CN1688334A

CN1688334A - 改进的细菌外膜囊泡

Info

Publication number: CN1688334A
Application number: CNA038237237A
Authority: CN
Inventors: M·皮扎; D·塞鲁托; R·拉波利
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-09-01
Publication date: 2005-10-26
Also published as: DE60314756T2; EP1534326B1; DE60314756D1; PT2258389E; RU2005108994A; SI2258389T1; BRPI0314094A8; EP1864679A3; CY1107737T1; SI1864679T1; EP1534326A2; ES2289351T3; JP5808358B2; ES2520392T3; MXPA05002316A; DK1534326T3; CY1115777T1; ES2483592T3; EP2258390A1; EP2258388B1

Abstract

现有方法制备脑膜炎球菌OMV在破坏细菌膜时需使用洗涤剂。根据本发明，可以在基本上没有洗涤剂存在下进行膜的破坏。所得OMVs保留了重要的细菌免疫原性成分，特别是(i)保护性NspA表面蛋白，(ii)蛋白NMB2132和(iii)蛋白NMB1870。典型的方法包括下列步骤：(a)在基本上没有洗涤剂存在下处理细胞；(b)离心步骤(a)所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞碎片分开，收集上清；(c)高速离心步骤(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)将步骤(c)所得的沉淀分散在缓冲液中；(e)根据步骤(c)进行第二次高速离心，收集沉淀中的外膜囊泡；(f)将步骤(e)所得的沉淀分散在水性介质中。

Description

改进的细菌外膜囊泡

本文全面参考了所引用的文献。

技术领域

本发明涉及用于免疫目的的囊泡制剂。

背景技术

抗脑膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)感染免疫的多种方法之一是使用外膜囊泡(OMV)。挪威国立卫生院(Norwegian National Institute of Public Health)已生产出一种有效抗B血清群的OMV疫苗(例如文献1)，但尽管此疫苗安全且可预防MenB疾病，其功效限于针对用于制造该疫苗的菌株。

“RIVM”疫苗以含6种不同PorA亚型的囊泡为基础，已在II期临床试验中显示在儿童中具免疫原性[2]。

文献3揭示了一种抗脑膜炎球菌B血清群不同病原血清型的疫苗，该疫苗以保留了一种65-kDa蛋白复合体的OMV为基础。文献4揭示了一种包含OMV的疫苗，该OMV来自基因修饰过的脑膜炎球菌株，该OMV包含：至少一种1型外膜蛋白(OMP)，但不包含2/3型OMP。文献5描述含表面环突变OMP的OMV和含脑膜炎球菌脂多糖(LPS)衍生物的OMV。

文献6描述了含OMV的组合物，其中添加了运铁蛋白结合蛋白(如TbpA和TbpB)和/或Cu，Zn-超氧化物岐化酶。文献7描述了含OMV并添加了多种蛋白的组合物。文献8揭示的膜囊泡制剂由含有经修饰fur基因的脑膜炎奈瑟氏球菌制得。

除脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群之外，还制备了其它细菌的囊泡。文献9揭示了制备针对脑膜炎球菌A血清群的基于OMV的疫苗的方法。文献10和11描述了淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)的囊泡。文献12描述了由乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)制备的囊泡制剂。还制备了粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)[13，14]、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)[15，16]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[15，16]、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)[17]、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)[18]、流感嗜血杆菌(Hacmophilusinfluenzae)[19&20]和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)[21]的囊泡。

细菌囊泡制剂的一个缺点是缺少重要的保护性抗原。为在OMV制剂中保留如NspA等抗原，文献20提出必须上调nspA的表达，同时敲除porA和cps。本发明的一个目标是提供改良囊泡制剂及其生产方法。具体地说，发明旨在提供保留了脑膜炎奈瑟氏球菌的重要细菌性免疫原性成分的囊泡。

发明内容

现有技术制备脑膜炎球菌OMV的方法在破坏细菌膜时使用洗涤剂[参见例如文献22，其中使用脱氧胆酸盐洗涤剂]。发明的基础是发现在基本上没有洗涤剂存在下破坏膜产生的OMV保留了重要细菌免疫原性成分，尤其是(i)保护性NspA表面蛋白，(ii)蛋白‘287’和(iii)蛋白‘741’。′

所以，本发明提供从细菌生产外膜囊泡制剂的方法，其中在基本上没有洗涤剂存在下破坏细菌膜。本发明还提供可用发明方法获得的OMV制剂。

就获得NspA^+ve囊泡而言，发明方法比象文献20所述那样进行多步骤遗传操作简单得多。

发明方法通常包括下列基本步骤：(a)在基本上没有洗涤剂存在下处理细菌细胞；(b)离心步骤(a)所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞碎片分开，收集上清；(c)高速离心步骤(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)将步骤(c)所得的沉淀重新分散在缓冲液中；(e)根据步骤(c)进行第二次高速离心，收集沉淀中的外膜囊泡；(f)将步骤(e)所得的沉淀重新分散在水介质中。

本发明方法还可以包括下列步骤：(g)将步骤(f)所得的再分散组合物通过至少2个孔径递减的滤器进行除菌过滤；(h)可选地将步骤(g)所得组合物加入药学上可接受载体中和/或佐剂组合物中。

步骤(a)产生细菌外膜囊泡，这些囊泡一般包含基本呈现各自天然形式的外膜成分。这一步骤方法的优点在于保留了膜成分NspA、‘287’和‘741’。

步骤(b)通常采用约5000-10000g，至多1小时的离心。

步骤(c)和(e)一般采用约35000-100000g，至多2小时的离心。离心步骤优选在2-8℃进行。

任何适当缓冲液能用于步骤(d)，例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液等。步骤(f)也可使用缓冲液，该缓冲液可与步骤(d)所用相同，或者只用水(例如注射用水)。

步骤(g)中最后一滤器的孔径优选约0.2μm。

发明还提供脑膜炎奈瑟氏球菌囊泡制剂，其特征是，所述囊泡包含(i)NspA蛋白，(ii)‘287’蛋白和(iii)‘741’蛋白。

细菌

制备OMV的细菌可以是革兰氏阳性的，但优选革兰氏阴性的。细菌可以来自莫拉氏菌属(Moraxella)、志贺氏菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、密螺旋体菌属(Treponema)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)或螺旋杆菌属(Helicobacter)(优选种参见前文)，但优选奈瑟氏球菌(Neisseria)属。优选的奈瑟氏球菌种是脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，可使用任何A、C、W135和Y血清群的菌种，优选B血清群的菌种来制备囊泡。B血清群中的优选菌株是MC58、2996、H4476和394/98。

为减少热原活性，细菌应具有低内毒素(LPS)水平。已知有合适的突变细菌，例如突变奈瑟氏球菌[23]和突变螺旋杆菌[24]。文献25描述了从革兰氏阴性菌制备无LPS外膜的方法参见。

细菌可以是野生型细菌也可以是重组细菌。优选的重组细菌过量表达(相对于对应的野生型菌株而言)免疫原如NspA、287、741、TbpA、TbpB，超氧化物岐化酶[6]等。细菌可表达一种以上的PorA I型外膜蛋白，例如表达2、3、4、5或6种PorA亚型：P1.7，16；P1.5，2；P1.19，15；P1.5c，10；P1.12，13和P1.7h，4[例如文献26，27]。

本发明方法通常包括最初的细菌培养步骤，其后可以跟一步浓缩所培养细胞的步骤。

膜的破坏

用于形成囊泡的膜破坏在基本上没有洗涤剂存在下进行。

具体地说，膜破坏基本上在没有脱氧胆酸盐洗涤剂存在下进行，其它洗涤剂可以存在。

膜破坏可在基本上没有离子洗涤剂存在下进行，非离子洗涤剂可以存在。或者，膜破坏可在基本上没有非离子洗涤剂存在下进行，离子洗涤剂可以存在。在一些实施方案中，离子或非离子洗涤剂都不存在。

膜破坏和囊泡形成后的步骤中可以使用洗涤剂。因此，如果某方法中膜破坏在没有洗涤剂存在下进行，但后来向制得的囊泡中加入洗涤剂，则该方法也在本

发明范围之内。

术语“基本上没有”指进行膜破坏时，相关洗涤剂的浓度不超过0.05％(例如≤0.025％、≤0.015％、≤0.010％、≤0.005％、≤0.002％、≤0.001％或甚至0％)。因此，囊泡制备过程中存在痕量洗涤剂的方法也在本发明范围内。

无洗涤剂存在下，可采用物理技术，例如超声处理、均化、微流化、空腔化、渗透休克、研磨、弗氏压碎器、混合等对完整细菌进行膜的破坏。

囊泡

发明方法用来生成外膜囊泡。OMV是从培养细菌的外膜制备的。它们可获得自培养于发酵液或培养于固体培养基上的细菌，优选的获得方法是：从培养基中分离出细菌细胞(例如通过过滤或通过低速离心沉淀细胞)，裂解细胞(不用洗涤剂)和从细胞质分子中分离出外膜组分(例如通过过滤，通过示差沉淀或聚集外膜和/或OMV，通过使用特异识别外膜分子的配体的亲和分离方法，或通过沉淀外膜和/或OMV的高速离心)。

OMVs是能与微泡(MVs[28])和‘天然OMVs’(‘NOMVs’[66])区分开来的，微泡和‘天然OMVs’是天然就有的膜泡，在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。可以如下获得MVs：在肉汤培养基中培养奈瑟氏球菌，从肉汤培养基中分离全细胞(例如通过过滤或通过低速离心只沉淀细胞而不沉淀更小的水泡)，随后收集除去了细胞的培养基中的MVs(例如通过过滤，通过示差沉淀或聚集MVs，通过高速离心沉淀MVs)。一般根据培养物产生的MVs量来选择用于生产MVs的菌株。文献29和30描述了MV高产奈瑟氏球菌。

保留的细菌免疫原性成分

本发明方法基本上没有洗涤剂存在使得囊泡制剂保留了细菌表面的免疫原性成分，如果采用基于洗涤剂的现有技术方法，这些成分将会流失或减少。就脑膜炎奈瑟氏球菌而言，用本发明方法保留的3种免疫原包括但不限于：(1)NspA；(2)蛋白‘287’和(3)蛋白‘741’。

NspA(奈瑟氏球菌表面蛋白A)可见于文献31-37，即文献38的SEQ IDs4008-4033。它是预防脑膜炎球菌疾病的候选疫苗。它在菌株间高度保守。然而并非如最初所愿，现在认为NspA本身尚不足以作为保护抗原而需要与其它抗原联用[例如文献36和文献38的实施例11]。已发现，基于洗涤剂的现有技术制备方法去除了NspA。然而，根据本发明，NspA能保留在囊泡中。这种NspA^+ve囊泡具有优势，因为一次制备制得了两种已知有效免疫原的组合(即囊泡+NspA)，这两种免疫原相互提高彼此的功效。

蛋白‘741’在文献39中被描述为‘NMB1870’(GenBank：AAF42204，GI：7227128)。它还可见于文献40和41。它引发强效杀菌抗体。已发现，用基于洗涤剂的现有方法制得的囊泡中蛋白‘741’被部分去除。然而，本发明方法可将‘741’保留在囊泡中。这种741^+ve囊泡具有优势，因为一次制备制得了两种已知有效免疫原的组合(即囊泡+741)，这两种免疫原相互提高彼此的功效。

蛋白‘287’在文献39中被描述为‘NMB2132’(GenBank：AAF42440，GI：7227388)。它还可见于文献40和42。它引发强效杀菌抗体。已发现，用基于洗涤剂的现有方法制得的囊泡中通常没有蛋白‘287’，为了弥补，此前曾提出在OMV制剂中补加287[43]。然而，本发明能将‘287’保留在囊泡中。这种287^+ve囊泡具有优势，因为一次制备制得了两种已知有效免疫原的组合(即囊泡+287)，这两种免疫原相互提高彼此的功效。

优选的NspA(a)与氨基酸序列GI：1518522有至少a％的序列一致性，且/或(b)包含氨基酸序列GI：1518522中至少x个氨基酸的片段。优选的‘741’(a)与氨基酸序列GI：7227128有至少b％的序列一致性，且/或(b)包含氨基酸序列GI：7227128者至少x个氨基酸的片段。优选的‘287’(a)与氨基酸序列GI：7227388有至少c％的序列一致性，且/或(b)包含氨基酸序列GI：7227388者至少x个氨基酸的片段。a、b和c值彼此独立，但各自至少是70(例如75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5或100)。x、y和z值彼此独立，但各自至少是8(例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250等)。所述片段以包含抗原表位的为佳。

优选的NspA、287和741蛋白基本不利了野生型蛋白(如在完好细菌中那样)在患者体内引发杀菌抗体的能力。

免疫原性药物组合物

本发明方法提供囊泡制剂。为了给予患者，最好将囊泡配制成免疫原性组合物，更好的是配制成适合用作人用(例如儿童或成人用)疫苗的组合物。本发明疫苗可以是预防型的(即用于预防感染)也可是治疗型的(即用于治疗感染后的疾病)，但通常是预防型的。

本发明组合物优选无菌。

本发明组合物优选无热原。

发明组合物的pH一般为6.0-7.0，优选6.3-6.9，例如6.6±0.2。组合物宜用缓冲液维持在此pH。

其它适适合给予人的成分参见文献44。

本发明组合物一般包括佐剂。提高组合物效力的优选佐剂包括但不限于：(A)MF59(5％鲨烯、0.5％土温80和0.5％Span 80，用微流化器制成超微颗粒)[参见文献45的第10章，和文献46]；(B)可生物降解且无毒材料形成的微粒(即直径约100nm-150μm的颗粒，优选约200nm到30μm，最优选约～500nm到～10μm)，所述材料例如例如聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等，优选(交酯-乙醇酸交酯)共聚物，颗粒可以表面带电(例如通过加入阳离子、阴离子、非离子洗涤剂如SDS(阴性)或CTAB(阳性)[如文献47&48])；(C)脂质体[参见文献45的第13和14章]；(D)ISCOMs[参见文献45的第23章]，它可以不含其它洗涤剂[49]；(E)SAF，含10％鲨烯、0.4％土温80和5％Pluronic-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或旋涡搅拌成较大颗粒的乳剂[参见文献45的第12章]；(F)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immuochem)，含2％鲨烯、0.2％土温80和一种或多种细菌细胞壁成分，所述成分选自单磷脂A(MPL)、双分枝菌酸藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(G)皂角苷佐剂，如QuilA或QS21[参见文献45的第22章]，也称为Stimulon^TM；(H)壳聚糖[例如50]；(I)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(J)细胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等[参见文献45的第27&28章]；(K)皂角苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[51]；(L)单磷脂A(MPL)或3-O-脱酰MPL(3dMPL)[例如文献45的第21章]；(M)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[52]；(N)包含CpG基序的寡核苷酸[53]，即含至少一个CG二核苷酸，可用5-甲基胞苷取代胞嘧啶；(O)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯[54]；(P)与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯山梨糖酯表面活性剂[55]，或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子表面活性剂如八木糖醇的组合[56]；(Q)免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)和皂角苷[57]；(R)免疫刺激剂和金属盐颗粒[58]；(S)皂角苷和水包油乳剂[59]；(T)大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(“LT”)或其去毒突变体，如K63或R72突变体[例如文献60的第5章]；(U)霍乱毒素(“CT”)或其去毒突变体[例如文献60的第5章]；(V)双链RNA；(W)铝盐，如氢氧化铝(包括羟基氧化物)、磷酸铝(包括羟基磷酸盐)、硫酸铝等[文献61的第8&9章]；(X)单磷脂A模拟物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐衍生物例如RC-529[62]；(Y)聚磷腈(PCPP)；或(Z)生物粘合剂[63]如酯化透明质酸微球[64]或粘膜粘着剂(mucoadhesive)，选自聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。也可使用可作为免疫刺激剂增强本发明组合物效果的其它物质[例如参见文献45的第7章]。铝盐(特别是磷酸铝和/或氢氧化铝)是肠胃外免疫的优选佐剂。突变毒素是优选的粘膜佐剂。

本发明组合物中囊泡的含量是“免疫有效量”，即将该量作为一次性剂量或多次给药的一部分给予个体后能够有效治疗或预防疾病。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类(如非人的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医疗情况的评估和其它相关因素。预计，该量的范围很宽，通过常规试验即可确定。药物治疗可以是一次给药也可以是多次给药(例如包括加强剂量)。所述疫苗可与其它免疫调节剂联用。

通常，发明组合物制备成注射剂。本发明组合物的直接传递一般是肠胃外途径(例如通过注射，皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射，或者传递到组织间质间隙)或粘膜途径(例如口或鼻内[65、66])。组合物还可以创伤给药。

本发明组合物可在制成后直接给予个体。待治疗的个体可以是动物，特别是人。本发明疫苗特别适合给儿童和青少年接种。

本发明组合物可包含脑膜炎奈瑟氏球菌一种以上血清亚型的囊泡[28]。类似的，本发明组合物可包含一种以上囊泡，如MV和OMV。

除囊泡之外，本发明组合物还可包含抗原。例如，本发明组合物可包含一种或多种下列抗原：

-来自幽门螺旋杆菌的抗原，如CagA[67到70]、VacA[71，72]、NAP[73，74，75]、HopX[例如76]、HopY[例如76]和/或脲酶。

-来自膜炎奈瑟氏球菌A、C、W135和/或Y血清群的多糖抗原，如文献77所述来自C血清群的寡糖[文献78]或文献79的寡糖。

-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖抗原[例如80、81、82]。

-来自甲肝病毒的抗原，如灭活病毒[例如83、84]。

-来自乙肝病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如84、85]。

-来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，如来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，可以与粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3[例如文献86&87]组合。

-白喉抗原，如白喉类毒素[例如文献88的第3章]，如CRM₁₉₇突变体[例如89]。

-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如文献108的第4章]。

-来自流感嗜血杆菌的多糖抗原[例如78]。

-来自丙肝病毒的抗原[例如90]。

-来自淋病奈瑟氏球菌的抗原[例如91、92、93、94]。

-来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如文献95到101]。

-来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原[例如102]。

-来自牙龈卟啉单胞菌的抗原[例如103]。

-脊髓灰质炎抗原[例如104、105]，如OPV或优选IPV。

-狂犬病抗原[例如106]，如冻干的灭活病毒[例如107，RabAvert^TM]。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如文献108的第9、10&11章]。

-流感抗原[例如文献108的第19章]，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-来自粘膜炎莫拉氏菌的抗原[例如109]。

-来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)的蛋白抗原[例如110、111]。

-来自无乳链球菌(B组链球菌)的多糖抗原。

-来自脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)(A组链球菌)的抗原[例如111、112、113]。

-来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如114]。

-来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)[例如115、116、117]的抗原。

-来自黄病毒家族(黄病毒属)病毒的抗原，如来自黄热病病毒、日本脑炎病毒、4种登革热病毒亚型、蝉传脑炎病毒、西尼罗河病毒。

-瘟疫病毒抗原，如来自经典猪热病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或羊边界病毒(border disease virus)。

-微小病毒抗原，例如来自微小病毒B19。

-朊病毒(例如CJD朊蛋白)

-淀粉样蛋白，如β肽[118]

-癌症抗原，如文献119表1或文献120表3&4所列。

组合物可包含一种或多种其它抗原。

必要时可将有毒蛋白抗原去毒(例如通过化学和/或遗传方法将百日咳毒素去毒[87])。

当组合物包含白喉抗原时，最好同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似的，当组合物包含破伤风抗原时，最好同时包含白喉和百日咳抗原。类似的，当组合物包含百日咳抗原时，最好同时包含白喉和破伤风抗原。因此优选DTP组合。

多糖抗原以缀合物形式的为佳。用于缀合物的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白[121]、合成肽[122、123]、热激蛋白[124、125]、百日咳蛋白[126、127]、流感嗜血杆菌蛋白D[128]、细胞因子[129]、淋巴因子[129]、激素[129]、生长因子[129]、C.difficile毒素A或B[130]、铁吸收蛋白[131]等，优选CRM197白喉类毒素[132]。

脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群也可加入OMV组合物，例如加入文献133到139所述的蛋白抗原。

组合物中的各抗原的浓度通常至少1μg/ml。一般，任一抗原浓度都足以引发针对该抗原的免疫反应。

本发明组合物中也不用蛋白质抗原而代之以编码该抗原的核酸。因此，发明组合物中的蛋白成分可由编码蛋白的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)取代。治疗患者的方法

本发明提供本发明囊泡用作药物。

本发明还提供引发患者免疫反应的方法，包括将本发明组合物给予患者。免疫反应优选性抗脑膜炎球菌疾病的保护性免疫反应，可以包括体液免疫反应和/或细胞免疫反应。患者优选是儿童。

本发明方法能在已接受过抗抗脑膜炎奈瑟氏球菌初次免疫的患者体内引发加强免疫反应。OMV的皮下和鼻内初次免疫/加强免疫方案可见于文献65。

本发明还提供发明囊泡用于制造增强患者免疫反应的药物的用途。所述药物优选免疫原性组合物(例如疫苗)。所述药物以用于预防和/或治疗奈瑟氏球菌所致疾病(例如脑膜炎、败血病、淋病等)的为佳。

本发明的方法和用途可将脑膜炎奈瑟氏球菌一种以上血清亚型的囊泡[例如文献28]给予受主。

OMV制剂

本发明提供的组合物包含脑膜炎球菌外膜囊泡、氢氧化铝佐剂、组氨酸缓冲液和氯化钠，其中：(a)氯化钠浓度大于7.5mg/ml；且/或(b)OMVs浓度小于100μg/ml。

氯化钠浓度优选大于8mg/ml，更优选约9mg/ml。

OMVs浓度优选小于75mg/ml，例如约50mg/ml。

组氨酸缓冲液的pH优选pH6.3至pH6.7，例如pH6.5。

佐剂的浓度可以是约3.3mg/ml使用(以Al³⁺浓度计)。

定义

两氨基酸序列间的一致性百分比是指：将两序列排列对齐时，两序列间相同氨基酸的百分比。所述排列对齐和同源性或序列一致性百分比可用本领域已知的软件来测定，例如文献140的7.7.18节所述。优选排列方式之一是用Smith-Waterman同源性搜索算法确定的，该算法采用仿射缺口搜索，开放型缺口的罚分为12，延伸型缺口的罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源搜索算法是本领域熟知的，可见于文献141。

术语“包含”具有“包括”和“由…组成”的意思，例如组合物“包含”X可以是仅由X组成，也可以还包含其它物质，例如X+Y。

数值x前的“约”指例如x±10％。

“基本上”包括“完全”的情形，例如“基本上没有”Y的组合物可以是完全不含Y。必要时，本发明定义中的“基本上”可忽略。

附图概述

图1和2显示细菌(‘TOT’)和外膜囊泡(‘OMV’)中(1)蛋白‘287’和(2)蛋白‘741’的有无，外膜囊泡由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58、H4476和394/98制得。箭头显示图1中的‘287’的位置和图2中‘741’的位置。

图3显示2002年8月29日GenBank登录号GI：7227128、GI：7227388和GI：1518522的氨基酸序列。

本发明实施方式

OMV制剂

用现有技术‘Norwegian’方法(菌株H4476和394/98)或以下方法(菌株MC58)制备OMV：

-收集2-5个平板上的细菌，加至10ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，在56℃加热45分钟将其灭活。然后在冰上对样品进行超声处理(10分钟工作循环50次，端头在6/7处)以破坏膜。

-5000g/4℃/离心30分钟或10000g/离心10分钟去除细胞碎片。

-上清以50000g/4℃再离心75分钟。

-将沉淀重悬于7ml以10mM Tris-HCl(pH8.0)配制的2％N-月桂酰肌氨酸盐(肌氨酰)溶液中，放置20分钟使得细胞质膜溶解。

-样品以10000g离心10分钟以去除颗粒，上清以75000g/4℃离心75分钟。样品在10mM Tris-HCl(pH8.0)中洗涤，并75000g离心75分钟。

-将沉淀重悬于10mM Tris-HCl(pH8.0)或蒸馏水中。

用Western印迹法检测细菌和OMV制剂中有否蛋白质NspA、287和741(图1&2)，结果概括于下表：

菌株	洗涤剂	NspA		287		741
		NspA		287		741		细菌	OMV	细菌	OMV	细菌	OMV
		MC58	-	+++	+++	+++	+++	细菌	OMV	细菌	OMV	细菌	OMV	+++	+++
H44/76	+	MC58	-	+++	+++	+++	+++	+++	-^[20]	+++	-	+++	+	+++	+++
H44/76	+	394/98	+	+++	n.d.	+++	++	+++	-^[20]	+++	-	+++	+	+++	+

与以洗涤剂为基础的现有技术方法相反，不存在洗涤剂使得OMV保留了NspA，并避免了287和741的流失。

从MenB的新西兰株制备OMV制剂

由脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌株394/98制备OMV。配制了2种制剂，各自的组分和浓度如下：

	制剂‘A’	制剂‘B’
	制剂‘A’	制剂‘B’	OMV	50μg/ml	50μg/ml
氢氧化铝佐剂	3.3μg/ml	3.3μg/ml	OMV	50μg/ml	50μg/ml
氢氧化铝佐剂	3.3μg/ml	3.3μg/ml	蔗糖	3％	-
组氨酸缓冲液，pH6.5	-	5mM	蔗糖	3％	-
组氨酸缓冲液，pH6.5	-	5mM	氯化钠	-	9mg/ml

制剂‘B’的免疫活性优于制剂‘A’。制剂‘B’与文献142所述制剂的区别在于OMV浓度减半，NaCl浓度更高，pH稍许不同。

虽然以上通过实施例对本发明仅进行了描述，但还可在发明范围和精神内作出多种修改。

文献(其内容纳入本文供参考)

[1]Bjune et al：(1991)Lancet 338(8775)：1093-1096.

[2]de Kleijn et al.(2001)Vaccine 20：352-358.

[3]US 5,597,572&5,747,653；另见EP 0301992.

[4]EP 0449958(WO90/06696).

[5]US 5,705,161；另见WO94/08021.

[6]WO00/25811.

[7]WO01/52885.

[8]WO98/56901.

[9]WO01/91788.

[10]Parmar et al.(1997)Vaccine 15：1641-1651.

[11]WO99/5 9625.[12] WO00/50074.

[13]US 5,552,146，5,981,213 & 5,993,826；另见WO93/03761.

[14]Zhou et al.(1998)FEMS Microbial Lett 163：223-228.

[15]Kadurugamuwa & Beveridge(1999)Microbiology 145：2051-2060.

[16]WO97/05899.

[17]Kesavalu et al.(1992)Infect.Immun.60：1455-1464.

[18]Blanco et al.(1999)J.Immunol 163：2741-2746.

[19]WO01/09350.

[20]WO02/09746.

[21]Keenan et al.(1998)FEMS Microbial Lett 161：21-27.

[22]EP 0011243.

[23]WO99/10497.

[24]WO02/07763.

[25]EP 0624376.

[26].Claassen et al.(1996)Vaccine 14：1001-1008.

[27]Peeters et al.(1996)Vaccine 14：1009-1015.

[28]WO02/09643.

[29]US 6,180,111.

[30]WOO1/34642.

[31]Martin et al.(1997)J.E～p.Med.185：1173-1183.

[32]Plante et al.(1999)Infect.I，nmun.67：2855-2861.

[33]Cadieux et al.(1999)Infect.Immun.67：4955-4959.

[34]Moe et al.(1999)Infect.Immun.67：5664-5675.

[35]Martin et al.(2000).J.Biotechnol.83：27-31.

[36]Moe et al.(2001)Infect.Immun.69：3762-3771.

[37]WO96/29412.

[38]WO00/71725.

[39]Tettelin et al.(2000)Science 287：1809-1815.

[40]WO99/57280.

[41]WO03/020756(SEQ IDs 1-22).

[42]WO00/66741.

[43]WOO1/52885.

[44]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy.20th版，ISBN：0683306472.

[45]Vaccine design：the subunit and adjuvant approach，eds.Powell & Newman，Plenum出版社1995(ISBN 0-306-44867-X).

[46]WO90/14837.

[47]WOO2/26212.

[48]WO98/33487.

[49]WO00/07621.

[50]WO99/27960.

[51]WO98/57659.

[52]EP 0835318，0735898和0761231.

[53]Krieg(2000)Vaccine 19：618-622；Krieg(2001)Curr opin Mol Ther 2001 3：15-24；WO96/02555，WO98/16247，WO98/18810，WO98/40100，WO98/55495，WO98/37919和WO98/52581etc.

[54]WO99/52549.

[55]WO01/21207.

[56]WO01/21152.

[57]WO00/62800.

[58]WO00/23105.

[59]WO99/11241.

[60]Del Giudice et al.(1998)Molecular Aspects of Medicine，vol.19，1st期.

[61]Vaccine Design…(1995)eds.Powell & Newman.ISBN：030644867X.Plenum.

[62]Johnson et al.(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278.

[63]WO00/50078.

[64]Singh et al.(2001)J.Cont.Rele.70：267-276.

[65]Bakke et al.～2001)Infect.Immun.69：5010-5015.

[66]Katial et al.(2002)Infect.Immun.70：702-707.

[67]Covacci & Rappuoli(2000).1.Exp.Med.19：587-592.

[68]WO93/18150.

[69]Covacci et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5791-5795.

[70]Tummuru et al.(1994)Infect.Immun.61：1799-1809.

[71]Marchetti et al.(1998)Vaccine 16：33-37.

[72]Telford et al.(1994)J.Exp.Med.179：1653-1658.

[73]Evans et al.(1995)Gene 153：123-127.

[74]WO96/01272 & WO96/01273，尤其是SEQ ID NO：6.

[75]WO97/25429.

[76]WO98/04702.

[77]Costantino et al.(1992)Vaccine 10：691-698.

[78]Costantino et al.(1999)Vaccine 17：1251-1263.

[79]WO03/007985.

[80]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19：331-332.

[81]Rubin(2000)Pediatr Glin North Am 47：269-285，v.

[82]Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207.

[83]Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 19：1187-1188.

[84]Iwarson(1995)APMIS 103：321-326.

[85]Gerlich et al.(1990)Vaccine 8 Suppl：S63-68 & 79-80.

[86]Gustafsson et al.(1996)N Engl.J.Med 334：349-355.

[87]Rappuoli et al.(1991)TIBTECH 9：232-238.

[88]Vaccines(1988)eds.Plotkin & Mortimer.ISBN 0-7216-1946-0.

[89]Del Guidice et al.(1998)Molecular Aspects of Medicine 19：1-70.

[90]Hsu et al.(1999)C！in Liver Dis 3：901-915.

[91]WO99/24578.

[92]WO99/36544.

[93]WO99/57280.

[94]WO02/079243.

[95]WO02/02606.

[96]Kalman et al.(1999)Nature Genetics 21：385-389.

[97]Read et al.(2000)Nucleic Acids Res 28：1397-406.

[98]Shirai et al.(2000).J.Infect.Dis.181(Suppl.3)：S524-S527.

[99]WO99/27105.

[100]WO00/27994.

[101]WO00/37494.

[102]WO99/28475.

[103]Ross et al.(2001)Vaccine 19：4135-4142.

[104]Sutter et al.(2000)Pediatr Clin North Am 47：287-308.

[105]Zimmerman & Spann(1999)Am Fain Physician 59：113-118，125-126.

[106]Dreesen(1997)Vaccine 15 Suppl：S2-6.

[107]MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16；47(1)：12，19.

[108]Vaccines(1988)eds.Plotkin & Mortimer.ISBN 0-7216-1946-0.

[109]McMichael(2000)Vaccine 19 Suppl 1：S101-107.

[110]Schuchat(1999)Lancet 353(9146)：51-6.

[111]WOO2/34771.

[112]Dale(1999)Infect Dis Clin North Am 13：227-43，viii.

[113]Ferretti et al.(2001)PNAS USA 98：4658-4663.

[114]Kuroda et al.(2001)Lancet 357(9264)：1225-1240；另见ps.1218-1219.

[115]J Toxicol Clin Toxicol(2001)39：85-100.

[116]Demicheli et al.(1998)Vaccine 16：880-884.

[117]Stepanov et al.(1996)J Biotechnol 44：155-160.

[118]Ingram(2001)Trends Neurosci 24：305-307.

[119]Rosenberg(2001)Nature 411：380-384.

[120]Moingeon(2001)Vaccine 19：1305-1326.

[121]EP-A-0372501

[122]EP-A-0378881

[123]EP-A-0427347

[124)WO93/17712

[125]WO94/03208

[126)WO98/58668

[127]EP-A-0471177

[128]WO00/56360

[129]WO91/01146

[130]WO00/61761

[131]WO01/72337

[132]Research Disclosure，453077(Jan.2002)

[133]WO99/24578.

[134]WO99/36544.

[135]WO99/57280.

[136]WO00/22430.

[137]Tettelin et al.(2000)Science 287：1809-1815.

[138]WO96/29412.

[139]Pizza et al.(2000)Science 287：1816-1820.

[140]Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987)Supplement 30.

[141]Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.(1981)2：482-489.

[142]WO03/009869.

Claims

1.从细菌生产外膜囊泡制剂的方法，其中，在基本上没有脱氧胆酸盐类洗涤剂存在下将细菌膜破坏。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在基本上没有任何洗涤剂存在下将细菌膜破坏。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法包括下列步骤：(a)在基本上没有洗涤剂存在下处理细胞；(b)离心步骤(a)所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞碎片分开，收集上清；(c)高速离心步骤(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)将步骤(c)所得的沉淀分散在缓冲液中；(e)根据步骤(c)进行第二次高速离心，收集沉淀中的外膜囊泡；(f)将步骤(e)所得的沉淀分散在水介质中。

4.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括：(g)通过至少2个孔径递减的滤器对步骤(f)所得的再分散组合物进行除菌过滤；(h)可选地将步骤(g)所得组合物加入药学上可接受的载体和/或佐剂组合物中。

5.如权利要求3或4所述的方法，步骤(b)包括以约5000-10000g离心至多1小时，步骤(c)和(e)包括以约35000-100000g离心至多2小时。

6.如上述权利要求中任一项所述的方法，膜的破坏是通过超声处理、均化、微流化、空腔化、渗透休克、研磨、弗氏压碎器、混合或任何其它物理技术进行。

7.如上述权利要求中任一项所述的方法，步骤(d)和/或步骤(f)所用缓冲液是Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。

8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，步骤(g)中最后一个滤器的孔径约0.2μm。

9.如上述权利要求中任一项所述的方法，用来制备OMVs的细菌来自莫拉氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属、密螺旋体菌属、卟啉单胞菌属、螺杆菌属或奈瑟氏球菌属。

10.如权利要求9所述的方法，所述细菌是脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。

11.如权利要求10所述的方法，脑膜炎奈瑟氏球菌来自B血清群。

12.如上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将免疫有效量的OMVs配制成免疫原性组合物。

13.OMV组合物，所述组合物由述权利要中任一项所述的方法获得。

14.脑膜炎奈瑟氏球菌囊泡组合物，所述囊泡包括(i)NspA蛋白，(ii)‘287’蛋白和(iii)‘741’蛋白。

15.如权利要求13或14所述的组合物，所述组合物无菌且/或无热原且/或由缓冲液调制在pH6.0-7.0。

16.如权利要求13至15中任一项所述的组合物，所述组合物用作药物。

17.增强患者免疫反应的方法，所述方法包括给予患者权利要求13至15中任一项所述的组合物。

18.权利要求13至15中任一项所述外膜囊泡用于制造增强患者免疫反应的药物的用途。