JP6002763B2 - グラム陰性細菌の外膜小胞を、洗浄剤を含まずに生産するためのプロセス - Google Patents

Description

本発明は、医微生物学及びワクチンの分野に関する。特に、本発明は、ワクチンにおいて用いられるグラム陰性細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）を、洗浄剤を含まずに調製するためのプロセス、前記プロセスにより得ることが可能なＯＭＶ、及びこのようなＯＭＶを含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、特に免疫応答を誘発するための方法において用いられる医薬としての本発明のＯＭＶの使用に関する。

髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）とは、約１５％の致死率で急性髄膜炎及び敗血症を引き起こしうるヒト病原菌である［Ｇｉｒａｒｄら、２００６］。血清群Ｂ髄膜炎は、北米における髄膜炎症例の３０〜４０％を占め［Ｓｈａｒｉｐら、２００６；Ｋａｐｌａｎら、２００６］、一部の欧州諸国では最大８０％を占める［Ｔｒｏｔｔｅｒら、２００７；Ｇｒａｙら、２００６］が、広域にわたり防御的なワクチンは利用可能でない。他の血清群に対して有効なワクチンは、担体タンパク質へとコンジュゲートされた莢膜多糖に基づき、開発されている［Ｓｎａｐｅら、２００８］。この手法は、免疫原性の低さ［Ｍｏｒｌｅｙら、２００１］及びワクチン接種誘導性の自己免疫に対する懸念［Ｆｉｎｎｅら、１９８３］のために、血清群Ｂに対しては実現可能ではなかった。今日まで、外膜小胞（ＯＭＶ）に基づくワクチンは、血清群Ｂの流行を制御するのに成功した唯一のワクチンであり、ノルウェー、キューバ、及びニュージーランドにおける例がある［Ｂｊｕｎｅら、１９９１；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、２００６；Ｍａｒｔｉｎら、１９９８；Ｓｉｅｒｒａら、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら、１９９１］。

ＯＭＶは、グラム陰性細菌の外膜から放出され、外膜タンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びペリプラズム成分を含有するリン脂質（ＰＬ）二重層からなる［Ｄｅａｔｈｅｒａｇｅら、２００９］。ＰｏｒＡタンパク質は、ＯＭＶ中の主要な防御的抗原として同定されたが、広まる血清群Ｂ株の間で高度に可変的であり、これが、ワクチン開発を複雑にしている［Ｓａｕｋｋｏｎｅｎら、１９８９；Ｍａｒｔｉｎら、２００６］。この理由で、Ｒｉｊｋｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｖｏｌｋｓｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ ｅｎ Ｍｉｌｉｅｕ（ＲＩＶＭ）、すなわち、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、複数のＰｏｒＡ亜型を発現する、遺伝子改変された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に基づき、ＯＭＶワクチンを開発した。この多価ＯＭＶワクチンは当初、合計６つのＰｏｒＡ亜型を発現する、２つの三価ＰｏｒＡ株により作製され［ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙら、１９９５；Ｃｌａａｓｓｅｎら、１９９６］、第ＩＩ相臨床試験で機能的な免疫原性をもたらした。世界中に広まる血清群Ｂ株に対する十分な対応を確保するために、第３の三価株が付加された［ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎら、２００７］。

ＯＭＶワクチンは従来、ＬＰＳを除去し、小胞放出を増大させる洗浄剤抽出（ｄＯＭＶ精製プロセス）により調製される。髄膜炎菌のＬＰＳは、毒性が高いが、小胞構造を維持し、ＰｏｒＡに対する免疫応答を補助するには、剰余量（約１％）が必要である［Ａｒｉｇｉｔａら、２００５；Ａｒｉｇｉｔａら、２００３；Ｓｔｅｅｇｈｓら、２００４］。洗浄剤濃度を考慮することでｄＯＭＶ精製プロセスはこれらの要件を満たすが、大きな欠点もある。洗浄剤は、ＬＰＳと共にＰＬも除去し、また、因子Ｈ結合タンパク質など、免疫原性に寄与するリポタンパク質も除去する［Ｋｏｅｂｅｒｌｉｎｇら、２００９；Ｋｏｅｂｅｒｌｉｎｇら、２００８］。結果として得られる免疫応答は、交差防御を誘発せずに、特定のＰｏｒＡ亜型を指向する［Ｍｏｒｌｅｙら、２００１；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔら、１９９６］。加えて、ＬＰＳ及びＰＬの選択的な除去は、天然の小胞構造を変化させ、凝集を促進する［Ｈｏｌｓｔら、２００９；Ｃａｍｅｔｔｉら、２００８］。洗浄剤処理は、ＬＰＳの毒性を減少させるのには必要であるが、ワクチン開発を複雑にする有害な副作用を有する。

洗浄剤を含まないＯＭＶの精製プロセスは、全てのＬＰＳを保持し、天然の小胞構造の保存だけでなく、また、非経口の免疫化に用いられると、固有に毒性なワクチンも結果としてもたらす［Ｈｏｌｓｔら、２００９］。洗浄剤を含まない２つの精製プロセスが記載されている。天然のＯＭＶ（ｎＯＭＶ）によるプロセス［Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９７９；ＵＳ６，５５８，６７７］は、ｄＯＭＶと同様のステップを含むが、洗浄剤を含まない抽出ステップを伴い、上清ＯＭＶ（ｓＯＭＶ）プロセス［Ｐｏｓｔら、２００５；Ｄｅｖｏｅら、１９７３；Ｈｏｅｋｓｔｒａら、１９７６］では、抽出せずに、限外濾過又は超遠心分離を使用して、培養物上清から自発的に放出されるＯＭＶを精製する。ｎＯＭＶワクチンは、動物及びヒトにおいて有望な結果をもたらしたが、ＬＰＳ含量が高いために、ワクチンの鼻腔内投与への適用可能性が制限された［Ｇｕｔｈｒｉｅら、２００４；Ｋａｔｉａｌら、２００２；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、１９９９；Ｄｒａｂｉｃｋら、１９９９］。ｓＯＭＶワクチンについての前臨床データは、マウスにおける単一の研究であって、ｄＯＭＶについては見いだされなかった血清群Ｂ株のパネルに対する交差防御について報告する研究に限定されており、毒性及び安定性の潜在的な差違については扱われなかった［Ｆｅｒｒａｒｉら、２００６］。ｓＯＭＶプロセスは、実現可能なプロセス開発のためにはそのＯＭＶ収率が低過ぎるので、さらなる難題を課する［Ｐｏｓｔら、２００５；Ｄｅｖｏｅら、１９７３］。

ＲＩＶＭ ＢｉｌｔｈｏｖｅｎにおけるｌｐｘＬ１突然変異株の発見［ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙら、２００１］は、ＬＰＳの毒性問題に対する解決策をもたらした。ｌｐｘＬ１の欠失は、免疫応答に必要とされるアジュバント活性を保存しながら、ＬＰＳの毒性を弱毒化する［Ｋｏｅｂｅｒｌｉｎｇら、２００８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙら、２００１；Ｆｉｓｓｅｈａら、２００５；ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら、２０１０］。

しかし、ｎＯＭＶ／ｓＯＭＶの臨床試験又はＧＭＰに準拠する製造のためには、頑健で規模拡大可能な生産プロセスが要請されており、そこでは、高収率のためにはＥＤＴＡ抽出ステップが必要とされるが、これは、細菌の溶解など、現在のところは望ましくない効果を引き起こしている［Ｐｒａｃｈａｙａｓｉｔｔｉｋｕｌら、２０１０］。溶解により引き起こされるＤＮＡの放出は、超遠心分離などの除去プロセスだけでは容量が限定されるので、大規模生産にとっての問題である。

したがって、ｓＯＭＶ及びｎＯＭＶを調製するのに現在利用可能なプロセスは、低収率及び／又は低純度に悩まされており、及び／又は研究室規模に限定されており、細菌のＯＭＶを調製するプロセスの改善、特に、業務用規模におけるプロセスが必要とされている。

驚くべきことに、ＯＭＶを、任意の規模で実施しうるプロセスにおいて、洗浄剤を含まずに、高収率及び高純度で調製しうることが今や実証された。

したがって、第１の態様では、本発明は、ワクチンにおいて用いられる細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）を、洗浄剤を含まずに調製するためのプロセスであって、
ａ）グラム陰性細菌の集団を、定常増殖期まで培養するステップと、
ｂ）定常増殖期の開始後少なくとも約１時間の時点で、ａ）において得られた細菌を、ｐＨが約ｐＨ７．５を超えるか若しくはｐＨ８．０を超えるように調整されるか、又は約ｐＨ７．５を超えるか若しくはｐＨ８．０を超え、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度が約１から１００ｍＭの間となるように調整されるか又は約１から１００ｍＭの間である培地中でインキュベートして、ＯＭＶを抽出するステップと、
ｃ）ｂ）において抽出されたＯＭＶを回収するステップであって、回収が、ＯＭＶからの細菌の除去を少なくとも含むステップと
を含むプロセスを提供する。

定常期の開始後約１時間の時点は、１から９時間の間の時点であることが好ましく、１から８時間、１から７時間、１から６時間、２から５時間、２から４時間、２から３．５時間、又は２．５から３．５時間の間であることがより好ましい。

本発明に従うプロセスのうちのいずれかでは、ＯＭＶを、好ましくは濾過滅菌により、好ましくは小孔が約０．３マイクロメートル未満のフィルターを用いて滅菌することが好ましい。滅菌は、ステップｃ）の間に実施することが好ましく、収率の低下は、本発明に従うステップｂ）を実施することにより、大幅に減少する。濾過滅菌はまた、滅菌濾過とも称し、本明細書では、対象の化合物を含む濾過物が微生物を含まないか、又は濾過物中の微生物の量が許容可能な低レベルまで低減されるように、好ましくは小孔が約０．５から０．２マイクロメートルの間のフィルターを介して対象の化合物を濾過することとして定義する。

本明細書では、「洗浄剤を含まない」という用語が、本発明に従うプロセスのうちのいずれの抽出ステップにおいても、洗浄剤を添加及び／又は使用しないこととして好ましくは定義され、本発明に従うプロセスのうちのいずれにおいても、洗浄剤を全く添加及び／又は使用しないことがより好ましい。洗浄剤を、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の消泡剤（型番：Ａ６４２６、Ａ５６３３、Ａ５７５７、Ａ８０１１、又はＡ５７５８）、又は他の製造業者の同等の機能を伴う分子などの消泡剤の形態の加工補助物質として、集団を培養するときに用いる場合、これは、本発明に従うプロセスの範囲内にあると考えられる。また、本発明に従うプロセス内で用いられる溶液中では、微小量の洗浄剤、例えば、培養のための複合培地中の微量の洗浄剤が固有に存在する可能性があるが、このような固有の存在もまた、本発明に従うプロセスの範囲内にあると考えられる。

本明細書では、洗浄剤が、薬剤、好ましくは、界面活性剤の効能を有し、細菌と接触させるとその細菌からタンパク質を抽出する効能を有する試薬として定義されることが好ましい。洗浄剤は、アニオン性の場合もあり、カチオン性の場合もあり、非イオン性（実質の電荷がゼロであり、また双性イオン性としても知られる）の場合もあり、シュウ酸エチルの場合もある。消泡剤、すなわち、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の消泡剤（型番：Ａ６４２６、Ａ５６３３、Ａ５７５７、Ａ８０１１又はＡ５７５８）など、業務用プロセス液における泡の形成を低減及び阻止する薬剤は、洗浄剤の定義内に入れないことが好ましい。本発明に従うプロセスのうちのいずれかにおけるグラム陰性細菌集団の培養も、当業者に知られている任意の方法により実施することができる。好ましい培養培地は、好ましくはＢａａｒｔら、２００７において記載される培地など、既知組成培地である。温度は、約３０から約４０℃の間など、任意の温度で変化させることができる。ｐＨは、約５．５から８．５のｐＨなど、任意のｐＨで変化させることができる。好ましい培養条件は、約３５℃、ｐＨ７．２で、曝気処理を伴う培養を含む。培養は、前培養又は種培養及び本培養が含まれるがこれらに限定されない複数のステップで実施することができる。培養は、研究室又は業務用発酵槽における振とうフラスコ培養、小規模培養、又は大規模培養（連続培養、バッチ培養、流加培養、又は固体培養を含めた）が含まれるがこれらに限定されない任意の規模で実施することができる。培養物の容量は、好ましくは少なくとも約１０Ｌ、より好ましくは少なくとも約２０Ｌ、４０Ｌ、６０Ｌ、８０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、８００Ｌ、１５００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、又は４０，０００Ｌである。

本明細書では、細菌集団が、属及び種が同じであることが好ましい少なくとも２つの細菌として定義される。

ＯＭＶは、細菌に、毒性が低減されるように修飾されたＬＰＳを産生させる遺伝子改変を有するグラム陰性細菌から調製することが好ましい。グラム陰性細菌は、毒性が低減されたＬＰＳであって、毒性が低減されるように修飾されたＬＰＳ（又はそのリピドＡ部分（ＬＡ））を有することが好ましい。本明細書では、毒性が低減されるように修飾されたＬＰＳを、対応する野生型のＬＰＳの毒性より毒性が低くなるように修飾されたＬＰＳとして理解する。修飾されたＬＰＳの毒性は、対応する野生型のＬＰＳの約９０、８０、６０、４０、２０、１０、５、２、１、０．５、又は０．２％未満であることが好ましい。野生型のＬＰＳ及び毒性が低減された多様な修飾ＬＰＳの毒性は、当技術分野で公知の任意の適切なアッセイにおいて決定することができる。毒性、すなわち、ＬＰＳの生物学的活性を決定するのに好ましいアッセイは、ＭＭ６マクロファージ細胞系におけるＴＮＦ−アルファの誘導についてのＷＥＨＩ試験である［Ｅｓｐｅｖｉｋ及びＮｉｅｓｓｅｎ、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ９５：９９〜１０５；Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋら、１９８８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４１：４５６〜４６１］。

しかし、グラム陰性細菌のＬＰＳ（又はそのＬＡ部分）の毒性が低減されていることは好ましいが、ＬＰＳが、免疫刺激活性、すなわち、アジュバント活性の少なくとも一部を保持することはさらに好ましい。したがって、本発明において用いられる、毒性が低減されたＬＰＳグラム陰性細菌は、対応する野生型のＬＰＳの少なくとも約１０、２０、４０、８０、９０、又は１００％の免疫刺激活性を有することが好ましく、この場合、この免疫刺激活性は、ＷＯ２００５／１０７７９８の例３において記載される通り、樹状細胞（ＤＣ）を、毒性が低減されたＬＰＳを産生するグラム陰性細菌と共培養したときの、少なくとも１つのサイトカインの産生又は少なくとも１つの共刺激性分子の発現を測定することにより決定する。ＤＣにより産生されるサイトカインは、ＩＬ１２、ＩＬ１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ６、及びＩＬ−１βから選択されることが好ましく、ＤＣが発現する共刺激性分子は、ＣＤ４０及びＣＤ８６から選択されることが好ましい。

リピドＡ部分の毒性は低減されているが、アジュバント活性（の一部）は保持するグラム陰性ＬＰＳは、例えば、遺伝子改変されたグラム陰性病原菌から得ることができ、ＷＯ０２／０９７４６において総説されている。遺伝子改変されたグラム陰性病原菌であって、リピドＡ部分の毒性は低減されているが、それらのアジュバント活性（の一部）は保持するＬＰＳを産生するグラム陰性病原菌には、例えば、ｌｐｘＬ１遺伝子及びｌｐｘＬ２遺伝子又はこれらの相同体（以前はｈｔｒＢ及びｍｓｂＢとして知られていた；例えば、ＷＯ００／２６３８４；ＵＳ５，９９７，８８１を参照されたい）、並びにリピドＡ４’−キナーゼをコードするｌｐｘＫ遺伝子又はその相同体（また、以下も参照されたい）から選択される１又は複数の遺伝子の発現を減少させるか、又はノックアウトする１又は複数の遺伝子改変を有するグラム陰性細菌と、ｌｐｘＥ及びｐａｇＬの１又は複数の異種遺伝子の発現をもたらす遺伝子改変を有するグラム陰性細菌とが含まれる。好ましい遺伝子改変は、ｌｐｘＬ１遺伝子及びｌｐｘＬ２遺伝子又はこれらの相同体から選択される１又は複数の遺伝子の発現を減少させるか、又はノックアウトする改変である。リピドＡ部分の毒性が低減されているが、そのアジュバント活性（の一部）を保持する、好ましいＬＰＳは、ＷＯ００／２６３８４において記載されているＬＰＳであり、対応する非修飾ＬＰＳ分子と比較して、ＬＰＳ分子１つ当たりの第２アシル鎖の数が低減され、少なくとも１つの第２アシル鎖がグルコサミン二糖の還元末端において第１アシル鎖へと結合しているリピドＡを伴うＬＰＳであり、前記リピドＡは、非修飾ＬＰＳ分子と同じ数の第１アシル鎖を有し、及び／又は前記リピドＡは、グルコサミン二糖の還元末端におけるグルコサミンの２位における第１アシル鎖上に第２アシル鎖を有し、及び／又は前記ＬＰＳは、第２アシル鎖がラウロイル鎖であるＬＰＳであり、及び／又は前記リピドＡは、還元末端においてホスホエタノールアミンをリン酸基へと接合させており、及び／又は前記リピドＡは、分子構造：

を有することが好ましい。

本明細書では、定常増殖期を、培養における段階であって、栄養物質の枯渇及び／又は毒性生成物の蓄積の結果として増殖速度が緩徐化する段階として定義する。この段階は、例えば、細菌が、以前は利用可能であった特定の栄養物質源を使い尽くし始めるにつれて達せられる。定常増殖期とは、培養における時期であって、細菌の増殖速度が、細菌の死滅速度に近接するか又はこれと同等となる時期であることが好ましい。細菌の増殖速度は、０．１未満まで緩徐化していることが好ましい。細菌の増殖速度は、約０．３〜０．５の間から０．１未満へと変化していることがより好ましく、約０．４０±０．１０時間^−１（指数関数的増殖）から０．００±０．１０時間^−１（定常増殖）へと変化していることがなおより好ましい。定常増殖期の開始は、当業者が、適切な時点において測定された光学密度若しくは乾燥重量で細菌の増殖をモニタリングすること、又はブドウ糖などの炭素供給源、アミノ酸若しくはアンモニウムなどの窒素供給源などの栄養物質の枯渇を測定すること、又は酸素の消費若しくはＣＯ_２の産生をモニタリングすることが含まれるがこれらに限定されない利用可能な任意の手段を介して決定することができる。

定常増殖期の開始は、最大酸素消費速度及び最大ＣＯ_２産生速度のうちの少なくとも１つを決定することにより定義することが好ましい。したがって、最大酸素消費速度及び最大ＣＯ_２産生速度のうちの少なくとも１つを、少なくとも培養ステップの間連続的にモニタリングすることが好ましい。

定常期の開始は、バッチ培養などにおいて栄養物質が枯渇するときに、受動的に誘導されうる。定常期の開始は、栄養物質を流加培養におけるフィードから枯渇させること、ｐＨを変化させること、又はフィード若しくは酸素の供給を停止させるか若しくは低減することなどにより、能動的に誘導することもできる。定常期の開始後、細菌は、温度、酸素濃度、撹拌、ｐＨなど、定常期の開始時に存在する培養条件と同じ培養条件下で維持することが好ましい。本明細書の前出で詳述された定常増殖期の開始後少なくとも１時間の時点より後に、細菌又は細菌を含む培養物を、約２０℃未満、より好ましくは約１５℃、１０℃、８℃、６℃未満、さらに、５℃、４℃、３℃、２℃、又は約１℃未満の温度まで冷却することが好ましい。冷却する場合、細菌又は細菌を含む培養物は、本明細書の上記で定義された通り、２０℃未満の温度で保管することができる。細菌は、−２０℃未満で、より好ましくは−８０℃、−１３５℃未満で、又は−１５０℃未満で保管することができる。しかし、細菌又は細菌を含む培養物は、例えば、０℃未満の温度など、これは、細菌の溶解を誘導しうるので、培養物又は細菌（の一部）の凍結を引き起こす温度までは冷却しないことが好ましい。

本明細書の前出で詳述した定常増殖期の開始後少なくとも１時間の時点より後では、得られた細菌を、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地中でインキュベートして、ＯＭＶを抽出する。金属キレート化剤は、当業者に知られている任意の金属キレート化剤でありうる。金属キレート化剤は、ポリアミノカルボン酸、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択される１つ又は少なくとも１つであることが好ましい。金属キレート化剤は、ＥＤＴＡであることが好ましい。インキュベーションは、任意の規模で実施することができる。本発明は、複数の異なる培養物に由来する細菌を、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む単一の培地中でインキュベートして、ＯＭＶを抽出することを包摂する。好ましくは、インキュベーションの容量は、少なくとも約１０Ｌ、より好ましくは少なくとも約２０Ｌ、４０Ｌ、６０Ｌ、８０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、８００Ｌ、１５００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、又は４０，０００Ｌである。細菌は、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地と、当業者に知られている任意の手段により接触させることができる。細菌は、例えば、培養培地から遠心分離により分離し、次いで、例えば、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地中で再懸濁させることにより、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地と接触させることができる。培養培地を、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地で段階的に置きかえることが好ましい。培養物中で得られる細菌は、精密濾過によりまず濃縮することが好ましい。培養物の容量は、２分の１、より好ましくは３分の１、より好ましくは４分の１、より好ましくは５分の１、より好ましくは６分の１、より好ましくは７分の１、より好ましくは９分の１、より好ましくは１０分の１に減少させることが好ましい。次いで、濃縮された細菌の懸濁液を、ダイアフィルトレーションする。培養培地は、ｐＨが抽出に適切な緩衝液で段階的に置きかえることが好ましい。本明細書では、ダイアフィルトレーションを、一定の容量を伴う精密濾過であって、ダイアフィルトレーションの後、対象の化合物が、第２の培地中に存在するように、対象の化合物を含む第１の培地を、連続的な透析を介して第２の培地で置きかえる精密濾過として定義する。したがって、培養培地それ自体を、別の適切な培地、好ましくは１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．６で段階的に置きかえる。濃縮とダイアフィルトレーションとは、同時に実施することもでき、逐次的に実施することもできる。同時に実施する場合、第２の培地は、ｐＨが抽出に適切であり、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地、又はダイアフィルトレーションの直後、適量の金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを、適切なｐＨまで添加する培地緩衝液であり、第２の培地は、トリス−ＨＣｌなどの緩衝剤を、約１０ｍＭから２５０ｍＭの間の濃度で含み、好ましくは以下で定義される通り、約１ｍＭから１００ｍＭの間の金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを添加してｐＨが約ｐＨ７．５を超えていることが好ましい。ダイアフィルトレーションは、第１の培地を第２の培地で完全に置きかえるまで実施することが好ましく、このプロセスには少なくとも１時間〜４時間、又はそれ以上を要しうる。ダイアフィルトレーションは、当業者に知られている任意の適切な膜を用いて実施することができる。小孔サイズが０．２マイクロメートルの中空糸エレメントを用いることが好ましい。

金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地は、ＯＭＶの抽出に適する任意の培地でありうる。培地は、洗浄剤を含まないことが好ましい。金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地は、緩衝剤、又は緩衝剤の混合物をさらに含むことが好ましく、緩衝剤の例は、トリス及びリン酸であるがこれらに限定されない。好ましい培地は、１０ｍＭのＥＤＴＡを伴う１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．６である。

好ましくは、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地は、約１から１００ｍＭの間の濃度の金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを有する。この濃度は、約１から５０ｍＭの間であることが好ましく、より好ましくは約１から２５ｍＭ、２から２５ｍＭ、３から２５ｍＭ、４から２５ｍＭ、５から２５ｍＭ、又は５から２０ｍＭの間であり、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５ｍＭなど、約５から１５ｍＭの間であることが最も好ましい。金属キレート化剤は、本明細書の前出で定義された金属キレート化剤であることが好ましく、金属キレート化剤は、ＥＤＴＡであることがより好ましい。培地は、細菌を培地と接触させた後の金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度が好ましい値であることが好ましい。培地の金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度は、調整することができる。調整は、細菌を培地と接触させる間任意の時点において行うこともでき、細菌の培地中でのインキュベーション時に行うこともでき、複数回にわたり実施することができ、連続的及び／又は自動的に実施することができる。当業者は、培地の金属キレート化剤濃度を調整する仕方、例えば、金属キレート化剤濃度を測定することにより、適量の金属キレート化剤を固体として、又は溶液として添加することにより調整する仕方について承知している。金属キレート化剤が、ＥＤＴＡである場合、ＥＤＴＡは、任意の形態であることが可能であり、例えば、酸としての場合もあり、当業者に知られるＥＤＴＡ塩のうちの１つとしての場合もあり、ＥＤＴＡの複数の形態の混合物としての場合もある。

金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地は、ｐＨが約ｐＨ７．５を超えることが好ましい。金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地のｐＨは、約ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９、ｐＨ８．０、ｐＨ８．１、ｐＨ８．２、ｐＨ８．３、ｐＨ８．４、ｐＨ８．５、ｐＨ８．６、ｐＨ８．７、ｐＨ８．９、ｐＨ９．０、ｐＨ９．１、ｐＨ９．２、ｐＨ９．３、ｐＨ９．４、又はｐＨ９．５を超えることが好ましい。培地のｐＨは、約ｐＨ７．５からｐＨ９．５の間、より好ましくは約ｐＨ８．０からｐＨ９．０の間、より好ましくは約ｐＨ８．２からｐＨ８．８の間、より好ましくは約ｐＨ８．４からｐＨ８．７の間であることがより好ましい。金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地のｐＨは、約ｐＨ８．６であることが最も好ましい。ｐＨは、細菌を、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地と接触させた後で好ましい値であることが好ましい。金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地のｐＨは、調整することができる。調整は、細菌を培地と接触させる間任意の時点において行うこともでき、細菌の培地中でのインキュベーション時に行うこともでき、複数回にわたり実施することができ、連続的及び／又は自動的に実施することができる。当業者は、培地のｐＨを調整する仕方、例えば、ｐＨを測定し、適切な酸又は塩基を金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地へと添加することにより調整する仕方について承知している。

ＯＭＶを抽出するのに好ましい培地は、ｐＨが約ｐＨ７．５を超え、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度が、約５から１５ｍＭの間の培地であり、より好ましくは、ｐＨが約ｐＨ８．６であり、金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度が、約５から１５ｍＭの間の培地であり、好ましくは、培地は緩衝剤として、例えば、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌを含む。

細菌を金属キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む培地中でインキュベートして、ＯＭＶを抽出した後、細菌をＯＭＶから少なくとも除去することにより、ＯＭＶを回収する。細菌のＯＭＶからの除去は、当業者に知られている任意の手段を介して実施することができる。除去するための方法の例は、サイズ０．５〜０．２μｍの小孔による濾過、遠心分離、又は細菌を（自発的に）沈降させるための他の任意の方法であるがこれらに限定されない。細菌をＯＭＶから除去する好ましい方法は、プロセスの規模に応じて、バッチ遠心分離又は連続遠心分離による方法であり、例えば、約１００Ｌまでの容量にはバッチ遠心分離であり、約１００Ｌを上回る容量には連続遠心分離である。

回収の後で、又は回収と同時に、ＯＭＶ調製物を精製することができる。精製は、当業者に知られている任意の方法を含みうる。以下の群に由来する少なくとも１つの方法を適用することが好ましい：本明細書の前出で記載した限外濾過、及び／又は培地を交換する、例えば、金属キレート化剤を抽出培地から除去し、及び／又はＯＭＶ調製物を濃縮するためのダイアフィルトレーション；１又は複数の適切なヌクレアーゼを用いて、好ましくはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて酵素的に実施しうる、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸の分解；好ましくは小孔サイズが約０．５μｍから１．０μｍの間のフィルターを用いる濾過による清澄化；ゲル濾過（サイズ除外クロマトグラフィーなど；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム材料；ＯＭＶは、カラムの空隙容量から回収する）；本明細書の前出で記載した滅菌濾過。少なくとも滅菌濾過を適用することが好ましい。複数の精製方法を適用することが好ましい。以下の方法を連続的に適用することが好ましい：必ずしもこの順序ではないが、限外濾過（例えば、１００又は３００ｋＤａのカットオフ）、ダイアフィルトレーション（例えば、１００又は３００ｋＤａのカットオフ）、核酸の酵素的な分解、清澄化、ゲル濾過、及び滅菌濾過。本発明に従う好ましいプロセスは、超遠心分離を包含しない。

ｂｅｎｚｏｎａｓｅを用いる核酸の分解は、約０．１から１０Ｕ／ｍｌの間のｂｅｎｚｏｎａｓｅ及び約１から１０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含むｐＨ８．４±０．４の緩衝液中、４℃から３７℃で１から２０時間にわたり実施することが好ましい。

本発明に従うプロセスのうちのいずれにおいても、グラム陰性細菌集団は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、又はパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属の種を含むことが好ましく；ナイセリア属又はボルデテラ属の種を含むことがより好ましく；グラム陰性細菌集団は、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、髄膜炎菌、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又はパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）を含むことがなおより好ましく；髄膜炎菌、好ましくは血清群Ｂ髄膜炎菌、又は百日咳菌を含むことがなおより好ましい。

グラム陰性細菌集団は、遺伝子産物の発現を減少させるか、又はノックアウトする１又は複数の突然変異を有するグラム陰性細菌を含むことが好ましい。遺伝子産物は、ｃｐｓ、ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｅｘｂＢ、ｅｘｂＤ、ｆｒｐＢ、ｇａｌＥ、ｈｔｒＢ、ｍｓｂＢ、ｌｐｂＢ、ｌｐｘＫ、ｌｐｘＬ１、ｎｍｂ００３３、ｏｐＡ、ｏｐＣ、ｒｍｐＭ、ｐｈｏＰ、ｐｉｌＣ、ｐｍｒＥ、ｐｍｒＦ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｓｉａＡ、ｓｉａＢ、ｓｉａＣ、ｓａｉｄ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎｃ、ｔｂｐＡ、及びｔｂｐＢ、又はこれらの相同体からなる群から選択されることが好ましく、これらの突然変異の多くは、ＷＯ０２／０９７４６において総説されている。遺伝子産物は、ｃｐｓと、ｌｐｘＬ１、ｒｍｐＭ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、及びｏｐＡを含めたリピドＡ生合成遺伝子産物からなる群から選択されることが好ましい。グラム陰性細菌は、好ましくはＷＯ００／２６３８４において記載された突然変異など、ｌｐｘＬ１の発現を減少させるか、又はノックアウトする突然変異を少なくとも有することが好ましい。グラム陰性細菌は、ｌｐｘＬ１及びｒｍｐＭの両方の発現を減少させるか、又はノックアウトする突然変異を少なくとも有することが好ましい。ｌｐｘＬ１は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約３０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有することが好ましい。ｌｐｘＬ１は、配列番号１のアミノ酸配列と同一であることが最も好ましい。

ｒｐｍＭは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約３０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有することが好ましい。ｒｐｍＭは、配列番号２のアミノ酸配列と同一であることが最も好ましい。

グラム陰性細菌は、髄膜炎菌血清群Ｂ分離株であるＨ４４／７６の複製株又は派生株である髄膜炎菌株であることが好ましい［Ｈｏｌｔｅｎら、１９７９；ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎら、２００７］。

本発明に従う任意の株の複製株及び／又は派生株が、本発明により包摂されることが理解される。「複製株」という用語は、生物学的物質であって、微生物の増殖、例えば、培養培地中の細菌の増殖により産生される物質など、その物質の実質的に非修飾のコピーを表す生物学的物質を指す。「派生株」という用語は、生物学的物質から創出された物質であり、例えば、遺伝子物質中の遺伝性の変化により引き起こされる新たな特性を有するように実質的に修飾された物質を指す。これらの変化は、自発的に生じる場合もあり、化学的及び／又は物理的作用物質（例えば、突然変異誘発物質）を適用した結果の場合もあり、及び／又は当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法による場合もある。別の株から「派生した」株に言及する場合は、その派生株を用いて、例えば、髄膜炎菌など、本発明の方法において用いられるグラム陰性細菌に対する免疫応答を誘発しうる限りにおいて、その株の「複製株」並びにその株の「派生株」の両方が包摂されることが理解される。

本明細書では、同一性の百分率が、配列中の同一なヌクレオチド／アミノ酸の数を、任意のギャップの長さを差し引いた全ヌクレオチド／アミノ酸の長さで除した比を計算することにより決定されることが好ましい。本明細書では、ＤＮＡの複数の配列アライメントを、当業者に入手可能な、任意の適切な配列アライメントソフトウェアパッケージを用いて実施した。３０％以上の同一性レベルを示す関連性のあるアミノ酸配列の最小限の長さは、好ましくは約４０アミノ酸であるものとし、より好ましくは約５０、７０、１００、１５０、１７０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０アミノ酸以上であるものとし、ｌｐｘＬ１の場合は、約５０、７０、１００、１５０、１７０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、２９５アミノ酸以上であることがより好ましい。好ましくは、配列同一性は、配列番号１又は２の配列全体にわたり計算する。

本明細書では、発現が、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が含まれるがこれらに限定されないポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することと理解されるであろう。

本明細書の前出で定義された遺伝子産物の発現を減少させるか、又はノックアウトするために、当業者には、多くのよく知られたツールが利用可能である。当業者がポリヌクレオチド内に適切な修飾を導入して、機能的な遺伝子産物の発現を減少させるか、又はノックアウトするのに適切な戦略を選択することは、日常的な慣行である。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、１９８９）において記載されている。対応する方法はまた、キットの形態でも市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡによるＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット）。ポリヌクレオチドの欠失は、例えば、当業者によく知られている遺伝子置換法により達成することができる。

抗原の複数の血清型が発現し、最終的には、ＯＭＶ調製物となるように、グラム陰性細菌集団が、複数の種のグラム陰性細菌を含むことが好ましい。グラム陰性細菌の種は、抗原の複数の血清型を発現することがより好ましい。細菌集団が髄膜炎菌を含む場合、この集団は、ｐｏｒＡ抗原の複数の血清型を発現する髄膜炎菌を含むことが好ましく、細菌集団は、各種がｐｏｒＡ抗原の複数の血清型を発現する複数の種の髄膜炎菌を含むことがより好ましい。グラム陰性細菌集団は、合計９つのＰｏｒＡ亜型を発現する、３つの三価ＰｏｒＡ髄膜炎菌株［ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙら、１９９５；Ｃｌａａｓｓｅｎら、１９９６；ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎら、２００７］を含むことが好ましい。

髄膜炎菌血清群Ｂの分離株Ｈ４４／７６の複製株又は派生株である髄膜炎菌株であることが好ましいグラム陰性細菌は、前記グラム陰性細菌に対する外来抗原を発現しうる。本発明に従い調製されるＯＭＶであって、前記グラム陰性細菌から調製されるＯＭＶは、前記外来抗原を含むであろう。したがって、本発明に従うＯＭＶは、アジュバント活性を伴う媒体として用いることができ、前記外来抗原と関連する疾患又は状態を処置するために簡便に用いることができる。グラム陰性細菌に対する外来抗原は、任意の抗原であることが可能であり、ＮａｄＡタンパク質、ヘパリン結合タンパク質、Ｑ熱表面抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属抗原、パータクチン、百日咳毒素、９２ｋＤａ抗原、ｆｉｍ２、ｆｉｍ３、皮膚死毒素、因子Ｈ結合タンパク質、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、若しくはＹに由来する多糖、クラミジア属表面抗原、ジフテリアトキソイド、弱毒化ポリオウイルス若しくは不活化ポリオウイルス、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ多糖、又は、例えば、アルツハイマー病などの自己免疫応答が関与しうる疾患と関連する自己抗原、及び腫瘍抗原からなる群から選択される１つ又は少なくとも１つであることができる。

外来抗原は、当業者に知られている任意の手段を介して発現させることができ、外来抗原は、ＯＭＶを標的とすることが好ましい。外来抗原又はその部分は、髄膜炎菌血清群Ｂ ｐｏｒＡ若しくはその部分へと融合させるか、又はこの中に含ませることが好ましい。

本発明の範囲内では、各々が単一又は複数の抗原血清型を発現するグラム陰性細菌の複数の種を培養するか、又は他の形でこれらをもたらし、前記細菌の１又は複数のプール集団から同時にＯＭＶを抽出することが可能である。また、ＯＭＶを細菌集団から個別に抽出し、次いで、好ましくはＯＭＶの調製物をプールすることも本発明の範囲内にある。さらに、異なる種のグラム陰性細菌を、単一の混合集団内で併せて培養するか、又は個別の集団内で個別に培養するか、或いはなお個別の集団と混合集団と組み合わせて培養することも本発明の範囲内にある。

本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得られたＯＭＶ調製物は、将来の使用のために簡便に、凍結乾燥形態若しくは溶液のいずれかで保管することもでき、又は溶液中で凍結しておくこともできる。本発明に従うプロセスのうちのいずれかでは、凝集を防止するためのスクロースなどの（コロイド）安定化剤、及び／又は微生物の増殖を防止するためのチオメルサールなどの保存剤などの１又は複数の化合物を、ＯＭＶ調製物へと添加することができる。

本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得られたＯＭＶ調製物は、医薬、好ましくは、髄膜炎を処置するための医薬を調製するために簡便に用いることができ、前記医薬は、髄膜炎菌感染に対するワクチンであることが好ましい。したがって、本発明に従うプロセスのうちのいずれかは、ＯＭＶを、担体、アジュバント、安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤、及び／又は分散剤など、医薬として許容される賦形剤と組み合わせるステップをさらに含みうる。加えて、本発明に従うプロセスのうちのいずれかでは、ＯＭＶを別の抗原と組み合わせて混合ワクチンを調製することもでき、好ましくは適切な医薬として許容される担体タンパク質へとコンジュゲートされたＮａｄＡタンパク質、ヘパリン結合タンパク質、Ｑ熱表面抗原、パータクチン、百日咳毒素、９２ｋＤａ抗原、ｆｉｍ２、ｆｉｍ３、皮膚死毒素、因子Ｈ結合タンパク質、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、若しくはＹに由来する多糖、好ましくは適切な医薬として許容される担体タンパク質へとコンジュゲートされたクラミジア属表面抗原、ジフテリアトキソイド、弱毒化ポリオウイルス若しくは不活化ポリオウイルス、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌ｂ多糖が含まれるがこれらに限定されない、好ましくは、髄膜炎菌血清群Ｂ又は他のグラム陰性病原菌に由来する外膜タンパク質を含む抗原と組み合わせて混合ワクチンを調製することもできる。

ワクチン接種は、病原菌に対する予防的防御のため、又は病原菌の感染後における疾患を処置するために適用される。

本明細書では、アジュバントが、抗原と組み合わせて、対象、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトを免疫化するために用いられると、免疫系を刺激し、これにより、好ましくはアジュバント自体に対する特異的な免疫応答を発生させることなく、抗原に対する免疫応答を惹起、増強、又は促進する任意の物質又は化合物を包含すると定義する。好ましいアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を、同じ条件下ではあるがアジュバントの非存在下における抗原に対して発生する免疫応答と比較して、少なくとも１．５、２、２．５、５、１０、又は２０倍増強する。当技術分野では動物又はヒトの群において、アジュバントにより産生される、所与の抗原に対する免疫応答の統計学的な平均の、対応する対照群を上回る増強を決定するための試験が利用可能である。アジュバントは、少なくとも２つの異なる抗原に対する免疫応答を増強することが可能であることが好ましい。

医薬担体は、有効成分を対象へと送達するのに適する任意の適合性で非毒性の物質でありうる。鼻腔内送達用の医薬として許容される担体は、水、緩衝生理食塩液、グリセリン、ポリソルベート２０、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、及びカプリル酸／カプリン酸グリセリドの水性の混合物により例示され、中性のｐＨ環境をもたらすように緩衝することができる。非経口送達用の医薬として許容される担体は、場合によって２０％のアルブミンを補充した、滅菌緩衝０．９％のＮａＣｌ又は５％のブドウ糖により例示される。非経口投与用の調製物は、無菌でなければならない。有効成分を投与するための非経口経路は、既知の方法、例えば、皮下経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋内経路、動脈内経路、又は病変内経路を介する注射又は注入に従う。本発明に従う組成物は、ボーラス注射により投与することが好ましい。経口投与のためには、有効成分を、エリキシル剤、シロップ、及び懸濁液などの液体剤形で投与することができる。経口投与用の液体剤形は、患者による受容を増大させるために、着色剤及び香味剤を含有しうる。当技術分野では、非経口投与可能、経口投与可能、又は鼻腔内投与可能な組成物を調製するための方法がよく知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０）（全ての目的のために参照によりその全体において組み込まれる）を含めた多様な出典においてより詳細に記載されている。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つにより得ることが可能なＯＭＶを提供する。前記ＯＭＶは、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つから直接導出された生成物であることが好ましい。

本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得ることが可能なＯＭＶ調製物は、医薬、好ましくは髄膜炎を処置するための医薬を調製するために簡便に用いることができ、前記医薬は、髄膜炎菌感染に対するワクチンであることが好ましい。前記ＯＭＶ調製物は、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つから直接導出された生成物であることが好ましい。したがって、本発明は、本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得ることが可能なＯＭＶと、本明細書の前出で記載した担体、アジュバント、安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤、及び／又は分散剤など、医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。前記ＯＭＶは、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つから直接導出された生成物であることが好ましい。本発明は、アジュバント活性自体を含むＯＭＶをもたらすので、好ましい医薬組成物は、アジュバント活性を含むＯＭＶ以外のさらなるアジュバントを含まない。

医薬組成物は、ワクチンとして用いることができる。ワクチンは、対象、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトの免疫化（免疫応答を高めること）又はワクチン接種のために用いることができる。医薬組成物中では、ＯＭＶを、別の抗原と組み合わせて、すなわち、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、肺炎球菌性疾患、ジフテリア、百日咳、ポリオ、ＲＳＶ、又は破傷風に対するワクチンと組み合わせて、混合ワクチンを調製することができる。

本発明は、好ましくは髄膜炎の処置における医薬としての使用のための、本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得ることが可能なＯＭＶをさらに提供する。前記医薬は、髄膜炎菌感染に対するワクチンであることが好ましい。前記ＯＭＶは、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つから直接導出された生成物であることが好ましい。

本発明は、好ましくは髄膜炎を処置するための医薬を調製するための、本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得ることが可能なＯＭＶの使用をさらに提供する。前記医薬は、髄膜炎菌感染に対するワクチンであることが好ましい。前記ＯＭＶは、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つから直接導出された生成物であることが好ましい。

本発明は、対象において、好ましくは髄膜炎菌に対する免疫反応を誘発するためのプロセスであって、本発明に従うプロセスのうちのいずれかにより得ることが可能なＯＭＶを前記対象へと投与すること、又は本発明に従う医薬組成物、好ましくは髄膜炎菌感染に対するワクチンを前記対象へと投与することを含むプロセスをさらに提供する。前記ＯＭＶは、本発明の第１の態様に従うプロセスのうちのいずれか１つから直接導出された生成物であることが好ましい。

本発明は、対象において、好ましくは髄膜炎菌に対する免疫反応を誘発するための、本発明に従うＯＭＶ又は本発明に従う医薬組成物の使用であって、本発明に従うＯＭＶ又は本発明に従う医薬組成物を前記対象へと投与することを含む使用をさらに提供する。

本明細書及びその特許請求の範囲では、「〜を含む」という動詞及びその活用形を、その語に後続する項目が包含され、具体的に言及されていない項目が除外されないことを意味するように、その非限定的な意味で用いる。加えて、不定冠詞の「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」による要素への言及も、文脈により、要素のうちの１つであり、且つ、それだけが存在することが明確に要請されない限り、複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞の「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」は通常、「少なくとも１つの」を意味する。数値との関連で用いられる場合の「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語（例えば、約１０）は、その値が、所与の値（１０）を０．１％上回るか又は下回る可能性があることを意味することが好ましい。

本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含を要請するように狭く解釈すべきではない。当業者は、このような誤って同定された塩基を同定することが可能であり、このような誤りを是正するにはどのようにすべきかについて承知している。配列が誤っている場合は、そのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、髄膜炎菌血清群Ｂ分離株であるＨ４４／７６内に存在する遺伝子の発現により得ることが可能なポリペプチドの配列を有効とすべきである。

本明細書において引用される全ての特許及び論文の参考文献は、参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む。

本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない、以下の例によりさらに記載される。

別段に言明されない限り、本発明の実施は、分子生物学、ウイルス学、微生物学、又は生化学の従来の標準的な方法を使用する。このような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌらの１及び２巻（１９９４）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ＵＳＡ；並びにＢｒｏｗｎのＩ及びＩＩ巻（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ」、２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｎ．Ｇａｉｔ編）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編）において記載されている。

ＨＰ ＮｏｎａＭｅｎ株［ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎら、２００７］と同じ９つのＰｏｒＡ亜型を併せて発現する３つの異なる三価ＲＬ ＮｏｎａＭｅｎ株に由来するが、ｒｍｐＭ遺伝子及びｌｐｘＬ１遺伝子においてさらなる欠失を伴う三価バルクＯＭＶの典型的なＰｏｒＡ含量を示す図である。およそ４１ｋＤａでＰｏｒＡを含有するＲＬ１６２１５株、ＲＬ１０１２４株、及びＲＬ１４１６株のそれぞれに由来する三価バルクＯＭＶが描示される。ＲＬ ＮｏｎａＭｅｎの三価バルクＯＭＶの典型的なＰｏｒＡ含量は、全タンパク質含量の６０〜８０％の間である。 ＡｌＰＯ４アジュバントを伴うか又は伴わない、２つの異なる用量（ＰｏｒＡ１つ当たり７．５及び１５μｇ）のＲＬ ＮｏｎａＭｅｎワクチンによる、ウサギにおける機能的な免疫原性を示す図である。免疫化前の血清は、Ｄ＝０において採取し、免疫化後の血清は、３回の免疫化の後に採取した。３つのワクチン全てが、Ｄ＝４３において、Ｄ＝０におけるより著明に高い殺菌力価をもたらしたが、用量又はアジュバントに関連する著明な効果は観察されなかった。これは、ＰｏｒＡ１つ当たり７．５μｇのＲＬが、十分な抗原を含有し、本明細書で記載されるプロセスによりワクチンを作製する場合、アジュバントの使用が必要でないことを示した。

配列

（実施例１）
収率及び純度が改善された、髄膜炎菌血清型Ｂに対する九価のＯＭＶワクチンの規模拡大可能な製造
以下の例は、４０Ｌの産生用培養物により実施したが、少なくとも８００Ｌまでは完全に規模拡大可能である。

株Ｈ４４／７６に由来する３つの異なる髄膜炎菌血清群Ｂ株［Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら、１９９１］であって、ｃｐｓ遺伝子、ｐｏｒＢ遺伝子、ｒｍｐＭ遺伝子、及びｌｐｘＬ１遺伝子［Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら、２０１０］においてさらなる欠失を伴い、各々が３つずつの固有なＰｏｒＡ亜型［Ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎら、２００７］を発現する髄膜炎菌血清群Ｂ株、すなわち：
株ＲＬ１６．２．１５が、Ｐ１．７，１６／Ｐ１．５−１，２−２／Ｐ１．１９，１５−１を発現し、
株ＲＬ１０．１２．４が、Ｐ１．５−２，１０／Ｐ１２−１，１３／Ｐ１．７−２，４を発現し、
株ＲＬ１４．１．６が、Ｐ１．２２，１４／Ｐ１．７−１，１／Ｐ１．１８−１，３，６を発現する髄膜炎菌血清群Ｂ株
を、−１３５℃で、マスターの種地として保管した。マスターの種地を融解させ、１５０ｍＬの既知組成培地［Ｂａａｒｔら、２００７］を伴う振とうフラスコ内で増殖させ、指数関数的増殖の間にアリコートに分割し、グリセロールを添加した後−１３５℃で保管し、作業用種地を得た。

既知組成増殖培地（Ｂａａｒｔら、２００７）を伴う初代前培養用振とうフラスコに、凍結させた作業用種地を接種して、各産生バッチに同一な出発点をもたらした。指数関数的増殖の間に、初代前培養物全体を用いて、バイオリアクター内の３Ｌの既知組成増殖培地［Ｂａａｒｔら、２００７］中で増殖させた二代目前培養物を接種した。二代目前培養物を増殖させる間、温度を３５℃に制御し、撹拌速度を変化させ、純粋な酸素をヘッドスペースエアフローへと添加して、溶存酸素濃度を３０％に制御した。指数関数的増殖の間、二代目前培養物に由来する１Ｌのバイオマスを、４０Ｌの既知組成増殖培地（Ｂａａｒｔら、２００７）へと移した。産生用培養物を、温度を３５℃に制御し、ｐＨを７．２に制御し、リン酸及び消泡剤と共に、バイオリアクター内で増殖させた。可変撹拌速度と可変スパージャーエアフローとを組み合わせて、溶存酸素濃度を３０％に制御した。

定常増殖期は、定期的なＯＤ測定により決定される通りに始まった。その後、３時間の定常増殖の後で、完全な４０Ｌの産生用培養物を撹拌槽へと移すことによりこれを採取し、ＯＭＶの収率と、細菌の溶解により引き起こされるＤＮＡの放出との間の最適なバランスを確認した。採取された産生用培養物は、まず、２０℃まで冷却し、次いで、容量を、中空糸ユニット（０．２μｍの小孔サイズ）による精密濾過を用いて４０Ｌから６Ｌまで低減した。濃縮された採取物を、２倍容量（１２Ｌ）の、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．６でダイアフィルトレーションして、バイオマスのｐＨを、ｐＨ８．４±０．４へと調整した。濃縮された１００ｍＭのＥＤＴＡ液を、１０ｍＭの最終濃度まで添加して、ＯＭＶの抽出を開始させた後、１００ｒｐｍの撹拌槽内、２０℃で３０分間インキュベーションを行った。バイオマスを、ＯＭＶ抽出物から、半高速（１Ｌのバケット６個；３０分間；４℃；２０，０００×ｇ）のパラレルバッチ遠心分離により分離し、上清を保持した。業務用規模で生産するのに所望の場合は、バッチ遠心分離を連続遠心分離で置きかえることができる。上清をプールし、小孔サイズを初期の０．５μｍから最終的な０．２μｍの小孔サイズへと狭小化させたユニットを介する深層濾過により、任意の残留病原菌又は他の粒子を除去した。

病原菌を含まないＯＭＶ抽出物は、４℃で数週間にわたり保管するか、又は下流の加工用に直接的に用いた。容量をまず、カットオフが１００ｋＤａの限外濾過を用いて、１２分の１の０．５Ｌへと低減し、次いで、２倍容量（１Ｌ）の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．６によりダイアフィルトレーションして、ＥＤＴＡを除去した。粗ＯＭＶ中に存在する任意のゲノムＤＮＡを、Ｍｇ^２＋共因子の存在下で、１０００Ｕ／Ｌ（最終濃度）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて（２１℃で１８時間のインキュベーション）、１０００ｂｐ未満の断片へと消化した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ処理の間に形成した可能性がある任意の沈殿物を、清澄化フィルター（１．２〜０．５μｍ）により除去してから、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ材料（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で充填したゲル濾過カラム上で粗ＯＭＶを精製して、ＤＮＡ及び低分子を、ＯＭＶから除去し、保管用緩衝液（３％（ｗ／ｖ）のスクロースを伴う１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）への緩衝液交換を可能とした。次いで、三価バルクＯＭＶを、小孔サイズが０．２μｍのユニットを介する濾過により滅菌し、保管用緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、及び３％（ｗ／ｖ）のスクロース）により、１ｍｇ／ｍＬの三価ＰｏｒＡへと希釈した。この濃度でならば、バルクＯＭＶは、４℃で少なくとも６カ月間、品質の低下なく安全に保管されうるであろう（表２）。

定常増殖期の開始後３時間において産生用培養物を採取し、ｐＨ８．６においてＯＭＶの抽出を実施することにより得られた収率の改善は２．７倍であったが、定常増殖の開始後９時間まで採取を遅延させ、ＤＮＡの除去能を改善するためのプロセスの改変を実装したならば、なお６．３倍（表３）までも増大させうるであろう（すなわち、１００００Ｕ／ＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅを用いることによればこのように増大させうるであろう。上記のプロセスの全収率は、産生用培養物１リットル当たり３０±４ｍｇの三価ＰｏｒＡ（ＰｏｒＡ亜型１つ当たりのヒト用量である７．５μｇの１３３８倍同等量）であった））。このＰｏｒＡ収率は、下流プロセス全体の効率を３３±７％として得られた。この計算に滅菌濾過を組み入れ、記載されたプロセスを基準プロセスと比較したところ、高い濾過効率及び再現性（９２％±４％、表４）が結果としてもたらされることを強調しておく。基準プロセスでは、保存剤［チオメルサレート；Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら、１９９１；及びＣｌａａｓｅｎら、１９９６］が用いられて、滅菌濾過と関連する収率の低下が防止されるか、又は機械的せん断を伴うプロセスステップが組み入れられて、ＯＭＶサイズが低減され、効率が改善された［ＲＩＶＭ ２００７ ＮｏｎａＭｅｎ：Ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎら、２００７；及びＺｏｌｌｉｎｇｅｒら、２０１０］。加えて、上述の株に由来する三価バルクＯＭＶでは、他の株及びプロセスに由来するＯＭＶと比較して、ＰｏｒＡ純度も改善された［Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら、２０１０、ＵＳ６５５８６７７（図５）；Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら、１９９１］。典型的な三価ＰｏｒＡ含量は、全タンパク質含量の６０〜８０％であった（図２）。ＬＰＳ含量の高さにもかかわらず、毒性の低さが観察された。これは、ＬＰＳの毒性を弱毒化するｌｐｘＬ１の欠失により可能とされた［Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら、２０１０］。

上述で列挙した３つの株に由来する三価バルクＯＭＶを均等に混合して、九価のバルクＯＭＶを創出し、保管用緩衝液で、最終濃度が九価ＰｏｒＡ ０．１３５ｍｇ／ｍｌ（投与１回当たりのＰｏｒＡ亜型１つ当たり７．５μｇ；アジュバントを伴わない）及び九価ＰｏｒＡ ０．２７０ｍｇ／ｍｌ（投与１回当たりのＰｏｒＡ亜型１つ当たり１５μｇ；ＡｌＰＯ_４アジュバントを伴う場合及びこれを伴わない場合の両方）となるまで連続的に希釈した。３つの異なるワクチンを０．５ｍＬのアリコートに細分し、１、１５、及び２９日目のウサギにおける非経口投与まで４℃で保管した。

全てのＯＭＶワクチンが、Ｄ＝０におけるよりＤ＝４３において著明に高い殺菌力価をもたらしたが、用量又はアジュバントに関連する著明な効果は、観察されなかった。これは、ＰｏｒＡ１つ当たり７．５μｇのＲＬが、十分な抗原を含有し、ワクチンを本発明に従うプロセスにより作製する場合は、アジュバントの使用が必要でないことを示した。加えて、ＯＭＶワクチンは、ΔｐｏｒＡ ＨＩ５株に対する高い殺菌力価により示される通り、ＰｏｒＡ単独以外の抗原に基づく交差防御も誘導した（図２）。

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Claims (24)

1. ワクチンにおいて用いられる細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）を、洗浄剤を含まずに調製するためのプロセスであって、
   ａ）グラム陰性細菌の集団を、定常増殖期まで培養するステップと、
   ｂ）定常増殖期の開始後少なくとも１時間の時点で、ａ）において得られた細菌を、ｐＨがｐＨ８．０を超えるように調整されるか又はｐＨ８．０を超え、かつ金属キレート化剤の濃度が１から１００ｍＭの間となるように調整されるか又は１から１００ｍＭの間である培地中でインキュベートして、ＯＭＶを抽出するステップと、
   ｃ）ｂ）において抽出されたＯＭＶを回収するステップであって、回収が、ＯＭＶからの細菌の除去を少なくとも含むステップと
   を含む上記プロセス。
2. 前記金属キレート化剤がＥＤＴＡである、請求項１に記載のプロセス。
3. グラム陰性細菌が、細菌に毒性が低減されたＬＰＳを産生させるが、ＬＰＳがそのアジュバント活性の少なくとも一部を保持する遺伝子改変を有する、請求項１又は２に記載のプロセス。
4. 前記遺伝子改変が、ｌｐｘＬ１遺伝子及びｌｐｘＬ２遺伝子若しくはこれらの相同体、並びにｌｐｘＫ遺伝子若しくはその相同体から選択される１又は複数の遺伝子の発現を減少させるか、若しくはこれをノックアウトする改変であり、並びに／又は１又は複数のｌｐｘＥ遺伝子及び／若しくはｐａｇＬ遺伝子の発現をもたらす改変である、請求項３に記載のプロセス。
5. ｂ）において、細菌を培地中でインキュベートする定常増殖期の開始後の時点が、１から９時間の間である、請求項１から４までのいずれか一項に記載のプロセス。
6. 前記時点が２から５時間の間である、請求項５に記載のプロセス。
7. ＯＭＶを滅菌する、請求項１から６までのいずれか一項に記載のプロセス。
8. ＯＭＶを濾過滅菌により滅菌する、請求項７に記載のプロセス。
9. ＯＭＶを小孔が０．３マイクロメートル未満のフィルターを用いて濾過滅菌により滅菌する、請求項８に記載のプロセス。
10. ステップｂ）における金属キレート化剤の濃度が、５から１５ｍＭの間であり、及び／又は、ｐＨが、ｐＨ８．０からｐＨ９．５の間である、請求項１から９までのいずれか一項に記載のプロセス。
11. 前記ｐＨが、ｐＨ８．０からｐＨ９．０の間である、請求項１０に記載のプロセス。
12. 前記ｐＨが、ｐＨ８．２からｐＨ８．８の間である、請求項１１に記載のプロセス。
13. 前記ｐＨが、ｐＨ８．４からｐＨ８．７の間である、請求項１２に記載のプロセス。
14. 前記金属キレート化剤がＥＤＴＡである、請求項１０から１３までのいずれか一項に記載のプロセス。
15. ａ）における培養物の容量、及び／又はｂ）における培地の容量が、少なくとも１０Ｌである、請求項１から１４までのいずれか一項に記載のプロセス。
16. 前記ａ）における培養物の容量、及び／又はｂ）における培地の容量が、少なくとも２０Ｌ、４０Ｌ、６０Ｌ、８０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、８００Ｌ、１５００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、又は４０，０００Ｌである、請求項１５に記載のプロセス。
17. グラム陰性細菌が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属又はボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属の種である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のプロセス。
18. 前記グラム陰性細菌が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又は百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）である、請求項１７に記載のプロセス。
19. グラム陰性細菌が、遺伝子産物の発現を減少させるか、又はノックアウトする１又は複数の突然変異を有する、請求項１から１８までのいずれか一項に記載のプロセス。
20. 前記遺伝子産物が、ｃｐｓと、ｌｐｘＬ１、ｒｍｐＭ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、及びｏｐＡを含むリピドＡ生合成遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１９に記載のプロセス。
21. グラム陰性細菌が、複数のｐｏｒＡ亜型を発現する、請求項１から２０までのいずれか一項に記載のプロセス。
22. 集団が、グラム陰性細菌の複数の株を含み、各株が、異なるｐｏｒＡ亜型を発現する、請求項１から２１までのいずれか一項に記載のプロセス。
23. グラム陰性細菌が、前記グラム陰性細菌に対する外来の抗原を発現する、請求項１から２２までのいずれか一項に記載のプロセス。
24. ＯＭＶを、医薬として許容される賦形剤と組み合わせるステップをさらに含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載のプロセス。