CN117222656A - 嵌合免疫原和用于制备针对特定表位的多克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

在替代实施方案中，提供了嵌合免疫原或抗原，和用于制备和使用所述嵌合免疫原或抗原的方法，包括用于制备和获得对所选表位具有特异性的多克隆抗体的方法。在替代实施方案中，提供了用于在兔中产生表位特异性抗体应答的方法，其中所述免疫应答包括产生特异性针对(或特异性结合)至少一个人表位的兔抗体，并且所述方法包括向兔施用足够量的嵌合或重组多肽以产生所述表位特异性抗体应答。在替代实施方案中，提供了包含以下的嵌合或重组多肽：通过或经由基本上非免疫原性接头与免疫原性肽或多肽缀合或附接的铁蛋白多肽。

Description

嵌合免疫原和用于制备针对特定表位的多克隆抗体的方法
相关申请的交叉引用
此PCT国际发明专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年5月3日的美国临时专利申请序列号(USSN)63/183,616的优先权权益。将上述申请通过引用以其整体且出于所有目的明确并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及免疫学和免疫测定。在替代实施方案中，提供了嵌合免疫原，和用于制备和使用所述嵌合免疫原的方法，包括用于制备和获得对所选表位具有特异性的多克隆抗体的方法。在替代实施方案中，提供了用于在兔中产生表位特异性抗体应答的方法，其中所述免疫应答包括产生特异性针对(或特异性结合)至少一个人表位的兔抗体，并且所述方法包括向兔施用足够量的嵌合或重组多肽以产生所述表位特异性抗体应答。在替代实施方案中，提供了包含以下的嵌合或重组多肽：通过或经由基本上非免疫原性接头与免疫原性肽或多肽缀合或附接的铁蛋白多肽。
背景技术
多克隆抗体对多个表位具有不同的反应性，从而确保即使在面对靶标或环境变化的多样性时也有稳健反应。为了获得多克隆抗体，用蛋白质、蛋白质片段或其混合物免疫动物，然后体液免疫系统选择产生抗体的B细胞克隆以用于扩增和成熟。在随后的阶段，这些B细胞将通过诱变和高亲和力免疫球蛋白基因的选择进一步多样化。尽管免疫系统具有针对几乎任何外来蛋白产生抗体的基本能力，但已知一些表位是有优势的，并且产生识别这些“优势”表位的抗体的B细胞克隆将接管免疫应答。这意味着标准多克隆抗体偏向一些表位，并且可能对其他表位缺乏反应性。
原则上，可以通过使用单个肽或肽的混合物使用单个(例如，线性)表位来免疫。然而，肽的三维(3D)结构可能与衍生出它们的蛋白质不同，从而导致产生对所述蛋白质具有较低亲和力或没有亲和力的抗体。肽(特别是并非优势表位的那些肽)通常太小而无法靠自身引发免疫应答，并且需要构建为更大的结构，或者需要依赖与更具免疫原性的成分共刺激来刺激经免疫的动物产生针对体液应答偏好的优势表位以外的其他表位的抗体。
可以使用各种技术如新生儿药物诱导掩蔽消减免疫或高区带耐受方法来针对非选择表位形成耐受(参见例如，美国专利7,598,030；美国专利8,133,744)，但耐受形成可能是一个有漏洞的过程，其中针对非选择表位的抗体克隆以某一水平继续显露；并且已经建议使用组合以获得更高的效率。在所有情况下，耐受形成意味着，除了标准免疫，还需要另外的程序作为此过程的一部分，从而增加了复杂性和成本。
从经免疫动物的血清中纯化用于商业用途的抗体。即使可以提取总免疫球蛋白，也经常需要通过减去不需要的反应性(吸附纯化)或通过特异性选择所需的反应性(亲和纯化)来进一步纯化抗体。
有利的是，能够明确多克隆抗体将识别哪些特定表位，而不必在免疫和/或纯化程序中添加额外的步骤。例如，消除对昂贵且耗时的吸附纯化和/或亲和纯化步骤的需要将是有利的。
发明内容
在替代实施方案中，提供了嵌合或重组多肽，所述嵌合或重组多肽包含：
(a)源自第一物种的多肽，和
(b)源自至少第二物种的至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基，
其中，源自所述第二或另外的物种的所述至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分，
并且所述嵌合或重组多肽的氨基酸序列基本上由源自所述第一物种的氨基酸序列构成，
并且当来自所述第二物种的氨基酸序列被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分时，在源自所述第一物种的多肽上生成、形成或产生至少一个新表位，当将所述嵌合或重组多肽施用于所述第一物种时，所述至少一个新表位能够使所述第一物种产生对所述至少一个新表位具有特异性的体液抗体应答，
其中当所述嵌合或重组多肽被用于使所述第一物种的动物产生体液免疫应答时，在所述第一物种中如此产生的多克隆抗体基本上仅特异性地结合所述至少一个新表位，并且不特异性结合、或基本上不特异性结合、或仅以低亲和力结合源自所述第一物种但缺乏所述至少一个新表位或多个新表位的多肽，所述至少一个新表位或多个新表位由被插入源自第一物种的多肽的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的源自所述第二或另外的物种的所述至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基产生、形成或生成。换句话说，在所述第一物种中新产生的针对蛋白质的抗体与来自所述第一物种但其中不含来自所述第二物种的形成所述至少一个新表位的蛋白质序列的多肽可能存在一些低亲和力和/或非特异性结合。
当使用蛋白质结构域如轻链恒定结构域用于免疫(所述恒定结构域作为源自所述第一物种的多肽)时，可以看到另一种可能的情况，其中在所述第一物种中可能存在针对在生理环境中通常不暴露(例如，当蛋白质正常折叠或呈其天然三维(3D)结构时，通常不暴露)的表面的抗体应答，例如，恒定区中通常不暴露的表面是λ轻链中的恒定结构域与可变结构域之间的接头区(连接所述可变结构域和恒定结构域的区域)以及在完整IgG中通常与重链连接的C末端半胱氨酸。也就是说，当从结构域的正常环境中除去所述结构域时，可能对现在暴露的(在所述嵌合或重组多肽中)一个表面或多个表面具有体液应答。值得注意的是，尽管这可能会引起针对免疫原中新暴露的同源物序列(例如，兔同源物序列，如λ轻链的兔恒定结构域)的抗体产生，但其应该不会引导识别正常(正常折叠的)轻链的体液应答，因为这些区域(通常不暴露的表面)将被隐藏或者在天然3D结构中折叠。
在如本文所提供的嵌合或重组多肽的替代实施方案中：
-源自所述第二物种的多肽是源自所述第一物种的多肽的同源物；
-来自所述至少一个第二物种的氨基酸序列与所述第一物种同源，并且被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的所述至少一个同源第二物种序列替代源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的所有或基本上所有结构同源区段或部分；
-来自所述至少一个第二物种的氨基酸序列与所述第一物种同源，并且被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的所述至少一个同源第二物种序列与源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列结构同源；
-第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约25％至99％的序列同一性；
-所述第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有基本上相同的二级和/或三级结构；
-第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约25％至99％的序列同一性，并且与其在所述第二物种中的同源物具有基本相同的二级和/或三级结构；
-第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约50％的序列同一性；或者，第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约70％的序列同一性；或者，第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约80％的序列同一性；或者，第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约90％的序列同一性；
-当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有约2至约8的Z得分；或者当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少8的Z得分；
-源自所述第一物种的多肽和其源自所述第二物种的同源多肽是抗体；或者，源自所述第一物种的多肽和源自所述第二物种的所述至少一个异源氨基酸序列源自抗体重链或抗体轻链；
-所述抗体重链是IgM、IgG、IgA或IgE同种型重链，或所述轻链是κ或λ轻链；
-所述第一物种是哺乳动物物种；所述第二物种是哺乳动物物种；或者，所述第一物种是鸡形目(Galliformes)或稚科(Phasianidae)属物种，并且所述第二物种是哺乳动物物种；或者，所述第一物种是兔、鼠物种、绵羊、山羊、猪、牛、马或鸡；并且所述第二物种是人；或者，所述鼠物种是大鼠或小鼠；
-所述嵌合或重组多肽的氨基酸序列的至少约80％至约99％是源自所述第一物种的氨基酸序列，和/或所述嵌合或重组多肽的氨基酸序列的约1％至约20％之间是源自所述至少一个第二物种的氨基酸序列；
-一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个新表位被插入源自所述第一物种的多肽的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分；
-所述至少一个新表位包括源自抗体轻链的隐藏表面的表位，其中所述隐藏表面仅在所述抗体轻链游离且不是包含轻链和重链二者的IgG分子的一部分时暴露；
-通过以下设计由源自所述至少一个第二物种的所述至少一个异源氨基酸序列生成、产生或形成的所述表位：
(a)将源自所述第一物种的多肽的序列与其来自所述第二物种的同源多肽比对，
(b)确定源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的一个或多个氨基酸序列差异，
(c)选择源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的至少一个氨基酸序列差异，并且
(d)修饰源自所述第一物种的多肽的序列，以与来自所述第二物种的同源多肽的所选的至少一个氨基酸序列匹配或相同；
-选择源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的至少一个氨基酸序列差异包括在来自所述第二物种的多肽的3D模型或结构上突出显示所确定的源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的一个或多个氨基酸序列差异，并且选择在所述多肽的暴露表面或外表面之中或之上的至少一个氨基酸序列差异；
-被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的来自所述至少一个第二物种的氨基酸序列包含：存在于人IgG3而不是人IgG1、IgG2或IgG4或兔IgG中的序列；存在于人IgG1而不是人IgG2、IgG3或IgG4或兔IgG中的序列；存在于人IgG2而不是人IgG1、IgG3或IgG4或兔IgG中的序列；或存在于人IgG4而不是人IgG1、IgG2或IgG3或兔IgG中的序列；
-通过进一步包括以下的方法制备所述嵌合或重组多肽：在将一个或多个新表位插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分之后，从源自所述第二或另外的物种的所述至少一个异源氨基酸序列中除去所述一个或多个新表位，例如，如图8所示；
-将至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分，并且任选地所述至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基来自不同的动物物种，并且任选地所述至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个源自人，并且所述至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个源自非人或动物物种，例如，如图9所示；
-所述异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个包含并非源自所述至少第二物种的人工表位，例如，如图10所示；
-所述异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个包含最初源自所述至少第二物种的表位，所述表位在所述第一物种中免疫沉默(不能在所述第一物种中产生抗体应答)，但被修饰成为能够使所述第一物种产生针对所述表位的抗体应答的免疫活性表位，例如，如图10所示；
-在所述异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个新表位被修饰，使得所述第一物种针对经修饰的新表位产生的抗体的结合与可比的未经修饰的新表位的情况下相比更弱或更慢，例如，如图11所示；和/或
-所述嵌合或重组多肽进一步包含与所述第一物种不同源的源自至少第二物种的至少一个新表位，并且所述至少一个新表位能够在所述第一物种中产生针对所述至少一个新表位的抗体，例如，如图12所示。
在替代实施方案中，提供了重组多肽，所述重组多肽包含来自第一物种的第一多肽的一部分和来自第二物种的第二多肽的至少一部分，其中所述第二多肽的所述至少一部分是所述第一多肽的同源物，并且其中所述第二多肽的所述至少一个同源部分包含不存在于所述第一多肽中的表位。
在如本文所提供的重组多肽的替代实施方案中：
-所述至少一个第二多肽的部分存在于或基本上存在于所述第一多肽的同源部分的位置处，并且已经替代或基本上替代所述第一多肽的同源部分；
所述重组多肽包含第二多肽的至少一部分和第三多肽的至少一部分，所述部分各自是所述第一物种的不同序列的同源物，并且其中所述第二多肽的部分和所述第三多肽的部分各自包含不存在于所述第一多肽中的表位；
-所述第一多肽和所述第二多肽具有相似或基本上相同的3D结构；
-所述第一多肽和所述第二多肽具有约25％与约95％之间的氨基酸同一性；或所述第一多肽和所述第二多肽具有至少约25％的氨基酸同一性；或者，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少约50％的氨基酸同一性；或者，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少约70％的氨基酸同一性；或者，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少约90％的氨基酸同一性；
-当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有约2至约8的Z得分；或者当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少8的Z得分；
-所述第一多肽中的至少一个序列被除去，并被由所述第二多肽的同源部分形成的至少一个表位替代；
-已被从所述第一多肽中除去的至少一个序列包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的序列；
-已被除去的至少一个序列包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的序列；
-所述至少一个序列被包含由单克隆抗体特异性识别的表位的序列替代；
-已被替代的所述至少一个表位被包含导致在所产生的抗体上的至少一个互补位(抗原结合位点)亚型的表位的序列替代；
-已被替代的所述至少一个表位被包含作为优势表位或更有优势的表位的序列替代；
-已被替代的所述至少一个表位被包含作为弱表位或更弱表位的表位或者在所述第一物种中引发弱体液应答进而导致相对较低的抗体滴度的表位的序列替代；
-在替代实施方案中，待被插入所述第一物种多肽的来自所述第二物种的序列的一个或多个部分(或表位)首先被修饰或改变为与来自所述第一物种的序列相同或更相似，其中，这确保仅一个或一些最初或天然存在于所述第二序列中的表位仍然存在于最终的重组或嵌合多肽中；这可以使所产生的多克隆抗体对所选定的靶标(或表位)更具特异性(例如，通过减少在转移的第二物种中存在的表位的数量)；或者，这可以通过消除高疏水性互补位将存在于所产生的抗体中的可能性来改变所产生的多克隆抗体的特征或特性；
-所述第二多肽中的表位被修饰，从而与未经修饰的表位的情况下相比降低由所述第一物种产生的特异性识别所述表位的抗体的亲和力；
-所述重组多肽包含来自第三物种的第三多肽的一部分，所述部分包含不存在于所述第一多肽或所述第二多肽中的表位；
-存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的至少一个表位已被并入所述重组多肽中；
-存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的至少一个表位被并入所述重组多肽中；
-来自所述第二多肽的表位被修饰，以增加特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体的亲和力，或者产生特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体对所述表位的亲和力；
-所述第一物种是兔，并且所述第二物种是人；或所述第一多肽是兔抗体轻链，并且所述第二多肽是人抗体轻链；和/或
-将所述重组多肽施用于所述第一物种，所述表位能够导致特异性结合所述第二多肽中的表位但不特异性结合所述第一多肽的抗体的产生。
在替代实施方案中，提供了编码如本文所提供的嵌合或重组多肽的重组核酸。
在如本文所提供的重组核酸的替代实施方案中：
-所述重组核酸是或包含DNA或RNA分子，其中任选地所述RNA是mRNA分子，或所述重组核酸包含可被细胞机构用于制备多肽的合成或经修饰的核苷酸；
-所述重组核酸进一步包含转录调节元件并且与所述转录调控元件可操作地连接，并且任选地所述转录调节元件包括启动子，并且任选地所述启动子是诱导型启动子或组成型启动子；
-所述重组核酸进一步包含编码另外的蛋白质或肽部分或结构域的序列；
-所述另外的蛋白质或肽部分或结构域包含纯化部分或结构域以帮助纯化或分离由所述重组核酸编码的所述嵌合或重组抗体；
-所述另外的蛋白质或肽部分或结构域包含组氨酸(聚his)标签或麦芽糖结合蛋白；和/或
-所述重组核酸进一步包含位于所述纯化部分或结构域与编码所述嵌合或重组抗体的序列之间的编码蛋白酶切割位点的序列，并且任选地所述蛋白酶切割位点是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点。
在替代实施方案中，提供了包含如本文所提供的重组核酸的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒。
在替代实施方案中，提供了细胞，所述细胞包含如本文所提供的嵌合或重组多肽，如本文所提供的重组核酸，或如本文所提供的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒；并且任选地，所述细胞是细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
在替代实施方案中，提供了用于产生多克隆抗体或用于产生多克隆免疫血清的方法，所述多克隆抗体或所述多克隆免疫血清对表位具有特异性或与表位特异性结合，所述方法包括：
(a)向受试者施用如本文所提供的嵌合或重组多肽或用如本文所提供的嵌合或重组多肽免疫所述受试者，
(b)向受试者施用如本文所提供的重组核酸，或如本文所提供的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒，或
(c)向受试者施用如本文所提供的细胞，
其中，所述受试者是如本文所提供的所述第一多肽来源的物种，或所述受试者是如本文所提供的所述第一多肽的部分来自的物种，并且所述表位源自如本文所提供的所述第二多肽来源的物种，或所述表位源自如本文所提供的所述第二多肽的部分来自的物种。
在如本文所提供的方法的替代实施方案中：
-所述受试者是哺乳动物或禽类物种；或者，所述受试者是兔、鼠物种、绵羊、山羊、猪、牛、马或鸡；并且任选地所述鼠物种是大鼠或小鼠；
-所述重组核酸是RNA或DNA构建体；
-通过在细胞中表达如本文所提供的重组核酸，或如本文所提供的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒来产生所述嵌合或重组多肽；
-所述细胞是细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞；
-所述方法进一步包括在所述施用于或免疫所述哺乳动物之前基本上分离或纯化所述嵌合或重组多肽；
-所述分离或纯化包括使用疏水相互作用色谱法(HIC)、离子交换色谱法(IEC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、亲和纯化、吸附纯化或其任何组合；
-将步骤(a)、(b)或(c)中的所述施用重复两次与二十次之间，或重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或以每2至20周或3至16周一次的间隔重复；
-所述方法产生基本上缺乏对所述表位不具有特异性或不特异性结合所述表位的抗体的多克隆抗体或多克隆免疫血清；
-所述方法产生基本上包含对所述表位的错误折叠形式不具有特异性或不特异性结合所述表位的错误折叠形式的抗体的多克隆抗体或多克隆免疫血清；
-所述第一多肽中的至少一个序列被除去，并被所述第二多肽的一部分形成的表位替代；
-来自所述第二多肽的序列中的至少一个表位被存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的表位替代；
-来自所述第二多肽的序列中的至少一个表位被包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的表位的序列替代；
-所述第二多肽中由单克隆抗体特异性识别的至少一个表位被源自所述第一多肽的对应序列替代；
-所述第二多肽中的包含导致(或产生)至少一种互补位亚型的表位的至少一个序列被来自所述第一多肽的对应序列替代；
-所述第二多肽中的包含优势表位的至少一个序列被源自所述第一多肽的对应序列替代；
-所述第二多肽中的包含弱表位或引发弱体液应答进而导致相对较低的抗体滴度的表位的至少一个序列被源自所述第一多肽的对应序列替代；
-所述第二多肽中的表位被修饰，以降低特异性识别所述表位的抗体的亲和力；
-所述重组多肽包含来自第三物种的第三多肽的一部分，所述部分包含不存在于所述第一多肽或所述第二多肽中的表位；
-存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的至少一个表位已被并入所述重组多肽中；
-存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的至少一个表位被并入所述重组多肽中；和/或
-来自所述第二多肽的表位被修饰，以增加特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体的亲和力，或者产生特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体对所述表位的亲和力。
在替代实施方案中，提供了如本文所提供的嵌合或重组多肽；如本文所提供的核酸；如本文所提供的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒；或者，如本文所提供的细胞，用于在产生多克隆抗体中使用或用于产生多克隆免疫血清，所述多克隆抗体或所述多克隆免疫血清对表位具有特异性或与表位特异性结合。
在替代实施方案中，提供了以下的用途：(a)如本文所提供的嵌合或重组多肽；(b)如本文所提供的核酸；(c)如本文所提供的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒；或者，(d)如本文所提供的细胞，所述用途为用于产生多克隆抗体或用于产生多克隆免疫血清，所述多克隆抗体或所述多克隆免疫血清对表位具有特异性或与表位特异性结合。
在替代实施方案中，提供了包含以下的嵌合或重组多肽：通过或经由基本上非免疫原性接头与免疫原性肽或多肽缀合或附接的铁蛋白多肽，其中所述免疫原性肽或多肽包含如本文所提供的嵌合或重组多肽，并且所述铁蛋白多肽来自或源自所述第一物种。在这些嵌合或重组多肽的替代实施方案中：
-所述铁蛋白多肽折叠成螺旋束，所述螺旋束组装成含有24个拷贝的铁蛋白多肽的球状结构，
-所述基本上非免疫原性接头包括聚G接头或聚-(GGGGS)接头(SEQ ID NO:31)，并且任选地所述聚-(GGGGS)接头(SEQ ID NO:31)包含(GGGGS)5(SEQ ID NO:29)接头或由其组成，
-所述铁蛋白多肽携带至少一个His(6)-Lys-His(3)(SEQ ID NO:32)部分，或多个His(6)-Lys-His(3)(SEQ ID NO:32)部分；
-任选地携带来自第二物种(例如人类)的至少一个表位的肽或嵌合多肽位于所述接头和/或一个或多个所述His(6)-Lys-His(3)序列之后；
-可替代地，卷曲螺旋结构多肽位于所述接头和/或一个或多个His(6)-Lys-His(3)序列之后，该卷曲螺旋结构多肽可以结合与免疫原性部分、肽或嵌合多肽连接的另一个卷曲螺旋结构多肽，并且其中这两个卷曲螺旋多肽都源自物种1，因此在物种1中是非免疫原性的，
-所述第一物种是非人动物，任选地哺乳动物，任选地兔、山羊或美洲驼，或所述铁蛋白多肽源自非人动物，任选地哺乳动物，任选地兔、山羊或美洲驼，并且任选地所述免疫原性肽或多肽包含嵌合免疫原性肽或多肽，并且所述嵌合免疫原性肽或多肽包含插入兔肽或多肽中的人免疫原性序列，并且所述兔多肽残基在注入兔体内时是非免疫原性的；和/或
-所述非免疫原性兔肽或多肽序列源自兔免疫球蛋白多肽。
在如本文所提供的嵌合或重组多肽的替代实施方案中：
(a)所述铁蛋白多肽包含可与第二卷曲螺旋蛋白或基序结合的至少一个第一卷曲螺旋蛋白或基序(任选地，所述第二卷曲螺旋蛋白或基序包含免疫原性肽或与免疫原性肽结合，任选地通过非免疫原性接头共价附接)，其中所述第一卷曲螺旋蛋白或基序通过非免疫原性接头附接至所述铁蛋白多肽，从而得到嵌合铁蛋白-卷曲螺旋蛋白多肽，所述嵌合铁蛋白-卷曲螺旋蛋白多肽任选地可以折叠成三级结构或螺旋束结构，
并且任选地所述卷曲螺旋蛋白或基序源自所述第一物种，并且任选地源自所述第一物种的卷曲螺旋蛋白或基序结合源自所述第一物种的另一卷曲螺旋蛋白或基序，
并且任选地所述铁蛋白多肽包含两个、三个、四个或更多个第一卷曲螺旋蛋白或基序，
并且任选地所述卷曲螺旋蛋白或基序包含γ-氨基丁酸B型受体亚基1异形体X1(GBR1)和/或γ-氨基丁酸B型受体亚基2(GBR2)，其中所述GBR1可以选择性地结合GBR2基序，
并且任选地所述GBR1基序包含：
STNNNEEEKSRLLEKENRELEKIIAEKEERVSELRHQLQSR(SEQ ID NO:33)，并且任选地所述GBR2基序包含：
SVNQASTSRLEGLQSENHRLRMKITELDKDLEEVTMQLQDT(SEQ ID NO:34)；
(b)所述铁蛋白多肽已在其氨基酸序列中插入至少一个His(6)-Lys-His(3)(SEQID NO:32)部分，或多个His(6)-Lys-His(3)(SEQ ID NO:32)部分；
(c)所述基本上非免疫原性接头包括聚G接头或聚-(GGGGS)接头(SEQ ID NO:31)；
(d)所述聚-(GGGGS)接头(SEQ ID NO:31)包含(GGGGS)5(SEQ ID NO:29)接头或由其组成；
(e)所述非免疫原性接头附接至所述铁蛋白多肽的氨基末端；
(f)所述第一物种是兔，或所述铁蛋白多肽源自兔；
(g)所述免疫原性肽或多肽包含嵌合免疫原性肽或多肽，并且所述嵌合免疫原性肽或多肽包含插入兔肽或多肽中的人免疫原性序列，并且所述兔多肽残基在注入兔体内时是非免疫原性的；和/或
(h)所述非免疫原性兔肽或多肽序列源自兔免疫球蛋白多肽。
在替代实施方案中，提供了包含多种如本文所提供的嵌合或重组多肽的制品，并且任选地所述制品包含24种所述嵌合或重组多肽，
并且任选地所述嵌合或重组多肽中的每一种包含卷曲螺旋蛋白，并且所述卷曲螺旋蛋白彼此结合。
在替代实施方案中，提供了用于在兔中产生表位特异性抗体应答的方法，其中所述免疫应答包括产生特异性针对(或特异性结合)至少一个人表位的兔抗体，并且所述方法包括向兔施用足够量的如本文所提供的嵌合或重组多肽以产生所述表位特异性抗体应答。
在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个示例性实施方案的细节。根据描述和附图以及根据权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将变得清楚。
出于所有目的将本文引用的所有出版物、专利、专利申请都通过引用以其整体明确地特此并入。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张以彩色绘制的附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。
本文所阐述的附图是说明本文所提供的示例性实施方案，并不意在限制如权利要求所涵盖的本发明的范围。
图1A-图1C说明了人表位向兔支架上的转移：
图1A示出了人(SEQ ID NO:2)和兔(SEQ ID NO:1)λLC恒定结构域序列的序列比对，其中使用所述序列比对发现序列差异；
图1B示意性地说明了位于选择的所选隐藏区域中的具有物种特异性序列的表位；并且
图1C示出了嵌合序列：rhLAC1(SEQ ID NO:3)；rhLAC2+3(SEQ ID NO:4)；和rhLAC7(SEQ ID NO:5)；其中所选表位(黑色、加下划线和加粗)被移植到兔骨架序列(蓝绿色)上，这些序列被合成并插入到表达载体中，
如在下面的实施例1中详细讨论的。
图2A-图2C展示了显示嵌合蛋白表达的图像，其中表达构建体被转化到来自相关生物体的细胞中并用于生产嵌合蛋白：
图2A展示了SDS-PAGE页面图像，其中使用标准方法(如HIS-trap柱和尺寸排阻柱)纯化蛋白质，并且通过SDS-PAGE验证蛋白质表达，SDS-PAGE证明蛋白质的过表达，预期条带在大约13-14kDa处：
图2B展示了显示TEV切割后纯度的SDS-PAGE图像；
图2C展示了显示TEV切割后纯度的蛋白质印迹图像；其中在蛋白质印迹中包括含有大肠杆菌(E.coli)杂质的阳性对照(标记为1的泳道)，以证明用于验证样品纯度的抗大肠杆菌pAb的功能。
图3A-图3D以图形方式展示了数据，所述数据显示了插入到兔骨架上的人表位可以由针对天然人λ游离轻链(hλ-FLC，可变和恒定结构域)产生的抗体特异性识别：ELISA板被嵌合λ-LC恒定结构域(rh-λ-LC-CD)rhLac1(图3A)、rhLac2+3(图3B)和rhLac7(图3C)包被或被兔λ-LC恒定结构域rLac(图3D)包被。在标准程序中使用DAKO A0101(兔多克隆抗人λ-FLC抗体，红线)作为一抗，然后是二级HRP缀合的山羊多克隆抗兔IgG抗体试剂(P0448)，其中以TMB为显色剂。
图4A-图4E以图形方式展示了数据，所述数据显示了通过用嵌合λ轻链恒定结构域(λ-LC-CD)免疫而衍生的多克隆抗体(pAb)对人λ-LC具有特异性；将经纯化的在兔λ-LC-CD支架上携带人表位的嵌合蛋白用于兔的免疫；收集抗血清，并纯化Ig级分；pAb(蓝线)在如图3所述的标准ELISA测定中被用作一抗：图4A-图4C示出了，用1μg/mL嵌合λ-LC-CD rhLAC1(图4A)、rhLAC2+3(图4B)和rhLAC7(图4C)包被的孔被该一抗识别，表明嵌合蛋白引导兔的免疫系统引发针对人λ-LC蛋白中所选表位的pAb；这得到了如下事实的进一步支持：用兔λ-LC(图4D)包被的孔未被pAb识别；并且用1μg/mL人λ-LC(可变和恒定结构域)(图4E)包被的孔也被此pAb识别，并且显示嵌合λ-LC-CD可以引发针对天然人λ-LC的pAb。
图5示意性地展示了人IgG分子，显示了IgG分子由两条重链(灰色)和两条轻链(有色)组成。轻链有两种变体：κ和λ。两者都含有可变结构域(蓝色)和恒定结构域(红色)。整体(重链和轻链二者配对在一起的完整IgG)中重链与轻链之间的相互作用遮挡轻链的一部分。被遮挡的轻链部分表示为“隐藏表面”并且其余部分表示为“暴露表面”。
图6展示了人(SEQ ID NO:6)和兔(SEQ ID NO:7)λ轻链恒定结构域的序列比对和3D结构；所述结构域具有由两个配对β折叠构成的β夹心结构：红色折叠由四条β链组成，并且蓝色折叠由三条β链组成，并且红色β链构成隐藏表面。
图7示意性地展示了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原产生针对一个物种的一个表位或多个表位的多克隆抗体，所述一个表位或多个表位被插入来自第二物种的蛋白质，任选地同源蛋白质，其中所述多克隆抗体是在所述第二物种中制备的。
图8示意性地展示了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成缺少一个或多个表位，使得当使用所述免疫原产生多克隆抗体时，不产生针对除去的一个表位或多个表位的抗体。
图9示意性地展示了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成包含另外的一个表位或多个表位，使得当使用所述免疫原产生多克隆抗体时，产生对所述另外的一个表位或多个表位具有特异性的抗体。
图10示意性地展示了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成包含经修饰的一个表位或多个表位，所述经修饰的一个表位或多个表位在呈未经修饰形式时不会在第二物种中产生免疫应答，但在呈经修饰形式时会在所述第二物种中产生免疫应答。
图11示意性地展示了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成包含经修饰的一个表位或多个表位，其中所述一个表位或多个表位被修饰成免疫原性更低，使得当使用所述免疫原产生多克隆抗体时，产生不太稳健的免疫应答，或者产生的多克隆抗体更弱地或更慢地结合具有所述经修饰的一个表位或多个表位的蛋白质。
图12示意性地展示了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法。
图13展示了人表位向兔支架上的转移，特别地，此图展示了嵌合λ-LC-CD(SEQ IDNO:8)，其显示了所选表位(黑色或加粗)(也参见图1A，其展示了人(SEQ ID NO:2)和兔(SEQID NO:1)λ-LC恒定结构域序列的序列比对，其中使用所述序列比对发现序列差异)。
图14展示了λ-LC-CD的图像，左边图像显示了移植到兔骨架(深蓝绿色)序列上的人表位(阴影较浅或黄色)，如在下面的实施例2中进一步讨论的。
图15展示了显示TEV切割后的纯度的SDS-PAGE图像，如在下面的实施例2中进一步讨论的。
图16展示了显示TEV和SEC纯化后的纯度的SDS-PAGE和蛋白质印迹图像，如在下面的实施例2中进一步讨论的。
图17A-图17D以图形方式展示了数据，所述数据显示了通过用精制嵌合λ游离轻链(λ-LC)恒定结构域免疫而衍生的多克隆抗体(pAb)对人λ-LC隐藏表面具有特异性；将经纯化的在兔λ-LC-CD支架上携带人表位的嵌合蛋白用于兔的免疫；收集抗血清，并且纯化Ig级分(IgGf实施例2)；在如图3中所述的标准ELISA测定或凝集测定中将pAb(IgGf实施例1，实线或蓝线；A0101，间断虚线(----)或红线；和IgGf实施例2，点线(……)或黄线)用作一抗。
图17A显示用1μg/mL(6.67μM)SEC纯化的人IgG包被的孔被IgGf实施例1和A0101识别，而IgGf实施例2对完整的人IgG具有显著更低的反应性，表明IgGf实施例1和A0101含有对暴露表面具有特异性的互补位；
图17B显示只有IgGf实施例1具有在完整的人IgG的存在下凝集的特性；
图17C阳性对照显示，所有pAb都在人λ-FLC的存在下凝集；并且
图17D阴性对照显示，IgGf实施例1和IgGf实施例2在兔IgG的存在下不能凝集，
因此，支持图4D中的ELISA数据，并表明嵌合λ-LC-CD可以引发针对天然人λ-FLC的pAb。图18A-图18B展示了人表位向兔支架上的转移：
图18A展示了使用序列比对发现的人和兔血清淀粉样蛋白A(SAA)序列差异，其中人序列为SEQ ID NO:9，并且兔序列为SEQ ID NO:10；并且
图18B展示了嵌合血清淀粉样蛋白A(SAA)序列(SEQ ID NO:11)，其显示了移植到兔骨架(红色)序列上的所选的表位(黑色、加下划线和加粗)，所述所选的表位具有位于亲水区中的物种特异性序列；并且，
图19展示了SAA的图像，左边图像显示了移植到兔骨架(红色)序列上的人表位(阴影较浅或黄色)，
如在下面的实施例3中进一步讨论的。
图20A-图20B展示了人表位向兔支架上的转移：
图20A显示了如何使用序列比对发现人(SEQ ID NO:12)和兔(SEQ ID NO:13)κ轻链恒定结构域(κ-LC-CD)序列差异，如在下面的实施例4进一步讨论的；并且
图20B展示了具有移植到兔骨架(蓝色)序列上的所选的κ轻链(κ-LC)表位(黑色，加下划线和加粗)的嵌合序列(SEQ ID NO:14)。
图21展示了选择的κ轻链(κ-LC)CD表位(在左边图像中阴影较浅或黄色)，这些表位是位于所选隐藏区域中的物种特异性序列，如在下面的实施例4中进一步讨论的。
图22A展示了显示蛋白表达的SDS-PAGE，以证明κ轻链恒定结构域(κ-LC-CD)蛋白的过表达，在沉淀物(P)和上清液(S)中的预期条带处于大约13kDa至14kDa(箭头)，如在下面的实施例4中进一步讨论的。
图22B展示了显示TEV切割和SEC之后的嵌合(κ-LC-CD)蛋白纯度的SDS-PAGE，如在下面的实施例4中进一步讨论的。
图22C展示了显示TEV切割和SEC之后的嵌合κ-LC-CD蛋白纯度的蛋白质印迹(WB)，如在下面的实施例4中进一步讨论的。
图23A用1μg/mL(6.67nM)SEC纯化的人IgG包被孔。虽然阳性对照Q0499(点线(……)或浅蓝色线)有力地识别完整的人IgG，但阴性对照A0100(间断虚线(-----)或红色线)显示较差的结合并且针对嵌合(κ-LC-CD，实线或黄色线)的抗血清几乎没有反应性。这证明嵌合抗原对完整的人IgG产生的副反应性极小(如果有)。
图23B：用1μg/mL(40nM)天然人κLC(可变和恒定结构域)包被孔。两个阴性对照A0499(下部点线或浅蓝色线)和A0101(下部间断虚线(-----)或红色线)没有与人κ-LC反应，而两个阳性对照A0100(上部间断虚线(-----)，或红色/橙色线)和来自用嵌合κ-LC-CD免疫的兔的抗血清(实线或黄线)发出强信号。这证明嵌合恒定结构域引导针对存在于天然人κFLC中的表位的免疫应答。
图23C：用1μg/mL(80nM)嵌合κ-LC-CD包被孔。抗兔IgG抗体-HRP可视化试剂提供高背景，但是尽管当使用阴性对照Q0499(点线或浅蓝色线)和A0101(间断点划线(-.-)或红色/灰色线)时检测不到信号，但是当用两种阳性对照A0100(虚线(---)或实线或红色/橙色线)和用来自用嵌合κ-LC-CD免疫的兔的抗血清(程度甚至更高)时可以看到高于背景的信号。这证明抗血清和A0100二者识别嵌合κ-LC-CD。
图23D：用1μg/mL(80nM)重组兔κLC恒定结构域r-κ-LC-CD包被孔。抗血清与κ-LC-CD的任何结合均低于背景。这和与嵌合恒定结构域的高水平结合形成鲜明对比(图23C)，表明抗血清中的多克隆抗体对插入兔支架中的人表位具有特异性。
图24A用1mg/mL(6.67μM)SEC纯化的人IgG进行凝集实验。虽然阳性对照Q0499(浅蓝色)使完整的人IgG强凝集，但阴性对照A0100(红色)和针对嵌合κ-LC-CD的抗血清(黄色)不能凝集。结合图23A中的ELISA数据，这表明嵌合抗原对完整的人IgG产生的副反应性极小(如果有)。
图24B用1mg/mL(6.67μM)SEC纯化的兔IgG进行凝集实验。用A0499(点线或浅蓝色线)、A0100(虚线(---)或红色/橙色线)或来自用嵌合κ-LC-CD免疫的兔的抗血清(实线或黄线)未观察到凝集。这证明嵌合恒定结构域不引导针对自身(兔子)序列的免疫应答。
图24C用1mg/mL(40μM)天然人κFLC进行凝集实验。用A0100(虚线或红线)和来自用嵌合κ-LC-CD免疫的兔的抗血清(实线或黄线)观察到凝集。这支持插入的人表位引导针对天然人抗原的免疫应答。
图24D用1mg/mL(80μM)嵌合κ-LC-CD进行凝集实验。抗血清(实线或黄线)和A0100(虚线或红线)二者通过嵌合κ-LC-CD凝集，表明应用的表位可以被多于一种抗体结合。通过扩展，这表明至少两种抗体可以同时结合隐藏表面。
图25A-图25B展示了如何使用序列比对发现人和兔γ免疫球蛋白(IgG)序列差异；具有所选表位(图25A：有色和加下划线；图25B，加下划线和加粗)的嵌合序列被移植到兔骨架序列上，并被合成并插入到表达载体中；兔骨架(SEQ ID NO:15)；rhIgG1(SEQ ID NO:16)；rhIgG2(SEQ ID NO:17)；rhIgG2_2(SEQ ID NO:18)；rhIgG3(SEQ ID NO:19)；rhIgG4(SEQ ID NO:20)，如在下面的实施例5中进一步讨论的。
图26A-图26F展示了通过如本文所提供的方法制备的兔和嵌合IgG，其中人同种型特有表位(有色，或比灰色IgG骨架颜色更深)被移植到兔IgG骨架(灰色)上；其中图26A展示了没有插入人表位的兔IgG骨架；并且图26B展示了插入人表位(有色或颜色更深)的嵌合IgG1亚型，图26C展示了插入人表位(有色或颜色更深)的嵌合IgG2亚型，图26D展示了插入人表位(有色或颜色更深)的嵌合IgG2_2亚型，图26E展示了插入了人表位(有色或颜色更深)的嵌合IgG3亚型，并且图26F展示了插入人表位(有色或颜色更深)的嵌合IgG4亚型，如在下面的实施例4中进一步讨论的。
图27A-图27F展示了数据，所述数据显示如何将人表位取代到非人多肽背景上以产生抗人表位特异性应答：
图27A展示了携带(或其中已插入)对人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有特异性的表位的经构建的兔IgG；
图27B-图27E分别以图形方式展示了数据，所述数据显示兔对兔Ig中人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4表位的免疫应答；
图27F展示了为改善兔对Ig1和IgG2表位的反应性而重新设计的IgG1或IgG2亚型，SEQ ID NO:21是兔骨架，SEQ ID NO:22是rhIgG1_2，并且SEQ ID NO:23是rhIgG2_3，
如在下面的实施例6中详细讨论的。
图28A-图28F展示了具有所需特性的嵌合抗体的构建：
图28A展示了兔血清淀粉样蛋白A(SAA)骨架，其中红色残基(或更深颜色)是兔SAA序列，并且阴影较浅或黄色残基表示插入的人特有氨基酸；
图28B展示了人SAA，其中蓝色(或更深颜色)指示可能与脂质表面相互作用的六个疏水残基；
图28C展示了通过用与珠偶联的图28A所示的SAA免疫得到的抗体；
图28D展示了通过用如图28B所示的SAA免疫得到的抗体导致具有抗体(Ab)的免疫颗粒，所述抗体包含一些识别人疏水(蓝色)表位的互补位；
图28E-图28F是显示C和D与五种不同水平的SAA反应的动力学的图，
如在下面的实施例7中详细讨论的。
图29以图形方式展示了数据，所述数据显示用不完全人表位免疫可以提供针对人C反应蛋白(CRP)的慢反应多克隆抗体(srpAb)，如下面的实施例8中详细讨论的。
图30A-图30B展示了包含附接的免疫球蛋白抗原CDv6的示例性嵌合铁蛋白构建体(图30A)，其中所述CDv6在图30B中被单独描绘，如下面的实施例9中详细讨论的。
图31展示了蛋白质印迹的图像，所述图像显示针对免疫原CdV6(嵌合兔-人游离轻链结构域)引发的用作一级IgG的pAb(样品1108)与来自尺寸排阻的B9(柱#2和#1是不同的纯化级分)和“20级分”相互作用，如下面的实施例9中详细讨论的。
图32以图形方式展示了数据，所述数据显示动态光散射(DLS)或按强度的尺寸分布(尺寸随强度变化)，如下面的实施例9中详细讨论的。
图33以图形方式展示了数据，所述数据显示与铁蛋白融合的表达的CDv6被正确折叠，如在下面的实施例9中详细讨论的。
图34A展示了示例性重组铁蛋白核心的序列，其呈现(或包含)其中插入人表位的经修饰的CdV6(SEQ ID NO:35)，
并且子序列为：
嵌合CdV6
接头 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:29)
兔铁蛋白
如在下面的实施例9中详细讨论的。
图34B(SEQ ID NO:36)展示了通过以下的非共价结合形成的异二聚体：(1)嵌合重组抗原，其中嵌合重组抗原与卷曲螺旋GBR2基序(SEQ ID NO:34)的氨基末端共价结合；与(2)GBR1基序(加下划线)(SEQ ID NO:33)，通过使用非免疫原性接头(加粗)(SEQ ID NO:29)与铁蛋白分子的氨基末端结合；其中所述异二聚体的两个亚基通过GBR1基序与GBR2基序的缔合非共价结合：
STNNNEEEKSRLLEKENRELEKIIAEKEERVSELRHQLQSR MTSQIRQNYSPEVEAAVNHLVNLHLRASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREAAERLLKMQNQRGGRALFQDVQKPSQDEWGKTLNAMEAALALEKNLNQALLDLHALGSAHTDPHLCDFLENHFLDEEVKLLKKMGDHLTNIRRLSGPQASLGEYLFERLTLKHD-C末端(SEQ ID NO:36)
各图中相同的附图符号指示相同的要素。
具体实施方式
在替代实施方案中，提供了嵌合免疫原，和用于制备和使用所述嵌合免疫原的方法，包括用于获得对所选表位具有特异性的多克隆抗体的方法。
在替代实施方案中，提供了方法，所述方法包括用如本文所提供的嵌合或重组免疫原免疫动物，例如，用其天然存在的蛋白质之一或其一部分的经修饰版本免疫动物，所述经修饰版本携带源自来自另一类型动物或物种的蛋白质(例如同源蛋白质)的所选表位。此人工杂合蛋白或蛋白质结构域(即如本文所提供的嵌合或重组免疫原)使动物产生对源自来自另一类型动物或物种的蛋白质的一个或多个所选表位具有特异性的多克隆抗体。
在替代实施方案中，提供了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原产生针对一个物种的一个表位或多个表位的多克隆抗体，所述一个表位或多个表位被插入来自第二物种的蛋白质，任选地同源蛋白质，其中所述多克隆抗体是在所述第二物种中制备的，如图7所示。
在替代实施方案中，提供了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成缺少一个或多个表位，使得当使用所述免疫原产生多克隆抗体时，不产生针对除去的一个表位或多个表位的抗体，如图8所示。
在替代实施方案中，提供了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成包含另外的一个表位或多个表位，使得当使用所述免疫原产生多克隆抗体时，产生对所述另外的一个表位或多个表位具有特异性的抗体，如图9所示。
在替代实施方案中，提供了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成包含经修饰的一个表位或多个表位，所述经修饰的一个表位或多个表位在呈未经修饰形式时不会在第二物种中产生免疫应答，但在呈经修饰形式时会在所述第二物种中产生免疫应答，如图10所示。
在替代实施方案中，提供了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，其中所述免疫原被工程化或设计成包含经修饰的一个表位或多个表位，其中所述一个表位或多个表位被修饰成免疫原性更低，使得当使用所述免疫原产生多克隆抗体时，产生不太稳健的免疫应答，或产生的多克隆抗体更弱地或更慢地结合具有所述经修饰的一个表位或多个表位的蛋白质，如图11所示。
在替代实施方案中，提供了用于制备如本文所提供的免疫原(或抗原)以供产生抗体或多克隆抗体的示例性方法，如图12所示。
嵌合或重组多肽和核酸
在替代实施方案中，提供了嵌合或重组多肽以及用于制备和使用嵌合或重组多肽的方法。在替代实施方案中，提供了编码和表达如本文所提供的多肽的嵌合或重组核酸，包括含有和表达这些核酸的表达媒介物，以及用于含有和表达这些核酸的细胞，并且还包括完整生物体表达系统。
在替代实施方案中，可以使用本领域已知的任何方法进行如本文所提供的重组多肽的制备和表达，所述方法包括例如使用完整生物体如真菌、植物或动物(如小鼠)，以及源自完整生物体的细胞培养(如培养中的哺乳动物细胞)，或使用单细胞生物体，如藻类、真菌、酵母、昆虫(例如，杆状病毒)或细菌细胞。
用于制备(例如，重组产生)如本文所提供的嵌合或重组多肽和/或核酸的生物体的选择可以取决于若干因素，包括是否期望或需要二次修饰如糖基化，或者是否期望或需要蛋白质与膜系统缔合或(例如，原位)插入膜系统中，或者是否期望或需要特定的蛋白质折叠模式，和/或是否期望或需要二硫桥形成。
在替代实施方案中，用于表达如本文所提供的嵌合或重组多肽(例如用于体外或体内表达)的核酸包含在表达媒介物中，例如在表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒中。在替代实施方案中，表达如本文所提供的嵌合或重组多肽的核酸或表达媒介物被施用于动物(例如，作为裸DNA，其可以进行适当配制)，用于使该动物产生针对如本文所提供的重组多肽中的表位的体液免疫应答的目的。
在替代实施方案中，编码蛋白质的DNA序列(其可以在表达媒介物中)被转移至生物体或细胞，并被置于相关表达元件如转录启动子、增强子和/或多聚腺苷酸化信号序列的控制下。在替代实施方案中，如本文所提供的蛋白质序列在一个或多个特定细胞器中被加工，并且这可能需要添加一个或多个定位信号，如周质定位序列。
在替代实施方案中，编码蛋白质的DNA序列(例如，作为表达媒介物)被(稳定地或不稳定地)插入到基因组中，或者可以可替代地是附加型的。重组蛋白表达系统可以是短暂的或永久的。
在替代实施方案中，例如为了增强给定蛋白质出于免疫目的作为抗原或免疫原来发挥作用或功能的能力，纯化重组产生的蛋白质；例如，杂质的存在可导致经免疫动物产生针对无关靶标的抗体；并且在过多杂质的存在下，可能会阻碍大量所需抗体的形成，并且除去多克隆抗体针对杂质的反应性可能是耗时且昂贵的。
在替代实施方案中，基于所需蛋白质的特定特征进行蛋白质种类的纯化，例如，纯化包括使用如疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEC)和/或尺寸排阻色谱(SEC)的色谱方法使用疏水性、电荷和/或大小。在替代实施方案中，特定的蛋白质相互作用被用于纯化目的，例如，使用亲和纯化，或者蛋白质的特异性的缺乏被用于除去其他蛋白质种类，例如，使用吸附纯化。在替代实施方案中，抗体或其他蛋白质特异性结合蛋白被用于蛋白质的亲和纯化和/或吸附纯化。
在替代实施方案中，当重组表达蛋白质时，添加允许进行特定纯化方法的蛋白质序列，如例如表位标签，如FLAG、血凝素(HA)、c-myc、T7、Glu-Glu、ALFA标签、V5标签、Myc标签、HA标签、Spot标签、T7标签和NE标签；生物素和链霉亲和素或抗生物素蛋白系统；聚组氨酸亲和力标签，如小型HIS标签(6-8个氨基酸)(并且任选地使用固定金属亲和色谱)；N末端谷胱甘肽S-转移酶(GST)分子，然后是蛋白酶切割位点；43kDa大型麦芽糖结合蛋白(MBP)；内含肽-几丁质结合结构域(内含肽-CBD)标签；或者，钙调蛋白结合肽(CBP)纯化系统，所述系统利用来自肌肉肌球蛋白轻链激酶的C末端片段，以从细菌中纯化目的蛋白质。这增加了可用于纯化目的的工具，并使得可以使用标准方法纯化许多不同蛋白质。
在一些情况下，需要在进行免疫之前除去此类纯化序列。这可以通过在纯化序列与实际的编码蛋白质的序列(例如，如本文所提供的嵌合蛋白质的序列)之间放置蛋白酶位点来实现。一个例子是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶，其在切割共有序列后仅留下N末端甘氨酸残基。
在替代实施方案中，在经免疫动物中原位制备如本文所提供的重组蛋白，例如，通过修饰动物中的细胞以具有新的或改变的DNA序列，所述新的或改变的DNA序列可以编码所述重组蛋白的表达，并且表达和/或分泌那些免疫原性蛋白。
免疫程序
在替代实施方案中，提供了用于制备抗体或用于在动物中(例如，在哺乳动物(例如，兔、鼠物种如小鼠或大鼠、绵羊、山羊、猪、牛或马)中或在稚科属物种(例如，鸡)中)产生或刺激免疫应答的方法，所述方法包括施用如本文所提供的嵌合或重组蛋白。
在替代实施方案中，为了获得针对蛋白质靶标的多克隆抗体，源自一类动物(物种)的蛋白质被用于在另一类动物(物种)中产生免疫应答。
在替代实施方案中，如本文所提供的包含至少一个人表位的嵌合或重组蛋白被用于在小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马或鸡中刺激免疫系统，例如，用于产生体液应答，并且得到或产生的一个多克隆抗体或多个多克隆抗体可以特异性识别人蛋白，并且可以用于特异性识别、标记、结合和/或分离所述至少一个人表位所来源的人蛋白。
在替代实施方案中，来自任何物种的蛋白质被用于免疫另一物种以产生体液免疫系统，只要与被免疫的物种中的任何同源蛋白质或蛋白质结构域相比，用于免疫的蛋白质携带至少一种修饰(例如，至少一个氨基酸差异)即可。
在替代实施方案中，当施用如本文所提供的嵌合或重组蛋白时，还使用佐剂。虽然施用的嵌合或重组蛋白是引导免疫应答以产生针对重组蛋白表达的特定表位的抗体的试剂，但与蛋白质混合的佐剂可以确保免疫系统被激活；例如，通过使用佐剂，蛋白质被放置于经较长的时间段释放到体内的沉积物中。在替代实施方案中，使用不同的佐剂，例如，基于各种原理如水包油原理的佐剂，例如使用弗氏佐剂。在替代实施方案中，将蛋白质和佐剂混合物注射到一个或多个皮下位置中。在替代实施方案中，施用程序被重复几次(例如，在约2次与10次之间)以加强免疫应答(加强阶段)；并且可以通过以定期但通常较长的间隔(例如，每3到16周另外施用一次)更新免疫来维持多克隆抗体的高产量。
选择待移植到骨架蛋白上的表位
在替代实施方案中，提供了重组多肽，所述重组多肽包含来自第一物种的第一多肽的一部分和来自第二物种的第二多肽的至少一部分，其中第二多肽的至少一部分是第一多肽的同源物，并且其中第二多肽的同源部分包含不存在于第一多肽中的表位。在替代实施方案中，同源蛋白质或蛋白质结构域存在于两种目的物种中。
在替代实施方案中，同源蛋白质是具有相似3D结构的蛋白质；当蛋白质具有多于30％相同的蛋白质序列相似性时，在90％的情况下这些蛋白质具有相同的3D结构，并且具有少得多的序列同一性的蛋白质仍可具有相似的三维结构。在替代实施方案中，使用例如距离矩阵比对(DALI)来评估蛋白质之间的3D结构相似性，并且根据经验法则，高于8的Z得分指示同源性，而2到8的得分表示灰色地带(grey zone)。
在替代实施方案中，骨架蛋白或来自第一物种的第一多肽源自待免疫的物种(物种一)，并且表位序列源自待被多克隆抗体识别的物种(物种二)。
在替代实施方案中，待插入或构建到“背景”蛋白或来自第一物种的第一多肽中的表位序列通过以下方式衍生：
首先，比对两个氨基酸序列，并突出显示小到一个氨基酸残基的差异；
选择此类氨基酸残基差异中的至少一个(或多个)；并且
通过改变所选的氨基酸或多个所选的氨基酸来修饰骨架序列(物种一)。
在替代实施方案中，在所选的一个表位或多个表位被引入骨架序列后，重组表达衍生的杂合(或嵌合)蛋白，并任选地纯化用于免疫物种一，并且可以应用得到的多克隆抗体(或源自这种体液应答的单克隆抗体)以识别物种二中的蛋白质。
在替代实施方案中，如果杂合或嵌合蛋白可以以至少约50μg/mL的浓度在溶液中维持至少一天，则认为所述杂合或嵌合蛋白已准备好用于免疫。可任选地在免疫前经由免疫学和/或生物化学测试或通过光谱检查(例如，圆二色性)证实蛋白质结构是正确的，来进行进一步的质量控制。
在替代实施方案中，当多克隆抗体要被用于对完整蛋白质进行测定(例如，如ELISA、比浊法和CLIA测定的测定)时，包括例如以下的其他步骤可能是有利的：
-比对两个氨基酸序列，并突出显示小到一个氨基酸的差异；
-在蛋白质或结构域的3D结构上突出显示所述差异；
-鉴定表面暴露区域中存在的差异；
-选择此类表面暴露差异中的至少一个；和/或，
-通过将所选的氨基酸改变为物种二的那些氨基酸来修饰骨架序列(物种一)。
在一些情况下，蛋白质或结构域的3D结构可能是未知的，并且不能应用第二和第三步骤；代替地，在替代实施方案中，检查具有不同表位序列的一系列杂合蛋白，直到获得所需抗体。
制备和使用如本文所提供的嵌合蛋白的示例性应用
防止出现不需要的抗体反应性或特征
在替代实施方案中，如本文所提供的重组多肽用于以下，或者如本文所提供的方法进一步包括以下：
-增加对家族中一个同源蛋白质种类的特异性，例如，通过在应用的骨架序列中避免在蛋白质家族(物种二中)的其他成员中存在的来自物种二的表位，使得免疫反应将瞄准或更集中于对于所选蛋白质种类更为独特的其余表位；
-增加对蛋白质中许多结构域中的一个结构域的特异性；这可以通过以下来进行：除去存在于(物种二的)蛋白质家族的其他结构域中的表位，使得免疫反应将瞄准对于所选结构域更独特的其余表位；
-增加多克隆抗体组合物对给定应用的协同性；一个例子是获得针对表位子集的反应性，以在比浊反应中引起快速高效的交叉结合，并且另一个例子是产生可在如ELISA或CLIA的测定中与单克隆抗体协同的多克隆抗体(例如，通过除去由所述单克隆抗体识别的表位)；
-防止出现多克隆抗体的不需要的特征，例如，通过从物种二序列中选择性地除去表位，使得避免抗体上的互补位的亚型，例如，可以影响或控制如抗体等电点(pI)和疏水性的关键特征以在与其他材料相互作用(一个例子是与塑料表面相互作用)时提供所需特征；
-获得对多克隆抗体的制造过程的更高程度的控制，使得批次之间更加标准化；一个例子是从物种二序列中除去一个或多个免疫优势表位，直到在经免疫的动物中实现对次要表位的更一致的反应性；另一个例子是从物种二多肽中消除或除去最弱的表位，以避免对此类元件的更可变的应答；和/或
-通过以下方式降低对给定蛋白质的反应性(例如，反应速度)：除去一些表位和/或通过使用(或插入物种二序列中)经修饰的一个表位或多个表位来降低抗体亲和力，其中这可用于如宽范围比浊测定的应用。
添加所需反应性或特征
在替代实施方案中，如本文所提供的重组多肽用于以下，或者如本文所提供的方法进一步包括以下：
-多物种反应性，使得同一抗体可以用于例如人和动物物种二者的诊断；可以通过将另外的表位插入到物种一骨架中，或者通过组合或融合具有不同表位特征或具有不同新插入表位的不同重组蛋白来制备这种抗体；
-多蛋白质反应性，使得蛋白质家族的所有或所选子集被多克隆抗体识别；这可以通过将在家族成员之间不同的表位添加或插入到物种一骨架中或通过在免疫混合物中组合具有不同版本的所选表位的杂合蛋白来实现；
-多结构域反应性，使得结构域类型的所有或所选子集被多克隆抗体识别；这可以通过将在结构域之间不同的表位添加到物种一骨架中或通过在免疫混合物中组合具有不同版本的所选表位的杂合结构域来实现；
-对不产生初级应答的表位的反应性；通过使用一系列经修饰的表位，可以克服对给定表位的初级应答的缺乏，如在开发针对病毒的疫苗时所显示的，例如Escolano等人,2016,Cell166,1445-1458；这种依序免疫的方法也可用于生产多克隆抗体；和/或
-增强多克隆抗体的所需特征，例如，通过从物种二序列中选择性地除去表位，使得避免抗体上的互补位的亚型；可以影响或控制如抗体pI和疏水性的关键特征以在与其他材料相互作用(例如，与塑料表面相互作用)时提供所需特征。
在替代实施方案中，体液免疫是涉及B细胞转化成产生并分泌针对特定抗原的抗体的浆细胞的免疫应答。
在替代实施方案中，表位(也称为抗原决定簇)是抗原中被抗体识别的部分。
在替代实施方案中，互补位(也称为抗原结合位点)是抗体中识别并结合抗原的部分。
在替代实施方案中，等电点(pI)是蛋白质的净电荷变为零时的溶液pH；在溶液pH高于pI时，蛋白质的表面主要带负电，因此带相同电荷的分子将展现出排斥力。
疫苗和疫苗接种
在替代实施方案中，提供了疫苗配制品，所述疫苗配制品包含如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸(包括编码蛋白质的DNA和RNA分子(例如，编码蛋白质的mRNA))或核酸表达媒介物和/或如本文所提供的细胞。
在替代实施方案中，如本文所提供的疫苗配制品包含或进一步包含佐剂或不完全佐剂，或药学上可接受的赋形剂，其中任选地药学上可接受的赋形剂包括无菌缓冲液、盐水或水。
在替代实施方案中，如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸(如编码蛋白质的RNA)或核酸表达媒介物被配制在脂质体中，例如，作为具有聚阳离子脂质组合物的脂质体递送媒介物(例如，阳离子脂质体)和/或具有与聚乙二醇缀合的胆固醇骨架的脂质体，其中示例性阳离子脂质体组合物包含以下或使用以下制造：N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇，N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇，1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)-氯化咪唑啉鎓盐(DOTIM)和胆固醇，二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇，及其组合。
例如，在替代实施方案中，编码蛋白质的核酸可以是编码一种或多种免疫原性肽或蛋白质的DNA，并且所述DNA可以被携带于表达媒介物(如病毒载体，例如腺病毒载体(如Ad5)或腺相关载体(AAV))中。在替代实施方案中，如本文所提供的疫苗中所使用的重组腺病毒可以如美国专利申请号US20200399323 A1中所述，其描述了例如包括E1区中的缺失或E1区的缺失或导致病毒复制缺陷的任何缺失的重组腺病毒，例如，复制缺陷病毒可以包括E1、E3和/或E4区中的一个或多个中的缺失；或者可以如美国专利申请号US20190382793 A1中所述，其描述了如何制备用于基因疗法的重组腺病毒。
在替代实施方案中，编码蛋白质的核酸可以是RNA，例如mRNA，其可以被配制在脂质配制品或脂质体中并被注射，例如肌内(IM)注射，例如使用如美国专利申请号US20210046173 A1中所述的配制品和方法，所述文献描述了向受试者递送(例如，经由肌内施用)包含含有开放阅读框(ORF)的RNA(例如，mRNA)的免疫原性组合物，所述开放阅读框包含如本文所提供的免疫原性或抗原性序列(或由其组成，或基本上由其组成)；其中任选地所述RNA(或携带DNA的表达媒介物)被配制在包含以下的脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)或纳米脂质体中：包含胆固醇与DSPC的混合物的非阳离子脂质、或PEG-脂质、或经PEG修饰的脂质、或LNP、或可电离的阳离子脂质；或(13Z,16Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺、胆固醇、DSPC和PEG-2000DMG的混合物。在替代实施方案中，PEG脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油烯基、PEG-二油烯基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基咪唑双酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)，或PEG脂质是偶联至二肉豆蔻酰基甘油的PEG(PEG-DMG)。
在替代实施方案中，如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸或核酸表达媒介物与佐剂一起配制或施用，所述佐剂例如可以包括：氢氧化铝或矿物油、免疫应答刺激物如脂质A、百日咳鲍特菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白质；例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室，密歇根州底特律)；Merck佐剂65(Merck and Company，新泽西州罗威)；AS-2(GlaxoSmithKline，宾夕法尼亚州费城)；铝盐如氢氧化铝凝胶(铝佐剂)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球体；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、白介素-12和其他类似的生长因子也可用作佐剂。
在替代实施方案中，以一种或多种剂量方案施用如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸或核酸表达媒介物。
在替代实施方案中，以约100μg与约1mg之间的剂量；或以包含约50μg与500μg之间的剂量；或以约1mg与约10mg之间施用如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸或核酸表达媒介物或如本文所提供的疫苗。可以例如以单剂量或以两个、三个、四个或五个或更多个剂量施用疫苗。在一个实施方案中，以一或两周的间隔施用两个剂量。
在替代实施方案中，经由皮内、透皮、鼻内(例如，通过鼻内滴剂或鼻内气溶胶递送)、肌内、皮下或舌下途径施用如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸或核酸表达媒介物或如本文所提供的疫苗。
在替代实施方案中，使用注射器、气动注射器或喷射注射装置施用如本文所提供的嵌合或重组多肽、编码所述嵌合或重组多肽的核酸或核酸表达媒介物或如本文所提供的疫苗。
制品和试剂盒
提供了用于实践如本文所提供的方法的制品和试剂盒，所述制品和试剂盒包括例如用于表达如本文所提供的嵌合或重组多肽的核酸(如表达媒介物)，或如本文所提供的嵌合多肽，或表达如本文所提供的嵌合或重组多肽的细胞，或如本文所提供的疫苗配制品(例如，包含如本文所提供的嵌合或重组多肽)；并且任选地，制品和试剂盒可进一步包含用于实践如本文所提供的方法的说明书。
任何以上方面和实施方案都可以与如本文在发明内容、附图说明和/或具体实施方式部分中所公开的任何其他方面或实施方案组合。
如在本说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。
除非明确说明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或”应被理解为是包含性的，并且涵盖“或”和“和”两者。
除非明确说明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准差内。约可以被理解为在所述值的20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非根据上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值都被术语“约”修饰。
除非明确说明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“基本上所有”、“基本上大部分”、“基本上全部”或“大多数”涵盖组合物的参考量的至少约90％、95％、97％、98％、99％或99.5％或更多。
将本文所引用的每个专利、专利申请、出版物和文件的全部内容都通过引用特此并入。对以上专利、专利申请、出版物和文件的引用并非承认前述中任一者是相关现有技术，其也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。通过引用并入这些文件单独不应当被解释视为主张或承认任何文件的内容的任何部分被认为是满足任何国家或地区对专利申请的法定披露要求的必要材料。然而，保留在适当情况下依靠任何此类文件提供审查机关或法院认为对所要求保护的主题至关重要的材料的权利。
在不背离本发明的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。尽管已参考一个或多个具体实施方案非常详细地描述了本发明，但本领域普通技术人员将认识到，可以对本申请中明确公开的实施方案进行改变，然而这些修改和改进在本发明的范围和精神内。可以在不存在本文没有明确公开的任何一种或多种要素的情况下适当地实践本文说明性描述的本发明。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含/包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个可以用其他两个术语中的任一个替代。因此，已采用的术语和表达是作为描述性而非限制性的术语而使用，所示出和描述的特征或其部分的等同物并不排除在外，并且应认识到，在本发明的范围内可以进行各种修改。在以下权利要求中阐述了本发明的实施方案。
将参考本文所述的实施例进一步描述本发明；然而，应理解，本发明并不限于此类实施例。
实施例
除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术均根据标准方案进行，例如，如Sambrook等人(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in MolecularBiology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷中所述。标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Brown(1998)Molecular BiologyLabFax,第二版,第I卷和第II卷,Academic Press(UK)。聚合酶链式反应的标准材料和方法可见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press以及McPherson等人(2000)PCR-Basics:FromBackground toBench,第一版,Springer Verlag,Germany。
实施例1：制备和使用嵌合免疫原
此实施例展示用于制备和使用如本文所提供的嵌合免疫原的示例性方法。
材料和方法
表位选择
基于使用现有DAKO/Agilent多克隆抗体A0101和一条人游离轻链的恒定结构域进行的序列比对和表位作图来鉴定人表位。将经鉴定的表位用于设计针对物种2而不是物种1反应的嵌合变体。
蛋白质表达和纯化
所有编码λ-FLC的嵌合变体的构建体都是以订购的或被克隆到pET22(+)中。将构建体设计为具有N末端His标签和之后的TEV切割位点，以将His标签与λ-FLC恒定结构域分离。使用大肠杆菌菌株BL21(InvitrogenTM)周质表达重组兔λ-FLC恒定结构域和具有移植到兔支架上的人表位的嵌合恒定结构域变体。将含有重组蛋白的溶原性肉汤培养基针对结合缓冲液(20mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH 7.4)透析，之后使用His标签柱(GE Healthcare)通过亲和色谱(IMAC)固定重组蛋白。将经固定的蛋白质用洗涤缓冲液(20mM Na2HPO4，1M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)以至少15个柱体积洗涤，并用洗脱缓冲液(20mMNa2HPO4，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱。将经His标记的重组蛋白透析至切割缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH 8)中，然后添加补充有2mM还原的L-谷胱甘肽(最终浓度)的TEV蛋白酶(0.2mg/mL，最终浓度)。使切割反应在+4℃下过夜。为了使经切割的重组蛋白与His标签、TEV蛋白酶和未切割的重组蛋白分离，将混合物加载到His标签柱上，并收集流出物且其含有未标记的重组蛋白。使用尺寸排阻色谱(SEC)SUPERDEX 75TMPrep Grad(GEHealthcare)，以结合缓冲液为洗脱液，进一步纯化样品。为了分析(ELISA和比浊法测定)，重组蛋白可以保留His8标签。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
使用预制NUPAGETM4-12％ Bis-Tris凝胶(InvitrogenTM)通过SDS-PAGE跟踪蛋白质纯度。用SDS样品缓冲液(350mM Tris.HCL，357mM十二烷基硫酸钠，44.6％甘油，179μM溴酚蓝，pH 6.8)加载所有蛋白质样品，并在MESSDS运行缓冲液中进行。将凝胶用SimplyBlueTM(InvitrogenTM)染色。对于蛋白质印迹，将NUPAGETM4-12％Bis-Tris凝胶(InvitrogenTM)和MESSDS运行缓冲液/>用于分离蛋白质。在30V下进行电印迹1小时，并将蛋白质转移到蛋白质印迹缓冲液(25mM Tris，0.192M甘氨酸和乙醇25.3％)中的PVDF膜(BioRad)。在印迹之后，使用封闭缓冲液(50mM Tris-HCL，0.5M NaCl，0.5％Tween20，pH 9.0)进行封闭步骤。将含有经转移蛋白质的经封闭的PVDF膜与一级pAb(稀释1000x的兔抗大肠杆菌)在+4℃下在振荡下孵育1小时(最少)。在将膜与二级pAb(猪抗兔)孵育1小时之前，将膜用封闭缓冲液洗涤4x 10min。在与二级pAb孵育后，将膜用封闭缓冲液洗涤4x10min，并与DAB(二氨基联苯胺)和底物孵育20min。
抗原制备和免疫
基于对来自SEC纯化的级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，产生高纯度的抗原样品。最终抗原样品中仅包括不含杂质的级分。所述抗原样品构成等量的三个恒定结构域变体嵌合λ-FLC(LAC1、LAC2+3、LAC7)，以引发包括人游离轻链的四种异形体的互补位的全体pAb。在即将皮下免疫三月龄兔之前，将抗原样品与弗氏不完全佐剂(FIA)以等量(1:1)混合。在免疫前和最后一次免疫后七周收集血清。通过添加最终浓度15mM的叠氮化钠(NaN3)来保存血清，并在4℃下储存。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
用包被缓冲液(10mM Na2HPO4，145mM NaCl，0.1％ Tween-20，pH 7.2)将所有抗原(λ-FLC-、兔λ-FLC恒定结构域、人λ-FLC或人完整IgG的嵌合变体)稀释至1μg/mL，并用于在4℃下包被96孔板过夜。将所有一级pAb(A0101、X0903和实施例1IgG级分(IgG实施例1))用5％脱脂乳从10μg/mL开始进行3倍连续稀释。将板使用洗涤缓冲液(10mM Na2HPO4，500mM NaCl，0.1％ Tween-20，pH 7.2)洗涤，并在室温下搅拌下与一级pAb孵育1小时。随后用洗涤缓冲液洗涤，并与在5％脱脂乳中稀释至10μg/mL的二级pAb(P0448)在搅拌下孵育1小时。最后，将板用洗涤缓冲液洗涤，并在添加100μL/孔的TMB(DAKO S1599)后显影5分钟。通过向每个反应孔中添加100μL 0.5M H2SO4来终止反应。通过使用SOFTMAXTM6.2.1的ELISA读取器检测结果，检测波长为450nm和650nm。
图1A-图1C说明了人表位向兔支架上的转移：
图1A示出了人(SEQ ID NO:2)和兔(SEQ ID NO:1)λ-FLC恒定结构域序列的序列比对，其中使用所述序列比对发现序列差异；
图1B示意性地说明了位于选择的所选隐藏区域中的具有物种特异性序列的表位；并且
图1C示出了嵌合序列：rhLAC1(SEQ ID NO:3)；rhLAC2+3(SEQ ID NO:4)；和rhLAC7(SEQ ID NO:5)；其中所选表位(黑色、加下划线和加粗)被移植到兔骨架序列(蓝绿色)上，这些序列被合成并插入到表达载体中。
实施例2：
此实施例展示用于制备和使用如本文所提供的重组或嵌合免疫原的示例性方法。
此实施例类似于实施例1；然而，在实施例1证明所述概念的情况下，实施例2使用所述概念来开发针对λ-FLC的特异性pAb。这通过精制所选表位来实现。
材料和方法
表位选择
从数据库读取兔和人λ游离轻链(λ-FLC)序列(PIR分别为：A30505和P0DOX8)。比对序列以鉴定两个物种之间λ-FLC恒定结构域中的序列差异。通过比对和检查人λ-FLC(PDB条目：1a8j)和完整的人IgG(PDB条目：1hzh)的晶体结构来进行表位的选择。将PISA服务器用于鉴定具有少于10％溶剂暴露残基的表面表位。将这些残基包括在嵌合变体中以产生特异性λ-FLC pAb，参见图14。
蛋白质表达和纯化
参见实施例1中的部分。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
参见实施例1中的部分。
抗原制备和免疫
基于对来自SEC纯化的级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，产生高纯度的抗原样品。最终抗原样品中仅包括不含杂质的级分。抗原样品构成携带所有人表位的单个嵌合λ-FLC恒定结构域变体，以引发具有与人游离轻链的所有同种型同样好地相互作用的能力的全体pAb。在即将皮下免疫三月龄兔之前，将抗原样品与弗氏不完全佐剂(FIA)以等量(1:1)混合。在免疫前和最后一次免疫后七周收集血清。通过添加最终浓度15mM的叠氮化钠(NaN3)来保存血清，并在4℃下储存。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
用包被缓冲液(10mM Na2HPO4，145mM NaCl，0.1％ Tween-20，pH 7.2)将人完整IgG和SEC纯化的IgG稀释至1μg/mL，并用于在4℃下包被96孔板过夜。将所有一级pAb(A0101、实施例1IgG级分(IgGf实施例1)和实施例2IgG级分(IgGf实施例2))用5％脱脂乳从10μg/mL开始进行3倍连续稀释。将板使用洗涤缓冲液(10mM Na2HPO4，500mM NaCl，0.1％ Tween-20，pH 7.2)洗涤，并在室温下搅拌下与一级pAb孵育1小时。随后用洗涤缓冲液洗涤，并与在5％脱脂乳中稀释至10μg/mL的二级pAb(抗兔IgG，P0448)在搅拌下孵育1小时。最后，将板用洗涤缓冲液洗涤，并在添加100μL/孔的TMB(DAKO S1599)后显影5分钟。通过向每个反应孔中添加100μL0.5M H2SO4来终止反应。通过使用SOFTMAXTM6.2.1的ELISA读取器检测结果，检测波长为450nm和650nm。
凝集测定
使用ABX Pentra400(HORIBA)仪器进行比浊法测定，以测量随时间渐增的凝集。将仪器波长调节至340nm和700nm，以便探测在凝集反应期间产生的聚集体。分析杯含有154μlS2007缓冲液(DAKO)、8μL抗原、31μL pAb和5μL H2O。得到198μL的最终反应体积。将抗原稀释至2mg/mL(人IgG，0.54μM最终浓度)或1mg/mL(兔IgG，0.27μM最终浓度)，并从此时起每个稀释步骤稀释2次，最终得到九种浓度。所有凝集实验均在10mg/mL(10.5μM最终浓度)的pAb浓度下进行，以确保低群集(populated)的IgG子群体也在可测量范围内。
实施例3：
此实施例展示用于制备和使用如本文所提供的嵌合或重组免疫原的示例性方法。
在此实施例中，抗原(或免疫原)中的潜在表位的数量有所降低。例如，已经除去多个疏水表位，目的是开发具有较少疏水互补位的多克隆抗体。这些变化将使多克隆抗体更加可用于颗粒增强比浊法中。
材料和方法
表位选择
从数据库读取人和兔血清淀粉样蛋白A1(SAA1)序列(Uniprot分别为：P0DJI8和P53614)。比对序列以鉴定两个物种之间亲水区中的序列差异。通过比对和检查人SAA1(PDB条目：4IP8)的晶体结构来进行表位的选择。不选择氢键中涉及的残基。
蛋白质表达和纯化
编码SAA1或兔SAA的嵌合变体的构建体以订购，作为克隆到pET30a(+)中的质粒。将构建体设计为具有N末端His标签和之后的TEV切割位点，以将His标签与SAA1恒定结构域分离。使用大肠杆菌菌株BL21(InvitrogenTM)在包涵体中表达重组兔SAA1结构域和具有移植到兔支架上的人表位的嵌合SAA1结构域变体。收获细胞并将其重悬于8M尿素、20mM Tris，pH 8.5中，旋转并用0.2μm过滤器过滤，然后使用His标签柱(GEHealthcare)通过亲和色谱(IMAC)固定重组蛋白。将经固定的蛋白质用洗涤缓冲液(20mMTris-HCL，1M NaCl，20mM咪唑，pH 8.5)以至少15个柱体积洗涤，并用洗脱缓冲液(20mMTris-HCL，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.5)洗脱。将经His标记的重组蛋白针对20mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液透析，然后添加补充有2mM二硫苏糖醇(DTT，最终浓度)的TEV蛋白酶(0.2mg/mL，最终浓度)。将切割反应放置最少4小时，然后通过将混合物加载到His标签柱上来将经切割的重组蛋白与His标签、TEV蛋白酶和未切割的重组蛋白分离。收集含有未经标记的重组蛋白的流出物。将样品通过针对结合缓冲液透析解折叠，并使用尺寸排阻色谱(SEC)SUPERDEX 75PREP GRADTM(GE Healthcare)，以结合缓冲液为洗脱液，进一步纯化。最后，将SEC纯化的重组蛋白通过针对20mM Tris，pH透析再折叠，并用作抗原。为了分析(ELISA和凝集测定)，重组蛋白可以保留His8标签。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
使用预制NuPage 4-12％ Bis-Tris凝胶(InvitrogenTM)通过SDS-PAGE跟踪蛋白质纯度。用SDS样品缓冲液(350mM Tris.HCL，357mM十二烷基硫酸钠，44.6％甘油，179μM溴酚蓝，pH 6.8)加载所有蛋白质样品，并在MESSDS运行缓冲液中进行。将凝胶用SimplyBlueTM(InvitrogenTM)染色。对于蛋白质印迹，将NuPage 4-12％ Bis-Tris凝胶(InvitrogenTM)和MESSDS运行缓冲液/>用于分离蛋白质。在30V下进行电印迹1小时，并将蛋白质转移到蛋白质印迹缓冲液(25mM Tris，0.192M甘氨酸和乙醇25.3％)中的PVDF膜(BioRad)。在印迹之后，使用封闭缓冲液(50mM Tris-HCL，0.5M NaCl，0.5％Tween20，pH 9.0)进行封闭步骤。将含有经转移蛋白质的经封闭的PVDF膜与一级pAb(稀释1000x的兔抗大肠杆菌)在+4℃下在振荡下孵育1小时(最少)。在将膜与二级pAb(猪抗兔)孵育1小时之前，将膜用封闭缓冲液洗涤4x 10min。在与二级pAb孵育后，将膜用封闭缓冲液洗涤4x 10min，并与DAB(二氨基联苯胺)加底物孵育20min。
抗原制备和免疫
基于对来自SEC纯化的级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，产生高纯度的抗原样品。最终抗原样品中仅包括不含杂质的级分。在即将皮下免疫三月龄兔之前，将抗原样品与弗氏不完全佐剂(FIA)以等量(1:1)混合。在免疫前和最后一次免疫后七周收集血清。通过添加最终浓度15mM的叠氮化钠(NaN3)来保存血清，并在4℃下储存。
人表位向兔支架上的转移：
如图18A所示，使用序列比对发现人和兔血清淀粉样蛋白A(SAA)序列差异，其中人序列为SEQ ID NO:9，并且兔序列为SEQ ID NO:10。图18B展示了嵌合血清淀粉样蛋白A(SAA)序列(SEQ ID NO:11)，其显示了移植到兔骨架(红色)序列上的所选的表位(黑色、加下划线和加粗)，所述所选的表位具有位于亲水区中的物种特异性序列。
图19示意性地展示了SAA的图像，左边图像显示了移植到兔骨架(红色)序列上的人表位(阴影较浅或黄色残基)。
将经合成的序列插入表达载体中。将嵌合蛋白在大肠杆菌中表达并在免疫前纯化。
实施例4：
此实施例展示用于制备和使用如本文所提供的嵌合或重组免疫原的示例性方法。
在此实施例中，制备构建体，所述构建体设计成使经免疫的兔产生针对人κ轻链恒定结构域中的隐藏表位的多克隆抗体。预计这种抗体对人κ游离轻链具有特异性，因此可用于针对来自例如骨髓瘤患者的样品的诊断目的。
材料和方法
表位选择
从数据库读取人和兔κ游离轻链(κ-FLC)序列(Uniprot分别为：P01834和P01840)。比对序列以鉴定两个物种之间κ-FLC恒定结构域的序列差异。通过比对和检查人κ-FLC(PDB条目：6n35)和完整的人IgG(PDB条目：1hzh)的晶体结构来进行表位的选择。将PISA服务器用于鉴定具有少于10％溶剂暴露残基的表面表位。将这些残基包括在嵌合变体中以产生特异性κ-FLC pAb。
蛋白质表达和纯化
编码κ-FLC或兔κ-FLC的嵌合变体的构建体(B4)以订购，作为克隆到pET22(+)中的质粒。将构建体设计为具有N末端His标签和之后的TEV切割位点，以将His标签与κ-FLC恒定结构域分离。使用大肠杆菌菌株BL21(InvitrogenTM)周质表达重组兔κ-FLC恒定结构域和具有移植到兔支架上的人表位的嵌合恒定结构域变体。将含有重组蛋白的溶原性肉汤培养基针对结合缓冲液(20mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH 7.4)透析，之后使用His标签柱(GE Healthcare)通过亲和色谱(IMAC)固定重组蛋白。将经固定的蛋白质用洗涤缓冲液(20mM Na2HPO4，1M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)以至少15个柱体积洗涤，并用洗脱缓冲液(20mM Na2HPO4，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱。将经His标记的重组蛋白针对结合缓冲液透析，然后添加补充有2mM还原的L-谷胱甘肽(最终浓度)的TEV蛋白酶(0.2mg/mL，最终浓度)。使切割反应放置4小时，之后使经切割的重组蛋白与His标签、TEV蛋白酶和未切割的重组蛋白分离，将混合物加载到His标签柱上，并收集流出物且其含有未标记的重组蛋白。使用尺寸排阻色谱(SEC)SUPERDEX 75PREP GRADTM(GE Healthcare)，以结合缓冲液为洗脱液，进一步纯化样品。为了分析(ELISA和凝集测定)，重组蛋白可以保留His8标签。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
与实施例1所述相同。
抗原制备和免疫
基于对来自SEC纯化的级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，产生高纯度的抗原样品。最终抗原样品中仅包括不含杂质的级分。在即将皮下免疫兔之前，将抗原样品与弗氏不完全佐剂(FIA)以等量(1:1)混合。通过添加最终浓度15mM的叠氮化钠(NaN3)来保存血清，并在4℃下储存。
人表位向兔支架上的转移
图20A示出了如何使用序列比对发现人(SEQ ID NO:12)和兔(SEQ ID NO:13)κ-FLC恒定结构域序列差异。
图20B展示了具有移植到兔骨架(蓝色)序列上的所选表位(黑色，加下划线和加粗)的嵌合序列(SEQ ID NO:14)。
图21展示了选择的表位(在左边图像中阴影较浅或黄色)，这些表位是位于所选隐藏区域中的物种特异性序列。
合成嵌合序列并将其插入表达载体中。
抗原的制备
将表达构建体转化到来自相关生物体的细胞中，并用于生产重组蛋白。使用标准方法(如HIS-trap柱和尺寸排阻柱(SEC))纯化蛋白质。
图22A展示了显示蛋白表达的SDS-PAGE，以证明蛋白的过表达，在沉淀物(P)和上清液(S)中的预期条带处于大约13kDa至14kDa(箭头)。
图22B展示了显示TEV切割和SEC之后的蛋白纯度的SDS-PAGE；
图22C展示了显示TEV切割和SEC之后的蛋白纯度的蛋白质印迹(WB)。
基于SDS-PAGE和WB，将纯级分(Fx)合并并构成抗原。在蛋白质印迹DAKO A0100中，多克隆κ-FLC产物被用作阳性对照(10)，以证明嵌合抗原的功能。先前已示出用于验证样品纯度的抗大肠杆菌pAb的功能(参见λ-FLC例子图2C)。
对于SDS-PAGE中的大小测定，使用BENCHMARKTM分子量(220、160、120、100、90、80、70、60、50 40、30、25、20、15、10kDa)，并在WB中使用PAGERULERTM预染色的蛋白梯状标志(180、130、100、70(橙色)、55、40、35、25、15、10(绿色)kDa)。
图23展示了ELISA数据，所述ELISA数据显示来自用嵌合rhκ-Cd免疫的兔的抗血清是特异性的，针对重组兔κ恒定结构域(D)没有或几乎没有反应性，但针对人κ-FLC具有反应性(B)。所述抗血清也针对完整的人IgG显示较低的反应性(A)，表明比对照A0100更具特异性。
图24展示了凝集实验，所述凝集实验显示抗血清能够凝集人κ-FLC(C)，但不能凝集完整的人IgG。证明抗血清与多于一个表位反应，并且这些表位隐藏在人完整IgG中。
实施例5：制备嵌合抗原
此实施例展示用于制备和使用如本文所提供的嵌合免疫原的示例性方法。
对于人IgG亚型1-4，根据如本文所提供的方法设计抗原，并重组产生抗原并使用色谱纯化抗原。
材料和方法
表位选择
比对人IgG同种型(1、2、3和4)和兔IgG序列以鉴定IgG的Ch1-Ch2-Ch3区域中的同种型序列差异。通过检查整个IgG(pdb条目：1hzh)的晶体结构，仔细选择表位。
蛋白质表达和纯化
标准HEK细胞表达，然后进行蛋白A或蛋白G纯化，并使用PBS作为洗脱液通过SEC进一步纯化。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
与实施例1所述相同。
抗原制备和免疫
基于对来自SEC纯化的级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，产生高纯度的抗原样品。最终抗原样品中仅包括不含杂质的级分。在即将皮下免疫三月龄兔之前，将抗原样品与弗氏不完全佐剂(FIA)以等量(1:1)混合。在免疫前和最后一次免疫后七周收集血清。通过添加最终浓度15mM的叠氮化钠(NaN3)来保存血清，并在4℃下储存。
人表位向兔支架上的转移：
图24A-图24B展示了如何使用序列比对发现人和兔γ免疫球蛋白(IgG)序列差异；具有所选表位(图24A：有色和加下划线；图24B，加下划线和加粗)的嵌合序列被移植到兔骨架序列上，并被合成并插入到表达载体中；兔骨架(SEQ ID NO:15)；rhIgG1(SEQ ID NO:16)；rhIgG2(SEQ ID NO:17)；rhIgG2_2(SEQ ID NO:18)；rhIgG3(SEQ ID NO:19)；rhIgG4(SEQ ID NO:20)。
图25A-图25F展示了通过如本文所提供的方法制备的兔和嵌合IgG，其中人同种型特有表位(有色)被移植到兔IgG骨架(灰色)上；其中图25A展示了没有插入人表位的兔IgG骨架；并且图25B展示了插入人表位(有色)的嵌合IgG1亚型，图25C展示了插入人表位(有色)的嵌合IgG2亚型，图25D展示了插入人表位(有色)的嵌合IgG2_2亚型，图25E展示了插入了人表位(有色)的嵌合IgG3亚型，并且图25F展示了插入人表位(有色)的嵌合IgG4亚型。
实施例6：重组人表位的制备
在此实施例中，证明了人表位可以被取代到非人多肽背景上，在此实施例中，被取代到免疫球蛋白背景上，并且具体地在此实施例中，被取代到兔IgG背景上，以赋予经免疫动物(在此实施例中，在经免疫兔中)产生的抗体应答同种型特异性，或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型特异性。换句话说，例如，当通过用来自人IgG1的氨基酸取代兔氨基酸而在兔免疫球蛋白多肽(Ig)中产生人IgG1表位时，用此嵌合Ig免疫的动物的抗体应答对人IgG1同种型Ig具有特异性。经取代的人表位替代兔表位，换句话说，人表位取代所选兔表位。
如图27A所示，构建兔IgG，所述兔IgG携带对人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有特异性的表位(或在其中已被所述表位取代)；人表位(在兔Ig中取代的人氨基酸残基)以深色展示。
如以图形方式所示，图27B-图27E分别显示了兔对兔Ig中人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4表位的免疫应答。在所有四种情况下(人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4表位)，看到类似低水平的背景(点)。相反，在用携带对人IgG3或IgG4具有特异性的表位的兔IgG免疫的兔中特异性信号(实线滴定曲线)高，而在用携带对人IgG1或IgG2具有特异性的表位的兔IgG免疫的兔中特异性信号更低(或中等)。
这些数据一起证明，人表位(包括不限于人Ig同种型表位)可以被取代到兔IgG背景上，并导致兔产生人表位特异性免疫应答(例如，在经免疫兔中引发IgG1-4亚型应答特异性)。
由于在用携带对人IgG1或IgG2具有特异性的表位的兔IgG免疫的兔中特异性信号更低(或中等)，因此重新设计两种IgG1或IgG2亚型，以改善兔对Ig1和IgG2表位的反应性；嵌合IgG1和IgG2亚型免疫原的修正变体的氨基酸序列在图27F中示出，加下划线的氨基酸残基表示人表位。
实施例7：除去所选表位
在此实施例中，展示了特定表位的除去(或一个类型的表位取代另一个类型表位)如何导致改善所得的所产生抗体的表现；具体地，显示了所选人疏水残基(其取代非疏水残基)的除去得到疏水性较低且因此自缔合较少的抗体，并且当疏水性较低的Ig在凝集反应中附接至珠时，自缔合的减少导致其表现有所改善。在此实施例中，将经取代的表位插入兔血清淀粉样蛋白A(SAA)多肽背景或骨架中。
图28A展示了兔血清淀粉样蛋白A(SAA)骨架，其中红色残基(或更深颜色)是兔SAA序列，并且黄色(或更浅颜色)表示插入的人特有氨基酸。
图28B展示了人SAA，其中蓝色(或更深颜色)或圈出的残基指示可能与脂质表面相互作用的六个疏水残基。
构建嵌合SAA，其中六个疏水人(蓝色)部分或圈出的残基被对应的兔氨基酸替代，如图28A所示。
图28C展示了通过用与珠偶联的图28A所示的SAA免疫得到的抗体。
图28D展示了通过用如图28B所示的SAA免疫得到的抗体导致具有抗体(Ab)的免疫颗粒，所述抗体包含一些识别人疏水(蓝色)表位的互补位。
图28E-图28F是显示C和D与五种不同水平的SAA反应的动力学的图。
对于图28A-图28B，与兔SAA相比，在人SAA中不同的氨基酸残基以黄色(或更浅颜色的残基)和蓝色(或更深颜色且圈出的残基)显示。在图28B中，六个蓝色(或更深颜色且圈出的)残基是潜在参与SAA与脂质颗粒的结合的疏水表位。
当将SAA多克隆抗体缀合到胶乳颗粒上时(图28D)，表面包括对疏水表位具有特异性的互补位(用蓝色或圈出的残基表示)。当将此类珠添加到含有SAA的反应缓冲液中时，首先观察到OD的异常降低。此后，OD随着珠结合SAA而增加，并增加流体的浊度。
相反，当使用与通过用在六个蓝色或圈出的残基位置具有兔序列的SAA(如图28A所示)免疫得到的抗体偶联的珠时，OD正常地立即增加。
所提出的解释是，所述六个疏水残基诱导具有互补位的一些疏水特征的抗体。由于这些疏水互补位，所述抗体标记的珠可能在一定程度上变得相关。当将此类珠放入反应缓冲液中时，此类珠分散，从而引起降低的吸光度，直到凝集反应接管并引起吸光度增加。
具有插入的人氨基酸残基的兔SAA的氨基酸序列如下，加粗残基表示非疏水插入人残基，并且加下划线的残基表示兔疏水残基：
实施例8：慢反应表位的产生
在此实施例中，展示了仅用几个人特有氨基酸(aa)残基取代的嵌合C反应蛋白(CRP)抗原的构建，并且用此经修饰的嵌合多肽免疫可导致慢反应抗体的产生。
图29以图形方式展示了数据，所述数据显示用不完全人表位免疫可以提供针对人CRP的慢反应多克隆抗体(srpAb)。标准兔抗人CRP多克隆抗体为蓝色，并且srpAb为红色。通过用携带部分是人且部分是兔的人工表位的兔CRP免疫兔来制备srpAb。从在3个月内接受6次免疫的充分免疫的兔中获得srpAb。将两种抗体滴定以具有相同浓度的针对人CRP的抗体。
可以发现人表位引导慢反应抗CRP抗体的表达。上部或蓝色曲线显示当使用DAKO多克隆兔抗人CRP抗体时的吸光度动力学。下部或红色曲线显示当使用通过使用具有一个人表位的兔CRP免疫得到的多克隆兔抗人CRP抗体时的吸光度动力学。应当理解，也可以通过插入来自第二物种的至少一个氨基酸或缺失来自第一物种的至少一个氨基酸来产生慢反应表位。
实施例9：在铁蛋白骨架上构建多肽表位
在此实施例中，展示了包含兔铁蛋白骨架或核心的嵌合分子的构建，其中表位特异性嵌合模块经由接头附接到所述嵌合分子上。
在替代实施方案中，重组铁蛋白形成24-mer同聚体，所述同聚体即使当N末端或C末端编码突出杆状物在遗传上发生改变以携带其他蛋白质序列时也可自组装。根据许多出版物，由于病毒颗粒状结构具有许多重复，其引起非常高水平的滴度。
在替代实施方案中，表位特异性嵌合模块附接到兔铁蛋白骨架，使得所述表位特异性嵌合模块从铁蛋白核心或球向外突出，所述铁蛋白核心或球可以包含24个重组铁蛋白分子。在功能上，兔铁蛋白是一种融合有多个嵌合蛋白的“沉默”载体(因为在兔中没有针对铁蛋白核心产生免疫反应，由于铁蛋白源于被免疫的物种)。
图30A-图30B展示了示例性嵌合铁蛋白构建体(图30A)，其包含附接的来自兔的已被人表位取代的免疫球蛋白抗原CDv6，其中所述CDv6单独描绘在图30B中。嵌合CDv6-铁蛋白抗原可以产生或引导高水平的针对CDv6中的人表位的多克隆抗体，但CDv6的铁蛋白核心或球和非人序列在被免疫的物种中是非免疫原性的(即，不会产生抗体应答)。图30A展示了示例性嵌合免疫原，其包含经由(GGGGS)5接头(SEQ ID NO:29，显示为杆状结构)与嵌合兔CdV6融合的24-mer兔铁蛋白。图30B示意性地展示了嵌合CdV6，其包含金色(或更浅颜色)的兔-人恒定结构域，并且插入的人表位为红色(或更深颜色)。
在替代实施方案中，将铁蛋白“球”或核心的每个单独的铁蛋白分子连接到抗原基序的接头被选择为尽可能非免疫原性的和/或不存在于待用衍生的多克隆抗体分析的人样品中发现的蛋白质。例如，所述接头可以是包含聚G的接头，例如，GGGGS(SEQ ID NO:31)接头，或等效物。
在替代实施方案中，“沉默”或非免疫原性的铁蛋白载体蛋白由可以彼此结合成对并高度特异性地结合在一起的两种组分(如卷曲螺旋基序)中的一种制得。当第二组分(或卷曲螺旋基序)与免疫原性多肽(如CDv6)结合时，其将CDv6部分“速接(click)”到铁蛋白球或核心中(或在其表面上)的单独重组铁蛋白分子上的卷曲螺旋基序上，使得所述免疫原性多肽远离所述铁蛋白球或核心突出展示。这样，可以制备携带多达24个拷贝的包含来自不同物种的表位的免疫原性多肽如CDv6的铁蛋白球或核心，并将其用于免疫，以及高滴度的对所述免疫原性多肽具有特异性(例如，对插入CDv6中的人表位具有特异性)的多克隆抗体。
在替代实施方案中，卷曲螺旋基序包含γ-氨基丁酸B型受体亚基1异形体X1(GBR1)和/或γ-氨基丁酸B型受体亚基2(GBR2)，其中GBR1可以选择性地结合GBR2基序。在替代实施方案中，GBR1基序包含：
STNNNEEEKSRLLEKENRELEKIIAEKEERVSELRHQLQSR(SEQ ID NO:33)。
在替代实施方案中，GBR2基序包含：SVNQASTSRLEGLQSENHRLRMKITELDKDLEEVTMQLQDT(SEQ ID NO:34)。
在替代实施方案中，通过使用非免疫原性接头将GBR1基序与铁蛋白分子的氨基末端结合，例如如下所示，其中GBR1基序加下划线且接头加粗，并且其余氨基酸残基包含铁蛋白分子：
N末端-STNNNEEEKSRLLEKENRELEKIIAEKEERVSELRHQLQSR MTSQIRQNYSPEVEAAVNHLVNLHLRASYT YLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREAAERLLKMQNQRGGRALFQ DVQKPSQDEWGKTLNAMEAALALEKNLNQALLDLHALGSAHTDPHLCDFLENHFLDEEVKLLKKMGDHLTNIRRLSGPQASLGEYLFERLTLKHD-C末端(SEQ ID NO:35)。
在替代实施方案中，嵌合抗原附接至卷曲螺旋基序如GBR1或GBR2基序的氨基末端，任选地通过非免疫原性接头共价附接。
在替代实施方案中，附接至或连接至嵌合抗原(任选地CDv6)的卷曲螺旋基序(任选地GBR1或GBR2基序)结合(或被结合)至与铁蛋白分子共价结合或连接(任选地通过使用非免疫原性接头)的卷曲螺旋基序(任选地GBR1或GBR2基序)，以产生如图34B所示的异二聚体。
在替代实施方案中，对进一步纯化的需要是不必要的或很小的，因为卷曲螺旋兔铁蛋白球和CDv6骨架来自兔，并且因此在兔中是免疫沉默的。
在替代实施方案中，将免疫沉默的铁蛋白载体蛋白改变为携带允许位点特异性化学修饰的序列。作为一个例子，插入已知赋予乙酰化热点的His(6)-Lys-His(3)(SEQ IDNO:32)标签，其中对于每个接头有一个His(6)-Lys-His(3)(SEQ ID NO:32)标签在铁蛋白核心的远端附接至接头。允许重组铁蛋白-His(6)-Lys-His(3)(SEQ ID NO:32)偶联至激活部分，并形成具有多达24个单元的此类突出免疫原性部分的铁蛋白球并将其应用于免疫。
图31展示了蛋白质印迹的图像，所述图像显示针对免疫原CdV6(嵌合兔-人游离轻链结构域)引发的用作一级IgG的pAb(样品1108)与来自尺寸排阻纯化柱的“B9”级分(柱#2和#1是不同的纯化级分)和来自尺寸排阻的“20级分”相互作用，表明即使在20μg/mL下，抗人血清对B9和级分20也没有反应性或反应性微小；当使用多40倍的pAb时观察到轻微的反应性，可能来自与人铁蛋白的交叉反应性。
图32以图形方式展示了数据，所述数据显示动态光散射(DLS)或按照强度的尺寸分布(尺寸随强度变化)，所述数据显示大约10至15nm Rh是经纯化蛋白质样品中的主要粒度；这与计数接头和结构域时20至30nm的预期直径非常吻合。
图33以图形方式展示了数据，所述数据显示与铁蛋白融合的表达的CDv6被正确折叠。对人λ表位具有特异性的兔多克隆抗体识别示例性铁蛋白-CDv6结构域融合蛋白。由于对人λ轻链表位具有特异性的多克隆兔抗体在组装成24mer结构时既与CDv6结构域交联又与铁蛋白-CDv6融合蛋白交联，因此可以得出结论，当与铁蛋白融合时，CDv6结构域被正确折叠。凝集速率与两种蛋白质的尺寸(半径)相关，表明所述速率由扩散决定。
图34A展示了包含其中插入人表位的经修饰的CdV6的示例性重组铁蛋白的序列(SEQ ID NO:35)，加下划线的部分是CdV6序列，并且加粗的残基是接头序列，并且所述序列的其余部分是兔铁蛋白残基。
图34B(SEQ ID NO:36)展示了通过以下的非共价结合形成的异二聚体：(1)嵌合重组抗原，其中嵌合重组抗原与卷曲螺旋GBR2基序(SEQ ID NO:27)的氨基末端共价结合；与(2)GBR1基序(加下划线)(SEQ ID NO:26)，其通过使用非免疫原性接头(加粗)与铁蛋白分子的氨基末端结合(SEQ ID NO:28)；其中所述异二聚体的两个亚基通过GBR1基序与GBR2基序的缔合非共价结合。在一个实施方案中，24个异二聚体接合在一起形成向外部环境展示抗原的“球”或核心；因此，当将24-mer作为免疫原施用时，其可有效产生针对所展示抗原的免疫应答。
已描述了本发明的许多实施方案。然而，可以理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方案在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 安捷伦科技有限公司
<120> 嵌合免疫原和用于制备针对特定表位的多克隆抗体的方法
<130> 6363.139819PCT
<140> 有待分配
<141> 2022-05-03
<150> US 63/183,616
<151> 2021-05-03
<160> 36
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> 兔
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Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
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Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
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<220>
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Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Asn Asp
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Phe Tyr Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
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Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
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Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser
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<212> PRT
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Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Asn Asp
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Phe Tyr Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
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Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
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Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
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Glu Lys Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
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Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
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Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
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Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
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Glu Lys Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
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Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
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Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
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Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Ile Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
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Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr
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Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser Val Thr
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Gln Gly Val Asp Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
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Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Glu Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
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Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
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Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
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Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser Ala Asn Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
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Glu Lys Ser Leu Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
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Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
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Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
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Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
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Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Thr Asp Ala Arg Glu Asn
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Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg
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Gln Arg Trp Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Thr Gln Gly Ala Trp Asp
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Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Asn Ala
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Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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Arg Ser Trp Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Thr Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
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Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
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Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
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Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr
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<213> 智人 (Homo sapiens)
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<223> 兔
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Gly Asp Pro Val Ala Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp
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Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr
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Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr
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Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Gly Asp Pro Val Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp
1 5 10 15
Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Ser Ile Val Cys Leu Ala Asn Lys Tyr
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Tyr Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr
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Thr Gly Ile Gln Asn Ser Val Thr Glu Gln Asn Ser Ala Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser
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Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
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Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
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Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
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Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
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Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
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Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
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Pro Gly Lys
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 16
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
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Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Ile Cys
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Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Ala
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Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
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Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
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Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
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Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Asp Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
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Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
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Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
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Pro Gly Lys
<210> 17
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Pro Gly Lys
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<223> 合成
<400> 18
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
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Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
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Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 19
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Ser Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Ile Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 20
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Ser Pro Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Glu Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 21
<211> 323
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 兔
<400> 21
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 22
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Ile Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Asp Lys Thr His Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Asp Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 23
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Asn Phe Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
85 90 95
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Pro Pro Val Ala Gly Gly Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
115 120 125
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp
130 135 140
Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr
145 150 155 160
Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val
165 170 175
Val Ser Thr Leu Pro Ile Val His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu
180 185 190
Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
195 200 205
Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr
210 215 220
Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr
225 230 235 240
Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu
245 250 255
Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu
260 265 270
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr
275 280 285
Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu
290 295 300
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly
305 310 315 320
Lys
<210> 24
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Arg Ser Trp Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Thr Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Leu Gln Arg Leu Met Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg
85 90 95
Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr
100
<210> 25
<211> 175
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 兔铁蛋白
<400> 25
Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Pro Glu Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn His Leu Val Asn Leu His Leu Arg Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Ala Ala Glu
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln
65 70 75 80
Asp Val Gln Lys Pro Ser Gln Asp Glu Trp Gly Lys Thr Leu Asn Ala
85 90 95
Met Glu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Lys Asn Leu Asn Gln Ala Leu Leu
100 105 110
Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala His Thr Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Asn His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Leu Lys Lys
130 135 140
Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile Arg Arg Leu Ser Gly Pro Gln Ala
145 150 155 160
Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 26
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 人铁蛋白
<400> 26
Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala
85 90 95
Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu
100 105 110
Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys
130 135 140
Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala
145 150 155 160
Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 27
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
35 40 45
Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser Ala Asn Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Pro Glu Val
130 135 140
Glu Ala Ala Val Asn His Leu Val Asn Leu His Leu Arg Ala Ser Tyr
145 150 155 160
Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu
165 170 175
Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu
180 185 190
Ala Ala Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Phe Gln Asp Val Gln Lys Pro Ser Gln Asp Glu Trp Gly Lys Thr
210 215 220
Leu Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Lys Asn Leu Asn Gln
225 230 235 240
Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala His Thr Asp Pro His
245 250 255
Leu Cys Asp Phe Leu Glu Asn His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu
260 265 270
Leu Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile Arg Arg Leu Ser Gly
275 280 285
Pro Gln Ala Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys
290 295 300
His Asp
305
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
35 40 45
Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser Ala Asn Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 30
<211> 175
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 兔铁蛋白
<400> 30
Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Pro Glu Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn His Leu Val Asn Leu His Leu Arg Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Ala Ala Glu
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln
65 70 75 80
Asp Val Gln Lys Pro Ser Gln Asp Glu Trp Gly Lys Thr Leu Asn Ala
85 90 95
Met Glu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Lys Asn Leu Asn Gln Ala Leu Leu
100 105 110
Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala His Thr Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Asn His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Leu Lys Lys
130 135 140
Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile Arg Arg Leu Ser Gly Pro Gln Ala
145 150 155 160
Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
His His His His His His Lys His His His
1 5 10
<210> 33
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Ser Thr Asn Asn Asn Glu Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu
1 5 10 15
Asn Arg Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser
20 25 30
Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Arg
35 40
<210> 34
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Ser Val Asn Gln Ala Ser Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu
1 5 10 15
Asn His Arg Leu Arg Met Lys Ile Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu
20 25 30
Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Thr
35 40
<210> 35
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Gly Gln Pro Ala Val Thr Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser
35 40 45
Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser Ala Asn Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Pro Glu Val
130 135 140
Glu Ala Ala Val Asn His Leu Val Asn Leu His Leu Arg Ala Ser Tyr
145 150 155 160
Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu
165 170 175
Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu
180 185 190
Ala Ala Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Phe Gln Asp Val Gln Lys Pro Ser Gln Asp Glu Trp Gly Lys Thr
210 215 220
Leu Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Lys Asn Leu Asn Gln
225 230 235 240
Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala His Thr Asp Pro His
245 250 255
Leu Cys Asp Phe Leu Glu Asn His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu
260 265 270
Leu Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile Arg Arg Leu Ser Gly
275 280 285
Pro Gln Ala Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys
290 295 300
His Asp
305
<210> 36
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Ser Thr Asn Asn Asn Glu Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu
1 5 10 15
Asn Arg Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser
20 25 30
Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Pro Glu Val Glu
65 70 75 80
Ala Ala Val Asn His Leu Val Asn Leu His Leu Arg Ala Ser Tyr Thr
85 90 95
Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu
100 105 110
Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Ala
115 120 125
Ala Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu
130 135 140
Phe Gln Asp Val Gln Lys Pro Ser Gln Asp Glu Trp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Lys Asn Leu Asn Gln Ala
165 170 175
Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala His Thr Asp Pro His Leu
180 185 190
Cys Asp Phe Leu Glu Asn His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Leu
195 200 205
Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile Arg Arg Leu Ser Gly Pro
210 215 220
Gln Ala Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His
225 230 235 240
Asp

Claims (17)

1.一种嵌合或重组多肽，所述嵌合或重组多肽包含：
(a)源自第一物种的多肽，和
(b)源自至少第二物种的至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基，
其中，源自所述第二或另外的物种的所述至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分，
并且所述嵌合或重组多肽的氨基酸序列基本上由源自所述第一物种的氨基酸序列构成，并且当来自所述第二物种的氨基酸序列被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分时，在源自所述第一物种的多肽上生成、形成或产生至少一个新表位，当将所述嵌合或重组多肽施用于所述第一物种时，所述至少一个新表位能够使所述第一物种产生对所述至少一个新表位具有特异性的体液抗体应答，
其中当所述嵌合或重组多肽被用于使所述第一物种的动物产生体液免疫应答时，在所述第一物种中如此产生的多克隆抗体基本上仅特异性结合所述至少一个新表位，并且基本上不特异性结合源自所述第一物种但缺乏所述至少一个新表位或多个新表位的多肽，所述至少一个新表位或多个新表位由被插入源自第一物种的多肽的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的源自所述第二或另外的物种的所述至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基产生、形成或生成。
2.根据权利要求1所述的嵌合或重组多肽，其中：
(a)源自所述第二物种的多肽是源自所述第一物种的多肽的同源物；
(b)来自所述至少一个第二物种的氨基酸序列与所述第一物种同源，并且被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的所述至少一个同源第二物种序列替代源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的所有或基本上所有结构同源区段或部分；
(c)来自所述至少一个第二物种的氨基酸序列与所述第一物种同源，并且被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的所述至少一个同源第二物种序列与源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列结构同源；
(d)第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约25％至99％的序列同一性；
(e)所述第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有基本上相同的二级和/或三级结构；
(f)第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约25％至99％的序列同一性，并且与其在所述第二物种中的同源物具有基本上相同的二级和/或三级结构，或者，第一物种的同源物与其在所述第二物种中的同源物具有至少约50％的序列同一性，或与其在所述第二物种中的同源物具有至少约70％的序列同一性，或与其在所述第二物种中的同源物具有至少约80％的序列同一性，或与其在所述第二物种中的同源物具有至少约90％的序列同一性；和/或
(g)当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有约2至约8的Z得分，或者当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少8的Z得分。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的嵌合或重组多肽，其中：
(a)源自所述第一物种的多肽和其源自所述第二物种的同源多肽是抗体；
(b)源自所述第一物种的多肽和源自所述第二物种的所述至少一个异源氨基酸序列源自抗体重链或抗体轻链；
(c)所述抗体重链是IgM、IgG、IgA或IgE同种型重链，或所述轻链是κ或λ轻链；
(d)所述第一物种是哺乳动物物种；所述第二物种是哺乳动物物种；或者，所述第一物种是鸡形目或稚科属物种，并且所述第二物种是哺乳动物物种；
(e)所述第一物种是兔、鼠物种、绵羊、山羊、猪、牛、马或鸡；并且所述第二物种是人；
(f)所述鼠物种是大鼠或小鼠；
(g)所述嵌合或重组多肽的氨基酸序列的至少约80％至约99％是源自所述第一物种的氨基酸序列，和/或所述嵌合或重组多肽的氨基酸序列的约1％至约20％之间是源自所述至少一个第二物种的氨基酸序列；
(h)一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个新表位被插入源自所述第一物种的多肽的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分；
(i)所述至少一个新表位包括源自抗体轻链的隐藏表面的表位，其中所述隐藏表面仅在所述抗体轻链游离且不是包含轻链和重链二者的IgG分子的一部分时暴露：
(j)通过以下设计由源自所述至少一个第二物种的所述至少一个异源氨基酸序列生成、产生或形成的所述表位：
(i)将源自所述第一物种的多肽的序列与其来自所述第二物种的同源多肽比对，
(ii)确定源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的一个或多个氨基酸序列差异，
(iii)选择源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的至少一个氨基酸序列差异，并且
(iv)修饰源自所述第一物种的多肽的序列，以与来自所述第二物种的同源多肽的所选的至少一个氨基酸序列匹配或相同；
(k)选择源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的至少一个氨基酸序列差异包括在来自所述第二物种的多肽的三维(3D)模型或结构上突出显示所确定的源自所述第一物种的多肽与其来自所述第二物种的同源多肽之间的一个或多个氨基酸序列差异，并且选择在所述多肽的暴露表面或外表面之中或之上的至少一个氨基酸序列差异；
(l)被插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分的来自所述至少一个第二物种的氨基酸序列包含：存在于人IgG3而不是人IgG1、IgG2或IgG4或兔IgG中的序列；存在于人IgG1而不是人IgG2、IgG3或IgG4或兔IgG中的序列；存在于人IgG2而不是人IgG1、IgG3或IgG4或兔IgG中的序列；或存在于人IgG4而不是人IgG1、IgG2或IgG3或兔IgG中的序列；
(m)通过进一步包括以下的方法制备所述嵌合或重组多肽：在将一个或多个新表位插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分之后，从源自所述第二或另外的物种的所述至少一个异源氨基酸序列或氨基酸残基中除去所述一个或多个新表位；
(n)将至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基插入源自所述第一物种的多肽的氨基酸序列的一部分中、与所述部分接合、在所述部分中产生、或者替代或取代所述部分；
(o)所述至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基来自不同的动物物种；
(p)所述至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个源自人，并且所述至少两个或更多个不同的异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个源自非人或动物物种；
(q)所述异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个包含并非源自所述至少第二物种的人工表位；
(r)所述异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个包含最初源自所述至少第二物种的表位，所述表位在所述第一物种中免疫沉默(不能在所述第一物种中产生抗体应答)，但被修饰成为能够使所述第一物种产生针对所述表位的抗体应答的免疫活性表位；
(s)在所述异源氨基酸序列或氨基酸残基中的至少一个新表位被修饰，使得所述第一物种针对经修饰的新表位产生的抗体的结合与可比的未经修饰的新表位的情况下相比更弱或更慢；和/或
(t)所述嵌合或重组多肽进一步包含与所述第一物种不同源的源自至少第二物种的至少一个新表位，并且所述至少一个新表位能够在所述第一物种中产生针对所述至少一个新表位的抗体。
4.一种重组多肽，所述重组多肽包含来自第一物种的第一多肽的一部分和来自第二物种的第二多肽的至少一部分，其中所述第二多肽的所述至少一部分是所述第一多肽的同源物，并且其中所述第二多肽的所述至少一个同源部分包含不存在于所述第一多肽中的表位。
5.根据权利要求4所述的重组多肽，其中：
(a)所述至少一个第二多肽的部分存在于或基本上存在于所述第一多肽的同源部分的位置处，并且已经替代或基本上替代所述第一多肽的同源部分；
(b)所述重组多肽包含第二多肽的至少一部分和第三多肽的至少一部分，所述部分各自是所述第一物种的不同序列的同源物，并且其中所述第二多肽的部分和所述第三多肽的部分各自包含不存在于所述第一多肽中的表位；
(c)所述第一多肽和所述第二多肽具有相似或基本上相同的三维结构；
(d)所述第一多肽和所述第二多肽具有至少约25％的氨基酸同一性，或具有至少约50％的氨基酸同一性，或具有至少约70％的氨基酸同一性，或具有至少约90％的氨基酸同一性；
(e)当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有约2至约8的Z得分，或者当使用距离矩阵比对来比对时，所述第一多肽和所述第二多肽具有至少8的Z得分；
(f)所述第一多肽中的至少一个序列被除去，并被所述第一多肽的同源部分替代；
(g)已被从所述第二多肽中除去的所述至少一个序列包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的序列；
(h)已被除去的所述至少一个序列包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的序列；
(i)已被替代的所述至少一个序列包含由单克隆抗体特异性识别的表位；
(j)已被替代的所述至少一个表位包含导致至少一种互补位亚型的表位，并且任选地已被替代的所述至少一个表位是优势表位；
(k)已被替代的所述至少一个表位是弱表位，或在所述第一物种中引发弱体液应答进而导致相对较低的抗体滴度的表位；
(l)所述第二多肽中的表位被修饰，以降低由所述第一物种产生的抗体的亲和力，未经修饰的表位；
(m)所述重组多肽包含来自第三物种的第三多肽的一部分，所述部分包含不存在于所述第一多肽或所述第二多肽中的表位；
(n)存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的至少一个表位已被并入所述重组多肽中；
(o)存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的至少一个表位被并入所述重组多肽中；
(p)来自所述第二多肽的表位被修饰，以增加特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体的亲和力，或者产生特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体对所述表位的亲和力；
(q)所述第一物种是兔，并且所述第二物种是人，并且任选地所述第一多肽是兔抗体轻链恒定结构域，并且所述第二多肽是人抗体轻链恒定结构域；和/或
(r)当将所述重组多肽施用于所述第一物种时，所述表位能够导致特异性结合所述第二多肽中的表位但不特异性结合所述第一多肽的抗体的产生。
6.一种重组核酸，所述重组核酸编码根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽。
7.根据权利要求6所述的重组核酸，其中：
(a)所述重组核酸进一步包含转录调节元件并且与所述转录调控元件可操作地连接，并且任选地所述转录调节元件包括启动子，并且任选地所述启动子是诱导型启动子或组成型启动子；
(b)所述重组核酸进一步包含编码另外的蛋白质或肽部分或结构域的序列，并且任选地所述另外的蛋白质或肽部分或结构域包含纯化部分或结构域以帮助纯化或分离由所述重组核酸编码的嵌合或重组抗体，并且任选地所述另外的蛋白质或肽部分或结构域包含组氨酸(聚his)标签或麦芽糖结合蛋白；
(c)所述重组核酸进一步包含位于所述纯化部分或结构域与编码所述嵌合或重组抗体的序列之间的编码蛋白酶切割位点的序列，并且任选地所述蛋白酶切割位点是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点；
(d)所述重组核酸包含能够由细胞机构识别以产生蛋白质的DNA、RNA和/或合成或经修饰的核苷酸；
(e)所述核酸包含3'帽或3'甲基化、5'和/或3'非翻译区和/或聚腺嘌呤(聚A)5'尾；和/或
(f)所述核酸或RNA包括mRNA。
8.一种表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒，所述表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒包含根据权利要求6至7中任一项所述的重组核酸。
9.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽，根据权利要求6至7中任一项所述的重组核酸，或根据权利要求8所述的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒，并且任选地所述细胞是细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
10.一种用于产生多克隆抗体或用于产生多克隆免疫血清的方法，所述多克隆抗体或所述多克隆免疫血清对表位具有特异性或与表位特异性结合，所述方法包括：
(a)向受试者施用根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽或用根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽免疫受试者，
(b)向受试者施用根据权利要求6至7中任一项所述的重组或嵌合核酸，或根据权利要求8所述的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒，或
(c)向受试者施用根据权利要求9所述的细胞，
其中，所述受试者是第一多肽来源的物种，并且所述表位源自所述第二多肽来源的物种。
11.根据权利要求10所述的方法，其中：
(a)所述受试者是哺乳动物或禽类物种，或所述受试者是兔、鼠物种、绵羊、山羊、猪、牛、马或鸡，并且任选地所述鼠物种是大鼠或小鼠；
(b)所述重组或嵌合核酸是RNA或DNA构建体；
(c)通过在细胞中表达重组核酸、或表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒来产生所述嵌合或重组多肽，并且任选地所述细胞是细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞；
(d)所述方法进一步包括在所述施用于或免疫所述哺乳动物之前基本上分离或纯化所述嵌合或重组多肽；
(e)所述分离或纯化包括使用疏水相互作用色谱法(HIC)、离子交换色谱法(IEC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、亲和纯化、吸附纯化或其任何组合；
(f)将所述施用(a)、(b)或(c)重复两次与二十次之间，或重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或以每2至20周或3至16周一次的间隔重复；
(g)所述方法产生基本上缺乏对所述表位不具有特异性或不特异性结合所述表位的抗体的多克隆抗体或多克隆免疫血清，并且任选地所述方法产生基本上包含对所述表位的错误折叠形式不具有特异性或不特异性结合所述表位的错误折叠形式的抗体的多克隆抗体或多克隆免疫血清；
(h)所述第一多肽中的至少一个序列被除去，并由所述第二多肽的一部分形成的表位替代，并且任选地所述第一多肽中已被除去的所述至少一个序列被包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的表位的序列替代，并且任选地所述第一多肽中已被除去的所述至少一个序列被包含存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的表位的序列替代，并且任选地所述第一多肽中已被替代的所述至少一个序列被包含由单克隆抗体特异性识别的表位的序列替代；
(i)所述第一多肽中已被替代的所述至少一个序列被包含导致至少一种互补位亚型的表位的序列替代，或所述第一多肽中已被替代的所述至少一个序列被包含作为优势表位的表位的序列替代；
(j)所述第一多肽中已被替代的所述至少一个序列被包含作为弱表位的表位或引发弱体液应答进而导致相对较低的抗体滴度的表位的序列替代；
(k)所述第二多肽中的表位被修饰，以降低特异性识别所述表位的抗体的亲和力；
(l)所述重组多肽包含来自第三物种的第三多肽的一部分，所述部分包含不存在于所述第一多肽或所述第二多肽中的表位；
(m)存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的至少一个表位已被并入所述重组多肽中；
(n)存在于所述第一多肽和所述第二多肽所属的家族的另一成员中的结构域中的至少一个表位被并入所述重组多肽中；和/或
(o)来自所述第二多肽的表位被修饰，以增加特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体的亲和力，或者产生特异性识别来自所述第二多肽的表位的抗体对所述表位的亲和力。
12.以下的用途
(a)根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽，
(b)根据权利要求6至7中任一项所述的核酸，
(c)根据权利要求8所述的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒，或
(d)根据权利要求9所述的细胞，
所述用途为用于产生多克隆抗体或用于产生多克隆免疫血清，所述多克隆抗体或所述多克隆免疫血清对表位具有特异性或与表位特异性结合。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽；根据权利要求6至7中任一项所述的核酸；根据权利要求8所述的表达盒、载体、重组病毒、人工染色体、粘粒或质粒；或根据权利要求9所述的细胞，用于在产生多克隆抗体中使用或用于产生多克隆免疫血清，所述多克隆抗体或所述多克隆免疫血清对表位具有特异性或与表位特异性结合。
14.一种嵌合或重组多肽，所述嵌合或重组多肽包含：通过或经由基本上非免疫原性接头与免疫原性肽或多肽缀合或附接的铁蛋白多肽，
其中所述免疫原性肽或多肽包含根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合或重组多肽，并且所述铁蛋白多肽来自或源自所述第一物种。
15.根据权利要求14所述的嵌合或重组多肽，其中：
(a)所述铁蛋白多肽包含可与第二卷曲螺旋蛋白或基序结合的至少一个第一卷曲螺旋蛋白或基序(任选地，所述第二卷曲螺旋蛋白或基序包含免疫原性肽或与免疫原性肽结合，任选地通过非免疫原性接头共价附接)，其中所述第一卷曲螺旋蛋白或基序通过非免疫原性接头附接至所述铁蛋白多肽，从而得到嵌合铁蛋白-卷曲螺旋蛋白多肽，所述嵌合铁蛋白-卷曲螺旋蛋白多肽任选地可以折叠成三级结构或螺旋束结构，
并且任选地所述卷曲螺旋蛋白或基序源自所述第一物种，并且任选地源自所述第一物种的卷曲螺旋蛋白或基序结合源自所述第一物种的另一卷曲螺旋蛋白或基序，并且任选地所述铁蛋白多肽包含两个、三个、四个或更多个第一卷曲螺旋蛋白或基序，并且任选地所述卷曲螺旋蛋白或基序包含γ-氨基丁酸B型受体亚基1异形体X1(GBR1)和/或γ-氨基丁酸B型受体亚基2(GBR2)，其中所述GBR1可以选择性地结合GBR2基序，并且任选地所述GBR1基序包含：
STNNNEEEKSRLLEKENRELEKIIAEKEERVSELRHQLQSR(SEQ ID NO:33),并且任选地所述GBR2基序包含：
SVNQASTSRLEGLQSENHRLRMKITELDKDLEEVTMQLQDT(SEQ ID NO:34)；
(b)所述铁蛋白多肽已在其氨基酸序列中插入至少一个His(6)-Lys-His(3)(SEQ IDNO:32)部分，或多个His(6)-Lys-His(3)(SEQ ID NO:32)部分；
(c)所述基本上非免疫原性接头包括聚G接头或聚-(GGGGS)接头(SEQ ID NO:31)；
(d)所述聚-(GGGGS)接头(SEQ ID NO:31)包含(GGGGS)5(SEQ ID NO:29)接头或由其组成；
(e)所述非免疫原性接头附接至所述铁蛋白多肽的氨基末端；
(f)所述第一物种是兔，或所述铁蛋白多肽源自兔；
(g)所述免疫原性肽或多肽包含嵌合免疫原性肽或多肽，并且所述嵌合免疫原性肽或多肽包含插入兔肽或多肽中的人免疫原性序列，并且所述兔多肽残基在注入兔体内时是非免疫原性的；和/或
(h)所述非免疫原性兔肽或多肽序列源自兔免疫球蛋白多肽。
16.一种制品，所述制品包含多种根据权利要求14或15所述的嵌合或重组多肽，并且任选地所述制品包含24种所述嵌合或重组多肽，
并且任选地所述嵌合或重组多肽中的每一种包含卷曲螺旋蛋白，并且所述卷曲螺旋蛋白彼此结合。
17.一种在兔中产生表位特异性抗体应答的方法，其中所述免疫应答包括产生特异性针对(或特异性结合)至少一个人表位的兔抗体，并且所述方法包括向兔施用足够量的根据权利要求14至15中任一项所述的嵌合或重组多肽以产生所述表位特异性抗体应答。
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