PT89484B - Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao - Google Patents

Description

THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION

GENES CLONADOS CODIFICADORES DE PROTEÍNAS DE FUSÃO Ig-CD4 E SUA UTILIZAÇÃO

que ê capaz de se ligar a gpl20.

invento também está relacionado com um método para a produção de uma molécula do tipo imunoglobulina que consiste em se incluir na referida molécula a proteína de fusão do invento juntamente com uma cadeia leve ou pesada de imunog1obu1ina.

invento também está relacionado com um método para tratamento de infecções provocadas por HIV ou SIV caracterizado pela administração das proteínas de fusão ou moléculas do tipo imunog1obu1ina do invento a um animal.

invento também está relaciona^ do com ensaios para HIV ou SIV caracterizados por se pôr em contacto uma amostra suspeita de conter gpl20 de HIV ou SIV com a molécula de proteína de fusão tipo imunog1obu1ina do invento e detecção da formação de um complexo.

Referência a um pedido de patente relacionado

Este pedido de patente é uma continuação em parte do Pedido de Patente U.S. No. de Série 07/147 351 entregue em 22 de Janeiro de 1988.

Campo do Invento invento situa-se no campo da genética recombinante.

Fundamento do invento

Os vírus de imunodeficiência humano, HIV, e símio, SIV, são os agentes causadores do Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e do Síndroma da Imunodeficiência Símia (SIDS), respectivamente. Ver Curren, J. et al., Science 329: 1359-1357 ( 1985 ); Weiss,

R. et al., Nature 324:572-575 (1985). 0 vírus HIV contem uma g 1 icoproteina do envólucro, gpl20 que se liga à proteína DC4 presente na superfície de linfócitos T helper, macrófagos e outras células. Dalgleish et al., Nature:312: :763 (1984). Depois da ligação de gpl20 a CD4, a entrada do vírus é facilitada por uma fusão de membranas envolvendo o envólucro e a membrana da célula alvo do vírus.

No decurso da infecção, o organismo hospedeiro desenvo1ve anticorpos contra proteínas virais, incluindo as principais glicoproteinas do envólucro gpl20 e gp41. Apesar desta imunidade humoral a doença avança resultando numa imuno-supressão letal caracterizada por múltiplas infecções oportunístlcas, parasitémia.demencia e morte. A incapacidade dos anticorpos anti-virais produzi-4-

dos pelo hospedeiro em parar a progressão da doença representa um dos aspectos mais frustantes e alarmantes da infecção e dá pouca esperança a esforços de vacinação baseados em abordagens convencionais.

Dois factores podem ter um papel importante na ineficácia da resposta humoral aos vírus da imunodeficiência. Primeiro, tal como outros vírus de RNA (e tal como os retrovirus em particular), os vírus da imunodeficiência apresentam uma taxa de mutação elevada que permite a evolução rápida da variação antigénica em resposta às defesas imunes do hospedeiro. Segundo, as próprias g1icoproteinas do envólucro são moléculas altamente glicosiladas apresentando pcucos epítopos adequados à ligação de anticorpos de elevada afinidade. 0 alvo em movimento fracamente antigénio que o envólucro virai apresenta deixa ao hospedeiro uma estreita oportunidade de restringir a infecção virai através da produção de anticorpos específicos.

As células infectadas pelo vírus HIV expressam a g1icoproteina gpl20 na sua superfície. Gpl20 medeia as fusões entre células CD4⁺ através de uma reacção semelhante à que preside a entrada do vírus na célula não infectada conduzindo à formação de células gigantes multinucleadas de vida curta. A formação de sincicios está dependente de uma interacção directa da g1icoproteina do envólucro gpl20 com a proteina CD4. Dalgleish et al., supra, Klatzmann, D. et al, Nature, 312: 763(1984);McDouga1, J.S. et al, Sc i ence, 231; 382 ( 1986); Sodroski, J. et al, Nature, 322: 470 ( 1986 ); Lifson, J.D. et al, Nature, 323: 725 ( 1 986 ); Sodroski, J. et al, Nature, 321 :412 (1980).

A proteina CD4 consiste numa região extracelular de 370 aminoácidos contendo quatro domínios tipo imunog1obu1ina, um dominio que atravessa a membrana e uma região intracelular carregada de 40 residuos de

aminoácidos.

Maddon, P. et al, Ce11 £2:93( 1985); Clark, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sei . (USA) 84:1649 (1987).

A evidência de que a ligação CD4gpl20 é responsável pela infecção virai de células portadoras do antigénio CD4 inclui a observação de um complexo especifico formado entre gpl20 e CD4. McDougal et al, supra Outros investigadores mostraram que linhas celulares, refrac tárias ao HIV, foram convertidas em linhas celulares sensíveis após transfecção e expressão do gene de cDNA de CD4 humano. Maddon et al, Ce 11 £7:333-348 ( 1986 ).

Ao contrário da maioria das interacções anticorpo-envó1ucro, a interacção-receptor envólucro é caracterizada por uma associação imutável de elevada

O afinidade (Ka ~ 10 1/role ). Ainda, a afinidade do vírus para CD4 é de pelo menos três ordens de grandeza superior à afini dade de CD4 para o seu ligando endógeno putativo, os antigénios MHC classe II. De facto, até à data, não foi demonstrada uma associação física especifica entre monómeros de CD4 e antigénios classe II.

Como resposta à infecção por bactérias ou outras partículas, o organismo hospedeiro produz geralmente anticorpos que se ligam a proteínas especificas ou açúcares na superfície da bactéria ou da partícula, revestindo assim a bactéria. Este revestimento da bactéria ou outras partículas por anticorpos estimula a citólise através de células linfóides portadoras do receptor Fc por um mecanismo de toxicidade celular dependente de anticor pos (ADCC). Outras proteinas do soro, co1ectivamente designadas complemento (C), ligam-se a alvos revestidos com anticorpos e também podem revestir insepecificamente partículas estranhas. Elas provocam a morte celular por lise ou esti-6mulam a ingestão através da ligação a receptores específicos no macrófago designados receptores do complemento. Ver Darnell J. et al., em Molecular Cel 1 Biology, Scientific American Books, págs 641 e 1087 (1986).

As classes de Ig mais eficazes na activação de complemento são IgM e IgGl. 0 sistema do complemento consiste em 14 proteínas que, actuando por ordem, provocam a lise das células. Quase todas as proteinas C existem no soro normal como precursores inactivos.Quando activadas algumas tornam-se enzimas proteolíticas altarraite especificas cujo substracto é a proteína seguinte numa reacção sequenciada em cadeia.

	Toda	a sequencia C pode	ser despe-
lotada	por uma de duas vias de	iniciação. Numa (a	via clás-
s i ca ) ,	complexos Ab-Ab ligam e	activam Cl, C4 e C2	para
forma r	uma enzima que cliva C3.	Na segunda via os	polissa-
cá r i dos	que se encontram normalmente na superfície	de mui-

tas bactérias e fungos ligam-se a quantidades Ínfimas de um fragmento de C3 e depois as duas outras proteinas (factor B e properdina) para formar uma outra enzima que cliva C3.Uma vez clivado C3 por qualquer uma das vias, está aberto o caminho à restante sequencia de passos que conduzem à lise celular. Ver Davis, B.D., et al., em M i crob i o 1 ogy , 3^? ed., Harper e Row, Phi 1 ade 1 phia , PA, págs 452-466(1980).

Vários investigadores descreveram já métodos para a preparação de proteinas híbridas. Por exemplo Murph y, Patente dos Estados Unidos 4 675 382(1982) descreve a utilização de técnicas de DNA recombinante para fazer moléculas de proteina híbridas através da formação do gene fundido pretendido codificador de uma proteina híbrida da toxina da difteria e de um ligando polipeptidico como seja uma hormona, seguido da expressão do gene fundido.

Muitos investigadores prepararam anticorpos monoclonais (Mabs) por técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais são moléculas altarente especificas bem caracterizadas no que respeita à estrutura primária e terciária. Eles têm sido largarente usados para caracterização e quantificação imunoquimica i n vitro de antigênios. Os genes das cadeias pesada e leve foram introduzidos em hospedeiros adequados e expressos, seguido de reagregação das cadeias individuais para dar moléculas de anticorpo funcionais (ver, por exemplo, Munro, Nature 312: :597 (1984); Morrisson,S.L., Science 229:1202(1985); Oi et al, B i otechn i ques 4:214 ( 1986); Wood et al, Nature 314:

:446-449(1985)). As regiões ciáveis da cadeia leve e pesada têm sido clonadas e expressas em hospedeiros estranhos nos quais mantêm a sua capacidade de ligação (Moore et al, Pedido de Patente Europeia 0088994 (publicado em 21 de Setembro de 1983).

Os anticorpos quiméricos ou híbridos também foram preparados por técnicas de DNA recombinante.

Oi e Morrison, Biotechniques 4:214(1986) descreve uma estratégia para a produção de tais anticorpos quiméricos que inclien um anticorpo quimérico de IgG humana anti-leu3.

Gascoigne, N.R.J., et a 1,Proc.Natl. Acad.Sei.(USA)84:2936-2940(1987) descreve a preparação de uma construção de genes quiméricos contendo um domínio varia, vel (V) da cadeia do receptor das células T e uma sequência codificadora da região constante (C) de uma molécula de imunog 1 obu1ina 2a. As células transfectadas com o gene quimérico sintetizam um produto proteico que expressa determinantes antigênios da imunog1obu1ina e do receptor das células T assim como sítios de ligação à proteína A.Esta proteína associa-se a uma cadeia normal para formar uma molécula de imunog 1 obu 1 ina tetramêrica (H2L2, onde H = pesafa e L-leve) aparentemente normal que é secretada.

Sharon, J. et a 1., Nature 309:54(1984) descreve a construção de um gene quimérico codificador da região variável (V) de uma cadeia pesada de ratinho especifica para o hepteno azofeni1arsonato e a região constante (C) de uma cadeia leve Kappa de murganho (V^C^). Este gene foi introduzido numa linha celular de mieloma de murganho.0 gene quimérico foi expresso para dar uma proteina que se associou com as cadeias leves secretadas pela linha celular de mieloma para dar uma molécula de anticorpo especifica de azofen i1 a rsonato.

Morrison, Science 229:1202(1985) descreve que as regiões variáveis das cadeias leve ou pesada podem ser ligadas a uma sequencia não Ig para criar proteínas de fusão. Este artigo estabelece que as potenciais utilizações das proteínas de fusão são três:(l) ligar especificarrante anticorpos a enzimas para usar em ensaios; (2) isolar proteínas não Ig por colunas de antigénio; e (3) libertar especificamente agentes tóxicos.

Técnicas recentes para a introdução estável de genes de imunoglobulina em células de mieloma (Banerji, J. et a I, Ce 1 1 33: 729-740 (1983); Potter, H, et al , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 8J_: 71 6 1 - 71 6 5 ( 1 9 8 4 ) , acoplado a informação estrutural detalhada, permitiu a utilização de métodos de DNA in vitro como seja mutagénese, para gerar anticorpos recombinantes possuindo novas propriedades.

Pedido de Patente PCT W087/02671 descreve métodos para a produção de anticorpos obtidos por engenharia genética com as propriedades pretendidas da especificidade da região variável e da região constante através da clonagem e expressão de genes das cadeias leve e pesada.

mRNA das linhas clonadas de hibridomas de células B que

-9produzem anticorpos monoclonais com a especificidade pretendida é isolado para clonagem de cDNA. A geração de sequências codificadoras das cadeias leve e pesada é conseguida removendo as regipoes variáveis clonadas e ligando-as a vectores de módulos de cadeias leves ou pesadas. Isto dá sequências de cDNA que codificam as cadeias de imunog1obu 1 ina. A ausência de intrões permite que estas sequências de cDNA sejam expressas em hospedeiros procarióticos, tais como bactérias, ou em hospedeiros eucarióticos inferiores, como sejam leveduras.

A geração de anticorpos quiméricos em que a parte da imunog1obu1ina de ligação ao antigénio é fundida com outras partes foi demonstrada. Exemplos de genes que não sendo de imunoglobul ina estão fundidos a anticorpos incluem nuclease de Staphylococcus aureus, o oncogene c-myc, de murganho e o fragmento Klenow da DNA-po1imerase I de Ej. coli (Neuberger, M.S. et a 1 , 312:604-612 (1984); Neuberger, M.S, Trends in Biochemical Science 347-349(1985)). 0 Pedido de Patente Europeia 120 694 descreve a obtenção por engenharia genética das regiões variáveis e constantes de uma molécula, de imunoglobulina que é expressa em células hospedeiras jj. coI i . E ainda descrito que a molécula de imunog1obu1ina pode ser sintetizada por uma célula hospedeira com uma outra porção peptidica ligada a um dos domínios constantes. Tais porções peptidicas estão descritas como citotóxicas ou enzimáticas. 0 pedido de patente e os exemplos descrevem a utilização de uma cadeia tipo lambda derivada de um anticorpo monoclonal que se liga a haptenos 4-hidroxi-3-n i trofen ilo (NP ) .

Pedido de Patente Europeia

125 023 está relacionado com a utilização de técnicas de DNA recombinante para produzir moléculas de imunoglobul inas q£ são quiméricas ou modificadas de outro modo. Uma das uti-

lizações descritas para estas moléculas de imunog1obu 1 ina é para diagnóstico do corpo em geral e a tratamento por injecção dos anticorpos dirigidos contra tecidos alvo específicos. A presença da doença pode ser determinada através da ligação de uma marca adequada aos anticorpos ou o tecido doente pode ser atacado pelos anticorpos portadores de uma droga adequada. 0 pedido de patente descreve anticorpos obtidos por engenharia genética para ajudar a libertação especifica de um agente como anticorpos alterados.

Pedido de Patente PCT W083/101533 descreve anticorpos quiméricos em que a região variável de uma molécula de imunoglobulina é ligada a uma porção de uma segunda proteina que podem compreender a porção activa de uma enzima.

Boulianne et a 1, Nature 312:643( 1984) construiu um gene de imunoglobulina em que os segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de murganho especificas para o hapteno trinitrofeno1 (TNP) são ligadas aos segmentos que codificam regiões mu e Kapa humanas. Estes genes quiméricos foram expressos para dar IgM quimérica funcional de que se liga a TNP.

Morrison et a 1, P.N.A.S.(USA) 81:6851 (1984), descreve uma molécula quimérica utilizando os exões da região variável da cadeia pesada de uma proteina G de mieloma anti-fosfori1-colina, os quais foram ligados aos exões do gene da cadeia leve Kapa humana. Os genes foram usados para transfectar linhas celulares de mieloma de murganho, gerando células transformadas que produziram IgG quimérica murganho humano com funções deligação ao antigénio.

Apesar do progresso conseguido na determinação do mecanismo de infecção pelo HIV, continua a exis

-11tira necessidade de métodos de tratamento das infecções virais por ΗIV.

SUMARIO DO INVENTO invento está relacionado com um gene compreendendo uma sequencia de DNA que codifica uma proteina de fusão compreendendo 1) CD4 ou um seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV e 2) uma cadeia leve ou pesada de imunog1obu1ina; em que CD4 ou o referido fragmento de ligação a gpl20 substitui a região variável da cadeia leve ou pesada de imunog1obu1ina.

invento também está relacionado com vectores contendo o gene do invento e hospedeiros transformados com os vectores.

invento também está relacionado com um método para a produção de uma proteina de fusão compreendendo CD4, ou um seu fragiento que se ligue a gpl20 de HIV e uma cadeia leve ou pesada de imunog 1 obu1ina, em que a região variável da cadeia leve ou pesada da imunoglobulina foi substituída por CD4 ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV, o qual se caracteriza por;

cultura num meio nutritivo em condições de produção de proteina, uma estirpe hospedeira transformada com o vector contendo o gene do invento, o referido vector compreendendo ainda sinais de expressão que sejam reconhecidos pela referida estirpe hospedeira e expressão directa da referida proteina de fusão e recuperação da proteina de fusão assim produzida.

invento também está relacionado com uma proteina de fusão compreendendo CD4 ou um seu fragmento que é capaz de se ligar a gpl20 de HIV, fundida com o extremo C de uma segunÈ proteina que compreende uma cadeia leve ou pesada de imunog1obu1ina, em que a região variável da referida cadeia leve ou pesada é substituída por CD4 ou um seu fragmento de ligação a gpl20 de HIV.

As proteínas de fusão de IgGl e moléculas do tipo imunoglobulina podem ser úteis para a imunidade mediada pelo complemento e mediada por células (ADCC), enquanto que as proteínas de fusão IgM são úteis principalmente através da imunidade mediada pelo complemento .

invento também está relacionado com um complexo entre as proteínas de fusão e a molécula tipo imunog1obu1ina do invento e gpl20 de HIV.

invento também está relacionado com um método para o tratamento de infecções por HIV ou SIV compreendendo a administração da proteina de fusão ou molécula tipo imunog1obu1ina do invento a um animal.

invento está ainda relacionado com um método para a detecção de gpl2O de HIV numa amostra caracterizado por uma amostra suspeita de conter HIV ou gpl20 ser posta em contacto com a proteina de fusão ou molécula tipo imunog1obu1ina do invento e detecção da formação de um complexo.

Descrição das realizações preferidas invento ê dirigido a um gene de uma proteína que compreende

1)	uma sequência fragmento que	de se	DNA que codifica CD4	ou um seu fundido a
liga	a	gpl20 de	HIV,
2)	uma sequência	de	DNA	que	codifica	uma	cadeia

pesada de imunog 1 obu 1 ina .

De preferencia, o anticorpo tem função efectora.

invento é também dirigido a um gene de uma proteína que compreende

D	uma sequência fragmento que	de DNA que codifica	CD4 HIV,	ou um seu fundido a
se	1 iga	a	gpl20 de
2)	uma sequência	de	DNA	que	codifica	uma	cadeia

leve de imunog 1 obu 1 ina; em que a referida sequencia que codifica CD4 ou um seu fragmento de ligação a gpl20, substitui a região variável da cadeia leve de imunoglobu 1 ina .

invento é também dirigido à expressão destas novas proteínas de fusão em hospedeiros transformados e ao seu uso no tratamento e diagnóstico das infecções por HIV. Em particular, o invento está relacionado com a expressão dos referidos genes em hospedeiros mamíferos que expressam cadeias leves ou pesadas complementares para dar moléculas do tipo imunog1obu 1 ina que têm função efectora de anticorpo e também se ligam a gpl20 de HIV ou SIV.

-140 termo função efectora de anticorpo conforme aqui é usado significa capacidade para fixar complemento ou para activar ADCC.

As proteínas de fusão e moléculas do tipo imunog 1 obu 1 ina podem ser administradas a um animal com a finalidade de tratar infecções por HIV ou SIV. Pelos termos infecções por HIV pretende-se significar o estado em que se tem AIDS, complexo relacionado com AIDS (ARC) ou em que um animal é portador do vírus AIDS, mas que não apresenta os sintomas clínicos de AIDS ou ARC. Pelos termos infecções por SIV pretende-se significar o estado de estar infectado com vírus da imunodeficiência de símios.

Pelo termo animal pretende-se significar todos os animais que possam beneficiar da administração das proteínas de fusão e moléculas tipo imunog1obu1ina do invento. Entre tais animais estão os seres humanos, no entanto o invento não pretende 1 imitar-se-lhes.

Pelo termo proteína de fusão pretende-se incluir uma proteína de fusão compreendendo CD4, ou um seu fragmento que é capaz de se ligar a gpl20, ligado no seu extremo C a uma cadeia de imunog1obu 1 ina em que a porção do extremo N da imunoglobu 1 ina é substituido por CD4. Em geral, aquela porção da imunog1obu1ina que é eliminada ê a região variável. As proteínas de fusão do invento podem também compreender imunog1obu 1 inas em que foi eliminado mais do que a região varuável e substituido por CD4 ou o seu fragmento de ligação a gpl20 de HIV. Por exemplo, as regiões V^ e CHI de uma cadeia de imunog 1 obu 1 ina podem ser eliminadas. De preferencia, qualquer quantidade do extremo N da cadeia pesada de imunog1obu1inas pode ser eliminada desde que o restante fragmento tenha a função efectora de anticorpo.

A sequência mínima necessária para a ligação do complemento inclui domínios CH2 e CH3. A ligação de porções Fc pela região de charneira é vantajosa para aumentar a eficácia de ligação do complemento.

A porção CD4 da proteina de fusão pode compreender a sequencia CD4 completa, a região extracelular de 370 aminoácidos e o domínio que atravessa a membrana ou a região extracelular. A proteina de fusão pode compreender fragmentos da região extracelular obtidos por corte da sequencia de DNA que codifica CD4 no sitio BspMl na posição 514 ou o sitio PvuII na posição 629 (ver Tabela 1) para dar sequências de nucleotideos que codificam fragmentos de CD4 que mantêm a ligação a gpl20. Em geral, qualquer fragmento de CD4 pode ser usado desde que mantenha a ligação a gp120.

Sempre que a proteina de fusão compreenda uma cadeia leve de imunog1obu1ina é necessário que não se elimine mais da cadeia de Ig do que o necessário para se formar um complexo estável com uma cadeia pesada de Ig. Em particular, os resíduos de cisteina necessários para a formação da ligação dissulfureto devem ser preservados em ambas as partes da cadeia leve e pesada.

Quando expressa num hospedeiro, e.g. uma célula de mamífero, a proteina de fusão pode-se associar com outras cadeias leves ou pesadas de Ig secretadas pela célula para dar uma molécula funcional do tipo imunoglobulina que seja capaz de se ligar a gpl20. A gpl20 pode estar em solução, ser expressa na superficie de células infectadas ou pode estar presente na superficie do próprio vírus HIV. Como alternativa, a proteina de fusão pode ser expressa numa célula de mamífero que não segregue outras cadeias de Ig leves ou pesadas. Quando expressa nes

tas condições a proteina de fusão pode formar um homodímero.

Na realização do invento podem ser usadas sequências genómicas ou de cDNA. As sequências genómicas são expressas eficazmente em células de mieloma uma vez que possuem estruturas de promotores nativos.

As regiões constantes do anticorpo clonadas e usadas na molécula quimérica tipo imunog1obu1ina podem ser derivadas de qualquer fonte de mamífero. As regiões constantes podem ser activas na ligação do complemento ou em ADCC. No entanto, trabalho preliminar (ver Exemplos) indica que as proteínas de fusão do invento podem mediar a morte de células infectadas por HIV ou SIV através de um mecanismo de ADCC ou independente do complemento. As regiões constantes podem ser derivadas de qualquer isotipo apropri£ do, incluindo IgGl, IgG3 ou IgM.

A ligação de vãrios fragmentos de DNA, é efectuada de acordo com técnicas convencionais, empregando extremos cegos para a ligação, digestão com enzimas de restrição para proporcionar extremos adequados, preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tratamento com bases e fosfatase para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases adequadas. A construção genética pode codificar facultativamente uma sequencia líder para permitir expressão eficaz da proteina de fusão. Por exemplo, pode-se usar a sequencia líder utilizada por Maddon et a 1., Ce 11 £2:93-104 (1985) para a expressão de CD4.

Para cDNA, o cDNA pode ser clonado e o clone resultante despistado, por exemplo, através da utilização de uma sonda complementar ou por ensaio para o CD4 expresso usando um anticorpo conforme divulgado por

-17Dalgleish et a 1. , Nature 3 12: 763-766 ( 1984); Klatzmann et a 1. , Immunol. Today 7:291 -297( 1986); McDougal et a 1 ,

J. Immuno1 . 135:3151-3162 ( 1985 ):e McDougal, J. et a 1,

J. Immunol. 137:2937-2944 (1986).

Para expressar a proteina híbrida de fusão são necessários sinais transcricionais e traducionais reconhecidos por um elemento adequado do hospedeiro.

Os hospedeiros eucariotas que podem ser usados incluem células de mamífero susceptíveis de serem cultivadas i n v i tro, particu 1 armente leucócitos, mais particu 1armente células de mieloma ou outros linfócitos transformados ou oncogénicos,

e.g., células transformadas por EBV. Como alternativa, podem ser empregues células sem serem dé mamífero, como sejam bactérias, fungos, e.g. leveduras, fungos filamentosos ou similares.

Os hospedeiros preferidos para a produção da proteina de fusão são células de mamífero, cultivadas i n v i tro em cultura de tecidos ou i n vivo em animais. As células de mamífero proporcionam modificações pós-tradução às moléculas de imunog1obu1ina dando origem a um enrolamento correcto e glicosilação dos locais adequados. As células de mamifero que podem ser úteis como hospedeiros incluem células de origem fibrob1ástica, tais como VERO ou CHO-Kl ou células de origem linfóide, tais como o hibridoma SP2/0-AG14 ou o mieloma P3x63Sgh e seus derivados. Com a finalidade de preparar uma molécula tipo imunoglobulina, um plasmideo contendo um gene que codifique uma imunoglobulina de cadeia pesada, em que a região variável tenha sido substituída com CD4 ou um seu fragmento que se ligue a gpl20, pode ser introduzido, por exemplo, em células de mieloma J558L, um plasmacitoma de murganho expressando a cadeia leve de lambda 1 mas que não expressa uma cadeia pesada (ver Oi et a 1., PNAS (USA) 80/825-829 ( 1983).Outros

-18hospedeiros preferidos incluem células COS, células BHK e células de hepatoma.

As construções podem ser ligadas umas às outras para formar um único segmento de DNA ou podem ser mantidas como segmentos separados, por si sós ou incluídos em vectores.

Sempre que a proteína de fusão não seja glicosilada, qualquer hospedeiro pode ser usado para expressar a proteína que é compatível com sequências do replicão e de controle no plasmideo de expressão. Em geral, os vectores contendo o replicão e sequências de controle são derivados de espécies compatíveis com uma célula hospede] ra e são usados em ligação com o hospedeiro. 0 vector geralmente é portador de um sitio de replicão, assim como genes específicos que sejam capazes de proporcionar selecção fenotipica nas células transformadas. A expressão da proteína de fusão pode também ser colocada sob controle com outras sequências reguladoras que podem ser homólogas para o organismo no seu estado não transformado. Por exemplo, o DNA cromossómico de E. coli dependente de lactose compreende um operão lactose ou lac que medeia a utilização de lactose através da elaboração da enzima beta-ga1actosidase. Os elementos de controle lac podem ser obtidos a partir do fago bacteriano plac5, o qual infecta £. coli . 0 sistema promotor-operador lac pode ser induzido por IPTG.

Também podem ser empregues outros sistemas promotores/operadores ou suas partes. Por exemplo podem ser usados colicina El, ga1actose,‘fosfata se alcalina, triptofano, xilose, tax e similares.

Para hospedeiros mamíferos estão disponíveis vários sistemas vectores possíveis para expressão. Uma classe de vectores utiliza elementos de DNA que derivam

de vírus animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovirus, vírus da vacina, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Células que tenham estávelmente integrado o DNA nos seus cromossomas podem ser se 1eccionadas através da introdução de uma ou mais marcas que permitam selecção de células hospedeiras transfectadas. A marca pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas, e.g. antibióticos ou metais pesados tais como cobre ou similares. 0 gene marcador se 1eccionáve1 pode ser directamente ligado às sequências de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por cotransformação. Podem também ser necessáris elementos adicionais para a síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir sinais de splicing assim como promotores da transcrição, potenciadores e sinais de terminação. Os vectores de expressão de cDNA tendo tais elementos incluem os descritos por Okayama, Η.,Mo 1 CeI.Bio 1., 3:280(1983) e outros.

Uma vez que o vector a sequência de DNA contendo as construções tenham sido preparados para expressão, as construções de DNA podem ser introduzidas num hospedeiro adequado. Podem ser empregues várias t-écnicas, tais como fusão de protop1astos, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação ou outras técnicas convencionais. Após a fusão, as células são cultivadas em meio e testadas quanto à actividade adequada. A expressão do(s) gene(s) resulta na produção da proteina de fusão. Esta proteina de fusão expressa pode então ser sujeita a posterior montagem para formar a molécula tipo imunog1obu 1 ina .

As células hospedeiras para a produção de imunog1obu 1 ina podem ser células imortalizadas, particu 1 armente células de mieloma ou de linfoma. Estas células podem ser cultivadas num meio nutritivo adequado em frascos de cultura ou injectadas num hospedeiro siner-20-

gistico, e.g. murganho ou rato ou hospedeiro imunodeficiente ou local do hospedeiro imunodeficiente, e.g. murganho labro ou bolsa de hamster. Em particular, as células podem ser introduzidas na cavidade abdominal de um animal para permitir a produção de fluido ascítico que contenha a molécula do tipo imunog1obu1ina. Como alternativa as células podem ser injectadas subcutâneamente e o anticorpo quimérico é colhido do sangue do hospedeiro. As células podem ser usadas do mesmo modo que as células de hibridoma. Ver Diamond et a 1 ,

N. Eng. J. Med. 304: 1344 (1981) e Kennatt, McKearn e Bechtol (Eds.) Monoclonal Antibodles:Hybridomas:--A New Dirension in Biologic Analysis, Plenum, 1980.

As proteinas de fusão e moléculas do tipo imunog1obu1ina do invento podem ser isoladas e purificadas de acordo com condições convencionais, como sejam extracção, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, e1ectroforese e similares, Por exemplo, as proteinas de fusão IgGl podem ser purificadas fazendo passar uma solução através de uma coluna que contenha proteina A ou proteina G imobilizada que selectivamente se liga à porção Fc da proteina de fusão. Ver, por exemplo, Reis, K.J., et a 1 , J. Immunol 132:3098-3102 (1984); Pedido de Patente PCT, Publicação No. W087/00329. 0 anticorpo quimérico pode ser eluido por tratamento com um sal caotrópico ou por eluição com ácido acético aquoso (1M).

Como alternativa as proteinas de fusão podem ser purificadas em colunas de anticorpo anti-CD4 ou em colunas de anticorpo anti-imunog1obu1ina.

Numa execução do invento, as sequências de cDNA que codificam CD4 ou um seu fragmento que se ligue a gpl20, podem ser ligadas num plasmideo de expressão que codifique um anticorpo em que a região variável do gene i!

foi eliminada. Os métodos para a preparação de genes que codificam regipoes constantes da cadeia pesada ou leve de imunog1obu1inas estão descritos, por exemplo, por Robinson, R. et a 1, Pedido de Patente PCT, Publicação No. W087-0267 1 .

As moléculas preferidas do tipo imunoglobulina que contem CD4 ou seus fragrentos, contêm a região constante de um anticorpo IgM, IgGl ou IgG3 que se liga ao complemento na região Fc.

A proteina de fusão e moléculas do tipo imunog 1 obu1ina do invento podem ser usadas no tratamento de infecções virais por HIV. A proteina de fusão complexa-se com gpl20 q£ é expressa em células infectadas. Apesar do invento não estar lifado a qualquer teoria particular, parece-lhe que a porção Fc da proteina de fusão hibrida possa ligar-se ao complemento o qual medeia a destruição da célula. Deste modo, as células infectadas são destruídas de modo a que seja parada a produção de mais partículas virais.

Com a finalidade de tratar infecções causadas por HIV, a proteina de fusão ou molécula tipo imunoglobulina do invento pode adicionalmente conter uma marca radioactiva ou agente terapêutico que aumente a destruição da partícula HIV ou a célula infectada por HIV.

São exemplos dos radioisõtopos que podem ser ligadas à proteina de fusão ou molécula tipo imu1 ? R noglobulina do invento para usar em terap i a por HIV, I, 131_T 90_v 67_Cu 217_Bi 211_λ+ 212_nk 47_c„ _ 109,

I, 'Y, ^u'Cu, Bi, 2^At, 212pb, ⁴⁷Sc e ^lu''Pd. Faculta tivamente pode ser usada uma marca tal como bóron que emite particu 1 asc<e p quando do bombardeamento com radiação de neutrões.

Para o diagnóstico i n vivo, radionu-22-

clidos podem ser ligados à proteina de fusão ou molécula do tipo imunoglobul ina do invento directamente ou usando um grupo funcional intermediário. Um grupo intermediário que é muitas vezes usado para ligar radioisótopos , que existem na forma de catiões metálicos, a anticorpos é o ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA). São exemplos típicos de catiões metálicos que são ligados deste modo,

99m

Tc,

123

T,

In ,

131 ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu,

Ga e

Ga.

Ainda, a proteina de fusão e a molécula tipo imunog1obu1ina do invento podem ser ligadas a um agente para visualização de imagens por NMR que inclui átomos paramagnéticos. 0 uso de um agente para visualização de imagens por NMR permite o diagnóstico i n vivo da presença e grau de infecção por HIV num paciente usando técnicas de 1 57

NMR. Elementos particu 1 armente úteis neste método são Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr e ⁵⁶Fe.

Os agentes terapêuticos podem incluir, por exemplo, toxinas bacterianas como seja a toxina da difteria ou rícino. Os métodos para a produção de proteínas de fusão compreendendo o fragmento A da toxina da difteria estão descritos na Patente U.S. 4 675 382 (1987). A toxina da difteria contem duas cadeias po1ipeptidicas. A cadeia B liga-se â toxina a um receptor numa superfície da célula.A cadeia A de facto entra no citoplasma e inibe a síntese proteica por inactivação do factor de elongação 2, o factor que transloca os ribossomas ao longo do mRNA simultaneamente com a hidrólise de ETP. Ver Darnell, J., et a 1. , em Molecular Ce 11 Biology, Scientific American Books, Inc., página 662 (1986). Como alternativa, pode-se preparar uma proteina de fusão compreendendo ricino, uma lectina tóxica.

A introdução das moléculas quiméricas por terapia com genes pode também englobar, por exemplo o

uso de retrovírus ou outros meios para introduzir o material genético codificador das proteínas de fusão em tecidos alvo adequados. Nesta execução, os tecidos alvo tendo os genes clonados do invento podem então produzir a proteína de fusão i n vivo.

As gamas de doses para a administra ção da proteína de fusão ou molécula tipo imunog 1 obu 1 ina do invento são aquelas que são suficientemente largas para produzir o efeito pretendido através do qual os sintomas de infecção por HIV ou SIV são melhorados. A dosagem não deverá ser tão grande que cause efeitos secundários adversos, como seja reacções cruzadas indesejáveis, reacções analifáticas e similares. De um modo geral a dosagem variará com a idade, estado, sexo e grau da doença do paciente, contra indicações, se as houver, tolerância imune e outras variáveis do género, a serem ajustadas pelo médico. A dosagem pode variar de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, de preferencia 0,1 mg/kg a 1,0 mg/kg, da molécula tipo imunog1obu1ina numa ou mais administrações diárias, durante um ou vários dias. A molécula tipo imunoglo bulina pode ser administrada parentéricamente por injecção ou por perfusão gradual ao longo do tempo. Eles podem ser administrados intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente ou subcutâneamente.

As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não-aquosas, suspensões e emulsões. São exemplos de solventes não aquosos propi1enog1ico1, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos tais como oleato de eti1 o.Veicu 1 os aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões, ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer lactada ou óleos fixados. Os veículos intravenosos incluem agentes de enchimento fluidos e nutritivos, agentes

de enchimento e1ectró1itos, tais como os baseados em dextrose de Ringer e similares. Podem estar também presentes preservativos e outros aditivos, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos , anti-oxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares. Ver, de um modo geral, Remi ngton¹ s Pharmaceutical Science, 16³ Ed., Mack Eds. 1980.

invento também está relacionado com um método para a preparação de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo os componentes do invento,o medicamento sendo usado para terapia de infecções por HIV ou SIV em animais.

A detecção e quantificação de substâncias antigénicas e amostras biológicas frequentemente utilizou técnicas de imunoensaio. Estas técnicas são baseadas na formação do complexo entre a substância antigênica

e.g., gp!20, a ser testada e um anticorpo ou anticorpos em que um dos membros do complexo pode ser marcado de modo detec tável. No presente invento, a molécula tipo imunog1obu1ina ou proteina de fusão podem ser marcadas com qualquer marca convencional.

Assim, a proteina de fusão híbrida ou molécula tipo imunog1obu1ina do invento podem também ser usadas no ensaio para infecções por HIV ou SIV numa amostra biológica pondo-se uma amostra, derivada de um animal que se suspeita estar infectado por HIV ou SIV, em contacto com a proteina de fusão ou molécula tipo imunog1obu1ina do invento, e detecção da formação ou não de um complexo com gpl20, em solução ou na superficie de células infectadas por HIV.

Por exemplo, uma mostra biológica pode ser tratada com nitrocelulose ou outro suporte sólido

que seja capaz de imobilizar as células, partículas celulares ou proteína solúvel. 0 suporte pode então ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com a proteína de fusão a qual pode ser marcada de forma detectável. 0 suporte de fase sólida pode ser então lavado com o tampão uma segunda vez para remover a proteína de fusão não ligada e a marca na proteína de fusão detectada.

Ao efectuar-se o ensaio do presente invento numa amostra contendo gpl20, o processo compreende :

a) põe uma amostra suspeita de ter gpl20 em contacto com um suporte sólido para fazer a imobilização de gpl20 ou célula que expresse gpl20 na sua superfície;

b) pôr o referido suporte sólido em contacto com a molécula tipo imunog1obu1ina ou proteína de fusão do invento marcada de forma detectável.

c) incubação da referida molécula tipo imunog 1 obu 1 ina marcada de forma detectável com o referido suporte durante um período de tempo suficiente para permitir que a molécula tipo imunog 1 obu 1 ina ou proteína de fusão se ligue a gpl20 imobilizada ou célula que expresse gp!2O na sua superfície;

d) separação do suporte de fase sólida da mistura de incubação obtida no passo c); e

e) detecção da molécula tipo imunog1obu 1 ina ou proteína de fusão ligada e deste modo detecção e quantificação de g ρ120.

Como alternativa, o complexo da molécula tipo imunog lobu 1 ina narcada (ou proteína de fusão)-gp!20 numa amostra pode ser separado da mistura de reacção

pondo o complexo em contacto com um anticorpo ou proteina imobilizado que seja especifico para uma imunog 1 obu 1 ina ou, e.g., proteina A, proteina G, anticorpos anti-IgM ou anticorpos anti-IgG. Tais anticorpos anti-imunog1obu1ina podem ser monoclonais ou policlonais. 0 suporte sólido pode então ser lavado com tampões adequados para dar um complexo imobilizado gp120-molécu1 a tipo imunog1obu1ina marcada- anticorpo. A marca na proteina de fusão pode ser detectada para dar uma medida da gpl20 endógena e portanto, a presença de HIV.

Este aspecto, do invento está relacionado com um método para a detecção de infecção por HIV ou SIV numa amostra caracterizado por (a) uma amostra suspeita de conter gpl20 ser posta em contacto com uma proteina de fusão ou molécula do tipo imunog 1 obu1ina compreendendo CD4, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 e a porção Fc de uma cadeia de imunoglobu1 ina , (b) detecção da formação ou não do complexo.

invento também está relacionado com um método para a detecção de gpl20 numa amostra, caracterizado ainda por (c) a mistura obtida no passo (a) ser posta em contacto com uma molécula de ligação a Fc, como seja um anticorpo, proteina A ou proteina G, a qual está imobilizada num suporte de fase sólida e é especifica para a proteina de fusão híbrida para dar um complexo gp120-proteina de fusão imobi1izada-anticorpo.

(d) lavagem do suporte de fase sólida obtida no passo (c) para remover a proteina de fusão não ligada,

(e) e detecção da marca na proteína de fusão híbrida.

Certamente, as concentrações especificas da molécula tipo imunog1obu1ina (ou proteína de fusão) marcadas de forma detectável e gpl20, a temperatura e o tempo de incubação, assim como outras condições de ensaio podem ser variados, dependendo de vários factores incluindo a concentração de gpl20 na amostra, a natureza da amostra e similares. Os familiarizados com a matéria serão capazes de determinar as condições óptimas do ensaio para cada determinação empregando experimentação de rotina.

Outros passos tais como lavagem, agitação, filtração e similares podem ser adicionados aos ensaios como é habitual ou necessário para a situação particular.

Uma das vias em que a molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão do presente invento pode ser marcada de modo detectável é por ligação da mesma à enzima. Esta enzima por sua vez, quando mais tarde exposta ao seu substracto, reagirá com o substracto de modo a produzir um componente químico que pode ser detectado por exemplo por espectrofotometria, fluorimetria ou por meios visuais. As enzimas que podem ser usadas para marcar de forma detectável a molécula tipo imunog1obu1ina ou proteínas de fusão do presente invento incluem, mas não estão limitadas a malato-desidrogenase , nuclease de estafi1ococus, a 1 fa-g1icerofosfato -desidrogenase , triose-fosfato-isomerase, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, beta-ga1actosidase , ribonuclease, urease, catalase, g 1 ucose-VI-fosfato-desidrogenase, glucoamilase e acetilcolina-estearase.

A molécula tipo imunog1obu1ina ou proteina de fusão do presente invento pode também ser marcada com um isótopo radioactivo que pode ser determinado por meios tais como a utilização de um contador gama ou um contador de cintilação ou por autorradiografia. São isótopos particularmente úteis para a finalidade do presente invento:

131

I, P,

S, ¹⁴C, ^5lCr,

Cl, ^3/Co,

Fe e

H,

125

Se

E também possível marcar a molécula tipo imunoglobu1ina, ou proteina de fusão com um composto fluo rescente. Quando a molécula tipo imunog1obu 1 ina marcada com uma substância emissora de fluorescência é exposta à luz do comprimento de onda correcto, a sua presença pode ser detecta_ da devido à fluorescência do corante. Entre os compostos marcadores fluorescentes mais vulgarmente usados encontram-se o isotiocianato de fluorescência, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficociamina , o-ftaldeido e fluorescamina .

A molécula tipo imunog 1 obu 1 ina ou ptoteina de fusão do invento pode ser também marcada de modo detectável usando metais emissores de fluorescência tais 1 52 como Eu ou outros da série de lantanídeos. Estes metais podem ser ligados â molécula tipo imunog1obu1ina ou proteina de fusão usando grupos quelatores de metais como seja o ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) ou ácido eti1enodiaminotetracét ico (EDTA ).

A molécula tipo imunog1obu 1 ina ou proteina de fusão do presente invento também pode ser marcada de modo detectável, através do seu acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença da molécula tipo imunoglobulina ou proteina de fusão é então determinada por detecção da presença de luminescência que surge no decurso da reacção química. São exemplos de compostos para marcação quimoluminescente particularmente úteis luminol, isoluminol, éster de

acridinio teromático, imidazole, sal de acridinio e éster de oxa1 ato.

Igualmente, um composto bloluminescente pode ser usado para marcar a molécula do tipo imunog1obu 11 na ou proteina de fusão do presente invento. A bio 1 uminescência é um tipo de quimio 1 uminescência encontrada nos sistemas biológicos em que uma proteina catalítica aumenj ta a eficácia da reacção quimio 1 uminescente. A presença de j uma proteina bio 1 uminescente é determinada através da detecção j da presença de luminescência. São compostos bio 1 uminescentes 1' importantes para fins de marcação a luciferina, luciferase e ϊ aequorina.

li

I,

I:

i; A detecção da molécula tipo imunoglobulina ou proteina de fusão pode ser conseguida através de um contador de cintilação, por exemplo, se a marca detectável fôr um emissor gama radioactivo ou através de um fluorímetro, por exemplo se a marca fôr um material fluorescente. No caso de uma marca enzimática, a detecção pode ser consegu_i_ da por métodos co1orimêtricos que empregam um substrato para a enzima. A detecção pode também ser conseguida por comparação visual do grau de reacção enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de modo idêntico.

ensaio do presente invento é idealmente adequado à preparação de um Kit.Tal Kit pode compreender um meio transportador sendo compartimentado para receber um ou mais recipientes tais como frascos, tubos e similares, cada um dos referidos recipientes compreendendo os elementos separados do imunoensaio.

Por exemplo, pode haver um meio transportador contendo um suporte de fase sólida e ainda um meio transportador contendo a molécula tipo imunog1obu1ina ou proteina de fusão marcada de modo detectável em solução.

-30Outro meio transportador pode conter soluções padrão compreeji dendo diluições seriadas de compostos tais como gpl20 ou seus fragmentos para serem detectados. As soluções padrão destes compostos a serem analisados podem ser usados para preparar uma curva padrão com a concentração de gpl20 colocada em abeissa e o sinal de detecção em ordenada.Os resultados obtidos a partir de uma amostra contendo gpl20 podem ser interpolados de tal gráfico para dar a concentração de gpl20.

A molécula tipo imunog1obu1ina ou proteina de fusão do presente invento pode também ser usada como corante de secções de tecido. Por exemplo uma molécula tipo imunog1obu1ína marcada compreendendo CD4 ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 podem ser postos em contacto com uma secção de tecido, e.g. uma amostra de biópsia de cérebro. Esta secção pode ser então lavada e a marcada detectada .

Os exemplos que se seguem são ilustrativos mas não são limitativos do método e da composição do presente invento. Outras modificações e adaptações adequadas que são óbvias para os entendidos na matéria estão dentro do espirito e âmbito deste invento.

EXEMPLOS

Exemp1 o 1: Preparação de construções de cDNA de CD4-Ig

A porção extracelular da molécula CD4 (Ver Madden, P. J., et al., Cell 42:93-104 (1985) foi fundida em três sitios num gene daregião constante da cadeia pesada de IgGl humano por meio de uma molécula sintética acbptadora dadora de splicing. Para explorar o adaptador dador de splicing, um adaptador BamHI tendo a sequencia

CGCGGATCCGCG foi primeiro inserida no resíduo de aminoácido 395 da sequencia do precursor de CD4 (resíduo de nucleotídeo 1295). Uma sequencia sintética dadora de splicing.

GATCCCGAGGGTGAGTACTA

GGCTCCCACTCATGATTCGA ligada por extremos complementares BamHI e HindIII foi criada e fundida ao sitio HindIII no intrão que precede o domínio CHI, ao sítio EspI no intrão que precede o domínio em charneira e ao sitio Bani que precede o domínio CH2 da sequencia genómica de IgGl. A montagem dos genes quiméricos p.or ligação no sítio BamHI deu moléculas em que a região variável(V), as regipoes V+CH1 ou as regiões V, CHI e charneira foram substituídas por CD4.No último caso, espera-se que a molécula quimérica forme uma estrutura de monóteros, enquanto que no primeiro espera-se uma molécula dimérica.

Tal construção genética que contem a sequencia de DNA que codifica CD4 ligada â IgGl humana no sitio Hind3 a montante da região CHl(proteina de fusão CD4 Η γΐ) está descrita na Tabela 1. 0 plasmideo contendo esta construção genética (pCD4Hyl) foi depositado em co i i (MC1061/P3) na Arerican Type Culture Collection (ATCC) de acordo com os termos do tratado de Budapeste e dado o número de acesso 57611.

Na Tabela 2 está descrita uma segunda construção genética que contem a sequência de DNA codificadora de CD4 ligada à IgGl humana no sitio Esp a montante da região charneira' (proteina de fusão CD4E γ 1 ) . 0

plasmídeo contendo esta construção genética (pCD4E γΐ) foi depositado em E. coli (MC1061/P3) na ATCC de acordo com os teros do tratado de Budapeste e dado o número de acesso

67610 .

Na Tabela 3 está descrita uma terceira construção genética que contém a sequência de DNA que codifica CD4 ligada a IgM humano no sítio Mst2 a montante da região CHI, (proteína de fusão CD4M^j). O plasmídeo contendo esta construção genética (pCD4M^u) foi depositado em E. coli (MC1061/P3) na ATCC de acordo com os termos do Tratado de Budapeste e dado o número de acesso 67609.

Na Tabela 4 está descrita uma quarta construção que contem a sequência de DNA codificadora de CD4 ligada a IgM humana no sítio Pst a montante da região CH2 (proteína de fusão CD4Pji). O plasmídeo contendo está construção genética (pCD4Pji) foi depositado em EL coli (MC1061/ /P3) na ATCC de acordo com os termos do Tratado de Budapeste e dado o número de acesso 67608.

Na Tabela 5 está descrita uma quinta construção genética que contém a sequência de DNA codificadora de CD4 ligada a IgGl humana no sítio Bani a jusante da região charneira (proteína de fusão CD4By'l).

Preparam-se duas construções semelhantes a partir da região constante da cadeia pesada de IgM humana por fusão com os intrões a montante dos domínios CH e CH2 u no sítio MstII e no sítio PstI respectivamente. As fusões foram feitas ligando o sítio PstI da construção CD4/IgGl fundida no sítio Esp no gene IgGI aos sítios MstII e Pst no gene de IgM. No primeiro caso, isto foi efectuado por tratamento do extremo Pst com DNA-polimerase de T4 e do extremo MstII com DNA-polimerase de E. coli seguido de li-33-

gação; e no segundo caso, apenas por ligaçao.

A imunoprecipitação das proteínas de fusão com um painel de anticorpos monoclonais dirigidos contra epítopos CD4 mostrou que houve preservação de todos os epítopos. Demonstrou-se uma associação de elevada afinidade especifica entre as moléculas quiméricas e as proteínas do invólucro de HIV expressas na superfície das células transfectadas com uma construção proviral atenuada (eliminada a transcriptase reversa).

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122	22416	1	2346	1	31	211
/	/ //		/		/	/

GGCTCAGGTCCCTACTGGCTCAGGCCCCTGCCTCCCTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGG

61---------+---------4---------4---------4---------4---------4 120

CCGAGTCCAGGCATGACCGAGTCCCGGGACGGAGGGAGCCGTTCCGGTGTTACTTGGCCC

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H

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B		S		S	F		H
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/ /

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		//	/ ///				/

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23	11224161	1	1 1
/	/ / //

AACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGCCCAAGAACCTCCCGCTCCACCTCACCC

901---------«---------♦---------*---------♦---------*---------+ 960

TTGCCCAATGGGTCCTGGGATTCGAGGTCTACCCGTTCTTCGAGGGCGAGGTGGAGTGGG

RVTQDPKLQMGKKLPLHLTL

	BS					BSS
M	SC	HS	D	M	H	SCAHM
N	TR	AT	D	N	P	TRUAN
L	NF	EU	E	L	H	NF9EL
1	11	31	1	1	1	11631

/ / / /

TGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGA 951-------------------4---------·♦---------4---------4---------4 1020 acggggtccggaacggagtcataccaccgagacctttggagtgggaccgggaacttcgct

PQALPQYAGSGNLTLALEAKS

F

A

N

BS

SC

TR

NF /

H D P D Η E 1 1

A

L

U

AAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGCTGATGAGACCCACTCAGCTCCAGA

1021----------*·---------♦---------*---------♦---------*---------♦ 1080

TTTGTCCTTTCAACGTAGTCCTTCACTTGGACCACCACTACTCTCGGTGAGTCGAGGTCT

TCKLHQEVNLVVMRATQLQK-

	PS	S
M	ADNNPA	DF	AM	DE	A
N	VRLLUU	DA	LN	DS	L
L	AAAAM9	EN	UL	EP	U
1	224416	11	11	11	1
	/////	/	/	/

AAAATTTGACCTGTGACGTGTGGGCACCCACCTCCCCTAAGCTGATCCTGAGCTTGAAAC

1081---------♦---------4---------4---------4---------4---------4 1140

TTTTAAACTGGACACTCCACACCCCTGGGTGGAGCGCATTCCACTACGACTCGAACTTTG

NLTCEVWGPT	S P K L	M L S	L K L -
Μ T	H	M	DM
N A	P	N	DS
L Q	A	L	ET
1 1	2	1	12 / GAACCCTG -------4 1200
TGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGCCGGTGTCGGTGCT

ACCTCTTGTTCCTCCCTTTCCAGAGCTTCCCCCTCTTCCGCCACACCCACGACTTCGCAC

ENKEAKVSKREKPVWVLNPE-39-

Η

F D Μ I Α

D Α Ν V

Κ Ε Ε F Α

13 11

PS Η

ADPA I

VRLAJ Ν

ΑΑΜ9 F

2216 1 ///

AGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACACGTCCTGCTGGAATCCAACA

1201 — — — ---4 — - — — 4 —--------4- — — ---4 --------— - 4---, 1260

TCCGCCCCTACACCGTCACAGACGACTCACTGAGCCCTCTCCAGGACGACCTTAGGTTGT

Q C L	L S D	S G Q V L L	ESN	I
S	SA	BHF BS		H
ANA	HNCP	SGNMAANXA	RSD	1	A
VLU	PCRA	PIUNMULHV	SCD	N	L
AA9	AIFL	1ADLH3A0A	AAE	D	U
236	2111	21211A421	111	3	1
ZZ	//	z / z /	Z

TCAACCTTCTGCCCACATGCTCCACCCCGCTGCACCCGCATCCCCAGCCTCACTACTAAG

1261---------*---------4---------4---------+---------4---------4 1320

AGTTCCAAGACGGGTGTACCAGGTGGGGCCACGTGCGCCTAGGGCTCCCACTCATGATTC

KVLPTWSTPVHADPE

	BS	B
H	H	SC	HS	s	M	M	D	S
P	A	TR	AT	T	N	N	D	P
H	E	NF	EU	Y	L	L	E	M
1	3	11	31	1	1	1	1	1
Z		z	z

CTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGCGCAGGGAGCGGGCTAAGGTGAGG

1321 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1380

GAAAGACCCCGTCCGGTCCGGACTGGAACCGAAACCCCGTCCCTCCCCCGATTCCACTCC

B	A	BH	B	P
BASHBHHNN	P	SG	N	BS	F	H
AHPHBAPAL	A	PI	L	AP	L	G
NAWAEEHRA	L	IA	A	NI	M	A
121112114	1	21	3	22	1	1
z zzzz		Z		Z

CAGGTGGCGCCAGCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACC

1381 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1440

GTCCACCGCGCTCGTCCACGTGTGGCTTACGGGTACTCGGCTCTGTGACCTCCGACTTGG

F		BS	S	B SS B S	FN
N	M	SC	DNHA	H SMAAHNABSAC	NS
U	N	TR	RLAU	H TNUUALPAPLR	UP
D	L	NF	AAE9	A NL99EAAN1UF	DB
2	1	11	2436	1 11663412211	22
		Z	Z	Z ZZ Z	Z

TCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGC

1441 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1500

AGCGCCTGTCAATTCTTGGGTCCCCGGAGACGCGGACCCGGGTCGAGACAGGGTGTGGCG A49.4.WP 122088

		F	BSS	BS
MS	BNN	NM	S BMDMHNABSAA	SCB
AA	ALL	UN	T BBRNALPAPUU	TRA
EC	NAA	4L	Y VDALEAAN199	NFN
32	134	Hl	1 12213412266	111
/	/		/ / ////	/

1501

1561

1621

1681

GGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1560

CCAGTGTACCGTGGTGGAGAGAACGTCGGAGGTGGTTCCCGCGTAGCCAGAAGGGGGACC

				A S T K G P	S	V F	P L A
		BH		B NFS BS	F	BS
N	M	MSG		MSB SNAH SC	N	SC
L	N	NPI		NPB PUJA TR	U	TR
A	L	LIA		L1V B49E NF	4	NF
4	1	121		121 2H53 11	H	11
		/		/		/
CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT
GTGGGAGGAGGTTCTCGTGGAGACCCCCGTGTCGCCGGGACCCGACGGACCAGTTCCTGA
P S S K	S	T s	G	G T A A L G	C	L V	K D Y
						NF	A BH
H	M	T		H D BANHBHN		SN	P SG
P	A	T		P D AHAHBAL		PU	A PI
A	E	H		Η E NARAEEA		B4	L IA
2	3	1		1 1 1211124		2H	1 21
				/ //			/
ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGCCGTGCACA
TGAAGGGGCTTGGCCACTGCCACAGCACCTTGAGTCCGCGGGACTGGTCGCCGCACGTGT
F P E P	V	T V	S	W N S G A L	T	S C	V Η T
S				H	F	B
HNC			DM	I M D	N	M SM	B
PCR			DS	N N D	U	N TA	B
AIF			ET	F L E	4	L EE	V
211			12	1 1 1	H	1 23	1
n			Z			/
CCTTCCCGGCTCTCCTACACTCCTCAGGACTCTACTCCCTCACCACCGTGGTGACCCTCC
GGAAGGGCCGACAGGATGTCAGGAGTCCTGAGATGAGGGAGTCGTCGCACCACTGGCACG
F Ρ A V	L	Q s	S	G L Y S L S	S	V V	T V P
B F B		B		H

1620

1680

1740

SH

PP

1H

N ASM B NSB U LTN A LPB 4 UXL N AlV H 111 1 421 /

M

A

E

I

N

F

CCTCCAGCAGCTTGGCCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCACCAACA

---------4---------+---------4---------4---------_----------4

CGAGCTCCTCGAACCCCTGGCTCTGGATCTACACGTTGCACTTACTGTTCGCGTCCTTCT

SSSLGTQTYICNVNHKPSNT

1741

1800

s	m	HM	HM
T	N	AN	PN
Y	L	EL	HL
1	1	31	11

CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAA

1801---------*---------♦---------*---------♦---------+---------♦ 1860

GGTTCCACCTGTTCTTTCAACCACTCTCCGGTCGTGTCCCTCCCTCCCACAGACGACCTT

K V D K K V

E	BS	ss	F	BS	F
DE	CHH	F	SC	HHNCF	N	BSC	N
DS	OHA	0	TR	PGCRA	U	BTR	U
EP	4AE	K	NF	AAIFN	4	VNF	4
11	712	1	11	21111	H	111	H
/			/	//		//

GCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCA

1861---------♦---------»---------♦—.....---------♦---------♦ 1920

CGTCCGAGTCGCGAGGACGGACCTGCGTAGGGCCGATACGTCGGGGTCAGGTCCCGTCGT

S	S
DBHMHNA	HMNCN	M	MNDM
RBABPLU	PNCRL	N	NLDB
AVE0HA9	ALIFA	L	LAEO
2132146	21114	1	1312
// //	//

AGGCACGCCCCCTCTCCCTCTTCACCCCGAGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGA

1921---------♦---------·».........4---------♦---------4---------♦ 1980

TCCGTCCGGGCCAGACGGACAAGTGGGCCTCGGAGACGGGCGGGGTGAGTACGAGTCCCT

BS	P	B	BS
SC	F	Μ B N S	SC
TR	L	A A L P	TR
NF	M	Ε N A 1	NF
11	1	114 2	11
/			/
GAGGGILIICIGGCI111llltAGGl1t1GGGCAGGCACACGC1AGCTCCCCCTAACCCA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 2040

CTCCCACAAGACCGAAAAAGGGTCCGAGACCCGTCCGTGTCCGATCCACGGGGATTGGGT

1981

S	B	B	B	S
DHA	S	DBS	S	M	HNC	A
RAU	P	DAP	P	N	PCR	V
AE9	M	ENI	M	L	AIF	A
236	1	122	1	1	211	2
/		/			/

GGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAG

---------4---------4---------4---------₄---------₊---------* 2100

CCGGGACGTGTGTTTCCCCGTCCACGACCCCAGTCTGGACGGTTCTCCGTATAGGCCCTC

2041

PS
DNPA	D	H	D	A	W
RLUU	D	A	D	L	N
AAM.9	E	E	E	U	L
2416	1	3	1	1	1
/ // GACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGA

CTCGGACGCGGACTGGATTCGCGTGGGGTTTCCGGTTTCAGAGGTGAGGGAGTCGACCCT Η B I M MM P BS Ν Ν AB S AP F L EO T Nl 1 1 32 1 22 / /

/ /

CACCTTCTCTCCTCCCAGAT7CCACTAACTCCCAATCTTC7CTCTCCACACCCCAAATCT

2161 ---------4---------4---------4---------♦---------₊........-♦ 2220

GTCGAAGACAGGAGGGTCTAAGGTCATTGAGGGT7AGAAGAGAGACGTCTCGGGTTTAGA

	N	BBS	BS
M	NS	SSC	SC HS	M
A	LP	PTR	TR AT	N
E	AH	INF	NF EU	L
3	31	211	11 31	1
	/	/	/ /

TCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCACCCCAGGCCTCGCCCTCC

2221

2280

2281

---------4---------+ ---4---------₄---------4---------4

ACACTGTTTTGAGTGTGTACGGGTCGCACGCGTCCATTCGCTCGCGTCCGGACCGGGAGG

D	K	T Η T	c	P B	P C P	BS	S	s	S
A	M	B	N	SM	F	SC	F	DHNA	HNC
L	N	A	L	PA	0	TR	A	RALU	PCR
U	L	N	A	IE	K	NF	N	AEA9	AIF
1	1	1	4	21	1	11 /	1	2346 /	211 /

AGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCACGGACAGGCCCCACCCGGG

-------------------4---------4---------4---------4---------4

TCGAGTTCCGCCCTGTCCACGGGATCTCATCGGACGTAGGTCCCTGTCCGGGGTCGGCCC

2340

						BS		S
A	M	M	M	D	M	SC	y	ANA	M
F	A	B	N	D	N	TR	B	VLU	B
L	E	0	L	E	L	NF	0	AA9	0
3	2	2	1	1	1	11	2	246	2

/ /

TGCTCACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCACT

2341 ---------4---------4---------4---------4---------4- —......4 2400

ACCACTGTGCAGGTGGAGGTAGAGAAGGAGTCGTGGACTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCA

APELLGGPSV

2401

2461

2521

2561

	S	SS
M	S	AN	M	HMANNAC	DM	M
N	T	UL	N	PNVCLUR	DS	A
L	Y	3A	L	ALAIA9F	EI	E
1	1	A3	1	2121461	12	3
				/ / //	/

-43CTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGACCTCAC

-------------------+---------+---------₄---------4---------4 2460

CAACCACAACCCGCGTTTTGGGTTCCTGTCGGACTACTACAGGGCCTCCGGACTCCAGTG

L	F P P K	P K D T	L M	I S R T	P E V
N
NS	M	M	DM	M	RM M
LP	A	N	DS	B	SA N
AH	E	L	ET	0	AE L
31	2	1	12	2	12 1
/			/

ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAACT7CAACTGGTACGTGGA

---------4---------+---------4---------4---------4---------4 2520

TACCCACCACCACCTCCACTCGGTCCTTCTGCCACTCCACTTCAACnCACCATCCACCT

CVVVDVSHEDPEV

F FN Μ N NSS N U UPA L 4 DBC 1 H 222 //

R M R

S AS

A EA

2 1

CCGCGTGGAGCTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 2580

CCCGCACCTCCACCTATTACCGTTCTGTTTCCGCGCCCTCCTCG7CATCTTGTCGTGCAT

G V E	V Η N A K T	KPREEQYNST
S		BS
HNC HH	M	SC	R
PCR GP	N	TR	S
AIF AH	L	NF	A
211 11	1	11	1
/		/

CCGGGTCGTCACCGTCCTCACCGTCCTCCACCAGCAC7GGCTGAATGGCAAGGAGTACAA

---------4---------4---------4---------4---------.---------4 2640

GGCCCACCAGTCGCAGGAGTGCCAGCACGTGGTCCTGACCGACT7ACCGT7CCTCATGTT

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKM T N A L Q 1 1

CTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCACCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA

---------4---------4-------------------4---------4---------_- 2700

CACCT7CCAGAGGT7CTTTCCGCACGCTCCGGGCTACCTCTTTTGGTACAGGTT7CGCTT

CKVSNKALPAPIEKTISKAK2641

-442701

P s ADNNPMA VRLLUNU AAAAML9 2244116

A Η Μ N

U A N L

E L A

3 1 3

S

HHN BSAH APA GFUA EAE LI9E 321 1163 //// / Z

AGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTG

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

TCCACCCTGGCCACCCCACGCTCCCGGTGTACCTGTCTCCGGCCGAGCCGGGTCCGACAC

2760

D M D N E L 1 1

M

A

E

N

S

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B

R

S

A

M

N

L

F

N

U

H

A

V

A

B

B

V

CCCTCAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCTACACGCCAGCCCCGAGAACCACAGCT

2761 ---------♦---------·*---------♦-------------------4---------4 2820

GGCACTCTCACTGGCGACATGGTTGGAGACAGGATGTCCCGTCGGGCCTCTTGGTGTCCA

GQPREPQV-

	ss			BS	BS
R F	AHNNCCS	A	F	SC	SC
S 0	VPCCRRM	L	0	TR	TR
A K	AAIIFFA	U	K	NF	NF
1 1	1211111	1	1	11	11
	/////			/	/

CTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAACAACCACCTCACCCTCACCTCCCT

2821 ---------4---------4.........4---------4---------4---------4 2880

CATGTGGGACGGGGGTACGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGACCGA

YTLPPSRDELTKNQVSLTCLB F

S N H

P U P

M 4 A

H 2 cgtcaaaggcttctatcccagcgacatccccctgcagtcggagaccaatccgcagccgga

2881 ---------*---------4-------------------4---------4---------4 2940 ccagtttccgaagatagggtccctgtagcggcacctcaccctctcgttacccgtcggcct

VKCFYPSDIAVEWESNGQPEB

B

V

H Μ I N N L F 1 1 m

B

N

L

A

H

P

H caacaactacaagaccacgcctcccctgctggactccgacggctccttcttcctctacac

2941 ---------4---------4——.......4.......--4---------4---------4 3000

CTTCTTCATGTTCTCCTGCGGAGGCCACCACCTGAGCCTCCCGACGAACAACGACATGTC

NNYKTTPPVLOSDGSFFLYS

	B	F		S
Μ A	S	NM	MBX	NF	M
N L	P	UB	ABM	LA	N
L U	m	40	EVN	AN	L
1 1	1	H2	211	31	1

3001 /

CAAGCTCACCCTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT

---------+---------4-----...-4---------4---------4---------4

GTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGCACTA

3060

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

3061

N N S L I A 1 3

S

Μ M HNC

Β N PCR

L AIF

1 211 /

GCATGAGCCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTAAATG

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

CGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTAC

3120

HEALHNHYTQKSLSLSPGK.

CXHHN

FMAPA

RAEAE

13321 /

AGTGCGACGGCCG

---------₊__. 3133

TCACGCTGCCGGC

3121

I

-46Tabela 2

F N N S U P 4 B H 2

B

B

V

M

N

L

H

G

A

S

DHA

RAU

AE9

236 /

B

S

X

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2---------4---------+ -------4---------4---------*---------+ 60

CCGACAAACTCTICGTCGCCCCrrCTTKTGCGrrCGGGTCTCCCGGACGCTAAACACAC

B	PS		s			S
DBS	ADNPA	D	DHNA	M	HM	HNC
DAP	VRLUU	D	RALU	N	AN	PCR
ENI	AAAM9	E	AEA9	L	EL	A1F
122	22416	1	2346	1	31	211
/	/ //		/		/	/

GGCTCAGGTCCCTACTGCCTCAGCCCCCTCCCTCCCTCCCCAACCCCACAATCAACCGCG

61---------4-----————4——————— 4 -----4---------4---------, 120

CCGAGTCCACGCATGACCCAGTCCCGGCACCCAGGCAGCCGTTCCCGTGTTACnCGCCC

H

I

N

F

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B

B

V

F

N

U

H

HH

HA

AE

F

N M U N 4 L Η 1

D

D

E rAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCCCTCCTCCCACCAGCCACTC

121---------4---------4---------4---------4---------4---------4 180

CTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCGGTGAG

VPFRHLLLVLQLALLPAATQR A S L A U 1 1

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGCATACACTGGAACTGACCTGTACAGCTT

181 ---------4---------4---------4---------4.........4-......--4 24C

TCCCTTTCTTTCACCACCACCCGTTrTTTCCCCTATCTCACCTTCACTGGACATGTCGAA

GKKVVLGKKCDTVELTCTASM M B B 0 0 2 2

H

I

N

F cccagaagaagagcatacaattccactgcaaaaactccaaccacataaagattctggcaa

241 -------------------4---------4---------4---------4---------, 300

CCGKT7CT7CTCCTATGTTAAGCTGACCTTTTTCACCT7CGTCTATT7CTAAGACCCT7 qkksiqfhwknsnqikilcn-47-

B		s		s	F		H
NBS	F	AA	A	A	N	H	I
LAP	0	VU	L	U	U	H	N
AN1	K	A9	U	3	D	A	F
422	1	26	1	A	2	1	1

/ /

ATCACGGCTCCTT CTTAACTAAACGTCCATCCAAGCTGAATGATCCCCCTGACTCAAGAA

3Q} ___________________4---------4---------4---------4---------4 360

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F L	T K G P S K L	N D	R A D	S R	1
S	S	H		H
MANAS	BA	I	A	I	D
BVLUT	CU	N	F	N	D
0AA9Y	L3	F	L	F	E
22461	IA	1	2	1	1
/	/

421

CAACCCTTTGGGACCAACCAAACTTCCCCCTCATCATCAAGAATCTTAACATAGAAGACT

361 ---------♦---------+---------♦---------♦------------------♦ 420

CTTCCCAAACCCTGGTTCCTTTGAACCCGGACTACTAGTTCTTACAATTCTATCTTCTGA

SLWDQGNFPLIIKNLKIEDSS

Μ M AMAM M

Β N VNUN A

L AL9L E

1 2161 1 //

CACATACTTACATCTGTCAAGTGCACGACCAGAAGGAGCAGCTGCAATTCCTAGTCTTCC _________₊_________4_________4---------4---------4---------4 480

GTCTATGAATGTAGACACTTCACCTCCTGGTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC DTYICEVEDQKEEVQLLVFGB s s

P T

Μ Y

1

GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCACGGCCAGACCCTCACCCTGACCTTGG

481 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 540

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B	es
ES	SC
AP	TR
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22	11
/	/

D

D

E

M

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L

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F Y 1 1

AGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC

TCTCGGGGGGACCATCATCGGGGAGTCACGTTACATCCTCAGGTTCCCCATTTTTGTATG SPPGSSPSVQCRSPRGKNIQ541

600

		N		BBH S	B			BS
M	MD	ASP	A	BSSGSC	S	B	N	SC
B	ND	LPV	L	APTIAR	T	A	L	TR
0	LE	UBU	U	N1NACF	X	N	A	NF
2	11	122	1	221111	1	1	4	11
		//		/ ///				/

AGCGGCGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGACCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACAT

601 ---------»---------+---------*---------♦---------*---------♦ 660

TCCCCCCCTTCTGCCAGACGCACAGAGTCGACCTCCAGGTCCTATCACCGTCGACCTGTA

GGKTLSVSQLELQDSGTWTCN

NS

LP

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M

B

NM A HA L EE U 11 1

GCACTGTCTTCCAGAACCAGAACAAGCTCGAGTTCAAAATAGACATCCTGGTCCTAGCTT

661 ---------*---------♦---------*---------*---------+---------* 720

CGTGACAGAACGTCTTGGTCTTCTTCCACCTCAAGTTTTATCTGTAGCACCACGATCGAA

TVLQNQKKVEFKIDIVVLAFHS

AT

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M W N N L L 1 1

TCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCC

721---------4---------♦---------♦----------♦---------♦---------* 780

AGGTCnCCGGAGGTCGTATCAGATAnCTTTCTCCCCCTTGTCCACCTCAAGAGGAAGC

QKASSIVYKKEGEQVEFSFPA

L

U

A

L

U

M

N

L

CACTCGCCTTTACACTTGAAAACCTCACGGGCAGTGGCGACCTGTGGTGGCACCCGGACA

781 4---------4 4---------4- -- +---------4 340

CTGAGCGCAAATCTCAACTTiTCCACTCCCCCTCACCCCTCCACACCACCGTCCGCCTCT

LAFTVEKLTCSGELWWQAERP S Η M FM A P N LN U H L ML 3 1 1 11 A

M

B

GCCCTTCCTCCTCCAAGTCTTGCATCACCTTTCACCTGAAGAACAAGCAAGTGTCTGTAA

841 ---------4---------4---------4-------------------*---------- 9oq

CCCGAAGGAGGAGGTTCAGAACCTAGTCGAAACTGCACTTCTTCTTCCTTCACAGACATT

ASSSKSWITFDLKNKEVSVK-49-

B	BS PS
SM	SCADNPAD	A	A	H
TA	TRVRLUUD	L	L	P
EE	NFAAAM9E	U	U	H
23	11224161	1	1	1
/	/ / //

AACCCGT7ACCCAGGACCCTAACCTCCAGATGCCCAAGAAGCTCCCCCTCCACCTCACCC

9Q1 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 960

T7GCCCAATGGGTCCTCGCATTCCAGC7CTACCCGT7CT7CGAGGGCCAGG7CCACTCGG

R	V	T Q	D Ρ K	L	Q M G K	K L P L
	BS					BSS
M	SC	HS	D	M	H	SCAHM
N	TR	AT	D	N	P	TRUAN
L	NF	EU	E	L	H	NF9EL
1	11	31	1	1	1	11631
	/	/				/ /

TGCCCCAGGCCTTGCCTCACTATGCTGGCTCTCGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGA

961 ---------4---------4---------♦---------₄---------4---------* 1020

ACGGGGTCCGGAACGGAGTCATACGACCGAGACCTTÍCGAGTGGGACCGGGAACTTCGCT

PQALPQYAGSCNLTLALEAK1021

S BS

F SC H D A

A TR P D L

N NF Η E U

11 111 /

AAACAGCAAAGT7CCATCACCAACTGAACCTGGTGGTGATGAGAGCCACTCACCTCCAGA

-------·-·♦-------------------*---------♦---------♦---------* 1080

TTTGJCCTTTCAACGTAGTCCTTCACTTGGACCACCACTACTCICGGTGAGTCGAGGTCT

G K L H C	} E V N L	V V M	R	A T	q
M	PS ADNNPA	S DF	AM	DE	A
N	VRLLUU	DA	LN	DS	L
L	AAAAM9	EN	UL	EP	U
1	224416	11	11	11	1
	/////	/	/	/

AAAAT77GACC7CÍGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTCAGCTTCAAAC

1081

---------4---------4---------4---------4 ---------4---------4

TTnAAACTCGACACTCCACACCCCTGGCTGGAGGCGATTCCACTACGACTCCAACTTTC

NLTCEVWGPTSPKLMLSLKL

M T Η M DM

N A Ρ N DS

L Q A L ET

1 2 1 12 /

TGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGCCGGTGTGGGTGCTGAACCCTG

1141

1140

1200

ACC7CT7GT7CC7CCGTT7CCACAGCTTCGCCC7CT7CGGCCACACCCACGACTTGGGAC

ENKEAKVSKREKPVWVLNPE-50\

1201

Η

F D Μ I Α

D Α Ν V

Κ Ε Ε F Α

13 11

PS Η

ADPA I

VRLÍU Ν

ΑΑΜ9 F

2216 1 ///

AGGCGGGGATGTGCCAGTCTCTGCTGAGTCACTCGCGACAGGTCCTGCTGCAATCCAACA

---------+---------4---------4---------4---------4---------♦ 1260

TCCGCCCCTACACCGTCACAGACGACTCACTCACCCCTCTCCAGGACGACCTTAGGTTCT

AGWWQCLL	S D	S G Q V L L	ESN	I
S	SA	BKF BS	H
ANA	HNCP	SGNMAANXA	RSD I	A
VLU	PCRA	PIUNMULHV	SCO N	L
AA9	AIFL	1ADLH3A0A	AAE D	U
236	2111	21211A421	111 3	1
//	//	/ / / /	/

TCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCACGCGGATCCCGAGGGTGAGTACTAAG

1261---------*---------♦........-+---------♦---------*---------♦ 1320

AGTTCCAAGACGGCTGTACCAGGTGGGGCCACGTGCGCCTAGGGCTCCCACTCATGATTC

K	V L	P	T w	S T Ρ V H	A D P	E
	E		BS	SS	F	BS	F
H	CHH	F	SC	HHNCF	- N	BSC	N
P	OHA	0	TR	PGCRA	U	BTR	U
H	4AE	K	NF	AAIFN	4	VNF	4
1	712	1	11	21111	H	111	H
/			/	//		//

CTTCACCGCKCTCCCTGGACCCATCCCGGCTATGCACCCCCAGTCCAGGCCAGCÂAGCC

1321 ---------*-------------------*---------4---------4---------4 1350

GAAGTCGCGAGGACGGACCTGCGTACGGCCGAIACGTCGGGGTCAGGTCCCGTCGnCCG

ς	S
DSHVHNi	H7NCN	M	WNDM
R6A5PLU	PNCRL	N	NLDB
AVE0HA9	AlIFA	L	LAEO
2132146	21114	1	1312

// // //

AGGCCCCGTCTGCCTCnCACCCGGAGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGACAGC

1381 ---------*---------4 — — ----4-- — ----4---------4_--_ — _ — 4 1440

TCCGCGGCAGACGCAGAAGTGGGCCTCGGAGACCGGCGGGGTCAGTACGAGTCCCTCTCC

BS	P	B	BS	S
SC	F	W	B	N	S	SCDHA
TR	L	A	A	L	P	TRRAU
NF	M	E	N	A	1	NFAE9
11	1	1	1	4	2	11236
/						/	/

GTCnCTGGCTTTTTCCCAGGCTCTGGGCAGCCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCC

1441 ---------4-------— 4 — ----4- — -- — --4---------4------- — ₊ 1500

CAGAAGACCGAAAAAGGCTCCGAGACCCCTCCGTGTCCGATCCACGGCGAT7CGCTCCCG

-511501

1561

1621 ] 661

B	B	B	s	PS
S	DBS	S M	HNC	ADNPA
P	DAP	P N	PCR	VRLUU
M	ENI	M L	AIF	AAAM9
1	122	1 1	211	22416
	/		/	/ //

CTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTCCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACC

---------4---------♦---------4---------4---------4---------4 ] 560

GACGTCTGTTTCCCCGTCCACGACCCGAGTCTGCACCGTTCTCGGTATACGCCCTCCTGG

D H DAM

D A 0 L N

E E E U L

3 111

CTCCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACC

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1620

GACGGGGACTCGATTCGGGTGGGGTTTCCGGTTTGAGAGGTGAGGCAGTCGAGCCTGTGG

H

I M MM N N AB F L EO 1 1 32

B

P BS M

S AP A

T NI E

22 3

TTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTCCACAGCCCAAATCTTGTG

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1680

AACAGAGGAGGGTCTAAGGTCATTGAGCGTTAGAAGAGAGACGTCTCGGGTTTAGAACAC

N	BBS	BS
NS	SSC	SC HS	Μ A
LP	PTR	TR AT	N L
AH	1N-	NF EU	L U
	211	11 31	1 1
/	/	/ /

ACAAAACTCACACA7GCCCA::G7GCCCAGCTAAGCCACCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCT

---------4-------------------4---------4---------4---------4 1740 tgttttgagtgtgtacgggtggcacgggtccattccgtcgggtccggaccgggaggtcga

K	T Η T	C	P P C P
			B		BS	s	s	S
M	B	N	SM	F	SC	F	DHNA	HNC
N	A	L	PA	0	TR	A	RALU	PCR
L	N	A	1E	K	NF	N	AEA9	AIF
1	1	4	21	1	11	1	2346	211
					/		/	/

caacgccggacaggtgccctagagtaccctgcatccagccacagcccccagccggctcct

---------4---------4---------4---------♦---------4---------4 1800

GTTCCGCCCTCTCCACCGGATCTCATCCCACGTAGCTCCCTGTCCGCGCTCCGCCCACGA

1741

-521801

1861

1921

1981

Α Μ Μ FAB L Ε 0 3 2 2

M D Ν D L Ε 1 1

BS

M SC

N TR

L NF

11 /

S

M ANA M B VLU B 0 AA9 0 2 246 2 /

CACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCACCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC

-«-----------------.4.........4.--------₄---------♦ ------♦

CTGTGCAGGTGGAGGTAGAGAAGGAGTCGTGGACTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCAGAAG

A P E	L	L G G P	S V	F
		s		ss		N
M	s	AN	M	•HMANNAC DM	M	NS
N	T	UL	N	PNVCLUR DS	A	LP
L	Y	3A	L	ALAIA9F ET	E	AH
1	1	A3	1	2121461 12	3	31
				/ / // /		/

CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC

---------4---------4---------4---------4---------_----------4

GACAAGCGGGGTTTTGGGTTCCTGTCGGACTACTACACGGCCTCGGCACTCCACTCTACG

P K	P K D	T L M	I S F	? Τ P Ε V T
M	M	DM	M	RM M
A	N	DS	B	SA N
E	L	ET	0	AE L
2	1	12	2	12 1

/

GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC

CACCACCACCTGCACTCCGTCCT7CTGCGACTCCAGTTCAAGT7GACCATGCACCTCCCG

D	P	Ε V K	F N W	Y V	D	G
	r	FN				S
M	N	NSS	R	M	R	HNC
N	U	UPA	S	A	S	PCR
L	í	DBC	A	E	A	AIF
1	H	222	1	2	1	211
		//				/

GTGGAGGTCCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGG

CACCTCCACCTATTACCCTTCTGTTTCCCCGCCCTCCTCGTCATCTTCTCCTGCATCGCC

VEVHNAKTKPREEQYNSTYR

1860

1920

1980

2040

HH	M	BS SC	R
GP	N	TR	s
AH	L	NF	A
11	1	11 / :accaggaciggctga	1
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG(	ATCGCAACCACTACAAGTGC

---------4---------4---------♦---------4---------4---------♦ 2100

CACCAGTCGCAGGAGTGGCACGACG7GGTCCTCACCGACTTACCCTTCCTCA7GT7CACG

2041

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKC 2101

Μ T N A L Q 1 1

AAGG7C7CCAACAAACCCCTCCCAGCCCCCATCCAGAAAACCATCTCCAAACCCAAAGGT

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 2160

T7CCAGAGGT7GTTTCGGGAGGGTCGGGGGTACCTCTTT7GGTAGAGGTTTCGGTT7CCA

: v s n κ	A L	P A	P ]	[EKTISKAK
P s	S			S
ADNNPMA	A	Η M	N	HHN BSAH	D
VRLLUNU	U	A N	L	APA GFUA	D
AAAAML9	9	E L	A	EAE LI9E	E
2244116	6	3 1	3	321 1163	1
//// /				/

GGCACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTCCCCT

2161

---------4---------4---------4---------4---------₄---------2220

CCCTCGCCACCCCACGC7CCCGCTGTACCTG7CTCCGGCCGAGCCGGGTGGGAGACCGCA

N F

M	M	S	R	M	N	A	B	R F
N	A	P	S	N	U	V	B	S D
L	E	B	A	L	4	A	V	A K
1	3	2	1	1	H	1	1	1 1
GAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC
								------4 2280

CTCTCACTCGCGACATCGT7CCACACAGGATCTCCCCTCGCCGCTCT7CG7GTCCACATG

GQPREPQVY

2221

-542281

ss	BS
AHNNCCS	A	F	SC
VPCCRRí.'	L	D	TR
AAI1FFA	U	K	NF
1211111	1	1	11

BS Β SC S TR P NF M 11 1 ///// / / ACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

---------+---------4---<--«-<->-4---------4 ---------4

TGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGCTCCAGTCGGACTGGACCGACCAG

2340

TLPPSRDELTKNQVSLTCLV

F

N Η B

U Ρ B

A V

H 2 1

AAAGGCTTCTATCCCACCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCGCAGAAC

2341

2400 rnCCCAACATACCCTCCCTCTACCGCCACCTCACCCTCTCGTTACCCCTCGCCCTCTTC

KGFYPSDIAVEWESNCQPEN

2401

H

Μ I N N L F 1 1

M

B

N

L

A

H

P

H

Μ A N L L U 1 1

AACTACAAGACCACCCCTCCCGTCCTCGACTCCCACCCCTCCTTCTTCCTCTACACCAAC

2460

TTGATGTTCTGGTGCGGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGATGTCGTTC

T	Ρ Ρ V L D	S D G S F	F L	Y	S K
B	F		S
S	NM	MBX	NF	M	N
P	UB	ABM	LA	N	S
M	40	EVN	AN	L	I
1	H2	211	31 /	1	1

CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGCGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT

2461

2520

GAGTCGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGCACTACGTA

LTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

-552521

Ν

L

Α

Μ

Β

Ο

S

Μ HNC Ν PCR L AIF 1 211 /

GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC7CCCTGTCTCCGGGTAAATGACTG

---------4---------4------------------------------4---------4

CICCGiGACGIGnGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTACICAC

EALHNHYTQKSLSLSPCK·

2580

CXH

FMA

RAE

133 /

CGACGCCCG

2581 --------- 2589

GCTGCCGGC

Tabela 3

F N N S U P 4 B H 2

S

B W H DHA

Β N G RAU

V L A AE9

1 236

B

S

T

X /

GCCIGTTTGAGAACCAGCCGGCAAGAAAGACGCAAGCCCAGAGGCCCTGCCATTTCTGTG

-------------------4---------4---------4---------4--«-------4

CGGACAAACTCTTCGTCGCCCGTTCTTrCTGCCTTCGGGTCTCCCGCACGGTAAAGACAC

B	PS	S	S
DBS	ADNPA	D	DHNA	W	HW	HNC
DAP	VRLUU	D	RALU	N	AN	PCR
ENI	AAAW9	E	AEA9	L	EL	AIF
122	22416	1	2346	1	31	211
/	/ //		z		/	/

GGCTCACCTCCCTACTCGCTCAGCCCCCTGCCTCCCTCCGCAAGCCCACAATGAACCCGG

61---------*---------+---------+---------♦---------4---------4

CCCACTCCACCCATGACCCAGTCCGCCCACCGACCGACCCGTTCCGGTGTTACrrCGCCC

120

H	F	F
I	B	N	HH	N W	D
N	B	U	HA	U N	D
F	V	4	AE	4 L	E
1	1	H	12	Η 1	1

GAGTCCCTTTTACGCACTTGCTTCTGGIGCTGCAACTCGCCCTCCTCCCACCAGCCACTC

121 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 180

CTCAGGGAAAATCCGTCAACGAAGACCACGACCTTGACCGCGACGAGGGTCGTCGGTCAG

VPFRHLLLVLQLALLPAATQB

B

V

E

C

K

E

C

K

R

S

A

A

L

U

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTT

181

TCCCrnCTTTCACCACGACCCGTTTTTTCCCCTATGTCACCnGACTGGACATGTCGAA GKKVVLGKKGDTVELTCTAS240

-57V Μ I

Β Ν

G Ο F

2 1

241

CCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAA — — — — - - - — — — — — — — — — 300

GGGICTTCnCTCGIAIGTTAAGGTGACCTTTTTGAGCT7GG7CTATTrCTAAGACCCTT

K s	I Q	F H W K	N S	N Q	I	K	I
B		S		S	F		H
NBS	F	AA	A	A	N	H	I
LAP	0	VU	L	U	U	H	N
AN1	K	A9	U	3	D	A	F
422	1	26	1	A	2	1	1

/ /

ATCACGGCICCncnAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA

301 ---------+---------*---------*---------4---------4---------4 360

TACTCCCGACGAAGAATTGATTTCCAGCTAGGTTCGACrrACTACCGCGACTCAGTTCTT

Q G S F L	TKCPSKLND	R A	D S R ,
S	S	H		H
MANAS	BA	I	A	I	D
BVLUT	CU	N	F	N	D
0AA9Y	L3	F	L	F	E
22461	IA	1	2	1	1
/	/

GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTCATCATCAAGAAlCnAACATAGAACACT

361 ---------♦---------♦---------4---------4---------4---------4 420

CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAACGGCGACTACTACrrCTTACAATTCTATCTTCTGA

S L	W D Q G N	F P L I	IKNLKIED
M	M	S AMAM	M
B	N	VNUN	A
0	L	AL9L	E
2	1	2161	1
CAGATAC	TTACATCTGTGAAGT	// GGAGGACCAGAA	CGACGAGGTGCAATTGCTACTGTTC

CTCTATCAATCTAGACACTTCACCTCCTGCTCTTCCTCCTCCACCnAACGATCACAAGC

DTYICEVEDQKEEVQLLVFG-58-

Β

S

Ρ

Μ

S τ

Υ

GATTCACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGACCCTCACCCTGACCTTGG

481 ___________________*---------*---------*---------*---------♦ 540

CTAACTGACGGT7GAGACTCTGGGTCGACGAAGTCCCCGTCTCGGACTGGGACTGGAACC

T	A N	S D T H L	L Q	G Q	5
B	BS			H
BS	SC	D	1,'	1	S
AP	TR	D	N	N	T
NI	NF	E	L	F	Y
22	11	1	1	1	1
/	/

AGAGCCCCCCTGCTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGCAGTCCAAGCCGTAAAAACATAC

541 ---------4---------4-------------------4---------4---------4 600

TCTCGGCGGCACCATCATCCGGCACTCACGTTACATCCTCACGTTCCCCATTTTTGTATG

P	S V Q C R S P	R	G	K	N
		N	BBH S	B			BS
M	MD	ASP A	BSSGSC	S	B	N	SC
B	ND	LPV L	ΑΡΤΙAR	T	A	L	TR
0	LE	UBU U	N1NACF	X	N	A	NF
2	11	122 1	221111	1	1	4	11
		//	/ ///				/

ACCGGGCCAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTCGACCTCCACGATAGTCGCACCTGGACAT

601 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 660

TCCCCCCCTTCTCGCAGAGGCACAGAGTCGACCTCGACGTCCTATCACCGTGGACCTGTA

GGKTLSVSQ

N

NS Μ NM A

LP B HA L

AH 0 EE U

2 11 1 /

CCACTGTCTTCCAGAACCACAACAAGCTGGACTTCAAAATACACATCGTGCTGCTAGCTT

661 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 720

CGTCACAGAACCTCTTGCTCTTCTTCCACCTCAACTTTTATCTGTAGCACCACGATCGAA

TVLQNQKKVEFKIDIVVLAF-59-

HS MM

AT N N

EU L L

1 1 /

TCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCC

721_________♦---------*---------*---------4---------4---------4 780

AGGTCTTCCGGAGGTCGTATCAGATATTCTTTCTCCCCCTTGTCCACCTCAAGAGGAAGG

QKASSIVYKKECEQVEFSFPA AM

L L N

U U L

1 1

CACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGA

781 ---------4------------------4---------₊---------₊ 840

GTGAGCGGAAATGTCAACTTTTCGACTGCCCG'CACCGCTCGAZACCACCGTCCGCCTCT

P S

Η M FM A M

P N LN U B

H L ML 3 D

1 11 A 2

GGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGCATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAACTGTCTCTAA

841

---------4---------4---------₄---------4---------4---------4 9QQ cccgaaggaggaggttcagaacctagtcgaaactggacttcttgttccttcacacacatt

ASSSKSWITFDLKNKEVSVK-

B	BS PS
SM	SCADNPAD	A	A	H
TA	TRVRLUUD	L	L	P
EE	NFAAAM9E	U	U	H
23	11224161	1	1	1
/	/ / //

aaccccttacccaggaccctaagctccacatccccaacaacctccccctccacctcaccc

901 ---------4---------4.........4.........4---------4---------4 960 ttgcccaatgcgtcctgccattccagctctacccgttcttcgacgccgaggtcgagtccg

R	V	T Q	D P K	L	Q M G K K	L P L
	BS					BSS
M	SC	HS	D	M	H	SCAHM
N	TR	AT	D	N	P	TRUAN
L	NF	EU	E	L	H	NF9EL
1	11	31	1	1	1	11631
	/	/				/ /

tgccccagcccttgcctcagtatgctggctctggaaacctcaccctggcccttgaagcga

961 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1020 acgcggtccggaacggactcatacgaccgagacctttggagtcggaccgggaacttcgct pqalpqyagsgnltlaleak1021

s

F

A

N

BS

SC

TR

NF /

H D P D Η E 1 1

A

L

U

AAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1080

TTTCTCCTTTCAACGTAGTCCTTCACTTGGACCACCACTACTCTCGCTGAGTCGAGCTCT

1081

1141

T G K L H Q E	V N L	V	V M	R A	T Q L Q K
	PS		S
M	ADNNPA		DF	AY	DE A
N	•VRlLUU		DA	LN	DS L
L	AAAAY9		EN	UL	EP U
1	224416		j 1	11	11 1
	/////		/	/	/
AAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTC	CCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAAC
TTTTAAACTCGACACTCCACACCCCTGCGTCGAGGGGATTCCACTACCACTCCAACTTTG
N L T C E V W	G Ρ T	S	P K	L M	L S L K L
M	T		H		M DM
N	A		P		N DS
L	Q		A		L ET
1	1		2		1 12
TGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAACCCGGTGTGGGTGCTGAACCCTG
ACCTCTTCTTCCTCCCTTTCCACAGCTTCGCCCTCTTCCCCCACACCCACCACTTCCCAC
E Ν K E A K V	S K R	E	K P	V W	V L Ν Ρ E
	H			PS	H
F	D Μ I	A		ADPA	I
0	DAN	V		VRUU	N
K	E E F	A		AAM9	F
1	1 3 1	1		2216	1

1140

1200 ///

AGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACA

---------4---------4-------------------4---------4---------4 1260

TCCGCCCCTACACCGTCACACACGACTCACTCAGCCCTCTCCAGCACCACCTTACGTTCT

AGMWQCLLSDSGQVLLESNI

1201

s	SA	BHF BS	H
ANA	HNCP	SGNM.AANXA	RSD I A
VLU	PCRA	PIUNMJLHV	SCO N L
AA9	AIFL	1ADLH3A0A	AAE D U
236	2111	21211A421	111 3 1
//	//	/ / / /	/

TCAAGGTTCTCCCCACATGGTCCACCCCGGTGCACGCGGATCCCGAGGGTGAGTACTAAG

1261 _________*---------⁴---------*---------⁴---------*---------* 1320

AGT7CCAACACGGGTGTACCACGTGCCCCCACCTGCGCCTACCGCTCCCACTCATCATTC

K	V L	P	T w	S T P V H	A D P	E
	E		BS	SS	F	BS	F
H	CHH	F	SC	HHNCF	N	BSC	N
P	OHA	0	TR	PGCRA	U	BTR	U
H	4AE	K	NF	AAIFN	4	VNF	4
1	712	1	11	21111	H	111	H
/			/	//		//

CTTCACCCCTCCTCCCTGGACCCATCCCGCCTATGCACCCCCACTCCACCCCACCAACGC

1321 ---------+---------------------------------------*---------- 1380

CAACTCCCGACGACGCACCTGCGTAGGGCCCATACGTCGGGGTCACGTCCCCICGTTCCC

S	S
DBHMHNA	HMNCN	V	VNO'.'
RBABPLU	PNCR_	N	N_D3
AVE0HA9	AL1FA	L	LAEO
2132146	21114	1	1312
// //	//

ACGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGCAGCCTCTCCCCGCCCCACTCATGCTCAGCCAGACG

1381 ---------*------- — + --------- +-------------------♦---------< 1440

TCCCGCGCAGACGGAGAAGTGGGCCTCCGACACCGCCGCCCTCACTACGAGTCCCTCTCC

BS	P	B	BS S
SC	F	V	B	N	S	SCDHA
TR	L	A	A	L	P	TRRAU
NF	M	E	N	A	1	NFAE9
11	1	1	1	4	2	11236

/ / / CTCTTCTCCCTTTTTCCCACCCTCTGCCCACGCACACCCTACGTCCCCCTAACCCACCCC

1441 ---------4---------4---------♦---------♦-------------------_- 1500

CAGAAGACCGAAAAAGGGTCCCACACCCGTCCCTGTCCGATCCACGCGGATTGGGTCCCG

B	B	B	S	PS
S	DBS	S M	HNC	ADNPA
P	DAP	P N	PCR	VRLUU
M	ENI	M L	AIF	AAAM9
1	122	1 1	211	22416
	/		/	/ //
CTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGACCACC ---------+---------4- —......4-----------------------------4 1560

GACGTGTCTTTCCCCGTCCACGACCCCAGTCTCGACGGTTCICCGTATAGGCCCTCCTGC

D

D

E

H

A

E

D

D

E

A

L

U

M

N

L

CTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGCACACC

1561---------♦---------♦---------♦---------4---------♦---------4 1620

GACCGGGACTCGATTCCGCTCCGGTTTCCGGTTTGAGAGGTGAGGGAGTCGAGCCTCTCC

LPLT*AHPKGQTLHSLSSDT CP.PKPTPKAKLSTPSARTP-

s	P	p q r p	1 N S P L P	Q L G Η 1
H				S
I	M	MM	DF	F
N	N	AB	DO	A
F	L	EO	EK	N
1	1	32	11	1
		/	/

rTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTCAGGGAGTGCATCCCCCCC

1621 ---------*---------4---------*---------.....---------♦ 1680

AAGAGAGGACGGTCTAACGTCATTGAGGGTTAGAAGACAGAGTCCCICACGTAGGCGGGG

M C

N 0

L R

1

AACCCTTTICCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCC....

1681 ---------4---------♦-------------- 1714

TTCGGAAAAGGGGGAGCAGAGGACACTCTTAAGG....

TLFPLVSCENS....

Tabela 4

F N N S U P 4 B H 2

B

B

V

M

N

L

H

G

A

S

DHA

RAU

AE9

236 /

B

S

T

X

GCCTGTTTGAGAAGCAGCGGGCAAGAAAGACGCAAGCCCAGAGGCCCTGCCATTTCTGTG

1___________________4---------4---------4---------4---------4 60

CGGACAAACTCTTCGTCGCCCGTTCTTTCTGCGTTCGGGTCTCCGGCACCGTAAACACAC

B	PS	S	S
DBS	ADNPA	D	DHNA	M	HM	HNC
DAP	VRLUU	D	RALU	N	AN	PCR
ENI	AAAM9	E	AEA9	L	EL	AIF
122	22416	1	2346	1	31	211
/	/ //		/		/	/

GGCTCAGGTCCCTACTGGCTCAGGCCCCTGCCTCCCTCGGCAAGGCCACAATCAACCGGG 61---------+---------*---------4---------4---------4---------4 120

CCGAGTCCACGGATGACCCAGTCCGGGGACGGACGCAGCCGTTCCGGIGHACnCCCCC

121

181

H

I

N

F

GAGTCCC1

B

B

V

F

N

U

H

HH

HA

AE

F

Ν M U N 4 L Η 1

D

D

E

7AGGCACTTGCTTCTCGTGCTCCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTC

CTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCCGTGAG

180

VPFRHLLLVLQLALLPAATQB

B

V

R s

A

A

L

U

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGCGCAAAAAAGGCGATACAGTCGAACTGACCTGTACAGCTT

TCCCTTTCTTTCACCACGACCCCTTTTnCCCCTATGTCACCTTGACTCGACATGTCGAA

GKKVVLGKKGDTVELTCTAS240

Η

Μ Μ I

Β Β Ν

0 F

2 1

241

301

CCCAGAAGAACAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATKTGGGAA

---------4---------4---- - -- - - —-----------------4----------- 300

GGGKTICnCTCGIATGTTMGGTGACCTTTTTGAGGTTGGKTATTTCTAAGACCCT!

K s	I Q	F H W K	N S	N Q	I	K	I
B		S		S	F		H
NBS	F	AA	A	A	N	H	1
LAP	0	VU	L	U	U	H	N
AN1	K	A9	U	3	D	A	F
422	1	26	1	A	2	1	1

/ /

ATCAGGGCTCCT7CTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTCACTCAAGAA

---------+---------+---------₄---------₊---------.---------4 360

TAGTCCCGAGGAAGAATTGATTrCCACGTAGGTTCGACTTACTACCCCGACTGAGríCTT

Q G S F L T	K G P S K	L N D	R A	D S R	1
S	S	H		H
MANAS	BA	I	A	I	D
BVLUT	CU	N	F	N	D
0AA9Y	L3	F	L	F	E
22461	IA	1	2	1	1
/	/

GAAGCCrrrGCCACCAACCAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCnAAGATACAAGACT

361---------+---------♦---------+---------♦---------♦---------♦ 420

CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAAGCCGGACTAGTAGTTCTTAGAATTCTATCTTCTGA

S L	W D Q C N	F P L I	IKNLKIEDS
		S
M	M	AMAM	M
B	N	VNUN	A
0	L	AL9L	E
2	1	2161	1
		//
CAGATACTIACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGT7CG ---------4---------------------------------------4---------4

421 ---------♦---------*---------♦---------♦---------♦---------+ 480

GTCTATGAATGTAGACACnCACCTCCIGGTCnCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC dtyicevedqkeevqllvfg-

-65Β

S

Ρ

Μ

S τ

Υ

GATTGACTGCCAACTCTCACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGG

481 ---------+---------♦-------------------4---------♦---------- 540

CTAACTGACGGTTCACACTGTGGGTCGACGAAGTCCCCCTCTCCCACTGGGACTGGAACC

LTANSDTHLLQGQSLTLTLEΒ BS Η

BS SC D Μ I S

AP TR D Ν Ν Τ

Nl NF Ε L F Υ

11 1 111 / /

AGACCCCCCCTGCTAGTACCCCCTCAGTGCAATGTACGAGTCCAACCGGTAAAAACATAC

541

600

TCTCGCGCGGACCATCATCGCGGAGTCACGTTACATCCTCAGGTTCCCCATTTTTGTAT G SPPGSSPSVQCRSPRGKNIQ601

Μ

Β

ΜΟ

ND

LE

Ν

ASP

LPV

UBU

122 //

ΒΒΗ S Β A BSSC5C 5 L APTIAR Τ U N1NACF X

BS

Β Ν SC A L TR Ν A NF

221111 1 1 4 11 / ///

AGCGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACAT

---------4--------------♦---------♦---------4

TCCCCCCCTT CTGGGAGAGGCACAGAGTCGACCTCGAGGTCCTATCACCGTGGACCTGTA GGKTLSVSQLELQDSGTWTC660

Ν

NS Μ NM Α

LP Β HA L

AH 0 ΕΕ U

2 11 1 /

GCACTCTCTTGCACAACCAGAACAACCTGGAGTTCAAAATAGACATCCTGGTGCTAGCTT

661

720

CGTGACACAACCTCTTGGTCTTCTTCCACCTCAAGTTTTATCTGTACCACCACGATCGAA

TVLQNQKKVEFKIDIVVLAFHS

AT

EU /

Μ M Ν N L L 1 1

TCCAGAAGGCCTCCAGCATAG7CTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCC

721 ---------♦---------♦---------♦---------♦---------+---------♦ 780

AGGICTTCCGCAGGTCGTATCAGATATTCITTCTCCCCCTTCTCCACCKAAGAGGAACG qkassivykkegeqvefsfp-66-

Α

L

U

A

L

U

M

N

L

CACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGGCAGCCGGAGA

781 ---------*---------*---------*.........♦---------*---------- 840

GTGAGCCGAAATGTCAACnTTCGACTGCCCGTCACCGCTCCACACCACCGTCCCCCTCT

LAFTVEKLTGSGELfcfcQAERH

P

H

P S M FM A N LN U L ML 3 1 11 A

M

B

GGGCTTCCTCCTCCAAGTCT7CGATCACCTTTGACCTGAAGAACAACGAAGTGTCTGTAA

841 ---------♦ — — — — 4_________4____ - +---------<---------4 9oo

CCCGAACGACCACGTTCACAACCTACTGCAAACTGGACTTCTTCTTCCTTCACAGACATT

ASSSKSWITFDLKNKEVSVK-

B	BS PS
SM	SCADNPAD	A	A	H
TA	TRVRLUUD	L	L	P
EE	NFAAAM9E	U	U	H
23	11224161	1	1	1
/	/ / //

AACGGGTTACCCAGCACCCTAAGCTCCAGATGCCCAAGAACCTCCCCCTCCACCTCACCC

901 ---------+-------------------*---------♦---------+---------♦ 960

TTGCCCAATGGGTCCTGGGATTCGAGGTCTACCCGTTCTTCGAGGGCGAGGTGGAGTGGG

H L T L -

R	V	T Q	D P	K L	Q M G K K	L P L
	BS					BSS
M	SC	HS	D	M	H	SCAHM
N	TR	AT	D	N	P	TRUAN
L	NF	EU	E	L	H	NF9EL
1	11	31	1	1	1	11631
	/	/				/ /

TGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTCGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGA

961 ---------₊---------4---------4---------4---------4---------+ ιορο

ACGGGGTCCGGAACGCAGTCATACGACCGAGACCTTTGCAGTGGGACCGGGAACTTCGCT

PQALPQYAGSGNLTLALEAKS

F

A

N

BS

SC

TR

NF /

H D P D Η E 1 1

A

L

U

AAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTCGTCCTGATGAGACCCACTCAGCTCCAGA

1021 ---------♦---------♦---------------------------------------- 1080

T7TGTCCT7TCAACGTAGTCCTTCACTTGGACCACCACTACTCTCGGTGAGTCGAGGTCT tgklhqevnlvvmratqlqk-

M	ADNNPA	DF	AM	DE	A
N	VRLLUU	DA	LN	DS	L
L	AAAAM9	EN	UL	EF	U
1	224416	11	11	11	1
	/////	/	/	/

AAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAAC

1081

TTTTAAACTGGACACTCCACACCCCTGGGTCGACGGCATTCGACTACGACTCGAACTTTG NLTCEVWGRTSPKLMLSLKL-
Μ T	H	M	DM
N A	P	N	DS
L Q	A	L	ET
1 1	2	1	12

1141

1201

TGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGCCGGTGTGGGTGCTGAACCCTG

---------₊---------4---------4---------₊---------₊---------„ 1200

ACCTCTTGTTCCTCCCTTTCCACAGCTTCGCCCTCTTCCGCCACACCCACGACTTGCCAC

E N K E A K V	S	K	R	E	K P V w	V L N P
			H		PS	H
F	D	M	I	A	ADPA	I
0	D	A	N	V	VRUU	N
K	E	E	F	A	AAV9	F
1	1	3	1	1	2216	1

III

ACGCGGCCATCTCGCACTGTCTGCTCAGTGACTCGGCACACGTCCTGCTGCAATCCAACA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1260

TCCCCCCCTACACCCTCACACACCACTCACTCACCCCTCTCCACGACCACCTTACGTTCT

W í	) C L L	S D	S G Q V L L	E S	N	I
	S	SA	BHF BS		H
	ANA	HNCP	SGNVAANXA	RSD	I	A
	VLU	PCRA	PIUNMULHV	SCD	N	L
	AA9	AIFL	1ADLH3A0A	AAE	D	U
	236	2111	21211A421	111	3	1
	//	//	/ / / /	z

1261

TCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTCCACGCGGATCCCGAGGCTGAGTACTAAG ___________________4-------------------♦---------♦---------♦ 1320

ACTTCCAAGACGCGTGTACCACGTGGGCCCACGTGCGCCTAGGGCTCCCACTCATCATTC

K	V L	P	T w s	Τ Ρ V H	A D P	E
	E		BS	SS	F	BS	F
H	CHH	E	SC	HHNCF	N	BSC	N
P	OHA	0	TR	PGCRA	U	BTR	U
H	4AE	K	NF	AA1FN	4	VNF	4
1	712	1	11	21111	H	111	H
/			Z	zz		zz
CTTCACCGCTCCTCCCTCCACCCATCCCCGCTATCCACCCCCAGTCCACCCCACCAACCC

GAAGTCGCCACGACGGACCTGCGTAGGCCCGATACCTCGGCCTCACGTCCCCTCGTTCCC

1321

5	S
DBHMHNA	HMNCN	M	MNDY
RBABPlU	PNCRL	N	NLDS
AVE0HA9	ALIFA	L	LAEC
2132146	21114	1	1312
// //	//

AGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGCGAGAGG

1381 ---------*---------♦---------♦---------♦---------♦---------♦ 1440

TCCCGGGCAGACGCAGAAGTGGGCCTCGGAGACGGGCGCGGTGAGTACGAGTCCCTCTCC

BS	P				B	BS S
SC	F	M	B	N	S	SCDHA
TR	L	A	A	L	P	TRRAU
NF	M	E	N	A	1	NFAE9
11	1	1	1	4	2	11236
/						/ /

GTCTTCTGGCTTTTTCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCC

1441 ---------+---------+---------♦---------♦---------♦---------* 1500

CACAACACCCAAAAAGGGTCCGAGACCCGTCCCTGTCCCATCCACCCCGATTCCGTCCCG

B	B	B	S	PS
S	DBS	S M	HNC	ADNPA
P	DAP	P N	PCR	VRLUU
M	ENI	M L	AIF	AAAM9
1	122	1 1	211	22416
	/		/	/ //

CTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACC

1501---------♦---------♦---------4---------4---------4---------4 1550

GACGTGTGTTTCCCCCTCCACGACCCGAGTCTCGACGGTTCTCGGTATACGCCCTCCTCC

D	H	D	A	M
D	A	D	L	N
E	E	E	U	L
1	3	1	1	1

CTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCACCTCGGACACC

1561 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1620

GACGGCGACTGGATTCGGCTCGGGTTTCCGGTTTCACAGCTCACGCAGTCCAGCCTGTCG

H F

I	M	MM	BP	DE	AN
N	N	AB	BS	DS	LU
F	L	EO	VT	EP	U4
1	1	32	11	11	IH
		/	/	/

TTCTCTCCTCCCACATTCCAGTAACTCCCAATCrrCTCTCTGCACTGATTGCTGACCTGC

1621 ---------4---------4---......4---------4--......-♦---------♦ 1680

AACACAGCACGCTCTAACCTCATTGAGCGT7ACAACAGAGACCTCACTAACCACTCCACG

1681

F

Μ Η Μ Μ Ν

Β G Ν Β U

Α L 0 D

11 2 2

CTCCCΑAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGCCTTCTTCGGCAACCCCCGCΑAGT

-------------------4---------4---------4---------4---------4 }740

CACCCTTTCACTCCCACAACCAGGGTGGGGCGCTGCCCAAGAACCCCTTGGCGGCGTTCA

1741

K	V S V	F V	P P R D G	F F	G	N P R	K
	BS		S	H		B S	F
A	SC	H	HNC	I	B	SMC	N
L	TR	A	PCR	N	B	TNR	U
U	NF	E	AIF	F	V	NLF	4
1	11	3	211	1	1	111	H
	/		//			//

CCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGC

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1800

GGTTCGACTAGACGGTCCGGTGCCCAAAGTCAGCGGCCGTCTAAGTCCACACGACCGACG

K	L 1	[ C Q	A T	G F S	P R	Q I	Q V S	W L	R
F	B				S	BS			H
NH	S	H	H	AM	AA	SCM	D	H	I
UH	P	P	G	HA	VU	TRN	D	A	N
DA	M	H	A	AE	A9	NFL	E	E	F
21	1	1	1	23	26	111	1	3	1
/					/	/

GCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAG

1801

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1850

CGCTCCCCTTCGTCCACCCCAGACCGCAGTGGTGCCTGGTCCACGTCCGACTCCGGTTTC

EGKQVGSGVTTDQVQAEAKE-

SS B	B
AAHNABS	SM	H
UUALPAP	TA	P
99EAAN1 '	EE	H
6634122	23	1
/ //	/

AGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAG.. . .

---------₊---------.---------.---------₊---------₊ 1910

TCAGACCCGGCTGCTGCATGnCCACTGGTCGTGTGACTGGTAGTTTCTC . . . .

SGPTTYKVTSTLTIKE ...

1861

Tabela 5

F N N S U P 4 B H 2

B

B

V

M

N

L

H

G

A

S

DHA

RAU

AE9

236 /

B

S

T

X

GCCTGTTTGAGAAGCAGCGGGCAAGAAAGACGCAAGCCCAGAGGCCCTCCCATTTCTGTG 1---------4---------4----.----4---------4---------4---------♦ 60

CGGACAAACTCTTCGTCGCCCGTTCTTTCTGCGTTCGGGTCTCCGGGACGGTAAAGACAC

B	PS		S			S
DBS	ADNPA	D	DHNA	M	HM	HNC
DAP	VRLUU	D	RALU	N	AN	PCR
ENI	AAAM9	E	AEA9	L	EL	AIF
122	22416	1	2346	1	31	211
/	/ //		/		/	/

GGCTCACGTCCCTACTCGCTCAGGCCCCTCCCTCCCTCCGCAAGGCCACAATGAACCGGG 61 ---------4---------4---------4---------4---------4---------♦ 120

CCGAGTCCAGGGATGACCGAGTCCGGGGACGCACCGAGCCGTTCCGCTGTTACTTCGCCC

H

I

N

F

GAGTCCC

B

B

V

F

N

U

H

HH

HA

AE

F

N M U N 4 L Η 1

D

D

E

TTAGGCACKGCnCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTC

121 ---------4---------4.........♦---------+---------₊---------♦ 180

CTCAGGGAAAATCCCTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGCAGGGTCGTCGGTGAG

VPFRHLLLVLQLALLPAATQR A S L A U 1 1

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTT

181 ---------*---------♦---------♦---------♦---------♦---------♦ 240

TCCCmcmCACCACGACCCGTTTTTTCCCCTATGTCACCnCACTGCACATCTCGAA

GKKVVLCKKGDTVELTCTASH

MM I

BB N

0 F

2 1

CCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGCAAAAACTCCAACCACATAAACATTCTGGCAA

241 ---------*---------*---------·♦---------♦---------♦---------♦ 300

CGGTCncnCTCGIATGTTAAGGTGACCTTTnGAGGnGGTCTATTTCTAAGACCCTT

Q K K S I QFHWKNSNQIKILGN-71-

301

361

B		S	S F H
NES	F	AA	A A N Η I
LAP	0	VU	L U U Η N
AN1	K	A9	U 3 D A F
422	1	26	1 A 2 11
/		/
ATCAGGGCTCCTTCT7AACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTCACTCAAGAA
TAGTCCCGAGGAAGAATTGATTTCCAGGTAGGTTCGACTTACTAGCGCGACTGAGTTCTT
Q G S F L	T K	G P S K	LNDRADSRR
S		S	Η H
MANAS		BA	ΙΑ I D
BVLUT		CU	N F ND
0AA9Y		L3	F L FE
22461		IA	12 11
/		/
CAACCCTT7GGCACCAACGAAACT7CCCCCTCATCATCAAGAATCTTAAGATACAAGACT
CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAAGGGGGACTAGTAGTTCTTAGAATTCTATCTTCTGA
S L W D Q	G N	F P L I	IKNLKIEDS
Μ M		S AMAM	M
Β N		VNUN	A
0 L		AL9L	E
2 1		2161	1

360

420 //

CAGATACnACATCTCTGAAGTCGACGACCAGAAGCAGGACCTGCAATTCCTACTGTTCG 421---------♦---------♦---------4---------+---------♦---------4

GTCTATGAATGTAGACACTTCACCTCCTGGTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC

DTYICEVEDQKEEVQLLVFG

480

B

S

P

M

S

T

Y

GATTGACTGCCAACTC7CACACCCACCTGCTTCACGGGCAGACCCTCACCCTCACCT7GC 481 ---------+---------♦---------♦---------+---------♦---------CTAACTCACGGT7GAGAC7GTGGGTCGACGAAGTCCCCG7CTCCGACTCCGACTCCAACC

LTANSDTHLLQGQSLTLTLE

64C

B	BS	H
BS	SC	D	M	I	S
AP	TR	D	N	N	T
Nl	NF	E	L	F	Y
22	11	1	1	1	1
/	/

AGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC

54]

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

TCTCGGCGCCACCATCATCGGGGAGTCACGnACATCCTCAGGTTCCCCATTTTTCTATG

600

P	S V Q C R S P	R	G	K	N
		N	BBH S	B			BS
M	MD	ASP A	BSSGSC	S	B	N	SC
B	ND	LPV L	APTIAR	T	A	L	TR
0	LE	UBU U	N1NACF	X	N	A	NF
2	11	122 1	221111	1	1	4	11
		//	/ ///				/

AGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACAT

601 ---------+---------+---------♦---------♦---------♦---------♦ 660

TCCCCCCCTTCTGGGAGAGGCACAGAGTCGACCTCGAGGTCCTATCACCGTGGACCTGTA

CCKTLSVSQLELQDSGTW ΤΟΝ

NS Μ NV A

LP B HA L

AH 0 EE U

2 11 1 /

GCACTCTCTTCCACAACCACAAGAACCTCGAGTTCAAAATACACATCGTCGTCCTAGCTT

661 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 720

CCTCACACAACCTCTTGCTCTTCTTCCACCTCAAGTTTTATCTGTAGCACCACCATCGAA

TVLQNQKKVEFKIDIVVLAFHS MM

AT N N

EU L L

1 1 /

TCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGCCAACACGTCGACTTCTCCTTCC

721 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 780

AGGTCTTCCGGAGGTCGTATCAGATATTCTTTCTCCCCCTTGTCCACCTCAACACCAAGG

QKASSIVYKKEGEQVEFSFPA AM

L L N

U U L

1 1

CACTCCCCTTTACACTTGAAAACCTGACGGGCAGTGCCGACCTGTGCTGCCAGGCGGAGA

781---------♦---------⁺---------*---------♦---------*---------♦ 840

GTGAGCGGAAATGTCAACTTTTCGACTGCCCGTCACCGCTCGACACCACCGTCCGCCTCT

LAFTVEKLTGSGELWWQAER-73-

Η

Ρ

Η

Ρ S 1/ FM Α Ν LN U L ML 3 1 11 Α

Μ

Β

Ο

CGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAA

841 ---------*---------+---------*---------♦---------♦---------♦ 900

CCCGAAGGAGGAGCTTCACAACCTAGTGGAAACTCGACTTCTTGTTCCTTCACAGACATT

S	S S K s	W I	T F D L K N
B	BS PS
SM	SCADNPAD	A	A H
TA	TRVRLUUD	L	L P
EE	NFAAAM9E	U	U H
23	11224161	1	1 1
/	Z / //

AACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCC

901 ---------+---------♦---------♦---------+---------*---------* 960

TTGCCCAATGCCTCCTGCGATTCCAGGTCTACCCGTTCTTCGAGCGCGAGGTGCACTGGC

R	V	3 Q	D Ρ K	L	Q M G	K K L P L
	BS					BSS
M	SC	HS	D	M	H	SCAHM
N	TR	AT	D	N	P	TRUAN
L	NF	EU	E	L	H	NF9EL
1	11	31	1	1	1	11631
	/	/				/ /

TGCCCCACGCCT7GCCTCACTATGCTGGCTCTCGAAACCTCACCCTCCCCCTTGAACCGA 961 ---------♦---------♦---------*---------4---------4---------4 1020

ACGCGGTCCGGAACGGAGTCATACGACCCAGACCTTTCGAGTCCGACCGCCAACTTCGCT

PQALPQYAGSGNLTLALEAKS BS

F SC

A TR

N NF

11

H D A PD L HE U 1 1 1 /

AAACAGGAAAGTTGCATCAGCAAGTGAACCTGCTGGTGATGAGACCCACTCAGCTCCAGA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

TTTGTCCTTTCAACGTAGTCCTTCACTTCGACCACCACTACTCTCCCTGAGTCGACCTCT

TGKLHQEVNLVVMRATQLQK

1021

1080

-741081

1141

1201

1261

	PS	S
M	ADNNPA	DF	AM	DE	A
N	VRLLUU	DA	LN	DS	L
L	AAAAM9	EN	UL	EP	U
1	224416	11	11	11	1
	/////	/	/	/

AAAATTTCACCTGTCAGCTCTGCGGACCCACCTCCCCTAACCTGATGCTGAGCTTCAAAC

---------4----------------4---------TTTTAAACTGGACACTCCACACCCCTGGGTGCAGCGGATTCGACTACGACTCGAACTTTG m

N

L

1140

WGPTSPKLMLSLKL

T

A

Q

H

P

A

M DM

N DS

L ET

12 /

TGCACAACAAGGACGCAAACGTCTCGAAGCCGGAGAAGCCGGTGTCGCTGCTGAACCCTC

ACCTCTTGTTCCTCCCTTTCCAGAGCTTCCCCCTCTTCCGCCACACCCACCACTTCCCAC

ENKEAKVSKR

EKPVWVLNPE

H

F D Μ I A

D A Ν V

K E E F A

13 11

PS

ADPA

VRUU

AAM9

2216 ///

H

I

N

F acccgccgatgtcgcagtgtctgctgagtgactccgcacaggtcctgctgcaatccaaca

TCCCCCCCTACACCGTCACAGACGACTCACTCAGCCCTGTCCACGACGACCTTACCTTCT

AGMWQCLLSDSGQVLLESNI

S	SA	BHF BS	B
ANA	HNCP	SGNMAANXA	SH
VLU	PCRA	PIUNWULHV	PP
AA9	AIFL	1ADLH3A0A	IH
236	2111	21211A421	21
//	//	/ / / /

TCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCACGCGGATCCCGAGGGTGAGTGTGCCC

---------+---------4---------4---------4---------4---------♦

AGTTCCAAGACGGGTGTACCAGGTGGGGCCACGTGCGCCTAGGGCTCCCACTCACACGGG

KVLPTWSTPVHADPE

1200

1260

1320

	BS	S	S	S
MF	SC	F	DHNA	HNC A Μ M
AO	TR	A	RALU	PCR FAB
EK	NF	N	AEA9	AIF L E 0
11	11	1	2346	211 322
/	/		/	/
TAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCT
ATCTCATCGGACGTAGGTCCCTGTCCGGGGTCGGCCCACGACTGTGCAGCTGGAGCTAGA
		BS	S
M D	M	SC	M ANA M	M S
N D	N	TR	B VLU B	Ν T
L E	L	NF	0 AA9 0	L Y
1 1	1	11	2 246 2	1 1
		/	/
CTTCCTCAGCAC	CTGAíCTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA
GAAGGAGTCCTGGACTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCAGAAGGAGAAGGCGGGTTTTGGGT
A P	E L	L	G G P	SVFLFPPKPK

S		ss			N
AN	M	HW.ANNAC	DM	M	NS
UL	N	PNVCLUR	DS	A	LP
3A	L	ALAIA9F	ET	E	AH
A3	1	2121461	12	3	31
		/ / //	/		/

ACCACACCCTCATCATCTCCCGCACCCCTGAGGTCACATGCGTCCTGGTGGACCTCACCC

1441 ---------4---------4-----------₊---------4---------4 1500

TCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTCCAGTCTACGCACCACCACCTCCACTCGG

D T L M

TPEVTCVVVDVSH-

M	DM	M	RM	M
N	DS	B	SA	N
L	ET	0	AE	L
1	12	2	12	1
z ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA

1501 ---------4---------4---------4---------4---------4---------♦ 1560

TGCTTCTCCCACTCCAGTTCAAGTTCACCATGCACCTCCCCCACCTCCACCTATTACGGT

E D	Ρ E V	K F N	W Y V	D	G	V E V Η Ν A K
	F FN				S
M	N NSS	R	M	R	HNC	HH
N	U UPA	S	A	S	PCR	GP
L	4 DBC	A	E	A	AIF	AH
1	H 222	1	2	1	211	11
	//				/
AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCG

TCTCTTTCCCCGCCCTCCTCCTCATCTTGTCGTCCATCCCCCACCACTCCCAGCACTCCC

TKPREEQYNSTYRVVSVLTV-761621

1681

1741

Μ

Ν

L

BS

SC

TR

NF /

R

S

A

TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTCCAAGGTCTCCAACAAACCCC

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 1680

AGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTCGGG

LHQDWLNGKEYKCKVSNKALP S S

Μ T ADNNPMA A

N A VRLLUNU U

L Q AAAAML9 9

1 2244116 6 //// /

TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAG

-------------------4---------4---------4---------4---------4 1740

AGGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCACCCTGGGCACCCCACGCTC

PAPIEKTISKAK

H	M	N	HHN	BSAH	D	M	M	S	R
A	N	L	APA	GFUA	D	N	A	P	S
E	L	A	EAE	LI9E	E	L	E	B	A
3	1	3	321	1163	1	1	3	2	1

GGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCA

---------4·---------+---------+---------4----------4.--------- - 4·

CCGGTGTACCTGTCTCCGGCCGAGCCGGGTGGGAGACGGGACTCTCACTGGCGACATGGT

1800

F SS

Μ N A B R F AHNNCC

N U V B S D VPCCRR

L 4 A V A K AAI1FF

Η 1 1 11 121111 ////

ACCTCTGTCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG

---------4---------4---------4---------+---------4---------4 1860

TGGAGACAGGATGTCCCGTCGGGGCTCTTGGTGTCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCC

GQPREPQVYTLPPSRD1801

1861

1921

	BS	BS	B
s	A	F	SC	SC	S
M	L	0	TR	TR	P
A	U	K	NF	NF	M
1	1	1	11	11	1
/			/	/

ATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG

---------4---------4---------4---------4---------4---------4

TACTCCACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGACGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGC

ELTKNQVSLTCLVKGFYPSD

F

Ν Η B

U P B

A V

H 2 1

ACATCGCCCTGCACTCCGACAGCAATGGGCAGCCGCAGAACAACTACAACACCACGCCTC

TGTAGCCGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCGGCCTCTTCTTGATGTTCTGGTGCGGAG

ESNGQPENNYKTTPP

M

B

N

L

A

H

P

H

B

S

P

M

CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA

---------4---------4----....-4---------4---------4---------₊

GGCACCACCTGACGCTGCCGAGGAAGAAGGACATGTCGTTCGAGTCGCACCTCTTCTCGT

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

1920

1980

1981

2040

F S

NM	MBX	NF	M	N	N
UB	ABM	LA	N	S	L
40	EVN	AN	L	I	A
H2	211	31	1	1	3

/

GCTCGCAGCACGGCAACCTCTTCTCATGCTCCCTGATCCATGACGCTCTGCACAACCACT

2041

2100

CCACCGTCCTCCCCTTGCACAAGAGTACGAGGCACTACGTACTCCGAGACGTCTTGCTGA

F	S	C S V Μ Η E A
M	M	S HNC	CXH
B	N	PCR	FMA
0	L	AIF	RAE
2	1	211	133
		/	/

ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCG

---------4---------4---......4---------4---------4 2150

TGTGCGTCnCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTACTCACGCTGCCCGC

TQKSLSLSPGK·

2101

-79Exemplo 2: Preparação das proteínas de fusão a partir dos sobrenadantes de células COS

Células COS cultivadas em meio DME suplementado com 10% de Soro de Vitela e sulfato de gentamicina a 15 /jg/ml foram passadas para meio DME contendo 10% de NuSerum(Co11aborative Research) e gentamicina para dar 50% de confluência no dia antes da transfecção. No dia seguinte, o DNA de plasmideo purificado por CsCl foi adicionado para uma concentração final de 0,1 a 2,0 pg/ml seguido de DEAE Dextran para 400 pg/ml e cloroquina para 100 ^jM. Após 4 horas a 37°C, o meio foi aspirado e adicionada uma solução a 10% de dimeti1su1fóxido em tampão salino de fosfato ao longo de 2 minutos, aspirada e substituída por DME/10% de Soro de Vitela, 8 a 24 horas mais tarde as células foram tripsinizadas e passadas a 1:2.

Para marcação radioactiva o meio foi aspirado 40 a 48 horas após transfecção, as células lavadas uma vez com tampão salino de fosfatos e adicionado meio DME sem cisteina ou metionina. 30 minutos mais tarde,

5 adicionou-se cisteina e metionina marcadas com S para concentrações finais de 30-60^liCí e 100-200/jCi respectivamente e as células ficaram a incorporar a marca durante mais 8 a 24 horas. Os sobrenadantes foram recuperados e examinados por electroforese em geis de 7,5% de poliacrilamida após desnaturação e redução ou em 5% de po 1 ia cri1amida após desnaturação sem redução. A proteina CD4B γ 1 deu a mesma massa molecular com ou sem redução enquanto que as proteínas de fusão CD4E y'1 e CD4H yl mostraram massas moleculares sem redução de duas vezes a massa observada com redução, indicando que formaram estruturas tipo dimero. As proteínas de fusão CD4-IgM formaram grancfes multimeros para além da resolução do sistema de gem sem redução e os monómeros da massa molecular esperada sem redução.

As proteinas não marcadas foram preparadas deixando as células crescerem durante 5 a 10 dias após transfecção em meio DME contendo 5% NuSerum e gentamic_i_ na como acima. Colheram-se os sobrenadantes, centrifugaram-se e purificaram-se por adsorção em bloco a proteina A Trisacril, proteina A agarose, anticorpo de cabra anti IgG humana agarose, anticorpo de coelho anti-IgM humana agarose ou anticorpo monoclonal anti-CD4 agarose. Os conjugados de anticorpo agarose foram preparados por acoplagem dos anticorpos purificados a agarose activada com brometo de cianogénio de acordo com as recomendações do fabricante e usando uma concentração de anticorpo de 1 mg/ml. Após adsorção em bloco por agitação durante a noite numa mesa rotatória, as esferas foram colhidas por decantação para um funil de vidro com filtro e lavadas algumas vezes no funil com tampão salino de fosfatos contendo 1% do detergente NP40. As esferas foram removidas do funil e vertidas numa pequena coluna de plástico rejeitável coluna Quik-Sep QS-Q,Iso1ab ) , lavada com pelo menos 20 volumes da coluna de tampão salino de fosfatos contendo 1% de Nonidet P40 com 5 volumes de 0,15M NaCl, lmM EDTA (pH 8,0) e eluida pela adição de ácido acético O,1M, ácido acético O,1M contendo 0,1M NaCl ou tampão glicina-HCl 0,25M, pH 2,5.

Exemplo 3: Bloqueio da formação de síncicios pelas proteinas de fusão

As proteinas de fusão purificadas ou parcialmente purificadas foram adicionadas a células HP3-ALL infectadas 12 horas antes com um vírus da vacina recombinante codificador da proteina do invólucro de HIV. Após incubação durante mais 6^8 horas as células foram lavadas com tampão salino de fosfatos, fixadas com formaldeido e fotografadas. Todas as proteinas as proteinas de fusão

de tamanho completo CD4-imunoglobulina mostraram inibição da formação de sincicios numa concentração de 20 jug/ml com excepção da proteina 4H / 1 , a qual foi testada apenas a 5 pg/ml e mostraram inibição parcial da formação de sincicios nas mesmas condições.

Exeiplo 4: Ensaio de Citólise por libertação de crómio

As proteínas de fusão purificadas foram examinadas quanto à capacidade para fixar complemento num ensaio de libertação de crómio usando células infectadas com o vírus da vacina como sistema modelo. Linhas Namalwa (células B) ou HPB-ALL (células T) foram infectadas com o vírus da vacina codificando a proteina do invólucro de HIV e 18 horas mais tarde foram marcadas radioactivamente por 51 incubação em 1 mCi/ml de cromato de sódio em tampão salino de fosfatos durante 1 hora a 37°C. As células marcadas foram centrifugadas para remover o cromato não incorporado e incubadas em poços de microtitu 1 ação com diluições seriadas das proteínas de fusão CD4-imunog1obu1ina e complemento de coelho numa concentração final de 40%. Após 1 hora a 37°C, as células foram bem misturadas, centrifugadas e os sobrenadantes contados num contador garre. Nenhuma libertação especifica pode ser convicentemente documentada.

Exemplo 5: Ligação da proteina CD4E/I a receptores Fc

A proteina de fusão CD4E y1 purificada foi testada quanto à sua capacidade para deslocar IgGl humana marcada radioactivamente dos receptores Fc humanos expressos em células COS em cultura. A IgGl foi mar1 25 cada radioactivamente com iodeto de sódio usando 1 mCi

de iodeto, 100 pg de IgGl e duas iodobeads (Pierce). A proteína marcada foi separada das contagens não incorporadas por passagem numa coluna de Sephadex G25 equilibrada com tampão salino de fosfatos contendo 0,5 mM EDTA e 5% de leite desnatado. Prepararam-se diluições seriadas da proteína de fusão CD4Eyl ou de IgGl não marcado e misturaram-se com uma quantidade constante de traçador IgGl marcado radioactivamente. Após incubação com células COS portadoras dos receptores FcRI e FcRII a 4°C durante pelo menos 45 minutos num volume de 20 μ 1 adicionou-se 200 pl de uma mistura 3:2 de dibutil para diocti1-fta 1 atos e as células foram separadas da marca não ligada por centrifugação numa microcentrifuga durante 15 a 30 segundos. Os tubos foram cortados com tesouras e os sedirentos de células contados num contador de radiação gare. A afinidade da proteína CD4E y1 para receptores foi medida em paralelo com a afinidade da proteína IgGl autêntica e verificou-se ser a mesma dentro do erro experimenta 1 .

Exemplo 6: Expressão estável da construção de fusão pCD4E yl em células de rim de hamster bébé.

Vinte e quatro horas antes da transfecção, 0,5 χ 10θ células de rim de hamster bébé (BHK; ATCC CCL10) foram semeadas num frasco de cultura de 2 cm em meio de Eagle modificadão de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS). As células foram cotransfectadas com uma mistura dos plasmideos pCD4Eyl (20 /jg) , pSV2dhfr(5 pg; Lee et al. , Nature 294:228-232( 1981 ) e pRMH140 (5 ug, Hudziak et al, Cell 31:137-146(1986) de acordo com uma técnica de transfecção com fosfato de cálcio modificada como descrito em Zettlmeissl et a 1 . , (Behring Inst.Res. Comm. 82: 26-34(1988)). 72 h pós-infecção as células foram passadas 1:3 a 1:4 (placas de cultura de 60mm)

e as colónias resistentes foram seleccionadas em meio DMEM contendo 10% FCS, 400 /jg/ml de G418 (Geneticin, Gibco) e meto trexato IpM (meio de selecção) . 0 meio foi mudado duas vezes por semana. As colónias resistentes (40-100/transfecção) surgiram 10-15 dias após a transfecção e foram ainda propagadas como uma mistura de clones (i.e., BHK-MKl)ou como clones isolados individualmente. Para a determinação dos níveis de expressão relativa, as misturas de clones ou clones individuais foram cultivadas atê à confluência em frascos de cultura T25, lavadas duas vezes com meio DMEM sem proteina e incubadas durante 24 horas com 5 ml de meio DMEM sem proteina. Estes meios foram colhidos e sujeitos a uma ELISA especifica de IgG humana para determinar os níveis de expressão relativa da proteina de fusão CD4-IgGl CD4E<1. Para posterior análise escolheu-se um clone individual (BHK-UC3) devido aos seus niveis de expressão relativamente altos.

Exemplo 7: Detecção da proteina CD4E y1 em sobrenadantes de cultura i Para a marcação de células com ³⁵S, o clone BHK-UC3 e as células BHK não transfectadas (testemunha) foram cultivados até â confluência em frascos de cultura T25 e subsequentemente incubados durante duas horas em meio HamFR sem metionina. A marcação foi conseguida por incubação 24 h em 2,5 ml no mesmo meio contendo 100 pCi de S metionina (1070 Ci/mmole, Amersham). Para a preparação dos lisados celulares, as células marcadas foram colhidas em 1 ml de tampão salino de fosfatos, pH 7,2 (PBS) e lisadas por congelação e descongelação sucessivas. Os lisados clarificados (após centrifugação a 20000 rpm, 20 min) e os sobrenadantes de cultura foram incubados com Proteina A-Sepharose (Pharmacia) e o material ligado foi analisado em 10% SDS-Proteina A Sepharose (Pharmacia) e o material ligado foi

-84analisado num gel de 10% de SDS de acordo com Laemm1i(Nature 227: 680-685 ( 1970 )), que foi subsequentemente autorradiogra fado. Uma banda especifica de aproximadamente 80 KDa pode ser detectada apenas no sobrenadante do clone BHK-UC3, a qual está ausente no lisado do clcre BHK-UC3 e nos respectivos controlos.

Exemplo 8: Purificação da proteina CD4E γΊ a partir dos sobrenadantes de cultura

Para demonstrar que a proteina de fusão codificada pelo plasmideo pCD4Ey-l pode ser obtida em grandes quantidades o clone BHK-UC3 foi cultivado em frascos 2 roller de 1750 cm em meio selectivo (500 ml). As monocamadas confluentes foram lavadas duas vezes com meio DMEM sem proteina (200 ml) e ainda incubadas durante 48 horas com meio DMEM sem proteina (500 ml). Os sobrenadantes de cultura condicionados (1-21) e respectivos sobrenadantes das células BHK não transfectadas foram clarificados por centrifugação ( 9000 rpm, 30 min) e microfi1 trados através de uma membrana 0,45 um (Nalgene). Após adição de 1% (v/v) de tampão Tris-HCl 1,9M, pH 8,6, o meio condicionado foi absorvido a uma coluna de Proteina A-Sepharose equilibrada com tampão Tris-HCl 50mM pH 8,6 contendo 150 mM NaCl (4°C). A coluna carregada foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio. A eluição da proteina de fusão CD4-IgGl CD4E 1 foi conseguida com tampão citrato de sódio 0,lM, pH3, seguido de neutralização imediata do efluxo da coluna para pH8 com a base Tris.

As fracções do pico foram colhidas e o conjunto foi analisado num gel de SDS corado com azul Coomassie numa banda do tamanho esperado (80 KDa) e que reagiu com anticorpo policlonal anti cadeia pesada de IgG humana e com um anticorpo monoclonal de murganho anti-CD4 (BMA040, Behringwerke) em transfere^ cias Western. Os rendimentos das proteínas de fusão purifica-85das obtidas pelo processo dado são de 5-18 mg/24/1 de sobrenadante de cultura. 0 respectivo valor para uma mistura de clones BHK (cerca de 80 clones resistentes;BHK-MK1) como descrito atrás foi de 2-3 mg/24 h/1.

Exemplo 9: Caracterizapão fisica e biológica da proteina de fusão CD4E<1

Conforme provado por SDS-electroforese em geis de gradiente de 10-15% (Phast-System, Pharmacia) em condições não redutoras, a proteina de fusão CD4E 1 migra na posição de um homodímero (cerca de 160 KDa) como um anticorpo monoclonal de murganho não reduzido. Este resultado foi suportado por ultracentrifugação de equilíbrio analítico, onde a proteina de fusão se comporta como uma molécula dimérica homogénea com cerca de 150 KDa. 0 coeficiente de absorvância da proteina foi determinado como ^A280⁼ =18cm²/mg usando a determinação quantitativa de proteina de acordo com Bradford(Anal.Biochem. 72:248-254( 1976) ) .

A proteina de fusão CD4Eyl apresenta formação de complexos específicos com uma proteina de fusão pgal-gpl20 solubilizada (pMBl790;Broker et a 1.,

Behring Inst. Res. Commun. 82: 338-348 (1988)) expressa em _E. coli. Nesta proteina (110 KDa) uma parte importante da proteina gp!20 de HIV (Va1₄g-Trp^g) é fundida à ^-galactosidase (aminoácidos 1-375). Numa experiência testemunha uma proteina de fusão de 67KDa Bgal-HIV 3' orf (pgalI-375;

3' orf Pro 14-Asp 123) não mostrou formação de complexos. Nestas experiencias, a proteina CD4Efl foi incubada com a respectiva proteina de fusão em proporções molares de cerca de 5:1. 0 complexo foi isolado por ligação a Proteina A-Sepharose e as proteínas ligadas à Proteina A-Sepharose -- juntamente com testemunhas relevantes-- foram analisadas em geis de SDS gradiente 10-15% (Phast-System,Pharmacia ).

-86A proteina de fusão CD4Eyl liga-se à superfície de linfócitos T4 em cultura infectados com HIV (ΗIV1/HTLV-111 B ) conforme determinado por imunofluorescência directa com proteina CD4Efl marcada com isotiocia nato de fluorescência (FITC). Ela bloqueia a formação de sincícios em linfócitos T4 em cultura quando da infecção com HIV (0,25 TCID/célula) numa concentração de 10 pg/rnl.Ainda, os linfócitos T4 em cultura (subclone da linha celular H9) infectados com HIV são mortos selectivamente quando da incubação com CD4E<1 na presença ou ausência de complemento. A uma cultura de linfócitos T4 (10⁶ células/ml) altamente infectada com HIV ( 50%), adicionou-se 50, 10 ou 1 pg/ml da proteina de fusão CD4E 1 na presença ou ausência de complemento de porquinho da Irdia. As células foram observadas quanto à morte especifica pela proteina de fusão, a qual é definida pela percentagem de células mortas após 3 dias em relação âs células viáveis na cultura no começo da experiência corrigido para os valores de morte inespecifica.observa do nas culturas testemunhas sem a proteina de fusão 004ΕγΊ (Tabela 5, Experiência I). Surpreendentemente, a adição da proteina CD4E^1 às células T4 infectadas na ausência do complemento resultou em taxas de morte especifica semelhante às na presença do complemento (Tabela 5, Experiência II). Este resultado demonstra um efeito citolitico independente do complemento de CD4Ey1 nos linfócitos T em cultura infectados por HIV.

Tabe1 a 5

No. Experiência Sistema de ensaio Morte especifica(% )

I células T4 não infectadas 0,7 +50 pg/ml CD4Efl + Compl.

células T4 infectadas 35,1 +50 pg/ml CD4Ey4 + Compl.

células T4 infectadas 25,1 +10 pg/ml CD4E_rl + Compl.

células T4 infectadas +1 pg/ml CD4E0 + Compl.

II células T4 infectadas 49,9 +10 pg/ml CD4Eyl + Compl.

células T4 infectadas 69,4 +10 pg/ml CD4E_Y1 + Compl.

Tendo agora descrito este invento ra sua totalidade, poderá ser apreciado pelos familiarizados corr a matéria que o mesmo pode ser efectuado com qualquer gama larga de parâmetros equivalentes de composição, condições e métodos de preparação de tais proteínas de fusão sem se afastar do espirito e âmbito do invento ou de qualquer uma das suas execuções.

Claims (46)

1*. - Método para a produção de ura gene codificador de uma proteína de fusão que é capaz de ser secretada, caracterizado por se incorporar no referido gene 1) a sequência de DNA de CD4 extracelular ou ura seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV quando fundido com uma cadeia de imunoglobulina e 2) a sequência de DNA de uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que a sequência de DNA que codifica pelo menos a região variável da referida cadeia de imunoglobulina foi substituída pela sequência de DNA que codifica CD4 extracelular ou o referido fragmento de ligação a gpl20.

2·. - Método para a produção de um gene de proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a sequência de DNA, que codifica o referido fragmento de CD4, compreender a seguinte sequência de DNA:

CAATGAACCGGG

- +.......... 120

GTTACTTGGCCC

GAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTC 121 .........+.........+................+.........+.......... jaó

CTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCGGTGAG

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTT

181 .........+.........+.........+-........+.........+.......... 240

TCCCTTTCTTTCACCACGACCCGTTTTTTCCCCTATGTCACCTTGACTGGACATGTCGAA

CCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAA

241 .........+.........+.........+--.......+.........+.......... 3oo

GGGTCTTCTTCTCGTATGTTAAGGTGACCTTTTTGAGGTTGGTCTATTTCTAAGACCCTT

ATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA

301 ........- +.........+......--- +.........+---------+----------360

TAGTCCCGAGGAAGAATTGATTTCCAGGTAGGTTCGACTTACTAGCGCGACTGAGTTCTT

GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACT

361 ---------+.........+.........₊.........+........_₊.......... 420

CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAAGGGGGACTAGTAGTTCTTAGAATTCTATCTTCTGA

-89CAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCG

421 ---------+---------+ --.......+---------+---------+ -.........4θο

GTCTATGAATGTAGACACTTCACCTCCTGGTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC

GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTC

481 ---------+---------+........-+--CTAACTGACGGTTGAGACTGTGGGTGGACGAAG ou uma sua variante, degenerada.

3·. - Método para a produção de um gene de proteina de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracter1zado por a referida sequencia de DNA que codifica o referido fragmento de CU4 compreender a seg uínte . sequencía de DNA:

CAATGAACCGGG

- +---------- 120

GTTACTTGGCCC

GAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTC 121 .........+ ---......+.........+.........+---------+---------- 180

CTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCGGTGAG

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTT 181 ---------+---------+.........+.......--+---------+--........ 240

TCCCTTTCTTTCACCACGACCCGTTTTTTCCCCTATGTCACCTTGACTGGACATGTCGAA

CCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAA 241 ---------+......--- +.........+.........+---------+ --........ 300

GGGTCTTCTTCTCGTATGTTAAGGTGACCTTTTTGAGGTTGGTCTATTTCTAAGACCCTT

ATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA 301 ----------η---------+—---—+----------1-----------1----------- 360

TAGTCCCGAGGAAGAATTGATTTCCAGGTAGGTTCGACTTACTAGCGCGACTGAGTTCTT

GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACT 361 ---------+---------+.........+.........+ .........+.......... 420

CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAAGGGGGACTAGTAGTTCTTAGAATTCTATCTTCTGA

CAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCG 421 ---------+---------h----------+---------+-------------------- 480

GTCTATGAATGTAGACACTTCACCTCCTGGTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC

GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGG

481 ---------+.........+.........+.........+---------+.......— 540

CTAACTGACGGTTGAGACTGTGGGTGGACGAAGTCCCCGTCTCGGACTGGGACTGGAACC

541

601 ou uma

AGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC __ ______+ ____+— - — - - —h- - -------— ----+--------- - 600

TCTCGGGGGGACCATCATCGGGGAGTCACGTTACATCCTCAGGTTCCCCATTTTTGTATG

AGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAG

--------------------l·---------TCCCCCCCITCTGGGAGAGGCACAGAGTC sua variante degenerada.

4*. - Método para a produção de um gene de proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida cadeia de imunoglobulina ser da classe IgM, IgGl ou IgG3.

5*. - Método para a produção de um gene codificador de uma proteína de fusão que é capaz de ser secretada, caracterizado por se incorporar no referido gene 1) a sequência de DNA de CD4 extracelular ou um seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV quando fundido com uma cadeia de imunoglobulina e 2) a sequência de DNA de uma cadeia leve de imunoglobulina, em que a sequência de DNA que codifica pelo menos a região variável da referida cadeia leve de imunoglobulina foi substituída pela sequência de DNA que codifica CD4 extracelular ou o referido fragmento de ligação a gpl20 de HIV.

6*. — Método para a produção de um gene de proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por a sequência de DNA, que codifica o referido fragmento de CD4, compreender a seguinte sequência de DNA:

-9 1 CAATGAACCGGG

- + -......... 120

GTTACTTGGCCC

GAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTC

121 .........+ --.....-- +......--- + -........+......--- + -......... 180

CTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCGGTGAG

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTT

181 ---------+.........+.........+---------+---------+ -.........240

TCCCTTTCTTTCACCACGACCCGTTTTTTCCCCTATGTCACCTTGACTGGACATGTCGAA

CCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAA 241 ---------+.........+.........+---.....- +---------+---------- 300

GGGTCTTCTTCTCGTATGTTAAGGTGACCTTTTTGAGGTTGGTCTATTTCTAAGACCCTT

ATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA 301 ---------+.........+.........+.........+ --.....--+---------- 360

TAGTCCCGAGGAAGAATTGATTTCCAGGTAGGTTCGACTTACTAGCGCGACTGAGTTCTT

GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACT 361 ---------+.........+.........+......---+-------....... 420

CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAAGGGGGACTAGTAGTTCTTAGAATTCTATCTTCTGA

CAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCG 421 ---------+.........+.........+.........+.......-- +.......... 480

GTCTATGAATGTAGACACTTCACCTCCTGGTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC

GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTC 481 ---------+.........+.........+ --CTAACTGACGGTTGAGACTGTGGGTGGACGAAG ou uma sua variante degenerada.

, 7-. - Método para a produção de um gene de proteina de fusão de acordo com a reivindicação 5

-92caracterizado por a s e n u e n c i a de DNA que codifica o referido fragmento de CD4 compreender a seguinte sequência de DNA:

CAATGAACCGGG

- +.......... 120

GTTACTTGGCCC

GAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTC

121 ---------+----------1----------+----------1-----------e---------- 180

CTCAGGGAAAATCCGTGAACGAAGACCACGACGTTGACCGCGAGGAGGGTCGTCGGTGAG

AGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTT

181 ---------+---------+----------1-----------e----------e---------- 240

TCCCTTTCTTTCACCACGACCCGTTTTTTCCCCTATGTCACCTTGACTGGACATGTCGAA

CCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAA

241 .........+ ---......+.........+.........+---------+ --........ 300

GGGTCTTCTTCTCGTATGTTAAGGTGACCTTTTTGAGGTTGGTCTATTTCTAAGACCCTT

ATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA

301 .......--+-........+.........+.........+---------+-......... 360

TAGTCCCGAGGAAGAATTGATTTCCAGGTAGGTTCGACTTACTAGCGCGACTGAGTTCTT

GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACT

361 ---------+---------₊.........₊.........₊---------₊---------- 420

CTTCGGAAACCCTGGTTCCTTTGAAGGGGGACTAGTAGTTCTTAGAATTCTATCTTCTGA

CAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCG

421 ---------+---------+-........+---------+---------₊--------·.. 480GTCTATGAATGTAGACACTTCACCTCCTGGTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGC

GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGG

481 ----------1-----------e— -----+----------1-----------1----------- 540

CTAACTGACGGTTGAGACTGTGGGTGGACGAAGTCCCCGTCTCGGACTGGGACTGGAACC

AGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC

541 ----------1----------+----------E----------e----------e---------- 600

TCTCGGGGGGACCATCATCGGGGAGTCACGTTACATCCTCAGGTTCCCCATTTTTGTATG

AGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAG 601 ---------+---------+.........

TCCCCCCCTTCTGGGAGAGGCACAGAGTC ou urna sua variante degenerada.

-938⁴. - Vector caracterizado por compreender o qene de proteína de fusão obtido de acordo com a reivindicação I.

9*. - Vector de acordo com a reivindicação 8, caracterizado oor ter as características ídenti ficadoras de pC04Hy|, que foi depositado em co 1 1 . na ATCC de acordo com os termos do tratado de Budapeste com o numero de acesso 67611.

10^fl. - Vector de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ter as características de identificação d'¹ pCD4M/j, que foi depositado em £. co 1 i na ATCC de acordo com os termos do tratado de Budapeste com o numero de acesso 67608.

ll⁴. - Vector de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ter as caracteristicas de Identificação de pC04Pp , que foi depositado em E. co

11 na ATCC de acordo com o tratado de Budapeste com o numero de acesso 67609.

12*. - Vector de acordo com a reivindicação 8. caracterizado por ter as características de Identificação de pCOAE VI, que foi depositado em co1j na ATCC nos termos do tratado de Budapeste coin o Numero de acesso 67610.

13⁴. - Vector caracterizado por compreender o gene de proteina de fusão obtido de acordo com a reivindicação 5.

14». - Hospedeiro caracterizado por ser transformado com o vector da reivindicação 8.

15^a. - Hospedeiro de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por expressar numa cadeia leve de imunoglobulina juntamente com o produto de expressão do referido gene da proteína de fusão para dar uma molécula do tipo imunoglobulina que se liga a gpl20.

16*. - Hospedeiro caracterizado por ser transformado com o vector da Reivindicação 13.

17*. - Hospedeiro de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por expressar numa cadeia pesada de imunoglobulina juntamente com o produto de expressão do referido gene da proteína de fusão para dar uma molécula do tipo imunoglobulina gue se liga a gpl20 de HIV ou SIV.

18*. - Hospedeiro de acordo com a Reivndicação 17, caracterizado por a referida cadeia pesada de imunoglobulina ser da classe de imunoglobulina IgM, IgGl ou IgG3.

19·. - Método para a produção de uma proteína de fusão que é capaz de ser secretada compreendendo CD4 extracelular, ou um seu fragmento que se liga a gpl20 quando fundido com uma cadeia de imunoglobulina, e uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que pelo menos a região variável da cadeia de imunoglobulina foi substituída por CD4 extracelular ou o referido fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV, caracterizado por:

se cultivar num meio nutritivo em condições de produção de proteina, uma estirpe hospedeira transformada com o vector da Reivindicação 8, compreendendo ainda o referido vector sinais de expressão que são reconhecidos pela estirpe hospedeira referida e que dirigem a expressão da referida proteína de fusão e se recuperar a proteína de fusão assim produzida.

20*. - Método de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por a referida estirpe hospedeira ser uma linha celular de mieloma que produz cadeias leves de imunoglobulina, por a referida proteína de fusão compreender uma cadeia pesada de imunoglobulina da classe IgM, IgGl ou IgG3 e por se produzir uma molécula do tipo imunoglobulina compreendendo a referida proteína de fusão.

21*. - Método para a produção de uma pro teína de fusão que é capaz de ser secretada compreendendo CD4 extracelular, ou um seu fragmento que se liga a gpl20 quando fundido com uma cadeia de imunoglobulina, e uma cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia de imunoglobulina foi substituída por CD4 extracelular ou o referido fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV, caracterizado por:

se cultivar num meio nutritivo em condições de produção adequadas, uma estirpe hospedeira transformada com o vector da Reivindicação 13, compreendendo ainda o referido vector sinais de expressão que são reconhecidos pela estirpe hospedeira referida e que dirigem a expressão da referida proteína de fusão e se recuperar a proteína de fusão assim produzida.

22*. - Método de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por o referido hospedeiro produzir cadeias pesadas de imunoglobulina classe IgM, IgGl e IgG3 juntamente com a referida proteína de fusão para dar uma molécula do tipo imunoglobulina que se liga a gpl20 de HIV.

23*. - Método para a produção de uma proteína de fusão, caracterizado por se incluir na referida proteína CD4, ou um seu fragmento que é capaz de se ligar a gpl20 de HIV ou SIV, fundida no extremo C a uma segunda proteína que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina da classe IgM, IgGl ou IgG3, em que a região variável da re-96ferida cadeia pesada de imunoglobulina foi substituída por CD4 ou seu franmento de ligação a gpl20 de HIV.

24«. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se produzir a proteina de fusão C04H γ 1 .

25«. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se produzir a proteina de fusão CD4Mp.

26*. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se produzir a proteina de fusão C04Pp.

27*. - Método de acordo com a reivindicação 23. caracterizado por se produzir as proteina de fusão CD4E γ 1 .

28*. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se produzir a proteina de fusão CD4Byl.

29«. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se produzir a proteina de fusão de reivindicação 23 que possui uma marca detectável.

30*. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se incluir ainda na referida proteina um agente terapêutico, agente de visualização marcado radioactivamente ou para RMN ligado à referida proteina de fusão.

-9731^a. - Método para a produção de uma molécula tipo imunoqlobulina. caracterizado por se incluir na referida molécula a proteina de fusão da reivindicação 23 e uma cadeia leve de Imunoqlobulina.

32^a. - Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por se produzir uma molécula do tipo Imunoqlobulina compreendendo ainda uma marca detectáve 1.

33^a. - Método de acordo com a reivindicação 31, caracter 1zado por se produzir uma molécula tipo Imunoqlobulina compreendendo ainda um aqente terapêutico, um aqente de visualização marcado radioactIvamente ou para RMN ligado à referida molécula do tipo ímunoglobulina .

34*. - Método para a produção de uma proteina de fusão caracter1zado por se incluir na referida proteina C04 ou um seu fraqmento que se liga a gpl20 de HIV, fundido no extremo C a uma segunda proteina compreendendo uma cadeia leve de Imunoqlobulina de onde foi eliminada a reqião variável.

35^a. - Método de acordo com a rei vlndlcação 23, caracterizado por o referido fragmento de

C1M compreender a sequencia de

V P F R H L L L V L Q L A L L P G K K V V L G K K G D T V E L T Q K K S I Q F H W K N s N Q I K Q G s F L T K G P S K L N D R A s L w D Q G N F P L I I K N L K D T Y I C E V E D Q K E E V Q L L T A N s D T H L L Q

aminoácidos que se segue:

Η N R G

A A T Q

C T A S

I L G N

D S R R

I E D S

L V F G

-9836». - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o referido fragmento de CD4 compreender a seguinte sequencia de aminoácídos:

Μ N R G

VPFRHLLLVLQLALLPAATQ GKKVVLGKKGDTVELTCTAS QKKSIQFHWKNSNQIKILGN QGSFLTKGPSKLNDRADSRR S L W D Q G N F P L I I KN L K I E D S DTYICEVEDQKEEVQLLVFG LTANSDTHLLQGQSLTLTLE SPPGSSPSVQCRSPRGKNIQ GGKTLSVSQ

37*. - Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por se produzir uma proteina que possui uma marca detectável.

38*. - Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por se incluir ainda na referida proteina um aqente terapêutico, um agente de visualização marcado radioactivamente ou para MNR líqado à referida proteína de fusão.

39*. - Método para a produção de uma molécula de tipo imunog1obul i na, caracter1zado por se incluir na referida molécula a proteina de fusão da reivlndicação 34 e uma cadeia pesada de Imunog1obu 11 na da classe IgM, IgG¹! ou IgG3:

-9940«. - Método de acordo com a re l vindicação 39, caracterizado por se produzir uma molécula do tipo imunog1obu1lna compreendendo ainda uma marca detectá ve 1.

41^a. - Método de acordo com a rei vindicação 39, caracterizado por se produzir uma molécula do tipo ImunogIobu 1 ina compreendendo ainda um agente terapêutico, um agente de visualização marcado radioact1vamente ou para RMN ligado â referida molécula do tipo imunog lobu 1 ina.

42·. - Método para a produção de um complexo caracterizado por se incluir no referido complexo a proteina de fusão da reivindicação 23 e gpl20 de Hl V ou S1 V.

43*. - Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por a referida gp!20 ser uma parte de um Hl V ou SIV, ser expressa na superfície de uma célula Infectada por HIV ou SIV ou estar presente em solução.

44*. - Método para a produção de um complexo caracterizado por se incluir no referido ®mplexo proteina de fusão da reiv1nd1 cação 34 e gpl20 de HIV ou SIV.

45*. - Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por a referida gpl20 ser uma parte de um HIV ou SiV, ser expressa ria superfície de uma célula infectada com HIV ou SIV ou estar presente em SOlUÇãO.

-10046^a. - Método para o tratamento de infecções provocadas por HIV ou SIV. caracterizado por compreender a administração da proteina de fusão da reivindicação 23, a um animal, sendo a gama de dosagem diaria de ingrediente activo de 0,01 mq/kq a 50 mg/kq, de preferencia de 0, 1 mg/kg a 1,0 mq/kq.

47^a. - Méiodo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o referido animal ser um humano.

48^a. - Método para tratamento de infecções provocadas por HIV ou SIV, caracterizado por compreender a administração da proteina de fusão da reivindicação 34 a um animal, sendo a gama de dosagem diaria de ingrediente activo de 0,01 mg/kg e 50 mg/kg, de preferencia de 0,1 mq/kq, a 1,0 mg/kg.

49^a. - Método de acordo com a reivindicação 48, caracterízado por o referido animal ser um ser humano.

50^a. - Método para a detecção de gpl20 de HIV ou SIV numa amostra, caracterizado por (a) se pôr em contacto uma amostra suspeita de conter gpl20 de HIV ou SIV com a proteina de fusão da reivindicação 23 e (b) se detectar a formação ou não de um complexo.

51^a. - Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por a referida proteína de fusão possuir uma marca detectável.

-10152³. - Método para a detecção de gpl20 de HIV ou SIV numa amostra caracterizado por (a) se pôr em contacto numa amostra suspeita de conter gpl20 de HIV ou SIV com a proteina de fusão da reivindicação 34 e (b) se detectar a formação ou não de um complexo.

53³. - Método de acordo com a rei vindicação 52, caracterizado por a referida proteina de fusão possuir uma marca detectável.