CN103687612B

CN103687612B - 无去污剂制备革兰氏阴性细菌外膜泡囊的方法

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Publication number: CN103687612B
Application number: CN201280033688.2A
Authority: CN
Inventors: B·范德沃特比姆德; L·A·范德波尔
Original assignee: STAAT DER NEDERLANDEN VERT DOO
Current assignee: Intravacc LLC
Priority date: 2011-07-07
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: EP2729167B1; DK2729167T3; WO2013006055A8; SI2729167T1; CA2840096C; CA2840096A1; US9272006B2; JP2014520801A; HUE037969T2; IL230326B; RS57267B1; AU2012278407A1; AU2012278407B2; ES2670669T3; NZ618918A; WO2013006055A1; JP6002763B2; PT2729167T; PL2729167T3; TR201808206T4

Abstract

本发明涉及医学微生物学和疫苗的领域。本发明特别涉及无去污剂制备在疫苗中使用的革兰氏阴性细菌外膜泡囊(OMV)的方法、通过所述方法获得的OMV，以及包含这样的OMV的药物组合物。本发明还涉及本发明的OMV作为药剂的用途，特别是其在诱发免疫应答的方法中的用途。

Description

无去污剂制备革兰氏阴性细菌外膜泡囊的方法

发明领域

本发明涉及医学微生物学和疫苗的领域。本发明特别涉及无去污剂制备在疫苗中使用的革兰氏阴性细菌外膜泡囊(OMV)的方法、可通过所述方法获得的OMV，以及包含这样的OMV的药物组合物。本发明还涉及本发明的OMV作为药剂的用途，特别是其在诱发免疫应答的方法中的用途。

发明背景

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是可引起急性脑膜炎和败血症的人病原体，其致死率约15％[Girard等人，2006]。血清群B脑膜炎在北美洲占脑膜炎病例的30-40％[Sharip等人，2006；Kaplan等人，2006]，并且在一些欧洲国家中占高达80％[Trotter等人，2007；Gray等人，2006]，然而仍没有可用的广泛保护性疫苗。已经基于缀合至载体蛋白的荚膜多糖，研发了针对其它血清群的有效疫苗[Snape等人，2008]。对于血清群B，由于较差的免疫原性[Morley等人，2001]，以及对于疫苗接种引发的自身免疫的担心[Finne等人，1983]，该方法不可行。至今，基于外膜泡囊(OMV)的疫苗是唯一成功地控制血清群B传染病的疫苗，如在挪威、古巴和新西兰[Bjune等人，1991；Thornton等人，2006；Martin等人，1998；Sierra等人，Fredriksen等人，1991]的实例。

OMV从革兰氏阴性细菌的外膜释放，其由包含外膜蛋白的磷脂(PL)双分子层、脂多糖(LPS)和胞质组分组成[Deatherage等人，2009]。PorA蛋白被鉴定为是OMV中的主要保护性抗原，但它在传播的血清群B菌株之间是高度可变的，这使疫苗的研发复杂化[Saukkonen等人，1989；Martin等人，2006]。因此，Rijks Instituut voor Volksgezondheid enMilieu(RIVM)，即国家公共卫生和环境研究所(Bilthoven，荷兰)研发了基于表达多种PorA亚型的基因修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株的OMV疫苗。起初，该多价OMV疫苗由2种总共表达6种PorA亚型的三价PorA菌株制备[van der Ley等人，1995；Claassen等人，1996]，并且在II期临床试验中提供了功能性免疫原性。为了确保对于全球传播的血清群B菌株的足够覆盖，加入了第三种三价菌株[van den Dobbelsteen等人，2007]。

传统上通过去污剂提取(dOMV纯化方法)来制备OMV疫苗，以移除LPS，并增强泡囊释放。脑膜炎奈瑟球菌的LPS是高毒性的，但是需要残留量(约1％)来维持泡囊结构并辅助针对PorA的免疫应答[Arigita等人，2005；Arigita等人，2003；Steeghs等人，2004]。通过适度的去污剂浓度，dOMV纯化方法满足这些要求，然而其还有重要缺点。连同LPS，去污剂移除有助于免疫原性的PL以及脂蛋白(例如因子H结合蛋白)[Koeberling等人，2009；Koeberling等人，2008]。所产生的免疫应答直接针对特定的PorA亚型，而不引发交叉保护[Morley等人，2001；van der Voort等人，1996]。此外，LPS和PL的选择性移除改变原始的泡囊结构，并且促进聚集[Holst等人，2009；Cametti等人，2008]。为了降低LPS毒性，需要进行去污剂处理，但这具有使疫苗研发复杂化的有害的副作用。

无去污剂OMV纯化方法保留所有LPS，不仅导致保留的原始泡囊结构，而且导致当用于非消化道免疫法时自身有毒的疫苗[Holst等人，2009]。已经记载了两种无去污剂纯化方法。原始的OMV(nOMV)方法[Zollinger等人，1979；US 6,558,677]包括与dOMV相似的步骤，然而其有无去污剂提取步骤，并且上清液OMV(sOMV)方法[Post等人，2005；Devoe等人，1973；Hoekstra等人，1976]利用超滤法或超速离心法来纯化从培养物上清液自发释放的OMV，而无提取。nOMV疫苗在动物和人中产生鼓舞人心的结果，但是高的LPS含量限制了该疫苗鼻内给药的适用性[Guthrie等人，2004；Katial等人，2002；Saunders等人，1999；Drabick等人，1999]。sOMV疫苗的临床前数据限于在小鼠中的单个研究，其报告了针对一组血清群B菌株的交叉保护作用，这用dMOV时未发现，然而未讨论毒性和稳定性中可能的不同[Ferrari等人，2006]。sOMV方法带来了额外的挑战，因为它生产OMV的收率对于适合的工艺研发而言太低[Post等人，2005；Devoe等人，1973]。

在RIVM Bilthoven发现的lpxL1突变株[van der Ley等人，2001]提供了对于LPS毒性问题的解决方案。lpxL1的缺失使LPS毒性减弱，同时保留免疫应答需要的佐剂活性[Koeberling等人，2008；van der Ley等人，2001；Fisseha等人，2005；van de Waterbeemd等人，2010]。

然而，对于nOMV/sOMV的临床试验或者GMP制备，需要强大的、可规模化的生产方法，其中为了高收率，需要EDTA提取步骤，但是至今，其导致不期望的效果，如细菌溶胞作用[Prachayasittikul等人，2010]。对于大规模生产，由溶胞作用导致的DNA释放是问题，因为如超速离心法的移除方法仅具有有限的能力。

因此，由于至今可用于制备sOMV和nOMV的方法低收率和/或低纯度和/或限于实验室规模，需要改进的方法用于制备细菌OMV，特别需要工业规模的方法。

发明描述

令人惊奇地，现在已证明在一可以任意规模进行的方法中，可无去污剂且高收率和高纯度地制备OMV。

因此，在本发明的第一方面中提供无去污剂制备在疫苗中使用的细菌外膜泡囊(OMV)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养革兰氏阴性细菌群落至静止生长期；

b)在静止生长期开始后至少约1小时的时间点，在调节至或具有高于约pH7.5或高于pH8.0的pH、浓度为约1-100mM的金属螯合剂的培养基中，孵育在a)中获得的细菌，以提取OMV，所述金属螯合剂优选为EDTA；以及

c)回收在b)中提取的OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV移除所述细菌。

静止期开始后约1小时的时间点优选为1-9小时的时间点，更优选1-8小时、1-7小时、1-6小时、2-5小时、2-4小时、2-3.5小时或2.5-3.5小时。

在本发明任意的方法中，优选将OMV灭菌，优选通过过滤灭菌，优选使用具有小于约0.3微米小孔的滤器。优选在步骤c)期间进行灭菌；由于进行了本发明的步骤b)，大大降低了收率的损失。过滤灭菌也称作无菌过滤，在本文中定义为将所关注的化合物通过滤器过滤，所述滤器优选具有约0.5-0.2微米的小孔，以使包含所关注的化合物的滤液不包含任何微生物，或将滤液中微生物的量降低至可接受的低水平。

术语“无去污剂”在本文中优选定义为在本发明任意方法的提取步骤期间，未加入和/或使用去污剂；更优选地，在本发明任意方法期间，根本未加入和/或使用去污剂。如果在培养群落期间使用去污剂，例如作为消泡剂形式的加工助剂，如Sigma-Aldrich的消泡剂(货号(cat.nr.)A6426、A5633、A5757、A8011或A5758)，或者来自其他生产商的具有类似功能的分子，认为这是在本发明方法的范围内。在本发明的方法使用的溶液中，自身存在少量的去污剂也是可能的，例如在用于培养的复合培养基中的痕量去污剂；这样的自身存在也被认为是在本发明方法的范围内。

在本文中去污剂优选定义为具有表面活性剂能力，并且当与细菌接触时，具有从细菌中提取蛋白质的能力的物质，优选为试剂。去污剂可为阴离子型的、阳离子型的、非离子型的(净电荷为0，也称作两性离子的)或者为乙氧化物(ethyloxylate)。消泡剂，即在工业处理液体中减少并阻止泡沫形成的物质，如来自Sigma-Aldrich的消泡剂(货号：A6426、A5633、A5757、A8011或A5758)优选不在去污剂的定义范围内。在本发明的任意方法中培养革兰氏阴性细菌群落可通过本领域技术人员已知的任意方法进行。优选的培养基为化学限定培养基，优选地如在Baart等人，2007中记载的那些。温度可在任意温度下变化，例如约30℃-约40℃。pH可在任意pH下变化，如约5.5-8.5的pH。优选的培养条件包含在通气下，于约35℃，pH7.2下培养。可以数个步骤进行培养，包括但不限于预培养或种菌培养和主培养。培养可以任意规模进行，包括但不限于摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模培养(包括连续、分批、分批补料或固态培养)。培养物的体积优选地至少为约10L，更优选地至少约20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10,000L、20,000L或40,000L。

在本文中细菌群落定义为至少两个细菌，优选为相同属和种。

OMV优选从具有基因修饰的革兰氏阴性细菌制备，所述基因修饰导致所述细菌产生修饰为具有降低的毒性的LPS。所述革兰氏阴性细菌优选具有毒性降低的LPS，其中所述LPS(或者它的脂质A基团(LA))修饰为具有降低的毒性。在本文中，修饰为具有降低的毒性的LPS要理解为修饰为比相应的野生型LPS的毒性低的LPS。优选地，修饰的LPS的毒性比相应的野生型LPS的毒性低约90％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.2％。可在本领域已知的任意适合的实验中测定野生型和多种修饰的毒性降低的LPS的毒性。用于测定LPS的毒性(即生物活性)的优选实验为用于MM6巨噬细胞细胞系中TNF-alpha诱导的WEHI试验[Espevik和Niessen，1986，J.Immunol.Methods 95：99-105；Ziegler-Heitbrock等人，1988，Int.J.Cancer41：456-461]。

然而，尽管所述革兰氏阴性细菌的LPS(或它的LA基团)优选具有降低的毒性，所述LPS也优选保留至少部分免疫刺激活性(即佐剂活性)。从而，在本发明中使用的革兰氏阴性细菌的毒性降低的LPS优选具有至少约10％、20％、40％、80％、90％或100％的相应的野生型LPS的免疫刺激活性，其中免疫刺激活性如下测量：如WO 2005/107798的实施例3中记载的，在将树突细胞(DC)与产生毒性降低的LPS的革兰氏阴性细菌共同培养时，测量至少一种细胞因子的产生或至少一种共刺激分子的表达。由DC产生的细胞因子优选选自IL12、IL10、TNF-α、IL6和IL-1β，并且由DC表达的共刺激分子优选选自CD40和CD86。

如在WO 02/09746中所总结，具有脂质A基团的降低的毒性但保留(部分)佐剂活性的革兰氏阴性LPS可例如从基因修饰的革兰氏阴性病原体中获得。产生脂质A基团毒性降低的LPS但保留(部分)它们的佐剂活性的基因修饰的革兰氏阴性病原体包括例如如下革兰氏阴性细菌，其具有一处或多处减少或敲除一种或多种选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物(先前称作htrB和msbB；参见例如WO 00/26384；US 5,997,881)以及编码脂质A4′-激酶的lpxK基因或其同源物(也参见以下)的表达的基因修饰；以及引起一种或多种外源lpxE和pagL基因表达的基因修饰。优选的基因修饰为减少或敲除一种或多种选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物的基因的表达的修饰。优选的脂质A基团毒性降低但保留(部分)它的佐剂活性的LPS为WO 00/26384中记载的LPS，并且为具有如下脂质A的LPS，与相应的未修饰的LPS分子相比，所述脂质A的每LPS分子的仲(secondary)酰基链数量减少，并且所述脂质A在葡糖胺二糖的还原端具有至少一个连接至伯(primary)酰基链的仲酰基链；所述脂质A优选具有与未修饰的LPS分子相同数量的伯酰基链，和/或所述脂质A在葡糖胺二糖还原端的葡糖胺2位的伯酰基链上具有仲酰基链，和/或所述LPS为如下LPS，其中所述仲酰基链为月桂酰基链，和/或所述脂质A具有结合至还原端磷酸酯基团的磷酸乙醇胺，和/或所述脂质A具有以下分子结构：

在本文中，静止生长期定义为在培养中，由于营养物耗竭和/或毒性产物蓄积，生长速率降低的阶段。例如当细菌开始耗尽之前可得的特定营养源时到达该阶段。静止生长期优选为在培养中，细菌生长速率与细菌死亡速率接近或相等的时期。细菌生长速率优选降低至低于0.1。细菌生长速率更优选从约0.3-0.5变化至低于0.1，甚至更优选从约0.40±0.10h^-1(指数生长)变化至0.00±0.10h^-1(静止生长)。静止生长期的开始可由本领域技术人员通过任意可用的手段测定，包括但不限于通过适时测量光密度或测量干重，或者通过测量如碳源(例如葡萄糖)、氮源(例如氨基酸或铵)的营养物的耗竭，或者通过监测氧消耗或CO₂产生来监测细菌生长。

静止生长期的开始优选通过测定最大氧消耗速率和最大CO₂产生速率中的至少一个来定义。因此优选地，至少在培养步骤期间，连续监测最大氧消耗速率和最大CO₂产生速率中的至少一个。

静止期的开始可被动地引发，如在分批培养中，当营养物开始耗竭时被动地引发。静止期的开始可主动地引发，如在分批补料培养中通过在补料中缺失营养物、通过pH变化，或者通过停止或减少补料或氧供应来主动地引发。静止期开始后，优选将细菌保持在与静止期开始时存在的相同培养条件(如温度、氧浓度、搅拌、pH等)下。优选地，如在本文中之前说明的静止生长期开始后至少1小时的时间点后，将细菌或包含细菌的培养物冷却至低于约20℃的温度，更优选地低于约15℃、10℃、8℃、6℃，更优选地5℃、4℃、3℃、2℃，或低于约1℃。当冷却后，可将细菌或包含细菌的培养物在如上述定义的低于20℃的温度下储存。可将细菌在低于-20℃，更优选低于-80℃、-135℃或低于-150℃下储存；然而，优选地不将细菌或包含细菌的培养物冷却至会导致(部分)培养物或细菌冻结的温度(如低于0℃的温度)，因为这可能引发细菌的溶胞作用。

如在本文中之前说明的静止生长期开始后至少1小时的时间点后，将获得的细菌在包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基中孵育，以提取OMV。所述金属螯合剂可为本领域技术人员已知的任意金属螯合剂。所述金属螯合剂优选为选自聚氨基羧酸，如次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、1，2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)中的一种或至少一种。所述金属螯合剂优选为EDTA。所述孵育可以任意规模进行。本发明包括将来自数种不同培养物的细菌在包含金属螯合剂(优选为EDTA)的单一培养基中孵育，以提取OMV。孵育的体积优选至少为约10L，更优选至少约20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10,000L、20,000L或40,000L。所述细菌可通过本领域技术人员已知的任意手段与包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基接触。例如可将所述细菌通过离心法与培养基分离，然后与包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基接触，例如通过在包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基中再悬浮来接触。所述培养基优选逐步用包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基替代。在培养物中获得的细菌优选首先通过微孔过滤来浓缩。所述培养物的体积优选减少2倍，更优选3倍、更优选4倍、更优选5倍、更优选6倍、更优选7倍、更优选9倍、更优选10倍。然后将浓缩的细菌悬浮液渗滤(diafiltrated)。所述培养基优选逐步用pH对于提取适合的缓冲液替代。在本文中，渗滤定义为恒定体积的微孔过滤，其中将包含所关注化合物的第一培养基通过连续透析用第二培养基替代，以使渗滤后所关注的化合物存在于所述第二培养基中。这样，从而将培养基的介质逐步用其它适合的介质替代，所述其它合适的介质优选为100mM Tris-HCl pH8.6。浓缩和渗滤可同时或接连进行。当同时进行时，所述第二培养基为具有对于提取适合的pH，并且包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基，或者为具有适合pH的培养基缓冲液，渗滤后直接向其加入适合量的金属螯合剂(优选为EDTA)；所述第二培养基优选包含如Tris-HCl的缓冲剂，其浓度为约10mM-250mM，pH高于约pH7.5，优选如以下所定义，向其加入约1mM-100mM的金属螯合剂(优选为EDTA)。将渗滤优选进行至第一培养基完全被第二培养基替代；该过程可能花费至少1小时-4小时，或者更长。渗滤可使用本领域技术人员已知的任意适合的膜来进行。优选使用孔径为0.2微米的中空纤维元件。

所述包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基可为适合用于OMV提取的任意培养基。所述培养基优选不包含去污剂。所述培养基优选包含金属螯合剂，优选为EDTA，其还优选包含缓冲剂或者多种缓冲剂的混合物；缓冲剂的实例为但不限于Tris和磷酸盐。优选的培养基为100mM Tris-HCl；pH8.6，具有10mM EDTA。

所述包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基优选具有一定浓度的金属螯合剂，优选为约1-100mM的EDTA。所述浓度优选为约1-50mM，更优选为约1-25mM、2-25mM、3-25mM、4-25mM、5-25mM或5-20mM，并且最优选为约5-15mM，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15mM。所述金属螯合剂优选为在本文中之前定义的一种，所述金属螯合剂更优选为EDTA。优选地，在细菌和培养基接触后，所述培养基具有金属螯合剂(优选为EDTA)优选的浓度值。可调节所述培养基的金属螯合剂(优选为EDTA)的浓度。可在细菌与培养基接触期间或者细菌在培养基中孵育期间的任意时间进行调节，并且可进行不止一次调节，并且可连续地和/或自动地进行调节。本领域技术人员知道如何调节培养基的金属螯合剂的浓度，例如通过测量所述金属螯合剂的浓度，以及通过加入适量的固体或者溶液形式的金属螯合剂来调节。当所述金属螯合剂为EDTA时，所述EDTA可为任意形式，例如本领域技术人员已知的酸或EDTA盐中的一种，或者数种形式的EDTA的混合物。

所述包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基的pH优选高于约pH7.5。所述包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基的pH优选高于约pH7.6、pH7.7、pH7.8、pH7.9、pH8.0、pH8.1、pH8.2、pH8.3、pH8.4、pH8.5、pH8.6、pH8.7、pH8.9、pH9.0、pH9.1、pH9.2、pH9.3、pH9.4或pH9.5。所述培养基的pH更优选为约pH7.5-pH9.5、更优选约pH8.0-pH9.0、更优选约pH8.2-pH8.8、更优选约pH8.4-pH8.7。所述包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基的pH最优选为约pH8.6。在细菌与包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基接触后，pH优选为优选的值。可调节包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基的pH。可在细菌与培养基接触期间或者细菌在培养基中孵育期间的任意时间进行调节，并且可进行不止一次调节，并且可连续地和/或自动地进行调节。本领域技术人员知道如何调节培养基的pH，例如通过测量pH，并且向包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基中加入适合的酸或碱来调节。

用于提取OMV的优选培养基为pH高于约pH7.5，并且其中金属螯合剂(优选为EDTA)的浓度为约5-15mM的培养基；更优选地为pH为约pH8.6，并且所述金属螯合剂(优选为EDTA)的浓度为约5-15mM的培养基；所述培养基优选包含作为缓冲剂的Tris-HCl，例如100mM。

细菌在包含金属螯合剂(优选为EDTA)的培养基中孵育以提取OMV后，至少通过从OMV移除细菌来回收OMV。从OMV移除细菌可通过本领域技术人员已知的任意手段进行。移除方法的实例为但不限于：通过0.5-0.2μm孔径的过滤、离心，或者细菌(自发)沉降的任意其它方法。从OMV移除细菌的优选方法为根据方法的规模，通过分批或连续离心，例如用于至多约100L体积的分批离心，以及用于高于约100L体积的连续离心。

回收后或者与回收同时，可将OMV制剂纯化。纯化可包括本领域技术人员已知的任意方法。优选施用下组中的至少一种方法：如在本文之前描述的超滤和/或渗滤，以交换培养基，例如从提取培养基中移除金属螯合剂，和/或浓缩OMV制剂；降解核酸(如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))，这可使用一种或多种适合的核酸酶(优选使用Benzonase(Merck，荷兰))酶促地进行；通过过滤澄清，优选使用孔径为约0.5μM-1.0μM的滤器；凝胶过滤(例如尺寸排阻色谱法；Sepharose 6 Fast Flow柱填料；OMV从柱子的外水体积回收)；如本文之前描述的无菌过滤。优选至少施用无菌过滤。优选施用多于一种纯化方法。优选连续施用下列方法：超滤(例如100或300kDa截留(cut-off))、渗滤(例如100或300kDa截留)、核酸的酶促降解、澄清、凝胶过滤和无菌过滤，但不一定以这种顺序施用。本发明优选的方法不包括超速离心。

使用核酸酶(benzonase)的核酸降解优选在pH8.4+/-0.4，包含约0.1-10U核酸酶/ml以及约1-10mM Mg²⁺的缓冲液中，于4℃-37℃下进行，持续1-20小时。

优选地，在本发明的任意方法中，革兰氏阴性细菌群落包括以下物种：奈瑟球菌属(Neisseria)、博德特菌属(Bordetella)、嗜血菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)或巴斯德菌属(Pasteurella)；更优选为以下物种：奈瑟球菌属或博德特菌属；甚至更优选地，革兰氏阴性细菌群落包括乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrheae)、脑膜炎奈瑟球菌、百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)或多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；甚至更优选为脑膜炎奈瑟球菌，优选为血清群B脑膜炎奈瑟球菌或百日咳博德特菌。

革兰氏阴性细菌群落优选包括具有一个或多个突变的革兰氏阴性细菌，所述突变减少或敲除基因产物的表达。所述基因产物优选选自cps、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、exbB、exbD、frpB、galE、htrB、msbB、lpbB、lpxK、lpxL1、nmb0033、opA、opC、rmpM、phoP、pilC、pmrE、pmrF、porA、porB、siaA、siaB、siaC、said、synA、synB、sync、tbpA和tbpB，或其同源物；在WO02/09746中总结了许多这些突变。所述基因产物优选选自cps，包括lpxL1、rmpM、porA、porB和opA的脂质A生物合成基因产物。所述革兰氏阴性细菌优选至少具有减少或敲除lpxL1表达的突变，优选如在WO 00/26384中所记载。所述革兰氏阴性细菌优选至少具有减少或敲除lpxL1和rmpM表达的突变。lpxL1优选具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少约30％的序列相同性，更优选至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。最优选地，lpxL1与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相同。

rpmM优选具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少约30％的序列相同性，更优选至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。最优选地，rpmM与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同。

所述革兰氏阴性细菌优选为脑膜炎奈瑟球菌菌株，其为脑膜炎奈瑟球菌血清群B隔离群H44/76的复制物或衍生物[Holten等人，1979；van den Dobbelsteen等人，2007]。

要理解，本发明包括本发明任意菌株的复制物和/或衍生物。术语“复制物”是指表示物质本质上未修饰的复制品的生物物质，如通过微生物生长(例如微生物在培养基中生长)产生的物质。术语“衍生物”是指从生物物质创造的物质，并且其本质上修饰为具有新的性质，例如由遗传物质中可遗传的变化导致的新性质。这些变化可以是自发地发生，或者为施用化学剂和/或物理因子(例如诱变因子)和/或通过本领域已知的重组DNA技术的结果。当称菌株“衍生”自另一菌株时，要理解这既包括那个菌株的“复制物”，也包括该菌株的“衍生物”，只要所述衍生菌株可用于引发针对本发明的方法中使用的革兰氏阴性细菌(如脑膜炎奈瑟球菌)的免疫应答。

本文中的相同性的百分比优选通过计算序列中相同的核苷酸/氨基酸的数目除以总核苷酸/氨基酸的长度减去任意裂隙(gap)的长度的比率来测定。在本文中，使用本领域技术人员可用的任意适合的序列比对软件包进行DNA多重序列比对。表现30％或更高相同性水平的相关氨基酸序列的最小长度应优选为约40个氨基酸，更优选约50、70、100、150、170、200、210、220、230、240或更多个氨基酸，并且在lpxL1的情况中，更优选约50、70、100、150、170、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、295或更多个氨基酸。优选地，序列相同性在SEQ ID NO：1或2的整个序列上计算。

在本文中，表达会被理解为包括在产生多肽中涉及的任意步骤，包括但不限于翻译、翻译后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

为了如本文之前所定义的减少或敲除基因产物的表达，本领域技术人员有很多熟知的工具可用。对于本领域技术人员而言，为了减少或敲除功能基因产物的表达，选择适合的策略以在多核苷酸中引入适合的修饰是常规操作。例如，体外诱变的方法在Sambrook等人(Molecular cloning，A laboratory Manual，2^nd ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，USA，1989)中记载。相应的方法也以试剂盒(例如Stratagene，La Jolla，USA的Quikchange定点诱变试剂盒)的形式市售可得。多核苷酸的缺失例如可通过技术人员熟知的基因替代技术实现。

所述革兰氏阴性细菌群落优选包含多种革兰氏阴性细菌，以表达多种抗原血清型，并且最终进入OMV制剂中。更优选地，一种革兰氏阴性细菌表达多种抗原血清型。当细菌群落包含脑膜炎奈瑟球菌时，该群落优选包含表达多种porA抗原血清型的脑膜炎奈瑟球菌；更优选地，细菌群落包含多种脑膜炎奈瑟球菌，每种表达多种porA抗原血清型。所述革兰氏阴性细菌群落优选包含三种三价PorA脑膜炎奈瑟球菌菌株，其总共表达9种PorA亚型[van der Ley等人，1995；Claassen等人，1996；van den Dobbelsteen等人，2007]。

所述革兰氏阴性细菌(其优选为脑膜炎奈瑟球菌血清群B隔离群H44/76的复制物或衍生物的脑膜炎奈瑟球菌菌株)可表达对所述革兰氏阴性细菌而言外来的抗原。根据本发明从所述革兰氏阴性细菌制备的OMV会包含所述外来抗原。这样，本发明的OMV可用作具有佐剂活性的载体，并且可方便地用于与所述外来抗原相关的疾病或病症的治疗。所述对革兰氏阴性细菌而言外来的抗原可为任意抗原，并且可为选自下列抗原中的一种或至少一种，所述抗原为NadA蛋白、肝素结合蛋白、Q热表面抗原、衣原体属(Chlamydia)抗原、百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素、92kDa抗原、tim2、tim3、皮肤坏死毒素、因子H结合蛋白、脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135或Y的多糖、衣原体属表面抗原、白喉类毒素、减毒或灭活脊髓灰质炎病毒、破伤风类毒素、流感嗜血菌b(Haemophilus influenzae b)多糖或与其中可能涉及自身免疫反应的疾病(例如阿尔茨海默病)相关的自身抗原，以及肿瘤抗原。

可通过本领域技术人员已知的任意手段表达所述外来抗原；所述外来抗原优选靶向至OMV。所述外来抗原或其部分优选融合至或包含于脑膜炎奈瑟球菌血清群B porA或其部分中。

在本发明的范围内，可培养或者提供数种革兰氏阴性细菌，每种表达单一或多种抗原血清型，并且可同时从一种或多种所述细菌的合并群落提取OMV。单独从细菌群落提取OMV，然后优选地将OMV的制剂合并也在本发明的范围内。将不同种的革兰氏阴性细菌在单个的，混合的群落中共同培养，或者单独地在单个群落中培养，或者甚至以单个的和混合的群落的组合培养还在本发明的范围内。

通过本发明的任意方法获得的OMV制剂可方便地储存(以冻干的形式或在溶液中，或者在溶液中冻结)，供以后使用。在本发明的任意方法中，可向所述OMV制剂加入一种或数种化合物，如(胶体)稳定剂(例如蔗糖)和/或防腐剂(如硫柳汞)，前者用于防止聚集，而后者用于防止微生物生长。

可将通过本发明的任意方法获得的OMV制剂方便地用于制备药剂，优选治疗脑膜炎的药剂，所述药剂优选为针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。因此，本发明的任意方法还可包括将OMV与药学可接受的赋形剂组合的步骤，所述赋形剂如载体、佐剂、稳定剂、渗透剂、缓冲剂和/或分散剂。此外，在本发明的任意方法中，可将OMV与另外的抗原组合，以制备混合疫苗，优选与包含来自脑膜炎奈瑟球菌血清群B或来自其它革兰氏阴性病原体的外膜蛋白的抗原组合，所述抗原包括但不限于NadA蛋白、肝素结合蛋白、Q热表面抗原、百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素、92kDa抗原、tim2、tim3、皮肤坏死毒素、因子H结合蛋白、优选缀合至适合的药学可接受的载体蛋白的脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135或Y的多糖、衣原体属表面抗原、白喉类毒素、减毒或灭活脊髓灰质炎病毒、破伤风类毒素、优选缀合至适合的药学可接受的载体蛋白的流感嗜血菌b多糖。

为了针对病原体的预防性保护或致病性感染后的疾病治疗而施用疫苗接种。

在本文中，佐剂定义为包括任意如下物质或化合物，当其与抗原联合用于使个体(优选哺乳动物，优选人)免疫时，刺激免疫系统，从而诱发、增强或促进针对所述抗原的免疫应答，优选地不产生对于佐剂自身的特异性免疫应答。当与在相同条件下，但无佐剂存在下针对给定抗原产生的免疫应答相比，优选的佐剂使针对所述抗原的免疫应答增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。本领域中有可用的试验，用于测定在一组动物或人中，通过佐剂产生的针对给定抗原的免疫应答比相应的对照组的统计平均增强。所述佐剂优选能够增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。

所述药学载体可为适合向个体递送活性成分的任意相容的、无毒性物质。用于鼻内递送的药学可接受的载体的实例是水、缓冲盐水溶液、甘油、聚山梨酯20、聚氧乙烯蓖麻油以及辛酸甘油酯/癸酸甘油酯的水性混合物，并且其可为缓冲的，以提供中性pH环境。用于非消化道递送的药学可接受的载体的实例是无菌缓冲的0.9％NaCl或任选地补充有20％白蛋白的5％葡萄糖。用于非消化道给药的制剂必须是无菌的。活性成分的非消化道给药途径与已知方法相一致，如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或病灶内(intralesional)途径的注射或输注。本发明的组合物优选通过弹丸注射(bolusinjection)给药。对于口服给药，活性成分可以液体剂型(如酏剂、糖浆剂和混悬剂)给药。用于口服给药的液体剂型可包含着色剂和调味剂，以提高患者的接受度。用于制备可非消化道、口服或鼻内给药的组合物的方法是本领域中熟知的，并且在多种来源中更详细地记载，包括例如Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(为了所有目的，以其整体援引加入本文)。

在第二方面中，本发明提供可通过本发明第一方面的任意一种方法获得的OMV。优选地，所述OMV为本发明第一方面的任意一种方法的直接衍生产物。

可将可通过本发明的任意方法获得的OMV制剂方便地用于药剂的制备，优选治疗脑膜炎的药剂，所述药剂优选为针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。所述OMV制剂优选为本发明第一方面的任意一种方法的直接衍生产物。因此，本发明提供包含可通过本发明的任意方法获得的OMV和药学可接受的赋形剂的药物组合物，所述药学可接受的赋形剂例如在本文之前描述的载体、佐剂、稳定剂、渗透剂、缓冲剂和/或分散剂。所述OMV优选为本发明第一方面的任意一种方法的直接衍生产物。由于本发明提供自身包括佐剂活性的OMV，优选的药物组合物不包含除所述包括佐剂活性的OMV之外的其它佐剂。

所述药物组合物可用作疫苗。该疫苗可用于免疫(提高免疫应答)或者个体的免疫接种，所述个体优选为哺乳动物，优选为人。在所述药物组合物中，所述OMV可与其它抗原组合，以制备混合疫苗，即与针对脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135、Y、肺炎球菌病、白喉、百日咳、脊髓灰质炎或破伤风的疫苗组合。

本发明还提供优选地在脑膜炎的治疗中，作为药剂使用的，可通过本发明的任意方法获得的OMV。所述药剂优选为针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。所述OMV优选为本发明第一方面的任意一种方法的直接衍生产物。

本发明还提供可通过本发明的任意方法获得的OMV在制备药剂中的用途，所述药剂优选用于脑膜炎的治疗。所述药剂优选为针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。所述OMV优选为本发明第一方面的任意一种方法的直接衍生产物。

本发明还提供在个体中诱发免疫反应的方法，所述免疫反应优选针对脑膜炎奈瑟球菌，所述方法包括向所述个体给药可通过本发明的任意方法获得的OMV，或者向所述个体给药本发明的药物组合物，其优选为针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。所述OMV优选为本发明第一方面的任意一种方法的直接衍生产物。

本发明还提供本发明的OMV或者本发明的药物组合物在个体中诱发免疫反应的用途，所述免疫反应优选针对脑膜炎奈瑟球菌，所述用途包括向所述个体给药本发明的OMV，或者本发明的药物组合物。

在本文件及其权利要求中，动词“包含/包括”及其词形变化形式以其开放含义使用，意指包含该词语后的条目，但是不排除未具体提到的条目。此外，用不定冠词“a”或“an”指代的元素不排除存在多于一个该元素的可能，除非上下文中明确要求该元素有且仅有一个。因此，不定冠词“a”或“an”通常意指“至少一个”。当词语“约”或“大约”与数值联合使用时(如约10)，其优选意指该值可为所给值(10)多或少0.1％的值。

在本文中提供的序列信息不应被如此狭义地解释以至于要求包含错误识别的碱基。技术人员能够识别这样错误识别的碱基，并且知道如何校正这样的错误。在序列错误的情况中，可通过在包含编码多肽的核酸序列的脑膜炎奈瑟球菌血清群B隔离群H44/76中存在的基因的表达获得的多肽序列应该占优势。

在本说明书中引用的所有专利和参考文献以其整体援引加入本文。

下列实施例进一步描述本发明，其不应解释为限制本发明的范围。

除非另外陈述，本发明的实施会应用分子生物学、病毒学、微生物学或生物化学的标准常规方法。这样的技术在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual(2^nd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press中；在Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中；在Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷中；以及在Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition，Academic Press(UK)的第I和II卷中；在Oligonucleotide Synthesis(N.Gait editor)中；在Nucleic AcidHybridization(Hames和Higgins，eds.)中记载。

附图说明

图1.来自三种不同的三价RL NonaMen菌株的三价散装OMV的代表性PorA含量，所述菌株与HP NonaMen菌株表达相同的9种PorA亚型[van den Dobbelsteen等人，2007]，但是另外缺失rmpM和lpxL1基因。所描述的为分别来自菌株RL16215、RL10124和RL1416的三价散装OMV，其包含大约41kDa的PorA。RL NonaMen三价散装OMV的代表性PorA含量为总蛋白含量的60-80％。

图2.在兔子中，RL NonaMen疫苗在2种不同剂量(7.5和15μg/PorA)，带有或不带有AlPO4佐剂下的功能免疫原性。在D＝0时取免疫接种前血清，在三次免疫接种后取免疫接种后血清。在D＝43时，三种疫苗全部产生比D＝0时显著更高的杀菌滴度，但未观察到显著的剂量或佐剂相关作用。这表明RL 7.5μg/PorA包含足够的抗原，并且当疫苗是用本文中描述的方法制备时，不需要使用佐剂。

序列

表1.在序列表中说明的序列

SEQ ID NO：	SEQ类型	基因产物
			1	多肽	脑膜炎奈瑟球菌lpxL1

2

多肽

脑膜炎奈瑟球菌rpmM

实施例

实施例1：针对脑膜炎奈瑟球菌血清型B的九价OMV疫苗的收率和纯度提高的、可规模化的制备

下列实施例用40L生产培养物进行，但是完全可规模化至至少800L。

将三种不同的脑膜炎奈瑟球菌血清群B菌株作为主种子批(master seed lot)在-135℃下储存，其源自菌株H44/76[Fredriksen等人1991]，另外缺失cps、porB、rmpM和lpxL1基因[Van de Waterbeemd等人2010]，并且各自表达3种独特的PorA亚型[Van denDobbelsteen等人2007]，即：

对于菌株RL16.2.15为P1.7，16/P1.5-1，2-2/P1.19，15-1，

对于菌株RL10.12.4为P1.5-2，10/P12-1，13/P1.7-2，4，并且

对于菌株RL14.1.6为P1.22，14/P1.7-1，1/P1.18-1，3，6。

将主种子批解冻，并在摇瓶中用150mL化学限定培养基扩大培养(expand)[Baart等人2007]，在指数生长期间分为等分部分，并且加入甘油，然后在-135℃下储存，以得到工作种子批(working seed lot)。

将带有化学限定生长培养基(Baart等人，2007)的原代预培养物摇瓶用冻结的工作种子批接种，以对于每个生产批次提供相同的起始点。在指数生长期间，在生物反应器中，将全部的原代预培养物用于接种在3L化学限定生长培养基(Baart等人，2007)中生长的第二代预培养物。在第二代预培养物生长期间，在可变的搅拌速度以及向顶部气流加入纯氧下，将温度控制为35℃，并将溶解氧浓度控制在30％。在指数生长期间，将1L来自第二代预培养物的生物质(biomass)转移至40L化学限定生长培养基(Baart等人，2007)。生产培养物在温度控制在35℃、pH控制为7.2、具有磷酸和消泡剂的生物反应器中生长。在可变的搅拌速度和可变的喷射气流(sparger airflow)相结合下，将溶解氧浓度控制为30％。

通过周期性OD测量来测定静止生长期的开始。静止生长3小时，随后通过将其转移入搅拌罐来收获全部40L生产培养物，以确保OMV收率和由细菌溶胞作用导致的DNA释放之间的最佳平衡。首先将收获的生产培养物冷却至20℃，然后使用中空纤维元件(0.2μm孔径)的微孔过滤，将体积从40L减少至6L。将浓缩的收获物用2体积(12L)的pH8.6的100mM Tris-HCl缓冲液渗滤，以将生物质的pH调节至pH8.4±0.4。加入100mM EDTA浓溶液至10mM的终浓度，以开始OMV的提取，然后将其在以100rpm搅拌的罐中，在20℃下孵育30分钟。通过半高速的平行批次离心(6个1L的桶(bucket)；30分钟；4℃；20.000xg)，将生物质从OMV提取物分离；保留上清液。如果期望，对于工业规模生产，分批离心可用连续离心替代。将上清液合并，并且通过用孔径从初始的0.5μm缩窄为0.2μm的最终孔径的元件的深度过滤，移除任意残留的病原体或其它颗粒。

将无病原体的OMV提取物在4℃下储存数周，或者在下游处理中直接使用。首先使用100kDa截留的超滤，将体积减少12倍至0.5L，然后用2体积(1L)pH8.6的100mM Tris-HCl缓冲液渗滤，以移除EDTA。使用1000U/L(终浓度)的Benzonase(Merck)，在Mg²⁺辅因子的存在下(在21℃下孵育18小时)，将在粗OMV中存在的任意基因组DNA消化为小于1000bp的片段。将在Benzonase处理期间形成的任意沉淀用澄清过滤器(clarification filter，1.2-0.5μm)移除，然后在凝胶过滤柱上纯化粗OMV，所述凝胶过滤柱装有Sepharose 6 Fast Flow填料(GE Healthcare)，以从OMV移除DNA和小分子，并且使缓冲液变为储存缓冲液(10mMTris-HCl pH7.4，3％(w/v)蔗糖)。然后将三价散装OMV通过用0.2μm孔径的元件过滤灭菌，并且稀释为含储存缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.4，3％(w/v)蔗糖)的1mg/mL的三价PorA。在该浓度下，可将散装OMV在4℃下安全储存至少6个月，且不损失质量(表2)。

通过在静止生长期开始后3小时时收获生产培养物，并且在pH8.6下进行OMV提取，获得的收率提高为2.7倍，并且如果收获延迟至静止生长开始后9小时时，并且为了提高DNA移除能力进行方法修改(即通过使用10000U/L Benzonase)，甚至可以提高至6.3倍(表3)。如上所述的方法的总收率为每升生产培养物30±4mg三价PorA(1338人的每种PorA亚型7.5μg剂量的等同物)。在33±7％的总下游处理效率下获得该PorA收率。在该计算中包括无菌过滤，并且要强调的是，当与参考方法相比时，所描述的方法产生高的过滤效率和再现性(92％±4％，表4)。所述参考方法或者使用防腐剂[硫柳汞；Fredriksen等人1991和Claasen等人1996]以防止与无菌过滤相关的收率损失，或者包括机械剪切的处理步骤以降低OMV尺寸并提高效率[RIVM 2007 NonaMen：Van den Dobbelsteen等人2007和Zollinger等人2010]。此外，来自上面提到的菌株的三价散装OMV与来自其它菌株和方法[Zollinger等人2010，US6558677(图5)；Fredriksen等人1991]的OMV相比，具有提高的PorA纯度。代表性的三价PorA含量为总蛋白质含量的60-80％(图2)。尽管高LPS含量，但观察到低毒性。这通过使LPS毒性衰减的lpxL1缺失而实现[Van de Waterbeemd等人2010]。

将来自之前列出的三种菌株的三价散装OMV按比例混合，以制备九价散装OMV，并且用储存缓冲液连续稀释至终浓度为0.135mg/mL的九价PorA(每剂量每种PorA亚型7.5μg；无佐剂)，和0.270mg/mL的九价PorA(每剂量每种PorA亚型15μg；有或无AlPO₄佐剂)。将三种不同的疫苗再分为0.5mL等分部分，并且在4℃下储存，直到在第1、15和29天对兔子非消化道给药。

在D＝43时，所有OMV疫苗产生比D＝0时显著更高的杀菌滴度，但未观察到显著的剂量或佐剂相关作用。这表明RL 7.5μg/PorA包含足够的抗原，并且当疫苗是用本发明的方法制备时，不需要使用佐剂。此外如由针对ΔporA菌株HI5高的杀菌滴度所表明(图2)，所述OMV疫苗基于除单独PorA的其它抗原而引发交叉保护。

表4：三个连续散装OMV批次的无菌过滤效率。观察到少量损失(＜10％)，这主要由无菌滤器的死体积导致。

测量	批次1	批次2	批次3	平均值
					无菌过滤前的三价PorA收率(mg)	1553	1404	1308	1422±124
无菌过滤后的三价PorA收率(mg)	1420	1229	1257	1302±103
					无菌过滤效率(％)	91％	88％	96％	92±4％

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Claims

1.无去污剂制备在疫苗中使用的细菌外膜泡囊(OMV)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养革兰氏阴性细菌群落至静止生长期；

b)在静止生长期开始后1-9小时的时间点，在调节至或具有高于pH 8.0的pH、浓度为1-50mM的金属螯合剂的培养基中，孵育在a)中获得的细菌，以提取OMV，其中所述金属螯合剂为NTA、DTPA、EGTA、BAPTA和EDTA中的至少一种；以及

c)回收在b)中提取的OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV移除所述细菌；

其中所述革兰氏阴性细菌具有基因修饰，所述基因修饰导致所述细菌产生毒性降低的LPS，但是所述LPS保留至少部分它的佐剂活性。

2.权利要求1的方法，其中所述金属螯合剂为EDTA。

3.权利要求1的方法，其中所述基因修饰为降低或敲除一种或多种基因的表达的修饰，所述一种或多种基因选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物，和/或所述基因修饰为引起一种或多种lpxE和/或pagL基因表达的修饰。

4.权利要求1的方法，其中所述时间点为2-5小时。

5.权利要求1的方法，其中步骤c)还包括将所述OMV灭菌。

6.权利要求5的方法，其中将所述OMV通过过滤灭菌来灭菌。

7.权利要求6的方法，其中将所述OMV通过使用具有小于0.3微米小孔的滤器进行过滤灭菌来灭菌。

8.权利要求1的方法，其中在步骤b)中，所述金属螯合剂的浓度为5-15mM，和/或其中所述pH为pH 8.0-pH 9.5。

9.权利要求8的方法，其中所述金属螯合剂为EDTA。

10.权利要求8的方法，其中所述pH为pH 8.0-pH 9.0。

11.权利要求10的方法，其中所述pH为pH 8.2-pH 8.8。

12.权利要求11的方法，其中所述pH为pH 8.4-pH 8.7。

13.权利要求1的方法，其中a)中培养物的体积和/或b)中培养基的体积至少为10L。

14.权利要求13的方法，其中a)中培养物的体积和/或b)中培养基的体积至少为20L。

15.权利要求14的方法，其中a)中培养物的体积和/或b)中培养基的体积为40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10,000L、20,000L或40,000L。

16.权利要求1的方法，其中所述革兰氏阴性细菌为奈瑟球菌属(Neisseria)或博德特菌属(Bordetella)的菌种。

17.权利要求16的方法，其中所述革兰氏阴性细菌为脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)或百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)。

18.权利要求1的方法，其中所述革兰氏阴性细菌具有一种或多种降低或敲除基因产物表达的突变。

19.权利要求18的方法，其中所述基因产物选自cps和脂质A生物合成基因产物。

20.权利要求19的方法，其中所述脂质A生物合成基因产物选自lpxL1、rmpM、porA、porB和opA。

21.权利要求1的方法，其中所述革兰氏阴性细菌表达多种porA亚型。

22.权利要求1的方法，其中所述群落包含多于一种革兰氏阴性细菌的菌株，并且其中每种菌株表达不同的porA亚型。

23.权利要求1的方法，其中所述革兰氏阴性细菌表达对所述革兰氏阴性细菌而言外来的抗原。

24.权利要求1的方法，其还包括将所述OMV与药学可接受的赋形剂组合的步骤。