JP6934860B2 - コイルドコイルコネクタ - Google Patents
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Description
国際公開第94/293332A1号は、分子内、逆平行、コイルドコイルステムループ配置で立体構造的に締め付けられているポリペプチドを記載している。ループ区分は、第1アルファらせん構造のカルボキシ末端および第2アルファらせん構造のアミノ末端の間にコネクタを含む。
複合体タンパク質分子の安定性および折り畳み構造は、免疫原のような医薬を設計する際に非常に重要である。
本発明によれば、第1および第2分子を含むらせん状コイルドコイル型構造のコネクタが提供され、特にここで、第1および第2分子のそれぞれは、ポリペプチド部分またはポリペプチド鎖を含むタンパク質性分子であり、ここで、第1分子は、ペプチド性第1アルファらせんを含み、かつ第2分子は、ペプチド性第2アルファらせんを含み、その第2アルファらせんは、第1アルファらせんに巻き付いており;
ここで、第1アルファらせんは、以下:
i)アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域;または
ii)アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるN末端領域;
を含み、ここで
aは、4〜8アミノ酸のモチーフ配列であり;
x1は、リジンであり;そして
x2は、モチーフの拡張であり、ここで、拡張は、1〜10アミノ酸からなり、かつここで、拡張は、前記のモチーフa−x1またはx1−a中に組み込まれている4個より多くの連続するアミノ酸を含まない。
具体的には、拡張は、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む。
具体的には、モチーフ配列aは、天然アミノ酸のいずれかの配列からなる。好ましくは、モチーフ配列は、モチーフリピートにおける疎水性残基の周期性およびアルファらせんの傾向を確実にするために少なくとも1個の疎水性アミノ酸を含む。
特定の態様によれば、第1および第2アルファらせんは、巻き付いてコイルドコイル(換言すると、集合した)二重らせんになっている。
a)モチーフa−x1は、SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 5、およびSEQ ID 7からなる群から選択され;または
b)モチーフx1−aは、SEQ ID 2、SEQ ID 4、SEQ ID 6、およびSEQ ID 8からなる群から選択される。
特定の例によれば、
a)モチーフa−x1は、SEQ ID 1であり、モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 41、SEQ ID 69、もしくはSEQ ID 71のいずれかであり、そのモチーフa−x1−x2は、場合により(例えばカルボキシル末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
b)モチーフa−x1は、SEQ ID 3であり、モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 43、SEQ ID 85、もしくはSEQ ID 87のいずれかであり、そのモチーフa−x1−x2は、場合により(例えばカルボキシル末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
c)モチーフa−x1は、SEQ ID 5であり、モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 45、SEQ ID 101、もしくはSEQ ID 103のいずれかであり、そのモチーフa−x1−x2は、場合により(例えばカルボキシル末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
d)モチーフa−x1は、SEQ ID 7であり、モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 47、SEQ ID 117、もしくはSEQ ID 119のいずれかであり、そのモチーフa−x1−x2は、場合により(例えばカルボキシル末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
e)モチーフx1−aは、SEQ ID 2であり、モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 42、SEQ ID 77、もしくはSEQ ID 79のいずれかであり、そのモチーフx2−x1−aは、場合により(例えばアミノ末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
f)モチーフx1−aは、SEQ ID 4であり、モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 44、SEQ ID 93、もしくはSEQ ID 95のいずれかであり、そのモチーフx2−x1−aは、場合により(例えばアミノ末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
g)モチーフx1−aは、SEQ ID 6であり、モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 46、SEQ ID 109、もしくはSEQ ID 111のいずれかであり、そのモチーフx2−x1−aは、場合により(例えばアミノ末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
h)モチーフx1−aは、SEQ ID 8であり、モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 48、SEQ ID 125、もしくはSEQ ID 127のいずれかであり、そのモチーフx2−x1−aは、場合により(例えばアミノ末端において)1個以上のアミノ酸により拡張されている。
a)第1アルファらせんは、モチーフa−x1を含み、かつ第2アルファらせんは、モチーフx1−aを含み;または
b)第1アルファらせんは、モチーフx1−aを含み、かつ第2アルファらせんは、モチーフa−x1を含み;
好ましくはここで、モチーフa−x1を含むアルファらせんは、さらにC末端モチーフa−x1−x2を含み、かつモチーフx1−aを含むアルファらせんは、さらにN末端モチーフx2−x1−aを含む。
a)
i)モチーフa−x1は、SEQ ID 1であり;
ii)モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 41、SEQ ID 69、もしくはSEQ ID 71のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aは、SEQ ID 2であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 42、SEQ ID 77、もしくはSEQ ID 79のいずれかであり;
または
b)
i)モチーフa−x1は、SEQ ID 3であり;
ii)モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 43、SEQ ID 85、もしくはSEQ ID 87のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aは、SEQ ID 4であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 44、SEQ ID 93、もしくはSEQ ID 95のいずれかであり;
または
c)
i)モチーフa−x1は、SEQ ID 5であり;
ii)モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 45、SEQ ID 101、もしくはSEQ ID 103のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aは、SEQ ID 6であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 46、SEQ ID 109、もしくはSEQ ID 111のいずれかであり;
または
d)
i)モチーフa−x1は、SEQ ID 7であり;
ii)モチーフa−x1−x2は、SEQ ID 47、SEQ ID 117、もしくはSEQ ID 119のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aは、SEQ ID 8であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aは、SEQ ID 48、SEQ ID 125、もしくはSEQ ID 127のいずれかである。
i)SEQ ID 10、SEQ ID 68、もしくはSEQ ID 70のいずれか;
ii)SEQ ID 12、SEQ ID 72、もしくはSEQ ID 73のいずれか;
iii)SEQ ID 53、SEQ ID 74、もしくはSEQ ID 75のいずれか;
iv)SEQ ID 14、SEQ ID 76、もしくはSEQ ID 78のいずれか;
v)SEQ ID 16、SEQ ID 80、もしくはSEQ ID 81のいずれか;
vi)SEQ ID 55、SEQ ID 82、もしくはSEQ ID 83のいずれか;
vii)SEQ ID 18、SEQ ID 84、もしくはSEQ ID 86のいずれか;
viii)SEQ ID 20、SEQ ID 88、もしくはSEQ ID 89のいずれか;
ix)SEQ ID 57、SEQ ID 90、もしくはSEQ ID 91のいずれか;
x)SEQ ID 22、SEQ ID 92、もしくはSEQ ID 94のいずれか;
xi)SEQ ID 24、SEQ ID 96、もしくはSEQ ID 97のいずれか;
xii)SEQ ID 59、SEQ ID 98、もしくはSEQ ID 99のいずれか;
xiii)SEQ ID 26、SEQ ID 100、もしくはSEQ ID 102のいずれか;
xiv)SEQ ID 28、SEQ ID 104、もしくはSEQ ID 105のいずれか;
xv)SEQ ID 61、SEQ ID 106、もしくはSEQ ID 107のいずれか;
xvi)SEQ ID 30、SEQ ID 108、もしくはSEQ ID 110のいずれか;
xvii)SEQ ID 32、SEQ ID 112、もしくはSEQ ID 113のいずれか;
xviii)SEQ ID 63、SEQ ID 114、もしくはSEQ ID 115のいずれか;
xix)SEQ ID 34、SEQ ID 116、もしくはSEQ ID 118のいずれか;
xx)SEQ ID 36、SEQ ID 120、もしくはSEQ ID 121のいずれか;
xxi)SEQ ID 65、SEQ ID 122、もしくはSEQ ID 123のいずれか;
xxii)SEQ ID 38、SEQ ID 124、もしくはSEQ ID 126のいずれか;
xxiii)SEQ ID 40、SEQ ID 128、もしくはSEQ ID 129のいずれか;または
xxiv)SEQ ID 67、SEQ ID 130、もしくはSEQ ID 131のいずれか。
i)第1アルファらせんは、SEQ ID 10、SEQ ID 68、もしくはSEQ ID 70のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 10、SEQ ID 68、もしくはSEQ ID 70のいずれかからなり;かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 9を含み、もしくはSEQ ID 9からなり;
ii)第1アルファらせんは、SEQ ID 12、SEQ ID 72、もしくはSEQ ID 73のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 12、SEQ ID 72、もしくはSEQ ID 73のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 11を含み、もしくはSEQ ID 11からなり;
iii)第1アルファらせんは、SEQ ID 53、SEQ ID 74、もしくはSEQ ID 75のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 53、SEQ ID 74、もしくはSEQ ID 75のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 52を含み、もしくはSEQ ID 52からなり;
iv)第1アルファらせんは、SEQ ID 14、SEQ ID 76、もしくはSEQ ID 78のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 14、SEQ ID 76、もしくはSEQ ID 78のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 13を含み、もしくはSEQ ID 13からなり;
v)第1アルファらせんは、SEQ ID 16、SEQ ID 80、もしくはSEQ ID 81のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 16、SEQ ID 80、もしくはSEQ ID 81のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 15を含み、もしくはSEQ ID 15からなり;
vi)第1アルファらせんは、SEQ ID 55、SEQ ID 82、もしくはSEQ ID 83のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 55、SEQ ID 82、もしくはSEQ ID 83のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 54を含み、もしくはSEQ ID 54からなり;
vii)第1アルファらせんは、SEQ ID 18、SEQ ID 84、もしくはSEQ ID 86のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 18、SEQ ID 84、もしくはSEQ ID 86のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 17を含み、もしくはSEQ ID 17からなり;
viii)第1アルファらせんは、SEQ ID 20、SEQ ID 88、もしくはSEQ ID 89のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 20、SEQ ID 88、もしくはSEQ ID 89のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 19を含み、もしくはSEQ ID 19からなり;
ix)第1アルファらせんは、SEQ ID 57、SEQ ID 90、もしくはSEQ ID 91のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 57、SEQ ID 90、もしくはSEQ ID 91のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 56を含み、もしくはSEQ ID 56からなり;
x)第1アルファらせんは、SEQ ID 22、SEQ ID 92、もしくはSEQ ID 94のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 22、SEQ ID 92、もしくはSEQ ID 94のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 21を含み、もしくはSEQ ID 21からなり;
xi)第1アルファらせんは、SEQ ID 24、SEQ ID 96、もしくはSEQ ID 97のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 24、SEQ ID 96、もしくはSEQ ID 97のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 23を含み、もしくはSEQ ID 23からなり;
xii)第1アルファらせんは、SEQ ID 59、SEQ ID 98、もしくはSEQ ID 99のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 59、SEQ ID 98、もしくはSEQ ID 99のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 58を含み、もしくはSEQ ID 58からなり;
xiii)第1アルファらせんは、SEQ ID 26、SEQ ID 100、もしくはSEQ ID 102のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 26、SEQ ID 100、もしくはSEQ ID 102のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 25を含み、もしくはSEQ ID 25からなり;
xiv)第1アルファらせんは、SEQ ID 28、SEQ ID 104、もしくはSEQ ID 105のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 28、SEQ ID 104、もしくはSEQ ID 105のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 27を含み、もしくはSEQ ID 27からなり;
xv)第1アルファらせんは、SEQ ID 61、SEQ ID 106、もしくはSEQ ID 107のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 61、SEQ ID 106、もしくはSEQ ID 107のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 60を含み、もしくはSEQ ID 60からなり;
xvi)第1アルファらせんは、SEQ ID 30、SEQ ID 108、もしくはSEQ ID 110のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 30、SEQ ID 108、もしくはSEQ ID 110のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 29を含み、もしくはSEQ ID 29からなり;
xvii)第1アルファらせんは、SEQ ID 32、SEQ ID 112、もしくはSEQ ID 113のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 32、SEQ ID 112、もしくはSEQ ID 113のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 31を含み、もしくはSEQ ID 31からなり;
xviii)第1アルファらせんは、SEQ ID 63、SEQ ID 114、もしくはSEQ ID 115のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 63、SEQ ID 114、もしくはSEQ ID 115のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 62を含み、もしくはSEQ ID 62からなり;
xix)第1アルファらせんは、SEQ ID 34、SEQ ID 116、もしくはSEQ ID 118のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 34、SEQ ID 116、もしくはSEQ ID 118のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 33を含み、もしくはSEQ ID 33からなり;
xx)第1アルファらせんは、SEQ ID 36、SEQ ID 120、もしくはSEQ ID 121のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 36、SEQ ID 120、もしくはSEQ ID 121のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 35を含み、もしくはSEQ ID 35からなり;
xxi)第1アルファらせんは、SEQ ID 65、SEQ ID 122、もしくはSEQ ID 123のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 65、SEQ ID 122、もしくはSEQ ID 123のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 64を含み、もしくはSEQ ID 64からなり;
xxii)第1アルファらせんは、SEQ ID 38、SEQ ID 124、もしくはSEQ ID 126のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 38、SEQ ID 124、もしくはSEQ ID 126のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 37を含み、もしくはSEQ ID 37からなり;
xxiii)第1アルファらせんは、SEQ ID 40、SEQ ID 128、もしくはSEQ ID 129のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 40、SEQ ID 128、もしくはSEQ ID 129のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 39を含み、もしくはSEQ ID 39からなり;または
xxiv)第1アルファらせんは、SEQ ID 67、SEQ ID 130、もしくはSEQ ID 131のいずれかを含み、もしくはSEQ ID 67、SEQ ID 130、もしくはSEQ ID 131のいずれかからなり、かつ第2アルファらせんは、SEQ ID 66を含み、もしくはSEQ ID 66からなる。
特定の例によれば、平行集合体において、第1アルファらせんのC末端領域は、第2アルファらせんのC末端領域に集合しており;または、第1アルファらせんのN末端領域は、第2アルファらせんのN末端領域に集合している。連結している鎖がアミノ酸配列に融合している場合、両方の鎖は、アルファらせんをC末端ドメインとして含むことができ、または両方の鎖は、アルファらせんをN末端ドメインとして含むことができる。
a)拡張は、リジンを含まず、かつ/または
b)アルファらせんの末端領域に続くアミノ酸は、リジンではなく、かつ/または
c)C末端アミノ酸は、リジンではない。
a)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖は、第2アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはC末端領域中に組み込んでおり;または
b)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖は、第2アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはN末端領域中に組み込んでおり、または
c)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるN末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖は、第2アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはN末端領域中に組み込んでおり;または
d)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖は、第2アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはC末端領域中に組み込んでいる。
a)ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素;
b)2個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも1個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体または抗体形式;
c)抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体、ここで、抗体の少なくとも1個のポリペプチド鎖は、構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくはここで、構成要素は、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである;ならびに
d)親和性物質、ここで、受容体またはリガンドは、受容体特異的リガンドの精製のために、またはリガンドの異なるバリアントの親和性を試験するためにキャリヤー、例えば固相に連結されている。
a)第1ポリペプチド鎖をコードする第1異種核酸を組み込んでいる第1宿主細胞を提供し;
b)第2ポリペプチド鎖をコードする第2異種核酸を組み込んでいる第2宿主細胞を提供し;
c)前記の宿主細胞を前記の第1および第2ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し;そして
d)前記の第1および第2ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する;
を含む、本明細書で記載されるタンパク質を生成する方法を提供し、好ましくはここで、第1および/または第2宿主細胞は、哺乳類または酵母宿主細胞である。
特定の側面によれば、方法は、以下の工程:
a)以下:
(i)第1ポリペプチド鎖をコードする第1異種核酸;
および
(ii)第2ポリペプチド鎖をコードする第2異種核酸;
を組み込んでいる宿主細胞を提供し;
b)前記の宿主細胞を、前記の第1および第2ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し;そして
c)前記の第1および第2ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する;
を含み、好ましくはここで、宿主細胞は、哺乳類または酵母宿主細胞である。
用語“コイル”は、本明細書で用いられる際、ペプチド性アルファらせんの少なくとも一部であるアミノ酸配列および三次元構造からなるモチーフを意味するものとする。コイルリピートは、ペプチド性アルファらせんを構成することができる。そのようなコイルリピートは、同一のモチーフの、または異なる(例えばバリアント)モチーフのリピートを含むことができ、それは、合致するモチーフを認識して少なくとも2個のペプチド性アルファらせんを高い親和性で集合させることにより機能性である。
“中性”アミノ酸が、それらのそれぞれの3文字および1文字コードならびに極性と一緒に下記で示されている:
アラニン:(Ala、A)非極性、中性;
アスパラギン:(Asn、N)極性、中性;
システイン:(Cys、C)非極性、中性;
グルタミン:(Gln、Q)極性、中性;
グリシン:(Gly、G)非極性、中性;
イソロイシン:(Ile、I)非極性、中性;
ロイシン:(Leu、L)非極性、中性;
メチオニン:(Met、M)非極性、中性;
フェニルアラニン:(Phe、F)非極性、中性;
プロリン:(Pro、P)非極性、中性;
セリン:(Ser、S)極性、中性;
スレオニン:(Thr、T)極性、中性;
トリプトファン:(Trp、W)非極性、中性;
チロシン:(Tyr、Y)極性、中性;
バリン:(Val、V)非極性、中性;および
ヒスチジン:(His、H)極性、陽性(10%) 中性(90%)。
アルギニン:(Arg、R)極性、陽性;および
リジン:(Lys、K)極性、陽性。
アスパラギン酸:(Asp、D)極性、陰性;および
グルタミン酸:(Glu、E)極性、陰性。
用語“免疫原”は、本明細書において用いられる際、対象において免疫反応を誘発する1種類以上の抗原を意味するものとする。用語“抗原”は、本明細書において用いられる際、特に抗体の結合部位によりおそらく認識され得る、またはHLAクラスIもしくはクラスII分子のペプチド溝に結合することができ、それ自体が特定のT細胞に関する刺激因子の役目を果たすことができるあらゆる抗原決定基を指すものとする。標的抗原は、標的分子全体として認識されるか、または免疫学的に関連する、すなわちやはり天然もしくはモノクローナル抗体により認識可能であるそのような分子の断片、特に部分構造、例えば標的のポリペプチドもしくは炭水化物構造(一般に“エピトープ”、例えばB細胞エピトープ、T細胞エピトープと呼ばれる)として認識されるかのどちらでもよい。本明細書において、T細胞エピトープの使用が、例えばアレルギーワクチンを提供するために好ましい。
10、11、12または13アミノ酸を含むであろう。ペプチドの長さに対する決定的な上限は存在せず、それは、タンパク質のポリペプチド配列のほぼ完全長を含むことができるであろう。エピトープは、線状エピトープであることも立体構造エピトープであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一の区分で構成されている。線状エピトープは、連続している、または重複していることができる。立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて3次構造を形成することにより一緒になったアミノ酸または炭水化物で構成され、そのアミノ酸は、線状配列において必ずしも互いに隣接していない。具体的には、エピトープは、診断的に関連する分子の少なくとも一部であり、すなわち、試料中のエピトープの非存在または存在は、疾患に対して、または患者の健康状態に対して、または製造における進行状況に対して、または環境および食品の状態に対して定性的または定量的に相関している。エピトープは、療法的に関連する分子、すなわち疾患の過程を変化させる特異的結合ドメインにより標的とされることができる分子の少なくとも一部であることもできる。
高められたTh1免疫反応は、Th1免疫反応と関係するサイトカイン類の1種類以上(例えばIFNγ)における増大および活性化されたマクロファージにおける増大を含み得る。
例えば、免疫原性組成物、すなわちアジュバント構成要素、例えばTLR9リガンドおよび第1ペプチド性アルファらせんに連結された抗CD32部分(例えばそれぞれが特異的にCD32を認識するペプチド、または抗体、抗体の抗原結合部位を含む抗体フラグメントもしくは構築物)、ならびに例えば第1アルファらせんに合致する第2ペプチド性アルファらせんに連結されたペプチド免疫原を含む免疫原構成要素を含むワクチンが、提供されることができる。そのような免疫原性組成物の特定の例が、国際公開第2014009209A2号において開示されている。
用語“抗体”は、本明細書において用いられる際、リンカー配列を有する、または有しない免疫グロブリンの重鎖および/または軽鎖の定常および/または可変ドメインとして理解されている抗体ドメインからなる、または抗体ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。ポリペプチドは、ループ配列により連結された抗体ドメイン構造の少なくとも2個のベータストランドからなるベータバレル構造を含む場合、抗体ドメインとして理解されている。抗体ドメインは、天然構造のものであることができ、または例えば抗原結合特性もしくはいずれかの他の特性、例えば安定性もしくは機能的特性、例えばFc受容体FcRnおよび/もしくはFcガンマ受容体への結合を改変するために変異誘発もしくは誘導体化により改変されていることもできる。
用語“キメラ”は、抗体に関して用いられる際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が特定の種由来の、または特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同性であり、一方で鎖の残りの区分が別の種またはクラスにおける対応する配列に相同性である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳類のある種由来の抗体の可変領域を真似ており、一方で定常部分は、別の種由来の抗体の配列に相同性である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域との組み合わせで、非ヒト宿主生物からの容易に入手可能なB細胞またはハイブリドーマを用いて現在既知の種に由来することができる。
用語“ヒト化”は、抗体に関して用いられる際、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子であって、その分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づいている分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインを含むか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域(CDR)のみを含むかのどちらであることもできる。抗原結合部位は、野生型であることができ、または例えば1個以上のアミノ酸置換により改変されている、好ましくはヒト免疫グロブリンにより近く似るように改変されていることもできる。ヒト化抗体の一部の形態は、全てのCDR配列を保持している(例えばマウス抗体からの6個のCDR全部を含有するヒト化マウス抗体)。他の形態は、元の抗体に関して変更されている1個以上のCDRを有する。
用語“ヒト”は、抗体に関して用いられる際、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むことが理解されている。本発明のヒト抗体は、例えばCDR中にヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基を含むことができる(例えばインビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入された変異)。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または1種類以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から単離された抗体を含む。
本明細書で記載される核酸に関して、用語“単離された核酸”が、時々用いられる。この用語は、DNAに適用される場合、それが由来する生物の天然存在ゲノム中ですぐ近くに隣接している配列から分離されているDNA分子を指す。例えば、“単離された核酸”は、ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクター中に挿入された、または原核もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムDNA中に組み込まれたDNA分子を含むことができる。RNAに適用される場合、用語“単離された核酸”は、主に上記で定義された単離されたDNA分子によりコードされるRNA分子を指す。あるいは、その用語は、それがその天然の状態において(すなわち細胞または組織中で)会合しているであろう他の核酸から十分に分離されているRNA分子を指すことができる。“単離された核酸”(DNAまたはRNAのどちらでもよい)は、さらに生物学的または合成的手段により直接生成され、その生成の間に存在する他の構成要素から分離された分子を表すことができる。
従って、本発明は、特に向上したコネクタドメインおよびポリペプチド鎖がそのような向上したコネクタを用いて互いに連結されている向上した多量体タンパク質を提供する。
免疫原性組成物は、国際公開第2014009209A2号に従って調製される。従って、ScFV−coil1が、弾頭の調製のための基礎である。ScFV−coil1分子を弾頭分子に変換するため、CpGオリゴヌクレオチド(TLR9結合剤)が、ScFV−coil1タンパク質骨格中の“Lys”アミノ酸にカップリングされる。
しかし、質量分析での分析は、哺乳類細胞中で生成されたScFV−coil1分子の約40%においてLys(289)が切断されたことを示しており(図4a)、これは、以前にHarris (1995. Processing of C-terminal lysine and arginine residues of proteins isolated from mammalian cell culture. J.Chromatogr.A 705:129-134)により記載されている現象である。しかし、昆虫細胞中で生成されたScFV−coil1は、分子の100%がLys(289)を含有していたため、この現象を示さなかった(図4b)。ScFV−coil1中のLys分子は、CpG分子のカップリングに関する標的であり、従って免疫原性構築物におけるScFV−coil1の完全な機能性に関して重要である。
Alaを配列のC’末端に追加することにより(ScFV−coil1ala、図2)、Lys(289)が効果的に保護された。HEK293細胞中またはCHO細胞中で生成されたScFV−coil1alaの質量分析は、100%完全長のScFV−coil1alaを示した(図4c)。同じことが、GlyまたはSerがC’末端に追加された場合にも当てはまった(データは示されていない)。
精製されたScFV−coil1バリアントは、質量分布に関してWaters 3100質量検出器上で製造業者の指示に従って分析された。質量スペクトルは、陽イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン化(ESI−MS)により獲得された。質量スペクトルは、プログラムMaxEnt v.4.1(Waters)によりデコンボリューションされた。
図4Aにおいて示されているように、組み換えHEK293細胞中で生成されたscFV−coil1に関して、見付かったMWは30755.5 Da(総物質の約60%)および30630 Da(総物質の約40%)であり、それは予想MWからLys(289)を減算したものに相当する。
図4Cにおいて示されているように、組み換えHEK293細胞中で生成された(実施例1に従って得られた)scFV−coil1alaに関して、見付かったMWは30831.0 Daであり、これは完全長タンパク質を示している。
pepKに関するScFV−coil1の異なるバージョンのC末端に対する大腸菌の親和性が、Octet QK機器上でバイオレイヤー干渉法により決定された。この目的に関して、ストレプトアビジンバイオセンサーにビオチン化されたpepKが装填され、非特異的結合に関する表面のブロッキング後、会合および解離速度が、ScFV−coil1タンパク質に関して測定された。異なるタンパク質濃度により得られた結合曲線から、親和性が計算された。明確にするため、1つの濃度のみがグラフ中に示されている。組み換えHEK細胞から得られた(実施例1に従って得られた)ScFV−coil1alaに関して8.7pM、組み換えS2昆虫細胞から得られたScFV−coil1に関して15.8pM、および組み換えHEK細胞中から得られたScFV−coil1に関して32.5pMのKD値が、計算された。最低の親和性は、分子の約40%におけるLys 289の欠失を示している(図4A)HEK細胞由来のScFV−coil1に関して見出される。完全な本来の配列を含有する昆虫細胞からの物質(図4B)は、中程度の親和性を示し、一方でScFV−coil1ala(図4C)は、意外にも最高の親和性を示している(図5参照)。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
[態様1]第1および第2分子を連結するらせん状コイルドコイル型構造のコネクタであって、該第1分子が、ペプチド性第1アルファらせんを含み、該第2分子が、ペプチド性第2アルファらせんを含み、その第2アルファらせんが、該第1アルファらせんに巻き付いており;
ここで、該第1アルファらせんは、以下:
i)アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域;または
ii)アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるN末端領域;
を含み、ここで
aは、4〜8アミノ酸のモチーフ配列であり;
x1は、リジンであり;そして
x2は、モチーフの拡張であり、ここで、該拡張は、1〜10アミノ酸からなり、かつここで、該拡張は、前記のモチーフa−x1またはx1−a中に組み込まれている4個より多くの連続するアミノ酸を含まない、上記コネクタ。
[態様2]拡張が、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む、態様1に記載のコネクタ。
[態様3]拡張が、アルファらせんを拡張する最初の1〜4アミノ酸内に前記の選択されたアミノ酸を含む、態様2に記載のコネクタ。
[態様4]第1および第2アルファらせんのそれぞれが、2〜9個、好ましくは3〜5個の合致するアミノ酸モチーフのリピートを含み、好ましくは該リピートが、同一のモチーフの、または互いに少なくとも1アミノ酸異なるモチーフのリピートである、態様1〜3のいずれかに記載のコネクタ。
[態様5]らせん状コイルドコイル型構造中に、合致するアミノ酸リピート配列を有する2〜7個のアルファらせんの束を含む、態様1〜4のいずれかに記載のコネクタ。
[態様6]第1および第2アルファらせんが、平行または逆平行アルファらせんであり、好ましくは第1および第2アルファらせんが、巻き付いてコイルドコイル2重らせんになっている、態様1〜5のいずれかに記載のコネクタ。
[態様7]ヘテロ2量体性コイルドコイルを含み、第1アルファらせんが、第2アルファらせんと異なっている、態様1〜6のいずれかに記載のコネクタ。
[態様8]a)モチーフa−x1が、SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 5、およびSEQ ID 7からなる群から選択され;または
b)モチーフx1−aが、SEQ ID 2、SEQ ID 4、SEQ ID 6、およびSEQ ID 8からなる群から選択される、
態様1〜7のいずれかに記載のコネクタ。
[態様9]a)モチーフa−x1が、SEQ ID 1であり、かつモチーフa−x1−x2が、SEQ ID 41、SEQ ID 69、もしくはSEQ ID 71のいずれかであり、該モチーフa−x1−x2が、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
b)モチーフa−x1が、SEQ ID 3であり、かつモチーフa−x1−x2が、SEQ ID 43、SEQ ID 85、もしくはSEQ ID 87のいずれかであり、該モチーフa−x1−x2が、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
c)モチーフa−x1が、SEQ ID 5であり、かつモチーフa−x1−x2が、SEQ ID 45、SEQ ID 101、もしくはSEQ ID 103のいずれかであり、該モチーフa−x1−x2が、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
d)モチーフa−x1が、SEQ ID 7であり、かつモチーフa−x1−x2が、SEQ ID 47、SEQ ID 117、もしくはSEQ ID 119のいずれかであり、該モチーフa−x1−x2が、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
e)モチーフx1−aが、SEQ ID 2であり、かつモチーフx2−x1−aが、SEQ ID 42、SEQ ID 77、もしくはSEQ ID 79のいずれかであり、該モチーフx2−x1−aが、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
f)モチーフx1−aが、SEQ ID 4であり、かつモチーフx2−x1−aが、SEQ ID 44、SEQ ID 93、もしくはSEQ ID 95のいずれかであり、該モチーフx2−x1−aが、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
g)モチーフx1−aが、SEQ ID 6であり、かつモチーフx2−x1−aが、SEQ ID 46、SEQ ID 109、もしくはSEQ ID 111のいずれかであり、該モチーフx2−x1−aが、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されており;または
h)モチーフx1−aが、SEQ ID 8であり、かつモチーフx2−x1−aが、SEQ ID 48、SEQ ID 125、もしくはSEQ ID 127のいずれかであり、該モチーフx2−x1−aが、場合により1個以上のアミノ酸により拡張されている、
態様1〜8のいずれかに記載のコネクタ。
[態様10]a)第1アルファらせんがモチーフa−x1を含み、かつ第2アルファらせんがモチーフx1−aを含み;または
b)第1アルファらせんがモチーフx1−aを含み、かつ第2アルファらせんがモチーフa−x1を含み;
好ましくは、モチーフa−x1を含むアルファらせんがC末端モチーフa−x1−x2をさらに含み、かつモチーフx1−aを含むアルファらせんがN末端モチーフx2−x1−aをさらに含む、態様1〜9のいずれかに記載のコネクタ。
[態様11]a)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID 1であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID 41、SEQ ID 69、もしくはSEQ ID 71のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID 2であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID 42、SEQ ID 77、もしくはSEQ ID 79のいずれかであり;
または
b)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID 3であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID 43、SEQ ID 85、もしくはSEQ ID 87のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID 4であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID 44、SEQ ID 93、もしくはSEQ ID 95のいずれかであり;
または
c)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID 5であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID 45、SEQ ID 101、もしくはSEQ ID 103のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID 6であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID 46、SEQ ID 109、もしくはSEQ ID 111のいずれかであり;
または
d)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID 7であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID 47、SEQ ID 117、もしくはSEQ ID 119のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID 8であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID 48、SEQ ID 125、もしくはSEQ ID 127のいずれかである、
態様9に記載のコネクタ。
[態様12]X2が、1個のアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、またはセリンのいずれかからなる、態様1〜11のいずれかに記載のコネクタ。
[態様13]態様1〜12のいずれかに記載のコネクタにより互いに連結された少なくとも2個のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であって、第1ポリペプチド鎖が第1アルファらせんを組み込んでおり、かつ第2ポリペプチド鎖が第2アルファらせんを組み込んでおり;かつ第1および第2ポリペプチド鎖が第1および第2アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されており、好ましくは該タンパク質が、以下:
a)ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素;
b)2個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも1個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体または抗体形式;
c)抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体であって、ここで、該抗体の少なくとも1個のポリペプチド鎖が、該構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくは該構成要素が、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである;ならびに
d)受容体またはリガンドが、キャリヤーに連結されている親和性物質;
からなる群から選択される、
上記多量体タンパク質。
[態様14]a)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはC末端領域中に組み込んでおり;または
b)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはN末端領域中に組み込んでおり、または
c)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるN末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはN末端領域中に組み込んでおり;または
d)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはC末端領域中に組み込んでいる、
態様13に記載のタンパク質。
[態様15]態様13または14に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程:
a)第1ポリペプチド鎖をコードする第1異種核酸を組み込んでいる第1宿主細胞を提供し;
b)第2ポリペプチド鎖をコードする第2異種核酸を組み込んでいる第2宿主細胞を提供し;
c)宿主細胞を、第1および第2ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し;そして
d)第1および第2ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する;
を含み、好ましくは該第1および/または第2宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
[態様16]態様13または14に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程:
a)以下:
(i)第1ポリペプチド鎖をコードする第1異種核酸;
および
(ii)第2ポリペプチド鎖をコードする第2異種核酸;
を組み込んでいる宿主細胞を提供し;
b)宿主細胞を、第1および第2ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し;そして
c)第1および第2ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する;
を含み、好ましくは該宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
[態様17]態様15または16に記載の方法により得ることができるタンパク質の調製物であって、該タンパク質分子の少なくとも90%が、第1および第2核酸によりコードされるポリペプチド鎖の正しいC末端およびN末端領域を含む、上記調製物。
Claims (15)
- ペプチド性第1アルファらせんおよび該第1アルファらせんに巻き付いているペプチド性第2アルファらせんを含むらせん状コイルドコイル型構造のコネクタであって、
ポリペプチド鎖が、ペプチド性第1アルファらせんのN末端またはC末端に融合し、
i)該ポリペプチド鎖がペプチド性第1アルファらせんのN末端に融合する場合、該第1アルファらせんは、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなり、かつ該第2アルファらせんは、アミノ酸モチーフのリピートからなり;または
ii)該ポリペプチド鎖がペプチド性第1アルファらせんのC末端に融合する場合、該第1アルファらせんは、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなり、かつ該第2アルファらせんは、アミノ酸モチーフのリピートからなり;
ここで
aは、4〜8アミノ酸のモチーフ配列であり;
x1は、リジンであり;そして
x2は、モチーフの拡張であり、ここで、該拡張は、1〜2アミノ酸からなり、かつ
a)モチーフa−x1は、SEQ ID NO:1であり、かつモチーフa−x1−x2は、
a1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってC末端において拡張されている、SEQ ID NO:1からなるモチーフa−x1の拡張であり;もしくは
a2)SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:69、もしくはSEQ ID NO:71のいずれかであり;または
b)モチーフa−x1は、SEQ ID NO:3であり、かつモチーフa−x1−x2は、
b1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってC末端において拡張されている、SEQ ID NO:3からなるモチーフa−x1の拡張であり;もしくは
b2)SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:85、もしくはSEQ ID NO:87のいずれかであり;または
c)モチーフa−x1は、SEQ ID NO:5であり、かつモチーフa−x1−x2は、
c1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってC末端において拡張されている、SEQ ID NO:5からなるモチーフa−x1の拡張であり;もしくは
c2)SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:101、もしくはSEQ ID
NO:103のいずれかであり;または
d)モチーフa−x1は、SEQ ID NO:7であり、かつモチーフa−x1−x2は、
d1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってC末端において拡張されている、SEQ ID NO:7からなるモチーフa−x1の拡張であり;もしくは
d2)SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:117、もしくはSEQ ID
NO:119のいずれかであり;または
e)モチーフx1−aは、SEQ ID NO:2であり、かつモチーフx2−x1−aは、
e1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってN末端において拡張されている、SEQ ID NO:2からなるモチーフx1−aの拡張であり;もしくは
e2)SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:77、もしくはSEQ ID NO:79のいずれかであり;または
f)モチーフx1−aは、SEQ ID NO:4であり、かつモチーフx2−x1−aは、
f1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってN末端において拡張されている、SEQ ID NO:4からなるモチーフx1−aの拡張であり;もしくは
f2)SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:93、もしくはSEQ ID NO:95のいずれかであり;または
g)モチーフx1−aは、SEQ ID NO:6であり、かつモチーフx2−x1−aは、
g1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってN末端において拡張されている、SEQ ID NO:6からなるモチーフx1−aの拡張であり;もしくは
g2)SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:109、もしくはSEQ ID
NO:111のいずれかであり;または
h)モチーフx1−aは、SEQ ID NO:8であり、かつモチーフx2−x1−aは、
h1)1〜2個のアミノ酸からなる拡張であるx2によってN末端において拡張されている、SEQ ID NO:8からなるモチーフx1−aの拡張であり;もしくは
h2)SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:125、もしくはSEQ ID
NO:127のいずれかである、
上記コネクタ。 - x2が、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む、請求項1に記載のコネクタ。
- x2が、アルファらせんを拡張する最初のアミノ酸として、前記の選択されたアミノ酸を含む、請求項2に記載のコネクタ。
- 第1および第2アルファらせんのそれぞれが、2〜9個、好ましくは3〜5個の合致するアミノ酸モチーフのリピートを含み、好ましくは該リピートが、同一のモチーフの、または互いに少なくとも1アミノ酸異なるモチーフのリピートである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のコネクタ。
- らせん状コイルドコイル型構造中に、合致するアミノ酸リピート配列を有する2〜7個のアルファらせんの束を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のコネクタ。
- 第1および第2アルファらせんが、平行または逆平行アルファらせんであり、好ましくは第1および第2アルファらせんが、巻き付いてコイルドコイル2重らせんになっている、請求項1〜5のいずれか1項に記載のコネクタ。
- ヘテロ2量体性コイルドコイルを含み、第1アルファらせんが、第2アルファらせんと異なっている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のコネクタ。
- a)第1アルファらせんがモチーフa−x1を含み、かつ第2アルファらせんがモチーフx1−aを含み;または
b)第1アルファらせんがモチーフx1−aを含み、かつ第2アルファらせんがモチーフa−x1を含み;
好ましくは、モチーフa−x1を含むアルファらせんがC末端モチーフa−x1−x2をさらに含み、かつモチーフx1−aを含むアルファらせんがN末端モチーフx2−x1−aをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のコネクタ。 - a)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID NO:1であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:69、もしくはSEQ ID NO:71のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID NO:2であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:77、もしくはSEQ ID NO:79のいずれかであり;
または
b)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID NO:3であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:85、もしくはSEQ ID NO:87のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID NO:4であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:93、もしくはSEQ ID NO:95のいずれかであり;
または
c)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID NO:5であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:101、もしくはSEQ ID NO:103のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID NO:6であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:109、もしくはSEQ ID NO:111のいずれかであり;
または
d)
i)モチーフa−x1が、SEQ ID NO:7であり;
ii)モチーフa−x1−x2が、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:117、もしくはSEQ ID NO:119のいずれかであり;
iii)モチーフx1−aが、SEQ ID NO:8であり;そして
iv)モチーフx2−x1−aが、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:125、もしくはSEQ ID NO:127のいずれかである、
請求項1〜8のいずれか1項に記載のコネクタ。 - x2が、1個のアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、またはセリンのいずれかからなる、請求項1〜9のいずれか1項に記載のコネクタ。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のコネクタにより互いに連結された少なくとも2個のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であって、第1ポリペプチド鎖が第1アルファらせんを組み込んでおり、かつ第2ポリペプチド鎖が第2アルファらせんを組み込んでおり;かつ第1および第2ポリペプチド鎖が第1および第2アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されており、好ましくは該タンパク質が、以下:
a)ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素;
b)2個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも1個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体;
c)抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体であって、ここで、該抗体の少なくとも1個のポリペプチド鎖が、該構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくは該構成要素が、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである;ならびに
d)受容体またはリガンドが、キャリヤーに連結されている親和性物質;
からなる群から選択される、
上記多量体タンパク質。 - a)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはC末端領域中に組み込んでおり;または
b)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフa−x1のリピートおよびC末端モチーフa−x1−x2からなるC末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはN末端領域中に組み込んでおり、または
c)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるN末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはN末端領域中に組み込んでおり;または
d)第1アルファらせんを組み込んでいる第1ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフx1−aのリピートおよびN末端モチーフx2−x1−aからなるN末端領域を含み;かつ第2ポリペプチド鎖が、第2アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはC末端領域中に組み込んでいる、
請求項11に記載のタンパク質。 - 請求項11または12に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程:
a)第1ポリペプチド鎖をコードする第1異種核酸を組み込んでいる第1宿主細胞を提供し;
b)第2ポリペプチド鎖をコードする第2異種核酸を組み込んでいる第2宿主細胞を提供し;
c)宿主細胞を、第1および第2ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し;そして
d)第1および第2ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する;を含み、好ましくは該第1および/または第2宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。 - 請求項11または12に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程:
a)以下:
(i)第1ポリペプチド鎖をコードする第1異種核酸;
および
(ii)第2ポリペプチド鎖をコードする第2異種核酸;
を組み込んでいる宿主細胞を提供し;
b)宿主細胞を、第1および第2ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し;そして
c)第1および第2ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する;を含み、好ましくは該宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。 - 請求項13または14に記載の方法により得ることができるタンパク質の調製物であって、該タンパク質の少なくとも90%が、第1および第2核酸によりコードされるポリペプチド鎖の正しいC末端およびN末端領域を含む、上記調製物。
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