CN111433348A - 一种改良的生产外膜囊泡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学微生物学和疫苗学领域。具体地，本发明涉及一种方法，其中通过应用高于生理溶解氧张力(DOT)的DOT来刺激革兰氏阴性细菌的细菌外膜囊泡(OMV)的自发释放。如此产生的OMV用于疫苗。本发明进一步涉及通过所述方法可获得的OMV，并且涉及包含这种OMV的药物组合物。本发明进一步涉及本发明的OMV作为药物的用途，特别是用于引发免疫应答的方法中。
Description
技术领域
本发明涉及医学微生物学和疫苗学领域。具体地，本发明涉及一种生产用于疫苗的革兰氏阴性细菌自发性(spontaneous)外膜囊泡(OMV)的方法、可由所述方法获得的OMV以及包含这种OMV的药物组合物。本发明还涉及本发明的OMV作为药物的用途(特别是用于引发免疫应答的方法中)。
背景技术
外膜囊泡(OMV)由革兰氏阴性细菌天然产生，参与致病、细胞间通讯以及应激反应(Kulp and Kuehn 2010)。最近的研究表明，革兰氏阳性细菌和古细菌(archaea)中也有膜囊泡形成(Ellen et al.2009；Rivera et al.2010)。OMV是球状纳米颗粒，囊泡由含有蛋白质和脂多糖(LPS)的磷脂双层组成，囊泡腔包含细菌的周质组分(Kulp and Kuehn 2010；Schwechheimer and Kuehn 2015)。
由于OMV与细菌的外膜高度类似、不复制，且特征性地充满病原体相关分子模式，因此，这些囊泡已成功用作疫苗(Gorringe and Pajon 2012；Holst et al.2009)。这些疫苗已通过从细菌外膜提取囊泡来生产。通过这种方式，可使LPS脱毒并人工形成囊泡(Fredriksen et al.1991；Zollinger et al.1979)。但是，囊泡提取是不利的，因为研究发现，提取的OMV(eOMV)的蛋白质组与自发性OMV(sOMV)的蛋白质组之间存在差异(Lappannet al.2013；van de Waterbeemd et al.2013a)。此外，对于脱毒来说，提取方法不再是必要的，因为可以采用分子脱毒(van der Ley et al.2001)，分子脱毒是使用自发释放OMV的基础。自发释放囊泡的使用简化了OMV的纯化，因为它无需疫苗制品下游处理中的提取步骤(Lappann et al.2013；van de Waterbeemd et al.2013a)。
可行的sOMV生产一直都不明确。虽然在过去40年开展了关于OMV的研究，但是，触发细菌释放OMV的确切机制仍然未知。由于OMV的组成与细菌外膜不同，因此，通常认为囊泡的释放不是一个随机的过程(Schwechheimer et al.2013)。虽然仍不清楚是否存在共同的机制，但是有几种模型描述了OMV的生物发生(biogenesis)。OMV的生物发生被假定为基于周质中小肽聚糖积累、外膜对肽聚糖层的锚定减少，或O抗原电荷排斥。这些模型在(Hauratet al.2015)和(Schwechheimer and Kuehn 2015)中进行了综述。脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的sOMV产生可通过使将外膜锚定到肽聚糖层的rmpM基因缺失而增加(van de Waterbeemd et al.2010)。已利用减少外膜和肽聚糖层之间的连接来提高大肠杆菌(E.coli)的sOMV产生(Bernadac et al.,J Bacteriol.1998,180(18):4872-8)。
Van de Waterbeemd et al.(2013b)最近的工作表明，半胱氨酸耗竭触发脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)释放OMV。Van de Waterbeemd等人表明，半胱氨酸耗竭触发的OMV释放可能是通过半胱氨酸耗竭引起的氧化应激而介导。事实上，由添加至培养基的过氧化物的脉冲诱导的氧化应激具有类似但短暂的效果，因为每次添加过氧化物后，sOMV会被暂时的释放。然而，对于可规模化的OMV生产方法来说，加入过氧化氢是不可行的，因为将过氧化氢添加到细菌培养物中会导致显著的细胞死亡和细菌裂解。
因此，仍然需要更高效的、可规模化的生产sOMV的方法。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种生产自发释放的细菌外膜囊泡(OMV)的方法，其中该方法包括以下步骤：a)培养革兰氏阴性细菌菌群，该培养包括通过应用溶解氧张力(DOT)来刺激OMV的释放，所述溶解氧张力(DOT)高于在35℃测量的30％空气饱和度的生理DOT；以及，b)回收a)中释放的OMV，其中该回收至少包括从OMV中除去细菌。优选地，在该方法中，应用来刺激OMV释放的DOT为在35℃测量的至少31％、32％、35％、40％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％空气饱和度，并且其中优选地，应用来刺激OMV释放的DOT低于在35℃测量的350％、325％、300％、275％、250％、225％、205％或185％空气饱和度。
本发明的一种方法优选是这样一种方法，其中培养革兰氏阴性细菌包括采用添加补料培养基(feeding medium)的模式，其中所述模式选自补料分批模式、半连续模式和连续模式。更优选地，该方法包括：a)第一阶段，其中革兰氏阴性细菌的生物质在第一DOT积累；以及，b)第二阶段，其中通过应用比第一DOT高的第二DOT来刺激OMV从a)中积累的生物质释放；其中优选地，第一DOT是生理DOT，优选低于在35℃测量的50％、40％、35％或32％空气饱和度的DOT。
在本发明的方法中，革兰氏阴性细菌优选具有以下至少一项：a)遗传修饰，该遗传修饰使细菌产生具有减少的毒性的LPS但LPS仍保留至少部分的其佐剂活性；优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物的一个或多个基因的表达的修饰，和/或所述遗传修饰是引起一个或多个lpxE和/或pagL基因表达的修饰；b)遗传修饰，该遗传修饰使该细菌与没有该遗传修饰的相应野生型细菌相比过量生产OMV，其中该遗传修饰是减弱包含肽聚糖相关位点的一种或多种蛋白的肽聚糖结合活性的修饰，优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自tolQ、tolR、tolA、tolB、tolRA、rmpM和ompA基因的一个或多个基因的表达的修饰；以及，c)遗传修饰，该遗传修饰降低或敲除基因产物的表达，优选地，基因产物选自cps、脂质A生物合成基因产物、PorA、PorB和OpA。革兰氏阴性细菌优选属于选自奈瑟球菌属(Neisseria)、博德特菌属(Bordetella)、螺杆菌属(Helicobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、志贺菌属(Shigella)、嗜血菌属(Haemophilus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、莫拉菌属(Moraxella)、克雷伯菌属(Klebsiella)和不动杆菌属(Acinetobacter)的属；优选地，该细菌是选自脑膜炎奈瑟球菌、乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、志贺菌属物种(Shigella spp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherischia coli)、黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的种。在一个实施方案中，革兰氏阴性细菌表达相对于所述革兰氏阴性细菌是外源的抗原。在另一个实施方案中，革兰氏阴性细菌表达多种抗原，其中优选选择不同的抗原从而包含主要的抗原变体，以提高疫苗覆盖范围。
优选地，在根据本发明的方法中，OMV经过灭菌，优选地采用过滤器灭菌，优选地使用孔小于约0.3微米的过滤器。
根据本发明的方法还可包括将OMV与药学上可接受的赋形剂组合和任选组合佐剂的步骤。
在根据本发明的方法中，OMV优选用于疫苗。
在第二方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的OMV。
在第三方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的OMV或在本发明的方法中产生的OMV和药学上可接受的赋形剂以及任选包含佐剂。
在第四方面，本发明涉及(优选在脑膜炎治疗中)用作药物的所述OMV或所述药物组合物。
具体实施方式
我们出人意料地发现，可以直接而可靠地使用生物反应器培养的常见控制参数来触发外膜囊泡(OMV)的自发释放。
在第一方面，本发明涉及一种生产自发释放的细菌外膜囊泡的方法。优选地，该方法包括以下步骤：a)培养革兰氏阴性细菌菌群，所述培养包括通过应用比30％的生理溶解氧张力(DOT)高的DOT来刺激OMV释放。该方法还优选包括以下步骤：b)回收a)中释放的OMV，其中优选地，该回收至少包括从OMV中除去细菌。
如本文所用，术语OMV(“外膜囊泡”)表示具有周质内容物的释放的外膜球体，该周质内容物包含由革兰氏阴性细菌的外膜产生的生物活性分子(毒素、蛋白质、DNA)。OMV有时也称为“bleb”。这些囊泡通常参与致病过程，因为它们有助于长距离递送细菌毒力因子、促进炎症和刺激宿主免疫应答。由细菌形成的OMV也可介导细胞间交换事件，包括细胞间信号传导、蛋白质和DNA交换(参见例如Berleman J et al.,2013)。
在根据本发明的方法中的革兰氏阴性细菌菌群的培养可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。用于培养的优选培养基是例如在Baart et al.,2003中描述的化学成分确定的培养基(chemically defined medium)。温度可以是在例如约30℃至约40℃之间变化的任何温度。pH可以是在例如约5.5至约8.5之间变化的任何pH。优选的培养条件包括在约35℃和pH7.2培养。
细菌菌群在本文中定义为至少两种细菌，优选属于相同的属和种。
本发明的方法包括应用增加的DOT来刺激OMV释放。应用来刺激OMV释放的DOT优选是诱导细菌中的(细胞外)氧化应激的DOT，其可通过细菌的蛋白质谱确定。优选地，应用来刺激OMV释放的DOT高于该细菌的生理DOT，细菌的生理DOT通常是30％左右。溶解氧张力在本文中表示为在35℃测量时空气饱和度百分比。DOT可在发酵期间使用本领域已知的DOT(即氧气)传感器测量和监测。DOT参数通过氧电极和常规的实验室技术来计算。因此，100％空气饱和度对应于空气饱和的溶液，而0％空气饱和度对应于使用惰性气体(例如氮气)彻底清洗的溶液。校准在标准大气压条件和包含约21％氧气的常规空气中进行。
在发酵期间，可通过本领域本身已知的手段来控制DOT，包括例如搅拌速度、通气率、供气中的氧气分数和/或压力。优选地，在本发明的方法中，DOT不是通过(脉冲)添加过氧化氢来增加的。在一个优选的方法中，应用来刺激OMV释放的DOT是至少31％、32％、35％、40％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。优选地，应用来刺激OMV释放的DOT低于350％、325％、300％、275％、250％、225％、205％或185％。优选地，在本发明的方法中，应用来刺激OMV释放的DOT应用至少10、20、40或60分钟，更优选地，应用至少2、3、4或6小时。
在一个优选的方法中，所述培养包括采用添加补料培养基的模式，其中所述模式选自补料分批模式、半连续模式和连续模式。优选地，这些模式采用补料方案，其中OMV的自发释放得到最好的开发。
分批方法是一种培养模式，其中培养细胞所需的所有营养物都包含在初始培养基中，在发酵过程中不需要再提供其它营养物。在补料分批方法中，在分批阶段之后进行补料阶段，在补料阶段，通过补料将一种或多种营养物提供给培养物。营养物补料的一个目的可以是增加生物质的量(所谓的“高细胞密度培养方法”或“HCDC”)，以同样增加释放的OMV的产量。虽然在大多数培养方法中，补料模式是关键和重要的，但是，本发明并不受限于某一补料模式。
营养物的补料可以以本领域已知方法中的连续或不连续模式进行。补料模式可预先定义(即，补料的添加独立于实际的方法参数)，例如线性恒定、线性增加、分步增加或按照数学函数(例如指数)补料。
本发明意义上的半连续培养方法是在其第一阶段以补料分批方法运作的方法(即，分批阶段后是补料阶段)。在达到一定体积或生物质后(即，通常是在达到发酵罐体积上限时)，从生物反应器中移除包含OMV的大部分细胞培养液。随后，再次开始补料，直至生物质或培养液的体积再次达到某一值。这种方法(排出培养液并通过补料重新填充)可进行至少一次，理论上可进行无数次。
在一个优选的方法中，补料培养基以引起一定的比生长速率(specific growthrate)的速率补料，该比生长速率是生长培养基中细菌最大比生长速率(μmax)的1.0-0.05。例如，该生长速率可以是0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05μmax。在一个实施方案中，该方法包括一阶段，在该阶段中，比生长速率不高于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05μmax，从而优选地，在此期间比生长速率限于上述速率的阶段是生产阶段，在生产阶段期间，OMV被释放，从而在生产阶段促进高的DOT。在生产阶段期间，不需要应用最低正比生长速率，因为如果生产阶段产生较高的OMV产量，那么在生产阶段没有生长，甚至会观察到负生长速率。
在本发明的一个优选方法中，该方法包括：a)第一阶段，其中革兰氏阴性细菌的生物质在第一DOT积累；以及，b)第二阶段，其中通过应用比第一DOT高的第二DOT来刺激OMV从a)中积累的生物质中释放；优选地，在第一阶段，DOT控制在支持细菌生长的水平。更优选地，在第一阶段应用的第一DOT支持细菌的良好或最佳生物质积累。因此，在第一阶段应用的第一DOT优选是生理DOT。优选地，第一DOT是在35℃测量的100％或更低的DOT，优选是低于75％、50％、40％、35％或32％空气饱和度的DOT。该方法的第二阶段包括一时段(stage)，其中应用的第二DOT高于第一DOT，以刺激OMV从第一阶段积累的生物质中释放。因此，第二DOT可以是应用来刺激以上所描述的OMV释放的DOT。优选地，第二DOT比第一DOT高至少1.05、1.1、1.2、1.5、2、5或10倍。
优选地，在根据本发明的任何方法中，革兰氏阴性细菌具有使细菌产生具有减少的毒性的的LPS但LPS仍保留至少部分的其佐剂活性的遗传修饰；优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物的一个或多个基因的表达的修饰；和/或所述遗传修饰是引起一个或多个lpxE和/或pagL基因表达的修饰。优选地，革兰氏阴性细菌至少具有降低或敲除lpxL1基因表达的突变，lpxL1基因编码与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少约30％序列相同性，更优选至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
经修饰具有较低毒性的LPS在本文中理解为经修饰具有比相应野生型LPS毒性低的毒性的LPS。优选地，经修饰的LPS具有低于相应野生型LPS毒性的约90％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.2％的毒性。野生型和各种毒性减少的经修饰LPS的毒性可用本领域技术人员已知的任何合适方法确定。一种优选的测定毒性的方法(即，LPS的生物活性)是测定MM6巨噬细胞系的TNFα诱导的WEHI检测(Espevik and Niessen,1986,J.Immunol.Methods 95:99-105；Ziegler-Heitbrock et al.,1988Int.J.Cancer41:456-461)。虽然优选革兰氏阴性细菌的LPS(或其脂质A部分)具有减少的毒性，还优选LPS保留至少一部分其免疫刺激性(即佐剂活性)。因此，用于本发明的革兰氏阴性细菌具有减少毒性的LPS优选具有至少约10％、20％、40％、80％、90％或100％的相应野生型LPS的免疫刺激活性，其中免疫刺激活性通过测量至少一种细胞因子的产生或与树突状细胞(DC)共培养时至少一种共刺激分子的表达来测定。
脑膜炎奈瑟球菌中的异源pagL表达产生了不同减弱的五酰化LPS结构，该结构仍然能够诱导TLR4激活并诱导人单核细胞系的TRIF偏向的细胞因子的产生(Pupo et al.,2014,J.Biol.Chem.289:8668-8680)。
优选地，在根据本发明的任何方法中，革兰氏阴性细菌具有遗传修饰，该遗传修饰使该细菌与没有该遗传修饰的相应野生型细菌相比过量生产OMV，其中该遗传修饰是减弱包含肽聚糖相关位点的一种或多种蛋白的肽聚糖结合活性的修饰，优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自tolQ、tolR、tolA、tolB、tolRA、rmpM和ompA基因的一个或多个基因的表达的修饰。一种优选的增加OMV产生的遗传修饰是减少或消除编码位于外膜和肽聚糖之间的锚定蛋白的基因的表达的修饰，以增加囊泡的形成，从而增加OMV产量。用于此目的的一种合适的遗传修饰例如减少或消除OmpA同源物的表达，OmpA同源物常存在于革兰氏阴性细菌中，例如奈瑟球菌属物种中的RmpM蛋白(Steeghs et al.,2002Cell Microbiol,4:599–611；van de Waterbeemd et al.,2010Vaccine,28:4810-4816)。因此，优选地，经遗传修饰的细菌具有减少或消除rmpM基因或其同源物表达的遗传修饰。优选地，rmpM基因或其同源物编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约30％序列相同性的氨基酸序列，更优选具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。
优选地，在根据本发明的任何方法中，革兰氏阴性细菌属于选自奈瑟球菌属、博德特菌属、螺杆菌属、沙门氏菌属、弧菌属、志贺菌属、嗜血菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、莫拉菌属、克雷伯菌属和不动杆菌属的属。更优选地，该细菌是选自脑膜炎奈瑟球菌、乳酰胺奈瑟球菌、淋病奈瑟菌、幽门螺杆菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺菌属物种、流感嗜血杆菌、百日咳博德特菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和黏膜炎莫拉菌的种。最优选地，该革兰氏阴性细菌为脑膜炎奈瑟球菌菌株，该菌株是脑膜炎奈瑟球菌血清群B分离株H44/76的复制或衍生菌株(Holten et al.,1979,J Clin Microbiol,9(2):186-188；vanden Dobbelsteen et al.,2007,Vaccine,25(13):2491–6)。
优选地，在根据本发明的任何方法中，革兰氏阴性细菌具有一个或多个突变，以降低或敲除基因产物的表达，优选地，所述基因产物选自cps、porA、porB和opA；这些突变中，许多突变都在WO02/09746中进行了综述。
为降低或敲除本文限定的基因产物的表达，本领域技术人员可利用很多熟知的工具。选择恰当的策略将合适的修饰引入多核苷酸中以降低或敲除功能性基因产物的表达，这对本领域技术人员来说是常规操作。例如，体外突变方法在Sambrook et al.(Molecularcloning,A laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,USA,1989)中有描述。相应的方法也可以以试剂盒的形式商购获得(例如，Stratagene,La Jolla,USA的Quikchange定点突变试剂盒)。多核苷酸的缺失可例如通过本领域技术人员熟知的基因替换技术来实现。
优选地，在根据本发明的任何方法中，革兰氏阴性细菌表达多个PorA亚型，其中优选地，菌群包含多于一种革兰氏阴性细菌菌株，以及其中每种菌株表达不同的PorA亚型。优选地，革兰氏阴性细菌菌群包含革兰氏阴性细菌的多个种，使得表达抗原的多个血清型，并最终存在于OMV制备物中。更优选地，革兰氏阴性细菌物种表达抗原的多个血清型。当细菌菌群包含脑膜炎奈瑟球菌时，该菌群优选包含表达PorA抗原的多个血清型的脑膜炎奈瑟球菌；更优选地，细菌菌群包含脑膜炎奈瑟球菌的多个种，每个种表达PorA抗原的多个血清型。优选地，革兰氏阴性细菌菌群包含三种三价PorA脑膜炎奈瑟球菌菌株，共表达9种PorA亚型(van der Ley et al,1995,Vaccine,13(4):401–7；Claassen et al,1996,Vaccine,14(10):1001–8；van den Dobbelsteen et al,2007,同上文)。
优选地，在根据本发明的任何方法中，革兰氏阴性细菌表达相对于所述革兰氏阴性细菌是外源的抗原。外源抗原可通过本领域技术人员已知的任何方法表达；优选地，外源抗原靶向OMV。优选地，外源抗原或其部分融合至或包含于脑膜炎奈瑟球菌血清群B porA或其部分，或融合至革兰氏阴性细菌的表面暴露的脂蛋白的N末端部分，例如WO2016/193370中所描述。外源抗原可以是病原体(传染剂(infectious agent))和/或肿瘤的抗原。例如，该抗原可以来自病原体和传染剂，如病毒、细菌、真菌和原生动物。
在本发明范围内，可以培养或提供革兰氏阴性细菌的数种不同菌株，每种菌株表达与其它菌株表达的抗原不同的一种或多种抗原，例如单个或多个抗原血清型；可以从所述细菌的一个或多个汇集菌群中同时提取OMV，从而生产多价疫苗。同样在本发明范围内的是，分别从不同细菌菌群中提取OMV，然后优选地汇集OMV的制备物。还在本发明范围内的是，不同种的革兰氏阴性细菌以单个混合菌群或分别以独立的菌群或甚至以独立和混合菌群的组合一起培养。
在根据本发明的方法中，OMV的回收可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。优选地，OMV的回收至少包括从OMV中除去细菌。从OMV中除去细菌的优选方法包括一个或多个过滤步骤，任选地包括无菌过滤步骤。或者，可通过离心，任选地随后无菌过滤上清液，从OMV中除去细菌。
通过根据本发明的任何方法获得的OMV制备物可以以冻干形式或溶液或在溶液中冷冻方便地储存，以备后用。在根据本发明的任何方法中，可将一种或数种化合物添加至OMV制备物中，例如(胶体)稳定剂(例如蔗糖)以防止聚集，和/或防腐剂(例如硫柳汞)以防止微生物生长。
优选地，在根据本发明的任何方法中，OMV经过灭菌，优选地通过过滤器灭菌，优选地使用孔小于约0.3微米的过滤器。优选地，灭菌在步骤b)过程中进行。过滤器灭菌也称为无菌过滤，在本文中定义为通过过滤器(优选孔在约0.5-0.2微米之间)过滤感兴趣的化合物，使得包含感兴趣的化合物的滤液不含有任何微生物，或滤液中的微生物量减少至可接受的低水平。
在回收后或者在回收的同时，可纯化OMV制备物。纯化可包括本领域技术人员已知的任何方法。优选地，应用以下至少一种方法：使用如前文所描述的超滤和/或渗滤来交换培养基，例如从提取培养基中除去金属螯合剂和/或浓缩OMV制备物；降解核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，降解可使用一种或多种合适的核酸酶通过酶促进行，核酸酶优选使用
(Merck,the Netherlands)；过滤澄清，优选使用孔径在约0.5μM至1.0μM之间的过滤器；凝胶过滤(例如尺寸排阻色谱；Sepharose 6Fast Flow色谱柱材料；从柱子的空隙体积中回收OMV)；如前文所描述的无菌过滤。优选地，至少应用无菌过滤。优选地，应用多于一种的纯化方法。优选地，连续地应用以下方法：超滤(例如100kDa或300kDa截留值(cut-off))、渗滤(例如100kDa或300kDa截留值)、核酸的酶促降解、澄清、凝胶过滤和无菌过滤，但是不一定要按照这个顺序。根据本发明的一个优选方法不包括超速离心。
使用
的核酸降解优选在pH 8.4+/-0.4的缓冲剂中于4℃-37℃进行1-20个小时，缓冲剂包含约0.1-10U
/ml以及约1-10mM之间的Mg2+。
优选地，在根据本发明的任何方法中，OMV用在疫苗中。该疫苗可用于免疫(产生免疫应答)或接种对象(优选为哺乳动物，优选为人)。在疫苗中，OMV可与另一抗原组合以制备混合疫苗，例如与针对脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135、Y、肺炎球菌疾病、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、RSV、破伤风和霍乱的疫苗组合。
优选地，在根据本发明的任何方法中，a)中培养物的体积和/或b)中培养基的体积为至少约10L，更优选至少约1L、2L、5L、10L、20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10.000L、20.000L或40.000L。
培养可在数个步骤中进行，包括但不限于预培养或种子培养和主培养。培养可以以任何规模进行，包括但不限制于实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小规模或大规模培养(包括连续培养、分批培养、补料分批培养或固态培养)。
本发明还提供一种方法，该方法还包括将OMV与药学上可接受的赋形剂组合和任选组合佐剂的步骤。典型的“药学上可接受的载体”包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生的任何载体。合适的载体一般是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、多乳酸、多乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这样的载体为本领域的技术人员所熟知。
佐剂在本文中定义为包括当与抗原组合使用以使对象(优选哺乳动物，优选人)免疫时，刺激免疫系统从而引发、增强或促进针对抗原的免疫应答的任何物质或化合物，优选不对佐剂本身产生特异性免疫应答。与相同条件下但无佐剂时针对指定抗原产生的免疫应答相比，优选的佐剂使针对指定抗原的免疫应答增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。本领域可利用用于测定在一组动物或人中，由佐剂产生的针对指定抗原的免疫应答相对于相应的对照组的统计学平均增强的测试。佐剂优选能增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。
在第二方面，本发明提供了可通过根据本发明第一方面的任何一个方法获得的OMV。优选地，所述OMV是从根据本发明第一方面的任何一个方法直接获得或衍生的产品。
可通过根据本发明第一方面的任何方法获得的OMV制备物可方便地用于制备药物，优选制备用于治疗脑膜炎的药物，优选所述药物是针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。优选地，所述OMV制备物是从根据本发明第一方面的任何一个方法直接获得或衍生的产品。
本发明还提供包含可通过根据本发明的任何方法获得的OMV的药物组合物。除了包含OMV以外，药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂，例如载体、佐剂、稳定剂、等渗剂、缓冲剂和/或分散剂，例如前文所描述的。优选地，所述药物组合物是从根据本发明的任何一个方法直接获得或衍生的产品。
在另一方面，本发明涉及可通过根据本发明的任何方法获得的OMV，或涉及用作药物的包含这种OMV的药物组合物。优选地，该药物用于治疗传染病或肿瘤。优选地，所述药物是针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。
本发明还提供一种用于引起对象免疫应答的方法，优选免疫应答针对引起传染病的病原体(例如脑膜炎奈瑟球菌)，或针对肿瘤相关抗原，该方法包括以下步骤：向所述对象施用有效量的可通过根据本发明任何方法获得的OMV，或向所述对象施用有效量的包含所述OMV的药物组合物。优选地，该药物组合物是疫苗，优选是针对脑膜炎奈瑟球菌感染的疫苗。
除非另外指出，否则本发明的实施将使用分子生物学、病毒学、微生物学或生物化学的标准常规方法。这样的技术描述于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,ALaboratory Manual(2nd>edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷；以及Brown(1998)Molecular Biology LabFax,Second Edition,Academic Press(UK)的第I卷和第II卷；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait editor)；Nucleic Acid Hybridization(Hames and Higgins,eds.)。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性的意义用来表示包含该词后的项目，但不排除没有特别提到的项目。另外，当用不定冠词“一个”或“一种”来提及要素时，并不排除存在超过一个要素的可能性，除非上下文清楚地要求此处有且仅有一个要素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个”。
词语“约”或“大约”与数值联用时(例如，约10)，优选表示该值可以是多于或少于指定值(10)的0.1％的值。
在本书面说明中引述的所有专利和参考文献在此均通过引用以其整体并入本文。
本发明还通过以下实施例进行描述，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。
附图说明
图1.脑膜炎奈瑟球菌的加速器(accelerostat)培养。图A显示了稀释速率(黑色线，aD为0.0055h-2)、实际测量的稀释速率(菱形)、二氧化碳释放速率随时间的变化(灰色线)。图B显示了加速器培养(黑色)和化学恒定器培养(灰色)中，在不同稀释速率的sOMV比生产率。
图2.溶解氧张力增加对脑膜炎奈瑟球菌生长的影响。图A显示了DOT改变器(DOT-changestat)中溶解氧的控制，其中DOT设定点每小时增加1％。DOT升高对生长的影响显示于图B中，而两种细菌都能处理高水平的DOT。研究发现，囊泡的释放随着更高的DOT而增加(图C)。
图3.高溶解氧张力诱导脑膜炎奈瑟球菌分批培养物中的OMV释放。控制在30％和100％空气饱和度的脑膜炎奈瑟球菌分批培养物的生长曲线显示出了类似的生长(图A)。结果表明，氧气浓度的增加诱导了更高的囊泡释放水平(图B)。图是两个重复培养的叠加图，实际上可提供涵盖24h的充分数据点。第一重复由0h至12h培养和24h培养时的数据点组成，第二重复由0h时和15h至22h时的数据点组成。
图4.DOT触发大肠杆菌和百日咳博德特菌中的OMV释放。大肠杆菌(A)的DOT改变器显示在DOT改变器中，αDOT＝1.5％/h时，DOT水平升高至200％时的生长。OMV释放与DOT的升高直接相关。在DOT改变器实验中，αDOT＝1.0％/h时，百日咳博德特菌(B)显示出在高达180％的DOT生长，此后，废气中的二氧化碳浓度显示下降。
实施例
实施例1
材料和方法
细菌菌株
这个研究使用脑膜炎奈瑟球菌血清群B分离株H44/76的重组衍生物(Holten1979)。选择的菌株是H44/76分离株的缺乏PorA的衍生物。这种菌株具有非荚膜表型，因为敲除了siaD，lpxL1的缺失减弱了LPS毒性，rmpM的缺失增加了囊泡的形成(除非另有说明)，lgtB的突变促进了与树突状细胞的相互作用(Steeghs et al.2006；van de Waterbeemdet al.2010)。这种菌株存储在甘油中，作为工作种子批。所有培养都在化学成分确定的培养基中进行(Baart et al.2007b)。在硫酸盐上的生长在适应后进行，因为半胱氨酸是优选的硫源(Port et al.1984)。适应是通过将菌株在摇瓶中用较低浓度的半胱氨酸进行传代培养，然后在无半胱氨酸的培养基中生长而进行。
生物反应器培养
在碟形底部的5升Applikon生物反应器中进行分批培养，基于总体积的H/D比率为1.6。培养使用3升工作体积在Pierre Guerin Trytoni控制器中进行操作。温度控制在35±0.5℃，pH使用1M HCl和1M NaOH控制在pH7.2±0.05。除非另有说明，否则溶解氧张力(DOT)控制在30％。膜覆盖的电流计氧传感器(InPro 6850i,Mettler Toledo)在35℃的空气饱和的无菌培养基中校准100％。在培养的第一阶段，通过提高搅拌速率(300-1000RPM)控制DOT，接着，通过添加纯氧，增加顶空通气(1NL/min)中的氧气分数。接种后，直接将100％DOT培养物的搅拌速率设为1000RPM，然后通过在顶空中添加纯氧来控制DOT。无菌过滤(0.22μm)后，取样进行光密度测量以及用于营养物和sOMV测量，并于4℃储存。通过Thermo Primaδb过程质谱仪分析废气组合物。
连续培养
以类似于分批培养设置的设置进行连续培养。将5升生物反应器的工作体积从3.0升降至2.0升，以减少实验所需的补料培养基。容器配有培养基入口和两个出口管，一个出口管在搅拌器高度处浸没在培养液中，另一个出口管直接设在液-气界面。后者可以将固定最大搅拌速度的工作体积正好控制为2.0升，不受发泡影响。生物反应器的重量、补料培养基和pH滴定溶液均通过天平来测量，用于验证稀释速率。取样进行光密度测量和废气分析，这类似于分批培养。使用与分批培养相同的控制回路来控制生物反应器。生长8小时后，启动补料泵和排放泵以使连续培养开始。基于稳定的细菌密度值和生物反应器体积的至少3次稀释的稳定二氧化碳排放量，假定培养物处于稳态。
加速器培养和DOT改变器培养
从D＝0.03h-1的稳定状态的化学恒定器发酵(操作如前面部分所描述)开始，线性提高稀释速率，aD＝0.0055h-2，从而启动加速器。通过提高培养基流入速率和同等地提高培养液流出速率来改变稀释速率。从培养液中取50mL样品以纯化sOMV。将样品在4000×g于4℃离心30min，在100kDa旋转过滤器上浓缩无菌过滤的上清液(Nalgene RapidFlow 0.2μmPES过滤器单元)。用TrisHCl(pH 7.4)缓冲的3％蔗糖清洗浓缩的sOMV，冲掉污染蛋白。接下来，将经过渗滤的sOMV在125.000×g离心2h。将含有sOMV的沉淀溶解在1mL含3％蔗糖的pH7.4的TrisHCl中。
DOT改变器培养是从化学恒定器培养启动的。为此，如前面所描述，获得稳定状态的连续培养，μ＝0.04h-1。在此稳定状态期间，将DOT控制在30％，30％是DOT改变器的起始点。DOT改变器启动后，以DOT＝1.0％/h使DOT线性增加。
sOMV及代谢物的定量
将培养样品无菌过滤(0.22μm)，然后测量sOMV。通过将50μL的稀释样品或已知浓度的OMV与50μL染料溶液(0.05mM FM 4-64)混合，用磷脂特异性探针FM 4-64(SynaptoRedC2,Biotium)测量sOMV。在混合此溶液后，使用板式荧光计(Synergy MX,Biotek ex480,em650)直接测量荧光。从基于标准品的应答的校准曲线计算培养上清液中sOMV的浓度(sOMV对应于0–2.5mg/L总蛋白，且eOMV对应于0-10mg/L总蛋白)。在DOT改变器实验中，使用纳米颗粒跟踪分析(Malloy and Carr 2006)来进行sOMV定量。用经浓度升级进行校准的带有488nm激光器模块和sCMOS相机的NanoSight NS500(MalvernInstruments 2015)获取静态测量(30秒的10次抓取)。温度控制在25℃，抓取的图像用NTA 3.2软件构建3.2.16分析。自动化流量测量如前所述进行(Gerritzen et al.2017)。
OMV的尺寸在带有Zetasizer 7.11软件的Zetasizer Nano-ZS(MalvernInstruments)中通过动态光散射评估。测量使用SOP进行，SOP在后向散射模式中取三次测量值，具有自动的测量持续时间，定位设置是“寻找最佳位置”。样品假定为折射率为1.450以及吸光度为0.001的蛋白，水作为分散剂，粘度是0.8872cP，折射率是1.330。数据使用正态分析模型处理。
结果
sOMV释放作为生长速率的函数
分批培养静止期期间，OMV生产率增加(van de Waterbeemd et al.2013b)，这里提出了生长速率对OMV释放有何影响的问题。此处，我们通过缓慢增加脑膜炎奈瑟球菌化学恒定器培养物的稀释速率，评估加速器中生长速率对OMV释放的影响。在这个加速器培养方法中，缓慢的稀释速率(aD)改变应使培养保持在稳定状态(Paalme et al.1995)。在这个加速器中，使用0.0055h-2的aD(图1)。二氧化碳释放速率(CER)随稀释速率同时增加，直至稀释速率升至0.18h-1，相应地表明了生长速率增加。OMV在整个加速器过程中产生，这些OMV在尺寸和蛋白质组成方面相似(数据未显示)。生长速率从0.03h-1变为0.18h-1，表明不影响sOMV的比生产率(图1)。三种不同生长速率的脑膜炎奈瑟球菌的化学恒定器培养物证实了这些结果。我们从这些结果中得出结论，生长速率的降低(例如，从0.18h-1到0.03h-1)不是sOMV释放的触发因素。
通过DOT改变器评估的氧化应激的影响
由于单独的生长速率降低不能用作sOMV释放的触发因素，因此，我们设想，可能使用氧化应激来直接诱导sOMV释放。因此，我们评估了氧化应激对sOMV释放的影响。我们之前已经证明了在添加过氧化氢的条件下释放囊泡(van de Waterbeemd et al.2013b)。然而，对于可规模化的OMV生产方法来说，添加过氧化氢的方法是不可行的，因为将过氧化氢局部添加到细菌培养物中会导致显著的细胞死亡和细菌裂解。我们接着测试了细胞外氧化应激是否可由高浓度的溶解氧诱导，溶解氧浓度是生物反应器培养中的控制参数之一。为了使高氧带来的应激最小化，以及为了防止氧气抑制，通常将DOT保持在低水平(Haugaard1968)。尤其是对于兼性厌氧病原体，标准的做法是将培养设计为具有低的DOT。例如，我们用于两种疫苗概念Hexamen和Nonamen的脑膜炎奈瑟球菌培养中，已将DOT水平设计为30％空气饱和度(Baart et al.2007a；Claassen et al.1996)。此处，我们使用改变器方法评估了DOT的增加对细菌生长和OMV释放的影响。对于这种DOT变化器，将化学恒定器培养的DOT线性增加至维持稳定状态的培养(图2A)。脑膜炎奈瑟球菌显示出能够在高达150％DOT生长而不显著影响在线测量值(图2B)。更高的DOT水平导致二氧化碳产生快速减少，以及由于冲洗和裂解，生物质浓度降低。在高达220％的DOT时，观察到二氧化碳产生。sOMV的释放与培养液中氧气的浓度线性相关(图2C)。通过高水平的DOT，可将OMV产生增加4倍，同时保持细菌的生长。实施例2中大肠杆菌和百日咳博德特菌的DOT改变器实验显示了类似的相关性，即DOT水平升高时，OMV释放增加(图4)。从而，以高DOT诱导OMV生产可应用于普遍的革兰氏阴性细菌。
氧气浓度升高时分批培养的生产率增加
接着，将高氧气浓度应用到分批培养中，以评估在分批培养中提高sOMV产量的可行性。使用100％空气饱和度的溶解氧张力，因为这个值显示OMV释放增加，同时在改变器中维持与30％空气饱和度时类似的生长特征(图2)。细菌在化学成分确定的培养基中生长，该培养基在从静止期开始就触发sOMV释放。30％和100％空气饱和度的分批培养物的细菌生长谱类似，表明脑膜炎奈瑟球菌处理较高的氧气浓度的能力(图3A)。更高的氧气浓度触发囊泡释放增加，在培养结束时，相对于30％的标准水平，导致3倍更高的生产率(图3B)。OMV的尺寸在整个培养中保持恒定，并且尺寸在两种浓度下类似(数据未显示)。高溶解氧水平还被证明是分批培养中sOMV释放的强力诱导剂。
实施例2
材料和方法
大肠杆菌
将大肠杆菌JC8031(TolRA)用于大肠杆菌的DOT改变器(Espesset et al.1994)。通过将10μL的冷冻甘油储液(-80℃)加入到100mL LB培养基(大胶囊：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，MP Biomedicals)中，并将摇瓶在37℃温育16小时，开始摇瓶培养。生物反应器培养均在无消泡剂的LB培养基中在37℃进行，最大搅拌速度是600RPM。
百日咳博德特菌
在这个研究中使用百日咳博德特菌疫苗菌株BP509(van Hemert 1967)。使用无硫酸镁的化学成分确定的培养基(Metz et al.2017；Thalen et al.1999)。DOT改变器的启动类似于上文描述的脑膜炎奈瑟球菌培养，DOT改变器的稀释速率是0.05h-1。使用具有5.4L工作体积的7L Applikon生物反应器，基于总体积的H/D比率为2.2。
结果
通过提高DOT水平来释放OMV不限于脑膜炎奈瑟球菌，也可扩展至其它革兰氏阴性细菌。我们在DOT改变器实验中测试了氧化应激对百日咳博德特菌和大肠杆菌的影响(图4)。两种细菌都在DOT升高时表现出囊泡形成增强。大肠杆菌能够处理超过200％的DOT，此后，实验停止。百日咳博德特菌在DOT超过180％时，显示二氧化碳释放速率降低，此后，实验终止。
此外，两种培养物的生物质浓度在更高的DOT时表现出明显的下降。这种联系也在脑膜炎奈瑟球菌上观察到。我们假定，氧化应激下，维持需要相对更多的能量。由于实验设置是化学恒定器，其具有固定的营养物供应和稀释速率，因此，维持所需的能量增加表现为生物质浓度的降低，因为能用于细菌生长的能量减少了。
在百日咳博德特菌的DOT改变器期间，pH控制受到实验期间DOT设定点为约80％DOT时的pH滴定剂阻断的影响。这导致了pH在3小时内从7.2线性增加至7.4，然后由于加入了过量的酸，pH快速下降至5.5。在此快速下降后，控制器再次快速维持pH 7.2的设定点(数据未显示)。明显地在这个时间点观察到高sOMV浓度，但此偏差的确切影响仍未知。此偏差不影响DOT增加与百日咳博德特菌囊泡释放之间的关系的结论，因为这个作用在30％至80％的DOT之间已经观察到。
关于实施例1和实施例2的讨论
在这个研究中，我们研究了外部信号来诱导OMV形成。结果表明，0.03h-1至0.18h-1的生长速率不影响OMV的生物生成。氧化应激确实触发OMV释放，其可通过增加生物反应器培养物的溶解氧张力直接应用于这些培养。氧化应激可通过增加生物反应器培养物的DOT而直接应用于这些培养。DOT改变器培养物表明，革兰氏阴性细菌能够处理高达200％空气饱和度的溶解氧浓度。DOT升高直接增加OMV释放。OMV生产率在120％的DOT的DOT改变器培养中增加4倍，在DOT控制在100％的分批培养中增加3倍。对大肠杆菌和百日咳博德特菌应用升高的DOT导致类似的OMV释放增加，表明这种方法可广泛应用于革兰氏阴性细菌。
通过氧化应激生产OMV可在生物反应器中通过控制培养液中的氧气浓度触发。在增加OMV形成的已知突变的基础上，观察到氧化应激触发以触发OMV释放(Bernadac etal.1998；Deatherage et al.2009；van de Waterbeemd et al.2010)。这些突变减少了外膜与肽聚糖层之间的连接。对于脑膜炎奈瑟球菌，虽然我们还测试了高DOT对包含RmpM的相关菌株的影响，但是我们使用rmpM敲除菌株来评估氧气对囊泡释放的影响(数据未显示)。在DOT改变器中，高DOT水平不触发也包含RmpM的脑膜炎奈瑟球菌的囊泡释放的增加，虽然每升培养物的OMV产量保持低于rmpM敲除培养物。
氧化应激可以是诱导OMV释放的一般机制。此处，我们证明了针对脑膜炎奈瑟球菌、大肠杆菌和百日咳博德特菌的这种联系。Sabra等人通过电子显微照片证明了，铜绿假单胞菌在极端氧化应激(pO2～350％的空气饱和度)条件下相对于缺氧条件(pO2～0)下形成更多的囊泡(Sabra et al.2003)。在生物学上，细菌形成OMV的应答可解释为对避免巨噬细胞吞噬的应答。在感染过程中，sOMV释放很可能有助于暴发性脑膜炎球菌性脓毒症的疾病进展和严重程度(Brandtzaeg et al.1989；van Deuren et al.1995)。脑膜炎奈瑟球菌在吞噬细胞氧化爆发时遭遇氧化应激(Moslen 1994；Ng et al.2004)。Lappann等人证明，脑膜炎奈瑟球菌的sOMV诱导中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的形成，以及OMV与NET的结合充当细菌规避与NET结合的诱饵(Lappann et al.2013a)。OMV在与吞噬细胞相互作用过程中的作用应该会获得更多关注。
生长速率显示影响氧化应激应答。氧化应激的产生是需氧细菌生长的特征，因为呼吸链的组分被氧化(Storz and Imlay 1999)。奈瑟球菌属物种是含有线粒体样呼吸链的氧化酶阳性病原体(
1984)。奈瑟球菌属物种通常显示出高水平的呼吸(Archibaldand Duong 1986)。脑膜炎奈瑟球菌基因组编码多个小c型细胞色素和单个cbb3型的末端细胞色素氧化酶(Aspholm et al.2010；Deeudom et al.2008；Li et al.2010；Seib etal.2006)。Li等人假定奈瑟球菌属物种的高呼吸能力和过高的氧气还原能力起到了防御内源性活性氧(ROS)的作用(Li et al.2010)。SodA和MntC是参与奈瑟球菌属物种氧化应激应答的主要效应物(Seib et al.2004；Tseng et al.2001)。在这个研究的加速器实验中，生长速率随CER线性增加至生长速率高达0.18h-1。在更高的稀释速率下，观察到CER减少，实验停止。此培养基上的脑膜炎奈瑟球菌的最大比生长速率是0.5h-1(van de Waterbeemd etal.2010)，因此，在此稀释速率下，不希望冲洗。选择的加速速率中等高(aD＝0.0055h-2)，且可能需要更多的适应时间来适应生长速率的增加。选择的加速速率可能会导致低估了较高稀释速率的影响。这些化学恒定器显示出碳源葡萄糖和谷氨酸的耗竭，培养很可能会受碳限制。观察到的生长速率降低和更低的细菌密度可以由维持所需的能量增加来解释。
我们的初始结果表明，虽然氧化应激可对细菌造成损害，但是不影响OMV尺寸。总的来说，氧气浓度升高会影响细菌生长和生物组分的生产(Baez and Shiloach 2014)。奈瑟球菌属物种适应呼吸系统引起的ROS的产生，因为活性氧作为有氧呼吸的副产物而积累(Imlay 2008；Korshunov and Imlay 2006)，且包含处理ROS的数种方法(Seib etal.2004；Seib et al.2006)。DOT改变器实验表明，可以控制DOT的增加，从而有可能保持生长。诸如对OMV添加酶(Alves et al.2015；Su et al.2017)的应用也能从这种生产方法中获益。
本公开内容拓展了sOMV生产率有关的知识，并增强了过程控制。我们使用细菌培养物的溶解氧张力来诱导氧化应激，以测试氧化应激对囊泡释放的影响。虽然为兼性有氧微生物设计具有高DOT的发酵方法并非明显的(Hewitt et al.2000)，但是结果表明，其是诱导外膜囊泡形成的方便的工艺参数。除了通过改变代谢来诱导氧化应激以外，升高DOT可能是更简单更好的可控方法。使用这种方法，从革兰氏阴性菌培养物中可行地生产sOMV用于许多应用成为可能。
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<210> 1
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 1
Met Pro Ser Glu Lys Lys Met Cys Ile Glu Met Lys Phe Ile Phe Phe
1 5 10 15
Val Leu Tyr Val Leu Gln Phe Leu Pro Phe Ala Leu Leu His Lys Ile
20 25 30
Ala Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Val Lys Pro Arg Arg
35 40 45
Arg Ile Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Cys Phe Ser Glu Trp Ser Glu
50 55 60
Glu Lys Arg Lys Thr Val Leu Lys Gln His Phe Lys His Met Ala Lys
65 70 75 80
Leu Met Leu Glu Tyr Gly Leu Tyr Trp Tyr Ala Pro Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Lys Ser Leu Val Arg Tyr Arg Asn Lys His Tyr Leu Asp Asp Ala Leu
100 105 110
Ala Ala Gly Glu Lys Val Ile Ile Leu Tyr Pro His Phe Thr Ala Phe
115 120 125
Glu Met Ala Val Tyr Ala Leu Asn Gln Asp Ile Pro Leu Ile Ser Met
130 135 140
Tyr Ser His Gln Lys Asn Lys Ile Leu Asp Glu Gln Ile Leu Lys Gly
145 150 155 160
Arg Asn Arg Tyr His Asn Val Phe Leu Ile Gly Arg Thr Glu Gly Leu
165 170 175
Arg Ala Leu Val Lys Gln Phe Arg Lys Ser Ser Ala Pro Phe Leu Tyr
180 185 190
Leu Pro Asp Gln Asp Phe Gly Arg Asn Asp Ser Val Phe Val Asp Phe
195 200 205
Phe Gly Ile Gln Thr Ala Thr Ile Thr Gly Leu Ser Arg Ile Ala Ala
210 215 220
Leu Ala Asn Ala Lys Val Ile Pro Ala Ile Pro Val Arg Glu Ala Asp
225 230 235 240
Asn Thr Val Thr Leu His Phe Tyr Pro Ala Trp Lys Ser Phe Pro Gly
245 250 255
Glu Asp Ala Lys Ala Asp Ala Gln Arg Met Asn Arg Phe Ile Glu Asp
260 265 270
Arg Val Arg Glu His Pro Glu Gln Tyr Phe Trp Leu His Lys Arg Phe
275 280 285
Lys Thr Arg Pro Glu Gly Ser Pro Asp Phe Tyr
290 295
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 2
Met Thr Lys Gln Leu Lys Leu Ser Ala Leu Phe Val Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ser Gly Thr Ala Val Ala Gly Glu Ala Ser Val Gln Gly Tyr Thr Val
20 25 30
Ser Gly Gln Ser Asn Glu Ile Val Arg Asn Asn Tyr Gly Glu Cys Trp
35 40 45
Lys Asn Ala Tyr Phe Asp Lys Ala Ser Gln Gly Arg Val Glu Cys Gly
50 55 60
Asp Ala Val Ala Ala Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Pro Val Val Val Val Glu Gln Ala Pro Gln Tyr Val Asp Glu Thr
85 90 95
Ile Ser Leu Ser Ala Lys Thr Leu Phe Gly Phe Asp Lys Asp Ser Leu
100 105 110
Arg Ala Glu Ala Gln Asp Asn Leu Lys Val Leu Ala Gln Arg Leu Ser
115 120 125
Arg Thr Asn Val Gln Ser Val Arg Val Glu Gly His Thr Asp Phe Met
130 135 140
Gly Ser Asp Lys Tyr Asn Gln Ala Leu Ser Glu Arg Arg Ala Tyr Val
145 150 155 160
Val Ala Asn Asn Leu Val Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Arg Ile Ser
165 170 175
Ala Val Gly Leu Gly Glu Ser Gln Ala Gln Met Thr Gln Val Cys Glu
180 185 190
Ala Glu Val Ala Lys Leu Gly Ala Lys Val Ser Lys Ala Lys Lys Arg
195 200 205
Glu Ala Leu Ile Ala Cys Ile Glu Pro Asp Arg Arg Val Asp Val Lys
210 215 220
Ile Arg Ser Ile Val Thr Arg Gln Val Val Pro Ala His Asn His His
225 230 235 240
Gln His
Claims (14)
1.一种生产自发释放的细菌外膜囊泡(OMV)的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)培养革兰氏阴性细菌菌群，所述培养包括通过应用比在35℃测量的30％空气饱和度的生理溶解氧张力(DOT)高的DOT来刺激OMV释放；以及，
b)回收a)中释放的所述OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV中除去细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中应用来刺激OMV释放的DOT为至少在35℃测量的31％、32％、35％、40％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％空气饱和度，以及其中优选地，应用来刺激OMV释放的DOT低于在35℃测量的350％、325％、300％、275％、250％、225％、205％或185％空气饱和度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养包括采用添加补料培养基的模式，其中所述模式选自补料分批模式、半连续模式和连续模式。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)第一阶段，其中所述革兰氏阴性细菌的生物质在第一DOT积累；以及，
b)第二阶段，其中通过应用比第一DOT高的第二DOT来刺激OMV从a)中积累的生物质中释放；
其中优选地，所述第一DOT是生理DOT，优选是低于在35℃测量的50％、40％、35％或32％空气饱和度的DOT。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌具有以下至少一项：
a)遗传修饰，所述遗传修饰使所述细菌产生具有减少的毒性的LPS但LPS仍保留至少部分的其佐剂活性；优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物的一个或多个基因的表达的修饰，和/或所述遗传修饰是引起一个或多个lpxE和/或pagL基因表达的修饰；
b)遗传修饰，所述遗传修饰使所述细菌与没有所述遗传修饰的相应野生型细菌相比过量生产OMV，其中所述遗传修饰是减弱包含肽聚糖相关位点的一种或多种蛋白的肽聚糖结合活性的修饰，优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自tolQ、tolR、tolA、tolB、tolRA、rmpM和ompA基因的一个或多个基因的表达的修饰；以及，
c)遗传修饰，所述遗传修饰降低或敲除基因产物的表达，优选地，基因产物选自cps、脂质A生物合成基因产物、PorA、PorB和OpA。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌属于选自奈瑟球菌属(Neisseria)、博德特菌属(Bordetella)、螺杆菌属(Helicobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、志贺菌属(Shigella)、嗜血菌属(Haemophilus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、莫拉菌属(Moraxella)、克雷伯菌属(Klebsiella)和不动杆菌属(Acinetobacter)的属；优选地，所述细菌是选自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、志贺菌属物种(Shigella spp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherischia coli)、黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的种。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌表达相对于所述革兰氏阴性细菌是外源的抗原。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌表达多种抗原，其中优选地，所述菌群包含多于一种革兰氏阴性细菌菌株，以及其中每种菌株表达不同的抗原。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述OMV经过灭菌，优选地通过过滤器灭菌，优选地使用孔小于约0.3微米的过滤器。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，还包括将OMV与药学上可接受的赋形剂组合和任选组合佐剂的步骤。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述OMV用于疫苗。
12.可通过前述权利要求任一项所述的方法获得的OMV。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求12所述的OMV和药学上可接受的赋形剂以及任选包含佐剂。
14.根据权利要求12所述的OMV或根据权利要求13所述的药物组合物，其用作药物，优选在脑膜炎治疗中。
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