BE1022008B1 - Compositions immunogenes combinees - Google Patents

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BE1022008B1 BE2014/0597A BE201400597A BE1022008B1 BE 1022008 B1 BE1022008 B1 BE 1022008B1 BE 2014/0597 A BE2014/0597 A BE 2014/0597A BE 201400597 A BE201400597 A BE 201400597A BE 1022008 B1 BE1022008 B1 BE 1022008B1
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pertussis
antigen
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BE2014/0597A
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Ann-Muriel Steff
Stéphane T. Temmerman
Jean-François Toussaint
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Glaxosmithkline Biologicals S.A.
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Abstract

Compositions immunogènes combinées capables de fournir une protection contre une infection et une maladie provoquée à la fois par le VRS et B. pertussis. Plus spécifiquement, cette invention concerne des compositions qui comprennent un analogue recombiné de la protéine F du VRS, avec des antigènes pertussiques de type acellulaire (Pa) ou germes entiers (Pw) et leur utilisation, en particulier dans le cadre d'une immunisation néonatale et maternelle. Des schémas vaccinaux, des méthodes, ainsi que des utilisations, et des kits, des compositions immunogènes sont également décrits pour protéger le nourrisson contre la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis par l'immunisation maternelle.

Description

COMPOSITIONS IMMUNOGENES COMBINEES CONTEXTE
Cette invention concerne le domaine de l'immunologie. Plus particulièrement cette invention concerne des compositions et des procédés capables de susciter des réponses immunitaires spécifiques du virus respiratoire syncytial (VRS) et de Bordetella pertussis.
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est à l'échelle mondiale la cause la plus courante des infections des voies respiratoires inférieures (IVRI) chez le nourrisson de moins de 6 mois et les prématurés nés à moins, ou à 35 semaines de gestation. Le spectre des maladies à VRS comprend un large tableau de symptômes respiratoires allant de la rhinite et de l'otite à la pneumonie et la bronchiolite, ces deux dernières maladies étant associées à une morbidité et mortalité considérable. L'homme est le seul réservoir connu du VRS. La propagation du virus à partir de sécrétions nasales contaminées s'opère par l'intermédiaire de grosses gouttelettes respiratoires, de sorte qu'un contact étroit avec une personne infectée ou une surface contaminée est requis pour la transmission. Le VRS peut subsister pendant plusieurs heures sur des jouets ou autres objets, ce qui explique le taux élevé d'infections à VRS nosocomiales, en particulier dans les services pédiatriques.
Les chiffres annuels mondiaux des infections et de la mortalité attribuables au VRS sont estimés à 64 millions et 160 000 respectivement. Rien qu'aux Etats-Unis on estime que le VRS est responsable de 18 000 à 75 000 hospitalisations et de 90 à 1900 décès par an. Dans les climats tempérés, le VRS est documenté comme cause, d'épidémies hivernales annuelles d'IVRI aigües, comprenant la bronchiolite et la pneumonie. Aux Etats-Unis, pratiquement tous les enfants ont été infectés par le VRS avant l'âge de 2 ans. Le taux d'incidence des IVRI associées au VRS chez des enfants par ailleurs en bonne santé a été calculé comme étant de 37 pour 1000 enfants-année au cours de leurs deux premières années de vie (45 pour 1000 enfants-année chez le nourrisson de moins de 6 mois) et le risque d'hospitalisation comme étant de 6 pour 1000 enfants-année. L'incidence est supérieure chez les enfants atteints d'une maladie cardio-pulmonaire et chez le prématuré, qui représentent presque la moitié des hospitalisations liées au VRS aux Etats-Unis. Les enfants atteints d'une IVRI plus sévère provoquée par le VRS présentent plus tard une incidence accrue d'asthme infantile. Ces études démontrent le besoin généralisé en termes de vaccins contre le VRS, ainsi que leur utilisation, dans les pays industrialisés, où les coûts de traitement des patients atteints d'IVRI sévères et de leurs séquelles sont substantiels. Le VRS·4' est également de plus en plus reconnu comme cause importante de morbidité à partir d'une maladie de type grippe chez les personnes âgées.
La bactérie Bordetella pertussis est l'agent causatif de la coqueluche, une maladie respiratoire qui peut être sévère chez le nourrisson et le jeune enfant. Les estimations de 1 ' OMS suggèrent que, en 2008, environ 16 millions de cas de coqueluche sont apparus dans le monde, et que 195 000 enfants ont succombé à la maladie. Des vaccins sont disponibles depuis des décennies, et on estime (OMS) que la vaccination a permis d'éviter environ 687 000 décès en 2008. L'évolution clinique de la maladie est caractérisée par des quintes de toux rapides suivies d'un effort inspiratoire, souvent associé à un "chant du coq" caractéristique. Dans les cas graves, la privation d'oxygène peut conduire à des lésions du cerveau ; toutefois, la complication la plus courante reste la pneumonie secondaire. Bien qu'une antibiothérapie soit disponible, avant que la maladie soit diagnostiquée, les toxines bactériennes ont souvent provoqué de graves dommages. La prévention de la maladie est par conséquent très importante, et les progrès dans le domaine de la vaccination sont de ce fait d'un intérêt significatif. Les vaccins de première génération contre B. pertussis étaient des vaccins à germes entiers, composés de bactéries entières qui étaient tuées par traitement thermique, par le formol ou autres moyens. Ils ont été introduits dans de nombreux .pays dans les années 50 et les années 60 et ont réduit avec succès l'incidence de la coqueluche.
Le problème avec les vaccins à germes entiers contre B. pertussis est le niveau élevé de réactogénicité qui leur est associé. Ce problème a été résolu par la mise au point de vaccins anticoquelucheux acellulaires contenant des protéines de B. pertussis très purifiées - généralement au moins l'anatoxine pertussique (PT ; anatoxine pertussique traitée chimiquement ou modifiée génétiquement pour éliminer sa toxicité) . et une hémagglutinine filamenteuse (FHA), souvent avec la protéine pertactine de 69 kD (PRN) et dans certains cas, en plus, des fimbriae de types 2 et 3 (FIM 2 et 3) . Ces vaccins acellulaires sont généralement bien moins réactogènes que les vaccins à germes entiers, et ont été adoptés pour les programmes de vaccination dans de nombreux pays. Toutefois, une tendance globale croissante dans les cas de coqueluche rapportés aux Etats-Unis depuis le début des années 80 (avec une recrudescence des cas rapportés en 2012 supérieure à n'importe quelle année depuis 1955), et des épidémies très médiatisées dans de nombreux pays au cours de ces dernières années, ont conduit à spéculer que la protection obtenue par les vaccins acellulaires est moins durable que celle conférée par les vaccins à germes entiers. Ce déclin de l'immunité après les immunisations infantiles signifie que les adolescents et les adultes sont des réservoirs potentiels de cette maladie très contagieuse. Cela fait courir un risque particulier aux nouveau-nés au cours des premiers mois de leur vie, avant la survenue de la vaccination pédiatrique à 2-3 mois.
Les stratégies pour protéger les nouveau-nés vulnérables comprennent le « cocooning », à savoir la vaccination des adolescents et des adultes ' (y compris les femmes qui viennent d'accoucher) susceptibles d'être en contact avec les nouveau-nés, tandis que la vaccination des femmes enceintes (immunisation maternelle) est désormais recommandée dans plusieurs pays, de façon que les anticorps anti-pertussiques soient transmis par voie placentaire et fournissent une protection jusqu'à ce que le nouveau-né puisse être vacciné directement. La vaccination à la naissance des nouveau-nés a également été évaluée dans des essais cliniques.
Bien que la vaccination anticoquelucheuse soit bien établie, malgré diverses tentatives de production d'un vaccin contre le VRS sans danger et efficace capable de susciter des réponses immunitaires durables et protectrices chez les populations saines et à risque, aucun des candidats évalués à ce jour ne s'est avéré sans danger et efficace pour prévenir l'infection par le VRS et/ou réduire ou prévenir les maladies provoquées par le VRS. Par conséquent, il subsiste un besoin non satisfait en termes de vaccin combiné conférant une protection à la fois contre l'infection par le VRS et B. pertussis et autres maladies associées, qui constituent un danger pour les nouveau-nés et les jeunes enfants.
BREF RESUME
Cette invention concerne des compositions immunogènes combinées, telles que des vaccins, capables de fournir une protection contre une infection et/ou une maladie provoquée à la fois par le VRS et B. pertussis (parfois appelé pertussis dans la présente demande). Plus spécifiquement, cette invention concerne des compositions qui · comprennent un analogue recombiné de la protéine F du VRS, avec des antigènes pertussiques de type acellulaire (Pa) ou germes entiers (Pw) et leur utilisation, en particulier dans le cadre d'une immunisation néonatale et maternelle. Des schémas vaccinaux, des procédés et des utilisations des compositions immunogènes sont en outre décrits pour protéger le nourrisson contre la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis par administration à une femme enceinte d'un analogue recombiné de la protéine F du VRS et d'un antigène pertussique dans au moins une composition immunogène, la protection des nouveau-nés dès leur naissance étant procurée par le transfert transplacentaire des anticorps maternels protecteurs contre le VRS et la coqueluche. Ladite au moins composition immunogène peut être une composition combinée VRS-B. pertussis telle que décrite dans la présente demande. Des kits utiles pour cette immunisation maternelle sont également décrits.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La FIG. IA est une représentation schématique mettant en évidence les caractéristiques structurales de la protéine F du VRS.
La FIG. IB est une représentation schématique d'exemples d'antigènes de préfusion F (PréF) du VRS.
La FIG. 2 montre la conception de l'étude pour une expérience portant sur des cochons d'Inde réalisée dans 1'Exemple 1.
La FIG. 3 montre les résultats de l'Exemple 1 après épreuve virulente dans la descendance de cochons d'Inde avec le VRS.
La FIG. 4 montre la chronologie de la réponse en anticorps neutralisants dans le modèle du cochon d'Inde de 1'Exemple 1.
Les FIG. 5A et 5B sont des graphiques montrant les titres neutralisants et la protection contre une infection provoquée par le VRS après immunisation avec un vaccin combiné VRS + pertussis (Exemple 2).
Les FIG. 6A et 6B sont des graphiques montrant les titres d'anticorps sériques et la protection contre une infection provoquée par Bordetella pertussis après immunisation avec un vaccin combiné VRS + pertussis (Exemple 3).
Les FIG. 7A et 7B sont des graphiques montrant les titres neutralisants chez les mères cochons d'Inde et leurs petits après immunisation maternelle de mères primo-inoculées VRS avec un vaccin combiné VRS + pertussis (Exemple 4).
La FIG. 8 montre la protection contre une infection provoquée par le VRS des petits de mères cochons d'Inde après immunisation maternelle de mères amorcées VRS avec un vaccin combiné VRS + pertussis (Exemple 4).
DESCRIPTION DETAILLEE
INTRODUCTION
La mise au point de vaccins pour prévenir l'infection à VRS a été compliquée par le fait que les réponses immunitaires de l'hôte semblent jouer un rôle dans la pathogenèse de la maladie. Les premières études remontant aux années 60 ont montré que des enfants vaccinés avec un vaccin contre le VRS inactivé par le formol souffraient d'une forme aggravée de la maladie lors d'une exposition ultérieure au virus, comparés à des sujets témoins non vaccinés. Ces essais précoces ont provoqué l'hospitalisation de 80 % des vaccinés et deux décès. L'aggravation de la maladie a été reproduite dans des modèles animaux et semble résulter de niveaux inadéquats d'anticorps neutralisants sériques, d'une absence d'immunité locale, et d'une induction excessive d'une réponse immunitaire en cellules T auxiliaires de type 2 (Th2) avec éosinophilie pulmonaire et production accrue d'interleukines IL-4 et IL-5. Par contre, un vaccin couronné de succès qui protège contre l'infection à VRS induit une réponse immunitaire orientée Thl, caractérisée par la production d'IL-2 et d'interféron γ (IFN).
Bien que l'immunisation contre la coqueluche soit bien établie, en l'absence autrefois de vaccin acceptable contre le VRS, l'opportunité d'étudier un vaccin combiné capable de conférer une protection contre une infection et/ou une maladie à VRS et B. pertussis ne s'est pas présentée. Comme ces agents infectieux représentent un risque très significatif pour le nouveau-né et le jeune nourrisson (qui dans le cas de B. pertussis doivent encore se construire une protection complète stimulée par le schéma vaccinal pédiatrique) et qu'ils présentent également tous les deux un danger pour les personnes âgées, une composition immunogène combinée permettant 1'administration des deux vaccins à la fois au cours d'une seule injection serait avantageuse en termes de confort pour le receveur, d'observation du schéma vaccinal, du rapport coût-efficacité, et libérerait de l'espace dans le calendrier des immunisations pour d'autres vaccins.
La présente invention décrit des compositions immunogènes combinées (e.g. vaccins) qui protègent contre l'infection, ou la.maladie associée, à la fois par le VRS et B. pertussis, et des procédés pour les utiliser, notamment pour protéger les nouveau-nés et les nourrissons, populations chez lesquelles on trouve les plus fortes incidences et gravité, en termes de morbidité et de mortalité, associées à ces pathogènes. La protection de cette démographie présente des défis. Les nourrissons, notamment les prématurés, peuvent avoir un système immunitaire immature. Il y a également la possibilité d'une interférence des anticorps maternels avec la vaccination Chez le très jeune enfantOn a connu dans le passé le problème de l'aggravation de la maladie provoquée par le VRS avec la vaccination de très jeunes enfants contre le VRS, ainsi que les défis posés par le déclin de l'immunité provoqué par l'infection naturelle et l'immunisation. L'immunisation maternelle avec des vaccins contenant des antigènes pertussiques s'est avérée accroître les titres d'anticorps anti-pertussiques chez le nouveau-né (par rapport aux nouveau-nés dont les mères n'ont pas été soumises à une immunisation maternelle) (par exemple, Gall et al (2011), Am J Obstet Gynecol, 204:334.el-5, incorporé ici par référence), et cette immunisation maternelle est désormais recommandée dans certains pays. Outre divulguer les méthodes d'immunisation utilisant les compositions combinées ci- décrites, la présente invention décrit en plus les schémas vaccinaux, les procédés et les utilisations desdites compositions immunogènes pour protéger les nouveau-nés et les nourrissons par immunisation des femmes enceintes avec des combinaisons d'antigènes de VRS et de B. pertussis, y compris par utilisation des compositions immunogènes combinées VRS-B. pertussis ci-décrites. Les antigènes suscitent de manière avantageuse la production d'anticorps qui sont transférés à l'enfant en gestation par le placenta et a pour effet de conférer une protection immunologique passive à l'enfant après sa naissance et qui dure pendant toute la période critique de l'infection et de la forme grave de la maladie provoquées par le VRS.et B. pertussis.
Un aspect de cette invention concerne une composition . immunogène combinée comprenant au moins un antigène du VRS et au moins un antigène de B. pertussis, dans laquelle ledit au moins antigène de B. pertussis comprend au moins un antigène pertussique acellulaire (Pa) ou comprend un antigène à germes entiers (Pw).
En particulier, l'invention concerne une composition immunogène combinée dans laquelle ledit au moins antigène du VRS est un analogue soluble recombiné de la protéine F. Des analogues F stabilisés dans la conformation postfusion ("PostF"), ou qui sont labiles par rapport à la conformation, peuvent être utilisés. De manière avantageuse, l'analogue de la protéine F est un antigène de préfusion F ou "PréF" qui comprend au moins une modification qui stabilise la conformation préfusion de la protéine F.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit au moins antigène de B. pertussis de la composition immunogène combinée comprend au moins un antigène Pa choisi dans le groupe constitué par : l'anatoxine pertussique (PT), 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN), des fimbriae de type 2 (FIM2), des fimbriae de type 3 (FIM3). Ces vaccins Pa sont bien connus dans la technique.
Dans un autre mode de réalisation, ledit au moins antigène de B. pertussis comprend un antigène Pw, les -vaccins Pw étant bien connus dans la technique. Tel qu'il est utilisé ici, le terme "antigène à germes entiers (Pw)" désigne un germe de B. pertussis inactivé (qui naturellement contient strictement de nombreux antigènes différents), et équivaut par conséquent à un vaccin Pw.
Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène combinée décrite comprend un véhicule ou un excipient pharmaceutiquement acceptable, tel qu'un tampon. En plus ou en variante, la composition immunogène péut comprendre un adjuvant, par exemple, un adjuvant qui comprend 3D-MPL, QS21 (par ex., sous une forme détoxifiée), une émulsion huile dans l'eau (par ex., avec ou sans molécules iirimuno-stimulatrices, telles que ' 11 α-tocophérol) , des sels minéraux tels que des sels d'aluminium (comprenant l'alun, le phosphate d'aluminium, 1'hydroxyde d'aluminium) et le phosphate de calcium, ou leurs combinaisons.
Dans certains modes de réalisation, les compositions immunogènes combinées décrites comprennent en plus au moins un antigène provenant d'au moins' un organisme pathogène autre que le VRS et B. pertussis. En particulier, ledit au moins organisme pathogène peut être choisi dans le groupe constitué par : Corynebacterium diphtheriae ; Clostridium tetani ; le virus de l'hépatite B ; le virus de la polio ; Haemophilus influenzae Type b ; N. meningitidis Type C ; N. meningitidis Type Y ; N. meningitidis Type A, N. meningitidis Type W ; et N. meningitidis Type B.
Selon un autre aspect, cette invention concerne l'utilisation des compositions immunogènes décrites pour prévenir et/ou traiter 1'infection/la maladie à VRS et B. pertussis. Par conséquent, un procédé pour susciter une réponse immunitaire contre le VRS et B. pertussis, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité immunologiquement efficace de ladite composition immunogène combinée est décrit.
Selon un autre aspect, cette invention concerne les compositions immunogènes combinées ci-décrites pour leur utilisation en médecine, en particùlier pour prévenir ou traiter chez un sujet une infection provoquée par le VRS et B. pertussis, ou une maladie associée à ceux-ci.
Selon un autre aspect, cette invention concerne un schéma vaccinal pour protéger un nourrisson contre l'infection ou la maladie provoquée par' le VRS et B. pertussis, le schéma vaccinal comprenant : l'administration à une femme enceinte portant un enfant en gestation d'au moins une composition immunogène capable de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique à la fois du VRS et de B. pertussis, ladite au moins composition immunogène comprenant un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis, dans lequel au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis dont la production a été suscitée ou augmentée chez la femme enceinte par ladite au moins composition immunogène sont transférés par l'intermédiaire du placenta à l'enfant en gestation, pour le protéger ainsi contre une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
Selon un aspect, une méthode pour protéger un nourrisson contre une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis est également décrite, ladite méthode comprenant : l'administration à une femme enceinte portant un enfant en gestation d'au moins une composition immunogène capable de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique à la fois du VRS et de B. pertussis, ladite au moins composition immunogène comprenant un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis, dans lequel au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis dont la production a été suscitée ou augmentée chez la femme enceinte par ladite au moins composition immunogène sont transférés par l'intermédiaire du placenta à l'enfant en gestation, pour le protéger ainsi contre une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
Un autre aspect selon la présente invention concerne une composition immunogène ou une pluralité de compositions
immunogènes comprenant un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis pouvant être utilisée pour protéger un nourrisson contre une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis, dans laquelle -la ou les compositions immunogènes est/sont formulée(s) à des fins d'administration à une femme enceinte et dans laquelle la ou les compositions immunogènes est/sont .capable(s) de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique à la fois du VRS et de B. pertussis, et dans laquelle au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis dont la production a été stimulée chez la femme enceinte par la ou les compositions immunogènes sont transférés par l'intermédiaire du placenta à l'enfant en gestation, pour le protéger ainsi contre une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
Selon un autre aspect, un kit comprenant une pluralité de compositions immunogènes formulées à des fins d'administration à une femme enceinte est décrit, le kit comprenant : (a) une première composition immunogène comprenant un analogue de protéine F capable d'induire, de susciter ou de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique du VRS ; et (b) une seconde composition immunogène comprenant au moins un antigène de B. pertussis capable d'induire, de susciter ou de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique de B. pertussis, dans lequel après administration à une. femme enceinte, les première et seconde compositions immunogènes induisent, suscitent ou stimulent au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis, lesdits anticorps étant transférés par l'intermédiaire du placenta à l'enfant en gestation de la femme enceinte, le protégeant ainsi d'une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
TERMES
Afin de faciliter la revue des divers modes de réalisation de la présente invention, des explications sont fournies pour les termes suivants. Des termes et des explications supplémentaires peuvent être fournis dans le cadre de cette invention.
Sauf indications contraires, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont les significations normalement connues de l'homme du métier dont l'invention relève. On peut trouver les définitions des termes courants en biologie moléculaire dans Benjamin Lewin, Genes V, publié par Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287^9) ; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publiée par Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) ; et Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publié par VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Sauf indications contraires, les termes singuliers "un", "une", et "le", "la" comprennent les référents pluriels. De manière similaire, et sauf indications contraires, le terme "ou" est destiné à inclure "et". Le terme "pluralité" fait référence à deux ou plus. On comprendra en outre que toutes les tailles des bases ou les tailles d'acides aminés, et toutes les valeurs de poids moléculaires ou de masses moléculaires, indiquées pour les acides nucléiques ou les polypeptides sont approximatives, et sont indiquées à des fins descriptives. De plus, les limites numériques indiquées par rapport aux concentrations ou aux niveaux d'une substance, telle qu'un antigène, sont destinées à être approximatives. Ainsi, quand il est indiqué qu'une concentration est d'au moins (par exemple) 200 pg, on comprendra que la concentration est au moins approximativement (ou "environ" ou de 200 pg.
Bien que des méthodes et des matériels similaires ou équivalents à ceux décrits dans la présente demande puissent être utilisés dans la pratique ou pour tester la présente invention, des' méthodes et des matériels convenables sont décrits ci-dessous. Le terme "comprend" signifie "inclut". Ainsi, sauf indications contraires, on entendra que le terme "comprend", et ses variantes telles que "comprennent/ comprendre", et "comprenant" impliquent l'inclusion du composé ou de la composition indiqué(e) (e.g., acide nucléique, polypeptide, antigène) ou d'une étape, ou d'un groupe de composés ou d'étapes, mais pas à l'exclusion de tout autre composé, composition, étape, ou groupe de ceux-ci. L'abréviation "e.g." est dérivée du latin exempli gratia, et sert dans la présente à indiquer un exemple non limitatif. Par conséquent, l'abréviation "e.g." est synonyme du terme "par exemple".
Le terme "protéine F" ou "protéine de fusion" ou "polypeptide de protéine F" ou "polypeptide de protéine de fusion" désigne un polypeptide ou une protéine ayant tout ou. partie d'une, séquence d'acides aminés d'un polypeptide de protéine de fusion du VRS. De nombreuses protéines de fusion du VRS ont été décrites et sont connues de l'homme du métier. Le document W02008/114149 donne des exemples de variants de protéine F (par .exemple, variants naturels).
Un "analogue de la protéine F" désigne une protéine F qui comprend une modification qui altère sa structure ou sa fonction mais conserve ses propriétés immunologiques de façon qu'une réponse immunitaire générée contre un analogue de la protéine F reconnaisse la protéine F native. Le document WO2010/149745, incorporé ici dans sa totalité par référence, donne des exemples d'analogues de protéine F. Le document W02011/008974, incorporé ici dans sa totalité par référence, donne également des exemples d'analogues de protéine F. Les analogues de la protéine F comprennent par exemple les antigènes PréF qui incluent au moins une modification qui stabilise la conformation préfusion de la protéine F et qui sont généralement solubles, i.e., non liés à la membrane. Les analogues de la protéine F incluent également les antigènes post-fusion F (postF) qui sont dans la conformation postfusion de la protéine F du VRS, avantageusement stabilisés dans cette conformation. Les analogues F incluent en outre la protéine F dans une conformation intermédiaire, avantageusement stabilisés dans cette conformation. De manière générale, ces alternatives sont également solubles.
Un "variant", en référence à un acide nucléique ou à un polypeptide (e.g., un acide nucléique ou polypeptide^ de la protéine F ou G du VRS, ou un acide nucléique ou un polypeptide d'un analogue F) est un acide nucléique ou un polypeptide qui diffère d'un acide nucléique ou d'un polypeptide de référence. Généralement, la ou les différence(s) entre le variant et l'acide nucléique ou le polypeptide de référence porte(nt) sur un nombre proportionnellement petit de différences comparé au référent.
Un "domaine" de polypeptide ou de protéine est un élément structurellement défini au sein du polypeptide ou de la protéine. Par exemple, un "domaine de trimérisation" est une séquence d'acides aminés au sein d'un polypeptide qui favorise l'assemblage du polypeptide en trimères. Par exemple, un domaine de trimérisation peut favoriser l'assemblage en trimères par des associations avec d'autres domaines de trimérisation (d'autres polypeptides ayant une séquence d'acides aminés identique ou différente). Le terme sert également à désigner un polynucléotide qui code pour un peptide ou polypeptide.
Les termes "natif(s)/native(s)" et "naturel(s)/ naturelle(s)" désignent un élément, tel qu'une protéine, un polypeptide ou un acide nucléique qui est présent dans le même état que dans la nature. C'est-à-dire que l'élément n'a pas été modifié artificiellement. On comprendra que, dans le contexte de la présente invention, il existe de nombreux variants natifs/naturels des protéines ou polypeptides du VRS, e.g., obtenus à partir de souches naturelles ou d'isolats différents du VRS. Le document WO2008/114149, incorporé ici par référence dans sa totalité, contient des exemples de souches, de protéines et de polypeptides du VRS, voir par exemple Figure 4.
Le terme "polypeptide" désigne un polymère dans lequel les monomères sont des résidus acides aminés qui sont joints les uns aux autres par des liaisons amide. Les termes "polypeptide" ou "protéine" tels qu'ils sont utilisés ici sont destinés à inclure toute séquence d'acides aminés et incluent les séquences modifiées telles que les glycoprotéines. Le terme "polypeptide" est spécifiquement destiné à englober les protéines naturelles, ainsi que celles qui sont produites par recombinaison ou synthèse. Le terme "fragment", en référence à un polypeptide, désigne une partie (c'est-à-dire, une sous-séquence) d'un polypeptide. Le terme "fragment immunogène" désigne tous les fragments d'un polypeptide qui conservent au moins un épitope immunodominant de la protéine ou du polypeptide de référence entier. L'orientation au sein d'un polypeptide est généralement indiquée dans le sens extrémité N-terminale vers extrémité C-terminale, ledit sens étant défini par l'orientation des fragments amino et carboxy des acides aminés individuels. Les polypeptides sont traduits de l'extrémité N- ou aminoterminale vers l'extrémité C- ou carboxy-terminale.
Un "peptide signal" est une courte séquence d'acides aminés (e.g., longue d'environ 18-25 acides aminés) qui dirige les protéines sécrétoires ou membranaires nouvellement synthétisées vers et à travers les membranes, e.g., dans le réticulum endoplasmique. Les peptides signal sont fréquemment mais pas toujours situés à l'extrémité N-terminale d'un polypeptide, et sont fréquemment séparés par clivage par des peptidases signal après que la protéine a franchi la membrane. Les séquences signal contiennent typiquement trois caractéristiques. structurales communes : une région N-terminale polaire basique (région-n) , une région centrale hydrophobe, et une région C-terminale hydrophile (région-c).
Les termes "polynucléotide" et "séquence d'acide nucléique" désignent une forme polymère de nucléotides d'une longueur d'au moins 10 bases. Les nucléotides peuvent être des ribonucléotides, des désoxyribonucléotides, ou des formes modifiées de l'un ou l'autre de ces nucléotides. Le terme inclut les formes simples et doubles brins de l'ADN. Par "polynucléotide isolé", on entend un polynucléotide qui n'est pas immédiatement contigu aux deux séquences codantes auxquelles il est immédiatement contigu (une sur l'extrémité 5' et une sur l'extrémité 3') dans le génome naturel de l'organisme dont il est dérivé. Dans un mode de réalisation, un polynucléotide code pour un polypeptide. Le sens 5' et 3' d'un acide nucléique est défini en référence à la connectivité des motifs nucléotidiques individuels, et est désigné en fonction des positions du carbone du cycle sucre désoxyribose (ou ribose). La teneur informationnelle (codage) d'une séquence polynucléotidique se lit dans le sens 5' vers 3' .
Un acide nucléique "recombiné" est un acide nucléique dont la séquence n'est pas naturelle ou dont la séquence est constituée par la combinaison artificielle de deux segments de séquence normalement séparés. Cette combinaison artificielle peut être obtenue par une synthèse chimique ou, plus couramment, par la manipulation artificielle de segments d'acides nucléiques isolés, e.g., par des techniques de génie génétique. Une protéine "recombinée" est une protéine qui est codée par un acide nucléique hétérologue (e.g., recombiné), qui a été introduit dans une cellule hôte, telle qu'une cellule bactérienne ou eucaryote. L'acide nucléique peut être introduit, sur un vecteur d'expression contenant des signaux capables d'exprimer la protéine codée par l'acide nucléique introduit ou l'acide nucléique peut être intégré au chromosome de la cellule hôte.
Le terme "hétérologue", quand il s'applique à un acide nucléique, à un polypeptide ou autre composant cellulaire, indique que le composant se trouve là où on ne le trouve pas normalement dans la nature et/ou qu'il provient d'une source ou d'une espèce différente.
Le terme "purification" (e.g., appliqué à un pathogène ou à une composition contenant un pathogène) désigne le procédé d'élimination de certains composants d'une composition, dont la présence n'est pas souhaitée. La purification est un terme relatif, et n'exige pas que toutes les traces du composant indésirable soient éliminées de la composition. Dans le cadre de la production de vaccins, la purification inclut des procédés tels que la centrifugation, la dialyse, la chromatographie par échange d'ions, et la chromatographie d'exclusion, la purification par affinité ou la précipitation. Ainsi, le terme "purifié" n'exige pas une pureté absolue ; il est plutôt considéré comme un terme relatif. Ainsi, par exemple, une préparation d'acide nucléique ou de protéine purifiée est une préparation dans laquelle l'acide nucléique ou la protéine spécifiés est plus enrichi que l'acide nucléique ou la protéine dans son environnement générateur, par exemple au sein d'une cellule ou dans une chambre de réaction biochimique. Une préparation d'acide nucléique ou de protéine essentiellement pure peut être purifiée de façon que l'acide nucléique souhaité représente au moins 50 % de la teneur en acide nucléique totale de la préparation. Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique ou une protéine essentiellement pur représentera au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, ou au moins 95 % ou plus de la teneur en acide nucléique ou en protéine totale de la préparation.
Un composant biologique "isolé" (tel qu'une molécule d'acide nucléique, une protéine ou un organite) a été essentiellement séparé ou séparé par purification des autres composants biologiques dans la cellule de l'organisme dans lequel le composant est naturellement présent, tels que d'autres ADN et ARN chromosomiques et extra-chromosomiques, protéines et organites. Les acides nucléiques et les protéines "isolés" comprennent les acides nucléiques et les protéines purifiés par des méthodes de purification standards. Le terme englobe également les acides nucléiques et les protéines préparés par l'expression recombinée dans une cellule hôte ainsi que les acides nucléiques et les protéines synthétisés chimiquement.
Un "antigène" est un composé, une composition, ou une substance qui peut stimuler la production d'anticorps et/ou une réponse en cellules T chez un sujet, comprenant les compositions qui sont injectées, absorbées ou administrées de quelque autre façon au sujet. Le terme "antigène" inclut tous les épitopes antigéniques apparentés. Le terme "épitope" ou "déterminant antigénique" désigne un site sur un antigène auquel les cellules B et/ou T répondent. Les "épitopes antigéniques dominants" ou "l'épitope dominant" sont les épitopes auxquels une réponse immunitaire de l'hôte fonctionnellement significative, e.g., une réponse en anticorps ou une réponse en cellules T, est apportée. Ainsi, s'agissant d'une réponse immunitaire protectrice contre un pathogène, les épitopes antigéniques dominants sont les fragments antigéniques qui, quand ils sont reconnus par le système immunitaire de l'hôte, ont pour effet de protéger contre la maladie provoquée par le pathogène. Le terme "épitope T" désigne un épitope qui, quand il se lie à une molécule appropriée du CMH, est spécifiquement fixé par une cellule T (par l'intermédiaire d'un récepteur de cellules T). Un "épitope B" est un épitope qui est spécifiquement fixé par un anticorps (ou par une molécule de récepteur de cellules B) .
Un "adjuvant" est un agent qui améliore la production d'une réponse immunitaire d'une manière non spécifique de l'antigène. Les adjuvants courants comprennent les suspensions de minéraux (alun, hydroxyde d'aluminium, phosphate d'aluminium) sur lesquels l'antigène est adsorbé ; les émulsions, comprenant les émulsions eau dans l'huile, et huile dans l'eau (et leurs variantes, comprenant les doubles émulsions et les émulsions réversibles), les liposaccharides, les lipopolysaccharides, les acides nucléiques immuno-stimulateurs (tels que les oligonucléotides CpG), les liposomes, les agonistes des récepteurs Toll-like (en particulier, les agonistes TLR2, TLR4, TLR7/8 et TLR9), et diverses combinaisons de ces composants..
Un "anticorps" ou une "immunoglobuline" est une protéine plasmatique, constituée de quatre polypeptides qui se lie spécifiquement à un antigène. Une molécule d'anticorps est constituée de deux polypeptides à chaîne lourde et de deux polypeptides à chaîne légère (ou des multiples de ceux-ci) maintenus ensemble par des liaisons disulfure. Chez l'homme, les anticorps sont définis en cinq isotypes ou classes : IgG, IgM, IgA, IgD, et IgE. Les anticorps IgG peuvent en outre être subdivisés en quatre sous-classes (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4). Un anticorps "neutralisant" est un anticorps qui est capable d'inhiber l'infectivité d'un virus. Par exemple, les anticorps neutralisants spécifiques du VRS sont capables d'inhiber ou de réduire l'infectivité du VRS.
Une "composition immunogène" est une composition de matière pouvant être administrée à un su-jet humain ou animal (e.g., dans un cadre expérimental ou clinique) qui est capable de susciter une réponse immunitaire spécifique, e.g., contre un pathogène, tel que le VRS ou B. pertussis. A ce titre, une composition immunogène comprend un ou plusieurs antigènes (par exemple, des antigènes polypeptidiques) ou épitopes antigéniques. Une composition immunogène peut également comprendre un ou plusieurs composants supplémentaires capables de susciter ou d'améliorer une réponse immunitaire, tels qu'un excipient, un véhicule, et/ou un adjuvant. Dans certains cas, les compositions immunogènes sont administrées pour susciter une réponse immunitaire qui protège le sujet contre des symptômes ou des affections induits par un pathogène. Dans certains cas, les symptômes ou la maladie provoqués par un pathogène sont évités (ou réduits ou améliorés) par inhibition de la réplication du pathogène (e.g., VRS ou B. pertussis) après exposition du sujet au pathogène. Dans le cadre de la présente invention, on comprendra que le terme "composition immunogène" englobe les compositions qui sont destinées à être administrées à un sujet ou à une population de sujets afin de susciter une réponse immunogène protectrice ou palliative contre le VRS et/ou B. pertussis (à savoir, des compositions vaccinales ou des vaccins). Le terme "composition immunogène combinée" est utilisé dans la présente demande comme référence pour désigner spécifiguement les compositions immunogènes décrites dans la présente demande et gui comprennent à la fois des antigènes de VRS et de B. pertussis (par opposition à des compositions immunogènes comprenant des antigènes de VRS mais pas de B. pertussis, ou inversement).
Une "réponse immunitaire" est la réponse d'une cellule du système immunitaire, telle qu'une cellule B, une cellule T, ou un monocyte, à un stimulus, tel qu'un pathogène ou un antigène (e.g., formulé sous la forme d'une composition immunogène ou d'un vaccin). Une réponse immunitaire peut être une réponse en cellules B, avec pour résultat la production d'anticorps spécifiques, tels que des anticorps neutralisants spécifiques de l'antigène. Une réponse immunitaire peut également être une réponse en cellules T, telle qu'une réponse en CD4+ ou une réponse en CD8+. Les réponses en cellules B et cellules T sont des aspects d'une réponse immunitaire "cellulaire". Une réponse immunitaire peut également être une réponse immunitaire "humorale", médiée par des anticorps. Dans certains cas, la réponse est spécifique d'un antigène particulier (à savoir, "réponse spécifique de l'antigène"). Si l'antigène est dérivé d'un pathogène, la réponse spécifique de l'antigène est une "réponse spécifique du pathogène". Une "réponse immunitaire protectrice" est une réponse immunitaire qui inhibe la fonction ou l'activité nocive d'un pathogène, réduit l'infection par un pathogène, ou diminue les symptômes (y compris la mort) qui résultent de l'infection par le pathogène. Une réponse immunitaire protectrice peut être mesurée, par exemple, par l'inhibition de la réplication virale ou de la formation de plaques dans un dosage de réduction de plaques ou un dosage de neutralisation par ELISA, ou par mesure de la résistance à l'épreuve virulente par un pathogène in vivo. L'exposition d'un sujet à un stimulus pathogène, tel qu'un pathogène ou un antigène (e.g., formulé sous la forme d'une composition immunogène ou d'un vaccin), suscite une réponse immunitaire primaire spécifique du stimulus, à savoir, l'exposition "amorce" la réponse immunitaire. Une exposition ultérieure, e.g., par immunisation, au stimulus peut augmenter ou "stimuler" l'amplitude (ou la durée, ou les deux) de la réponse immunitaire spécifique. Par conséquent, "stimuler" une réponse immunitaire préexistante par administration d'une composition immunogène augmente l'amplitude d'une réponse spécifique de l'antigène (ou du pathogène), (e.g., par accroissement du titre d'anticorps et/ou de l'affinité, par accroissement de la fréquence des cellules B ou T spécifiques de l'antigène, par induction d'une fonction effectrice de maturation, ou l'une quelconque de leurs combinaisons).
Une réponse immunitaire orientée "Thl" est caractérisée par la présence de cellules T auxiliaires CD4+ productrices d'IL-2 et d'IFN-γ, et par conséquent, par la sécrétion ou la présence d'IL-2 et d'IFN-γ. Par contre, une réponse immunitaire orientée "Th2" est caractérisée par une prépondérance de cellules CD4+ productrices d'IL-4, IL-5, et IL-13.
Une "quantité immunologiquement efficace" est la quantité de composition (typiquement, de composition immunogène) utilisée pour susciter une réponse immunitaire chez un sujet à la composition ou à un antigène contenu dans la composition. Généralement, le résultat recherché est la production d'une réponse immunitaire spécifique de l'antigène (e.g., du pathogène) qui est capable de protéger ou contribue à protéger le sujet contre le pathogène. Toutefois, obtenir une réponse immunitaire protectrice contre un pathogène peut exiger de multiples administrations de la composition immunogène. Par conséquent, dans le cadre de la présente invention, le terme "quantité immunologiquement efficace" englobe une dose fractionnaire qui contribue en combinaison avec des administrations antérieures et postérieures à obtenir une réponse immunitaire protectrice. L'adjectif "pharmaceutiquement acceptable" indique que le référent se prête à une administration à un sujet (e.g., un sujet humain ou animal). Remington's Pharmaceutical Sciences, par E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15ème Edition (1975), décrit des compositions et des formulations (comprenant des diluants) se prêtant à l'administration pharmaceutique de compositions thérapeutiques et/ou prophylactiques, comprenant des compositions immunogènes.
Le terme "moduler" en référence à une réponse, telle qu'une réponse immunitaire, signifie "altérer", ou "faire varier" la survenue, l'amplitude, la durée ou les caractéristiques de la réponse. Un agent qui module une réponse immunitaire altère au moins la survenue et/ou l'amplitude et/ou la durée et/ou les caractéristiques de la réponse immunitaire après son administration, ou altère au moins sa survenue et/ou son amplitude et/ou sa durée et/ou ses caractéristiques, comparé à un agent de référence.
Le terme "réduit" est un terme relatif, dans le sens où un agent réduit une réponse ou une affection si la réponse ou l'affection est quantitativement diminuée après administration de l'agent, ou si elle est diminuée après administration de l'agent, comparé à un agent de référence. De manière similaire, le terme "protège" ne signifie pas nécessairement qu'un agent élimine complètement le risque •d'une infection ou d'une maladie provoquée par l'infection, mais qu'au moins une caractéristique de la réponse ou de l'affection est sensiblement ou significativement réduite ou éliminée. Ainsi, une composition immunogène qui protège contre ou réduit une infection ou une maladie, ou un de ses symptômes, peut prévenir ou éliminer l'infection ou la maladie mais pas nécessairement chez tous les sujets, du moment que l'incidence ou la sévérité de l'infection ou l'incidence ou la sévérité de la maladie est réduite de manière mesurable, par exemple, d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou d'au moins environ 7 0 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 % par rapport à l'infection ou à la maladie en l'absence de l'agent, ou comparé à un agent de référence.
Un "sujet" est un organisme vertébré multicellulaire vivant, tel qu'un mammifère. Dans le cadre de la présente invention, le sujet peut être un sujet expérimental, tel qu'un animal non humain, e.g., une souris, un rat des cotonniers, un cochon d'Inde, une vache, ou un primate non humain. En variante, le sujet peut être un sujet humain.
ANALOGUES DE LA PROTEINE F DU VRS
Dans un mode de réalisation particulier l'analogue de la protéine F est un antigène de préfusion F ou "PréF" qui comprend au moins une modification qui stabilise la conformation préfusion de la protéine F. En variante, des analogues F stabilisés en conformation postfusion ("PostF") , ou qui sont labiles par rapport à la conformation peuvent être utilisés. Généralement l'antigène constitué par l'analogue de la protéine F, (e.g., PréF, PostF, etc.) est dépourvu de domaine transmembranaire, et est soluble, i.e., non lié à la membrane (par exemple, pour faciliter l'expression et la purification de l'analogue de la protéine F) .
Des détails concernant la structure de la protéine F du VRS sont fournis dans la présente demande en référence à la terminologie et aux désignations largement admises dans la technique, et sont représentés schématiquement sur la FIG. IA. Une représentation schématique d'exemples d'antigènes PréF est illustrée sur la FIG. IB.
Dans des modes de réalisation exemplaires, l'analogue de la protéine F comprend dans le sens extrémité N-terminale vers extrémité C-terminale : au moins une partie ou essentiellement tout le domaine F2 et le domaine Fi d'un polypeptide de protéine F du VRS, éventuellement avec un domaine de trimérisation hétérologue. Dans un mode de réalisation, il n'y a pas de site de clivage furine entre le domaine F2 et le domaine Fi. Dans certains modes de réalisation exemplaires, le domaine F2 comprend au moins une partie d'un polypeptide de la protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 26-105 du polypeptide précurseur de la protéine F de référence (Fo) de SEQ ID No:2 et/ou le domaine Fi comprend au moins une partie d'un polypeptide de la protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 137-516 du polypeptide précurseur de la protéine F de référence (Fo) de SEQ ID N0:2.
Par exemple, dans des modes de réalisation spécifiques, l'analogue de la protéine F est choisi dans le groupe constitué par : (a) un polypeptide comprenant un polypeptide choisi dans le groupe de SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID No:10, SEQ ID N0:18, SEQ ID No:20 et SEQ ID No:22 ;
(b) un polypeptide codé par un polynucléotide choisi dans le groupe de SEQ ID No:5, SEQ ID No:7, SEQ ID N0 : 9, SEQ ID No:17, SEQ ID No:19 et SEQ ID No:21, ou par une séquence polynucléotidique qui s'hybride dans- des conditions stringentes sur pratiquement toute sa longueur à un polynucléotide choisi dans le groupe de SEQ ID No:5, SEQ' ID No:7, SEQ ID No:9, SEQ ID No :17, SEQ ID No:19 et SEQ ID No:21, ledit polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés correspondant au moins en partie à une souche naturelle du VRS ; (c) un polypeptide présentant une identité de séquence d'au moins 95 % avec un polypeptide choisi dans le groupe de SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID No:10, SEQ ID N0:18, SEQ ID No:20 et SEQ ID No:22, ledit polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés qui ne correspond pas à une souche naturelle du VRS.
Eventuellement, l'analogue de la protéine F comprend en outre un peptide signal. Eventuellement, l'analogue de la protéine F peut en outre comprendre une "étiquette" ou séquence pour faciliter la purification, e.g., une séquence multi-histidine.
Dans des modes de réalisation comprenant un domaine de trimérisation hétérologue, ce domaine peut comprendre un domaine en super-hélice, tel qu'une glissière à isoleucine, ou il peut comprendre un domaine de trimérisation alternatif, issu par exemple de la fibritine ("foldon") du bactériophage T4 ou de la HA de 1'influenza.
Dans certains modes de réalisation exemplaires, l'analogue de la protéine F comprend au moins une modification choisie parmi : (i) une modification qui altère la glycosylation ; (ii) une modification qui élimine au moins un site de clivage non-furine ; (iii) une modification qui délète un ou plusieurs acides aminés du domaine pep27 ; et (iv) une modification de substitution ou d'addition de type acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe du domaine extracellulaire de la protéine F.
Dans certains modes de réalisation, l'analogue de la protéine F comprend un multimère de polypeptides, par exemple, un trimère de polypeptides.
Comme mentionné ci-dessus, dans un mode de réalisation particulier l'antigène recombiné du VRS de la composition immunogène combinée décrite comprend un analogue de protéine de Fusion (F) qui contient un polypeptide soluble de protéine F, qui a été modifié pour stabiliser la conformation préfusion de la protéine F, à savoir, la conformation de la protéine F assemblée mature avant sa fusion à la membrane de la cellule hôte. Ces analogues de protéine F sont désignés "PréF" ou "antigènes PréF", pour des raisons de clarté et de simplicité. Ces antigènes, décrits et proposés à titre d'exemples dans WO2010/149745, manifestent des caractéristiques immunogènes améliorées, et sont sans danger et très protecteurs quand ils sont administrés à un sujet in vivo. L'homme du métier comprendra que toute protéine F du VRS peut être modifiée pour stabiliser la conformation préfusion selon les enseignements de la présente demande. Par conséquent, pour faciliter la compréhension des principes régissant la production d'antigènes PréF, les composants structuraux individuels seront indiqués en référence à une protéine F exemplaire dont les séquences polynucléotidiques et d'acides aminés sont fournies dans SEQ ID Nos:l et 2, respectivement. De manière similaire, si applicable, les antigènes de protéine G sont décrits en référence à une protéine G exemplaire dont les séquences polynucléotidiques et d'acides aminés sont fournies dans SEQ ID Nos:3 et 4, respectivement.
En référence à la séquence d'acides aminés primaire du polypeptide de protéine F (FIG. IA), les termes suivants sont utilisés pour décrire les caractéristiques structurales des antigènes PréF.
Le terme Fo désigne un précurseur de protéine F entière après traduction. Le polypeptide Fo peut être subdivisé en un domaine F2 et un domaine Fi séparés par un peptide intermédiaire, désigné pep27. Pendant la maturation, le polypeptide Fo subit un clivage protéolytique au niveau des deux sites furine situés entre F2 et Fi et flanquant pep27. Pour la discussion qui suit, le domaine F2 comprend au moins une partie, et jusqu'à tous les acides aminés 1-109, et la partie soluble du domaine Fi comprend au moins une partie, et jusqu'à tous les acides aminés 137-526 de la protéine F. Comme indiqué ci-dessus, ces positions d'acides aminés (et toutes les positions d'acides aminés ultérieures indiquées dans la présente demande) sont données en référence au polypeptide précurseur de la protéine F exemplaire (Fo) de SEQ ID N0 : 2. L'antigène de préfusion F (ou "PréF") est un analogue soluble (à savoir, non lié à la membrane) de la protéine F qui comprend au moins une modification qui stabilise la conformation préfusion de la protéine F, de façon que l'antigène du VRS conserve au moins un épitope immunodominant de la conformation préfusion de la protéine F. L'analogue soluble de la protéine F comprend le domaine F2 et le domaine
Fi de la protéine F du VRS (mais ne comprend pas le domaine transmembranaire de la protéine F du VRS) . Dans des modes de réalisation exemplaires, le domaine F2 comprend les acides aminés. 26-105 et le domaine Fi comprend les acides aminés 137-516 d'une protéine F. Toutefois, des parties plus petites peuvent également être utilisées, du moment que la conformation tridimensionnelle de l'antigène PréF stabilisée est conservée. De manière similaire, des polypeptides ;qui comprennent des composants structuraux supplémentaires (e.g., polypeptides de fusion) peuvent également être utilisés à la place des domaines F2 et Fi exemplaires, du moment que les composants supplémentaires n'altèrent pas la conformation tridimensionnelle, ou n'affectent pas par ailleurs . négativement la stabilité au choc, la production ou la maturation, ou ne diminuent pas ;l'immunogénicité de l'antigène. Les domaines F2 et Fi sont positionnés selon une orientation extrémité N-terminale vers extrémité C-terminale conçue pour répliquer le repliement et l'assemblage de l'analogue de la protéine F en une conformation préfusion mature. Pour améliorer la production, le domaine F2 peut être précédé d'un peptide signal sécrétoire, tel qu'un peptide signal natif de la protéine F ou un peptide signal hétérologue choisi pour améliorer la production et la sécrétion dans les cellules hôtes chez lesquelles l'antigène PréF recombiné doit être exprimé.
Les antigènes PréF sont stabilisés (dans leur conformation préfusion trimère) par introduction d'une ou de plusieurs modifications, telles que l'addition, la délétion ou la substitution, d'un ou de plusieurs acides aminés. Une de ces modifications stabilisatrices est l'addition d'une séquence d'acides aminés comprenant un domaine stabilisateur hétérologue. Dans des modes de réalisation exemplaires, le domaine stabilisateur hétérologue est un domaine de multimérisation protéique. Un exemple particulièrement avantageux de ce domaine de multimérisation protéique est un domaine en super-hélice, (coiled-coil) tel qu'un domaine de type glissière à isoleucine (« isoleucine zipper ») qui favorise la trimérisation de multiples polypeptides possédant ce domaine. Un domaine glissière à isoleucine exemplaire est représenté dans SEQ ID No:ll. Typiquement, le domaine stabilisateur hétérologue se trouve côté extrémité C-terminale par rapport au domaine Fi.
Eventuellement, le domaine de multimérisation est lié au domaine Fi par une courte séquence lieur d'acides aminés, telle que la séquence GG. Le lieur peut également avoir une séquence plus longue (par exemple, contenant la séquence GG, telle que la séquence d'acides aminés : GGSGGSGGS ; SEQ ID
No:14). De nombreux lieurs conformationnellement neutres connus dans la technique peuvent être utilisés dans ce contexte sans altérer la conformation de l'antigène PréF.
Une autre modification stabilisatrice est l'élimination d'un site de reconnaissance et de clivage furine situé entre les domaines F2 et Fi dans la protéine Fo native. Un seul ou les deux sites de reconnaissance furine, situés aux positions 105-109 et aux positions 133-136, peuvent être éliminés par délétion ou substitution d'un ou de plusieurs acides aminés des sites de reconnaissance furine, pour que la protéase soit incapable de cliver le polypeptide PréF en ses domaines constitutifs. Eventuellement, le peptide intermédiaire pep27 peut également être éliminé ou substitué, e.g., par un peptide lieur. En plus, ou éventuellement, un site de clivage non-furine (e.g., site métalloprotéinase aux positions 112-113) à proximité du peptide de fusion peut être éliminé ou substitué.
Un autre exemple de mutation stabilisatrice est l'addition ou la substitution de type acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe de la protéine F. Typiquement, un acide aminé chargé, tel que la lysine, sera ajouté ou se substituera à un résidu neutre, tel que la leucine, dans la région hydrophobe. Par exemple, un acide aminé hydrophile peut être ajouté, . ou se substituer à un acide aminé hydrophobe ou neutre dans le domaine en super-hélice HRB du domaine extracellulaire de la protéine F. A titre d'exemple, un résidu acide aminé chargé, tel que la lysine, peut se substituer à la leucine présente à la position 512 de la protéine F. En variante, ou en plus, un acide aminé hydrophile peut être ajouté, ou se substituer, à un acide aminé hydrophobe ou neutre dans le domaine HRA de la protéine F. Par exemple, un ou plusieurs acides aminés chargés, tels que la lysine, peuvent être insérés aux positions ou à proximité des positions 105-106 (e.g., à la suite de l'acide aminé correspondant au résidu 105 de la SEQ ID No: 2 de référence, par exemple entre les acides aminés 105 et 106) de l'antigène PréF. Eventuellement, des acides aminés hydrophiles peuvent être ajoutés ou se substituer à la fois dans les domaines HRA et HRB. En variante, un ou plusieurs résidus hydrophobes peuvent être délétés, du moment que la conformation globale de l'antigène PréF n'est pas affectée négativement.
En plus ou en variante, une ou plusieurs modifications qui altèrent l'état de glycosylation de l'antigène PréF peuvent être introduites. Par exemple, un ou plusieurs acides aminés dans un site de glycosylation présent dans une protéine F native du VRS, e.g., au niveau ou autour du résidu acide aminé 500 (comparé à SEQ ID No:2) peuvent être délétés ou substitués (ou un acide aminé peut être ajouté pour que le site de glycosylation soit altéré) afin d'accroître ou de réduire l'état de glycosylation de l'antigène PréF. Par exemple, les acides aminés correspondant aux positions 500-502 de SEQ ID No: 2 peuvent être choisis parmi : NGS ; NKS ; NGT ; et NKT. Ainsi, dans certains mode de réalisation, les antigènes PréF comprennent un analogue soluble de la protéine F constitué d'un domaine F2 (e.g., correspondant aux acides aminés 26-105 de SEQ ID No:2) et d'un domaine Fi (e.g., correspondant aux acides aminés 137-516 de SEQ ID No:2) d'un polypeptide de la protéine F du VRS, dans lequel au moins une modification qui altère la glycosylation a été introduite. L'antigène PréF du VRS inclut typiquement un peptide de fusion intact entre le domaine F2 et le domaine Fi. Eventuellement, l'antigène PréF inclut un peptide signal.
Comme décrit ci-dessus, ces analogues de la protéine F peuvent comprendre au moins une modification choisie parmi : (i) l'addition d'une séquence d'acides aminés comprenant un domaine de trimérisation.hétérologue (tel qu'un domaine glissière à isoleucine) ; (ii) la délétion d'au moins un site de clivage par la furine ; (iii) la délétion d'au moins un site de clivage non-furine ; (iv) la délétion d'un ou de plusieurs acides aminés du domaine pep27 ; et (v) au moins une substitution ou addition de type acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe du domaine extracellulaire de la protéine F.
Comme décrit ci-dessus, ces antigènes PréF du VRS modifiés en termes de glycosylation s'assemblent en multimères, e.g., trimères.
Dans des modes de réalisation exemplaires, les antigènes PréF modifiés en termes de glycosylation sont choisis dans le groupe suivant : a) un polypeptide comprenant ou constitué par SEQ ID N0 :22 ; b) un polypeptide codé par SEQ ID No:21 ou par une séquence polynucléotidique qui s'hybride dans des conditions stringentes sur pratiquement toute sa . longueur à SEQ ID No:21 ; c) un polypeptide présentant une identité de séquence d'au moins 95 % avec SEQ ID No:22. L'une quelconque et/ou toutes ces modifications stabilisatrices peuvent être utilisées individuellement et/ou en combinaison avec l'une quelconque des autres modifications stabilisatrices ci-décrites pour obtenir un antigène PréF. Dans dès modes de réalisation exemplaires la protéine PréF comprend un polypeptide comprenant un domaine F2 et un domaine Fi sans site de clivage furine intermédiaire entre le domaine F2 et le domaine Fi, avec un domaine stabilisateur hétérologue (e.g., domaine de trimérisation) positionné côté extrémité C-terminale par rapport au domaine Fi. Dans certains modes, l'antigène PréF comprend également une ou plusieurs additions et/ou substitutions de type résidu hydrophile dans un domaine HRA et/ou HRB hydrophobe. Eventuellement, l'antigène PréF porte une modification d'au moins un site de clivage non-furine, tel qu'un site métalloprotéinase.
Un antigène PréF peut éventuellement inclure un composant polypeptidique supplémentaire qui comprend au moins une partie immunogène de la protéine G du VRS. A savoir, dans certains modes de réalisation, l'antigène PréF est une protéine chimérique qui comprend à la fois un composant de protéine F et de protéine G. Le composant de protéine F peut être tout antigène PréF décrit ci-dessus, et le composant de protéine G choisi est une partie immunologiquement active de la protéine G du VRS (jusqu'à et/ou comprenant une protéine G entière). Dans des modes de réalisation exemplaires, le polypeptide de protéine G comprend les acides aminés 149-229 d'une protéine G (les positions des acides aminés étant indiquées en référence à la séquence de la protéine G représentée dans SEQ ID No:4). L'homme du métier comprendra qu'une partie ou un fragment plus petit de protéine G peut être utilisé, du moment que la partie choisie conserve les caractéristiques immunologiques dominantes du plus gros· fragment de protéine G. En particulier, le fragment choisi conserve l'épitope immunologiquement dominant entre à peu près les positions d'acides aminés 184-198 (e.g., acides aminés 180-200),et est suffisamment long pour se replier et s'assembler selon une conformation stable qui présente l'épitope immunodominant. Des fragments plus longs peuvent également être utilisés, e.g., allant environ de l'acide aminé 128 à environ l'acide aminé 229, jusqu'à la protéine G entière, du moment que le fragment choisi se replie selon une conformation stable dans le cadre de la protéine chimérique, et n'interfère pas avec la production, la maturation moléculaire ou la stabilité une fois produit par recombinaison dans des cellules hôtes. Eventuellement, le composant de protéine G est lié au composant de protéine F par une courte séquence lieur d'acides aminés, telle que la séquence GG. Le lieur peut également avoir une séquence plus longue (telle que la séquence d'acides aminés : GGSGGSGGS: SEQ ID N0:14). De nombreux lieurs conformationnellement neutres connus dans la technique peuvent être utilisés dans ce contexte sans altérer la conformation de l'antigène PréF.
Eventuellement, le composant de protéine G peut comprendre une ou plusieurs substitutions d'acides aminés qui réduisent ou - préviennent l'aggravation de la maladie virale dans un modèle animal de la maladie provoquée par- le VRS. A savoir, la protéine G peut inclure une substitution d'acide aminé de façon que, quand une composition immunogène comprenant l'antigène chimérique PréF-G est administrée à un sujet choisi parmi un modèle animal admis (e.g., modèle murin du VRS), le sujet présente des symptômes réduits, voire aucun symptôme, de la maladie virale aggravée par le vaccin (e.g., éosinophilie, neutrophilie) , comparé à un animal témoin recevant un vaccin qui contient une protéine G non modifiée. La réduction et/ou la prévention de la maladie virale aggravée par le vaccin peut être apparente quand les compositions immunogènes sont administrées- en l'absence d'adjuvant (mais pas, par exemple, quand les antigènes sont administrés en présence d'un adjuvant induisant une réponse Thl forte). De plus, la substitution d'acide aminé peut réduire ou prévenir la maladie virale aggravée par le vaccin quand il est administré à un sujet humain. Un exemple de substitution d'acide aminé convenable est le remplacement de l'asparagine à la position 191 par une alanine (Asn -> Ala à la position d'acide aminé 191: N191A).
Eventuellement, tout antigène PréF décrit ci-dessus peut inclure une séquence supplémentaire servant d'auxiliaire de purification. Un exemple est une étiquette polyhistidine. Cette étiquette peut être éliminée du produit final si souhaité.
Quand ils sont exprimés, les antigènes PréF subissent un repliement intramoléculaire et s'assemblent en une protéine mature qui comprend un multimère de polypeptides. De manière favorable, les polypeptides de l'antigène préF s'assemblent en un trimère qui ressemble à la conformation préfusion de la protéine F mature du VRS.
Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène comprend un antigène PréF (tel que le mode de réalisation exemplaire représenté par SEQ ID No:6) et un second polypeptide qui comprend un composant de protéine G. Le composant de protéine G comprend typiquement au moins les acides aminés 149-229 d'une protéine G. Bien que des parties plus petites de protéine G puissent être utilisées, les fragments doivent comprendre, au minimum, l'épitope immunodominant des acides aminés 184-198. En variante, le composant de protéine G peut comprendre une plus grande partie de la protéine G, comme les acides aminés 128-229 ou 130-230, éventuellement sous forme d'un élément d'une plus grosse protéine, telle que la protéine G entière, ou un polypeptide chimérique.
Dans d'autres modes de réalisation, la composition, immunogène comprend un antigène PréF qui est une protéine chimérique qui comprend également un composant de protéine G (tels que les modes de réalisation exemplaires représentés par SEQ ID Nos:8 et 10). Le composant de protéine G de cet antigène PréF chimérique (ou PréF-G) comprend typiquement au moins les acides aminés 149-229 d'une protéine G. Comme indiqué ci-dessus, des fragments plus petits ou plus gros (tels que les acides aminés 129-229 · ou 130-230) de la protéine G peuvent également être utilisés, du moment que les épitopes immunodominants sont conservés, et que la conformation de l'antigène PréF-G n'est pas affecté négativement. D'autres détails concernant les antigènes PréF, et des méthodes pour les utiliser, sont présentés ci-dessous, et dans les Exemples.
Les antigènes recombinés du VRS ci-décrits sont des analogues de la protéine F dérivés de et, correspondant immunologiquement en tout ou en partie, à la protéine F du VRS. Ils peuvent comprendre une ou plusieurs modifications qui altèrent la structure ou la fonction de la protéine F mais conservent ses propriétés immunologiques de façon qu'une réponse immunitaire générée contre un analogue de la protéine F reconnaisse la protéine F native et par conséquent reconnaisse le VRS. Les analogues de protéine F ci-décrits sont utiles en tant qu'immunogènes.
Dans la nature, la protéine F du VRS est exprimée sous la forme d'un précurseur de polypeptide unique de 574 acides aminés de long, désigné Fo. In vivo, Fo s'oligomérise dans le réticulum endoplasmique et est traité protéolytiquement par une furine protéase au niveau de deux séquences consensus de furine conservées (sites de clivage furine), RARR109 (SEQ ID No:15) et RKRR136 (SEQ ID No:16) pour générer un oligomère constitué par deux fragments liés par un disulfure. Le plus petit de ces fragments est appelé F2 et provient de la partie N-terminale du précurseur Fo. Le fragment C-terminal le plus gros, Fi, ancre la protéine F dans la membrane par l'intermédiaire d'une séquence d'acides aminés hydrophobes, qui sont adjacents à une queue cytoplasmique de 24 acides aminés. Trois dimères F2-F1 s'associent pour former une protéine F mature, qui adopte une conformation préfusogène ("préfusion") métastable qui après déclenchement subit un changement conformationnel au contact d'une membrane cellulaire cible. Ce changement conformationnel expose une séquence hydrophobe, connue sous le nom de peptide de fusion, qui s'associe à la membrane cellulaire hôte et favorise la fusion de la membrane du virus, ou d'une cellule infectée, avec la membrane cellulaire cible.
Le fragment Fi contient au moins deux domaines à répétition de type heptade, désignés HRA et HRB, et qui sont situés à proximité du peptide de fusion et des domaines d'ancrage transmembranaires, respectivement. Dans la conformation préfusion, le dimère F2-F1 forme une structure de type tête globulaire et tige, dans laquelle les domaines HRA sont dans une conformation segmentée (étendue) dans la tête globulaire. Par contre, les domaines HRB forment une tige en super-hélice à trois brins s'étendant à partir de la région de tête. Lors de la transition des conformations préfusion à postfusion, les domaines HRA s'affaissent et sont amenés à proximité des domaines HRB pour former un faisceau six hélices anti-parallèle. A l'état post-fusion, le peptide de fusion et les domaines transmembranaires sont juxtaposés, pour faciliter la fusion à la membrane.
Bien que la description conformationnelle fournie ci-dessus se base sur le modèle moléculaire de données cristallographiques, les distinctions entre les conformations pré-fusion et post-fusion peuvent être surveillées sans recourir à la cristallographie. Par exemple, la micrographie électronique peut être utilisée pour distinguer entre les conformations pré-fusion et post-fusion (également appelées préfusogènes et fusogènes), comme démontré par Calder et al., Virology, 271:122-131 (2000) et Morton et al., Virology, 311:275-288, qui sont incorporés ici par référence pour leurs enseignements technologiques. La conformation pré-fusion peut également être distinguée de la conformation fusogène (postfusion) par des tests d'association de liposomes comme décrit par Connolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006), qui est également incorporé ici par référence pour ses enseignements technologiques. De plus, les conformations pré-fusion et fusogènes peuvent être distinguées à l'aide d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement les épitopes conformationnels présents sur l'une des formes pré-fusion ou fusogène de la protéine F du VRS, mais pas sur l'autre. Ces épitopes conformationnels peuvent être dus à l'exposition préférentielle d'un déterminant antigénique à la surface de la molécule. En variante, les épitopes conformationnels peuvent provenir de la juxtaposition d'acides aminés qui sont non contigus dans le polypeptide linéaire.
Typiquement, les analogues de la protéine F (PréF, PostF, etc.) sont dépourvus de domaine transmembranaire et de queue cytoplasmique, et peuvent également être désignés "ectodomaine de la protéine F" ou "ectodomaine soluble de la protéine F".
Les analogues de la protéine F comprennent un polypeptide de protéine F, qui a été modifié pour stabiliser la conformation pré-fusion de la protéine F, à savoir, la conformation de la protéine F mature assemblée avant sa fusion avec la membrane cellulaire hôte. Ces analogues de la protéine F sont désignés "analogues PréF", "PréF" ou "antigènes PréF", à des fins de clarté et de simplicité, et sont généralement solubles. Les analogues PréF ci-décrits s'expliquent d'après la découverte selon laquelle les analogues solubles de la protéine F qui ont été modifiés par incorporation d'un domaine de trimérisation hétérologue manifestent des caractéristiques immunogènes améliorées, et sont sans danger et très protecteurs quand ils sont administrés à un sujet in vivo. Des antigènes PréF exemplaires sont décrits dans WO2010/149745, incorporé ici par référence dans sa totalité pour sa description d'exemples d'antigènes PréF.
Les analogues de la protéine F comprennent également un polypeptide de protéine F ayant la conformation d'une protéine F de post-fusion et qui peuvent être désignés "antigène PostF" ou "antigène post-fusion". Des analogues PostF sont décrits dans W02011/008974, incorporé ici par référence. L'antigène PostF contient au moins une modification pour altérer la structure ou la fonction de la protéine F post-fusion native.
Les analogues PréF' ci-décrits sont conçus pour stabiliser et conserver la conformation pré-fusion de la protéine F du VRS, pour que dans une population de protéine exprimée, une partie substantielle de la population de protéine exprimée soit dans la conformation préfusogène (pré-fusion) (e.g., comme prédit par modélisation structurale et/ou thermodynamique ou comme évalué par un ou plusieurs des procédés décrits ci-dessus). Les modifications stabilisatrices sont introduites dans une protéine F native (ou synthétique), telle que la protéine F exemplaire de SEQ ID No:2, de façon que les épitopes immunogènes majeurs de la conformation pré-fusion de la protéine F soient conservés après introduction de l'analogue PréF dans un environnement cellulaire ou extracellulaire (par exemple, in vivo, e.g., après administration à un sujet).
Premièrement, un domaine stabilisateur hétérologue peut être placé à l'extrémité C-terminale de la construction afin de remplacer le domaine d'ancrage à la membrane du polypeptide Fo. Ce domaine stabilisateur devrait compenser l'instabilité HRB, contribuer à stabiliser le conformère préfusion. Dans des modes de réalisation exemplaires, le domaine stabilisateur hétérologue est un domaine de multimérisation protéique. Un exemple particulièrement favorable de ce domaine de multimérisation protéique est un domaine de trimérisation. Les domaines de trimérisation exemplaires se replient en super-hélice qui favorise l'assemblage en trimères de multiples polypeptides possédant ces domaines en super-hélice. A titre d'exemples de domaines de trimérisation, il y a les domaines de trimérisation issus de 1'hémagglutinine de 1'influenza, la spiculé du SARS, la gp41 du VIH, le GCN4 modifié, la fibritine du bactériophage T4. et l'ATCase. Un exemple favorable de domaine de trimérisation est une glissière à isoleucine. Un domaine glissière à isoleucine illustratif est le variant d'isoleucine de GCN4 remanié décrit par Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993). La séquence d'un domaine glissière à isoleucine convenable est représentée par SEQ ID No: 11, bien que les variants de cette séquence qui conservent sa capacité à former un domaine stabilisateur en super-hélice soient également convenables. D'autres domaines de trimérisation en super-hélice stabilisateurs comprennent : TRAF2 (No. d'accès GENBANK® Q12933 [gi: 23503103] ; acides aminés 299-348) ; la thrombospondine 1 (No. d'accès P07996 [gi:135717] ; acides aminés 291-314) ; la matriline-4 (No. d'accès 095460 [gi:14548117] ; acides aminés 594-618 ; CMP (matriline-1) (No. d'accès NP_002370 [gi:4505111] ; acides aminés 463-496 ; HSF1 (No. d'accès AAX42211 [gi: 61362386] ; acides aminés 165-191 ; et la cubiline (No. d'accès NP_001072 [gi:4557503] ; acides aminés 104-138. Un domaine de trimérisation convenable devrait permettre l'assemblage d'une partie substantielle de la protéine exprimée en trimères. Par exemple, au moins 50 % d'un polypeptide PréF recombiné possédant un domaine de trimérisation s'assemblera en trimère (e.g., comme évalué par AFF-MALS). Typiquement, au moins 60 %, plus favorablement au moins 70 %, et de manière préférée entre toutes au moins environ 75 % ou plus du polypeptide exprimé est sous la forme d'un trimère.
Un autre exemple de mutation stabilisatrice est l'addition ou la substitution de type acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe de la protéine F. Typiquement, un acide aminé chargé, tel que la lysine, sera ajouté ou se substituera à un résidu neutre, tel que la leucine, dans la région hydrophobe. Par exemple, un acide aminé hydrophile peut être ajouté, ou se substituer à un acide aminé hydrophobe ou neutre dans le domaine en super-hélice HRB du domaine extracellulaire de la protéine F. A titre d'exemple, un résidu acide aminé chargé, tel que la lysine, peut se substituer à la leucine présente à la position 512 de la protéine F (par rapport au polypeptide natif Fo ; L482K dans le polypeptide analogue PréF illustratif de SEQ ID No:6). En variante, ou en plus, un acide aminé hydrophile peut être ajouté, ou se substituer, à un acide aminé hydrophobe ou neutre dans le domaine HRA de la protéine F. Par exemple, un ou plusieurs acides aminés chargés, tels que la lysine, peuvent être insérés aux positions ou à proximité des positions 105-106 (e.g., à la suite de l'acide aminé correspondant au résidu 105 de la SEQ ID No: 2 de référence, par exemple entre les acides aminés 105 et 106) de l'analogue PréF. Eventuellement, des acides aminés hydrophiles peuvent être ajoutés ou introduits par substitution à la fois dans les domaines HRA et HRB. En variante, un ou plusieurs résidus hydrophobes peuvent être délétés, du moment que la conformation globale de l'analogue PréF n'est pas affectée négativement.
Deuxièmement, pep27 peut être éliminé. L'analyse d'un modèle structural de la protéine F du VRS à l'état pré-fusion suggère que pep27 crée une grande boucle non contrainte entre Fi et F2· Cette boucle ne contribue pas à la stabilisation de l'état pré-fusion, et est éliminée après clivage de la protéine native par la furine. Par conséquent, pep27 peut également être éliminé des modes de réalisation qui impliquent un analogue conformationnel post-fusion (ou autre).
Troisièmement, un ou les deux motifs de clivage furine (situés entre les domaines F2 et Fi dans la protéine native Fo) peuvent être délétés. Un ou les deux sites de reconnaissance de la furine, situés aux positions 105-109 ou 106-109 et aux positions 133-136 peuvent être éliminés par délétion ou substitution d'un ou de plusieurs acides aminés des sites de reconnaissance de la furine, par exemple délétion d'un ou de plusieurs acides aminés ou substitution d'un ou de plusieurs acides aminés, ou combinaisons d'une ou de plusieurs substitutions ou délétions, ou modification telle que la protéase est incapable de cliver le polypeptide PréF (ou autre analogue de la protéine F) en ses domaines constitutifs. Eventuellement, le peptide pep27 intermédiaire peut également être éliminé ou substitué, e.g., par un peptide lieur. En plus, ou éventuellement, un site de clivage non-furine (e.g., site métalloprotéinase aux positions 112-113) à proximité du peptide de fusion peut être éliminé ou substitué.
Par conséquent, un analogue de la protéine F pouvant être utilisé -dans les procédés et selon les utilisations de la présente invention qui est un ectodomaine non clivé comportant un ou plusieurs sites de clivage furine altérés peut être obtenu. Ces polypeptides analogues de la protéine F sont produits par des techniques de recombinaison dans une cellule hôte qui les sécrète à l'état non clivé aux positions d'acides aminés 101 à 161, e.g. à l'état non clivé au niveau des sites de clivage furine aux positions 105-109 et 131-136. Dans des modes de réalisation particuliers, la substitution K131Q, la délétion des acides aminés aux positions 131-134, ou les substitutions K131Q ou R133Q ou R135Q ou R136Q, sont utilisées pour inhiber le clivage en 136/137.
Dans une conception exemplaire, le peptide de fusion n'est pas séparé de F2 par clivage, ce qui empêche la libération du conformère pré-fusion de la tête globulaire et 1'accessibilité aux membranes proches. L'interaction entre le peptide de fusion et l'interface de la membrane est considérée comme un point majeur dans l'instabilité de l'état pré-fusion. Lors du processus de fusion, l'interaction entre le peptide de fusion et la membrane cible entraîne l'exposition du peptide de fusion hors de la structure tête globulaire, augmentant l'instabilité de l'état pré-fusion et le repliement dans le conformère post-fusion. Ce changement de conformation permet le processus de fusion à la'membrane. L'élimination d'un ou des deux sites de clivage furine devrait priver· la partie N-terminale du peptide de fusion d'accessibilité à la membrane, stabilisant l'état pré-fusion. Ainsi, dans les modes de réalisation exemplaires ci-décrits, l'élimination des motifs de clivage furine donne un analogue PréF qui comprend un peptide de fusion intact, qui n'est pas clivé par la furine pendant ou après la maturation et 1'assemblage.
Eventuellement, au moins un site de clivage non-furine peut également être éliminé, par exemple par substitution d'un ou de plusieurs acides aminés. Par exemple, des constatations expérimentales suggèrent que dans des conditions conduisant au clivage par certaines métalloprotéinases, l'analogue dé la protéine F peut être clivé au voisinage des acides aminés 110-118 (par exemple, avec un clivage s'opérant entre les acides aminés 112 et 113 de l'analogue de la protéine F ; entre une leucine à la position 142 et une glycine à la position 143 du polypeptide de la protéine F de référence de SEQ ID No: 2). Par conséquent, la modification d'un ou de plusieurs acides aminés dans cette région peut réduire le clivage de l'analogue de la protéine F. Par exemple, la leucine à la position 112 peut être substituée par un acide aminé différent, tel qu'une isoleucine, une glutamine ou un tryptophane (comme illustré dans le mode de réalisation exemplaire de SEQ ID No:20). En variante ou en plus, la glycine à la position 113 peut être substituée par une sérine ou alanine. Dans d'autres modes de réalisation, les analogues de la protéine F contiennent en outre des sites de clivage trypsine altérés, et les analogues de la protéine F ne sont pas clivés par la trypsine au niveau d'un site entre l'acide aminé 101 et 161.
Eventuellement, un analogue de la protéine F peut inclure une ou plusieurs modifications qui altèrent le motif ou l'état de glycosylation (e.g., par augmentation ou réduction de . la proportion de molécules glycosylées sur un ou plusieurs des sites de glycosylation présents dans un polypeptide de protéine F native). Par exemple, le polypeptide de la protéine F native de SEQ ID No: 2 devrait être glycosylé aux positions d'acides aminés 27, 70 et 500 (correspondant aux positions 27, 70 et 470 de l'analogue PréF représentatif de SEQ ID No: 6). Dans un mode de réalisation, une modification est introduite au voisinage du site de glycosylation à la position d'acide aminé 500 (désignée N470). Par exemple, le site de glycosylation peut être éliminé par substitution d'un acide aminé, de type glutamine (Q) à la place de l'asparagine à la position 500 (de la séquence de référence, qui correspond par alignement à la position 470 de l'analogue PréF exemplaire). De manière avantageuse, une modification qui accroît l'efficacité de la glycosylation sur ce site de glycosylation est introduite. A titre d'exemples de modifications convenables, il y a aux positions 500-502, les séquences d'acides aminés suivantes : NGS ; NKS ; NGT ; NKT. De manière intéressante, on a constaté que les modifications de ce site de glycosylation qui induisent une glycosylation accrue induisent également une production de PréF sensiblement accrue. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, les analogues PréF ont un site de glycosylation modifié à la position correspondant à l'acide aminé 500 de la séquence PréF de référence (SEQ ID No:2), e.g., à la position 470 de l'analogue PréF représenté par SEQ ID No:6. De manière convenable, les modifications comprennent les séquences : NGS ; NKS ; NGT ; NKT aux acides aminés correspondant aux positions 500-502 de la séquence polypeptidique de la protéine F de référence. La séquence d'acides aminés d'un mode de réalisation exemplaire qui comprend une modification "NGT" est illustré dans SEQ ID No: 18. L'homme du métier peut facilement déterminer des modifications similaires pour les modifications NGS, NKS, et NKT correspondantes. Ces modifications se combinent favorablement à l'une quelconque des mutations stabilisatrices ci-décrites (e.g., une superhélice hététologue, telle qu'un domaine de type glissière à isoleucine et/ou une modification dans une région hydrophobe, et/ou l'élimination de pep27, et/ou l'élimination d'un site de ciivage furine, et/ou l'élimination d'un site de clivage non-furine) . Par exemple, dans un mode de réalisation spécifigue, l'analogue de la protéine F comprend une substitution qui élimine un site de clivage non-furine et une modification qui accroît la glycosylation.- Une séquence d'analogue PréF exemplaire est illustrée dans SEQ ID No: 22 (ledit mode de réalisation exemplaire comprenant une modification "NGT" et une substitution de type glutamine à la place de leucine à la position 112). Par exemple, dans certains modes de réalisation exemplaires, les analogues PréF modifiés sur le plan glycosylation sont choisis dans le groupe suivant : a) un polypeptide comprenant ou constitué par SEQ ID No:22 ; b) un polypeptide codé par SEQ ID No: 21 ou par une séquence polynucléotidique qui s'hybride dans des conditions stringentes sur pratiquement toute sa longueur à SEQ ID No:21 ; c) un polypeptide présentant une identité de séquence d'au moins 95 % avec SEQ ID No:22.
Plus généralement, l'une quelconque des modifications stabilisatrices ci-décrites, e.g., l'addition d'un domaine stabilisateur hétérologue, tel qu'une super-hélice (par exemple, un domaine de type glissière à isoleucine), de préférence située à l'extrémité C-terminale de l'analogue soluble de la protéine F ; la modification d'un résidu, tel que leucine à lysine, dans le domaine HRB hydrophobe ; l'élimination de pep27 ; l'élimination d'un ou des deux motifs de clivage furine ; l'élimination d'un site de clivage non-furine tel qu'un site de clivage trypsine ; et/ou une modification d'un site de glycosylation peuvent être utilisées en combinaison avec l'aine quelconque ou plusieurs des autres modifications stabilisatrices (voire toutes selon toute combinaison souhaitée). Par exemple, une superhélice hétérologue (ou autre domaine stabilisateur hétérologue) peut être utilisée seule ou en combinaison quelconque avec : une modification dans une région hydrophobe, et/ou l'élimination de pep27, et/ou l'élimination d'un site de clivage furine, et/ou l'élimination d'un site de clivage non-furine. Dans certains modes de réalisation spécifiques, l'analogue de la protéine protéine F, tel que l'analogue PréF, comprend un domaine en super-hélice C-terminal (glissière à isoleucine), une substitution stabilisatrice dans le domaine HRB hydrophobe, et l'élimination d'un ou des deux sites de clivage furine. Ce mode de réalisation comprend un peptide de fusion intact qui n'est pas éliminé par le clivage par la furine. Dans un mode de réalisation spécifique, l'analogue de la protéine F comprend également un site de glycosylation modifié à la position d'acide aminé 500. L'analogue de la protéine F pour les compositions et méthodes ci-décrites peut être obtenu par un procédé qui comprend l'utilisation d'un matériel biologique contenant l'analogue de la protéine F (e.g., analogue PréF, analogue PostF ou ectodomaine non clivé de la protéine F, etc.) et la purification des monomères ou multimères (e.g., trimères) polypeptidiques de l'analogue ou d'un mélange de ceux-ci à partir du matériel biologique. L'analogue de la protéine F peut être sous la forme de monomères ou de trimères polypeptidiques, ou d'un mélange de monomères et de trimères, qui peut exister à l'équilibre. La présence d'une forme unique peut procurer des avantages tels qu'une réponse immunitaire plus prévisible ou une meilleure stabilité.
Par conséquent, dans un mode de réalisation, l'analogue de la protéine F utilisable selon l'invention est un analogue de protéine F purifié, qui peut être sous la forme de monomères ou de trimères ou d'un mélange de monomères et de trimères, essentiellement exempt de lipides et de lipoprotéines.
Le polypeptide de la protéine F peut être choisi parmi toute protéine F d'une souche VRS A ou VRS B, ou parmi leurs variants (tels que définis ci-dessus). Dans certains modes de réalisation exemplaires, le polypeptide de la protéine F est la protéine F représentée par SEQ ID No: 2. Pour faciliter la compréhension de la présente invention, toutes les positions des résidus acides aminés, indépendamment de la souche, sont indiquées par rapport à (c'est-à-dire que la position du résidu acide aminé correspond à) la position d'acide aminé de la protéine F exemplaire. Les positions d'acides aminés comparables de toute autre souche A ou B du VRS peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier par alignement des séquences d'acides aminés de la souche VRS sélectionnée avec celles de la séquence exemplaire à l'aide d'.algorithmes d'alignement faciles à se procurer et bien connus (tels que BLAST, e.g., en utilisant les paramètres par défaut). De nombreux autres exemples de polypeptides de protéine F provenant de différentes souches du.· VRS- sont décrits dans W02008/114149 (qui est incorporé ici par référence pour sa description d'exemples supplémentaires de séquences de protéines F et G du VRS). Des variants supplémentaires peuvent résulter de la dérive génétique, ou peuvent être produits artificiellement par mutagenèse ciblée ou aléatoire, ou par recombinaison de deux variants préexistants ou plus. Ces variants supplémentaires conviennent également dans le cadre des analogues de la protéine F utilisés dans les compositions immunogènes ci-décrites.
Dans d'autres modes de réalisation alternatifs utiles dans les compositions et les méthodes ci-décrites, la protéine F du VRS est un analogue de protéine F tel que décrit dans W02011/008974, incorporé ici par référence pour sa description d'analogues de protéine F supplémentaires, voir par exemple les analogues de protéine F sur la Figure 1 de W02011/008974 et également décrits dans l'Exemple 1 de WO2011/008974.
Pour le choix des domaines F2 et Fi de la protéine F, l'homme du métier saura qu'il n'est pas strictement nécessaire d'inclure le domaine F2 et/ou Fi entier.
Typiquement, les considérations conformationnelles sont importantes lors du choix d'une sous-séquence (ou fragment) du domaine F2. Ainsi, le domaine F2 comprend typiquement une partie du domaine F2 qui facilite l'assemblage et la stabilité du polypeptide. Dans certains variants exemplaires, le domaine F2 comprend les acides aminés 26-105. Toutefois, des variants comportant des modifications mineures de longueur (par addition, ou délétion d'un ou de plusieurs acides aminés) sont également possibles.
Typiquement, au moins une sous-séquence (ou fragment) du domaine Fi est choisie et conçue pour conserver une conformation stable qui inclut les épitopes immunodominants de la -protéine F. Par exemple, il est généralement souhaitable de choisir une sous-séquence du domaine polypeptidique Fi qui inclut des épitopes reconnus par des anticorps neutralisants dans les régions des acides aminés 262-275 (neutralisation par le palivizumab) et 423-436 (MAb chlOlF de chez Centocor) . De plus, il peut être souhaitable d'inclure des épitopes T, e.g., dans la région des acides aminés 328-355, plus généralement, une partie contiguë unique du sous-motif Fi (e.g., couvrant les acides aminés 262-436) est utilisée, les épitopes pouvant être retenus dans une séquence synthétique qui inclut ces épitopes immunodominants sous la forme d'éléments discontinus assemblés sous une conformation stable. Par exemple, un polypeptide du domaine Fi comprend au moins les acides aminés 262-436 d'un polypeptide de la protéine F du VRS. Dans un exemple non limitatif fourni dans la présente demande, le domaine Fi comprend les acides aminés 137 à 516 d'un polypeptide de protéine F native. L'homme du métier comprendra que des sous-séquences supplémentaires plus courtes peuvent être utilisées à la discrétion du praticien.
Pour le choix d'une sous-séquence du domaine F2 ou Fi (e.g., comme abordé ci-dessous pour le composant de protéine G de certains analogues PréF-G), en plus de la considération conformationnelle, il peut être souhaitable de choisir des séquences (e.g., variants, sous-séquences, et autres) basées sur l'inclusion d'épitopes immunogènes supplémentaires. Par exemple, des épitopes T supplémentaires peuvent être identifiés à l'aide de motifs d'ancrage ou autres méthodes, telles que la détermination du réseau neuronal ou la détermination polynomiale, connues dans la technique, voir, e.g., RANKPEP (accessible par le Web à : mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) ; ProPredl (accessible par le Web à : imtech.res.in/raghava/propredl/index.html) ; Bimas (accessible par le Web à : www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html) ; et SYFPEITH (accessible par le Web à : syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm). Par exemple, les algorithmes sont utilisés pour déterminer le "seuil de liaison" des peptides, et choisir ceux dont les scores leur confèrent une forte probabilité de liaison au CMH ou à l'anticorps à une certaine affinité. Les algorithmes se basent soit sur les effets sur la liaison au· CMH d'un acide aminé particulier à une position particulière, soit sur les effets sur la liaison à l'anticorps d'un acide aminé particulier à une position particulière, ou encore les effets sur la liaison d'une substitution particulière dans .un peptide contenant un motif. Dans le cadre d'un peptide immunogène, un "résidu conservé" est un résidu qui apparaît à une fréquence significativement plus élevée que celle attendue par une distribution aléatoire à une position particulière dans un peptide. Les résidus d'ancrage sont des résidus conservés qui fournissent un point de contact avec la molécule du CMH. Les épitopes T identifiés par ces méthodes prédictives peuvent être confirmés par mesure de leur liaison à une protéine spécifique du CMH et par leur capacité à stimuler les · cellules T quand ils sont présentés dans le cadre de la protéine du CMH.
De manière avantageuse, un analogue de la protéine F, par exemple les analogues PréF (comprenant les analogues PréF-G abordés ci-dessous), un analogue PostF, ou autre analogue conformationnel, comprennent un peptide signal correspondant au système d'expression, par exemple, un peptide signal de mammifère ou viral, tel qu'une séquence signal native Fo du VRS (e.g., acides aminés 1-25 de SEQ ID No:2 ou acides aminés 1-25 de SEQ ID No: 6). Typiquement, le peptide signal est choisi pour être compatible avec les cellules choisies pour l'expression recombinée. Par exemple, un peptide signal (tel qu'un peptide signal baculoviral, ou le peptide signal de la melittine), peut être substitué pour l'expression, dans des cellules d'insectes. Des peptides signal végétaux convenables sont connus dans la technique, si un système d'expression végétal est préféré. De nombreux exemples de peptides signal sont connus dans la technique, (voir, e.g., Zhang & Henzel,
Protein Sci., 13:2819-2824 (2004), qui décrit de nombreux peptides signal humains) et sont catalogués, e.g., dans la base de données des peptides signal SPdb, qui contient les séquences signal des Archae, des procaryotes et des eucaryotes (http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/). L'un quelconque des antigènes précédents peut éventuellement inclure une séquence ou étiquette supplémentaire, telle qu'une étiquette His pour faciliter la purification.
Eventuellement, l'analogue de la protéine F (par exemple, l'analogue PréF ou PostF ou autre) peut inclure des composants immunogènes supplémentaires. Dans certains modes de réalisation particulièrement avantageux, l'analogue de la protéine F inclut un composant antigénique de la protéine G du VRS. Les protéines chimériques exemplaires comportant un composant PréF et G comprennent les PreF_Vl (représentés par SEQ ID Nos: 7 et 8) et PreF_V2 (représentés par SEQ ID Nos: 9 et 10) .
Dans les analogues PréF-G, une partie antigénique de la protéine G (e.g., protéine G tronquée, représentée par les résidus acides aminés 149-229) est ajoutée à l'extrémité C-terminale de la construction. Typiquement, le composant de protéine G est joint au composant de protéine F par une séquence lieur flexible. Par exemple, dans le motif PreF_Vl exemplaire, la protéine G est jointe au composant PréF par un lieur -GGSGGSGGS- (SEQ ID No:14). Dans le motif PreF_V2, le lieur est plus court. Au lieu du lieur -GGSGGSGGS- (SEQ ID No:14), PreF_V2 inclut 2 glycines (-GG-) à titre de lieur.
Lorsqu'il est présent, le domaine polypeptidique de la protéine G peut inclure tout ou partie d'une protéine G choisie parmi une souche VRS A ou VRS B quelconque. Dans certains modes de réalisation exemplaires, la protéine G est (ou présente une identité de 95 % avec) la protéine G représentée par SEQ ID No:4. Des exemples supplémentaires de séquences de protéine G convenables se trouvent dans W02008/114149 (qui est incorporé ici par référence).
Le composant polypeptidique de protéine G est choisi de façon à inclure au moins une sous-séquence (ou fragment) de la protéine G qui conserve le(s) épitope(s) T immunodominant(s), e.g., dans la région des acides aminés 183-197, telle que les fragments de la protéine G qui comprennent les acides aminés 151-229, 149-229, ou 128-229 d'une protéine G native. Dans un mode de réalisation exemplaire, le polypeptide de la protéine G est une sous-séquence (ou fragment) d'un polypeptide de protéine G native qui comprend tout ou partie des résidus acides aminés 149 à 229 d'un polypeptide de protéine G native. L'homme du métier comprendra aisément que des parties plus longues ou plus courtes de la protéine G peuvent également être utilisées, du moment que la partie sélectionnée ne déstabilise pas la conformation ou n'altère pas l'expression, le repliement ou la maturation de l'analogue de la protéine F. Eventuellement, le domaine de la protéine G inclut une substitution d'acide aminé à la position 191, dont il a été précédemment démontré qu'elle était impliquée dans la réduction et/ou la prévention de l'aggravation de la maladie caractérisée par une éosinophilie associée aux vaccins anti-VRS inactivés par le formol. Une description complète des attributs des protéines G naturelles et substituées (N191A) figure, e.g., dans la Publication du brevet US No. 2005/0042230, qui est incorporé ici par référence.
En variante, l'analogue de la protéine F peut être formulé dans une composition immunogène qui contient également un second polypeptide qui inclut un composant de protéine G. Le composant de protéine G comprend typiquement au moins les acides aminés 149-229 d'une protéine G. Bien que des parties plus petites de la protéine G puissent être utilisées, ces fragments doivent inclure, au minimum, l'épitope immunodominant constitué par les acides aminés 184— 198. En variante, la protéine G peut comprendre une partie plus importante de la protéine G, telle que les acides aminés 128-229 ou 130-230, éventuellement à titre d'élémént d'une protéine plus grosse, telle qu'une protéine G entière, ou un polypeptide chimérique.
Par exemple, en ce qui concerne le choix des séquences correspondant à des souches naturelles, un ou plusieurs des domaines peuvent correspondre en séquence à une souche de VRS A ou B, tels que les isolats de laboratoire courants désignés A2 ou Long, ou toute autre souche ou isolat naturel. De nombreuses souches du VRS ont été isolées à ce jour. Des souches exemplaires désignées par leur numéro d'Accès GenBank et/ou EMBL figurant dans W02008/114149, incorporé ici par référence pour sa description des séquences d'acides nucléiques et polypeptidiques du VRS protéine F pouvant être utilisées dans les analogues de protéine F ci-décrits. Des souches supplémentaires du VRS sont susceptibles d'être isolées, et sont incluses dans le genre du VRS. De manière similaire, le genre du VRS inclut les variants résultant de souches naturelles (e.g., souches précédemment identifiées ou qui le seront ultérieurement) obtenues par dérivé génétique, et/ou recombinaison.
En plus de ces variants naturels et isolés, les variants modifiés qui. partagent une similarité de séquence avec les séquences susmentionnées peuvent également être utilisés dans le cadre des analogues de la protéine F, comprenant les analogues PréF, PostF ou autres analogues (dont F-G) . L'homme du métier comprendra que la' similarité entre le polypeptide de l'analogue de la protéine F (et les séquences polynucléotidiques décrites ci-dessous), et le polypeptide, (et les séquences nucléotidiques en général), peut être exprimée en termes de similarité entre les séquences, également appelée identité de séquence. L'identité de séquence est fréquemment mesurée en termes d'identité (ou de similarité) en pourcentage, plus le pourcentage étant élevé, et plus les structures primaires des deux séquences étant similaires. En général, plus les structures primaires des deux séquences d'acides aminés (ou de polynucléotides) sont similaires, plus les structures d'ordre supérieur résultant du repliement et de l'assemblage sont similaires. Les séquences polypeptidiques (et polynucléotidiques) des variants d'une protéine F ont typiquement une seule ou un petit nombre de délétions, additions ou substitutions d'acides aminés, mais partageront cependant un pourcentage très élevé de leur séquences d'acides aminés, et généralement de polynucléotides. Plus important, les variants retiennent les attributs structuraux et, par conséquent, conformationnels des séquences de référence ci-décrites.
Les méthodes pour déterminer l'identité de séquence sont bien connues dans la technique, et s'appliquent aux polypeptides des analogues de protéine F, ainsi qu'aux acides nucléiques qui les codent (e.g., comme décrit ci-dessous). Divers programmes et algorithmes d'alignement sont décrits dans : Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ; Needleman et Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970 ; Higgins et Sharp, Gene 73:237, 1988 ; Higgins et Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al-, Nucleic Acids Research 16:10881, .1988 ; et Pearson et Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, présentent un aspect détaillé des méthodes d'alignement de séquences et des calculs d'homologie. L'outil BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) est disponible auprès de plusieurs sources, comprenant le NCBI (National Center for Biotechnology Information,
Bethesda, MD) et l'Internet, et peut être utilisé conjointement avec les programmes d'analyse de séquences blastp, blastn, blastx, tblastn et tblastx. Une description expliquant comment déterminer l'identité de séquencé à l'aide de ces programmes est disponible sur le site web du NCBI.
Dans certains cas, l'analogue de la protéine F comporte une ou plusieurs modifications d'acides aminés par rapport à la séquence d'acides aminés de la souche naturelle à partir de laquelle il est dérivé (e.g., en plus des modifications stabilisatrices susmentionnées) . Ces différences peuvent être une addition, délétion ou substitution d'un ou de plusieurs acides aminés. Un variant diffère typiquement de pas plus de 1, ou 2, ou 5, ou 10, ou 15, ou 20 % environ des résidus acides aminés. Par exemple, un variant d'analogue de protéine F, e.g., PréF ou PostF ou autre séquence polypeptidique d'analogue peut inclure 1, ou 2, ou jusqu'à 5, ou jusqu'à environ 10, ou jusqu'à environ 15, ou jusqu'à environ 50, ou jusqu'à environ 100 différences d'acides aminés, comparé à la partie pertinente d'une séquence de protéine F de référence (par exemple, les séquences polypeptidiques des analogues PréF de SEQ ID Nos : 6, 8, 10, 18, 20 et/ou 22). Par conséquent, un variant dans le contexte d'une protéine F ou G du VRS, ou d'un analogue de protéine F, partage typiquement une identité de séquence d'au moins 80 %, ou 85 %, plus couramment, d'au moins environ 90 % ou plus, par exemple 95 %, - voire 98 % ou 99 % avec une protéine de référence, e.g., dans le cas d'un analogue PréF : les séquences de référence illustrées dans SEQ ID No:2, 4, 6, 8, 10, 18, 20 et/ou 22, ou tout autre analogue PréF ci-décrit. Des variants supplémentaires inclus à titre de caractéristique de la présente divulgation sont les analogues de la protéine F qui comprennent tout ou partie d'une séquence de nucléotides ou d'acides aminés choisie parmi les variants naturels décrits dans W02008/114149. D'autres variants peuvent résulter de la dérive génétique, ou peuvent être produits artificiellement par mutagenèse ciblée ou aléatoire, ou par recombiriaison de deux variants préexistants ou plus. Ces variants supplémentaires conviennent également dans le cadre des antigènes de type analogues de protéine F ci-décrits. Par exemple, la modification peut être une substitution d'un ou de plusieurs acides aminés (tels que deux acides aminés, trois acides aminés, quatre acides aminés, cinq acides aminés, jusqu'à environ dix acides aminés, ou plus) qui n'altère pas la conformation ou les épitopes immunogènes de l'analogue de la protéine F obtenu.
En variante ou en plus, la modification peut inclure une délétion d'un ou de plusieurs acides aminés et/ou une addition d'un ou de plusieurs acides aminés. Il va de soi que, si souhaité, un ou plusieurs des domaines polypeptidiques peuvent être un polypeptide synthétique qui ne correspond à aucune souche unique, mais comprend des sous-séquences provenant de multiples souches, voire d'une séquence consensus déduite par alignement de multiples souches de polypeptides du virus VRS. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs des domaines polypeptidiques sont modifiés par addition d'une séquence d'acides aminés qui constitue une étiquette, qui facilite la maturation ou la purification ultérieures. Cette étiquette peut être une étiquette antigénique ou épitopique, une étiquette enzymatique ou une étiquette polyhistidine. Typiquement l'étiquette se trouve à l'une ou l'autre extrémité de la protéine, à savoir à l'extrémité C-terminale ou à l'extrémité N-terminale de l'antigène ou de la protéine de fusion.
Les analogues de la protéine F (et également, si applicable, les antigènes G) ci-décrits peuvent être produits à l'aide de procédures bien établies pour l'expression et la purification des protéines recombinées.
En bref, les acides nucléiques recombinés qui codent pour les analogues de la protéine F sont introduits dans des cellules hôtes par l'une quelconque des diverses procédures bien connues, telles que 1'électroporation, la transfection médiée par des liposomes, la précipitation au phosphate de calcium, l'infection, la transfection et autre,· suivant le choix des vecteurs et des cellules hôtes. Les cellules hôtes avantageuses comprennent les cellules hôtes procaryotes (i.e., bactériennes), telles que E. coli, ainsi que de nombreuses cellules hôtes eucaryotes, comprenant les cellules fongiques (e.g., levure, telle que Saccharomyces cerevisiae et Picchia pastoris), les cellules d'insectes, les cellules végétales, et les cellules de mammifères (telles que 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293) ou les cellules du mélanome de Bowes. Après expression dans une cellule hôte choisie, les analogues recombinés de la protéine F peuvent être isolés et/ou purifiés selon des procédures connues dans la technique. Des méthodes d'expression exemplaires, ainsi que des acides nucléiques qui codent pour les analogues PréF (comprenant les analogues PréF-G) sont fournis dans WO2010/149745, qui est incorporé ici pour sa description de méthodes convenables pour l'expression et la purification d'.analogues de protéine F.
ANTIGENES DE B. PERTUSSIS
Dans un mode de réalisation particulier des compositions immunogènes combinées décrites, ledit au moins antigène de B. pertussis comprend au moins un antigène Pa choisi dans le groupe constitué par : l'anatoxine pertussique (PT), 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN), les fimbriae de type 2 (FIM2), et les fimbriae de type 3 (FIM3). Les antigènes sont partiellement ou très purifiés.
La PT peut être produite de diverses façons, par exemple par purification de l'anatoxine à partir d'une culture de B. pertussis suivie par une détoxification chimique (par exemple comme décrit dans W091/12020, incorporé ici par référence), ou en variante par purification d'un analogue génétiquement détoxifié de la PT (par exemple, comme décrit dans les documents qui suivent, incorporés ici par référence pour leur description des modifications génétiques envisagées de la PT : EP306318, EP322533, EP396964, EP322115, EP275689) . Dans un mode de réalisation particulier, la PT est détoxifiée génétiquement. Plus particulièrement, la PT détoxifiée génétiquement porte une ou les deux substitutions suivantes : R9K et E129G.
La composition immunogène combinée décrite peut comprendre l'un quelconque des 1, 2, 3, 4 ou 5 antigènes pertussiques acellulaires PT, FHA, PRN, FIM2 et FIM3. Plus particulièrement, ladite composition peut comprendre les combinaisons- : PT et FHA ; PT, FHA et PRN ; PT, FHA, PRN et FIM2 ; PT, FHA, PRN et FIM3 ; et PT, FHA, PRN, FIM2 et FIM3.
Dans un mode de réalisation particulier, la PT est utilisée en une quantité de 2-50 pg (par exemple exactement ou approximativement 2,5 ou 3,2 pg par dose), de 5-40 pg (par exemple exactement ou approximativement 5 ou 8 pg par dose), ou de 10-30 pg (par exemple exactement ou approximativement 20 ou 25 pg par dose).
Dans un mode de réalisation particulier, la FHA est utilisée en une quantité de 2-50 pg (par exemple exactement ou approximativement 2,5 ou 34,4 pg par dose), de 5-40 pg (par exemple exactement ou approximativement 5 ou 8 pg par dose) ou de 10-30 pg (par exemple exactement ou approximativement 20 ou 25 pg par dose).
Dans un mode de réalisation particulier, la PRN est utilisée en une quantité de 0,5-20 pg, 0,8-15 pg (par exemple exactement ou approximativement' 0,8 ou 1,6 pg par dose) ou 2-10 pg (par exemple exactement ou approximativement 2,5 ou 3 pg ou 8 pg par dose).
Dans un mode de réalisation particulier, les FIM2 et/ou FIM3 sont utilisées en une quantité totale de 0,5-10 pg (par exemple exactement ou approximativement 0,8 ou 5 pg par dose) .
Dans un mode de réalisation particulier, la composition immunogène combinée comprend la PT et FHA en des quantités équivalentes par dose, soit exactement, soit approximativement de 8 ou 20 ou 25 pg. En variante, la composition immunogène combinée comprend la PT et FHA à exactement ou approximativement 5 et 2,5 pg respectivement, ou exactement ou approximativement 3,2 et 34,4 pg. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend la PT, FHA et PRN en des quantités exactes ou approximatives respectives par dose de : 25:5:8 pg ; 8:8:2,5 pg ; 20:20:3 pg ; 2,5:5:3 pg ; 5:2,5:2,5 pg ; ou 3,2:34,4:1,6 pg.
En variante, ou en combinaison avec l'un quelconque des antigènes Pa décrits ci-dessus, la composition immunogène combinée décrite peut comprendre un antigène dérivé de la protéine "BrkA" de B. pertussis (comme décrit dans W02005/032584, et Marr et al (2008), Vaccine, 26(34):4306-4311, incorporé ici par référence).
Dans un autre mode de réalisation, ledit au moins antigène Pa comprend une vésicule de membrane externe (OMV) obtenue à partir de B. pertussis, comme décrit dans Roberts et al (2008), Vaccine, 26:4639-4646, incorporé ici par référence. En particulier, cette OMV peut être dérivée d'une souche recombinée de B. pertussis exprimant une enzyme modifiant le lipide A, telle qu'une 3-O-désacylase, par exemple PagL (Asensio et al (2011), Vaccine, 29:1649-1656, incorporé ici par référence).
Dans un autre mode de réalisation alternatif, ledit au moins antigène de B. pertussis comprend un antigène Pw. Pw peut être inactivé par plusieurs méthodes connues, comprenant des méthodes sans mercure. Ces méthodes peuvent comprendre l'inactivation par la chaleur (e.g. 55-65°C ou 56-60°C, pendant 5-60 minutes ou pendant 10-30 minutes, e.g. 60°C pendant 30 minutes), par le formaldéhyde (e.g. 0,1 % à 31°, 24 heures), par le glutaraldéhyde (e.g. 0,05 % à température ambiante, 10 minutes), par l'acétone-I (e.g. trois traitements à température ambiante) ou l'acétone-II (e.g. trois traitements à température ambiante et un quatrième à 37°C) (voir par exemple Gupta et al., 1987, J. Biol. Stand. 15:87 ; Gupta et al., 1986, Vaccine, 4:185). Des méthodes de préparation d'antigènes Pw tués pouvant être utilisés dans la composition immunogène combinée sont décrites dans W093/24148.
Plus particulièrement, la combinaison immunogène comprend Pw en une quantité par dose (en Unités Internationales d'Opacité, "IOU") de : 5-50, 7-40, 9-35, 11-30, 13-25, 15-21, ou approximativement ou exactement 20.
Dans un mode de réalisation particulier d'une composition immunogène combinée comprenant un antigène Pw selon l'invention, le composant Pw de la composition suscite une réactogénicité réduite. La réactogénicité (douleur, fièvre, œdème, etc.) des vaccins Pw est principalement provoquée par un lipo-oligosaccharide ("LOS", qui est synonyme de lipopolysaccharide ("LPS") dans, le cadre de B. pertussis ; "LOS" sera utilisé ici), qui est l'endotoxine provenant de la membrane extérieure de la bactérie. La partie lipide A du LOS est principalement responsable. Afin de produire un vaccin contenant un antigène Pw moins réactogène (par rapport aux vaccins Pw "classiques" tels que ceux produits pâr les procédures d'inactivation abordées ci-dessus), l'endotoxine peut être génétiquement ou chimiquement détoxifiée et/ou extraite de la membrane extérieure. Toutefois, ceci doit être fait de façon à ne pas altérer sensiblement l'immunogénicité de l'antigène Pw, dans la mesure où le LOS est un puissant adjuvant du système immunitaire.
Dans un mode de réalisation, ledit au moins antigène de B. pertussis de la composition immunogène combinée décrite comprend un antigène Pw de "faible réactogénicité" dans lequel le LOS a été génétiquement ou chimiquement détoxifié et/ou extrait. Par exemple, l'antigène Pw peut être soumis à un traitement avec un mélange d'un solvant organique, tel que le butanol, et l'eau, comme décrit dans W02006/002502 et Dias et al (2012), Human Vaccines & Immunotherapeutics, 9(2):339-348 qui sont incorporés ici par référence pour leur description de l'extraction chimique du LOS.
Dans un mode de réalisation alternatif, la "basse réactogénicité" est obtenue en dérivant l'antigène Pw d'une souche de Б. pertussis génétiquement manipulée pour produire un LOS moins toxique. W02006/065139 (incorporé ici par référence) décrit la 3-O-désacylation et détoxification génétique du LOS de B. pertussis, pour obtenir des souches comprenant un LOS au moins partiellement 3-O-désacylé. Ledit au moins antigène de B. pertussis de la composition immunogène combinée peut par conséquent être un antigène Pw dérivé d'une souche de B. pertussis qui a été manipulée pour exprimer une enzyme modifiant le lipide A, telle que la dé-O-acylase. En particulier, cette souche peut exprimer PagL comme décrit dans WO2006/065139, ainsi que dans Geurtsen et al (2006), Infection and Immunity, 74(10):5574-5585 et Geurtsen et al (2007), Microbes and Infection, 9:1096-1103, tous incorporés ici par référence. En variante ou en plus, la souche à partir de laquelle l'antigène Pw est dérivé peut naturellement, ou suite à la manipulation : perdre sa capacité à modifier ses groupes lipide A-phosphate avec une glucosamine ; avoir un squelette lipide A-diglucosamine substitué à la position C-3' par CIO-OH ou C12-0H ; et/ou exprimer des espèces LOS moléculaires dépourvues d'heptose terminale. Cette souche, 18-323, est décrite dans Marr et al (2010), The Journal of Infectious Diseases, 202(12):1897-1906 (incorporé ici par référence).
COMPOSITION IMMUNOGENE
Les compositions immunogènes combinées ci-décrites contiennent typiquement un véhicule ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, et contiennent éventuellement des antigènes supplémentaires.
Les véhicules et excipients pharmaceutiquement acceptables sont connus et peuvent être choisis par l'homme du métier. Par exemple, le véhicule ou l'excipient peut avantageusement inclure un tampon. Eventuellement, le véhicule ou l'excipient contient également au moins un composant qui stabilise la solubilité et/ou les compositions. Des exemples d'agents de solubilisation/stabilisation comprennent les détergents, par exemple, la sarcosine du laurier et/ou Tween. D'autres agents de solubilisation/stabilisation comprennent l'arginine, et les polyols vitrifiants (tels que le saccharose, le tréhalose et autre). De nombreux véhicules pharmaceutiquement acceptables et/ou excipients pharmaceutiquement acceptables sont connus dans la technique et sont décrits, e.g., dans Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975).
Par conséquent, des excipients et des véhicules convenables peuvent être choisis par l'homme du métier pour obtenir une formulation se prêtant à l'administration à un sujet par la voie d'administration choisie.
Les excipients convenables comprennent, sans limitation : le glycérol, le polyéthylène glycol (PEG), le sorbitol, le tréhalose, le sel de sodium de N-lauroylsarcosine, la L-proline, la sulfobétaïne non détergente, le chlorhydrate de guanidine, l'urée, l'oxyde de triméthylamine, KC1, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ et autres sels de cation divalents, le dithiothréitol, le dithioérytrol, et le β-mercaptoéthanol. D'autres excipients peuvent être des détergents (dont : Tween80, Tween20, Triton X-00, NP-40, Empigen BB, 1'octylglucoside, le lauroylmaltoside, Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-0, Zwittergent 3-2, Zwittergent 3-4, Zwittergent 3-6, CHAPS, le désoxychloate de sodium, le dodécylsulfate de sodium, le bromure de cétyltriméthylammonium).
Eventuellement, la composition immunogène combinée décrite contient également un adjuvant, lequel adjuvant peut également être utilisé avec les schémas vaccinaux, les méthodes, les utilisations et le kit décrits. Quand la composition immunogène combinée doit être administrée à un sujet appartenant à un groupe d'âge particulier susceptible (ou à risque accru) de contracter une infection à VRS et/ou B. pertussis, l'adjuvant est choisi pour son innocuité et son efficacité chez le sujet ou la population de sujets. Par conséquent, pour formuler une composition immunogène combinée destinée à être administrée à un sujet âgé (tel qu'un sujet de plus de 65 ans), l'adjuvant est choisi pour son innocuité et son efficacité chez le sujet âgé. De manière similaire, quand la composition immunogène combinée est destinée à être administrée à des sujets nouveau-nés ou des nourrissons (tels que des sujets de la naissance à deux ans), l'adjuvant est choisi pour son innocuité et son efficacité chez le nouveau-né et le nourrisson. Dans le cas d'un adjuvant choisi pour son innocuité et son efficacité chez le nouveau-né et le nourrisson, une dose d'adjuvant qui est une dilution (e.g., dose représentant une fraction) de la dose typiquement administrée à un sujet adulte peut être choisie.
De plus, l'adjuvant est typiquement choisi pour améliorer l'aspect recherché de la réponse immunitaire quand il est administré par une voie d'administration, par laquelle la composition immunogène combinée est administrée. Par exemple, pour formuler une composition immunogène combinée pour une administration par voie nasale, le protéosome et la protolline sont des adjuvants avantageux. Par contre, quand la composition immunogène combinée est formulée pour une administration par voie intramusculaire, des adjuvants comprenant un ou plusieurs des suivants : 3D-MPL, squalène (e.g., QS21), liposomes, et/ou émulsions huile et eau sont avantageusement choisis.
Un adjuvant convenable pouvant être utilisé en association avec les antigènes de type analogues de la protéine F du VRS est un dérivé de lipopolysaccharide bactérien non toxique. Un exemple de dérivé non toxique convenable du lipide A est le lipide A monophosphorylé ou plus particulièrement le lipide A monophosphorylé 3-désacylé (3D-MPL) . Le 3D-MPL est commercialisé sous le nom de MPL par GlaxoSmithKline Biologicals N.A., et est désigné dans le présent document sous les noms de MPL ou 3D-MPL. Voir, par exemple, les brevets US Nos. 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094. Le 3D-MPL favorise avant tout les réponses en cellules T CD4+ ayant un phénotype IFN-y (Thl). Il peut être produit selon les procédés décrits dans GB2220211 A. Chimiquement c'est -un mélange de lipide A monophosphorylé 3- désacylé avec 3, 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Dans les compositions selon la présente divulgation, un 3D-MPL à petites particules peut être utilisé. Le 3D-MPL à petites particules a une taille de particules telle qu'il peut être stérilisé par filtration sur membrane de 0,22 pg. Ces préparations sont décrites dans W094/21292.
Un lipopolysaccharide, tel que 3D-MPL, peut être utilisé en des quantités entre 1 et 50 pg, par dose humaine de la composition immunogène. Ce 3D-MPL peut être utilisé à raison d'environ 25 pg, par exemple entre 20-30 pg, de manière convenable entre 21-29 pg ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg, ou 25 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène comprend le 3D-MPL à raison d'environ 10 pg, par exemple entre 5-15 pg, de manière convenable entre 6-14 pg, par exemple entre 7 et 13 pg ou entre 8 et 12 pg ou entre 9 et 11 pg, ou 10 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène comprend le 3D-MPL à raison d'environ 5 pg, par exemple entre 1-9 pg, ou entre 2-8 pg ou manière convenable entre 3-7' pg, ou 4-5 pg, ou 5 pg.
Dans d'autres modes de réalisation, le lipopolysaccharide peut être un disaccharide de β ( 1-6)-glucosamine, comme décrit dans le brevet US No. 6 005 099 et le brevet EP No. 0 729 473 Bl. L'homme du métier saura facilement produire divers lipopolysaccharides, tels que le 3D-MPL, sur la base des enseignements de ces références. Toutefois, chacune de ces références est incorporée ici par référence. En plus des immunostimulants précités (qui ont une structure similaire à celle du LPS ou MPL ou 3D-MPL) , les dérivés monosaccharides et disaccharides acylés qui représentent une sous-partie de la structure ci-dessus du MPL sont également des adjuvants convenables. Dans d'autres modes de réalisation, l'adjuvant est un dérivé synthétique du lipide A, dont certains sont décrits comme des agonistes de TLR-4, et comprennent, mais sans limitation : OM174 (2-désoxy-6-o-[2-désoxy-2-[(R)-3- dodécanoyl-oxytétradécanoylamino] -4-o-phosphon.o-p-D-glucopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl-amino]-a-D-glucopyranosyldihydrogénophosphate), (WO 95/14026) ; OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]décan-1,10-diol, 1,10-bis(dihydrogénophosphate) (WO 99/64301 et WO 00/0462) ; et OM 197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)-dodécanoyl-oxytétradécanoyl-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl-amino] décan-1,10-diol, 1-dihydrogénophosphate 10-(6-amino-hexanoate) (WO 01/46127). D'autres ligands TLR4 qui peuvent être utilisés sont les les alkylphosphates de glucosaminide (AGP) tels que ceux décrits dans WO 98/50399 ou le brevet US No. 6 303 347 (des procédés de préparation des AGP sont également décrits), de manière convenable RC527 ou RC529 ou les sels pharmaceutiquement acceptables d'AGP tels que décrits dans le brevet US No. 6 764 840. Certains AGP sont des agonistes des TLR4, et d'autres des antagonistes. Les deux devraient être utiles à titre d'adjuvants. D'autres ligands TLR-4 convenables, capables de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-4 (Sabroe et al, JI 2003 pl630-5) sont, par exemple, le lipopolysaccharide provenant de bactéries à Gram négatif et ses dérivés, ou fragments, en particulier un dérivé non toxique de LPS (tel que 3D-MPL). D'autres agonistes convenables des TLR sont : la protéine de ' choc thermique (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ou 90 ; la Protéine A tensioactive, les oligosaccharides d'hyaluronane, les fragments d'héparane-sulfate, les fragments de fibronectine, les peptides fibrinogéniques et la b-défensine-2, et le dipeptide muramyle (MDP). Dans un mode de réalisation, l'agoniste des TLR est HSP 60, 70 ou 90. D'autres ligands TLR-4 convenables sont ceux décrits dans WO 2003/011223 et dans WO 2003/099195, tels que le composé I, le composé II et le composé III décrits aux pages 4-5 de W02003/011223 ou aux pages 3-4 de W02003/099195 et en particulier les composés décrits dans W02003/011223 comme ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680, et ER804764. Par exemple, un ligand TLR-4 convenable est ER804057. D'autres agonistes des TLR sont également utiles à titre d'adjuvants. Le terme "agoniste des TLR" désigne un agent qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire de la voie de signalisation TLR, soit sous la forme d'un ligand direct, soit indirectement par génération de ligands endogènes ou exogènes. Ces agonistes naturels ou synthétiques des TLR peuvent être utilisés à titre d'adjuvants alternatifs ou supplémentaires. Une brève revue du rôle des TLR à titre de récepteurs adjuvants figure dans Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002. Ces adjuvants potentiels comprennent, mais ne sont pas limités aux agonistes des TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9. Par conséquent, dans un mode de réalisation, l'adjuvant et la composition immunogène combinée comprennent en outre un adjuvant qui est choisi dans le groupe constitué par : un agoniste des TLR-1, un agoniste des TLR-2, un agoniste des TLR-3, un agoniste des TLR-4, un agoniste des TLR-5, un agoniste des TLR-6, un agoniste des TLR-7, un agoniste des TLR-8, un agoniste des TLR-9, ou une combinaison de ceux-ci.
Dans un mode de réalisation selon la présente invention, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-1 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-1 est choisi parmi : les lipopeptides tri-acylés (LP) ; la moduline soluble dans le phénol ; LP de Mycobacterium tuberculosis ; LP S-(2,3-bis(palmitoyloxy)-(2-RS)-propyl)-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, trichlorhydrate (Pam3Cys) qui imite l'extrémité amino terminale acétylée d'une lipoprotéine bactérienne et LP OspA issu de Borrelia burgdorferi.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-2 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-2 est l'un ou plusieurs des suivants : une lipoprotéine, un peptidoglycane, un lipopeptide bactérien issu de M. tuberculosis, B burgdorferi ou T pallidum ; les peptidoglycanes issus d'espèces comprenant Staphylococcus aureus ; les acides lipotéichoïques, les acides mannuroniques, les porines de Neisseria, les fimbriae bactériennes, les facteurs de virulence de Yersinia, les virions du CMV, 1'hémagglutinine de la rougeole, et le zymosan issu de la levure.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-3 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-3 est l'ARN double brin (ARNdb), ou l'acide polyinosinique-polycytidylique (Poly IC), un modèle d'acide nucléique moléculaire associé à l'infection virale.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de. type signalisation par l'intermédiaire des TLR-5 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-5 est la flagelline bactérienne.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-6 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-6 est la lipoprotéine mycobactérienne,· le LP di-acylé, et la moduline soluble dans le phénol. D'autres agonistes TLR6 sont décrits dans WO 2003/043572.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-7 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-7, est un ARN simple brin (ARNsb) , la loxoribine, un analogue de guanosine aux positions N7 et C8, ou un composé ou dérivé d'imidazoquinoline. Dans un mode de réalisation, l'agoniste des TLR est l'imiquimod. D'autres agonistes TLR7 sont décrits dans WO 2002/085905.
Dans un, autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-8 est utilisé. De manière convenable, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par 1'.intermédiaire des TLR-8 est un ARN simple brin (ARNsb) , une molécule d'imidazoquinoline ayant une activité antivirale, par exemple le résiquimod (R848) ; le résiquimod pouvant également être' reconnu par TLR-7. D'autres agonistes . TLR8 qui peuvent être utilisés comprennent ceux décrits dans WO 2004/071459.
Dans un autre mode de réalisation, un agoniste des TLR qui est capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-9 est utilisé. Dans un mode de réalisation, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire dès TLR-9 est HSP90. En variante, l'agoniste des TLR capable de provoquer une réponse de type signalisation par l'intermédiaire des TLR-9 est 1 ' ADN bactérien ou viral, un ADN contenant des nucléotides CpG non méthylés, en particulier des contextes de séquences connus en tant que motifs CpG. Les oligonucléotides contenant des CpG induisent de manière prédominante une réponse Thl. Ces oligonucléotides sont connus et décrits, par exemple, dans WO 96/02555, WO 99/33488 et les brevets U.S. Nos. 6 008 200 et 5 856 462. De manière convenable, ces nucléotides CpG sont des oligonucléotides CpG. Les oligonucléotides convenables pouvant être utilisés dans la composition immunogène combinée sont les oligonucléotides contenant CpG, qui comprennent éventuellement deux motifs dinucléotidiques CpG ou plus séparés par au moins trois, de manière convenable au moins six nucléotides ou plus. Un motif CpG est un nucléotide cytosine suivi par un nucléotide guanine. Les oligonucléotides CpG sont typiquement des désoxynucléotides. Dans un mode de réalisation spécifique, l'internucléotide dans l'oligonucléotide est un phosphoro-dithioate, ou de manière convenable une liaison phosphorothioate, bien qu'un phosphodiester et d'autres liaisons internucléotides soient possibles. Des oligonucléotides avec des liaisons internucléotides mixtes sont également possibles. Des procédés de production d'oligonucléotides phosphorothioate ou phosphorodithioate sont décrits dans les brevets US Nos. 5 666 153, 5 278 302 et WO 95/26204. D'autres adjuvants qui peuvent être utilisés dans la composition immunogène combinée décrite, et avec les schémas vaccinaux, les méthodes, les utilisations et les kits décrits comprenant un analogue de la protéine F, tel qu'un analogue
PréF, e.g., seul ou en association avec 3D-MPL, ou un autre adjuvant ci-décrit, sont les saponines, telles que QS21. Ces adjuvants ne sont typiquement pas utilisés (mais pourraient l'être si souhaité) avec un antigène de B. pertussis.
Les saponines sont décrites dans : Lacaille-Dubois, M et Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Les saponines sont des glycosides stéroïdiens ou triterpéniques largement distribués dans le règne végétal et celui des animaux marins. Les saponines sont connues pour former des solutions colloïdales dans l'eau qui moussent après agitation, et pour précipiter le cholestérol. Quand les saponines sont proches des membranes cellulaires, elles créent des structures porogènes dans la membrane qui la font éclater. L'hémolyse des érythrocytes est un exemple de ce phénomène, qui est une propriété de certaines, mais pas de toutes les saponines.
Les saponines sont connues comme adjuvants dans les vaccins destinés à être administrés par voie systémique. L'activité adjuvante et hémolytique des saponines individuelles a été étudiée de manière approfondie dans la technique (Lacaille-Dubois et Wagner, supra). Par exemple, Quil A (dérivé de l'écorce de l'arbre sud-américain Quillaja Saponaria Molina), et des fractions de celui-ci, sont décrits dans le brevet US 5 057 540 et "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55 ; et EP 0 362 279 Bl. Des structures particulaires, dénommées Complexes stimulateurs immuns (ISCOM), comprenant des fractions de Quil A sont hémolytiques et ont été utilisées dans la fabrication de vaccins (Morein, B., EP 0 109 942 Bl ; WO 96/11711 ; WO 96/33739). Les saponines hémolytiques QS21 et · QS17 (fractions de Quil A purifiées par HPLC) ont été décrites comme de puissants adjuvants systémiques, et leur procédé de production est décrit dans le brevet US No. 5 057 540 et EP 0 362 279 Bl, qui sont incorporés ici par référence. D'autres saponines qui ont été utilisées dans des études de vaccination systémique comprennent celles dérivées d'autres espèces végétales telles que Gypsophila et Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). QS21 est une fraction non toxique purifiée par Hplc dérivée de l'écorce de Quillaja Saponaria Molina. Un procédé de production de QS21 est décrit dans le brevet US No. 5 057 540. Des formulations adjuvantes non réactogènes contenant QS21 sont décrites dans WO 96/33739. Les références précitées sont incorporées ici par référence. La saponine immunologiquement active, telle que QS21, peut être utilisée en des quantités entre 1 et 50 pg, par dose humaine de la composition immunogène combinée. De manière avantageuse QS21 est utilisé à raison d'environ 25 pg, par exemple entre 20-30 pg, de manière convenable entre 21-29 pg ou entre 22-28 pg ou entre 23-27 pg ou entre 24-26 pg, ou 25 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène combinée comprend QS21 à raison d'environ 10 pg, par exemple entre 5-15 pg, de manière convenable entre 6-14 pg, par exemple entre 7-13 pg ou entre 8-12 pg ou entre 9-11 pg, ou 10 pg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition immunogène combinée comprend QS21 à raison d'environ 5 pg, par exemple entre 1-9 pg, ou entre 2-8 pg ou de manière convenable entre 3-7 pg ou 4-6 pg, ou 5 pg. Il a été démontré que les formulations comprenant QS21 et du cholestérol sont des adjuvants performants quand ils sont formulés avec un antigène. Ainsi, par exemple, les polypeptides des analogues de la protéine F du VRS peuvent avantageusement être utilisés dans la composition immunogène combinée avec un adjuvant comprenant une association de QS21 et cholestérol.
Eventuellement, l'adjuvant peut également comprendre un sel inorganique tel que le sel d'aluminium, en particulier 1'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium, ou le phosphate de calcium. Par exemple, un adjuvant contenant 3D-MPL en association avec un sel d'aluminium (e.g., hydroxyde d'aluminium ou "alun") se prête à une formulation dans une composition immunogène combinée contenant un antigène du type analogue de la protéine F du VRS pour une administration à un sujet humain. En variante, ces adjuvants de type sel inorganique peuvent être utilisés autrement qu'en association avec des adjuvants sans sel inorganique, i.e. la composition immunogène combinée peut être adjuvantée uniquement avec un, ou plus d'un adjuvant de type sel inorganique tel que 1'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium et le phosphate de calcium.
Une autre classe d'adjuvants convenables pouvant être utilisée avec les antigènes de type analogues de la protéine F du VRS (et éventuellement, avec les antigènes' pertussiques, tels que les protéines acellulaires purifiées de B. pertussis) est celle des compositions immunostimulatrices à base d'OMP. Les compositions immunostimulatrices à base d'OMP conviennent tout particulièrement aux adjuvants pour muqueuses, e.g., pour une administration par voie intranasale. Les compositions immunostimulatrices à base d'OMP sont un genre de préparations de protéines de membrane externe ' (OMP, comprenant certaines porines) provenant de bactéries à Gram négatif, telles que, mais non limitées à, l'espèce Neisseria (voir, e.g., Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988 ; Lowell et al., Science 240:800, 1988 ; Lynch et al.,. Biophys. J. 45:104, 1984 ; Lowell, in "New Génération Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong
Kong, page 193, 1997 ; le brevet U. S. No. 5 726 292 ; le brevet U.S. No. 4 707 543), qui est utile en tant que véhicule ou dans des compositions immunogènes, telles que des antigènes bactériens ou viraux. Certaines compositions immunostimulatrices à base d'OMP qui sont hydrophobes et sans danger pour une utilisation chez l'homme peuvent être dénommées "Protéosomes". Les protéosomes ont la faculté de s'auto-assembler en amas vésiculaires ou d'OMP de type vésiculaire d'environ 20 à environ 800 nm, et de s'incorporer, de se coordonner, de s'associer par non-covalence (e.g., de manière électrostatique ou hydrophobe), ou de coopérer par ailleurs avec des antigènes protéiques (Ag) , en particulier des antigènes comportant un fragment hydrophobe. Tout procédé de préparation qui donne un composant protéique de membrane externe sous forme vésiculaire ou de type vésiculaire, comprenant des structures membraneuses multi-moléculaires ou des compositions OMP de type globulaire à l'état fondu constituées d'une ou de plusieurs OMP, s'inscrit dans la définition du protéosome. Les protéosomes peuvent être préparés, par exemple, comme décrit dans la technique (voir, e.g., le brevet U. S. No. 5 726 292 ou le brevet U.S. No. 5 985 284). Les protéosomes peuvent également contenir un lipopolysaccharide ou un lipooligosaccharide endogène (LPS ou LOS, respectivement) provenant des bactéries utilisées pour produire les porines OMP (e.g., espèce Neisseria) , qui représentera généralement moins de 2 % de la préparation OMP totale.
Les protéosomes sont principalement composés de protéines de membrane externe (OMP) chimiquement extraites de Neisseria. menigitidis (principalement des porines A et B ainsi que des OMP de classe 4), maintenues en solution par un détergent (Lowell GH. Protéosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB,
Cobon GS, eds, New Génération Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). Les protéosomes peuvent être formulés avec divers antigènes tels que des protéines purifiées ou recombinées dérivées de sources virales, comprenant les polypeptides de la protéine F du VRS décrits dans la présente, e.g., par diafiltration ou par des procédés de dialyse classiques ou avec des protéines antigéniques purifiées de B. pertussis. L'élimination progressive du détergent permet la formation de complexes hydrophobes particulaires d'environ 100-200 nm de diamètre (Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kapér JB, Cobon GS, eds, New Génération Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997 ; 193-206) . "Protéosome : LPS ou Protolline" désigne ici des préparations protéosomiques mélangées, e.g., par ajout exogène, avec au moins un type de lipopolysaccharide pour obtenir une composition OMP-LPS (qui peut servir de composition immunostimulatrice). Par conséquent, la composition OMP-LPS peut être constituée de deux des composants basiques de la protolline, qui comprennent (1) une préparation de protéosomes (e.g., Projuvant) à base de protéines de membrane externe obtenue à partir de bactéries à Gram négatif, telles que Neisseria meningitidis, et (2) une préparation d'un ou de plusieurs liposaccharides. Le lipo-oligosaccharide peut être endogène (e.g., contenu à l'état naturel dans la préparation de protéosomes de type OMP), il peut être mélangé ou combiné à une préparation OMP sous la forme d'un lipo-oligosaccharide préparé de façon exogène (e.g., préparé à partir d'une culture ou d'un micro-organisme différent de celui utilisé pour la préparation OMP), ou une combinaison des deux. Les LPS ajoutés de façon exogène peuvent provenir de la même bactérie à Gram négatif que celle utilisée pour obtenir la préparation OMP ou d'une bactérie à Gram négatif différente. On comprendra également que la protolline peut éventuellement inclure des lipides, des glycolipides, des glycoprotéines, de petites molécules, ou autre, et leurs combinaisons. La protolline peut être préparée, par exemple, comme décrit dans la Publication de la demande de brevet U.S. No. 2003/0044425.
Des combinaisons de différents adjuvants, tels que ceux mentionnés précédemment, peuvent également être utilisées dans les compositions contenant des analogues de la protéine F tels que des analogues PréF (et contenant éventuellement des antigènes de B. pertussis également, si souhaité) . Par exemple, comme déjà indiqué, QS21 peut être formulé avec 3D-MPL. Le rapport QS21:3D-MPL sera typiquement de l'ordre de 1:10 à 10:1; tel que de 1:5 à 5:1, et souvent sensiblement de 1:1. Typiquement, le rapport 3D-MPL:QS21 est dans la plage de 2,5:1 à 1:1. Une autre formulation à base d'une combinaison d'adjuvants comprend 3D-MPL et un sel d'aluminium, tel que 1'hydroxyde d'alùminium.
Dans certains cas, la formulation de l'adjuvant comprend un sel inorganique, tel qu'un sel d'aluminium (alun), par exemple,. un phosphate d'aluminium ou un hydroxyde d'aluminium, ou un phosphate de calcium. Quand l'alun est présent, e.g., en association avec 3D-MPL, sa quantité est-typiquement entre environ 100 цд et 1 mg, comme par exemple d'environ 100 цд, ou d'environ 200 цд à environ 750 цд, comme d'environ 500 цд par dose.
Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant comprend une émulsion huile et eau, e.g., une émulsion huile dans l'eau. Un exemple d'émulsion huile dans l'eau comprend une huile métabolisable, telle que le squalène, un tocol tel qu'un tocophérol, e.g., 1'alpha-tocophérol, et un tensioactif, tel que le trioléate de sorbitan (Span 85™) ou le monooléate. de polyoxyéthylène sorbitan (Tween 80™), dans un véhicule aqueux. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion huile dans l'eau ne contient aucun immunostimulant supplémentaire, (en particulier elle ne contient pas de dérivé de lipide A non toxique, tel que 3D-MPL, ni de saponine, telle que QS21). Le véhicule aqueux peut être, par exemple, une solution saline à tampon phosphate. En plus, l'émulsion huile dans l'eau peut contenir du Span 85 et/ou de la lécithine et/ou de la tricapryline.
Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène combinée comprend une émulsion huile dans l'eau et éventuellement un ou plusieurs autres immunostimulants, ladite émulsion huile dans l'eau comprenant 0,5-10 mg d'huile métabolisable (de manière convenable, un squalène), 0,5-11 mg de tocol (de manière convenable, un tocophérol, tel que 1'alpha-tocophérol) et 0,4-4 mg d'agent émulsifiant.
Dans un mode de réalisation spécifique, la formulation adjuvante comprend le 3D-MPL préparé sous la forme d'une émulsion, telle qu'une émulsion huile dans l'eau. Dans certains cas, l'émulsion a une petite taille de particules, inférieure à 0,2 μιη de diamètre, comme décrit dans WO 94/21292. Par exemple, les particules du 3D-MPL sont suffisamment petites pour être stérilisées par filtration sur une membrane de 0,22 micron (comme décrit dans le brevet européen No. 0 689 454). En variante, le 3D-MPL peut être préparé dans une formulation liposomale. Eventuellement, l'adjuvant contenant le 3D-MPL (ou un dérivé de celui-ci) contient également un composant immunostimulateur supplémentaire. L'adj.uvant est choisi pour son innocuité et son efficacité chez la. population . à laquelle la composition immunogène doit être administrée. Pour des populations adultes et âgées, les formulations comprennent typiquement davantage d'adjuvant que dans une formulation infantile typique. Dans des formulations particulières utilisant une émulsion huile dans l'eau, cette émulsion peut comprendre des composants supplémentaires comme, par exemple, un cholestérol, un squalène, un alpha-tocophérol, et/ou un détergent, tel que Tween 80 ou Span85. Dans des formulations exemplaires, ces composants peuvent être présents dans les quantités suivantes : environ 1-50 mg de cholestérol, 2-10 % de squalène, 2-10 % d ' alpha-tocophérol et 0,3-3 % de Tween 80. Typiquement, le rapport squalène:alpha-tocophérol est égal ou inférieur à 1 pour obtenir une émulsion plus stable. Dans certains cas, la formulation peut également contenir un stabilisant.
Quand une composition immunogène combinée contenant un antigène de type polypeptide de protéine F du VRS est formulée pour l'administration à un nourrisson, le dosage de l'adjuvant est déterminé pour être efficace et relativement non réactogène chez un sujet nourrisson. Généralement, le dosage de l'adjuvant dans une formulation infantile est inférieur (par exemple, la dose peut représenter une fraction de celle présente dans une formulation destinée à être administrée à des adultes) à celle utilisée dans les formulations conçues pour être administrées à des adultes (e.g., adultes âgés de 65 ans ou plus). Par exemple, la quantité de 3D-MPL est typiquement dans la plage de 1-200 цд, par exemple 10-100 цд, ou 10-50 цд par dose. Une dose pour nourrisson est typiquement en limite basse de cette plage, e.g., environ 1 à environ 50 цд, comme par exemple environ 2 цд, ou environ 5 цд, ou environ 10 цд, à environ 25 цд, ou à environ 50 цд. Typiquement, quand QS21 est utilisé dans la formulation, les plages sont comparables (et conformes aux rapports indiqués ci-dessus). Dans le cas d'une émulsion huile et eau (e.g., une émulsion huile dans l'eau), la dose d'adjuvant administrée à un enfant ou un nourrisson peut être une fraction de celle administrée à un sujet adulte. Une démonstration de l'efficacité des compositions immunogènes contenant un antigène PréF en combinaison à diverses doses d'un adjuvant exemplaire sous la forme d'une émulsion huile dans l'eau est présentée dans WO2010/149745.
Dans les compositions (comprenant la composition immunogène combinée décrite) contenant un analogue de la protéine F du VRS et un antigène de B. pertussis pour l'immunisation maternelle, la composition est conçue pour induire une . forte réponse en anticorps neutralisants. Les mères ont déjà été exposées au VRS et à B. pertussis et produiront par conséquent une réponse primaire existante, de sorte que le but pour conférer une protection au futur nourrisson est de stimuler cette réponse primaire aussi efficacement que possible et en respectant les sous-classes d'anticorps telles que les IgGi qui sont capables de traverser le placenta à une efficacité élevée et de fournir une protection au nourrisson. La protection peut être obtenue sans inclure d'adjuvant, ou en incluant un adjuvant qui ne comprend que des sels inorganiques, en particulier un hydroxyde d'aluminium (alun), un phosphate d'aluminium ou un phosphate de calcium. En variante, elle peut être obtenue par une formulation contenant un adjuvant sous la forme d'une émulsion huile et eau, ou un autre adjuvant qui améliore la production des anticorps de la sous-classe des IgGi. Par conséquent l'analogue de la protéine F destiné à l'immunisation maternelle est avantageusement formulé avec un sel inorganique, de manière avantageuse, l'alun, ou avec un adjuvant sous la forme d'une émulsion huile et eau.
Dans ce contexte, l'adjuvant est choisi pour son innocuité et sa bonne tolérance chez la femme enceinte. Eventuellement, les compositions immunogènes comprennent également un adjuvant autre que l'alun. Par exemple, des adjuvants comprenant un ou plusieurs 3D-MPL et/ou un squalène (e.g., QS21) et/ou des liposomes, et/ou des émulsions huile et eau sont choisis de manière avantageuse, à condition que la formulation finale améliore chez la femme sensibilisée la production d'anticorps spécifiques du VRS et/ou de B.pertussis ayant les caractéristiques recherchées (e.g., en termes de sous-classe et fonction de neutralisation).
On notera qu'indépendamment de l'adjuvant choisi, sa concentration dans la formulation finale est calculée pour son innocuité et son efficacité chez la population cible. Par exemple, dans le cadre de l'immunisation maternelle, indépendamment de l'adjuvant choisi, sa concentration dans la formulation finale est calculée pour être sans danger et efficace chez la population cible des femmes enceintes.
Une composition immunogène telle que ci-décrite (i.e. combinée), ou destinée à être utilisée dans les schémas vaccinaux, les méthodes, les utilisations et les kits décrits, contient typiquement une quantité immunoprotectrice (ou une dose correspondant à une fraction de celle-ci) d'antigène et peut être préparée par des techniques classiques. Dans le cas de l'immunisation maternelle, la quantité requise est celle qui permet le transfert passif des anticorps pour s'avérer immunoprotectrice chez les nourrissons des femmes enceintes immunisées. La préparation de compositions immunogènes, comprenant celle pour l'administration à des sujets humains, est décrite de manière générale dans Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, édité par Powell et Newman, Plenurri Press, 1995 ; New Trends and Developments in Vaccines, édité by Voiler et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. L'encapsulation dans des liposomes est décrite, par exemple, par Fullerton, brevet Ü.S. 4 235 877. La conjugaison de protéines à des macromolécules est décrite, par exemple, par Likhite, brevet U.S. 4 372 945 et par Armor et al., brevet Ü.S. 4 474 757.
Typiquement, la quantité d'antigène (e.g. protéine) dans chaque dose de la composition immunogène est choisie en tant que quantité qui induit une réponse immunoprotectrice sans effets secondaires nocifs, significatifs chez le sujet typique. "Immunoprotectrice" dans ce contexte ne signifie pas nécessairement une protection complète contre l'infection ; mais la protection contre des symptômes ou la maladie, notamment la maladie grave associée aux pathogènes. La quantité d'antigène peut varier en fonction de l'immunogène spécifique qui est utilisé. Généralement, chaque dose humaine devrait comprendre 1-1000 цд de chaque protéine ou antigène, comme par exemple environ 1 à environ 100 цд, par exemple, environ 1 à environ 50 pg, comme par exemple environ 1 цд, environ 2 цд, environ 5 pg, environ 10 цд, environ 15 цд, environ 20 цд, environ 25 цд, environ 30 цд, environ 40 цд, ou environ 50 цд, ou environ 60 цд. Généralement, une dose humaine sera dans un volume de 0,5 ml. Ainsi la composition pour les utilisations et les méthodes ci-décrites peut par exemple être de 10 ou 30 ou 60 цд dans une dose humaine de 0,5 ml. La quantité utilisée dans une composition immunogène est choisie en fonction de la population cible (e.g., nourrisson ou personne âgée ou femme enceinte). La. quantité optimale pour une composition particulière peut être déterminée par des études standards impliquant l'observation des titres d'anticorps et autres réponses chez le sujet. Après une vaccination initiale, les sujets peuvent recevoir un rappel dans les 4-12 semaines qui suivent (ou, pour l'immunisation maternelle, à tout moment avant l'accouchement, de manière avantageuse au moins deux ou au moins quatre semaines avant la date prévue pour l'accouchement). Par exemple, pour l'administration d'une composition immunogène à un nourrisson, les inoculations initiale et ultérieures peuvent être pratiquées pour coïncider avec d'autres vaccins administrés pendant cette période.
Des détails supplémentaires sur les formulations sont fournis dans WO2010/149745, qui est incorporé ici par référence pour sa description de détails supplémentaires concernant la formulation de compositions immunogènes comprenant des analogues de la protéine F du VRS tels que des analogues PréF.
Dans certains modes de réalisation, les compositions immunogènes combinées décrites comprennent en plus au moins un antigène provenant d'au moins un organisme pathogène autre que le VRS et B. pertussis. Plus particulièrement, ledit au moins antigène peut être choisi dans le groupe constitué par : l'anatoxine diphtérique (D) ; l'anatoxine tétanique (T) ; l'antigène de surface' de l'hépatite B (HBsAg) ; le virus de la polio inactivé (IPV) ; le saccharide capsulaire de H. influenzae type b (Hib) conjugué à une - protéine porteuse ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type C conjugué à une protéine porteuse (MenC) ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type Y conjugué à une protéine porteuse (MenY) ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type A conjugué à une protéine porteuse (MenA) ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type W conjugué à une protéine porteuse (MenW) ; et un antigène issue de N. meningitidis type B (MenB).
Des vaccins combinés contenant des antigènes (Pa ou Pw) de B. pertussis avec D et T et diverses combinaisons d'autres antigènes choisis parmi IPV, HBsAg, Hib et les saccharides capsulaires conjugués de N. meningitidis sont connus dans la technique, par exemple, sous les noms de produits Infanrix™ (DTPa-IPV-HBsAg-Hib) et Boostrix™ (dTpa). A cet égard, WO93/024148, W097/000697 et W098/019702, sont incorporés ici par référence, de même que W002/00249 qui décrit une composition DTPw-HepB-MenAC-Hib. Des protéines porteuses convenables pour les antigènes de type saccharide capsulaire sont connus dans la technique, et comprennent T, D et le dérivé de D CRM197.
Des compositions immunogènes combinées particulières comprennent, outre au moins un antigène du VRS et au moins un antigène de B. pertussis : D et T ; D, T et IPV ; D, T et HBsAg ; D, T et Hib ; D, T, IPV et HBsAg ; D, T, IPV et 'Hib ; D, T, HBsAg et Hib ; ou D, T, IPV, HBsAg et Hib.
Dans un mode de réalisation particulier, D est utilisé en une quantité par dose de 1-10 Unités Internationales (IU) (par exemple exactement ou approximativement 2 IU) ou 10-40 IU (par exemple exactement ou approximativement 20 ou 30 IU) ou de 1-10 Unités de Limite de floculation (Lf) (par. exemple exactement ou approximativement 2 ou 2,5 ou 9 Lf) ou 10-30 Lf (par exemple exactement ou approximativement 15 ou 25 Lf) .
Dans un mode de réalisation particulier, T est utilisé en une quantité par dose de 10-30 IU (par exemple exactement ou approximativement 20 IU) ou 30-50 IU (par exemple exactement ou approximativement 40 IU) ou de 1-15 Lf (par exemple exactement ou approximativement 5 ou 10 Lf).
Dans des modes de réalisation exemplaires, les compositions immunogènes combinées comprennent, outre ledit au moins antigène du VRS et ledit au moins antigène de B. pertussis, D et T en quantités exactes ou approximatives respectives par dose de : 30:40 IU ; 25:10 Lf ; 20:40 IU; 15: 5Lf ; 2:20 IU; 2,5:5 Lf; 2:5 Lf; 25:10 Lf; 9:5 Lf. Par exemple, cette composition peut comprendre (en plus dudit au moins antigène du VRS) : (i) 20-30 ug, par exemple exactement ou approximativement 25 ug de PT ; (ii) 20-30 ug, par exemple exactement ou approximativement 25 ug de FHA ; (iii) 1-10 ug, par exemple exactement ou approximativement 3. ou 8 ug de PRN ; (iv) 10-30 Lf, par exemple exactement ou approximativement 15 ou 25 Lf de D ; et (v) 1-15 Lf, par exemple exactement ou approximativement 5 ou 10 Lf de T. A titre d'autre exemple, cette composition peut comprendre (en plus dudit au moins antigène du VRS) : (i) 2-10 ug, par exemple exactement ou approximativement 2,5 ou 8 ug de PT ; (ii) 2-10 ug, par exemple exactement ou approximativement 5 ou 8 ug de FHA ; (iii) 0,5-4 ug, par exemple 2-3 ug comme exactement ou approximativement 2,5 ou 3 ug de PRN ; (iv) 1-10 Lf, par exemple exactement ou approximativement 2 ou 2,5 ou 9 Lf de D ; et (v) 1-15 Lf, par exemple exactement ou approximativement 5 ou 10 Lf de T.
La composition immunogène peut en outre comprendre des antigènes supplémentaires, tel qu'un autre antigène du VRS (e.g., un antigène de type protéine G comme décrit dans WO2010/149745) ou un antigène du métapneumovirus humain (hMPV), ou un antigène de la grippe, ou un antigène venant de Streptococcus ou Pneumococcus. W02010/149743 décrit des exemples d'antigènes hMPV qui peuvent être combinés à des antigène du VRS, et est incorporé ici par référence pour sa description d'exemples d'antigènes hMPV.
Le mode de réalisation de l'immunisation maternelle ci-décrit est mis en œuvre par une voie convenable pour l'administration d'un vaccin anti-VRS et B. pertussis, comprenant l'administration par voie intramusculaire, intranasale, ou cutanée. De manière avantageuse, l'immunisation maternelle ci-décrite est pratiquée par voie cutanée, ce qui signifie que l'antigène est introduit dans le derme et/ou l'épiderme de la peau (e.g., voie intradermique). Dans un mode de réalisation particulier, un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F tel qu'un antigène PréF ou un antigène PostF et/ou un antigène de B. pertussis comprenant des protéines acellulaires de B. pertussis ou B. pertussis sous forme de germes entiers est administré à une femme enceinte par voie cutanée ou intradermique. Dans un mode de réalisation particulier, la composition immunogène est formulée avec un adjuvant décrit dans la présente demande, par exemple une saponine telle que QS21, avec ou sans 3D-MPL, pour une administration^ par voie cutanée ou intradermique. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène est formulée avec un sel inorganique tel que l'hydroxyde d'aluminium ou le . phosphate d'aluminium ou le phosphate de calcium, avec ou sans immunostimulant tel que QS21 ou 3D-MPL, pour une administration par voie cutanée ou intradermique. L'antigène de B. pertussis est typiquement formulé en combinaison avec un sel d'aluminium et peut éventuellement être administré par voie cutanée ou intradermique. Eventuellement, l'analogue de la protéine F et l'antigène de B. pertussis sont cô-formulés dans une composition immunogène combinée telle que décrite dans la présente, e.g., en présence d'un sel inorganique tel que 1'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium ou le phosphate de calcium, avec ou sans immunostimulant tel que QS21 ou 3D-MPL, pour une administration par voie cutanée ou intradermique. L'administration par voie cutanée comprenant la voie intradermique peut nécessiter ou permettre une dose plus faible d'antigène que d'autres voies telles que l'administration par voie intramusculaire. Par conséquent, une composition immunogène combinée pour l'administration par voie cutanée ou intradermique est décrite, ladite composition comprenant au moins un antigène du VRS et au moins un antigène de B.pertussis à une faible dose, e.g. inférieure à la dose intramusculaire normale, e.g. à 50 % ou moins de la dose intramusculaire normale, par exemple de 50 pg ou moins, ou 20 pg ou moins, ou 10 pg ou moins ou 5 pg ou moins par dose humaine d'un analogue de la protéine F et, par exemple, entre 1-10 pg de PT, entre 1-10 pg de FHA, et entre 0,5-4 pg de PRN (avec ou sans composant antigénique supplémentaire). Eventuellement, la composition immunogène pour une administration par voie cutanée ou intradermique comprend également un adjuvant, e.g. un sel d'aluminium ou QS21 ou 3D-MPL ou une combinaison de ceux-ci.
Les dispositifs pour une administration cutanée comprennent les dispositifs à aiguille courte (ayant une aiguille d'environ 1 à environ 2 mm de long) telle que celle décrite dans US 4 886 499, US 5 190 521, US 5 328 483, US 5 527 288, US 4 270 537, US 5 015 235, US 5 141 496, US 5 417 662 et EP1092444. Les vaccins cutanés peuvent également être administrés par des dispositifs qui limitent la distance de pénétration effective de l'aiguille dans la peau, tels que ceux décrits dans WO99/34850, incorporé ici par référence, et leurs équivalents fonctionnels. Les dispositifs d'injection à jet qui administrent des vaccins liquides dans le derme par l'intermédiaire d'un injecteur à jet liquide ou d'une aiguille qui perce le stratum corneum et produit un jet qui atteint le derme conviennent également. Des dispositifs d'injection à jet sont décrits par exemple dans US 5 480 381, US 5 599 302, US 5 334 144, US 5 993 412, US 5 649 912, US 5 569 189, US 5 704 911, US 5 383 851, US 5 893 397, US 5 466 220, US 5 339 163, US 5 312 335, US 5 503 627, US 5 064 413, US 5 520 639, US 4 596 556, US 4 790 824, US 4 941 880, US 4 940 460, WO 97/37705 et WO 97/13537.
Les dispositifs pour une administration cutanée comprennent également les dispositifs de type balistique pour l'administration de poudre/particules qui utilisent un gaz comprimé pour accélérer le vaccin à l'état pulvérulent à travers les couches extérieures de la peau jusqu'au derme. De plus, des seringues ordinaires peuvent être utilisées selon la méthode classique d'administration par voie cutanée de Mantoux. Toutefois, l'utilisation de seringues classiques requiert des opérateurs très compétents et par conséquent les dispositifs capables d'une administration précise sans utilisateur ultra-compétent sont préférés. D'autres dispositifs pour l'administration cutanée comprennent les patchs contenant les compositions immunogènes ci-décrites. Un patch pour une administration cutanée comprend un support constitué d'un substrat plein (e.g. pansement chirurgical occlusif ou non occlusif). Ces patchs administrent la composition immunogène au derme ou à l'épiderme par l'intermédiaire de microprojections qui percent le stratum corneum. Ces microprojections mesurent généralement entre 10 Dm et 2 mm, par exemple, 20 à 500 Dm, 30 Dm à 1 mm, 100 à 200, 200 à 300, 300 à 400, 400 à 500, 500 à 600, 600 à 700, 700, 800, 800 à 900, 100 Dm à 400 Dm, en particulier entre environ 200 et 300 Dm ou entre environ 150 et 250 Dm. Les patchs pour l'administration cutanée comprennent généralement une pluralité de microprojections, par exemple entre 2 et 5000 micro-aiguilles, par exemple entre 1000 et 2000 microaiguilles. Les microprojections peuvent être de toute forme convenable pour percer le stratum corneum, l'épiderme et/ou le derme. Les microprojections peuvent être mises en forme comme décrit dans W02000/074765 et W02000/074766 par exemple. Elles peuvent avoir un rapport d'aspect (hauteur à diamètre à la base) d'au moins 3:1, d'au moins environ 2:1, ou d'au moins environ 1:1. Une forme convenable pour ces microprojections est celle d'un cône à base polygonale, par exemple hexagonale ou rhombique. D'autres formes de microprojections possibles sont décrites, par exemple, dans la demande de brevet publiée Ü.S. 2004/0087992. Dans un mode de réalisation particulier, les microprojections ont une forme qui s'épaissit vers la base. Le nombre de microprotubérances dans la matrice est typiquement d'au moins environ 100, d'au moins environ 500, d'au moins environ 1000, d'au moins environ 1400, d'au moins environ 1600, ou d'au moins environ 2000. La densité des microprotubérances, compte tenu de leur petite taille, peut ne pas être élevée, mais par exemple le nombre de microprotubérances par cm2 peut être d'au moins environ 50, d'au moins environ 250, d'au moins environ 500, d'au moins environ 750, d'au moins environ 1000, ou d'au moins environ 1500. Dans un mode de réalisation selon l'invention, la composition immunogène combinée est administrée au sujet dans les 5 heures qui suivent le placement du patch sur la peau de l'hôte, par exemple, dans les 4 heures, 3 heures, 2 heures, 1 heure ou 30 minutes qui suivent. Dans un mode de réalisation particulier, la composition immunogène combinée est administrée dans les 20 minutes qui suivent le placement du patch sur la peau, par exemple, dans les 30 secondes, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 minutes qui suivent.
Les microprojections peuvent être à base de tout matériau convenable connu de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, une partie au moins des microprojections sont biodégradables, en particulier leur pointe ou couche la plus à l'extérieur. Dans un mode de réalisation particulier, pratiquement toute la microprojection est biodégradable. Le terme "biodégradable" tel qu'il est utilisé ici signifie "dégradable dans les conditions prévues de l'utilisation in vivo" (e.g. insertion dans la peau), indépendamment du mécanisme de biodégradation. Des mécanismes de biodégradation exemplaires comprennent la désintégration, la dispersion, la dissolution, l'érosion, l'hydrolyse, et la dégradation enzymatique.
Des exemples de microprojections contenant des antigènes sont décrits dans W02008/130587 et W02009/048607. De procédés de fabrication de micro-aiguilles métabolisables sont décrits dans W02008/130587 et WO2010/124255. Les microprojections peuvent être revêtues d'antigène par tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple par les procédés décrits dans WO06/055844, WO06/055799.
Des dispositifs d'administration convenables pour l'administration cutanée comprenant l'administration par voie intradermique, dans les méthodes et utilisations ci-décrites comprennent le dispositif BD Soluvia™ qui est un dispositif à micro-aiguilles pour l'administration par voie intradermique, le système d'administration par patch Corium MicroCor™, le patch vaccinal à micro-aiguilles Georgia Tech, le dispositif d'administration à micro-aiguilles Nanopass et le dispositif à micro-aiguilles Debiotech Nanoject™. Un dispositif d'administration par voie cutanée ou transdermique contenant une composition immunogène combinée telle que décrite dans la présente, éventuellement formulée avec un adjuvant tel qu'un sel inorganique e.g. l'alun, ou QS21, ou 3D-MPL ou une combinaison de ceux-ci est également décrit.
En ce qui concerne la méthode décrite pour susciter une réponse immunitaire contre le VRS et B. pertussis, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité immunologiquement efficace de la composition immunogène combinée, la réponse immunitaire suscitée contre le VRS et B. pertussis comprend avantageusement une réponse immunitaire protectrice qui réduit ou prévient l'incidence, ou réduit la gravité de l'infection par le VRS et B. pertussis et/ou réduit ou prévient l'incidence, ou réduit la gravité d'une réponse pathologique après une infection par le VRS et B. pertussis. Ladite réponse immunitaire suscitée peut être une réponse à une stimulation. De plus, la composition immunogène combinée y parvient sans aggraver la maladie virale après contact avec le VRS.
La composition immunogène combinée peut être administrée par toute une variété de voies, dont certaines, comme la voie intranasale, placent directement les antigènes au contact des muqueuses des voies respiratoires supérieures. En variante, des voies d'administration plus classiques peuvent être utilisées, telles 'que la voie d'administration intramusculaire.
Par conséquent, la composition immunogène combinée est considérée ici pour une utilisation en médecine, et en particulier pour prévenir ou traiter chez un sujet humain une infection par le VRS et B. pertussis, ou une maladie associée à ceux-ci. Dans certains modes de réalisation contenant des antigènes provenant d'autres pathogènes, ladite prévention ou ledit traitement s'étendra auxdits autres pathogènes.
Dans un mode de réalisation particulier de ces méthodes et utilisations, le sujet est un sujet humain. Ledit sujet humain peut être choisi dans le groupe comprenant ; un nouveau-né ; un nourrisson ; un enfant ; un adolescent; un adulte ; et une personne âgée. Le sujet peut être une femme enceinte portant un bébé en gestation. En variante, le sujet peut ne pas être une femme enceinte. Quand le sujet est un nouveau-né, '1'.administration de la composition immunogène combinée peut s'effectuer 1 jour, 1 semaine, ou 1 mois après la naissance.
Dans un mode de réalisation préféré, le sujet (de préférence, humain) reçoit la composition immunogène combinée selon un schéma monodose, i.e. sous la forme d'une dose indépendante qui ne fait pas partie d'une série prédéterminée de doses. La dose peut être administrée en même temps que d'autres vaccins, par exemple dans le cadre d'un calendrier d'immunisations tel qu'un calendrier d'immunisations pédiatrique. Bien que dans ce mode de réalisation monodose, le sujet puisse recevoir plus d'une dose de la composition au cours de sa vie de sujet, chacune de ces doses est indépendante et "unique" au sens où elle est administrée en l'absence de toute autre dose planifiée jugée nécessaire pour atteindre le niveau de protection recherché. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène combinée est administrée à un sujet selon un schéma monodose une seule fois au cours d'une période de 10, avantageusement, de 5 ans. Dans un mode de réalisation, le sujet est un adolescent âgé de 10 à 18 ans et la composition immunogène combinée lui est administrée une seule fois, i.e. selon un schéma monodose. Dans un autre mode de réalisation, le sujet est une femme enceinte et la composition immunogène combinée ne lui est administrée qu'une seule fois par grossesse, i.e. la femme enceinte ne reçoit qu'une seule dose de la composition au cours d'une grossesse.
IMMUNISATION MATERNELLE
Un défi particulier dans la mise au point d'un vaccin sans danger et efficace qui protège les nourrissons contre la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis est que l'incidence la plus élevée et la morbidité et mortalité la plus importante est chez le.très jeune nourrisson. Les jeunes nourrissons, notamment les prématurés, peuvent avoir un système immunitaire immature. Protéger les jeunes nourrissons contre la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis (coqueluche) est par conséquent important. Il y a également un risque d'interférence entre les anticorps transférés par l'intermédiaire du placenta au bébé ("anticorps maternels") et la vaccination du nourrisson, de sorte que la vaccination dans la très petite enfance peut ne pas être suffisamment efficace, e.g., pour susciter une réponse en anticorps neutralisants entièrement protectrice.
Selon un aspect, la présente invention concerne des schémas vaccinaux, des méthodes et des utilisations de compositions immunogènes et de kits convenables pour protéger les jeunes nourrissons de la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis par l'immunisation active de femmes enceintes avec une ou des compositions immunogènes efficaces comprenant un analogue de la protéine F du VRS et un ou des antigènes de B. pertussis de type acellulaire ou germes entiers. L'analogue de la protéine F suscite avantageusement la production d'anticorps (e.g., anticorps neutralisants) par stimulation ou augmentation de l'ampleur de la réponse humorale précédemment amorcée par exposition naturelle au VRS (ou vaccination antérieure contre celui-ci). De manière similaire, l'antigène de B. pertussis suscite la production d'anticorps, par stimulation ou augmentation de l'ampleur de la réponse humorale précédemment amorcée par exposition naturelle à B. pertussis, ou vaccination antérieure contre celui-ci. Les anticorps produits en réponse à l'analogue de la protéine F et à l'antigène de B. pertussis sont transmis au bébé en gestation par l'intermédiaire du placenta, avec pour effet la protection immunologique passive du nourrisson après sa naissance et durant la période critique pour l'infection et la maladie grave provoquée par le VRS et B. pertussis (e.g., avant que la vaccination du nourrisson ne soit entièrement protectrice). Typiquement, la protection immunologique passive conférée par cette méthode dure de la naissance à au moins deux mois, par exemple jusqu'à environ 6 mois, voire plus.
Toutes ces compositions sont conçues pour induire une forte réponse en anticorps (e.g., anticorps neutralisants). Comme les mères enceintes ont typiquement été exposées au VRS une ou plusieurs fois au cours de leur vie, elles possèdent une réponse primaire existante au VRS. La proportion de la population exposée à une infection provoquée par le VRS avant d'atteindre l'âge adulte est essentiellement de 100 %. Les programmes d'immunisations pédiatriques conçus pour protéger, et prévenir la coqueluche sont répandus. Toutefois, malgré une immunisation répandue, l'infection naturelle par B. pertussis est également courante. Ainsi, la sensibilisation à B. pertussis est également répandue. Une protection contre le VRS et B. pertussis pour le nourrisson immédiatement après sa naissance et pendant les quelques mois cruciaux qui suivent peut par conséquent être obtenue par une stimulation aussi efficace que possible de ces réponses primaires pour accroître les réponses (niveaux) en anticorps sériques contre le VRS et B. pertussis chez la mère, et de manière avantageuse en respectant les sous-classes (sous-types) d'anticorps particuliers tels que les IgGi qui peuvent franchir le placenta et fournir une protection au bébé. Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes utilisables dans la présente ne comprennent pas d'adjuvant, ou comprennent un adjuvant qui favorise une forte réponse en IgGi tel qu'un sel inorganique comme un sel d'aluminium, en • particulier un hydroxyde d'aluminium, un phosphate d'aluminium, ou phosphate de calcium. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une composition immunogène utilisable pour.1'immunisation maternelle est avantageusement formulée avec un sel inorganique, de manière avantageuse, l'alun. Dans d'autres modes de réalisation, l'adjuvant qui favorise une réponse forte en IgGi est une émulsion huile dans l'eau, ou une saponine, telle que QS21 (ou une de ses formes détoxifiées).
Une femelle enceinte peut être une femme, et par conséquent, le nourrisson ou le bébé en gestation peut être du genre humain. Pour une femme enceinte, l'âge gestationnel du fœtus en cours de développement se mesure à compter du premier jour des dernières règles. Le nombre de semaines de grossesse se mesure à compter de 14 jours après le premier jour des dernières règles. Par conséquent, quand une femme enceinte est à 24 semaines de gestation, cela correspondra à 26 semaines après le premier jour de ses dernières règles, soit 26 semaines de grossesse. Quand une grossesse a été obtenue par une technique de procréation médicalement assistée, l'âge gestationnel du fœtus en cours de développement se calcule à compter de deux semaines ayant la date de conception.
Le terme "bébé en gestation" tel qu'il est utilisé ici désigne le fœtus ou le fœtus en cours de développement d'une femme enceinte. Le terme "âge gestationnel" sert à designer le nombre de semaines de gestation, i.e'. le nombre de semaines depuis le premier jour des dernières règles. La gestation chez la femme est typiquement d'environ 40 semaines à compter du premier jour des dernières règles, et peut commodément se diviser en trimestres, le premier trimestre s'étendant du premier jour des dernières règles jusqu'à la 13ème semaine de gestation ; le deuxième allant de la 14ème à la 27ème semaine de gestation, et le troisième démarrant à la 28ème semaine et allant jusqu'à la naissance. Le troisième trimestre démarre donc à la 26ème semaine de grossesse et se poursuit jusqu'à la naissance du bébé.
Le terme "nourrisson" tel qu'il est utilisé ici va de 0 à 2 ans. On comprendra que la protection procurée par les méthodes et les utilisations ci-décrites peuvent protéger le jeune dans son enfance, entre 2 et 11 ans, voire sa petite enfance, par exemple entre 2 et 5 ans, ou même dans son adolescence, entre 12 et 18 ans. Toutefois c'est durant l'enfance, notamment de la naissance à environ 6 mois qu'un individu est le plus vulnérable à une infection grave provoquée par le VRS et aux complications de la coqueluche.
Un nourrisson peut être immunologiquement immature au cours des premiers mois de sa vie, notamment s'il est né prématurément, e.g., avant 35 semaines de gestation, alors que son système immunitaire peut ne pas être suffisamment bien développé pour monter une réponse immunitaire capable de prévenir l'infection ou la maladie provoquée par un pathogène de la façon dont le ferait un système immunitaire développé en réponse au même pathogène. Un nourrisson immunologiquement immature est plus susceptible de succomber à l'infection et à la maladie qu'un, nourrisson ayant un système immunitaire plus développé ou mature. Le nourrisson peut également présenter une vulnérabilité accrue aux IVRI (comprenant la pneumonie) durant les premiers mois de sa vie pour des raisons physiologiques et développementales, les voies aériennes étant par exemple plus petites et moins développées que chez l'enfant et l'adulte. Pour ces raisons, toute référence dans la présente demande aux six premiers mois de l'enfance peut être étendue aux prématurés et aux nourrissons nés avant terme en fonction de la quantité de temps perdu en âge gestationnel au-dessous de 40 semaines ou au-dessous de 38 semaines ou au-dessous de 35 semaines.
Dans un autre mode de réalisation, la femme enceinte et son nourrisson ou la femelle pleine et son petit sont de toute espèce parmi celles . décrites ci-dessus sous "sujets". Pour un animal plein, tel qu'une femelle cochon d'Inde ou une vache pleine, le temps de "gestation" correspond au temps depuis l'accouplement. Chez la femme et chez certains animaux, par exemple, le cochon d'Inde, des anticorps passent de la mère au fœtus via le placenta. Certains isotypes d'anticorps peuvent être préférentiellement transférés à travers le placenta, par exemple, chez la femme, les anticorps IgGi étant l'isotype le plus efficacement transféré à travers le placenta. Bien que des sous-classes existent chez les animaux de laboratoire, tels que le cochon d'Inde et la souris, les diverses sous-classes ne remplissent pas nécessairement la même fonction, et une corrélation directe entre les sous-classes chez la femme et l'animal ne peut pas être facilement établie.
De manière avantageuse, la protection du nourrisson par inhibition de l'infection et réduction de l'incidence ou de la gravité de la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis couvre au moins la période néo-natale et la très jeune enfance, par exemple au moins les première semaines de la vie après la naissance, comme le premier mois après la naissance, ou les deux premiers mois, ou les trois premiers mois, ou les quatre premiers mois, ou les cinq premiers mois, ou les six premiers mois après la naissance, ou plus, e.g., quand le nourrisson est un nourrisson né à terme à environ 40 semaines de gestation ou plus. Après les premiers mois, quand le nourrisson est moins vulnérable aux effets d'une infection grave par le VRS et de la coqueluche, la protection contre l'infection par le VRS et B. pertussis peut décliner. Ainsi, une protection vitale est fournie pendant la période où elle est le plus nécessaire. Dans le cas d'un prématuré, de manière avantageuse la protection est fournie sur une plus longue période de temps après la naissance, par exemple, une période de temps supplémentaire équivalant au moins à la période de temps entre la naissance et ce qui aurait été une gestation de 35 semaines (i.e., d'environ 5 semaines supplémentaires), ou une gestation de 38 semaines (d'environ 2 semaines supplémentaires), ou plus longue suivant l'âge gestationnel du bébé au moment de la naissance.
Il ressortira que protéger le nourrisson ne signifie pas nécessairement une protection de 100 % contre l'infection par le VRS ou par B. pertussis. Du moment qu'il y a une réduction de l'incidence ou de la gravité de l'infection ou de la maladie, on admettra que la protection est fournie. De manière avantageuse, la protection du nourrisson comprend sa protection contre une maladie grave et l'hospitalisation provoquées par le VRS et B. pertussis. A ce titre, les compositions et les méthodes ci-décrites réduisent l'incidence ou la gravité de la maladie provoquée par le VRS, telle que l'infection des voies respiratoires inférieures (IVRI), la pneumonie ou autres symptômes ou maladie, et par B. pertussis. Par exemple,, en ce qui concerne le VRS, l'administration d'une composition immunogène telle que décrite dans la présente peut réduire l'incidence (dans une cohorte de nourrissons dont les mères ont été vaccinées) des IVRI d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou de 60 à 70 %, ou d'au moins environ 7 0 %, ou d'au-moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 %, comparé aux nourrissons dont les mères n'ont pas été vaccinées. De manière avantageuse, cette administration réduit la gravité des IVRI d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou de 60 à 70 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins' environ 90 %, comparé à des nourrissons infectés dont les mères n'ont pas été vaccinées. De manière avantageuse, cette administration réduit la nécessité d'une hospitalisation due à une maladie grave provoquée par le VRS dans cette cohorte d'au moins environ. 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou de 60 à 70 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 %, comparé à des nourrissons infectés dont les mères n'ont pas été vaccinées. Qu'une hospitalisation pour raison d'IVRI grave soit jugée nécessaire, ou qu'un cas particulier d'IVRI soit hospitalisé peut varier d'un pays à l'autre, et par conséquent les IVRI jugées graves selon des symptômes cliniques définis bien connus dans la technique paraît être une meilleure mesure que la nécessité de l'hospitalisation. En ce qui concerne B. pertussis, l'administration d'une composition immunogène contenant un antigène pertussique de type acellulaire ou germes entiers telle que décrite dans la présente demande peut réduire l'incidence (dans une cohorte de nourrissons dont les mères ont été vaccinées) des maladies graves (e.g., pneumonie et/ou détresse et insuffisance respiratoire) d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou de 60 à 70 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 %, comparé aux nourrissons dont les mères n'ont pas été vaccinées. De manière avantageuse, cette administration réduit la gravité de la pneumonie d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou de 60 à 70 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 %, comparé à des nourrissons infectés dont les mères n'ont pas été vaccinées. De manière avantageuse, cette administration réduit la nécessité de l'hospitalisation, en raison de complications graves de la coqueluche dans cette cohorte d'au moins environ 50 %, ou d'au moins environ 60 %, ou de 60 à 70 %, ou d'au moins environ 70 %, ou d'au moins environ 80 %, ou d'au moins environ 90 %, comparé à des nourrissons infectés dont les mères n'ont pas été vaccinées.
Typiquement, selon les schémas vaccinaux, les méthodes, les utilisations et les kits décrits, l'analogue de la protéine F et l'antigène de B. pertussis sont administrés à la femme enceinte au cours du troisième trimestre de grossesse (gestation), bien qu'un effet bénéfique (notamment pour les grossesses à risque accru d'accouchement prématuré) puisse être obtenu avant le début du troisième trimestre. Le moment choisi pour l'immunisation maternelle est déterminé de façon à permettre la génération des anticorps maternels et leur transfert au foetus. Par conséquent, de manière avantageuse un temps suffisant s'écoule entre l'immunisation et la naissance pour permettre un transfert optimal des anticorps maternels à travers le placenta. Chez la femme, le transfert des anticorps démarre généralement à environ 25 semaines de gestation, augmentant jusqu'à 28 semaines et devenant et restant optimal à partir d'environ 30 semaines de gestation. On pense qu'un minimum d'environ deux à quatre semaines sont nécessaires entre l'immunisation maternelle telle que décrite dans la présente et la naissance pour permettre le transfert efficace des anticorps maternels dirigés contre la protéine F du VRS et les antigènes de B. pertussis (e.g., comprenant un ou plusieurs antigènes parmi l'anatoxine pertussique (PT), 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN), les fimbriae de type 2 (FIM2), les fimbriae de type 3 (FIM3) et BrkA, ou un antigène pertussique de type à germes entiers) au fœtus. Par conséquent, 1'immunisation maternelle peut être pratiquée à tout moment après 25 semaines de gestation (mesurées à compter du premier jour des dernières règles), par exemple à ou après 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34 semaines de gestation (23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 semaines de grossesse), ou à ou avant 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 ou 30 semaines de gestation (36, 35, 34, 33, 32, 31, 29 ou 28 semaines de grossesse) . De manière favorable, l'immunisation maternelle est pratiquée entre 26 et 28 semaines, par exemple entre 26 et 38 semaines, comme entre 28 et 34 semaines de gestation.
De manière avantageuse, l'immunisation maternelle est pratiquée au moins deux ou trois ou au moins quatre ou au moins cinq ou au moins six semaines avant la date prévue d'accouchement. Le moment choisi pour l'administration peut avoir besoin d'être ajusté dans le cas d'une femme enceinte à risque d'accoucher prématurément, afin de disposer d'un temps suffisant pour la génération des anticorps et le transfert au fœtus.
De manière avantageuse, une monodose (ou respectivement des doses uniques) de l'analogue de la protéine F du VRS et du ou des antigènes ou de leur formulation est administrée à la femme enceinte, au cours de la période décrite. L'immunisation maternelle ci-décrite contre le VRS et B. pertussis peut être considérée comme une "stimulation" d'une immunité maternelle existante contre le VRS et B. pertussis qui. accroît la réponse immunitaire contre le VRS et B. pertussis qui a précédemment été primo-inoculée, e.g., par exposition naturelle ou vaccination. Ainsi, une seule dose devrait être requise. Par conséquent, dans un mode de réalisation préféré des schémas, méthodes et utilisations ci-décrites, notamment quand le composant antigénique du VRS (e.g., protéine recombinée, telle qu'un analogue de la protéine F) et le composant antigénique de B. pertussis sont co-formulés dans une seule composition immunogène (i.e. combinée), l'analogue de la protéine F du VRS et les antigène de B. pertussis sont administrés selon un schéma monodose (ou respectivement de doses uniques). En d'autres termes, pendant une gestation (grossesse), la femme enceinte reçoit l'analogue de la protéine F et les antigènes de B. pertussis une seule fois, ce qui signifie que quand ils sont co-formulés dans une composition immunogène combinée, ladite composition n'est administrée qu'une seule fois au cours de la grossesse. Si une seconde dose est administrée, celle-ci est également de manière avantageuse dans la même période de temps que l'administration de la première, de manière avantageuse à un intervalle de temps entre la première et la seconde dose d'une à huit semaines, ou de deux à six semaines, par exemple, deux semaines ou quatre semaines ou six semaines. L'administration d'un analogue de la protéine F et d'un antigène de B. pertussis à une femme enceinte a pour effet de stimuler les titres d'anticorps maternels, par exemple, d'augmenter les titres d'anticorps sériques (e.g., neutralisants), de préférence de la sous-classe des IgGi. L'accroissement du titre d'anticorps chez la mère provoque le transfert passif des anticorps spécifiques de VRS et spécifiques de B. pertussis ayant une fonction effectrice neutralisante au bébé en gestation à travers le placenta par un mécanisme de transport actif médié par les récepteurs Fc, e.g., dans le syncytiotrophoblaste des villosités choriales. Le transport à travers le placenta des anticorps IgGi spécifiques du VRS et spécifiques de B. pertussis résultant des méthodes d'immunisation ci-décrites devrait être efficace et générer des titres qui, chez le nourrisson né (presque) à terme avoisinent, égalent, voire dépassent les titres dans la circulation maternelle. Par exemple, les titres d'anticorps spécifiques de VRS sont de manière avantageuse à des niveaux d'au moins 30 pg/mL à la naissance. Typiquement, les titres peuvent être égaux ou supérieurs, par exemple à 40 pg/mL, 50 pg/mL, 60 pg/mL, voire plus, tels que 75 pg/mL, 80 pg/mL, 90 pg/mL, 100 pg/mL, voire jusqu'à 120 pg/mL ou plus chez les nourrissons en bonne santé nés au terme de la grossesse. Ces valeurs peuvent être sur une base individuelle ou sur une base médiane de population. De manière avantageuse, le niveau d'anticorps observé à la naissance est supérieur aux seuils indiqués et persiste plusieurs mois après la naissance.
Les titres d'anticorps anti-pertussiques (e.g., PT-) sont typiquement mesurés par ELISA en termes d'unités ELISA/ml (EU), comme décrit, e.g., dans Meade et al., "Description and évaluation of sérologie assays used in a multicenter trial of acellular pertussis vaccines", Pediatrics (1995) 96:570-5, incorporé ici par référence. Brièvement, par exemple, des plaque de microtitrage (e.g., Immulon 2, VWR International, West Chester, PA, Etats-Unis) sont revêtues de quantités standards de PT, FHA, FIM ou PRN. Des dilutions sériques successives sont incubées pendant environ 2 h à 28°C et une dilution appropriée d'IgG de chèvre anti-humains conjugués à une phosphatase alcaline est ajoutée. La réaction se développe et la plaque est lue à 405 nm. La limite de détection basse de chaque anticorps spécifique est déterminée par de multiples mesures d'une substance de référence diluée successivement pour chaque antigène et est fixée à 1 unité ELISA (EU) pour PT, FHA et PRN, et à 2 ' EU pour FIM. De manière avantageuse, après l'administration d'une composition immunogène comprenant un antigène pertussique selon le schéma vaccinal, la méthode, l'utilisation ou telle que contenue dans les kits ci-décrits, les titres d'anticorps anti-pertussiques sont à des niveaux d'au moins 10 EU à la naissance. Typiquement, les titres peuvent être égaux ou supérieurs, comme par exemple à 20 EU, 30 EU, 40 EU, 50 EU, 60 EU, 70 EU, 80 EU, 90 EU ou au-dessus de 100 EU. Ces valeurs peuvent être sur une base individuelle ou sur une base médiane de population. De manière avantageuse, le niveau d'anticorps observé à la naissance est supérieur aux seuils indiqués et persiste plusieurs mois après la naissance.
La fonction effectrice, e.g., capacité de neutralisation (titre neutralisant) des anticorps anti-VRS transférés peut également être évaluée, et donne une mesure de l'attribut fonctionnel corrélée à la protection. Par exemple, dans le cas du VRS, une quantité spécifique d'un virus VRS capable de réplication et une dilution sérique définie sont mélangées et incubées. Le mélange réactionnel virus-sérum est ensuite transféré sur des cellules hôtes (e.g., cellules HEp-2) permissives pour la réplication virale et incubé dans des conditions et pendant une période de temps suffisantes pour la croissance cellulaire et la réplication virale. Le virus non neutralisé est capable d'infection et de réplication dans les cellules hôtes. Ceci conduit à la formation d'un nombre donné d'unités formant plaque (PFU) sur la monocouche cellulaire qui peuvent être détectées à l'aide d'un anticorps anti-VRS étiqueté par un fluorochrome. Le titre neutralisant est déterminé en calculant la dilution sérique qui induit un niveau spécifique d'inhibition (e.g., 50 % d'inhibition ou 60 % d'inhibition) des PFU comparé à une monocouche cellulaire infectée avec le virus seul, sans sérum. Par exemple, il a été démontré que l'anticorps Palivizumab a un titre de neutralisation (concentration efficace médiane [EC50]) exprimé en concentration d'anticorps requise pour réduire la détection de l'antigène du VRS de 50 % comparé à des cellules infectées par le virus non traitées- de 0,65 pg par mL (moyenne 0,75 ± 0,53 pg par mL ; n=69, plage 0,07-2,89 pg par mL) et de 0,28 pg par mL (moyenne 0,35 ± 0,23 pg par mL ; n=35, plage 0,03-0,88 pg par mL) contre des isolats VRS A et VRS B cliniques, respectivement. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, le titre neutralisant d'anticorps transférés via le placenta au bébé en gestation peut être mesuré chez le nourrisson après sa naissance et a (sur une base médiane de population) une valeur EC50 d'au moins environ 0,50 pg/mL (par exemple, d'au moins environ 0,65 pg/mL), ou plus pour une souche A du VRS et une valeur EC50 d'au moins environ 0,3 pg/mL (par exemple, d'au moins environ 0,35 pg/mL), ou plus pour une souche B du VRS. De manière avantageuse, le titre d'anticorps neutralisants reste supérieur au seuil indiqué pendant plusieurs semaines à mois après la naissance.
La fonction effectrice de neutralisation des toxines des anticorps anti-anatoxine pertussique peut être également mesurée, si souhaité, e.g., dans un dosage de neutralisation de cellules d'ovaires de hamster chinois (CHO), par exemple comme décrit dans Gillenius et al., "The standardization of an assay for pertussis toxin and antitoxin in microplate culture of Chinese hamster ovary cells". J. Biol. Stand. (1985) 13:61-66, incorporé ici par référence. Toutefois, l'activité neutralisante dans ce dosage est moins bien corrélée à la protection.
Eventuellement, selon les schémas vaccinaux, les méthodes, les utilisations et les kits ci-décrits, pour prolonger la protection contre le VRS et B. pertussis au-delà des premiers mois de la vie pendant lesquels les anticorps maternels transférés passivement fournissent la protection, le nourrisson peut être activement immunisé pour déclencher une réponse immunitaire adaptive spécifique du VRS et/ou de B. pertussis. Cette immunisation active du nourrisson peut être pratiquée par administration d'une ou de plus d'une composition qui contient un antigène du VRS et/ou un antigène de B. pertussis. Par exemple, la ou les compositions peuvent comprendre un analogue de la protéine F, éventuellement formulé avec un adjuvant pour amplifier la réponse immunitaire suscitée par l'antigène.' Pour une administration à un nourrisson qui n'a pas été précédemment exposé au VRS, l'analogue de la protéine F peut être formulé avec un adjuvant qui suscite une réponse immunitaire qui est caractérisée par la production de cellules T qui présentent un profil de cytokines Thl (ou qui est caractérisée par un équilibre des cellules T qui présentent des profils de cytokines Thl et Th2). De manière analogue, le nourrisson peut être activement immunisé par un vaccin anti-coquelucheux (B. pertussis), qui peut éventuellement être administré sous la forme d'un vaccin combiné conférant également une protection contre d'autres pathogènes.
En variante, plutôt que d'administrer un analogue de la protéine F du VRS ou autre vaccin sous-unités protéiques au nourrisson, la composition qui suscite une réponse immunitaire adaptative pour protéger contre le VRS peut comprendre un vaccin issu d'un virus atténué vivant, ou un acide nucléique qui code pour un ou plusieurs antigènes du VRS (tels qu'un antigène protéine F, un antigène G, un antigène N, ou un antigène M2, ou des fragments de ceux-ci) . Par exemple, l'acide nucléique peut être dans un vecteur, tel qu'un vecteur viral recombiné, par exemple,' un vecteur adénoviral, un vecteur viral adéno-associé, un vecteur MVA, un vecteur ourlien, ou autre. Des vecteùrs viraux exemplaires sont décrits dans WO2012/08 9231, qui est incorporé ici par référence pour sa description de compositions immunogènes qui contiennent un vecteur viral qui code pour un ou plusieurs antigènes du VRS. En variante, l'acide nucléique peut être un acide nucléique auto-réplicatif, tel qu'un ARN autoréplicatif, e.g., sous la forme d'un réplicon viral, tel qu'un réplicon alpha-viral (e.g., sous la forme d'une particule de réplicon virale encapsulée avec des protéines structurales virales). Des exemples de ces réplicons de type ARN auto-réplicatif sont décrits dans W02012/103361, qui est incorporé ici pour sa description des réplicons ARN qui codent pour des protéines pour VRS et leur formulation sous forme de compositions immunogènes.
En plus ou en variante, une ou plusieurs compositions contenant un antigène de B. pertussis peuvent être administrées au nourrisson. Par exemple, la composition peut comprendre un antigène pertussique acellulaire choisi dans le groupe constitué par : l'anatoxine pertussique (PT), 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN), des fimbriae de type 2 (FIM2), des fimbriae de type 3 (FIM3) et BrkA, ou une combinaison de ceux-ci (e.g., PT et FHA ; PT, FHA et PRN ; ou PT, FHA, PRN et FIM2 ou FIM3, ou le deux) , par exemple où PT est détoxifiée chimiquement ou génétiquement comme décrit dans la présente. En variante, la composition peut comprendre un antigène pertussique à germes entiers comme décrit dans la présente.
Dans le cadre des schémas vaccinaux, des méthodes et des utilisations décrites dans la présente, le composant antigénique du VRS (e.g., protéine recombinée, telle qu'un analogue de la protéine F) et le composant antigénique de B. pertussis peuvent être co-formulés dans une seule composition immunogène (i.e. combinée), comme décrit dans la présente. En variante, le composant antigénique du VRS et le composant antigénique de B. pertussis sont formulés dans deux compositions immunogènes différentes (ou plus), qui peuvent être administrées au même moment, ou à des moments différents, e.g., selon les divers calendriers d'immunisation pédiatriques approuvés et recommandés, et qui peuvent être présentées dans des kits (comme décrit dans la présente).
Quand une composition qui suscite une réponse immunitaire adaptative au VRS et/ou une réponse immunitaire adaptative à B. pertussis est administrée à un nourrisson né d'une mère ayant été immunisée contre le VRS et B. pertussis pendant sa grossesse, comme décrit dans la présente, la composition peut être administrée une ou plusieurs fois. La première administration peut intervenir le jour de la naissance, ou peu après (e.g., le jour ou le lendemain de la naissance), ou dans la semaine ou dans les deux semaines environ qui suivent. En variante, la première administration peut intervenir 4 semaines environ, six semaines environ, 2 mois environ, 3 mois environ, 4 mois environ après la naissance, ou plus tard, comme par exemple 6 mois environ, 9 mois environ, ou 12 mois environ après la naissance. Par exemple, dans le cas d'une composition contenant un antigène de B. pertussis (e.g., Pa ou Pw) , il est courant d'administrer le vaccin environ 2, 4 et 6 mois après la naissance (suivi de doses supplémentaires à 12-18 mois et éventuellement, entre 4 et 7 ans). Ainsi, dans un mode de réalisation, cette divulgation concerne des méthodes destinées à protéger un nourrisson contre une maladie provoquée par le VRS et B. pertussis, par administration d'une ou de plusieurs compositions qui suscitent une réponse immunitaire spécifique du VRS et/ou de B. pertussis chez un nourrisson né d'une mère à laquelle on a administré pendant sa grossesse une ou des compositions immunogènes comprenant un analogue de la protéine F et un antigène de B. pertussis. De manière avantageuse, les anticorps maternels anti-VRS et anti-B. pertussis ne médient pas l'inhibition ou "l'émoussement" de la réponse immunitaire du nourrisson à ces antigènes respectifs dans les compositions administrées au nourrisson.
Comme mentionné ci-dessus, les compositions immunogènes utilisables dans les schémas vaccinaux, les méthodes et les utilisations décrits peuvent être des compositions VRS-B. pertussis combinées (co-formulées) comme décrit dans la présente demande, ou peuvent être des compositions différentes qui fournissent séparément un analogue de la protéine F et un antigène de B. pertussis. Ces compositions "séparées" peuvent être fournies dans des kits. Elles peuvent être administrées le même jour (co-administrées) ou à des jours différents.
Dans les schémas vaccinaux, les méthodes et les utilisations décrits, le nourrisson peut être immunologiquement immature. Il peut être âgé de moins de six mois, comme par exemple de moins de deux mois, par exemple de moins de un mois, par exemple, être un nouveau-né.
Ladite au moins composition immunogène administrée à la femme enceinte dans le cadre des schémas vaccinaux, méthodes et utilisations décrits peut, dans un mode de réalisation, être administrée à 26 semaines de gestation ou plus tard, par exemple entre 26 et 38 semaines de gestation, par exemple, entre 28 et 34 semaines de gestation.
Dans un mode de réalisation des schémas vaccinaux, méthodes et utilisations décrits, ledit au moins sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS est détectable à un niveau de 30 pg/mL ou plus dans le sérum du nourrisson à sa naissance et/ou ledit au moins sous-ensemble d'anticorps anti-pertussiques est détectable à un niveau de 10 Unités ELISA/ml (EU) ou plus dans le sérum du nourrisson à sa naissance.
Dans certains modes de réalisation, ces schémas vaccinaux, méthodes et utilisations comprennent en outre l'administration au nourrisson d'au moins une composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS et/ou B. pertussis. Quand une réponse immunitaire active est amorcée ou induite à la fois contre le VRS et B. pertussis, ladite au moins composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS et ladite au moins composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre B. pertussis peuvent être la même composition ou en variante, elles peuvent être différentes. Dans ce dernier cas, les compositions différentes peuvent être administrées le même jour ou à des jours différents. De manière avantageuse, la réponse immunitaire active amorcée ou induite chez le nourrisson par ladite au moins composition immunogène n'est pas quantitativement différente, au sens clinique du terme, de la réponse immunitaire active générée en réponse à ladite ou auxdites mêmes compositions chez les nourrissons nés de mères qui n'avaient pas été immunisées lors de leur grossesse selon les schémas vaccinaux, les méthodes et les utilisations décrites.
Dans les modes de réalisation des schémas vaccinaux, des méthodes et des utilisations dans lesquels au moins une composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS et/ou B. pertussis chez le nourrisson est administrée au nourrisson, ladite au moins composition administrée au nourrisson peut comprendre un acide nucléique, un vecteur viral recombiné ou une particule de réplicon virale, ledit acide nucléique, vecteur viral recombiné ou particule de réplicon virale codant au moins pour un antigène protéique de VRS ou un analogue antigénique. Ladite au moins composition peut comprendre un antigène du VRS comprenant un analogue de la protéine F.
Des kits qui comprennent une pluralité de compositions immunogènes formulées pour l'administration à une femme enceinte sont décrits, lesdits kits comprenant : (a) une première composition immunogène comprenant un analogue de la protéine F capable d'induire, de susciter ou de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique du VRS ; et (b) une seconde composition immunogène comprenant au moins un antigène de B. pertussis capable d'induire, de susciter ou de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique de B. pertussis, la première et la seconde composition immunogène induisant, suscitant ou stimulant après administration à une femme enceinte au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis, lesdits anticorps étant transférés via le placenta au bébé en gestation de ladite femme enceinte, pour le protéger ainsi contre une infection ou une maladie provoquée par le VRS et B. pertussis. De préférence, les compositions respectives du kit sont administrées à la femme enceinte une seule fois par grossesse. Autrement dit, au cours d'une grossesse, la femme enceinte ne reçoit de préférence qu'une seule dose de chacune des compositions du kit.
Dans ce kit, l'analogue de la protéine F de la première composition et/ou ledit au moins antigène de B. pertussis de la seconde composition immunogène peuvent être tels que décrits dans la présente, y compris dans les divulgations faites dans le contexte de la description des compositions immunogènes combinées divulguées. Dans un mode de réalisation, la première composition immunogène et/ou la seconde composition immunogène sont dans une seringue préremplie. Cette seringue peut être une seringue à deux compartiments.
Les exemples qui suivent sont fournis pour illustrer certaines caractéristiques et/ou modes de réalisation particuliers. Ces exemples ne doivent pas être interprétés comme limitant l'invention aux caractéristiques ou aux modes de réalisation particuliers décrits.
EXEMPLES
Dans tous les exemples, le vaccin VRS(Pré-F) utilisé comprend un antigène Pré-F à glycosylation modifiée du type correspondant à la SEQ ID N0 : 22, i.e. contenant la modification L112Q et une modification des acides aminés correspondant aux positions 500-502 de la SEQ ID NO : 2 sélectionnée parmi : NGS ; NKS ; NGT ; et NKT.
Exemple 1 - Validation de principe immunisation maternelle contre le VRS dans le modèle du cochon d'Inde
Le modèle du cochon d'Inde a été choisi dans la mesure où sa structure de placenta et son transfert d'IgG est plus proche de ceux de l'être humain que les modèles de rongeurs typiques (revus dans Pentsuk et van der Laan (2009) Birth Defects Research (part B) 86:328-344). La période de gestation relativement longue chez le cochon d'Inde (68 jours) permet l'immunisation et le développement d'une réponse immunitaire pendant la gestation. Afin de reproduire l'état d'immunité vis-à-vis du VRS des femmes enceintes qui ont été exposées au VRS pendant toute leur vie et ont une réponse immunitaire préexistante au VRS, les femelles cochons d'Inde ont été primo-inoculées soit 6 semaines, soit 10 semaines avant la vaccination (FIG. 2).
Les femelles cochons d'Inde (N=5/groupe) ont été primo-inoculées par voie intranasale avec un virus VRS vivant (2,5 x 105 pfu) , 6 ou 10 semaines ayant la vaccination (à peu près au moment de l'accouplement ou 4 semaines avant). Deux groupes n'ont pas été primo-inoculées. Les femelles pleines ont été immunisées environ 6 semaines après le début de la gestation avec 10 цд d'antigène PréF combiné à de 1'hydroxyde d'aluminium. Un groupe de femelles non primo-inoculées a reçu une injection de PBS. Des échantillons sériques ont été recueillis pendant la primo-inoculation et la période de gestation pour surveiller les niveaux d'anticorps liants et neutralisants anti-VRS.
La progéniture (âgée de 7-16 jours) a été soumise à une épreuve virulente par voie intranasale avec un VRS vivant à 1 x 107 pfu. Quatre jours après l'épreuve virulente, les poumons ont été prélevés et séparés en 7 lobes. Le virus a été titré dans 6 des 7 lobes et les particules virales totales par gramme de poumon ont été calculées.
Les résultats figurent sur le graphique des FIG. 3 et 4.
Des niveaux d'anticorps similaires ont été observés le jour de la vaccination (D70-75 - avant vaccination) - que les femelles cochons d'Inde aient été primo-inoculées 6 ou 10 semaines plus tôt. Les titres plateau ont été atteints 14 jours après la primo-inoculation. Les titres d'anticorps neutralisants ne déclinent pas après avoir atteint un plateau pendant au moins environ 60 jours. Par conséquent la primoinoculation en ces deux points temporels était équivalent dans ce modèle et convenable pour reproduire l'infection maternelle chez la femme.
Les résultats obtenus pour la charge virale dans les poumons chez les bébés cochons d'Inde (FIG. 3) indiquent que la progéniture née de mères primo-inoculées et vaccinées était protégée contre l'épreuve virulente par le VRS, comparée à la progéniture née de mères non primo-inoculées/non vaccinées. Par contre, la progéniture née de mères non primo-inoculées/vaccinées n'était pas protégée contre la l'épreuve virulente par le VRS. Steff et al (Proof of concept of the efficacy of a maternai RSV, recombinant F protein, vaccine for protection of offspring in the guinea pig model - poster 114, RSV Vaccines for the World conference, Porto, Portugal, 14-16 Octobre 2013), apportent d'autres preuves de l'efficacité de' l'antigène PréF à induire des niveaux d'anticorps protecteurs chez les bébés cochons d'Inde après l'immunisation maternelle.
Exemple 2 - Le vaccin combiné protège contre la provocation par le VRS
Cet exemple démontre la protection contre le VRS suscitée par un vaccin combiné contenant des antigènes de VRS (Pré-F) et de B. pertussis (PT, FHA et PRN) . L' immogénicité (titres d'anticorps neutralisants). des deux doses du vaccin combiné Pa-VRS a été évaluée dans le modèle de souris Balb/c, suivi par une épreuve virulente du VRS par voie intranasale pour mesurer l'efficacité du vaccin combiné.
Des groupes de souris BALB/c (n=14/groupe) ont été immunisés par voie intramusculaire à un intervalle de 3 semaines avec les formulations indiquées dans le Tableau 1.
Tableau 1 : Formulations vaccinales administrées avant la
provocation par le VRS
Les sérums de toutes les souris ont été collectés individuellement le Jour 0 (avant la première immunisation), le Jour 21 (avant la seconde immunisation) et le Jour 35 (2 semaines après la seconde immunisation) et testés pour déterminer la présence d'anticorps neutralisants anti-VRS à l'aide d'un dosage de réduction de plaques. Brièvement, des dilutions en série de chaque sérum ont été incubées avec un VRS Long (ciblant 100 pfu/puits) pendant 20 min à 33°C. Après incubation, le mélange .virus-sérum a été transféré sur des plaques préalablement ensemencées avec des cellules Vero et vidées de leur milieu de croissance. Sur chaque plaque, les cellules d'une colonne ont été incubées avec le virus seul (100 % d'infectivité) et 2 puits n'ont reçu ni virus, ni sérum (témoins cellulaires) . Les plaques ont été incubées pendant 2 h à 33°C, le milieu a été retiré et le milieu pour VRS contenant 0,5 % de CMC (carboxyméthylcellulose basse viscosité) a été ajouté à tous les puits. Les plaques ont été incubées pendant 3 jours à 33 °C avant coloration par immunofluorescence.
Pour la coloration, les monocouches cellulaires ont été lavées avec du PBS et fixées avec 1 % de paraformaldéhyde. Les cellules positives au VRS ont été détectées à l'aide d'un antisérum de chèvre anti-VRS commercial, puis à l'aide d'IgG anti-chèvre de lapin conjuguées à FITC. Le nombre de plaques colorées par puits a été compté à l'aide d'un système d'imagerie automatisé. Les titres d'anticorps neutralisants de chaque sérum a été déterminé comme étant l'inverse de la dilution sérique provoquant une réduction de 60 % dans le nombre de plaques, comparé au témoin sans sérum (EÜ6o) - Les résultats sont illustrés sur la FIG. 5A.
Le vaccin à base de PréF adjuvanté avec А1(ОН)з protège les souris contre une épreuve virulente intranasale par le VRS et ce modèle animal est par conséquent utile pour étudier la capacité des vaccins à VRS à médier la clairance virale dans les poumons. La combinaison d'antigènes de B. pertussis (PT, FHA et PRN) et VRS (PréF) dans un seul vaccin a ensuite été testée pour son efficacité protectrice dans le modèle murin de l'épreuve virulente intranasale par le VRS. Deux semaines après la seconde dose vaccinale, les souris ont été soumises à une épreuve virulente par instillation de 50 μΐ (25 pL par narine) avec une souche VRS A Long (environ l,45xl06 pfu/50 μΐ) . Les poumons ont été prélevés quatre jours après l'épreuve virulente pour évaluer la charge virale pulmonaire. Quatre jours après l'épreuve virulente, les souris ont été euthanasiées, les poumons ont été prélevés dans des conditions aseptiques et individuellement pesés et homogénéisés. Des dilutions en série (8 réplicats de chaque) de chaque homogénéisât pulmonaire ont été incubées avec des cellules Vero et les puits contenant des plaques ont été identifiés par immunofluorescence, 6 jours après ensemencement. Le titre viral a été déterminé par la méthode Spearman-Kârber pour le calcul de TCID50 et a été exprimé par gramme de poumon. La méthode statistique utilisée est une analyse de variance (ANOVA 1) sur les valeurs loglO.
Les résultats sont illustrés sur la FIG. 5B. Comme prévu, 2 pg de PréF combiné à А1(ОН)з ont efficacement favorisé la clairance virale dans les poumons, comparé aux souris vaccinées avec Pa seul (groupe témoin où aucune protection contre l'épreuve virulente par le VRS n'est attendue). Seuls deux animaux sur 14 dans le groupe PréF avaient des niveaux détectables de VRS dans les poumons, avec aucun VRS détectable chez les 12 autres animaux. Le vaccin combiné Pa-VRS a lui aussi été capable de protéger les souris contre l'épreuve virulente par le VRS comme mis en évidence par un seul animal sur 14 ayant des niveaux détectables de VRS dans les poumons, le VRS étant indétectable chez les 13 autres animaux. Dans l'ensemble, les animaux vaccinés avec le vaccin PréF + А1(ОН)з ou avec des antigènes Pa + PréF + Al (ОН),з avaient, des titres viraux pulmonaires significativement plus bas que les animaux témoins vaccinés avec Pa seul (P<0,001). Dans le groupe vacciné avec les antigènes Pa + PréF en l'absence d'adjuvant, il n'y a pas eu de réduction significative (P<0,001) dans les titres viraux, toutefois aucun animal dans ce groupe n'a paru entièrement protégé contre l'épreuve virulente par le VRS étant donné que le virus était quantifiable dans les poumons de tous les animaux. A l'aide d'un modèle animal d'épreuve virulente, nous avons observé que le vaccin combiné Pa-VRS suscitait une réponse immunitaire protectrice contre le VRS comparable à celle du vaccin à VRS. Cette réponse immunitaire a été associée à la production d'anticorps neutralisants anti-VRS.
Exemple 3 - Le vaccin combiné protège contre 1 ' épreuve virulente par B. pertussis
Cet exemple montre la protection contre Bordatella pertussis suscitée par un vaccin combiné contenant des antigènes de VRS et de B. pertussis (PT, FHA et PRN). L·'immunogénicité (titres d'anticorps neutralisants) de deux doses du vaccin combiné Pa-VRS a été évaluée dans le modèle Balb/c, suivie par une provocation intranasale par une souche B. pertussis infectieuse pour mesurer l'efficacité du vaccin combiné.
Des groupes de souris BALB/c (n=20/groupe) ont été immunisés par voie sous-cutanée deux fois à trois semaines d'intervalle avec la formulation indiquée dans le Tableau 2.
Table 2: Formulation vaccinale administrée avant l'épreuve virulente par B. pertussis
Les sérums de toutes les souris ont été collectés individuellement sept jours après la seconde immunisation (d28 - veille de l'épreuve virulente) et testés pour déterminer la présence d'anticorps de type IgG anti-PT, anti-FHA et anti-PRN. En bref, des plaques 96-puits ont été revêtues de FHA (2 pg/ml), PT (2 pg/ml) ou PRN (6 pg/ml) dans un tampon carbonate-bicarbonate (50 mM) et incubées toute une nuit à 4°C. Après l'étape de saturation avec le tampon PBS-BSA à 1 %, les sérums murins ont été dilués à 1/100 dans du PBS-BSA 0,2 % Tween 0,05 % et dilués en série dans les puits des plaques (12 dilutions, étape 4) . Une IgG anti-souris couplée à la peroxydase a été ajoutée (dilution à 1/5000). La • réaction colorimétrique a été observée après l'ajout du substrat pour la peroxydase (OPDA), et arrêtée avec du HCL IM avant lecture par spectrophotométrie (longueurs d'ondes : 490-620 nm). .Pour chaque sérum testé et référence ajoutée sur chaque plaque, une courbe logistique 4 paramètres a été lissée en fonction de la relation entre l'OD et la dilution (Softmaxpro). Ceci a permis le calcul du titre de chaque échantillon exprimé en titres STD. Les réponses en anticorps sérologiques spécifiques des antigènes Pa (PT, FHA et PRN) induites par les vaccins sont considérées comme indicatives (mais pas décisives) de la capacité des vaccins à susciter des réponses en anticorps contre les antigènes individuels présents dans le vaccin Pa. La FIG. 6A montre que DTPa, Pa seul et la combinaison Pa-VRS favorisaient des réponses en IgG spécifiques de PT, FHA et PRN après deux immunisations. Aucun anticorps spécifique de l'antigène n'a été détecté dans les sérums de souris non vaccinées ou vaccinées avec VRS (données non présentées). Les analyses statistiques ont démontré l'équivalence entre les réponses en anticorps anti-PT et anti-FHA induites par DTPa (Infanrix™) et la combinaison Pa-VRS.- Les quantités d'anticorps anti-PRN induites par le vaccin Pa seul et le vaccin combiné Pa-VRS étaient également statistiquement équivalentes, démontrant que la présence de l'antigène du VRS n'interférait pas avec la production de réponses en anticorps anti-pertussiques.
Pour démontrer la protection, une semaine après la stimulation, les souris ont été soumises à une épreuve virulente par instillation de 50 μΐ de suspension bactérienne (environ 5xl06 CFU/50 μΐ) dans la narine gauche. Cinq souris de chaque groupe ont été euthanasiées 2 heures, 2 jours, 5 jours et 8 jours après l'épreuve virulente bactérienne. Les poumons ont été prélevés dans des conditions aseptiques et homogénéisés individuellement. La clairance bactérienne des poumons a été mesurée par comptage de la croissance de colonies sur des plaques gélosées Bordet-Gengou. Les données ont été représentées en fonction du nombre moyen d'unités formant colonies (CFU - loglO) par poumon dans chaque groupe de traitement à <. chaque moment de collecte. La méthode statistitique utilisée est une analyse de variance (ANOVA) sur les valeurs loglO à 2 facteurs (traitement et jour) utilisant un modèle de variance hétérogène.
Dans ce modèle, le.vaccin à B. pertussis acellulaire (Pa) protège les souris contre une provocation intranasale avec la bactérie. Ce modèle animal est par conséquent utile pour étudier la capacité d'un vaccin à base de B. pertussis à médier la clairance bactérienne dans les poumons. La combinaison des antigènes de B. pertussis (PT, FHA et PRN) et du VRS (Pré-F) dans un seul vaccin a ensuite été testée pour son efficacité protectrice dans le modèle murin de l'épreuve virulente intranasale. Des résultats représentatifs sont illustrés sur la FIG. 6B. Comme prévu, la dose humaine ajustée (un quart de dose du vaccin commercial DTPa Infanrix™) a efficacement favorisé la clairance bactérienne comparée aux souris non vaccinées. Le vaccin Pa seul et le vaccin combiné Pa-VRS ont tous deux également été capables de susciter une réponse immunitaire protectrice conduisant à l'élimination de la bactérie. Comme prévu, le vaccin PréF de VRS seul a été incapable de protection contre B. pertussis dans ce modèle animal.
Ces résultats démontrent dans un modèle animal que le vaccin combiné Pa-VRS a suscité une réponse immunitaire protectrice contre B. pertussis ainsi que contre VRS comme démontré dans l'Exemple 2 ci-dessus. Cette réponse immunitaire a été associée à la production d'anticorps spécifiques contre les trois antigènes sous-unités présents dans le vaccin Pa acellulaire (PT, FHA et PRN).
Exemple 4 - L'administration du vaccin combiné Pa-VRS à des mères pleines n'interfèrent pas avec la protection des petits après l'épreuve virulente par le VRS dans le modèle du cochon d'Inde
Des femelles cochons d'Inde (N=5/groupe) ont été primo-inoculées par voie intranasale avec un virus VRS vivant (800 pfu). Un des groupes n'a pas été primo-inoculé. L'accouplement a démarré le lendemain de la primoinoculation. Les femelles pleines ont été immunisées 4 et. 7 semaines après la primo-inoculation (schéma deux doses) ou 7 semaines après la primo-inoculation (schéma monodose) avec l'un des vaccins suivants : 10 pg d'antigène PréF combiné à de 1'hydroxyde d'aluminium (130 pg) , 10 pg d'antigène PréF + antigènes DTaP (5 Lf anatoxine diphtérique, 2 Lf anatoxine tétanique, 5 pg FHA, 5 pg d'anatoxine pertussique inactivée, 1,6 pg de PRN) combiné à de l'hydroxyde d'aluminium (130 pg) ou seulement avec les antigènes DTaP (mêmes quantités que ci-dessus) combinés à de 1'hydroxyde d'aluminium (100 pg) . Des échantillons sériques ont été recueillis 14 jours après la première ou la seconde immunisation (jour 63 après amorçage) pour les femelles immunisées une fois ou deux, respectivement.. Les niveaux d'anticorps neutralisants anti-VRS ont été déterminés à ce point temporel (là 6 semaines avant la naissance des petits).
Des échantillons sériques ont été prélevés sur la progéniture dans les 24 à 72 heures après la naissance. Les petits entre 5 et 18 jours ont été soumis à une épreuve virulente par voie intranasale avec un VRS vivant à 2 x 106 pfu. Quatre jours après l'épreuve virulente, les poumons ont été prélevés et homogénéisés. Le virus a été titré dans les homogénéisats pulmonaires et les particules virales totales par gramme de poumon ont été calculées.
Les résultats sont indiqués sur les graphiques des FIG. 7 et 8 .
Les titres d'anticorps neutralisants anti-VRS chez les mères vaccinées une fois ou deux avec des antigènes DTaP seuls (groupes 3 et 6 sur la FIG. 7A) étaient de 316 et 272, respectivement. Ceci représente les titres induits par la primo-inoculation par le VRS puisqu'il n'y avait pratiquement aucune réponse de neutralisation du VRS chez les mères non primo-inoculées vaccinées avec des antigènes DTaP (groupe 7 sur la FIG. 7A). Les petits nés de mères primo-inoculées avec VRS et vaccinées une fois ou deux avec des antigènes DTaP seulement n'avaient que des titres de neutralisation du VRS de 425 et 563 (groupes 3 et 6 sur la Fig. 7B) , respectivement, représentant les niveaux d'anticorps neutralisants transférés à la progéniture en raison de la primo-inoculation avec le VRS vivant. Ces titres d'anticorps neutralisants étaient suffisants pour induire une protection complète contre l'épreuve virulente par le VRS chez les petits (FIG. 8).
Si l’on compare les niveaux d’anticorps neutralisants induits chez les mères après primo-inoculation avec le VRS vivant et soit une monodose de vaccin PréF seul (groupe 1 sur la FIG. 7A) , soit une dose combinée d’antigènes PréF et DTaP (groupe 2 sur la FIG. 7B) , aucune différence significative dans les titres d’anticorps neutralisants n’est observée, indiquent une absence d’interférence de vaccin DTaP sur la réponse en anticorps neutralisants anti-VRS. Une observation similaire peut être faite pour les titres d’anticorps neutralisants des petits (comparer les groupes 1 et 2 sur la FIG. 7B) . Toutefois quand des mères primo-inoculées ont reçu deux doses d’antigènes PréF et DTaP combinés, les titres neutralisants anti-VRS chez les mères étaient plus bas que ceux obtenus après vaccination PréF seulement, bien que la différence n’ait pas atteint une signification statistique (titres de 832 contre 1590 après vaccin combinée PréF-DTaP contre vaccin PréF seulement, respectivement ; groupes 4 et 5, FIG. 7A). Les niveaux d’anticorps neutralisants transférés aux petits quand les mères ont été vaccinées avec deux doses de vaccin combiné PréF-DTaP étaient significativement plus bas que ceux observés quand les mères étaient vaccinées deux fois avec le vaccin PréF seulement (titres de 519 contre 2439 après vaccin combiné PréF-DTaP contre PréF seulement, respectivement ; groupes 4 et 5, FIG. 7BCes résultats indiquent que la vaccination maternelle avec une seule dose du vaccin combiné DTaP-VRS ne produit pas d’interférence dans les niveaux d’anticorps neutralisants anti-VRS transférés aux petits, alors qu’un certain degré d’interférence était apparent dans les niveaux d’anticorps neutralisants anti-VRS observés chez les petits 24 et 72 heures après leur naissance après vaccination maternelle deux doses avec DTaP-VRS combinés.
Les résultats obtenus pour la charge virale pulmonaire chez la progéniture du cochon d'Inde (FIG. 8) indiquent que la progéniture née de mères primo-inoculées et vaccinées était complètement protégée contre l'épreuve virulente par le VRS, indépendamment du schéma vaccinal utilisé chez les mères. Le fait que les animaux primo-inoculés et vaccinés avec des antigènes DTaP seulement (sans antigène du VRS) sont entièrement protégés contre l'épreuve virulente par le VRS alors que les animaux non primo-inoculés et vaccinés avec des antigènes DTaP seulement ne sont pas protégés suggère que la primo-inoculation avec le VRS vivant était suffisant pour induire des niveaux protecteurs d’anticorps qui ont été transférés à la progéniture, indépendamment du schéma vaccinal utilisé après la primo-inoculation. L'interférence apparente sur les niveaux observés des anticorps neutralisants suscités après deux doses d'antigènes PréF et DTaP combinés (FIG. 7) n'a eu aucune interférence détectable sur la protection des petits contre l'épreuve virulente par VRS. LISTAGE DES SEQUENCES SEQ ID No:l Séquence de nucléotides codant pour la protéine de fusion de référence du VRS Souche A2 No. d'accès GenBank : U50362 atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaaaacatcactgaaga attttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaactggttggtataccagtgttataactatagattaagt aatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaa ttgcagttgctcatgcaaagcacccagcaacaaacaatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgcc aaaaaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttg ctgtatctaaggtcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcagttatcaa atggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaagcaaagctgcag catatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaagcaggtgta actacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgt ccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactat atggtgttatagatacaccctgttggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaa gaactgacagaggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtattt tgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatgattgtaaaattatgact tcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaacaaatgtacagcatccaataaaa atcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattat gtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgat gcatcaatatctcaagtcaacgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaat ccaccataaatatcatgataactactataattatagtgattatagtaatattgttatcttaattgctgttggactgctcttatactgtaaggcca gaagcacaccagtcacactaagaaagatcaactgagtggtataaataatattgcatttagtaactaa SEQ ID No:2 Séquence d'acides aminés du précurseur de protéine F de référence du VRS Fo Souche A2 No. d'accès GenBank : AAB86664
Mellilkanaittiltavtfcfasgqniteefyqstcsavskgylsalrtgwytsvitielsnikenkcngtdakvklikqeldkykna vtelqllmqstpatnnrarrelprfmnytlnnakktnvtlskkrkrrflgfllgvgsaiasgvavskvlhlegevnkiksallstnkav vslsngvsvltskvldlknyidkqllpivnkqscsisniatviefqqknnrlleitrefsvnagvttpvstymltnsellslindmpitn dqkklmsnnvqivrqqsysimsiikeevlaywqlplygvidtpcwklhtsplcttntkegsnicltrtdrgwycdnagsvsffp qaetckvqsnrvfcdtmnsltlpsevnlcnvdifnpkydckimtsktdvsssvitslgaivscygktkctasnknrgiiktfsngcd yvsnkgvdtvsvgntlyyvnkqegkslyvkgepiinfydplvfpsdefdasisqvnekinqslaflrksdellhnvnagkstini mittiiiviivillsliavglllyckarstpvtlskdqlsginniafsn SEQ ID No:3 Séquence de nucléotides codant pour la protéine G de référence du VRS Souche Longue
Atgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttattattcatatcatcgggct tatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatgataatctcaacttcacttataattacagccatcatattc atagcctcggcaaaccacaaagtcacactaacaactgcaatcatacaagatgcaacaagccagatcaagaacacaaccccaacata cctcactcaggatcctcagcttggaatcagcttctccaatctgtctgaaattacatcacaaaccaccaccatactagcttcaacaacacc aggagtcaagtcaaacctgcaacccacaacagtcaagactaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccactac aaaacaacgccaaaacaaaccaccaaacaaacccaataatgattttcacttcgaagtgtttaactttgtaccctgcagcatatgcagca acaatccaacctgctgggctatctgcaaaagaataccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagcctacaaaaaaacc aaccttcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaaccactaaaccaaaggaagtacccaccaccaagcccacagaagagcca accatcaacaccaccaaaacaaacatcacaactacactgctcaccaacaacaccacaggaaatccaaaactcacaagtcaaatgga aaccttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacatccgagcacccatcacaaccctcatctccac ccaacacaacacgccagtag SEQ ID No:4
Séquence d'acides aminés de la protéine G de référence du YRS
MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIF
IASANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPG
VKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSN
NPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPTEEPTI
NTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNT
TRQ SEQ ID No:5
Séquence de nucléotides de l'analogue PréF optimisée pour CHO aagcttgccaccatggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcc cagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacac ctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggag ctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctg ctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagc gccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactac atcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaac aaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccga gctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtc ctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctg gaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggta ctgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaa . ctccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagac cgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaacc ggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtact acgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacg agttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataac gtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgagg cctgataatctaga SEQ ID N0:6
Séquence d'acides aminés de l'analogue PréF
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAYSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVG
SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ
LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQICNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLIN
DMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQS Y SIMSIIKEEVL A YVV QLPL Y GVIDTPC WKLHTS
PLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTL
PSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKT
FSNGCD YV SNKGVDTV SV GNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA
SISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA SEQ ID No:7
Séquence de nucléotides codant pour PreFG_Vl optimisée pour CHO aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcc cagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacac ctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaa ctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggctt cctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaa gagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaaga actacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcaga agaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaac tccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcag cagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacacccctt gctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggct ggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacacca tgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaa gaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaaga accggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactg tactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccg acgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcat aacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcg aggctggcggctctggcggcagcggcggctccaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcg aggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctgg caagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaa ggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatcta SEQ ID N0:8
Peptide PreFG Vl pour CHO
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGV
GSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK
QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLI
NDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQS YSIMSIIKEEVL A YV V QLPL Y GVIDTPC WKLHT
SPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WY CDNAGS V SFFPL AET CKV QSNRVF CDTMNSLT
LPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIK
TFSNGCD YV SNKGVDTV SV GNTL YYVNKQEGKSLYVKGEPIINF YDPLVFPSDEFD
ASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGSGG
SGGSKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTK
PTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTK SEQ ID No:9
Séquence de nucléotides codant pour PreFG_V2 pour CHO aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcc cagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacac ctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaa ctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggctt cctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaa gagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaaga actacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcaga agaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaac tccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcag cagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacacccctt gctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggct ggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacacca tgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaa gaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaaga accggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactg tactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccg acgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcat aacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcg aggctggcggcaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgct ccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcct accaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcac caccaccatcaccactgataatcta SEQ ID No: 10
Peptide PreFG_V2 pour CHO
MELLILKTN AIT AIL A A VTLCF AS SQNITEEF YQSTCS AV SKGYLS ALRT G WYTS VITI
ELSNIKENKCNGTDAKYKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGV
GSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK
QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLI
NDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQS YSIMSIIKEEVL A YVV QLPL Y GVIDTPC WKLHT
SPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WY CDN AGS V SFFPL AET CKVQSNRVF CDTMN SLT
LPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIK
TFSNGCDYYSNKGVDTVSYGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFD
ASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGKQR
QNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTF
KTTKKDHKPQTTKPKEVPTTK SEQ ID No: 11
Bispirale exemplaire (glissière à isoleucine)
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA SEQ ID No: 12
Polynucléotide CH02 codant pour l'antigène PréF atggagctgcccatcctgaagaccaacgccatcaccaccatcctcgccgccgtgaccctgtgcttcgccagcagccagaacatcac ggaggagttctaccagagcacgtgcagcgccgtgagcaagggctacctgagcgcgctgcgcacgggctggtacacgagcgtgat cacgatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaacggcacggacgcgaaggtgaagctgatcaagcaggagctggaca agtacaagagcgcggtgacggagctgcagctgctgatgcagagcacgccggcgacgaacaacaagttcctcggcttcctgctggg cgtgggcagcgcgatcgcgagcggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagtccgcgc tgctgagcacgaacaaggcggtcgtgagcctgagcaacggcgtgagcgtgctgacgagcaaggtgctcgacctgaagaactacat cgacaagcagctgctgccgatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaac aaccgcctgctggagatcacgcgggagttctccgtgaacgcaggcgtgacgacgcccgtgtctacgtacatgctgacgaacagcg agctgctcagcctgatcaacgacatgccgatcacgaacgaccagaagaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcgccagca gagctacagcatcatgagcatcatcaaggaggaggtgctggcatacgtggtgcagctgccgctgtacggcgtcatcgacacgccct gctggaagctgcacacgagcccgctgtgcacgaccaacacgaaggagggcagcaacatctgcctgacgcggacggaccgggg ctggtactgcgacaacgcgggcagcgtgagcttcttcccgctcgcggagacgtgcaaggtgcagagcaaccgcgtcttctgcgac acgatgaacagcctgacgctgccgagcgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaacccgaagtacgactgcaagatcatgac gagcaagaccgatgtcagcagcagcgtgatcacgagcctcggcgcgatcgtgagctgctacggcaagacgaagtgcacggcga gcaacaagaaccgcggcatcatcaagacgttcagcaacggctgcgactatgtgagcaacaagggcgtggacactgtgagcgtcg gcaacacgctgtactacgtgaacaagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagccgatcatcaacttctacgacccgct cgtgttcccgagcgacgagttcgacgcgagcatcagccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggcgttcatccgcaagagc gacgagaagctgcacaacgtggaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgcgcgcatc aagaagctgatcggcgaggcgcatcatcaccatcaccattga SEQ ID No: 13
Polynucléotide avec intron codant pour l'antigène PréF atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcacc gaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcacc atcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtac aagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtggg ctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtacgtgtcgggacttgtgttcccctttttttaataaaaagttatatctttaatgttat atacatatttcctgtatgtgatccatgtgcttatgactttgtttatcatgtgtttaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaa gagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaaga actacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcaga agaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaac tccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcag cagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacacccct tgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggct ggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacacca tgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaa gaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaaga accggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactg tactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccg acgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcat aacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcg aggccggaggtcaccaccaccatcaccactga SEQ ID No: 14 Séquence lieur synthétique
GGSGGSGGS SEQ ID No: 15
Site de clivage furine
RARR SEQ ID No: 16
Site de clivage furine
RKRR SEQ ID No: 17
Séquence de nucléotides codant pour PreF_NGTL atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcacc gaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcacc atcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtac aagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtggg ctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtcc accaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagca gctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgct ggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccct gatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatca tgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcaca cctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacg ccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccct gccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctc cagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatca agaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagc aggagggeaagagectgtaegtgaagggegagcetatcatcaaettctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcct ccatcagccaggtgaacgagaagatcaacgggaccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggaca agatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcc SEQ ID No: 18
Séquence d'acides aminés de PreF_NGTL
MELLILKTN AIT AIL A AVTLCF AS SQNITEEF YQSTCS AV SKG YLS ALRT GWYTS VITI
ELSNIKENKCNGTDAKYKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVG
SAIASGIAVSKYLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ
LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLIN
DMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTS
PLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGS V SFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTL
PSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKT
FSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA
SISQVNEKINGTLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA SEQ ID No: 19
Séquence de nucléotides codant pour PreF_Ll 12Q atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcacc gaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcacc atcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtac aagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgcagggcgtggg ctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtcc accaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagca gctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgct ggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccct gatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatca tgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcaca cctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacg ccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccct gccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctc cagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatca agaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagc aggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcct ccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaa gatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcc SEQ ID No:20
Séquence d'acides aminés de PreF_Ll 12Q
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLQGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIYNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLIN DMPITNDQKKLMSNNY QIVRQQS YSIMSIIKEEVLA YVV QLPLY GVIDTPC WKLHTS PLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WY CDN AGS V SFFPL AET CKVQSNRVF CDTMNSLTL PSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTD VS S S VITSLGAIVSC YGKTKCTASNKNRGIIKT FSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDA SISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA SEQ ID No:21
Séquence de nucléotides codant pour PreF_NGTL_Ll 12Q atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcacc gaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcacc atcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtac aagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgcagggcgtggg ctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtcc accaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagca gctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgct ggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccct gatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatca tgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcaca cctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacg ccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccct gccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctc cagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatca agaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagc aggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcct ccatcagccaggtgaacgagaagatcaacgggaccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggaca agatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcc SEQ ID No:22
Séquence d'acides aminés de PreF_NGTL_Ll 12Q
MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLQGVG
SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ
LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLIN
DMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQS YSIMSIIKEEVLA YVV QLPLY GVIDTPC WKLFTTS
PLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTL
PSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKT
FSNGCD YV SNKGVDTV SV GNTL YYVNKQEGKSLYVKGEPIINF YDPLVFPSDEFDA
SISQVNEKINGTLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA

Claims (113)

  1. REVENDICATIONS
    1. Composition immunogène combinée comprenant au moins un antigène du virus respiratoire syncytial (VRS) et au moins un antigène de Bordetella pertussis, dans laquelle ledit au moins antigène VRS est un analogue soluble recombiné de la protéine F et le au moins antigène de B. pertussis comprend au moins un antigène pertussique acellulaire (Pa) ou comprend un antigène à germes entiers (Pw).
  2. 2. Composition immunogène combinée selon la revendication 1, dans laquelle ledit analogue de la protéine F est un antigène PréF qui comprend au moins une modification qui stabilise la conformation pré-fusion de la protéine F.
  3. 3. Composition immunogène combinée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend dans le sens extrémité N-terminale vers extrémité C-terminale : un domaine F2 et un domaine Fi d'un polypeptide de protéine F du VRS, et un domaine de trimérisation hétérologue, sans site de clivage furine entre le domaine F2 et le domaine Fi.
  4. 4. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend au moins une modification choisie parmi : (i) une modification qui altère la glycosylation ; (ii) une modification qui élimine au moins un site de clivage non-furine ; (iii) une modification qui délète un ou plusieurs acides aminés du domaine pep27 ; et (iv) une modification de substitution ou d'addition de type acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe du domaine extracellulaire de la protéine F.
  5. 5. Composition immunogène combinée selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle le domaine F2 comprend un polypeptide de protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 26-105 et/ou le domaine Fi comprend un polypeptide de protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 137-516 du polypeptide précurseur de la protéine F de référence (Fo) de SEQ ID N0 : 2.
  6. 6. Composition immunogène combinée selon la revendication 1, dans laquelle l'analogue de la protéine F est choisi dans le groupe constitué par : i. un polypeptide comprenant un polypeptide choisi dans le groupe de SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID No:10, SEQ ID N0:18, SEQ ID No:20 et SEQ ID No:22 ; ii. un polypeptide codé par un polynucléotide choisi dans le groupe de SEQ ID No:5, SEQ ID No:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID No:17, SEQ ID No:19 et SEQ ID No:21, ou par une séquence polynucléotidique qui s'hybride dans des conditions stringentes sur pratiquement toute sa longueur à un polynucléotide choisi dans le groupe de SEQ ID No:5, SEQ ID No:7, SEQ ID No:9, SEQ ID N0 :17, SEQ ID No:19 et SEQ ID No:21, ledit polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés correspondant au moins en partie à une souche naturelle du VRS ; iii. un polypeptide présentant une identité de séquence d'au moins 95 % avec un polypeptide choisi dans le groupe de SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID No:10, SEQ ID No : 18, SEQ ID No:20 et SEQ ID No:22, ledit polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés qui ne correspond pas à une souche naturelle du VRS.
  7. 7. Composition immunogène combinée selon la revendication 1, dans laquelle ledit analogue de la protéine F comprend un domaine F2 et un domaine Fi d'un polypeptide de protéine F du VRS, le polypeptide de la protéine F comprenant au moins une modification qui altère la glycosylation.
  8. 8. Composition immunogène combinée selon la revendication 7, dans laquelle ledit analogue de protéine F comprend au moins une modification choisie parmi : (i) une addition d'une séquence d'acides aminés comprenant un domaine de trimérisation hétérologue ; (ii) une délétion d'au moins un site de clivage furine ; (iii) une délétion d'au moins un site de clivage non- furine ; (iv) une délétion d'un ou de plusieurs acides aminés du domaine pep27 ; et (v) au moins une substitution ou addition de type acide amine hydrophile dans un domaine hydrophobe du domaine extracellulaire de la protéine F.
  9. 9. Composition immunogène combinée selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle ladite au moins modification qui altère la glycosylation comprend une substitution d'un ou de plusieurs acides aminés comprenant et/ou adjacent(s) à l'acide aminé correspondant à la position 500 de SEQ ID No:2.
  10. 10. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-9, dans laquelle les acides aminés correspondant aux positions 500-502 de SEQ ID No: 2 sont choisis parmi : NGS ; NKS ; NGT ; NKT.
  11. 11. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-10, dans laquelle la modification qui altère la glycosylation comprend une substitution de glutamine à l'acide aminé correspondant à la position 500 de SEQ ID No:2.
  12. 12. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-11, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend un peptide de fusion intact entre le domaine F2 et le domaine Fi.
  13. 13. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-12, dans laquelle ladite au moins modification comprend l'addition d'une séquence d'acides aminés comprenant un domaine de trimérisation hétérologue.
  14. 14. Composition immunogène combinée selon la revendication 12, dans laquelle le domaine de trimérisation hétérologue est positionné à l'extrémité C-terminale par rapport au domaine Fi.
  15. 15. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-14, comprenant un domaine F2 et un domaine Fi sans site de clivage furine intermédiaire.
  16. 16. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-15, dans laquelle l'analogue de la protéine F s'assemble en formant un multimère, tel qu'un trimère.
  17. 17. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-16, dans laquelle le domaine F2 comprend au moins une partie d'un polypeptide de protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 26-105 du polypeptide précurseur de protéine F de référence (Fo) de SEQ ID No:2.
  18. 18. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-17, dans laquelle le domaine Fi comprend au moins une partie d'un polypeptide de protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 137-516 du polypeptide précurseur de protéine F de référence (Fo) de SEQ ID No:2.
  19. 19. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-18, dans laquelle le domaine F2 comprend un polypeptide de protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 26-105 et/ou dans laquelle le domaine Fi comprend un polypeptide de protéine F du VRS correspondant aux acides aminés 137-516 du polypeptide précurseur de protéine F de référence (Fo) de SEQ ID No:2.
  20. 20. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-19, dans laquelle l'analogue de la protéine F est choisi dans le groupe comprenant : i. un polypeptide comprenant SEQ ID No:22 ; ii. un polypeptide codé par SEQ ID No:21 ou par une séquence polynucléotidique qui s'hybride dans des conditions stringentes sur pratiquement toute sa longueur à SEQ ID No:21 ; iii. un polypeptide présentant une identité de séquence d'au moins 95 % avec SEQ ID No:22.
  21. 21. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-20, dans laquelle le domaine F2 comprend les acides aminés 1-105 du polypeptide de la protéine F du VRS.
  22. 22. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-21, dans laquelle le domaine F2 et le domaine Fi sont positionnés avec un peptide de fusion intact et sans domaine pep27 intermédiaire.
  23. 23. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 8-22, dans laquelle le domaine de trimérisation hétérologue comprend un domaine de superhélice ou comprend une glissière à isoleucine.
  24. 24. Composition immunogène combinée selon la revendication 23, dans laquelle le domaine de type glissière à isoleucine comprend la séquence d'acides aminés de SEQ ID N0:11.
  25. 25. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-24, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend au moins une substitution ou une addition du type acide aminé hydrophile dans un domaine hydrophobe du domaine extracellulaire de la protéine F.
  26. 26. Composition immunogène combinée selon la revendication 25, dans laquelle le domaine hydrophobe est le domaine en super-hélice HRB du domaine extracellulaire de la protéine F.
  27. 27. Composition immunogène combinée selon la revendication 26, dans laquelle le domaine en super-hélice HRB comprend la substitution d'un résidu neutre par un résidu chargé à la position correspondant à l'acide aminé 512 du précurseur de la protéine F de référence (Fo) of SEQ ID N0:2.
  28. 28. Composition immunogène combinée selon la revendication 27, dans laquelle le domaine en super-hélice HRB comprend la substitution de la leucine par une lysine ou glutamine à la position correspondant à l'acide aminé 512 du précurseur de la protéine F de référence (Fo) of SEQ ID N0:2.
  29. 29. Composition immunogène combinée selon la revendication 25, dans laquelle le domaine hydrophobe est le domaine HRA du domaine extracellulaire de la protéine F.
  30. 30. Composition immunogène combinée selon la revendication 29, dans laquelle le domaine HRA comprend l'addition d'un résidu chargé à la suite de la position correspondant à l'acide aminé 105 du précurseur de la protéine F de référence (Fo) of SEQ ID N0:2.
  31. 31. Composition immunogène combinée selon la revendication 30, dans laquelle le domaine HRA comprend l'addition d'une lysine à la suite de la position correspondant à l'acide aminé 105 du précurseur de la protéine F de référence (Fo) de SEQ ID N0:2.
  32. 32. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 25-31, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend au moins une première substitution ou addition de type acide aminé hydrophile dans le domaine HRA et au moins une seconde substitution ou addition de type acide aminé hydrophile dans le domaine HRB du domaine extracellulaire de la protéine F.
  33. 33. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-32, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend au moins une addition, une délétion ou une substitution d'acide aminé qui élimine un site de clivage furine présent dans un précurseur de protéine F naturel (Fo) .
  34. 34. Composition immunogène combinée selon la revendication 33, dans laquelle l'analogue de la protéine F comprend une addition, une délétion ou une substitution d'acide aminé qui élimine un site de clivage furine à une position correspondant aux acides aminés 105-109, à une position correspondant aux acides aminés 133-136, ou aux deux positions correspondant aux acides aminés 105-109 et 133-136 du précurseur de la protéine F de référence (Fo) de SEQ ID N0:2.
  35. 35. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-34, dans laquelle les domaines polypeptidiques Fi et F2 correspondent en séquence à la souche Longue du VRS A.
  36. 36. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 7-35, dans laquelle le au moins antigène du VRS comprend un multimère, tel qu'un trimère, de polypeptides.
  37. 37. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1-36, dans laquelle ledit au moins antigène Pa est choisi dans le groupe constitué par : l'anatoxine pertussique (PT), 1 ' hémagglutinine filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN), les fimbriae de type 2 (FIM2), les fimbriae de type 3 (FIM3) et BrkA.
  38. 38. Composition immunogène combinée selon la revendication 37, dans laquelle la PT est détoxifiée chimiquement, ou est détoxifiée génétiquement par exemple par une ou les deux mutations: R9K et E129G.
  39. 39. Composition immunogène combinée selon la revendication 37 ou 38, dans laquelle ledit au moins antigène Pa comprend : PT et FHA ; PT, FHA et PRN ; ou PT, FHA, PRN et soit FIM2 ou FIM3, soit les deux.
  40. 40. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, comprenant : i. 10-30 pg, par exemple exactement ou approximativement 25 pg de PT ; ii. 10-30 pg, par exemple exactement ou approximativement 25 pg de FHA.
  41. 41. Composition immunogène combinée selon la revendication 40, comprenant en outre : 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 8 pg de PRN.
  42. 42. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, comprenant : i. 10-30 pg, par exemple exactement ou approximativement 20 pg de PT ; ii. 10-30 pg, par exemple exactement ou approximativement 20 pg de FHA ; iii. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 3 pg de PRN ; et iv. 1-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 5 pg au total de FIM2 ET FIM3.
  43. 43. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, comprenant : i. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 8 pg de PT ; ii. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 8 pg de FHA ; et iii. 0,5-4 pg, par exemple exactement ou approximativement 2,5 pg de PRN.
  44. 44. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, comprenant : i. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 2,5 pg de PT ; ii. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 5 pg de FHA ; iii. 0,5-4 pg, par exemple exactement ou approximativement 3 pg de PRN ; et iv. 1-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 5 pg au total de FIM2 et FIM3.
  45. 45. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, comprenant : i. 2-5 pg, par exemple exactement ou approximativement 3,2 pg de PT ; ii. 25-40 pg, par exemple exactement ou approximativement 34,4 pg de FHA ; iii. 0,5-3 pg, par exemple exactement ou approximativement 1,6 pg de PRN ; et iv. 0,5-1 pg, par exemple exactement ou approximativement 0,8 pg de FIM2.
  46. 46. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, comprenant : i. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 8 pg de PT ; ii. 1-4 pg, par exemple exactement ou approximativement 2.5 pg de FHA ; et iii. 1-4 pg, par exemple exactement ou approximativement 2.5 pg de PRN.
  47. 47. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 36, dans laquelle ledit au moins antigène de B. pertussis comprend un antigène Pw.
  48. 48. Composition immunogène combinée selon la revendication 47, dans laquelle ledit antigène Pw a une teneur réduite en endotoxine.
  49. 49. Composition immunogène combinée selon la revendication 48, dans laquelle ladite teneur réduite en endotoxine est obtenue par extraction chimique d'un lipo-oligosaccharide (LOS), ou par manipulation génétique d'une production d'endotoxine, par exemple pour induire la surexpression ou l'expression hétérologue d'une 3-0-désacylase.
  50. 50. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 47 à 49, dans laquelle ledit antigène Pw comprend des cellules de B. pertussis comprenant au moins un LOS partiellement 3-O-désacylé.
  51. 51. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 50, comprenant en outre un véhicule ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
  52. 52. Composition immunogène combinée selon la revendication 51, dans laquelle le véhicule ou l'excipient comprend un tampon.
  53. 53. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 52, comprenant en outre au moins un adjuvant.
  54. 54. Composition immunogène combinée selon la revendication 53, dans laquelle le au moins adjuvant comprend au moins un adjuvant choisi dans le groupe comprenant : un sel d'aluminium tel qu'un hydroxyde d'aluminium ou un phosphate d'aluminium ; un phosphate de calcium ; 3D-MPL ; QS21 ; un adjuvant oligodésoxynucléotide contenant CpG ; et une émulsion huile dans l'eau.
  55. 55. Composition immunogène combinée selon la revendication 53 ou 54, dans laquelle le au moins adjuvant comprend 1'hydroxyde d'aluminium.
  56. 56. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 53 ou 54, dans laquelle le au moins adjuvant comprend une émulsion huile dans l'eau.
  57. 57. Composition immunogène combinée selon la revendication 56, dans laquelle l'émulsion huile dans l'eau comprend moins de 5 mg de squalène par dose humaine.
  58. 58. Composition immunogène combinée selon la revendication 56 ou 57, dans laquelle l'émulsion huile dans l'eau comprend un tocol.
  59. 59. Composition immunogène combinée selon la revendication 53, dans laquelle ledit adjuvant se prête à une administration à un nouveau-né ou à une femme enceinte.
  60. 60. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 52, dans laquelle la composition immunogène ne comprend pas d'adjuvant.
  61. 61. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 60, comprenant en outre au moins un antigène provenant d'un organisme pathogène autre que le VRS et B. pertussis.
  62. 62. Composition immunogène combinée selon la revendication 61, comprenant un ou plusieurs antigènes choisis dans le groupe constitué par : l'anatoxine diphtérique (D) ; l'anatoxine tétanique (T) ; l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) ; le virus de la polio inactivé (IPV) ; le saccharide capsulaire de H. influenzae type b (Hib) conjugué à une protéine porteuse ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type C conjugué à une protéine porteuse ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type Y conjugué à une protéine porteuse ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type A conjugué à une protéine porteuse ; le saccharide capsulaire de N. meningitidis type W conjugué à une protéine porteuse ; et un antigène issu de N. meningitidis type B.
  63. 63. Composition immunogène combinée selon la revendication 62, comprenant : D et T ; D, T et IPV ; D, T et HBsAg ; D, T et Hib ; D, T, IPV et HBsAg ; D, T, IPV et Hib ; D, T, HBsAg et Hib ; ou D, T, IPV, HBsAg et Hib.
  64. 64. Composition immunogène combinée selon la revendication 62 ou 63 comprenant, en plus dudit au moins antigène de VRS : i. 20-30 pg, par exemple exactement ou approximativement 25 pg de PT ; ii. 20-30 pg, par exemple exactement ou approximativement 25 pg de FHA ; iii. 1-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 3 ou 8 pg de PRN ; iv. 10-30 Lf, par exemple exactement ou approximativement 15 ou 25 Lf de D ; et v. 1-15 Lf, par exemple exactement ou approximativement 5 ou 10 Lf de T.
  65. 65. Composition immunogène combinée selon la revendication 62 ou 63 comprenant, en plus dudit au moins antigène de VRS : i. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 2,5 ou 8 pg de PT ; ii. 2-10 pg, par exemple exactement ou approximativement 5 ou 8 pg de FHA ; iii. 0,5-4 pg, ou par exemple 2-3 pg comme exactement ou approximativement 2,5 ou 3 pg de PRN ; iv. 1-10 Lf, par exemple exactement ou approximativement 2 ou 2,5 ou 9 Lf de D ; et v. 1-15 Lf, par exemple exactement ou approximativement 5 ou 10 Lf de T.
  66. 66. Composition immunogène combinée selon les revendications 40 à 46, 62 ou 65, dans laquelle le au moins antigène de VRS comprend un antigène PréF qui comprend au moins une modification qui stabilise la conformation préfusion de la protéine F.
  67. 67. Composition immunogène combinée selon la revendication 66, ne comprenant en outre aucun adjuvant, ou comprenant un adjuvant de type sel inorganique.
  68. 68. Méthode pour susciter une réponse immunitaire contre VRS et B. pertussis, comprenant l'administration à un sujet de la composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 67.
  69. 69. Méthode selon la revendication 68, dans laquelle l'administration de ladite composition suscite une réponse immunitaire spécifique du VRS sans aggraver la maladie virale après contact avec le VRS.
  70. 70. Méthode selon les revendications 68 ou 69, dans laquelle ladite réponse immunitaire est une réponse de stimulation.
  71. 71. Méthode selon l'une quelconque des revendications 69 à 70, dans laquelle la réponse immunitaire contre le VRS et B. pertussis comprend une réponse immunitaire protectrice qui réduit ou prévient l'incidence, ou réduit la gravité de l'infection par le VRS et B. pertussis et/ou réduit ou prévient l'incidence, ou réduit la gravité d'une réponse pathologique après une infection par le VRS et B. pertussis.
  72. 72. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 67 utilisable en médecine.
  73. 73. Composition immunogène combinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 67 destinée à prévenir ou à traiter chez un sujet une infection par le VRS et B. pertussis, ou une maladie associée à ceux-ci.
  74. 74. Méthode selon l'une quelconque des revendications 68-71 ou composition immunogène combinée selon les revendications 72 ou 73, dans laquelle la composition immunogène combinée est administrée, ou est destinée à être administrée, à un sujet selon un schéma monodose.
  75. 75. Méthode selon l'une quelconque des revendications 68-71 ou composition immunogène combinée selon les revendications 72 ou 73, dans laquelle le sujet est un mammifère, tel qu'un être humain, choisi dans le groupe comprenant : un nouveau-né ; un nourrisson ; un enfant ; un adolescent ; un adulte ; et une personne âgée.
  76. 76. Méthode ou composition immunogène combinée selon la revendication 75, dans laquelle le sujet est un adolescent de 10 à 18 ans et dans laquelle ladite composition immunogène combinée est administrée, ou est destinée à être administrée, une seule fois.
  77. 77. Méthode selon l'une quelconque des revendications 68-71 ou composition immunogène combinée selon les revendications 72 ou 73, dans laquelle le sujet n'est pas une femelle pleine.
  78. 78. Méthode selon l'une quelconque des revendications 68-71 ou composition immunogène combinée selon les revendications 72 ou 73, dans laquelle le sujet est éventuellement une femme enceinte portant un enfant en gestation.
  79. 79. Méthode ou composition immunogène combinée selon la revendication 78, dans laquelle ladite composition immunogène combinée est administrée, ou est destinée à être administrée, à ladite femme enceinte à raison d'une seule fois par grossesse.
  80. 80. Schéma de vaccination pour protéger un nourrisson contre l'infection ou la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis, le schéma de vaccination comprenant : l'administration à une femme enceinte portant un enfant en gestation d'au moins une composition immunogène capable de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique à la fois du VRS et de B. pertussis, ladite au moins composition immunogène comprenant un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis, dans lequel au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis suscités ou amplifiés chez la femme enceinte par ladite au moins composition immunogène sont transférés via le placenta à l'enfant en gestation, pour le protéger ainsi contre une infection ou une maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
  81. 81. Méthode destinée à protéger un nourrisson contre l'infection ou la maladie provoquée par le VRS et B. pertussis, la méthode comprenant : l'administration à une femme enceinte portant un enfant en gestation d'au moins une composition immunogène capable de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique à la fois du VRS et de B. pertussis, ladite au moins composition immunogène comprenant un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis, dans laquelle au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis suscités ou amplifiés chez la femme enceinte par ladite au moins composition immunogène sont transférés via le placenta à l'enfant en gestation, pour le protéger ainsi contre une infection ou une maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
  82. 82. Composition immunogène ou pluralité de compositions immunogènes comprenant un antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis pouvant être utilisée pour protéger un nourrisson contre une infection ou une maladie provoquée par le VRS et B. pertussis, dans laquelle la ou les compositions immunogènes est/sont formulée(s) à des fins d'administration à une femme enceinte et dans laquelle la ou les compositions immunogènes est/sont capable(s) de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique à la fois du VRS et de B. pertussis, et dans laquelle au moins un sous- ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis dont la production a été stimulée chez la femme enceinte par la ou les compositions immunogènes sont transférés par l'intermédiaire du placenta à l'enfant en gestation, pour le protéger ainsi contre une infection ou maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
  83. 83. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 0 à 82, dans lequel l'antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis sont co-formulés dans la même composition immunogène, ladite composition étant une composition immunogène combinée telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 67.
  84. 84. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 83, dans lequel ladite composition immunogène est administrée, ou est destinée à être administrée à ladite femme enceinte à raison d'une seule fois par grossesse.
  85. 85. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 82, dans lequel l'antigène recombiné du VRS comprenant un analogue de la protéine F et au moins un antigène de B. pertussis sont formulés dans des compositions immunogènes différentes.
  86. 86. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon la revendication 85, dans lequel les deux compositions immunogènes différentes sont administrées le même jour (coadministrées) .
  87. 87. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon la revendication 85, dans lequel les deux compositions immunogènes différentes sont administrées à des jours différents.
  88. 88. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 85 à 87, dans lequel l'analogue de la protéine F est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 36 et le au moins antigène de B. pertussis est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 37 à 50.
  89. 89. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 88, dans lequel ladite femelle pleine est un être humain.
  90. 90. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 89, dans lequel le nourrisson est immunologiquement immature.
  91. 91. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 90, dans lequel le nourrisson a moins de six mois.
  92. 92. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 91, dans lequel le nourrisson a moins de deux mois, par exemple moins de un mois, par exemple est un nouveau-né.
  93. 93. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 92, dans lequel le au moins sous-ensemble d'anticorps spécifiques de VRS et/ou d'anticorps spécifiques de pertussis transférés via le placenta comprend des anticorps IgG, de préférence des anticorps IgGi.
  94. 94. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 93, dans lequel le au moins sous-ensemble d'anticorps spécifiques de VRS transférés via le placenta est constitué par des anticorps neutralisants.
  95. 95. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 94, dans lequel le au moins sous-ensemble d'anticorps spécifiques de VRS est détectable à un niveau de 30 pg/mL ou plus dans le sérum du nourrisson à sa naissance.
  96. 96. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 81 à 95, dans lequel le au moins sous-ensemble d'anticorps spécifiques de pertussis est détectable à un niveau de 10 Unités ELISA/ml (EU) ou plus dans le sérum du nourrisson.
  97. 97. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 96, comprenant en outre l'administration à un nourrisson d'au moins une composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS chez le nourrisson.
  98. 98. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 97, comprenant en outre l'administration au nourrisson d'au moins une composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre B. pertussis chez le nourrisson.
  99. 99. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon la revendication 97 ou 98, comprenant l'administration au nourrisson d'au moins une composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS et· d'au moins une composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre B. pertussis.
  100. 100. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon la revendication 99, dans lequel la au moins composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS et la au moins composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre B. pertussis sont la même composition.
  101. 101. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon la revendication 99, dans lequel la au moins composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre le VRS et la au moins composition qui amorce ou induit une réponse immunitaire active contre Б. pertussis sont des compositions différentes.
  102. 102. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon la revendication 101, dans lequel les compositions différentes sont administrées le même jour ou à des jours différents.
  103. 103. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 97 à 101, dans lequel la au moins composition administrée au nourrisson comprend un antigène du VRS comprenant un analogue de la protéine F.
  104. 104. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 97 à 102, dans lequel la au moins composition administrée au nourrisson comprend un acide nucléique, un vecteur viral recombiné ou une particule de réplicon virale, ledit acide nucléique, vecteur viral recombiné ou particule de réplicon virale codant au moins pour un antigène protéique de VRS ou un analogue antigénique.
  105. 105. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 104, dans lequel la au moins composition immunogène est administrée à une femme enceinte à 26 semaines de gestation ou plus tard.
  106. 106. Schéma de vaccination, méthode ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 80 à 105, dans lequel la femme enceinte est entre 26 et 38 semaines de gestation, par exemple entre 28 et 34 semaines de gestation.
  107. 107. Kit comprenant une pluralité de compositions immunogènes formulées pour l'administration à une femme enceinte, dans lequel le kit comprend : (a) une première composition immunogène comprenant un analogue de la protéine F capable d'induire, de susciter ou de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique du VRS ; et (b) une seconde composition immunogène comprenant au moins un antigène de B. pertussis capable d'induire, de susciter ou de stimuler une réponse immunitaire humorale spécifique de B. pertussis, la première et la seconde composition immunogène induisant, suscitant ou stimulant après administration à une femme enceinte au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques du VRS et au moins un sous-ensemble d'anticorps spécifiques de B. pertussis, lesdits anticorps étant transférés via le placenta au bébé en gestation de la femme enceinte, pour le protéger ainsi contre une infection ou une maladie provoquée par le VRS et B. pertussis.
  108. 108. Kit selon la revendication 107, dans lequel l'analogue de la protéine F de la première composition immunogène est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 36.
  109. 109. Kit selon la revendication 107 ou 108, dans lequel le au moins au moins antigène de B. pertussis de la seconde composition immunogène est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 37 à 50.
  110. 110. Kit selon les revendications 107 à 109, dans lequel les caractéristique pertinentes du kit sont telles que définies pour le schéma vaccinal, la méthode ou l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 83 à 101.
  111. 111. Kit selon l'une quelconque des revendications 107 à 110, dans lequel la première composition immunogène et/ou la seconde composition immunogène sont dans au moins une seringue pré-remplie.
  112. 112. Kit selon la revendication 111, dans lequel la seringue pré-remplie est une seringue à deux compartiments.
  113. 113. Kit selon l'une quelconque des revendications 107 à 112, dans lequel les compositions respectives sont pour l'administration à ladite femme enceinte à raison d'une seule fois par grossesse.
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