KR102576597B1

KR102576597B1 - 면역 노화 평가용 조성물 및 키트

Info

Publication number: KR102576597B1
Application number: KR1020220178322A
Authority: KR
Inventors: 최중범; 김영주
Original assignee: 주식회사 리버스매직
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2023-09-08
Also published as: KR20230098032A

Abstract

본 발명은 면역 노화를 평가하기 위한 바이오마커 측정에 사용되는 면역 노화 평가용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 상기 면역 노화 평가용 조성물 및 키트는 림프구 표지자의 발현 수준을 측정함으로써 면역 노화를 신속하고 정확하게 평가할 수 있으며, 그 평가 결과를 바탕으로 체계적으로 면역력을 관리할 수 있으며, 나아가 면역력 노화 및 면역반응 이상을 예비하여 건강 증진을 도모할 수 있다.

Description

면역 노화 평가용 조성물 및 키트{Composition and kit for evaluating immune aging}

본 발명은 면역 노화를 평가하기 위한 바이오마커 측정에 사용되는 면역 노화 평가용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

사람은 나이가 들면서 노화(aging)를 겪는데, 노화는 신체기능의 저하 및 퇴화를 일으켜 암 발생이나 세균, 바이러스 등에 의한 감염에 취약해지도록 만든다. 하지만 개인마다 노화 정도가 다르고, 또 노화가 건강한 노화(healthy aging)와 건강하지 못한 노화(unhealthy aging)로 구분되어 건강한 노화보다는 건강하지 못한 노화가 질병에 대한 감수성을 더 크게 증가시킨다. 건강하지 못한 노화는 염증노화(inflammaging)를 동반하는데, 염증노화는 지속적인 약한 수준에서의 만성 염증(chronic low grade inflammation)이며 면역 이상반응(immune disorders)으로서 암을 비롯한 다양한 자가면역질환, 치매나 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌 신경질환, 고혈압, 당뇨, 심혈관계 질환 등 거의 모든 만성질환(chronic diseases)의 원인이 된다. 이러한 염증노화는 주로 개인의 좋지 못한 식생활 습관과 환경 및 유전적 요인 등의 복합적인 원인에 의한 것으로, 몸의 내부에 축적되는 전염증성 사이토카인과 산화적 스트레스, 유전자 손상 및 후성유전학적 변화 등을 일으켜 면역 노화(immune aging)에 따른 급속한 면역기능 저하 또는 면역 과민반응과 같은 면역력 이상(impaired immunity)을 초래하게 된다.

특히 현대인들은 면역력에 문제를 일으킬 수 있는 영양 상태 불균형, 비만, 흡연과 음주, 스트레스 및 과로, 운동 및 수면 부족 등과 같은 다양한 위험 요소에 노출되어 있으며 이러한 복합적인 위험 요소의 개인차에 따라 면역력이 노화 또는 저하되는 정도가 다르다고 할 수 있다.

하지만 면역체계는 매우 복잡하여 현재로서는 이렇게 개인마다 다른 면역력을 종합적이며 과학적으로 진단하고 평가할 만한 기술이 없는 실정이며, 대부분의 면역력 관리는 사실상 개인의 느낌에 의존하여 이루어지게 되어 정확하지 않다는 문제가 있다.

이런 이유로 나이가 들면서 본인의 면역력에 문제가 생기거나 급격하게 면역력이 노화되어 문제가 발생하더라도 이를 인지하기 어려워 면역력을 집중적으로 관리해야 하는 골든 타임(golden time)을 놓치게 되며, 이것이 훗날 암이나 감염질환 또는 다양한 자가면역질환 등과 같은 노인성 중증 면역질환의 단초가 될 수도 있다. 따라서 이제는 세계적으로도 고령화 시대에 접어든 상황인 만큼 현재 면역력을 제대로 알고 관리하기 위한 종합적이며 체계적인 면역 진단 기술과 면역력 관리 시스템의 개발이 절실히 요구되고 있다.

일본 등록특허 제5030109호 미국 등록특허 제8815524호

본 발명은 면역 노화를 평가하기 위해 림프구 표지자의 발현 수준을 측정하는 면역 노화 평가용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 면역 노화를 평가하기 위해 림프구 표지자의 발현 수준을 측정하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 림프구에서 CD3, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CD56, CD57, CD62L, CD70, CD85j, CD95, CD197, TIGIT 및 VISTA로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 면역 노화 평가용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 “면역 노화 평가”는 노화에 의해 면역 기능이 변화하는 정도, 즉 면역 노화가 진행되는 정도를 예측 또는 측정하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 면역 노화 평가를 위해 림프구 표지자의 발현 수준에 근거한 림프구 아형을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 "림프구(lymphocyte)”는 골수에 있는 줄기세포로부터 혈액 세포가 분화되는 과정에서 조혈줄기세포가 림프계 전구세포로 분화 및 성숙하여 만들어진 백혈구의 일종으로, 성숙된 림프구는 크게 골수에서 유래하는 B 림프구(B 세포)와, 흉선에서 유래하는 T 림프구(T 세포)와 자연살해(natural killer, NK) 세포로 나눌 수 있다. 본 발명에서는 면역 노화 평가를 위해 T 림프구, NK 세포 등의 림프구를 림프구 아형의 측정 대상으로 한다.

상기 T 림프구는 아직 항원을 만나지 못한 미접촉 T 세포(naive T cell), 항원을 만나 기능별로 분화한 보조 T 세포(helper T cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell) 및 자연살해 T 세포(natural killer T cell), 그리고 기억 T 세포(memory T cell)와 조절 T 세포(regulatory T cell) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 림프구는 T 림프구 및 NK 세포를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "림프구 아형(subset)”은 림프구의 표면에 존재하는 항원분자, 즉 표지자(marker)에 따라 구분한 세포집단을 의미한다. 주요 표지자들로는 표면 면역글로불린(surface immunoglobulin), 분화 관련 항원(differentiation antigen) 및 막 수용체(membrane receptor)가 있으며, 주로 CD(cluster of differentiation) 항원이라 한다.

예를 들면, CD3를 발현하는 림프구 (T 림프구)는 CD3+로 표시되고, CD3와 함께 CD8를 발현하는 림프구 (세포독성 T 림프구)는 CD3+CD8+로 표시되고, CD3을 발현하지 않으면서 CD56를 발현하는 림프구 (NK 세포)는 CD3-CD56+로 표시된다.

이러한 림프구 표지자의 발현 수준 또는 발현 여부를 관찰하기 위해서는 림프구를 포함하는 생물학적 시료를 대상으로 관찰하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 "생물학적 시료"는 생체에서 유래되어 생체 변화를 알아낼 수 있는 핵산, 유전자, 펩티드, 아미노산, 단백질, 지질, 당, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자들뿐만 아니라 세포, 조직을 포함하는 시료를 의미한다. 본 발명에서는 림프구를 포함하는 시료라면 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 림프액 및 조직액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 림프구를 포함하는 혈액인 것이 바람직하다.

상기 제제는 단백질 분자인 림프구 표지자에 직접 결합하거나 이를 암호화하는 유전자에 결합하는 물질일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 림프구 표지자 또는 이의 유전자에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "상보적으로 결합하는"이란 표적 서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드의 염기에 따라 결합하는 것을 의미하며, 아데닌은 티민과, 구아닌은 시토신과 각각 수소결합을 한다. 또한 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.

보다 구체적으로, 상기 제제는 림프구 표지자에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머(aptamer), 올리고펩티드 및 PNA(peptide nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 세포표면에서 림프구 표지자의 특이적인 검출을 위해 항원-항체 반응(antigen-antibody reaction)을 이용할 수 있도록 항체인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서는 특정 림프구 표지자에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체, 다클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fv 등일 수 있다.

상기 항체는 당업계에 공지된 기술을 통해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다클론 항체는 표적 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 동물로부터 제조 가능하다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 면역 노화 평가용 조성물은 림프구 표지자 14개의 발현 수준을 측정하여 림프구를 구성하는 다양한 조합의 림프구 아형을 검출 또는 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 CD3, CD8 및 CD56로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 제1 림프구 표지자; 및 CD27, CD28, CD45RO, CD57, CD62L, CD70, CD85j, CD95, CD197, TIGIT 및 VISTA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 제2 림프구 표지자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 림프구 표지자는 림프구의 계열(lineage)을 결정하기 위한 표지자로, 하나 또는 두 가지를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 제2 림프구 표지자는 계열이 결정된 림프구를 구성하는 아형을 구분하기 위한 표지자로, 하나 또는 두 가지를 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 조성물에 의해 검출된 림프구는 예를 들면, 상기 제1 림프구가 CD3+ 또는 CD3+CD8+인 경우, 상기 제2 림프구 표지자는 CD45RO-CD197+, CD28+TIGIT-, CD95-CD62L+, CD28+CD45RO-, CD28+CD197+, CD197+TIGIT-, CD95+CD62L-, CD62L+CD85j+, CD57-CD27+, CD28+CD27+, CD28+CD57-, CD57-CD62L+, CD197+CD62L+, CD27+CD62L+, CD70-CD27+, CD57-CD70+, TIGIT-CD95-, CD45RO-CD95-, CD70+CD56-, CD70+CD27-, CD45RO+CD197+, CD8-CD62L+ 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 제1 림프구가 CD3+CD8+인 경우, 상기 제2 림프구 표지자는 CD28+, CD197+, CD45RO+, CD45RO-, TIGIT+, TIGIT-, CD95+, CD95-, CD62L+, CD85j+, CD27+, CD57+, CD57-, CD70+, VISTA+ 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 CD3, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CD56, CD57, CD70, CD95, CD197 및 TIGIT로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다.

이러한 조성물에 의해 검출된 림프구는 예를 들면, CD27-CD70-, CD3+CD57-, CD3+CD70+, CD56+CD27-, CD8-CD197+, CD3+CD70-, CD3-CD57-, CD3+CD95+, CD8-CD95-, CD28-CD45RO- 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양상은 전술한 면역 노화 평가용 조성물을 포함하는 면역 노화 평가용 키트를 제공한다.

본 발명에서 사용된 “면역 노화 평가용 키트”는 검사 대상자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 면역 노화를 평가할 수 있는 물질을 의미하며, 이를 통해 면역 노화 평가를 신속하고 간편하게 진단할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 면역분석법을 이용하는 것일 수 있다.

상기 면역분석법(immunoassay)은 항원-항체 반응을 이용하여 표적 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 분석 방법으로, 그 일례로는 면역블롯팅(immunoblotting), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 방사능면역침전(radio-immunoprecipitation), 면역침전(immunoprecipitation), 면역확산(immuno diffusion), 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역형광(immunofluorescence), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 유세포 분석(flow cytometry), 면역친화성(immunoaffinity) 정제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 면역분석법은 종래에 개발된 단백질 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 ELISA 키트, 웨스턴 블롯(Western blot) 키트, 유세포분석 키트, 방사선면역분석 키트, 면역확산 키트, 면역침전 키트, 면역조직화학 키트, 면역형광염색 키트 및 단백질 마이크로어레이 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 면역 노화 평가용 조성물 또는 키트는 면역 노화 수준을 예측하는 바이오마커, 즉 림프구 표지자의 발현 수준을 측정하는데 사용되며, 이러한 림프구 표지자의 발현을 이용하여 면역 노화를 평가하기 위한 지수(index)를 산출하는데 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 면역 노화 평가용 조성물 및 키트는 림프구 표지자의 발현 수준을 측정함으로써 면역 노화를 신속하고 정확하게 평가할 수 있으며, 그 평가 결과를 바탕으로 체계적으로 면역력을 관리할 수 있으며, 나아가 면역력 노화 및 면역반응 이상을 예비하여 건강 증진을 도모할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 림프구 아형에 대한 quadrant 분석 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 면역 노화 진단 모형의 출생 나이와 면역 나이 사이의 관계를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2 면역 노화 진단 모형의 출생 나이와 면역 나이 사이의 관계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 제3 면역 노화 진단 모형의 출생 나이와 면역 나이 사이의 관계를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제4 면역 노화 진단 모형의 출생 나이와 면역 나이 사이의 관계를 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 면역 노화 평가를 위한 바이오마커 탐색

1-1. 면역세포 분리 및 염색

20세 이상 건강한 성인 남녀 360명을 대상으로 동의를 얻어 채혈한 혈액을 유세포 분석에 사용하였다. 혈액은 모두 유세포 분석 당일 오전 8 ~ 10시 사이에 채혈되어 EDTA 튜브(tube)에 담아 보관되었으며, 채혈 이후 최대 3시간 이내 모두 실험에 사용되었다.

림프구의 표면에서 발현되는 표지자를 염색하기 위해, 표지자에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 부착된 마우스 항 인간 항체(fluorescence dye conjugated mouse anti-human antibody)를 사용하였다. 여기서 사용된 항체로는 CD3 (BD, 557835), CD8 (BD, 557746), CD56 (BD, 562751), CD27 (BD, 746908), CD28 (BD, 555728), CD45RO (BD, 559865), CD57 (BioLegend, 359622), CD62L (BioLegend, 104421), CD70 (BD, 565338), CD95 (BD, 564596), CD197 (BD, 560765), TIGIT (BD, 747840), VISTA (BD, 566670) 및 CD85j (BD, 746434)가 있다.

염색 방법으로는 당업계에 공지된 용해/세척 방법(lyse/wash method)을 이용하였으며, 간략하게 설명을 하면 다음과 같다. 먼저, 연구실로 옮겨진 EDTA 튜브에 들어 있는 혈액을 잘 섞어준 다음 마이크로파이펫(micropipette)을 이용해 100 uL를 유세포 분석용 테스트 튜브에 옮겼다. 그런 다음 항체 제조사의 설명서를 참조해 항체 믹스(mix)를 만들어 혈액과 잘 섞어주고 실온에서 빛을 차단한 채 30분간 혈액 면역세포를 형광 염색하였다. 염색이 끝나고 면역세포만의 원활한 유세포 분석을 위해 적혈구(red blood cell, RBC)를 제거하였다. 이를 위해 테스트 튜브마다 2 mL의 RBC 용해 완충액(lysis buffer) (BD FACSTM Lysing Solution, 349202)을 넣어주고 실온에서 빛을 차단한 채 30분간 반응시켰다. 반응을 마치고 테스트 튜브를 5분간 실온에서 1,500 rpm (RCF 220 ~ 270)으로 원심분리를 실시하였다. 그런 다음 깨진 RBC를 포함하는 테스트 튜브 내 상층액을 제거하였다. 이후 펠렛(pellet)이 남은 테스트 튜브에 2 mL의 PBS(phosphate buffered saline)를 넣어주고 전술한 바와 동일한 조건으로 원심분리를 실시하였다. 마찬가지로 원심분리가 끝나면 상층액을 모두 버리고 300 uL의 PBS를 테스트 튜브에 넣어 준 다음 유세포 분석 전까지 빛을 차단한 상태로 4℃에서 보관하였다.

1-2. 유세포 분석

염색된 혈액 면역세포는 유세포 분석기 Aurora (Cytek®)를 사용하여 유세포를 계측하고 분석하였다. 유세포 분석 시스템의 모니터 화면에는 X축과 Y축으로 구성된 그래프상에서 면역세포 아형이 하나의 점으로 표현되었다. 이렇게 그래프상에서 점으로 표현되는 면역세포는 세포의 크기(size)와 주름진 정도(granularity)에 따라 X축의 Forward scatter(FSC-A)와 Y축의 Side scatter(SSC-A)로 구분이 되며 면역세포의 크기와 주름진 정도에 따라 림프구(lymphocytes), 단핵구(monocytes) 및 과립구(granulocytes)로 구분되어 그래프상에 표현되었다. 노화 표지자인 CD3, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CD56, CD57, CD62L, CD70, CD85j, CD95, CD197, TIGIT 및 VISTA의 조합을 이용하여 림프구 아형을 분석하였다.

1-3. 바이오마커 선별

면역 노화를 평가하는데 있어서 유효한 림프구 아형의 상관계수와 분산팽창계수를 고려하여 다양한 림프구 아형의 면역 노화 진단 모형을 제작하였다. 먼저, 림프구 아형과 출생 나이를 변수로 설정하여 상관관계 분석(Pearson's correlation test)을 통해 상관계수(correlation coefficient, r)와 결정계수(coefficient of determination, r²) 값을 구하였다. 그런 다음 통계적 유의성 검증을 실시하여 결정계수(r²) ≥ 0.01이고, 유의확률(p value) < 0.05인 림프구 아형을 선택하였다. 이들 림프구 아형에 대해 다중공선성 진단을 실시하였을 때 분산팽창계수(variation inflation factor, VIF)가 10 이상인 것이 없어 공선성에 문제가 되는 림프구 아형이 없음을 확인하였다. 이어서 선형 다중회귀분석을 실시하여 결정계수가 가장 높은 림프구 아형을 선별하였다. 그리고 림프구 아형에 대한 선형 회귀분석 모형을 제작하였고, 하기 표 1 내지 4에 나타내었다.

하기 표 1 및 2는 결정계수가 가장 높은 림프구 아형 중 CD3+CD8+ T 림프구에서 발현되는 림프구 아형이다.

하기 표 1의 면역 노화 진단 모형 (제1 면역 노화 진단 모형)은 CD3+CD8+인 림프구에서 서로 다른 2개의 림프구 표지자로 구성된 18개의 림프구 아형으로 제작되었다.

하기 표 2의 면역 노화 진단 모형 (제2 면역 노화 진단 모형)은 CD3+CD8+인 림프구에서 하나의 림프구 표지자로 구성된 15개의 면역세포 아형으로 제작되었다.

림프구 아형	비표준화 계수		표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
림프구 아형	B	표준오차	표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
상수	73.256	9.526		7.690	0.000
CD45RO-CD197+	-0.285	0.208	-0.292	-1.372	-0.171	-0.736	0.541
CD28+TIGIT-	-0.314	0.076	-0.363	-4.154	0.000	-0.734	0.538
CD95-CD62L+	-0.065	0.107	-0.069	-0.608	0.543	-0.728	0.530
CD28+CD45RO-	-0.010	0.164	-0.010	-0.064	0.949	-0.725	0.525
CD28+CD197+	-0.138	0.120	-0.140	-1.152	0.250	-0.720	0.519
CD197+TIGIT-	0.221	0.143	0.213	1.549	0.122	-0.667	0.445
CD95+CD62L-	-0.071	0.106	-0.068	-0.667	0.505	0.630	0.397
CD62L+CD85j+	-0.043	0.033	-0.046	-1.317	0.189	-0.469	0.220
CD57-CD27+	11.908	5.067	0.728	2.350	0.019	-0.492	0.242
CD28+CD27+	-0.489	0.035	-0.565	-13.999	0.000	-0.566	0.320
CD28+CD57-	-8.204	3.214	-0.503	-2.552	0.011	-0.524	0.275
CD57-CD62L+	21.209	4.683	1.268	4.529	0.000	-0.514	0.264
CD197+CD62L+	8.549	3.549	0.505	2.409	0.016	-0.493	0.243
CD27+CD62L+	-20.918	5.694	-1.239	-3.674	0.000	-0.522	0.305
CD70-CD27+	-9.622	3.578	-0.555	-2.690	0.007	-0.491	0.241
CD57-CD70+	-3.348	0.922	-0.193	-3.632	0.000	-0.612	0.375
TIGIT-CD95-	-2.410	1.916	-0.146	-1.258	0.209	-0.633	0.401
CD45RO-CD95-	-1.809	1.582	-0.109	-1.144	0.253	-0.574	0.329

림프구 아형	비표준화 계수		표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
림프구 아형	B	표준오차	표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
상수	68.198	26.286		2.595	0.010
CD28+	-0.043	0.066	-0.047	-0.650	0.051	-0.552	0.305
CD197+	-0.037	0.083	-0.038	-0.445	0.065	-0.691	0.477
CD45RO+	-0.029	0.105	-0.027	-0.270	0.078	0.529	0.280
CD45RO-	-0.105	0.104	-0.099	-1.013	0.031	-0.541	0.293
TIGIT+	-0.330	0.158	-0.351	-2.083	0.038	0.682	0.465
TIGIT-	-0.632	0.165	-0.678	-3.822	0.000	-0.714	0.509
CD95+	0.321	0.195	0.339	1.647	0.100	0.746	0.556
CD95-	-0.174	0.194	-0.183	-0.898	0.037	-0.728	0.530
CD62L+	0.408	0.099	0.394	4.115	0.000	-0.610	0.372
CD85j+	0.011	0.025	0.015	0.433	0.065	-0.112	0.013
CD27+	-0.683	0.175	-0.549	-3.907	0.000	-0.535	0.287
CD57+	-0.171	0.119	-0.063	-1.434	0.015	0.257	0.066
CD57-	0.495	0.172	0.395	2.885	0.004	-0.439	0.193
CD70+	0.445	0.106	0.163	4.211	0.000	-0.532	0.283
VISTA+	-0.047	0.050	-0.033	-0.951	0.034	-0.290	0.084

하기 표 3 및 4는 사용자 편의성을 고려하여 결정계수가 가장 높은 림프구 아형들 가운데서도 quadrant 분석이 매우 용이하도록 구분이 명확한 림프구 아형이다. 종합병원의 임상병리사 또는 그에 준하는 의료인력이 유세포 분석 후 프로토콜에 따라 quadrant 분석 시 도 1의 ③을 참고하면, CD3+CD8+ 아형에서 VISTA와 CD95로 구성되는 quadrant 4가지 아형은 각각의 경계가 매우 모호해서 검사자마다 그 quadrant line이 달라질 수 있고 이로 인해 결과에도 영향을 받을 수 있다. 따라서 하기 표 3 및 4의 면역 노화 진단 모형 (각각 제3 및 제4 면역 노화 진단 모형)은 분석 오류를 사전에 방지할 수 있으며, 실제로 임상병리사가 진단분석용으로 사용하기에 가장 적합한 최적의 모형이다.

림프구 아형	비표준화 계수		표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
림프구 아형	B	표준오차	표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
상수	-23.453	11.135		-2.106	0.036
CD28+TIGIT- in CD3+CD8+	-0.138	0.053	-0.160	-2.602	0.010	-0.731	0.534
CD8+TIGIT- in CD3+	-0.441	0.088	-0.214	-5.024	0.000	-0.640	0.410
CD70+CD56- in CD3+	1.367	0.252	0.336	5.428	0.000	0.560	0.314
CD45RO-CD197+ in CD3+CD8+	-0.151	0.055	-0.155	-2.750	0.006	-0.743	0.552
CD27-CD70-	0.767	0.098	0.608	7.795	0.000	0.350	0.123
CD3+CD57-	0.500	0.097	0.395	5.154	0.000	-0.443	0.196
CD3+CD70+	1.717	0.271	0.362	6.334	0.000	0.469	0.220
CD70+CD27- in CD3+	-1.268	0.308	-0.271	-4.119	0.000	0.411	0.169
CD56+CD27-	0.298	0.056	0.164	5.287	0.000	0.341	0.116
CD8-CD197+	0.312	0.066	0.176	4.750	0.000	-0.185	0.034

림프구 아형	비표준화 계수		표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
림프구 아형	B	표준오차	표준화 계수 (β)	t	유의확률 (p)	상관계수 (r)	결정계수 (r²)
상수	78.701	7.783		10.112	0.000
CD28+TIGIT- in CD3+CD8+	-0.370	0.035	-0.426	-10.701	0.000	-0.734	0.539
CD45RO+CD197+ in CD3+CD8+	0.427	0.052	0.222	8.284	0.000	0.494	0.244
CD3+CD70-	-0.546	0.060	-0.415	-9.128	0.000	-0.425	0.181
CD3-CD57-	-0.271	0.046	-0.217	-5.876	0.000	0.087	0.008
CD3+CD95+	0.176	0.070	0.102	2.535	0.012	0.310	0.096
CD8-CD95-	0.111	0.059	0.065	1.892	0.059	-0.092	0.008
CD57- in CD3+	0.585	0.079	0.351	7.438	0.000	-0.333	0.111
CD27+ in CD3+	-0.749	0.083	-0.533	-8.999	0.000	-0.532	0.283
CD8-CD62L+ in CD3+	0.382	0.061	0.223	6.210	0.000	-0.060	0.004
CD28-CD45RO-	-0.064	0.054	-0.038	-1.182	0.238	0.348	0.121

실시예 2. 면역 노화 평가 실시

제1 내지 제4 면역 노화 진단 모형에서 얻은 값을 이용하여 면역 노화 평가를 실시하였다.

먼저, 각 면역 노화 진단 모형에서 얻은 상수값과 각 림프구 표지자 (림프구 아형)에 대한 비표준화 계수값 (B)을 [수학식 1]에 대입하여 비표준화 예측 값을 구하였고, 이를 U-value라 명명하였다.

[수학식 1]

(상기 수학식 1에서, β₀는 상수이고, βn는 n번째 림프구 표지자에 대한 비표준화 계수이고, Xn은 유세포 분석을 통해 얻은 n번째 림프구 표지자를 포함하는 림프구 아형의 분포율 % 값이다)

그리고 U-value는 [수학식 2]를 이용해 표준화를 진행하였고, 이를 통해 S-value를 구하였다.

[수학식 2]

(상기 수학식 2에서, X는 모집단 내 각 개체의 U-value이고, μ는 모집단 전체 U-value의 평균이고, σ는 모집단 전체 U-value의 표준편차이다)

그리고 S-value는 다시 [수학식 3]을 통해 정규화되어 Z-score로 변환되었다.

[수학식 3]

(상기 수학식 3에서, X는 모집단 내 각 개체의 S-value이고, Xmin은 모집단 전체 S-value의 최소값이고, Xmax는 모집단 전체 S-value의 최대값이다)

또한 Z-score와 출생 나이가 일대일 대응 관계가 성립한다고 가정하여 전단사 함수를 나타내는 [수학식 4]를 통해 최종적으로 면역 나이(ciAge)를 구하였다.

[수학식 4]

제1 내지 제4 면역 노화 진단 모형의 면역 나이는 하기 표 5에 나타내었으며, 각 모형에서의 출생 나이와 면역 나이의 상관관계를 분석한 산점도는 도 2 내지 5에 나타내었다.

		모형1	모형2	모형3	모형4
출생 나이 (cAge)	최대값	85
	최소값	20
	평균	47.94
	표준편차	15.63
면역 나이 (ciAge)	최대값	85
	최소값	20
	평균	47.2	47.39	47.34	48.1
	표준편차	12.4	11.96	11.08	12.1
결정계수 (R²)		0.753	0.736	0.756	0.743
평균절대편차 (MAD)		23.17	24.56	23.45	23.19
추정값의 표준오차 (SEE)		7.98	8	7.46	7.51

상기 표 5 및 도 2 내지 5를 참조하면, 제1 내지 제4 면역 노화 진단 모형은 각 모형을 구성하는 림프구 아형이 서로 다르지만, 각 모형에서 산출된 면역 나이가 유사하며 각 림프구 아형이 모두 출생 나이에 대한 강한 상관관계를 가지는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 제1 내지 제4 면역 노화 진단 모형의 림프구 아형을 이용하여 면역 노화 평가를 수행할 수 있음을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나의 림프구의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 면역 노화 평가용 조성물:
i) 제1 림프구 표지자가 CD3+CD8+이고, 제2 림프구 표지자가 CD45RO-CD197+, CD28+TIGIT-, CD95-CD62L+, CD28+CD45RO-, CD28+CD197+, CD197+TIGIT-, CD95+CD62L-, CD62L+CD85j+, CD57-CD27+, CD28+CD27+, CD28+CD57-, CD57-CD62L+, CD197+CD62L+, CD27+CD62L+, CD70-CD27+, CD57-CD70+, TIGIT-CD95-, CD45RO-CD95-, CD45RO+CD197+, CD28+, CD197+, CD45RO+, CD45RO-, TIGIT+, TIGIT-, CD95+, CD95-, CD62L+, CD85j+, CD27+, CD57+, CD57-, CD70+ 또는 VISTA+인 림프구;
ii) 제1 림프구 표지자가 CD3+이고, 제2 림프구 표지자가 CD8+TIGIT-, CD70+CD56-, CD70+CD27-, CD8-CD62L+, CD57- 또는 CD27+인 림프구; 및
iii) CD27-CD70-, CD3+CD57, CD3+CD70+, CD56+CD27-, CD8-CD197+, CD3+CD70-, CD3-CD57-, CD3+CD95+, CD8-CD95- 또는 CD28-CD45RO-인 림프구.
청구항 1에 있어서,
상기 림프구는 T 림프구 및 NK 세포를 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 제제는 림프구 표지자 또는 이의 유전자에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 조성물.
삭제
삭제
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 면역 노화 평가용 키트.
청구항 6에 있어서,
상기 키트는 면역분석법을 이용하는 것인 키트.