
所述哺乳动物较佳是人，更佳是儿童。
这些用途和方法较佳用于预防和/或治疗奈瑟球菌(如脑膜炎、败血症、淋病等)、流感嗜血杆菌(如中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂蜗织炎、心包炎、脑膜炎等)或者肺炎球菌(如脑膜炎、脓毒症、肺炎等)引起的疾病。因而，细菌性脑膜炎的预防和/或治疗是优选的。
本发明的疫苗可以是预防性(即，预防感染)或治疗性(即，治疗感染后的疾病)疫苗，但通常是预防性疫苗。
组合物的其它组分
通常，除了上述组分外，本发明的组合物还含有一种或多种“药学上可接受的载体”，包括自身不诱导产生有害于接受该组合物个体的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖(WO00/56365)和脂质聚集物(如油滴或脂质体)。这些载体是本领域普通技术人员熟知的。该疫苗还可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于药学上可接受的赋形剂的完整讨论可在Remington′s Pharmaceutical Science中获得(如参考文献88)。
用作疫苗的免疫原性组合物含有免疫有效量的抗原，如果需要的话还可含有上述任何其它组分。“免疫有效量”指所给予个体的量，不论是单剂量还是一系列给药中的一部分，对治疗或预防都是有效的。这个有效量的不同取决于：待治疗个体的健康和身体状况、年龄、根据分类学待治疗个体所属的类别(如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的剂型、治疗医师对个体医学状态(medical situation)的评估以及其它相关因素。预期此有效量范围相当宽，可采用常规试验确定。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如，包括强化剂量)。该疫苗可与其它免疫调节剂一同给予。
该疫苗可与其它免疫调节剂一同给予。
除铝盐外，疫苗可包括佐剂。用于增强所述组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)水包油型乳剂(有或没有其它特异性免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如，(a)MF59TM(WO 90/14837；参考文献1的第10章)，含有5％鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(任选地含有MTP-PE)，用微量流化器制成亚微米级颗粒；(b)SAF，含有10％鲨烯、0.4％Tween 80、5％普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP，微量流化成亚微米级乳剂或涡流振荡产生粒径较大的乳剂，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含有2％鲨烯、0.2％Tween 80以及含有单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(2)皂素佐剂，例如可采用StimulonTM(CambridgeBioscience，Worcester，MA)或从其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激性复合物)，这种ISCOM可不加去污剂，见WO00/07621；(3)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636)等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3dMPL)，如GB-2220221、EP-A-0689454；(6)3dMPL与如QS21和/或水包油型乳剂的组合，如EP-A-0805318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含有CpG基序的寡核苷酸〔Krieg，Vaccine，2000，19，618-622；Krieg，Curr opin Mol Ther，2001，3：15-24；Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner等，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Inmunol.，1998，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224；Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等，J.Immunol.，1996，157，1840-1845；Cowdery等，J.Immunol.，1996，156，4570-4575；Halpern等，Cell.Immunol.，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol.，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol.，1996，157，4918-4925；Yi等，J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol.，1998，160，4755-4761；和Yi等，J.Immunol.，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581〕，含有至少一个CG二核苷酸，任选地在胞嘧啶的位置上有5-甲基胞嘧啶；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，如WO99/52549；(9)聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂与八氧基醇(octoxynol，WO01/21207)的组合或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它的非离子型表面活性剂如八氧基醇的组合(如WO01/21152)；(10)免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)和皂苷，如WO00/62800；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，如WO00/23105；(12)皂苷和水包油型乳剂，如WO99/11241；(13)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地加固醇)，如WO98/57659；(14)壳聚糖；(15)霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定性毒素，或它们的脱毒突变体(参考文献89)；(16)聚(α-羟基)酸微粒，如PLG；(17)起到免疫刺激剂作用以提高所述组合物效力的其它物质。
胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
一旦配制后，可将本发明的组合物直接给予。待治疗的对象可以是动物；具体而言，可以治疗人。该疫苗特别可用于接种儿童和青少年。
通常，将免疫原性组合物制备成可注射的液态溶液形式或悬浮液形式，也可以将其制备成在注射前可用液体载体配制成溶液、悬浮液的固体形式。可乳化或包裹在脂质体中，以提高佐剂效果。该组合物的直接输送通常通过非肠胃给药(如皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射，或者输送到组织的空隙空间)。还可将该组合物给予病损处。其它给药方式包括口服给药和肺部给药、栓剂以及透皮或经皮给药(如可参见WO98/20734)、针以及无针注射给药。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括强化剂量)。
混合抗原、铝盐和组氨酸的步骤
为了制备本发明的组合物，必须混合抗原、铝盐和组氨酸。较佳的是，当混合抗原和铝盐时，组氨酸应存在。因此，在吸附于铝盐时存在组氨酸。这与将组氨酸加到已存在的抗原/铝盐组合中是不同的，即，本方法中的组氨酸不是简单地在抗原和铝盐相互作用后作为缓冲剂加入，而是在它们相互作用时存在。
因此，在本发明的方法中，较佳将抗原与组氨酸/铝盐混合物混合。因此，本发明的方法可包括以下步骤：(a)制备铝盐和组氨酸的混合物；(b)将抗原与所述混合物混合。(a)所述的混合物较佳是水溶液，可在水溶性条件下制备，也可以是干的混合物，在使用前可再水合。
一旦一种或多种抗原在组氨酸存在下吸附于铝盐，可将该混合物与其它抗原混合，如与已存在的白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎或乙型肝炎病毒组合物混合。
定义
术语“含有”指“包括”以及“由......组成”，如一种“含有”X的组合物可基本上由X组成，或者可包括其它物质，如X+Y。
与数值x相关的术语“约”指如x±10％。
                    附图的简要说明
图1显示抗原性组合物离心后的SDS-PAGE分析。泳道1包括MW标记物(220，97，66，46，30，21，14kDa)。在泳道2使用OMV抗原(2μg)；ΔG287抗原在第3泳道(10μg)和第4泳道(0.5μg)。第5和第6泳道的抗原是OMV(50μg/ml)和ΔG287(100μg/ml)与1mg/ml羟基氧化铝的组合；泳道5的组合物包括10mM的磷酸钠(PBS)，而泳道6的组合物包括5mM组氨酸的盐水溶液。
图2也是抗原性组合物离心后的SDS-PAGE分析。泳道1包括与图1相同的MW标记物。泳道2是OMV抗原(2.5μg)；ΔG287在泳道3(2μg)和泳道4(0.5μg)。泳道5、6和7中的抗原是OMV(50μg/ml)和ΔG287(100μg/ml)与1mg/ml羟基氧化铝组合的盐水溶液(pH6.5)。泳道5的组合物包含2.5mM磷酸钠。泳道6的组合物包括5mM组氨酸。泳道7的组合物包含10mM的组氨酸。
图3也显示抗原性组合物离心后的SDS-PAHE分析。泳道1包括与图1相同的MW标记物。泳道2是OMV抗原(2μg)；ΔG287抗原在泳道3(2μg)和泳道4(0.5μg)。泳道5和泳道6中的抗原是OMV(50μg/ml)和ΔG287(100μg/ml)与3.3mg/ml羟基氧化物的盐水溶液(pH6.5)的组合。泳道5的组合物含有2.5mM的磷酸钠(PBS)，而泳道6的组合物含有5mM的组氨酸的盐水溶液。
图4显示疫苗制剂在4℃时的pH稳定性。实心符号代表用5mM组氨酸缓冲的疫苗，空心符号代表用2.5mM磷酸钠缓冲的疫苗。最初的pH是6.0(菱形)、6.5(方形)或7.0(三角形)。
图5也显示与图4相同的内容，但温度为37℃。
图6显示各种抗原的SDS-PAGE凝胶。泳道1含有MW标记物。泳道2-6含有标记物：(2)ΔG287-953；(3)961c；(4)936-741；(5)新西兰(New Zealand)OMV；和(6)挪威(Norwegian)OMV。泳道7到10显示在2-8℃保存1个月后离心得到的本发明组氨酸制剂的上清液：(7)ΔG287-953；(8)961c+936-741+ΔG287-953；(9)961c+936-741+ΔG287-953+OMV新西兰；(10)961c+936-741+ΔG287-953+OMV挪威。
图9显示与图8相同的内容，但泳道6-9是在36-38℃保存。
图10显示新西兰OMV的SDS-PAGE凝胶。泳道1含有MW标记物。泳道2、3、6和7含有保存在2-8℃的OMV标记物(泳道2和3)或者保存在36-38℃的OMV标记物(泳道6和7)，其量为2μg(泳道2和6)或1μg(泳道3和7)。泳道4、5、8和9显示保持在2-8℃(泳道4和5)或36-38℃(泳道8和9)30天后本发明组氨酸制剂中的OMV。泳道4和8显示离心后OMV的上清液，而泳道5和9显示沉积物。
                   实施本发明的方式
实施例1——脑膜炎球菌的B′287′抗原的pH稳定性和吸附
参考文献11公开了从脑膜炎奈瑟球菌B血清群获得的命名为′287′的蛋白质。参考文献90公开了这种抗原的一种截短形式(“ΔG287”)，此抗原被截短除去N末端的氨基酸一直到六甘氨酸区域(包括此区域)。287和ΔG287都能在小鼠中诱导保护性免疫应答。参考文献16-19公开了从脑膜炎奈瑟球菌B血清群获得的OMV抗原。这些OMV也能引起小鼠中的保护性免疫应答。
通过将这两类抗原吸附于羟基氧化铝佐剂而配制。测试了两种佐剂浓度，分别为1mg/ml和3.3mg/ml。
小鼠免疫接种研究显示，此疫苗免疫原性与抗原吸附于佐剂的水平相关。为了评估吸附水平，以1300rpm离心最终制剂的样品10分钟，用SDS-PAGE分析上清液，检测未吸附抗原的存在。加载适当浓度的相关蛋白质标准品，以作定量比较。
为了用磷酸钠缓冲液维持稳定的生理pH于4℃和37℃4周，发现此组合物需要10mM的磷酸钠。但是，在此水平，ΔG287的吸附仅为50％(图1，泳道5)。2.5mM的磷酸钠可维持100％的吸附(图2和3的泳道5)，但此组合物的pH不论在4℃还是在37℃都不稳定。
因此，需要找到能维持pH稳定而不减少吸附的其它缓冲系统。
使用5mM组氨酸(图1-3的泳道6)以及10mM组氨酸(图2，泳道7)可获得95-100％的吸附。因此，对于吸附而言，5mM或10mM的组氨酸等价于1mg/ml(图1和2)或3.3mg/ml羟基氧化铝存在下的2.5mM的磷酸钠。
为了明确使该疫苗组合物稳定的pH范围，选择了3种起始pH值(pH 6.0、6.5和7.0)，在2.5mM的磷酸钠或5mM的组氨酸存在下，监测4周时间内的pH稳定性。稳定性的监测在4℃和37℃下进行。
所有疫苗中的抗原都是ΔG287(100μg/ml)和OMV(50μg/ml)组合配以3.3mg/ml羟基氧化铝佐剂。
图4显示4℃的pH稳定性，图5显示37℃的pH稳定性〔NB由于细菌污染的缘故，未能测定4周内pH6.0组氨酸缓冲的疫苗〕。
在两种温度下，在2.5mM磷酸钠缓冲液中，pH倾向于随着时间而升高，但在5mM的组氨酸缓冲液中pH稳定。
因此，与磷酸钠缓冲液相比，组氨酸的使用赋予了随着时间稳定的pH而不减少吸附。
实施例2——脑膜炎球菌C糖抗原的吸附
当溶液(“液体”疫苗)中存在糖偶联物时，该偶联物倾向于水解而降解(参考文献7和8)。可通过冻干偶联物而避免这种降解(参考文献7)，但是这需要在再重建时加入佐剂。因此，较佳是能具有液体形式的疫苗，在此疫苗中，糖类不会发生水解性降解。
于是研究了偶联于CRM197载体蛋白(参考文献20)上的脑膜炎球菌C血清群寡糖。CRM197是酸性的，因此不能完全吸附于带负电荷的磷酸铝。但是，组氨酸带正电荷，认为这可能掩盖负电荷。因此，为提高MenC-CRM197吸附于羟基磷酸铝而测试了组氨酸缓冲液。
在存在和缺乏组氨酸缓冲液的条件下，在将离心分离佐剂沉淀物后，用BCA蛋白试验测定疫苗上清液中的蛋白质浓度，从而评估抗原吸附。将疫苗配制成20mg/ml的寡糖和45μg/ml的CRM197蛋白质。结果如下：
  抗原   佐剂   组氨酸(mM)   蛋白质(μg/ml)
  MenC-CRM 197 羟基磷酸盐Al3+＝0.6mg/ml   0   42.4
  5   28.6
  10   21.7
当组氨酸存在于制剂中时，抗原吸附因此增加：无组氨酸时，吸附约为6％，5mM组氨酸提高吸附到36％，10mM组氨酸提高吸附到几乎52％。
因此，组氨酸是一种有用的提高抗原吸附到羟基磷酸盐的添加剂。
实施例3——脑膜炎球菌B NadA抗原的吸附
在参考文献11中，从脑膜炎奈瑟球菌B血清群获得的NadA(奈瑟氏粘附素A)被公开为蛋白质′961′(SEQ ID 2943和2944)，而在参考文献13中为“NMB1994”(还可参见GenBank登记号11352904和7227256)。NadA的等位形式在参考文献91中公开。NadA的优选形式缺乏C末端锚定区(“961c”)。
在10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)的存在下将961c(100μg/ml)吸附到羟基氧化铝上。在2-8℃或36-38℃保存4周后，抗原仍有100％的吸附(图8和9，泳道6)。在0时间时组合物的pH是6.44，保存4周后pH稍微升高到6.48(2-8℃)或6.47(36-38℃)。
实施例4——脑膜炎球菌B杂交抗原的吸附
参考文献92和93公开了脑膜炎球菌B抗原的杂交表达。一种这样的杂交物是“ΔG287挪威-953”，另一种是“936-741”。在10mM组氨酸缓冲液(pH6.3)的存在下将这两种杂交物(100μg/ml)分别吸附到羟基氧化铝上(3mg/ml)。2-8℃或36-38℃保存4周后，ΔG287挪威-953仍有100％的吸附(图6和7，泳道7)，pH稍微从6.44升高到6.52(2-8℃)或6.53(36-38℃)。963-741在36-38℃维持100％的吸附(图9，泳道7)，但在2-8℃的吸附为～99％(图8，泳道7)，其pH从6.33稍微升高到6.37(2-8℃)或6.38(36-38℃)。
实施例5——脑膜炎球菌OMV的吸附
如上所述，脑膜炎球菌B OMV疫苗是周知的。制备脑膜炎球菌B的挪威株或新西兰株(394/98)的OMV。在10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)存在下，将这两种OMV制品(50μg/ml)吸附到羟基氧化铝(3mg/ml)上。2-8℃或36-38℃保存4周后，两种OMV制品都保持了100％的吸附(图8和9，泳道8和9)。对于挪威株的OMV，4周后，在两种保存温度下pH都从6.39稍微升高到6.42。对于新西兰株OMV，pH从6.40稍微上升到6.42(2-8℃)或6.43(36-38℃)。
另外将新西兰株OMV与5mM组氨酸配制。以纯水开始，加入羟基氧化铝，接着加入组氨酸，搅拌10分钟。然后加入OMV，并混合15分钟。然后加入NaCl，继续混合10分钟。最终的组合物含有3.3mg/ml羟基氧化铝、7.5mMNaCl、5mM组氨酸、100μg/ml OMV，pH 6.42。
在2-8℃或36-38℃保存的过程中，pH和吸附的变化如下：
          pH         吸附百分比
  2-8℃   36-38℃   2-8℃   36-38℃
  0时间   6.42   6.42   100   100
  15天   6.36   6.37   100   100
  30天   6.35   6.34   100   100
图10中泳道4与5(2-8℃)的比较或者泳道8与9(36-38℃)的比较显示保存1个月后OMV仍保持吸附。
实施例6——脑膜炎球菌OMV和蛋白质抗原混合物的吸附
961c、ΔG287挪威-953和936-741各抗原以100μg/ml混合，在10mM组氨酸(pH6.3)存在下将混合物吸附到羟基氧化铝(3mg/ml)上。在另两种制剂中，包括脑膜炎球菌B挪威株或新西兰株的OMV。
在2-8℃或36-38℃保存4周后，所有3种混合物(图6和7，泳道8-10)都显示出100％的吸附，但是，936-741在所有3种混合物中在2-8℃的温度下吸附为～96％，在36-38℃下为～99％。3种混合物中各自的pH从0时间的6.53稍微升高到4周后的6.62(2-8℃)。在36-38℃，三种混合物的pH升高到6.71±0.02。
单种抗原将它们各自PBS的残留磷酸盐离子携带到混合物中。磷酸盐离子有时以3-5mM的量存在于组合的抗原混合物中。在这些高浓度残留磷酸盐缓冲液的存在下，很难使pH稳定在6.0-7.0之间，即使使用5mM的组氨酸。但是，当组氨酸增加到10mM时，pH值即稳定。此外，即使在2-8℃或36-38℃保存1个月后抗原仍保持吸附。
实施例7——脑膜炎球菌A糖抗原的吸附
参考文献94公开了脑膜炎球菌A血清群荚膜寡糖的CRM197偶联物。该偶联物不完全稳定，因此，将其制备成冻干形式，给药时需重建。制备冻干形式的偶联物，使其含有某些组分，在重建成单剂量后具有以下组成：
  组分   浓度
  CRM-MenA   20μg糖/ml
  磷酸钾缓冲液   5mM
  甘露醇   15mg/ml
此组合物没有佐剂，因此，制备一佐剂，用于其重建：
  组分   浓度
  羟基氧化铝   0.68mg Al3+/ml
  组氨酸缓冲液   10mM
  氯化钠   8mg/ml
  Tween 80   0.005％
  pH   7.2±0.05
*无定形羟基磷酸盐，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92
实施例8——脑膜炎球菌C、W135和Y糖抗原的吸附
参考文献94公开了脑膜炎球菌C、W135和Y血清群荚膜寡糖的CRM197偶联物。制备了吸附于羟基氧化铝佐剂(2mg/ml)或羟基磷酸铝佐剂(0.6mg/mlAl3+)的3种偶联物的三价混合物。两种三价混合物的组成如下：
 组分   浓度   浓度
 羟基氧化铝   0.68mg Al3+/ml   -
 羟基磷酸铝*   -   0.6mg Al3+/ml
  CRM-MenC   20μg糖/ml   20μg糖/ml
  CRM-MenY   20μg糖/ml   20μg糖/ml
  CRM-Men W135   20μg糖/ml   20μg糖/ml
  磷酸钠缓冲液   -   10mM
  组氨酸缓冲液   10mM   -
  氯化钠   9mg/ml   9mg/ml
  Tween 80   0.005％   0.005％
*无定形羟基磷酸盐，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92
对于羟基氧化物/组氨酸制剂，在批次混合物中或包装到小瓶中后糖类组分的稳定性如下：
时间(天)            在2-8℃保存             在36-38℃保存
  游离糖(μg/ml)   游离糖(％)   游离糖(μg/ml)   游离糖(％)
  MenC批次
  0   ＜1.2   ＜6   ＜1.2   ＜6
  15   ＜1.2   ＜6   ＜1.2   ＜6
  30   ＜1.2   ＜6   ＜1.2   ＜6
  MenC小瓶
  0   ＜1.2   ＜6   ＜1.2   ＜6
  15   ＜1.2   ＜6   ＜1.2   ＜6
  30   ＜1.2   ＜6   1.3   6.6
  MenW135批次
  0   2.5   12.5   2.5   12.5
  15   2.3   11.4   3.5   16.8
  30   2.3   11.5   3.5   17.3
  MenW135小瓶
  0   2.1   10.6   2.1   10.6
  15   2.3   11.7   2.7   13.3
  30   20.   10.2   3.3   16.3
  MenY批次
  0   1.7   8.3   1.7   8.3
  15   ＜1.3   ＜6.3   2.0   10.2
  30   1.3   6.3   2.4   12.2
  MenY小瓶
  0   1.4   7.1   1.4   7.1
  15   1.5   7.6   2.1   10.7
30 1.3 6.3 2.9 14.3
因此，在2-8℃，在包装之前或之后，游离糖水平至少在1个月内是稳定的。
在热应力条件下，MenW135和MenY的游离糖随着时间有少量增加，但MenC仍保持稳定。
30天后，在两种保存温度下，小瓶和批量中的pH都稳定在7.15±0.05。
实施例9——脑膜炎球菌A、C、W135和Y糖抗原的吸附
稀释实施例8的两种三价液体组合物，将0.5毫升用于重建实施例7的冻干MenA偶联物。将所得四价混合物在第0天和第28天经皮下注射给予每组10只Balb/c小鼠(雌性，6-8周龄)。该混合物每剂量含有2μg的各糖偶联物，这代表1/5的单一人剂量(SHD)。对照是盐水或未偶联的同源多糖。在免疫前以及在第42天采血，将血清保存在-70℃。
所用的所有偶联物对动物而言是安全的，且具有免疫原性。GMT post-IIELISA滴度(95％的置信区间)如下：
  疫苗   佐剂   A   Y   W135   C
MenA(冻干和再悬浮) 羟基磷酸盐   172(69-439)   -   -   -
羟基氧化物   619(419-906) - - -
MenY 羟基磷酸盐 -   328(147-731) - -
羟基氧化物 -   452(344-593) - -
MenW 羟基磷酸盐 - -   80(28-225)   -
羟基氧化物 - -   227(185-411) -
MenC 羟基磷酸盐 - - -   317(152-659)
羟基氧化物 - - -   723(615-851)
MenA(冻干)+MenC、W135、Y 羟基磷酸盐   32(15-68)   397(252-627)   99(35-288)   114(53-246)
羟基氧化物   206(112-372)   141(97-205)   139(76-251)   163(122-218)
因此，通常，羟基氧化铝+组氨酸组的滴度较高。羟基氧化铝+组氨酸组的血清杀菌滴度通常也较好。
在平行实验中，如上述免疫小鼠，但疫苗组合物含有不同比例的各种寡糖偶联物。在所有实验中使用冻干的MenA寡-偶联物。ELISA滴度如下：
       抗原质量(μg/剂) 铝佐剂                       GMT ELISA(95％置信区间)
  A   C   W135   Y   A   C   W135   Y
4 2 2 2 羟基磷酸盐   177(107-291)   367(263-510)   239(135-424)   239(184-311)
4 2 2 2 羟基氧化物   390(313-486)   494(345-706)   338(266-430)   158(96-260)
2 2 2 2 羟基磷酸盐 132(59-296)   582(268-1155) 143(75-272) 247(152-400)
2 2 2 2 羟基氧化物   337(239-476)   569(462-679)   171(117-251)   100(59-169)
第二组实验使用2μg/ml剂量的MenA和MenC糖进行，此剂量为MenY的一半、MenW135的1/4。ELISA滴度如下：
      抗原质量(μg/剂) 铝佐剂                     GMT ELISA(95％置信区间)
  A   C   W135   Y   A   C   W135   Y
2 2 2 2 羟基磷酸盐   32(15-68)   114(53-246)   99(35-288)   397(252-627)
羟基氧化物   206(112-372)   163(122-218)   139(76-251)   141(97-205)
2 2 1 0.5 羟基磷酸盐   96(49-187)   238(101-561)   42(20-89)   315(114-867)
羟基氧化物   293(144-597)   267(158-451)   83(43-163)   224(152-392)
因此，至少对于A、C和W135血清群而言，羟基氧化物+组氨酸制剂在这些不同的抗原比例下通常产生比羟基磷酸盐更好的滴度。
应理解，本发明仅以实施例方式进行描述，在不偏离本发明的范围和精神的情况下，可进行各种修改。
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94-启龙股份公司于2002年6月20日提交的国际专利申请，代理案卷号为P027504WO，要求了英国专利申请0115176.0的优选权。

Claims (26)

1.一种生产含有抗原、铝盐和组氨酸的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：第一步，混合铝盐和组氨酸，得到组氨酸/铝盐混合物；和第二步，混合所述组氨酸/铝盐混合物和一种或多种抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原是蛋白质抗原或糖抗原。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原是选自以下的细菌抗原：
·脑膜炎奈瑟球菌蛋白质抗原；
·脑膜炎奈瑟球菌外膜囊制品；
·脑膜炎奈瑟球菌糖抗原。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗原是选自以下的细菌抗原：
·脑膜炎奈瑟球菌蛋白质抗原；
·脑膜炎奈瑟球菌外膜囊制品；
·脑膜炎奈瑟球菌糖抗原。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述抗原得自脑膜炎奈瑟球菌B血清群。
6.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖抗原是偶联的抗原。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质抗原用编码所述蛋白质的核酸代替。
8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原吸附于铝盐。
9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述铝盐是氢氧化物或磷酸盐，或者两种或多种所述盐的混合物。
10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述铝盐是羟基磷酸铝，所述抗原是酸性抗原。
11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物中组氨酸的浓度为1-100mM。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述组氨酸的浓度为5-10mM。
13.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有钠盐。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述钠盐的浓度为2.5-5mM。
15.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物的pH为6-7。
16.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物还含有药学上可接受的载体。
17.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物含有一种以上抗原。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述一种以上抗原吸附于铝盐。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述组合物含有2、3、4、5、6或7种以下物质：百日咳杆菌抗原、白喉抗原、破伤风抗原、乙型肝炎病毒抗原、流感嗜血杆菌抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒以及脑膜炎奈瑟球菌C血清群糖抗原。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述组合物含有2、3、4、5、6或7种以下物质：百日咳杆菌抗原、白喉抗原、破伤风抗原、乙型肝炎病毒抗原、流感嗜血杆菌抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒以及脑膜炎奈瑟球菌C血清群糖抗原。
21.一种采用权利要求1-20中任一项所述的方法获得的含有抗原、铝盐和组氨酸的组合物，其特征在于，所述抗原是选自以下的细菌抗原：
·脑膜炎奈瑟球菌蛋白质抗原；
·脑膜炎奈瑟球菌外膜囊制品；
·脑膜炎奈瑟球菌糖抗原。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，将所述组合物用作药剂。
23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述药剂是疫苗。
24.权利要求21所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备提高哺乳动物针对所述抗原的免疫反应用的药剂。
25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述药剂是疫苗。
26.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物是人。
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