JPH06508743A

JPH06508743A - ヒトｔｎｆ結合タンパク質１（ｔｎｆ−ｂｐ　１）に対するモノクローナル抗体

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Publication number: JPH06508743A
Application number: JP4511052A
Authority: JP
Inventors: ギュンターアドルフ
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1991-06-19
Filing date: 1992-06-13
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: DE4120213C2; JP3425146B2; DE4120213A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＴＮＦ結合タンパク質ｒ　（ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉ）に対するモノクローナル抗体本発明は、Ｔ１１１Ｆ結合タンパク質Ｉ　（ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ）に対するモノクローナル抗体及びそれらを分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。

二つの形態上関連したサイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）及びリンホトキシン（ＴＮＦ−β）は、腫瘍細胞に対するｉｎｖ已「０におけるそれらの細胞障害活性及びマウスモデルの腫瘍の出血性壊死を引き起こす能力の結果として当初見いだされた。それらのｃＤＮＡのクローニング及びＥ、Ｃｏ１１におけるそれらの発現は、事実上無制限の量でそれらのタンパク質を入手可能とし、高い特異的抗体及び感受性イムツノアッセイの開発を可能とした。これらのタンパク質の生物学的活性、炎症プロセスの多面的（ｐｌｅｏｒｒｏｐｉｃ）媒介物質としてのそれらの生理学的役割及び病的状態におけるそれらの関与について豊富な情報がある。具体的には、ＴＮＦ−αの産生の増加は、例えば、敗血症性ショック、「移植細胞対宿主」病における組織損傷及び大脳マラリア及び悪液質の発病と関係があった（バラトラ−（ｏｅｕｔｌｅｒ）、１９８８年：ポール（Ｐａｕｌ）及びルドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、１９８８年：バラトラ−及びセラミ（Ｃｅｒａｍｉ）、１９８９年）。

ＴＮＦ〜αの考えられる望ましくない効果により、このサイトカインのナチュラルインヒビターが調査されることになった。ＴＮＦ−αに結合し、そのことによりその活性を阻害するタンパク質は、腎不全患者（ベータ（Ｐｅｅｔｒｅ）ら、１９８８年）及び熱病患者（セキンノヤー（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ）ら、１９８８年）の尿に初めに同定された。見掛けの分子量が約３０ｋＤａのこのタンパク質を精製し、ホモジナイズし、部分的に配列決定しくＥＰ−Ａ２３０８３７８）　、そのｃＤＮＡをクローン化した（オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ）ら、■９８９年：エンンエルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ）ら、１９８９年；ヒムラー（Ｈｉｍｌｅｒ）ら、１９９０年、ノヤル（Ｓｃｈａｌ　ｌ）ら、１９９０年）。ＴＮＦ−ＢＰと呼称されるこのタンパク質はＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−１？）の細胞外フラグメントであることを、このｃＤＮＡの構造は示した。

（このフラグメントはタンパク質分解により放出されると仮定された）。これらの結果は、丁ＮＦ−αの完全な膜レセプターを単離することにより確認され、それは池の作業部会により独立して行われた（ロノ／ヤ−（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ）ら、１９９０年）Ｑ全レセプタータンパク質は４５５アミノ酸（５５〜６０ｋＤａ）からなり、；　ＴＮＦ−ＢＰは、レセプターの細胞外ドメインの大部分を構成し、３つすべてのＮ−グリコシレージョン部位を含む。尿から単離したＴＮＦ −ＢＰは、タンパク質分解の結果、Ｎ−末端が異質であり、従ってそれは１６１アミノ酸（主部分）又は１７２アミノ酸からなる二つの分子種の混合物であることが見いだされた（ヒムラー（Ｈｉｍｍｌｅｒ）ら、１９９０年）。

近年、高分子量の第二のＴＮＦレセプタータイプのフラグメントである第二のＴＮＦ−結合タンパク質の存在が示された（７５〜８０ｋＤａ；エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ）ら、１９９０ａ　；スミス（Ｓａ＋ｉ　ｔｈ）ら、１９９０年；コーン（Ｋｏｈｎｏ）ら、１９９０年）。その後、二つのレセプター及び結合タンパク質はＴＮＦ−ＲＩ／ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉ及びＴＩＩＩＦ−ＲＩＩ／　ＴＮＦ−ＢＰｌｌと呼ばれた（それぞれ、６０ｋＤａ及び８０ｋＤａレセプターである）。配列を比較することにより、二つのタンパク質は形態上関連していることが示された；具体的には、システィン基の数及び分布が非常に類似していた。

しかし、二つのレセプターは、免疫学的には互いに異なるものである（エンゲルマンら、１９９０ａ　；ブロッカウス（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ）ら、１９９０年）。

ヒドロ０ｋＤａのＴＮＦ−レセプターは、ＴＮＦ−αノブナル伝達に必須の役割を担う。そのレセプターの活性は、タンパク質ベースの幾つかの調節作用に依存する。フォルボールエステル又は他の活性化因子であるタンパク質キナーゼＣによる細胞の処理により、ＴＮＦ〜αの細胞結合部位の数がすばやく減少する。このことは、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉに対応するレセプターの細胞外部分のタンパク質分解による放出と関係がある。異なる動態とはいえ、同様の影響が様々な池の物質、具体的には生理学的リガンドＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βにより引き起こされる。ヒト及びう・ントのＴＮＦ−ＲＩ上のタンパク質分解酵素に関する分解部位は保持される：それらはすべての公知のタンパク質分解酵素の特異性とは構造上具なるものである。従って、特異性が高いタンパク質分解酵素はＴＮＦの細胞の感受性をコントールする調節回路の一部であると思われる。これらの正確なメカニズムは未だ知られていない。近年この現象ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉが有意に増加することが見い出された（タンプＬａｎｊｚ）ら、１９９０ａ）。

従って、培養残留物又は体液中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌの濃度は、リガンドとの相互作用又は他の媒介物質による調節の結果として、ｉｌ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＴＮＦレセプターシステムの活性の指標となる。従って、体液中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度は、様々な疾患の有用なマーカーと考えることができる。

従って、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌを検出する有効カリ感受性のある方法及びそのような検出方法に有用なキットが必要になった。

ＴＮＦ−Ｒｌに対するモノクローナル抗体は記載されてきており、それらは可溶化されたレセプター（ブロックハウス（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ）ら、１９９０年、　ＥＰ　Ａ２３３４１６５　；ｈ　？（Ｔｈｏｍａ）ら、１９９０年）又は精製されたＴＮＦ−ＤＰ　Ｉ　（エンゲルマンら、１９９０ｂ）を用いて免疫性を与えることにより製造された：しがし、その抗体がＴＮＦ−ＢＰ　Ｉのイムノアッセイにおける使用に好適なことは示されてこなかった。

タンプ（Ｌａｎｔｚ）ら（１９９０ａ）は、競合的ＥＬＩＳＡを開発した。それは３段階の試験方法において、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌでコートした試験プレート、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉのポリクローナルウサギ抗体、ウサギ免疫グロブリンに対するビオチン標識ヤギ抗体及びアビジン結合アルカリフォスファターゼを使用した。このアッセイにより、正常ドナーの血清中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌの存在が見出され、増加した濃度のＴＮＦ−ＢＰ　ｌはＴＮＦ−αで処理した腎不全患者又は癌患者の血清中に見出された。

ＥＰ　Ａｌ　４１２４８６には、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉのモノクローナル抗体が記載されている。これらの抗体の一つは、コーティング抗体としてサンドイッチＥＬＩＳＡに使用された：ポリクローナルウサギ抗−ＴＮＦ−ＨＰ　Ｉ抗体は第二の抗体として使用され、ポリクローナルヤギ抗−ウサギ抗体は第三の酵素結合抗体として使用された。

公知のアッセイは、それらの構造及び要求される方法には複雑であり、さらにポリクローナル抗体の使用は動物の使用を含むので、それはますます避けるべきである。

本発明の目的は、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出するための単純かつ高感受性イムノアッセイあ使用に好適な、ヒ１−ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉに特異的なモノクローナル抗体を製造することである。

本発明は、ｊｂｐ−１、ｔｂｐ−２及びｔｂｐ−６と呼称されるヒトＴＮＦ−ＢＰ　ｌのモノクローナル抗体、それらの活性フラグメント及びこれらの抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系ＴＢＰ−１、ＴＢＰ−２及びＴＢＰ−６に関する。

ＴＢＰ−１及びＴＢＰ−２と呼称されるハイブリドーマ細胞系は１９９１年６月５日に、ＴＢＰ−６と呼称される該細胞系は１９９１年１１月２８田へ特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；ソールズベリー、英国）に寄託された（ＴＢＰ−１寄託番号９１０６０５５５、ＴＢＰ−２：寄託番号９１０６０５５６、ＴＢＰ−６：寄託番号９１１１２８１１）。

それ自体公知の方法を用いてヒトの尿から高度に精製したＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを用いてマウスを免疫し、かつ陽性抗体反応を示すマウスの膵臓細胞をメラノーマ細胞との融合に使用してＴＮＦ−ＢＰ　Ｉに対するモノクローナル抗体を分泌する本発明のハイブリドーマ細胞を得た。第一の細胞融合により、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌのモノクローナル抗体を製造する二つの培養物を生成した：第二の細胞融合により、第三の抗体産生培養物を生成した。得られた抗体はｔｂｐ−１及びＩｂｐ− ２及びｔｂｐ−ｅと呼称された。抗体を精製し、特性決定した：　ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６はＩｇＧ１−抗体であるのに対し、ｔｂｐ−２はＩｇＧ２ｂ−抗体である。３つの抗体すべてが、ウェスタンプロットにおいてＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを認識することができ、ｔｂｐ−１は最も反応性が高いことが示された。

ｔｂｐ−２はより弱く反応したが、ｔｂｐ−６は最も弱い着色を示した。抗体により認識されたエピトープの特性決定をするために、可溶化ＴＮＦＮシープター（トーマ（Ｔｈｏｍａ）ら、１９９０年）で免役することにより得られた３つの抗体及びＨ２Ｏ２と呼称される第４の抗体を調査した。調査した抗体はＴＮＦ− ＢＰ　１分子上の３つの異なるエピトープを認識し、ｔｂｐ−２及び８３９８は同しかオーバーラツプしたエピトープを認識する。抗体との様々な取合せにおいてＴＮＦ−αの存在下において行われたサンドイッチＥＬＩＳＡから、Ｈ２Ｏ２及びｔｂｐ−２により認識されたエピトープはＴＮＦ−αの結合に関与するが、ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６により認識されたものはりガント結合部位に関連しないことが結論として導かれた。驚くべきことに、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの幾つかのモノクローナル抗体は、過剰のＴＮＦ−αの存在下においてＴＮＦ−ＢＰ　ｌを結合することかできるたけてなく、さらにＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βの細胞障害活性に対してＴＮＦ−ＢＰ　ｌの防護効果を有意に増加することが見出された。この効果は、二つの抗体ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６に観察された。（これらの二つの抗体は、Ｔ’ＮＦ−ＢＰ　ｌに対する抗体のグループに属し、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌの結合に関してＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βと競合しない。これに対して、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌに結合するＴＮＦ−αと競合する抗体ｔｂｐ−２及びＨ２Ｏ２は、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの活性を阻害する）。

他の態様によると、本発明は、イムノアッセイにより体液又は細胞培養残留物中のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出するためのｔｂｐ−１及び／又はｔｂｐ−２の使用に関する。

（これらの抗体の使用に関連して、ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−２という語句は、ＴＮＦ−ＢＰ　［に結合する以下の活性フラグメントを含む。当業者は、活性抗体フラグメント（Ｆａｂ−断片）を製造する方法、例えば、酵素消化による方法に通しているであろう）。

本発明は、また、イムノアッセイにより体液又は細胞培養残留物においてＴＮＦ −ＢＰ　Ｉを検出するためのｔｂｐ−］及びｔｂｐ−ｅの使用に関する。抗体の組合せであるｔｂｐ−１／１ｂｐ−６は、他の試験システムにおいてＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの測定を混乱させる非常に高濃度のＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βがあるサンプルにおける使用に特に好適である。

本発明の範囲に使用することができるイムノア１セイは、当業者に精通し、非常に多くの入手可能な標準的方法に基づいている。これらの方法は、測定されるべき抗原物質と一つ以上の抗体との複合体の形成に基づくものである。一つ以上の複合体のパートナ−を標識し、該抗原を検出及び／又は定量的に測定することができる。標識は、例えば、結合した酵素、放射性同位体、金属キレート又は螢光体、ケミルミネッセント物質又はバイオルミネッセント物質の形態をとってもよい。

競合的イムノアッセイの場合、分析されるべきサンプル中の抗原は、抗体結合部位に結合する公知の量の標識抗原と競合する。従って、抗体と結合する標識抗原の量は、サンプル中の抗原の量に反比例する。

標識抗体を使用する試験において、標識結合抗体の量は、抗原の量に正比例する。

抗原に対する結合を互いに妨げる二つの抗体を使用する、抗体／抗原／抗体複合体の形成に基ついたアッセイは、　「サンドイッチ」免疫アッセイとして知られる。

モノクローナル抗体は制限されない量において一定の質で入手可能であるので、モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイは、それらの一定の質及び複製可能性のために、ポリクローナル抗体を使用するア、セイ以上の重要な利点を存する。

さらに、それらはポリクローナル抗体に関連した欠点、即ち、それらを産生ずるために動物を一定に使用すべきであるという欠点が避けられる。

好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、サンドイッチイムノアッセイ、具体的にはサンドイッチＥＬＩＳＡに使用される。

本発明のモノクローナル抗体は、サンドインチ免疫アッセイにおいてコーティング−及び標識結合抗体（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）として使用することができ、かくしてポリクローナル抗体の使用を不必要にする。

池の態様によると、本発明はイムノアッセイキット、具体的にはｔｂｐ−１及び／又はｔｂｐ−２を含有するサンドイッチイムノアッセイキットに関する。

本発明の好ましい態様は、サンドイッチイムノアッセイキット好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡキットであり、ここてｔｂｐ−１はコーテング抗体であり、ｔｂｐ−２は標識された、好ましくは酵素結合抗体である。

サンドイッチイムノアッセイにおいてｔｂｐ−２又はｔｂｐ−１と抗体／抗原／抗体複合体を形成することができる他の抗体でｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２を置き換えることは本発明の範囲において可能である。

Ｌｂｐ−］又はｔｂｐ−２を他の抗体により置換するならば、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉ又はその一部の同じエピトープを認識する抗体を、置換されるべきｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２として使用することが好ましい。

サンドインチイムノアッセイは、ｔｂｐ−２又はｔｂｐ−１と抗体／抗原／抗体複合体を形成するそれらの能力を基礎としたイムノアッセイにおいて、抗体がｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２の置換体として好適であることを測定するために使用することかできる。

イムノアッセイプレートをｔｂｐ−を又はｔｂｐ−２てコートし、抗原を加え、調査されるべき標識抗体を施す。試験抗体の標識を測定することにより決定することかできる＋ｂｐ−１又はｔｂｐ−２と抗体／抗原／抗体複合体を形成可能な抗体は、ｊｂｐ−１又はＬｂｐ−２により抗原上の異なるエピトープを認識する。ｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２とサンドインチを形成することかできない抗体は、これら抗体と同じかオーバーランプしているエピトープを認識する。

もし抗体ｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２の一つがサンドイッチイムノアッセイにおいて置換されるならば、好ましくは、標識結合抗体ｔｂｐ−２は、ｔｂｐ−２と同Ｃかオー７１−ランプするエピトープ特異性を有する抗体により置換される。好適な抗体の例は、トーマ（Ｔｈｏｍａ）ら（１９９０年）により記載されたモノクローナル抗体Ｈ３９８であり、本発明の範囲においてそれは同一かオーバーラツプしているエピトープに結合することを示すものである。

１：ｂｐ−１／１ｂｐ−２を基づいた本発明によるサンドイッチＥＬＩＳＡの助けを借りると、ヒト血清、血漿、尿及び／又は細胞培養残留物中において、約２００ｎｇ／ｆの感受性かつ１０％より高い正確度でＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出することが可能であった。

驚くべきことに、ＴＮＦ−レセプター、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βのナチュラルリガンドは、ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−２が使用される本発明のイムノアッセイの予測される質に影響しないことが見出された：　ＴＮＦ−βはアッセイに測定可能な影響を及ぼさないが、ＴＮＦ−αはＩＯμｇ／１以上の濃度のシグナルに測定可能な変化を唯−生じる。健常人におけるＴＮＦ−αの濃度は２０ｎｇハ以下であるのが一般的であり、深刻な病的状態においてさえ、ＴＮＦ−α濃度は１ｕｇ力をまれに越えるのみであるので（例えば、ラーデヴイルタ（Ｌａｈｄｅｖｉｒｔａ）ら、１９８８年；オフナーら、１９９０年）、自然な状態で分泌された内因性ＴＮＦ−αにより本発明が曲解されることは除外することができる。

その感受性から見ると、モノクローナル抗体ｔｂｐ−１／１ｂｐ−２に基づいたイムノアッセイは、また、正常なレベルから低下する方に逸脱したＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの濃度を検出することができる。従って、ＴＮＦ−ＯＰ　ｌの減少した産生により達成される体の機能的疾患を、診断に役立つように見出すことができる。

血清、血漿及び尿及び細胞培養残留物におけるＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出することに加え、モノクローナル抗体ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−２は他の体液、例えば髄液又は気管支肺胞分泌液においてＴＮＦ−ＢＰ　ｌを検出するためにも使用できる。

驚くべきことに、本発明の範囲において行われる実験において、ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６の組合せを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡに得られたシグナルは、ｔｏｍｇ／ｌの範囲において極めて高いＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β濃度によってでさえも影響されないことが見出された。

抗体の組合せｔｂｐ−ｔ／１ｂｐ−６は、サンドインチイムノアッセイ、具体的にはサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて好ましく使用されるが、Ｌｂｐ−１及びｔｂｐ−ｅはコーティング抗体及び標識抗体として使用されてもよい。

ＴＮＦ−ＢＰ　ｌを検出するための一組の抗体ｔｂｐ−１／１ｂｐ−６の使用の例としては、白血球のような細胞がリポ多糖で刺激されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験から得られるサンプル、又は多量のリポ多糖又はバクテリアで処理された実験動物から得られる血清サンプルがあげられる。このような条件下では、ＴＮＦ−α は極めて多量に分泌される。

従って、本発明の助けにより、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌを検出する高感受性の方法か提供され、そのことにより生理学的リガンドＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βによるＴＮＦ−レセプターの活性及び様々な病的状態又はｉｎ　Ｖｉｔｒｏモデルにおける他の媒介物質によるそのトランスモンユレー／ヨン（ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を決定することができる。従って、体液におけるＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの検出は、ＴＮＦ−α産生の増加を伴う病的状態の診断又はそのような診断を確認するのに特に有用である。

ＴＮＦ−α測定に比べて、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ測定の一つの利点は、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの正常レベルが血清中に見出され、そのために僅かに上昇したレベルでさえも検出可能となり診断が達成されるという事実にある。

ＴＮＦ−αの導入と敗血症及び動物における内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘａｅｍｉｃ）反応の発生との明らかな相互作用にもかかわらず、厳しいグラム陰性感染を患う患者におけるＴＮＦ−αを測定すると相反する結果が生した。このことは、ＴＮＦ−αの合成及び分泌をコントロールするメカニズムに関連することを明らかとした。好適な刺激により活性化された時、ＴＮＦ−αはマクロファージにより直ちに分泌され、その後マクロファージはさらなる刺激に耐性であるへきである。さらに、血漿における半減期は短く、人ではたった１５〜１７分である。これらの現象から、血液系におけるＴＮＦ−αの出現はすばやく、短命であり、それゆえに検出が困難であると（＼う理由は明らかにされた（ミッチ（Ｍｉｃｈｉｅ）ら、１９８８年）。従って、もし血液が正確な時間に患者から採取されないならば、ＴＮＦ−α濃度の増加は分析の瞬間に見出されないであろうと考えられる。ランプ（Ｌａ、ｎｔｚ）ら（１９９０ａ）は、ＴＮＦ−αの注入後、血清中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌレベルは、血清ＴＮＦレベルよりもゆっくりと下降することを立証した。これの発見により、もしＴＮＦ−レセプターンステムの活性化に関連した、具体的にはＴＮＦ−αによる、病的状態の診断を設定するならば、診断を基礎としｔこＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度の測定は特に都合かよく、ここてＴＮＦ−α レベルは、ＴＮＦ−ＨＰ　ｌレベルと比へるとよりすばやく低下することか示された。

ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの測定の助けを借りて診断することができる疾患の例として（よ、グラム陰性又は一般的な細菌の感染、敗血症性ノヨノク、「移植細胞対宿主Ｊ病における組織損傷及び大脳マラリア及び悪液質があげられる。

本発明のイムノアッセイは、もし治療が正確に行われなければ生命を脅かす疾患である、敗血症性ノヨソクの診断に特に有益である。

モノクローナル抗体ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−２に基ついた本発明のイムノアッセイにより、ＴＮＦ４Ｐ　ｌは平均濃度的２ｕｇ／Ｉで正常ドナーの血清中に検出することができる。

上昇したレベルは、ひどい火傷を負った患者の血清中に見出された：非常に高いレベルは透析患者に見出されたが、慢性多発関節炎患者の血清はＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度の上昇を示さなかった。

また、本発明のイムノアッセイは、第一に、尿中のＴＮＦ−ＢＰ　［を検出する簡単な免疫学的方法を提供するものであり、正常ドナーの尿サンプルにおいて、平均約２ｕｇ力の濃度のＴＮＦ−ＢＰ　ｌが検出された。

本発明のイムノアッセイは、尿中のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの濃度を測定することにより腎不全のケースに見出されるような、尿と血清において’ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度の上昇に相互関係がある病的状態の診断に使用することができる。この方法は、血液サンプルを要求しないこと及び尿の分析を基礎とした診断を提供することができるという利点を有し、それは患者にとってかなり好ましいことである。

本発明のイムノアッセイに使用することができる「診断」という語句は、また、ＴＮＦ−レセブターンステムの活性化に関連する疾患のコース、又は疾患の処置、例えばＴＮＦ−αの抗体を用いた処置に関する治療のコースをモニタリングすることをカバーする。また、本発明のイムノアッセイの使用は、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βが投与される治療の進行をモニタリングするのに好都合である。これらの診断の応用のコースにおいて、体液のサンプルは規則的な間隔をおいて患者から一般的に採取し、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌのその含有量を試験した。

ＴＮＦ−ＢＰ　ｌに結合するのにＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βと競合せず、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの防護効果を増す、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌのモノクローナル抗体を本発明に従って使用し、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βが損傷効果を有する疾患の治療の範囲内でＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの効果を増強してもよい。（ＴＮＦ−αに対するＴＮＦ−ＢＰ　ｌの防護効果は、比較的弱いことが見出された（ランプ（Ｌａｎｔｚ）ら、１９９０ｂ、ローチャー（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ）ら、１９９１年）。

内因性ＴＮＦ−１１Ｐ　＋及び治療用に投与された外因性ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの両方に関するこれらの抗体の防護効果の強化を利用するために、抗体をそれ自体で又は治療剤として好適な標品においてＴＮＦ−ＢＰ　ｌと組み合わされてもよい。

ＴＮＦ−α及び’ＴＮＦ−βに対するＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの防護効果を増強するこの種類の抗体の例としてはｔｂｐ−を及びｔｂｐ−６があげられる。この目的に関するＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの他の抗体の適性は、バイオアッセイにおいて該抗体をそれらの効果についてＴＮＦ−ＢＰ　ｌで試験することにより確認される。モノクローナル抗体の用量は、ＴＮＦ−１３Ｐ　Ｉの量に従って調節され、ＴＮＦ− ＨＰ　Ｉの量を基準として等モルから約１００倍モル過剰量の範囲内であるのが好適である。

本発明が適用される他の分野は、アフィニティクロマトグラフィによりＴＮＦ− １１Ｐ　＋を精製するために固定された形態（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ　ｆｏｒｍ）のモノクローナル抗体ｔｂｐ−１、ｔｂｐ−２及びｔｂｐ−６の使用である。

さらに、本発明のモノクローナル抗体、具体的にはｔｂｐ−１は免疫プロットにおいてＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出するのに使用できる。

図面の簡単な説明図トモツクローナル抗体を使用したＴＮＦ−ＢＰ　ｌのＥＬＩＳＡ　０図２：血清及び尿サンプルのＴＮＦ−ＢＰ　ＩのＥＬ［ＳＡに関する代表的検量線。

図３　：　ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの免疫反応性に関するＴＮＦ−αの効果。

図４　ヒト血清及び尿におけるＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度。

図５　サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出するＴＮＦ−α の効果。

図６　細胞障害性バイオアッセイにおけるＴＮＦ４Ｐ　Ｉの防護効果に対するモノクローナル抗体の効果。

本発明を以下の実施例により具体的に説明する。

実施例１ヒトＴＮＦ−ＢＰ　ｌに特異的なモノクローナル抗体の製造ａ）免疫処置生後約６週間の３匹の雌性ＢＡＢＬ／Ｃマウスを、ＥＰ　Ａ２３９３４３８に記載した方法により、以下の計画に従って、均一に精製したＴＮＦ−ＢＰ　ｌを用いて免疫した。

第一の免疫：マウスあたり９μｇのＴＮＦ−ＯＰ　ｌを完全フロインドアジュバントにおいて腹腔内投与により投与した。

第二の免疫：第一の免疫の３週間後、マウスあたり９μｇのＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを不完全フロインドアジュバントにおいて腹腔内投与した。

第三の免疫：第二の免疫の５週間後、マウスあたり９μｇのＴＮＦ−ＤＰ　Ｉを不完全フロインドアジュバントにおいて腹腔内投与した。

８日後、血清サンプルをマウスから採取し、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの抗体の形成をサンドイッチＥＬＩＳＡにより調査した。これを行うためにＴＮＦ−ＢＰ　Ｉのウサギ抗体でコートした試験プレートにＴＮＦ−ＢＰ　ｌを結合し、マウス免疫グロブリンのベルオキシダーゼ結合ウサギ抗体を用いて特異的抗体を検出した。試験血清は１：１０２、ｌ：ｌｏ３、■・１０′及び１．１０″の希釈液において適用した。３匹のマウスすべてが１０’までの希釈液において陽性の反応を示した（バックグラウンドの２倍以上の吸収量）。

第三の免疫の約８週間後、最も高いタイターのマウスに３日間連続的に、ＰＢＳ中の４μｇのＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを用いて追加刺激を与えた　このマウスの膵臓細胞を、次の日にハイブリドーマ細胞との融合に使用した。第３の免疫の８力月後に、使用したマウスにＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの第４の量（１５μｇ）を追加的に与え、７週間後に追加刺激を与えたこと以外は、第二の免疫を同様の方法で行った。

ｂ）融合：最後の注射１日の後、マウスの膵臓を滅菌条件下で取り出し、機械で切り（ｃｈｏｐ　ｕｐ）、血清のない培地（ＲＰＭＩ　１６４０）で洗った。約１０″個の膵臓細胞を、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉ　ｌ５ｅｅｉｎＸ１９７５年）の方法を用いて、ＰＥ０４０００の存在下において約５刈０’　Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　ＢＡＬＢ／ｃメラノーマ細胞と融合した（キルニー（Ｋｅａｒｎｅｙ）ら、１９７９年）。その後、該細胞をＨＡＴ−選択培地（ペニシリンＧナトリウム１００Ｕ／＋ｎｌ　、ストレプトマイノン５０［Ｊ／ｍｌ及び２０％ＦＣ５−１０−’Ｍヒポキサンチン、４　Ｘｌ０−’Ｍアミノプテリン及び１．６　Ｘｌ０−’Ｍチミジンで補ったＲＰＭＩ　１６４０）に呼濁し、　［フィーダーレイヤー（Ｆｅｅｄｅｒ　Ｌａｙｅｒ）」としてマウス腹膜細胞を含有する１６の９６−ウェルミクロタイタープレートに分配した。１１日後、上清を取り出し、抗体産生について試験した。選択培地において成長した工５００培養物のうち、９０％以上のものがハイブリドーマの発育を示した。

Ｃ）ハイブリドーマ培養残留物のスクリーニング特に規定しない限り、以下の緩衝液をすべてのＥＬＩＳＡ実験に使用した。

コーティング緩衝液・０．０５Ｍ炭酸カルシウム　ｐ）１９．６洗浄媒体ゴヤｅｅｎ２０を０．５ｇ／ｌて含むｐＨ７，４のリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）試験緩衝液：ウシ血清アルブミン（５ｇ／Ｉ）及びＴｗｅｅｎ　２０　（０，５ｇ／ｌ）を含むＰＢＳ基質溶液：　０．０５Ｍクエン酸カリウム中、テトラメチルベンジンヒドロクロライド（０，１ｇ／ｌ）及び過ホウ酸ナトリウム（０，０５ｇ／ｌ）、ｐＨ５，０停止溶液（Ｓｔｏｐｐｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　＋　２Ｍ　硫酸９６−ウェルのイムツノアッセイプレートを、■・３０００の血清希釈液（５０μｍ／ウェル、４℃で一晩又は３７°Ｃで１時間インキュベーション）に相当する濃度のコーティング緩衝液中、硫酸アンモニウム沈澱物（５０％飽和）で部分的に精製した耐Ｆ−ＢＰ　Ｉのウサギ抗体でコートした。そのプレートを一度洗い、周囲温度で１時間、試験緩衝液で遮蔽した。その後ハイブリドーマ残留物（５０μｌ）を抗原（５０μＩ、試験緩衝液中ｌＯμｇ　ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ／ｌ）と−緒に加え、その皿を２時間周囲温度でインキュベートした。それらを一度洗い、マウス免疫グロブリンのベルオキシダーゼ結合ウサギ抗体の溶液（Ｉ）ＡＸＯ、デンマーク、試験緩衝液の１：５０００の希釈液、５０μｍ／ウェル）を加え、プレートを周囲温度で２時間インキュベートした。その後、それらを３回洗い、基質溶液２００μｌを各ウェルに加えた。２０〜４０分後、５０μ Ｉの停止溶液を加えることにより反応を止めた。その溶液の吸収量を、陰性コントロールとしての培養培地及び陽性コントロールとしての希釈マウス免疫血清を使用し、４５０ｎｍ　（標準：　６９０ｎｍ）の波長でＥＬＩＳＡリーダーにおいて測定した。第一の免疫処置で調査した培養物のうちたった２つが、いずれかの抗体産生を示した（ＴＢＰ−１及びＴＢＰ−２）　：第二の融合は第三の抗体 −陽性細胞系（ＴＢＰ−６）を生じた。

該陽性培養物を、約２５日後にＨＡＴ−培地からＨＴ−培地に移し、さらに１０日後、それらを正常培養培地（ＲＰＭＩ　１６４０　完全、１％抗生物質、１０％Ｌ−グルタミン、ｌＯ％ＦＣ３）に移した。

ｄ）ハイブリドーマのクローニング陽性培養物を制限希釈方法によりクローン化した。）００８ｍの培地が細胞１つを含むように希釈を行い、その後９６ウエルの皿のウェルをこの容量で充たした（全部で３つの皿を調製し、前の日に各ウェルをマウス腹膜マクロファージ懸濁液１００μ（で充たした。）。培養残留物を上記のようにＥＬＩＳＡにより試験した；各培養物から得た陽性クローンを貯蔵し、増やし、凍結させた。

ｅ）モノクローナル抗体の産生ｉｎ　Ｖ！ＶＯにおいて抗体を産生ずるために、約ｌＯ７細胞を各ハイブリドーマ培養物から取り、０．５ｍｌの不完全フロインドアジュバントであらかじめ２日又は３日処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜組織内に注入した。約１０〜１４日後、腹水を取り出した。形成したモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈澱物により精製し、その後キャリヤー結合タンパク質−Ｇのアフィニティクロマトグラフィを行った。

細胞培養における抗体産生のため、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）をタンパク質−Ｇセファロースのクロマトグラフィにより精製し、ウシＩｇＧを除去した；この血清調製物をハイブリドーマ培養物に５％濃度において使用した。抗体を、タンパク質〜Ｇ−セファロースを使用して培養残留物から再び単離した。代わりの方法として、細胞を血清を含まない媒体（血清フリー（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）及びタンパク質フリー（ｐｒｏｔｅｉｎ（ｒｅｅ）のハイブリドーマ媒体、Ｍｅｓｓｒｓ、　ＳＩＧＭＡ　、カタロ外ｏ、　５−２７７２、ＩＪＳＡ）において成長させ、さらに抗体をタンパク質−〇−セファロースのクロマトグラフィにより同様に単離した。

実施例２モノクローナル抗体の特性決定抗体のサブアイソタイプ（ｓｕｂｉｓｏｊｙｐｅ）を、ベルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（セロチック、オックスフォード、ＧＢ）を使用して決定した。ｔｂｐ −１及びｔｂｐ−６はＩｇＧ１−抗体であるのに対し、Ｉｂｐ−２はＩｇＧ２＝抗体であった。

ウェスタンプロットにおいて、３つの抗体すべてはＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを認識した；　ｔｂｐ−１は強い反応性を示し、ｔｂｐ−２はより小さな強さで反応したがｔｂｐ−ｓは非常にわずかな着色を生したのみてあった。

抗体により認識されたエピトープを決定するために、３つの抗体ｔｂｐ−１、ｔｂｐ−２及びｔｂｐ−ｓ及び抗体Ｈ３９８てあって可溶化したＴＮＦ−レセプターで免疫することによりト・−マ（Ｔｈｏｍａ）ら（１９９０年）により開発されたものをセイヨウワサビのペルオキシダーゼに結合し、Ｅｌ、ＩＳＡにより特性決定した・試験プレートを非標識抗体（１０ｍｇ／りの一つでそれぞれコートし、その後抗原の一組の希釈液を加え、その後酵素結合抗体の一つを施した。この実験は可能なかぎりの取りあわせて行った〔図、１：Ａ：ｔｂｐ−１；Ｂ：ｔｂｐ−２、Ｃ：　ｔｂｐ−６、［）　：　Ｈ２Ｏ２゜印は、ペルオキシダーゼ結合体を示す　ｔｂｐ−１（黒丸）　、ｔｂｐ−２（黒四角）　、ｔｂｐ−ｅ　（黒三角）、８３９８　（白丸）〕。各抗体種のとれも「サンドイッチＪを形成可能でないことが見出され、そのことは抗原がモノマーの形態において存在することを示していた。

抗体ｔｂｐ−１とｔｂｐ−２、ｔｂｐ−６又はＨ２Ｏ２の組合せ及びｔｂｐ−２とｔｂｐ−６又はｔｂｐ−６とＨ２Ｏ２の組合せは用量依存シグナルを生ずることが可能であったが、Ｈ２Ｏ２と結合したｔｂｐ−２は反応しなかった。このことから、抗体はＴＮＦ−ＢＰ　１分子の３つの異なるエピトープを認識すると結論づけられた；ｔｂｐ−２及び旧９８は同一かオーツく−ランプしたエピトープに結合した。さらなる開発のため、試験の取りあわせを、ｊｂｐ−１がコーティング抗体を構成し、ｔｂｐ−２がペルオキシダーゼ結合抗体を構成するものから選択した。

実施例３酵素結合イムノソルベントアッセイ（サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ）の開発ヒト血清中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌを検出するＥＬＩＳＡの使用に照らし、まず、すべての様々な培地を、サンプル及びスタンダードに希釈培地としてのそれらの適性について調査した。Ｆｅ２及びウソ血清の両方が使用可能な用量−活性曲線を生成したが、貯蔵した正常ヒト血清は非常に高いブランク値を示した。この現象は、非特異的反応性又は抗原の存在によるかとうかをチェックするために、固定したＴＮＦ−αを含むアフィニティカラムにヒト血清をとおした。クロマトグラフィカラムのスルーフロー（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗ）を希釈媒体として使用した時、ブランク値は、ウシ血清で得られたものとほぼ等しかった。このことは、正常ヒト血清が、免疫反応性かつ生物学的活性なＴＮＦ−ＤＰ　Ｉを含むことを示していた。使用した血清プール中のＴｔｌｌＦ−ＢＰ　ｌの濃度は約ｌμｇ／ｌと評価された。５０％ウシ血清を用いて描いたスタンダードカーブは、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌが除去された５０％ヒト血清のものと区別できなかった。

従って、前者の培地をその後の試験ずへてに使用した（使用したウソ血清の供給物のすべては様々な会社から得られ、そのうちの二つのみが好適であることが分かった：他のものすべては繁殖性が乏しいことを示した。）。

標準方法に従って試験を設定し、行った。

まず、血清中のＴＮＦ−ＤＰ　Ｉを測定するアッセイを開発するための予試験において、いわゆる２段階アッセイ、即ちその後に洗浄工程が続くサンプルのインキュージョンと、該抗体−酵素結合体を用いたインキュベーションが別々に行われる方法には、より速くより好都合な１段階方法を越える利点はないことか見出された。

さらに、予試験は、コーティング抗体の濃度を多様にするためカリ免疫反応のインキュ−ジョン時間を多様にするために行われた。

最適化したアッセイを行い、血清中のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを以下のように測定した：９６ウエルのイムノアッセイプレートを、コーティング緩衝液中３ｍｇ／Ｉの濃度のモノクローナル抗体ｔｂｐ−１でコートした（４℃で一晩又は周囲温度で１時間；１００μｌ／ウエル）。ウェルを一度洗い、残っている結合部位を、周囲温度で１時間、２００μｌの試験緩衝液で遮蔽した。他の洗浄サイクルの後、列２及び１１のウェルに１００μｌの５０％ウシ血清１５０％ＰＢＳを入れた。

ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの標準溶液（実施例１ａを参照されたい。２０μｇ／ｌの５０％ウシ血清１５０％ＰＢ５．１００μｍ）を、Ａ２及びＡｌｌのウェルにピペットで移した：比ｌ：２の段階希釈液を、列２及び１１のウェルに直接作成した。

他のすべてのウェルにＰＢＳ　５０μｌを加え、血清サンプルを２度ピペットで移した（５０μｌ／ウエル）。試験緩衝液中のペルオキシダーゼ結合抗体ｔｂｐ −２の溶液５０μｍを、好適な希釈液が予試験において確認された後に、すべてのウェルに入れた。（セイヨウワサビペルオキシダーゼに対する抗体の結合（ベーリ：／ガーマンハイム）をウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）及びナカネ（ＮａｋａｎｅＸ１９７８年）により記載された方法に従って行った。）。プレートを、プレート振動装置（ｐｌａｔｅ　ｖｉｂｒａｔｉｎｇ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）において、周囲温度で３時間インキュベートした。

その後、プレートを３回洗い、基質溶液（２００１ｚｌ　）加え、５０μｍの停止溶液を添加することにより反応を止め、吸収量の値を上記のように測定した。

サンプルにおけるＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの濃度をＴｉ　ｔｅｒｃａｌｃプログラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａ、ｃｋａｒｄ）を使用して計算した。

検量線をプロットする時に１０％ＦＣ３を含む細胞培地を使用し、サンプルを希釈せすに使用したこと以外は、細胞培養残留物を分析するために同様の方法においてアッセイを設定した。

改良（２段階）方法を尿中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌを測定するために開発した。この必要性は、いくつかのサンプルの低いｐＨ値及び試験の妨げとなる他の説明されない因子のために生した。ｐＨ値により引き起こされる影響は、緩衝能力か不十分なために標準試験緩衝液により補うことかできなかった。最も酸性の強いサンプル（ｐＨ５）でさえ中性のｐＨにまで引き上げることができることを確実にするために、強いリン酸緩衝液（０，５Ｍ）か必要であった。この測定は、いくつかのサンプルかなお繁殖性の乏しさを示す場合には、十分てはなかった。この問題は２段階試験方法を使用することにより解決された（サンプル及び結合体の継続的なインキュベーション）、血清アッセイについて記載したようにプレートをコートし、遮蔽し、洗った。その後、０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４中、ウシ血清アルブミン（５ｇ／ｌ）及びＴｗｅｅｎ２０（０，５ｇ／１９からなる溶液を、プレート中のウェルにピペットを用いて移した（５０μＩ／ウエル）。その検量線を、同し溶液を用いて描いた。

その後床サンプル（５０μＩ／ウェル：測定を２度行った）を加え、プレートを振動装置上で２時間インキュベートした。その後、プレートを洗い、試験緩衝液中の酵素結合体の溶液１００μＩを加え、その後インキュベーションをさらに２時間行った。プレートの最終処理及びＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの定１的測定を血清試験について上記したように行った。

一般的な検量線を図２に示した（黒丸　血清サンプル、白丸：尿サンプル）：それは、０．３〜ＩＯμｇ、／１の濃度範囲においてＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの定量的測定を認めた。ブラインドの値に３つの標準偏差を合わせたものに相当するシグナルを生しる濃度として定義した血清中の検出可能な最低量を、０．２μｇ／Ｉ　（独立したア・ンセイの平均）と測定した。１ｍｇ／ｌ（標準試験範囲と比較して１００倍過剰な量）までの濃度においてこ大１フ・ｌり（ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ　ｈｏｏｋ）ｊ効果（過剰の抗原）は見出されなかった。尿サンプルの試験の感受性は、比較可能であった。細胞培養サンプルの感受性は、これらのサンプルか希釈されないで使用されるので、約Ｏ１μｇ／ｌである。

血清アッセイの正確性を、６つの異なる試験において２及び１０μｇ／の濃度のＴＮＦ−ＢＰ　ｌを含む血清サンプルを分析することにより試験した。アッセイ内（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ）変動係数はそれぞれ４．７％及び５．９％であり、アッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）変動係数はそれぞれ６．６％及び７．５％であった。直線性を、血清中のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの一組の外部２倍希釈液（０，３〜ｌＯμｇ／Ｉ濃度）を調査することにより測定し、測定した値の回帰直線を、予期した値と比較することにより実験により計算した。

３つの独立した試験において、相関係数０．９９８〜ｌを得た。

血清アッセイによるＴＮｌ”ＢＰ　Ｉの検出を、外因性ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを７の正常ドナーの血清に二つの異なる濃度（１及び５μｇ／ｌ）において加えることにより調査した。この実験は、すべてのサンプルが様々な濃度の外因性ＴＮＦ− ＯＰ　Ｉを含んでいたという事実により、さらに困難になった：従って、検出率を計算する前にこれらの値を引かなければならなかった。平均検出率は、ｌμｇ／Ｉにおいて８３±１５％であり、５μｇ力において８５±１３％であることが見出された（範囲：それぞれ６２〜１０１％、６５〜１０５％）。

外因性ＴＮＦ−ＢＰ　ｌを加えた１４の尿サンプルにおける改良尿アッセイによるＴＮＦ−ＤＰＩの検出を、血清サンプルに関して行ったものと同様の方法で調査した；公称濃度５μｇ／ｌに関する平均検出率は８３±１５％であった（範囲＝５２〜１０４％）。

ＴＮＦ−レセプターの生理学的リガンドがＴＮＦ−ＢＰ　ｌの抗体との相互作用に影響を及ぼすかどうかを測定するために、増加した濃度の組み換えＴＮＦ−α （グレー（Ｇｒａｙ）ら、１９８４年）及び組み換えＴＮＦ−β（ペン二カ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら、１９８４年）の存在下、それぞれの場合Ｅ、　Ｃｏｔ　ｉ　から、かつ９９％より高い純度で、一定の濃度のＴＮＦ−ＢＰ　１（５μｇ／Ｉ）を用いてＥＬＩＳＡを行った。図３から分かるように（Ｃは、ＴＮＦ−ＢＰ　１を含まないアッセイのバンクグラウンドを示すものである。）、ＴＮＦ−αは、１０μｇ／１以上の濃度の抗体とＴＮＦ−ＢＰ　ｌの反応を阻害する；これに対して、ＴＮＦ−βは、非常に高い濃度（１００ｆｆ１ｇ／ｌまて）でさえも活性を示さなかった。

実施例４ＴＮＦ−ＢＰ　ｌの安定性ａ）血清中の安定性貯蔵した正常血清の濾過−滅菌サンプルを、様々な温度で２４時間貯蔵した。さらにサンプルを何回かの凍結／解凍サイクルにかけた。表１から分かるように、３７℃におけるインキュベーションも、繰り返した凍結及び解凍のいずれも、ＴＮＦ−ＢＰＩの免疫反応性に影響を及ぼさなかった。サンプルは、外因性ＴＮＦ −ＢＰ　ｌ　（サンプルｌ：１．２μｇ／ｌ）を含む貯蔵したヒト血清及び外因性ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを加えた同じ血清サンプル（サンプル２　最終濃度５μｇ／ｌ）からなるものであった。

ｂ）尿の安定性試験をａ）に明記したように行った。ｐｌ（値が広範囲な３つのサンプルを調査した。

表Ｉから分かるように、凍結及び解凍の後、ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉはすべてのサンプルにおいて安定であった。すべてのサンプルは、どのような活性も失うことなく、３７℃までの温度で２４時間貯蔵することができた。尿サンプルを３つの異なるドナーから得た（サンプルトｐＨ５，１，１，９μｇ／ｌ；サンプル２：ｐＨ５，９，４，０μｇ／Ｉ　；サンプル３：ｐＨ７，２，３，７μｇ／ｌ）。ｒｎｄ」は、「測定せず」を示す。

実施例５ヒト血清におけるＴＮＦ−ＢＰ　ｌの検出４２の正常ドナー（血液ドナー及び実験スタッフ）から得た血清を、実施例３に記載した血清サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して調査した。ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度は、０．５〜５．４μｇ／ｌて様々であり、平均は２．１１．ｔｇ／Ｉであった（標準偏差１、Ｏｆ１ｇ／ｌ　；図４）。同時に得られる血清、ＥＤＴＡ−血漿、クエン酸加血漿及びヘパリン血漿は、二人から入手可能であった。　ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度は有意に異なっていなかった（ドナーＡ　：１７．２．０．１．６及び１．９μｇ／Ｉ　；ドナーＢ：１．８．１．８．１．８及び１．９μｇ／Ｉ）。慢性多発性関節炎の１５人の患者の血清中のＴＮＦ−ＢＰ　１８度は、健常人のもの（２，３±０．７９μｇ／ｌ　；範囲　１．２〜３．９μｇ／ｌ）とは有意に異なっていなかった。有意に上昇したレベルは、厳しい火傷を負った患者の血清に見出されたく６．５±１．７　ｔｔｇ／Ｉ　：範囲：　３．１〜９．１　μｇ／Ｉ　：　ｎ＝１ｃｌ）、腎不全患者（ｎ＝６）は、２０〜６９Ｉ１ｇハの範囲の著しく高い濃度を示した（平均上標準偏差・４９±１７μｇ／Ｉ）。

実施例６尿サンプルに特異的な実施例３において開発したサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、１６の正常ドナーの尿サンプルのＴＮＦ−ＢＰ　ｌ：ａ度を測定した。それは、０．７８〜４．３μｇ／ｌで多様であった（平均上標準偏差−２，２±１．２μｇ／ｌ）。雌性（２，１＝１．４　ｕｇ／Ｉ　：　ｎ＝９）と雄性（２，２±１．０　μｇ／ｌ　；　ｎ＝７）のドナー間に有意な差は見られなかった。

実施例７ヒト細胞系由来の培養残留物中のＴＮＦ−ＢＰ　ｌの測定開発したＥＬＩＳＡがヒト細胞培養により製造されたＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを検出するのに好適かどうかを測定するために、−組の細胞系を調査した。一般的に、新鮮な培地での希釈又は付着細胞の通過の数日後、培地（１０％ＦＣ５を含む）を濃密な培養物がら採取した。１０％ＦＣ３を含有する培地を、標準希釈液として使用した：アッセイを一段階方法により行った。ＴＮＦ−ＢＰ　ｌは、細胞系Ａ３４９　（肺癌；　１．１　μｇ／Ｉ）、ＨｅＬａ（子宮癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ）＋０．３８μｇ／ｌ）及びＮａｍｌｗａ（バーキットリンパ腫、　０．２５μｇ／ｌ）の残留物に検出可能であったが、細胞系Ｕ９３７　（細網肉腫）　、ＥｏＬ− ３（好酸球白血病）　、Ｒａｊｉ　（バーキットリンパ腫）　、Ｉ（Ｌ−６０（骨髄性白血病）　、Ｕ２６６　（骨髄腫）及びＬｕＫＩ＋（エプスタインバーウィルスにより永遠性が与えられた（ｉｍｎｏｒｔａｌ　１ｓｅｄ）Ｂ−細胞系リンパ芽球腫細胞系）において検出制限値以下であった。初期の結果によると（ランフ（Ｌａｎｔｚ）ら、１９９０ｂ）、ＴＮＦ−β（１０μｇ／ｌ）の存在において培養されたＨＬ−６０細胞は、増加した量のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを放出したことが観察された：この処置の４日後、０．４５μｇ／Ｉの濃度が達成された。

実施例８ａ）ＴＮＦ−ＢＰ　ｌに対する抗体の結合におけるＴＮＦ−αの影響の測定ＴＮＦ−αがＴＮＦ−ＢＰ　ｌに対する抗体の結合に影響するかどうかを測定するために、一段階サンドイッチＥＬＩＳＡを、多くの異なる取りあわせにおいて行った。モノクローナル抗体の一つを、抗原をぬぐい取るためのコーティング抗体として使用し、一定の量のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを様々な濃度のＴＮＦ−αの存在下において使用し、さらにセイヨウワサビのペルオキシダーゼで標識した第二のモノクローナル抗体を使用した。

ＥＬＩＳＡを、実施例３に記載したように実質的に行い・プレートをコーティング緩衝液中のｌｏｕｇ／ｍｌの抗体でコートし、洗浄し、試験緩衝液で遮蔽した。（様々な濃度のＴＮＦ−αの存在下、）最終濃度５　ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−ＢＰ　ｌ及びペルオキシダーゼ結合抗体を用いた一段階インキ、ベーノヨノを試験緩衝液において周囲温度で３時間行った。その後プレートを洗浄し、基質溶液で発育させ、その後反応を止め、吸収量をプレートリーダーにおいて４５０μｍで測定し、６９０ｒｕｎにおける吸収量を引いた。これらの実験結果を図５に示した：表Ａ−Ｄは、抗体ｊｂｐ−１、ｔｂｐ−２、ｔｂｐ−６及びＨ２Ｏ２でコートしたプレートの結果を示した：印は、抗体ｔｂｐ−１（黒丸）、ｔｂｐ−２（白丸）　、ｔｂｐ−６（黒長方形）及びＨ３９Ｂ　＜自長方形）のペルオキシダーゼ結合体を表すものである。バックグラウンドシグナル（ＴＮＦ−ＢＰ　ｌを含まないもの）をＣて示した。抗体ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６の組合せて得られたシグナルは、試験した最も高いＴＮＦ−α濃度により影響されなかった（１０ μｇ／ｍｌ）。対照してみると、ｔｂｐ−２又はＨ２Ｏ２を含むすべての組合せは、ＴＮＦ−αに感受性であったが、異なる用量−活性比を示した。（これらの結果は、Ｈ２Ｏ２及びｔｂｐ−２がＴＮＦ−α結合部位に関連したエピトープを認識するのに対し、ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６が独立したエピトープを定義することを示すものである。）ｂ）ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉに対する抗体の結合におけるＴＮＦ−βの影響の測定アッセイを、ａ）に記載したような、ＴＮＦ−βに関するモノクローナル抗体ｔｂｐ −１及びｔｂｐ−６を用いて行った。また、ＴＮＦ−βの場合、１０μｇ／ｍｌの濃度ではアッセイは妨害されないことが見出された。

実施例９モノクローナル抗体の生物学的活性を測定するための細胞毒性バイオアッセイａ）ＴＮＦ〜αに対するＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの防護効果に関する抗体の影響ＴＮＦ− αの細胞毒性活性を、１９８６年にクラ−７−（Ｋｒａｍｅｒ）及びカルバ−（Ｃａｒｖｅｒ）により記載された方法を使用して本質的に測定した。この目的のため、マウスＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　］、、　２）をミクロタイタープレート中で一晩培養し、ＴＮＦ−α標品を、一連の２倍希釈液に加え、アクチノマイシンＤを加え、最終濃度１μｇ／ｍｌを得た。

このプレートを３９°Ｃで１８〜２０時間インキュベートし、細胞を０．５％クリスタルバイオレフトで染色し、吸収量を５４０ｒ＋ｍで測定された。（細胞のコントロール及びブランクの値は、各プｌ／−トにおいて４倍で提供された）。

定義により、細胞の５０％を除去する溶液は１ユニット／ｍｌを含むものである。アッセイ条件下において、使用した組み換えヒトＴＮＦ−αの特異的活性は５Ｘ１０７ユニット／ｍｇタンパク質であった。４刈０４　Ｅ／ｍｌの固定化した活性を有する８６／６５９（ＮＩＢＳＣ１英国）であるＴＮＦ−αに関する参考標品は、５　Ｘ　１０４　Ｅ／ｍｌを示した。中和アッセイを、一定の量のＴＮＦ−α（最終濃度２０　Ｅ／ｍｌ）及び／又はモノクローナル抗体と１時間３７ °Ｃて、培地中、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌの段階希釈液をプレインキユベーティングすることにより行った。その後、培養液をプレートから移し、ブレインキュベートしたＴＩＩＩＦ−α／ＴＮＦＢＰ　Ｉ／抗体溶液を１００μｍの量において細胞に加えた。プレートを上記のようにインキュベートし、染色した。細胞（ＥＤ５０）に関する５０％防護効果を示すＴＮＦ−ＢＰ　１濃度を図から測定した。行ったバイオアッセイの結果を図６に示した：印は以下の結果を示すものである・ＴＮＦ−ＢＰ　ｌのみ（黒丸：破線）、以下の濃度で抗体と合わせたＴＮＦ−ＢＰ　ｌ、０．Ｏ１μｇ／ｍｌ　（白玉角）　、０．１　μｇ／ｍｌ　（黒三角）、１　Ｈ／ｍｌ　（自長方形）　、ＩＯμｇ／ｍｌ　（黒長方形）又は１００　、ｃｚｇ／ｍｌ　（白丸）。

一定の量のＴＮＦ−α（２０細胞毒性ユニツ）ヅｍｌに相当する４００μｇ／ｍｌ）の存在において、半一最大防護（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）は、２７０±４４ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度（６つの独立試験の平均）が得られることが見出された。モノクローナル抗体ｔｂｐ−２をＴＮＦ−ＢＰ　ｌと一緒に加えた時、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌの防護効果が減少した：抗体濃度１、ＩＯ又は１００μｇ／ｍｌにおいて、半一最大防護に要求されるＴＮＦ −ＢＰ　Ｉの濃度は、それぞれ３８０．１．０００及び１．２．０００μｇ／ｍｌに増加した。Ｈ２Ｏ２は、ＴＮＦ−ＨＰ　Ｉの防護効果を同様の程度にまで減少した（最終値、８４０．３．８００及び＞　２０．　ＯＯＯｎｇ／ｍｌ　）。

（ＴＮＦを含まずに１００μｇ／ｍｌまでの量のこれらの抗体を用いた細胞を処理することにより、いかなる種類の細胞毒性活性も生じなかった；また、抗体は、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌを含まずにＴＮＦの細胞毒性に対して細胞を防護しないことが見出された。）しかし、驚くべきことに、抗体ｔｂｐ−１は、ＴＮＦ−ＨＰ　Ｉの防護効果を増加した。

］００ｎｇ／ｍｌまでの抗体濃度において、細胞は、４０μｇ／ｍｌという低い用量においてＴＮＦ−ＢＰ　ｌにより完全に保護された。ｊｂｐ−６は同様であったが、定量的には活性はより低かった（この抗体はＥＬＩＳＡにおいて低い活性を示し、低い親和性を有すると仮定される）。過剰な量の抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、半−最大保護は、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌ濃度７．３±０．５μｇ／ｍ１（ｔｂｐ−（）又は５３±１３ｎｇ／ｍｌ　（ｆｂｐ−６）において見出すことができ、それらは（４つの実験において行われるタイトレーンヨンにより立証された）防護効果において約４０倍又は５倍の増加に相当するものである。同じＴＮＦ−α濃度であるがＴＮＦ−ＢＰ　Ｉを含まないで行われるコントロール試験において、抗体は活性を示さなかった。

ｂ）ＴＮＦ−βに対するＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの防護効果についての抗体の影響ａ）に記載したように行われるＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイにおいて、ＴＮＦ −βの細胞毒性活性は、ＴＮＦ−αのものよりも高かった（３００　Ｅ／ｎｇ対５０　Ｅ／ｎｇ）。また、ＴＮＦ−ＢＰ　ｌは、ＴＮＦ−βの同じ細胞毒性量（６６ｐｇ／ｍｔに相当する２０　［！／ｍｌ）に対する細胞毒性効果の阻害を示したが、要求される用量は少なくとも１０倍という多量なものであった（ＥＤ５０＝３．８００ｎｇ／ｍｌであり、ＴＮＦ−ａの２７０ｎｇ／ｍｌと比較される）。抗体ｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６（１０μｇ／ｍｌ）の添加は、ＴＮＦ−αに関するものと同様の範囲にまで防護効果を増強した：半−最大防護効果は、それぞれ５３ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌに達成された。

表１血清及び尿におけるＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの安定性処理　％検出血清　尿サンプルｌ　サンプル２　サンプルＩ　サンプル２　サンプル３貯蔵温度一２０℃　１００　１００　１００　１００　１００＋　４℃　９８　１００　９７　１０５　１０５＋２０℃　１００　９８　１００　１１２　１０９＋３７ ℃　９８　９１　１１０　１０７　８９凍結／解凍サイクル５　９２　１０４　ｎｄ　９４　９９参考文献バラトラ−（Ｂｅｕｔｌｅｒ　Ｂ、）著、１９８８．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　８５．２８７−２８８バウトラ−（Ｂｅｕｔｌｅｒ　Ｂ、）及びセラミ（Ｃｅｒａｍｉ　Ａ、）著、１９８９．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７゜ブＯツクハウス（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ　Ｍ、　）ら著、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７゜エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ比）ら著、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６４．１１９７４−１１９８０エンゲルマン（Ｅｎｇｅｉｍａｎｎ　ｆ（、）ら著、　１９９０　ａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ−２６５，１５３１−１５３６エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ　ｌ（、）ら著、　１９９０　ｂ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｕ　２６５．１４４９７−１４５０５グレイ（Ｇｒａｙ　Ｐ、　Ｗ、　）ら著、　１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７２１−７２４ヒムラー（Ｈｉａｎｌｅｒ　Ａ、　）ら著、　１９９０．　ＤＮＡ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９．７０５−７１５キルニー（Ｋｅａｒｎｅｒ　Ｊ、　Ｆ、）ら著、１９７９．　Ｊ、ｌ＋ｎｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２３．１５４８−１５５０コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ、　）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，）著、１９７５．　Ｎａｔｕｒｅ　２６５゜コーツ（Ｘｏｈｎｏ　Ｔ、　）ら著、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７．８３３１−８３３５クラ−マー（Ｋｒａｍｅｒ、　Ｓ、　ＳＬ）及びカーバー（Ｃａｒｖｅｒ、　Ｍ、　Ｅ、）著、１９８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　９３．２０１−２０６０−デビルり（Ｌａｈｄｅｖ：ｒｔａ　Ｊ、ン　ら著、１９８８．　、＾ｍ　Ｊ、　Ｍｅｄ、８５．２８９−２９１ランツ（Ｌａｎｔｚ　Ｍ、　）ら著、１９９０　ａ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　２．　ｌ−５ランツ（１，ａｎｔｚ　Ｍ−）ら著、１９９０　ｂ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８６．　１３９６−１４０２０−ン＋　−（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ　Ｈ，）ら著、１９９０．　Ｃｅ１１６１．３５１−３５９０−ンヤ−（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ　ｔｌ、　）ら著、１９９１．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６６、　１８３２４−１８３２９ミソチ（Ｍｉｃｈｉｅ　Ｈ，Ｒ，）ら著、１９８８．　Ｊ、　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３１８．　１４８１−１４８６オフナー（Ｏｆｆｎｅｒ　Ｆ、　）ら著、１９９０．　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　ｖｅｄ、　１１６．１００−＋０５オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ　１．）　ら著、＋９８９．　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、４２．２７０−２７５ポール（Ｐａｕｌ　Ｎ、　Ｌ、）及びラドル（Ｒｕｄｄｌｅ、　）著、１９８８．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．４０７− S３８ベーター（Ｐｅｅｔｒｅ　Ｃ，）ら著、１９８８．　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　４１．４１４−４１９ペン二カ（Ｐｅｎｎｉｅａ　Ｄ、　）ら著、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３］２．７２４−７２８シヤル（Ｓｃｈａｌｌ　Ｔ、　Ｊ、）ら著、１９９０．　Ｃｅ１ｌ　６１．３６１−３７０セキンジ＋−（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ　Ｐ、　）ら著、１９８８．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７、１５１１−１５１６スミス（Ｓｍｉｔｈ　Ｃ，Ａ、）ら著、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４８．１０１９−１０２３１−−マ（Ｔｈａｗ　Ｂ、　）ら著、１９９０．　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１７２．　１０１９−１０２３ウイルソン（Ｗｉｌｓｏｎ　Ｍ、　Ｂ、）及びナヵネ（Ｎａｋａｎｅ　Ｐ、　Ｋ、）著、１９７８．　Ｉａｎｕｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ。

アムステルダム、　２１５−２２４Ｎ汁帝Ｆｉｇ−２ＴＮＦ−ＢＰ　Ｉ　（μｇ／Ｌ）Ｆｉｇ、３ τＮＦ−α　（ｎｇ／Ｌ）Ｆｉｇ−５Ｆｉｇ−６喜訃殆　喜蔀萄フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０６ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ＣＩ２Ｒ１：９１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｔｂｐ−１、ｔｂｐ−２及びｔｂｐ−６と呼称されるヒトＴＮＦ−ＢＰ　Ｉのモノクローナル抗体であって、ハイプリドーマ細胞系ＴＢＰ−１、ＴＢＰ−２及びＴＢＰ−６それぞれにより分泌されるもの、又はその活性断片。
２．ＥＣＡＣＣ　において、それぞれ寄託番号９１０６０５５５（ＴＢＰ−１）、９１０６０５５６（ＴＢＰ−２）及び９１１１２８１１（ＴＢＰ−６）で寄託されているハイブリドーマ細胞系ＴＢＰ−１、ＴＢＰ−２及びＴＢＰ−６。
３．サンプルをｔｂｐ−１及び／又はｔｂｐ−２と接触させ、サンプルに含まれるＴＮＦ−ＢＰＩと抗体との２成分系又は３成分系複合体の形成を測定することを特徴とする、サンプルにおけるＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの測定方法。
４．３成分系抗体／抗原／抗体複合体の形成を測定し、ここで、使用した第一の抗体はｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２であり、使用した第二の抗体は第一の抗体と抗体／抗原／抗体複合体を形成可能なものであることを特徴とする、請求の範囲第３項に記載の方法。
５．ｔｂｐ−１を第一の抗体として使用し、ｔｂｐ−２を第２の抗体として使用することを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
６．サンプルが体液であることを特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。
７．体液が血清であることを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の方法。
８．体液が血漿であることを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の方法。
９．体液が尿であることを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の方法。
１０．サンプルが細胞培養残留物であることを特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。
１１．ａ）サンプルをキャリヤー結合ｔｂｐ−１と接触させること、ｂ）ａ）において形成した複合体をｔｂｐ−２と、又はｔｂｐ−１と抗体／抗原／抗体複合体を形成可能な抗体と接触させ、一方、この工程で使用した抗体は測定可能な標識を有するものであること、ｃ）形成した抗体／抗原／抗体複合体の量が標識を測定することにより測定されることを特徴とする、請求の範囲第４項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。
１２．ｂ）において、ｔｂｐ−２と同じＴＮＦ−ＢＰ　Ｉのエピトープ又はその領域を認識する抗体を使用することを特徴とする、請求の範囲第１１項に記載の方法。
１３．ｂ）において、酵素結合抗体を使用することを特徴とする、請求の範囲第１１項又は第１２項に記載の方法。
１４．体液中のＴＮＦ−ＢＰ　Ｉの濃度を測定することを特徴とする、ＴＮＦ− レセプターシステムの活性化を含むヒトの体の病的状態、具体的にはＴＮＦ−ａ濃度がＴＮＦ−ＢＰＩ濃度よりもすばやく減少する状態、を診断する方法。
１５．敗血症性ショックを診断する、請求の範囲第１４項に記載の方法。
１６．体液が血清であることを特徴とする、請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の方法。
１７．体液が血漿であることを特徴とする、請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の方法。
１８．ＴＮＦ−ＢＰＩの濃度を免疫学的に測定することを特徴とする、請求の範囲第１４項〜第１７項のいずれか１項に記載の方法。
１９．ＴＮＦ−ＢＰＩの濃度を、ｔｂｐ−１及び／又はｔｂｐ−２に対する結合により測定することを特徴とする、請求の範囲第１８項に記載の方法。
２０．キットが一つの容器にｔｂｐ−１を、他の容器にｔｂｐ−２を含み、ここで２つの抗体のうちの１つが固体キャリヤー結合していてもよく、他の抗体が測定可能な標識を有するものであること、さらに所望によりｔｂｐ−１又はｔｈｐ −２と抗体／抗原／抗体複合体を形成可能な他の抗体によりｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２を置き換えていてもよいことを特徴とする、請求の範囲第４項〜第１９項のいずれか１項に記載の方法を行うためのサンドイッチイムノアッセイキット。
２１．ｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２を置換する抗体を、ｔｂｐ−１又はｔｂｐ−２と同じＴＮＦ−ＢＰＩのエピトープ又はオーバーラップしたエビトープに結合することを特徴とする、請求の範囲第２０項に記載のキット。
２２．サンプルをｔｂｐ−１及びｔｂｐ−６と接触させ、サンプル中に含まれるＴＮＦ−ＢｐＩと抗体との３成分系複合体の形成を測定することを特徴とする、サンプル中のＴＮＦ−ＢＰＩの測定方法。
２３．ａ）サンプルをキャリヤー結合ｔｂｐ−１又はｔｂｐ−６と接触させること、ｂ）ａ）において形成した複合体をｔｂｐ−６又はｔｂｐ−１と接触させること、ここで、この工程において使用した抗体は測定可能な標識を有すること、ｃ）形成した抗体／抗原／抗体の量を、標識を測定することにより測定することを特徴とする、請求の範囲第２２項に記載の方法。
２４．キットが一つの容器にｔｂｐ−１を、他の容器にｔｂｐ−６を含み、二つの抗体のうちの一つが固体キャリヤーと所望により結合し、他の抗体が測定可能な標識を有することを特徴とする、請求の範囲第２３項に記載の方法を行うためのサンドイッチイムノアッセイキット。
２５．ＴＮＦ−ａ及び／又はＴＮＦ−βに対する内因性又は外因性ＴＮＦ−ＢＰＩの防護効果を増すために、ＴＮＦ−ＢＰＩに結合するのにＴＮＦ−ａ及び／又はＴＮＦ−βと競合しない抗体のグループから選ばれ選ばれる、ＴＮＦ−ＢＰＩのモノクローナル抗体の使用。
２６．請求の範囲第２５項に明記された目的のためのモノクローナル抗体ｔｂｐ −１及び／又はｔｂｐ−６の使用。