JPH0678772A - ヒトインターロイキン−５受容体のα鎖又はその一部、特にｓｈＩＬ５ＲαをコードするＤＮＡ及びそれを含むベクター、このベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにその製造及び利用方法 - Google Patents
ヒトインターロイキン−５受容体のα鎖又はその一部、特にｓｈＩＬ５ＲαをコードするＤＮＡ及びそれを含むベクター、このベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにその製造及び利用方法Info
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- JPH0678772A JPH0678772A JP3357983A JP35798391A JPH0678772A JP H0678772 A JPH0678772 A JP H0678772A JP 3357983 A JP3357983 A JP 3357983A JP 35798391 A JP35798391 A JP 35798391A JP H0678772 A JPH0678772 A JP H0678772A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 疾病例えば慢性ぜん息などの診断、治療及び
インターロイキン５アンタゴニストのスクリーニングに
有用な、ヒトインターロイキン５−受容体の組換え型α
鎖又はその一部分を遺伝子工学的に調製する。 【構成】 本発明は、ヒトインターロイキン５−受容体
の組換えα鎖又はその一部分、このような受容体又はそ
の一部分に対しコードするＤＮＡ配列、このようなベク
ターで形質転換された宿主細胞及び、このような形質転
換された宿主細胞を用いたこのヒトインターロイキン５
−受容体のα鎖の製造方法及びこのような受容体又はそ
のフラグメントを含む薬剤化合物及び疾病例えば慢性ぜ
ん息などの治療のためのその利用を提供するものであ
る。
インターロイキン５アンタゴニストのスクリーニングに
有用な、ヒトインターロイキン５−受容体の組換え型α
鎖又はその一部分を遺伝子工学的に調製する。 【構成】 本発明は、ヒトインターロイキン５−受容体
の組換えα鎖又はその一部分、このような受容体又はそ
の一部分に対しコードするＤＮＡ配列、このようなベク
ターで形質転換された宿主細胞及び、このような形質転
換された宿主細胞を用いたこのヒトインターロイキン５
−受容体のα鎖の製造方法及びこのような受容体又はそ
のフラグメントを含む薬剤化合物及び疾病例えば慢性ぜ
ん息などの治療のためのその利用を提供するものであ
る。
Description
【０００１】
【従来の技術】インターロイキン−５（ＩＬ−５又はＩ
Ｌ５）は、Ｂ細胞及び好酸球に対して生物学的活性をも
つ、肥満細胞及びＴ細胞により分泌されるリンフォカイ
ンである。Ｂ細胞に対する活性はマウス系統に制限され
るように思われる。ヒトＢ細胞活性化及び分化アッセイ
のパネル内には検出可能な活性は全く見い出せない［Cl
utterbuck 他、Eur. J. Immunol. 17, 1743-1750 (1987
年）］。
Ｌ５）は、Ｂ細胞及び好酸球に対して生物学的活性をも
つ、肥満細胞及びＴ細胞により分泌されるリンフォカイ
ンである。Ｂ細胞に対する活性はマウス系統に制限され
るように思われる。ヒトＢ細胞活性化及び分化アッセイ
のパネル内には検出可能な活性は全く見い出せない［Cl
utterbuck 他、Eur. J. Immunol. 17, 1743-1750 (1987
年）］。
【０００２】マウスの造血においては、ＩＬ−５は好酸
球系列の増殖及び分化のための選択的信号である［山口
他、J. Exp. Med. 167, 43-56 (1988 年）］。この点に
おいて、ＩＬ−５機能は、その他の骨髄系列のためのコ
ロニー刺激因子との相似を示す。同様にヒト（ｈ）ＩＬ
−５は、ヒト好酸球の活性化において非常に有効であ
る。［Lopez 他、J. Exp. Med. 167, 219-224 (1988
年）；斉藤他、Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85, 2288-229
2)] 。
球系列の増殖及び分化のための選択的信号である［山口
他、J. Exp. Med. 167, 43-56 (1988 年）］。この点に
おいて、ＩＬ−５機能は、その他の骨髄系列のためのコ
ロニー刺激因子との相似を示す。同様にヒト（ｈ）ＩＬ
−５は、ヒト好酸球の活性化において非常に有効であ
る。［Lopez 他、J. Exp. Med. 167, 219-224 (1988
年）；斉藤他、Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85, 2288-229
2)] 。
【０００３】インターロイキン５は、細胞膜受容体−複
合体を通してその活性を媒介する。この複合体は、マウ
ス及びヒト系統の両方において物理化学的に特徴づけさ
れてきた。増殖をＩＬ５に依存するマウスのプレＢ細胞
株は、骨髄から得られたものであり、ＩＬ５−受容体分
析のために用いられる［Rolink他、J. Exp. Med. 169,
1693-1701 (1989 年）］。ヒトＩＬ５−受容体は、好酸
球分化へ向けて誘導された前骨髄球細胞株ＨＬ６０のサ
ブクローンについて研究されうる。［Plaetinck 他、J.
Exp. Med. 172, 683-691 (1990 年）］。
合体を通してその活性を媒介する。この複合体は、マウ
ス及びヒト系統の両方において物理化学的に特徴づけさ
れてきた。増殖をＩＬ５に依存するマウスのプレＢ細胞
株は、骨髄から得られたものであり、ＩＬ５−受容体分
析のために用いられる［Rolink他、J. Exp. Med. 169,
1693-1701 (1989 年）］。ヒトＩＬ５−受容体は、好酸
球分化へ向けて誘導された前骨髄球細胞株ＨＬ６０のサ
ブクローンについて研究されうる。［Plaetinck 他、J.
Exp. Med. 172, 683-691 (1990 年）］。
【０００４】好酸球分化は酪酸ナトリウムを用いて開始
される。これらの細胞上には、高い親和力（Kd＝３０p
M）のＩＬ５結合部位しか見い出させない。しかしなが
ら架橋結合研究により、マウスＩＬ５Ｒ−α−及び−β
鎖に非常によく似た分子質量をもつ、ＩＬ５結合に関与
する２つのポリペプチド鎖の存在が明らかになる。
される。これらの細胞上には、高い親和力（Kd＝３０p
M）のＩＬ５結合部位しか見い出させない。しかしなが
ら架橋結合研究により、マウスＩＬ５Ｒ−α−及び−β
鎖に非常によく似た分子質量をもつ、ＩＬ５結合に関与
する２つのポリペプチド鎖の存在が明らかになる。
【０００５】可溶性ヒトＩＬ５Ｒα−鎖（ｓｈＩＬ５Ｒ
α）を、慢性ぜん息又は好酸球増加が示されたその他の
疾病状態のＩＬ−５アンタゴニストとして用いることが
できる。さらに、ｓｈＩＬ５Ｒα又はα−鎖自体或は
又、α−鎖及びβ−鎖から成る全ての高親和力受容体
［Tavernier 他、「Cell」６６、１１７５−１１８４
（１９９１年）］を、ＩＬ−５アンタゴニストのスクリ
ーニングのための一手段として用いることが可能であ
る。
α）を、慢性ぜん息又は好酸球増加が示されたその他の
疾病状態のＩＬ−５アンタゴニストとして用いることが
できる。さらに、ｓｈＩＬ５Ｒα又はα−鎖自体或は
又、α−鎖及びβ−鎖から成る全ての高親和力受容体
［Tavernier 他、「Cell」６６、１１７５−１１８４
（１９９１年）］を、ＩＬ−５アンタゴニストのスクリ
ーニングのための一手段として用いることが可能であ
る。
【０００６】従って、本発明の目的は、ヒトインターロ
イキン−５受容体（ｈＩＬ５−Ｒ）のα−鎖又はその一
部、特にｓｈＩＬ５ＲαをコードするＤＮＡ配列、かか
るＤＮＡ配列を含むベクター、かかるベクターで形質転
換された原核又は真核性宿主細胞、図１に示されるアミ
ノ酸配列を含むものが特異的に好まれる本発明のＤＮＡ
配列によってコードされる組換えタンパク質、特に組換
えｓｈＩＬ５Ｒα、ならびに適切な培地内で本発明の形
質転換された宿主を培養し、本発明の組換えタンパク質
を分離することによりこのようなタンパク質を製造する
方法にある。
イキン−５受容体（ｈＩＬ５−Ｒ）のα−鎖又はその一
部、特にｓｈＩＬ５ＲαをコードするＤＮＡ配列、かか
るＤＮＡ配列を含むベクター、かかるベクターで形質転
換された原核又は真核性宿主細胞、図１に示されるアミ
ノ酸配列を含むものが特異的に好まれる本発明のＤＮＡ
配列によってコードされる組換えタンパク質、特に組換
えｓｈＩＬ５Ｒα、ならびに適切な培地内で本発明の形
質転換された宿主を培養し、本発明の組換えタンパク質
を分離することによりこのようなタンパク質を製造する
方法にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の好ましいＤＮＡ
配列は、例えば例５に記されているハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングにより、例４に記されているような
適切なｃＤＮＡ−ライブラリーから得ることのできるｃ
ＤＮＡクローンのインサートｃＤＮＡを含むものであ
る。さらに好ましいのは、例えば「λｇｔ１１−ｈＩＬ
５Ｒα１２」ｃＤＮＡクローンのインサートｃＤＮＡの
ような例５で調製されるインサートｃＤＮＡである。さ
らに本発明の好ましいＤＮＡ配列は、ｓｈＩＬ５Ｒαを
コードする配列、特定的には、図１に示されているよう
な配列を含む配列である。
配列は、例えば例５に記されているハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングにより、例４に記されているような
適切なｃＤＮＡ−ライブラリーから得ることのできるｃ
ＤＮＡクローンのインサートｃＤＮＡを含むものであ
る。さらに好ましいのは、例えば「λｇｔ１１−ｈＩＬ
５Ｒα１２」ｃＤＮＡクローンのインサートｃＤＮＡの
ような例５で調製されるインサートｃＤＮＡである。さ
らに本発明の好ましいＤＮＡ配列は、ｓｈＩＬ５Ｒαを
コードする配列、特定的には、図１に示されているよう
な配列を含む配列である。
【０００８】本発明のＤＮＡ配列のクローニングは、以
下の要領で達成できる。膜結合形でマウスのＩＬ−５−
受容体（ｍＩＬ５Ｒ）を含むマウス細胞株を、当該技術
分野において既知の方法又は特定的には例２などに記さ
れているような方法に従って培養することができる。次
にこのような細胞を遠心分離によって収集し、溶解さ
せ、例えばトリトン−Ｘ−１００といった適切な界面活
性剤を用いて膜抽出物を調製することができる。ｍＩＬ
５Ｒのα−鎖の分離のためには、遠心分離によって清澄
された膜抽出物をイムノアフィニティー マトリックス
に通すことができる。このような免疫マトリックスに相
応する抗体すなわち、ｍＩＬ５Ｒのα鎖に対する抗体
は、当該技術分野において周知の方法によって、或は
又、例えば例１−３に特定的に示されているような方法
によって調製し、適当なマトリックスに結合させること
ができる。ｍＩＬ５−Ｒのα−鎖は、さらにドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）によって精製し、適切なマトリックスに
ブロットすることができる。
下の要領で達成できる。膜結合形でマウスのＩＬ−５−
受容体（ｍＩＬ５Ｒ）を含むマウス細胞株を、当該技術
分野において既知の方法又は特定的には例２などに記さ
れているような方法に従って培養することができる。次
にこのような細胞を遠心分離によって収集し、溶解さ
せ、例えばトリトン−Ｘ−１００といった適切な界面活
性剤を用いて膜抽出物を調製することができる。ｍＩＬ
５Ｒのα−鎖の分離のためには、遠心分離によって清澄
された膜抽出物をイムノアフィニティー マトリックス
に通すことができる。このような免疫マトリックスに相
応する抗体すなわち、ｍＩＬ５Ｒのα鎖に対する抗体
は、当該技術分野において周知の方法によって、或は
又、例えば例１−３に特定的に示されているような方法
によって調製し、適当なマトリックスに結合させること
ができる。ｍＩＬ５−Ｒのα−鎖は、さらにドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）によって精製し、適切なマトリックスに
ブロットすることができる。
【０００９】このように精製したマウスのＩＬ−５−受
容体鎖は、例えばＮ末端アミノ酸配列決定又は酵素なら
びに化学的なペプチド開裂といった当該技術において既
知であるペプチド化学の方法によって特徴づけることが
できる。酵素又は化学的な開裂により得られたフラグメ
ントは、例えばＨＰＬＣといった通常の方法に従って分
離でき、それ自体さらにＮ末端配列決定を受けることが
できる。
容体鎖は、例えばＮ末端アミノ酸配列決定又は酵素なら
びに化学的なペプチド開裂といった当該技術において既
知であるペプチド化学の方法によって特徴づけることが
できる。酵素又は化学的な開裂により得られたフラグメ
ントは、例えばＨＰＬＣといった通常の方法に従って分
離でき、それ自体さらにＮ末端配列決定を受けることが
できる。
【００１０】こうして得られたアミノ酸配列情報から出
発して、遺伝子コードの縮重を考慮に入れ、当該技術分
野において既知の方法に従って［例えばSambrook他s.a.
参照］オリゴヌクレオチドを製造することができる。
発して、遺伝子コードの縮重を考慮に入れ、当該技術分
野において既知の方法に従って［例えばSambrook他s.a.
参照］オリゴヌクレオチドを製造することができる。
【００１１】当該技術分野において既知の方法［Sambro
ok他、「Molecular Cloning 」第２版、Cold Spring Ha
robor Laboratory Press (1989年）］に従ってｃＤＮＡ
又はゲノムＤＮＡライブラリーを製造することができ、
かくして、例えば例４に特に記されているように、誘導
を伴って又は伴なわずにマウス又はヒトのＩＬ５Ｒを発
現する細胞株からのｍＲＮＡ調製に基づくｃＤＮＡライ
ブラリーが好まれる。このとき、かかるライブラリーは
オリゴヌクレオチドによってスクリーニングされる［Sa
mbrook他、s.a.］。特異的クローンがこのようにしてひ
とたび識別されると、本発明の望ましいＤＮＡ配列を収
容しているファージを分離して［Sambrook他、s.a.] 、
制限酵素開裂パターン分析又は標準的な手順に従った配
列決定［Sambrook他，s.a.] により相応する挿入を特徴
づけることができる。本発明のものに対して、厳しいハ
イブリッド形成条件［Sambrook他、s.a.］の下でハイブ
リッド形成し、かつなおもＩＬ５を結合するタンパク質
をコードするＤＮＡ配列及びこのようなタンパク質自体
も本発明の目的であるということに留意されたい。この
ようなＤＮＡ配列は、例えば相応する天然ＤＮＡ配列か
ら出発して当該技術分野において既知の突然変異誘発方
法によって［例えばSambrook他を参照のこと］、調製す
ることができる。
ok他、「Molecular Cloning 」第２版、Cold Spring Ha
robor Laboratory Press (1989年）］に従ってｃＤＮＡ
又はゲノムＤＮＡライブラリーを製造することができ、
かくして、例えば例４に特に記されているように、誘導
を伴って又は伴なわずにマウス又はヒトのＩＬ５Ｒを発
現する細胞株からのｍＲＮＡ調製に基づくｃＤＮＡライ
ブラリーが好まれる。このとき、かかるライブラリーは
オリゴヌクレオチドによってスクリーニングされる［Sa
mbrook他、s.a.］。特異的クローンがこのようにしてひ
とたび識別されると、本発明の望ましいＤＮＡ配列を収
容しているファージを分離して［Sambrook他、s.a.] 、
制限酵素開裂パターン分析又は標準的な手順に従った配
列決定［Sambrook他，s.a.] により相応する挿入を特徴
づけることができる。本発明のものに対して、厳しいハ
イブリッド形成条件［Sambrook他、s.a.］の下でハイブ
リッド形成し、かつなおもＩＬ５を結合するタンパク質
をコードするＤＮＡ配列及びこのようなタンパク質自体
も本発明の目的であるということに留意されたい。この
ようなＤＮＡ配列は、例えば相応する天然ＤＮＡ配列か
ら出発して当該技術分野において既知の突然変異誘発方
法によって［例えばSambrook他を参照のこと］、調製す
ることができる。
【００１２】このように決定された配列及び或る種の受
容体のすでに知られている配列に基づいて、可溶性受容
体サブユニットをコードする部分的配列が決定され、ｃ
ＤＮＡクローン「λｇｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１２」の場
合などがそうであるように、このようなｓｈＩＬ５Ｒα
を、本発明のクローンの特異的インサートｃＤＮＡがす
でにコードしていない場合においては、既知の方法［Sa
mbrook他、s.a.、 Maliszewski及びFanslow, Tibtech.,
8, 324-329 (1990 年）も参照］を用いて完全な配列か
らこれを切りとることができる。
容体のすでに知られている配列に基づいて、可溶性受容
体サブユニットをコードする部分的配列が決定され、ｃ
ＤＮＡクローン「λｇｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１２」の場
合などがそうであるように、このようなｓｈＩＬ５Ｒα
を、本発明のクローンの特異的インサートｃＤＮＡがす
でにコードしていない場合においては、既知の方法［Sa
mbrook他、s.a.、 Maliszewski及びFanslow, Tibtech.,
8, 324-329 (1990 年）も参照］を用いて完全な配列か
らこれを切りとることができる。
【００１３】このとき、完全な配列又はこのような部分
的配列を、既知の方法を用いて、原核細胞におけるその
増幅及び／又は発現について当該技術分野で記述されて
いるベクターの中に組込ませることが可能である［Samb
rook他、s.a.］。適切な原核性宿主有機体は、例えば、
グラム−陰性細菌及びグラム−陽性細菌、例えば、E.co
liＨＢ１０１［ＡＴＣＣ No.３３６９４］又はE.coliＷ
３１１０［ＡＴＣＣ No.２７３２５］及びE.coliＭＣ１
０６１［Casadabam 及びCohen 、J. Mol. Biol. 138, 1
79-207 (1980年）］といったE.coli菌株［なお、このう
ちE.coliＷ３１１０及びＭＣ１０６１は、πＶＸ又はｐ
ｓｈＩＬ５Ｒα（例９参照）といったｐＣＤＭ８タイプ
のベクターが増幅される場合すでにプラスミド「ｐ３」
（Sambrook他、s.a.) を内含している］又はB. subtili
s(バチルス・ズブチルス）菌株である。
的配列を、既知の方法を用いて、原核細胞におけるその
増幅及び／又は発現について当該技術分野で記述されて
いるベクターの中に組込ませることが可能である［Samb
rook他、s.a.］。適切な原核性宿主有機体は、例えば、
グラム−陰性細菌及びグラム−陽性細菌、例えば、E.co
liＨＢ１０１［ＡＴＣＣ No.３３６９４］又はE.coliＷ
３１１０［ＡＴＣＣ No.２７３２５］及びE.coliＭＣ１
０６１［Casadabam 及びCohen 、J. Mol. Biol. 138, 1
79-207 (1980年）］といったE.coli菌株［なお、このう
ちE.coliＷ３１１０及びＭＣ１０６１は、πＶＸ又はｐ
ｓｈＩＬ５Ｒα（例９参照）といったｐＣＤＭ８タイプ
のベクターが増幅される場合すでにプラスミド「ｐ３」
（Sambrook他、s.a.) を内含している］又はB. subtili
s(バチルス・ズブチルス）菌株である。
【００１４】さらに、本発明に従った核酸配列は既知の
方法を用いて、例えば酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞
といった真核性宿主細胞中での発現のため、適切なベク
ターー内に組込まれうる。上述のようなベクターも又本
発明の目的である。
方法を用いて、例えば酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞
といった真核性宿主細胞中での発現のため、適切なベク
ターー内に組込まれうる。上述のようなベクターも又本
発明の目的である。
【００１５】哺乳動物の細胞のための標準的な発現ベク
ターは、すぐれた転写速度を生ずるための効率のよいプ
ロモーター要素、発現すべきＤＮＡ配列及び、転写の能
率的な終結及びポリアデニル化のためのシグナルを含ん
でいる。使用可能な付加的な要素は、例えばｍＲＮＡの
より長い半減期をもたらすことのできるさらに強められ
た転写及び配列へと導く「エンハンサー」である。シグ
ナルペプチドをコードする内因性配列フラグメントが欠
如している核酸配列の発現のためには、その他の既知の
タンパク質のシグナルペプチドをコードするような適切
な配列を含むベクターを使用することができる。例えば
Cullen, B.R.が「Cell」４６、９７３−９８２（１９８
６年）で、ならびにSharma, S.他が「分子生物学におけ
る時事通信」Gething. M.J., Cold Spring Harbor Lab.
(1985年）編、ｐ７３〜７８で記したベクターｐＬＪ２
６８を参照されたい。
ターは、すぐれた転写速度を生ずるための効率のよいプ
ロモーター要素、発現すべきＤＮＡ配列及び、転写の能
率的な終結及びポリアデニル化のためのシグナルを含ん
でいる。使用可能な付加的な要素は、例えばｍＲＮＡの
より長い半減期をもたらすことのできるさらに強められ
た転写及び配列へと導く「エンハンサー」である。シグ
ナルペプチドをコードする内因性配列フラグメントが欠
如している核酸配列の発現のためには、その他の既知の
タンパク質のシグナルペプチドをコードするような適切
な配列を含むベクターを使用することができる。例えば
Cullen, B.R.が「Cell」４６、９７３−９８２（１９８
６年）で、ならびにSharma, S.他が「分子生物学におけ
る時事通信」Gething. M.J., Cold Spring Harbor Lab.
(1985年）編、ｐ７３〜７８で記したベクターｐＬＪ２
６８を参照されたい。
【００１６】哺乳動物の細胞内の特定のＤＮＡ配列のト
ランジェント発現に用いられるこれらのベクターの大部
分は、ＳＶ４０ウィルスの複製開始点を含んでいる。ウ
ィルスのＴ抗原を発現する細胞（例えばＣＯＳ細胞）に
おいて、これらのベクターは豊富に増殖される。しかし
例えば例１０に記述されているようなトランジェント発
現は、ＣＯＳ細胞に制限されるわけではない。原則とし
て、この目的のために、トランスフェクション可能な全
ての哺乳動物細胞株を使用することが可能である。強い
転写をもたらしうるシグナルは、例えばＳＶ４０のアー
リー及びレイトプロモーター、ＨＣＭＶ（ヒト サイト
メガロウィルス）の「主要な即時−アーリー」遺伝子の
プロモーター及びエンハンサー、例えばＲＳＶ、ＨＩＶ
及びＭＭＴＶといったレトロウィルスのＬＴＲ（「長末
端反復」）である。しかしながら、例えばアクチン及び
コラゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどの細胞遺伝子の
シグナルを用いることも可能である。
ランジェント発現に用いられるこれらのベクターの大部
分は、ＳＶ４０ウィルスの複製開始点を含んでいる。ウ
ィルスのＴ抗原を発現する細胞（例えばＣＯＳ細胞）に
おいて、これらのベクターは豊富に増殖される。しかし
例えば例１０に記述されているようなトランジェント発
現は、ＣＯＳ細胞に制限されるわけではない。原則とし
て、この目的のために、トランスフェクション可能な全
ての哺乳動物細胞株を使用することが可能である。強い
転写をもたらしうるシグナルは、例えばＳＶ４０のアー
リー及びレイトプロモーター、ＨＣＭＶ（ヒト サイト
メガロウィルス）の「主要な即時−アーリー」遺伝子の
プロモーター及びエンハンサー、例えばＲＳＶ、ＨＩＶ
及びＭＭＴＶといったレトロウィルスのＬＴＲ（「長末
端反復」）である。しかしながら、例えばアクチン及び
コラゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどの細胞遺伝子の
シグナルを用いることも可能である。
【００１７】しかしながら代替的には、ゲノム（染色
体）の中に組込まれた特異的ＤＮＡ配列を有する安定し
た細胞株も得ることができる。このためには、ＤＮＡ配
列は、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）又はヒポキシサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇ
ｐｔ）などの選択可能な標識と合わせて同時トランスフ
ェクションされる。染色体に安定した形でとり込まれた
ＤＮＡ配列は、同様に豊富に増幅されうる。このための
適切な選択標識は例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ｄｈｆｒ）である。完全長なｄｈｆｒ遺伝子を全く含
まない哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）はかくして、
トランスフェクションが行なわれた後に増量したメトト
レキセートを含む培地で培養される。このようにして、
１，０００以上の望ましいＤＮＡ配列のコピーを含む細
胞株を得ることができる。
体）の中に組込まれた特異的ＤＮＡ配列を有する安定し
た細胞株も得ることができる。このためには、ＤＮＡ配
列は、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）又はヒポキシサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇ
ｐｔ）などの選択可能な標識と合わせて同時トランスフ
ェクションされる。染色体に安定した形でとり込まれた
ＤＮＡ配列は、同様に豊富に増幅されうる。このための
適切な選択標識は例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ｄｈｆｒ）である。完全長なｄｈｆｒ遺伝子を全く含
まない哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）はかくして、
トランスフェクションが行なわれた後に増量したメトト
レキセートを含む培地で培養される。このようにして、
１，０００以上の望ましいＤＮＡ配列のコピーを含む細
胞株を得ることができる。
【００１８】発現のために用いることのできる哺乳動物
の細胞は例えば、ヒト細胞株Ｈｅｌａ［ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ２］及び２９３［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３］ならび
に３Ｔ３［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３］及びＬ細胞、例え
ば［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１４９］、（ＣＨＯ）細胞［ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ６１］、ＢＨＫ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０］
細胞ならびにＣＶＩ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０］及びＣＯ
Ｓ細胞株［ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０、ＣＲＬ１６５１］
である。
の細胞は例えば、ヒト細胞株Ｈｅｌａ［ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ２］及び２９３［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３］ならび
に３Ｔ３［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３］及びＬ細胞、例え
ば［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１４９］、（ＣＨＯ）細胞［ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ６１］、ＢＨＫ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０］
細胞ならびにＣＶＩ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０］及びＣＯ
Ｓ細胞株［ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０、ＣＲＬ１６５１］
である。
【００１９】適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐ
ＢＣ１２ＭＩ［ＡＴＣＣ６７１０９］、ｐＳＶ２ｄｈｆ
ｒ［ＡＴＣＣ３７１４６］、ｐＳＶＬ［Pharmacia, Upp
sala, スウェーデン］、ｐＲＳＶｃａｔ［ＡＴＣＣ３７
１５２］、ｐＭＳＧ［Pharmacia, Uppsala, スウェーデ
ン］及び、譲渡番号ＤＳＭ６４７９の下で１９９１年４
月１７日にドイツ連邦共和国BraunschweigのDeutsche S
ammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(ＤＳＭ）社で特許を目的としてブタペスト条約の条件
下でE.coliＭＣ１０６１（プラスミドｐ３を内含する）
内で形質転換された形で寄託されたｐｓｈＩＬ５Ｒα
［例７参照］などのｐＣＤＭ８型プラスミド、がある。
このプラスミドｐｓｈＩＬ５Ｒαは、当該技術分野にお
いて既知のものであり例９などに詳述されている寄託さ
れた形質転換済みE.coliから分離されうる。特に形質転
換されたE.coli細胞といった、本発明のＤＮＡ配列を含
むこのようなプラスミドで変換された原核性宿主細胞、
ならびにその形質転換のために用いられるこのようなプ
ラスミドも同様に本発明の目的である。
ＢＣ１２ＭＩ［ＡＴＣＣ６７１０９］、ｐＳＶ２ｄｈｆ
ｒ［ＡＴＣＣ３７１４６］、ｐＳＶＬ［Pharmacia, Upp
sala, スウェーデン］、ｐＲＳＶｃａｔ［ＡＴＣＣ３７
１５２］、ｐＭＳＧ［Pharmacia, Uppsala, スウェーデ
ン］及び、譲渡番号ＤＳＭ６４７９の下で１９９１年４
月１７日にドイツ連邦共和国BraunschweigのDeutsche S
ammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(ＤＳＭ）社で特許を目的としてブタペスト条約の条件
下でE.coliＭＣ１０６１（プラスミドｐ３を内含する）
内で形質転換された形で寄託されたｐｓｈＩＬ５Ｒα
［例７参照］などのｐＣＤＭ８型プラスミド、がある。
このプラスミドｐｓｈＩＬ５Ｒαは、当該技術分野にお
いて既知のものであり例９などに詳述されている寄託さ
れた形質転換済みE.coliから分離されうる。特に形質転
換されたE.coli細胞といった、本発明のＤＮＡ配列を含
むこのようなプラスミドで変換された原核性宿主細胞、
ならびにその形質転換のために用いられるこのようなプ
ラスミドも同様に本発明の目的である。
【００２０】これらの細胞がトランスフェクションされ
る方法は、選択された発現系統及びベクター系統によっ
て異なる。これらの方法の概論は例えばPollard 他著
「分子生物学の方法」内の「哺乳動物細胞のＤＮＡ形質
転換」の中に見られる［「Nuclic acid 」第２巻、１９
８４年、Walker, J.M., 編、Humana, Clifton,ニュージ
ャージ州］。その他の方法はChen及びオカヤマ［「プラ
スミドＤＮＡによる哺乳動物細胞の高効率形質転換」Mo
lecular and Cell Biology、７、２７４５−２７５２、
１９８７年］及びFelgner [Felgner他著「リポフェクチ
ン：高効率の脂質を媒体とするＤＮＡトランスフェクシ
ョン方法」Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417,
1989 年］に見られる。本発明の適切なプラスミド（ベ
クター）でのトランスフェクションを受けた真核性宿主
細胞、特に哺乳動物細胞ひいては特定的にはＣＯＳ−細
胞が最も好まれるような細胞、ならびにそのトランスフ
ェクション及び相応する組換えタンパク質の発現に用い
られるプラスミドも又本発明の目的である。
る方法は、選択された発現系統及びベクター系統によっ
て異なる。これらの方法の概論は例えばPollard 他著
「分子生物学の方法」内の「哺乳動物細胞のＤＮＡ形質
転換」の中に見られる［「Nuclic acid 」第２巻、１９
８４年、Walker, J.M., 編、Humana, Clifton,ニュージ
ャージ州］。その他の方法はChen及びオカヤマ［「プラ
スミドＤＮＡによる哺乳動物細胞の高効率形質転換」Mo
lecular and Cell Biology、７、２７４５−２７５２、
１９８７年］及びFelgner [Felgner他著「リポフェクチ
ン：高効率の脂質を媒体とするＤＮＡトランスフェクシ
ョン方法」Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417,
1989 年］に見られる。本発明の適切なプラスミド（ベ
クター）でのトランスフェクションを受けた真核性宿主
細胞、特に哺乳動物細胞ひいては特定的にはＣＯＳ−細
胞が最も好まれるような細胞、ならびにそのトランスフ
ェクション及び相応する組換えタンパク質の発現に用い
られるプラスミドも又本発明の目的である。
【００２１】一連のタンパク質の発現のためにすでに用
いられて成功をおさめているバキュロウィルス発現系統
［概論については、Luckow及びSummers 共著、バイオ／
テクノロジー ６、４７−５５、１９８８年を参照のこ
と］は、昆虫細胞内での発現のために使用できる。組換
えタンパク質はオーセンティックな形で又は融合タンパ
ク質として生成されうる。このように生成されたタンパ
ク質は又、グリコシル化などのように変更もされうる
［Smith 他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 8404-840
8, 1987 年）。望ましいタンパク質を発現する組換えバ
キュロウィルスの生成のために、いわゆる「トランスフ
ァーベクター」が用いられる。ここで、例えば多角体遺
伝子のプロモーターのような強いプロモーターの制御下
で非相同ＤＮＡ配列を含むプラスミドがこの下に存在
し、そのためこれは両側でウィルス配列によりとり囲ま
れている、ということを理解されたい。このときトラン
スファーベクターは、野生型バキュロウィルスのＤＮＡ
と共に昆虫細胞内にトランスフェクションされる。相同
組換えにより細胞内にもたらされる組換えウィルスはこ
のとき、既知の方法に従って識別され分離されうる。バ
キュロウィルス発現系統及びそこで用いられる方法の概
論は、Luckow及びSummers 「バキュロウィルスベクター
及び昆虫細胞培養手順のための方法の手引き」、Texas
Agricultural Experimental Station, Texas A & M大
学、会報１５５５号、第２版、１９８８年、に記されて
いる。
いられて成功をおさめているバキュロウィルス発現系統
［概論については、Luckow及びSummers 共著、バイオ／
テクノロジー ６、４７−５５、１９８８年を参照のこ
と］は、昆虫細胞内での発現のために使用できる。組換
えタンパク質はオーセンティックな形で又は融合タンパ
ク質として生成されうる。このように生成されたタンパ
ク質は又、グリコシル化などのように変更もされうる
［Smith 他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 8404-840
8, 1987 年）。望ましいタンパク質を発現する組換えバ
キュロウィルスの生成のために、いわゆる「トランスフ
ァーベクター」が用いられる。ここで、例えば多角体遺
伝子のプロモーターのような強いプロモーターの制御下
で非相同ＤＮＡ配列を含むプラスミドがこの下に存在
し、そのためこれは両側でウィルス配列によりとり囲ま
れている、ということを理解されたい。このときトラン
スファーベクターは、野生型バキュロウィルスのＤＮＡ
と共に昆虫細胞内にトランスフェクションされる。相同
組換えにより細胞内にもたらされる組換えウィルスはこ
のとき、既知の方法に従って識別され分離されうる。バ
キュロウィルス発現系統及びそこで用いられる方法の概
論は、Luckow及びSummers 「バキュロウィルスベクター
及び昆虫細胞培養手順のための方法の手引き」、Texas
Agricultural Experimental Station, Texas A & M大
学、会報１５５５号、第２版、１９８８年、に記されて
いる。
【００２２】発現されたＩＬ−５−受容体鎖又はそのフ
ラグメントは次に、例えば硫酸アンモニウムでの析出、
透析、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イムノアフ
ィニティークロマトグラフィーといったアフィニティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの技術的現状におい
て既知のものであるタンパク質化学の方法に従って、細
胞残渣又は培養上澄から精製されうる。
ラグメントは次に、例えば硫酸アンモニウムでの析出、
透析、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イムノアフ
ィニティークロマトグラフィーといったアフィニティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの技術的現状におい
て既知のものであるタンパク質化学の方法に従って、細
胞残渣又は培養上澄から精製されうる。
【００２３】さらに、本発明に従ったＩＬ−５−受容体
鎖又はそのフラグメントは、技術的現状において既知の
ものである手順に従って、ＩＬ−５アゴニスト又はアン
タゴニストの検出のために用いることができる。
鎖又はそのフラグメントは、技術的現状において既知の
ものである手順に従って、ＩＬ−５アゴニスト又はアン
タゴニストの検出のために用いることができる。
【００２４】本発明のＩＬ−５−受容体鎖又はそのフラ
グメントならびに技術的現状において既知の方法に従っ
て製造できる生理学的に相容性のある塩は、同様に、そ
の過程でＩＬ−５が関与する疾病の治療のために及び／
又は相応する薬学調製剤の製造のためにも用いることが
できる。この目的のため、望ましい場合又は必要な場合
にはその他の薬学的に活性な物質と組合せた形で、この
化合物のうちの単数又は複数のものを、通常使用されて
いる固体又は液体のキャリヤ材料を用いて既知の方法で
加工することができる。このような製剤の秤量は、類似
の活性及び構造をもつすでに使用済みの製剤との類推で
通常の基準を考慮に入れて行なうことができる。このよ
うな薬剤及び治療目的のための本発明の化合物の使用も
同様に、本発明の目的である。
グメントならびに技術的現状において既知の方法に従っ
て製造できる生理学的に相容性のある塩は、同様に、そ
の過程でＩＬ−５が関与する疾病の治療のために及び／
又は相応する薬学調製剤の製造のためにも用いることが
できる。この目的のため、望ましい場合又は必要な場合
にはその他の薬学的に活性な物質と組合せた形で、この
化合物のうちの単数又は複数のものを、通常使用されて
いる固体又は液体のキャリヤ材料を用いて既知の方法で
加工することができる。このような製剤の秤量は、類似
の活性及び構造をもつすでに使用済みの製剤との類推で
通常の基準を考慮に入れて行なうことができる。このよ
うな薬剤及び治療目的のための本発明の化合物の使用も
同様に、本発明の目的である。
【００２５】以上に本発明に関し全体的に記述してき
た。以下の図及び例は、制限的な意味をもたずに、本発
明の詳細を例示するためのものである。
た。以下の図及び例は、制限的な意味をもたずに、本発
明の詳細を例示するためのものである。
【００２６】図１は、ｓｈＩＬ５Ｒαの核酸配列及び導
き出されたアミノ酸配列を示す。従って、ｍＩＬ５Ｒα
の相応するアミノ酸配列は、以下においてヒト配列のも
のとは異なるアミノ酸のみ示すことで表示されている。
配列は、ヌクレオチド及びアミノ酸に対する標準的な略
語で表示されている。
き出されたアミノ酸配列を示す。従って、ｍＩＬ５Ｒα
の相応するアミノ酸配列は、以下においてヒト配列のも
のとは異なるアミノ酸のみ示すことで表示されている。
配列は、ヌクレオチド及びアミノ酸に対する標準的な略
語で表示されている。
【００２７】図２は、ｓｈＩＬ５Ｒαの特徴づけを示し
ている。詳細は全て例１１に示されている。
ている。詳細は全て例１１に示されている。
【００２８】図３は、ｈＩＬ５ＲαのＤＮＡ配列及び誘
導されたアミノ酸配列を示す。従って、ｍＩＬ５Ｒαの
相応するアミノ酸配列は、以下においてヒト配列のもの
とは異なるアミノ酸のみ示すことによって表示されてい
る。配列は、標準的略語で表示されている。
導されたアミノ酸配列を示す。従って、ｍＩＬ５Ｒαの
相応するアミノ酸配列は、以下においてヒト配列のもの
とは異なるアミノ酸のみ示すことによって表示されてい
る。配列は、標準的略語で表示されている。
【００２９】
【実施例】例１ マウスのＩＬ５Ｒに対する単クローン抗体の生産 基本的にA. Rolink 他（s.a.）により記述されている通
りに免疫化を行なった。簡単に言うと：０日目に、２×
１０7 個のＢ１３細胞［Rolink他s.a.］をリン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ−Ａ）で洗い、完全フロインドアジュバン
ト（ＣＦＡ）と混合し、ウィスターラットの後肢に注射
した。これを５日目及び７日目にフロインドアジュバン
ド（ＦＡ）無しでくり返し行なった。８日目にリンパ節
をとり出し、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞を、
ＰＥＧ１５００［Boehringer）を用いて、５：１．５の
比率でＳp ２／０−Ａｇ１４細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
５８１］と融合させた。組換えｈＩＬ−６が５００pg/m
l 存在する中で細胞をマイクロタイタープレート内にま
いた［Haegeman他、Europ. J. Biochem. 159, 625-632
(1986 年）］。翌日、ハイブリッド細胞の選択のため
に、２倍の濃度のアミノプテリンを含む同量の培地を加
えた。８日目に、アミノプテリン無しの培地で細胞に再
度補給した。その上澄みがもつ、ｍＩＬ５［Tavernier.
J. 他、 ＤＮＡ８、４９１−５０１（１９８９年）］又
はＢ１３細胞のマウスインターロイキン−３（ｍＩＬ
３）駆動のＢ１３細胞増殖を抑制する能力（当該技術分
野において既知のとおり 3Ｈデオキシ−シチジン取込み
測定法により測定されるもの）に基づいて、ハイブリド
ーマを選定した。ｍＩＬ３供給原として、ＷＥＨＩ−３
細胞（ＡＴＣＣ No.Ｔ１Ｂ６８）からのコンディション
メディムを用いた。抑制活性を示す上澄みを、Ｂ１３細
胞上に放射性標識づけした［既知の方法に従って］ｍＩ
Ｌ５又は「Ｒ５２」［ＩＬ−５−Ｒのβ鎖のみを認識す
る単クローン抗体（Rolink他s.a.）］を用いて競合的結
合測定法で再度試験した。ｍＩＬ５結合をほぼ完全に抑
制するその能力に基づいて、又相応するｍＩＬ−５−Ｒ
鎖の免疫沈降法により、ｍＩＬ−５−Ｒのα鎖のみに対
する単クローン抗体を識別した。選択されたハイブリド
ーマは、限界希釈法により再クローニングした。
りに免疫化を行なった。簡単に言うと：０日目に、２×
１０7 個のＢ１３細胞［Rolink他s.a.］をリン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ−Ａ）で洗い、完全フロインドアジュバン
ト（ＣＦＡ）と混合し、ウィスターラットの後肢に注射
した。これを５日目及び７日目にフロインドアジュバン
ド（ＦＡ）無しでくり返し行なった。８日目にリンパ節
をとり出し、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞を、
ＰＥＧ１５００［Boehringer）を用いて、５：１．５の
比率でＳp ２／０−Ａｇ１４細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
５８１］と融合させた。組換えｈＩＬ−６が５００pg/m
l 存在する中で細胞をマイクロタイタープレート内にま
いた［Haegeman他、Europ. J. Biochem. 159, 625-632
(1986 年）］。翌日、ハイブリッド細胞の選択のため
に、２倍の濃度のアミノプテリンを含む同量の培地を加
えた。８日目に、アミノプテリン無しの培地で細胞に再
度補給した。その上澄みがもつ、ｍＩＬ５［Tavernier.
J. 他、 ＤＮＡ８、４９１−５０１（１９８９年）］又
はＢ１３細胞のマウスインターロイキン−３（ｍＩＬ
３）駆動のＢ１３細胞増殖を抑制する能力（当該技術分
野において既知のとおり 3Ｈデオキシ−シチジン取込み
測定法により測定されるもの）に基づいて、ハイブリド
ーマを選定した。ｍＩＬ３供給原として、ＷＥＨＩ−３
細胞（ＡＴＣＣ No.Ｔ１Ｂ６８）からのコンディション
メディムを用いた。抑制活性を示す上澄みを、Ｂ１３細
胞上に放射性標識づけした［既知の方法に従って］ｍＩ
Ｌ５又は「Ｒ５２」［ＩＬ−５−Ｒのβ鎖のみを認識す
る単クローン抗体（Rolink他s.a.）］を用いて競合的結
合測定法で再度試験した。ｍＩＬ５結合をほぼ完全に抑
制するその能力に基づいて、又相応するｍＩＬ−５−Ｒ
鎖の免疫沈降法により、ｍＩＬ−５−Ｒのα鎖のみに対
する単クローン抗体を識別した。選択されたハイブリド
ーマは、限界希釈法により再クローニングした。
【００３０】例２ ｍＩＬ５Ｒ−β−鎖のイムノアフィニティ精製 Ｂ１３細胞を、２×１０6 細胞／mlの密度になるまで、
５％ウシ胎児血清、２mMＬ−グルタミン、５０μg/mlゲ
ンタマイシン及び１００単位／mlの組換えマウスＩＬ−
５を含むイスコフ改変ダルベコ培地(Gibco Laboratorie
s, Grand Island N.Y., USA)中で、大きいスピナーフラ
スコ内で増殖させた。１０ l の培養からの細胞を遠心
分離により濃縮し、ＰＢＳで洗浄し、１％のトリトン−
Ｘ−１００とプロテアーゼインヒビターのカクテル（１
mMのＰＭＳＦ、１０mMのベンズアミジン、ＨＣｌ、１０
０Ｕ/ml のアプロテニン）を含む２００mlのＰＢＳの中
で溶解させた。氷上に１０分間放置した後、溶解産物を
１，０００×g で１０分間遠心分離に付し、４℃で９０
分間の超遠心分離（１００，０００×g)により清澄させ
た。上澄みを、最終的に０．５M の濃度になるようにＮ
ａＣｌで希釈し、精製のために用いた。５mg/ml ゲルの
濃度でSchneider 他［J. Biol. Chem. 257,10766 (1982
年）］に従って、「Ｒ５２」をプロテインＧ−セファ
ロース４FastFlow (Pharmacia, LKB Biotechnology AB,
Uppsala,スウェーデン）に共有結合させた。Ｂ１３細
胞の溶解産物２００mlを４℃で２mlのプロテインＧ−セ
ファロース４Fast Flow の上に通し、次に２mlのＲ５２
結合プロテインＧ−セファロース４Fast Flow の上に通
した。なお両方共直径１cmのカラム内に詰め込まれてい
た。次に、両方のカラム上に、フロースルー（流出物）
を再度装入した。５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．２）、
１mMＥＤＴＡ、０．５M ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０を
含む緩衝液（１００ml）、その後１０mlの０．１％（Ｎ
Ｐ４０）を用いて、ゲルを徹底的に洗った。次に、残留
タンパク質を、０．１％Nonidet Ｐ４０（ＮＰ４０）を
含む４mlの５０mMジエチルアミン（pH１１）中で溶出さ
せ、１M ＮａＨ2 ＰＯ4 を加えることにより中和し、凍
結乾燥法によって濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び溶出
物の２．５％のクマシー染色によって純度を評価した。
５％ウシ胎児血清、２mMＬ−グルタミン、５０μg/mlゲ
ンタマイシン及び１００単位／mlの組換えマウスＩＬ−
５を含むイスコフ改変ダルベコ培地(Gibco Laboratorie
s, Grand Island N.Y., USA)中で、大きいスピナーフラ
スコ内で増殖させた。１０ l の培養からの細胞を遠心
分離により濃縮し、ＰＢＳで洗浄し、１％のトリトン−
Ｘ−１００とプロテアーゼインヒビターのカクテル（１
mMのＰＭＳＦ、１０mMのベンズアミジン、ＨＣｌ、１０
０Ｕ/ml のアプロテニン）を含む２００mlのＰＢＳの中
で溶解させた。氷上に１０分間放置した後、溶解産物を
１，０００×g で１０分間遠心分離に付し、４℃で９０
分間の超遠心分離（１００，０００×g)により清澄させ
た。上澄みを、最終的に０．５M の濃度になるようにＮ
ａＣｌで希釈し、精製のために用いた。５mg/ml ゲルの
濃度でSchneider 他［J. Biol. Chem. 257,10766 (1982
年）］に従って、「Ｒ５２」をプロテインＧ−セファ
ロース４FastFlow (Pharmacia, LKB Biotechnology AB,
Uppsala,スウェーデン）に共有結合させた。Ｂ１３細
胞の溶解産物２００mlを４℃で２mlのプロテインＧ−セ
ファロース４Fast Flow の上に通し、次に２mlのＲ５２
結合プロテインＧ−セファロース４Fast Flow の上に通
した。なお両方共直径１cmのカラム内に詰め込まれてい
た。次に、両方のカラム上に、フロースルー（流出物）
を再度装入した。５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．２）、
１mMＥＤＴＡ、０．５M ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０を
含む緩衝液（１００ml）、その後１０mlの０．１％（Ｎ
Ｐ４０）を用いて、ゲルを徹底的に洗った。次に、残留
タンパク質を、０．１％Nonidet Ｐ４０（ＮＰ４０）を
含む４mlの５０mMジエチルアミン（pH１１）中で溶出さ
せ、１M ＮａＨ2 ＰＯ4 を加えることにより中和し、凍
結乾燥法によって濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び溶出
物の２．５％のクマシー染色によって純度を評価した。
【００３１】例３ マウスのＩＬ５Ｒα−鎖のイムノアフィニティ精製 ２×１０10個の細胞からのＢ１３細胞溶解産物（例２に
従ってβ−鎖２量体を精製するのに用いた「Ｒ５２」−
イムノアフィニティカラムのラン・スルー分画）を、ｍ
ＩＬ５Ｒα−鎖を認識する１０mgのｍＡｂｓを有する２
mlのヒドラジドavidgel(結合活性ゲル）ＡＸ（Bilprohe
Int. Inc.) に、４℃で一晩混合した。このゲルを次に
カラム内に注ぎ込み、大量洗浄（５０mMトリスＨＣｌ、
pH８．２、１mMＥＤＴＡ、０．５M ＮａＣｌ、０．５％
ＮＰ４０；とそれに続くＨ2 Ｏ中０．１％ＮＰ４０）の
後、５０mMジエチルアミン、pH１１、０．０１％ＮＰ４
０を用いて溶出を行なった。選択された分画を直ちに凍
結乾燥させ、β−メルカプトエタノールの存在する２倍
量のlaemmli 緩衝液中で再度懸濁させた。試料を、１．
５mm１０％のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル内に通した。このゲ
ルを１０％ＨＡｃ、３０％メタノール内で固定させ、ク
マシーブリリアントブルーで染色した。６０kDa のｍＩ
Ｌ５Ｒα−鎖を含む切片をＳＤＳ緩衝液で処理し、さら
にスライスし、新しいＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル内で電気泳
動させた。
従ってβ−鎖２量体を精製するのに用いた「Ｒ５２」−
イムノアフィニティカラムのラン・スルー分画）を、ｍ
ＩＬ５Ｒα−鎖を認識する１０mgのｍＡｂｓを有する２
mlのヒドラジドavidgel(結合活性ゲル）ＡＸ（Bilprohe
Int. Inc.) に、４℃で一晩混合した。このゲルを次に
カラム内に注ぎ込み、大量洗浄（５０mMトリスＨＣｌ、
pH８．２、１mMＥＤＴＡ、０．５M ＮａＣｌ、０．５％
ＮＰ４０；とそれに続くＨ2 Ｏ中０．１％ＮＰ４０）の
後、５０mMジエチルアミン、pH１１、０．０１％ＮＰ４
０を用いて溶出を行なった。選択された分画を直ちに凍
結乾燥させ、β−メルカプトエタノールの存在する２倍
量のlaemmli 緩衝液中で再度懸濁させた。試料を、１．
５mm１０％のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル内に通した。このゲ
ルを１０％ＨＡｃ、３０％メタノール内で固定させ、ク
マシーブリリアントブルーで染色した。６０kDa のｍＩ
Ｌ５Ｒα−鎖を含む切片をＳＤＳ緩衝液で処理し、さら
にスライスし、新しいＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル内で電気泳
動させた。
【００３２】Immobilon −Ｐ膜（Millipore Corp.)へ移
しアミドブラックで染色した後、６０kDa のバンドを切
除し、トリプシンで原位置（切片上）消化させた。Ｃ４
−逆相カラム上でペプチドを分離し、オンライン１２０
Ａ型ＰＴＨ−アミノ酸分析器（Applied Biosystems In
c., Foster City, CA.)の備わった４７０Ａ型気相シー
クエネーターを用いた配列分析に付した。当該技術分野
においては既知の方法に従って合成されたオリゴヌクレ
オチドプローブの相応するセットの配列と合わせてアミ
ノ酸配列（アミノ酸の標準的略語）が以下に示されてい
る。
しアミドブラックで染色した後、６０kDa のバンドを切
除し、トリプシンで原位置（切片上）消化させた。Ｃ４
−逆相カラム上でペプチドを分離し、オンライン１２０
Ａ型ＰＴＨ−アミノ酸分析器（Applied Biosystems In
c., Foster City, CA.)の備わった４７０Ａ型気相シー
クエネーターを用いた配列分析に付した。当該技術分野
においては既知の方法に従って合成されたオリゴヌクレ
オチドプローブの相応するセットの配列と合わせてアミ
ノ酸配列（アミノ酸の標準的略語）が以下に示されてい
る。
【００３３】
【００３４】
【００３５】例４ 一方向性λＧＴ１１ｃＤＮＡライブラリーの構築 １．マウスのプレ−Ｂ細胞Ｂ１３ｃＤＮＡライブラリー ｍＲＮＡは「ファストトラック」ｍＲＮＡ分離システム
（Invitrogen Corp.)を用いてＢ１３細胞から抽出し
た。このプロトコールを用いて、オリゴ（dT）セルロー
スを用いて細胞の溶解産物から直接ｐｏｌｙ（Ａ)+ｍＲ
ＮＡを分離した。収量は１０8 細胞あたり約５０μg で
あった。５mgのｐｏｌｙ（Ａ)+ｍＲＮＡを、オリゴdT−
Ｎｏｔ１プライマーアダプター（５′−ＡＡＴＴＣＧＣ
ＧＧＣＣＧＣ（Ｔ)15 −３′、Promega Corp.)及びクロ
ーニングされたモロニーマウス白血病ウィルスＲＮａｓ
ｅＨ- 逆転写酵素（BRL Life Technologies, Inc）を用
いて逆転写した。前述の手順（Sambrook他、s.a.) を用
いてＥｃｏＲ１連鎖した２本鎖のｃＤＮＡを作った。唯
一の３′付着端を生成するのにＮｏｔ１開裂を用い、１
％のアガロースゲル上でｃＤＮＡのサイズ選択（＞１，
０００bp）をした。「gean clean」のプロトコール（Ｂ
１０ １０１ Inc) を用いた溶出の後、ｃＤＮＡをλｇ
ｔ１１Ｓｆｉ−Ｎｏｔベクター（Promega Corp.)のＥｃ
ｏＲ１−Ｎｏｔ１アーム内に連結した。生体外パッケー
ジングの後、約４０×１０6 個の組換えファージが得ら
れた。
（Invitrogen Corp.)を用いてＢ１３細胞から抽出し
た。このプロトコールを用いて、オリゴ（dT）セルロー
スを用いて細胞の溶解産物から直接ｐｏｌｙ（Ａ)+ｍＲ
ＮＡを分離した。収量は１０8 細胞あたり約５０μg で
あった。５mgのｐｏｌｙ（Ａ)+ｍＲＮＡを、オリゴdT−
Ｎｏｔ１プライマーアダプター（５′−ＡＡＴＴＣＧＣ
ＧＧＣＣＧＣ（Ｔ)15 −３′、Promega Corp.)及びクロ
ーニングされたモロニーマウス白血病ウィルスＲＮａｓ
ｅＨ- 逆転写酵素（BRL Life Technologies, Inc）を用
いて逆転写した。前述の手順（Sambrook他、s.a.) を用
いてＥｃｏＲ１連鎖した２本鎖のｃＤＮＡを作った。唯
一の３′付着端を生成するのにＮｏｔ１開裂を用い、１
％のアガロースゲル上でｃＤＮＡのサイズ選択（＞１，
０００bp）をした。「gean clean」のプロトコール（Ｂ
１０ １０１ Inc) を用いた溶出の後、ｃＤＮＡをλｇ
ｔ１１Ｓｆｉ−Ｎｏｔベクター（Promega Corp.)のＥｃ
ｏＲ１−Ｎｏｔ１アーム内に連結した。生体外パッケー
ジングの後、約４０×１０6 個の組換えファージが得ら
れた。
【００３６】２．ヒトのＨＬ６０クローン（酪酸塩誘導
の）ｃＤＮＡライブラリー ｍＲＮＡの精製に先立ち、適切に125 Ｉ−ｈＩＬ５結合
しているかについて（細胞１個あたり２，０００の結合
部位）、酪酸誘導されたＨＬ６０クローン１５細胞［Fi
schkoff, Leukemia Res. 12, 679-686 (1988年); Plaet
inck他、J. Exp. Med. 172, 683-691 (1990 年); HL 6
0: ATCC-No. CCL 240]を検査した。４．１についてと
同じプロトコールを用い、比較可能な組換えファージ収
量が得られた。
の）ｃＤＮＡライブラリー ｍＲＮＡの精製に先立ち、適切に125 Ｉ−ｈＩＬ５結合
しているかについて（細胞１個あたり２，０００の結合
部位）、酪酸誘導されたＨＬ６０クローン１５細胞［Fi
schkoff, Leukemia Res. 12, 679-686 (1988年); Plaet
inck他、J. Exp. Med. 172, 683-691 (1990 年); HL 6
0: ATCC-No. CCL 240]を検査した。４．１についてと
同じプロトコールを用い、比較可能な組換えファージ収
量が得られた。
【００３７】例５ マウス及びヒトのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ ２組のオリゴヌクレオチドプローブ、「オリゴヌクレオ
チド１」及び「オリゴヌクレオチド２」（例３参照）
を、当該技術分野において既知の方法（Sambrook他、s.
a)により用いられているプローブのタイプに応じて異な
るハイブリッド形成条件（以下参照）の下でスクリーニ
ングのために用いた。
グ ２組のオリゴヌクレオチドプローブ、「オリゴヌクレオ
チド１」及び「オリゴヌクレオチド２」（例３参照）
を、当該技術分野において既知の方法（Sambrook他、s.
a)により用いられているプローブのタイプに応じて異な
るハイブリッド形成条件（以下参照）の下でスクリーニ
ングのために用いた。
【００３８】結果は以下の方法に示されている：
【００３９】１．両方のセットのオリゴヌクレオチドプ
ローブとのハイブリッド形成に基づいて、マウスのｃＤ
ＮＡライブラリーの一部から２つのｃＤＮＡクローン
（λｇｔ１１−ｍＩＬ５Ｒα２，３）を選択した（１．
２×１０6 のプラークがスクリーニングされた）。この
目的でBiodyne Ａトランスファー膜（Pall)(Sambrook
他、s.a)を用いて前述のとおりにプラークリフトを調製
した。キネージングによりオリゴヌクレオチド１を放射
性標識し（Sambrook他、s.a)、「中間ストリンジェンシ
ー」のハイブリッド形成条件の下でハイブリッド形成さ
せた（以下参照）。オリゴヌクレオチド２は、キネージ
ングにより放射性標識し（Sambrook他、s.a)、「低スト
リンジェンシー」のハイブリッド形成条件下でハイブリ
ッド形成させた（以下参照）。
ローブとのハイブリッド形成に基づいて、マウスのｃＤ
ＮＡライブラリーの一部から２つのｃＤＮＡクローン
（λｇｔ１１−ｍＩＬ５Ｒα２，３）を選択した（１．
２×１０6 のプラークがスクリーニングされた）。この
目的でBiodyne Ａトランスファー膜（Pall)(Sambrook
他、s.a)を用いて前述のとおりにプラークリフトを調製
した。キネージングによりオリゴヌクレオチド１を放射
性標識し（Sambrook他、s.a)、「中間ストリンジェンシ
ー」のハイブリッド形成条件の下でハイブリッド形成さ
せた（以下参照）。オリゴヌクレオチド２は、キネージ
ングにより放射性標識し（Sambrook他、s.a)、「低スト
リンジェンシー」のハイブリッド形成条件下でハイブリ
ッド形成させた（以下参照）。
【００４０】２．「オリゴヌクレオチド１」と、当該技
術分野において既知の方法によりマウスλｇｔ１１ｍＩ
Ｌ５Ｒα２から誘導されたｃＤＮＡインサートの両方と
のハイブリッド形成に基づいて、ヒトのｃＤＮＡライブ
ラリーの一部分から１つのｃＤＮＡクローン（λｇｔ１
１−ｈＩＬ５Ｒα８）を選択した（２．４×１０6 のプ
ラークをスクリーニングした）。
術分野において既知の方法によりマウスλｇｔ１１ｍＩ
Ｌ５Ｒα２から誘導されたｃＤＮＡインサートの両方と
のハイブリッド形成に基づいて、ヒトのｃＤＮＡライブ
ラリーの一部分から１つのｃＤＮＡクローン（λｇｔ１
１−ｈＩＬ５Ｒα８）を選択した（２．４×１０6 のプ
ラークをスクリーニングした）。
【００４１】オリゴヌクレオチド１は、キネージングに
より放射性標識させ（Sambrook他、s.a.) 、「低ストリ
ンジェンシー」のハイブリッド形成条件下でハイブリッ
ド形成させた。ｃＤＮＡインサート形λｇｔ１１ｍＩＬ
５Ｒα２を、無作為標識で放射性標識し（Sambrook他、
s.a.) 、「中間ストリンジェンシー」のハイブリッド形
成条件下でハイブリッド形成させた。
より放射性標識させ（Sambrook他、s.a.) 、「低ストリ
ンジェンシー」のハイブリッド形成条件下でハイブリッ
ド形成させた。ｃＤＮＡインサート形λｇｔ１１ｍＩＬ
５Ｒα２を、無作為標識で放射性標識し（Sambrook他、
s.a.) 、「中間ストリンジェンシー」のハイブリッド形
成条件下でハイブリッド形成させた。
【００４２】３．ｍＩＬ５Ｒα２ｃＤＮＡプローブを用
いて、２でスクリーニングしたヒトのｃＤＮＡライブラ
リの半分から、付加的な５つのｃＤＮＡクローン（λｇ
ｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１１→１５）を選択した。ハイブ
リッド形成は「中間ストリンジェンシー」の条件下で行
なった。
いて、２でスクリーニングしたヒトのｃＤＮＡライブラ
リの半分から、付加的な５つのｃＤＮＡクローン（λｇ
ｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１１→１５）を選択した。ハイブ
リッド形成は「中間ストリンジェンシー」の条件下で行
なった。
【００４３】４．ｈＩＬ５Ｒα８−ｃＤＮＡプローブを
用いて、２でスクリーニングしたヒトのｃＤＮＡライブ
ラリのもう半分から、付加的な３５のｃＤＮＡクローン
（λｇｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１６→５１）を選択した。
ハイブリッド形成は、「高ストリンジェンシー」の条件
下で行なった（以下参照）。
用いて、２でスクリーニングしたヒトのｃＤＮＡライブ
ラリのもう半分から、付加的な３５のｃＤＮＡクローン
（λｇｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１６→５１）を選択した。
ハイブリッド形成は、「高ストリンジェンシー」の条件
下で行なった（以下参照）。
【００４４】ハイブリッド形成条件 Ｌ）「低ストリンジェンシー」のハイブリッド形成条
件： − 予備ハイブリッド形成：５×ＳＳＣ（当該技術分野
において既知のクエン酸緩衝食塩水、例えばSambrook
他、s.a.参照）。５×Denhardt's、０．１％ＳＤＳ、
０．０５％ピロリン酸ナトリウム、１００μg/mlの音波
処理したサケ精子ＤＮＡ；４２℃で一晩。 − ハイブリッド形成：同じ緩衝液ではあるが放射線標
識したプローブを含むもので、プレハイブリッド形成の
緩衝液を置換した。 − 洗浄：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃で連続
４回の洗浄（各々約３０分）
件： − 予備ハイブリッド形成：５×ＳＳＣ（当該技術分野
において既知のクエン酸緩衝食塩水、例えばSambrook
他、s.a.参照）。５×Denhardt's、０．１％ＳＤＳ、
０．０５％ピロリン酸ナトリウム、１００μg/mlの音波
処理したサケ精子ＤＮＡ；４２℃で一晩。 − ハイブリッド形成：同じ緩衝液ではあるが放射線標
識したプローブを含むもので、プレハイブリッド形成の
緩衝液を置換した。 − 洗浄：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃で連続
４回の洗浄（各々約３０分）
【００４５】Ｉ）「中間ストリンジェンシー」のハイブ
リッド形成条件： − プレハイブリッド形成：２０％のホルムアミド、５
×ＳＳＣ、５×Denhardt's、５mMＥＤＴＡ、２５mMリン
酸ナトリウム（pH６．５）、０．０５％ピロリン酸ナト
リウム、１００μg/mlの音波処理したサケの精子ＤＮ
Ａ；４２℃で一晩。 − ハイブリッド形成：同じ緩衝液ではあるが放射性標
識したプローブを含むもので、プレハイブリッド形成の
緩衝液を置換した。 − 洗浄：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃で連続
４回の洗浄（各々約３０分）
リッド形成条件： − プレハイブリッド形成：２０％のホルムアミド、５
×ＳＳＣ、５×Denhardt's、５mMＥＤＴＡ、２５mMリン
酸ナトリウム（pH６．５）、０．０５％ピロリン酸ナト
リウム、１００μg/mlの音波処理したサケの精子ＤＮ
Ａ；４２℃で一晩。 − ハイブリッド形成：同じ緩衝液ではあるが放射性標
識したプローブを含むもので、プレハイブリッド形成の
緩衝液を置換した。 − 洗浄：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃で連続
４回の洗浄（各々約３０分）
【００４６】Ｈ）「高ストリンジェンシー」のハイブリ
ッド形成条件： − 予備ハイブリッド形成：６×ＳＳＣ、５×Denhard
t's、０．５％ＳＤＳ、１００μg ml-1の音波処理した
サケ精子ＤＮＡ；６８℃で一晩。 − ハイブリッド形成：６×ＳＳＣ、５×Denhardt's、
０．５％ＳＤＳ、５mMＥＤＴＡ、１００μg ・ml-1の音
波処理したサケ精子ＤＮＡ；放射線標識したプローブを
含む。 − 洗浄：以下の連続洗浄（各々約３０分）が行なわれ
た： −２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で（２回）。 −０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃で（２
回）。
ッド形成条件： − 予備ハイブリッド形成：６×ＳＳＣ、５×Denhard
t's、０．５％ＳＤＳ、１００μg ml-1の音波処理した
サケ精子ＤＮＡ；６８℃で一晩。 − ハイブリッド形成：６×ＳＳＣ、５×Denhardt's、
０．５％ＳＤＳ、５mMＥＤＴＡ、１００μg ・ml-1の音
波処理したサケ精子ＤＮＡ；放射線標識したプローブを
含む。 − 洗浄：以下の連続洗浄（各々約３０分）が行なわれ
た： −２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で（２回）。 −０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃で（２
回）。
【００４７】例６ 配列決定 全てのｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ７ｚｆ型ベクター（Promeg
a Corp.)内でサブクローニングし、ＥｘｏIII 欠失突然
変異体を生成した。Sanger手順に基づくプロトコールを
使用し、自動化３７０Ａ ＤＮＡシーケンサー上でＴａ
ｑポリメラーゼ及び一本鎖ＤＮＡを関与させて、配列決
定を行なった。
a Corp.)内でサブクローニングし、ＥｘｏIII 欠失突然
変異体を生成した。Sanger手順に基づくプロトコールを
使用し、自動化３７０Ａ ＤＮＡシーケンサー上でＴａ
ｑポリメラーゼ及び一本鎖ＤＮＡを関与させて、配列決
定を行なった。
【００４８】例７ プラスミド「ｐｓｈＩＬ５Ｒα」の構築 前述のとおりにプラスミド構築を行なった。特定の参考
情報又は調製の詳細が全く与えられていない場合には、
Sambrook他（１９８９年）、「分子クローニング」実験
室マニュアル（第２版）、Cold Spring Harbor, N.Y. C
old Spring Harbor Laboratory Pressに従った標準的方
法を用いた。
情報又は調製の詳細が全く与えられていない場合には、
Sambrook他（１９８９年）、「分子クローニング」実験
室マニュアル（第２版）、Cold Spring Harbor, N.Y. C
old Spring Harbor Laboratory Pressに従った標準的方
法を用いた。
【００４９】ファージλｇｔ１１−ｈＩＬ５Ｒα１２か
らのインサート（例５参照）を、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ
１制限酵素を用いて切除した。４つのデオキシヌクレオ
チド三リン酸が全て存在する中で、E.coliＤＮＡポリメ
ラーゼ１クレノウフラグメントを用いて両方の付着端を
充てんし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて非パリンドロー
ムＢｓｔＸ１リンカーを付加した。これらのリンカーの
配列は以下のとおりである：５′ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡ
ＣＡ３′３′ＧＡＡＡＴＣＴＣ５′
らのインサート（例５参照）を、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ
１制限酵素を用いて切除した。４つのデオキシヌクレオ
チド三リン酸が全て存在する中で、E.coliＤＮＡポリメ
ラーゼ１クレノウフラグメントを用いて両方の付着端を
充てんし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて非パリンドロー
ムＢｓｔＸ１リンカーを付加した。これらのリンカーの
配列は以下のとおりである：５′ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡ
ＣＡ３′３′ＧＡＡＡＴＣＴＣ５′
【００５０】次の段階において、修飾されたインサート
をプラスミドｐＣＤＭ８内に連結させ［SeedおよびAruf
fo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365 (1987
年）; Aruffo及びSeed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4, 8573 (1987 年); Seed, Nature 、３２９、８４０
（１９８７年）］、ＣＭＶ−プロモータに対し適切な方
向性をもつ構成をさらに分析すべく選択した。
をプラスミドｐＣＤＭ８内に連結させ［SeedおよびAruf
fo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365 (1987
年）; Aruffo及びSeed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4, 8573 (1987 年); Seed, Nature 、３２９、８４０
（１９８７年）］、ＣＭＶ−プロモータに対し適切な方
向性をもつ構成をさらに分析すべく選択した。
【００５１】例８ E.coliＭＣ１０６１（ｐ３）の形質転換 例７のプラスミドｐｓｈＩＬ５ＲαでのE.coliＭＣ１０
６１（ｐ３）の形質転換は、電気泳動手順で達成され
た。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Richmond, CA. USA)からのGene P
ulser を２０μF 、２．５KV及び２００オームという設
定値でメーカーの指示に従って使用した。
６１（ｐ３）の形質転換は、電気泳動手順で達成され
た。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Richmond, CA. USA)からのGene P
ulser を２０μF 、２．５KV及び２００オームという設
定値でメーカーの指示に従って使用した。
【００５２】例９ プラスミドＤＮＡの分離 例８に記されているような形質転換されたE.coliＭＣ１
０６１からのプラスミドＤＮＡを、細胞のアルカリ溶解
とそれに続くセシウム−塩素超遠心分離段階に基づいて
標準的手順［Birnboim及びDoly, Nucl. Acids Res. 7,
1513 (1979年);Sambrook 他、１９８９年、s.a.］を用
いて調製した。このようにして、プラスミドｐｓｈＩＬ
５Ｒαをプラスミドｐ３から分離させた。ｓｈＩＬ５Ｒ
αをコードするインサートをｐｓｈＩＬ５Ｒαから切り
とり、例６に記されているとおりに配列決定した。ｓｈ
ＩＬ５Ｒαの完全な核酸配列及び導かれたアミノ酸配列
は、図１に示されている。
０６１からのプラスミドＤＮＡを、細胞のアルカリ溶解
とそれに続くセシウム−塩素超遠心分離段階に基づいて
標準的手順［Birnboim及びDoly, Nucl. Acids Res. 7,
1513 (1979年);Sambrook 他、１９８９年、s.a.］を用
いて調製した。このようにして、プラスミドｐｓｈＩＬ
５Ｒαをプラスミドｐ３から分離させた。ｓｈＩＬ５Ｒ
αをコードするインサートをｐｓｈＩＬ５Ｒαから切り
とり、例６に記されているとおりに配列決定した。ｓｈ
ＩＬ５Ｒαの完全な核酸配列及び導かれたアミノ酸配列
は、図１に示されている。
【００５３】例１０ ＣＯＳ−１細胞内でのｓｈＩＬ５Ｒαの発現 ＣＯＳ−１細胞を、Sambrook他、１９８９年、s.a.に記
されているＤＥＡＥ−デキストラン プロトコールを用
いてトランスフェクションした。簡単に言うと、下位融
合性ＣＯＳ−１細胞をトリプシン処理により収集し、ト
ランスフェクションに先立って２４時間２．３×１０4
細胞／cm2 で再度プレートにまいた。単層を最少必須培
地（ＭＥＭ）−ＨｅｐｅｓpH７．２で２回洗い、トラン
スフェクション混合物［例９に記されているとおりに分
離された１０μg のｐｓｈＩＬ５Ｒα／０．５mgのＤＥ
ＡＥデキストラン（Mr＝２×１０6 ；Pharmacia, Uppsa
la, スェーデン）／ml ＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ，pH７．
２］で３０分間培養した。次に、細胞に１０％のウシ胎
児血清（ＦＣＳ）と１００μM の２リン酸クロロキーネ
を含む８体積の予備加熱されたダルベコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ）を補い、３７℃で４時間培養した。その
後培地を吸引によって除去し、ＤＭＥＭで一回単層を洗
浄し、３日間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで培養した。
されているＤＥＡＥ−デキストラン プロトコールを用
いてトランスフェクションした。簡単に言うと、下位融
合性ＣＯＳ−１細胞をトリプシン処理により収集し、ト
ランスフェクションに先立って２４時間２．３×１０4
細胞／cm2 で再度プレートにまいた。単層を最少必須培
地（ＭＥＭ）−ＨｅｐｅｓpH７．２で２回洗い、トラン
スフェクション混合物［例９に記されているとおりに分
離された１０μg のｐｓｈＩＬ５Ｒα／０．５mgのＤＥ
ＡＥデキストラン（Mr＝２×１０6 ；Pharmacia, Uppsa
la, スェーデン）／ml ＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ，pH７．
２］で３０分間培養した。次に、細胞に１０％のウシ胎
児血清（ＦＣＳ）と１００μM の２リン酸クロロキーネ
を含む８体積の予備加熱されたダルベコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ）を補い、３７℃で４時間培養した。その
後培地を吸引によって除去し、ＤＭＥＭで一回単層を洗
浄し、３日間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで培養した。
【００５４】例１１ ｓｈＩＬ５Ｒαの特徴づけ 例１０に記されているとおりに調製したプラスミドｐｓ
ｈＩＬ５ＲαでトランスフェクションされたＣＯＳ−１
細胞の上澄みを、以下のような競合的結合測定法で分泌
されたｓｈＩＬ５Ｒαの存在について試験した：例５に
記されているようにクローンから得られ、例７に記され
ているように構築されたｍＩＬ５ＲαをコードするｃＤ
ＮＡ（アミノ酸配列については図１参照）を含むプラス
ミドで例１０に記されているように形質転換されたＣＯ
Ｓ−１細胞を、３７℃で３０分間０．０２％のアジ化ナ
トリウムと０．５mMＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）での処理により解離させ、０．３mlの結合培
地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋０．０２％アジ化ナトリ
ウム）あたり１．５×１０5 細胞の割合で再度懸濁さ
せ、１００倍の余分な未標識ｍＩＬ５が存在しない（図
２；「−」、全結合）又は存在する（図２；「＋col
d」、非特異的結合）状態で１時間４℃で０．８mMの125
Ｉ−ｍＩＬ５で培養した。
ｈＩＬ５ＲαでトランスフェクションされたＣＯＳ−１
細胞の上澄みを、以下のような競合的結合測定法で分泌
されたｓｈＩＬ５Ｒαの存在について試験した：例５に
記されているようにクローンから得られ、例７に記され
ているように構築されたｍＩＬ５ＲαをコードするｃＤ
ＮＡ（アミノ酸配列については図１参照）を含むプラス
ミドで例１０に記されているように形質転換されたＣＯ
Ｓ−１細胞を、３７℃で３０分間０．０２％のアジ化ナ
トリウムと０．５mMＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）での処理により解離させ、０．３mlの結合培
地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋０．０２％アジ化ナトリ
ウム）あたり１．５×１０5 細胞の割合で再度懸濁さ
せ、１００倍の余分な未標識ｍＩＬ５が存在しない（図
２；「−」、全結合）又は存在する（図２；「＋col
d」、非特異的結合）状態で１時間４℃で０．８mMの125
Ｉ−ｍＩＬ５で培養した。
【００５５】ｐｓｈＩＬ５Ｒα（図２、「ｓｈＩＬ５Ｒ
α」）でトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞の
上澄み（結合培地の８０％）を、125 Ｉ−ｍＩＬ５の結
合抑制能力について試験した。トランスフェクションさ
れていないＣＯＳ−１細胞の８０％の上澄みが存在する
中でも結合が行なわれた（図２、「対照」）。遊離放射
能から細胞膜結合された125 Ｉ−ｍＩＬ５を分離するた
め、ＣＯＳ−１細胞をフタル酸オイルのクッションを通
して沈降させ、記述されているとおりに［Plaetinck
他、J. Exp. Med. 172, 683-691 (1990 年）］ガンマー
カウンター内で個々のペレットを計数した。
α」）でトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞の
上澄み（結合培地の８０％）を、125 Ｉ−ｍＩＬ５の結
合抑制能力について試験した。トランスフェクションさ
れていないＣＯＳ−１細胞の８０％の上澄みが存在する
中でも結合が行なわれた（図２、「対照」）。遊離放射
能から細胞膜結合された125 Ｉ−ｍＩＬ５を分離するた
め、ＣＯＳ−１細胞をフタル酸オイルのクッションを通
して沈降させ、記述されているとおりに［Plaetinck
他、J. Exp. Med. 172, 683-691 (1990 年）］ガンマー
カウンター内で個々のペレットを計数した。
【００５６】例１２ プラスミド「ｐｈＩＬ５Ｒα」の構築 ｈＩＬ５ＲαをコードするｃＤＮＡを、３′拡張ポリメ
ーラゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法［Fritz 他、Nucl. Acid R
es. 19, 3747 (1991年）］により分離した。ｓｈＩＬ５
ＲαをコードするｍＲＮＡは、長さが約１，３５０塩基
にすぎないことから、ｈＩＬ５ＲαをコードするｃＤＮ
Ａｓから誘導されたＰＣＲ生成物は、サイズ選択するこ
とができる。第１段階では、その５′末端で既知の２７
の塩基伸張でひっかけ上げられた無作為６量体でのプラ
イミングによってｃＤＮＡを合成した。次に、１，０３
６〜１，０５５の位置にあるｓｈＩＬ５Ｒα配列に対し
相補的な順向プライマー（図１参照）と、無作為６量体
のテイル（尾部）配列に相補的な逆向プライマーの間
で、ＰＣＲ反応を行なった。大部分の反応生成物が非特
異的であったが、サザンブロット分析によるとＩＬ５Ｒ
αが、酪酸塩が誘導したＨＬ６０クローン１５細胞から
のｍＲＮＡが使用されたときにのみ配列決定する、とい
うことがわかった。３５０bp以上のＤＮＡフラグメント
を精製し、Ｎｓｉｌ及びＳａｌ１との開裂の後、ｐＵＣ
１８ベクター（Pharmacia, Freiburg, BRD）内でサブク
ローニングさせた。ｈＩＬ５Ｒαをコードするサブクロ
ーンを、次にコロニーハイブリッド形成段階によって選
択した。こうすることにより、ｓｈＩＬ５Ｒαに相応す
るＤＮＡが対抗選択された。ＤＮＡ配列分析はその後、
３５０bp以上のインサートを伴うサブクローンが実際に
ｈＩＬ５Ｒαをコードすることを立証した。次に、イン
サートのＮｓｉｌ−Ｘｂａｌ（ブラントの）切除及びＮ
ｓｉｌ−Ｎｏｔｌ（ブラントの）開放ｐｓｈＩＬ５Ｒα
ベクターへの挿入（例７参照）により、フルサイズのｈ
ＩＬ５ＲαｃＤＮＡを生成した。ｈＩＬ５Ｒαの完全な
ＤＮＡ配列及び誘導されたアミノ酸配列は図３に示され
ている。ＤＮＡ配列はｓｈＩＬ５ＲαＤＮＡ−配列の１
２４３番目におけるスイッチによって特徴づけられ、そ
の結果３′末端部分は、膜内外領域にまたがる新しい配
列に置換されることになる。細胞質ドメインの長さは、
アミノ酸５８個である、シグナル導入プロセスに関与す
るドメインはこの短い細胞質テイル内には見い出せな
い。
ーラゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法［Fritz 他、Nucl. Acid R
es. 19, 3747 (1991年）］により分離した。ｓｈＩＬ５
ＲαをコードするｍＲＮＡは、長さが約１，３５０塩基
にすぎないことから、ｈＩＬ５ＲαをコードするｃＤＮ
Ａｓから誘導されたＰＣＲ生成物は、サイズ選択するこ
とができる。第１段階では、その５′末端で既知の２７
の塩基伸張でひっかけ上げられた無作為６量体でのプラ
イミングによってｃＤＮＡを合成した。次に、１，０３
６〜１，０５５の位置にあるｓｈＩＬ５Ｒα配列に対し
相補的な順向プライマー（図１参照）と、無作為６量体
のテイル（尾部）配列に相補的な逆向プライマーの間
で、ＰＣＲ反応を行なった。大部分の反応生成物が非特
異的であったが、サザンブロット分析によるとＩＬ５Ｒ
αが、酪酸塩が誘導したＨＬ６０クローン１５細胞から
のｍＲＮＡが使用されたときにのみ配列決定する、とい
うことがわかった。３５０bp以上のＤＮＡフラグメント
を精製し、Ｎｓｉｌ及びＳａｌ１との開裂の後、ｐＵＣ
１８ベクター（Pharmacia, Freiburg, BRD）内でサブク
ローニングさせた。ｈＩＬ５Ｒαをコードするサブクロ
ーンを、次にコロニーハイブリッド形成段階によって選
択した。こうすることにより、ｓｈＩＬ５Ｒαに相応す
るＤＮＡが対抗選択された。ＤＮＡ配列分析はその後、
３５０bp以上のインサートを伴うサブクローンが実際に
ｈＩＬ５Ｒαをコードすることを立証した。次に、イン
サートのＮｓｉｌ−Ｘｂａｌ（ブラントの）切除及びＮ
ｓｉｌ−Ｎｏｔｌ（ブラントの）開放ｐｓｈＩＬ５Ｒα
ベクターへの挿入（例７参照）により、フルサイズのｈ
ＩＬ５ＲαｃＤＮＡを生成した。ｈＩＬ５Ｒαの完全な
ＤＮＡ配列及び誘導されたアミノ酸配列は図３に示され
ている。ＤＮＡ配列はｓｈＩＬ５ＲαＤＮＡ−配列の１
２４３番目におけるスイッチによって特徴づけられ、そ
の結果３′末端部分は、膜内外領域にまたがる新しい配
列に置換されることになる。細胞質ドメインの長さは、
アミノ酸５８個である、シグナル導入プロセスに関与す
るドメインはこの短い細胞質テイル内には見い出せな
い。
【図１】ｓｈＩＬ５Ｒαの核酸配列及び還元されたアミ
ノ酸配列を示す。
ノ酸配列を示す。
【図２】ｓｈＩＬ５Ｒαの特徴づけを示す。
【図３】ＤＮＡ配列及び誘導されたｈＩＬ５Ｒαのアミ
ノ酸配列を示す。
ノ酸配列を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項９】 請求項１乃至３のいずれか１項に記載の
ＤＮＡ配列によりコードされる組換えタンパク質を含有
する慢性ぜん息の治療剤。
ＤＮＡ配列によりコードされる組換えタンパク質を含有
する慢性ぜん息の治療剤。
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図４】図３のつづきである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/20 15/24 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヴァルター・フィエルス ベルギー国、ビー−9070 デステルベルゲ ン、ボイケンドレーフ ３ (72)発明者 ゲールト・プレティンク ベルギー国、ビー−9070 デステルベルゲ ン、デンデルモントセステーンヴェーク 767 (72)発明者 ヤン・ターフェルニア ベルギー国、ビー−9860 バレゲム、ボッ テルヴェーク ２ (72)発明者 ヨゼ・ヴァン・デル・ハイデン ベルギー国、ビー−9820 モンテ、ジンク 23 (54)【発明の名称】 ヒトインターロイキン−５受容体のα鎖又はその一部、特にｓｈＩＬ５ＲαをコードするＤＮＡ 及びそれを含むベクター、このベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにその製造及び利用 方法
Claims (12)
- 【請求項１】 一部はなおヒトインターロイキン５と結
合する、ヒトインターロイキン５−受容体のα鎖又はそ
の一部をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 ヒトインターロイキン５−受容体のα−
鎖の可溶部分をコードし、この可溶部分はなおヒトイン
ターロイキン５と結合する、請求項１に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項３】 （ａ）図１に与えられているＤＮＡ配列
ならびにその相補的ストランド又はこれらの配列を含む
もの； （ｂ）（ａ）で規定された配列又はそのフラグメントを
ハイブリッド形成するＤＮＡ配列、 （ｃ）遺伝子コードの縮重のため（ａ）及び（ｂ）に定
められている配列とハイブリッド形成しないが、正確に
同じアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列 の中から選択される、請求項１又は２に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれか１項に記載の
ＤＮＡ配列を含むベクター。 - 【請求項５】 真核性宿主細胞の中での発現を導くこと
のできる、請求項４に記載のベクター。 - 【請求項６】 請求項４又は５に記載のベクターで形質
転換された原核性又は真核性宿主細胞。 - 【請求項７】 請求項１乃至３のいずれか１項に記載の
ＤＮＡ配列によりコードされる組換えタンパク質。 - 【請求項８】 疾病の治療のための請求項７に記載の組
換えタンパク質。 - 【請求項９】 適切な培地中で請求項６に記載の形質転
換された宿主細胞を培養し、該組換えタンパク質を分離
する工程を含む、請求項７に記載の組換えタンパク質の
調製方法。 - 【請求項１０】 要すれば、付加的な薬学的に活性な物
質及び／又は無毒性で不活性な治療的に適合するキャリ
ア材料と組合せた形で、請求項７に記載の１又はそれ以
上の化合物を含む薬剤化合物。 - 【請求項１１】 疾病、特に慢性ぜん息の治療のための
請求項７に記載の化合物の使用。 - 【請求項１２】 請求項９に記載の工程に従って調製さ
れるところの、請求項７に記載の組換えタンパク質。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90811030 | 1990-12-27 | ||
| EP91810327 | 1991-04-30 | ||
| CH90811030.7 | 1991-04-30 | ||
| CH91810327.6 | 1991-04-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678772A true JPH0678772A (ja) | 1994-03-22 |
| JP2554418B2 JP2554418B2 (ja) | 1996-11-13 |
Family
ID=26127858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3357983A Expired - Lifetime JP2554418B2 (ja) | 1990-12-27 | 1991-12-27 | ヒトインターロイキン−５受容体のα鎖又はその一部、特にｓｈＩＬ５ＲαをコードするＤＮＡ及びそれを含むベクター、このベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにその製造及び利用方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0492214A3 (ja) |
| JP (1) | JP2554418B2 (ja) |
| KR (1) | KR920012440A (ja) |
| AR (1) | AR246310A1 (ja) |
| AU (1) | AU647560B2 (ja) |
| CA (1) | CA2058003A1 (ja) |
| FI (1) | FI916067A (ja) |
| HU (1) | HUT59725A (ja) |
| IE (1) | IE914548A1 (ja) |
| IL (1) | IL100470A0 (ja) |
| MX (1) | MX9102767A (ja) |
| NO (1) | NO915084L (ja) |
| NZ (1) | NZ241094A (ja) |
| PT (1) | PT99929A (ja) |
| TW (1) | TW280833B (ja) |
| YU (1) | YU199691A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002525580A (ja) * | 1998-09-10 | 2002-08-13 | イミュノテク | 好塩基球及び好酸球の検出又は定量のための方法 |
| US6538111B1 (en) | 1995-09-11 | 2003-03-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody against human interleukin-5 receptor alpha chain |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5453491A (en) * | 1990-09-11 | 1995-09-26 | Kiyoshi Takatsu | Murine interleukin-5 receptor |
| US5965362A (en) | 1992-03-04 | 1999-10-12 | The Regents Of The University Of California | Comparative genomic hybridization (CGH) |
| US5683983A (en) * | 1995-06-07 | 1997-11-04 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US5677280A (en) * | 1995-06-07 | 1997-10-14 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US5668110A (en) * | 1995-06-07 | 1997-09-16 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US5654276A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-05 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US7455964B1 (en) | 1996-07-15 | 2008-11-25 | The Hospital For Sick Children | Genes from the 20q13 amplicon and their uses |
| US7049424B2 (en) | 1996-07-15 | 2006-05-23 | The Regents Of The University Of California | Genes from the 20Q13 amplicon and their uses |
| US5861279A (en) * | 1996-01-17 | 1999-01-19 | Schering Corporation | Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists |
| WO1997026332A1 (en) * | 1996-01-17 | 1997-07-24 | Schering Corporation | Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists |
| US7109299B1 (en) | 1999-12-16 | 2006-09-19 | Affymax, Inc. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
Citations (1)
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| JPH0654690A (ja) * | 1990-09-11 | 1994-03-01 | Kiyoshi Takatsu | インターロイキン５レセプター |
-
1991
- 1991-11-30 TW TW080109431A patent/TW280833B/zh active
- 1991-12-06 EP EP19910120951 patent/EP0492214A3/en not_active Ceased
- 1991-12-16 HU HU913961A patent/HUT59725A/hu unknown
- 1991-12-18 CA CA002058003A patent/CA2058003A1/en not_active Abandoned
- 1991-12-20 NZ NZ241094A patent/NZ241094A/xx unknown
- 1991-12-20 FI FI916067A patent/FI916067A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-12-20 AU AU89985/91A patent/AU647560B2/en not_active Ceased
- 1991-12-23 PT PT99929A patent/PT99929A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-12-23 NO NO91915084A patent/NO915084L/no unknown
- 1991-12-23 IL IL100470A patent/IL100470A0/xx active IP Right Grant
- 1991-12-23 AR AR91321501A patent/AR246310A1/es active
- 1991-12-23 MX MX9102767A patent/MX9102767A/es unknown
- 1991-12-23 IE IE454891A patent/IE914548A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-12-26 KR KR1019910024356A patent/KR920012440A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-12-26 YU YU199691A patent/YU199691A/sh unknown
- 1991-12-27 JP JP3357983A patent/JP2554418B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0654690A (ja) * | 1990-09-11 | 1994-03-01 | Kiyoshi Takatsu | インターロイキン５レセプター |
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| US7179464B2 (en) | 1995-09-11 | 2007-02-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method of treatment by administering an antibody to human interleukin-5 receptor α chain |
| US7238354B2 (en) | 1995-09-11 | 2007-07-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method of treating atopic dermatitis using antibody against human interleukin-5 receptor alpha chain |
| JP2002525580A (ja) * | 1998-09-10 | 2002-08-13 | イミュノテク | 好塩基球及び好酸球の検出又は定量のための方法 |
Also Published As
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|---|---|
| AU8998591A (en) | 1992-10-15 |
| YU199691A (sh) | 1994-06-24 |
| AR246310A1 (es) | 1994-07-29 |
| KR920012440A (ko) | 1992-07-27 |
| NZ241094A (en) | 1993-07-27 |
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| EP0492214A3 (en) | 1992-09-09 |
| AU647560B2 (en) | 1994-03-24 |
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| IE914548A1 (en) | 1992-07-01 |
| IL100470A0 (en) | 1992-09-06 |
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| CA2058003A1 (en) | 1992-06-28 |
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