CN1816350A - 带有几丁聚糖佐剂和/或脑膜炎抗原的粘膜疫苗 - Google Patents

带有几丁聚糖佐剂和/或脑膜炎抗原的粘膜疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有免疫原性的组合物，包含(a)一种来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N. Meningitidis)血清组C的荚膜糖抗原，和(b)一种几丁聚糖佐剂。所述组合物优选包含(c)一种或多种其他抗原和/或(d)一种或多种其他佐剂。所述组合物特别适于粘膜给药，包括鼻内给药。本发明还包含用于粘膜给药的免疫原性组合物，包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的荚膜糖。优选的，本发明的组合物中的荚膜糖结合到载体蛋白和/或是寡糖。结合的寡糖抗原是特别优选的。

Description

带有几丁聚糖佐剂和/或脑膜炎抗原的粘膜疫苗
这里被引用的所有文献皆全文并入以供参考。
技术领域
本发明属于疫苗领域，尤其是关于可对抗脑膜炎球菌感染和疾病的疫苗。
背景技术
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种革兰氏阴性的人病原体【如参考文献1的第28章】，其能引起细菌性脑膜炎。尽管可明显区分脑膜炎球菌的一个特征是其存在多糖荚膜，所述多糖荚膜存在于所有的病原脑膜炎球菌中，但是它与淋病双球菌(N.gonorrhoeae)密切相关。
基于微生物的荚膜多糖，已经鉴定出了脑膜炎奈瑟氏球菌的12个血清组(A，B，C，H，I，K，L，29E，W135，X，Y和Z)。A组是在亚撒哈拉非洲最常见的流行疾病病因。血清组B和C引起的疾病绝大部分发生在发达国家，其余一些情况是由血清组W135和Y引起的。
除了被用作分类，荚膜多糖已经被用于接种疫苗。一种可注射的来自血清组A、C、Y和W135的荚膜多糖四价疫苗已经使用了很多年【2，3】，并且已经被许可用于人类。虽然在青少年和成人中都是有效的，但其仅能产生低的免疫应答和短期的保护性，并且不能应用于婴儿【如4】。所述疫苗中的多糖是非结合的，并且以1∶1∶1∶1的重量比例存在【5】。MENCEVAX ACWYTM和MENOMUNETM都包含50μg每一种纯化的多糖，从它们的冻干形式进行混合。
结合的血清组C寡糖已经被允许用于人类【如MenjugateTM；参考文献6】。然而，仍然需要对对抗血清组A、W135和Y的结合疫苗以及它们的制造方法进行改进，所述需要被分为产品、方法和用途，公开在参考文献8中。但是，目前仍然存在进一步更新和改进的余地，特别是在给药和制剂方面。
本发明公布的内容
本发明提供了一种具有免疫原性的组合物，包含(a)一种来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)血清组C的荚膜糖抗原，和(b)一种几丁聚糖佐剂。所述组合物优选包含(c)一种或多种其他抗原和/或(d)一种或多种其他佐剂。
本发明还提供了一种用于粘膜给药的具有免疫原性的组合物，包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的荚膜糖。
优选的，本发明的组合物中的荚膜糖结合到载体蛋白和/或是寡糖。结合的寡糖抗原(图1)是特别优选的。
来自脑膜炎球菌血清组C的荚膜糖抗原
脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组C的荚膜糖已经被广泛地应用为抗原。比如，MenjugateTM的活性组分是一种荚膜多糖的寡糖片断，结合到CRM197载体蛋白。
当本发明的组合物包含一种来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖抗原时，优选应用一种荚膜多糖的低聚片断和/或将糖抗原结合到载体蛋白。特别优选的MenC糖抗原公开在参考文献6和9中。
下文将给出寡糖产物和结合物的进一步详细的内容。
糖类混合物
本发明的组合物可以包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种(即2，3或4)的荚膜糖。
来自一种以上脑膜炎奈瑟氏球菌血清组的糖类混合物是优选的，如包含来自血清组A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等。优选的，单个糖抗原的保护性效果没有因相互组合而被去除，尽管实际的免疫原性(如ELISA效价)可能会降低。
优选的组合物包含来自血清组C和Y的糖。其他优选的组合物包含来自血清组C、W135和Y的糖。
当一种混合物包含来自血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)可大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。
当一种混合物包含来自血清组Y以及包含血清组C和W135之一或全部时，MenY糖：MenW135糖的比例(w/w)可大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)；和/或MenY糖∶MenC糖的比例(w/w)可小于1(如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。
优选的来自血清组A∶C∶W135∶Y的糖的比例(w/w)为：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶1∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。
荚膜多糖的纯化
脑膜炎球菌荚膜多糖典型的制备过程包括多糖沉淀(如使用阳离子洗涤剂)、乙醇分馏、冷苯酚抽提(去除蛋白)和超离心(去除LPS)步骤【如参考文献10】。
然而，更优选的制备过程【8】包括在多糖沉淀后，使用低级醇溶解沉淀的多糖。沉淀作用可以应用一种阳离子洗涤剂如四丁基胺盐和十六烷三甲基铵盐(如溴化盐)，或海美溴铵和十四烷基三甲基铵盐。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是特别优选的【11】。沉淀物质的溶解作用可是使用低级醇如甲醇、正丙醇、丙二醇、正丁醇、丁二醇、2-甲基-正丙醇、2-甲基-丙二醇、二醇等。但是乙醇特别适用于溶解CTAB-多糖混合物。乙醇优选加入到沉淀的多糖，达到在50％和95％之间的最终乙醇浓度(基于乙醇和水的总含量)。
在重新溶解后，可进一步处理多糖以去除污染物。在即使很轻微的污染也不能被接受的情况下(如用于人疫苗的制造)，这是特别重要的。一般这将包含一步或多步的过滤，如深层过滤，应用活性炭来过滤，分级过滤和/或超滤。
一旦过滤去除污染物后，所述多糖可进行沉淀以用于进一步处理和/或加工。这可通过阳离子交换方便地实现(如通过加入钙盐或钠盐)。
所述多糖可以是经过化学修饰的。比如，其可进行修饰，用阻滞基取代一个或多个羟基基团。这对于血清组A特别有用【12】。
寡糖
荚膜多糖通常选择寡糖的形式，这可通过将纯化的荚膜多糖进行断裂来方便地获得(如通过在温和的酸中水解，或通过加热)，之后通常要对符合所需大小的片断进行纯化。
多糖的断裂优选使寡糖的最终平均聚合度(DP)低于30(即在10和20之间，优选血清组A约为10；血清组W135和Y约为15至25，优选15至20；血清组C约为12至22等)。DP可以通过离子交换层析或比色分析来方便地测量【13】。
如果进行水解，水解产物通常要进行分级，以去除长度太短的寡糖。这可通过多种方法来进行，如超滤后进行离子交换层析。聚合度低于或等于约6的寡糖特别要从血清组A中去除，聚合度低于4的寡糖特别要从血清组W135和Y中去除。
共价结合
本发明的组合物中的荚膜糖通常被结合到载体蛋白。通常的，所述结合能够增强糖的免疫原性，由于它们被从T-非依赖的抗原转换到了T-依赖的抗原，因而可产生免疫记忆的引发。所述结合对于儿科疫苗是特别有用的【如参考文献14】，并且是一种众所周知的技术【如参见参考文献15-23等】。
优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。CRM197白喉类毒素【24，25，26】是特别优选的。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白【27】、合成肽【28，29】、热休克蛋白【30，31】、百日咳蛋白【32，33】、细胞因子【34】、淋巴因子【34】、激素【34】、生长因子【34】、包含来自不同病原体衍生抗原的多样人类CD4+T细胞决定簇的人工蛋白【35】、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D【36】、来自艰难梭菌(C.Difficile)的毒素A或B【37】等。
在本发明的一种组合物中，可能应用多于一种的载体蛋白。因而不同的载体蛋白可以被用于不同的血清组如血清组A糖可结合到CRM197，而血清组C糖可结合到破伤风类毒素。也可对一种特别的糖抗原应用多于一种载体蛋白，如血清组A糖可分为两组，一些结合到CRM197，而另一些结合到破伤风类毒素。然而，通常优选对所有的糖应用相同的载体蛋白。
单一的载体蛋白可携带多于一种的糖抗原【38】。比如，一种单一的载体蛋白可结合到来自血清组A和C的糖。
优选糖∶蛋白的结合比例(w/w)在0.5∶1(即蛋白过量)和5∶1(即糖过量)之间，更优选的比例在1∶1.25和1∶2.5之间。
结合物可应用于结合自由载体蛋白【39】。
可应用任何合适的结合反应，必要时使用任何合适的连接物。
在进行结合前，通常将糖活化或功能化。比如，活化作用可包括氰化试剂，比如CDAP(如1-氰基-4-二甲氨基-吡啶硼酸四氟【40，41】。其他合适的方法应用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、p-硝基苯酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；还可参见参考文献21的介绍。
经由连接基的连接可应用任何已知的方法，比如参考文献42和43中所描述的方法。一种类型的连接包括多糖的还原胺化作用，将结果的氨基基团连接到一种脂肪酸连接基的一个末端【19，44，45】。其他连接物包括B-氨基丙酸【46】、硝基苯基乙胺【47】、盐酰卤【48】、配糖键【49】、6-氨基己酸【50】、ADH【51】、C4至C12结构域【50】等。作为应用连接物的可替换方式，可采用直接连接的方式。直接连接到蛋白可包含多糖的氧化，与蛋自发生还原胺化作用，比如参考文献53和54所描述的。
一种方法涉及将氨基基团引入到糖中(如用-NH2取代末端的＝O基团)，然后用一种己二酸双酯类化合物(如己二酸N-羟基糖二酯)进行衍生化，优选能与载体蛋白反应的。
在结合后，自由的和结合的糖可进行分离。可采用许多合适的方法，包括疏水色谱法、切线超滤、恒容过滤等【也可参见参考文献55和56等】。
当本发明的组合物包含结合的寡糖时，优选在结合前制备所述寡糖。
本发明的组合物的制备
当本发明的组合物包括多于一种类型的荚膜糖时，优选将它们分离地制备(包括任何断裂分段、结合等)，然后将它们混合，得到本发明的组合物。
然而，当组合物包含来自血清组A的荚膜糖时，优选的，血清组A糖不与其他糖组合，直到在用药前的短时间内再组合，以最小化潜在的水解的可能性。这可通过将血清组A组分以冻干形式保存、将其他组分以液体形式保存来方便地实现，在使用前将液体组分与冻干组分混合。
因而本发明的组合物可获自一种试剂盒，所述试剂盒包含：(a)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，以冻干的形式存在；以及(b)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C、W135和Y中的一种或多种(如1，2，3)的荚膜糖，以液体的形式存在。本发明还提供了一种用于制备本发明的方法，包含将来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的冻干的荚膜糖与来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C、W135和Y中的一种或多种(如1，2，3)的荚膜糖进行混合，其中所述一种或多种的糖是液体形式的。
本发明还提供了一种本发明的组合物，包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C、W135和Y的荚膜糖，其中荚膜糖是液体形式的。所述组合物可与一种冻干的血清组A糖抗原共同包装以用于再混合；或可将所述组合物单独使用，如在不需要免疫对抗血清组A的情况下。
本发明的组合物的存在形式
本发明的组合物可以以不同的方法存在和包装。
当组合物应用于注射时，它们可存在于小瓶中，或可存在于事先灌注的注射器中，所述注射器可以含有或不含针头。一个注射器将包括单剂量的组合物，而一个小瓶中可包括单剂量或多剂量的组合物。可注射的组合物通常是液体溶液或悬浮液。可选择地，它们可以固体的形式存在，注射前在液体媒介中溶解或悬浮。
当本发明的组合物在使用前临时制备(如当血清组A糖以冻干形式存在时)并以试剂盒形式存在时，所述试剂盒可包含两个小瓶，或其可包含一个事先灌注的注射器和一个小瓶，在注射前，把注射器的内容物用于活化小瓶中的内容物。
然而，优选的组合物是用于粘膜给药的。在可用的多种粘膜给药选择中，鼻内途径是最可行的，因为它只需相对简单并已大量生产的设备。因而本发明的组合物优选适于鼻内给药的和/或包装为鼻内给药的形式，如鼻喷雾剂、鼻滴剂、凝胶或粉末【如参考文献57和58】。
用于本发明的组合物的粘膜给药的可选途径是口、胃、肺、肠、透皮、直肠、眼睛、以及阴道途径。因而本发明的组合物可以是适于粘膜给药的和/或包装为粘膜给药的形式【如参见参考文献59，60和61】。比如，当所述组合物是用于口服给药的，其可以是片剂或胶囊(可任选地，为肠衣包被的形式)、液体、转基因植物材料、滴剂、吸入剂、气雾剂、肠衣包被、栓剂、阴道栓剂等形式【也可参见参考文献62和参考文献73的第17章】。
无论选择哪种给药途径，本发明的组合物优选地包装为单位剂量的形式。可以常规地建立有效剂量。用于注射或用于鼻内给药的组合物的通常人用剂量为0.1-0.5ml，如进行两次100μl的喷雾，每个鼻孔100μl。
每一剂量中，单种糖抗原的量通常为1-50μg(以糖的量测定)，优选的为每种约10μg。
本发明的组合物优选无菌的，优选没有热原的。并且，它们优选经缓冲的，如在约pH6和pH8之间，通常约为pH7。当一种组合物包含氢氧化铝盐时，优选使用一种组氨酸缓冲液【63】。
佐剂
所述组合物通常包括一种或多种佐剂。所述佐剂可以在混合成本发明的组合物之前和/或之后加入到糖中，但是优选在混合不同的糖之前将佐剂与一种糖抗原组合。
然而，并非必须在混合前对每种糖加以佐剂。可在一种糖制剂中加入过量的佐剂，当加入其他没有佐剂的糖抗原时，过量的佐剂被稀释到所需的最终浓度。在一个特别的体现方式中，当本发明的组合物需要用一种冻干的抗原(如一种冻干的血清组A组分)加以制备时，优选在冻干的材料中不含佐剂。
对于粘膜给药，优选应用一种粘膜佐剂。粘膜佐剂包括但不限于：(A)大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)，或其解毒的突变体【如参考文献64的第5章】；(B)霍乱毒素(CT)，或其解毒的突变体【如参考文献64的第5章】；或(C)用生物可降接的和无毒的材料(如多聚(α-羟基酸)、多聚羟基丁酸、聚原酸酯、多聚酸酐、多聚已内酯等，如乳酸甘醇酸共聚物等)制作的微粒(即直径约100nm至约150μm的颗粒，更优选直径约200nm至约30μm的颗粒，最优选直径约500nm至约10μm的颗粒)，可选择地，加以处理使其具有带负电的表面(如用SDS处理)或具有带正电的表面(如用阳离子洗涤剂处理，如CTAB)；(D)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯【65】；(E)聚氧乙烯山梨糖酯表面活性剂结合辛苯醇醚【66】，或聚氧乙烯烷醚或酯表面活性剂结合至少一种其他非离子的表面活性剂如辛苯醇醚【67】；(F)几丁聚糖【如68】；(G)免疫刺激寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)和皂角苷【69】；(H)脂质体【参考文献73的第13和14章】；(I)单磷酰脂A模拟物，如氨基烷基磷酸氨基葡糖苷衍生物(如RC-529)【70】；(J)聚磷腈(PCPP)；(K)生物粘附物质【71】，如酯化的透明质酸微球【72】，或粘膜粘附物质，选自聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。还存在其他一些粘膜佐剂【如可参见参考文献85的第7章】。
除了上述给出的粘膜佐剂，本发明的组合物可以包括一种或多种其他佐剂，选自：(A)铝盐(alum)，如氢氧化铝(包括氢氧化合物)、磷酸铝(包括羟基磷酸)、硫酸铝等【参考文献73的第8章和第9章】；(B)水包油乳液制剂(带有或不带其他特殊的免疫刺激剂如胞壁酰基肽(胞壁酰基肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-非胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺-L-丙胺酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-丙三醇-3-羟基磷酸氧)-乙胺(MTP-PE)等)，或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59TM【参考文献73的第10章，74，75】，包含5％鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(可任选地，包含MTP-PE)，使用微喷均质机配制成亚微粒；(b)SAF，包含10％鲨烯，0.4％Tween 80，5％普流尼克-阻滞的聚合物L121，以及thr-MDP，均质为亚微粒乳剂或漩转形成大颗粒乳剂；以及(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，哈米尔顿，MT)，包含2％鲨烯，0.2％Tween 80，以及一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂A(MPL)、双分枝菌酸藻糖(TDM)、以及细胞骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(C)皂角苷佐剂【参考文献73的第22章】，如QS21或StimulonTM(剑桥生物科学，伍斯特，MA)，以单一剂量的形式或以生成自ISCOM(免疫刺激复合物，参考文献73的第23章)的微粒的形式存在，其中ISCOM可以不加入附加的洗涤剂，如参考文献76；(D)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(E)细胞因子，如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12【77】等)，干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(F)单磷酰脂A(MPL)或3-O-脱酰基的MPL(3dMPL)，如参考文献78和79，任选地，当应用肺炎球菌糖时，使铝盐充分不存在，如参考文献80；(G)3dMPL与比如QS21结构和/或水包油乳剂的组合物，如参考文献81，82，83；(H)包含CpG结构的寡核苷酸(即包含至少一个CG二核苷酸，任选地，可用5-甲基胞嘧啶取代胞嘧啶)；(I)免疫刺激物和金属盐的颗粒，如参考文献84；(J)皂角苷和水包油乳剂，如参考文献85；(K)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地，+固醇)，如参考文献86；(L)双链RNA；(M)其它可作为免疫刺激剂增强所述组合物有效性的物质【如参考文献73的第7章】。
当应用的是磷酸铝时，可以吸附一种或多种糖到铝盐上，但是优选不要这样处理，更可取的是使溶液中含有自由磷离子(如应用磷酸缓冲)。当应用的是氢氧化铝时，优选将糖吸附到盐上。将氢氧化铝作为佐剂的应用优选用于来自血清组A的糖。
优选的粘膜佐剂是几丁聚糖和细菌毒素的解毒的突变体(特别是LT)。它们可以单独地应用，或更优的，它们可以组合地应用，因为共同用药可以降低所用毒素的剂量，从而提高安全性。
几丁聚糖
已知几丁聚糖可用作佐剂【如参考文献87至98】，特别是用于粘膜(如鼻内)用途。几丁聚糖(图11)是一种外骨骼聚合体几丁质的N-脱乙酰化衍生物(图12)，尽管N-脱乙酰化作用几乎没有完全的。经过脱乙酰化作用，意味着几丁聚糖在稀的醋酸和蚁酸中是可溶的，不同于几丁质。也已发现几丁聚糖在非疫苗药学领域具有广泛的应用性【99】。
几丁聚糖的重复的葡糖胺单体包含一个氨基基团。所述基团可作为自由氨基(-NH2)或作为阳离子氨基(-NH3 +)存在，通过质子化作用影响聚合体的可溶性。氨基基团是具有化学活性的，并且可以被取代。对于本发明应特别关注的是，氨基基团可以被一种或多种烷基基团(“A”，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等)取代，如-NHA、-NH2A+、-NA1A2、-NHA1A2-、-NHA1A2A3+。优选的衍生物是三烷基化的，并且特别优选的衍生物是三甲基化的(即三甲基几丁聚糖，或“TMC”-图13)。这些衍生物在较宽的pH范围内比未经修饰的几丁聚糖的水溶解性高很多。
并非几丁聚糖聚合体中每一个氨基都必须被取代。在几丁聚糖的全长链上，被取代的程度可以由1H-NMR决定，并可通过反应步骤的数目和持续时间加以控制【100】。优选至少10％(如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的单体具有一个被取代的氨基。
有两个主要的理由来解释为什么几丁聚糖中几乎没有100％的单体携带烷基化的氨基。首先，取代反应通常不是100％完全发生的。第二，几乎没有发现几丁聚糖中100％的单体单位携带氨基基团，因为几丁质的脱乙酰化作用通常不是100％完全发生的。因而，本发明中应用的烷基化的几丁聚糖衍生物的一些单体单位上含有氨基和/或非烷基化的基团，并且几丁聚糖可保持一些氨基基团。本发明中应用的几丁聚糖和其衍生物优选至少75％乙酰化的。
几丁聚糖存在不同的分子量，如从分子量约5,000-10,000的寡糖到高分子量的聚合体(如600,000-1,000,000)。
当应用一种阳离子几丁聚糖或衍生物时，其将以盐的形式被使用，如氯化物或乳酸盐。
所述几丁聚糖或衍生物可以采用不同的物理形式存在，如以溶液的形式，或以粉末的形式，或以粒子的形式。优选的是以粒子的形式，包括微粒，其可交联或非交联，并可通过喷雾干燥方便地形成【101，102】。其他物理形式还包括凝胶、珠、胶片、棉球、纤维、乳剂等。
在本发明所描述的组合物、过程、方法和用途中，应用的术语“几丁聚糖”包含了上述所有的几丁聚糖形式以及衍生物。
解毒的突变体毒素
催化ADP-核糖单位从NAD+转移到靶蛋白的ADP-核糖基化细菌外毒素是众所周知的，例子包括白喉毒素(白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae))、霍乱毒素(CT，霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、热不稳定肠毒素(LT，大肠杆菌(E.coli)和百日咳毒素(PT)。更多的例子在参考文献103和104中。
毒素通常被分为两个功能独特的区域-A和B。A亚基与毒素的酶活性有关，而B亚基与细胞结合有关。所述亚基可以是在相同多肽链上的区域，或可存在于分离的多肽链上。所述亚基自身可以是低聚体，如CT的A亚基由A1和A2组成，通过一个二硫键连接，其B亚基是一个同源五聚体。典型地，与靶细胞的最初接触是由B亚基介导的，然后A亚基单独进入到细胞。
典型地，所述毒素是可产生免疫原性的，但是在疫苗中它们受到自身的毒性的牵制。为了去除毒性而不去除免疫原性，所述毒素需要经过化学试剂的处理，所述试剂如戊二醛或甲醛。更合理的方法是通过定点突变，针对关键的活性位点上的残基，去除有毒酶活性的同时保存免疫原性【如参考文献105(CT和LT)，106(PT)，64等】。现有的无细胞百日咳疫苗(acellular whooping cough vaccines)包括一种两个氨基酸被取代(Arg9→Lys以及Glu129→Gly；‘PT-9K/129G’【107】)的百日咳毒素。
在具有免疫原性的同时，所述毒素也被用于作为佐剂。肠胃外的免疫佐剂作用最早在1972年被发现【108】，粘膜的免疫佐剂作用发现于1984年【109】。在1993年惊人地发现，解毒形式的毒素保留了免疫佐剂作用【110】。
本发明的组合物包括一种解毒的ADP-核糖基化毒素。所述毒素可以是白喉毒素、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A或百日咳毒素，但优选的是霍乱毒素(CT)，或更优选的，是大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)。其他可用的毒素是那些公开在参考文献104(其中序列号1至7号以及它们的突变体)中的。
可以通过合适的方法，使毒素发生解毒作用而不丧失免疫原性和/或佐剂活性，优选的方法是突变。突变可以涉及一个或多个位点的取代、删除和/或插入。
优选的解毒突变体是：LT，在残基Arg-7上有突变(如以Lys取代)；CT，在残基Arg-7上有突变(如以Lys取代)；CT，在残基Arg-11上有突变(如以Lys取代)；LT，在Val-53上有突变；CT，在Val-53上有突变；CT，在Ser-61上有突变(如以Phe取代)；LT，在Ser-63上有突变(如以Lys或Tyr取代)【如参考文献111的第5章-K63；参考文献112-Y63】；CT，在残基Ser-63上有突变(如以Lys或Tyr取代)；LT，在残基Ala-72上有突变(如以Arg取代)【113-R72】；LT，在Val-97上有突变；CT，在Val-97上有突变；LT，在Tyr-104上有突变；CT，在Tyr-104上有突变；LT，在残基Pro-106上有突变(如以Ser取代)；CT，在残基Pro-106上有突变(如以Ser取代)；LT，在Glu-112上有突变(如以Lys取代)；CT，在Glu-112上有突变(如以Lys取代)；LT，在残基Arg-192上有突变(如以Gly取代)；PT，在残基Arg-9上有突变(如以Lys取代)；PT，在Glu-129上有突变(如以Gly取代)；以及任何公开在参考文献105中的突变体。
这些突变可以是同时发生的，如在PT中，可存在Arg-9-Lys+Clu-129-Gly突变；或在LT中，同时存在D53和K63突变，等。
在残基63或72上有突变的LT是一种优选的解毒毒素。LT-K63和LT-R72毒素是特别优选的【114】。
应注意，所述这些残基的计数基于它们的原型序列，比如，尽管在一个给定的LT突变体上，Ser-63实际可能不在第63个氨基酸的位置上，但氨基酸序列排列可显示该位点对应于Ser-63。
解毒的毒素可以以A和/或B亚基的形式存在，与佐剂活性相对应。
所述组合物的其它组分
除了脑膜炎球菌糖抗原，本发明的组合物可以包括脑膜炎球菌蛋白抗原。优选的，可包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的蛋白【如参考文献115至120】或OMV制剂【如参考文献121至124等】。
也包括非脑膜炎球菌抗原和非奈瑟抗原，特别是那些没有减少产生抗脑膜炎球菌免疫应答能力的抗原。比如，参考文献125公开了来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B和C的寡糖以及Hib糖的组合物。来自肺炎球菌、肝炎A病毒、肝炎B病毒、百日咳杆菌(B.pertussis)、白喉、破伤风、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、小儿麻痹和/或流感嗜血杆菌(H.influenzae)的抗原是优选的。特别优选非奈瑟抗原，包括：
-来自幽门螺旋杆菌的抗原，如CagA【126至129】、VacA【130，131】、NAP【132，133，134】、HopX【如135】、HopY【如135】和/或脲酶。
-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原【如136，137，138】。
-来自肝炎A病毒的抗原，如灭活的病毒【如139，140】
-来自肝炎B病毒的抗原，如表面和/或核心抗原【如140，141】，表面抗原优选能被吸附到磷酸铝的【142】。
-来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B的糖抗原【如9】，优选非吸附或吸附到磷酸铝的【143】。
-来自肝炎C病毒的抗原【如144】。
-来自淋病双球菌(N.gonorrhoeae)的抗原【如115至118】。
-来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原【如参考文献145至146，147，148，149，150，151】。
-来自砂眼衣原菌(Chlamydia trachomatis)的抗原【如152】。
-来自牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原【如153】。
-小儿麻痹抗原【如154，155】，比如IPV。
-狂犬病抗原【如156】，比如冻干的灭活的病毒【如157，RabAvertTM】。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原【如参考文献1的第12、13、17章】。
-流感抗原【如参考文献1的第21章】，比如血凝素和/或神经氨酸苷酶表面蛋白。
-来自卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原【如158】。
-来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)的抗原【如159，160】。
-来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)的抗原【如160，161，162】。
-来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原【如163】。
-来自副粘病毒如呼吸融合病毒(RSV【164，165】)和/或副流感病毒(PIV3【166】)的抗原。
-来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的抗原【如167，168，169】。
-来自黄病毒(flaviviridae)家族(黄病毒属)的病毒的抗原，如来自黄热病毒、日本脑炎病毒、四种血清型的登革病毒、蜱媒脑炎病毒、西尼罗河病毒的抗原。
-瘟疫病毒抗原，如来自猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或羊边界病病毒。
-小病毒抗原，如来自小病毒B19的抗原。
-破伤风类毒素【如参考文献1的第18章】。
-来自百日咳博德特氏菌(B.pertussis)百日咳全毒素(PT)和细丝状血凝素(FHA)，也可任选地与百日咳杆菌黏附素和/或凝集原2和3相组合【如参考文献170和171】。
-细胞百日咳抗原。
混合物中可包含这些抗原的一种或多种，需要时可将它们解毒(如通过化学和/或遗传学手段将百日咳毒素解毒)。
当混合物中包含一种白喉抗原时，优选还包含破伤风抗原和百日咳抗原。同样地，当包含破伤风抗原时，优选还包含白喉抗原和百日咳抗原。同样的，当包含百日咳抗原时，优选还包含白喉抗原和破伤风抗原。
典型地，混合物中的抗原以每种至少1μg/ml的浓度存在。通常，任何给定抗原的浓度将足以引起抗抗原的免疫应答。
在本发明的组合物中，优选不同时包含以下三种的全部：(1)脑膜炎球菌糖，(2)一种可引起抗流感嗜血杆菌的免疫应答的抗原，以及(3)一种可引起抗肺炎链球菌的免疫应答的抗原。然而，如果这三种抗原包含在了同一种组合物中，则优选所述组合物还包含一种几丁聚糖的烷基化衍生物(如三甲基几丁聚糖)作为佐剂。
在混合物中，除了应用蛋白作为抗原，还可选择应用核苷酸编码所述抗原。因而，混合物中的蛋白组分可以被编码所述蛋白的核苷酸取代(优选DNA，如以质粒的形式)。同样地，本发明的组合物可包含模拟糖抗原的蛋白，如模拟型【172】或抗个体基因型抗体。这些可取代单独的糖组分，或作为它们的补充。作为举例，所述疫苗可包含一条MenC【173】或MenA【174】荚膜多糖的肽模拟物，取代所述糖本身。
本发明的组合物可包含低浓度(如＜0.01％)的洗涤剂(如一种Tween，比如Tween80)。本发明的组合物可包含一种糖醇(如甘露醇)或海藻糖，如约15mg/ml，特别是当它们将要进行冻干或它们之中包含来自冻干材料的组分时。
免疫原性
本发明的组合物是具有免疫原性的。优选的免疫原性组合物是疫苗。本发明的疫苗既可以是预防性的(即防止感染)，也可以是治疗性的(即在感染后治疗疾病)，但典型的是预防性的。
除脑膜炎球菌糖以外，本发明的免疫原性组合物和疫苗典型地还包含“药学上可接受的载体”，其包括任何载体，所述载体自身不诱生对接受所述组合物的个体产生伤害的抗体。合适的载体通常是巨大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖【175】、脂质聚合体(如油滴或脂质体)、以及灭活病毒颗粒。这种载体对于本领域的普通技术人员来说是熟悉的。所述疫苗还可包含稀释液，比如水、生理盐水、甘油等。另外，也可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质以及类似物质。完整的关于药学可接受赋形剂的讨论见参考文献176。
作为疫苗应用的免疫原性组合物包含免疫学有效量的糖抗原，以及任何前述的其它所需组分。“免疫学有效量”是指给予个体一定的量(单剂量或作为一系列剂量的部分)，所述用量对于治疗或预防是有效的。量的变化取决于给药个体的健康和生理状况、年龄、个体的分类组(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、需要达到的预防程度、疫苗配方、治疗医生对体格状况的评价、以及其他相关因素。预计所述用量在相对宽的范围内将下降，可通过常规试验进行测定。
本发明的组合物的免疫原性可以通过将它们施用于受试者(如12-16个月的儿童，或动物模型【177】)来测定，然后测定标准参数，包括总体和高亲和抗荚膜IgG的血清杀菌抗体(SBA)、以及ELISA效价(GMT)。通常在约给药4周后检测免疫应答，与在给药前测定的值进行比较。优选SBA升高至少4倍或8倍的。当所述组合物给药多于一个剂量时，可以进行多于一次的给药后检测。
本发明的组合物的给药
前已述及，本发明的组合物可通过不同的途径给药，包括肠胃外和粘膜途径。优选的肠胃外给药途径是注射。注射可以是皮下的、腹膜内的、静脉内的或肌肉的注射。从股部进行肌肉给药是优选的。可以使用无针头的注射。优选的粘膜给药途径是鼻内途径。透皮或经皮的给药也是可用的。
给药可以采用单剂量方案或多剂量方案。一种初始剂量可伴随着一种加强剂量。在先发剂量和加强剂量之间合适的间隔时间可根据常规设定。
所述组合物通常可施用于动物，尤其可用于人类受试者。所述组合物特别适合于预防接种儿童和少年。
医学方法和用途
本发明提供了一种升高患者免疫应答的方法，包括给予患者一种本发明的组合物。所述免疫应答优选防护对抗脑膜炎疾病的，并且可以包含一种体液应答和/或细胞免疫应答。所述免疫应答和/或给药都优选以粘膜的方式。
所述患者优选的是儿童。更优选的患者类型是成年妇女，特别是分娩阶段或怀孕的妇女。本发明的组合物特别适于通过母婴途径被动免疫儿童。
本发明还提供了来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的荚膜糖的应用，其中所述荚膜糖结合到载体蛋白和/或寡糖，制备用于向动物鼻内给药以升高其免疫应答的药物。本发明还提供了以下物质的应用：(1)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少一种的荚膜糖，其中所述荚膜糖结合到载体蛋白和/或寡糖，以及(2)几丁聚糖，用于制备向动物鼻内给药以升高免疫应答的药物。
这些药物优选用于预防和/或治疗由奈瑟菌(如脑膜炎、败血病、淋病等)引起的疾病。它们优选用于鼻内给药。它们优选包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种(即2、3或4)的荚膜糖。
定义
术语“包含”意为“包括”，也指“由…组成”，例如：一种组合物“包含”X，其可指该组合物由X组成，或指其还包括一些附加成分，如X+Y。
术语“约”涉及一种数值x均值，比如x±10％。
“充分地”并不排除“完全地”，如一种组合物“充分地脱离了”Y，也可指完全地脱离了。当需要时，“充分地”也可从本发明的定义中忽略。
附图的简要说明
图1说明了一种寡糖结合物的制备。
图2、5和8显示了实施例中的血清IgG数据。图3、6和9显示了实施例中的血清BCA数据。图4、7和10显示了实施例中的脾脏增殖数据。
图11至13显示了(11)几丁聚糖(12)几丁质和(13)三甲基几丁聚糖的重复结构。
图14显示了应用TMC和/LT-K63，测得的IgG ELISA效价(14A)和杀菌效价(14B)。
图15显示了在相同实验中，测得的IgA在血清(15A)以及洗鼻水(15B)中的效价。
图16显示了脾脏增殖试验的结果，随着CRM197浓度的变化而变化(μg/ml)。
图17显示了在加入三种剂量的带几丁聚糖佐剂的MenC抗原后，获得的血清IgG效价。
图18显示了相同实验中的鼻内IgA效价。
图19显示了相同实验中的血清杀菌抗体。
本发明的实施方式
脑膜炎血清组C疫苗
一种CRM197脑膜炎球菌C寡糖结合物【6，9】以每剂量1μg(以糖的量测定)鼻内施用于小鼠，应用N-三甲基-几丁聚糖氯化物【179】和/或LT-K63佐剂。TMC每剂量8μg，其是从来自虾壳的几丁聚糖(“Chitoclear”，Primex ehf，冰岛)制得(94.5％乙酰化的)，取代率为18.9％。LT-K63以每剂量1或0.1μg使用。未经麻醉的雌BALB/c在0、21、35天进行鼻内免疫，给药10μl体积(每个鼻孔5μl)的制剂。在免疫前和免疫后分别提取血清样品。在的三雌免疫后的10天后提取洗鼻水，特异于MenC和LT的IgG和IgA抗体效价通过ELISA测定【180】。
血清IgG应答显示在图14中：(A)ELISA和(B)杀菌性(对数刻度)。图15显示了在(A)血清和(B)洗鼻水中的IgA效价。图16显示了脾脏增殖试验的结果。
数据显示，TMC可单独增强免疫原性，当与LT-K63共同给药时其也能增强免疫原性。接受1μg LT-K63和TMC的小鼠达到的IgG效价与那些通过皮下免疫获得的效价相当。而且，组合使用的佐剂在每一剂量上都获得同等的或比皮下免疫更好的血清杀菌抗体应答。皮下免疫没有升高洗鼻水中的MenC特异的IgA应答。
因而，TMC和LT-K63是有效的用于MenC糖抗原的鼻内佐剂，可单独应用或组合应用。较好的，将TMC加入到LT-K63，使LT-K63的剂量降低约90％而不丧失免疫原性。因而，TMC可使带有潜在残留毒性的组分降低毒性而不丧失免疫原性。
应用非甲基化的“Chitoclear”几丁聚糖作为佐剂，进行相同的实验。小鼠以每剂量2.5μg糖接受相同的结合物抗原，但用LT-K63(1μg)和/或几丁聚糖(10或20μg)，以相同的途径给药。应用六组小鼠：
  组   1   2   3   4   5   6
  铝盐   +   -   -   -   -   -
  LT-K63   -   +   -   -   +   +
  几丁聚糖   -   -   10μg   20μg   10μg   20μg
  给药途径   s.c.   i.n.   i.n.   i.n.   i.n.   i.n.
如图17至19所显示的，用LT-K63和几丁聚糖进行鼻内给药，与用铝盐的皮下给药相比，得到相当的IgG和血清杀菌应答，并引起鼻内IgA应答。
组合的疫苗
应用参考文献8所描述的材料，制备一种寡糖结合物的ACWY组合物。所述组合物用PBS缓冲至pH7.4。每一种结合物的浓度为：
  糖浓度(μg/ml)   CRM197浓度(μg/ml)
  A   487.50   1073.4
  C   656.00   968.5
  W   939.70   918.0
  Y   583.70   837.1
所述组合物以10μl体积(每个鼻孔5μl)鼻内施用于小鼠，不加入佐剂或加入以下粘膜佐剂之一：
 佐剂   浓度(μg/剂量)
 LT-K63   1
 几丁聚糖   25
 三甲基几丁聚糖(TMC)   25
 LT-K63+TMC   同上(1+25)
用于对比，用相同的抗原组合物进行皮下给药，用氢氧化铝作为佐剂。
作为对照，将MenC结合物单独给药，用相同的佐剂和相同的途径，并以与组合给药的组合物中MenC相当的浓度给药。
因此，10组小鼠接受了以下组合物：
# 抗原 抗原(μg) 佐剂 佐剂(μg)
  1   ACWY  4   铝盐(s.c.)   500
  2   C  1   铝盐(s.c.)   500
  3   ACWY  4   -   -
  4   C  1   -   -
  5   ACWY  4   LTK63   1
  6   C  1   LTK63   1
  7   ACWY  4   TMC   25
  8   C  1   TMC   25
  9   ACWY  4   TMC+LTK63   25+1
  10   C  1   TMC+LTK63   25+1
在实验的第一步设置中，在3次鼻内给药(皮下，铝盐)后血清IgG水平如下，以GMT(MEU/ml)±标准差表示(图2)：
  #   抗MenA   抗MenC   抗MenW   抗MenY
  1   356±2.5   310±2   176±4   479±1
  2   2   996±1   2   2
  3   10±8   11±4   4±5   34±2
  4   2   3±3   2   2
  5   81±3   54±3   22±2   162±2
  6   10   246±2   7   8
  7   21±2   42±2   11±3   79±1
  8   2   94±4   2   2
  9   140±4   103±4   118±2   285±2
  10   2   205±1   2   2
在幼兔补体存在下，相同的动物被检测了血清杀菌抗体。使用的菌株为A-F6124、C-C11、W135-5554和Y-240539。
结果如下(图3)：
  #   抗MenA   抗MenC   抗MenW   抗MenY
  1   512   1024   2048   8192
  2   -   8192   -   -
  3   64   128   96   8192
  4   -   64   -   -
  5   256   1024   1024   8192
  6   -   4096   -   -
  7   128   256   48   8192
  8   -   512   -   -
  9   2048   4096   1024   8192
  10   -   2048   -   -
在相同的10组中，还测定了在脾脏中的细胞增殖。接受MenACWY抗原的奇数组的结果显示在图4A中；仅接受MenC的偶数组的结果显示在图4B中。
在实验的第二步设置中，小鼠鼻内给药20μl的以下ACWY组合物(每种抗原含2μg糖)，组1除外，其接受皮下给药。
  #   佐剂   佐剂(μg)
  1   铝盐(s.c.)   500
  2   铝盐(i.n.)   500
  3   LTK63   1
  4   TMC   61
  5   TMC   122
  6   LTK63+TMC   1+61
  7   LTK63+TMC   1+122
  8   几丁聚糖   61
  9   几丁聚糖   122
  10   LTK63+几丁聚糖   1+61
  11   LTK63+几丁聚糖   1+122
在经过3次免疫后，血清IgG显示在图5中，血清BCA显示在图6中，细胞增殖显示在图7A和7B中。
在实验的第三步设置中，小鼠鼻内给药20μl的以下ACWY组合物(每种抗原含2μg糖)，组1除外，其接受皮下给药。
  #   佐剂   佐剂(μg)
  1   铝盐(s.c.)   500
  2   -   -
  3   LTK63   1
  4   LTK63   0.1
  5   TMC   61
  6   LTK63+TMC   1+61
  7   LTK63+TMC   0.1+61
  8   几丁聚糖   61
  9   LTK63+几丁聚糖   1+61
  10   LTK63+几丁聚糖   0.1+61
在经过3次免疫后，血清IgG显示在图8中，血清BCA显示在图9中，细胞增殖显示在图10A和10B中。
因而，LTK63和TMC(特别是它们的配对)是高效的佐剂，用于抗脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的组合疫苗的鼻内给药。
应理解，本发明仅通过上述实施例加以描述，有时可以进行适当的变更，这些变更也包括在本发明的范围和意愿中。
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Claims (20)

1.一种免疫原性组合物，其包含(a)一种来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖抗原，以及(b)一种几丁聚糖佐剂。
2.一种用于粘膜给药的免疫原性组合物，其包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的荚膜糖。
3.如权利要求1所述的组合物，其包含(c)一种或多种其它抗原和/或(d)一种或多种其它佐剂。
4.如上述任何权利要求所述的组合物，其中，所述荚膜糖结合到载体蛋白和/或是寡糖。
5.如权利要求3所述的组合物，其中，所述荚膜糖是结合到载体蛋白的寡糖。
6.如上述任一权利要求所述的组合物，其包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中2种、3种或4种的荚膜糖。
7.如权利要求6所述的组合物，其包含来自血清组A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y或A+C+W135+Y的糖。
8.如上述任何权利要求所述的组合物，其适于鼻内给药，和/或包装为鼻内给药的形式。
9.如权利要求8所述的组合物，其为鼻喷雾剂或鼻滴剂的形式。
10.如上述任何权利要求所述的组合物，其包含一种几丁聚糖佐剂和/或一种大肠杆菌热不稳定毒素的解毒突变体。
11.如权利要求11所述的组合物，其中，所述几丁聚糖是三烷基化的几丁聚糖。
12.如权利要求12所述的组合物，其中，所述几丁聚糖是三甲基几丁聚糖。
13.如权利要求10-12中任一项所述的组合物，其中，所述大肠杆菌热不稳定毒素的解毒突变体在63位残基上有一个丝氨酸到赖氨酸的取代。
14.如上述任何权利要求所述的组合物，其中，所述组合物不包括以下三种的全部：(1)脑膜炎球菌糖，(2)一种可引起抗流感嗜血杆菌的免疫应答的抗原，和(3)一种可引起抗肺炎链球菌的免疫应答的抗原。
15.如上述任何权利要求所述的组合物，其包含以下三种的全部：(1)脑膜炎球菌糖，(2)一种可引起抗流感嗜血杆菌的免疫应答的抗原，和(3)一种可引起抗肺炎链球菌的免疫应答的抗原；以及一种几丁聚糖的烷基化衍生物。
16.一种试剂盒，其包含：(a)冻干形式的来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，以及(b)液体形式的来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C、W135和Y中的一种或多种的荚膜糖，其中，(a)和(b)分别制备，当组合时，它们适于粘膜给药。
17.本发明提供了一种在患者体内提高免疫应答的方法，包含给予患者如权利要求1-15中任一项所述的组合物。
18.来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的荚膜糖在制备用于向动物粘膜给药以提高免疫应答的药物中的应用，其中，所述荚膜糖结合到载体蛋白和/或是寡糖。
19.(1)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少一种的荚膜糖，其中所述荚膜糖结合到载体蛋白和/或是寡糖，以及(2)几丁聚糖在制备用于向动物粘膜给药以提高免疫应答的药物中的应用。
20.如权利要求18或权利要求19所述的应用，其中，所述药物是用于鼻内给药的。
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