CN109485724A - 抗Desmin蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，提供了一种抗Desmin蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。发明人还提供了抗Desmin蛋白单克隆抗体的制备方法，制备该抗体的抗原为一段优选的、由大肠杆菌表达、具有免疫原性活性的重组蛋白。发明人还提供了一株分泌抗Desmin蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系14G1C12，保藏号为：CGMCC NO.16205。抗Desmin蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达Desmin蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗Desmin蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗Desmin蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

结蛋白(Desmin,也称肌间线蛋白)是一种分子量为50-55kDa的肌肉组织中间丝位于胞浆的蛋白,由470个氨基酸构成，其两端呈球形，中间呈杆状，主要以α螺旋构成细胞骨架结构，其中杆状区又分成1A、1B、2A和2B四个结构域。成熟的结蛋白在细胞内形成均聚物，帮助细胞质、丝状结构和网状结构的稳定形成。Desmin通过在心脏、骨骼和平滑肌中执行功能来保持机体的机械完整性。结蛋白通过网格蛋白连接于肌原纤维的Z线，使临近的肌原纤维彼此连接，起到动力传导作用。同时，结蛋白把肌原纤维与细胞核、肌膜下细胞骨架和胞浆内的细胞器连接，起到细胞内信号传导作用。结蛋白异变会导致几种不同类型的心肌病、肌原纤维肌病和肌肉营养不良等，严重时还会导致及肌间线蛋白病的发生。另外结蛋白在线粒体的定位、分布和功能中起着重要作用。它还参与松弛调节所需的细胞腺苷三磷酸盐的生产。

结蛋白是肌源性肿瘤的标志物，可以用于鉴定肌源性肿瘤,同时也有研究表明结蛋白对于肿瘤细胞的迁移及侵袭能力有影响。再者结蛋白还是左心室收缩功能的标志，也是心衰患者一个重要的预后指标。因此获取活性更高的抗Desmin单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

发明内容

发明人提供了一种抗Desmin蛋白单克隆抗体，,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

进一步地，,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Desmin蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Desmin蛋白α螺旋杆状区第109位至第412位氨基酸片段。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.16205的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系14G1C12，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2018年07月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述抗Desmin蛋白为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗Desmin蛋白单克隆抗体的制备方法，选取Desmin蛋白α螺旋杆状区第109位至第412位氨基酸片段作为免疫原，并进行蛋白重组，重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。

发明人还提供了一株分泌抗Desmin蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系14G1C12，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.16205。

发明人还提供上述任一所述的抗Desmin蛋白单克隆抗体，在Desmin蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案选取Desmin蛋白α螺旋杆状区第109位至第412位氨基酸对应的核苷酸片段SEQ ID No.1，通过大肠杆菌进行重组表达，重组蛋白由第109位至第412位氨基酸片段以及组氨酸标签组成。纯化后的重组蛋白作为免疫原，对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗Desmin蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系14G1C12,以及由该细胞系所分泌的抗Desmin蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达Desmin蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1：Desmin蛋白基因克隆的琼脂糖凝胶电泳图。

图2：Desmin蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：Desmin单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图4：Desmin单克隆抗体检测人Desmin蛋白的免疫印迹图。

图5：食管组织免疫组化染色对比图(左为14G1C12的Desmin，右为市售Desmin)。

图6：平滑肌瘤组织免疫组化染色对比图(左为14G1C12的Desmin，右为市售Desmin)。

图7：横纹肌瘤组织免疫组化染色对比图(左为14G1C12的Desmin，右为市售Desmin)。

具体实施方式

实施例1重组Desmin蛋白片段的制备

一、基因克隆

本发明选取人Desmin(hDesmin)α螺旋杆状区第109位至第412位氨基酸片段作为抗原，其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.1。根据核苷酸序列利用软件Primer 5.0设计Desmin蛋白的特异性上游引物：5’GAATTCAAGGTGGA 3’(酶切位点，EcoR I)和下游引物：5’AAGCTTTTATTCACCT3’(酶切位点，HindⅢ)，从人平滑肌细胞中反转录扩增包括编码第109位至第412位氨基酸的基因片段。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的目的基因和用于表达的质粒载体pET28a(+)进行EcoR I和HindⅢ双酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。

图1为Desmin蛋白基因克隆的琼脂糖凝胶电泳图。

二、蛋白表达与纯化

将测序正确的重组质粒pET-28a(+)-Desmin转化至大肠杆菌Rosetta中，挑取阳性单克隆菌落，接种于4mL含50mg/L卡那霉素抗性的试管LB培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于1L含有50mg/L卡那霉素抗性的三角瓶LB培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃继续培养21h，离心收集菌体超声破碎。将破碎溶液离心后沉淀溶于包涵体洗涤液(100mM Tris、2M脲素、1mM EDTA、0.5％吐温-20，pH8.0.每500mL菌液沉淀加10mL)洗涤两次，然后加入10mL含8M脲素镍柱平衡缓冲液(20mM磷酸钠、500mM氯化钠、5mM咪唑、8M脲素，pH8.0)混匀4℃过夜，12000g、10min离心收集上清，最后再利用Ni-NTA柱对收集的上清进一步纯化，获得高纯度，构象均一性的抗原蛋白溶液。

图2为Desmin蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

实施例2 14G1C12杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的Desmin蛋白稀释至1mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化，对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。第2次加强免疫后14天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用PBS溶液混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mL HAT(Sigma公司)培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶cells/mL，所有溶液转移至96孔板中，200μL/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL/孔。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μL培养液上清进行首次细胞筛选(ELISA、IHC-P及其他方法检测)，同时往培养孔中补加HAT培养基至200μL。ELISA检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO₂培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株14G1C12。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

将细胞株培养至对数生长期后用无血清培养基洗涤并重悬，计数2×10⁶个/mL。悬浮的细胞溶液腹腔注射事先用石蜡油致敏10天的BALB/C小鼠，每只小鼠注射0.5mL。饲养小鼠7天后开始采集腹水。收集的腹水于4℃、8000rpm离心10min，吸取上清溶液收集于离心管中，即为腹水，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用rProtein A sepharose Fast Flow(GE公司)亲和层析柱从腹水中纯化抗体主要分为：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1M Tris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH4.5)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。

最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度,见图3Desmin单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，结果纯度达到95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度,浓度达到3.0mg/mL以上。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将免疫原溶液稀释成1μg/mL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗板3次，每孔加入200μL封闭液(含2％BSA的PBS-T溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ，IgM，IgG1，IgG_2a，IgG_2b，IgG₃，IgA)抗体(Southern Biotech公司)，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μL TMB(湖州英创生物科技有限公司)底物(A、B等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL 1N HCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG₁型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组Desmin蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl TMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为6.82×10⁹L×mol^-1。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择免疫原溶液，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，对Desmin蛋白进行12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用常规湿转法将凝胶蛋白转移到PVDF膜。将膜置于5％BSA-TBST溶液中(蛋白面朝下)，于37℃摇床封闭1h，以消除非特异性背景。封闭结束后用TBST洗掉5％BSA-TBST，加入本发明制备的Desmin的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育1h。用TBST洗膜后，加入二抗，于脱色摇床孵育1h，使二抗与一抗充分结合。

再次用TBST洗膜，加入ECL显色试剂盒，实验结果如图4，Desmin单克隆抗体检测人Desmin蛋白的免疫印迹图所示。由图可见，条带单一且颜色较深，说明抗体与抗原的特异性反应明显。

实施例6组织芯片染色和鉴定

一、组织蜡块制备过程

对食管、平滑肌瘤、横纹肌瘤等样本组织进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用抗Desmin蛋白单克隆抗体(14G1C12)和对照抗体-市售抗Desmin蛋白单克隆抗体(鼠单抗D33)在86例平滑肌瘤、19例横纹肌肉瘤、73例胃肠道间质瘤，32例神经纤维瘤上进行同步检测，结果如下表所示。

结果显示:抗Desmin蛋白单克隆抗体(14G1C12)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗Desmin蛋白单克隆抗体(14G1C12)特异性强。同时，与市售抗体Dsemin(D33)的阳性和阴性结果一致，说明本抗体在肿瘤组织的特异性同市售抗体相当。

而部分病例中，使用抗Desmin蛋白单克隆抗体(14G1C12)的阳性染色强度高于使用对照试剂，说明抗Desmin蛋白单克隆抗体(14G1C12)的敏感性高于市售抗体。

而用抗Desmin蛋白单克隆抗体(14G1C12)和对照抗体-市售抗Desmin蛋白单克隆抗体(鼠单抗D33)，在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图5为食管组织免疫组化染色对比图(左为14G1C12的Desmin，右为市售Desmin)。图6为平滑肌瘤组织免疫组化染色对比图(左为14G1C12的Desmin，右为市售Desmin)。图7为横纹肌瘤组织免疫组化染色对比图(左为14G1C12的Desmin，右为市售Desmin)。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗Desmin蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130> 2100

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 927

<212> DNA

<213> 智人(Homo sp)

<400> 1

gaattcaagg tggaactgca agaactgaat gatcgttttg ccaactatat cgaaaaagtg 60

cgttttctgg aacagcagaa tgcagcactg gcagcagaag ttaatcgtct gaaaggtcgt 120

gaaccgacac gtgttgcaga actgtatgaa gaagaactgc gcgaactgcg tcgtcaggtt 180

gaagttctga ccaatcagcg tgcacgtgtt gatgttgaac gtgataatct gctggatgat 240

ctgcagcgcc tgaaagcaaa attacaagaa gaaatccagc tgaaagaaga ggccgaaaat 300

aatctggcag catttcgtgc agatgttgat gcagcaaccc tggcacgtat tgatctggaa 360

cgtcgtattg aaagcctgaa tgaagaaatc gccttcctga aaaaagtgca cgaagaagag 420

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gaatatcagg atctgctgaa tgttaaaatg gccctggatg ttgaaattgc cacctatcgt 900

aaactgctgg aaggtgaata aaagctt 927

<210> 2

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120

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<210> 3

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

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gttgtgatga cccagactcc actcactttg tcggttacca ttggacaacc agcctctatc 120

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ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcaggaacag attttacact gaaaatcagc 300

agagtggagg ctgaggattt gggaatttat tactgcgtgc aaggtacaca ttttccgtac 360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393

<210> 4

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ala

130

<210> 5

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln Glu

1 5 10 15

Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val

20 25 30

Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys

100 105 110

Val Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gaattcaagg tgga 14

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

aagcttttat tcacct 16

Claims (10)

1.一种抗Desmin蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别Desmin蛋白。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别Desmin蛋白α螺旋杆状区第109位至第412位氨基酸片段。

5.一种抗Desmin蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO.16205的杂交瘤细胞系产生。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述抗Desmin蛋白为小鼠IgG₁亚型单克隆抗体。

7.一种抗Desmin蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于:选取Desmin蛋白α螺旋杆状区第109位至第412位氨基酸片段作为免疫原并进行蛋白重组，所述重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。

8.一株分泌抗Desmin蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系14G1C12，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.16205。

9.权利要求1-6任一所述的抗Desmin蛋白单克隆抗体，在免疫检测中的用途。

10.根据权利要求9所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。