JP2002525580A - 好塩基球及び好酸球の検出又は定量のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、好酸球又は好塩基球の検出又は定量の方法に関連し、このことは、おそらく前記の好酸球又は好塩基球を含む試料を、ＩＬ−５のその受容体への固定を妨害せず、そして好酸球及び好塩基球を検出し、そして必要ならば定量するために、ＩＬ−５の生物学的活性を阻害しないＩＬ−５抗受容体（α鎖）モノクローナル抗体と接触させることにある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、健康な人及び病気の人における好塩基球及び好酸球の検出又は定量
のための新規方法、必要な試薬の調製及び、特にキットの形態におけるその実施
のための方法に関する。

【０００２】 好酸球及び好塩基球を研究するのが難しいのは、それぞれ１％〜３％及び１％
未満と、血液中でこれらの細胞の数が非常に少ないためである。しかし、それら
の数は、ある病状、例えば寄生虫の感染、アレルギー性及び喘息性の症状又はあ
る白血病において増大することがある。

【０００３】 好酸球が慢性のアレルギー性喘息において、重要な役割を果たすことが示され
てきた。好酸球は、それらが活性化され、そして脱顆粒されることがある呼吸経
路に侵入する。顆粒成分、酵素及び塩基性タンパク質の放出は、気管支の上皮に
損傷をもたらす。いくつかの報告は、更に好酸球の機能不全を報告している。

【０００４】 様々なアレルゲン、例えば肺炎のアレルゲン、毒液、食物タンパク質又は医薬
生成物による、好塩基球上に存在する特異的なＩｇＥの架橋は、顆粒内に含まれ
るか又は新たに生成され、そしてアナフィラキシーショックを誘導することがで
きるメディエーターの放出を導くことがある。

【０００５】 個体の症状を理解し、そして外来性因子に対するその感受性を評価するために
、好酸球及び好塩基球を計数し、そして特定の因子によって活性化することがで
きるものの比率を測定することがつまりは重要である。

【０００６】 好塩基球及び好酸球の計数方法は、好塩基球の場合、例えばオルト−トルイジ
ンブルーを用い、そして好酸球の場合、エオシンを用いる顆粒の染色（手作業に
よる計数）、それらのサイズ及びそれらの粒子サイズの分布に基づいているか、
又はそれらの細胞表面の分化の免疫表現型に基づいている。これらの方法は扱い
にくく、時間がかかり、そしてあまり特異的ではない。それらが高レベルの不確
実性及びかなりの統計的な誤差を有するのは、これらの細胞型の数が少ないため
である。更に、これらの方法の多くが、これらの細胞の活性化の程度を解析する
のに適していない。

【０００７】 これらの理由の全てから、好酸球及び好塩基球を検出し、そしてそれらが活性
化されたかどうかを更に具体的に定量できる手段による、生成物及び方法を有す
ることが望ましいであろう。

【０００８】 フローサイトメーターを用いる様々な方法が、好酸球及び好塩基球の検出のた
めに記述されてきた（例えば、Nakagawa et al., (1981) Allergy, 36 ; pp39-4
7 ; Gane et al., (1995) Cytometry 19 ; pp361-365 ; Huebl et al., (1996)
J. Clin. Lab. Analysis 10, 177-183）。

【０００９】 フローサイトメトリーによって好塩基球及び好酸球を研究する際に直面する主
な問題の１つは、ポジティブな細胞とネガティブな細胞との間の異なる分離にあ
る。著者の中には、好酸球の注目すべき特徴である、それらの自己蛍光性を、そ
れらを更に正確に同定するために使用するものもいる。しかし、ある臨床用の試
料は、単球、好中球及びリンパ球の非常に高い自己蛍光を示す。好酸球の粒子サ
イズの分布における大きな変化性も、本明細書で強調すべきであり、これはこれ
らの細胞に相当する散点図の領域（サイズ及び粒子サイズの分布の関数としての
分布）が広がっているという事実に反映されている。散点図上で、好塩基球はリ
ンパ球と単球との間の境に位置している。

【００１０】 白血球は、それらの表面上でタンパク質を発現しており、これは言い換えると
ＣＤ（Cluster of Differentiation）のことであり、それらを認識する抗体群に
よって特徴づけられる。同一の細胞上での複数のＣＤの発現は、前記細胞を特徴
づけることを可能にすることがある。同一のＣＤは、異なる細胞型上で発現する
ことがある。この理由から、フローサイトメトリー法の多くは、複数のこれらの
ＣＤを認識する抗体の混合物を、好塩基球及び好酸球のマーカーとして使用する
。

【００１１】 例えば、一方の抗ＣＤ２、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６及びＣＤ１９、並びに他方
の抗ＣＤ３２、抗ＣＤ２５、抗ＩｇＧ１及び抗ＩｇＧ４の、２つの抗体混合物の
使用は、蛍光フローサイトメーターによる好塩基球の検出を可能にする。抗ＣＤ
２抗体はＴ細胞を検出し、抗ＣＤ１９抗体はＢ細胞の検出を可能にし、そして抗
ＣＤ１４抗体は主に単球を検出するが、顆粒球もまた検出する。ＩｇＧのIII 型
受容体、ＣＤ１６は、好中球、あるＴ（ＮＫ）細胞及び単球上で発現する。Ｉｇ
ＧのII型受容体、ＣＤ３２は、単球、好中球及びＢリンパ球上で発現する。ＣＤ
２５は、Ｔ及びＢ細胞の活性化のマーカーであり、そしてマクロファージの活性
化のマーカーである。複数のこれらのマーカーは、異なる型のリンパ球によって
分けられている。好塩基球及び好酸球は、白血球の少数の集団である。この理由
から、好塩基球及び好酸球についての多くのデータは、精製した細胞から得られ
てきた。例えば、慢性骨髄性白血病を有する個体の好塩基球を、モノクローナル
抗体を用いる複数の精製段階、それに続く補体による赤血球の溶解の後に研究す
ることが可能であった。しかし、この方法が型通りの使用にとって実用的でない
のは、それが長々しく、そして大量の血液を必要とするためである。

【００１２】 好塩基球の検出のための他の方法は、ＩｇＥとの高い親和性を有する抗ＩｇＥ
抗体又は抗受容体抗体を使用する。しかし、これらの方法が好塩基球の明確な同
定を可能にしないのは、少量の高い親和性のＩｇＥ受容体が単球上で明らかにさ
れ、そして好酸球及びＢ細胞が、それらの表面上にＩｇＥを有することがあるた
めである。更に、プローブとして使用した抗体による好塩基球の表面上でのＩｇ
Ｅ又はそれらの受容体の架橋は、膜の特性を変化させる細胞活性化を導くことが
ある。アレルゲンによる好塩基球の活性化は、抗ＩｇＥ抗体の結合の低下をもた
らすことが示された。

【００１３】 従って、ヒトの血液の他の細胞集団中であっても、容易に、そして誤差の危険
性無しに好酸球及び好塩基球を計数し、そして特定の因子によって活性化が可能
なものの比率を測定することができることは望ましいだろう。

【００１４】 慢性気管支喘息又はアトピー性皮膚炎の様な病気を診断し、そして処置する問
題に応じて、ＥＰ−Ａ−０ ８１１ ６９１は様々な型の抗体、モノクローナル
、ヒト化したものなど、インターロイキン５受容体のα鎖に対する、このサイト
カインの活性を妨害するもの、を提供している。それはまた、好酸球の検出方法
を提供している。しかし、ＩＬ−５の生物学的活性を中和する抗体の使用は、フ
ローサイトメトリー解析において期待はずれの結果をもたらす。好酸球上で得ら
れる特異的なシグナルは、それらが精製されても、コントロール抗体で得られた
シグナル（バックグラウンド）と区別できない。

【００１５】 インターロイキン５の受容体（ＩＬ−５Ｒ）に対するモノクローナル抗体の群
を特徴づけるときに、前記出願人は、驚くべきことにヒト又は動物の血液の細胞
集団の中でも特に、好塩基球及び好酸球が、インターロイキン５受容体のα鎖に
特異的なある抗体を用いて、単独及び一緒に検出することができ、そしてこれら
の同一の細胞を、所望ならば計数できることを発見した。前記出願人は、自身の
生存のためにＩＬ−５依存であるＴＦ１細胞上でのバイオアッセイによって、こ
れらの選択した抗体が、これらの細胞の増殖を阻害しないことを示した。

【００１６】 更に、前記出願人は、これらの抗体に結合し、そして固相上に固定化した受容
体が、なおも標識したＩＬ−５を固定化することができることも示した。

【００１７】 この理由から、本出願は好酸球及び好塩基球の検出又は定量のための方法を提
供し、これは任意に前記好酸球又は好塩基球を含む試料を、ＩＬ−５のその受容
体への固定を妨害せず、そして好酸球及び好塩基球を検出し、そして所望ならば
定量するためにＩＬ−５の生物学的活性を阻害しない、ＩＬ−５抗受容体（α鎖
）モノクローナル抗体と接触させることを含んで成ることを特徴とする。

【００１８】 従って、本発明はＩＬ−５抗受容体（α鎖）モノクローナル抗体並びに好酸球
及び好塩基球の特異的マーカーとしての、ＩＬ−５受容体のα鎖の発現を使用す
る。このマーキングはこれらの血液細胞に特異的であり、そしてＢ又はＴ細胞、
単球あるいは好中球のいずれもマーキングされなかったことが観察された。

【００１９】 従って、これらの抗体は、どの様な環境下でも好塩基球及び好酸球を正確かつ
精密に計数するために使用できる。

【００２０】 任意に前記の好酸球又は好塩基球を含む試料は、例えば特に、好ましくはアレ
ルギー又は寄生虫性の疾患に苦しむ病人に由来する血液試料であってもよい。

【００２１】 上述した方法に従い、ＩＬ−５抗受容体モノクローナル抗体は、ＩＬ−５のそ
の受容体への固定化を妨害せず、そしてＩＬ−５の生物学的活性を阻害しない抗
体である。

【００２２】 ＩＬ−５の生物学的活性の阻害がないということは、自身の生存のためにＩＬ
−５依存であるＴＦ１細胞上でのバイオアッセイ、ＴＦ１細胞の増殖を阻害しな
い、本発明に従う抗体によって示すことができる。

【００２３】 上述した方法を行うのに好ましい条件下で、ＩＬ−５抗受容体モノクローナル
抗体は、ＩｇＥを妨害しない抗体である。“ＩｇＥを妨害しない”という表現は
、アレルゲン又は別の抗ＩｇＥ抗体の、これらの表面にあるＩｇＥへの結合を妨
害しない抗体を意味する。

【００２４】 上述した方法を行うのに更に好ましい条件下で、ＩＬ−５抗受容体モノクロー
ナル抗体は、好酸球又は好塩基球の細胞活性化を妨害しない抗体である。“好酸
球又は好塩基球の細胞活性化を妨害しない”という表現は、前記細胞の表面への
その結合によって、好塩基球又は好酸球の表面活性化マーカーの出現を誘導又は
阻害しない抗体を意味する。

【００２５】 上述した方法を行うのに、より更に好ましい条件下で、好酸球及び好塩基球の
検出及び、所望ならば定量は、フローサイトメーター又は光学スキャニングサイ
トメーターを使用する。

【００２６】 ヒト好塩基球は、それらの表面上にマーカー、例えばＣＤ１１，ＣＤ１３，Ｃ
Ｄ１８，ＣＤ２６，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ３３，ＣＤ４０，ＣＤ４３，ＣＤ
４４，ＣＤ４５，ＣＤ４９ｄ，ＣＤ５４を発現し、そして好酸球は、それらの表
面上にＣＤ１５，ＣＤ３２，ＣＤ４４，ＣＤ４９ｄ，ＣＤ５２，ＣＤ６５，ＣＤ
６６，ＣＤ６７を発現する。他方で、好塩基球又は好酸球のいずれもＣＤ３，Ｃ
Ｄ１４，ＣＤ１６，ＣＤ１９を発現しない。これらのマーカーの一覧は、余すこ
となく述べられている。

【００２７】 この理由から、本出願はまた、更に前記試料が、好酸球又は好塩基球以外の細
胞型を排除することを可能にする他のマーカーに対する、１又は好ましくは複数
の他のモノクローナル抗体と接触することを特徴とする、上記の方法を提供する
。従って、リンパ球、単球及び好中球を、好酸球及び好塩基球と区別することが
可能である。

【００２８】 従って、排除（exclusion ）マーカーは、不規則な事象を排除することによっ
て、計数の正確さをより一層向上させるために使用される。本出願は、特に前記
の他のモノクローナル抗体が、不規則な事象を排除することを可能にするマーカ
ーＣＤ３，ＣＤ１６及びＣＤ１９に対するものであることを特徴とする上記の方
法を提供する。

【００２９】 本発明は、活性化したか又は活性化してない好塩基球及び好酸球の検出及び特
異的な定量を認める。最近、４回貫通スーパーファミリーのリソソームタンパク
質であり、そして当初血小板活性化マーカーとして記載されていたＣＤ６３が、
好塩基球及び好中球の顆粒にも存在することが示された。前記細胞上でのＣＤ６
３の発現はカルシウム依存性である。好塩基球が活性されるとき、表面上で発現
したＣＤ６３は特異的な抗体で認識されることがある。マーキングの強度は、活
性化した細胞の数の関数である。

【００３０】 この理由から、本出願は更に、活性化した好塩基球の検出又は定量が、好塩基
球活性化マーカー及び、特にＣＤ６３抗原に対する１又は複数の他のモノクロー
ナル抗体と、前記試料とを接触させることによっても行われることを特徴とする
、上記の方法を提供する。

【００３１】 同様に、本発明は更に、活性化した好酸球の検出又は定量が、好酸球活性化マ
ーカー及び更に詳しくはＣＤ６９抗原に対する１又は複数のモノクローナル抗体
と、前記試料を接触させることによっても行われることを特徴とする、上記の方
法を提供する。

【００３２】 更に、好塩基球及び好酸球を別々に検出し、そして測定することができるのは
、識別の追加の手段が利用可能である場合であり、例えば、 −好酸球がかなり大きな横方向の散乱（side scatter）の値によって好塩基球
と区別される、フローサイトメーターにおける光の拡散、 −沈澱基質、例えばＤＡＢ（ジアミノベンジジン）又は蛍光基質、例えばジク
ロロフルオレセインジアセテート、高度に蛍光性の２′，７′−ジクロロフルオ
レセインに変換した非蛍光基質、を用いて明らかにされる、好酸球のペルオキシ
ダーゼ活性の特徴、を利用できる場合である。

【００３３】 本出願は更に： −ＩＬ−５のその受容体への固体を妨害せず、 −ＩｇＥを妨害せず、 −好酸球又は好塩基球の細胞活性化を妨害せず、 −ＩＬ−５の生物学的活性を阻害しない、 ことを特徴とする抗ＩＬ−５Ｒ抗体を提供する。

【００３４】 本発明の有利な態様は、一方ではＴ及びＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球及び好中
球に“特異的な”マーカーを持つ又は持たない、ＩＬ−５Ｒに対する抗体の混合
物の使用にあり、そして活性化した好酸球又は好塩基球が注目のものならば、他
方では、好塩基球及び好酸球の活性化マーカーに対するものにある。前記の細胞
活性化マーカーは、活性化後に細胞膜上に出現するタンパク質、又は酸化的酵素
活性の検出に特異的な抗体であってもよい。後者は細胞の活性化を検出し、そし
て任意に定量することを可能にする。

【００３５】 この理由から、本発明は更に、異なる適用を標的とするキットを提供し、前記
キットはそれらの基本として、好ましくはマウス、ラット又はウサギの、あるい
は遺伝子操作した抗ＩＬ−５Ｒモノクローナル抗体を持ち、そして主に好酸球又
は好塩基球の検出又は定量のためのキットは、 −上文で定義した様な、一次蛍光クロムに結合した少なくとも１つの抗ＩＬ−
５Ｒモノクローナル抗体、 −二次蛍光クロムに結合した、リンパ球、単球及び好中球のための抗体マーカ
ー混合物、 を含み、 そして活性化した好酸球及び好塩基球の検出及び定量のためのキットは、 −上文で定義した様な、一次蛍光クロムに結合した少なくとも１つの抗ＩＬ−
５Ｒモノクローナル抗体、 −二次蛍光クロムに結合した、リンパ球、単球及び好中球のための抗体マーカ
ー混合物並びに −活性化マーカーに対する、そして三次蛍光クロムに結合した抗体、 を含む。

【００３６】 本出願は更に、好酸球の酸化的活性に特異的な基質を含むことを特徴とする上
記キットを提供する。

【００３７】 本出願は更に、好酸球又は好塩基球の酸化的活性の検出又は定量のためのキッ
トを提供し、これは −上文で定義した様な、一次蛍光クロムに結合した少なくとも１つの抗ＩＬ−
５Ｒモノクローナル抗体、 −二次蛍光クロムに結合した、リンパ球、単球及び好中球のための抗体マーカ
ー混合物、 −好酸球又は好塩基球の酸化的活性のためのマーカー基質、 を含む。

【００３８】 上述した方法を行うのに好ましい条件は更に、上文で言及した本発明の他の内
容に適用される。

【００３９】 最後に、本出願は前記のＩＬ−５抗受容体モノクローナル抗体がＩｇＧ１型の
抗体であり、この相当するハイブリドーマが、Collection Nationale de Cultur
e de Micro-organismes (CNCM)に、第１−２０６８号の名のもと提出されたこと
を特徴とする、上記の方法、抗体又はキットを提供する。

【００４０】 本発明は、脱感作を診断するか、又は観察するために、あるいは好塩基球又は
好酸球の脱顆粒を修飾する新規分子の能力を明らかにするために、並びにアレル
ギー性、寄生虫性及び白血病性の病状を研究するために、異なる型の脱顆粒化因
子（アレルゲン、化学製品、寄生虫など）に対する好塩基球又は好酸球の応答の
、臨床及び医薬の研究所による試験に適用されることがある。

【００４１】 例１．抗ＩＬ−５Ｒモノクローナル抗体の獲得 １．試薬 一般試薬（塩類、緩衝液など）は、Merck (Darmastadt, Germany）から購入し
た。細胞培養試薬は、Biowitthaker (Virviers, Belgium)及びSigma (Saint-Lou
is, USA)のものである。フルオレセインＮ−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又
はフィコエリトリンシアニン５（ＰＥＣｙ５）に結合した抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６
、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４９ｄ、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ６９モノクローナル抗体並び
に抗ＩｇＥモノクローナル抗体クローンＥ１２４．２．８は、Immunotech (Mars
eilles, France）から購入した市販の製品である。

【００４２】 ２．融合 抗ＩＬ−５Ｒ抗体、クローンＨ１７Ｎは、遺伝子融合体ＩＬ−５Ｒ−ＩＬ−２
から産生し、そしてＣＨＯ細胞で発現したタンパク質、ＩＬ−５Ｒの可溶性組換
え型によるマウスの免疫化、更にKoehler 及びMilsteinによって記述された常用
の技術（1975, Nature 256, 495)を用いたミエローマＸ６３の細胞と胚細胞の融
合の後得られた。抗体の産生は、混成タンパク質ＩＬ−５Ｒ−ＩＬ−２又はＩＬ
−２のいずれかで覆ったプレートを用いるＥＬＩＳＡによってスクリーニングし
た。ＩＬ−５Ｒ−ＩＬ−２で覆ったプレート上のポジティブなクローン及びＩＬ
−２で覆ったプレート上のネガティブなクローンを限界希釈でクローン化した。
前記抗体は、ＩＬ−５の存在下及び非存在下でＩＬ−５Ｒを認識するそれらの能
力、本発明に従う基準によって、ＴＦ−１細胞上で選択した。

【００４３】 選択したモノクローナル抗体の中でも、Ｈ１７Ｎとして知られる抗ＩＬ−５Ｒ
モノクローナル抗体は、前記抗原に対して高い親和性を有するが、ＩＬ−５の生
物学的活性を阻害しない。その結果として、ＩＬ−５がその受容体に結合するに
もかかわらず、阻害は観察されない。相当するハイブリドーマは、１９９８年９
月３日に、パリのCollection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNC
M)に第１−２０６８号の名のもと提出した。Ｈ１７Ｎとして知られる抗ＩＬ−５
Ｒモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１型のものである。

【００４４】 ３．蛍光標識への結合 抗ＩＬ−５Ｒ抗体Ｈ１７Ｎは、G. Hermansonによる“Bioconjugate technique
s”, Academic Press, 1996 に記載のプロトコールに従い、フィコエントリンに
結合した。

【００４５】 例２．サイトメトリーによる全血液の解析 １．血液試料 相関解析に使用した血液試料は、Hopital La Conception (Marseilles, Frann
ce）から入手した。血液の調製は、抗凝血物質としてＥＤＴＡを含むチューブ上
で、ＳＴＫＳ−Ｃｏｕｌｔｅｒ装置（Miami, USA）によって行った。好塩基球の
活性化に使用した血液は、ヘパリンチューブを用いて採った。これらの試料は前
記の研究所に属する人から採取した。

【００４６】 ２．プロトコール 全血液由来の、異なる細胞の部分母集団におけるＩＬ−５Ｒの発現は、一方で
、例１の３つ目の段落で調製した、フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ
Ｈ１７Ｎを用い、そして他方で、研究した細胞集団に特異的なマーカーを用いる
、二重の免疫標識によって解析した。

【００４７】 使用したプロトコールは次の様なものである：１００μｌの全血液を、２０μ
ｌの抗ＩＬ−５Ｒ抗体Ｈ１７Ｎ−ＰＥ及び２０μｌの、別のマーカーのための二
次特異的抗体と一緒にインキュベートした。前記試料を、環境温度で１５分間イ
ンキュベートした。

【００４８】 次に、１mlの溶解試薬を加え、そして反応混合物をすぐに激しく混合した。前
記の試料が半透明になったとき（＜１分）、２５０μｌの固定化試薬を加え、そ
して試料を慎重に再び混合した。３mlの等張性のリン酸緩衝液（ＰＢＳ １Ｘ）
を次に加え、その後、前記試料を１２００rpm で３分間遠心した。上清を吸収に
よって除去し、そして５００μｌのＰＢＳ−０．５％ホルムアルデヒドを加えた
。前記試料を、サイトメーター解析の前に、暗い所に４℃で保存した。

【００４９】 非特異的な結合は、同じイソ型の対照標準の無関係な抗体、ＩＭ ０６７０（
Immunotech, Morseilles）を用いて監視した。このことは、装置への適当な調節
を行うことを可能にする。異なる蛍光クロムで標識した細胞のサイトメトリー解
析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Becton Dickinson, Mountain View, USA）
で行った。各試料につき１００，０００回解析した。

【００５０】 ３．フローサイトメトリーによる好塩基球及び好酸球の同定 前記の抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ抗体を、ＩＬ−５受容体を発現している細胞を
更に容易に特徴づけるために、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合させた。Ｈ１７
Ｎ−ＰＥ抗体及びコントロール抗体（同一のイソ型対照標準の無関係な抗体ＩＭ
０６７０）を用いた全血液の免疫標識を図１（Ａ及びＢ）に示す。

【００５１】 コントロール抗体の存在下で、マーキングがされていないことが観察された（
図１Ａ）。一方で、抗ＩＬ−５Ｒ−ＰＥ抗体の存在下、ある細胞の蛍光の遅れが
観察された（図１Ｂ）。抗ＩＬ−５Ｒ抗体でマーキングした細胞の２つの雲（領
域Ｒ５及びＲ４）は、好酸球及び好塩基球に相当する。この観察は、異なるＣＤ
（Clusters of Differentiation ）に特異的な抗体を用いての、複数の免疫標識
作業によって確認された。従って、ＩＬ−５Ｒにポジティブな細胞が、ＣＤ３，
ＣＤ１９及びＣＤ１６の発現にネガティブであり、これらのＣＤがリンパ球に特
異的であり、そしてＣＤ１４の発現にネガティブであり、これらが単球に特異的
であることが観察された。しかし、前記細胞は好酸球及び好塩基球で発現するが
、リンパ球、単球及び胸腺細胞でも発現するタンパク質、ＣＤ４９ｄにポジティ
ブである。

【００５２】 このことは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体によってマーキングされた細胞が、好酸球及び
好塩基球に都合よく相当することを示している。

【００５３】 例３：好酸球及び好塩基球の定量 マルセイユのHopital de la Conceptionで使用した、ＳＴＫＳ血液解析機（Co
ulter, Miami）によって与えられた好酸球と好塩基球との間のパーセンテージの
差異は、本発明に従う抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ抗体で検出した、ＩＬ−５Ｒの発
現にポジティブな細胞のパーセンテージと比較した。

【００５４】 好塩基球及び好酸球は、本発明に従う抗ＩＬ−５Ｒ抗体によってマーキングさ
れる細胞の唯一の型であるが、好塩基球の雲は、リンパ球に相当する細胞の雲に
極めて近い。

【００５５】 フィコエリトリンシアニン５に結合した抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１９
抗体の混合物を、不規則な事象を排除することを可能にする、ＰＥに結合した抗
ＩＬ−５Ｒ抗体に加えた。この組合わせは、更に正確な値を得ることを可能にし
た。この方法を用いることで、５０個の異なる試料で、前記の２つの方法で得ら
れた好酸球及び好塩基球のパーセンテージを比較した。結果を図４に示す。

【００５６】 図４Ａは、両方の技術によって得られる好酸球のパーセンテージの相関を示す
。これは〔％（血液解析機）〕＝０．９４〔％（サイトメーター）〕＋０（ｎ＝
５０）である。図４Ｂは、両方の技術によって得られる好塩基球のパーセンテー
ジの相関を示す。これは〔％（血液解析機）〕＝０．８６〔％（サイトメーター
）〕＋０．０７６（ｎ＝５０）である。非常に良好な相関が２つの方法の間にｒ
＝０．９８とｒ＝０．８３で観察され、このことは本発明に従う方法の高い信頼
性を示している。

【００５７】 例４：好塩基球の活性化 活性化した好塩基球によるヒスタミンの放出は、チューブ内に据えて、そして
投与量依存曲線を確立するために異なる濃度の抗ＩｇＥの存在下でインキュベー
トした、３００μｌの血液のアリコートで行った。

【００５８】 前記試料をおだやかに混合し、そして３７℃で１５分間インキュベートした。
細胞の活性化は、１mMのＥＤＴＡを含む３００μｌの冷やしたリン酸緩衝液を加
えて停止させた。前記のチューブは、＋４℃で３分間、１２００rpm で遠心した
。上清は、ヒスタミンを定量するために回収した。細胞の残査を３００μｌのリ
ン酸緩衝液、１mM ＥＤＴＡ中で再懸濁し、そして１００μｌのこの細胞懸濁液
を免疫標識後に解析した。

【００５９】 放出されたヒスタミンの定量は、市販の放射線免疫アッセイ（対照標準１６５
９、Immunotech, Marseilles, France）を用い、取扱い説明書に従い行った。合
計のヒスタミンは、９５０μｌの蒸留水中での５０μｌの血液の希釈、続く２回
の凍結−解凍周期による細胞の溶解後に決定した。細胞の活性化後に放出された
ヒスタミンは、合計のヒスタミンのパーセンテージとして表した。

【００６０】 フローサイトメトリーによる解析は、ＰＢＳで溶解した１００μｌの細胞残査
への、抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ−ＰＥ抗体、抗ＣＤ６３−ＦＩＴＣ抗体並びに抗
ＣＤ３、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９抗体（３つともＰＥＣｙ５に結合している）に
よる三重のマーキングの後に行った。前記の方法は、上述したものと同一であっ
た。同様に、１００，０００個の細胞の解析を行った。二重にマーキングされた
細胞ＣＤ６３＋及びＩＬ−５Ｒ＋のパーセンテージは、細胞の活性化後に決定し
た。

【００６１】 代表的な実験を図５に示す。二重にマーキングされた細胞（ＣＤ６３及びＩＬ
−５Ｒ）における、抗ＩｇＥの濃度の関数としての増大が観察された。この増大
は、図６の４つの異なるドナーで示した様な、放出されたヒスタミンのプロファ
イルと完全に相関している。

【００６２】 例５．好酸球の活性化 活性化マーカーＣＤ６９の発現は、チューブ内に据えて、そして投与量依存曲
線を確立するために異なる濃度のＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）
の存在下でインキュベートした、３００μｌの血液のアリコート上で行った。前
記試料をおだやかに混合し、そして３７℃で６時間インキュベートした。細胞の
活性化は、＋４℃で３分間、１２００rpm で遠心することで停止させた。上清は
、ヒスタミンを定量するために回収した。細胞の残査を３００μｌのＰＢＳ、１
mM ＥＤＴＡ中で再懸濁し、そして１００μｌのこの細胞懸濁液を免疫標識後に
解析した。

【００６３】 放出されたヒスタミンの定量は、市販の放射線免疫アッセイ（対照標準１６５
９、Immunotech, Marseilles, France）を用い、取扱い説明書に従い行った。合
計のヒスタミンは、９５０μｌの蒸留水中での５０μｌの血液の希釈、続く２回
の凍結−解凍周期による細胞の溶解後に決定した。細胞の活性化後に放出された
ヒスタミンは、合計のヒスタミンのパーセンテージとして表した。

【００６４】 フローサイトメトリーによる解析は、ＰＢＳで溶解した１００μｌの細胞残査
への、抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ−ＰＥ抗体、抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣ抗体又は抗Ｃ
Ｄ６３−ＦＩＴＣ−抗体並びに抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９抗体（３つと
もＰＥＣｙ５に結合している）による三重のマーキングの後に行った。前記の方
法は、上述したものと同一であった。同様に、１００，０００個の細胞の解析を
行った。二重にマーキングされた細胞の、一方のＣＤ６９＋及びＩＬ−５Ｒ＋、
他方のＣＤ６３＋及びＩＬ−５Ｒ＋のパーセンテージは、細胞の活性化後に決定
した。

【００６５】 代表的な実験を図７に示す。二重にマーキングされた細胞（ＣＤ６９＋及びＩ
Ｌ−５Ｒ＋）における、ＰＭＡ濃度の関数としての増大が観察される。興味深い
ことに、好酸球に対する抗ＣＤ６３抗体によるマーキングは、ＣＤ６３が好塩基
球に特異的であることを示す蛍光を全く与えなかった。

【００６６】 例６．好酸球又は好塩基球の検出又は定量のためのキット 次の構成物に相当するキットを調製した： −フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ抗体を含む容器、 −抗体混合物： ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ３ ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ１６ ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ１９、 を含む容器、 −フィコエリトリンに結合した“イソ型コントロール”抗体を含む容器、 −ＰＥＣｙ５に結合した“イソ型コントロール”抗体を含む容器。

【００６７】 例７．活性化した好酸球又は好塩基球の検出又は定量のためのキット 次の構成物に相当するキットを調製した： −フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ抗体を含む容器、 −抗体混合物： ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ３ ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ１６ ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ１９、 を含む容器、 −ＦＩＴＣに結合した抗ＣＤ６３抗体を含む容器、 −フィコエリトリンに結合した“イソ型コントロール”抗体を含む容器、 −ＰＥＣｙ５に結合した“イソ型コントロール”抗体を含む容器 −ＦＩＴＣに結合した“イソ型コントロール抗体を含む容器。

【００６８】 例８．好酸球又は好塩基球の検出又は定量のためのキット 次の構成物に相当するキットを調製した： −フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ抗体を含む容器、 −抗体混合物： ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ３ ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ１６ ＰＥＣｙ５に結合した抗ＣＤ１９、 を含む容器、 −ＰＥＣｙ５に結合した“イソ型コントロール”抗体を含む容器、 −ジクロロフルオレセインジアセテートを含む容器。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ Ｈ１７Ｎ（Ｂ）モノクロ
ーナル抗体及びイソ型コントロール（Ａ）によって得られたドットプロットの図
である。横軸は対数目盛で表した蛍光の強度を表し、そして縦軸は横方向の散乱
を表す。Ｒ４及びＲ５で標識した多角形は、それぞれ好塩基球及び好酸球を表す
。

【図２Ａ】 図２Ａは、好塩基球のために、フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ抗体
で得た二重のマーキングを例示する。横軸はフルオレセイン（ＦＩＴＣ）によっ
て放射される蛍光を表し、そして縦軸はフィコエリトリン（ＰＥ）によって放射
される蛍光を表す。 左側のドットプロットは、抗ＩＬ−５Ｒ−ＰＥと、ＦＩＴＣに結合した別のマ
ーカーに特異的な抗体との間の二重のマーキングを表す。右側のドットプロット
は、抗ＩＬ−５Ｒ−ＰＥのイソ型コントロールによって得たマーキングを表す。 使用したマーカーは、上から下まで抗ＣＤ１６（このマーカーは好中球、ＮＫ
細胞、クッパー細胞及びマクロファージの副次集団上に存在している）、抗ＣＤ
４９ｄ（インテグリンのα４鎖は好塩基球及び好酸球だけでなく、リンパ球、単
球及び胸腺細胞上で発現した）である。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、好酸球のために、フィコエリトリンに結合した抗ＩＬ−５Ｒ抗体で
得た二重のマーキングを例示する。横軸はフルオレセイン（ＦＩＴＣ）によって
放射される蛍光を表し、そして縦軸はフィコエリトリン（ＰＥ）によって放射さ
れる蛍光を表す。 左側のドットプロットは、抗ＩＬ−５Ｒ−ＰＥと、ＦＩＴＣに結合した別のマ
ーカーに特異的な抗体との間の二重のマーキングを表す。右側のドットプロット
は、抗ＩＬ−５Ｒ−ＰＥのイソ型コントロールによって得たマーキングを表す。 使用したマーカーは、上から下まで抗ＣＤ１６（このマーカーは好中球、ＮＫ
細胞、クッパー細胞及びマクロファージの副次集団上に存在している）、抗ＣＤ
４９ｄ（インテグリンのα４鎖は好塩基球及び好酸球だけでなく、リンパ球、単
球及び胸腺細胞上で発現した）である。

【図３】 図３は、全てフィコエリトリンシアニン５（ＰＥＣｙ５）に結合したＣＤ３，
ＣＤ１９及びＣＤ１６抗体の混合物と組合わせて、フィコエリトリンに結合した
抗ＩＬ−５Ｒ抗体によって得られた二重のマーキングを例示する。ＦＬ−１チャ
ンネルはフルオレセインによって放射された蛍光に相当し、チャンネルＦＬ２は
フィコエリトリンによって放射された蛍光に相当し、そしてチャンネルＦＬ３は
フィコエリトリンシアニン５によって放射された蛍光に相当する。 図Ａは、サイズ及び粒子サイズの分布に従う散乱に相当する。リンパ球に相当
する領域Ｒ１、単球に相当する領域Ｒ２及び顆粒球に相当する領域Ｒ３を識別す
ることができる。 図Ｂは横方向の散乱の関数、細胞のサイズの関数としての、抗ＩＬ−５Ｒ−Ｐ
Ｅの蛍光に相当する。Ｒ４は好塩基球に相当し、そしてＲ５は好酸球に相当する
。 図Ｃは、横方向の散乱の関数として、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９抗体
の混合物の蛍光を表す。Ｒ６は、マーキングしてない好酸球に相当する。 図Ｄは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１９抗体の混合物の蛍光並びに抗Ｉ
Ｌ−５Ｒ−ＰＥ抗体の蛍光を表す。好酸球は領域Ｒ５及びＲ６に投影されている
。Ｒ５及びＲ６に存在する事象のみを図Ｄに考慮している。

【図４】 図４は、血液解析機によって得られたパーセンテージと、本発明の方法のもの
との間の相関を例示する。横軸はフローサイトメトリーで得られた好酸球のパー
センテージ（Ａ）及び好塩基球のパーセンテージ（Ｂ）を表し、そして縦軸は血
液解析機で与えられた好酸球のパーセンテージ（Ａ）及び好塩基球のパーセンテ
ージ（Ｂ）を表す。 上のグラフは、好酸球のために得たデータに相当し、そして下のグラフは好塩
基球のために得たデータに相当する。相関係数は各グラフの内側に与える。

【図５Ａ】 図５Ａは、抗ＩｇＥ抗体による好塩基球の活性化後に得られた結果の典型的な
図である。 この図５上で、ドットプロット１は血液細胞のサイズ及び粒子サイズの分布を
表し、図２は抗ＩＬ−５Ｒ−ＰＥ抗体によって得られたマーキングを表わし（図
１に示したものに類似している図）、図３は好塩基球の単離並びに他の可能性の
ある混入物、例えばリンパ球及び単球の集団からの除去を表す。図４は好塩基球
を表す。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、活性化した好塩基球の４つのドットプロットを表す。各ドットプロ
ットは、抗ＩｇＥの濃度の減少による全血液の刺激に相当する。各ドットプロッ
トの雲は、ドットプロット５Ａ−４に従い単離した集団に相当する。横軸は、抗
ＣＤ６３抗体に結合したフルオレセインによって放射された蛍光を表し、そして
縦軸は、抗ＩＬ−５Ｒ抗体に結合したフィコエリトリンによって放射された蛍光
を表す。

【図６】 図６は、ＣＤ６３＋ＩＬ−５Ｒ＋細胞のパーセンテージと、放出されたヒスタ
ミンのパーセンテージとの比較を例示する。 各図はドナーを表す。黒の記号はＣＤ６３＋ＩＬ−５Ｒ＋細胞の％を表し、そ
して白の記号は放出されたヒスタミンのパーセンテージを表す。横軸はμｇ／ml
で表した、好塩基球の刺激に使用した抗ＩｇＥの濃度を表し、そして縦軸はＣＤ
６３を発現している好塩基球のパーセンテージ又は放出されたヒスタミンのパー
センテージを表す。

【図７】 図７は、ホルボールエステルによる好酸球の活性化を例示する（ＰＭＡ：ホル
ボールミリステートアセテート）。横軸は加えたＰＭＡの濃度を表し、そして縦
軸はＣＤ６９又はＣＤ６３分子を発現している好酸球のパーセンテージを表す。
各図は異なるドナーを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (72)発明者 モレル，モンテロー アンヌ エム． フランス国，エフ−13008 マルセイユ， ル マリー ルイーズ バト セー，リュ マリー ルイーズ ６ (72)発明者 ブレリー，エルブ フランス国，エフ−13360 ロケベール， ラマンディエール ル クロス (72)発明者 ラーゲ，ミシェル フランス国，エフ−13001 マルセイユ， リュ アドフ ティエール 16 Ｆターム(参考） 2G045 AA03 CA12 CA15 CA16 CA17 CA20 DA36 DA71 DA80 FA37 FB07 GC15 JA20 4B064 AG27 CA10 CA20 DA01 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA22 EA50 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好酸球及び好塩基球の検出又は定量のための方法であって、
   任意に前記の好塩基球又は好酸球を含む試料を、ＩＬ−５のその受容体への固定
   を妨害せず、そして好酸球及び好塩基球を検出し、そして所望ならば定量するた
   めにＩＬ−５の生物学的活性を阻害しないＩＬ−５抗受容体（α鎖）モノクロー
   ナル抗体と接触させることを含んで成ることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 前記のＩＬ−５抗受容体モノクローナル抗体が、ＩｇＥを妨
   害しない抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記のＩＬ−５抗受容体モノクローナル抗体が、好酸球又は
   好塩基球の細胞活性化を妨害しない抗体であることを特徴とする、請求項１又は
   ２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記の好酸球又は好塩基球の検出及び、所望ならば定量が、
   フローサイトメーター又は光学スキャニングサイトメーター（optical scanning
   cytometer）を使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 更に、前記の試料が、好酸球又は好塩基球の細胞型の他のマ
   ーカーに対する他のモノクローナル抗体と接触することを特徴とする、請求項１
   〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記の他のモノクローナル抗体がマーカー、ＣＤ３，ＣＤ１
   ６及びＣＤ１９に向かうことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 活性化した好塩基球の検出又は定量が、更に好塩基球活性化
   マーカーに対する１又は複数の他のモノクローナル抗体と、前記試料を接触させ
   ることによって行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載
   の方法。
8. 【請求項８】 前記の活性化マーカーがＣＤ６３抗原であることを特徴とす
   る、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 活性化した好酸球の検出又は定量が、更に好酸球活性化マー
   カーに対する１又は複数の他のモノクローナル抗体と、前記試料を接触させるこ
   とによって行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 前記の活性化マーカーがＣＤ６３抗原であることを特徴と
    する、請求項９に記載の活性化した好酸球の検出及び定量のための方法。
11. 【請求項１１】 −ＩＬ−５のその受容体への固定を妨害せず、 −ＩｇＥを妨害せず、 −好酸球又は好塩基球の細胞活性化を妨害せず、 −ＩＬ−５の生物学的活性を阻害しない、 ことを特徴とする、抗ＩＬ−５Ｒ抗体。
12. 【請求項１２】 好酸球及び好塩基球の検出又は定量のためのキットであっ
    て、 −一次蛍光クロムに結合した、請求項１１に記載の抗ＩＬ−５Ｒモノクローナ
    ル抗体、 −二次蛍光クロムに結合した、リンパ球、単球及び好中球のための抗体マーカ
    ー混合物、 を含むキット。
13. 【請求項１３】 好酸球及び好塩基球の検出又は定量のためのキットであっ
    て、 −一次蛍光クロムに結合した、請求項１１に記載の抗ＩＬ−５Ｒモノクローナ
    ル抗体、 −二次蛍光クロムに結合した、リンパ球、単球及び好中球のための、抗体マー
    カー混合物、並びに −活性化マーカーに向かい、そして三次蛍光クロムと結合する抗体、 を含むキット。
14. 【請求項１４】 好酸球又は好塩基球の酸化的活性の検出又は定量のための
    キットであって、 −一次蛍光クロムに結合した、請求項１１に記載の抗ＩＬ−５Ｒモノクローナ
    ル抗体、 −二次蛍光クロムに結合した、リンパ球、単球及び好中球のための抗体マーカ
    ー混合物、 −好酸球又は好塩基球の酸化的活性のためのマーカー基質、 を含むキット。
15. 【請求項１５】 アレルギー性、寄生虫性又は白血病性の病状の研究に適用
    される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキット。
16. 【請求項１６】 前記のＩＬ−５抗受容体モノクローナル抗体がＩｇＧ１型
    の抗体であり、この相当するハイブリドーマが第１−２０６８号の名のもと、Co
    llection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM)に提出されたもの
    であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法、抗体又
    はキット。