PT99929A - Processo para a preparacao de cadeias alfa recombinantes do receptor humano da interleucina 5 e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

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"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CADEIAS RECOMBINANTES DO RECEPTOR HUMANO DA INTERLEUCINA 5 E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM" A interleucina-5 (IL-5 ou IL5 ) é uma linfocina segregada pelas células T e pelos mastócitos,pos^ suindo actividades biológicas sobre as células B e sobre os eosinófilos. Admite-se que a actividade sobre as células B esteja restringida ao sistema dos murinos. Não se detectou qualquer actividade num painel de activação de células B em seres humanos ou em ensaios de diferenciação. [Clutterbuck et al., Eur. J. Immunol., 17 (1987) 1743 - 1750].

Na hematopoiese dos murinos, a IL-5 é um sinal selectivo para a proliferação e para a diferenciação da linhagem eosinofílica [Yamaguchi et al., J. Exp. Med., 167 (1988), 43 - 56]. Sobre esta questão, a função da IL--5 apresenta analogias com os factores estimuladores das colónias para outras linhagens mielóides. Por outro lado, a IL-5 humana (h) é bastante poderosa na activação dos eosi nófilos humanos [Lopez et al., J. Exp. Med., 167 (1988); 219 - 224; Saito et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 2288 - 2292)]. A interleucina 5 veicula raediaticamente a sua actividade através de um complexo receptor da membrana celular. Este complexo foi já caracterizado físico-quimica-mente em sistemas de murinos e humanos. As linhas de células precursoras das células B dos murganhos cujo desenvolvimento depende da IL5 foram desenvolvidas a partir da medula óssea e são utilizadas para a análise do receptor da IL5 [Rolink et al., J. Exp. Med., 169 , (1989) 1693-1701 ]. O receptor de IL5 humano pode ser estudado num subclone da linha de células promielociticas HL60 induzida no sentido da diferen ciação dos eosinófilos [Plaetinck et al., J. Exp. Med.,172 (1990) 683 - 691]. A diferenciação eosinofílica inicia-se uta lizando butirato de sódio. Nessas células apenas é possível encontrar sítios de ligação IL5 de alta afinidade (Kd = = 30 pM). Contudo, estudos de ligações cruzadas revelaram a presença de duas cadeias polipeptídicas implicadas na liga ção de IL5, com pesos moleculares com características muito próximas das cadeias e /3do RIL5 dos murinos.

Foi possível utilizar uma cadeia λ<ΉΙΙ.5 humana e solúvel («*RIL5hs) como antagonista da IL-5 em asma crónica ou noutros estados de doença com eosinofilia demonstrada. Por outro lado, foi possível utilizar a«^RIL5hs - 3 - ou a própria cadeia ou o receptor de elevada afinidade global, constituído pela cadeia o< e pela cadeia β [Taver-nier et al., Cell, 66, (1991) 1175-1184] como instrumento para o rastreio dos antagonistas da IL-5.

Consequentemente, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar uma sequência de ADN codificadora para a cadeia o< do receptor da interleucina-5 huma na (R-IL5-h) ou partes correspondentes, especialmente para uma cadeia t^RILShs, um vector constituído por uma sequência de ADN, células hospedeiras eúcarióticas inferiores transformadas com esse vector, proteínas recombinantes codificadas por uma sequência de ADN da presente invenção,especialmente a cadeia RIL5hs recombinante, sendo especialmente preferíveis os que contêm uma sequência de aminoácidos repre sentada na Figura 1, e ainda proporcionar um processo para a produção dessas proteínas através de uma cultura de hospedeiros transformados da presente invenção, num meio adequado isolando-se uma proteína recombinante da presente invenção.

As sequências de ADN preferenciais da presente invenção são aquelas que incorporam os ADNc de inserção de clones de ADNc obtidos a partir de bibliotecas adequadas de ADNc, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 4, por ra£ treio de hibridação conforme descrito, por exemplo, nô‘Êxêm^ pio -5vSão"ainda'preferíveis os ADNc de inserção quando prepa- -c- % rados de acordo com o Exemplo 5, por exemplo, os do clone de ADNc " X gtii - RIL5h12". Por outro lado, as sequêcias de ADN preferenciais da presente invenção são as sequências codificadoras para uma cadeia RIL5hs, especificamente as sequências que incorporam uma sequência representada na Figu · ra 1. A clonagem da sequência de ADN da presen te invenção pode ser efectuada conforme se descreve a seguir. É possível cultivar linhas de células de murinos que contenham o receptor de IL-5 dos murinos (RIL5m) numa forma acoplada à membrana, de acordo com métodos conhecidos na e£ pecialidade ou conforme especificamente descrito, por exemplo, no Exemplo 2. Essas células podem ser depois colhidas por centrifugação, e submetidas a um processo de lise, preparando-se depois um extracto da membrana utilizando um detergente adequado, por exemplo, Triton-X-100. Para se isolar a cadeia do RIL5m, pode fazer-se passar o extrac to de membrana, purificado por centrifugação, por uma matriz de imuno-afinidade. Os anticorpos correspondentes a essa imuno-matriz, designadamente os anticorpos para a cadeia o( do RIL5m podem ser preparados e acoplados a uma matriz adequada utilizando métodos bem conhecidos na especia lidade ou conforme especificamente descrito, por exemplo, nos Exemplos 1-3. A cadeia do "RIL5m pode ser depois purificada pelo método da eletroforese em gel de poliacril^ amida/dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e revelada sob a 5 forma de uma mancha numa matriz adequada. A cadeia do receptor da IL-5 dos murinos assim purificada pode ser caracterizada por métodos da química dos péptidos que são conhecidos pelos especialistas na matéria, tais como, por exemplo, os métodos de sequencia ção dos aminoácidos N-terminais ou os métodos de clivagem enzimática ou os métodos de clivagem peptídica por via qui_ mica. Os fragmentos obtidos por clivagem enzimática ou por clivagem química podem ser separados de acordo com métodos habituais, tais como, por exemplo, HPLC e esses mesmos fragmentos podem ser submetidos a novas sequenciaçdes N-ter minais. A partir da informação acerca da sequên cia de aminoácidos assim obtida é possível produzir oligonu-cleótidos de acordo com métodos conhecidos na especialidade [veja-se, por exemplo, Sambrook et al., s.a.] tendo em con sideração a degenerescência do código genético.

As bibliotecas de ADNc ou de ADN genómico podem ser produzidas mediante métodos conhecidos na especia lidade [Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harobor Laboratory Press 2§ ed., 1989], sendo preferíveis as bibliotecas de ADNc na base da preparação de ARNm a partir de linhas de células que se expressam com eventual indução do RIL5 humano ou de murinos, por exemplo, conforme e£ - 6 - pecificamente descrito no Exemplo 4. 0 rastreio dessas bi^- bliotecas pode então ser efectuado pelos oligonucleótidos [Sanbrook et al., s.a.]. Uma vez identificado um clone específico por esse processo, é possível isolar o fogo que aloja a sequência de ADN pretendida da presente invenção [Sambrook et al., s.a.] e é possível caracterizar as inser ções correspondentes através de uma análise do diagrama de clivagem por enzima de restrição ou correspondente sequen-ciação segundo procedimentos normalizados (Sambrook et al., s.a.). Deve notar-se que as próprias sequências de ADN que hibridam sob rigorosas condições de hibridação (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., s.a.) para proporcionar as da presente invenção e que são codificadoras para proteínas que se ligam ainda à i-L-5 e essas próprias proteínas constituem também um objectivo da presente invenção. Essas sequên cias de ADN podem ser preparadas, por exemplo, por métodos de mutagênese conhecidos na especialidade (veja-se, por exem pio, Sambrook et al.) a partir das correspondentes sequências de ADN naturais.

Tomando como base as sequências assim determinadas e as sequências já conhecidas para alguns recep-tores, é possível determinar as sequências parciais codificadoras para uma subunidade receptora solúvel e é possível Λ A # cortar essas sequências parciais a partir da sequencia com pleta recorrendo a métodos conhecidos [Sambrook et al., s. a., ver também Maliszewski e Fanslow, Tibtech., 8^ ( 1990) 324 - 329]no caso de um ADNc de inserção específico de um clone da presente invenção não ser ja^codificador para um desses RILShs, tal como sucede, por exemplo, no caso cor respondente ao clone de ADNc " X gt11-o< RIL5h12". A sequência completa ou essas sequências parciais podem ser integradas, utilizando métodos conhecidos em vectores descritos na literatura da especialidade,para a sua amplificação e/ou expressão em células procariótas [Sambrook et al., s.a.]. Os organismos hospedeiros procarióticos adequados são, por exemplo, as bactérias de gram negativa e de gram positiva tais como, por exemplo, as estirpes de E. coli,, tais como HB 101 [ATCC N2 33 694] ou E. coli W3110 [ATCC N2 27 325] e E. coli MC1061 [Casadabam e Cohen, J.Mol. Biol., 138 (1980) 179-2073 albergando já as duas últimas o plasmídeo "p3" (Sambrook et al., s.a.) no caso de vectores do tipo pCDM8, tais como IIVX ou pO<RIL5hs (veja-se o Exemplo 9) virem a ser amplificados ou estirpes B.subtilis.

Além disso, as sequências dos ácidos nuc-leicos de acordo com a presente invenção podem ser integradas, recorrendo a métodos conhecidos, em vectores adequados para expressão em células hospedeiras eucarióticas, tais como, por exemplo, células de leveduras, células de insectos e células de mamíferos. Esses vectores, tais como os outros referidos antes, constituem também um dos objectivos da presente invenção.

Um vector de expressão típico para as células dos mamíferos contém um elemento promotor eficiente com o objectivo de proporcionar um bom regime de transcrição, a sequência de ADN que se pretende expressar e sinais para uma terminação e uma poliadenilação eficientes do produto de transcrição. Os elementos adicionais que podem ser utilizados são "aumentadores" que proporcionam nova trans_ criçâo intensificada e sequências que proporcionam, por exem pio, um período de semi-vida mais longo do ARNm. Para a ex pressão de sequências do ácido nucleico em que falte o frag mento de sequncia endógena codificador para um péptido sinal, é possível utilizar vectores que contenham essas sequências adequadas, as quais são codificadoras para péptidos sinal de outras proteínas conhecidas. Veja-se, por exemplo, o vector pLJ268 descrito por (Cullen, B:R. em Cell 46, 973-982 (1986) e também Sharma, S. et al. em Current Communications in Molecular Biology, editado por Gething, M. J., Cold Spring Harbor Lab. 1985, páginas 73-78. A maior parte desses vectores que são uti lizados para uma expressão transitória de uma sequência de ADN particular em células de mamíferos, contém a origem de replicação do vírus SV40. Em células que expressem o anti, geno T do vírus (por exemplo, as células COS), esses vec- - 9

tores são reproduzidos abundantemènte. Todavia, a expressão transitória descrita, por exemplo, no Exemplo 10, não se limita às células COS. Em princípio é possível utilizar para realizar este objectivo qualquer linha de células de mamífero transfectável. Os sinais que podem reali zar uma forte transcrição são, por exemplo, o primeiro e o último promotores de SV40, o promotor e o aumentador do gene "primeiro principal imediato" do HCMV (citomegalo-vírus humano),as RTL ("repetições de terminal longo") de retrovírus, tais como, por exemplo, RSV, HIV e MMTV. Con tudo, é possível utilizar também sinais e genes celulares, tais como, por exemplo, os promotores da actina e os genes da colagenase.

Contudo, alternativamente é possível ob ter também linhas dé células estáveis que possuam a sequência de ADN específica integrada no genoma (cromossoma).

Para esse efeito, a sequência do ADN é co-transfectada em conjunto com um marcador seleccionável, por exemplo, neom_i cina, higromicina, di-hidrofolato redutase (dhfr) ou hipo xantina-guanina-fosforibosilo-transferase (hgpt). A sequên cia de ADN estavelmente incorporada no cromossoma também pode ser abundantemente amplificada. 0 marcador seleccio-nado e adequado para este efeito é, por exemplo, o di-hidrofolato redutase (dhfr). As células de mamíferos (por exemplo, células CHO) que não contêm nenhum gene dhfr intacto'são'assim incubadas com quantidades crescentes de metotrexato após ter sido efectuada a transfecção. Por este processo é possível 10 10

obter linhas de células que contêm mais de um milhar de cópias da sequência de ADN desejada.

As células de mamíferos que podem ser utilizadas para a expressão são, por exemplo, as células das linhas de células humanas Hela [ATCC CCL2] e 293 [ATCC CRL 15731 e também 3T3 [ATCC CCL 163] e as células L, por exemplo [ATCC CCL 149], as células (CHO) [ATCC CCL 61], as células BHK [ATCC CCL 10] e ainda as linhas de células CV 1 [ATCC CCL 70] e COS [ATCC CRL 1650, CRL 1651].

Os vectores de expressão adequados englobam, por exemplo, vectores, tais como pBC12MI [ATCC 67 109], pSV2dhfr [ATCC 37 146], pSVL [Pharmacia, Uppsala, Suécia, pRSVcat [ATCC 37 152], pMSG [Pharmacia, Uppsala, Suécia] e plasmídeos do tipo pCDM8, tais como, por exemplo, p RIL5hs [veja-se o Exemplo 73, os quais, transformados em E. coli MC 1061 (plasmídeo p3 de alojamento) foram depo sitados ao abrigo do Tratado de Budapeste relativo a patentes de invenção na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zell_ kulturen GmbH (DSM) em Braunschweig, na República Federal da Alemanha a 17 de Abril de 1991, com o número de registo DSM 6479. É possível isolar o plasmídeo p RIL5hs a partir de E.coli transformada e depositada, utilizando técnicas conhecidas na especialidade e descritas, por exemplo, pormeno rizadamente no Exemplo 9. As células hospedeiras procarió- 11 ticas transformadas com esses plasmídeos que contêm uma sequência de ADN da presente invenção, especialmente células E. ôoli transformadas constituem também um objectivo da presen te invenção, o mesmo sucedendo com os plasmídeos utilizados para essa transformação. 0 processo segundo o qual essas células são transfectadas depende do sistema de expressão e do sistema vector escolhidos. Para uma visão geral destes méto dos ver, por exemplo, Pollard et al., "DNA transformation of Mammalian Cells" in "Methods in Molecular Biology" [Nuc-leic Acids, Walker, J. M. ed., Humana, Clifton, New Jersey Vol. 2, 1984]. Existem outros métodos descritos por ["High-Efficiency Transformation of Mammalian Cells by Pias mid DNA", Molecular and Cell Biology, 7 (1987), 2745 - 2752] e em Felgner [Felgner et al., "Lipofectin: As células hospe deiras eucarióticas transfectadas com um plasmídeo adequado (vector) da presente invenção, especialmente as células hos pedeiras de mamíferos, considerando-se especialmente preferenciais as células COS, e também os plasmídeos para essa transfecção e expressão da correspondente proteína recombi-nante, constituem também um objectivo da presente invenção. 0 sistema de expressão baculovírus, já anteriormente utilizado com sucesso para a expressão de uma série de proteínas (para um estudo veja-se Luckow e Sum mers, Bio/Technology, 6 (1988) 47-55) pode ser utilizado 12

para a expressão em células de insectos. As proteínas recom binantes podem ser produzidas numa forma autêntica ou como proteínas de fusão. As proteínas assim produzidas também podem ser modificadas, por exemplo, podem ser glicosiladas [Smith et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82 (1987) 8404- -8408]. Para a produção de um baculovirus recombinante que expresse a proteína desejada utiliza-se um vector designado por "vector de transferência". Esta designação significa es pecificamente um plasmídeo que contem a sequência heterólo-ga de ADN sob o controlo de um promotor forte, por exemplo, a correspondente ao gene poliedro, ficando este rodeado pelos dois lados por sequências virais. 0 vector de transferência é depois transfectado no interior das células de insectos conjuntamente com o ADN do baculovirus de tipo sel^ vagem. Os vírus recombinantes originados nas células por recombinação homóloga podem ser depois identificados e isola dos de acordo com métodos conhecidos. Pode encontrar-se uma descrição do sistema de expressão do baculovirus e correspondentes métodos utilizáveis em Luckow e Summers, A Manual of Mathods for Baculovirus Yectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station, Texas A & M University, Bulletin No. 1555, 2§ edição, 1988. A cadeia expressada do receptor IL--5 ou os correspondentes fragmentos podem ser depois purifi^ - 13 - cados a partir da massa celular ou a partir dos sobrenadan tes da cultura de acordo com métodos da química das prote£ nas que são bem conhecidos na especialidade, tais como,por exemplo, a precipitação, por exemplo com sulfato de amónio a diálise, a ultrafiltração, a filtração em gel, a croma-tografia de permuta iónica, SDS-PAGE, focagem isoeléctrica cromatografia por afinidade tal como a cromatografia por imunoafinidade, HPLC ou similares.

Além disso, pode utilizar-se a caceia de receptor da IL-5 ou os correspondentes fragmentos, de acordo com a presente invenção, para a detecção de ago nistas ou de antagonistas de IL-5 utilizando procedimentos que são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. A cadeia do receptor da IL-5 ou os correspondentes fragmentos de acordo com a presente invenção e ainda os seus sais fisiologicamente compatíveis, os quais podem ser preparados mediante métodos bem conhecidos pelos especialistas na matéria, também podem ser utilizados para o tratamento de doenças nas quais esteja implicada a IL-5 e/ou também podem ser utilizados para a produção das correspondentes preparações farmacêuticas. Para satis_ fazer esse objectivo, é possível processar um ou mais dos referidos compostos, sempre que desejado ou necessário em associação com outras substâncias farmaceuticamente activas - 14 - de um modo conhecido, conjuntamente com os materiais veicula res sólidos ou líquidos vulgarmente utilizados. A dosagem dessas preparações pode ser efectuada tomando em consideração os critérios habituais, por analogia com preparações já utilizadas com actividade e estrutura semelhantes. Essas preparações farmacêuticas e a utilização dos compostos da presente invenção para fins terapêuticos constituem também um objectivo da presente invenção.

Após a descrição geral da presente invenção apresenta-se seguidamente Figuras e Exemplos com o fim de ilustrar pormenores da invenção, sem que isso consti^ tua qualquer limitação.

Figura 1

Representa a sequência de ácidos nuc leicos da o< RIL5hs e a sequência de aminoácidos deduzida, estando a correspondente sequência de aminoácidos da RIL5m indicada por baixo representando-se apenas os aminoácidos que são diferentes dos que correspondem à sequência humana.

As sequências são representadas pelas abreviaturas normaliza das para os nucleótidos e para os aminoácidos.

Figura 2 A Figura 2 representa uma caracterização da o< RIL5hs. Os correspondentes pormenores estão des- critos no Exemplo 11.

Figura 3 A Figura 3 representa uma sequência de ADN e uma sequência de aminoácidos derivada de RIL5h, estando a correspondente sequência de aminoácidos da o<RIL5m indicada por baixo, representando-se apenas os aminoácidos que são di ferentes dos correspondentes à sequência humana. As sequências estão representadas pelas abreviaturas normalizadas.

Exemplo 1

Produção de anticorpos monoclonais contra o RIL5 dos murtinos

Efectuou-se a imunização basicamente con forme descrito por A. Rolink et al., (s.a.). Resumidamente ternos rio dia 0 procedeu-se à incubação de 2 x 10 células B13 [Rolink et al., s.a.] com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS-A), misturou-se com o adjuvante de Freud completo (AFC) e injectou-se na pata posterior de ratazanas da estirpe Wistar. Repetiu-se este procedimento sem adjuvante de Freud (AF) ao 52 dia e ao 7e dia. Ao 8s dia pro cedeu-se à remoção dos nodos de linfa regionais e preparou--se uma suspensão celular. Essas células foram fundidas, utilizando PEG 1500 (Boehringer), com células Sp2/0-Ag14 [ATCC CRL 1581] na proporção de 5:1,5. Procedeu-se à dis- 16 16

tribuição das células por placas de microtitulação na presença de 500 pg/ml de IL6h recombinante [Haegeman et al., Europ. J. Biochem., 159 (1986) . 625-632]. Ao 62 dia adi cionou-se 0 mesmo volume de meio contendo uma concentração dupla de aminopterina para selecção das células híbridas. Efectuou-se o tratamento das células ao 82 dia com meio que não continha aminopterina. Procedeu-se à selecção dos hi-bridomas pela capacidade do seu sobrenadante para inibir a IL5m [ Tavernier, <1. et al., DNA, 8^, (1989) 491-501] ou uma proliferação de células B13 induzida pela interleucina -3 do murganho (IL3m) (a medição foi efectuada através de 3 um ensaio de incorporação de H-desoxicitidina conhecido na especialidade). Como fonte de IL3m utilizou-se meio con dicionado proveniente de células WEHI-3 (ATCC No. TIB68). Com os sobrenadantes que demonstraram inibir a actividade procedeu-se a novo teste num ensaio de ligação por competição com a IL5m marcada radioactivamente [de acordo com mé todos conhecidos na especialidade] ou com 0 anticorpo "R52" [um anticorpo monoclonal que reconhece apenas a cadeia /3 do RIL-5 (Rolink et al., s.a.)] em', células B13. Os anticorpos monoclonais dirigidos apenas para a cadeia oç do RIL5m foram identificados pela sua capacidade para inibirem quase completamente a ligação da IL5m e por imunoprecipitação da correspondente cadeia do RIL5m. Os hibridomas seleccionados foram reclonados pelo método de diluição limitadora. - 17

Exemplo 2

Purificação por imunoafinidade da cadeia β RIL5m

Processou-se o desenvolvimento de células B13 em grandes balões rotativos contendo meio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco laboratories, Grand Island N.Y., USA) contendo 5 % de soro de vitela fetal, L-gluta-mina 2 mM, 50 ug/ml de gentamicina e 100 unidades/ml de IL-5 recombinante de murganho, até se obter uma densidade de 2 x 10 células/ml. Concentrou-se por centrifugação cé lulas de culturas de 10 litros efectuou-se a lavagem com PBS e realizou-se a citólise em 200 ml de PBS contendo λ% de Triton-X-100 e uma mistura de inibidores de protease PMSF (1 mM de cloridrato de benzamidina 10 mM e aprotinina na proporção de 100 U/ml). Decorridos 10 minutos em gelo, centrifugou-se o lisado a 1000 x g durante 10 minutos e depois clarificou-se por ultracentrifugação (100' 000 x g) durante 90 minutos à temperatura de 4°C. Diluiu-se o sobre-nadante com NaCl até se obter a concentração final de 0,5 M e submeteu-se a purificação. Ligou-se covalentemente o anti^ corpo ”R52" ao produto proteico "G-Sepharose 4 Fast Flow" (Pharmacia, LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suécia) de acor do com Schneider et al., [J. Biol. Chem., 257 (1982), 10766], para uma concentração de 5 mg/ml de gel. Fez-se passar 200 ml de lisado de células B13, a temperatura de 4°C sobre 2 ml do produto proteico "G-Sepharose 4 Fast Flow" 18- e depois sobre 2 ml de R52 acoplado ao produto proteico "G--Sepharose 4 Fast Flow”, estando ambos carregados numa colu na com 1 cm de diâmetro. 0 fluxo passante foi depois recar regado nas duas colunas. Lavou-se o gel muito bem (100 ml) com um tampão contendo Iris-HCl 50 mM (pH 8,2), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 0,5 ? de NP40 e finalmente tratou-se com 10 ml de NP40 a 0,1 %. Depois realizou-se a eluição das proteínas retidas utilizando 4 ml de dietilamina 50 mM (pH 11) contendo 0,1 % de Nonidet Ρ4θ (NP40), neutralizou-se por adição de Nal^PO^ 1 M e concentrou-se por liofilização.Ava liou-se a pureza por SDS-PAGE e por coloração de 2,5 ? do eluído com Coomassie.

Exemplo 3

Purificação por imunoafinidade da cadeia o< RIL5 dos murinos

Durante a noite misturaram-se a uma temperatura de cerca de 4°C lisa os de células B13 provenientes de 2 x 10 células (processadas através das fracções de coluna de imunoafinidade do "R52" utilizada para purificar o dupleto da cadeia β de acordo com o Exemplo 2) com 2 ml de hidrazida avidgel AX (Bioprobe Int. Inc.) enrique cida com 10 mg de mAbs identificadora da cadeia οζ RIL5m. Carregou-se depois o gel numa coluna e após lavagem intensa (Tris-HCl 50 mM, pH 8,2 EDTA 1 mM, NaCl 0,5 mM-, ò,5 í de NP40; seguindo-se NP40 a 1 % em H20) procedeu-se à elui- - 19 - ção com dietilamina 50 mM, pH 11, 0,01 % de NP40. As fracções seleccionadas foram imediatamente liofilizadas e eom elas se preparou nova suspensão em 2 x tampão de Laem-mli na presença de A -mercapto-etanol. Efectuou-se o pro cessamento das amostras através de 1,5 mm de gel conten do 10 % de PAGE-SDS. Procedeu-se à fixação do gel com 10 % de Hac e 30 % de metanol e depois à coloração com Azul Brilhante de Coomassie. As lâminas que continham a cadeia * RIL5m de 60 kDa foram tratadas com tampão SDS, novamente dispostas em lâminas e submetidas a electroforese em gel re cente contendo PAGE-SDS.

Após transferência para uma membrana de "InHnobilon-P" (Millipore Corp.), e coloração com negro de amido, procedeu-se à excisão da banda dos 60 kDa e digeriu -se in situ com tripsina. Efectuou-se a separação dos pép-tidos em coluna de fase inversa C4 e submeteu-se a análise de sequenciação utilizando um sequenciador de fase gasosa tipo 470A equipado com o analisador de aminoácidos PPTH de tipo 120A, em linha (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Apresenta-se seguidamente as sequências dos aminoácidos (os aminoácidos estão indicados pelas abreviaturas normalizadas) e as sequências dos correspondentes conjuntos de sondas oligonucleotídicas, sintetizadas de acordo com métodos conhecidos na especialidade: 20 peptido 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 WGEWSQPIYVGK

Conjunto oligonuoleotídioo : 32 meros

T

5' CCIAC GTA AATIGG CTG IGA CCA CTC ICC CCA 3' A G T T

T

5' CCIAC GTA AATIGG CTG ACT CCA CTC ICC CCA 3’ AG T G T

Peptido 2

1234 5 6 7 8 HVDLEYHV

Conjunto oligonucleotídico 2 : 23 meros 5' AC ATG ATA TTC TAA ATC IAC ATG 3’

G G C C G G 5' AC ATG ATA TTC IAG ATC IAC ATG 3’

G G C G G 21

Exemplo 4

Construgão de bibliotecas unidlreoelonals de ADNo do^GT11 1.Biblioteca de ADNo das células B13 pré-B dos murinos

Extraiu-se ARNm de células B13 utilizando o sistema de isolamento de ARNm de físeguimento rápido" (Invitrogen Corp.). Utilizando este protocolo isolou-se di-rectamente poli(A) + ARNm a partir de lisados celulares utilizando oligo(dT) celulose; o rendimento obtido correspon-deu aproximadamente a 50 jjlg por 10υ células. Procedeu-se à transcrição inversa de 5 mg de poli(A) + ARNm utilizando um iniciador-adaptador oligodT-Notl 5'-AATTCGCGGCCGC(T)^-3*, Promega Corp.) e Transcriptase Inversa da RNaseH- do Vírus da Leucémila de Murinos Moloney clonada (BRL Life Techonolo-gies, Inc.). 0 ADNc de cordão duplo acoplado a EcoR1 foi preparado utilizando procedimentos descritos (Sambrook et al., s.a.). Recorreu-se à clivagem Not1 para geral uma extremidade aderente 3’ única e seleccionou-se os ADNc em função das suas dimensões (^1.000 p.b.) sobre gel de agarose a 1 %. Após eluição recorrendo ao protocolo de "limpeza de genes" (BIO 101 Inc.), acoplou-se os ADNc nas ramificações EcoR1-Not1 do vector ^ gt11 Sfi-Not (Promega Corp.). Após acondicionamento in vitro foram obtidos cerca de 4 χ’ΊΟ fagos recombinantes. 2. Biblioteca de ADNc (induzida pelo butirato) do clone HL60 humano

Antes da purificação do ARNm procedeu-se 22 ¢- Η à verificação de 15 células do clone HL60 induzida pelo butirato [Fischkoff, Leukemia Res., 12 (1988) 679 -686;

Plaetinck et al., J. Exp. Med., 172 (1990), 683-691; HL60: ATCC-No. CCL 240] para determinação da adequada ligação ^^I-lL5h (cerca de 2 000 sítios de ligação por célu la). Utilizou-se os mesmos protocolos utilizados em 4.1 e obteve-se uma produção comparável de fagos recombinantes.

Exemplo 5

Rastreio de bibliotecas de ADNc de murinos e de seres humanos

Utilizou-se dois conjuntos de sondas oli-gonucleotídicas "Oligonucleótido 1” e 'Oligonucleótido 2” (ver o Exemplo 3) para rastreamento sob diferentes condições de hibridação (veja-se mais adiante), dependendo do tipo de sonda utilizada, de acordo com métodos conhecidos na especia lidade (Sambrook et al., s.a.). Os resultados são apresentados no esquema subsequente. 1. Procedeu-se à selecção de dois clones de ADNc gt11-o^RIL5m 2,3) a partir de uma biblioteca de g ADNc de murinos (foram rastreadas 1,2 x 10 placas)tomando como base a hibridação com ambos os conjuntos de sondas oli_ gonucleotídicas. Para esse efeito preparou-se cargas de placas conforme descrito utilizando membranas de transferên cia "Biodyne A" (Pall), (Sambrook et al., s.a.). 0 oli- - 23 - - 23 -

gonucleótido 1 foi marcado radioactivamente por tratamento com quinase (Sambrook et al., s.a.) e hibridou-se sob condi^ ções de hibridação de "rigor intermédio" (veja-se adiante). 0 oligonucleótido 2 foi marcado radioactivamente por tratamento com quinase (Sambrook et al., s.a.) e hibridou-se sob condições de hibridação de "baixo rigor" (veja-se adi_ ante). 2. Seleccionou-se um clone de ADNc (^gt11-o(RIL5h8) a partir de uma biblioteca de ADNc humano (foram rastreadas 2,4 x 10 placas) tomando como base a hibridação com ambos "oligonucleótido 1" e inserção do ADNc derivado de acordo com métodos conhecidos na especialidade, a partir do clone ^ gt 11— c*RIL5m2 dos murinos.

Marcou-se o oligonucleótido 1 radioactivamente por tratamento com quinase (Sambrook et al., s.a.) e hibridou-se sob condições de hibridação de "fraco rigor". A inserção de ADNc proveniente do \ gt11-c^RIL5m2 foi marcada radioactivamente por marcação aleatória (Sambrook et al., s.a.) e hibridou-se sob condições de hibridação de "rigor intermédio". 3· Seleccionou-se mais 5 clones de ADNc ( Àgt11- o(RIL5h11 —*.15) a partir de metade da biblioteca de ADNc humano rastreado em 2, utilizando a sonda de ADNc do c<RIL5m2. A hibridação foi efectuada sob condições - 24 - de "rigor intermédio". 4. Procedeu-se à selecção de mais 35 clones de ADNc (Ast11- o( RIL5hl6 -^*-51) a partir da outra metade da biblioteca de ADNc humano rastreada em 2, utilizando a sonda de ADNc de o<RlL5h8. A hibridação foi efec-tuada sob condições de "elevado rigor" (veja-se adiante).

Condições de Hibridação F) condições de hibridação de "fraco rigor": -pré-hibridação; 5 x SSC (solução salina tamponada com citrato, conhecida na especialidade; veja-se, por exemplo, Sam-brook et al., s.a.), 5 x meio de Denhardt 0,1 % de SDS, 0,05 % de pirofosfato de sódio, e ADN de esperma de salmão soni-fiçado na proporção de 100 jag/ml; duran te a noite e á temperatura de 42°C. -hibridação: substituiu-se o tampão de pré-hibridação pelo mesmo tampão mas incluindo a sonda marcada radioactiva-mente. -lavagens: 4 lavagens consecutivas (cerca de 30 minutos cada uma) com 2 x SSC, 0,1 % de SDS, à temperatura de 37°C: I) condições de hibridação de "rigor intermédio": - pré-hibridação: 20 % de formamida, 5 x SSC, 5 x meio de Denhardt, EDTA 5 mM, fosfato de sódio 25 mM (pH 6,5), 0,05 % de pirofosfato de sódio, ADN do esperma de salmão sonificado na proporção de 100 jug/ml; durante a noite e à temperatura de 42°C. - hibridação: substituiu-se o tampão de pré-hibrjl dação pelo mesmo tampão mas incluindo a sonda mar cada radioactivamente. - lavagens: 4 lavagens consecutivas (cerca de 30 minutos cada uma) com 2 x SSC, 0,1 % de SDS à temperatura de 37°C. A) condições de hibridação de "alto rigor": - pré-hibridação: 6 x SSC, 5 x meio de Denhardt, 0,5 % de SDS, ADM de esperma de salmão sonifi cado na proporção de 100 jag/ml; durante a noite e á temperatura de 68°C. - hibridação: 6 x SSC, 5 x meio de Denhardt, 0,5 % de SDS, EDTA, 5 mM, ADN de esperma de salmão sonificado na proporção de 100 ^ig/ml incluindo a sonda marcada radioactivamente. - 26 -

- lavagens: foram efectuadas as seguintes lava gens consecutivas (cerca de 30 minutos cada uma): - 2 x SSC, 0,1 % de SDS à temperatura ambiente (duas vezes). - 0,1 x SSC, 0,1 de SDS à temperatura de 68°C (duas vezes).

Exemplo 6

Sequenciagão

Todos os ADNc foram subclonados em vecto-res de tipo pQEMTzf (Promega Corp.) tendo sido gerados mu-tantes de supressão Exo III. Efectuou-se a sequenciagão uti lizando um protocolo com base no procedimento de Sanger e im plicando a Taq polimerase e ADN de cordão simples, com o auxílio de um Sequenciador de ADN automático modelo 370A.

Exemplo 7

Construção do plasmídeo "pocRIL5hs"

As construções plasmídicas foram efectuadas conforme descrito nos parágrafos seguintes. No caso de não haver referências ou pormenores específicos de preparação significa que foram utilizadas metodologias normaliza- - 27 - /

Vr das de acordo com Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual(2nd edn). Cold Spring Harbor, N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Procedeu-se à excisão da inserção a partir do fago X gt11-o(RIL5h12 (veja-se o Exemplo 5) utilizando as enzimas de restrição EcoR1 e Not1. As duas extremidades aderentes foram preenchidas utilizando o fragmento 1 de Klenow da polimerase do ADN de E. ooli na presença dos quatro trifosfatos desoxinucleotídicos e adicionou-se ligantes BstX1 não palindrómicos utilizando ligase do ADN das T4. A sequência desses ligantes é a seguinte: 5’ CTTTAGAGCACA 3' 3’ GAAATCTC 51.

Num passo posterior uniu-se ao plasmídeo pCDM8 a inserção modificada [Seed e Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84 (1987), 3365; Aruffo e Seed, Proo.

Acad. Sei. USA, 84, '(1987) 8573; Seed, Nature, 329 ( 1987) 840] e seleccionou-se para análise a estrutura com a orien tação adequada em relação ao promotor CMV.

Exemplo 8

Transformação de MC1061(p3) de E. coli A transformação de MC 1061 (p3) de E.eoli com o plasmídeo p 0(RIL5hs do Exemplo 7 foi efectuado através do procedimento de electroporação. Em conformidade com as especificações do fabricante utilizou-se ura "Gene Pulser da Bio-RAd" (Richmond, CA, USA) com as especificações seguintes: 25 jiF, 2,5 kV e 200 Ohms.

Exemplo 9

Isolamento do ADN plasmídico

Preparou-se ADN plasmídico proveniente de MC1061 de E. coli transformado conforme descrito no Exemplo 8, recorrendo-se a um procedimento normalizado Birnboim e Doly, Nucl. Acids Res., 7 (1979) 1513; Sambrook et al., 1989, s.a.] com base na lise alcalina, seguindo-se um passo de ultracentrifugação em cloreto de césio. Por este processo separou-se o plasmídeo pO(RIL5hs do plasmídeo p3. A inserção codificadora para o^RIL5hs foi cortada a partir do plasmídeo poçRIL5hs e sequenciada conforme descrito no Exemplo 6. A sequência completa do ácido nucleico e a sequência inferida de aminoácidos da oçRIL5hs encontram-se representadas na Figura 1.

Exempl 10

Expressão da RIL5hs em células COS-1

Procedeu-se à transfecção de células C0S--1 utilizando o protocolo DEAD-Dextran conforme descrito por Sambrook et al., 1989, s.a.. Resumidamente procedeu-se - 29

* % à colheita de células COS-1 subconfluentes por tripsiniza ção e novamente se procedeu à sua distribuição em placas de H p modo a obter-se uma densidade de 2,3 x 10 células/cm, 24 horas antes da transfecção. As monocamadas foram lavadas duas vezes com uma quantidade mínima de meio essencial (MEM)- -Hepes, pH 7,2 e efectuou-se a incubação durante 30 minutos com a mistura de transfecção [10 pg de p o<RIL5hs isolado con forme descrito no Exemplo 9/0,5 mg de DEAD-dextrano (Mr = 6 = 2 x 10; Pharmacia, Uppsala, Suécia)/ml. MEM-Hepes, pH 7,2]. Seguidamente as células foram enriquecidas com 8 volu mes de meio de Eagles pré-aquecido modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10 % de soro de vitela fetal (SVF) e difos-fato de cloroquina 100 e depois efectuou-se a incubação durante 4 horas à temperatura de 37°C. Seguidamente removeu-se o meio por aspiração e procedeu-se à lavagem das mono camadas uma vez com DMEM e depois efectuou-se a incubação durante 3 dias em DMEM + 10 % de SVF.

Exemplo 11

Caracterização da RIL5hs

Preparou-se sobrenadante de células COS--1 transfectadas com o plasmídeo p©(RIL5hs, conforme descrito no Exemplo 10, e procedeu-se a um teste para confirmação da presença de c<RIL5hs secretada num ensaio de ligação por competição conforme se descreve a seguir: procedeu- - 30 -

-se à separação de células COS-1 transfectadas conforme des crito no Exemplo 10 com um plasmídeo contendo um'ADNc codificador para &cRIL5m (para conhecimento da sequência dos aminoácidos veja-se a Figura 1), cuja obtenção foi efectuada a partir de um clone conforme descrito no Exemplo 5 e cuja construção foi efectuada conforme descrito no Exemplo 7, por tratamento com uma solução salina tamponada com fosfato (STF) contendo EDTA 0,5 mM e 0,02 % de azeto de sódio, duran te 30 minutos e à temperatura de 37°C, preparou-se nova 5 suspensão na concentração de 1,5 x 10 células por 0,3 ml de meio de ligação (DMEM +10% de SVF + 0,02 % de azeto de sodio) e incubou-se com I-IL5m 0,8 nM à temperatura de 4°C durante 1 hora na ausência (Figura 2; ligação total) ou na presença (Figura 2; "+ friott, ligação não es pecífica de um excesso 100 vezes de IL5 não marcado. 0 sobr£ nadante das células COS-1 (80 % de meio de ligação) transfectadas com po(RIL5hs (Figura 2, " o^RILShs4) foi testado para verificação da sua capacidade para inibir a ligação de 125 I-IL5m. Efectuou-se também a ligação na presença de 80 % de sobrenadante de células COS-1 não transfectadas (Figura 2, "controlo")· Para se separar da radioactividade livre o 125 I-IL5m ligado a membrana celular, deixou-se sedimentar células COS-1 através de uma amálgama oleosa de ftalato e procedeu-se à contagem dos grânulos individuais num contador de raios gama conforme descrito em [Plaetinck et al., J. Exp. Med., 172 (1990) 683-691]·

Exemplo 12

Construção do plasmídeo ,tpo<'RIL5h,,

Procedeu-se ao isolamento dos ADNc que c£ dificam a o( RIL5h praticando uma estratégia de reacção da cadeia da polimerase da extensão 3' (RCP) [Fritz et al., Nucl. Aoid♦ Res., 19 (1991) 37^7]· Uma vez que o ARNm que codifica a c<RIL5hs tem um comprimento aproximado de apenas 1350 bases, os produtos da RCP derivados do ADNc que codificam a C<RIL5h podem ser seleccionados em função das suas dimensões. Em um primeiro passo procedeu-se à síntese do ADNc utilizando como iniciador um hexamero aleatório, ligado em cadeia com um segmento conhecido de 27 bases na sua extremidade 5'. Depois realizou-se uma reacção da cadeia da polimerase entre um iniciador estimulador complementar da sequência da oç RIL5hs (veja-se a Figura 1) na posição 1036-1055, e um iniciador inverso complementar da sequência posterior terminal (cauda) do hexamero aleatório. Embora a maior parte dos produtos de reacção sejam específicos, a análise da mancha de Southern revelou sequências ÔÇRIL5 apenas nos casos em que se utilizou ARNm de 15 células do clone HL60 induzido pelo buti-rato. Os fragmentos de ADN com mais de 350 pb foram purificados e após a clivagem com Nsil e Sall foram subclonados num vector pUCl8 (Pharmacia, Freiburg, BRD). Depois selec cionou-se os subclones que codificam a or RIL5h em um passo de hibridação da colónia, procedendo desse modo, seleccio- - 32

nou-se também os ADN correspondentes á ©<RIL5hs. A análise da sequência do ADN revelou depois que os subclones com inserções maiores do que 350 pb codificavam realmente a o<RIL5h. Depois gerou-se o ADNc da c<RIL5h com a sua con figuração completa, por excisão da inserção efectuada com Nsil-Sbal (embotado) e a inserção em Nsil - Notl (embotado abriu o vector p©(RIL5hs (veja-se o Exemplo 7). A sequência completa do ADN da RIL5h e a sequência derivada de aminoácidos encontram-se representadas na Figura 3. A sequência do ADN caracteriza-se por uma modificação na posi ção 1243 da sequência do ADN da ©(RIL5hs, resultando numa substituição da parte do terminal 3' por uma nova sequência que abrange a região transmembranal. 0 domínio cito- plásmico tem um comprimento correspondente a 58 aminoácidos. Nesta curta cauda citoplásmica não é possível encontrar um domínio implicado nos processos de transdução do sinal.

Claims (8)

1

R Ε I V INDICAÇÕES 1. - Processo para a preparação de cadeias do rece£ tor humano da interleucina 5 ou partes correspondentes que ainda se ligam à interleucina 5 humana, caracterizado por se culti var células hospedeiras transformadas com um vector de expressão constituído por uma sequência de ADN que codifica a cadeia do receptor humano da interleucina 5 ou partes correspon dentes que ainda se ligam â interleucina 5 humana.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN codificar uma parte solúvel do receptor humano da interleucina 5, ligando-se ainda essa parte solúvel à interleucina 5 humana.

3.- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN ser seleccionada entre as seguintes: (a) sequência de ADN representada a seguir: 3ζτ CwWL. , . yJU . 12 > r—r^r· .rcG.- rCACGCTATGCTAGATG u · αν/uv a Si rCATACACACGACAGACACGGTCCTCCCCACCCTCT.. íTTGAútTACTGGTCGGAACAAGAGGATCj· a CT 170 GTAGACAGGw·e kC AG A CT j - ΓΤΤΤ.- wG ACTGAAGTTTCCTCTCATGTTCAC * μλ* s* * · » Αλλ - m · — .·% « aaAaaOva · 243 \ mm ATC t mm GTG ^O·'· 'J CAT GTA TTA CTC A.C CTT TTG GGva GCC ACT GAG ATA CTG CAA GCT 309 \ Ma c Ile Ile Vai Ale His Val Leu Leu "t a Leu Leu Gly Ala Glu Hs Leu Gin Ala — — — Ma - Val 3rs Vai LôU Ai â. Thr f—m CCT JA* GAA AAG ATT TwA CTT CTC CCA CCT GTC AAT TTC ACC a ι«—ι Λ · « ΑΑλ GTT 353 21 Asp Leu Leu o—~ As? Glu Lys Ile Ser Leu Leu ?r m Pro Vai Asn PÍ13 — * a Lys V ai Asn Mas Lj 3 Phe Leu Ala ACT GCT GCT CAA GTT CCT TTA CAA mmm «, αν» AAA mrn\ ν·«·Λ ΑΛΤ CCT m > m VA, CAA CAA AGG AAT 423 41 *?h.r GIv Leu Ala Gin. Val Leu Leu Gin fP—, ·· r* Lys Prc Asn Pro As? GIn Glu Gin Ar? Asn His Asp h-S GTT AAT CTA <1 > UAA λ «n CAA G.G AAA ATA AAC GCT CCA AAA GAA GAT GAC m <n GAA ACC AGA 43S 51 Vai Asn Leu Glu Tyr Gin Val Lys Xle Asn Ala Pro Lys Glu As? Asp Glu th, — Λ- V As? His Gin Glu As? ATC ACT GAA AGC AAA TCT GTA ACC CTC CAC ΑΛΛ GGu TTT ‘'CA Gv.<\ AGT GTG CGG ACC 549 31 lia mu — Glu Ser lys Cys Val Thr Zl« Leu His Lys Gly Pila Ser Ala Ser Val Ar? *S* lys ?r? GlU Ala aT\. CTC CAG AAC !* < Λ VAU CAC TCA CTA CTG GCC AGC Au7V- TGm GCT TCT m —m gv. « GAA CTT CAT GCC 503 1C1 11a Leu Gin Asn As? His Ser Leu Leu Ala Ser Ser Tr? AI a. Ser Ala Glu LõU Hzs À-ia Lys Ser 5er Thr Thr Val Lys CCA CCA GGG CCT GGA ACC TCA ATT GTG AAT mm t — ·Λ ACT TGC ACC ACA AAC ACT ACA GAA 553 121 Pro Pro Gly Ser Pra Gly Thr Ser ^ ** A Val Asn Leu mu— Cys mu — mu — Asn mw — Thr Glu Val His Val Vai GAC AAT ΤΑΓ TCA mmm AGG TCA TAC CAA GTT mm m • v*w CTT CAC TGC ACC mm — « αν ζιιιφ GTT GCC 723 141 As? Asn Tyr Ser \ A* y Leu Arc Ser Tyr Gin Vai Ser Leu His Cys «T)U — Tr? Leu Vai Gly Ser Ser HiS mu — MÃs Pro Ar? ACA GAT GCC CCT GAG GAC ACG CAG TAT TTT CTC «1 ÍAU ma Φ AGG TAT GGC TCT TGG ACT GAA “39 1ST Thr As? Ala Pro Glu As? T2*r Gin <T*y — Phe Leu Tyr Ar? T7r Gly Ser Tr? Thr Glu Lys Phe Val Leu GAA TGC CAA GAA TAC AGC AAA GAC ACA CTG GGG AGA AAT ATC GCA TGC TGG TTT CCC AGG S49 1S1 Glu Cys Gin Glu m9w~— *J - Ser Lys As? Thr Leu Gly Ar? Asn He* Ala Cys Tr? Phe Pro Ar? Lys Ar? Ala Asn «V, * **«· . ACT mmm k · * ATC crc AGC AAA mmm Gw CGT GAC mmm *?v çmm TCG GTG CTT GTT AAC GGC mmm AGC AAG 309 201 Thr Phe 11 e Leu Ser Lys ciy Ar? As? Tr? Leu Ser Val Leu Val Âsn Gly Ser Ser Lys Asn Phe GlU Gin Ala His Ile . CAC TC? GCT ATC a mm AW CCC mmm GAT CAG CTG GCC /«Wt CAC GCC ATT GAT CAA ATA AAT 959 221 Sis Ser Ala Ils A-. ç Pro Phe As? Gin Leu Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gin Ile Asn Ar? Ala Lys Ser Pro Leu Val mmm Uw · CCA CTG AAT GTC ACA GCA GAG ATT GAA GGA ACT CGT CTC mmm ATC CAA TGG GAG AAA 1029 241 Pro Pro Leu Asn. Val Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Ar? Leu Ser He Glr. Tr? Glu Lys λΓ-, Val Ser Asn Ser Tyr CCA GTG m^m GCT —- CCA ATC CAT TGC TTT GAT m » m 1λ. GAA GTA AAA ATA CAC i λ m ΛΑ« ACA AGC 1039 2S1 Pro Val Ser Ala Pro TI a His Cys Phe As? Tyr Glu Vai Lys Ile His Asn mu- Ar? Leu As? Asn Leu -yr Lys AAT GGA TAT TTG CAG ATA GAA AAA TTG ATC ACC AAT GCA fpmm ATC TCA ATA ^Ml GAT GAT 1149 231 Asn Gly Tyr Leu Gin Ile Glu Lys Leu KeC Thr Asn Ala Phe Ile Ser He Ile As? As? His He Lys He Ala Lys LV3 ctt TCT AAG m AV· GAT GTT CAA GTG AGA CCA GCA GTG AGC TCC ATG TCC AGA GAG GCA GGC 1209 301 Leu Ser Lys Tyr As? Val Cln Val Ar? Ala Ala Vai Ser Ser Mec Cys Ar* Glu AI a Gly Vai "•V* V- Ser Ile Pro He a ?r.o CTC TGG AGT GAG • sfO AGC CAA CCT ΛΑ - TAT GTG GGG TTC mr> -v * ν*Λ AGA ΤΑΛ AGGAGATAACA' rCCA 1272 321 Leu Tr? Ser Glu Ser Gin Pro Ile Tyr Val Gly Phe Ser Ar? Snd Ar? Gly Lys Glu — *mmntí»/nwíH m m t Cwa · . W —..MV-W m — Λ·.Αν. «· TATCTGAAATAAAAACAACAi GCAGGGAT. AGCACATT. aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1351 4

e também os seus cordões complementares, ou os que incorporam essas sequências; (b) sequências de ADN que hibridam com sequências de finidas em (a) ou os seus fragmentos; (c) sequências de ADN que, devido â degeneração do código genético, não hibridam com sequências definidas em (a) e (b), mas que codificam polipeptidos que têm exactamente a me£ ma sequência de aminoácidos.

4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi. cações 1 a 3, caracterizado pelo facto de as células hospedeiras serem procariõticas ou eucariõticas.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de as referidas células hospedeiras eucariõticas serem células hospedeiras de mamíferos.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de as referidas células hospedeiras de mamí feros serem células CHO ou COS.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser do tipo pSV2, pRSV f pBCl2MI, pMSG ou pCDM8.

8.- Processo para a preparação de uma composição far macêutica, caracterizado pelo facto de se incorporar, como ingrediente activo, uma quantidade eficaz de um composto quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em conjunto com um veículo inerte, não tóxico, terapeuticamen-te compatível, eventualmente com outras substâncias farmaceuti. camente activas. O Agente Oficial da Propriedade Industrial