HU211284A9 - Új vízoldható polipeptidek, DNS-szekvenciák, új sejtek, eljárás a fenti polipeptidek előállítására, a fenti polipeptidek felhasználása, továbbá ezeket tartalmazó kompozíciók Az átmeneti oltalom az 1-9. és 14-15. igénypontokra vonatkozik. - Google Patents

Description

Találmányunk új vízoldható polipeptidekre, DNSszekvenciákra, új sejtekre, a fenti polipeptidek előállítására, gyógyszerként történő felhasználására és az e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítményekre vonatkozik.

Az a- és β-interferonok kiválasztott fehérjék csoportját képezik, amelyek különböző biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, így gerincesek sejtjeiben vírus ellenes és burjánzásellenes állapotot hoznak létre [I. Gresser és M. G. Tovey: Biochem. Biophys. Acta 516, 23(1978)].

Az α-interferon az immun, celluláris és humorális rendszerre - különösen a B-sejtek poliklonális aktiválására -jelentős hatást fejt ki [M. Peters, J. Immunok, 137, 3153 (1986); T-sejt funkciók gátlása (J. Knop és tsai: J. Immunoi., 133, 2412 (1984) és antigének hisztokompatibilitás kifejezésének módosítása (M. Fellous és tsai: Eur. J. Immunok, 9, 446 (1979)]. Az összes fenti folyamat az autoimmunitás kialakulásában játszik szerepet.

Bár az interferont a szervezet hasznos tényezőjének tekintik, abnormális termelése bizonyos betegségek patológiájához járulhat hozzá és ténylegesen különböző ún. autoimmun betegségekkel kapcsolatos. így pl. különböző betegségekben (pl. lupus erythematosus, reumatoid artritis, Behcet szindróma, diabetes mellitus, sclerosis multiplex, csontvelő aplázia és különböző többszörös immunhiányos betegségek) szenvedő betegek szérumában vagy szöveteiben magas interferonszint van jelen. Az interferon-szint és az AIDS-betegség kifejlődésének gyenge prognózisa között közvetlen összefüggés áll fenn [E. Buimovivi-Klein és tsai: AIDS Rés. 2, 99(1986)].

Ismeretes, hogy emberen a lupus erythematosus állatmodelljeként szolgáló spontán betegségben szenvedő speciális egértörzshöz (NZB) tartozó egereknek a- vagy β-interferont beadva a betegség előrehaladása súlyosbodik [H. Heremans és tsai: Infect. Immun. 21, 925 (1978); C. Adam és tsai: Clin. Exp. Immunoi. 40, 373 (1980)].

Fiatal egereknek nagy mennyiségű interferon beadása növekedésgátló szindrómát, májnekrózist és pusztulást idéz elő [I. Gresser és tsai: Natúré 258, 76 (1975)]. Hasonlóképpen nőstény egerek neonatális szakaszában bizonyos vírusokkal (pl. Pichinde limfocita choriomeningitis vagy reovírus) történő fertőzésekor nagy mennyiségű endogén interferon termelődik, amely ugyanazt a halálos szindrómát okozza. Az avagy β-antiinterferon antitest beadása a születéskor vírusokkal fertőzött fiatal egereket a fent említett szindrómától megvédi [Y. Riviere és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2135 (1977); Y. Riviere és tsai: J. Exp. Med., 152, 633 (1980); T. Clark és tsai: J. Virol, 59, 728 (1986)]. Ez a kísérlet az interferonnak a fenti betegség patogenézisében játszott szerepének meggyőző bizonyítéka.

Ezenkívül az NK-sejtek aktiválását és a hisztokompatibilis antigének kifejezésének módosítását az avagy β-interferon szabályozza és ez a csontvelő ojtványok kilökődésében jelentős szerepet játszik [C. Ohien és tsai: Science 246, 66 (1989)]. Ezenkívül igazolták, hogy az FI hibrid egereknek a parentális csontvelő ojtással szemben mutatott ellenállásának egyik jelentős eleme az a- vagy β-interferon termelés [Afifi és tsai: J. Immunoi. 134, 3739 (1985)]. így FI egerek vagy allogén egerek patkány- vagy egérszerű a- vagy β-interferon szérummal történő kezelése a parentális vagy allogén csontvelő beojtását és elburjánzását teszi lehetővé [Afifi és tsai (1985)].

Ismeretes, hogy az interferonok és altípusaik biológiai hatásait a sejtfelülethez nagy affinitást mutató specifikus receptorral mutatott kölcsönhatásuk idézi elő [M. Aquet és K. E. Mogensen: Academic Press London (1983)].

Jelenleg az autoimmun betegségek és azokkal kapcsolatos más betegségek (pl. sclerosis multiplex) kezelésére nem áll rendelkezésre megfelelő terápia. Az autoimmun betegségek ismert kezelési eljárásai nem kielégítőek és toxikus hatásokkal járnak. A „kilökődésellenes” terápiában használt kezelések a betegség tüneteit gátolják ugyan, a betegség okait azonban nem és egyúttal nagyon toxikusak. Nagy szükség van tehát olyan gyógyszerekre, amelyek megfelelő gyógyászati hatásokkal rendelkeznek, ugyanakkor azonban az autoimmun betegségekkel és szerv-kilökődésekkel szemben alacsony toxicitást mutatnak.

Nagyon kívánatos lenne az a- vagy β-interferon hatásának antagonista anyag befecskendezésével történő blokkolása, amely az autoimmun-típusú betegségek és a beojtások kilökődése szempontjából gyógyászatilag kedvező lenne. Az idegen immunoglobulinok befecskendezésén alapuló és hatékonynak bizonyult megközelítés azonban a humángyógyászatban gyakorlati alkalmazás tekintetében kedvezőtlen.

Találmányunk új megközelítést jelent és az a- vagy β-interferon hatásának blokkolása céljából az a-interferon specifikus receptora oldható formájának antagonistaként történő alkalmazásán alapul. A természetes receptor génsebészeti eljárásokkal előállított fenti variánsai a keringő vagy helyi endogén α-interferont megkötő képességet megtartják, ugyanakkor mentesek attól a résztől, amely révén a sejtfelülethez kötődnek, így szabadon keringhetnek és specifikus tulajdonságuk révén csak az a- vagy β-interferonhoz kötődnek.

A specifikus a- vagy β-interferon receptor oldható formái - az antitestekhez hasonlóan - az a- vagy β-interferonnak a szervezetben kifejtett hatásának blokkolására képesek.

Kívánatos lenne az a- és/vagy β-interferon aktivitásának blokkolására képes termék előállítása.

Találmányunk tárgya a fenti célkitűzés megoldásaként vízoldható polipeptid, amelyet az jellemez, hogy a- és β-interferonokkal szemben nagy affinitást mutat.

A „nagy affinitás” kifejezés azt jelenti, hogy a disszociációs állandó 10~⁹M értéknél kisebb.

A „vízoldható” kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptid a szervezetben (pl. az emberi testben) való keringésre, majd a sejthez történő kötődésre képes.

A jelen szabadalmi leírásban szereplő „hibrid” kifejezésen valamely találmányunk szerinti vízoldható po2

HU 211 284 A9 lipeptid (természetes receptor „oldható” része, módosított teljes receptor vagy pl. helyettesítéssel módosított természetes receptor „oldható” része) és egy másik molekula (különösen polipeptid-típusú molekula, pl. valamely immunoglobulin vagy immunoglobulin fragmens) fúziós (vagy konjugációs) terméke értendő.

Az „oldható a- vagy β-interferon receptor” kifejezés egy fent említett vízoldható polipeptidre vonatkozik.

Egyszerűsítés céljából a továbbiakban az „a- és β-interferon receptor” kifejezés helyett az „interferon receptor” kifejezést alkalmazzuk.

A fent meghatározott polipeptidek közül találmányunk tárgya különösen az a vízoldható polipeptid, amelyet az jellemez, hogy az 1. sz. mellékleten feltüntetett képletnek felel meg.

Ez a polipeptid az a- vagy β-interferon természetes natív receptora extracelluláris oldható részének felel meg.

Természetesen a fentiekben leírt polipeptidtől eltérő polipeptidek is megtartják a fenti interferonokkal szemben mutatott nagy affinitást. Ennek megfelelően az 1. sz. mellékleten feltüntetett polipeptid különösen megfelelő helyettesítésekkel vagy törlésekkel változtatható és ezek a variánsok is találmányunk tárgyát képezik.

A törlésekkel kapcsolatban megjegyezzük, hogy az

1. sz. mellékleten feltüntetett polipeptidben levő egy vagy több aminosav az a- és β-interferonnal szemben mutatott affinitás kedvezőtlen módosítása nélkül törölhető.

A törlések a teljes és natív receptorra is vonatkozhatnak, különösen az oldható rész szintjén; ily módon pl. a sejtmembránhoz való kötődés képessége elveszthető és ezáltal a keringés számára rendelkezésre áll.

Ha a natív és teljes interferon-receptornak a 2. sz. mellékleten feltüntetett szekvenciájából indulunk ki, a szekvencia transzmembrán és citoplazmikus szakaszai elhagyhatók.

A transzmembrán tartománynak megfelelő 437457 maradékok és a 458-557 maradékok (citoplazmikus tartomány) törlése pl. oldható fonnák (keringő) képződéséhez vezet.

A teljes a- és β-interferon receptort kódoló aminosavak és nukleotidok teljes szekvenciáját a 2. sz. mellékletben tüntetjük fel.

Amennyiben a törléseket a transzmembrán és citoplazmikus (vagy celluláris és intracelluláris) szakaszokban végezzük el, potenciálisan immun epitópok képződése elkerülhető. A törölt transzmembrán tartományú natív a- és β-interferon receptorok egyik előnye, hogy a rekombináns gazdasejtek szövettenyészetének felülúszójában képesek kiválasztódni.

Ennek megfelelően találmányunk tárgya vízoldható polipeptid, amelyet az jellemez, hogy az 1. és 2. sz. mellékleten feltüntetett képletnek megfelelő polipeptidekből törléssel származtathatók le.

A helyettesítéses variánsok ugyancsak találmányunk tárgyát képezik.

Ez esetben az interferon szekvenciájában levő egy vagy több aminosav eltávolítható vagy más aminosavakkal helyettesíthető oly módon, hogy az aminosavak össz-száma változatlan marad.

A helyettesítések előnyösen az interferon receptor oldható részére vonatkoznak. A receptor oldható részének funkciójában vagy immunológiai azonosságában számottevő változtatásokat úgy végezzük el, hogy olyan nemkonzervatív helyettesítéseket és aminosavmaradékokat vagy szekvenciákat választunk ki, amelyek a polipeptidben eredetileg jelenlevő csoportokból abban különböznek, amely a polipeptid háromdimenziós szerkezetének a helyettesítés közelében történő megtartása, valamint a molekula vagy az oldallánc nagy része konjugációjának vagy hidrofobicitásának megtartása szempontjából a legjelentősebb.

A receptor tulajdonságait módosító helyettesítések közül különösen jelentősek az alábbiak:

- valamely aminosav-maradéknak (pl. szeril vagy treonil) hidrofób-maradékkal (pl. leucil, izoleucil, fenil-alanil, alanil vagy valil) történő helyettesítése;

- ciszteinil-maradéknak bármely más maradékkal történő helyettesítése;

- elektropozitív oldalláncot tartalmazó maradéknak (pl. lizil, arginil vagy hisztidinil) elektronegatív maradékkal (pl. glutamil vagy aszpartil) történő helyettesítése;

- nagy térkitöltésű láncot tartalmazó maradéknak (pl. fenil-alanil) ilyen részt nem tartalmazó maradékkal történő helyettesítése.

A helyettesítéses variánsok szintén a teljes interferon receptor szerkezetére vonatkozhatnak és előnyösen a transzmembrán tartományt érintik. Az ezen a szinten végzett helyettesítések a polipeptidnek a lipid sejtekkel vagy membránokkal szemben mutatott affinitásának csökkentésével ténylegesen az tt- és β-interferonok receptorának oldható formáját hozzák létre.

A transzmembrán szakasz pl. különböző aminosavszekvenciákkal helyettesíthető (pl. homopoli-nukleotid DNS szekvencia vagy 5-50 azonos aminosavat - pl. szerin, lizin, arginin, glutamin és aszparaginsav - vagy más hidrofil aminosavakat tartalmazó bármely szekvencia) és ily módon az oldható receptorok a rekombináns gazdasejtek tenyészet táptalajába választhatók ki.

Találmányunk tárgya ennek megfelelően továbbá vízoldható polipeptidek, amelyeket az jellemez, hogy az 1. vagy 2. sz. mellékletben feltüntetett képleteknek megfelelő polipeptidek helyettesítéséből származtathatók le.

A fentiekből kitűnik, hogy helyettesítések vagy törlések, valamint az ilyen módosítások kombinációi egyaránt elvégezhetők.

Általánosan leszögezhető, hogy az ily módon kapott variánsok funkcionális transzmembrán szakaszt és előnyösen intracelluláris (citoplazmikus) részt nem tartalmaznak.

A fentiekben leírt vízoldható polipeptidek más variánsai kémiai módosításokkal állítható elő, különösen az a- és β-interferon receptor jellemző tulajdonságainak javítása céljából.

HU 211 284 A9

Az ilyen polipeptidek hidrofil polimereket tartalmazhatnak (pl. szabad aminocsoportokat tartalmazó aminosavaikra - pl. lizin - vagy szulfhidril-csoportjaikra - pl. cisztein - ojtott polietilénglikolt).

A fenti módosítások a találmányunk szerinti polipeptideknek különösen hosszabb plazma felezési időt kölcsönöznek vagy az oldhatóságot is fokozzák vagy a polipeptidek immunogén jellegét csökkentik.

A fenti módosításokat önmagukban ismert módszerekkel - pl. a 4 179 337 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon - végezhetjük el.

Találmányunk tárgya továbbá a fentiekben meghatározott polipeptidek azzal jellemezve, hogy hidridizáltak (vagy konjugáltak is).

A konjugáció immuno-kompetens polipeptideket is magában foglalhat, pl. olyan polipeptideket, amelyek a hibrid-polipeptiddel kezelt állatban immun-válaszokat válthatnak ki vagy az oldható interferonra nem reagáló polipeptid-résszel szemben irányított bármely antitesthez kapcsolódhatnak.

A fenti receptornak nem megfelelő epitópok általában a már létező antitestek által felismert antigéneket tartalmaznak (pl. baktériumok polipeptid fragmensei, mint pl. beta-galaktozidáz).

Az immun konjugációkat in vitro térhálósítással vagy valamely immunogén polipeptidet kódoló DNS által transzformált rekombináns sejttenyészettel végezhetjük el.

Előnyös körülmények között az immunogén ágenst az oldható receptorba vagy az oldható receptorból polipeptid kötéssel le származtatható fragmensbe illesztjük be vagy kapcsoljuk oly módon, hogy az oldható receptornak megfelelő epitópokat és a fent említett receptortól idegen legalább egy epitópot tartalmazó lineáris polipeptidláncot kapjunk. Ezeket az epitópokat a receptorral vagy ffagmenseivel kompatibilis polipeptidlánc bármely más helyére beiktathatjuk.

A fenti hibridek különösen abban az esetben hasznosak, ha egy állatnak az interferon receptor ellenes antitest készítése céljából gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó kompozíciót adunk be; ezek az antitestek önmagukban diagnosztikus szerként használhatók vagy a natív receptor vagy az interferon oldható receptorának tisztítására alkalmazhatók.

Más, adott esetben immunogén konjugált polipeptidek a találmányunk szerinti polipeptid C-terminális tartományával konjugált vízoldható polipeptiden kívül valamely homopolimert (pl. pentahisztidint) magában foglaló hibridet tartalmaznak. Ezután a hibrid a hordozóhoz rögzített kelátképző szer (pl. cink-ionok) segítségével könnyen izolálható, ily módon a hibrid a szennyezések keverékétől adszorpcióval elválasztható és eluálható. Az oldható receptor ezután pl. enzimes hasítással nyerhető ki.

Az oldható receptor kiválasztásának javítása céljából más hibridek állíthatók elő. Egy heterológ szignál polipeptid az oldható receptor szignál peptidet helyettesíti és ha a gazdasejt a képződő hibridet felismeri, úgy ezt a gazdasejt felhasználja és a receptor kiválasztódik.

A szignál polipeptidek megválasztása a felhasznált gazdasejt jellegzetes tulajdonságai alapján történik és baktériumok, élesztők, gombák, növények, emlősök vagy vírusok szekvenciái jöhetnek tekintetbe.

A fentiekben leírt polipeptidek előnyös körülmények között polipeptidekkel konjugáltak, különösen olyan polipeptidekkel, amelyek az emberi szervezetben történő lebomlásukat lelassító szerkezettel rendelkeznek.

Különösen a receptor oldható részénél hosszabb felezési idővel rendelkező plazmafehérjéknek (általában több mint 20 órával hosszabb felezési idő) a találmányunk szerinti oldható polipeptidekkel történő hibridizációja az oldható polipeptidek hatásidőtartamának meghosszabbítását teszi lehetővé.

Az ilyen plazmafehérjék pl. szérum-albumint, apolipofehérjéket, transzferineket és előnyösen immunoglobulinokat, különösen G-típusú, éspedig célszerűen Gl típusú immunoglobulinokat tartalmaznak.

Az ilyen hibridek az állati vagy emberi szervezetben, amelybe beadagolják, előnyösen nem immunogének és a plazmafehérjék saját biológiai aktivitásuk révén a betegekben káros mellékhatásokat nem idéznek elő.

Találmányunk előnyös kiviteli alakja értelmében a találmányunk szerinti vízoldható polipeptidnek az immunoglobulinnal történő konjugálását célszerűen annak konstans tartományának szintjén végezzük el. Előnyösen G-típusú - különösen előnyösen Gl típusú immunoglobulint alkalmazunk.

Az immunoglobulinok és néhány variánsuk ismert; ezek sok képviselőjét rekombináns sejttenyészetekkel állítják elő [Kohler és tsai: PNAS, USA, 77, 2197 (1980); Morrison és tsai: Ann. Rév. Immunoi. 2, 239 (1984)].

A találmányunk szerinti, az a- és β-interferon natív receptora extracelluláris részének aktivitásával rendelkező polipeptidek C-terminális végződésükön a könynyű lánc vagy nehéz lánc konstans tartománya N-terminális végződésével lehetnek konjugálva.

Ily módon a változtatható tartomány helyettesíthető és legalább a nehéz lánc konstans tartományának CH2 és CH3 átmeneti tartománya funkcionális aktív formában megtartható.

E célból a megfelelő DNS szekvencia kialakítható és a rekombináns sejttenyészetekben kifejezhető.

Az immunoglobulinok és az a- és β-interferon oldható receptoránál a plazmában hosszabb felezési időt mutató más polipeptidek a fenti receptorral és variánsaival ugyanezen eljárás segítségével konjugálhatók.

Az interferon receptor extracelluláris része legfeljebb 427-436 aminosavat tartalmaz, a kezdeti metionintól kiindulva (lásd 1. melléklet).

A rögzítési tartományt magában foglaló sejttartományt tartalmazó szekvenciákat általában az immunoglobulinok szekvenciájával konjugáljuk.

A konjugáció pontos helye nem döntő jelentőségű tényező. A fentiekben megjelölt kötődési helyek csupán tájékoztató jellegűek és az a- és β-interferon oldható receptora kiválasztási vagy megkötési jellemző

HU 211 284 A9 ismérveinek optimalizálása céljából az oldható interferon receptor számára más szomszédos helyek választhatók ki. Az optimális hely szokásos kísérletek segítségével határozható meg.

Általában azt találtuk, hogy a hibridek a sejtben fejeződnek ki, azonban a rekombináns gazdasejtek kiválasztási képességétől függően bizonyos variációkkal. Az alábbi táblázatban különböző immunoglobulin-interferon receptor fúziókat mutatunk be:

(a) RC1 (b) (RC1)2 (c) (RCh)2 (d) (RCl)2(RCh)2

A fentiekben „R” jelentése az a- és β-interferon oldható receptornak a rögzítés helyét tartalmazó extracelluláris szakaszának része, míg Cl és Ch jelentése a humán immunoglobulin könnyű láncának, illetve nehéz láncának konstans területe. A fenti szerkezetek csupán a fő szerkezeteket képviselik és pl. a közös (J) tartományt vagy az immunoglobulinok más szakaszait vagy a diszulfid hidakat nem mutatják. Ha a megkötési aktivitáshoz ilyen szakaszokra szükség van, úgy ezeknek olyan helyzetben kell jelen lenniük, amelyet az aés β-interferon oldható receptorokban, az a- és β-interferon immunoreceptorokban vagy immunoglobulinban a természetben elfoglalnak.

Ezek a példák a különböző ligand receptorok helyeket tartalmazó bifunkcionális hetero-antitestek olyan képviselői, ahol a VhCh immunoglobulin egy előre meghatározott antigénhez kapcsolódni képes. Más osztályokba tartozó immunoglobulinok nehéz láncainak felhasználása esetén komplexebb szerkezetek keletkeznek (pl. IgM, IgG2, 3, 4, IgA, IgE, IgD, előnyösen IgGl).

Előnyös hibridek keletkeznek olyan oldható a- és β-interferon receptor N-terminálisának fúziójával, amely az a- és β-interferon ligandja számára kötődési helyet az immunoglobulin Gl-t befolyásoló funkciókat tartalmazó antitest Fc C-terminális részében tartalmaz. A kísérleti részben ilyen hibrideket bemutató példákat ismertetünk.

Az ilyen hibridek tipikusan a C-terminális végződésükkel a K-lánc vagy Gl-lánc konstans tartományához kapcsolódó oldható a- és β-interferon receptor első 436 aminosavát vagy első 427 aminosavát tartalmazzák. Az 1. mellékletben leírt oldható a- és β-interferon receptort kódoló DNS-t a PCR reakció [Polymerase Chain Reaction: lásd R. K. Saiki és tsai: Science 239, 487^491 (1988)] és megfelelő restrikciós enzimek kombinálásával, a példákban bemutatott módon szintetizáljuk.

Az (a/b) IFN receptor cDNS-e szekvenciájában az 5’ végződésen és lefelé áramban előre meghatározott helyeken komplementer oligonukleotidokat alkalmazunk, a 2. mellékletben feltüntetett szekvencia alapján.

A PCR reakció templátjaként teljes cDNS-t (Uze és tsai) vagy egy lambda bakterofágot tartalmazó plazmidot alkalmazunk.

Kereskedelmi forgalomban levő cDNS könyvtár is felhasználható; a cDNS fragmens továbbá teljes RNSből vagy jól ismert módszerekkel előállított poliS + RNS-ből közvetlenül is szintetizálható [lásd O. Ohara és tsai: PNAS 86, 5673-77 (1989), J. Delort és tsai: Nucl. Acid Rés. 17, 6439-6448 (1989)]. A cDNS vagy RNS könyvtár emberi sejtekből (pl. Daudi, Namalwa) vagy szervekből (pl. emberi lép) lényegében azonos eredménnyel is kinyerhető.

Úgy látszik, hogy az interferon receptor különleges polipeptid. Szekvenciája azonban bizonyos allelikus változatokat tartalmaz.

A DNS fragmenst egy immunoglobulin könnyű vagy nehéz láncának konstans tartományát kódoló DNS-be illesztjük be; amennyiben a fúzió célja a humángyógyászatban végzendő kezelés, úgy az utóbbi előnyösen valamely humán immunoglobulin.

Áz immunoglobulinokat kódoló DNS-ek ismertek és kereskedelmi úton szerezhetők be vagy szintetizálhatók (lásd pl. Adams és tsai: Biochemistry 19, 2711— 2719 (1980); Gough és tsai: Biochemistry 19, 27022710 (1980); Dolby és tsai: PNAS USA77,6027-6031 (1980); Rice és tsai: PNAS USA 79, 7862-7865 (1982); Falkner és tsai: Natúré 298, 286-288 (1982) és Morrison és tsai: Ann. Rév. Immunoi. 2, 239-256 (1984)].

A hibrideket kódoló DNS-eket előnyösen a gazdasejtekbe transzfektáljuk kifejezésük céljából.

Ha a gazdasejt már transzfekciő előtt nehéz immunoglobulin láncokat termel, úgy a bifunkcionális hetero-antitestek termelése céljából elegendő az a- és β-interferon könnyű láncok oldható receptor hibridjeinek transzfektálása. Hasonlóképpen, ha a gazdasejt már könnyű láncokat kifejez, úgy az a- és β-interferon nehéz láncok oldható receptor hibridjét kódoló DNS transzfektálható a bifunkcionális antitest termelése céljából. Az a- és β-interferon kötődési helyét magában foglaló egy vagy több láncot és változtatható tartományokat magában foglaló egy vagy több láncot tartalmazó bifunkcionális immunoglobulinok kétszeresen specifikusak, és pedig a- és β-interferonokkal, valamint egy előre meghatározott antigénnel szemben. Ezeket a fentiekben ismertetett vagy in vitro eljárásokkal állítjuk elő. Az utóbbi esetben pl. a hibrid F(ab)2 fragmenseit ismert módszerekkel (lásd pl. 4 444 878 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) állítjuk elő.

Bifunkcionális antitestek alternatív módszerrel oly módon állíthatók elő, hogy a kívánt antigénnel szemben specifikus antitesteket kiválasztó B sejteket vagy hibridómákat az immunoglobulin a- és β-interferon oldható receptor hibridjeit termelő sejtekkel (pl. mielómák) fuzionálunk. A bifunkcionális antitestek az ilyen hibridómák tenyészetének felülúszójából nyerhetők ki.

Találmányunk tárgya továbbá DNS szekvenciák, amelyeket az jellemez, hogy a fentiekben leírt vízoldható polipeptideket vagy különösen polipeptidekkel képezett hibridjeiket kódolják.

Az emlős a- és β-interferonokkal szemben magas affinitással rendelkező polipeptidek példáiként a prímátok a- és β-interferonjainak oldható receptorait, a humán, patkány, egér, kutya, macska, szarvasmarha, ló és sertés a- és β-interferonok oldható receptorait említ5

HU 211 284 A9 jük meg. A fenti polipeptideket kódoló fent említett DNS szekvenciák számos területen alkalmazhatók. Közelebbről ezek a szekvenciák vagy szekvencia részek vagy szintetikus vagy félszintetikus kópiáik más cDNS könyvtárak vagy humán vagy állati ganom könyvtárak screenelésére alkalmazhatók, az a- és β-ϊηterferonok oldható receptorához hasonló más DNS szekvenciák hibridizáció útján történő szelektálása céljából. Az ilyen DNS-ek, fragmenseik vagy szintetikus vagy félszintetikus kópiáik az a- és β-interferonok oldható receptorainak variánsait képezik és más variánsok mutáció útján történő előállításánál kiindulási anyagként alkalmazhatók. Az ilyen mutációk a mutált kodonok által kódolt aminosavak szekvenciáját nem képesek megváltoztatni vagy ellenkezőleg az aminosavakat megváltoztatják. Az a- és β-interferonok találmányunk szerinti oldható receptorának termelése vagy felhasználása szempontjából a két mutáció típus előnyös lehet. Ezek a mutációk pl. magas szintű termelést, egyszerűbb tisztítást vagy nagyobb megkötő kapacitást tesznek lehetővé.

Egy DNS szekvencia példájaként a 2. mellékleten feltüntetett 1-1343 nukleotidok szekvenciáját említjük meg.

Az a- és β-interferonok természetes oldható receptorának variánsait kódoló DNS-t előnyösen olyan formában alkalmazzuk, amely a tervezett gazdasejttel kompatibilis emlősök, mikroorganizmusok vagy vírusok transzkripciójára vagy transzlációjára szolgáló ellenőrző elemek ellenőrzése mellett valamely transzkripciós egységben történő kifejezést lehetővé tesz. A megfelelő sejtek transzformálása, transzfektálása vagy infekciója után az ilyen vírusok a rekombináns polipeptid kifejezését lehetővé teszik. Az a- és β-interferonok természetes oldható receptorának variánsai emlősök, élesztők, baktériumok sejtjeiben vagy más sejtekben a megfelelő promotor ellenőrzése mellett kifejezhetők. Baktérium, gomba, élesztő vagy emlős gazdasejtek klónozására és kifejezésére felhasznált vektorokat Pouwels és tsai írták le (Clonins Vectors: A laboratory manual, Elsevier, New York, 1985); e szakkönyv releváns részeire e helyen referenciaként hivatkozunk. A kifejező vektor adott esetben, azonban nem szükségszerűen, egy replikációs helyet valamint egy vagy több, a transzformált sejtek között szelekciót lehetővé tevő szelekciós marker szekvenciát tartalmazhat.

A polipeptideket kódoló DNS-be beillesztett variációk a leolvasó keretet nem változtathatják meg és nem hozhatnak létre a kifejezés szempontjából káros szekunder szerkezeteket termelő komplementer szekvenciákat.

Az interferon természetes oldható receptorának polipeptid variánsai a természetes receptoréval hozzávetőlegesen azonos kötődési hellyel rendelkeznek, bár a receptor jellemzőinek megváltoztatása (pl. a fentiek szerinti javítása) céljából a variánsok szelektálhatók.

Bár a mutációs hely rögzített, maga a mutáció nem az. így pl. az adott helyen lejátszódó mutáció teljesítményének optimalizálása céljából a kodon vagy a célzott tartomány véletlenszerűen mutálható és a kapott polipeptid variánsok screenelhetők a szekunder aktivitások optimális kombinációjának megtalálása végett. A helyettesítéses mutációnak a DNS adott helyeire történő beillesztésére szolgáló módszerek jól ismertek, pl. az Ml3 rendszer. A humán receptort kódoló DNS bármely ismert eljárással előállítható; szekvenciáját a

2. sz. mellékletben tüntetjük fel.

A fentiekben leírt polipeptid szekvenciák klónozására általában prokariótákat alkalmazhatunk, így pl. az E. coli 294 (ATCC 31 446 sz.) törzs különösen hasznosnak bizonyult. Más törzsek is felhasználhatók, különösen az E. coli X 1776 (ATCC 31 537 sz.) törzs.

A találmányunk szerinti polipeptidek baktériumok, élesztők, emlősök sejtjeiben vagy más típusú sejtekben megfelelő promotor ellenőrzése mellett fejezhetők ki; így pl. a találmányunk szerinti rekombináns fehérjék kifejezésére prokarióta rendszerek - pl. E. coli - alkalmazhatók. Az E. coli tipikusan a pBR322 (ATCC 37 017) egy származékának felhasználásával transzformálható; ez egy E. coli törzsből [Bolivár és tsai: Gene 2, 95 (1977)] leszármaztatható plazmid. A pBR322 ampicilinnel és tetraciklinnel szemben rezisztens géneket tartalmaz és egyúttal a transzformált sejtek azonosításának egyszerű eszköze. A pBR322 plazmidnak vagy más mikróba plazmidoknak a rekombináns DNS konstrukciókban általánosan használt kifejezés ellenőrző szekvenciákat kell tartalmaznia vagy olyan mértékben kell módosítva lennie, hogy ilyen szekvenciákat tartalmazzon.

A fenti ellenőrző elemek példáiként az alábbiakat említjük meg: laktóz (lac) promotor [J. Mól. Appl. Génét. 1, 139-147 (1981); ATCC 37 121 számon szerezhető be], β-laktamáz promotor [Chang és tsai: Natúré 275, 615 (1978)], triptofán promotor [Miozzari: J. Bact. 133, 1457-1466 (1978)] és hibrid promotorok pl. tac [H. de Boer és tsai: PNAS USA 80, 21-25 (1983); ATCC 37 138 számon szerezhető be]. Nem korlátozó jelleggel megemlítjük, hogy ide tartoznak a kereskedelmi forgalomban levő vektorok, pl. a fág lambda promotort és hővel szemben labilis cl857 represszort magában foglaló trc vagy pPL-lambda promotort tartalmazó pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Upssala, Svédország).

Más funkcionális promotorok is alkalmasnak bizonyultak. A DNS szekvenciák általánosan ismertek; így ezek megfelelő kötőanyagok vagy adapterek felhasználásával az a- és β-interferon oldható receptora variánsát kódoló DNS-sel konjugálhatók. A bakteriális rendszerek promotorjai ezenkívül az antigén lefelé irányuló áramában elhelyezkedő részét kódoló DNS-hez operatív módon kapcsolódó ún. Shine-Dalgarno (SD) szekvenciát is tartalmaznak.

Találmányunk tárgya továbbá tisztított a- és β-interferonok oldható receptora variánsainak hasznos mennyiségének termelésére szolgáló kifejező vektorok.

A megfelelő gazdatörzs transzformálása és a gazdatörzs megfelelő tenyészetsűrűségig történő tenyésztése után a szelektált promotort megfelelő módon de-represszáljuk (pl. a hőmérséklet emelése vagy kémiai indukció útján), és a mikroorganizmusokat tovább te6

HU 211 284 A9 nyésztjük. A mikroorganizmusokat általában centrifugálással összegyűjtjük, kémiai vagy fizikai módszerekkel lizáljuk és az extraktumot további tisztításhoz kinyerjük.

A mikroorganizmusokat maximális növekedést biztosító és levegőztető körülmények között, erős keverés mellett pl. 10 literes fermentorban fermentáljuk. Előnyösen habzásgátlót alkalmazunk. A törzstenyészetet Mott és tsai által leírt [PNAS USA 82, 88 (1985)] szuperindukciós táptalajban 30 ’C-on tenyésztjük; a de-represszálást 5-6 értékű A600 abszorpciónak megfelelő tenyészetsűrűség mellett, a hőmérséklet 42 C-ra történő emelésével végezzük el és az összegyűjtést a hőmérsékletváltoztatás után 2-20 órával - előnyösen

3-6 órával - hajtjuk végre. A mikroorganizmus tömeget előbb szűréssel vagy más módon koncentráljuk, majd 10 000 g mellett 4 ’C-on 10 percen át centrifugáljuk, végül a pelletet gyorsan megszilárdítjuk. A baktériumtenyészetben termelt rekombináns fehérjéket a pellet extrakciójával, majd egy vagy több szakaszban végzett betöményítéssel, sómentesítéssel vagy ioncseréléssel vagy kizárásos kromatografálással izoláljuk.

Az a- és β-interferonok oldható receptora variánsainak kifejezésére felhasznált mikroorganizmusokat bármely megfelelő módszerrel lizálhatjuk, pl. fagyasztó-felengedő ciklusokkal, mechanikai feltöréssel vagy vegyszerek felhasználásával. Az a- és β-interferonok oldható receptora bizonyos fokig aggregátumok képzésére hajlamos és ez oly módon csökkenthető, hogy az extrakciót és tisztítást detergens (pl. Tween 80 vagy Triton XI00) jelenlétében végezzük el.

Olyan találmányunk szerinti vízoldható polipeptidek esetében, amelyek DNS szekvenciája nem metioninnal kezdődik, az iniciációs szignál felfelé irányuló áramban további metionin aminosavat eredményez és ez képezi a termék N-terminális maradékát. Bár az ilyen, további N-terminális metionint tartalmazó termékek a találmányunk szerinti kompozíciókban és eljárásokban közvetlenül felhasználhatók, előnyösen járunk el oly módon, hogy ezt a metionint előzetesen eltávolítjuk. Az ilyen N-terminális metioninok eltávolítására szolgáló in vivő vagy ex vitro standard módszerek jól ismertek.

A találmányunk szerinti polipeptidek kifejezésére élesztő rendszerek is felhasználhatók, így előnyösen Saccharomyces típusok - mint pl. a könnyen hozzáférhető S. cerevisiae - alkalmazhatók.

Hasznos élesztő vektorok általában az alábbi elemeket tartalmazzák: valamely replikáció eredet és az élesztő transzformációját lehetővé tevő szelekció marker, továbbá egy E. coli pl. E. coli ampicillin rezisztencia gén és S. cerevisae trpl gén, amely triptofánban növekedni képtelen élesztő mutáns szelekciós markere (beszerezhető ATCC 44 076 számon) és a gén felfelé áramban történő transzkripciójának előidézésére az élesztőben szuper-kifejezett génből kapott promotor. A megfelelő gazdaélesztő promotor szekvenciák közé tartozik a 3-foszfoglicerát-kináz vagy más glikolizis enzimek promotorja, a sav foszfatáz promotor (pl. PHO5) és az alfa-típusú kapcsoló faktorok promotorja.

Más élesztő promotorok is felhasználhatók, így pl. promotor tartományok, mint pl. a 2-alkohol-dehidrogenáz [Russel és tsai: J. Bioi. Chem. 258, 2674 (1982)]. Valamely szignál peptid (pl. a heterológ élesztőfehéije kiválasztását lehetővé tevő faktor szignál peptidje) a promotor és a felfelé áramlás irányában kifejezendő, szerkezeti gén közé beilleszthető [lásd Bittér és tsai: PNSA USA 82, 5330 (1984)]. Az élesztő transzformációs módszerek a szakember számára jól ismertek és az egyik reprezentatív módszert Hinnen és tsai ismertették [PNAS USA 75, 1929 (1978)]; utóbbi módszer segítségével trp+transzformánsok 0,67% nitrogéntartalmú élesztő bázist, 0,5% kazamino savakat, 2% glükózt és 10 μg/ml uracilt tartalmazó szelekciós táptalajban szelektálhatok. A PHO5 promotort magában foglaló vektorokat tartalmazó transzformált gazdatörzsek előbb gazdag táptalajban képezett előtenyészetben tenyészthetők, majd a közeg szervetlen foszfátkoncentrációjának csökkentésével de-represszálhatók. A törzset szokásos módszerekkel tenyésztjük.

A rekombináns polipeptidet oly módon nyerjük ki, hogy a glükozidázos enzimes kezeléssel, majd azt követő detergenssel végzett kezeléssel vagy mechanikai úton (pl. préseléssel) lizált sejtpelletet extraháljuk, majd egy vagy több lépésben betöményítjük, sómentesítjük, ioncserélésnek vagy kizárásos kromatografálásnak vetjük alá. Ha a polipeptid a periplazmatikus térbe választódik ki, a membrán külső rétegét károsító és a rekombináns polipeptid felszabadulását lehetővé tevő kémiai kezelés (pl. EDTA felhasználásával) után nyerjük ki. Ha a polipeptid a táptalajba választódik ki, közvetlenül nyerjük ki.

A találmányunk szerinti polipeptideket megfelelő promotorokkal végzett ellenőrzés mellett emlős sejtek felhasználásával is kiválaszthatjuk. Emlős a- és β-interferonok oldható receptorának termeléséhez sejtmentes rendszereket is felhasználhatunk, a találmányunk szerint kialakított DNS-ből leszármaztatható RNS-ek alkalmazása mellett.

Az emlős gazdasejtekben történő kifejezést ellenőrző promotorok különböző forrásokból nyerhetők, pl. vírus genomokból (pl. polioma, majom SV40 vírus, adenovírus, retrovírus, hepatitis citomegalo vírusa) vagy emlős promotorokból (pl. humán beta-globin gén DNSAse I-ére érzékeny helyeket tartalmazó promotor vagy rovar vírus promotorok pl. baculovírus rendszer polihedron promotor). Állati sejtek kifejezésére előnyösen használható az adenovírus-2 kései fő promotorjából leszármaztatható kontroll tartomány.

Az SV40 korai és kései tartományait előnyösen a vírus replikációs eredetét tartalmazó restrikciós fragmens formájában az SV40 vírusból izolálhatjuk [lásd Fiers és tsai: Natúré 273,113 (1978)].

A humán citomegalovírus korai azonnali tartományát egy Hind ΙΠΕ restrikciós fragmens formájában izoláljuk [Greenaway P. J. és tsai: Gene 18, 3 556 360 (1982)]. Az adenovírus-2 kései promotorját a 8-17 térképegységeket tartalmazó Hind III restrikciós fragmens alakjában izoláljuk [S. Hu és J. L. Manley: Proc. Natl. Acad. Sciences (USA 78, 820-824 (1981)]. Szü7

HU 211 284 A9 lőtípusú sejt eredetű eukarióta promotorok is hasznosnak bizonyultak.

Eukarióta kifejező vektorokban a transzkripciót oly módon növeljük, hogy a promotoron kívül aktivátorokat tartalmazó szekvenciákat is beiktatunk. Az aktivátorok DNS elemek, amelyek ugyanazon az oldalon hatnak és 10-3000 bp-t tartalmaznak és a promotor transzkripciós iniciáló kapacitását növelik. Emlős génekre ható sok aktivátor ismert (globin, elasztáz, albumin, inzulin stb.). Általában azonban eukarióta sejteket fertőző vírusok aktivátorait alkalmazzuk. így pl. az alábbi aktivátorokat említjük meg: a replikációs eredet kései oldalának SV40 aktivátora (100-270 bp), a citomegalovírus korai azonnali promotorjának aktivátora, a replikációs eredet kései oldala poliomájának aktivátora és az adenovírus aktivátora. Az eukarióta sejtekben (élesztők, gombák, rovarok, növények, állatok, ember) használt kifejezési vektorok, továbbá a mRNS kifejezésének befolyásolására képes faktorok transzkripciójának hasításához és befejezéséhez szükséges szekvenciákat is tartalmazhatnak. A kifejezési vektorok szelekciós gént tartalmaznak.

Az emlős sejtek szelekciós markerjei közül pl. a dehidrofolát reduktázt (DHFR), timidin-kinázt vagy neomicint említjük meg. Ha ilyen szelekciós markereket a gazda emlőssejtbe transzfektálunk, a szelekciós nyomás hatásának kitett transzformált sejt túlélésre képes. Általában két típusú szelekciós rendszer használatos. Egyrészről olyan mutáns vonalak alkalmazhatók, amelyek növekedése bizonyos ingrediensekkel kiegészített táptalajokon dependens (pl. CHO DHFR-sejtek vagy patkány vagy egér LTK-sejtek). Ezek a sejtek timidin vagy hipoxantin hozzáadása nélkül növekedésre képtelenek és e sejtek túlélésre képesek, ha transzfekció útján funkcionális DHFR vagy TK gént illesztünk be. Ennek megfelelően a DHFR vagy TK gének által nem transzformált sejtek a nem-kiegészített táptalajokban nem növekednek.

Ezenkívül olyan domináns szelekciót alkalmazunk, amely mutáns sejtet nem igényel: pl. a transzfektált sejtet a toxikus anyaggal szemben rezisztenssé tevő gént transzfektáljuk és kifejezzük [lásd Southern és Berg, J. Molec. Appl. Génét. 1, 327 (1982); Millugan és Berg Science, 20, 1422 (1980); Sugden és tsai: Mól. Cell. Bioi. 5,410-413 (1985)].

A sejt bizonyos kromoszóma tartományainak növekedését vagy replikációját amplifikációnak nevezzük és ezt a DHFT-t inaktiváló szelekciós ágensek [pl. methotrexát (MTX)] felhasználásával hozzuk létre. A DHFT gének kópiáinak amplifikációja vagy növekedése nagyobb DHFT termelést és nagyobb mennyiségű MTX-t eredményez. Az amplifikáció foka a táptalaj MTX koncentrációjának növekedésével emelkedik. A kívánt gén amplifikációját a kívánt gén és a kromoszómában kointegrált DHFR gén ko-transzfekciójával érjük el. A kívánt gén és a DHFR gén ko-amplifikációja után a kívánt fehérjét kódoló gén több kívánt fehérjét fejez ki.

A találmányunk szerinti oldható interferon receptor variánsainak kifejezésére gazdasejtként előnyösen majom vesesejteket tartalmazó emlős sejteket alkalmazhatunk [COS-7, ATCC CRL 1651 és kínai hörcsög sejtek, CHO- DHFR-, Urlaub és Chasin, PNAS (USA), 77,4216(1980)].

Az emlős sejtek transzformálására szolgáló módszerek jól ismertek; egy előnyös módszert Graham F. és van dér Eb írtak le [Virology 52, 456-457 (1973)]; e módszer során a DNS-t kalcium-foszfáttal csapják ki. Másik eljárás szerint elektroportációt hajtanak végre [G. Chu és tsai: Nucl. Acid. Red. 15, 1311-1326 (1987)]. Más transzfekciós módszereket is alkalmazhatunk, pl. a magba történő befecskendezést vagy protoplasztokkal végzett fúziót.

A kívánt kontroll és kódoló szekvenciákat tartalmazó kifejező vektorok felépítését jól ismert standard módszerekkel végezzük el [lásd pl. Maniatis T. és tsai: Molecular Cloning, 133-134, Cold Spring Harbor (1982); Current Protocols in Molecular Biology, szerkesztő Ausubel és tsai (1987), kiadó Greene Publishing Associates and Wiley Interscience], A DNS plazmidjait vagy fragmenseit felvágjuk, nagyság szerint osztályozzuk és ismét a kívánt formára hasítjuk.

A helyes plazmid szekvenciákat ligációs keverékekkel E. coli HB101 vagy E. coli K12 294 (ATCC 31 446) törzsekben történő transzformáció után meghatározzuk. Az ampicillinnel szemben rezisztens transzformánsokat kiválasztjuk. A plazmidokat a transzformánsokból izoláljuk és restrikciós enzimekkel vagy szekvencia meghatározással jól ismert módszerek segítségével analizáljuk [lásd Messing és tsai: Nucl. Acid Rés. 9, 309 (1981) vagy Maxam és tsai: Methods in Enzymology 65, 499 (1980)].

A gazdasejteket általában kifejező vektorokkal transzformáljuk, majd olyan megfelelő táptalajban tenyésztjük, amely a promotor kifejezését indukáló anyagokat, a transzformánsok szelektálására szolgáló komponenseket vagy a gének amplifikációját elvégző anyagokat tartalmaz. A kiválasztott kifejező tenyészethez felhasznált fermentációs körülmények (pl. hőmérséklet, pH stb.) a szakember számára jól ismertek.

A találmányunk szerinti polipeptideket rekombináns gazdasejtek felülúszóiból izoláljuk és tisztítjuk. A felülúszókat rendszerint ultraszűréssel töményítjük be, ioncserélő kromatográfiával vagy immunoaffinitással tisztítjuk a várt polipeptidek adszorbeálása, majd azt követő eluálása céljából. Az antigén aggregátumok képzésére erősen hajlamos. Ezért a úsztítás alatt előnyösen detergenseket (pl. Tween 80, Triton XI00 vagy CHAPS) adunk hozzá. A végterméket fehérjékkel (pl. albumin) stabilizáljuk, amelyek adott esetben detergenseket tartalmazhatnak.

Megjegyezzük, hogy a kifejezés ellenőrzésére szolgáló összes vektor vagy szekvencia és az összes gazdasejt nem működik egyformán minden kifejező rendszerben. A megfelelő vektorok, kifejezést ellenőrző szekvenciák és gazdasejtek kiválasztása a jelen találmány oltalmi körén belül a szakember kötelező tudásához tartozik. így pl. egysejtű gazdaszervezetek alábbi tulajdonságaik alapján választandók ki: a kiválasztott vektorral szembeni összeférhetőség; a találmányunk

HU 211 284 A9 szerinti DNS szekvenciák által kódolt termék toxicitása; a szekréciós jellemzők; a megfelelő fehérje hajtogató jellemzők; a fermentációs követelmények; a találmányunk szerinti DNS szekvenciákkal történő kifejezés után nyert rekombináns termékek tisztíthatóságának egyszerűsége.

A fenti paraméterekből a szakember olyan különböző vektor rendszer (kifejezést ellenőrző rendszer) gazdasejt kombinációkat választhat ki, amelyek a találmányunk szerinti DNS szekvenciáknak állati sejtekben nagy méretekben végzett fermentációval vagy tenyésztéssel történő kifejezésére képesek (pl. CHO vagy COS-7 sejtek).

A DNS szekvenciák találmányunk szerinti kifejezése után termelt polipeptideket az állati sejtek fermentlevéből vagy tenyészetéből szokásos módszerekkel izolálhatjuk és tisztíthatjuk. A szakember a megfelelő izolálást és tisztítási módszert a jelen találmány körén belül minden további nélkül meg tudja választani.

Találmányunk tárgya továbbá sejtek, amelyeket az jellemez, hogy a fentiekben leírt polipeptidet kifejezik. Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fenti polipeptidek előállítására, amelyet az jellemez, hogy a fenti polipeptid kifejezésére képes sejtet megfelelő táptalajban fermentálunk.

A találmányunk szerinti polipeptidek immunomodulátorként - különösen immunoszupresszánsként hasznosak és autoimmun betegségek, valamint ojtás kilökődések kezelésére alkalmazhatók.

Ennek megfelelően találmányunk tárgya továbbá gyógyszer, amelyet az jellemez, hogy a fentiekben meghatározott vízoldható polipeptideket tartalmaz.

Találmányunk tárgya továbbá gyógyászati készítmény, amelyet az jellemez, hogy hatóanyagként valamely fentiekben meghatározott gyógyszert tartalmaz.

A tisztított polipeptideket gyógyászatilag alkalmas formára hozhatjuk. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények gyógyászatilag hatásos mennyiségben valamely találmányunk szerinti polipeptidet és gyógyászati hordozóanyagot tartalmaznak. A gyógyászati készítmények szilárd, félszilárd és folyékony formában tabletták, pilulák, porok, injekciós vagy infúziós oldatok alakjában állíthatók elő. Az előnyös kikészítés! forma az adagolás módjától és a terápiás felhasználástól függ. A találmányunk szerinti gyógyászati készítményeket más gyógyászatilag jelentős polipeptidek alkalmazásához hasonló módszerekkel használhatjuk fel és a készítmény formája is más polipeptidekéhez hasonló. így a polipeptidet liofilizált alakban tárolhatjuk, amelyből a felhasználásra kész gyógyszer közvetlenül a felhasználás előtt sterilezőt vízzel alakítható ki és szokásos módon (azaz parenterális, szubkutáns, intravénás, intramuszkuláris vagy intralezionális úton) adagolható. A hatékony dózis 1-5 mg/kg/testtömeg/nap nagyságrendű. Megjegyezzük, hogy ennél kisebb vagy a felső határértéknél kétszer nagyobb dózis káros hatások nélkül befecskendezhető.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítményeket károsan abnormális a- és β-interferon termelésben szenvedő betegeknek, pl. az alábbi betegségek kezelése céljából adhatjuk be; lupus erythematosus, Behcet szindróma, apláziás anémia, diabétes mellitus, sclerosis multiplex, reumatoid arthritis vagy súlyos immunhiányos betegségek vagy AIDS. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények továbbá az immunaktivitást módosító tulajdonságaik révén (pl. NK-sejtek aktiválása vagy hisztokompatibilis antigének kifejezése) szerves ojtások kilökődésében szenvedő betegeknek is beadhatók.

A találmányunk szerinti hatóanyagok természetük és hatásmechanizmusuk révén általános toxicitástól (pl. a kémiai immuno-szupresszánsok - mint pl. glükokortikoidok - toxikus hatása) mentesek és ezért a jelenlegi klinikai gyakorlatban használatos gyógyszerekhez képest komoly javulást jelentenek: pl. az immunrendszer összes elemének sejtosztódását és citokin-szintézisét gátló immuno-szupresszorok vagy származékaik (pl. adrenális kortikoszteroidok) vagy a ciklosporin nevű gyűrűs undekapeptid, amely az immunrendszer aktiválódását szelektíven gátolja és bár nyilvánvaló haladást jelent, azonban számos nem-immunológiai toxikus hatása van [lásd N. Engl. J. Med. 321, 25, 17251738(1989)].

A találmányunk szerinti komponensek továbbá ütés β-interferonoktól eltérő agonisták vagy antagonisták ellenőrzésére is használhatók.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények továbbá a- és β-interferonok oldható receptora kötődési helye tercier szerkezetének meghatározására is felhasználhatók; ez a molekuláris modell elkészítésének előfeltétele, amelyből az immuno-szupresszorként felhasználható gyógyászatilag alkalmas antagonisták vagy vírusellenes és tumorellenes szerként alkalmazható agonisták szintézisében modellként szolgáló szerkezetekre következtetések' vonhatók le.

Találmányunk tárgya végül a fent említett polipeptidek diagnosztikumként, valamint anti-α- és β-interferon antitestek előállítására történő felhasználása.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört a példákra korlátoznánk.

1. példa

Emlős sejtek által kiválasztott natív a- és ^-interferonok vízoldható receptorának és variánsainak kifejezésére szolgáló vektorok felépítése

1. szekció

Natív interferon kifejezésére szolgáló plazmidok felépítése

Teljes cDNS-t tartalmazó és a natív a- és β-interferonok receptorát kódoló DNS fragmenseket PCR reakció felhasználásával szintetizálunk. Templátként a 2. mellékletben leírt a- és β-interferonok receptora cDNS-ének teljes hosszát tartalmazó lambda ZAP bakterofágot alkalmazunk és a reakció primeijeként specifikus oligonukleotidok szolgálnak. Közelebbről, a lambda ZAP bakterofágot egy szintetikus oligonukleotid párral inkubáljuk, amely a cDNS 5’ végén levő anti-érzékelő szállal komplementer, az

HU 211 284 A9 oligo 0:5’-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3’ szekvenciájú oligonukleotidból és a cDNS 3’ végén levő érzékelő szállal komplementer, az oligo-1: 3’-CAAAAAGTCGTCCTCAATGTGA CCATGGCC-5’ szekvenciájú oligonukleotidból áll.

Az oligonukleotidokat oly módon építjük fel, hogy a PCR reakció befejeződése után a kapott DNS fragmensek kettős szála a Pstl enzim számára az 5’ végződésen és a Kpnl számára a 3’ végződésen restrikciós helyet tartalmaz.

A PCR reakciót 100 μΐ reakciótérfogatban PCR pufferben végezzük el, amely 1-1 mM mennyiségben primereket, 100 pg lambda ZAP bakterofágot és 1 egység Taq polimerázt tartalmaz. A reakciókörülmények az alábbiak: 25 ciklus; egy ciklus 95 'C-on egy órán át végzett inkubálásból (denaturálás), 37-40 °C-on 3 percen át történő kezelésből (hibridizáció), majd 72 ’C-on 4 percen át történő melegítésből (polimerizáció) áll. Az utolsó ciklus után a reakciót 72 °C-on 10 percen át folytatjuk és a mintákat 4 ’C-on tároljuk. A reakciótermékeket klorformmal extraháljuk, majd etanolos kicsapás után a termékeket egymás után Kpnl-el és Pstl-el emésztjük. Az 1,7 kb fragmenst (1. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézis után összegyűjtjük és a pSVAdpAl kifejező vektorhoz kapcsoljuk.

A pSVAdpAl kifejező vektort a következőképpen építjük fel:

Az SV40 szekvenciákat a pSV2DHFR plazmidból kapjuk [Subrami és tsai: Molec. Cell. Bioi. 1, 854-864 (1981)]. Ezek a replikációs eredetet, az aktivátort, a korai és kései promotorokat (Pvull-HindlII fragmensek) és a hasító helyei (donor és akceptor) által körülvett antigén intronját, valamint a korai tartomány poliadenilezési helyét (Bgl II-Eco RI fragmens) tartalmazzák.

A 2-adeno kései fő promotor tartományát a pAdD26SVpA plazmidból EcoRi-PstI fragmens) kapjuk [Kaufman és Shimke: P. A.: J. Mól. Bioi. 159, 601121 (1982)]. Ez a promotort, a tripartita vezetőt [Zain és tsai: Cell. 16, 851 (1979)] és egy hibrid hasító helyet tartalmaz, amely a 2-adeno donor hasító helyéből és az immunoglobulin változtatható tartománya akceptor hasító helyéből áll.

A többszörös klónozó hely a pUC18 plazmidban találttal azonos. Ez a Pstl, Sál I, Acc I, Hinc II, Xba I, Bam Hi, Xma I, Sma I, Kpn, Sacl, Bán II, EcoRI számára restrikciós helyeket tartalmaz.

A plazmid az E. coli replikációs eredetét és az ampicillin rezisztens gént tartalmazza és a pML plazmidból származtatták le [Lusky és Botchan: Natúré 293,79-81 (1981)].

A pSVAdl plazmidot egymás után Kpnl-el és Pst I-el emésztjük, majd foszfatázzal kezeljük és a plazmid fő részét tartalmazó fragmenst (2. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk. A

2. fragmenst az 1. fragmenshez kapcsoljuk és a kapcsolt keveréket kompetens E. coli HB 101 sejtekbe transzfektáljuk. A transzformált tenyészetet ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és az ampcillin-rezisztens telepeket szelektáljuk. Ezekből a transzformánsokból a DNS plazmidot elkészítjük és analizáljuk; az elemzés során a megfelelő inzert jelenlétét restrikciós enzimekkel vizsgáljuk és a szekvencia helyességének megerősítése céljából az 5’ és 3’ végződéseken az inzert kapcsolódásait szekvencia-analízissel határozzuk meg.

A natív sejtreceptor emlős sejtekben történő kifejezéséhez a pSVAdIFRpA plazmidot alkalmazzuk.

2. szekció

Az a- és ^-interferon receptorok kiválasztott variánsainak kifejezésére szolgáló plazmidok felépítése

A különböző karboxi terminálisokat tartalmazó receptor különböző törléseit tartalmazó és a receptor kiválasztott formáit kódoló DNS fragmenseket PCR reakció felhasználásával szintetizálunk. Közelebbről, a receptor teljes cDNS-ét tartalmazó lambda ZAP bakterofágot rögzítőként szolgáló különböző szintetikus oligonukleotid párokkal inkubálunk, amelyek az 5’ végen levő anti-érzékelő szállal komplementer, az

5’ vég oligo: 5’-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3’ szekvenciájú oligonukleotidot és a cDNS különböző helyein levő érzékelő szállal komplementer, valamely

3’ vég oligo 1: 3’-GGTCCTTTATGGAGATTTACTCCATGGCC-5’

3’ vég oligo 2: 3’-TCACTGCGACATACACTCACTCCATGGCC-5’

3’ vég oligo 3: 3’-GTCAGACCTTTGTGCGGAACTCCATGGCC-5’

3’ vég oligo 4: 3’-GTCACACAGAAAGGAGTTTACTCCATGGCC-5’

3' vég oligo 5: 3’-CTCTGATGAATAACAGATACTCCATGGCC-5’ szekvenciájú oligonukleotidok közül egyet tartalmaznak.

Az oligonukleotidokat oly módon építjük fel, hogy a PCR reakció befejeződése után a kapott kettős szálú DNS fragmensek a Pstl enzim számára az 5’ végződésen és a Kpnl számára a 3’ végződésen restrikciós helyet tartalmaznak.

A PCR reakciót 100 μΐ reakciótérfogatban PCR pufferben végezzük el, amely 1-1 μΜ mennyiségben primereket, 100 pg lambda ZAP bakterofágot és 1 egység Tag polimerázt tartalmaz. A reakciókörülmények az alábbiak: 25 ciklus; minden ciklus 95 ’C-on egy percen át végzett inkubálásból (denaturálás), 3740 ’C-on 3 percen át végzett kezelésből (hibridizálás) és 72 ’C-on 4 percen át végzett melegítésből (polimerizáció) áll. Az utolsó ciklus után a reakciót 72 ’C-on 10 percen át folytatjuk, majd a mintákat 4 ‘C-on tároljuk. A reakciótermékeket kloroformmal extraháljuk, majd etanolos kicsapás után a termékeket egymás után Kpnl-el és Pstl-el emésztjük. A kívánt fragmenseket alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézis után összegyűjtjük. Az összegyűjtött fragmensek hossza hozzávetőlegesen a következő:

1. reakció (5’ vég oligo+ 3’ vég oligo 1): 1.3 kb fragmens 3

2. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 2): 1.3 kb fragmens 4

HU 211 284 A9

3. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 3): 1,1 kb fragmens 5

4. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 4): 0.9 kb fragmens 6

5. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 5): 0.6 kb fragmens 7

A 3-7-ből származó DNS fragmenseket külön-külön kapcsoljuk a pSVAdpA 1 kifejező vektorhoz.

A pSVAdl plazmidot egymás után Kpn 1-el és Pstlel emésztjük, majd foszfatázzal kezeljük és a plazmid fő részét tartalmazó fragmenst (2. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk. A 2. fragmenst külön-külön kapcsoljuk a 3-7. fragmensekhez és a kapcsolt keveréket kompetens E. coli HB101 sejtekbe transzfektáljuk. A transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és a rezisztens telepeket szelektáljuk. Ezekből a transzformánsokból a DNS plazmidot elkészítjük és analizáljuk; az elemzés során a megfelelő inzert jelenlétét restrikciós enzimekkel vizsgáljuk és a szekvencia helyességének megerősítése céljából az 5’ és 3’ végződéseken az inzert kapcsolódásait szekvencia analízissel határozzuk meg.

A plazmidok elnevezése: pSVAdsIFlpA, pSVAdsIFR2pA, pSVAdsIFR3pA, pSVAdsIFR4pA, pSVAdsIFR5pA. Ezeket a plazmidokat használjuk fel az oldható receptornak és fragmenseinek emlőssejtekben történő kifejezésére.

2. példa

CHO sejtek kifejezése

Miután az oldható receptor átmeneti kifejezését teszteltük, az oldható receptort folyamatosan kifejező stabil sejtvonalakat felépítjük. Ennek elvégzéséhez gazdasejtként dehidrofolátreduktáz-deficiens vonalat alkalmazunk, éspedig a CHO DUK-X vonalat használjuk [E Kao és tsai: PNAS USA, 64, 1284-91 (1969); Chasin L. és Urlaub G.: Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216-80 (1980)]. E rendszer felhasználásával az oldható a- és β-interferon receptort az egér DHFR gént tartalmazó pSV2DHFR vektorral ko-transzfektáljuk [Subrami és tsai: Molec. Cell. Bioi. 7. 854-864 (1981)]. E ko-transzfekció elvégzése előtt az összes plazmidot egy restrikciós enzimmel végzett restrikcióval linearizáljuk és transzfekció előtt minden plazmidot a pSV2DHFR plazmiddal külön-külön összekeverünk oly módon, hogy az SV2DHFR és IFR plazmid aránya 1:10 legyen. Ezáltal az IFR gének kópiáinak egy transzfektánsra eső számát maximalizáljuk. A plazmidok a sejtben polimerek képződése mellett kapcsolódnak, amelyek a gazdasejt kromoszómájában rekombináció segítségével integrálhatók [Haynes és Weissmann: Nucl. Acids. Rés. 11, 687-706 (1983); Scahill

S. J. és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4654-58 (1983)]. A patkány és egér DHFT-t egy a-táptalajban kifejező transzfektánsokat szelektáljuk; az a-táptalaj nukleozidmentes közeg. Ezután a DHFT-t magas szinten kifejező sejtek szelektálása céljából methotrexátot adunk hozzá (MTX; a DHFR-hez kapcsolódó toxikus folát analóg). Az MTX-el szembeni rezisztencia a

DHFR magas fökÖ kifejezésének következménye és gyakran a DHFR gén ampliftkációjának eredménye, amely hosszú kromoszóma szegmenseket - ún. „amplifikált egységeket” - tartalmazhat [Kaufman és Sharp: Molec. Cell. Bioi. 1, 1069-1076 (1981)]. Ily módon a DHFR szekvenciák és oldható a- és β-interferon receptorok ko-integrációja az oldható a- és β-interferon receptorok génjeinek amplifikációját teszi lehetővé.

A stabilan transzfektált sejtvonalakat 10% magzati botjúszérummal kiegészített szelektív táptalajban [DMEM/HAM FI 2 1:1, Gibco] történő klónozással izoláljuk. Ezután a kiónokat a legoldhatóbb a- és β-ϊηterferon receptorokat kifejező klón megtalálása céljából oly módon screeneljük, hogy a kondicionált táptalajt ³⁵C-ciszteinnel történő jelzés után in vivő immunokicsapásnak vetjük alá. Közelebbről, pSVAdIFRpA vagy pSVAdsIFRlpA vagy pSVAdsIFR2pA vagy pSVAdsIFR3pA vagy pSVAdpA vagy pSV2DHFR plazmiddal transzfektált kb. 10⁷ CHO sejtet 5 órán át 37 *C-on 4 ml RPMI cys-táptalajban (Gibco) 100 mCi/ml ³⁵S-ciszteinnel (Amersham) inkubálunk. A sejtek jelzése után 1 ml szűrt kondicionált táptalajt 0,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluoriddal beállítunk és a későbbiekben ismertetésre kerülő módon immunolecsapásnak vetünk alá. A csapadékot elektroforézissel reduktív körülmények között 7,5%-os PAGE gélen [U. K. Laemmli: Natúré 227, 680-85 (1980)] frakcionáljuk.

3. példa

Az oldható a- és ^-interferon receptorok tisztítása

A pSVAdsIFR3pA szerkezetű, a rekombináns oldható a- és β-interferon receptorokat kifejező CHO-sejtek kiónját szelektáljuk és 1% magzati borjú szérummal (FCS), 1 g/liter glükózzal és antibiotikumokkal [pl. sztreptomicinnel és penicillinnel (100 g/ml)] és 0,5 mM MTX-el kiegészített DMEM/HAM F12 (1 : 1) táptalajban 4 üvegben (Becton és Dickinson) 8 napon át tenyésztjük. Afelülúszót összegyűjtjük, 0,2 gm maxi csészén (Gelman Sciences) átszűrjük és a kiválasztott fehérjét FPLC mini Q anioncserélő oszlopon (Pharmacia) betöményítjük. Az oszlopot 100 mM Hepes-t (pH 7), 10% glicerint, 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMFS) és 400 gátlási egység aprotinin kallikreint/ml tartalmazó pufferrel öblítjük, majd nem-folytonos gradiens szerint nátrium-kloriddal (0,2 M-től 1,0 M-ig) eluáljuk. Az oldható receptor az interferon megkötésére képes és ezután a receptor tisztaságának nyomonkövetésére a ¹²⁵jóddal jelzett interferon megkötését használjuk.

A receptort tartalmazó anyagot dializált mono Q oszlopon eluáljuk és Micro-Prodicon típusú készülékben betöményítjük. A 10 000 daltonnái nagyobb molekulatömegű fehérjéket visszatartó membránt használunk. A betöményített anyagot 7,5% poliakrilamidot és 0,1% SDS-t tartalmazó 3 mm-es gélen csapjuk le. Egyidejűleg ugyanezen gél másik oldalán egy mintát (kb. 10 gg) lecsapunk. Elektroforézis után a gél ezen részét elektromos úton polividinil-bifluorid membránra (Millipore) visszük át, majd ^l25jóddal jelzett rekombináns

HU 211 284 A9 humán a 8 interferonnal hibridizáljuk. Ily módon áz oldható receptor helyzetét elektroforézis után azonosíthatjuk. A gélnek az oldható receptort tartalmazó részét kivágjuk, molekuláris ultraszűréssel betöményítjük és az SDS eltávolítása céljából dializáljuk.

4. példa

Az a- és ^-interferonok oldható receptorai variánsainak kifejezésére szolgáló, humán kappa immunoglobulin konstans tartományához és humán gl immunoglobulin konstans tartományához fuzionált plazmidok felépítése

A könnyű lánc fúzió

Az a- és β-interferonok oldható receptorai kifejezésére szolgáló olyan plazmidokat építünk fel, amelyek a kappa immunoglobulin konstans tartományához fuzionált különböző hosszúságú extracelluláris tartományokat tartalmaznak. Ezen plazmidok elnevezése a továbbiakban: pSVAdsIFRIK, pSVAdsIFR2K és pSVAdsIFR3K.

A pSVAdsIFRIK plazmid a metionin iniciácós kodonjától a lizin 436 kodon után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a kappa immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán kappa immunoglobulin treonin 109 kodonjánál kezdődik [Kábát és tsai: Hieter P. A. és tsai Cell 22, 197-207(1980)].

Hasonlóképpen, a pSVAdsIFR2K plazmid a metionin iniciációs kodonjától a glutamát 427 kodon után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a kappa immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán kappa immunoglobulin treonin 109 kodonjánál kezdődik [Kábát és tsai: Hieter P. A. és tsai: Cell 22, 197-207 (1980)].

Ezeket a plazmidokat a következőképpen építjük fel:

A kappa immunoglobulin DNS fragmensét humán lép cDNS könyvtárból szintetizáljuk (Clontech Laboratories, Inc.). A kívánt cDNS szintetizálása céljából a PRC reakcióhoz primerként oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek a publikált DNS szekvencia alapján az előre meghatározott tartományokkal komplementer szekvenciákat tartalmaznak [Hieter P. A. és tsai: Cell 22, 197-207(1980)].

Az oligonukleotid 5’ végződésének szekvenciája a következő:

’-ACTGTGGCTGC ACC ATCTGTCTTC A-3 ’ míg a 3’ végződés szekvenciája az alábbi:

’-CCCTCTCACAATCTCCCTCCATGGCC AG -5’

A PCR reakciót az 1, példában leírt módon végezzük el azzal a változtatással, hogy templátként 1 gg plazmidot alkalmazunk és a reakció után az elegyet a két szál végének helyreállítása céljából 4 trifoszfát nukleozid jelenlétében Klenow polimerázzal kezeljük. A DNS-t a Kpnl restrikciós enzimmel emésztjük és a kívánt fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.

Az oldható a- és β-interferon receptorok fragmenseit kódoló DNS fragmenseket azonos módon szintetizáljuk. Az 5’ oligonukleotid 5’ végződése az 1. példában leírttal azonos, azaz

5’-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3’ míg az oligonukleotid 3’ végződése az alábbi:

’-CTCTTTTGTTTTGGTCCTTTATGG AGATTT-5’ oligo 1

3-TCGTCACAAAAATCACAGCGACATACACTC-5’ oligo 2 ’-CCACG AGGTTTTGTCAG ACCTTTGTGCGGA-5’ oligo 3

A PCR reakciókat az 1. példában leírt módon végezzük el azzal a változtatással, hogy az utolsó reakcióciklus után a reakciótermékeket a két szál végének helyreállítása céljából Klenow polimerázzal kezeljük, majd az IFR1, IFR2 és IFR3 fragmensek kialakítása céljából PstL restrikciós enzimmel kezeljük.

A pSVAdAl kifejező vektort egymás után Kpnl és Pstl, majd foszfatáz segítségével emésztjük és a plazmid legnagyobb részét tartalmazó P fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.

Három komponenst tartalmazó reakcióban a P fragmenst az immunoglobulin fragmenshez és a sIFRl fragmenshez kapcsoljuk. Hasonlóképpen a P fragmenst az immunoglobulin fragmenshez és a sIFR2 fragmenshez kapcsoljuk, és végül a P fragmenst az immunoglobulin fragmenshez és az sIFR3 fragmenshez kapcsoljuk.

Minden ligációs keveréket külön-külön kompetens E. coli HB101 baktériumba transzformálunk, a transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és az ampicillin-rezisztens telepeket szelektáljuk. A plazmidokat a transzformánsokből izoláljuk és analizáljuk; az analízis során az inzertet restrikciós enzimekkel határozzuk meg vagy az inzert összeillesztés DNS szekvenciájának megerősítéséhez szekvencia meghatározást végzünk. Az a- és β-interferonok oldható receptora fúziójának kifejezéséhez ezeket a plazmidokat alkalmazzuk.

A nehéz lánc fúziói

Az oldható a- és β-interferon receptorok kifejezésére szolgáló, a g 1 immunoglobulin konstans tartományához fuzionált különböző hosszúságú extracelluláris tartományokat tartalmazó plazmidokat építünk fel. Ezen plazmidokat a továbbiakban a következőképpen nevezzük: pSVAdsIFRlgl, pSVAdsIFR2gl és pSVAdsIFR3gl.

A pSVAdsIFRlgl plazmid a metionin iniciációs kodonjától a lizin 436 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és tsai; Ellison J. W. és tsai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071 -4079 (1982)].

Hasonlóképpen, a pSVAdsIFR2gl plazmid a metionin iniciációs kodonjától a glutamát 427 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tarto12

HU 211 284 A9 mánya követ amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és tsai; Ellison J. W. és tsai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)].

A pSVAdsIFR3gl plazmid a metionin iniciációs kodonjától a prolin 360 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és tsai; Ellison J. W. és tsai: Nucl. Acids Rés. 10,4071-4079 (1982)].

Ezeket a plazmidokat a következőképpen építjük fel:

A Gl immunoglobulint kódoló szekvenciát humán lép cDNS könyvtárból szintetizáljuk (Clontech Laboratories Inc.). A kívánt cDNS szintetizálása céljából a PCR reakcióhoz fixerként oligonukleotideket alkalmazunk, amelyek a publikált DNS szekvencia alapján [Ellison és tsai; Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)] előre meghatározott tartományokkal komplementer szekvenciát tartalmaznak.

Az oligonukleotid 5’ végének szekvenciája a következő:

’-GCCTCCACC AAGGGCCC ATCGGTCTTCCCC-3’ míg a 3’ vég szekvenciája az alábbi:

’-G ACAG AGGCCC ATTTACTCACCATGGCCAG-5’

A PCR reakciót a továbbiakban ismertetésre kerülő módon végezzük el.

Az sIFRl, sIFR2 és sIFR3 fragmens a fentiekben leírtakkal azonos és a kifejező vektorokat a korábbiakban, a könnyű lánc fúziója kapcsán leírtak szerint építjük fel.

5. példa

Az oldható a- és ^-interferon receptorok E. coliban történő kifejezésére szolgáló vektorok felépítése

Az sIFR E. coli-ban történő kifejezésére a pHR148 kifejező vektort alkalmazzuk. A pHR148 vektort Rink és tsai írták le [Nucl. Acid. Rés. 12, 6369-6387 (1984)]. A HR148 plazmidot egymás után Ncol restrikciós enzimekkel, majd a két szál végének helyreállítása céljából 4 trifoszfát nukleozidok jelenlétében Klenow polimerázzal és Kpnl-el emésztjük. A foszfatázzal végzett kezelés után a plazmid legnagyobb részét tartalmazó DNS fragmenst (1. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.

Az a- és β-interferonok érett oldható receptorát kódoló DNS fragmenst (azaz amely nem tartalmaz peptidszignált) PCR reakcióval templátként a teljes cDNS-t tartalmazó plazmid (Uze és tsai: Cell.) és primerként egy oligonukleotid-pár felhasználásával szintetizáljuk.

Az oligonukleotid 5’ végének (az interferon N-terminális tartományából származtatható le) szekvenciája a következő:

’-GGTGG AAAA A ATCTAAAATCTCCTC AAAAAG-3’ (oligo 1) míg az oligonukleotid 3’ végének (az interferon transzmembránját éppen megelőző tartományból származtatható le) szekvenciája az alábbi:

’-TCACTGCGAC ATACACTCATCCCATGGCC-5’ (oligo 2).

Az oligonukleotidokat oly módon választjuk meg, hogy PCR fúzió után a szintetizált fragmens a 3’ végződésen egy Kpnl restrikciós enzim helyet és az 5’ végződésen egy „tompa” véget tartalmazzon (lásd 7. ábra).

A PCR reakciót az 1. példában leírtak szerint végezzük el azzal a változtatással, hogy a reakció után a termékeket a két szál végének helyreállítása céljából Klenow polimerázzal, majd Kpnl enzimmel kezeljük. Az 1,3 kb fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk és az 1. fragmenshez ligáljuk.

Egy második DNS fragmenst hasonlóképpen szintetizálunk azzal a változtatással, hogy az 5’ vég oligonukleotidot a ’-GG AAAAAATCTAAAATCTCCTCAAAAAG-3’ szekvenciával helyettesítjük.

A ligációs termékeket E. coli HB101 törzsbe transzformáljuk és a transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészébe öntjük. Az ampicillinrezisztens telepeket szelektáljuk, a plazmidokat a transzformánsokról izoláljuk és analizáljuk; az elemzés során restrikciós enzimekkel emésztjük és az inzert fúziós pontja szekvenciájának megerősítése céljából szekvenciameghatározást végzünk el.

Az oldható receptor E. coli-ban történő kifejezéséhez a ptrpEFRl és ptrpIFR2 elnevezésű plazmidokat alkalmazzuk. A rekombináns fehérje kifejezése céljából a transzformánsokat 1,0 abszorpciós (A650) érték eléréséhez 20-50 ml tenyésztőközegben M9 táptalajba [Rink és tsai: Nucl. Acid. Rés. 12, 6369-6387 (1984)] helyezzük. Ezután a sejteket centrifugáljuk, mossuk, az oldható interferon receptort a feltört sejtekről extraháljuk és tisztítjuk. Az oldható a- és β-interferon receptort Western biot vagy dót biot analízissel, a továbbiakban ismertetésre kerülő módon határozzuk meg.

6. példa

Humán interferon oldható receptorának meghatározására szolgáló módszerek Az oldható receptor meghatározásának módszerei a receptor azon képességén alapulnak, hogy humán a-interferonhoz specifikus módon kötődni képes.

a) Immunokicsapás

A humán a- és β-interferonok oldható receptorának meghatározása azon alapul, hogy az oldható receptor és ¹²⁵jóddal jelzett humán a 8 interferon között komplex képződik, amely a ^l25I-IFN-nek az a 2 interferon terminális aminorésze ellen irányított monoklonális antitesthez történő kapcsolódását gátolja [H. Amheiter és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 2539 (1983)]. Miután az interferon receptorához kötődött, a molekula terminális aminorésze az antitest számára nem hozzáférhető [H. Amheiter és tsai (1983)]. A szabadon mara13

HU 211 284 A9 dó ¹²⁵I-IFN-t az anti-IFN antitesttel komplexbe viszszük, majd A-sepharose fehérje (Pharmacia) hozzáadásával kicsapjuk. Az anti-IFN antitestet az A fehérjével a gyártó instrukciói szerint konjugáljuk.

A meghatározandó oldható receptorok 50 μΐ borát pufferrel (pH 8,3; 0,1 Μ H₃BO₃, M Na₂B₄O₇, 0,075 M NaCl, 0,1% NP4O) képezett sorozathígításait 81 Bq per fmól fajlagos aktivitású ¹²⁵jóddal jelzett α 2 interferon konstans mennyiségével (75 pmól) összekeverjük [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzymol. 119C, 267 (1986)] és egy órán át 4 ’C-on inkubáljuk. Konstans mennyiségű A-anti-IFN fehérjét 50 μΐ térfogatban felvesszük, amelyhez 50 μΐ borát puffért (pH 8,3; 0,2 M H₃BO₃, 0,05 M Na₂B₄O₇, 0,15 M NaCl, 0,1% NP40) adunk. Az elegyet egy órán át 4 C-on keverjük, majd Eppendorf-féle mikrocentrifugában 10,000 g mellett egy percen át centrifugáljuk és a felülúszót elöntjük. A csapadékot borát-pufferrel (pH 8,3; 0,1 M H₃BO₃, 0,025 M Na₂B₄O₇, 1 M NaCl, 0,5% NP4O) hatszor, 40 mM HEPES-sel (pH 8) és 2% glicerinnel kétszer, 40 mM HEPES-sel (pH 8) és 1 M karbamiddal egyszer, végül 40 mM HEPES-sel (pH 8) kétszer mossuk. A csapadékban levő immun komplex radioaktivitásának megszámlálása - az interferon-antiinterferon komplex képződés gátlási görbéjével összehasonlítva - az ily módon tesztelt minta oldható a- és β-interferon receptor tartalmának meghatározását teszi lehetővé.

b) Humán a- és ^-interferonok oldható receptáronak meghatározása a jelzett interferon sejtreceptorához történő kötődésének gátlása útján

Az a- és β-interferonok oldható receptorainak sorozathígításait 30 percen át 4 °C-on ¹²⁵jóddal (fajlagos radioaktivitás 25 Bq per fmól) jelzett rekombináns humán α 8 interferon változó koncentrációjú mennyiségeivel (0, 50, 100, 125, 500, 1000 és 2000 NE/ml) inkubáljuk. Ezután különböző ¹²⁵I-IFN oldható receptor keverékekhez 10⁷ sejt/ml végső koncentrációban Daudi humán limfoid sejteket adunk és 2 órán át 4 ’C-on inkubáljuk. A sejteket centrifugáljuk (800 g mellett, 10 percen át), majd a felülúszót elöntjük. Ezután 0,5% magzati borjúszérumot (Flow Laboratories) tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal háromszor mossuk és a sejtekhez kötött radioaktivitást LKB 1270 típusú gamma számlálóval történő számlálással meghatározzuk.

Az a- és β-interferonok oldható receptorának mennyiségét az interferon sejtreceptorához történő specifikus kötődésének gátlási görbéjéből határozzuk meg. A fajlagos megkötés a ^I25I-IFN önmagában és 100-szoros nem-jelzett interferon fölösleg jelenlétében felvett megkötési görbéi közötti különbség.

c) ak- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása „Western biot módszerrel

Az a-interferon receptor jelenlétére vizsgálandó mintát a 30,000 daltonnál nagyobb molekulatömegű fehérjéket visszatartó Amicon Centricon 30 típusú membrán felhasználásával betöményítjük. A mintákat 60 mM trisz-HCl pufferben (pH 6,8; 1,25% SDS, 1 mM PMFS és 400 gátlási egység kallikrein/ml aprotinin) felvesszük és 0,1% SDS-t tartalmazó 7,5% poliakrilamid gélen lecsapjuk. Standard körülmények között végzett elektroforézis után a mintákat „fél-szilárd” típusú elektrotranszfer készülékben (Nova Biot) 200 mA mellett egy óra alatt 39 mM glicint, 48 mM trisz-bázist (pH 8,3) és 18% metanolt tartalmazó pufferben polivinidil-bifluorid-membrándra (Millipore) visszük át. Az átvitel után a membránt 20 mM trisz-bázist, 0,2% Tween 20-t (pH 7,8) és 10% lefölözött tejet tartalmazó pufferrel (Regilait, Franciaország) keverés közben 25 ’C-on 4 órán át keverjük. Ezután 10^1θΜ ¹²⁵I-a 8 interferonnal (fajlagos aktivitás 50 Bq per fentamól) 2 órán át 25 ’C-on keverés közben a fenti pufferben hibridizáljuk. A membránt ugyanezen puffer aliquot részeivel ötször mossuk, majd levegőn szárítjuk és röntgensugárzásra érzékeny filmnek tesszük ki.

A rekombináns humán α 8 (a 8) interferont ¹²⁵jóddal jelezzük, a korábbiakban leírt klóramin módszer [K. E. Mogensen és G. Uze; Methods in Enzym. 119 C, 267 (1986)] módosításával. Ez 25 Bq per fmól vagy 6 Bq per nemzetközi interferon egység fajlagos radioaktivitásnak felel meg.

d) Humán a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása „dót biot” módszerrel

A meghatározandó oldható receptorok preparátumainak sorozathígításait 50 μΐ, 39 mM glicint és 48 mM trisz-bázist (pH 8,3) tartalmazó pufferben végezzük el és polivinidil-bifluorid-membránnal (Millipore) töltött „Bio-Biot” típusú készülék (Biorad) mélyedéseiben ülepedni hagyjuk.

A membránt 4 órán át 25 ’C-on keverés közben 20 mM trisz-bázist, 0,2% Tween 20-t (pH 7,8) és 10% fölözött tejet tartalmazó pufferTel (Regilait, Franciaország) kezeljük. Ezután ugyanebben a pufferben ^l25IIFN α 8-al 10'° M (fajlagos aktivitás 25 Bq per fmól) mellett 25 ’C-on 2 órán át keverés közben hibridizáljuk, majd keverés közben a fenti puffer aliquot részeivel ötször mossuk és röntgensugárzásra érzékeny filmnek tesszük ki. Az autoradiograf analízise és standard görbével történő összehasonlítás segítségével a membránhoz kötődő ¹²⁵I-IFN mennyisége meghatározható és ebből a vizsgált mintában az oldható receptor koncentrációja megállapítható.

A rekombináns humán α 8 (a 8) interferon ^I25jóddal történő jelzését a klóramin T módszer [K. E. Mogensen és G. Uze; Methods in Enzymol. 119C, 267 (1986)] módosításával végezzük el. Ez 25 Bq per fmól vagy 6 Bq per nemzetközi interferon egység fajlagos radioaktivitásnak felel meg.

7. példa

Gyógyászati készítmény

Alábbi összetételű injekciós készítményt állítunk elő:

Komponens	Mennyiség
3. példa szerinti termék	100 mg
Injekciós készítményekben felhasználható excipiens	2 ml

HU 211 284 A9

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy a- és β-interferonokhoz nagy affinitást mutat.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. mellékleten feltüntetett képletnek felel meg.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. mellékletben feltüntetett képletnek megfelelő polipeptidből helyettesítéssel származtatható le.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti vfzoldhatő polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. mellékletben feltüntetett képletnek megfelelő polipeptidből törléssel származtatható le.
5. 5. Vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. mellékleten feltüntetett szekvencia kódolja.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy egy másik polipeptiddel van hibridizálva.
7. 7. A 6. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a másik polipeptid olyan szerkezetű, hogy az emberi szervezetben az említett vízoldható polipeptid bomlását lelassítja.
8. 8. A 7. igénypont szerinti vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy a másik polipeptid egy immunoglobulin.
9. 9. A 8. igénypont szerinti vízoldható polipeptid, azzal jellemezve, hogy az immunoglobulin G típusú, előnyösen Gl típusú.
10. 10. DNS szekvenciák, azzal jellemezve, hogy az

    1-9. igénypontok bánnelyike szerinti polipeptidet kódolják.
11. 11. Sejtek, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bánnelyike szerinti polipeptidet kifejezik.
12. 12. Sejtek, azzal jellemezve, hogy a 6-9. igénypontok bánnelyike szerinti polipeptidet kifejezik.
13. 13. Eljárás az 1-9. igénypontok bánnelyike szerinti vízoldható polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptid kifejezésére képes valamely sejtet megfelelő táptalajban tenyésztünk.
14. 14. Gyógyszer, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vízoldható polipeptidet tartalmaz.
15. 15. Gyógyászati készítmények, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vízoldható polipeptidet tartalmaznak.
16. 16. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vízoldható polipeptidek felhasználása diagnosztikus szerként.
17. 17. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vízoldható polipeptidek felhasználása a- és β-antiinterferon antitestek előállítására.