CN101203605A

CN101203605A - 革兰氏阴性菌的lps的脱酰基化

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Publication number: CN101203605A
Application number: CNA2005800484206A
Authority: CN
Inventors: J·P·M·托马森; P·A·范德莱; J·J·G·戈尔特森
Original assignee: NVI NL VACCININST
Current assignee: Nederlanden Volksgezondheid Welzijn en Sport VWS
Priority date: 2004-12-17
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2008-06-18
Anticipated expiration: 2025-12-16
Also published as: WO2006065139A3; AU2005317304B2; NZ555889A; EP1828378A2; NO20073088L; US8048433B2; BRPI0519923A8; PT1828378E; CN101203605B; WO2006065139A2; JP2008523805A; EP1828378B1; PL1828378T3; NO340331B1; CA2590906C; AU2005317304A1; MX2007007288A; BRPI0519923A2; CA2590906A1; ES2493440T3

Abstract

本发明提供新的革兰氏阴性菌多肽，所述多肽显示脂质A3－O－脱酰基酶活性并能修饰和/或解毒革兰氏阴性菌LPS。本发明还提供革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)以及包含LPS的组合物，它们具有本发明的3－O－脱酰基酶活性或经过其处理，并且它们可用于药物和/或兽药目的，特别是用于制备针对革兰氏阴性致病菌例如百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌的全细胞疫苗或无细胞疫苗。

Description

革兰氏阴性菌的LPS的脱酰基化

发明领域

本发明涉及微生物学领域，特别是涉及革兰氏阴性菌LPS的合成和修饰的生物学领域。本发明还涉及医学领域，特别是涉及针对细菌性病原体的疫苗接种领域。本发明另外涉及革兰氏阴性细菌、革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)以及包含LPS的组合物，这些可用于药物和/或兽药目的，特别是用于制备针对革兰氏阴性菌例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的疫苗。本发明另外提供含有脱酰基化LPS的疫苗，以及修饰的和脱毒的LPS在制备全细胞疫苗和无细胞疫苗中的用途。

发明背景

百日咳博德特氏菌感染是百日咳的病因，据估计全世界每年约有6千万病例，并致死约355,000人(WHO)，特别是儿童和免疫损害的个体。尽管抗生素(红霉素)治疗是有效的，但到疾病被确诊时，细菌毒素常常已经造成严重的伤害。因此，疾病的预防是极为重要的。主要的控制措施仍然是进行接种疫苗。通常，针对百日咳感染的疫苗一直是基于百日咳博德特氏菌的全细胞。全细胞百日咳博德特氏菌疫苗(包含通过热处理、甲醛或其它措施而灭活的全细菌)，一直是自从20世纪50年代早期以来的常规接种程序。

通过全细胞百日咳疫苗的免疫尽管可有效预防婴儿的百日咳，已经涉及局部的、全身的和神经学反应，包括儿童的发烧、惊厥和脑病。在百日咳免疫后，LPS是造成儿童中不良反应的主要原因。在动物的细菌性感染期间，LPS或其脂质A部分通过Toll样受体(主要是TLR-4)的相互作用，来激活先天免疫系统。宿主对脂质A的应答，包括产生阳离子抗微生物肽、细胞因子、趋化因子和其它免疫刺激分子。在受限制的感染中，对脂质A的应答有助于清除细菌，但在不可控制的败血症中，高水平的循环细胞因子和促凝物活性可损害微血管系统，并导致革兰氏阴性感染性休克与弥漫性血管内凝血综合征。

尽管在小鼠中的被动免疫实验已经证明针对LPS的抗体可提供一定水平的保护，但没有关于LPS在百日咳疫苗中具有保护作用的确凿证据。此外，更重要地是，存在于疫苗中的LPS，确实通过强化针对其它抗原的免疫应答而提供佐剂活性(K.Mills：Immunity to Bordetellapertussis.Microbes and Infection 3：655-677，2001)。

安全方面的考虑已经负面影响了疫苗的摄入，并促使通过来自百日咳博德特氏菌的高度纯化的抗原而研制、制备无细胞的百日咳疫苗。近年来，除了所谓的“全细胞疫苗”或“WCV”之外，一些国家现在已经引进了无细胞疫苗或“ACV”。

无细胞疫苗通常由1至3种或更多的病原体抗原组成。至于通常使用的百日咳博德特氏菌抗原是；百日咳毒素(PT，通常对其处理来破坏其毒力，同时维持其免疫原性)、丝状血凝素(FHA)、菌毛以及69kD蛋白质或pertactin(Prn)。通常，无细胞疫苗的反应原性比全细胞疫苗的反应原性低得多。无细胞疫苗发生全身反应(发烧、呕吐、焦躁、厌食)和局部反应(气胀、发红、热度、触痛、硬度、疼痛)的频率明显减少。然而，对于无细胞疫苗的保护性免疫是否匹敌全细胞疫苗的保护效应，临床的数据仍然是有争议的。在许多研究中，全细胞疫苗的保护效应是更好的，而争论仍在继续，即全细胞疫苗的保护效应与其在婴儿中引起虽然罕见但却严重的副作用的风险相比孰轻孰重。现在，正在测试各种免疫模式，其中最多给予六个剂量的无细胞疫苗。最初，全细胞疫苗给药5次，掺入到常规疫苗计划中进行，末次加强在4-6岁时给予。现在推荐无细胞百日咳疫苗给药6次，其中包括在十几岁时给予最后一剂(联合了白喉-破伤风疫苗)。无细胞疫苗看来比全细胞疫苗更安全，但两者都不能用于以往对百日咳疫苗出现过过敏反应的儿童。

在本领域中，已经充分地证明了百曰咳全细胞疫苗的不良副作用(参见S.H.Yeh：Pertussis：persistent pathogen，imperfect vaccines.Expert Rev.Vaccines 2：113-127，2003)。尽管现在使用的无细胞疫苗部分地克服了这些不良副作用，但在这些疫苗所提供的保护性免疫仍然是有争论的，并且留下许多改进的余地。重要的是，在小鼠模型中，发现了全细胞疫苗比无细胞疫苗具有更优的长效保护(K.Mills：Immunity to Bordetellapertussis.Microbes and Infection 3：655-677(2001))。另外，无细胞疫苗成本更高，并难以生产、需要对各种抗原进行分离、彻底纯化和质量控制并以最适量/期望量对它们进行混合和配制。显然，需要长期研制更好的百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌及其它的革兰氏阴性菌疫苗。

发明详述

本发明提供用于制备改进的百日咳疫苗的方法和工具。本发明公开了新的博德特氏菌蛋白。根据本发明，使用这些新的百日咳博德特氏菌、副百日咳鲍特氏菌和支气管炎博德特氏菌蛋白和编码这些蛋白的DNA分子，以修饰脂质A，从而提供包含至少部分3-O-脱酰基化的和脱毒的LPS的新的百日咳博德特氏菌、副百日咳鲍特氏菌和支气管炎博德特氏菌菌株及其它革兰氏阴性菌细胞。本发明还提供用于接种的改良组合物，其包含博德特氏菌细菌细胞，所述博德特氏菌细菌细胞包含部分3-O-脱酰基化的LPS，以及药物组合物，所述药物组合物包含分离的且至少部分3-O-脱酰基化的LPS或体外3-O-脱酰基化的LPS。本发明另外提供了针对3-O-脱酰基化脂质A和/或LPS分子产生的且对其具有特异性的抗体。

作为革兰氏阴性菌外膜的主要组分，已知脂多糖(LPS)对于所述的膜发挥通透屏障的功能并抵抗补体介导的细胞溶解作用具有重要作用(综述见1)。它由三个共价连接的结构域组成：脂质A、核心以及O抗原。脂质A形成疏水膜锚着点，并引起LPS的内毒素活性。在大肠杆菌(Escherichia coli)中，它由1，4′-二磷酸化的β-1，6-连接的葡糖胺二糖组成，它通过酯或酰胺键在位点2、3、2′和3′具有R-3-羟基豆蔻酸残基取代。二级月桂酰和豆蔻酰基分别在2′-和3′-位点取代R-3-羟基豆蔻酰的羟基(图1A)。以前的研究表明：磷酸基、葡糖胺二糖、以及适当数目和长度的酰基链对于脂质A的生物学活性是很重要的(1，2，3)。

尽管观测到两种磷酸酯和酰基链数目以及长度的取代作用模式中的轻微变化，但脂质A的基本结构在革兰氏阴性菌中还是相当保守的(4，5)。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium)中，通过二元调控系统PhoP/PhoQ调控脂质A的其它修饰(6，7)(图1B)。应答于低Mg²⁺水平，传感激酶(Sensor kinase)PhoQ磷酸化并从而激活转录激活因子PhoP，这导致激活或抑制40种不同的基因(6，8)。参与脂质A修饰的二级调控系统是PmrA/PmrB二元系统，其自身受到PhoP/PhoQ的调控(9，10)。具有PhoP/PhoQ系统中的变异的突变体，降低了毒力并增加了对抗微生物肽的敏感性(11，12)。已经在其它革兰氏阴性菌中鉴定了PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系统的同系物，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)以及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(13，14)。

迄今为止，已经鉴定了一些修饰脂质A的酶。在鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)中发现，以一或两个4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)部分来取代1和4′磷酸基依赖于酶ArnT(15)。近来，PmrC蛋白被鉴定出在鼠伤寒沙门氏菌中介导磷酸乙醇胺(pEtN)加入脂质A中(16)。另一种被称为LpxO的酶，催化脂质A的依赖O₂的羟基化反应(17)，并在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中鉴定了脂质Al-磷酸酶(18)。所有这些酶被认为是位于内膜或周质间隙中(15，16，17，18)。最近，发现了位于外膜的修饰脂质A的新种类的酶。其中一个是棕榈酰转移酶PagP(19)。脂质A的棕榈酰化导致对阳离子的抗微生物肽的抗性的增加(7)。此外，棕榈酰化脂质A拮抗了LPS诱导的人细胞的激活(20)。在下列菌种中发现了PagP的同系物：鼠伤寒沙门氏菌、百日咳博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、大肠杆菌、以及鼠疫耶尔森氏菌(19，21)。

另一种位于外膜的脂质A修饰酶是3-O-脱酰基酶PagL(22)。该酶在鼠伤寒沙门氏菌中被发现，并表现出水解脂质A的3位的酯键，从而释放一级3-羟基豆蔻酰部分(22)。迄今为止，除了在密切相关的伤寒沙门氏菌种和副伤寒沙门氏菌种中之外，在非重复或未完成的微生物数据库中没有发现pagL的明显同系物。然而，其它的革兰氏阴性菌，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(14)、豇豆根瘤菌(R.Leguminosarum)(23)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(24)、和Porhyromonas gingivalis(25)，都含有3-O-脱酰基化脂质A类型，这暗示着这些生物体含有与pagL相似活性的酶。

本发明公开了各种革兰氏阴性菌中的pagL同系物的鉴定法。各种蛋白质中的有限序列相似性和发达的生物信息学工具被用于鉴定这些同系物和它们的活性位点的残基。在本说明书中，我们描述了用于在各种革兰氏阴性菌中异源表达的pagL同系物的存在和用途。尽管与来自沙门氏菌的已知pagL基因的总体序列相似性相当地低，但在C末端区中可鉴定到保守的pagL区。

现有技术仅仅描述了来自沙门氏菌的PagL蛋白，并公开了PagL仅在大肠杆菌中异源表达(22)，得到脱酰基化LPS。在本领域中，没有关于pagL同系物在其它革兰氏阴性菌中存在的已有数据。异源pagL在其它革兰氏阴性菌中的表达，pagL在其它革兰氏阴性菌中是否有功能，pagL对其它革兰氏阴性菌中的脂质A/LPS组成、细菌存活力、毒力以及免疫原性的作用，都是未知因素。仅仅已知大肠杆菌中异源沙门氏菌pagL表达的有限数据，其中在表达重组人TLR4的细胞中测量了TLR应答，但这并不反映革兰氏阴性菌感染的天然情况(Kawasaki等，J BiolChem.2004)。

本发明的说明书公开了铜绿假单胞菌和支气管炎博德特氏菌pagL同系物的活性，这点已经通过在大肠杆菌和博德特氏菌(Bordetella spp.)中的异源表达得到证实，其中所述的活性导致从脂质A上除去了R-3-羟基豆蔻酰基。以人巨噬细胞分析了LPS的生物学活性的影响。在PagL脱酰基作用后，大肠杆菌脂质A(但非百日咳博德特氏菌脂质A)发生另一种修饰，这是内源棕榈酰转移酶PagP的活性的结果。此外，鉴定出保守组氨酸-丝氨酸对是活性位点残基，这暗示着类似于丝氨酸水解酶的催化机理。最后，证明了PagL对LPS底物的体外活性。根据本发明，可应用pagL的生物学功能，以修饰革兰氏阴性菌致病力、毒力和免疫原性。这种修饰可发生在全菌细胞或其部分、组分或衍生的化合物上。本发明最后提供了针对革兰氏阴性细菌感染的新疫苗，包含本发明的革兰氏阴性细菌的全细胞，或从这些细菌所获得和/或分离的修饰的脂质A/LPS，或体外修饰的LPS/脂质A分子。

详细说明

定义：

本文中“序列相同性”，定义是通过比较序列而测定的两种或多种氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两种或多种核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还意味着通过所述的序列串的匹配而测定的氨基酸或核酸序列之间的序列相关的程度。通过将一条多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二条多肽序列进行比较，测定两条氨基酸序列之间的“相似性”。通过包括但不限于下列文献中描述的已知方法，可很容易地计算“相同性”和“相似性”：(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeine，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073，1988)。

测定相同性的优选方法，目的在于得到待测序列中的最大匹配。测定相同性和相似性的方法被编辑成可公开获得的计算机程序。测定两条序列之间的相同性和相似性的优选计算机程序方法，包括例如GCG程序包(Devereux，J等，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN以及FASTA (Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。从NCBI和其它来源可公开获得BLAST X程序(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

用于多肽序列比较的优选参数包括下列：算法(Algorithm)：Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)；比较矩阵(Comparison matrix)：来自Hentikoff和Hentikoff的BLOSSUM62(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919，1992)；空位罚分(Gap Penalty)：12；和空位长度罚分(Gap Length Penalty)：4。和这些参数一起使用的程序，是公众可得到的，例如来自Madison，WI的Genetics ComputerGroup公司的“Ogap”程序。上述参数是氨基酸比较(没有末端空位罚分的延续)的缺省参数。用于核酸比较的优选参数包括下列：算法：Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)；Comparison矩阵：匹配＝+10，错配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3。可使用来自Madison(Wisconsin)的Genetics Computer Group公司的Gap程序。以上列出都是用于核酸比较的缺省参数。

任选地，在测定氨基酸相似性的程度中，技术人员也可考虑技术人员已知的所谓的“保守”氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；具有酸性侧链的氨基酸组是天冬氨酸和谷氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文中公开的氨基酸序列的取代变体是在所公开的序列中已除去了至少一个残基并在其位置插入了不同残基的变体。优选地，氨基酸变化是保守的。以下是适于各种天然存在的氨基酸的优选的保守取代：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gln或Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met；Leu或Tyr；Ser至Thr Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；以及，Val至Ile或Leu。

根据本发明，当一种DNA片段与另一种DNA片段一起被置于功能性相关的位置时，是“可操纵连接地”。例如，如果可促进序列的转录，则启动子或增强子是可操作地连接于编码序列。如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前体蛋白，则其是可操作地连接于编码所述多肽的DNA。通常，可操作地连接的DNA序列是相邻的，且对于有信号序列的情况，它们既是相邻的同时也在阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必与转录受到其控制的编码序列相邻。通过在方便的限制酶切位点或插入的连接体或接头处进行连接，以实施连接。

合适启动子序列的选择，通常取决于为表达DNA片段而选定的宿主细胞。合适启动子序列的实例包括本领域中众所周知的原核和真核启动子(参见，例如Sambrook和Russell，2001，上文)。转录调控序列通常包括可被宿主识别的异源增强子或启动子。合适启动子的选择取决于宿主，但例如trp、lac的启动子和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖解酶启动子是已知并可得到的(参见，例如Sambrook和Russell，2001，上文)。可使用的表达载体包含复制系统和转录和翻译调控序列，以及多肽编码片段的插入位点。Sambrook和Russell(2001，上文)和Metzger等人(1988，Nature 334：31-36)描述了细胞系和表达载体的可行组合的实例。例如，合适的表达载体可在下列宿主中表达：酵母，如酿酒酵母(S.cerevisiae)；昆虫细胞，如Sf9细胞；哺乳动物细胞，如CHO细胞；以及细菌细胞，如大肠杆菌或博德特氏菌。

在第一个实施方案中，本发明提供包含脂质A 3-O-脱酰基酶活性的新的多肽，其中该多肽显示与SEQ ID No.1具有至少25、30、40、50、60、70、80、90、95、98或99％的氨基酸相同性，并且根据说明书中所述的分析法(如实施例3中举例说明的体内分析法或根据实施例9中的体外分析法)，该多肽表现出脂质A 3-O-脱酰基酶的活性。具有脂质A3-O-脱酰基酶活性的多肽，优选是根据SEQ ID No.1的多肽，或是支气管炎博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的PagL蛋白或其部分、或其变体，或是包含了具有脂质A 3-O-脱酰基酶活性的SEQ ID No.1的至少一部分的融合蛋白。

在另一个实施方案中，本发明包含编码所述多肽的核酸序列，其中该多肽显示与SEQ ID No.1具有至少25、30、40、50、60、70、80、90、95、98或99％的氨基酸相同性。优选地，根据本发明的核酸序列，显示与分别来自支气管炎博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的pagL基因的SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的核酸序列具有至少50、60、70、80、90、95、98或99％的相同性。所述的核酸序列是全长编码序列，或是自其衍生的编码或非编码(或互补)部分、片段或甚至是寡核苷酸。

本发明还包括DNA载体，该载体包含本发明的核酸序列，和/或包含可编码展现出与SEQ ID No.1具有至少25、30、40、50、60、70、80、90、95、98或99％的氨基酸相同性的肽的核酸序列。根据本发明的DNA载体，可以是本领域中已知的任何载体，例如但不限于：质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、人工染色体、用于(同源)基因组整合的载体。载体可含有标记，例如提供抗生素抗性的选择标记、荧光标记、分子标签等等。用于克隆本发明的核酸并表达编码蛋白的方法对于本领域技术人员是已知的，例如参考Sambrook等人(Molecular Cloning，冷泉港出版社，NY 1989)和Ausubel F.等人(Current Protocols in MolecularBiology，Wiley Interscience，2004)。优选本发明的载体是核酸序列被可操作地连接于调控序列(例如启动子、增强子和终止子)的载体，以便所述基因表达并将信使翻译为脂质A 3-O-脱酰基酶蛋白。最优选载体能在革兰氏阴性菌宿主细胞中表达并赋予其脂质A 3-O-脱酰基酶活性，任选地以诱导方式，例如通过质粒pMMB67上的诱导型tac启动子。

本发明还提供能结合SEQ ID No.1所示的多肽的抗体。如实施例所示，本发明的抗体可以是通过将本发明的多肽注入宿主中而激发的单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可用于诊断目的，例如分析革兰氏阴性菌中的PagL蛋白或其同系物的表达。抗体还可用于分离和/或纯化表现出脂质A 3-O-脱酰基酶活性的蛋白。

在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的核酸分子和/或包含编码本发明的多肽的核酸分子的革兰氏阴性菌。优选核酸分子被包括在本发明的DNA载体中，所述的载体使得编码的蛋白在革兰氏阴性菌细胞中表达并将脂质A 3-O-脱酰基酶活性提供给细胞。优选所述的革兰氏阴性菌是在其基因组中不包含可编码表现出脂质A 3-O-脱酰基酶活性的功能蛋白的基因的细菌，其中所述的蛋白例如是与如SEQ ID No.1所示的PagL蛋白具有显著(＞40％)的相同性的蛋白。最优选地，提供脂质A 3-O-脱酰基酶活性的来源将改变革兰氏阴性菌细胞的细胞壁外膜中的LPS的组分。具有脂质A 3-O-脱酰基酶活性源的革兰氏阴性菌，还可以是包含非功能基因的细菌(例如百日咳博德特氏菌)，其中例如通过突变、移码或缺失，所述的非功能基因可与如SEQ ID No.2或3所示的核酸序列具有显著的同源性。

然而，即便是在其基因组中包含编码具有脂质A 3-O-脱酰基酶活性的蛋白的(部分)功能基因的革兰氏阴性菌，也可为其提供落入本发明范围中的活性的额外来源。革兰氏阴性菌具有一定水平的脂质A 3-O-脱酰基酶活性，但通过提供本发明的多肽的额外的和/或增强的表达，可提高所述的活性。优选地，这导致细菌中的脂质A 3-O-脱酰基酶活性的瞬时或持续增加，直至与野生型细菌相比，细菌的脂质A和/或LPS成分被瞬时或持续改变或修饰的程度。例如，所述的革兰氏阴性菌是副百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌，但可选择任何其它的革兰氏阴性菌，优选致病革兰氏阴性菌，例如奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)，脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)。

根据本发明，包含脂质A 3-O-脱酰基酶活性或其水平提高的革兰氏阴性菌，优选在细菌细胞壁的外膜中至少部分包含3-O-脱酰化的脂质A和/或LPS类型。或者，在脂质A的3-O-脱酰作用之后，本发明的革兰氏阴性菌包含具有二级修饰的LPS或脂质A类型，例如在脂质A的棕榈酰化、去磷酸化或任何其它的3-O-脱酰化之后的二级修饰。本发明的细菌细胞的总LPS/脂质A中至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％为3-O-脱酰基化形式，或者其脂质A/LPS中至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％为具有二级修饰的形式，例如但不限于，棕榈酰化或去磷酸化。

在另一个方面中，本发明提供用于生产部分3-O-脱酰基化的LPS的方法。在第一个实施方案中，所述的方法包括在有助于去乙酰化LPS的合成的条件下培养革兰氏阴性菌的步骤，和任选地，包括回收脱酰基化LPS的步骤。用于培养各种革兰氏阴性菌的方法是本领域中已知的，例如参见″Methods for General and Molecular Bacteriology″(P.Gerhardt等，Eds.American Society for Microbiology，Washington DC，1994)。用于回收、分离和/或纯化LPS的方法也是本领域中已知的(MeningococcalVaccines，Methods and Protocols.A.J.Pollard和M.C.J.Maiden，Eds.Chapter 12：Construction of LPS mutants，PP.155-165.Humana Press，Totowa，New Jersey，2001)，例如可根据说明书中所提供的实例进行实施。

或者，本发明提供用于体外生产至少部分3-O-脱酰基化的LPS或脂质A的方法，该方法的步骤包括提供包含粗制或(部分)纯化形式的LPS或脂质A的组合物，并在有助于体外酶催化3-O-去乙酰化的条件下使该组合物接触本发明的多肽或蛋白。所述的条件参见本说明书的实施例9和方法章节。

在另一个实施方案中，本发明提供包含至少部分3-O-脱酰基化的LPS和/或脂质A的组合物，优选地总LPS或脂质A占的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90、95、98或99％是其3-O-脱酰基化的形式或是3-O-脱酰基化后的具有二级修饰的另一种形式，例如棕榈酰化形式。

包含部分3-O-脱酰基化的LPS和/或脂质A以及任选具有二级修饰本发明的组合物可用于制备药物组合物，其中本发明的组合物或者包含于细菌细胞的细胞壁外膜中，或者是粗制或纯化的形式。在特别优选的实施方案中，根据本发明的所述药物组合物，是适于接种目的的组合物。所述的药物组合物能在宿主生物体(优选是哺乳动物，更优选是人)中诱发针对革兰氏阴性菌的免疫应答。至少部分3-O-脱酰基化的LPS和/或脂质A的存在，或者具有3-O-脱酰基化后的二级修饰的存在，提供了一些优点，例如在受试者中，降低毒力、减少副作用的量及其严重度，以及在受治疗或接种的受试者中提高组合物的耐受量。药物组合物可含有1种或多种赋形剂和/或佐剂。药学上可接受的赋形剂和佐剂是本领域中已知的，并且技术人员可自由选择，例如参见：“Currentprotocols in Immunology，Wiley Interscience 2003or Remmington′sPharmaceutical Sciences，18^th ed.，Mack Publishing Company，1990”。

在第一个实施方案中，药物组合物可以是包含活的或活的减毒细菌细胞或无活力细菌细胞的全细胞疫苗，它们可通过冷冻、热处理、机械破坏、化学处理或制药和接种领域中已知的其它方法进行失活(J.L.Pace，H.A.Rossi，V.M.Esposito，S.M.Frey，K.D.Tucker，R.I.Walker.Inactivated whole-cell bacterial vaccines：current status and novel strategies.Vaccine 16：1563-1574(1998))。优选细菌细胞是革兰氏阴性致病菌细胞，更优选细菌细胞来自博德特氏菌属、沙门氏菌属、志贺菌属(Shigella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、埃希氏杆菌属、变形菌属(Proteus)，最优选是百日咳博德特氏菌属、副百日咳博德特氏菌属或支气管炎博德特氏菌属。

在第二个优选实施方案中，本发明的药物组合物可以是无细胞疫苗，其包含革兰氏阴性致病菌的1种、2种、3种或更多种免疫原性成分、并包含至少部分3-O-脱酰基化的LPS或脂质A、或3-O-脱酰基化之后的具有二级修饰的所述LPS。优选部分3-O-脱酰基化的脂质A和/或LPS是来自于根据本发明的革兰氏阴性致病菌细胞，其中优选细菌细胞是博德特氏菌属，最优选是百日咳博德特氏菌属、副百日咳博德特氏菌属或支气管炎博德特氏菌属。至少部分3-O-脱酰基化的脂质A和/或LPS，其任选具有脱酰基化之后的二级修饰，可用于诱发针对细菌产物的保护性免疫应答，或者也可与作为合适佐剂物质的其它组合物一起使用或混合。LPS是本领域中用于接种目的、活化Toll样受体以及刺激先天性免疫应答的已知的合适佐剂。本发明的部分3-O-脱酰基化的和至少部分脱毒的LPS和/或脂质A，极大地保持了这种免疫刺激(佐剂)活性，并很少引起与毒性相关的不良副作用，例如局部肿胀、发红、疼痛和发热。

根据本发明的药学上可接受的组合物和疫苗，可用于治疗患有或处于患上致病性革兰氏阴性菌感染的危险的受试者的方法，包括施用本发明的药物组合物、全细胞或无细胞疫苗。技术人员已知或可确定具体佐剂的使用、组合物中的物质的相对量和绝对量、以及给药的剂量方案，并且根据情况(例如具体致病性感染或待治疗的具体状况)可进行调整。剂量方案包括单剂量，但也可包括多剂量，例如加强剂量，并可进行口服给药、鼻内给药或胃肠外给药。适于接种目的的各种剂量方案是本领域中已知的，并可被技术人员进行适当地调整。

附图说明

图1：脂质A结构。大肠杆菌脂质A由通过四个R-3-羟基豆蔻酰部分取代的二磷酸化葡糖胺二糖组成，其中分别用月桂酸酯和豆蔻酸酯来酯化2′和3′脂肪-酰基链。B：沙门氏菌脂质A的调控修饰。分别地，由AmT和PmrC介导用L-Ara4N或pEtN来取代磷酸酯部分，由LpxO介导2-羟基豆蔻酸修饰的脂质A的形成，由PagP介导在2-位加入二级棕榈酰链，以及由PagL介导在3-位除去3-羟基豆蔻酰部分。

图2：PagL蛋白的多重序列比对。使用ClustalW(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)来比对序列。连字符表明用于最适比对所引入的空位。用星号标记完全保守的残基。冒号和圆点分别表示保守性强和保守性弱的残基。百日咳博德特氏菌中的pagLORF因移码而被破坏，为进行序列对比，通过在密码子33处加入两个核苷酸使其恢复。PagL同系物的GenBank蛋白登录号是：鼠伤寒沙门氏菌AAL21147、支气管炎博德特氏菌NP_890306、副百日咳鲍特氏菌NP_885487、百日咳博德特氏菌BX470248§、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)NP_253350、荧光假单胞菌(P.fluorescens)NZ_AAAT03000006§、恶臭假单胞菌(P.putida)NC_002947§、丁香假单胞菌(P.syringae)ZP_00125465、B.fungorum NZ_AAAJ03000003§、鼻疽伯克氏菌(B.mallei)NC_002970§、类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)NC_002930§、R.metallidurans ZP_00274744、茄科雷尔氏菌(R.solanacearum)NP 522762以及棕色固氮菌(A.vinelandii)ZP_00089534。符号§表示人工鉴定PagL同系物的全基因组(未完成)的GenBank登录号。

图3：PagL在大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)中的表达和膜定位。从含有空的pET-11a或pPagL质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE 3)分离膜，并通过SDS-PAGE进行分析。用考马斯亮蓝染色蛋白。星号表示经受微量测序并发现了相当于成熟PagL蛋白的条带。用双星号表示的条带，相当于PagL_(Bb)前体蛋白。左侧是分子量标准蛋白。

图4：用Tricine SDS-PAGE电泳分析LPS的体内修饰。将指数生长的、含有pET-11a或pPagL构建体的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)，用IPTG诱导所示的时间，之后收集1OD₆₀₀单位的培养物样品并通过Tricine-SDS-PAGE电泳进行分析。

图5：野生型和PagL-修饰型大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)LPS的GC/MS分析。纯化的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)野生型LPS(WT)、PagL_(St)修饰的LPS(L(St))、PagL_(Bb)修饰的LPS(L(Bb))、和PagL_(Pa)修饰的LPS(L(Pa))的GC/MS分析(t＝诱导后的时间)。所示为标准化的C14/C14-3OH比值，将野生型LPS设为100(短棒上方所示数值)。

图6：通过ESI-MS对野生型和PagL修饰型的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)LPS进行结构分析。通过ESI-MS，分析来自含有空的pET-11a(A)的野生型大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)的脂质A类型，和由PagL_(St)(B)、PagL(_Pa)(C)以及PagL(_Bb)(D)修饰的脂质A类型。在m/z 1797、1928、1622以及1490的主峰，分别被判读为通常发现于大肠杆菌中的特有的六酰化二磷酸酯类型、具有L-Ara4N部分取代的六酰化二磷酸酯类型、用L-Ara4N部分取代的3-O-脱酰基化单磷酸酯类型，以及3-O脱酰基化单磷酸酯类型。在m/z 1716和1847处的主峰可能代表在m/z

1797和1928处的类型的碎片离子。

图7：脱酰基化LPS的体内再修饰和内源PagP的作用。A：将处于指数生长的、并含有空的pET-11a载体或pPagL(_Bb)质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)，用IPTG诱导所示的时限。收集相当于1OD₆₀₀单位的样品，并通过Tricine SDS-PAGE电泳进行分析。B和C：将在诱导PagL的表达之后的所示时间中分离的纯化大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)野生型LPS(WT)和PagL_(Bb)修饰的LPS(L(Bb))的脂肪酸LPS含量，通过GC/MS进行分析。所示为标准化的C14/C14-3OH和C16/C14(C)的比值，将野生型LPS设为100(短棒上方所示数值)。D：将指数生长的、含有pPagL(Pa)的野生型大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)或大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)及其pagP突变体衍生物JG101，用IPTG诱导所示的时间，之后收集1OD₆₀₀单位的培养样品并通过Tricine-SDS-PAGE电泳进行分析。

图8：铜绿假单胞菌的PagL的拓扑模型。使用如(44)中所述的外膜蛋白结构的一般规则，构建PagL_(Pa)的拓扑模型。计划的模型由具有四个延伸到外部环境的环(L1-4)的八链β桶状(β-barrel)组成。残基在假定的β-链中显示为菱形结构，这可遮蔽暴露于脂双分子层的残基。His₁₄₉和Ser₁₅₁(显示为红色；指的是PagL_(Pa)前体中的位置)是完全保守的(图2)，并被认为是丝氨酸水解酶的“标准”的催化三联体的部分结构。黄色表示催化三联体的酸性残基的可能选择物。编号指前体序列中的残基位点。

图9：通过氨基酸取代鉴定PagL_(Pa)的活性位点的残基。将指数生长的、含有空的pET-11a载体或pPagL_(Pa)质粒、或突变体pPagL_(Pa)质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)，用IPTG诱导75分钟，之后收集1OD₆₀₀单位的培养样品并通过SDS-PAGE电泳进行分析，随后用针对PagL_(Pa)(A)的一级抗体进行免疫印迹，并通过Tricine-SDS-PAGE电泳来观测LPS(B)。

图10：百日咳博德特氏菌LPS的体内修饰。A：分离来自野生型百日咳博德特氏菌株Tohama的LPS，或分离含有pMMB67EH-PagL_(Bb)质粒的百日咳博德特氏菌株Tohama的LPS，并通过Tricine-SDS-PAGE电泳进行分析。B：通过GC/MS分析纯化的百日咳博德特氏菌株Tohama的野生型LPS(WT)的脂肪酸含量，以及PagL_(Bb)修饰的LPS(PagL)的脂肪酸含量。所示为标准化的C14-3OH/C10-3OH的比值，将野生型LPS设为100(短棒上方所示数值)。

图11：分离的LPS的物活性。通过纯化的LPS在MM6细胞中诱导IL-6(A)或IL-10(B)。横轴给出LPS的浓度(mg/ml)，纵轴给出在450nm的ELISA读数。

图12：通过半天然SDS-PAGE电泳，分析纯化的、重折叠的PagL_(Pa)(-)的热修饰性。考马斯亮蓝染色的半天然SDS-PAGE凝胶显示纯化的、重折叠的PagL_(Pa)(-)的热修饰性。电泳之前，室温下(RT)在含有0.1％SDS的样品缓冲液中，或在100℃下在含有2％SDS的样品缓冲液中，处理样品。左侧是分子量标准蛋白。

图13：通过膜结合或体外重折叠的PagL，进行体外修饰LPS。显示体外PagL活性的银染Tricine-SDS-PAGE电泳胶。A：在含有去垢剂的缓冲液中，将纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)与或不与细胞被膜于37℃一起温育18h，其中所述的细胞被膜来自含有空的pET-11a或pPagL质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)。B：在含有去垢剂的缓冲液(缺少或存在5mM EDTA)中，将纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌L3-LPS与或不与4μg体外重折叠的PagL_(Pa)(没有信号序列PagL_(Pa)(-))于37℃一起温育18h。在所有泳道中，上样同样量的分析混合液。

图14：通过Tricine-SDS-PAGE电泳分析体内的LPS修饰。通过热苯酚/水萃取，从野生型和表达PagP/PagL的百日咳博德特氏菌株Tohama分离LPS，并通过Tricine-SDS-PAGE电泳进行分析。

图15：通过ESI-MS对野生型和PagL/PagP修饰的百日咳博德特氏菌LPS进行结构分析。通过ESI-MS，对来自野生型百日咳博德特氏菌株Tohama(A)的脂质A、和被PagL_(Bb)(B)、PagP_(Ec)(C)以及PagP_(BP)(D)修饰的脂质A进行分析。在m/z 1557、1477、1387、1307、1251以及1081的主峰，分别被判读为通常发现于百日咳博德特氏菌中的特有的五酰化二磷酸酯类型、相对应的五酰化一磷酸酯类型、m/z 1557的失去3位的一级3-羟基癸酸残基的分子离子的脱酰基化脂质A类型、m/z 1477的失去3位的一级3-羟基癸酸残基的分子离子的脱酰基化脂质A类型、m/z 1477的失去一级3-羟基十四烷酸残基(3-hydroxytetradecanoic acidresidue)的分子离子的脱酰基化脂质A类型、m/z 1477的失去3位的一级3-羟基癸酸残基和一级3-羟基十四烷酸残基的分子离子的脱酰基化脂质A类型。在m/z 1320、1490、1545、1625、1715以及1796处的峰，分别相当于分子离子在m/z 1081、1251、1307、1387、1477以及1557处的PagP介导的棕榈酰化。

实施例

实验方法

菌株和生长条件

表I中描述了用于本研究的所有菌株。通常，将大肠杆菌和铜绿假单胞菌株在改良的Luria-Bertani肉汁琼脂上(称作LB琼脂(26))于37℃中进行生长，或在LB肉汤中并以200rpm进行振荡生长。对于大肠杆菌，培养基中补充0.2％葡萄糖。如果合适，在存在100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml萘啶酮酸(naladixic acid)、或100μg/ml链霉素的情况下培养细菌，用于维持质粒或菌株选择。在LB琼脂平板上于37℃培养鼠伤寒沙门氏菌SR11。在补充了15％脱纤维羊血的Borduet-Gengou琼脂(Difco)上，于35℃培养支气管炎博德特氏菌和百日咳博德特氏菌株。为了诱导百日咳博德特氏菌中的pagL_(Bb)基因的表达，将细菌在补充了1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)(终浓度)的人造Thijs培养基(48)中于35℃振荡(180rpm)生长。

表I：用于本研究的菌株和质粒

^a荷兰疫苗研究所，Bilthoven，荷兰

^b大肠杆菌遗传保藏中心，耶鲁大学，New Haven(CT)^cPagP亦称crcA

重组DNA技术

使用Promega

的lus SV Minipreps系统，分离质粒DNA。根据制造商(Fermentas)的说明书，使用小牛肠碱性磷酸酶和限制性核酸内切酶。使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒，从琼脂糖凝胶分离DNA片段。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，进行连接反应。

将来自鼠伤寒沙门氏菌SR11(pagL_(St))、支气管炎博德特氏菌B505(pagL_(Bb))的pagL基因，和来自铜绿假单胞菌PAO25的pagL基因(有或者没有其信号序列的编码部分)(pagL_(Pa)、pagL_(Pa)(-))，克隆入pET-11a(Novagen)的T7启动子之后。使用染色体DNA作为模板，通过PCR扩增基因。将约10⁹细菌重悬浮于50μl蒸馏水中，以制备模板DNA，之后将悬浮液置于95℃加热15分钟。然后，将悬浮液以16,100×g离心1分钟，之后上清液被用作模板DNA。包含NdeI位点(下划线)的正向引物序列，其包含ATG起始密码子，选自：

5’-AACATATGAAGAGAATATTTATATATC-3’(pagL_(St))、

5’-AACATATGAAGAAACTACTTCCGCTGG-3’(pagL_(Pa))、

5’-AACATATGGCGGACGTCTCGGCCGCCG-3’(pagL_(Pa)(-))和

5’-AACATATGCAATTTCTCAAGAAAAACA-3’(pagL_(Bb))。

包含BamHI位点(下划线)和终止密码子的反向引物序列，选自：

5’-AAGGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3’(pagL_(St))、

5’AAGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3’(pagL_(Pa)，pagL_(Pa)(-))和

5’-AAGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3’(pagL_(Bb))。在下列条件

下实施PCR：50μl的反应总体积、各个引物浓度为25pmol、0.2mMdNTP、3μl模板DNA溶液、1.5％二甲亚砜、由制造商(Roche)提供的含缓冲液的1.75单位的延伸高保真酶(Expand High Fidelity enzyme)混合物。如下所示温度程序：95℃-3分钟，95℃-1分钟、60℃-1分钟以及72℃-1分30秒的循环重复30次，随后72℃-10分钟并随后于4℃冷却。从琼脂糖凝胶纯化PCR产物，随后将其克隆入pCRII-TOPO。用NdeI和BamHI消化来自正确的克隆中的质粒DNA，并将PagL编码片段连接到NdeI/BamHI消化的pET-11a中。使用CaCl₂方法(27)，将连接混合物转化大肠杆菌DH5a。通过NdeI和BamHI的酶切消化，检查转化体的质粒DNA是否存在正确的pagL编码插入片段。显示正确的酶切消化模式的质粒被称为pPagL_(Pa)、pPagL_(Pa)(-)、pPagL_(Bb)以及pPagL_(St)(表I)。通过双向核苷酸测序，证实克隆pagL基因的正确编码序列。为了将pagL_(Bb)基因亚克隆到广范围的宿主中，用XbaI和HindIII消化低拷贝的pMMB67EH载体、pPagL_(Bb)质粒DNA，并将pagL_(Bb)的编码片段连接到XbaI/HindIII消化的pMMB67EH中。连接混合物用于转化大肠杆菌DH5α。通过XbaI和HindIII的酶切消化，检查转化体的质粒DNA是否存在正确的pagL编码插入片段。显示正确的酶切消化模式的质粒被称作pMMB67EH-PagL_(Bb)(表I)。将后一个质粒用于转化大肠杆菌SM10，通过在如Stibitz等人(52)所述的固体培养基上进行接合，所述的大肠杆菌SM10可允许随后将pMMB67EH-PagL_(Bb)转移到百日咳博德特氏菌中。使用位点-定向诱变试剂盒(Stratagene)和表II中列出的引物，将突变引入pagL中。将质粒pPagL_(Pa)作为构建突变的模板。通过双向核苷酸测序，证实克隆正确突变的存在。

表II：用于位点定向诱变的引物

^a引物名称显示了氨基酸取代，如H81A_FW A_FW表示所示的寡核苷酸用作位点定向诱变方法中的正向引物，以用丙氨酸取代前体PagL_(Pa)的位点81的组氨酸。

^b下划线表示被引入的突变。

SDS-PA GE和免疫印迹

使用0.2％SDS的电泳胶和Bio-RadMini-

仪器，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(28)，分析蛋白质。将样品施加到具有4％积层胶的13％聚丙烯酰胺凝胶上，并进行150V的电泳。用考马斯亮蓝染色蛋白。将来自Bio-Rad的预染色或未染色的Precision Plus Protein^TM Standard，用于测定相对分子量(Mr)。对于蛋白质印迹，将来自SDS-PAGE胶的蛋白质转移到硝化纤维膜上。在磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.6)、0.5％脱脂奶粉、0.1％Tween-20中过夜封闭膜，并与直接针对PagL_(Pa)的一级抗体在封闭缓冲液中一起温育，随后与辣根过氧化物酶偶联的兔抗豚鼠IgG抗体(Sigma)在封闭缓冲液中一起温育。使用

WestPico Chemiluminescent Substrate(Pierce)，进行显色印迹。

半天然的SDS-PAGE

使用0.2％SDS的电泳胶和Bio-RadMini-

仪器，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(28)分析蛋白质。对于半天然的SDS-PAGE，流动胶和积层胶中不加入SDS，并在电泳之前不加热样品。将样品施加到具有4％积层胶的13％聚丙烯酰胺凝胶上，并进行150V的电泳。对于半天然的SDS-PAGE，在冰上以恒流15mA进行电泳。用考马斯亮蓝染色蛋白。将来自Bio-Rad的预染色或未染色的Precision Plus Protein^TM Standard，用于测定相对分子量(Mr)。

Tricine-SDS-PA GE电泳

对于含有LPS的样品，将0.5mg/ml蛋白酶K(终浓度)加入样品缓冲液(28)。将样品在55℃中温育60分钟，随后在95℃中温育10分钟，以灭活蛋白酶K。然后通过添加样品缓冲液将样品稀释10倍，之后将2μl样品施加到Tricine-SDS-PAGE电泳胶上(30)。使溴酚蓝以35在分离胶上泳动，之后电压增加到105V。在溴酚蓝前端到达胶底部之后，将样品继续电泳另一个45分钟。将凝胶在11∶8∶1的水/乙醇/乙酸(v/v/v)中过夜固定，并随后按(31)所述用银染色。

多克隆抗体

为了抗体的制备，将pPagL_(Pa)(-)用于转化大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)，以备表达截短的pagL基因之用。从SDS-PAGE预制胶上，分离(29)并纯化包含体中聚积的PagL_(Pa)蛋白，并在Eurogentec中用于豚鼠的免疫。

微量测序

在192mM甘氨酸、25mM Tris(pH 8.3)、10％甲醇(v/v)中，使用Bio-Rad Mini-

2印迹仪，将蛋白质从SDS-PAGE胶在Immobilon^TM-P聚二氟乙烯膜上以100V转移1h。转移后，用蒸馏水将膜洗涤3次，每次15分钟。用考马斯亮蓝染色所转移的蛋白。将膜风干，切下假定的PagL带，并在Sequencing Center Facility(UtrechtUniversity，荷兰)上进行微量测序。

通过气相层析-质谱分析(GC/MS)分离和分析LPS

使用热酚/水萃取方法(3)，分离LPS。简而言之，在含有1mM

IPTG(终浓度)的3升Thijs培养基中，培养含有或没有质粒pMMB67EH-PagL_(Bb)的百日咳博德特氏菌株Tohama。离心收集细胞，并重悬浮在含5mM EDTA的40mM磷酸钠中缓冲液(pH 7.0)中。用溶菌酶在4℃中过夜处理细胞，之后加入等体积酚。将悬浮液加热到70℃，同时振荡温育30分钟。悬浮液冷却到10℃，之后离心分离相。收集上层相，并通过将等体积蒸馏水加到下层相，以重复萃取。随后在70℃温育、冷却和离心之后，混合两种上层相，并对自来水进行透析，直至苯酚气味消失。冷冻干燥透析的馏分后，将LPS以1mg/ml的浓度溶解在磷酸盐缓冲液中。为了通过GC/MS分析脂肪酸，将5倍(v/v)过量的丙酮加入等分量的分离LPS中，之后在氮气流中于60℃干燥溶液。随后，加入作为内标物的10μg的C12:0(2OH)(在乙醇中为1mg/ml)以及100μl乙酰氯/乙醇1∶9(v/v)，将样品在90℃中进行衍化1h。冷却后，通过加入200μl的1M K2HPO(pH8.0)，以终止反应，随后用200μl乙酸乙酯萃取酰基-乙酯。通过在Finnigan MAT SSQ上，以电子碰撞模式分析1μl的上层相。

LPS的生物学活性

通过人巨噬细胞细胞系MM6(49)，测试由野生型和PagL修饰的百日咳博德特氏菌Tohama的LPS诱导IL-6和IL-10。将MM 6细胞在补充了10％胎牛血清(Gibco BRL)的400μl IMDM(Gibco BRL)中接种在微孔板(2.10⁵/孔)中，并用200μl连续稀释的LPS液，在含5％CO₂的潮湿空气中，于37℃刺激16-18h。根据制造商的说明书(PeliPair^TM试剂盒，Sanquin Reagents，Amsterdam荷兰)，通过针对人IL-6或IL-10的ELISA，确定培养上清液中的IL-6和IL-10的水平量。

细胞被膜的分离

通过以1,500×g离心10分钟，收集细胞并在50ml冰冷的0.9％氯化钠溶液中洗涤一次。将细胞沉淀在-80℃中冰冻至少15分钟，然后悬浮在含Complete Protease抑制剂混合物(Roche)的20ml的3mMEDTA、10mM的Tris-HCl(pH8.0)中。通过超声波来破碎细胞，之后通过以1,500×g离心10分钟，来除去未破碎的细胞。通过以150,000×g离心1.5h，从上清液沉淀细胞被膜，并重悬浮在2mM Tris-HCl(pH7.4)中。将细胞被膜以等分量贮存在-80℃。

包含体的分离

为了分离包含体，在来自pPagL_(Pa)(-)(表I)的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)中表达PagL(Pa)(-)。在补充氨苄青霉素LB培养基中，于37℃培养两升培养物，直至OD₆₀₀介于0.4和0.6之间。然后，将1mMIPTG(终浓度)加入培养物中，以诱导重组基因的表达，之后将培养物于37℃进一步振荡温育。约4小时后，离心收集细胞(4,000rpm，15分钟(4℃))。将收集的细胞在400ml的0.9％NaCl中洗涤一次，然后重悬浮在TE 50∶40(50mM Tris-HCl(pH8.0)，40mM EDTA)中。加入蔗糖(0.25g/ml(终浓度))和溶菌酶(0.2mg/ml(终浓度))，之后将悬浮液在RT下振荡温育30分钟。使用配备macrotip的Branson 250Sonfier(输出量9，工作周期50％)，将悬浮液冰上超声处理三次(1.5分钟，之间暂停2分钟)。超声波之后，加入0.13％(w/v)Brij-35P(Fluka)，并将悬浮液另外超声处理2分钟。通过以4,000rpm(4℃)离心2小时，收集稠密物质(包含体)，之后在40ml TE 50∶40中洗涤一次，随后使用40ml的10mMTris-HCl(pH8.3)进行另一次洗涤步骤。将获得的包含体溶解在补充10mM甘氨酸(pH8.3)的8M尿素中，并用TCA进行沉淀。最后，将获得的蛋白质以10mg/ml的蛋白浓度溶解在补充了10mM甘氨酸(pH8.3)的8M尿素中。以13,000rpm将混合物离心2小时，以除去残余的非溶解物质和膜。

PagL_(Pa)㈠的重折叠和纯化

在10％(w/v)十二烷基二甲基氧化胺(LDAO)中，通过两倍稀释的10mg/ml蛋白溶液(参见上文)进行体外重折叠PagL_(Pa)(-)，随后进行超声波处理10分钟。使用1ml的MonoQ(Amersham Biosiences)离子交换柱，通过快速蛋白质液相层析(FPLC)来纯化重折叠的PagL_(Pa)(-)。将蛋白溶液在缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH8.0)，0.08％(w/v)C₁₀E₅)中稀释4次。将溶液装在用缓冲液A预先平衡的柱上，并用缓冲液A洗涤一次，用缓冲液A的0-1M NaCl线性梯度来洗脱蛋白。通过SDS-PAGE，分析馏分的重折叠PagL_(Pa)(-)蛋白的存在。集中含有蛋白的馏分，并用具有3kDa的分子量截留值的Centricon集中器(Amicon)，将其浓缩到10mg/ml的蛋白浓度。然后，使用具有3.5kDa的分子量截留值的膜，将蛋白溶液对10ml 2mM Tris-HCl(pH8.0)、0.06％(w/v)C₁₀E₅进行过夜透析三次，

体外修饰分析

将分离自含空的载体pET-11a或pPagL质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)的重折叠PagL_(Pa)(-)(10mg/ml)或细胞被膜，在重蒸馏水中稀释10倍。将4μl稀释的重折叠蛋白或胞外被膜溶液，在50mMHepes(pH8.0)、0.1％Triton X-100、0.5M NaCl以及0.75nmol脑膜炎奈瑟氏球菌L3-LPS的10μl终体积中，于37℃温育16h。为了测试反应是否依赖于二阶阳离子，将5mM EDTA加入具有重折叠的PagL_(Pa)(-)的反应中。通过煮沸样品缓冲液(28)终止反应，之后用0.5mg/ml蛋白酶K于55℃处理样品1小时，随后于95温育10分钟。通过加入样品缓冲液将样品稀释25倍，之后通过Tricine-SDS-PAGE电泳分析2μl样品(参见上文)。

分离LPS，并通过电喷雾电离-质谱分析(ESI-MS)进行分析

使用稍加改动的热酚/水萃取方法分离LPS(Westphal和Jann，Methods Carbohydr.Chem.5；83-91，1965)。简而言之，将细菌在具有1mM IPTG(终浓度)的THIJS培养基中培养64h。离心收集细胞，并重悬浮在含5mM EDTA的40mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中。用溶菌酶在4℃中过夜处理细胞，之后加入等体积酚。将悬浮液加热到70℃，同时振荡温育30分钟，随后冷却到10℃，之后通过以8,000×g离心10分钟，来分离相。收集上层相，并在将等体积蒸馏水加到下层相后，重复进行萃取。混合两种上层相，并对自来水进行透析，直至苯酚气味消失，冷冻干燥并随后溶于蒸馏水。随后以150,000×g离心沉淀LPS，并溶于蒸馏水中，之后通过分析3-羟基十四烷酸含量，使用如Welch所述的6890Agilent气相色谱仪(Clin.Microbiol.Rev.1991)来测定LPS浓度。对于ESI-MS，将200μl等分量的分离LPS(50nmol/ml)进行冷冻干燥，并溶于0.1ml的2％乙酸中。在95℃加热混合物，以水解LPS并释放脂质A部分。随后，混合物冷却到室温，并以16,100×g离心10分钟。将沉淀在0.1ml双蒸水中洗涤两次，溶于0.1ml双蒸水，并加入0.3ml氯仿/甲醇(2∶1，v/v)。剧烈涡旋振荡后，以16,100×g离心10分钟，进行分离相。然后，通过在Finnigan LCQ上以阴离子模式(Wilm和Mann，Anal.Chem.1996)进行纳电喷雾串式MS，将上层相用于纯化脂质A的结构分析。

实施例1：各种革兰氏阴性菌的PagL同系物的鉴定

通过检索NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中的革兰氏阴性菌的所有完成的和未完成的基因组，将鼠伤寒沙门氏菌PagL前体蛋白的187个氨基酸的序列，用于鉴定其它革兰氏阴性菌中的推定的PagL同系物。BLAST检索(34)显示了博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌以及副百日咳鲍特氏菌中所存在的推定同系物(图2)。如由signalP服务器(35)所预测的，支气管炎博德特氏菌和副百日咳鲍特氏菌的PagL同系物是具有N末端25个氨基酸信号肽的两种彼此相同178个氨基酸的多肽(图2)。在百日咳博德特氏菌Tohama I菌株中还发现了PagL同系物的基因(36)，但是该开放读码框(ORF)由于移码而被破坏(SEQ ID No.4)，这可被修复成如SEQ ID No.5所示的序列，并编码如SEQ ID No.1所示的蛋白。对百日咳博德特氏菌株B509和B134的PagL ORF进行的核苷酸测序，还显示存在相同的移码²，这表明PagLORF的破坏是百日咳博德特氏菌株的共同特征。通过使用新的支气管炎博德特氏菌的相同PagL同系物来作为探针以用于进一步BLAST分析，可鉴定下列基因组中的额外推定的PagL同系物：铜绿假单胞菌(SEQ IDNo.6，30％相同性)、荧光假单胞菌(SEQ ID No.7，29％相同性)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(SEQ ID No.8，31％相同性)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，2x(SEQ ID No.9+10，32/33％)、Ralstoniametallidurans(SEQ ID No.15，28％)、茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)(SEQ ID No.16，29％)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)(SEQ ID No.12，28％)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)(SEQ ID No.13，28％)、Burkholderia fungorum(SEQ ID No.11，29％)、以及棕色固氮菌(SEQ ID No.14，27％)。比对结果如图2所示。总之，所有PagL同系物显示了总体上彼此序列的低相同性，尽管高于鼠伤寒沙门氏菌的PagL同系物(24％相同性)，但它们在C末端附近具有明显的同源区。我们对这种保守基序的发现，可鉴定其它(细菌)物种中的PagL同系物，并可将适当的PagL同系物用于进行3-O-脱酰化的任何细菌寄主和/或任何LPS。

实施例2：pagL的克隆及其在大肠杆菌中的异源表达

为了验证推定的脂质A脱酰基酶活性，我们克隆了铜绿假单胞菌的pagL同系物(pagL_(Pa))和支气管炎博德特氏菌的pagL同系物(pagL_(Bb))。我们将pagL_(St)用作这些研究中的参照。通过PCR，从染色体扩增这些pagL基因，并最终克隆到pET-11a中，受T7启动子的控制，得到质粒pPagL_(Pa)、pPagL_(Bb)和pPagL_(St)。

为了研究PagL在大肠杆菌中的表达和膜定位，将含有空的载体pET-11a或pPagL质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)在LB中过夜生长，之后分离细胞被膜。SDS-PAGE分析，显示了在表达PagL的细胞被膜中，具有15000-18000Mr的显著的附加带的存在(图3)。这与成熟PagL蛋白的预期分子量一致，即Pagl_(Pa)16.1kDa、PagL_(Bb)17.2kDa、和PagL_(St)18.2kDa。为了鉴定附加的蛋白带，将它们进行微量测序。PagL_(Pa)、PagL_(Bb)以及PagL_(St)的前5个氨基酸残基的序列分别是ADVSA、QPTQG以及NDNVF，它们分别指示前导肽酶对信号肽的裂解出现在氨基酸残基23和24(AQA-ADV)、25和26(AQA-QPT)以及20和21(CSA-NDN)之间。特别是对于PagL_(Bb)的表达，在胶上可看见具有更高Mr的附加带(图2)。这条带的N末端序列，MQFLK，对应于PagL_(Bb)的前体的N末端序列。

实施例3：PagL对大肠杆菌LPS的体内修饰

为了研究克隆的PagL同系物是否对大肠杆菌LPS有活性，将IPTG加入含有空的载体pET-11a或pPagL质粒的、指数生长的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)细胞中，并在各种温育期之后，收集相当于OD₆₀₀单位的样品，并通过Tricine-SDS-PAGE电泳分析它们的LPS含量。根据预期水解脂质A的3位的R-3-羟基豆蔻酸，三种PagL同系物的任何一种表达，可将LPS转变成具有更高电泳迁移率的形式(图4)。这种转变在诱导PagL_(Pa)或PagL_(Bb)之后的75分钟内几乎是完全的，但是对于PagL_(St)，需要花费更长的时间。

PagL修饰的LPS的结构分析：为了测定其脂肪酸含量，自在存在10mM MgCl₂以抑制PhoP/PhoQ调控的脂质A修饰的情况下培养的细菌中分离LPS并通过GC/MS进行分析。与野生型LPS中的比值相比，PagL修饰的LPS样品中的C14∶/C14∶0(3OH)比值增加(图5)，这与预期的从脂质A清除C14-3OH相一致。为了证实这些数据，分离脂质A部分，并通过ESI-MS以阳离子模式进行分析，这表明了在野生型LPS中存在四种主要的脂质A类型(图6A)。m/z 1797的峰代表通常发现于大肠杆菌中的特有的六酰化二磷酸酯类型，而m/z 1928的峰相当于用L-Ara4N部分取代的六酰化二磷酸酯类型。m/z 1716和m/z 1847两个其余的峰，多半代表缺失磷酸基的上述两种类型的碎片离子。PagL_(St)(图6B)、PagL_(Pa)(图6C)或PagL_(Bb)(图6D)表达后，主要的脂质A类型出现于m/z 1622和m/z 1490中，它们分别相当于自出现于空载体对照中的m/z 1928和m/z 1797的主要类型中缺失一个β-羟基豆蔻酸残基和一个磷酸基。此外，磷酸基的缺失大概是电离方法的生物膺象。根据GC/MS和ESI-MS数据，可以推断：所鉴定的铜绿假单胞菌和支气管炎博德特氏菌的PagL同系物，与鼠伤寒沙门氏菌的PagL同系物相似，是活性的脂质A脱酰基酶。此外，数据暗示脱酰基化并不依赖于是否存在L-Ara4N部分，因为两种类型都被有效地脱酰基化。

实施例4：PagL脱酰基化的LPS的随后体内修饰

在这些实验过程中，观察到在延长的PagL表达之后，在Tricine-SDS-PAGE电泳胶上不再检测出PagL修饰的LPS，而且LPS再次迁移至野生型LPS的位置，正如表达PagL_(Bb)的菌株所显示的那样(图7A)。如SDS-PAGE胶上所示，在这个时点仍然存在丰富的PagL蛋白(数据未显示)。此外，GC/MS分析显示：在PagL_(Bb)诱导5小时之后，用于LPS分离的C14∶0/C14∶0(3OH)的比值不会再次降低(图7B)。因此，在Tricine-SDS-PAGE电泳胶上观测的二级修饰不是PagL修饰的复原结果，而是将电泳迁移率复原到野生型LPS的程度的额外修饰的结果。于是比较了其它的脂肪酸比值。在诱导产生PagL 5h的细胞的LPS中发现，C16∶0/C14∶0比值显著升高(图7C)，暗示着PagL脱酰基化的LPS随后被棕榈酰化。

将棕榈酸根添加到脂质A的一种蛋白质是外膜蛋白PagP(19)(图1)。因此，我们猜测PagL修饰的LPS的二级修饰可能是内源PagP活性的结果。为了研究这种可能性，我们用pPagL_(Pa)质粒转化野生型大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)及其pagP突变体衍生物JG101。在野生型菌株但非突变株的情况下，再次观测到PagL修饰的LPS的二级修饰(图7D)。该结果强烈地暗示：PagL修饰的LPS的二级修饰的确是内源PagP活性的结果(图7A)。

实施例5：PagL活性位点残基的鉴定

在所鉴定所PagL同系物之间的彼此序列的相同性是极低的(图2)。其中，少数完全保守的残基是组氨酸和丝氨酸，我们猜测它们是丝氨酸水解酶的“标准”的Asp/Glu-His-Ser的催化三联体。这些推定的活性位点残基位于我们预计的拓扑模型中的β-链顶部接近的脂质暴露侧面(图8)。有趣的是，在外膜磷脂酶A中，活性位点His和Ser位于相似的位点(37)。为了分别测试这些位于PagL_(Pa)前体蛋白的位点149和151的残基是否的确是对催化活性很重要，分别用丙氨酸或天冬酰胺、和丙氨酸或半胱氨酸进行取代它们。作为对照，分别对位于PagL_(Pa)前体的位点81和84的非保守组氨酸和丝氨酸残基进行相同的取代。通过免疫印迹(图9A)和Tricine-SDS-PAGE电泳(图9B)，分别对具有相关质粒并被IPTG诱导75分钟的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)细胞的蛋白和LPS性质进行分析。尽管取代非保守的His81和Ser84不会影响LPS的脱酰基化，但是当取代保守的His149和Ser151时(图9B)，即使未影响到这些突变体蛋白的表达(图9A)，也不再观测到LPS的脱酰基化。这些结果有利地支持了我们的假设，即前体PagL_(Pa)蛋白的位点149的保守组氨酸和位点151的保守丝氨酸是活性位点残基，并且PagL发挥丝氨酸水解酶的机制作用。

实施例6：pagL_(Bb)的克隆及其在百日咳博德特氏菌中的异源表达

为了体内修饰百日咳博德特氏菌LPS，我们克隆了支气管炎博德特氏菌的pagL基因(pagL_(Bb))。通过PCR，从染色体扩增pagL基因，并最终克隆到受Tac启动子控制下的pMMB67EH中，得到质粒pMMB67EH-pagL_(Bb)，这可通过接合反应转入百日咳博德特氏菌株Tohama中。

为了定位百日咳博德特氏菌LPS的体内修饰，将野生型百日咳博德特氏菌株Tohama、或含pMMB67EH-PagL_(Bb)质粒的百日咳博德特氏菌株Tohama，培养在补充了1mM IPTG(终浓度)的Thijs培养基中。通过热苯酚/水萃取分离LPS，并通过Tricine-SDS-PAGE电泳(图10A)和GC-MS(图10B)进行分析。Tricine-SDS-PAGE电泳胶的分析显示：从PagL_(Bb)表达菌株分离的LPS，迁移略微快于野生型百日咳博德特氏菌LPS。令人惊讶的是，从PagL_(Bb)表达菌株分离的LPS显出两种不同的LPS群体。一个群体沿着野生型Tohama LPS的高低迁移，一个群体迁移更快。在野生型LPS的制备中，还可观测到后一个LPS群体，然而它的丰度非常低。为了验证来自PagL表达菌株的LPS的确在其3位被脱酰基化，通过GC-MS对其分析。与野生型LPS中的比值(图10B)相比，PagL修饰的LPS样品中的C14∶0(3OH)/C10∶0(3OH)比值增加，这与预期的从百日咳博德特氏菌脂质A的3位去除C10-3OH相一致。

实施例7：PagL修饰的LPS的生物学活性

为了评定PagL修饰的LPS和野生型百日咳博德特氏菌的LPS的内毒素活性，测量它们在人巨噬细胞系MM6中刺激IL-6和IL-10产生的能力。如图2所示，与用等量的pagL修饰的LPS刺激细胞的情况相比，对于野生型LPS，通过MM6细胞所产生的IL-6(图11A)和IL-10(图11B)更多。因此，可以断定：由PagL在体内对百日咳博德特氏菌LPS进行脱酰基化，导致LPS的内毒素活性的降低。

实施例8：PagL(Pa)的克隆、表达、纯化和重折叠

将来自铜绿假单胞菌PAO25并且没有其信号序列编码部分的pagL基因，克隆到pET-11a中，得到质粒pPagL_(Pa)(-)。为了获得包含体，在大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)中表达缺少其信号序列的PagL。分离包含体并溶解在尿素中，之后通过在两倍10％十二烷基二甲基氧化胺(LDAO)中稀释，以重折叠蛋白，并通过快速蛋白质液相层析(FPLC)进一步纯化。通过SDS-PAGE(图12)证实正确的重折叠，并测量圆二色性(CD)(数据未显示)。在SDS-PAGE胶上，重折叠蛋白的电泳迁移率低于变性形式的电泳迁移率，然而CD测量显示重折叠蛋白主要具有β-折叠结构。

实施例9：通过膜定位和重折叠的PagL体外修饰LPS

为了测试膜定位或体外重折叠的PagL是否能体外修饰所加入的LPS，我们将重折叠的PagL_(Pa)(-)、或来自含有空的载体pET-11a或pPagL质粒的大肠杆菌BL21Star^TM(DE3)的分离细胞被膜，与脑膜炎奈瑟氏球菌的纯化LPS一起进行温育。通过Tricine-SDS-PAGE电泳(图13)，评价LPS的修饰。与预期水解脂质A的3位的R-3-羟基豆蔻酸相一致，当存在膜定位的PagL(图13A)或重折叠PagL(Pa)(-)(图13B)时，LPS被转变成具有更高电泳迁移率的形式。与重折叠PagL_(Pa)(-)的反应不依赖于二阶阳离子的存在，因为在5mM EDTA(图13B)的存在下，仍然观测到LPS的脱酰基化。

实施例10：PagP和PagL在百曰咳博德特氏菌中表达之后的脂质A结构的改变

为了在百日咳博德特氏菌株Tohama中表达PagP和PagL，在表达载体pMMB67EH的低拷贝数的广范围宿主中表达支气管炎博德特氏菌的PagL基因(pagL_(Bb)和百日咳博德特氏菌的PagP基因(PagP_(Bp))。作为对照，还构建了表达大肠杆菌pagP基因(pagP_(Ec))的菌株。从野生型百日咳博德特氏菌株Tohama和表达PagP或表达PagL百日咳博德特氏菌株Tohama中分离LPS，并通过Tricine-SDS-PAGE电泳进行分析。分离自PagL_(Bb)表达菌株的LPS，在胶上显得未受到影响，然而分离自PagP表达菌株的LPS显得受到可能的修饰，因为检测出比野生型百日咳博德特氏菌LPS更低电泳迁移率的带。此外，与PagP_(Bp)表达菌株相比，在PagP_(Ec)表达菌株中出现更高的修饰效率(图14)。为了进一步详细地评价可能的LPS修饰，通过ESI-MS以阴离子模式分析菌株本脂质A部分。这种分析表明在野生型LPS中存在四种主要的脂质A类型(图15A)。m/z 1557的峰代表通常发现于百日咳博德特氏菌中的特有的五酰化二磷酸酯类型(Caroff等，Microbes.Infect.，1994)，而m/z 1477的峰相当于五酰化一磷酸酯类型。m/z 1307和1251的两种其它峰代表分子离子在m/z 1477的脱酰基脂质A类型，它们分别缺失了3位的一级3-羟基癸酸残基或一级3-羟基十四烷酸残基(在2或3′位点)。这些结果表明在野生型百日咳博德特氏菌的脂质A类型之间的高不均一性，即在凝胶分析中表现出的不溶解性(图14)。有趣的是，计算来自相应峰高的各个脂质A类型的相对量，揭示了在野生型百日咳博德特氏菌LPS中，大量的脂质A类型(～50％)由四酰化形式组成。此外，大多数的脂质A类型是一磷酸酯形式(～80％)。为了排除高丰度的低酰基化的和低磷酸化的脂质A类型是由用于分离脂质A的水解方法引起的人工假象这种可能性，我们测试更短或更长的水解周期(介于1至4小时之间)是否影响脂质A类型的相对丰度，然而情况并非如此(数据未显示)。此外，测定已知浓度的野生型百日咳博德特氏菌的纯化LPS的溶液的总磷酸酯含量(totalphospahe content)。与由ESI-MS检测出的最为普遍的一磷酸脂质A类型一致，当LPS已经完全被磷酸化时，检测到的磷酸酯含量仅仅比预期的磷酸酯含量的一半稍多(数据未显示)。

根据PagL_(Bb)的表达(图15B)，在m/z 1081、1307和1387分别存在三种脂质A类型。在m/z 1307的主峰相当于缺失3位的3-羟基癸酸残基的脱酰基的一磷酸酯形式，而在m/z 1387的峰相当于m/z 1307的二磷酸化形式的分子离子。在m/z 1081的峰相当于缺失3-羟基葵酸残基和3-羟基十四烷酸残基的一磷酸酯形式。缺失其3位的3-羟基癸酸残基的脂质A类型的相对含量，从野生型百日咳博德特氏菌LPS中的约37％提高到表达PagL_(Bb)的菌株中的92％以上。因此，即使LPS的电泳迁移率不受到影响(图14，泳道2)，编码脂质A 3-O-脱酰基酶的PagL_(Bb)在百日咳博德特氏菌中仍具有活性。

PagP_(Ec)(图15C)和PagP_(Bp)(图15D)表达后，检测出一些新的脂质A类型(表III)。在m/z 1320、1490、1545、1625、1715以及1796的峰，分别相当于分子离子在m/z 1081、1251、1307、1387、1477以及1557时的期望PagP介导的棕榈酰化。通过Tricine-SDS-PAGE电泳后(图14)可以观测的在大肠杆菌PagP和百日咳博德特氏菌PagP中的修饰效率的差异，也可在质谱分析中得到展现。在表达大肠杆菌PagP的菌株中，～47％的总脂质A群体被棕榈酰化，与之相反的是，在表达PagP_(Bp)的菌株中，只有～9％。有趣的是，与在表达PagP_(Ec)的菌株中相反，在表达PagP_(Bp)的菌株中，发现缺失3-羟基十四烷酸残基的脂质A类型没有被棕榈酰化。对于这种差异的可能解释是：这是两种PagP酶的特异性中的差异。尽管大肠杆菌PagP在脂质A的2位点添加了酰基链，但百日咳博德特氏菌PagP在3′位点添加了棕榈酸根(Bishop等，EMBOJ.，2000；Preston等，Mol.Microbiol.，2003)。因此，完全没有被棕榈酰化的脂质A类型(缺失了百日咳博德特氏菌PagP的表达菌株的一个3-羟基十四烷酸残基)，暗示着缺失3-羟基十四烷酸残基的脂质A分子，是在其3′位点的特异缺失了该残基。由于大肠杆菌PagP的底物库大于百日咳博德特氏菌PagP的底物库，于是这可部分解释在两种PagP酶中所观测到的修饰效率的差异。此外，这种假说与存在体内低酰基化的脂质A类型相一致。

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48.Thalen，M.，van den IJssel，J.，Jiskoot，W.，Zomer，B.，Roholl，P.，deGooijer，C.，Beuvery，C.，and Trampen，J.(1999)J.Biotechnol.75，147-159.

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50.Simon，R.，Priefer，U.，and Puhler，A.A.(1983)Bio/Technol.1，784-791

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52.Stibitz，S.，Black，W.，and Falkow，S.(1986)Gene 50，133-140

序列表

<110>NVI荷兰疫苗研究所

<120>革兰氏阴性菌的LPS的去酰基化

<130>P218195EP

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>178

<212>PRT

<213>Bordetella sp.

<400>1

Met Gln Phe Leu Lys Lys Asn Lys Pro Leu Phe Gly Ile Val Thr Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Cys Ala Thr Ala Gln Ala Gln Pro Thr Gln Gly Gly Val

20 25 30

Ser Leu His Tyr Gly Ile Gly Asp His Tyr Gln Arg Val Thr Leu Asn

35 40 45

Tyr Glu Thr Pro Thr Leu Trp Ser His Gln Phe Gly Gly Asn Trp Gly

50 55 60

Arg Leu Asp Leu Thr Pro Glu Leu Gly Ala Ser Tyr Trp Trp Ala Asp

65 70 75 80

Gly Ser Arg Ser Pro Gly His Val Trp Gln Ala Ser Ala Ile Pro Met

85 90 95

Phe Arg Trp Trp Thr Gly Glu Arg Phe Tyr Ile Glu Ala Gly Ile Gly

100 105 110

Ala Thr Val Phe Ser Ser Thr Ser Phe Ala Asp Lys Arg Ile Gly Ser

115 120 125

Ala Phe Gln Phe Gly Asp His Ile Gly Leu Gly Phe Leu Leu Thr Pro

130 135 140

Ser Asn Arg Ile Gly Leu Arg Tyr Ser His Phe Ser Asn Ala Gly Ile

145 150 155 160

Lys Glu Pro Asn Pro Gly Leu Asp Ile Val Gln Leu Thr Tyr Thr Tyr

165 170 175

Gln Phe

<210>2

<211>537

<212>DNA

<213>Bordetella bronchiseptica

<400>2

atgcaatttc tcaagaaaaa caagcccctg ttcggcatcg ttacactggc tctggcatgt 60

gccaccgccc aggcgcagcc cactcagggc ggggtcagcc tgcattacgg tattggcgac 120

cactatcagc gcgtcacgct gaactacgaa acccccacgc tctggagcca ccagttcggc 180

ggcaattggg gccgcctgga cctgaccccc gaactgggcg cgtcatactg gtgggccgac 240

ggctcgcgct cgcccggcca cgtgtggcag gccagcgcca ttccgatgtt ccgctggtgg 300

accggcgagc gcttttacat cgaggccggc atcggcgcca cggttttcag cagcaccagc 360

ttcgccgaca agcgcatcgg ttcggccttc cagtttggcg accatatcgg gctgggcttc 420

ctgctgacgc ccagcaaccg catcggcctg cgctattcgc acttctccaa cgccggcatc 480

aaggaaccga accccggcct cgatatcgtg cagctgacct atacgtacca gttctga 537

<210>3

<211>537

<212>DNA

<213>Bordetel la parapertussis

<400>3

atgcaatttc tcaagaaaaa caagcccctg ttcggcatcg ttacactggc tctggcatgt 60

gccaccgccc aggcgcagcc cactcagggc ggggtcagcc tgcactacgg tattggcgac 120

cactatcagc gcgtcacgct gaactacgaa acccccacgc tctggagcca ccagttcggc 180

ggcaattggg gccgcctgga cctgaccccc gaactgggcg cgtcgtactg gtgggccgac 240

ggctcgcgct cgcccggcca cgtgtggcag gccagcgcca ttccgatgtt ccgctggtgg 300

accggcgagc gcttctacat cgaggccggc atcggcgcca cggttttcag cagcaccagc 360

ttcgccgaca agcgcatcgg ttcggccttc cagtttggcg accatatcgg gctgggcttc 420

ctgctgacgc ccagcaaccg catcggcctg cgctattcgc acttctccaa cgccggcatc 480

aaggaaccga accccggcct cgatatcgtg cagctgacct atacgtacca gttctga 537

<210>4

<211>535

<212>DNA

<213>Bordetella pertussis

<400>4

atgcaatttc tcaagaaaaa caagcccctg ttcggcatcg ttacactggc cctggcatgt 60

gccaccgccc aggcgcagcc cactcagggc ggggtgcctg cattacggta ttggcgacca 120

ctatcagcgc gtcacgctga actacgaaac tcccacgctc tggagccacc agttcggcgg 180

aaattggggc cgcctggacc tgacccccga actgggcgcg tcgtactggt gggccgacgg 240

ctcgcgctcg cccggccacg tgtggcaggc cagcgccatt ccgatgttcc gctggtggac 300

cggcgagcgc ttctacatcg aggccggcat cggcgccacg gttttcagca gcaccagctt 360

cgccgacaag cgcatcggtt cggccttcca gtttggcgac catatcggac tgggcttcct 420

gctgacgccc agcaatcgta tcggcctgcg ctattcgcat ttctcgaacg ccggcatcaa 480

ggaaccgaac cccggcctgg atatcgtgca gctgacctat acgtaccagt tctga 535

<210>5

<211>537

<212>DNA

<213>Bordetella pertussis

<220>

<221>Frameshift restored.

<222>(96)..(97)

<400>5

atgcaatttc tcaagaaaaa caagcccctg ttcggcatcg ttacactggc cctggcatgt 60

gccaccgccc aggcgcagcc cactcagggc ggggtcagcc tgcattacgg tattggcgac 120

cactatcagc gcgtcacgct gaactacgaa actcccacgc tctggagcca ccagttcggc 180

ggaaattggg gccgcctgga cctgaccccc gaactgggcg cgtcgtactg gtgggccgac 240

ggctcgcgct cgcccggcca cgtgtggcag gccagcgcca ttccgatgtt ccgctggtgg 300

accggcgagc gcttctacat cgaggccggc atcggcgcca cggttttcag cagcaccagc 360

ttcgccgaca agcgcatcgg ttcggccttc cagtttggcg accatatcgg actgggcttc 420

ctgctgacgc ccagcaatcg tatcggcctg cgctattcgc atttctcgaa cgccggcatc 480

aaggaaccga accccggcct ggatatcgtg cagctgacct atacgtacca gttctga 537

<210>6

<211>173

<212>PRT

<213>Pseudomonas aeruginosa

<400>6

Met Lys Lys Leu Leu Pro Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Ser Ser Val

1 5 10 15

His Val Ala Ser Ala Gln Ala Ala Asp Val Ser Ala Ala Val Gly Ala

20 25 30

Thr Gly Gln Ser Gly Met Thr Tyr Arg Leu Gly Leu Ser Trp Asp Trp

35 40 45

Asp Lys Ser Trp Trp Gln Thr Ser Thr Gly Arg Leu Thr Gly Tyr Trp

50 55 60

Asp Ala Gly Tyr Thr Tyr Trp Glu Gly Gly Asp Glu Gly Ala Gly Lys

65 70 75 80

His Ser Leu Ser Phe Ala Pro Val Phe Val Tyr Glu Phe Ala Gly Asp

85 90 95

Ser Ile Lys Pro Phe Ile Glu Ala Gly Ile Gly Val Ala Ala Phe Ser

100 105 110

Gly Thr Arg Val Gly Asp Gln Asn Leu Gly Ser Ser Leu Asn Phe Glu

115 120 125

Asp Arg Ile Gly Ala Gly Leu Lys Phe Ala Asn Gly Gln Ser Val Gly

130 135 140

Val Arg Ala Ile His Tyr Ser Asn Ala Gly Leu Lys Gln Pro Asn Asp

145 150 155 160

Gly Ile Glu Ser Tyr Ser Leu Phe Tyr Lys Ile Pro Ile

165 170

<210>7

<211>172

<212>PRT

<213>Pseudomonas fluorescens

<400>7

Val Lys Arg Leu Phe Cys Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Met Gly

1 5 10 15

Gln Ser Phe Thr Ala Gln Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala Val Gly Ala

20 25 30

Thr Ser Asp Ser Thr Met Thr Tyr Arg Leu Gly Met Asn Phe Asp Trp

35 40 45

Asp Lys Ser Trp Leu Gln Ser Asp Val Gly Arg Leu Thr Gly Tyr Trp

50 55 60

Ser Gly Ala Tyr Thr Tyr Trp Glu Gly Asp Lys Thr Ser Ser Asn Asn

65 70 75 80

Ser Leu Ser Phe Ser Pro Val Phe Val Tyr Glu Phe Ala Gly Gln Ser

85 90 95

Val Lys Pro Tyr Val Glu Ala Gly Ile Gly Val Ala Leu Phe Ser Asn

100 105 110

Thr Glu Tyr Glu Asp Asn Lys Leu Gly Gly Ser Phe Gln Phe Glu Asp

115 120 125

Arg Leu Gly Phe Gly Leu Arg Phe Asn Gly Gly His Glu Val Gly Ile

130 135 140

Arg Ala Thr His Tyr Ser Asn Ala Gly Leu Ser Ser Asp Asn Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Ser Tyr Ser Leu His Tyr Thr Met Pro Leu

165 170

<210>8

<211>172

<212>PRT

<213>Pseudomonas syringae

<400>8

Met Lys Arg Leu Phe Cys Leu Ala Val Ile Ala Ala Ala Leu Ala Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ala Asp Gly Val Glu Phe Ser Val Gly Gln

20 25 30

Thr Gly Glu Ser Thr Met Thr Tyr Arg Leu Gly Val Gln Phe Asp Trp

35 40 45

Asp Lys Thr Trp Leu Gln Ser Asp Ile Gly Arg Leu Thr Gly Tyr Trp

50 55 60

Asp Gly Ala Tyr Thr Tyr Trp Asp Gly Lys Asp Tyr Lys Asp Asn His

65 70 75 80

Ser Leu Ser Phe Ser Pro Val Leu Val Tyr Glu Phe Gly Asn Gly Asn

85 90 95

Val Lys Pro Tyr Leu Glu Ala Gly Ile Gly Val Ser Val Phe Ser Asn

100 105 110

Thr Gln Val Glu Asp Arg Lys Phe Gly Ser Ala Phe Asn Phe Glu Asp

115 120 125

Arg Ile Gly Phe Gly Leu Arg Phe Ala Gly Gly His Glu Val Gly Ile

130 135 140

Arg Ala Thr His Tyr Ser Asn Ala Gly Ile Lys Glu Pro Asn Asp Gly

145 150 155 160

Ile Glu Ser Tyr Ala Leu His Tyr Lys Met Pro Phe

165 170

<210>9

<211>173

<212>PRT

<213>Pseudomonas putida

<400>9

Met Lys Thr Arg Leu Ala Ala Ser Leu Ala Val Ala Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Ala Gly Ala Asp Leu Val Gln Ala Ala Gln Ile Ser Gly Ala Val Gly

20 25 30

Ala Thr Gly Gln Gly Asp Met Thr Tyr Arg Ile Gly Met Ser Phe Asp

35 40 45

Trp Asp Lys Lys Trp Leu Glu Ser Ser Thr Gly His Val Ser Gly Tyr

50 55 60

Trp Asp Ala Ala Tyr Thr Tyr Trp Glu Gly Gly Asp Ala Ser Gly Ala

65 70 75 80

His Ser Leu Ser Phe Ser Pro Val Phe Thr Tyr Glu Phe Ser Gly Phe

85 90 95

Thr Tyr Thr Pro Tyr Ile Glu Ala Gly Ile Gly Leu Ala Ala Phe Ser

100 105 110

Lys Thr Asp Val Gly Asp Gln Arg Leu Gly Ser Ala Val Asn Phe Glu

115 120 125

Asp Arg Ile Gly Phe Gly Leu Lys Leu Pro Gly Glu Gln Lys Val Gly

130 135 140

Ile Arg Ala Met His Tyr Ser Asn Ala Gly Ile Lys Gln Pro Asn Asp

145 150 155 160

Gly Ile Glu Ser Tyr Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Ala Phe

165 170

<210>10

<211>172

<212>PRT

<213>Pseudomonas putida

<400>10

Met Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Met Ser Ala Gln Ala Ala Asp Val Ser Phe Ser Val Gly Gln

20 25 30

Thr Gly Asp Ser Thr Met Val Tyr Arg Leu Gly Leu Gln Ser Asn Trp

35 40 45

Asp Ala Ser Trp Trp Gln Thr Ser Val Gly Arg Leu Thr Gly Tyr Trp

50 55 60

Asp Gly Ala Tyr Thr Tyr Trp Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ser Asn His

65 70 75 80

Ser Leu Ser Phe Ala Pro Val Phe Val Tyr Glu Phe Ala Gly Glu Ser

85 90 95

Val Lys Pro Tyr Ile Glu Ala Gly Ile Gly Val Ala Ala Phe Ser Ser

100 105 110

Thr Glu Leu Glu Ser Asn Glu Leu Gly Ser Ala Phe Gln Phe Glu Asp

115 120 125

Arg Ile Gly Phe Gly Leu Arg Phe Ala Gly Gly His Glu Ile Gly Val

130 135 140

Arg Ala Ile His Tyr Ser Asn Ala Gly Ile Lys Glu Pro Asn Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Ser Tyr Ser Leu His Tyr Arg Met Ala Leu

165 170

<210>11

<211>187

<212>PRT

<213>Burkholderia fungorum

<400>11

Met Asn Asn Lys Lys Asn Val Leu Arg Asp Leu Ala Leu Lys Ile Thr

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Leu Val Gly Ala Ser Gly Val Ala Ser Ala Asp Gln

20 25 30

Phe Gly Val Gln Val Ala Gly Gly Leu Gly Asp Arg His Val Lys Lys

35 40 45

Leu Asp Leu Gly Phe Val Trp Asp Pro Asp Leu Asn Trp Trp Gln Ile

50 55 60

Gly Asp Trp His Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ala His Val Ala Trp Trp

65 70 75 80

His Thr Asn Glu Gly Asn Val His Asp Asn Ile Gly Glu Val Gly Val

85 90 95

Thr Pro Ile Ile Arg Phe Ile Lys Glu Ser Gly Pro Ile Arg Pro Tyr

100 105 110

Ala Glu Leu Gly Ala Gly Ile Arg Leu Leu Ser Ser Pro Arg Ile Ser

115 120 125

Ser Thr Phe Thr Leu Gly Thr Ala Phe Gln Phe Ala Asp Met Ala Gly

130 135 140

Val Gly Met Gln Phe Gly Asn Arg Gln Gln Tyr Gln Ala Gly Tyr Arg

145 150 155 160

Phe Gln His Ile Ser Asn Gly Gly Ile Lys Glu Pro Asn Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Phe His Gln Leu Tyr Leu Gln Tyr Asn Phe

180 185

<210>12

<211>189

<212>PRT

<213>Burkholderia mallei

<400>12

Met Asn Asp Lys Asn Gly Gly Arg Val Gly Arg Ala Ile Ala Arg Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Gly Ala Ser Gly Ser Ala Phe Ala Asp

20 25 30

Arg Trp Gly Leu Gln Leu Gly Gly Gly Val Ala Asp His Asp Met Lys

35 40 45

Lys Gly Asp Ile Ala Val Val Trp Asp Pro Asn Trp Thr Trp Trp Glu

50 55 60

Ile Gly Gly Trp His Phe Ala Phe Val Ala Glu Gly His Leu Ser Tyr

65 70 75 80

Trp Arg Tyr Thr Gly Asp Arg Ala Ile Asn Ser Ser Ile Trp Glu Val

85 90 95

Gly Ala Thr Pro Ile Ile Arg Phe Ile Lys Ser Ala Gly Tyr Val Arg

100 105 110

Pro Phe Val Glu Leu Gly Ala Gly Val Arg Phe Leu Ser His Pro Thr

115 120 125

Ile Ser Gln Asn Tyr Ser Met Ser Thr Ser Phe Gln Phe Ala Asp Met

130 135 140

Val Gly Val Gly Ala Gln Phe Gly Asn His Gln Gln Tyr Gln Ala Gly

145 150 155 160

Phe Arg Phe Gln His Val Ser Asn Ala Gly Ile Lys Asp Pro Asn Pro

165 170 175

Gly Ile Asn Phe Ser Gln Leu Tyr Val Gln Tyr Asn Phe

180 185

<210>13

<211>189

<212>PRT

<213>Burkholderia pseudomallei

<400>13

Met Asn Asp Lys Asn Gly Gly Arg Val Gly Arg Ala Ile Ala Arg Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Gly Ala Ser Gly Ser Ala Phe Ala Asp

20 25 30

Arg Trp Gly Leu Gln Leu Gly Gly Gly Val Ala Asp His Asp Met Lys

35 40 45

Lys Gly Asp Ile Ala Val Val Trp Asp Pro Asn Trp Thr Trp Trp Glu

50 55 60

Ile Gly Gly Trp His Phe Ala Phe Val Ala Glu Gly His Leu Ser Tyr

65 70 75 80

Trp Arg Tyr Thr Gly Asp Arg Ala Ile Asn Ser Ser Ile Trp Glu Val

85 90 95

Gly Ala Thr Pro Ile Ile Arg Phe Ile Lys Ser Ala Gly Tyr Val Arg

100 105 110

Pro Phe Val Glu Leu Gly Ala Gly Val Arg Phe Leu Ser His Pro Thr

115 120 125

Ile Ser Gln Asn Tyr Ser Met Ser Thr Ser Phe Gln Phe Ala Asp Met

130 135 140

Val Gly Val Gly Ala Gln Phe Gly Asn Arg Gln Gln Tyr Gln Ala Gly

145 150 155 160

Phe Arg Phe Gln His Val Ser Asn Ala Gly Ile Lys Asp Pro Asn Pro

165 170 175

Gly Ile Asn Phe Ser Gln Leu Tyr Val Gln Tyr Asn Phe

180 185

<210>14

<211>177

<212>PRT

<213>Azotobacter vinelandii

<400>14

Met Arg Lys Tyr Leu Ser Leu Pro Ala Val Ala Val Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gly Val Ala Gln Ala Val Glu Val Gly Ala Ala Val Gly Val

20 25 30

Thr Ser Gln Asn Asp Met Thr Tyr Arg Leu Ser Leu Gly Leu Pro Trp

35 40 45

Glu Lys Gln Trp Trp Lys Ser Asp Leu Gly Tyr Val Thr Gly Tyr Trp

50 55 60

Asp Ala Gly Tyr Thr Tyr Trp Glu Gly Gly Ser Gly Asn Asp Asn Tyr

65 70 75 80

Ala Gly Ala His Ser Leu Ser Phe Ser Pro Val Phe Thr Tyr Glu Phe

85 90 95

Ser Gly Phe Ser Ser Val Thr Pro Phe Leu Glu Leu Gly Val Gly Val

100 105 110

Ala Phe Phe Ser Lys Thr Arg Val Gly Glu Gln Gln Leu Gly Ser Ser

115 120 125

Phe Asn Phe Glu Asp Arg Ile Gly Ala Gly Ile Lys Phe Ala Gly Gly

130 135 140

Gln Lys Val Gly Ile Arg Ala Ile His Tyr Ser Asn Ala Gly Ile Lys

145 150 155 160

Gln Pro Asn Asp Gly Ile Glu Ser Phe Ser Ala Tyr Tyr Ser His Ala

165 170 175

Phe

<210>15

<211>195

<212>PRT

<213>Ralstonia metallidurans

<400>15

Met Pro Pro Ala Asn Leu Ser Arg Lys Leu Pro Ser Ala Arg Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ala Glu

20 25 30

Glu Leu Val Gly Trp Ala His Pro Ala Val Gln Ala Ala Phe Ala Arg

35 40 45

Asp Thr Asp His Gly Ile Asn Lys Tyr Glu Ile Ala Val Asn Phe Asn

50 55 60

Thr Pro Ile Gln Tyr Gly Asn Pro Asp Gly Trp Leu Phe Arg Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Ala Asn Met Gly Tyr Trp Asp Ala Arg Ser Gly Thr Asn Arg

85 90 95

Gln Asn Leu Met Glu Phe Gly Leu Thr Pro Ile Leu Arg Val Glu Lys

100 105 110

Arg Gly Gly Tyr Phe Val Pro Phe Leu Glu Ala Gly Val Gly Leu Arg

115 120 125

Leu Leu Thr His Thr Ser Thr Ser Asp Gln His Asn Phe Ser Thr Ala

130 135 140

Phe Gln Phe Gly Asp Met Val Gly Leu Gly Val Gly Phe Gly Lys Asn

145 150 155 160

Ala Ala Thr Glu Val Gly Met Arg Phe Gln His Ile Ser Asn Ala Gly

165 170 175

Ile Lys Glu Pro Asn Pro Gly Thr Asn Leu Tyr Thr Gly Tyr Val Arg

180 185 190

Tyr Arg Phe

195

<210>16

<211>187

<212>PRT

<213>Ralstonia solanacearum

<400>16

Met Thr Arg Ser Ala Leu Pro Arg Ser Ala Lys Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Val Ser Ala Ala Thr Leu Leu Ala Ala Ala Pro Ala Gln Ala Asp Pro

20 25 30

Ser Val Arg Ala Ile Tyr Gly Arg Asp Asn Arg His Gly Ile Glu Lys

35 40 45

Tyr Gly Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Gly Phe His Cys Gly Asn Pro

50 55 60

Gln Gly Trp Phe Leu Asn Leu Asp Trp Glu Ile Ala Leu Gly Gln Trp

65 70 75 80

Arg Ser Thr Lys Gly Thr Asn Arg Gln Asn Leu Thr Glu Phe Gly Val

85 90 95

Thr Pro Leu Phe Arg Leu Glu Lys Arg Gly Gly Ser Trp Val Pro Phe

100 105 110

Ile Glu Ala Gly Ile Gly Pro Arg Leu Leu Ser His Thr Arg Thr Ser

115 120 125

Asp Glu His Asn Phe Ser Thr Ala Phe Gln Phe Ser Asp Met Ile Gly

130 135 140

Val Gly Val Ala Phe Gly Ser Arg Gln Gln Phe Gln Val Gly Tyr Arg

145 150 155 160

Phe Glu His Leu Ser Asn Ala Ser Ile Lys Arg Pro Asn Pro Gly Thr

165 170 175

Asp Leu Asn Glu Leu Tyr Leu Arg Tyr Thr Phe

180 185

<210>17

<211>187

<212>PRT

<213>Salmonella typhimurium

<400>17

Met Tyr Met Lys Arg Ile Phe Ile Tyr Leu Leu Leu Pro Cys Ala Phe

1 5 10 15

Ala Cys Ser Ala Asn Asp Asn Val Phe Phe Gly Lys Gly Asn Lys His

20 25 30

Gln Ile Ser Phe Ala Ala Gly Glu Ser Ile Arg Arg Gly Gly Val Glu

35 40 45

His Leu Tyr Thr Ala Phe Leu Thr Tyr Ser Glu Pro Ser Asp Phe Phe

50 55 60

Phe Leu Gln Ala Arg Asn Asn Leu Glu Leu Gly Gly Phe Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gly Ser Asp Asp Cys Ser Lys His Ser Gly Ser Val Pro Cys Asn Lys

85 90 95

Tyr Asn Gln Gly Val Leu Gly Ile Ser Lys Asp Val Ala Leu Val His

100 105 110

Phe Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Ile Gly Leu Gly Ala Tyr Ile Lys Ser

115 120 125

Lys Ser Arg Asp Asp Met Arg Val Asn Ser Ala Phe Thr Phe Gly Glu

130 135 140

Lys Ala Phe Leu Gly Trp Asn Phe Gly Ala Phe Ser Thr Glu Ala Tyr

145 150 155 160

Ile Arg His Phe Ser Asn Gly Ser Leu Thr Asp Lys Asn Ser Gly His

165 170 175

Asn Phe Val Gly Ala Ser Ile Ser Tyr Asn Phe

180 185

Claims

1.一种多肽，其显示与SEQ ID No.1具有至少25％氨基酸相同性并显示脂质A3-O-脱酰基酶活性。

2.一种多肽，其显示SEQ ID No.1的氨基酸序列。

3.一种DNA序列，其编码具有权利要求1或2中所定义的氨基酸序列。

4.一种DNA载体，其包含权利要求3中所述的DNA序列。

5.根据权利要求4中所述的DNA载体，其中编码所述多肽的DNA序列可操纵地连接于转录调控序列。

6.一种抗体，其能结合权利要求1或2中所述的多肽。

7.一种革兰氏阴性菌，其包含权利要求4或5中所述的DNA载体。

8.包含编码权利要求1或2中所述多肽的DNA序列的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。

9.根据权利要求8中所述的百日咳博德特氏菌，其外膜中包含部分或全部3-O-脱酰基化的脂多糖(LPS)类型。

10.根据权利要求9中所述的百日咳博德特氏菌，其外膜中包含棕榈酰化的LPS。

11.用于制备部分3-O-脱酰基化LPS的方法，方法的步骤包括在有助于合成3-O-脱酰基化LPS的条件下，培养权利要求7-10中任一项所述的细菌，和任选地，回收3-O-脱酰基化LPS。

12.一种组合物，其包含来自博德特氏菌(Bordetella sp.)的、含有至少部分3-O-脱酰基化的LPS。

13.根据权利要求7-10中任一项所述的细菌在制备用于治疗或预防博德特氏菌感染、优选百日咳博德特氏菌感染的药物中的用途。

14.包含至少部分3-O-脱酰基化LPS的分离的博德特氏菌LPS在制备用于治疗或预防博德特氏菌感染的药物中的用途。

15.一种全细胞疫苗，其包含权利要求7-10中任一项所述的细菌。

16.一种无细胞疫苗，其包含权利要求12中所述的组合物。

17.用于体外对革兰氏阴性菌LPS或包含革兰氏阴性菌LPS的组合物进行脱酰基化的方法，步骤包括在有助于革兰氏阴性菌LPS发生酶促脱酰基化的条件下，将所述LPS或所述组合物与权利要求1中所述的多肽相接触。

18.用于诱发针对博德特氏菌的免疫应答的方法，包括给受试者施用来自博德特氏菌的3-O-脱酰基化脂质A原料、3-O-脱酰基化LPS原料或棕榈酰化LPS原料。