PT624376E

PT624376E - Preparacao e utilizacoes de proteinas de membranas externas deficitarias em los de cocos gram-negativos

Info

Publication number: PT624376E
Application number: PT94106827T
Authority: PT
Inventors: Gary W Zlotnick
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-02
Publication date: 2000-07-31
Also published as: GR3033469T3; CA2123355A1; KR100355961B1; EP0624376B1; ES2145072T3; DE69423383T2; US20020136741A1; EP0624376A1; US6921537B2; CA2123355C; DK0624376T3; DE69423383D1; JPH0819396A; ATE190502T1; US6355253B1; JP3711289B2

Description

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DESCRICÃO "Preparação e utilizações de proteínas de membranas externas deficitárias em LOS de cocos Gram-negativos"

Antecedentes

Antoine van Leeuwenhoek (1987), 53: 413-419 revela o isolamento de proteínas de membranas externas por extracção com detergente de bactérias. A meningite bacteriana é uma doença inflamatória do sistema nervoso central causada pelo crescimento de bactérias no interior das leptomeninges e adjacente às leptomeninges. É uma doença infecciosa aguda, e muitas vezes letal, que afecta crianças e adultos jovens. Uma das causas mais comuns da meningite bacteriana em todo o mundo é a infecção com Neisseria meningitidis. A ocorrência de infecção com esta bactéria é imprevisível, uma vez que muitas pessoas são colonizadas sem exibirem a doença. Algumas pessoas são portadores temporários, enquanto outras são portadores crónicos, descarregando meningococos mais ou menos continuamente ou de uma forma esporádica. Durante o decurso da infecção, anticorpos bactericidas são produzidos na pessoa infectada, os quais aparentemente imunizam a pessoa contra a infecção subsequente (Goldschneider et al., 1969). Esta observação levou à expectativa de que vacinas baseadas em antigénios bacterianos podem ser eficazes contra a meningite. A N. meningitidis é um coco Gram-negativo. De modo característico, está rodeada por um envelope celular composto por uma membrana plasmática interna, um espaço periplasmático e uma membrana externa ou parede celular. A membrana externa é composta por moléculas de lipo-oligossacáridos (LOS), lípidos, proteínas e polissacáridos. Verificou-se que os anticorpos protectores produzidos em pessoas infectadas são dirigidos contra os polissacáridos capsulares e contra proteínas da membrana externa (Frash, 1983).

As estirpes de N. meningitidis foram classificadas em serogrupos de acordo com o tipo (antigénica e bioquimicamente) da cápsula. Os serogrupos correntemente reconhecidos incluem A, B, C, D, W135, X, Y, Z e 29E. Os 2 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ polissacáridos responsáveis pela especificidade de serogrupo dos grupos A, B, C, X, W135, e Y foram purificados. Uma vacina tetravalente baseada em polissacáridos capsulares purificados a partir dos serogrupos A, C, Y, e W135 tem sido desenvolvida (Hankins et al.,1982). No entanto, a falta de imunogenicidade no grupo abaixo dos 2 anos de idade, o grupo etário mais em risco da infecção meningocócica, tem limitado a utilidade desta vacina. A cápsula do Grupo B de N. meningitidis é fracamente imunogénica em todos os grupos etários, mesmo quando conjugada a um transportador proteico. Existe prova de que anticorpos contra esta cápsula podem ter uma reacção cruzada com tecido cerebral de fetos e de crianças recém-nascidas.

As principais proteínas da membrana externa (pem) de N. meningitidis foram divididas em cinco classes com base nas semelhanças estruturais, como determinado pela migração (Mr) nos geles de poliacrilamida-SDS e análise de mapas peptídicos (Tsai et al.,1981). Destas classes proteicas, a proteína da classel aparenta ser a mais interessante para a produção de vacinas. Este antigénio parece ser um imunodeterminante principal em humanos. Está expresso na maior parte dos isolados de N. meningitidis e é o fundamento para a especificidade dos subtipos das estirpes. Várias tentativas foram efectuadas para produzir uma vacina baseada nas proteínas da membrana externa. Foram testadas vacinas compostas de polissacáridos capsulares e proteínas da membrana externa, ou apenas proteínas da membrana externa num complexo vesicular. Só uma destas vacinas foi referida como sendo mais de 57% eficaz (Sierra et al.,1991).

Outro problema significativo no desenvolvimento de vacinas baseadas na membrana externa e na capsula é a presença de lipo-oligossacárido bacteriano (LOS), o qual produz efeitos laterais tóxicos em humanos. O LOS é também referido como endotoxina bacteriana. Quantidades baixas de LOS podem causar febres, e doses elevadas de LOS podem resultar num enfraquecimento geral (caquexia) do paciente. As mais recentes vacinas de complexos da membrana externa tinham níveis de LOS residuais de 10-70pg/mg de proteína (ver Zollinger, 1990 para revisão). Então, existe uma necessidade de vacinas eficazes e seguras para a meningite bacteriana causada por N. meningitidis, e especialmente para a doença causada por estirpes do Grupo B.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a um método para a remoção eficaz de lipo-oligossacáridos (LOS) a partir das membranas externas de cocos Gram-negativos por extracções sequenciais com certos detergentes. O LOS, que é também referido como endotoxina bacteriana, pode causar efeitos laterais indesejáveis nas vacinas, tais como febre. Como aqui descrito, o método produz membranas externas e proteínas solúveis da membrana externa, com um teor extremamente baixo de LOS, mas que retêm a imunogenicidade. Estes produtos da membrana externa deficitários em LOS mostram ainda induzir anticorpos bactericidas. Assim, são proporcionadas vacinas contendo membranas externas e proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS , que se espera que sejam úteis na terapia e profilaxia contra a meningite e outras doenças causadas por cocos Gram-negativos.

Estão aqui especificamente descritos produtos da membrana externa de Neisseria meningitidis. Produtos da membrana externa preparados a partir da Neisseria meningitidis pelo presente método mostram ter um teor de LOS de menos do que aproximadamente 0,01 % (p./p. da proteína total) e induzir anticorpos bactericidas em animais. Como resultado, são proporcionadas vacinas contra meningite neisserial, as quais são eficazes imunogenicamente e relativamente isentas de LOS bacterianos. De particular interesse é uma vacina contra estirpes do serogrupo B de N. meningitidis, para as quais não existe presentemente nenhuma vacina eficaz.

Espera-se que o presente método seja também aplicável a outros cocos Gram-negativos, uma vez que estas bactérias têm membranas externas estruturalmente semelhantes. Por exemplo, podem ser preparadas membranas externas deficitárias em LOS de outras espécies de Neisseria, tais como N. gonorrhoeae, e outros cocos Gram-negativos, tais como Moraxei/a,. Então, N. meningitidis é representativa de outros cocos Gram-negativos nos procedimentos e produtos descritos abaixo.

Este método é ainda aplicável a várias estirpes naturais de cocos Gram-negativos, assim como a estirpes recombinantes que são manipuladas geneticamente para produzir mais do que um epítopo específico de subtipo, por 4 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ exemplo, mais do que uma proteína da classe 1 de N. meningitidis. Podem ser preparadas vacinas multivalentes usando misturas de estirpes ou estirpes recombinantes expressando os epítopos de superfície de vários serogrupos, serotipos ou subtipos. O método compreende extracções sequenciais com diferentes tipos de detergentes. Primeiro, as membranas totais dos cocos são extraídas com detergente polioxietileno (ex. TRITON X-100™, BRIJ35™, ou TWEEN80™), resultando em membranas externas que são deficitárias de membranas internas e algumas deficitárias em LOS. Isto é seguido por extracção das membranas externas com detergente zwiteriónico de betaína, tais como uma das séries de ZWITERGENT™{ex., 3-12 ou 3-14) ou EMPIGEN BB™. Estes detergentes removem de modo específico essencialmente todos os restos de LOS enquanto extraem muito poucas proteínas. A resultante preparação de membranas externas deficitárias em LOS é composta de proteínas da membrana externa (pem) complexadas com componentes da parede celular. Esta preparação pode ser usada para propósitos vacinais directamente, ou as pem podem ser solubilizadas e extraídas dos outros componentes da parede celular usando um detergente zwiteriónico de betaína num tampão salino, p.ex., com ZWITERGENT3-14™ em cerca de 0,1 a cerca de 0,5M de NaCI. O passo de solubilização resulta em fracções deficitárias em LOS, uma contendo proteínas solúveis da membrana externa e outra contendo proteínas insolúveis da membrana externa complexadas com outros componentes da parede celular. As membranas externas deficitárias em LOS e as proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS mostram induzir anticorpos bactericidas em ratinhos.

Breve descrição do desenho A figura é um diagrama de fluxos de um método para preparar proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS a partir de N. meningitidis.

Descricão detalhada do invento É descrito aqui um método eficaz para remover os lipo-oligossacáridos (LOS) tóxicos a partir de preparações de membranas externas de cocos Gram-negativos, como exemplificados por Neisseria meningitidis. O método é 5 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ simples e resulta num teor mais baixo de LOS do que o alcançado com métodos anteriores para remoção de tóxicos de preparações de membranas externas. Em adição, o LOS é removido sem perda significativa de imunogenicidade. O método envolve extracções sequenciais com diferentes tipos de detergentes. Primeiro, as membranas totais dos cocos são extraídas com detergente polioxietileno, tais como TRITON X-100™, BRIJ35™ ou TWEEN80™. Isto remove as membranas internas e alguns dos LOS. Então, as membranas externas são extraídas com detergente zwiteriónico de betaína, tal como um dos das séries de ZWITERGENT™ (ex., 3-12 ou 3-14) ou EMPIGEN BB™. Este passo remove essencialmente todo o LOS restante, resultando complexos de membranas externas deficitárias em LOS e enriquecidas em proteínas (referidas como membranas externas deficitárias em LOS). Quantidades vestigiais de LOS podem permanecer, dependendo do detergente zwiteriónico particular usado; no entanto, estes níveis são baixos e não se espera que induzam efeitos laterais tóxicos em humanos. O procedimento preferido consiste em extractar várias vezes com TRITON X-100™ seguindo-se várias extracções com ZWITERGENT3-14™ (Zw3-14). Por exemplo, são preparadas membranas externas deficitárias em LOS a partir de uma estirpe do serogrupo B, tal como H44/76, 2996 ou H13. As membranas bacterianas são extraídas por duas vezes com TRITON X-100™, e depois pelo menos duas vezes com ZWITERGENT3-14™ (ver a figura). O rendimento resultante de uma grama de células bacterianas liofilizadas é de aproximadamente 32mg de membranas externas deficitárias em LOS e enriquecidas em proteína. Este produto não contém restos de LOS detectáveis por coloração com prata de geles de poliacrilamida-SDS. O produto de membrana externa deficitária em LOS deste método é um complexo de proteínas da membrana externa e componentes da parede celular. Para purificar ainda mais a preparação de antigénio, as proteínas da membrana externa (pem) são solubilizadas a partir das paredes celulares deficitárias em LOS, preferivelmente, por extracção com detergente zwiteriónico de betaína num tampão salino. ZWITERGENT3-14™ em cerca de 0,1 a cerca de 0,5M de cloreto de sódio é preferido para este propósito. Podem também ser usados outros detergentes zwiteriónicos e tampões salinos, tais como cloreto de 6 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ potássio. Ο passo de solubilização produz proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS, e uma fracção separada contendo pem insolúveis complexadas com outros componentes da parede celular. Obtém-se um rendimento de aproximadamente 16mg de pem solubilizadas por grama de células liofilizadas, por extracção das paredes celulares deficitárias em LOS com ZWITERGENT3-14™ a 1,0% em cloreto de sódio a 0,5M. Pode ser obtida mais proteína repetindo este passo de extracção.

As proteínas solúveis da membrana externa são ainda concentradas por vários métodos Standard para concentração de proteínas, tais como precipitação em etanol, filtração, e absorção. A concentração das pem solúveis permite ajustar a concentração final dos antigénios numa vacina ou composição reagente. A figura ilustra uma concretização do método para preparar proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS, partindo de células de N. meningitidis completas e prosseguindo até à concentração de proteínas solúveis da membrana externa. A Tabela 1 (no fim da Descrição Detalhada) mostra os teores de LOS e de proteínas das membranas externas deficitárias em LOS e das pem solúveis comparadas com o material inicial.

Os tipos de detergente usados e a ordem em que são usados são importantes para este método. Por exemplo, TRITONX-100™ remove eficientemente a maior parte dos LOS a partir das membranas externas com perdas mínimas de proteína. No entanto, é o ZWITERGENT 3-14™ que é importante para a remoção dos LOS restantes. A ordem dos detergentes usados é importante para determinar se uma proteína ou outro componente da parede celular é extraído ou deixado insolúvel. Cada detergente tem um efeito directo sobre o que é solubilizado com detergentes subsequentes. Por exemplo, se é usado sarcosilo, em vez de TRITON X-100™, para extrair membranas internas, o perfil de proteínas das membranas externas resultantes, tal como determinado por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS, é diferente. O nível de proteínas da membrana externa da classe 1 é também reduzido.

Podem ser efectuadas várias optimizações do método descrito acima no sentido de maximizar a remoção de LOS e minimizar a perda de proteínas. Por 7 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ exemplo, verificou-se que a gama de concentrações óptimas de Zw3-14 é de cerca de 0,5% até cerca de 1,0% (p/v). Níveis inferiores a 0,5% não são eficazes na diminuição do nível de endotoxina. Cada passo de extracção pode também ser executado mais do que uma vez. No entanto, extracções com detergentes de polioxietileno deveriam preceder a extracção com detergentes zwiteriónicos. Extraindo várias vezes pode resultar em preparações mais limpas, mas também pode resultar em menores rendimentos. Aumentando a concentração dos detergentes pode produzir-se o mesmo resultado com menos extracções. Podem também ser usadas combinações de diferentes detergentes de polioxietileno e de detergentes zwiteriónicos no primeiro e no segundo passos de extracção, respectivamente. Por exemplo, depois da extracção com TRITON X-100™ as membranas externas podem ser extraídas duas vezes com Zw3-12 e duas vezes com Zw3-14.

Preparam-se membranas totais a partir dos cocos por métodos Standard para lisar células bacterianas e separar as fracções membranares e citoplasmáticas. Por exemplo, utiliza-se uma célula de pressão Francesa para lisar as bactérias, centrifugação a baixa velocidade para remover as células não rompidas, e ultracentrifugação para recuperar as membranas totais. A separação das fracções desejadas das não desejadas depois de cada extracção pode também ser executada por uma variedade de métodos conhecidos, incluindo centrifugação, filtração, diálise, e absorção.

Substituições de detergentes

Podem ser utilizadas várias substituições de detergentes no método e a sua eficácia na remoção de LOS enquanto retendo a imunogenicidade das membranas externas pode ser testada. O BRIJ™, o TRITON X-100™, e o TWEEN80™ são detergentes de polioxietileno. O BRIJ35™ e o TWEEN 80™ apresentam um desempenho muito semelhante ao TRITON X-100™. Nenhum reduz o nível de endotoxinas tão eficazmente como TRITON X-100™, mas não afectam a subsequente remoção de LOS pelo ZWITERGENT3-14™. O teor proteico total dos produtos resultantes da membrana externa deficitária em LOS são semelhantes. A substituição de 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 8

TRITON Χ-100™ por sarcosilo resulta num baixo teor de endotoxinas (muito menos que 1,8ng/mg de proteína), mas o rendimento de membranas externas deficitárias em LOS em termos de proteína total é muito mais baixo do que o obtido com TRITON X-100™.

Os detergentes zwiteriónicos de betaína são sumariados pela seguinte fórmula: CH3 R,- +N-(CH2)n-R2- CH3 onde R, é uma cadeia alquilo com mais que 10 carbonos e menos que, ou com 16 carbonos, R2 é um grupo sulfonilo ou um grupo carboxilo, e n é maior que 1 e preferivelmente 2-3. Por exemplo, a série de ZWITERGENT™ tem R2= um grupo sulfonilo (-S03 ), n = 3, e grupos alquilo Rt de vários comprimentos. Os ZWITERGENT™ são denominados de acordo com o comprimento da cadeia alquilo, ex. Zw3-12 tem um grupo alquilo com 12 carbonos, e Zw3-14 tem 14 carbonos em R,. ENPINGEN BB™ tem R2= um grupo carboxilo (-C00), 12 carbonos em R1f e n = 2.

Dos ZWITERGENTS™ 3-08, 3-10, 3-12 e 3-14, o 3-14 é o mais eficaz na remoção de endotoxinas sem extrair excesso de proteína. As cadeias de detergentes mais curtas (3-08 e 3-10) são significativamente menos eficazes na remoção de LOS e também produzem menos proteína. Estes resultados sugerem que o comprimento da cadeia do grupo alquilo R, afecta a eficácia do detergente na remoção de LOS. É possível que Zw3-12 e Zw3-14 sejam eficazes porque as suas cadeias alquilo têm aproximadamente o mesmo comprimento que as cadeias alifáticas das moléculas de LOS. No entanto, detergentes com grupos alquilo com mais de 16 carbonos podem tornar-se insolúveis. O EMPIGEN BB™ funciona de modo substancialmente idêntico ao do Zw3-14. É igualmente eficaz na redução do nível de endotoxina e extrai as mesmas proteínas. Pode oferecer uma vantagem na medida em que parece extrair menos proteína, resultando uma proteína total aumentada nos produtos da membrana externa.

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Outros detergentes que são similares em estrutura aos especificamente mencionados aqui podem ser testados quanto à eficácia na preparação de membranas externas deficitárias em LOS e proteínas da membrana externa, como aqui descrito. Tais detergentes seriam considerados os equivalentes funcionais dos detergentes de polioxietileno no primeiro passo de extracção ou do detergente zwiteriónico usado no segundo passo de extracção ou no passo de solubilização.

Imunoqenicidade dos produtos da membrana externa

Para testar a imunogenicidade dos produtos da membrana externa deste método, membranas externas (o produto depois da extracção com TRITON X-100™), membranas externas deficitárias em LOS (o produto depois da extracção com Zw3-14 ou Zw3-12 como indicado), e pem solúveis deficitárias em LOS (o produto do passo de solubilização) são preparados a partir duma estirpe recombinante (H13) de N. meningitidis. A estirpe H13 (B:-:p1.7, 16; p1.5,2) é uma linha celular mutante dupla derivada da estirpe de tipo selvagem H44/76 (B; 1 5:p 1.7,1 6). A H13 é desprovida de proteínas da membrana externa da classe 3 e da classe 5 e é geneticamente manipulada para expressar a proteína da classe 1 p1.5,2 em adição à sua proteína da classe 1 natural p1.7,16. A estirpe de tipo selvagem 2996 (B:2B:p1.5,2) expressa a proteína da classe 1 de p1.5,2. Assim, H13 tem os subtipos de classe 1 tanto de H44/76 como de 2996.

As preparações de membranas externas deficitárias em LOS são testadas quanto à imunogenicidade injectando-as em ratinhos e analisando os soros resultantes. Os soros são colhidos 0, 4, e 8 semanas depois da imunização principal e na exsanguinação total na 10a semana (ver exemplos). Os soros são então testados, por análise de imunotransferência e no ensaio imunossorvente com ligação enzimática (ELISA), quanto à presença de anticorpos que reagem com as células completas a partir das estirpes H44/76 ou 2996, assim como, quanto a anticorpos que reconheçam pem da classe 1 purificadas p1.7,16. A tabela 2 mostra os títulos nos pontos finais de ELISA dos soros para purificar p1.7,1 6. Como se vê nesta tabela, as pem solúveis deficitárias em LOS (PEMS-LOS) induzem os títulos de anticorpos mais altos contra p1.7,16 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 10

purificada, enquanto os títulos dos soros induzidos por membranas externas e membranas externas deficitárias em LOS (ΜΕ-LOS) são mais baixos mas aproximadamente iguais. Uma análise Western de imunotransferência com os soros contra membranas externas a partir das células H44/76 e 2996 e de p1.7,16 purificada indica que os soros contém apenas anticorpos contra proteínas da membrana externa e não anticorpos contra LOS.

As tabelas 3 e 4 mostram os títulos do pontos finais de ELISA dos soros para células completas H44/76 e 2996, respectivamente. São mostrados os títulos dos soros a partir das membranas externas deficitárias em LOS preparadas usando Zw3-12, assim como Zw3-14. Os títulos de ELISA dos três anti-soros são semelhantes contra as células completas H44/76 (Tabela 3). O soro induzido pelas pem solúveis e o soro induzido pelas membranas externas deficitárias em LOS parecem aproximar-se de uma fase estacionária na exsanguinação total. O nível de anticorpos nos soros induzidos por membranas externas em bruto parece aumentar linearmente. Nos ensaios ELISA contra células completas 2996 (Tabela 4), os títulos dos soros induzidos por membranas externas em bruto e aqueles induzidos por membranas externas deficitárias em LOS são aproximadamente iguais, e ambos são mais baixos do que o título dos soros induzidos por pem solúveis deficitárias em LOS. Estes resultados mostram que membranas externas deficitárias em LOS e produtos pem solúveis deste processo são extremamente baixos em teor de endotoxinas sem perda significativa de imunogenicidade. Em adição, estes resultados mostram que são induzidos anticorpos contra duas estirpes com serotipos e subtipos diferentes (H44/76 e 2996) por produtos da membrana externa feitos a partir de uma estirpe recombinante (H13) que expressa os subtipos da classe 1 de ambas as estirpes.

Actividade Bactericida A capacidade da membrana externa deficitária em LOS e de preparações de pem solúveis para induzir anticorpos funcionais (isto é, anticorpos capazes de induzir destruição mediada por complemento das células meningococais) é testada determinando a actividade bactericida dos soros. O doseamento da

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ actividade bactericida é descrito nos Exemplos. A tabela 5 mostra os resultados obtidos usando membranas externas preparadas a partir da estirpe 2996 (subtipo p1.5,2) ou da estirpe recombinante H13 (subtipos p1.5,2 e p1.7,16). Membranas externas deficitárias em LOS e proteínas solúveis da membrana externa de 2996 produzem anticorpos capazes de matar uma estirpe homóloga de N. meningitidis, mas não uma estirpe heteróloga, H44/76. As preparações de membranas externas deficitárias em LOS feitas a partir de H13, que expressam os subtipos da classe 1 de H44/76 e 2996, induzem anticorpos bactericidas contra células completas H44/76, mas não contra células completas 2996. Esta falta de actividade bactericida contra 2996 não é contudo devida a perda durante a remoção de LOS, uma vez que as membranas externas brutas também não induzem anticorpos funcionais. Como se mostrou acima, produtos da membrana externa deficitária em LOS feitos a partir de H13 induzem anticorpos contra células 2996 (Tabela 4). É possível que a falta de actividade bactericida contra células 2996 sob estas condições seja devida a uma fraca expressão da proteína da classe 1 p1.5,2 na estirpe H13. Isto é consistente com observações a partir de transferências de Western, de que a estirpe H13 expressa significativamente menos proteína p1.5,2 do que a proteína de classel p1.7,16 nativa. Este problema pode ser superado por preparação de membranas externas deficitárias em LOS a partir de uma estirpe recombinante que expresse a proteína da classe 1 recombinante a um nível comparável com aquele da proteína da classe 1 nativa. Clones de H13 com forte expressão de p1.5,2 podem também ser seleccionados por pesquisa em filtros contendo colónias de H13, quanto a reactividade aos anticorpos anti-p1.5,2. Alternativamente, podem ser induzidos anticorpos bactericidas por aumento da dose de imunização das membranas externas deficitárias em LOS ou pem solúveis.

Utilidade do invento O método descrito acima é útil para preparar vacinas contra N. meningitidis e outros cocos Gram-negativos. São desta forma proporcionados métodos de terapia ou profilaxia contra doenças (ex. meningite) causadas por estes cocos. Os métodos anteriores de preparação de vacinas seguem uma estratégia de extrair primeiro proteínas da membrana externa (pem) a partir das paredes celulares e removendo depois tanto LOS quanto possível. O presente método difere dos métodos anteriores na medida em que remove os LOS antes da extracção das proteínas da membrana externa. Como resultado, o teor de

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ LOS é grandemente reduzido sem perda significativa de imunogenicidade das proteínas da membrana externa. O presente método pode remover os LOS até um título menor que 0,01 % (p/p de proteína total) antes da solubilização de pem. A preparação de pem solúvel contém menos que cerca de 3,0 ng de LOS por pg de proteína. Isto é 40X menos endotoxinas do que o relatado por Zollinger et a/, para as suas vacinas em 1978 (Zollinger, Patente US N° 4,707,543) e 100X menos endotoxinas do que correntemente tem sido testado em Cuba e no Brasil (Sierra et al., 1991).

Outra vantagem é a de que são produzidos dois tipos de preparações deficitárias em LOS, complexos de membranas externas e proteínas solúveis da membrana externa, sendo ambos imunogénicos e com baixo teor de LOS. Uma preparação de antigénio solúvel permite maior flexibilidade na escolha de adjuvantes e uma mais fácil administração da vacina. É de notar que a preparação de proteínas solúveis da membrana externa é capaz de induzir uma resposta de anticorpos funcionais na ausência de uma estrutura vesicular. Todos os ensaios com vacinas anteriores utilizam um complexo de membrana externa ou uma forma vesicular (Sierra et al.,1991). Em adição, estas vacinas anteriores têm baixos, mas mensuráveis, níveis de LOS. De facto, a vacina anterior contra o serogrupo B de N. meningitidis contém 1 % de LOS em peso, relativamente è proteína total. O presente método é útil para preparar vacinas multivalentes. Por exemplo, numa concretização, membranas externas deficitárias em LOS ou pem solúveis são feitas usando uma mistura de estirpes de vários serogrupos, serotipos e subtipos de N. meningitidis. Noutra concretização, estirpes recombinantes que expressem uma mistura de epítopos da membrana externa específicos da estirpe, tais como vários subtipos de proteínas da classe 1, são usadas como material de partida para vacinas com um valor de protecção mais amplo. A clonagem (Barlow et al., 1987) e as sequências de várias pem da classe 1 de N. meningitidis e a construção de estirpes de bactérias recombinantes são descritas previamente (Seid et al., WO 90/06696).

As preparações de membranas externas deficitárias em LOS, incluindo

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ pem solúveis, são também úteis como reagentes de diagnóstico, por exemplo, para distinguir anticorpos contra paredes celulares ou pem de anticorpos contra cápsulas de cocos ou LOS. Além disso, as preparações imunogénicas são úteis para criar anticorpos que reconheçam pem ou paredes celulares, mas não sacáridos capsulares.

Espera-se que este método de preparação de membranas externas deficitárias em LOS e pem solúveis seja eficaz em vários cocos Gram-negativos, uma vez que estas bactérias têm membranas externas estruturalmente semelhantes. Por exemplo, podem ser preparados por este método produtos de membrana externa deficitária em LOS e vacinas, a partir de outra Neissería, tal como Neissería gonorrhoeae, e a partir de outros cocos Gram-negativos, tais como Muraxella e particularmente M. catarrhalis.

Os exemplos seguintes ilustram especificamente a invento.

Exemplos

Estirões de N. meningitidis A Neissería meningitidis H44/76 (B: 1 5:p1.7,1 6), 2996 (B:2B:p1.5,2), e as células H13 (B:-:p1.7,16;p1.5,2) são gentilmente fornecidas por J.T. Poolman, Holanda. A H44/76 foi depositada em 11 de Dezembro, 1989 no Central Bureau Voor Schimmelculturen (CBS), Baarn, Holanda, de acordo com os termos do Tratado de Budapeste e é referenciada por CBS G35-89. A 2996 e H13 estão disponíveis a partir de RIVM, Holanda. A tipificação das estirpes é baseada no esquema proposto por Frash (1983).

As estirpes de N.meningitidis são cultivadas a partir do stock congelado de meios de ágar GC (Difco Laboratories, Detroit, Ml) suplementados com dextrose (4 g/l), glutamina (0,1 g/l), cocarboxilase (0,2 mg/l), e nitrato férrico (5 mg/l). As placas são incubadas durante 6 horas a 35°C em C02 a 5%. Depois de crescimento durante 6 horas, as colónias de uma placa são usadas para inocular 10Oml de meios de cultura líquidos consistindo em extracto de levedura dializada a 0,2%, ácido L-glutâmico (1,3 g/l), L-cisteina-HCI (0,02 g/l), fosfato de sódio di-hidratado, dibásico (1 Og/I), cloreto de potássio (0,09 g/l), cloreto de amónio (1,25 g/l), sulfato de magnésio hepta-hidratado (0,6 g/l), dextrose (5

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ g/l), e nitrato férrico (100 μΜ). Esta cultura líquida é cultivada a 37°C durante 18 horas. Uma alíquota da cultura de 18 horas é diluída em unidades de 20-30 Klett ou a uma densidade óptica de 0,1 a 650 nm, e a cultura é cultivada até à fase exponencial tardia. Uma vez que as células atinjam a fase exponencial tardia, elas são mortas pelo calor, sedimentadas, congeladas, e liofilizadas.

Preparação de membranas externas de meninaococos deficitárias em LOS e proteínas solúveis da membrana externa O TRITON X-100™, o BRIJ™, o EMPINGEN BB™ e os ZWITERGENTS™ estão disponíveis de Calbiochem, San Diego, CA. O TWEEN 80™ está disponível de ICN Nutricional Biochemical, Cleveland, OH.

Ressuspendem-se 1,5 gramas de células mortas pelo calor e liofilizadas em 75 mililitros de uma solução hipotónica de Hepes 10mM-NaOH, pH7,4, EDTA 1mM e lisam-se numa célula de Pressão Francesa SLM/AMINCO. As bactérias são agregadas em peletes por centrifugação (5 minutos, 8000xg, 10°C). 0 lisado celular é lavado com cloreto de sódio 0,5M, e o extracto citoplasmático é removido por centrifugação (200 OOOxg, uma hora, 10°C). As membranas internas são solubilizadas e removidas por centrifugação a 400 OOOxg durante uma hora a 10°C seguindo-se extracção com TRITON X-100™ a 1 % em Hepes-NaOH 10mM, pH7,4, cloreto de magnésio 1mM. Esta extracção é repetida uma vez. As membranas externas são lavadas por ressuspensão em Tris-HCI 50mM, pH8,0, EDTA 5mM, e centrifugadas (200 OOOxg, uma hora, 10°C). Estas são então extraídas duas vezes durante uma hora cada com ZWITERGENT3-14™ a 1% (p/v) no mesmo tampão e centrifugadas a 400 OOOxg durante uma hora a 10°C. As proteínas da membrana externa são solubilizadas extraindo as paredes celulares contendo proteínas com ZWITERGENT3-14™ a 1 % (p/v) e cloreto de sódio 0,5M durante uma hora à temperatura ambiente e concentradas por precipitação em etanol a 80% (v/v). As proteínas da membrana externa concentradas são solubilizadas em Tris-HCI 50mM, pH 8,0, EDTA 5mM, ZWITERGENT3-14™ a 1%, NaCI a 0,5M. SDS-PAGE e Imunotransferência

Os perfis proteicos e o teor de LOS de vesículas da membrana externa (VME) e proteínas solúveis são analisadas em geles de poliacrilamida-SDS a

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 15% com ο sistema tampão de Laemmli (1970). O aparelho usado é o sistema de gel MiniProteanil Dual de BIO-RAD (Richmond, CA). As amostras são aquecidas durante 5 minutos a 100°C em tampão amostra contendo Tris 0,1M-HCI, pH 7,0, ditiotreitol 25mM, dodecilsulfato de sódio a 2% (SDS), então ajustadas a 6% de sacarose. Os geles são corridos a 150V em 45-60 minutos e são corados com prata pelo método de Morrisey (1981), ou as proteínas são transferidas para nitrocelulose para imunotransferência como descrito (Towbin et al., 1979; Johnson et al., 1984). As manchas transferidas são bloqueadas durante 15 minutos a 37°C em BLOTTO (5% de leite seco. Tris 0,05M-HCI, pH8,0, NaCI 0,15M) e incubadas com uma diluição de soros de 1:500 em BLOTTO durante uma hora a 37°C. A presença de proteínas da membrana externa da classe 1 (PEM) p1.5,2 e p1.7,16 é determinada usando anticorpos monoclonais (fornecidos por J. T. Poolman). Proteínas reactivas são visualizadas com IgG e IgM de cabra anti-ratinho conjugadas com peroxidase de rábano (TAGO, Inc., Burlingame, CA), e o desenvolvimento segue-se usando 4-cloro-1-naftol como substrato.

Quantificação de proteínas O teor de proteínas totais é determinado através do estojo de ensaio de proteínas BCA Pierce (Rockford, IL) usando como padrão albumina de soro bovino.

Estudos em Animais

Cada grupo de dez ratinhos Webster Suíços, de oito semanas de idade, são imunizados subcutaneamente com 25μg de membranas externas, ou membranas externas deficitárias em LOS ou proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS em solução salina com 25μg de lípido A 3-O-desacilmonofosforilo (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) num volume de 0,2 ml. São administradas três vacinações nas semanas zero, quatro, e oito. É recolhido sangue dos ratinhos nos mesmos intervalos de tempo e fez-se a exsanguinação total na décima semana. Os soros reunidos a partir de cada grupo são analisados por imunotransferência e pelo ensaio imunossorvente com ligação enzimática (ELISA). A imunotransferência é executada como descrito acima e os soros são testados a uma diluição de 1:500 contra complexos da membrana externa a partir de células H44/76 e 2996 e proteínas

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ da membrana externa p1.7,16, purificadas. Os ensaios ELISA utilizam tanto células completas das estirpes H44/76 ou 2996 como pem purificadas da classel. As bactérias são inactivadas a 56°C durante uma hora e diluídas em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS: KCI 27mM, Na2HP04.7H20 43mM, KH2P04 15mM, MgCI2.6H20 5mM, NaCI 1,4M) até DO620 de 0,01-01. Revestem-se placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços (Nunc) com 10ΟμΙ de células e secam-se a 37°C durante a noite numa incubadora de secagem. As placas são lavadas três vezes com TWEEN 20™ a 0,05% em PBS (tampão de lavagem), seguindo-se incubação durante uma hora com 100μΙ de gelatina a 0,1% em PBS para bloqueio. As placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem. São usados gelatina a 0,1% e TWEEN 20™ a 0,05% em PBS para diluir o controlo e os soros de teste, e 100μΙ destas diluições são adicionados às placas que são incubadas á temperatura ambiente durante 90 minutos. As placas são novamente lavadas três vezes, adicionam-se 100μΙ da diluição de 1:1000 de IgG e IgM de cabra anti-ratinho conjugadas com fosfatase alcalina (TAGO), e a mistura é incubada à temperatura ambiente durante uma hora. As placas são lavadas três vezes, ao que se segue uma hora de incubação com 10ΟμΙ do substrato fosfato de nitrofenilo (Sigma) a 1,0 mg/ml em dietanolamina 1M/cloreto de magnésio 0,5 mM. A reacção é parada por adição de 100μΙ de NaOH 2 N, e é lida a absorvância a 410nm.

Realizaram-se também ELISA para detectar anticorpos de proteínas da membrana externa da classel p1.7,16. Placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços são cobertas com 100μΙ de p1.7,16 purificada a 5pg/ml em carbonato de sódio 14mM/bicarbonato de sódio 36mM, a pH9,6, tampão de azida de sódio a 0,02% a 37°C durante 90 minutos. As placas são lavadas seis vezes com PBS/ TWEEN20™ a 0,1% (Tampão de lavagem). Fazem-se diluições em série de soros de murino em PBS/TWEEN20™ a 0,05%, adicionam-se 100μΙ a cada uma das placas lavadas, e cada placa é incubada durante uma hora a 37°C. As placas são novamente lavadas seis vezes com tampão de lavagem. São adicionados 100μΙ de uma diluição de 1:2000 de IgG e IgM de cabra anti-ratinho conjugadas com fosfatase alcalina, e a mistura é incubada durante uma hora a 37°C. As placas são lavadas como anteriormente, são adicionados 100μΙ de solução de fosfato de nitrofenilo a 1 mg/ml em dietanolamina, e deixam-se as placas a incubar durante uma hora à temperatura ambiente. A reacção é parada com 50μΙ de hidróxido de sódio 3N, e a

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 17 absorvância é lida a 405nm.

Ensaio Bactericida O procedimento do ensaio é modificado a partir Hiby et al. (1991). Estirpes de N. meningitidis são cultivadas a partir de stock congelado de meios de ágar CG (Difco Laboratories, Detroit, Ml) suplementados com dextrose (4g/l), glutamina (0,1 g/l), cocarboxilase (0,2 mg/l), e nitrato férrico (5mg/l). As placas são incubadas durante 6 horas a 35°C em C02 a 5%. Depois de crescer durante seis horas, as colónias de uma placa são usadas para inocular 100ml de meios de cultura líquidos consistindo em extracto de levedura dializado a 0,2%, ácido L-glutâmico (1,3 g/l), L-cisteína-HCI (0,02g/l), fosfato de sódio di-hidratado dibásico (10g/l), cloreto de potássio (9,09 g/l), e cloreto de amónio (1,25 g/l). Esta cultura líquida é cultivada a 37°C durante 18 horas. Uma alíquota da cultura das 18 horas é diluída em 20-30 unidades Klett ou a uma densidade óptica de 0,1 a 650 nm, e a cultura é crescida até uma fase exponencial tardia. Uma vez atingida a fase exponencial tardia, as células são usadas no ensaio bactericidas. O ensaio bactericida é conduzido misturando 10μΙ de células N. meningitidis (cerca de 2-4 000 bactérias), 10μΙ de complemento (soro humano normal a 20%), 25μΙ de PBS com CaCI2 0,015mM e MgCI2 0,5mM (PCM), e 5μΙ de soro diluído (PCM como diluente). A fonte de complemento é pré-testada quanto à ausência de actividade bactericida por si só. A mistura é incubada a 36°C durante 45 minutos, diluída nesse momento com 200μΙ de PCM, e 50μΙ são plaqueados em placas de ágar CG. As placas de cultura são incubadas durante 24 horas a 35-36°C com C02 a 5%. As colónias são então contadas e a actividade bactericida é expressa como % do controlo (sem adição de soro). Os títulos são reportados como o recíproco da diluição à qual 50% das bactérias no ensaio são mortas, como extrapolado a partir de um gráfico da % de mortalidade versus diluição. Todos os soros são rotineiramente testados na semana 10. A mais alta concentração dos soros testada é 1/50; quaisquer soros que não matem a 1/50 são reportado como tendo um título de <50. O anti-soro de controlo positivo, preparado contra as células 2996 completas, é capaz de utilizar a fonte de complemento para matar a estirpe de 2996 sob estas condições.

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 18

Tabelai

Teor de endotoxinas e de proteínas de preparações de membranas externas Preparação Endotoxina (uE) Proteína (Mg)

Membranas externas 22360 448

Membranas externas deficitárias em LOS 8 175

Proteínas solúveis da membrana externa 7 30

deficitárias em LOS O material de partida para estas preparações é 1,5g de peso seco de células H1 3.

As unidades de endotoxinas (uE) são medidas por ensaio turbidimétrico usando lipopolissacárido (LPS) de E. coli como padrão, onde 1uE= 0,1 ng de LPS de E.coli.

Tabela2 Títulos nos pontos finais para p 1.7,1 6 purificada Títulos nos Dontos finais nas semanas depois da imunização DrinciDal Imunogénio 0 4 8 10 Membranas <100 6287 63946 142416 externas ME-LOS <100 2234 70835 129159 PEMS-LOS <100 20355 192939 199068 ME-LOS, membranas externas deficitárias em LOS PEMS-LOS, proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS. / 20 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ

Tabela3 Títulos nos pontos finais de ELISA em células H44/76 completas Títulos nos pontos finais nas semanas depois da imunização principal Imunogénio 0 4 8 10

Membranas externas 248 21726 122674 388553 ME-LOS Zw3-1 2 0 30345 297971 90546 ME-LOS Zw3-14 6070 10877 298854 346163 PEMS-LOS 0 30728 270977 320328 ME-LOS Zw3-12, membranas externas deficitárias em LOS preparadas com Zw3-12 ME-LOS Zw3-14, membranas externas deficitárias em LOS preparadas com

Zw3-14 PEMS-LOS, proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS. 21 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ

Tabela 4 Títulos nos pontos finais de ELISA em células 2996 conrmletas Títulos nos pontos finais nas semanas deoois da imunização DrinciDal Imunogénio 0 4 8 10 Membranas externas 0 7120 71166 137506 ME-LOS Zw3-1 2 0 9437 130823 79852 ME-LOS Zw3-14 0 6970 231942 118969 PEMS-LOS 0 14149 128629 202402 ΜΕ-LOS Zw3-12, membranas externas deficitárias em LOS preparadas com Zw3-1 2 ΜΕ-LOS Zw3-14, membranas externas deficitárias em LOS preparadas com Zw3-14 PEMS-LOS, proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS. 22 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ

Tabela 5

Actividade bactericida dos anti-soros para preparações de membranas externas

deficitárias em LOS

Imunogénio Título bactericida da estirpe H44/76 2996 Controlo negativo (sem. 0) <50 <50 Membranas externas de H13 1,100 <50 ME+ LOS parcial de H13 800 <50 ΜΕ-LOS de H13 900 <50 PEMS-LOS de H13 1,000 <50 Membranas externas de 2996 <50 600 ΜΕ-LOS de 2996 <50 225 PEMS-LOS de 2996 <50 150 ME+LOS parcial, membranas externas extraídas uma vez com Zw3-14 ou duas vezes com Zw3-12. ΜΕ-LOS, membranas externas deficitárias em LOS. PEMS-LOS, proteínas solúveis da membrana externa deficitárias em LOS.

Os títulos são o recíproco da diluição que deu origem a 50% de mortalidade. A concentração mais elevada de soros testada é 1/50; quaisquer soros que não matem a 1/50 são reportados como tendo um título<50. 23 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ

Bibliografia

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Equivalentes

Os peritos na arte reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às concretizações específicas do invento aqui descritas especificamente. Pretende-se que tais equivalentes estejam abrangidos no âmbito das reivindicações seguintes.

Lisboa, 9. MAI 2000

Por AMERICAN CYANAMID COMPANY - O AGENTE OFICIAL -

ENG.' ANTÓNIO JOÂO

O ADJUNTO

DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ruo das Flores, 74 - 4.* 1600 LISBOA

Claims

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de membranas externas deficitárias em lipo-oligossacáridos a partir de membranas totais de um coco Gram-negativo compreendendo, o dito método: a) Extrair membranas totais do coco com um detergente de polioxietileno para produzir membranas externas deficitárias de membranas internas; e b) Extrair as membranas externas produzidas no passo a) com um detergente zwiteriónico de betaína para produzir membranas externas deficitárias em lipo-oligossacáridos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o coco é seleccionado de entre o grupo que consiste em Neisseria e Moraxella.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, onde o coco é seleccionado de entre o grupo que consiste em Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catarrhalis.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o detergente de polioxietileno no passo a) é seleccionado de entre o grupo que consiste em: a) TRITON X-100™; b) BRIJ35™; e c) TWEEN80™.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o detergente zwiteriónico de betaína tem a fórmula: CH3 I Rr +N-(CH2)n-R2- I ch3 onde R, é uma cadeia alquilo com mais do que 10 carbonos e menos que, ou com 16 carbonos, R2 é um grupo carboxflico ou um grupo sulfonilo e n é maior que 1. \ 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 2/5
6. Método de acordo com a reivindicação 5, onde o detergente zwiteriónico de betaína é seleccionado de entre o grupo que consiste em: a) ZWITERGENT3-1 2™; b) ZWITERGENT3-14 ™; e c) EMPIGEN BB ™.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o passo a) é executado mais do que uma vez antes de avançar com o passo b).
8. Método de acordo com a reivindicação 1, onde passo b) é executado máis do que uma vez.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a extracção das membranas externas produzidas no passo b) com um detergente zwiteriónico de betaína num tampão salino para produzir uma fracção contendo proteínas solúveis da membrana externa e uma fracção contendo proteínas insolúveis da membrana externa e componentes da parede celular.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, onde o detergente zwiteriónico de betaína é ZWITERGENT3-14™, e o tampão salino é NaCI de cerca de 0,1 a cerca de 0,5N e compreende ainda a concentração das proteínas solúveis da membrana externa.
11. Membranas externas deficitárias em lipo-oligossacáridos isoladas, produzidas pelo método de acordo com a reivindicação 1, a reivindicação 4, a reivindicação 6, a reivindicação 9 e a reivindicação 10. 2. Fracção produzida pelo método de acordo com a reivindicação 9.
13. Fracção produzida pelo método de acordo com a reivindicação 10.
14. Método de preparação de uma composição capaz de induzir um anticorpo bactericida contra um coco Gram-negativo, compreendendo o dito método: a) obter membranas totais de um coco Gram-negativo; b) extrair as membranas totais com um detergente de polioxietileno para 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 3/5

produzir membranas externas deficitárias em membranas internas; c) extrair as membranas externas produzidas no passo b) com um detergente zwiteriónico de betaína para produzir membranas externas deficitárias em lipo-oligossacáridos; e combinar com um veículo fisiologicamente aceitável, preparando assim uma composição capaz de induzir um anticorpo bactericida contra o coco Gram-negativo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, onde o coco é seleccionado de entre o grupo que consiste em Neissería e Moraxel/a.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, onde o coco é seleccionado de entre o grupo que consiste em Neissería meningitidis, Neissería gonorrhoeae e Moraxella Catarrha/is.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, onde a Neissería meningitis pertence ao serogrupo B.
18. Método de acordo com a reivindicação 14, onde é usada mais do que uma estirpe de cocos Gram-negativo no passo a), pertencendo as ditas estirpes a mais do que um serogrupo, serótipo, ou subtipo da bactéria.
19. Método de acordo com a reivindicação 14, onde o coco Gram-negativo é recombinante e o coco recombinante expressa mais que um subtipo de proteínas de membrana externa da classe 1.
20. Método de acordo com a reivindicação 14, onde o detergente de polioxietileno no passo b) é seleccionado de entre o grupo que consiste em: a) TRITON X-100™; b) BR1J35™; e c) TWEEN80™; onde o detergente zwiteriónico de betaína no passo c) tem a fórmula: CH3 Rr +N-{CH2)n-R2- CH3

84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 4/5 onde R, é uma cadeia alquilo com mais do que 10 carbonos e menos que ou igual a 16 carbonos, R2 é um grupo carboxilo ou um grupo sulfonilo e n é maior que 1.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, onde o detergente zwiteriónico de betaína é seleccionado de entre o grupo que consiste em: a) ZWITERGENT3-12™; b) ZWITERGENT3-14 ™; e c) EMPIGEN BB ™.
22. Método de acordo com a reivindicação 14, compreendendo ainda: d) extrair proteínas da membrana externa produzidas no passo c) com detergente zwiteriónico de betaína num tampão salino para obter proteínas solúveis da membrana externa; onde o detergente zwiteriónico de betaína é ZWITERGENT3-14™ e o tampão salino é NaCI de cerca de 0,1 a cerca 0,5M.
23. Vacina, compreendendo uma composição preparada pelo método de acordo com a reivindicação 14, a reivindicação 16, a reivindicação 17, a reivindicação 18, a reivindicação 19, a reivindicação 20, a reivindicação 21, e a reivindicação 22.
24. Composição de acordo com a reivindicação 11, a reivindicação 12, a reivindicação 1 3 ou a reivindicação 23 para utilização em terapia.
25. Utilização de acordo com a composição da reivindicação 11, a reivindicação 12, a reivindicação 13 ou a reivindicação 23 para o fabrico de um medicamento para profilaxia ou terapia contra doença causada por um coco Gram-negativo. 26. utilização de acordo com reivindicação 25, onde a doença é meningite.
27. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 11, a reivindicação 1 2, a reivindicação 13 ou a reivindicação 23, para o fabrico de um 84 074 ΕΡ 0 624 376/ΡΤ 5/5 medicamento para induzir anticorpos para a dita composição.
28. Utilização de acordo com Reivindicação 27, onde o dito anticorpo reconhece as membranas externas de um coco Gram-negativo e não sofre reacção cruzada com os lipo-oligossacáridos do dito coco Gram-negativo.
29. Utilização de acordo com a reivindicação 27, onde o coco é seleccionado de entre o grupo que consiste em Neisseria e Moraxella.
30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, onde o coco é seleccionado de entre o grupo que consiste em Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catarrhaiis. Lisboa, "9· MÂ1 2000 Por AMERICAN CYANAMID COMPANY - O AGENTE OFICIAL -

Preparação de proteínas da membrana externa de Neisseria meningitidis deficitária em LOS CÉLULAS 2996 liofilização ressuspensão em tampão hipotónico y lise em prensa Francesa LISADO DE CÉLULAS lavagem com solução salina ultracentrifugação ▼ INVÓLUCROS DE CÉLULAS (MEMBRANAS TOTAIS) extracção com TRITON X-100™ a 1%(pelo menos 2X) ultracentrifugação T MEMBRANAS EXTERNAS extracção com ZWITERGENT3-14™ a 1 % (pelo menos 2X) ▼ MEMBRANAS EXTERNAS DEFICITÁRIAS EM LOS extracção com ZWITERGENT3-14™ a 1 % + NaCI 0,5M T PROTEÍNAS SOLÚVEIS DA MEMBRANA EXTERNA DEFICITÁRIAS EM LOS extracção com etanol a 80% T PROTEÍNAS SOLÚVEIS DA MEMBRANA EXTERNA CONCENTRADAS FIG.1