KR0172969B1 - 인터페론 알파 및 베타에 대해 높은 친화력을 갖는 수용성 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터페론 α 및 β에 대해 높은 친화력을 갖는 수용성 폴리펩티드, DNA 서열 및 발현 세포, 그의 제조 방법, 의약, 이들을 함유하는 조성물 및 진단시약으로서의 용도 또는 항체를 생성하기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

인터페론 α 및 β에 대해 높은 친화력을 갖는 수용성 폴리펩티드

본 발명은 신규 수용성 폴리펩티드, DNA 서열, 신규 세포, 상기 폴리펩티드의 제조 방법, 의약품으로서의 이의 용도 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

인터페론 α 및 β는 다양한 생물학적 특성이 있는 분비 단백질군으로서 이들은 척추동물의 세포 내에서 항바이러스 상태와 항 증식(anti-proliferative) 상태 유도 능력에 의해 특징지워진다(I. Gresser와 M.G. Tovey의 Biochem. Biophys. Acta 516:23/1978년 참조).

인터페론 α는 세포성 및 체액성 면역계, 특히 B세포의 폴리클로날 활성화(M. Peters의 J. Immunol., 137:3153/1986 참조)와 T 세포의 기능 억제(J. Knop 등, J. Immunol., 133:2412/1984 참조)와 조직 적합성(histo-compatibility) 항원의 발현 변형(M. Fellous 등의 Eur. J. Immunol., 9:446/1979 참조)에 대한 중요한 효과를 갖고 있다. 이 모든 과정은 자기-면역석(auto-immunity)의 발생과 관계가 있다.

따라서, 인테페론이 생명체에 대해 이로운 인자로 간주되긴 하지만, 인테페론의 비정상적인 생산은 특정한 병의 병리 현상을 유발할 수 있고, 사실상 자기-면역이라 불리는 다양한 질병과 연결된다. 예를 들면, 인터페론은 다양한 질병을 앓는 환자의 혈청 또는 조직내에 높은 비율로 존재한다. 다양한 질병의 예로는 홍반성 낭창, 류머티스성 관절염, 베체트 증후군, 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 골수 형성부전증 및 복합적인 다발성 면역 결핍증을 들 수 있다. 이 인터페론의 비율과 AIDS 질환 경과의 비관적인 예후 사이에는 직접적인 상관 관계가 있다(E. Buimovivi-Klein 둥의 AIDS Res., 2:99/1986 참조).

인간의 홍반성 낭창의 동물 모델로서 제공되는 자연발생적인 질병을 앓는 쥐의 개체군(NZB)에 있어서 인터페론 α 또는 β의 투여는 병을 악화시키는 것으로 밝혀졌다(H. Heremans 등의 Infect, immun., 21:925/1978; C. Adam 등의 Clin. Exp. Immunol. 40:373/1980 참조).

생쥐에 있어서 다량의 인터페론의 투여는 성장의 억제, 간의 괴사, 사망에 이르는 증상을 유도한다(I. Gresser 등의 Nature, 258:76/1975 참조). 마찬가지로, 암컷 쥐의 태아 기간 동안 어떤 바이러스(임파구축 맥락수막염을 일으키는 바이러스 또는 레오바이러스(Rheovirus))에 의한 감염은 죽음에 이르는 질병을 야기하는 많은 양의 내인성 인터페론의 생산을 동반한다. 항인터페론 α 또는 β 항체의 투여는 상기 증세의 바이러스에 의해 출생시 감염된 생쥐들을 보호한다(Y. Riviere 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:2135/1977; Y. Riviere 등의 J. Exp. Med., 152:633/1980; T. Clark 등의 J. Virol, 59:728/1986 참조). 이 실험은 이러한 질병의 발병에서의 인터페론의 유해한 역할에 대한 설득할 만한 증거를 보여준다.

게다가 NK 세포의 활성화와 조직 적합성 항원의 발현의 변형은 둘다 인터페론 α 또는 β에 의해서 조절되고 골수 이식 거부에 중요한 역할을 한다(C. Ohien 등의 Science, 246:66/1989 참조). 특히 인터페론 α 또는 β의 생산은 부모 골수의 이식에 대한 F1 잡종 쥐의 저항성에서 중요한 요인 중의 하나임을 보여준다.(Afifi 등의 J. Immunol., 134:3739/1985 참조). 쥐의 항 인터페론 α 또는 β 혈청으로 F1 쥐 또는 동종 쥐를 치료하면 동종 또는 부모의 골수 이식과 증식이 가능해 진다(Afifi 등의 문헌, 1985 참조).

인터페론 및 그의 아형(subtype)의 생물학적 효과는 세포 표면에 대해 높은 친화력을 갖는 특정 수용체와 그들의 상호작용에 의해서 발생하는 것으로 알려져 있다(M. Aguet와 K.E. Mogensen의 Academic Press, London, 1983 참조)

현재에는, 자기면역 질병과 자기면역 질병과 관련된 것으로 의심되는 다발성 경화증과 같은 다른 질병에 대한 효과적인 요법은 없다. 자기 면역 유형의 질환의 현재의 치료는 만족할 만하지 못하고 독성을 갖고 있다. 항거부(antirejection) 요법에서 사용된 것들은 이들 병리 현상의 출현을 억제하지만 그 원인을 억제하는 것은 아니며 아주 높은 독성을 갖는다. 따라서, 자기면역 질병과 기관 거부증에 대한 치료 효과가 있고 독성이 감소된 약물을 이용하는 것이 바람직하다.

즉, 자기면역 유형의 질병과 이식 거부증을 방지하기 위해서 치료학적으로 유용할 수 있는 길항제를 주입함으로써 인터페론(α 또는 β)의 작용을 차단하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 효능이 입증된 외부의 면역글로블린을 주입하여 치료하려는 시도는 인간의 치료학적 처치에서는 실용적이지 않다.

따라서, 본 발명은 인터페론 α 또는 β의 활동을 차단하기 위한 길항제로서 인터페론 α 또는 β의 특정 수용체의 가용형을 이용하는 것을 기초로 하는 새로운 시도에 관한 것이다. 유전공학 기술로 제조된 천연 수용체의 변이체들은 국부적이거나 순환적으로 내인성 인터페론 α와 결합하는 능력을 갖고 있으며 세포 표면에 결합되는 부분이 없다. 즉, 이들은 자유롭게 순환하면서, 이들의 특이성으로 인해 인터페론 α 또는 β와만 결합할 수 있다.

인터페론 α 또는 β와 결합하여 이들은 생명체내에서 인터페론 α 또는 β의 작용을 (항체가 그러는 것처럼) 차단할 수 있다.

그러므로, 인터페론 α 및(또는) β의 활성을 차단할 수 있는 생산물을 얻을 필요성이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 인터페론 α 및 β에 대해 높은 친화력을 갖는 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드를 얻는 것이다.

높은 친화력이라는 용어는 해리 상수가 10^-9M 이하임을 의미한다.

수용성은 폴리펩티드가 인체와 같은 생체에서 순환할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서, 혼성체(hybrid)란 본 발명에 따른 수용성 폴리펩티드(즉, 천연 수용체의 가용성 부분, 완전한 수용체의 변형체 또는 예를 들면 치환에 의해 변형된 천연 수용체의 가용성 부분)와 다른 분자, 특히 면역글로불린 또는 면역글로블리 단편과 같은 폴리펩티드형 분자의 융합(또는 결합)에 의해 생성된 산물을 의미한다.

인터페론 α 및 β(또는 인터페론)의 가용성-수용체는 상기한 바와 같은 수용성 폴리펩티드 중의 하나를 의미한다.

표현을 간략하게 하기 위해서 다음에서는 인터페론 α 또는 β의 수용체 대신에 인터페론 수용체라고 한다.

본 발명은 상기 정의한 폴리펩티드 중에서 제1도에 나타낸 서열에 대응하는 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드에 관한 것이다.

이 폴리펩티드는 인터페론 α 또는 β의 원래의 천연 수용체의 세포외 가용성 부분에 해당한다.

물론 상기 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드도 상기 인터페론에 대해 높은 친화력을 갖고 있다. 따라서, 제1도에 나타낸 폴리펩티드는 본 발명의 범위내에 드는, 치환 또는 결실 변이체에 의해 대체될 수 있다.

결실과 관련해서 보자면, 제1도에 대응하는 폴리펩티드에서 1개 이상의 아미노산은 인터페론 α 및 β에 대한 친화력을 해치지 않고서도 삭제될 수 있다.

완전한 천연 수용체에, 특히 그의 가용성 부분이 남도록 결실이 일어나면 세포막에 이들이 결합되는 능력을 잃고 순환할 수 있게 된다.

만약 제2도에 나타낸 인터페론의 완전한 천연 수용체의 서열을 가지고 이야기 한다면, 그 서열의 막횡단(trans-membrane) 및 세포질 영역이 제거될 수 있다.

가용성(순환) 형태를 얻기 위해서는, 예를 들면 막횡단 영역에 해당하는 437-457 잔기 및 458-557 잔기(세포질 영역)를 결실시킨다.

인터페론 α 및 β의 완전한 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드와 아미노산의 완전한 서열이 제2도에 도시되어 있다.

막횡단과 세포질(또는 세포와 세포내) 영역에서 결실을 수행한 경우에는 잠재적인 면역 에피토프를 제거할 수 있다. 막횡단 영역이 결여된 인터페론 α 및 β의 천연 수용체는 재조합 숙주 세포 배지의 상층액으로 분비되는 이점이 있다.

따라서, 본 발명은 제1도 또는 제2도의 서열에 대응하는 폴리펩티드의 결실에 의해서 유도되는 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드에 관한 것이다.

치환 변이체들도 또한 본 발명의 한 부분이다.

이 경우에 전제 아미노산 수를 유지하면서 인터페론 수용체의 서열 중에서 아미노산 1개 이상이 제거되거나 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.

치환은 특히 인터페론 수용체의 가용성 부분과 관계가 있다. 수용체 가용성 부분의 면역학적 동일성이나 기능을 실질적으로 변화시키려면, 치환부에 근접해 있는 폴리펩티드의 3차원 구조를 유지하는 성질, 즉 분자 또는 대부분의 측쇄의 접합체(conjugate) 또는 소수성을 유지하는 특성과 과련해서 가장 의미있는 방식으로 폴리펩티드에 원래 존재하던 것과 다른 서열 또는 아미노산 잔기로 치환하거나 비보존적 치환을 통해 변화시킬 수 있다.

수용체의 특성의 대부분을 변형시키는 치환은 다음과 같은 것이 있다:

- 세릴이나 트레오닐과 같은 아미노산 잔기가 소수성 잔기, 즉 로이실, 이소로이실, 페닐알라닐, 알라닐 또는 발릴에 의해 치환된 것;

- 시스테이닐이 임의의 잔기로 대체된 것;

- 양 전기의 측쇄를 갖고 있는 잔기, 예를 들면 리실, 아르기닐 또는 히스티디닐 잔기가 음전기 잔기, 예를 들면 글루타밀 또는 아스파르틸에 의해 대체된 것; 및

- 부피가 큰(bulky) 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면 페닐알라닐이 그렇지 않은 잔기에 의해 대체된 것.

치환 변이체는 인터페론의 완전한 수용체의 구조와 관련이 있으며, 특히 막횡단 영역과 관련이 있다. 이 부분에 치환이 일어나면, 특히 지방 세포나 막에 대한 상기 폴리펩티드의 친화력을 감소시킴으로써 인터페론 α 및 β 수용체의 가용성 형태가 형성될 것이다.

막횡단 영역은 다른 아미노산의 서열, 예를 들면 호모폴리-뉴클레오티드 DNA 서열에 의해 또는, 5 내지 50개의 동일한 아미노산(예를 들면 세린, 리신, 아르기닌, 글루타민, 아스파르트산) 또는 재조합 숙주-세포의 배양 배지로 가용성 수용체를 분비하게 하는 다른 친수성 아미노산을 함유햐는 임의의 서열에 의해 치환될 수 있다.

따라서, 본 발명은 제1도 또는 제2도의 서열에 대응하는 폴리펩티드를 치환시켜 생기는 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 정보는 치환 또는 결실 및 그러한 변형의 조합을 수행할 수 있음을 보여준다.

일반적으로, 이렇게 얻어진 변이체는 기능적인 막횡단 영역을 갖지 않고, 바람직하게는 세포내(intra-cellular) (세포질) 부분을 갖지 않을 것이다.

상기 수용성 폴리펩티드의 또다른 변이체는 특히 인터페론 α 및 β의 수용체의 특징을 개량시키기 위한 화학적 변형에 의해 생산될 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 리신과 같은 유리 아미노기 또는 시스테인과 같은 설프히드릴기를 함유하는 아미노산 위에 그래프팅된 폴리에틸렌글리콜과 같은 친수성 중합체를 함유할 수 있다.

이러한 변형은 특히 본 발명의 폴리펩티드의 혈장내에서 반감기를 증가시키거나, 용해도를 증가시키거나, 또는 궁극적으로 상기 폴리펩티드의 면역 특성을 저하시킨다.

이러한 변형은 공지된 방법에 의해서 실현될 수 있으며, 특히 미합중국 특허 제4 179 337호에 기재된 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명은 혼성화(또는 접합)된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

접합된 폴리펩티드는, 예를 들면 혼성 폴리펩티드가 투여된 동물에서 면역 반응을 일으킬 수 있거나 또는 가용성 인터페론 수용체를 제외한 폴립펩티드의 다른 부분에 대한 항체와 결합할 수 있는 폴리펩티드와 같은 면역 능력이 있는(immuno-competent) 폴립펩티드를 수반할 수 있다.

그러나, 일반적으로 상기 수용체에 해당하지 않는 에피토프(epitope)는 기존 항체(예를 들면, β-갈락토시다제와 같은 박테리아의 폴리펩티드 단편)에 의해 인지되는 항원을 포함할 것이다.

면역 접합은 시험관 내에서의 가교 결합 또는 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 의해서 형질전환된 재조합 세포 배양에 의해서 수행될 수 있다.

바람직한 조건에서 면역원 물질이 폴리펩티드 결합을 통해 가용성 수용체 또는 가용성 수용체로부터 유도된 단편에 삽입되거나 결합되어, 가용성 수용체에 대응하는 에피토프 및 상기 수용체에 이종성인 1개 이상의 에피토프를 함유하는 선형 폴리펩티드 사슬을 얻는다. 이러한 에피토프들은 수용체 또는 그의 단편과 상용성인 폴리펩티드 사슬 중 임의의 다른 위치에 도입될 수 있다.

이 혼성체는 약리학적으로 허용되는 지지체를 포함하는 제제가 동물에게 투여될 때 인터페론 수용체에 대한 항체의 제조면에서 특히 유용하며; 이 항체는 인터페론의 천연 수용체 또는 가용성 수용체의 정제를 위해서 또는 진단 시약으로서 유용하다.

면역 반응을 일으킬 수 있는 다른 접합된 폴리펩티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 C-단말 영역과 접합된 수용성 폴리펩티드 이외에 펜타히스티딘과 같은 호모폴리머를 포함하는 혼성체를 갖는다. 이어서 이 혼성체는 지지체 위에 고정된 아연 이온과 같은 킬레이트화제를 사용하여 불순물이 섞인 혼합체로부터 혼성체를 흡착 및 용출함으로써 쉽게 분리할 수 있다. 그 다음 가용성 수용체는 예를 들면 효소 분해에 의해서 회수될 수 있다.

가용성 수용체의 분비가 증가되도록 또다른 혼성체를 제조할 수 있다. 이종 시그날 폴리펩티드로 가용성 수용체의 시그날 폴리펩티드를 대체하여 생기는 혼성체는 숙주 세포에 의해 인식되면 숙주 세포가 시그날 폴리펩티드는 절단하고 수용체는 분비한다.

시그날 폴리펩티드는 사용된 숙주 세포의 특징을 기준으로 선택할 수 있고, 박테리아, 효모균, 균류, 식물, 포유동물 또는 바이러스의 서열 등이 있을 수 있다.

바람직한 조건하에서 상기 폴리펩티드는, 특히 인체 조직내에서 그들의 분해를 느리게 하기에 적합한 구조를 갖는 폴리펩티드와 접합된다.

수용체 자체의 가용성 부분 보다 혈장 반감기가 더 긴(보통 혈장 단백질에 비해 20시간 이상) 혈장 단백질과 본 발명에 따른 가용성 폴리펩티드와의 혼성화는 가용 폴리펩티드의 작용 기간을 연장시킬 것이다.

이러한 혈장 단백질로는 혈청-알부민, 아포리포단백질, 트랜스페린, 바람직하게는 G형, 특히 G1형의 면역글로불린 등이 있다.

바람직하게는, 이런 혼성체는 그들이 사용될 동물 또는 인간에게 있어서 면역원이 아니며, 상기 혈장 단백질은 자신들의 평소 생물학적 활성으로 인해 환자에게 불리한 부작용을 일으키지 않을 것이다.

바람직한 수행 조건에서, 본 발명에 따른 수용성 폴리펩티드는 특히 불편 영역(constant region)에서 면역글로불린과 결합될 것이다. 바람직한 면역글로불린은 G형, 특히 G1형이 될 것이다.

면역글로블린과 그 변이체의 일부는 공지되어 있다; 많은 것이 재조합 세포배양에 의해서 제조되었다(Kohler 등의 PNAS, USA, 77, 2197(1980); Morrison 등의 Ann. Rev. Immunol. 2, 239(1984) 참조)

인터페론 α 및 β의 천연 수용체의 세포외 부분의 활성을 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드는 그의 C-말단에 의해서 경쇄(light chain) 또는 중쇄(heavy chain)의 불변 영역의 N-말단에 접합될 수 있다.

가변 영역(variable region)은 이런 방식으로 대체될 수 있으며, 적어도 중쇄의 불변 영역에서 CH2와 CH3 전이 영역(transition region)은 기능적 활성 형태로 유지된다.

이를 위하여, 적당한 DNA 서열을 제작하고 재조합 배양 세포에서 발현시킬 수 있다.

인터페론 α 및 β의 가용성 수용체 보다 혈장 내에서 더 긴 반감기를 갖는 면역글로불린과 다른 폴리펩티드가 동일한 방법에 따라서 상시 수용체 및 이들 변이체와 결합될 수 있다.

인터페론 수용체의 세포외 부분은 메티오닌으로 시작하는 기껏해야 427에서 436의 아미노산을 함유한다(제1도 참조).

일반적으로 결합 영역을 비롯한 세포 영역을 함유하고 있는 서열은 면역글로불린의 서열과 접합될 것이다.

정확한 접합 부위는 결정적으로 중요하지는 않다. 상기한 경계는 표시로서만 고려되며, 인터페론의 가용성 수용체 주변의 다른 부위는 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 분비 또는 결합 특성을 최적 상태로 하는 것을 목적으로 하여 선택될 수 있다. 최적 부위는 일반적인 실험에 의해서 결정될 것이다.

일반적으로 혼성체는 세포내에서 발현되지만, 재조합 숙주 세포의 분비의 정도의 변화가 있음이 밝혀졌다. 다음의 표는 얻어진 다른 면역글로불린-인터페론 수용체 융합체를 보여준다.

(a) RCl

(b) (RCl)2

(c) (RCh)2

(d) (RCl)2(RCh)2

여기서 R은 결합 부위를 갖고 있는 인터페론 α 및 β의 가용 수용체의 세포외 도메인의 일부를 나타내고, Cl과 Ch는 인체 면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 불변 영역을 나타낸다. 상기 구조는 중요한 구조 만을 표현하는데, 예를 들면 이들은 면역글로불린의 결합(J) 영역 또는 다른 영역을 나타내지는 않으며, 더 나아가 이황화 다리 결합(연결)을 나타내지도 않는다. 이런 영역이 결합 활성에 필요할 경부에는, 이 영역은 자신들이 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체, 인터페론 α 및 β의 면역-수용체 또는 면역글로불린 내에서 자연스럽게 점유하는 위치에 있어야 한다.

이들의 예는 상이한 리간드 수용체 부위를 갖는 이중 기능 헤테로-항체에 있어서는 전형적인 것이며 이 부위에서의 VhCh 면역글로불린은 소정의 항원과 결합될 수 있다. 더 복잡한 구조는 다른 부류의 면역글로불린 예를 들면 IgM, IgG2, 3, 4, IgA, IgE, IgD, 바람직하게는 IgG1의 중쇄를 사용할 때 생길 것이다.

바람직한 혼성체는 기능을 발휘하는 면역글로불린 G1을 포함하는 항체의 C-말단 Fc부분과 인터페론 α 및 β의 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 N-말단의 융합으로부터 형성된다. 이 예는 이후에 실험 부분에서 상술할 것이다.

이러한 혼성체는 K쇄 또는 G1쇄의 불변 영역에 C-말단을 통해 결합된 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 최초의 436개의 아미노산 또는 최초의 427개의 아미노산을 함유한다. 제1도에서 나타낸 인터페론 α 및 β의 가용 수용체를 코딩하는 DNA는 PCR반응(Polymerase Chain Reaction; R.K. Saiki 등의 Science. 239, 487-491(1988) 참조)과 실시예에서 보여주는 것처럼 적절한 제한 효소에 의한 분해를 조화시켜 합성된다.

상보적인 올리고뉴클레오티드는 제2도에 나타낸 서열에 근거하면서 IFN(a/b) 수용체의 cDNA의 5' 말단 및 소정의 하류(downstream) 부위에 있는 cDNA 서열에 사용된다.

PCR 반응을 위한 주형으로서 완전한 cDNA() 또는 람다 박테리오 파지를 함유하는 플라스미드를 사용했다. 시판되는 cDNA 라이브러리가 사용될 수도 있으며, cDNA 단편은 공지된 방법(O. Ohara 등의, PNAS 86, 5673-5677(1989), J. Delort 등의 Nucl. Acid. Res. 17, 6439-6448(1989) 참조)에 의해서 제조된 전체 RNA로부터 또는 Poly A+RNA로부터 직접 합성할 수도 있다. cDNA 또는 RNA 라이브러리는 Daudi, Namalwa 같은 인체 세포로부터 또는 본질적으로 같은 결과를 낳는 인체의 지라와 같은 기관으로부터 얻을 수 있다.

인터페론의 수용체는 유일무이한 폴리펩티드인 것으로 보인다. 이 서열은 그럼에도 불구하고 대립형질 변이체(allelic variation)를 갖는다.

DNA 단편은 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 DNA로 삽입되며; 융합체(fusion)가 인간에게 있어서 치료학적인 처치를 위한 것이면, 이 면역글로불린은 바람직하게는 인체 면역글로불린일 것이다.

공지된 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 합성할 수 있다(Adams 등의 Biochemistry 19, 2711-2719(1980) : Gough 등의 Biochemistry 19, 2702-2710(1980) : Dolby 등의 PNAS USA 77, 6027-6031(1980) : Rice 등의 PNAS USA 79, 7862-7865(1982) : Falkner 등의 Nature 298, 286-288(1982) 및 Morrison 등의 Ann. Rev. Immunol, 2, 239-256(1984) 참조)

혼성체를 코딩하는 DNA를 발현시키기 위해 숙주 세포로 형질감염시키는 것이 바람직할 것이다.

만약 숙주가 형질감염 이전에 이미 면역글로불린 중쇄를 생산하고 있다면, 이중기능 헤테로(항체)를 생산하기 위해서 경쇄 인터페론 α 및 β의 가용성 혼성 수용체로 형질감염시키기에 충분하다. 마찬가지로, 숙주 세포가 경쇄를 이미 발현하고 있다면, 중쇄 인터페론 α 및 β의 가용 혼성 수용체를 코딩하는 DNA로 이중기능 항체를 생산하기 위해 형질감염시킬 수 있다. 인터페론 α 및 β의 결합부위를 함유하는 1개 이상의 사슬 및 가변 영역을 함유하는 1개 이상의 사슬이 포함된 이중기능 면역글로불린은, 인터페론 α 및 β에 대해서 및 소정의 항원에 대해서 이중 특이성을 갖는다. 이들은 상기 방법에 의해서 또는 시험관내의 과정에 의해서 생산된다. 후자의 경우에 혼성체의 F(ab)2 단편든 공지된 방법으로 제조된다(미합중국 특허 제4 444 878호의 참조).

이중기능 항체의 생산을 위한 별법은 인터페론 α 및 β 면역글로불린의 가용성 혼성 수용체를 생산하는 세포(예를 들면, 골수종)와 목적하는 항원에 대해 특이성을 갖는 항체를 분비하는 B세포 또는 하이브리도마를 융합시키는 것으로 이루어진다. 이중기능 항체는 이러한 하이브리도마의 배양 상층액으로부터 회수될 수 있다.

본 발명은 상기 수용성 폴리펩티드 또는 특히 폴리펩티드와의 혼성체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열에 관한 것이다.

포유동물의 인터페론 α 및 β에 대해 높은 친화력을 갖는 폴리펩티드는, 예를 들면 영장류의 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체, 인간, 쥐과 동물, 개과 동물, 고양이과 동물, 소과 동물, 말 및 돼지의 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체이다. 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 많은 용도를 갖는다. 특히, 이 서열이나 서열의 일부, 또는 이들의 합성 또는 반합성(semi-synthetic) 카피를 사용하여 인간이나 동물 게놈 라이브러리 또는 다른 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 혼성화시킴으로써 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체와 유사한 다른 DNA 서열을 선별한다. 그러한 DNA, 그의 단편 또는 합성 또는 반합성 카피는 돌연변이에 의한 다른 변이체를 제조하고 인터페론 α 및 β의 가용 수용체의 변이체를 발현하기 위한 출발 물질로서 사용된다. 이런 돌연변이는 돌연변이된 코돈에 의해서 코딩된 아미노산 서열을 변화시킬 수 없거나 또는 변화시킬 수 있다. 돌연변이의 두 유형은 본 발명에 따른 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 생산 또는 사용에 유리할 수 있다. 예를 들면, 이 돌연변이를 통해서, 높은 수준의 생산, 더 간단한 정제 또는 더 높은 결합 활성을 가능하게 할 수 있다.

DNA 서열의 예로서는 제2도의 1-1343 뉴클레오티드의 서열을 들 수가 있다.

인터페론 α 및 β의 천연 가용성 수용체의 변이체를 코딩하는 DNA는, 포유류, 미생물 또는 숙주 세포와 양립하는 바이러스의 전사 및 번역의 조절 요소를 조절하면서 전사 단위로 발현될 수 있는 형태로 존재할 것이다. 적절한 세포의 형질전환, 형질감염 또는 감염 후에, 그러한 벡터는 재조합 폴리펩티드의 발현을 허용한다. 인터페론 α 및 β의 천연 가용성 수용체의 변이체는 적당한 프로모터의 조절하에서 포유류, 효모, 박테리아 세포 또는 다른 세포내에서 발현될 수 있다. 박테리아, 균류, 효모 또는 포유동물 세포의 숙주와 함께 사용하기 위한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌(Pouwels 등의 Cloning Vector : A laboratory manual, Elsevier, New York, 1985)에 기재되어 있고, 관련 부분은 본 명세서에 참고로 인용한다. 발현 벡터는 형질전환된 세포로 선택될 수 있게 하는 1개 이상의 선택 마커 서열 뿐만 아니라 복제 부위(replication site)를 가질 수 있지만 갖지 않아야 한다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 도입된 변이들은 리딩 프레임(reading frame)을 변화시키지 않아야 하고 발현에 불리한 2차 구조를 생산할 수 있는 상보적 서열을 만들지 않아야 한다.

상기한 바와 같이 수용체를 개량하기 위해서 수용체의 특징들을 변화시키는 변이체의 선택이 가능하긴 하지만, 인터페론의 천연 가용 수용체의 폴리펩티드 변이체는 천연 수용체와 거의 동일한 결합 활성을 갖는다.

돌연변이의 부위가 결합되긴 하지만 돌연변이 자체가 결합되는 것은 아니다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이를 최대한 활용하기 위해서는 코돈이나 타켓영역을 무작위로 변이시켜 얻어진 폴리펩티드 변이체를 스크리닝하여 2차 활성의 적절한 조합을 발견할 수 있을 것이다. DNA 내의 주어진 부위에서 치환 돌연변이를 도입하기 위한 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들면 M13 시스템 등이 있다. 사람의 수용체를 코딩하는 DNA는 공지된 임의의 방법으로 얻어질 수 있다. 그 서열을 제2도에 나타냈다.

일반적으로 상기한 폴리펩티드 서열을 클로닝하기 위해서는 원핵생물을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 대장균(E. Coli) 294(ATCC No. 31446)가 특히 유용하다. 또 다른 균주가 사용될 수 있는데 특히, 대장균 X 1776(ATCC No. 31537)이 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 폴리펩티드는 적절한 프로모터의 조절하에서 포유동물, 효모, 박테리아 세포 또는 다른 유형의 세포내에서 발현될 수 있고, 대장균과 같은 원핵 생물계가 본 발명의 재조합 단백질을 발현하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 대장균은 통상적으로 대장균 균주(Bolivar 등의 Gene 2, 95(1977) 참조)로부터 유도된 플라스미드인 pBR322(ATCC No. 37017)의 유도체를 사용함으로써 형질전환된다. pBR 322는 암피실린과 테트라사이클린에 내성인 유전자를 갖고 있기 때문에 형질전환된 세포를 간단하게 판별할 수 있다. 플라스미드 pBR 322 또는 다른 미생물 플라스미드는 재조합 DNA 구조물에서 일반적으로 사용되는 발현 조절 서열을 포함하거나 또는 포함하도록 변형되어야 한다.

그러한 조절 요소로는 ATCC 37121로 입수가능한 락토스(lac) 프로모터(J. Mol. Appl. Genet., 1, 139-147(1981) 참조), β-락타마제 프로모터(Chang 등의 Nature 275, 615(1978) 참조), 트립토판 프로모터(Miozzari J. Bact. 133, 1457-1466(1978) 참조), ATCC 37138로 입수가능한 tac와 같은 혼성 프로모터(H. de Boer 등의 PNAS USA 80, 21-25(1983) 참조)를 들 수 있다. 다른 대표적인 예로는 열불안정성 C 1857 리프레서(Pharmacia Fine Chemicals, 스웨덴 웁살라 소재)와 λ 파지의 프로모터를 함유하는 pPL-λ 또는 trc 프로모터를 함유하는 pKK 223-3과 같은 시판 벡터를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 다른 기능적 프로모터가 적합하다. 그 DNA 서열은 일반적으로 알려져 있어서 그들은 적합한 결합제 또는 어댑터를 사용하여 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 변이체를 코딩하는 DNA와 접합할 수 있다. 박테리아계를 위한 프로모터는 또한 항원 하류를 코딩하는 DNA에 기능적으로 (operatively) 결합된 소위 샤인-달가르노(SD) 서열을 함유한다.

본 발명은 정제된 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 변이체를 유용한 양만큼 생산하기 위한 발현 벡터에 관한 것이다.

적당한 숙주 균주를 형질전환하고 이 숙주 균주를 적당한 배양 밀도로 배양한 후에, 선택된 프로모터는 적당한 방법(예를 들면, 온도 상승 또는 화학적 유도)에 의해서는 활성화되고 미생물은 다시 배양된다. 미생물을 원심분리시켜 모으고 물리적 또는 화학적 방법을 통해 용균시키고 추출물을 추가 정제시켜 회수된다.

미생물은 예를 들면 최대한의 통풍과 성장 조건 및 격렬한 교반 상태로 10ℓ들이 발효 용기에서 발효된다. 바람직하게는 거품 방지제가 사용된다. 배양물은 문헌[Mott 등의 PNAS USA 82, 88(1985)]에 기재된 바와 같은 30℃의 초유도(super-induction) 환경에서 증식시킨다. 활성화(derepression)는 42℃의 온도로 가온시켜서 5 내지 6의 A600 흡광도에 일치하는 배양 밀도에서 이루어지고, 온도변화 후 2 내지 20시간, 바람직하게는 3 내지 6시간이 지나서 모은다. 미생물 덩어리는 먼저 여과에 의해서 또는 다른 방법에 의해서 농축시키고, 4℃에서 10분동안 10000G로 원심분리시키고, 이어서 펠릿을 신속히 응결시킨다. 박테리아 배양에서 생산된 재조합 단백질은 펠릿의 추출에 이어서 1단계 이상의 농축, 탈염 또는 이온 교환 또는 배제 크로마토그래피에 의해 분리된다.

인터페론 α 및 β의 가용 수용체 변이체의 발현에 사용된 미생물은 냉동-해동 사이클, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 화학물질의 사용을 비롯한 적합한 방법에 의해서 용균될 수 있다. 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체는 응집체를 형성하려는 경형이 있는데, 이 응집체는 Tween 80 또는 Triton X 100과 같은 세정제의 존재하에서 추출 및 정제시켜서 감소될 수 있다.

메티오닌으로 시작되지 않는 DNA 서열을 갖는 본 발명에 따른 수용성 폴리펩티드에 대해서, 개시 시그날(initiation signal)은 상류에 추가의 메티오닌 아미노산을 초래하며, 그것은 생성물의 N-말단 잔기를 나타낸다. 추가의 N-말단 메티오닌을 갖는 생성물이 본 발명의 방법 및 조성물에 직접 사용될 수는 있지만, 통상적으로는 미리 이 메티오닌을 제거하는 것이 바람직하다. N-말단 메티오닌을 생체내 또는 시험관외에서 제거하기 위한 표준 방법이 당분야에 알려져 있다.

바람직하게는 시판되는, 맥주효모균(S. Cerevisiae)과 같은 시카로마이세스(Saccharomyces)종을 사용하는 효모계는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는데도 사용될 수 있다.

일반적으로 유용한 효모 벡터는 효모는 물론이고 대장균의 형질전환을 가능하게 하는 복제 개시점(replication origin) 및 선택 마커, 예를 들면 대장균의 암피실린 내성 유전자와 트립토판에서 성장할 수 없는 효모의 변이체에 대한 선택 마커를 제공하는 에스. 세레비제(ATCC 44076로 입수가능)의 trpl 유전자, 및 유전자 상류의 전사를 유도하기 위해 효모 내에서 과발현되는 유전자로부터 얻은 프로모터를 함유한다. 효모 숙주를 위한 적당한 프로모터의 서열로는 3-포스포글리세라이트 키나아제 또는 다른 해당과정 효소의 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들면 PH05, 및 α형 결합 인자의 프로모터를 들 수 있다. 사용될 수 있는 효모의 다른 프로모터는 2-알콜-탈수소효소와 같은 프로모터 영역이다(Russell 등의 J. Biol. Chem. 258, 2674, 1982 참조). 시그날 펩티드, 예를 들면 효모의 이종 단백질의 분비를 가능하게 하는 시그날 펩티드는 프로모터와 상류에서 발현되는 구조 유전자(structural gene) 사이에 삽입될 수 있다(Bitter 등의 PNAS USA, 82, 5330, 1984 참조). 효모의 형질전환 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며 전형적인 기술은 문헌[Hinnen 등의 PNAS USA. 75, 1929(1978)]에 기재되어 있고, 이것은 trp⁺형질전환체가 0.67% 효모의 질소 함유 염기, 0.5% 카사미노산, 우라실 10μg/ml, 2% 글루코스를 함유하는 선택 배지에서 선택되도록 한다. PHO5 프로모터를 갖는 벡터를 함유하는 형질전환된 숙주 균주는 먼저 풍부 배지(rich medium)에서 예비 배양된 후 그 배지의 무기 인산염의 농도를 감소시킴으로써 활성화된다. 이 균주를 통상 기술을 사용하여 배양한다.

재조합 폴리펩티드는, 글리코시다제에 의한 효소적 분해 후 세정제 처리나 프렌치 프레스와 같은 기계적 힘으로 용균될 수 있는 세포 펠릿을 추출한 후 1단계 이상의 농축, 탈염, 이온 교환 또는 배제 크로마토그래피에 의해 얻을 수 있다. 폴리펩티드가 세포벽과 세포막 사이의 공간(periplasmic space)으로 분비되는 경우에는, EDTA와 같이 막의 외층을 손상시키고 재조합 폴리펩티드를 방출시키는 화학물질을 처리하여 회수한다. 폴리펩티드가 배양 배지로 분비되는 경우에는 직접 회수될 수 있다.

포유동물의 세포는 적당한 프로모터의 조절하에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제작된 DNA로부터 유도된 RNA를 사용하여 포유동물의 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체를 생산하기 위해서 무세포 시스템(cell-free system)을 사용할 수 있다.

포유동물의 숙주 세포 내에서의 발현을 조절하는 프로모터는 다른 기원, 예를 들면 B형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 원숭이 바이러스 SV 40, 폴리오마와 같은 바이러스 게놈, 인체 β 글로빈 유전자의 DNase I에 예민한 부분을 갖는 프로모터와 같은 포유동물의 프로모터, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터와 같은 곤충 바이러스 프로모터로부터 얻을 수 있다. 동물 세포에서 발현하기 위해서 아데노-바이러스 2의 후기 주요 프로모터로 부터 유도된 조절 영역이 바람직하게 사용된다.

SV 40의 초기 및 후기 영역은 바이러스의 복제 개시점을 갖는 제한 단편의 형태로 SV 40 바이러스로부터 분리된다(Fiers 등의 Nature 273, 113, 1978 참조).

인체 사이토메갈로바이러스의 초기 인접 영역(early immediate region)은 제한 단편 Hind III로 분리된다(Greenway P.J. 등의 Gene 18, 3556360, 1982 참조). 아데노바이러스-2의 후기 프로모터는 8 내지 17 맵(map) 단위를 포함하는 Hind III 제한 단편의 형태로 분리된다(S. Hu J. L. Manley의 Proc. Natl. Acad. Sciences(USA) 78, 820 내지 824, 1981 참조). 부모형 세포 기원의 진핵 생물 프로모터도 역시 유용하다.

진핵 생물 발현 벡터 중에서 전사는 프로모터 이외에 활성인자(activator)를 갖는 서열을 삽입함으로써 증가된다. 활성인자는 동일한 쪽에서 작용하며 10 내지 300bp를 포함하는 DNA 요소이며, 프로모터의 전사 개시 능력을 증가시킨다. 이러한 많은 활성 인자는 포유 동물의 유전자에 대해 알려져 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, 인슐린 등). 그러나, 일반적으로 진핵생물 세포를 감염시키는 바이러스의 활성인자를 사용한다. 이들 예로는 복제 개시점 후기 쪽(100-270 bp)의 SV40 활성인자, 사이토메갈로바이러스의 초기 인접 프로모터의 활성인자, 아데노바이러스의 활성인자와 복제 개시점의 후기 쪽의 폴리오마 활성인자를 들 수 있다. 진핵생물 세포(효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간)에서 사용된 발현 벡터는 m-RNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 인자의 전사종결 및 스플라이싱에 필요한 서열도 포함할 수 있다. 발현 벡터는 선택 유전자를 함유할 것이다.

포유동물 세포를 위한 선택 마커의 예들은 데히드로폴레이트 환원제, (DHFR), 티미딘 키나아제 또는 네오마이신이다. 이러한 선택 마커가 숙주 포유동물의 세포 내로 형질감염될 경우, 선택 압력하에 있다면 형질전환된 세포가 생존할 수 있다. 일반적으로 2가지 유형의 선택 체계가 사용된다. 예를 들면, CHO DHFR-세포 또는 쥐의 LTK 세포와 같이 그 증식이 특정 성분으로 보강된 배지에 의존하는 변이주를 사용한다. 이들 세포는 티미딘 또는 하이포크산틴의 첨가 없이는 증식할 수 없고, 이들 세포는 DHFR이나 TK의 기능적 유전자가 형질감염에 의해서 도입된다면 생존한다. 따라서 DHFR이나 TK 유전자에 의해서 형질전환되지 않은 세포는 보강되지 않은 배지에서는 성장할 수 없다.

또한, 돌연변이 세포를 필요로 하지 않는 우성 선택법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 형질감염된 세포에 독성 물질에 대한 내성을 제공하는 유전자를 형질감염시키고 발현한다(Southern Berg, J. Molec. Appl. Genet. 1, 327(1982); Mulligan Berg Science, 20, 1422(1980); Sugden 등의 Mol. Cell. Biol. 5, 410-413(1985) 참조).

세포의 특정 염색체 영역의 증가 또는 복제는 증폭이라 불리우고, 예를 들면 DHFR을 불활성화시키는 메토트렉세이트(methotrexate)(MTX)와 같은 선택 물질을 사용하여 증폭을 야기시킬 수 있다. DHFR 유전자 카피의 증폭 또는 증가시키면 더 많은 양의 MTX를 사용할수록 DHFR은 더 많이 생산된다. 증폭의 정도는 배양 배지 내의 MTX 농도에 따라 증가한다. 목적하는 유전자의 증폭은 목적하는 유전자 및 염색체 내에서 동시통합된 DHFR 유전자의 동시 형질감염에 의해서 얻어진다. 목적하는 유전자와 DHFR 유전자의 동시 증폭 후에, 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자는 목적하는 단백질을 더 많이 발현한다.

본 발명에 따른 인터페론의 가용성 수용체의 변이체의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 원숭이의 신장 세포를 비롯한 포유 동물의 세포들이다(COS-7, ATCC CRL 1651 및 중국의 햄스터 세포, CHO-DHFR-, Urlaub Chasin, PNAS(USA), 77, 4216, 1980 참조).

포유 동물 세포의 형질전환 방법은 잘 알려져 있으며 바람직한 방법은 문헌[Graham F. Van der Eb(Virology 52, 456-457 1973)]에 기재되어 있고 이것은 인산 칼슘에 의한 DNA의 침전법을 사용한다. 다른 방법은 문헌[G. Chu 등의 Nucl. Acid, Res. 15, 1311-1326, 1987]에 기재된 바와 같은 전기 천공법이다. 핵으로의 주사 또는 원형질체와의 융합과 같은 다른 형질감염법도 사용될 수 있다.

목적하는 조절 서열 및 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터는 공지된 표준 방법에 의해 제작된다(Maniatis T. 등의 Molecular Cloning, 133-134, Cold Spring Harbor 1982; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubrel 등에 의해 편집, 1987, Greene Publishing Associates Wiley-Interscience사 출판 참조). 플라스미드 또는 분리된 DNA 단편들은 목적하는 형태로 잘려지고, 일정 크기로 만들어지고, 다시 스플라이싱된다.

플라스미드의 정확한 서열은 대장균 HBI01 또는 대장균 K12 294(ATCC 31446)에서 라이게이션(ligation)혼합물로 형질전환된 후에 결정된다. 암피실린에 내성인 형질전환체들이 선택된다. 플라스미드를 형질전환체로부터 분리하고 제한효소나 공지된 서열 확인 방법으로 분석한다(Messing 등의 Nucl. Acid Res. 9, 309(1981) 또는 Maxam 등의 Methods in Enzymology 65, 499(1980) 참조).

일반적으로 숙주 세포는 발현 벡터에 의해서 형질전환되고 그 후에 숙주 세포는 프로모터가 발현을 유도할 수 있도록 하는 물질, 형질전환체를 선택하기 위한 물질 또한 유전자를 증폭시키기 위한 물질이 함유된 적당한 배지에서 배양된다. 온도, pH와 같은 배양 조건은 발현시키기 위해서 선택된 배양을 위해서 사용되며, 그것은 당업계의 숙련인에게 공지된 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포의 상층액으로부터 분리되고 정제된다. 전형적으로 이러한 상층액은 한외 여과에 의해서 농축시키고, 이온교환 크로마토그래피에 의해서 또는 목적하는 폴리펩티드를 흡착시킨 후 그들을 용출시키는 면역-친화법에 의해서 정제한다. 항원은 응집체를 형성하려는 강한 경향이 있다. 따라서, Tween 80, Triton X 100 또는 CHAPS와 같은 세정제를 정제시키는 동안에 삽입시키는 것이 유리하다. 최종 생성물은 세정제를 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않는 알부민 같은 단백질로 안정화될 것이다.

그러나, 모든 숙주 세포뿐만 아니라 모든 벡터 또는 발현을 조절하기 위한 서열은 모든 발현 시스템에 대해서 동일한 방식으로 기능하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 당업계의 숙력인은 본 발명의 범주에서 벗어나지 않으면서 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 세포 중에서 선택할 것이다. 예를 들면, 단세포 숙주는 선택된 벡터와의 사용성, 본 발명의 DNA 서열에 의해서 코딩된 생성물의 독성, 분비(secretion)의 특징, 단백질의 정확한 폴딩(folding)의 특성, 발효 요건 및 본 발명에 따른 DNA 서열의 발현 후에 재조합 생성물의 정제의 용이성을 고려하여 선택해야 한다.

이들 변수 중에서, 당업계의 숙련인은 동물 세포, 예를 들면 CHO 또는 COS-7 세포의 대규모의 발효 또는 배양시에 본 발명에 따른 DNA 서열을 발현시키는, 다른 벡터 시스템/발현 조절 시스템/숙주 세포의 조합을 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 서열의 발현후에 생성된 폴리펩티드는 동물 세포의 발효 또는 배양물로부터 분리되고 종래 방법을 조합하여 이용함으로써 정제될 수 있다. 당업계의 숙련인은 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 가장 적절한 분리 및 정제 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명은 상기 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 및 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포가 적절한 영양 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 폴리펩티드는 면역조절제로서, 특히 면역억제제로서 유용하며, 자기면역 질환과 이식 거부증의 치료에 사용된다.

또한, 본 발명은 상기 정의한 수용성 폴리펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 의약에 관한 것이다.

본 발명은 상기 정의한 의약 중의 하나를 활성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물에 관한 것이다.

정제된 폴리펩티드는 약리학상 허용되는 통상의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 본 발명에 의한 폴리펩티드의 면역-치료학적 유효량 및 제약상 허용되는 지지체를 함유한다. 본 발명에 따른 조성물은 다양한 형태, 예를 들면 정제, 환제, 분말제, 주사액, 주입액 형태의 고체, 반고체 및 액체로 존재한다. 바람직한 형태는 치료 용도와 투여 방법에 따라 다르다. 일반적으로 본 발명의 제약 조성물은 제약상 중요한 다른 폴리펩티드를 위해서 사용된 것과 비슷한 조성물과 방법을 사용하여 투여될 것이다. 폴리펩티드는 멸균수를 타면 원래 상태로 회복되는 동결건조된 형태로 보관하다가 투여 직전에 멸균수에 용해시켜서, 일반적인 경로, 예를 들면 비경구, 피하, 정맥내, 근육내 또는 병변내 주사 방법에 의해서 투여된다. 유효 투여량은 매일 체중 1kg 당 1 내지 5mg의 양일 수 있다. 고투여량의 두배를 초과할 정도로 강하거나 약한 투여량은 독성 없이 주사될 수 있어야 한다.

본 발명에 따른 의약은 인터페론 α 및 β의 비정상적인 생산물이 해로운 환자, 예를 들면 홍반성 낭창, 베체트 중후군, 재생불량성 빈혈, 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염 또는 중증 면역결핍증에 걸린 환자 또는 AIDS에 걸린 환자에게도 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물도, NK 세포의 활성화 또는 조직 적합성 항원의 발현과 같은 면역 활성을 변화시키는 능력이 있기 때문에 기관 이식 거부증을 앓는 환자에게 치료학적 처치로서 투여될 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 그 특성 및 작용 메카니즘으로 인해 글루코코르티코이드와 같은 화학적 면역억제제의 것과 같은 일반적 독성이 없으며, 따라서 현재의 임상용도의 의약(예를 들면 면역계의 모든 요소를 위한 사이토킨 중의 세포 분열과 합성을 억제하는 아드레날린 코르티코스테로이드 또는 면역계의 활성화를 선택적으로 억제하고 증가를 나타내지만 많은 수의 비면역학적 독성 효과를 갖는 시클릭 운데카펩티드, 즉 시클로스포린과 같은 면역 억제 물질 또는 그의 유도체(N. Engl. J. Med., 321:25, 1725-1738, 1989 참조)}에 비해 큰 발전을 보여준다.

본 발명에 따른 조성물은 인터페론 α 및 β와 다른 아고니스트 또는 길항제를 조절하는데 사용될 수도 있다.

정제된 형태의 본 발명에 따른 조성물은 또한 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 결합 부위의 삼차원적 구조를 결정하는데 유용하다. 이 구조는 항종양 및 항바이러스제로서 유용한 아고니스트 또는 면역억제제로서 치료학적으로 유용한 길항제를 합성하기 위한 모델이 되는 구조를 추론하기 위해 분자 디자인을 형성하기 위한 사전 조건이다.

마지막으로, 본 발명은 진단제로서 상기 정의된 폴리펩티드의 용도 및 항인터페론 α 또는 β항체의 제조에 관한 것이다.

다음 실시예로써 본 발명을 예시하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

천연 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체 및 포유동물에서 분비되는 인터페론 수용체 변이체의 발현을 위한 벡터의 제작

1. 천연 인터페론을 발현하기 위한 플라스미드의 제작

완전한 cDNA를 포함하고 천연 인터페론 α 및 β의 수용체를 코딩하는 DNA 단편을 PCR 반응을 통해 합성했다. 반응을 위한 주형으로서는 인터페론 α 및 β의 수용체의 완전 길이 cDNA를 포함하는 제2도의 λ ZAP 박테리오파지를 사용하고 프라이머로서는 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 특히, λ ZAP 박테리오파지를 cDNA 5' 말단에서 안티센스 가닥에 상보적이며 아래의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 올리고 0: 5'-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3' 및 cDNA의 3' 말단에서 센스 가닥에 상보적이며 아래의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 1쌍의 합성 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션시켰다.

올리고-1: 3'-CAAAAAGTCGTCCTCAATGTGACCATGGCC-5'

이 올리고뉴클레오티드는, PCR 반응을 마친 후, 얻어진 이중 가닥 DNA 단편은 5' 말단에서는 제한 효소 Pst1에 대해, 3'-말단에서는 제한 효소 Kpn1에 대한 제한 부위를 포함하도록 제조되었다.

PCR 반응은 100㎕의 반응 용적의 PCR 완충액 중에서 실시되었고 이 완충액에는 각각 1mM의 프라이머, 100pg의 λ ZAP 박테리오파지와 Taq 폴리머라제 1유닛을 포함했다. 반응 조건은 아래와 같았다.; 25주기, 1주기는 95℃에서 1분동안 인큐베이션(변성), 37-40℃에서 3분 동안 인큐베이션(혼성화), 72℃에서 4분 동안 인큐베이션(중합)시키는 것이다. 마지막 주기 후에 반응을 72℃에서 10분동안 계속하고 시료는 4℃에서 저장하였다. 반응 생성물을 클로로포름으로 추출하였고, 에탄올을 사용하여 침전시킨 후에, 그 생성물을 Kpn1과 Pst1에 의해 계속 분해하였다. 1.7kb 단편(단편 1)은 낮은 융점의 아가로스 상에서의 전기영동후에 회수되었고 발현 벡터 pSVAdpA1에 연결되었다.

pSVAdpA1은 다음과 같이 제조되었다.

SV 40 서열을 pSV2 DHFR 플라스미드(Subrami 등의 Molec. Cell. Biol. 1, 854-864(1981) 참조)로부터 얻었다. 이들은 복제 개시점, 활성인자 및 초기 및 후기 프로모터 (Pvull-HindIII 단편)와 스플라이싱 부위(공여체 및 수용체)에 의해 둘러싸인 t 항원의 인트론 및 초기 영역의 폴라이데닐화 부위(Bg1 II-Eco RI 단편)를 포함한다.

2-아데노의 주요 후기 프로모터의 영역은 플라스미드 pAdD26SVpA(단편 EcoRI-PstI)로부터 얻어졌다(kaufman Shimke, P. A., J. Mol. Biol. 159, 601-621(1982) 참조). 이 영역은 프로모터, 삼분된(tripartite) 리더(Zain 등의 Cell. 16, 851, 1979) 및 혼성 스플라이싱 부위를 포함한다. 이 혼성 스플라이싱 부위는 2-아데노의 공여체 스플라이싱 부위와 면역글로블린의 가변 영역의 수용체 스플라이싱 부위로 이루어진다.

복수 클로닝 부위는 pUC18 플라스미드에서 발견된 부위와 같다. 이것은 pstl, Sal I. Acc I, Hinc II, Xba I, Bam HI, Xma I, Sma I, Kpn I, Sac 1, Ban II, EcoRI에 대한 제한 부위를 포함한다.

플라스미드는 대장균의 복제 개시점과 암피실린 내성 유전자를 포함하며, 플라스미드 pML로부터 유래되었다(Lusky Botchan, Nature 293, 79-81, 1981 참조).

pSVAd 1은 Kpn1과 Pst1로 계속적으로 분해된 후 포스파타제로 처리되었고 플라스미드의 대부분을 포함하는 단편(단편 2)이 낮은 융점의 아가로스 상에서의 전기영동에 의해서 분리되었다. 단편 2를 단편 1과 연결하고 결합 혼합물은 수용성(competent) 대장균 HB101 세포로 형질감염되었다. 배양 배지에 암피실린이 함유된 페트리 디쉬에 형질전환된 배양물을 부었고 암피실린 내성 콜로니를 선택했다. 이런 형질전환체로부터 DNA 플라스미드를 정제하고 서열이 정확한지 여부를 확인하기 위해서 제한 효소를 사용하여 정확한 삽입체의 존재 여부에 대해 분석하고 5' 및 3' 말단에서의 삽입체의 연결부의 분석을 위해서는 서열을 분석했다.

플라스미드 pSVAdIFRpA는 포유동물의 세포내에서 천연 세포 수용체를 발현하기 위해서 사용되었다.

2. 인터페론 α 및 β의 수용체의 분비된 변이체를 발현시키기 위한 플라스미드의 제작

다른 카르복실 말단기를 갖는 수용체의 다른 결실부를 포함하고 수용체의 분비된 형태를 코딩하는 DNA 단편을, PCR 반응을 이용하여 합성하였다. 더욱 상세하게 말하면, 수용체의 완전한 cDNA를 포함하는 λ ZAP 박테리오파지를, 프라이머로서 기능하며 5'-말단에서 안티 센스 가닥에 상보적인 다음 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드

5' 말단 올리고:5'-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3' 및 cDNA의 다른 위치에서 센스 가닥에 상보적이며 다음 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 다른 쌍의 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션시켰다.

3' 말단 올리고 1: 3'-GGTCCTTTATGGAGATTTACTCCATGGCC-5'

3' 말단 올리고 2: 3'-TCACTGCGACATACACTCACTCCATGGCC-5'

3' 말단 올리고 3: 3'-GTCAGACCTTTGTGCGGAACTCCATGGCC-5'

3' 말단 올리고 4: 3'-GTCACACAGAAAGGAGTTTACTCCATGGCC-5'

3' 말단 올리고 5: 3'-CTCTGATGAATAACAGATACTCCATGGCC-5'

이 올리고뉴클레오티드는, PCR 반응을 마친 후, 얻어진 이중 가닥 DNA 단편은 5' 말단에서는 제한 효소 Pst1에 대해, 3'-말단에서는 제한 효소 Kpn1에 대한 제한 부위를 포함하도록 제조되었다.

PCR 반응은 00μl의 반응 용적의 PCR 완충액에서 실시되었고 그 버퍼는 각각 1 μM의 프라이머, 100pg의 λ ZAP 박테리오파지와 폴리머라제 Taq 1 단위를 포함했다. 반응 조건은 아래와 같았다.; 25주기, 1주기는 95℃에서 1분 동안 인큐베이션(변성), 37-40℃에서 3분 동안 인큐베이션(혼성화), 72℃에서 4분 동안 인큐베이션(중합)시키는 것이다. 마지막 주기 후에 반응을 72℃에서 10분 동안 계속하고 시료는 4℃에서 저장하였다. 반응 생성물을 클로로포름으로 추출하였고, 에탄올을 사용하여 침전시킨 후에, 그 생성물을 Kpn1과 Pst1으로 계속 분해하였다. 목적하는 단편들을 낮은 융점의 아가로스 상에서의 전기영동 후에 회수했다. 회수된 단편의 길이는 대략 다음과 유사하다.

반응 1(5' 말단 올리고 + 3' 말단 올리고 1) : 1.3 Kb 단편 3

반응 2(5' 말단 올리고 + 3' 말단 올리고 2) : 1.3 Kb 단편 4

반응 3(5' 말단 올리고 + 3' 말단 올리고 3) : 1.1 Kb 단편 5

반응 4(5' 말단 올리고 + 3' 말단 올리고 4) : 0.9 Kb 단편 6

반응 5(5' 말단 올리고 + 3' 말단 올리고 5) : 0.6 Kb 단편 7

3-7 DNA 단편을 따로따로 발현 벡터 pSVAdpA1에 연결시켰다.

플라스미드 pSVAd 1을 Kpn1과 Pst1로 차례로 분해한 후 포스파타제로 처리했으며 플라스미드의 대부분을 포함하고 있는 단편(단편 2)을 저융점 아가로스 상에서 전기영동하여 분리했다. 그리고 단편 2는 단편 3 내지 7에 각각 별도로 연결되었고 이 결합 혼합물로 수용성 대장균 HB101 세포를 형질전환시켰다. 증식 배지에 암피실린을 함유하는 페트리 디쉬 위에 형질전환된 배양물을 부었고, 암피실린 내성 콜로니를 선택했다. 이 형질전환체로부터 DNA 플라스미드를 정제하고, 그 서열이 정확한지 여부를 확인하기 위해 제한 효소로 분석하여 정확한 삽입체의 존재를 확인하고, 5' 및 3' 말단에서 삽입체의 연결부를 분석하기 위해서는 서열화로 분석하였다.

플라스미드는 pSVAdsIFlpA, pSVAdsIFR2pA, pSVAdsIFR3pA, pSVAdsIFR4pA, pSVAdsIFR5pA라고 한다. 이들은 포유 동물 세포내의 가용성 수용체 및 가용성 수용체의 단편을 발현하는데 사용되었다.

[실시예 2]

CHO 세포에서의 발현

가용성 수용체의 일시적인 발현을 일단 시험한 후, 계속적으로 가용성 수용체를 발현시키는 안정된 세포주를 정했다. 이를 위해서, 숙주 세포로서 디하이드로폴레이트 환원제가 없는 균주를 사용했다; CHO DUK-X 주(F. Kao 등의 PNAS USA, 64, 1284-91, 1969, Chasin L. Urlaub G., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216-80, 1980 참조). 이 시스템을 이용하여, 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 각 구조물과 마우스의 DHFR 유전자를 포함하는 pSV2DHFR로 동시에 형질감염시켰다(Subrami 등의 Molec. Cell. Biol. 1, 854-864, 1981 참조). 이 동시 형질감염을 수행하기 전에, 모든 플라스미드는 제한 효소로 잘라 선형화하고, 형질감염 이전에 각 플라스미드는 따로따로 플라스미드 IFR에 대한 SV2DHFR의 몰비가 1:10이 되도록 플라스미드 pSV2DHFR과 혼합되었다. 이것은 형질감염체 당 IFR 유전자의 카피수를 최대화한다. 플라스미드는 재조합에 의해서 숙주 세포의 염색체와 통합될 수 있는 중합체를 형성하기 위해서 세포내에서 연결된다(Haynes Weissmann의 Nucl. Acids. Res. 11, 687-706, 1983; Scahill S. J. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 465~58, 1983 참조). 뉴클레오시드가 없는 배양 배지인 α 배지에서 마우스의 DHFR을 발현하는 형질감염체를 선택했다. 그리고 DHFR을 높은 수준으로 발현시키는 세포를 선택하기 위해서 메토트렉시이트(MTX)(DHFR에 연결하는 폴레이트의 독성 유사체)을 첨가했다. MTX의 내성은 DHFR의 높은 발현 수준에 기인하여, 증폭 단위라 불리우는 긴 염색체 부분을 포함할 수 있는 DHFR 유전자 증폭의 결과이다(Kaufman Sharp의 Molec. Cell. Biol. 1, 1069-1076, 1981 참조). 따라서, DHFR 서열과 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 동시 통합으로 인해 인터페론 α 및 β의 가용 수용체의 유전자의 증폭이 가능해진다.

안정하게 형질감염된 세포주는 10% 태송아지 혈청으로 보충된 선택 성장 배지(DMEM/HAM F12 1:1)(Gibco)에서 클로닝시켜 분리하였다. 이어서 클론을 스크리닝하여 생체내³⁵S-시스테인으로 표지한 후에 조정 배지(conditioned medium)의 면역 침전에 의해서 인터페론 α 및 β의 대부분의 의 가용성 수용체를 발현시킬 수 있는 것을 발견하였다. 특히 RPMI cys-배지(Gibco) 4ml중의³⁵S-시스테인(Amersham) 100 mCi/ml로 37℃에서 5시간 동안 pSVAdIFRpA, pSVAdsIFRIpA, pSVAdsIFR2pA, pSVAdsIFR3pA, pSVAdpA 또는 pSV2DHFR에 의하여 동시 형질감염된 약 10⁷CHO 세포를 인큐베이션시켰다. 이런 세포를 표지한 후에, 여과된 조정 배지 1ml를 0.5mM의 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 조정하고, 후술하는 바와 같이 면역침전시켰다. 침전물은 7.5%의 PAGE 겔 상의 환원 조건에서 전기 영동에 의해서 분별시켰다(U.K. Laemmli의, Nature, 227, 680-85, 1980 참조).

[실시예 3]

인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 정제

pSVAdsIFR3pA 구조물의 재조합 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체를 발현시키는 CHO 세포의 클론을 선택하여 8일 동안 1%의 FCS, 1g/l 글루코스와 스트렙토마이신과 페니실린(100mg/ml) 등의 항생제 및 0.5mM MTX가 보충된 DMEM/HAM F12(1:1) 배지 중의 4개의 롤러 병(Becton Dickinson)에서 배양하였다. 상층액은 회수하였고, 0.2㎛ 맥시 디쉬(Gelman Science)를 통해 여과시키고, FPLC 모노 Q 음이온 교환 칼럼(Pharmacia)으로 분비된 단백질을 농축시켰다. 이 칼럼 100mM Hepes pH 7, 10% 글리세롤, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF), 아프로티닌 1m당 칼리크레인 400 억제 유닛(inhibition unit)을 포함하는 완충액으로 세척한 후 NaCl의 불연속 구배(0.2에서 1.0M)로 용출시켰다. 가용성 수용체는 인터페론과 결합할 수 있기 때문에, 요오드 125로 표지된 인터페론으로 결합시키면 수용체의 정제 여부를 모니터할 수 있다.

수용체를 함유하는 물질은 투석된 모노 Q 칼럼에서 용출시키고 Micro-Prodicon형 장치에서 농축시켰다. 분자량이 10,000 달톤 이상인 단백질을 보유하는 막을 사용하였다. 농축된 물질을 0.1% SDS로 3mm의 7.5% 폴리아크릴 아미드 겔 위에 침착시켰다. 동시에 샘플(약 10μg)은 동일한 겔 위의 한쪽에 침착시켰다. 전기영동 후에 이 겔 부분은 폴리비디닐 비플루오라이드(polyvidinyl bifluoride) 막(Millipore) 위에서 전기에 의해 이동한 후 요오드 125로 표지된 재조합 인체 인터페론 α 8과 혼성화된다. 이 방법으로 전기영동 후에 가용성 수용체의 위치를 확인할 수 있다. 가용성 수용체를 함유하는 겔 부분을 자르고, 전기-용출에 의해서 단백질을 모으고 분자 한외 여과에 의해 농축시키고 투석하여 SDS를 제거하였다.

[실시예 4]

인체 카파 면역글로불린의 불변 영역에 및 인체 gl 면역글로블린의 불변 영역에 융합된 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 변이체를 발현시키기 위한 플라스미드의 제조

[경쇄 융합]

플라스미드를 제조하여 κ 면역글로불린의 불변 영역에 융합된 서로 다른 길이의 세포외의 영역을 갖는 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체를 발현시켰다. 이 플라스미드들은 이후로 pSVAdsIFRlK, pSVAdsIFR2K 및 pSVAdsIFR3K라 불리울 것이다.

pSVAdsIFRlK 플라스미드는 메티오닌에 대한 개시 코돈에서부터 융합점까지 N-말단 부분을 포함하는데, 이 융합점은 리신 436에 대한 코돈 다음에 있고, 그 바로 다음에 인체 κ 면역글로불린의 트레오닌 109에 대한 코돈에서 시작하는 κ 면역 글로불린의 불변 영역의 서열이 뒤따른다(kabat 등, Hieter, P.A. 등의 Cell 22, 197-207, 1980 참조).

마찬가지로 pSVAdsIFR2K 플라스미드는 메티오닌에 대한 개시 코돈에서부터 융합점까지 N-말단 부분을 포함하는데, 융합점은 글루타민 427에 대한 코돈 다음에 있고, 그 바로 다음에 인체 κ 면역 글로불린의 트레오닌 109에 대한 코돈에서 시작하는 κ 면역 글로불린의 일정 영역의 서열이 뒤따른다(kabat 등, Hieter, P.A. 등의 Cell 22. 197-207(1980) 참조).

이들 플라스미드는 다음과 같이 제작되었다.

κ 면역글로불린의 DNA 단편은 사람 지라의 cDNA의 라이브러리(Clontech Laboratories, Inc.)로부터 합성되었다. 목적하는 cDNA를 합성하기 위해서 PCR 반응의 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용했는데 이 올리고뉴클레오티드는 공지된 DNA 서열에 기초를 두면서 소정의 영역에 대해 상보적인 서열을 갖는다(Hieter, P.A. 등의 Cell 22, 197-207, 1980 참조). 5'-말단 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열을 갖는다.

5'-ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCA-3'

3'-말단 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열을 갖는다.

3'-CCCTCTCACAATCTCCCTCCATGGCCAG-5'

PCR 반응은 주형으로서 1μg의 플라스미드를 사용하고, 반응시킨 후에 혼합물을 이중 가닥의 말단을 수복(repair)하기 위해서 4종의 3인산염 뉴클레오시 드의 존재하에서 클레노우(Klenow) 폴리머라제로 처리하였다는 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 같이 수행하였다. DNA는 Kpn1 제한 효소로 분해시키고 목적하는 단편은 낮은 융점의 아가로스 상에서 전기영동시켜 분리하였다.

인터페론 α 및 β의 가용 수용체의 단편들을 코딩하는 DNA 단편들을 같은 방법으로 합성하였다. 5'-말단 올리고뉴클레오티드는 실시예 1에 기재한 것과 동일하다. 즉;

5'-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3'

3'-말단 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다.

3'-CTCTTTTGTTTTGGTCCTTTATGGAGATTT-5'-올리고 1

3'-TCGTCACAAAAATCACAGCGACATACACTC-5'-올리고 2

3'-CCACGAGGTTTTGTCAGACCTTTGTGCGGA-5'-올리고 3

PCR 반응은, 마지막 반응 주기 후에 반응 생성물을 2중 가닥의 말단을 수복하기 위해서 클레노우 폴리머라제로 처리하고, IFR1, IFR2 및 IFR3를 얻기 위해서 Pst1 제한 효소로 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재한 바와 같이 수행하였다.

발현 벡터 pSVAdA1은 Pst1과 Kpn1로 분해한 후, 포스파타제로 분해하고, 플라스미드의 가장 많은 부분을 함유하는 P 단편은 낮은 융점의 아가로스 상에서 전기영동시켜 분리되었다.

3가지 성분을 포함하는 반응에서 P 단편은 면역글로불린 단편 및 sIFR1 단편에 연결되었다. 마찬가지로, P단편은 면역글로불린 단편과 sIFR2 단편에 연결되었고, 마지막으로 P단편은 면역글로불린 단편 및 sIFR3 단편과 연결되었다.

라이게이션 혼합물 각각으로 수용성 대장균 HB 101 박테리아를 형질전환시키고 배지에 암피실린이 함유된 페트리 디쉬 위에 형질전환된 배양물을 붓고 암피실린 내성 콜로니를 선택했다. 플라스미드를 형질전환체로부터 분리하고 삽입체를 확인하기 위해서 제한 효소로 분석하고, 삽입체의 연결부의 DNA 서열을 확인하기 위해서는 서열화를 통해 분석하였다. 이 플라스미드들을 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 융합체를 발현시키는데 사용하였다.

[중쇄 융합]

플라스미드를 제작하여 g1 면역글로불린의 불변 영역에 융합된 서로 다른 길이의 세포외 영역을 갖는 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체를 발현시켰다. 이 플라스미드들은 이후에 pSVAdsIFR1g1, pSVAdsIFR2g1 및 pSVAdsIFR3g1이라 불리운다.

pSVAdsIFR1g1 플라스미드는 메티오닌에 대한 개시 코돈에서부터 융합점까지 N-말단 부분을 포함하는데, 이 융합점은 리신 436에 대한 코돈 다음에 있고, 그 바로 다음에 g1 인체 면역글로불린의 알라닌 113에 대한 코돈에서 시작하는 g1 면역글로블린의 불변 영역의 서열이 뒤따른다(kabat 등, Ellison J. W. 등의 Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079, 1982 참조).

마찬가지로 pSVAdsIFR2g1 플라스미드는 메티오닌에 대한 개시 코돈으로부터 융합점까지 N-말단 부분을 포함하는데, 이 융합점은 글루타민 427에 대한 코돈 다음에 있고, 그 바로 다음에 g1 인체 면역글로불린의 알라닌 113에 대한 코돈에서 시작하는 g1 면역글로불린의 불변 영역의 서열이 뒤따른다(kabat 등 ; Ellison J. W. 등의 Nucl. Acids, Res. 10, 4071-4079, 1982 참조).

pSVAdsIFR3g1 플라스미드는 메티오닌에 대한 개시 코돈에서부터 융합점까지 N-말단 부분을 포함하는데, 이 융합점은 프롤린 360에 대한 코돈 다음에 있고, 그 바로 다음에 g1 인체 면역글로불린의 알라닌 113에 대한 코돈에서 시작하는 g1 면역글로불린의 불변 영역의 서열이 뒤따른다(kabat 등, Ellison J. W. 등의 Nucl. Acids. Res 10, 4071-4079, 1982 참조).

이 플라스미드는 다음과 같이 제작되었다.

g1 면역글로불린을 코딩하는 서열은 사람 지라의 cDNA 라이브러리(Clontech Laboratories, Inc.)로부터 합성되었다. 목적하는 cDNA를 합성하기 위해서 PCR 반응의 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용했는데 이 올리고뉴클레오티드는 공지된 DNA 서열에 기초하여, 소정의 영역에 대해 상보적인 서열을 갖는다(Ellison 등의 Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079, 1982 참조). 5' 말단 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열을 갖는다.

5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC-3'

3'-말단 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열을 갖는다.

3'-GACAGAGGCCCATTTACTCACCATGGCCAG-5'

PCR 반응은 후술하는 바와 같이 수행되었다.

sIFR1, sIFR2 및 sIFR3 단편들은 상기 설명된 것과 같고 발현 벡터는 경쇄의 융합에 관해 상기한 바와 같이 제조되었다.

[실시예 5]

대장균내에서 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 변이체를 발현시키기 위한 벡터의 제작

대장균에서 sIFR을 발현시키기 위해 pHR 148 발현 벡터를 사용하였다. pHR 148은 문헌(Rink 등의 Nucl. Acid. Res. 12, 6369-6387(1984) 참조)]에 기재되어 있다. HR148 플라스미드를 Ncol 제한 효소로 분해하고 이어서 이중 가닥의 말단을 수복하기 위해 4종의 3인산염 뉴클레오시드의 존재하에서 클레노우 폴리머라제로 처리하고 Kpn1로 분해하였다. 포스파타제로 처리한 후에 플라스미드의 가장 큰 부분을 포함하는 DNA의 단편(단편 1)은 낮은 융점의 아가로스 상에서 전기영동시켜 분리하였다. 인터페론 α 및 β의 성숙한 가용성 수용체를 코딩하는, 즉, 펩티드 시그날이 없는 DNA 단편은, 완전한 cDNA를 함유하는 플라스미드를 주형으로 사용하고 한쌍의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR 반응에 의해서 합성되었다.

5'-말단 올리고뉴클레오티드(인터페론의 N-말단 영역으로부터 유도됨)는 다음과 같은 서열을 갖는다.

5'-GGTGGAAAAAATCTAAAATCTCCTCAAAAAG-3'(올리고 1)

3'-말단 올리고뉴클레오티드(인터페론의 막횡단 바로 앞의 영역으로부터 유도됨)는 다음과 같은 서열을 갖는다.

3'-TCACTGCGACATACACTCATCCCATGGCC-5'(올리고 2)

올리고뉴클레오티드는 PCR 융합 후에 합성된 단편이, 3'-말단에서는 Kpn1 제한 효소 부위를, 5'-말단에서는 평활(blunt) 말단을 갖도록 선택되었다.

PCR 반응은 반응 후에 생성물을 이중 가닥 말단을 수복하기 위해 클레노우 폴리머라제로 처리하고, 이어서 Kpn1 효소로 처리하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같이 수행하였다. 1.3Kb의 단편을 낮은 융점의 아가로스 상에서 전기영동시켜 분리하고 단편 1과 연결하였다.

DNA의 두 번째 단편은 5'-말단 올리고뉴클레오티드가 다음 서열에 의해 치환된 것을 제외하고는 첫 번째 단편과 비슷한 방법으로 합성하였다.

5'-GGAAAAAATCTAAAATCTCCTCAAAAAG-3'

라이게이션 생성물로 대장균 HB101을 형질전환시켜 배지에 암피실린을 포함하는 페트리 디쉬 위에 형질전환된 배양물을 부었다. 암피실린 내성 콜로니를 선택하고, 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 이를 제한 효소로 분해시키거나 서열화하여 삽입체의 융합체에서 서열을 확인하였다.

ptrpIFR1과 ptrpIFR2라 불리우는 두 플라스미드를 사용하여 대장균에서 가용성 수용체를 발현시켰다. 재조합 단백질을 발현시키기 위해서 형질전환체를 M9 배지 중의 20 내지 50ml의 배양 배지에 놓아서 1.0의 흡광도(A650)를 얻었다(Rink 등의 Nucl. Acid. Res. 12 6369-6387, 1984 참조). 이어서, 세포들을 원심분리시키고, 세척하고 인터페론의 가용성 수용체는 파쇄 세포로부터 추출하고 정제하였다. 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체는 후술하는 바와 같이 웨스턴 블롯(western blot) 또는 도트 블롯(dot blot)에 의해 확인되었다.

[실시예 6]

인체 인터페론의 가용성 수용체의 확인 방법

가용성 수용체의 확인 방법은 인체 인터페론 α와 특정 방식으로 결합하는 수용체의 능력에 근거한다.

a) 면역 침전

인체 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 확인은 인터페론 α2의 말단 아미노 잔기에 대한 모노클로날 항체로의¹²⁵I-IFN 결합을 방해하는 요오드 125로 표지된 인체 인터페론 α8 및 가용 수용체 사이의 복합체의 형성에 기초를 둔다[H. Arnheiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:2539(1983) 참조]. 분자의 말단 아미노 잔기는 수용체에 인터페론을 결합시킨 후 항체에 쉽게 접근할 수 없다[H. Arnheiter et al. (1983)]. 자유로이 남아 있는¹²⁵I-IFN은 항-IFN 항체와 복합체를 형성하며 A-세파로스 단백질(Pharmacia)의 첨가하면 침전된다. 항-IFN 항체는 제조업자의 지시에 따라 단백질 A와 결합한다.

pH 8.3의 붕산염 완충액 50㎕(0.1 M H₃BO₃, 0.025 M Na₂B₄O₇, 0.075M NaCl, 0.1% NPO₄) 중의 확인된 가용성 수용체의 희석액은 fmole 당 81Bq의 특이적 활성(specific activity)을 갖는 요오드 125로 표지된 일정량(75pmoles)의 인터페론 α2와 혼합해서[K. E. Mogensen et G. Uze, Methods in Enzymol. 119C:267(1986) 참조], 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. A-항-IFN 단백질의 일정량을 50㎕의 용적에 용해시키고, 여기서 pH 8.3의 붕산염 완충액(0.2 M H₃BO₃, 0.05 M Na₂B₄O₇, 0.15 M NaC1, 0.1% NPO₄) 50㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반시키고, 1분 동안 10000×g로 에펜도르프형(Eppendorf-type) 마이크로원심분리기에서 원심분리시키고 상층액을 따라내었다. 침전물을 pH 8.3의 붕산염 완충액(0.1 M H₃BO₃, 0.025M NaB₄O₇, 1M NaCl, 0.5% NPO₄)을 이용하여 6회 세척하고, pH 8의 40mM HEPES와 2% 글리세롤로 2회, pH 8의 40mM HEPES와 1M의 요소로 1회 마지막으로 pH 8의 40mM HEPES로 2회 세척하였다.

침전물 중의 면역 복합체의 방사량의 측정하고 인터페론-항인터페론 복합체 형성의 억제 곡선을 참고하여, 이런 식으로 시험된 시료의 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 양을 결정할 수 있다.

(b) 세포 수용체 위에 표지된 인터페론의 결합 억제에 의한 인체 인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 확인

인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 순차적인 희석액을 요오드 125(fmole 당 특히 방사능 25Bq)로 표지된 재조합 인체 인터페론 a8을 다양한 농도(0, 50, 100, 125, 500, 1000 및 2000 UI/ml)로 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그리고 인간의 Daudi 림포이드 세포는¹²⁵I-IFN 가용 수용체의 서로 다른 혼합물들에 최종 농도가 10⁷cells/ml로 되도록 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리하고(800g에서 10분 동안), 상층액은 따라내었다. 이 세포는 0.5% 태송아지의 혈청(Flow Laboratories)을 함유하는 RPMI 1640 배지로 3회 세척하고 세포에 결합한 방사량은 LKB 1270형의 γ-카운터를 사용한 계수에 의해서 결정하였다.

인터페론 α 및 β의 가용성 수용체의 양은 세포 수용체에 대한 인터페론의 특이적 결합의 억제 곡선에서 결정되었다. 특이적 결합은¹²⁵I-IFN만의 결합 곡선과 100배 초과량의 표지되지 않은 인터페론의 존재하의 결합 곡선 사이에 차이가 있다.

(c) 웨스턴 블롯에 의한 인체 인터페론 α 및 β의 가용 수용체의 결정

인터페론 a의 수용체의 존재를 확인하기 위해 샘플들을 30,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 단백질을 보유하는 아미콘 센트리콘(Amicon Centricon) 30형의 막을 이용하여 분자 한외 여과법에 의해 농축시켰다. 샘플들을 pH 6.8인 60mM 트리스-HC1 완충액, 1.25% SDS, 1mM PMSF와 아프로티닌의 칼리크레인/ml의 억제 단위 400에 용해시키고 0.1% SDS로 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 위에 침착시켰다. 표준 조건 하에서의 전기 영동 후에, 샘플들은 39mM 글리신, 48mM 트리스-염기, pH 8.3 및 18% 메탄올의 완충액 중에 200mA에서 1시간 동안 반건조형의 전자-전이 장치(Nova Blot, LKB) 안에서 폴리디비닐 비플루오라이드의 막(Millipore) 상에 전달하였다. 전달 후에, 막을 20mM 트리스-염기, 0.2% Tween 20, pH 7.8, 10% 탈지유의 완충액(Regilait, France)으로 교반 하에서 25℃에서 4시간 동안 처리하였다. 그것은 동일한 완충액 안에서 교반하면서 25℃에서 2시간 동안 10^-10M(fmole 당 50 Bq)의 특이 활성)에서¹²⁵I-인터페론 α8과 혼성화되었다. 막은 동일한 완충액의 부분 표본으로 5회 세척하고, 공기 건조시키고, X선 감수성 필름에 노출시켰다.

재조합 인체 인터페론 α8(αB)은 종래의 클로라민 T 방법을 변경시키는 것에 의해서 요오드 125로 표지된다(K. E. Mogensen 및 G. Uze의 Methods in Enzymol. 119C : 267(1986) 참조). 이것은 fmole 당 25Bq의 방사 활성 또는 국제단위 인터페론 당 6Bq에 대응한다.

(d) 도트 블롯에 의한 인체 인터페론 α 및 β의 가용 수용체의 결정

결정될 가용 수용체를 제조하기 위한 연속적 희석은 39mM 글리신, pH 8.3인 48mM 트리스-염기 50μl 완충액에서 행해지고 폴리디비닐 비플루오라이드 막(Millipore)으로 부하된 Bio-Blot형 장치(Biorad)의 울에 침착된다.

막은 20mM 트리스-염기, 0.2% Tween 20, pH 7.8 및 10% 탈지유로 교반하에 25℃에서 4시간 동안 처리하였다. 그것은 동일한 완충액 중에서의 교반하에 25℃에서 2시간 동안 10^-10M(fmole 당 25Bq의 특이 방사능)에서¹²⁵I-IFN α8과 혼성화하였다. 이것은 동일한 완충액의 부분 표본으로 교반하에 5회 세척하고 X선 감수성 필름에 노출시켰다. 표준 곡선을 참고로 하여 자동 방사선법의 분석은 막에 부착된¹²⁵I-IFN의 양을 결정하는 것과 시험된 샘플에서 가용 수용체의 농도를 감소시키는 것을 가능하게 한다.

재조합 인체 인터페론 α8(αB)은 T 클로라민 방법의 변형에 의한 요오드 125로 표지된다. 이것은 fmole당 25Bq의 특정 방사 활성 및 국제 단위 인터페론 당 6Bq에 대응한다.

[실시예 7]

제약 조성물

다음 성분들을 함유하는 주사용 조성물을 제조하였다.

- 실시예 3에 의한 생성물 100mg

- 주사용 제제를 위한 부형제 2ml

Claims (14)

1. 제1도의 서열에 대응하는 폴리펩티드 및 그의 유도체, 및 제2도의 서열에 대응하는 폴리펩티드의 유도체인 것을 특징으로 하는, 인터페론 α 및 β에 대해 높은 친화력을 갖는 수용성 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 제1도 또는 제2도의 서열에 대응하는 폴리펩티드로부터 치환에 의해 유도된 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, 제1도 또는 제2도의 서열에 대응하는 폴리펩티드로부터 결실에 의해 유도된 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드.
4. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, 다른 폴리펩티드와 혼성화(hybridization)되는 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드.
5. 제4항에 있어서, 다른 폴리펩티드가 상기 수용성 폴리펩티드의 인체 조직 내의 분해를 늦추는데 적합한 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서, 다른 폴리펩티드가 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드.
7. 제6항에 있어서, 면역글로불린이 G형, 바람직하게는 G1형인 것을 특징으로 하는 수용성 폴리펩티드.
8. 제1항, 2항, 3항 및 4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
9. 제1항, 2항 또는 3항에 따른 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
10. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
11. 적절한 영양 배지에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 제1항, 2항, 3항, 4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 수용성 폴리펩티드의 제조 방법.
12. 제1항, 2항, 3항 및 4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 수용성 폴리펩티드를 활성 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자기 면역 질환 및 이식 거부증 치료용 제약 조성물.
13. 활성 성분으로서 제1항, 2항, 3항 및 4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 수용성 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 진단제.
14. 항 인터페론 α 및 β 항체의 제조에 사용되는, 제1항, 2항, 3항 및 4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 수용성 폴리펩티드.