PT676965E - Método para reduzir a imunogenicidade da região variável de anticorpos - Google Patents
Método para reduzir a imunogenicidade da região variável de anticorpos Download PDFInfo
- Publication number
- PT676965E PT676965E PT94901552T PT94901552T PT676965E PT 676965 E PT676965 E PT 676965E PT 94901552 T PT94901552 T PT 94901552T PT 94901552 T PT94901552 T PT 94901552T PT 676965 E PT676965 E PT 676965E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- sequence
- human
- seq
- antibody
- auto
- Prior art date
Links
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 84
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 82
- 230000000599 auto-anti-genic effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 45
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 38
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 22
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 11
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 10
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 10
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O HWLKHNDRXWTFTN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- KNCJWSPMTFFJII-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KNCJWSPMTFFJII-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- -1 proteins and sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- ZOKPRHVIFAUJPV-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Arg Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O ZOKPRHVIFAUJPV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N D-glyceric acid Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N Glu-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WYWBYSPRCFADBM-GARJFASQSA-N His-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O WYWBYSPRCFADBM-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- GLYJPWIRLBAIJH-FQUUOJAGSA-N Ile-Lys-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GLYJPWIRLBAIJH-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- GLYJPWIRLBAIJH-UHFFFAOYSA-N Ile-Lys-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GLYJPWIRLBAIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 1
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000015094 Paraproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064255 Paraproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- OLTFZQIYCNOBLI-DCAQKATOSA-N Pro-Cys-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O OLTFZQIYCNOBLI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N Pro-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
ΡΕ0676965 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA REDUZIR A IMUNOGENICIDADE DA REGIÃO VARIÁVEL DE ANTICORPOS"
Campo do Invento 0 presente invento está relacionado com um método de redução da imunogenicidade de uma região variável de um anticorpo imunogénico, através da incorporação de uma sequência auto-antigénica, que forma um epitopo reconhecido por anticorpos humanos pré-imunidade, a presença da qual resulta numa resposta imune reduzida contra a região variável de um anticorpo.
Fundamento do Invento A utilização farmacêutica de compostos imuno-génicos, como sejam proteínas e açúcares, para diagnóstico ou terapia em seres humanos tem enorme potencial. No entanto, uma preocupação essencial é que os compostos imunogénicos muitas vezes induzem respostas imunes que poderão limitar a sua eficácia e, nalguns casos, causam reacções alérgicas perigosas. Isto é particularmente verdadeiro para proteínas não humanas. Ainda, é possível que mesmo as proteínas com sequências de aminoácidos humanas possam ser imunogénicas, como no caso em que a 2 ΡΕ0676965 proteína é alterada na estrutura ou conformação como consequência da produção ou quando a proteína é produzida em hospedeiros estranhos devido a modificação inadequada pós-tradução ou enrolamento incorrecto. Além do mais, muitos compostos não proteicos induzem uma resposta imune. 0 sistema imune do ser humano a quem o composto imunogénico é administrado reconhece o composto como "estranho" e monta uma resposta imune para o remover. A resposta imune inclui a produção de anticorpos específicos de elevada afinidade que se ligam ao composto imunogénico e efectuam a sua eliminação.
Os anticorpos monoclonais (Mabs) oferecem exemplos das utilizações terapêuticas de proteínas estranhas. A maior parte dos Mabs são de origem murina e tem-se observado, de um modo geral, que são imunogénicos quando injec-tados em seres humanos. Têm sido feitas tentativas para reduzir a imunogenicidade dos Mabs murinos, através da substituição das regiões constantes murinas por regiões humanas análogas para formar anticorpos quiméricos ou Mabs quiméricos, ou indo ainda um passo mais à frente e substituindo as sequências estruturais murinas pelas contrapartes humanas nas regiões variáveis dos anticorpos (anticorpos humanizados ou Mabs humanizados) . Estas abordagens podem reduzir a resposta imune induzida pelas regiões constantes ou estruturais murinas, mas podem ser ineficazes na redução das respostas imunes dirigidas contra as regiões variáveis ou idiotipos dos Mabs. De facto, existem vários exemplos de 3 ΡΕ0676965
Mabs quiméricos que induzem respostas imunes dirigidas contra as regiões variáveis (por exemplo, B72.3 descrito por Meredith, et al., (1992) J. Nucl. Medicine 33:23-29 e chl4.18 descrito por Saleh, et al., (1992) Hum. Antibody Hybridoma 3:19-24). De facto, as respostas imunes anti-região variável podem ser a regra e não a excepção. Nestes casos, é necessário uma outra abordagem.
Existe a necessidade de compostos terapêuticos ou de diagnóstico que não induzam uma resposta imune ou que induzam uma resposta imune reduzida. Existe a necessidade de um método de redução ou eliminação da imunogenicidade de compostos terapêuticos e de diagnóstico. 0 presente invento proporciona um método de redução da imunogenicidade de regiões variáveis de anticorpos. Ao associar-se uma sequência de aminoácidos auto-antigénica a uma proteína imunogénica, o sistema imune humano monta uma resposta imune reduzida contra o composto ou não monta de todo uma resposta imune contra ele. Assim, estes compostos podem ser administrados, como agentes terapêuticos ou de diagnóstico, com uma redução ou eliminação dos problemas associados à administração de compostos imunogénicos.
Sumário do Invento 0 presente invento está relacionado com compostos de fusão com imunogenicidade reduzida, os quais compreendem 4 ΡΕ0676965 compostos imunogénicos ligados a sequências auto-anti-génicas. A presença da sequência auto-antigénica torna o composto menos imunogénico. Ainda, o presente invento está relacionado com um método de redução da imunogenicidade de um composto imunogénico, através da ligação de uma sequência auto-antigénica a um composto que de outra forma seria imunogénico. 0 presente invento está também relacionado com a sequência nucleotidica recombinante que codifica sequências auto-antigénicas e com péptidos auto-antigénicos essencialmente puros.
Descrição Detalhada do Invento
Em soros humanos normais foi observada a presença de anticorpos específicos de fragmentos de proteínas degradadas, tais como fragmentos de proteínas endógenas degradadas por enzimas proteolíticas. Existem muitas descrições na literatura que referem a observação de imuno-reactividade endógena contra fragmentos de anticorpos clivados. Esta imuno-reactividade endógena contra proteínas endógenas é referida como "pré-imunidade". Os anticorpos envolvidos na imuno-reactividade pré-imunidade foram inicialmente descritos como "aglutinadores" ou "anticorpos anti-Fab" ("aFABA"). Está descrito que os anticorpos pré-imunes 1) estão presentes na maioria dos indivíduos, 2) possuem títulos variáveis na população, 3) não são IgM ou factores reumatóides, 4) são específicos de fragmentos e 5) são, de um modo geral, de baixa afinidade. Estes anticorpos podem ser genericamente descritos como um grupo heterogéneo 5 ΡΕ0676965 de anticorpos que partilha a caracteristica de reconhecer fragmentos de proteínas endógenas, geralmente as regiões terminais de fragmentos de anticorpos, as quais são expostas através da degradação de proteínas, geralmente degradação proteolítica.
Osterland, C.K. et al. (1963) Vos Sang 8:133, descreve uma actividade sérica capaz de "aglutinar" epitopos Fab- ou F(ab')2 que apenas ficam expostos após uma imunoglobulina ser clivada por uma enzima proteolítica. Ou seja, estes anticprpos reconhecem a proteína degradada mas não a proteína intacta.
Waller, M. et al., (1969) Immunochemistry 6:207-214, descrevem que "anticorpos naturais" em soros humanos foram capazes de diferenciar fragmentos Fab produzidos por diferentes enzimas. Diferentes anticorpos deste grupo eram específicos de diferentes epitopos em fragmentos Fab que foram gerados i.e., expostos, por clivagem específica sofrida por um fragmento Fab específico.
Ling, N.R. and P. Drysdale, (1981) Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 66:459, descrevem que fragmentos F(ab')2 de policlonais humanos, bovinos e de coelho e de paraproteínas IgG humanas de diferentes subclasses e tipo de cadeia leve foram acoplados a eritrócitos humanos e usados para detectar "anticorpos aglutinadores" em soros humanos normais e patológicos. Tais anticorpos foram descritos como ocorrendo frequentemente e demonstraram heterogeneidade de especificidade. 6 ΡΕ0676965
Persselin, J.E. e R.H. Steves, (1985) J. Clin. Invest.76:723, descrevem que soros derivados de doentes com artrite reumatóide continham duas populações de anticorpos dirigidos contra o fragmento Fab de um conjunto de IgGs humanas.
Heimer R., et al., (May 1985) Arthritis and Rheumatism 28(5):562, descrevem uma análise da especificidade de anticorpos IgG anti-F(ab')2 em soros não fraccionados de doentes com artrite reumatóide e de preparações de anticorpos purificados por afinidade.
Persselin, J.E. and R.H. Stevens (1989) Mongr. Allergy 26:74, descrevem um grupo de "anticorpos autólogos" dirigidos contra os fragmentos Fab e F(ab'h de IgG humana. Este grupo, que foi descrito como sendo prevalente em indivíduos normais e doentes que sofrem de uma variedade de alterações, foi caracterizado como sendo um grupo heterogéneo de anticorpos com propriedades biológicas e especificidade de alvo diversas.
Apesar das muitas descrições de "anticorpos naturais" estarem relacionadas com a existência de tais anticorpos que especificamente se ligam a fragmentos de IgG, pensa-se que existam grupos deste tipo de anticorpos que se liguem a fragmentos degradados de outras proteínas endógenas. Jordan et al., (Circulation, vol 86, n°4, suppl. 1, pg 1411) descrevem a produção do anticorpo quimérico c7E3 anti-Fab GPIIb/IIIa. 7 ΡΕ0676965
Como aqui usados, os termos "aglutinadores", "anticorpos aglutinantes", "anticorpos naturais", "anticorpos autólogos", "anticorpos pré-imunidade" e anticorpos de soro pré-imune" foram usados indiferentemente e pretendem significar anticorpos que estão normalmente presentes num indivíduo. Os anticorpos pré-imunidade são um grupo heterólogo de anticorpos que se ligam a proteínas endógenas degradadas mas que, geralmente, não se ligam às intactas. Eles existem em níveis baixos e, de um modo geral, ligam-se à região terminal num local de clivagem de uma proteína endógena clivada. Existem alguns anticorpos pré-imunidade que reagem com proteínas intactas. No entanto, muitos desses anticorpos reconhecem fragmentos mas não se ligam à proteína intacta. Nos casos em que não dá reacção cruzada com proteínas intactas, um anticorpo pré-imunidade geralmente reconhece um epitopo que ocorre, após clivagem, na região terminal de uma proteína. Este epitopo geralmente ocorre no extremo C. Ao ocorrer nestas posições, o epitopo é extremamente específico, de modo que o epitopo é apenas acessível e reconhecível quando surge no fim da proteína.
Descobriu-se que a presença num composto, que de outra forma seria imunogénico, de uma sequência de amino-ácidos que forma o epitopo de um anticorpo pré-imunidade reduz ou elimina a imunogenicidade daquele composto. A inclusão de tal sequência de aminoácidos permite converter um composto imunogénico num composto com imunogenicidade reduzida. ΡΕ0676965
Como aqui usados, os termos "sequência auto-antigénica", "péptido auto-antigénico", "sequência pré-imunidade", "sequência de aminoácidos pré-imunidade" e "péptido pré-imunidade" foram usados indiferentemente e pretendem referir uma sequência de aminoácidos que é um epitopo reconhecido por um anticorpo pré-imunidade e que, quando associado com um composto imunogénico, torna menos imunogénico o composto imunogénico.
Como aqui usados, os termos "compostos de fusão", "composto de imunogenicidade reduzida" e "compostos menos imunogénicos" foram usados indiscriminadamente e referem-se a compostos que compreendem um composto, que de outra forma seria imunogénico, ligado a uma sequência auto-antigénica, pelo que a presença das sequências auto-antigénicas resulta na redução ou eliminação da imunogenicidade do composto que de outra forma seria imunogénico. Quando um composto imunogénico, que é um composto que normalmente induz uma resposta imune quando administrado a um doente, está ligado a uma sequência auto-antigénica para formar um composto de fusão, o composto de fusão não induz resposta imune ou induz uma resposta imune reduzida quando administrado a um doente, comparativamente com a resposta imune induzida pelo composto imunogénico por si só.
Como aqui é usado, o termo "menos imunogénico" refere-se à imunogenicidade comparativamente reduzida, apresentada por compostos imunogénicos ligados a uma 9 ΡΕ0676965 sequência auto-antigénica, em relação à imunogenicidade apresentada pelo mesmo composto imunogénico não ligado a um composto auto-antigénico.
Como aqui usado, o termo "imunogénico" refere-se à capacidade de um composto para induzir uma resposta imune.
Como aqui usado, o termo "antigénico" refere-se à capacidade de um composto para reagir com o sistema imune, í.e. anticorpos.
As sequências auto-antigénicas podem ser identificadas por uma variedade de métodos, os quais podem ser facilmente executados por familiarizados com a matéria. Proteínas endógenas, tais como anticorpos, citocinas, factores de crescimento, receptores, enzimas e proteínas estruturais, podem ser clivadas por um painel de enzimas proteolíticas. Os fragmentos produzidos podem ser expostos a soros humanos e os fragmentos que se ligam a anticorpos pré-imunidade presentes nos soros podem ser facilmente identificados. A sequência de aminoácidos do epitopo que está associado ao anticorpo pré-imunidade pode ser determinada. Este epitopo representa uma sequência auto-antigénica. Como alternativa, podem ser produzidas bibliotecas peptídicas que possuem uma distribuição ao acaso de péptidos com cerca de 5 ou mais aminoácidos. Estas bibliotecas podem ser usadas num rastreio com soros humanos normais, para identificar péptidos que são epitopos 10 ΡΕ0676965 reconhecidos por anticorpos pré-imunidade endógenos. Estes péptidos podem ser identificados e usados nos testes como sequências auto-antigénicas.
Um exemplo de um grupo heterogéneo de anticorpos pré-imunidade, específicos de produtos de degradação proteica, é os anticorpos que reconhecem epitopos presentes na sequência C-terminal da cadeia pesada quando os anticorpos IgG são degradados por clivagem proteolítica. Assim, algumas realizações do presente invento estão relacionadas com um método para tornar menos imunogénico um composto que de outra forma seria imunogénico, através da sua ligação a uma variedade de sequências auto-antigénicas encontradas no extremo C da cadeia pesada de moléculas Fab ou F(ab')2 humanas ou quiméricas.
As sequências de aminoácidos que são os epitopos para os anticorpos pré-imunidade anti-fragmento de IgG são muitas vezes encontradas na região de charneira da cadeia pesada. A clivagem da cadeia pesada na região de charneira dá origem a uma sequência de aminoácidos no extremo C que pode ser reconhecida pelos anticorpos pré-imunidade específicos, os quais não reagem com moléculas de IgG intactas. Dependendo de onde a clivagem ocorre, um epitopo diferente é exposto e assim uma série diferente de anticorpos pré-imunidade pode-se ligar a ele. Desta forma, anticorpos individuais deste grupo reconhecem epitopos discretos produzidos por clivagem em vários locais. 11 ΡΕ0676965 A sequência auto-antigénica deriva da região de charneira de IgG. Nalgumas realizações preferidas, as sequências auto-antigénicas derivam da região de charneira de IgGi. A região de charneira refere-se a vários segmentos estruturais da cadeia pesada das moléculas de IgG. Diferentes classes de moléculas de IgG possuem diferentes sequências de aminoácidos nas respectivas regiões de charneira. A região de charneira é um elemento particularmente variável da estrutura da imunoglobulina. A Tabela 1 fornece uma lista de diferentes sequências de aminoácidos das respectivas regiões de charneira para várias classes de moléculas de IgG.
Para identificar se uma sequência de aminoácidos particular é uma sequência auto-antigénica, moléculas de IgG podem, por exemplo, ser clivadas com uma protease de um painel para dar fragmentos de IgG que possuem diferentes sequências da região de charneira no extremo. Como alternativa, péptidos e polipéptidos podem ser produzidos através da sintese de péptidos ou por tecnologia de DNA recombinante, os quais são modelados na sequência da região de charneira. Em qualquer dos casos, os soros humanos podem ser testados para determinar a presença dos anticorpos pré-imunidade que se ligam a uma sequência terminal exposta particular ou a um péptido sintético, respectivamente.
Foi observado que a sequência de aminoácidos 12 ΡΕ0676965 perto do local de clivagem da papaína das moléculas Fab humanas é reactiva com os anticorpos pré-imunidade "anti-Fab" humano endógeno. Esta sequência pode ensinar o sistema imune a ignorar uma molécula que a inclua, de forma a não ser induzida resposta imune. Esta sequência auto-antigénica evita uma resposta imune contra um composto ligado, que de outra forma seria imunogénico.
Uma sequência pré-imunidade derivada de Fab tendo a sequência C-terminal CDKTH (SEQ ID N0:1) foi identificada a partir de observações respeitantes à natureza de imunidade pré-existente e respostas imunes induzidas contra fragmentos Fab 7E3 murinos e quiméricos. Tanto as cadeias leves como pesadas do Fab 7E3 quimérico compreendem regiões variáveis murinas e regiões constantes humanas. Esta sequência simula um fragmento natural ou conformação de IgG humana encontrada em soro humano e, portanto, uma resposta imune de elevada afinidade típica não é montada contra a molécula ou contra a sequência Fab relacionada. Observou-se uma imunogenicidade reduzida da região variável 7E3 murina quando ligada a esta sequência na molécula c7E3. De acordo com o invento, um composto imunogénico, como seja uma proteína estranha, pode ser tornado não imunogénico ou menos imunogénico através da ligação de uma sequência auto-antigénica, como as encontradas no extremo C de moléculas Fab humanas, geradas com papaína, derivadas de IgGi, a um composto estranho. Assim, a associação de uma sequência antigénica a um agente terapêutico ou de diagnóstico imunogénico é útil para a redução da imunogenicidade do ΡΕ0676965 agente terapêutico ou de diagnóstico, evitando ou reduzindo assim uma resposta imune significativa contra o agente quando administrado a um doente. De forma semelhante, os fragmentos Fab gerados com papaina do anticorpo quimérico cl28, o qual é especifico de CD4 e dos fragmentos Fab gerados com papaina do anticorpo quimérico cl68 especifico do factor de necrose tumoral, possuem a sequência de pré-imunidade, CDKTH (SEQ ID N0:1), no seu extremo C.
Ainda, a clivagem de anticorpos com regiões constantes, tais como cl28, cl68 ou c7E3, com elastase expõe uma sequência de pré-imunidade no extremo C do fragmento de anticorpo assim gerado.
Também se encontrou que o fragmento F(ab')2 de 7E3 quimérico apresenta uma caracteristica semelhante à molécula Fab, como seja imunidade ou pré-imunidade natural em soro humano normal. Assim, a sequência auto-antigénica na sua sequência C-terminal pode também ser útil na redução da imunogenicidade de compostos estranhos em seres humanos.
Sequências auto-antigénicas preferidas podem compreender sequências de aminoácidos seleccionadas do grupo consistindo em: CDKTH (SEQ ID N0:1), PKSCD (SEQ ID NO:2), KSCDK (SEQ ID N0:3), SCDKT (SEQ ID N0:4), DKTHT (SEQ ID NO:5), KTHTC (SEQ ID N0:6), THTCP (SEQ ID N0:7), HTCPP (SEQ ID NO:8), TCPPC (SEQ ID NO:9) e CPPCP (SEQ ID NO:10). Estas sequências podem estar associadas ao composto que de outra forma seria imunogénico, de forma a assegurar que o 14 ΡΕ0676965 último resíduo de cada sequência particular represente um resíduo de aminoácido C-terminal.
Para determinar se uma sequência de aminoácidos será útil como sequência auto-antigénica, construções peptídicas, compreendendo a sequência específica a ser testada, foram expostas a soros humanos para determinar a presença no soro de anticorpos que reconhecem e ligam especificamente a sequência. A sequência auto-antigénica mais preferida compreende a sequência de aminoácdos CDKTH (SEQ ID N0:1). Como referido atrás, o resíduo H é o resíduo C-terminal de qualquer construção que contenha este péptido. Quando associado a uma região variável de anticorpo e presente na região C-terminal, este péptido reduz ou elimina a imunogenicidade da região variável do anticorpo, tornando assim a região variável do anticorpo menos imunogénica.
Uma vez identificada, uma sequência auto-antigénica pode ser ligada a uma região variável de anticorpo imunogénica, através de uma variedade de meios que podem ser facilmente executados por familiarizados com a matéria. Uma sequência nucleotídica, que codifica uma sequência auto-antigénica, pode ser ligada à sequência nucleotídica que codifica a região variável do anticorpo imunogénica para formar um gene quimérico que codifica uma proteína de fusão. A sequência auto-antigénica surgirá no fragmento C-terminal da proteína de fusão resultante quando 15 ΡΕ0676965 o gene quimérico é expresso. Estes péptidos podem ser ligados quimicamente à região variável de anticorpo imunogénica usando técnicas conhecidas. As sequências auto-antigénicas podem também ser ligadas à região variável de anticorpo por meios quimicos. Independentemente do método de ligação de uma sequência auto-antigénica a uma região variável de anticorpo que de outra forma seria imunogénica, a região variável de anticorpo imunogénica é convertida nua região variável de anticorpo com imunogenicidade reduzida, através da incorporação de uma sequência auto-antigénica que serve como epitopo para anticorpos pré-imunidade. Os familiarizados com a matéria podem conseguir a ligação de uma sequência auto-antigénica a uma região variável de anticorpo imunogénica através de técnicas conhecidas. Técnicas de acoplagem convencionais, por exemplo, incluem mas não estão limitadas a: acoplagem através do sulfidrilo livre de cisteina, acoplagem através do grupo ε-amina de lisina e acoplagem através de qualquer amina livre. As técnicas para manipulação de anticorpos são bem conhecidas e estão descritas em Winter and Millstein (1991) Nature 349:293, e Larrich and Fry (1991) Hum. Antibod. and Hybridomas 2:17.
De acordo com o invento, uma sequência auto-antigénica pode ser ligada a uma região variável de anticorpo imunogénica, de forma a converter a região variável de anticorpo imunogénica numa com imunogenicidade reduzida. Como aqui usado, os termos "compostos com imunogenicidade reduzida", "compostos menos imunogénicos", 16 ΡΕ0676965 "compostos não imunogénicos" e "compostos de fusão" são usados indiferentemente e pretendem referir uma região variável de anticorpo, a qual compreende uma sequência auto-antigénica ligada a uma região variável de anticorpo que de outra forma seria imunogénica. A presença da sequência auto-antigénica ligada à região variável de anticorpo, que de outra forma seria imunogénica, provoca uma resposta imune reduzida em indivíduos a quem tal região variável de anticorpo é administrada, relativamente à resposta imune induzida pela região variável de anticorpo imunogénico sem a sequência auto-antigénica. Uma sequência auto-antigénica pode ser adicionada a Fabs não humanas processadas ou Fabs humanas produzidas por via recombinante.
Um composto imunogénico preferido a ser convertido num composto com imunogenicidade reduzida de acordo com o presente invento é uma região variável de anticorpo IgG murino. Normalmente, uma região variável de anticorpo IgG murino induzirá uma resposta imune quando administrada a um ser humano. Esta resposta pode torná-la ineficaz ou menos eficaz devido à molécula da região variável de anticorpo IgG murino ser neutralizada e/ou removida antes de atingir e se ligar ao seu antigénio alvo. Ao tornar menos imunogénica a região variável de anticorpo IgG murino, esta torna-se mais eficaz como agente terapêutico ou de diagnóstico uma vez que é menos impedida pelo sistema imune do doente. 17 ΡΕ0676965
Uma realização preferida do presente invento é uma molécula de IgG murina tendo uma sequência auto-anti-génica compreendendo CDKTH (SEQ ID N0:1) ligada de forma que o residuo H seja um residuo C-terminal. De acordo com o invento, tal molécula pode ser produzida segundo técnicas convencionais de DNA recombinante usadas para produzir anticorpos. Por exemplo, uma sequência nucleotidica codificadora da sequência auto-antigénica pode ser inserida no extremo 3' de um gene codificante de um fragmento C-terminal da molécula IgG, de preferência no fragmento C-terminal da cadeia pesada. A sequência nucleotidica é inserida na grelha de leitura correcta para que os resíduos codificados surjam no final da proteína resultante.
Os resultados clínicos demonstram uma redução na imunogenicidade de antigénios estranhos contendo uma sequência auto-antigénica que é exposta por clivagem proteolítica de uma cadeia pesada de IgG. Foram feitas várias observações durante o desenvolvimento do Mab terapêutico 7E3 anti-plaquetas, as quais conduziram à descoberta de que a imunogenicidade de um composto normalmente imunogénico pode ser reduzida através da sua associação a uma sequência de aminoácidos que representa um epitopo reconhecido por um anticorpo pré-imunidade. Estas experiências estão descritas no Exemplo 1.
Resumidamente, Mab 7E3 foi injectado em seres humanos, como fragmento Fab murino e como fragmento Fab quimérico (c7E3). A imunogenicidade de ambos os fragmentos 18 ΡΕ0676965 foi analisada. Houve uma diferença fundamental na natureza das respostas imunes induzidas pelos Fabs murinos e quiméricos. 0 Fab 7E3 murino induziu uma resposta imune em doentes que foi dirigida quase totalmente contra a região variável de 7E3. Pelo contrário, apesar do Fab c7E3 possuir a região variável idêntica a Fab 7E3 murino, c7E3 não induziu respostas imunes comparáveis, indicando que a região constante humana do Fab c7E3 tornou a região variável menos imunogénica.
As análises de EIA, independentes de afinidade, com revestimento directo, indicaram que 50-80% da população humana normal tem anticorpos de soro pré-imune que reagem com fragmentos Fab quiméricos. Esta reactividade pré-imunidade não é específica das regiões variáveis destas moléculas uma vez que vários fragmentos Fab monoclonais quiméricos, assim como fragmentos Fab globais preparados a partir Ig total de soro humano, foram reconhecidos pelos anticorpos anti-Fab endógenos. Esta reactividade anti-fragmento parece ser de baixa afinidade e foi detectada apenas por ensaios EIA de fase sólida relativamente sensíveis. A localização dos epitopos reactivos dos Fabs quiméricos (ou humanos) monoclonais foi no extremo C da cadeia pesada do fragmento Fab gerado por digestão com papaína da molécula de IgG intacta. Estes anticorpos pré-imunidade endógenos anti-Fab 7E3 quimérico foram facilmente neutralizados usando o fragmento Fab ou um outro anticorpo 19 ΡΕ0676965 quimérico IgGi mas não por outras proteínas. Estas observações indicaram que o epitopo reactivo é, provavelmente, uma sequência curta de aminoácidos que deve estar presente no extremo C, ou perto dele, do fragmento Fab.
Um fragmento Fab humano ou quimérico simula uma molécula normalmente encontrada no soro e que induz uma resposta normal de anticorpos de baixa afinidade. Parece que a resposta imune contra moléculas que possuem a sequência auto-antigénica como um epitopo acessível pode ser regulada para impedir uma resposta secundária de elevada afinidade. Com efeito, o sistema imune pode ser des-sensibilizado ou tolerizado, face à exposição ao anti-génio, com moléculas portadoras do epitopo. Outras exposições posteriores a uma molécula semelhante não conduzirão à típica resposta imune de elevada afinidade. A pré-imunidade contra epitopos particulares parece ser específico de espécie. Quando as respostas imunes derivadas de primatas tratados com Fab 7E3 quimérico foram analisadas, os soros pré-tratamento destes macacos demonstraram pouca ou nenhuma imuno-reactividade com Fab 7E3 quimérico, mas mostraram uma reactividade significativa com os fragmentos Fab gerados a partir de IgG de macaco. Pelo contrário, os soros humanos não mostraram imuno-reactividade pré-existente contra Fab de macaco. Ainda, os macacos demonstraram uma imunogenicidade induzida significativamente maior contra Fab 7E3 quimérico do que tinham os seres humanos envolvidos nos ensaios clínicos da Fase I. 20 ΡΕ0676965
Outras espécies foram igualmente examinadas relativamente a imuno-reactividade pré-existente contra os seus fragmentos Fab e F(ab')2 autólogos. Painéis autólogos de soros derivados de coelhos e de cabras foram testados relativamente a reactividade contra fragmentos de Fab e F(ab')2 de IgG policlonais das suas respectivas espécies. Novamente, foi observado que houve reactividade de IgG significativa contra ambos os fragmentos de anticorpo da sua própria espécie. A mesma observação, no entanto, não foi feita para anticorpos murinos contra Fab 7E3 murino.
Se bem que experiências comparativas em humanos não tenham sido realizadas usando fragmentos F(ab')2 7E3 murinos e quiméricos, ou outros fragmentos Fab e F(ab')2 murinos e quiméricos, foram observados anticorpos específicos que se ligam a fragmentos Fab e F(ab')2 humanos. Os indivíduos com elevada reactividade anti-Fab quimérico não têm necessariamente reactividade elevada anti-F(ab')2 quimérico e vice versa. Ainda, o reconhecimento imune destes fragmentos quiméricos é aparentemente específico, uma vez que a ligação de anticorpos anti-Fab, de um modo geral, não pode ser bloqueada por Fab' ou F(ab')2 quimérico. A descrição do presente invento é aqui, de um modo geral, apresentada como estando relacionada com compostos que não são imunogénicos como resultado da ligação de uma sequência auto-antigénica humana a um composto que de outra forma seria imunogénico e com um 21 ΡΕ0676965 método de redução da imunogenicidade de compostos, através da ligação do composto imunogénico a uma sequência auto-antigénica humana. Considera-se que o presente invento possa ser aplicado a outras espécies. 0 âmbito do presente invento destina-se a abranger compostos que são menos imunogénicos numa espécie particular, como resultado da ligação a uma sequência auto-antigénica derivada dessa espécie a um composto, que de outra forma seria imunogénico na espécie particular, através da ligação do composto imunogénico a uma sequência auto-antigénica derivada daquela espécie.
Ainda, a descrição do presente invento está apresentada como relacionada com compostos em que uma sequência auto-antigénica é fisicamente ligada a um composto que de outra forma seria imunogénico. No entanto, é possível que não seja necessária a ligação física. Considera-se que a imunogenicidade reduzida de uma proteína possa ser conseguida através da coinjecção de uma sequência peptídica auto-antigénica ou de fragmentos Fab humanos não específicos.
Exemplos
Exemplo 1 0 anticorpo monoclonal 7E3 foi desenvolvido para terapia humana como um fragmento Fab da molécula de 22 ΡΕ0676965 anticorpo. 0 reagente foi produzido em duas versões; um derivado do anticorpo monoclonal murino (isotipo gama 1 murino) através de digestão com papaína (m7E3) e outro derivado de um anticorpo monoclonal quimérico ratinho/humano (isotipo gama 1 humano) também por digestão com papaína (c7E3). 0 Mab quimérico foi produzido, usando técnicas de clonagem convencionais, para se obter os genes da região variável a partir do hibridoma 7E3 e sua fusão com genes de regiões constantes humanas anteriormente clonados in vitro. Os genes quiméricos foram introduzidos em células de mamífero adequadas para expressão.
As duas moléculas Fab possuem a mesma região variável mas regiões constantes diferentes. As sequências de aminoácidos C-terminais expostas após digestão com papaína são diferentes. A papaína cliva as moléculas de anticorpos na região de charneira da cadeia pesada entre o domínio CHI e CH2. As sequências de aminoácidos de charneira de gama 1 humano e de gama 1 de ratinho são muito diferentes (Ver Tabela 1). Após clivagem de c7E3 com papaína, o extremo C da cadeia pesada termina com os aminoácidos CDKTH (SEQ ID N0:1). Desconhece-se o ponto de clivagem exacto pela papaína na região de charneira de gama 1 de ratinho, mas deve produzir um extremo C muito diferente da sequência humana, uma vez que a charneira de ratinho não possui uma sequência semelhante a CDKTH (SEQ ID NO:1) . 23 ΡΕ0676965
Os fragmentos Fab de m7E3 e c7E3 foram testados para determinar se os soros humanos possuem anticorpos que reagem com os fragmentos. Foi usado um ensaio de ELISA em fase sólida, em que Fab m7E3 ou Fab c7E3 foi imobilizado directamente em placas de ensaio de plástico e exposto a soro humano. Os anticorpos humanos ligados foram detectados usando anticorpos de cabra anti-humano conjugados com uma enzima que produzirá um produto corado quando incubada com o substrato adequado. Este ensaio é muito sensível e capaz de detectar interacções de baixa afinidade. Um grande número de soros humanos foi testado e Fab 7E3 não foi, de um modo geral, reactivo, enquanto Fab c7E3 reagiu com pelo menos 60% das amostras de soro humano. A especificidade de anticorpos reactivos, presentes em soro humano, foi avaliada incluindo no ensaio um excesso de várias moléculas como inibidores competitivos. Se uma determinada molécula inibir a ligação a c7E3, então deve também apresentar o ou os epitopos reactivos. Conforme esperado, c7E3 solúvel poderá inibir a ligação dos anticorpos humanos a c7E3 imobilizado. Outras moléculas que poderão inibir a ligação incluem fragmentos Fab ou outros anticorpos gama 1 quiméricos e Fab humano policlonal derivado de soro. Pelo contrário, nenhuma das moléculas que se seguem poderão inibir a ligação: 1) Fab m7E3; 2) IgG total c7E3; 3) fragmento Fab derivado da versão IgG4 de 7E3 (possui uma região de charneira diferente de gama 1; 4) fragmento F(ab')2 de c7E3; e 5) fragmento Fab' do fragmento Fab c7E3 é extremamente 24 ΡΕ0676965 específico do extremo C exposto após digestão com papaína do anticorpo c7E3.
As imunogenicidades de Fab m7E3 e Fab c7E3 foram testadas em seres humanos em ensaios clínicos na Fase I. Usando um formato de ensaio que minimiza a reactividade pré-imune de baixa afinidade, para que as respostas reais relacionadas com tratamento possam ser facilmente observadas, encontrou-se que 17/86 ou cerca de 20% dos indivíduos que receberam Fab m7E3 apresentaram respostas imunes com títulos que variam entre 1:50 e 1:600. Pelo contrário, apenas 1/67 ou 1,5% dos indivíduos que receberam Fab c7E3 apresentaram uma resposta imune (título = 1:50). O Fab c7E3, que reage com anticorpos humanos endógenos, demonstrou-se portanto ser muito menos imunogénico do que Fab m7E3 que não reage com anticorpos endógenos.
Exemplo 2
As possíveis sequências derivadas da região de charneira de Fab gama 1 humano (e F(ab')2) reactivas com anticorpos pré-imunidade endógenos "anti-fragmento" podem ser identificadas através de experiências de rastreio e competição usando péptidos sintéticos. Foram produzidos péptidos sintéticos, com cerca de 5 aminoácidos ou mais de comprimento, que possuem várias sequências encontradas na sequência de aminoácidos da região de charneira.
As sequências mais reactivas podem então ser 25 ΡΕ0676965 ligadas a um composto imunogénico com interesse para reduzir a imunogenicidade. A ligação pode ser conseguida de várias formas. Se o composto imunogénico for uma proteína, o extremo C natural da proteína imunogénica pode ser convertido na sequência pretendida por mutagénese dirigida do gene, mais facilmente conseguido usando sequências iniciadoras de PCR adequadamente desenhadas para eliminar o codão de terminação natural e adicionar a sequência pretendida. Estas técnicas poderão ser usadas para adicionar ou substituir a sequência em qualquer posição de qualquer gene. Como alternativa, pode ser construído um péptido sintético correspondendo à sequência reactiva mínima e poderá ser ligado a compostos imunogénicos por meios químicos.
Exemplo 3
As sequências de aminoácidos que são reactivas com anticorpos em soro humano normal, a serem usadas como sequências auto-antigénicas para tornar menos imunogénicas moléculas estranhas ou normalmente imunogénicas, podem ser identificadas por rastreio de péptidos sintéticos com soros humanos. Este é um método geral que não requer identificação de um local de clivagem específico por protease de uma proteína endógena e nem mesmo requer que a sequência seja natural.
Resumidamente, é gerada uma biblioteca de péptidos ao acaso de pelo menos cerca de 5 ou mais e, de 26 ΡΕ0676965 preferência, cerca de 5-10 aminoácidos de comprimento. Estes péptidos são testados relativamente a reactividade com anticorpos em soros humanos. Isto é conseguido, por exemplo, através da imobilização dos péptidos numa fase sólida e realização de um ensaio de ELISA convencional para detectar anticorpos humanos ligados após exposição a soros. Péptidos positivos foram então ainda avaliados para estabelecer se são reactivos apenas com soros humanos e não com outras espécies e para determinar a afinidade das interacções. Os péptidos que reagem com a maioria dos soros humanos mas não com soros de outras espécies, foram então estudados para determinar se são capazes de conferir imunogenicidade reduzida em compostos que de outra forma seriam imunogénicos. Se um determinado péptido induz ou não uma resposta imune requer dados empíricos de imunogenicidade .
Existem muitas formas possíveis de gerar e testar bibliotecas ou sequências peptídicas ao acaso. Um método é sintetizar colecções de péptidos (Schoofs, P.G. et al., (1988) Immun. 140:611) e testar estes lotes relativamente a reactividade com soro humano. Os lotes positivos foram subdivididos e testados de novo várias vezes para que a espécie activa seja eventualmente identificada. Um outro método é gerar uma sequência de DNA que codifique segmentos de aminoácidos ao acaso e fusão das sequências de DNA com um gene de bacteriófago (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552). As sequências de aminoácidos ao acaso são 27 ΡΕ0676965 apresentadas no exterior da partícula bacteriofágica como um extremo C artificial de uma proteína fágica. 0 fago é imobilizado e testado relativamente à reactividade com anticorpos humanos endógenos. Os fagos positivos são isolados e o DNA extraído e sequenciado para determinar a sequência de aminoácidos do segmento peptídico reactivo.
Exemplo 4
Em geral, na prática é difícil testar candidatos a sequências auto-antigénicas em seres humanos, para determinar se a sua presença torna menos imunogénicos os compostos imunogénicos, devido a necessitar de ensaios experimentais em seres humanos, o que levanta preocupações éticas em muitas circunstâncias. Devido a esta dificuldade em testar a imunogenicidade de moléculas candidatas em seres humanos, foi usado um modelo de coelho para simular o sistema humano e demonstrar que epitopos de anticorpos pré-imunidade podem ser identificados e ligados a compostos imunogénicos para reduzir a imunogenicidade dos compostos.
Os epitopos de anticorpos pré-imunidade podem ser identificados como descrito no Exemplo 3 mas substituindo o soro humano por soro de coelho nos protocolos descritos. As sequências de aminoácidos que reagem com os anticorpos endógenos podem ser identificados e ligados a vários compostos por métodos conhecidos. Podem ser gerados dados comparativos a partir de experiências em que os compostos 28 ΡΕ0676965 ligados às sequências suspeitas de serem auto-antigénicas e compostos por si sós são administrados a coelhos. A resposta imune contra cada um dos compostos pode ser medida.
Demonstrou-se que os coelhos apresentam o mesmo tipo de reactividade normal contra fragmentos Fab homólogos; ou seja, pré-imunidade contra fragmentos Fab. A região adequada de DNA de coelho da cadeia pesada de imunoglobulina foi clonada e determinada a sequência da região de charneira. Isto permite a construção de um composto de fusão que compreende uma sequência auto-antigénica de coelho ligada à IgG 7E3 quimérica no extremo C de uma molécula Fab e avaliação da sua imunogenicidade comparativamente com a imunogenicidade de Fab 7E3 quimérica em coelhos.
Exemplo 5 A estreptoquinase é uma proteína trombolítica aprovada como fármaco para doentes com acidentes cardiovasculares que sofram de bloqueios coronários. Uma grande desvantagem da estreptoquinase é ser altamente imunogénica em seres humanos. Assim, a sua utilidade está grandemente limitada. Particularmente, uma vez administrada estreptoquinase existe a possibilidade de reacções imunes perigosas quando de qualquer administração subsequente. 29 ΡΕ0676965 0 presente invento oferece um método de redução da imunogenicidade da estreptoquinase, reduzindo assim as desvantagens inerentes à molécula como fármaco, as quais constituem a base das preocupações relativas a segurança associadas à sua utilização. A produção de estreptoquinase usando tecnologia de DNA recombinante é conhecida e pode ser realizada pelos familiarizados com a matéria usando materiais de partida facilmente acessíveis. De forma semelhante, técnicas conhecidas podem ser realizadas para produzir um derivado de estreptoquinase que tenha a sequência auto-antigénica CDKTH (SEQ ID N0:1) no extremo C da proteína. Os familiarizados com a matéria podem produzir tal derivado de estreptoquinase sem experimentação adicional. 0 derivado de estreptoquinase pode ser testado in vitro e em modelos animais para assegurar que mantém a actividade de estreptoquinase. Experiências clínicas comparativas podem então ser realizadas para medir a imunogenicidade de estreptoquinase versus a imunogenicidade do derivado de estreptoquinase. As técnicas para efectuar estas experiências são do conhecimento geral e podem ser facilmente executadas pelos familiarizados com a matéria.
Exemplo 6
Existem vários exemplos de Mabs quiméricos que 30 ΡΕ0676965 induzem respostas imunes dirigidas contra as regiões variáveis. Estes incluem B72.3 (Meredith et al., (1992) J. Nucl. Medicine 33:23-29) e chl4.18 (Saleh, et al., (1992) Hum. Antibody Hybridoma 3:19-24). O facto de estes anticorpos induzirem respostas imunes representa um grande obstáculo à sua eficácia e a sua utilidade está grandemente limitada pela sua imunogenicidade. Particularmente, os doentes desenvolvem anticorpos contra os anticorpos e neutralizam a sua actividade. O presente invento proporciona um método de redução da imunogenicidade de Mabs quiméricos, reduzindo assim as bases das preocupações com segurança que estão associadas à sua utilização e aumentando a sua utilidade. Estão descritas técnicas para a manipulação de anticorpos em Winter e Millstein (1991) Nature 349:293 e Larrich e Fry (1991) Hum. Antibod. And Hybridomas 2:17. A produção de B72.3 e chl4.18 pode ser conseguida a partir de materiais de partida acessíveis, usando tecnologia de DNA recombinante conhecida dos familiarizados com a matéria. Igualmente, podem ser realizadas técnicas conhecidas para produzir derivados de Mab quiméricos dB72.3 e dchl4.18 em que a sequência auto-antigénica CDKTH (SEQ ID NO:l) está presente no extremo C de cada um dos anticorpos, de preferência na cadeia pesada. Os familiarizados com a matéria podem produzir tais Mabs quiméricos e derivados de Mabs quiméricos sem experimentação adicional. ΡΕ0676965
Derivados quiméricos de Mab dB72.3 e de dchl4.18 podem ser testados in vitro e em modelos animais para assegurar que mantêm a sua especificidade e actividade. Podem ser realizadas experiências clinicas comparativas para medir a imunogenicidade dos Mabs quiméricos B72.3 e chl4.18 versus a imunogenicidade de derivados quiméricos dos Mabs dB72.3 e dchl4.18, respectivamente. As técnicas para efectuar estas experiências são bem conhecidas e podem ser facilmente realizadas pelos familiarizados com a matéria.
Tabela 1
Sequências de Charneira de Imunoglobulinas Humanas e de Ratinho
Tipo de anticorpo Sequência de charneira IgGi humana EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:11) IGg2 humana ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO.12) IgG3 humana ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDT PPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:13) IgG3 humana Ml5 EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:14) IgG4 humana ESKYGPPCP(S/P)CP (SEQ ID N0:15) IgGi de ratinho VPRDCGCKPCICT (SEQ ID NO:16) IgG2a de ratinho EPRGPTIKPCPPCKCP (SEQ ID NO:17) 32 ΡΕ0676965 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l
Cis Asp Lis Tre His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2
Pro Lis Ser Cis Asp 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3
Lis Ser Cis Asp Lis 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 33 ΡΕ0676965 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4
Ser Cis Asp Lis Tre 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5
Asp Lis Tre His Tre 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6
Lis Tre His Tre Cis 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7
Lis Tre His Tre Cis 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 34 ΡΕ0676965 (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:
Tre His Tre Cis Pro 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:
His Tre Cis Pro Pro 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:
Tre Cis Pro Pro Cis 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10
Cis Pro Pro Cis Pro 1 5 35 ΡΕ0676965 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11:
Glu Pro Lis Ser Cis Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis Pro 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:
Glu Arg Lis Cis Cis Vai Glu Cis Pro Pro Cis Pro 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:
Glu Leu Lis Tre Pro Leu Gli Asp Tre Tre His Tre Cis Pro Arg Cis 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lis Ser Cis Asp Tre Pro Pro Pro Cis Pro Arg Cis Pro 20 25 30 Glu Pro Lis Ser Cis Asp Tre Pro Pro Pro Cis Pro Arg Cis Pro Glu 35 40 45 Pro Lis Ser Cis Asp Tre Pro Pro Pro Cis Pro Arg Cis Pro 50 55 60 36 ΡΕ0676965 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:
Glu Pro Lis Ser Cis Asp Tre Pro Pro Pro Cis Pro Arg Cis Pro 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto= "OUTRO" /nota= "SER ou PRO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:
Glu Ser Lis Tir Gli Pro Pro Cis Pro Xaa Cis Pro 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:
Vai Pro Arg Asp Cis Gli Cis Lis Pro Cis Ile Cis Tre 15 10 37 ΡΕ0676965 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:
Glu Pro Arg Gli Pro Tre Ile Lis Pro Cis Pro Pro Cis Lis Cis Pro 15 10 15
Lisboa, 17 de Outubro de 2007
Claims (5)
- ΡΕ0676965 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de redução da imunogenicidade de uma região variável de anticorpo imunogénica compreendendo: a) selecção de uma sequência auto-antigénica derivada de um ou mais fragmentos proteicos e/ou péptidos que é reconhecida por um anticorpo humano pré-imunidade, em que a referida sequência auto-antigénica compreende uma sequência de aminoácidos carboxi-terminal que forma um epitopo reconhecido pelo referido anticorpo humano pré-imunidade; e b) ligação da referida região variável de anticorpo imunogénico ao extremo amina da referida sequência auto-antigénica, o extremo carboxilo da referida sequência auto-antigénica não estando ligado, pelo que é produzido um composto de fusão tendo imunogenicidade reduzida num ser humano relativamente à referida região variável de anticorpo imunogénica, em que o composto de fusão tendo imunogenicidade reduzida num ser humano não é Fab c7E3. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a referida sequência auto-antigénica é seleccionada em a) por combinação de um anticorpo pré-imunidade e de um ou mais fragmentos e/ou péptidos e selecção de uma sequência auto-antigénica, que é reconhecida pelo referido anticorpo huma- 2 ΡΕ0676965 no pré-imunidade, de entre um ou mais fragmentos proteicos e/ou péptidos. 3. 0 método da reivindicação 1 ou 2, em que a referida sequência auto-antigénica é seleccionada em a) por combinação do anticorpo humano pré-imunidade e de um ou mais fragmentos de IgG humana que possuem sequências da região de charneira no extremo C-terminal e/ou péptidos derivados da região de charneira de uma IgG humana e selec-ção de uma sequência auto-antigénica, que seja reconhecida pelo referido anticorpo humano pré-imunidade, derivada de um ou mais fragmentos de IgG e/ou péptidos. 4. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a referida região variável de anticorpo é uma região variável de anticorpo não humano. 5. 0 método da reivindicação 4, em que a referida região variável de anticorpo não humano é uma região variável de um anticorpo monoclonal murino. 6. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a referida sequência auto-antigénica ocorre no extremo C de um fragmento de uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de IgG humana. 7. 0 método da reivindicação 6, em que a referida sequência auto-antigénica deriva da região de charneira de uma IgGi humana. 3 ΡΕ0676965 8. 0 método de qualquer uma das reivindicação 1-5, em que a referida sequência auto-antigénica deriva da região de charneira de uma IgG humana. 9. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a referida sequência auto-antigénica é um fragmento de uma proteína humana que tem um extremo carboxilo produzido pela clivagem da proteína humana com uma enzima proteolítica.
- 10. Um método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o extremo carboxilo da referida sequência auto-antigénica consiste numa sequência de aminoácidos selecci-onada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10.
- 11. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida sequência auto-antigénica está ligada ao referido composto imunogénico, através de ligação química de um péptido compreendendo a referida sequência auto-antigénica ao referido composto imunogénico.
- 12. O método de qualquer uma das reivindicações 1-10, em que a ligação da região variável de anticorpo imu-nogénica a sequência auto-antigénica compreende a expressão de um gene quimérico codificador de uma proteína de fusão, o referido gene quimérico compreendendo uma primeira 4 ΡΕ0676965 sequência nucleotídica que codifica a referida região variável de anticorpo imunogénica e uma segunda sequência nucleotidica que codifica a referida sequência auto-antigénica, para que a expressão do referido gene quimérico produza uma proteína de fusão tendo a referida sequência auto-antigénica ligada à referida região variável de anticorpo imunogénica. 13. 0 método da reivindicação 12, em que a referida segunda sequência nucleotidica está ligada ao extremo C da referida primeira sequência nucleotidica.
- 14. Um método de redução de imunogenicidade de uma região variável de um anticorpo monoclonal murino num ser humano compreendendo: a) combinação de um anticorpo humano pré-imunidade e de um ou mais fragmentos de IgG possuidores de sequências da região de charneira no extremo 3' e/ou péptidos derivados da região de charneira de uma IgG humana e selecção de uma sequência auto-antigénica reconhecida pelo referido anticorpo pré-imunidade derivada de um ou mais dos referidos fragmentos de IgG e/ou péptidos, em que a referida sequência auto-antigénica compreende uma sequência de aminoácidos no extremo carboxilo que forma um epitopo reconhecido pelo referido anticorpo humano pré-imunidade; e 5 ΡΕ0676965 b) ligação da referida região variável ao extremo amina da referida sequência auto-antigénica, o extremo carboxilo da referida sequência auto-antigénica não estando ligado, pelo que é produzido um composto de fusão tendo imunogenicidade reduzida relativamente à referida região variável de um anticorpo monoclonal murino, em que o referido composto de fusão possuidor de imunogenicidade reduzida não é Fab c7E3. 15. 0 método da reivindicação 14, em que a referida IgG humana é IgGl humana. 16. 0 método da reivindicação 15, em que a referida sequência auto-antigénica é SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:5. Lisboa, 17 de Outubro de 2007
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US97770592A | 1992-11-16 | 1992-11-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT676965E true PT676965E (pt) | 2007-10-29 |
Family
ID=25525432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT94901552T PT676965E (pt) | 1992-11-16 | 1993-11-16 | Método para reduzir a imunogenicidade da região variável de anticorpos |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6652863B1 (pt) |
| EP (1) | EP0676965B1 (pt) |
| AT (1) | ATE367827T1 (pt) |
| AU (1) | AU5610194A (pt) |
| DE (1) | DE69334156T2 (pt) |
| DK (1) | DK0676965T3 (pt) |
| ES (1) | ES2293635T3 (pt) |
| PT (1) | PT676965E (pt) |
| WO (1) | WO1994011028A1 (pt) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6652863B1 (en) * | 1992-11-16 | 2003-11-25 | Centocor, Inc. | Method of reducing the immunogenicity of compounds |
| EP1718749A4 (en) * | 2004-02-06 | 2007-07-18 | Nymox Corp | ANTI-AF-20 HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY |
| US7625549B2 (en) * | 2004-03-19 | 2009-12-01 | Amgen Fremont Inc. | Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice |
| US20080287320A1 (en) * | 2006-10-04 | 2008-11-20 | Codon Devices | Libraries and their design and assembly |
| US8501907B2 (en) * | 2007-08-10 | 2013-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Immunoglobulin cleavage fragments as disease indicators and compositions for detecting and binding such |
| WO2009149218A2 (en) * | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Codon Devices, Inc. | Novel proteins and methods of designing and using same |
| EP2784080B1 (en) * | 2011-10-31 | 2019-12-18 | Shimadzu Corporation | Peptide-hinge-free flexible antibody-like molecule |
| AU2014373593B2 (en) * | 2013-12-23 | 2020-07-16 | Zymeworks Bc Inc. | Antibodies comprising C-terminal light chain polypeptide extensions and conjugates and methods of use thereof |
| WO2018087349A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | Morphosys Ag | Fab molecules with a rodent hinge region and a non-rodent ch1 region |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| GB8430252D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
| PT89484B (pt) * | 1988-01-22 | 1994-03-31 | Gen Hospital Corp | Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao |
| US5770198A (en) * | 1988-05-18 | 1998-06-23 | The Research Foundation Of The State Of New York | Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin |
| KR940009084B1 (ko) | 1988-05-18 | 1994-09-29 | 체크 포인트 시스템스, 인코오퍼레이티드 | 자기 및 공명회로 검출용 안테나 시스템 |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5225538A (en) | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| CA2065010A1 (en) * | 1989-08-23 | 1991-02-24 | Brian Seed | Non-human primate cd4 polypeptides, fusions thereof, dna encoding, and uses thereof |
| WO1991010722A2 (en) * | 1989-12-27 | 1991-07-25 | Centocor, Inc. | Chimeric immunoglobulin for cd4 receptors |
| EP1136556B1 (en) | 1991-11-25 | 2005-06-08 | Enzon, Inc. | Method of producing multivalent antigen-binding proteins |
| ES2179824T3 (es) | 1991-12-20 | 2003-02-01 | Yamanouchi Pharma Co Ltd | Anticuerpos humanizados reactivos contra el antigeno gpiib/iiia. |
| US5777085A (en) | 1991-12-20 | 1998-07-07 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA |
| US5326856A (en) * | 1992-04-09 | 1994-07-05 | Cytogen Corporation | Bifunctional isothiocyanate derived thiocarbonyls as ligands for metal binding |
| US6652863B1 (en) * | 1992-11-16 | 2003-11-25 | Centocor, Inc. | Method of reducing the immunogenicity of compounds |
-
1993
- 1993-11-16 US US08/433,441 patent/US6652863B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-16 ES ES94901552T patent/ES2293635T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-16 AU AU56101/94A patent/AU5610194A/en not_active Abandoned
- 1993-11-16 PT PT94901552T patent/PT676965E/pt unknown
- 1993-11-16 WO PCT/US1993/011148 patent/WO1994011028A1/en active IP Right Grant
- 1993-11-16 AT AT94901552T patent/ATE367827T1/de active
- 1993-11-16 DE DE69334156T patent/DE69334156T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-16 EP EP94901552A patent/EP0676965B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-16 DK DK94901552T patent/DK0676965T3/da active
-
2003
- 2003-09-02 US US10/653,706 patent/US20050079183A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69334156T2 (de) | 2008-04-10 |
| AU5610194A (en) | 1994-06-08 |
| EP0676965A1 (en) | 1995-10-18 |
| EP0676965A4 (en) | 2002-08-07 |
| US20050079183A1 (en) | 2005-04-14 |
| DE69334156D1 (de) | 2007-09-06 |
| ES2293635T3 (es) | 2008-03-16 |
| ATE367827T1 (de) | 2007-08-15 |
| WO1994011028A1 (en) | 1994-05-26 |
| DK0676965T3 (da) | 2007-11-19 |
| EP0676965B1 (en) | 2007-07-25 |
| US6652863B1 (en) | 2003-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5196510A (en) | Molecular recognition units | |
| Jemmerson | Antigenicity and native structure of globular proteins: low frequency of peptide reactive antibodies. | |
| Surh et al. | Comparative epitope mapping of murine monoclonal and human autoantibodies to human PDH-E2, the major mitochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis. | |
| Grey | Duck immunoglobulins: II. Biologic and immunochemical studies | |
| Migliaccio et al. | Heterogeneous response of antimitochondrial autoantibodies and bile duct apical staining monoclonal antibodies to pyruvate dehydrogenase complex E2: the molecule versus the mimic | |
| Beachey et al. | Repeating covalent structure and protective immunogenicity of native and synthetic polypeptide fragments of type 24 streptococcal M protein. Mapping of protective and nonprotective epitopes with monoclonal antibodies. | |
| Sakata et al. | Immunochemistry of serum albumin. X. Five major antigenic sites of human serum albumin are extrapolated from bovine albumin and confirmed by synthetic peptides | |
| Plaué et al. | A branched, synthetic octapeptide of ubiquitinated histone H2A as target of autoantibodies. | |
| Elsayed et al. | Epitope mapping of region 11–70 of ovalbumin (Gal d I) using five synthetic peptides | |
| PT676965E (pt) | Método para reduzir a imunogenicidade da região variável de anticorpos | |
| Powers et al. | Comparative analysis of epitope recognition of glutamic acid decarboxylase (GAD) by autoantibodies from different autoimmune disorders | |
| JPH05310790A (ja) | Ｃｅｎｐ−ｂエピトープ | |
| JPH0881499A (ja) | 抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ | |
| AU587967B2 (en) | Anti-idiotype antibodies induced by synthetic polypeptides | |
| US5407833A (en) | Peptides of the SM-D antigen and their use for diagnosis of systemic lupus erythematosus | |
| Wen et al. | Mapping of epitopes on the 86 kDa subunit of the Ku autoantigen | |
| Park et al. | Targeted destruction of the polymerized human serum albumin binding site within the preS2 region of the HBV surface antigen while retaining full immunogenicity for this epitope | |
| St Clair et al. | Anti-La antibody production by MRL-1pr/1pr mice. Analysis of fine specificity. | |
| Kato et al. | The immunogenicity of various peptide antigens inducing cross‐reacting antibodies to a cell surface protein antigen of Streptococcus mutans | |
| Cooper et al. | Antibodies for immunochemistry | |
| Cook et al. | Antibodies to the collagen-like region of C1q and type II collagen are independent non-cross-reactive populations in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis | |
| JPH06511151A (ja) | アルコール中毒患者を同定しアルコール消費を監視するためのイムノアッセイ | |
| US10066006B2 (en) | Compositions and methods for redox modulated proteins | |
| Van Kampen et al. | B‐cell epitopes of the allergen Chi t 1.01: peptide mapping of epitopes recognized by rabbit, murine, and human antibodies | |
| JP2006008694A (ja) | 全身性エリテマトーデスの診断、治療製剤製造用ペプチド |