CN113817055A

CN113817055A - 抗Actin蛋白单克隆抗体、细胞系及其应用

Info

Publication number: CN113817055A
Application number: CN202111254039.2A
Authority: CN
Inventors: 彭永辉; 王小亚; 高惠然; 吴茂; 李玲玲; 李恢波
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN113817055B

Abstract

本发明涉及生物检测领域，提供了一种抗Actin蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明人还提供了一株分泌抗Actin蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系3G8C7A6，保藏号为：CGMCCNO.22312。抗Actin蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别人Actin蛋白，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗Actin蛋白单克隆抗体、细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗Actin蛋白单克隆抗体、细胞系及其应用。

背景技术

肌动蛋白(Actin)是一类形成微丝的球状多功能蛋白质。肌动蛋白在真核生物中广泛存在,在肌细胞中和非肌细胞的细胞质及细胞核内均有发现,是构成肌小节和细胞骨架的主要成分。其功能除了参与维持细胞的正常形态外，还参与调控细胞的应力纤维形成、黏附、迁移、凋亡、物质运输、跨膜信息传递以及受体聚集等。

肌动蛋白可以以球状的游离单体存在，称为G-肌动蛋白，或以丝状的线性聚合物微丝的一部分存在，称为F-肌动蛋白丝，这两者对于细胞的移动和收缩等重要的细胞功能是必不可少的。G一actin，由375个氨基酸残基所组成,分子量为42kD。目前已报道了动物有3种肌动蛋白异构体：α肌动蛋白(横纹肌型、心肌型、血管平滑肌型)，存在于收缩结构中；β肌动蛋白(细胞质型)发现于细胞的扩展边缘，使用其细胞结构的投射作为其移动手段、γ肌动蛋白(细胞质型、肠平滑肌型)存在于应力纤维的细丝中。肌动蛋白具有细胞分裂,染色体运动,细胞器的运动,细胞活化,细胞质流等所涉及的真核细胞的几乎所有的生理过程的重要的生理功能。肌动蛋白十分保守,各种生物体之间的氨基酸序列的同一性(Identity)高达70％以上甚至到100％。F一actin，是所有真核细胞运动的基础，肌动蛋白丝的基本结构曾用X一射线衍射和电子显微镜进行研究,表明肌动蛋白丝呈右手双股螺旋,重复螺距为72nm；其肌动蛋白单体呈左手螺旋排列，每轮含13个单体。

Actin抗体能特异性识别骨骼肌和心肌的α肌动蛋白。而与平滑肌的肌动蛋白无交叉反应。主要用于检测平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、肌上皮瘤等。还能识别肉芽组织、癫痕组织、结节性筋膜炎和纤维瘤中的肌纤维母细胞。另外Actin不仅在乳腺浸润性导管癌不同分子亚型中的表达存在差异,并且与肿瘤大小及淋巴结转移有关，检测Actin在乳腺浸润性导管癌中的表达,有助于为乳腺癌不同分子亚型的鉴别诊断及个体化靶向治疗(特别是TNBC型)提供新的研究方向。Actin在乳腺癌与正常乳腺及癌旁组织中的差异表达有利于乳腺良、恶性病变的鉴别诊断。

发明内容

发明人提供了一种抗Actin蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体制备过程中，免疫小鼠所用的抗原为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别人Actin蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.22312的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系3G8C7A6，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2021年04月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述抗Actin蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗Actin蛋白单克隆抗体的制备方法，其免疫小鼠所用的抗原为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。

发明人还提供了一株分泌抗Actin蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系3G8C7A6，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.22312。

发明人还提供以上任一所述的抗Actin蛋白单克隆抗体在人Actin蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

发明人再提供了一种人Actin蛋白免疫检测试剂，所述免疫检测试剂内含有以上任一的抗Actin蛋白单克隆抗体为有效成分。

区别于现有技术，上述技术方案依据Actin蛋白的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，上述技术方案选取Actin蛋白第121位至第374位氨基酸片段和其对应的核苷酸片段，通过大肠杆菌进行重组表达,对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和克隆，获得高效分泌抗Actin蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系3G8C7A6,并对单克隆细胞系3G8C7A6进行体外培养，并获得由该细胞系所分泌的抗Actin蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达Actin蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为实施例3纯化后Actin蛋白的电泳结果图；M：分子量标记。

图2：平滑肌瘤免疫组化染色结果图：其中左为3G8C7A6分泌的的Actin，右为市售Actin(兔多抗)。

具体实施方式

实施例1重组Actin蛋白片段的制备

一、抗原片段选择

从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号P68133的Actin蛋白序列作为标准序列。本发明选取人Actin蛋白第121位至第374位氨基酸片段作为抗原，根据其对应碱基序列(SEQ ID NO.1)利用软件Primer5.0设计Actin蛋白的特异性上游引物5’CGGGATCCTTCATTACCAAAGCGAT’(SEQ ID NO.6,酶切位点，BamHI)和下游引物：5’CATCTCGAGGTTGTGGATGATACGACAT3’(SEQ ID NO.7，酶切位点，XhoI)，反转录扩增编码第121位至第374位氨基酸的基因片段SEQ ID NO.1。

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的目的基因和用于表达的质粒载体pET27b进行BamH I和Xho I双酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。

二、重组Actin蛋白片段的表达和纯化

取出-80℃保存的感受态细胞100ul(BL21)，解冻后加入5ulActin质粒DNA，冰上放置30min。42℃热激90秒后冰浴5min后，加入800μL无抗性的LB培养基。37℃复苏培养60min，涂板，过夜培养。从转化的平板挑单克隆到4ml的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养后保菌。

取4ul菌液到4ml LB液体培养基中，过夜培养复苏。将培养的菌液转接到200ml LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，加入IPTG(0.5mM)低温过夜诱导。400ml大离心筒，4000rpm，离心10min收集菌体，弃上清。沉淀用20-30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)和终浓度为0.5M的NaCl溶液吹散，超声破碎菌体。12000rpm离心20分钟，取离心上清上样到Ni-NTA镍柱(QIAGEN)进行纯化，之后分别用含50mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑的10mM Tris-HCl(pH7.0)(含0.5M氯化钠)溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用。

实施例2 3G8C7A6杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的Actin蛋白稀释至1mg/mL，与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化，对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。第2次加强免疫后14天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用PBS溶液混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合：

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mLHAT(Sigma公司)培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶cells/mL，所有溶液转移至96孔板中，200μL/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO₂培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL/孔。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：

当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μL培养液上清进行首次细胞筛选(ELISA、IHC-P及其他方法检测)，同时往培养孔中补加HAT培养基至200μL。ELISA检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO₂培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G8C7A6。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3体外培养法制备单克隆抗体

一、体外培养

获得稳定的3G8C7A6杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。

以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养3G8C7A6杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。

二、单克隆抗体的纯化

用rProtein A sepharoseFastFlow(GE公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1MTris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的细胞上清加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度。结果见图1，纯化后Actin单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图,纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/mL以上。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将抗原蛋白稀释成1μg/mL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗板3次，每孔加入200μL封闭液(含2％BSA的PBS-T溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞系培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ，IgM，IgG2b，IgG2a，IgG2b，IgG₃，IgA)抗体(Southern Biotech公司)，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μLTMB(湖州英创生物科技有限公司)底物(A、B等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL 1N HCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2b型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被Actin蛋白，浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μlTMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl 1.0N盐酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为6.26×10⁹。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一、组织蜡块制备

对样本组织进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用本发明所制备的抗Actin蛋白单克隆抗体(3G8C7A6)和市售抗Actin蛋白单克隆抗体(HHF35)在在52例平滑肌瘤、7例平滑肌肉瘤和11横纹肌肉瘤进行同步检测，结果如下表所示：

结果显示:抗Actin蛋白单克隆抗体(3G8C7A6)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗Actin蛋白单克隆抗体(3G8C7A6)特异性强。同时，使用抗Actin蛋白单克隆抗体(3G8C7A6)的阳性率虽然与市售抗体阳性率相当，但阳性细胞数和阳性强度均明显高于使用对照试剂，说明抗Actin蛋白单克隆抗体(3G8C7A6)对相对市售抗体更具敏感度，可避免漏检的风险。

图2为其中一例平滑肌瘤免疫组化染色结果图：其中左为3G8C7A6分泌的的Actin，右为市售Actin(兔多抗)

而采用抗Actin蛋白单克隆抗体(3G8C7A6)和对照抗体(HHF35)，在30种正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在市售组织的特异性同市售抗体相当。

30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗Actin蛋白单克隆抗体、细胞系及其应用

<130> 2020

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgacgcaga tcatgttcga aacctttaac gttccggcaa tgtacgttgc tatccaggcg 60

gtcctgtccc tgtacgcgtc tggccgcact accggtatcg tgctggattc tggcgatggc 120

gttacccata acgtaccgat ttacgaaggc tatgcgctgc cacacgctat tatgcgtctg 180

gacctggcag gtcgtgacct gaccgactac ctgatgaaga ttctgacgga acgtggttac 240

agcttcgtaa ccaccgcgga acgcgagatc gtacgcgata tcaaagaaaa actgtgctat 300

gttgcgctgg acttcgaaaa tgaaatggca accgcggctt cctcctccag cctggaaaaa 360

tcctatgaac tgccggacgg tcaggtgatt accatcggta acgaacgttt ccgttgtccg 420

gaaaccctgt tccagccgtc cttcatcggc atggagtccg cgggcatcca cgaaaccacc 480

tataattcta ttatgaaatg cgatatcgat atccgtaaag acctgtacgc aaacaacgtt 540

atgagcggtg gcactactat gtatccgggc atcgccgacc gcatgcagaa agaaattacc 600

gcgctggcgc cgtctacgat gaaaattaaa attatcgcac cgccggagcg taagtactcc 660

gtctggattg gtggctccat cctggcatct ctgagcactt tccagcagat gtggatcacc 720

aaacaggaat acgacgaagc gggcccgtct atcgtccacc gt 762

<210> 2

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Met Cys Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Leu Ala Thr Ala Ala Arg

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn His His Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Asn Arg Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Pro Ala Gly Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 3

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His

100 105 110

Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys

130

<210> 4

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atgtgttgga gctgtatcat cctcttcctg ttagcaacag ctgcacgtgt gcactcccag 60

gtccagctgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcctcagt gaagatttcc 120

tgcaaggctt ttggctacac cttcacaaac catcatataa actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacagggcc tggactggat tggatatatt aatccttata atgattataa taggtacaac 240

cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctatatg 300

gagcttagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag gggactccct 360

gctgggccat attactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420

tca 423

<210> 5

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgtctcagt cataatgtcc 60

agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc tggggagaag 120

gtcaccttga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttcca gctacttgta ctggtaccag 180

cagaagccag gatcctcccc caaactctgg atttatagca catccaacct ggcttctgga 240

gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctctc aatcagcagc 300

atggaggctg aagatgctgc ctcttatttc tgccatcagt ggagtagtta cccaccgacg 360

ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 390

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

cgcggatcca tgacccagat tatgt 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

atctcgagac gatggacgat ggac 24

Claims

1.一种抗Actin蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体制备过程中，免疫小鼠所用的抗原为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别人Actin蛋白。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.22312的杂交瘤细胞系产生。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述抗Actin蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。

7.一株分泌抗Actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系3G8C7A6，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.22312。

8.权利要求1-6任一所述的抗Actin蛋白单克隆抗体在人Actin蛋白免疫检测中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

10.一种人Actin蛋白免疫检测试剂，其特征在于，所述免疫检测试剂内含有权利要求1-6任一所述的抗Actin蛋白单克隆抗体为有效成分。