JPH06501106A - Ｎ次元データストリームを適応的に自動クラスタリングする重力アトラクターエンジン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、１９９１年８月２８日に出願された米国出願第７５１．０２０号の 一部継続出願である。

発明の分野 この発明は、試料中の粒子を異なる集団に限定するために、即時の（または既存 データからの）マルチパラメーターデータを分類してクラス分けする方法に関す る。照明と検知領域を通り抜ける個々の細胞についてマルチパラメーターを記録 するフローサイトメトリーの分野において、この発明は特に有用である。そして 、ＡＩＤＳ患者の血液試料中の免疫蛍光標識されたＣＤ３．　ＣＤ４およびＣＤ ８リンパ球を分類し、計算するために特に有用である。

背景技術 粒子分析は、一般に細胞、核、染色体及び他の粒子の分析を含み、それらの粒子 を異なる集団に属するものとして識別し、および／または、異なる集団に選別す る目的を持つ。このタイプの分析は、画像計測法及び流動計測法による自動分析 を含む。どちらの場合も、細胞のような粒子は、１つあるいはそれ以上のマーカ ーで標識され、１つあるいはそれ以上のそのようなマーカーの存在、非存在が検 査される。白血球、癌細胞あるいは微生物のような細胞の場合は、細胞表面上の 分子あるいは細胞質内の分子をマーカーが認識するようにできる。細胞の物理的 性質の検査は、マーカーの存在、非存在の検査と同様に、細胞がどの集団に属す るのかを明らかにするために役立ちつるさらなる情報を提供する。

サイトメトリーは、マルチパラメーターを用いて、試料中の異なるタイプの細胞 を識別し分類するよ（知られた方法である。例えば、試料は血液、リンパ液、尿 のような多種の生物学的液体であったり、あるいは、結腸、肺、乳房、腎臓また は肝臓などの固い組織由来の細胞の懸濁液であってよい。フローサイトメトリー では、各領域において各々の細胞がエネルギー源によりて照射されている、１つ あるいはそれ以上の検知領域を、懸濁液中の細胞が、一度に一つずつ通り抜ける 。エネルギー源としては通常、（例えば、ヘリウム／ネオンまたはアルゴンの） レーザー、適当なフィルターを施した水銀アークランプなどから得られる単一波 長の光線を放射する照射手段が用いられる。１つの検知領域からなるフローサイ トメトリーにおいては、４８８ｎ■の放射波長の光線が用いられる。

一連の検知領域においては、光電子倍増管（”ＰＭＴ“）などの複数の光線を集 中させる手段が用いられ、各細胞を通り抜ける光（通常は前進光散乱と呼ばれる ）、検知領域を通り抜ける細胞の流れに対して直交する方向に反射される光（通 常は直交光散乱／側方光散乱と呼ばれる）、および細胞が蛍光ラベルで標識され ているならば細胞から放出される蛍光光線が、細胞が検知領域を通過しエネルギ ー源によって照射される際に記録される。１つ１つの細胞（または”事象“）に 対して前進光散乱値（ＦＳＣ）、直交光散乱値（ＳＳＣ）、そして蛍光光線値（ ＦＬＩ、ＦＬ２など）の異なるパラメーターが与えられる。よって、例えば、２ つの異なる蛍光マーカーで標識された細胞からは、２個、３個、あるいは４個の パラメーターが得られ（そして記録され）つる。

フローサイトメトリーでは、さらに、コンピューターのような、データの取得、 分析、記録手段を含み、細胞が検知領域を通り抜ける時に放射する光線散乱と蛍 光光線を検知した各ＰＭＴからのデータを複数のデータチャンネルに記録する。

この分析システムは、各細胞を一組のデジタル化されたパラメーターで表すこと によって、細胞を分析し、計算することを目的とする。一般的には、最新の分析 法では、実時間で収集された（または、後の分析のために記録された）データは 、見やすいように２次元にプロットされる。このようなプロットは、”　ドツト プロット“と呼ばれる。白血球について記録した光線散乱データを示した典型的 なドツトプロットの例は米国特許第４，９８７．０８６号の図１に示されている 。前進光線散乱値に対して直交光線散乱値をプロットすることで、血液から分離 された白血球の集団中の顆粒性白血球、単球、リンパ球を区別することができる 。例えば、光線散乱を用いて電子工学的に（または手動で）リンパ球のみをゲー トによって制御し、異なる放射波長の蛍光色素で標識された適当なモノクローナ ル抗体を用いることによって、さらにリンパ球の集団中の異なる細胞を区別する ことができる（例えば、Ｔヘルパー細胞とＴ細胞障害性細胞）。米国特許第４． 　７２７゜０２０号、第４，７０４，８９１号、第４．５９９，３０７号モして 東４，９８７．０８６号には、フローサイトメトリーを構成する様々な構成要素 の組み合わせ方、使用の一般的原理、そして血液試料中の細胞集団を識別するた めに細胞をゲートによって制御する取り組み方の１つが開示されている。

特に興味深いのは、ＡＩＤＳを引き起こすウィルス、ＨＩＶが感染した患者由来 の細胞の分析である。■ＩＶ感染およびＡＩＤＳにＣＤ４”　７９２８球が重要 な役割を果たしているのはよく知られている。例えば、感染者由来の血液試料中 のＣＤ４”　７９２８球の数を数えることによって病気の進行具合の示唆が得ら れる。ＣＤ４”　７９２８球の数が４００／ｍａ＋’以下の細胞は、患者が血清 陽性の状態からＡＩＤＳに進行していることを示している。ＣＤ４”　７９２８ 球に加え、ＣＤ８０Ｔリンパ球を数え、ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の割合を比較す ることも　ＡＩＤＳを理解するために用いられている。

どちらの場合も、血液試料は患者から得られる。ＣＤ３　（全Ｔリンノ々球に対 するマーカー）、ＣＤ４、そしてＣＤ８に対するモノクローナル抗体は、蛍光色 素によって直接あるいは間接的に標識される。これらの色素はお互い区別できる 異なる放射スペクトルを持つ。（このような色素の例は、米国特許第４，７４５ ．２８５号の実施例１に示されている。）次に、標識された細胞はフローサイト メトリー分析されデータが記録される。データの分析は即時に行われるか、また は後に分析するためにリストモードで保存される。

２次元で分析されたデータは分離した細胞の集団を与える場合もあるが、ドツト プロットが複数の集団を投影することがしばしばある。その結果、集団が明らか に重なる領域に存する細胞を区別するのが難しいことがある。そのような場合、 細胞を誤って異なる集団に分類し、そして、集団に属する細胞の数及び割合が不 正確になる。例えば、ＨＩＶ感染患者由来の血液において、誤つて過剰にＴ細胞 をＣＤ４”の集団に分類すると、臨床医は患者はＡＩＤＳがまだ進行していない ものと信じ、よって、与えられるべき治療が施されないことになる。白血病のよ うな癌では、治療後に骨髄中に癌細胞が残るようなこともあるかもしれない。こ れらの残余細胞は非常に低い確率で存在するので（すなわち、存在が稀なので、 大きな試料中では２稀な事象“として出現する）、それらを検知し、分類するこ とは困難ではあるが重要なことである。

最新のデータ分析法でも細胞の集団を区別するのに十分な方法は得られておらず 、それゆえ、細胞をより正確に識別し、さらに、あるいは、異なる集団に分類す ることができない。さらに、これらの方法では、技術者による準備処置が適切に なされているかどうかを判断することは不可能である（例えば、不正確な染色技 術によって非特異的に染色されたり、不正確なビベ、ノテイングによって不正確 な量の試薬、および／または試料が用いられたりする）。最後に、大部分の方法 は血液あるいは赤血球を溶解した血液中の単核の試料に対してはうま＜ＣＸ＜が 、赤血球が溶解されていない血液にたいしては、試料中に赤血球と残骸物が多量 に存在するためあまりうまくいかない。

発明の概要 ここに“重カアトラクターエンジグ　（グラビテーショナル・アトラフター・エ ンジン）として開示されている自動集団分類法は、サイトメーターの光収集手段 などの一群の感知器から得られたマルチパラメーターの事象を自動的に割り当て て分類することの必要性に取り組んでいる。この方法は、リストモードフォーマ ットあるいはデータベースフォーマットとして既に記録されている７１１升（ラ メ−ター事象の再分類においても有効である。ＡＩＤＳ患者由来の血液試料にお も１重カアトラクターは、固定された大きさ、形、方向の幾何学的境界面からな るが、但しその位置は変化することができ、マルチ／＜ラメ−ター事象の集団を 囲むために、コンピューターエンジンによって上記境界面を最適に位置させるよ う１こすることができる。識別され、および／または、選別されるべき１つの集 団あたり１つのアトラフターを使用することが要点であるが、同一の流れのデー タあるいは記録データ中の複数の集団に属する事象を分類するために、複数のア トラフターを同時に使用することができる。データの流れの中の事象の分類１ま 次の２つの過程から構成される　第一の過程（前分析過程）では、分類しようと してＬ）るデータ集団の統計的重心に、各アトラクターメンノく−の境界面の中 心カベ正確に位置するように、データの流れを分析する。あらかじめ決めておい た数の事象カベ分析し終えるか、あるいは、アトラフターの位１が著しく外れた 場合、前分析を終了する。第二の過程（分類過程）では、各アトラフターメンｌ く−の境界はその位置に固定され、入力されるデータ事象が分類のためのメンノ く−の境界に含まれるか否かをテストする。

重カアトラクターエンジンの主な利点は次に記載する点である。１）分類の過程 で事象のりストモード記録を必要としない（すなわち、データを即時に分析でき る）。２）機器の使用、試料調製、試料に内在するばらつきなどが任意に組合わ さることによって生じるデータ集団の中心が試料間によって変動することに対応 し得る分類法を提供する。３）複数の逃げた集団（ミッシング・クラスター）の 場合に安定性を示し、集団が存在すると期待される位置の近傍において、絶対的 零個の集団中の粒子まで数えることができる。４）データの流れのサンプリング 中にも、集団のベクトル平均とメンバーのカウント数を知ることができ、時間の かかる稀な事象の分析においても継続的な過程の質の保証（ＰＱＡ）がされる。

重カアトラクターエンジンを拡張応用することによってさらに有効性が増大する 。１）超球面状境界面の選択された軸を延長することによって葉巻型のアトラフ ターが得られる。２）前分析において重力相互作用による事象をゲートによって 制御するために用いられる境界面は、分類の際に用いる境界のメンノく−と異な る形と大きさを持つことができる。３）事象を分類するのに用いられる／くラメ −ターは、異なるアトラフターに対しては異なるものを用いることができるので 、滲みを生じさせるパラメーターを無視して、様々の程度の次元崩壊にお（１て もデータを分析することが可能になる。

重カアトラクターエンジンの第一の利点は、正確で効率的な自動集団化を可能に したことである。すなわち、ゲートで制御する幾何学的構造を、目的の集団の位 置の標準偏差に調製するのに人間の判断を必要とする手動集団化法に取って換わ ることができるのである。比較すると、閾値型の分離装置を位置づけるため１こ ヒストグラムカーブ分析を利用する従来の手動集団化法では、逃げた集団（特に 複数の集団）を取り扱うのに心もとない。

葉巻型のアトラフターエンジンは、部分的に相関する（すなわち、未補正の）事 象に起因する対角線状に伸びた集団を分類するのに有効である。これ６二対して 、−次元ヒストグラム分析を使用する従来の方法では補正されてＬＸなＬ）集団 １；対してはうまく行かない。なぜなら、１次元ヒストグラムでは過多の曲線空 間を必要とするからである。アトラフターは、任意のＮ次元空間中で定義できる ので、追加のパラメーターを加えることによって、コンピューターの複雑さを増 加させることな（重なった集団を是正することができる。データの流れに沿った 相互作用と共に、アトラフターエンジンの計算法の単純さと著しく並列化された 性質によって、高い確率の事象のマルチパラメーターデータの流れについて実時 間で分類を行うのに、この自動分類法は理想的である。データ分析を行うのにリ ストモード記録を覚えなければならない従来の方法と比較して、アトラフターエ ンジンの記憶量は少なくてすみ、試料のデータの流れの長さとも無関係なので、 数百刃の事象を対象とするような分析を日常的に実行することが可能となる。こ のような細胞診断のメガ分析における顕著な利点としては、正常な細胞百万個に 対し病気の細胞が１個しか存在しないような限界においても（すなわち稀少事象 分析）それを検知することができるので、早期発見、およびより穏やかな治療が 可能となる点である。

図面の簡単な説明 図１は、前分析を行う前において、多次元空間中の設定位置に存在している多次 元アトラフターを２つ示す（１つは球形、もう１つは葉巻型）。図１ではこのよ うな２つの分散プロットの投影（５，６）が描いてあり、球面アトラフターの重 心（１）、半径（２）、そして軌跡帯（７）、葉巻型アトラフターの中心線（３ ）、半径（４）そして軌跡帯（８）が示されている。

図２は、分類過程において、図１と同じ分散プロットの投影によって、同じ２つ のアトラフターを多次元空間の存在中心に示している。

図３は、一連のカラー２次元ドツトプロットで、異なる蛍光で標識されたモノク ローナル抗体を加えた赤血球から得られたりストモードのデータについてＳＦＣ 対ＳＣＣ（Ａ）　、ＦＩＴＣ蛍光の対数対ＰＥ蛍光の対数（Ｂ）、そしてＦＩＴ Ｃ蛍光の対数対ＰｅｒＣｐ蛍光の対数（Ｃ）を示したものである。３つの重カア Ｉ・ラフターと、自動集団化を行う前に各々が適当に分散している位置が示され ている。青色のドツトと境界線はＮＫ細胞のアトラフターを、赤色のドツトと境 界線はＢリンパ球を、緑色のドツトと境界線は、１９２３球を示す。

図４は、図３で示した２次元カラートッドプロットの分析後に自動集団化された 集団とアトラフターの最終位置を示す。灰色のドツトは試料中の集団化されなか った事象（単球、顆粒性白血球、残骸物など）を示す。

図５は、ＰＨの対数をＦ’Ｅ／Ｃｙ５蛍光で表した２つのドツトプロットで、Ａ ＩＩ）Ｓ患者由来の溶解していない血液試料を３つの集団に自動集団化したもの である。血液には、蛍光標識したマイクロビーズと蛍光標識した（Ａ）抗ＣＯ３ 及び抗ＣＩ＋４モノクローナル抗体、または（Ｂ）抗ＣＤ３及び抗ＣＤ８モノク ローナル抗体をあらかじめわかっている量だけ含んでいる溶液を加えである。

図６は、図５で示したドツトプロットと同様であるが、健常な個体から採取した 血液であるが、この試料はＰＱＡで拒絶された。

発明の詳細な説明 重カアトラクター（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ　ａｔｔｒａｃｔｏｒ）は小さ なコンピューター”エンジン“である。まず、これは、分析する試料のタイプに あわせて使用者が設定した、または目的とする集団の形、大きさ、そしておおよ その位置を定義するために固定された、１つまたはそれ以上の幾何学的パラメー ターを有している。さらに、このエンジンは、分析されるデータの流れにおける 集団の真の重心の位置を定め、続いて入力されるデータの流れのなかでアトラフ ターの幾何学的メンバー属性を満たす事象を分類するという方法を構成する。多 次元空間において期待されるアトラフターの位置の近傍において、事象の集積に よる重力的な作用の下で、アトラフターが重力に落下していくことによって、デ ータの集団を囲むアトラフターの最適な位置が決定されることから、“重力”と いう用語は適切である。”アトラフター゛という用語は動的システムの理論（ｄ ｙｎａｍｉｃａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｔｈｅｏｒｙ）から引用したもので、多数 の初期状態のベクトルが動き、共通の平衡化された最終状態のベクトルに収束し ていくシステムの様子を示したものである。この場合、状態ベクトルは、境界が 初期の設定された位置からデータ集団の真の重心における平衡に達するまで移動 するにつれて変動する幾何学的境界面（具体的には、その内部に固定された参照 点）におけるベクトルの一時的な位置を表している。

下記に示す重カアトラクターは幾何学のメンバーの最も単純なケース、超球面を 表している。球面アトラフターのエンジンは下に示すような固定要素と変動要素 を含む： 固定要素：Ｓ　設定値（シード）、すなわち、集団の期待されるおおよその位置 を表す超球面上の設定された初期の中心ベクトルｒ　超球面の半径 変動要素：Ｃ超球面上の現在の中心ベクトルｎ　現在のデータの流れの中で、現 時点までに重力的に相互作用した事象の数 データの流れが始まる前に、目的とする集団の固定要素、すなわち、設定位置Ｓ と半径ｒを初めに指定しておく。Ｓとｒの指定は、２次元投影スキャッタープロ ットにおける集団の投影を観察することによって行われる。Ｓは２次元境界設定 装置を用いて１度に２個の座標を指定し、ｒは境界設定装置上に満足な値が現れ るまで“導き出される”。

データの流れにやってくる事象は、種々の個数のマルチパラメーター事象ｅ１か ら構成される。ｉは流れ中の事象の番号（または順番）を示し、ｅはある事象の 複数パラメーター値のベクトルを示す。データの流れの分析の前に、Ｃは設定位 置Ｓに初期化される。

データの流れのアトラフターによる自動集団化は２つの過程から構成される。

第一の過程、前分析過程では、分類しようとしているデータ集団の統計的重心の あたりに、アトラフターのメンバーの帰属境界面を正確にセンタリングするため に、データの流れを分析する。前分析過程において、第一の事象そしてそれに続 く各事象が入力されると、球面アトラフターは各事象のベクトルをＣを原点とす る自身のローカル座標系に変換する。

ローカルｅ＋＝ｅ＋　Ｃ（ローカル座標系への変換）次に、アトラフターはロー カルｅ、がＣに引き付けられるために充分短いかどうか（ｅ、がＣの充分近傍に 存在するかどうか）を判断する。この相互作用をゲート制御する属性、ｇはロー カルｅ、のベクトルの長さがｒより短ければ肯定的に評価する。

ｇ（ローカルｅ１）＝長さくローカルｅ＋）＜ｒもし、上記の近似値テストに合 格すれば、ｅｌはＣに引き付けられる増加分となる（すなわち、重心計算に参入 する）ことが許される。単一集団（それがなければデータスペースが空になって しまうような場合）の重心は、単純に全てのＮ事象のベクトル、ｅ、のベクトル 平均としてめられる。

Ｃ＝Σｅ＋／Ｎ　（単一集団の重心） 多集団の分類では、各集団がそれぞれ相互作用ゲート制御する関数、ｇを適用し 、その重心計算において空間の他の場所の高密度地帯（デンシティ−ポケット） の影響をうけることを防いでいる。

Ｃ；Σｅ＋＊ｇ　（ローカルｅ、）／ＮＮ各相佳作用対して連続的にＣを校正す るのではな（（逃げた集団の場合、不安定性を被りやすい非効率的な処理である ）、アトラフターの重心Ｃは、指定された相互作用総計時（即ち、Ｓｌ、ｓ２． 　ｓ３・・・Ｓ＋ａ）において、定められたスケジュールに従って校正される。

このために、アトラフターは、相互作用する事象のベクトルすべての積算ベクト ル総計、シグマを保持している。前分析過程の開始にあたり、シグマとｎの値は Ｏに合わせられる。前分析過程において、前述のゲート制御属性を満たす事象の ベクトルが入力されると、ベクトルの加算によってシグマに累積され、相互作用 総計ｎも増加する。

ｓｉｇｍａ　＝　ｓｆｇｗａ　＋　ｅ　Ｉ（各事象相互作用の効果）ｎ＝ｎ＋１ そして、ｎが指定された校正時点の１つである場合は（例えばＳｌ）、重心が校 正される。

ｃ　＝　ｓｉｇｍａ　／　ｎ　（重心校正の効果）従って、Ｃの新しい値は、積 算ベクトル総計（シグマ）のスカラーをｎで割った値である。各校正が終了した 時点で、Ｃはそれまでにアトラフターと相互作用したすべての事象のベクトルの 平均値を有している。この新しいＣの値は、その前の値よりもより多くのデータ の量の重みを有しており、次の校正時点まで続く相互作用のゲート制御を支配す る。

初めの設定値、Ｓは算出を開始するための重心のデフォルト値として機能する。

これは期待される集団の位置について可能な情報を最もよく反映しなければなら ない。ゲート制御されたベクトル総計が実際のデータをいくつか（例えば５１ｇ ５０）累積すると、相互作用のゲート制御を固定するために最も適当な中心値と して算出されたＣがＳと交代する。

ローカルｅＩ＝ｅ・−〇　（算出されたぁがＳと交代）Ｃの校正スケジュールは 、回数を重ねるにつれて正確さを増大させる目的のみ機能している。第一のアト ラフター校正時点、ｓｌは「慣性力の限界」と呼ばれる。この限界を越えること が必要なのは、固定値Ｓと交代するときに脱線していないことを確実にするため である。ある一つの集団が少数の事象にまで縮小してしまい、重心の校正がゲー ト制御される最初の事象で校正され、そしてその事象がゲート制御で内部に取り 入れられた場合、校正されたゲートは設定位！からある距離ｒだけ離れた位置に 移動し、続いて入力された中心に近い事象を排除してしまうおそれがでてくる。

従って、もし、「慣性力の限界」が乗り越えられなければ、位置的な校正はなさ れない（即ち、設定値Ｓが集団のメンバー幾何学におけるデフォルトの位置を指 定する）。従って、密度模様が全く設定できないくらいまで縮小してしまうた集 団は、発見されると予想される点を中心にデフォルト値に基づいてゲート制御さ れる。

もし、「慣性力の限界」が乗り越えられれば、アトラフターは重心に引き付けら れる。周期的な重心校正（例えば、５０個の相互作用毎）によってアトラフター は収束値に近づくが、さらに効果的な校正スケジュールによって、相互作用の平 方根の逆数に比例して残存しているエラーが消滅するという統計学的法則が観測 される。それゆえ、放射状に増加する校正スケジュール（例えば、ｓｌ　＝　１ ００、ｓ２　＝　４００、Ｓ３・９００、ｓ４　＝　１６００．　、　、　）に よって各校正毎に統計学的に有意な重心の補正が施されるが、これに対して、周 期的な校正を施す場合は、同じ最終結果を得るまでにより振動する道程を通らな ければならない。

相互作用の数が最終スケジュール校正時点（アトラフターの相互作用規定量）と して定められた紺に到達するか、または時間で定められた全事象の取得による包 括的な終了指令が起こるかにより、１つのアトラフターに対する前分析過程が終 了する。複数のアトラフターが前分析過程のデータの流れと相互作用する場合、 自身のアトラフターの相互作用規定量に達してしまったアトラフターは、他の全 てのアトラフターが規定量に達するか、あるいは、包括的な終了指令が起こるま で休止している。もし、前分析過程が包括的な終了指令によって終了した場合、 相互作用規定量には達していないが「慣性力の限界」は越えている各アトラフタ ーには最終の重心校正を施して、それ以前の最後の校正以後に蓄積された事象の 相互作用が重心の最終値Ｃに含まれているようにする。相互作用規定量を満たす ことによって各データの流れの試料中の目的とする充分な数の集団によって終了 することを常に保証できる理論的な保証がない限り、時間あるいは取得した全事 象の機能として包括的な終了を指令することは、データの流れの前分析の過程の 終了を保証するために必要である。

アトラフターに基づいた自動集団化は２段階の過程からなる。東二の過程、”分 類”では各アトラフターの超球面メンバー境界は、前分析過程の最後の重心校正 が終了した後に固定された重心Ｃ（または、一度も校正が施されない場合はＳ） の位置に固定される。前分析されたものと同一のデータの流れの継続として続い て入力される各事象について、分類のための各メンバー境界内に含まれるか否か をそれぞれ判断し、含まれると判断される毎にメンバー総計が増加する。同一の 事象に対して複数の分類と算出がなされるのは不自然で望ましくないならば、１ つの事象については１つのアトラフターのみで分類し算出することを保証するた めの競合解決メカニズムを用意することことができる。１つの直接的な解決法と しては、競合している分類について優先順位をつける方法、もう１つの方法とし ては、最も近いユークリッド近似性を示すものをメンバーとして認める方法が挙 げられる。優先順位付けする分類の顕著な利点は、もつと幾何学的複雑さを有し 、もっと複雑に重なり合うことのできるアトラフターにまで容易に拡張できるこ とである。このため、この方法は実際にも利用されている。

分類過程の途中において、各アトラフターによってそれまでに累積されたメンバ ーの総計は、分析を終了するのに充分な数の目的の事象がどれくらいで算入し終 えるのか判断するのに利用することができる。これらの増加分の総計を、例えば 逃げた集団の早期発見に利用し、これは試料調製の不備を示すので分析を中断す るといったことも可能にするかもしれない。

分類の中断は、全てのアトラフターがメンバー規定量に達するか、時間または全 取得事象による分類段階中の包括的な終了指令が生じることによって、引き起こ される。

分類中または分類後、各アトラフターはその集団個体群の総計と重心（位置）ベ クトルを含むので、データ分析にさらなる利点をもたらす。これらの利点の中に は質保証メカニズムがあり、これによって使用者は、受容できるデーターの流れ かそれとも正常値を逸したものかを判断することができ、後者を自動的に排除で きる。

“最小限期待される集団中の個体数”　（メンバー総計あるいはその関数として 各集団について定められる星障望）は、分類過程中あるいはその終了後の実際の メンバー総計（またはその関数）と比較される。予想外に少数の個体数であるこ とを明示する各集団については、エラー表示または警告が出される。このタイプ のＰＱＡの利点は、重カアトラクター分類法独特の逃げた集団の安定性に起因す る（すなわち、アトラフターは、集団が存在すると期待される場所の近傍に生じ た事象に対しては、絶対的ゼロまで正確に算入するであろう）。目的とする各集 団について最小限の個体数が入力されているかどうかチェックすることによって 、機器、試料調製さらに目的とする個体（群）が存在しないかのように表示され る試料に内在する異常形などについて、自動集団化システム全体が絶えず警戒を 怠らないようにしている。

第２の利点は、各アトラフターがその初期設定位！から移動できる距離の”拘束 限界″を定めることができる点である。拘束限界距離（理論的に定められ、多次 元のスカラー距離として表現される）は、Ｃの開始設定位置からの実際の移動距 離と比較され、拘束限界距離を越えていないかどうかが決定される。越えてしま った場合はエラー表示または警告が発生し、集団が予測された位置から離れすぎ た位置に存在することを示す。各標的集団について実際の集団（ベクトル平均） の位置が予測された集団の位置の近傍かどうか調べることによって、機器、試料 調製、さらに集団の多次元における位置の不自然なズレとして表現される試料に 内在する異常形などについて、自動集団化システム全体が絶えず警戒を怠らない ようにしている。

池の分類法も個体群ベクトル平均を用いる（そして、理論的に予測される位置と の近似性を比較する）ことができるが、アトラフター法は、リストモード法を必 ずしも要求しないという利点がある。前分析過程でアトラフターがその位置を移 動する毎に限界値の拘束がチェックされるので、データーの流れを継続したまま 集団の位置の異常を早く検出することが実用的になり、それゆえＰＱＡによって 排除されるべき異常を検索し終えるまで待っているのではなく、あらかじめ、時 間のかかるメガ分析を中断することができる。

第３の利点は、十分に形成された集団は中空の領域に囲まれた事象の密度の濃い 領域から構成されるという点である。あまり十分に形成されていない集団に関し て適切にメンバーを定め分類するために、集団のメンバー境界の周囲に軌跡帯を 配置することができる。軌跡帯の目的は、境界からあまりに外れてしまった集団 の動き、集団の予想外の形の変化、および予想より大きなノイズに対して防御す ることにある。このような状態のうちのどれかあるいは全てが生じてしまった場 合、軌跡帯中に位置する多数の事象（オービタ−）はデータが受容できないもの であることを指示するであろう。一般に、ある集団についての１０個の事象のう ち３％以下しか軌跡帯に存在してはならない。

図１を参照すると、球面アトラフターに対する重心（１）、半径（２）、および 軌跡帯（３）が示されている。軌跡帯の厚みは任意である。薄いバンドは濃密な バンドよりもオービタ−の包有数が少ないと考えられる。図２は、分類中の全て の要素の動きを示している。

超球面アトラフターの限界（即ち、超球面アトラフターは多数の多次元データ集 団の引き伸ばされた形にはあまり適当でない）は、ゲート制御（または、境界面 ）幾何学の修飾によって解決できる。重心計算を他の集団の事象の影響から防御 する相互作用ゲート制御機能、ｇを各々適用するというアトラフターの特徴によ って、実際の集団の形に非常に近いゲート制御幾何学を展開することができる。

より適当な境界を適用することによって、決まったサイズのデータスペースの中 でより多くの集団数を標的とすることができる。

球面アトラフターを伸長して適合させるためには、重心ベクトルＣを２つの終点 ベクトルｅｌとｅ２の間の多次元空間中の直線成分に置き換える。２つの終点を 結ぶラインはアトラフターの”中心線”と呼ばれる。事象の近接性を単一の中心 点からの距離で算出するのではなく、拡張によって、中心線上の最近傍点からの 距離で算出する。中心線から等距離にある点の位置は、曲線的な両端を有する超 シリンダー状の境界面を形成する。三次元空間では、この立体は葉巻型の形をし ている。

葉巻型アトラフターの半径ｃｒは、葉巻型のシリンダーの半径および末端部（エ ンドキャップ）の曲率半径を指定する。

中心線の中間点ｍｐは葉巻の中心で、葉巻の部分座標系の原点となっている。

葉巻型アトラフターの幾何学的構成要素で球面アトラフターのものと異なるもの を下記に示す： 固定要素二設定中心線＝　［ｅｌｓ、ｅｚｓ］　集団の予想されるおおよその位 置と方向を表す葉巻型の初期中心線 に設定される両末端 ｃｒ　葉巻型のシリンダーとエンドキャップの半径変動要素：中心線＝　［ｅ＋ 、ｅ２］　現在の両末端ｍｐ　現在の中心線の中間点 事象ｅ、に対する葉巻型アトラフターの相互作用ゲート制御開数ｇ（ｅ、）は以 下のように定める： ｇ　（ｅ＋）　＝ｄｉｓｔａｎｃｅ　（ｅ　＋、　ｃｅｎｔｅｒｌｉｎｅ）　＜ 　ｒこの距離関数はまず始めに、中心線上でｅｌに一番近い点ｐを捜す（ｅｌの 中心線上への投影）。ｐが中心線の端から外れてしまう場合は、中心線の近い方 の末端までの距離を算出するが、そうでなければｐとｅｌの距離を用いる。

葉巻型アトラフターが前分析過程において位置の校正を始めた時、新しい中間点 ｍｐは、それまでに相互作用した全ての事象のゲート制御されたベクトルの平均 値を有する。中心線の両端は部分座標系においても固定された値を保持するので 、ｍｐに適用されたのと同じベクトル差を受け取り、従って、中心線はその中心 点に対する重力事象の総合力によって引かれて固定された構造のまま移動する。

分類過程において適用される葉巻型ゲート制御関数は、上記のｇ（ｅ＋）と同様 である。

近接関数および中心線の校正は、葉巻型アトラフターが球面アトラフターと異な る唯一の点である。その他の機能は全て同一である。葉巻型アトラフターの第１ の利点は、相関関係を有するマルチパラメーター集団を取り扱うことができる点 である。同一の感受性を有する２つのセンサーチャネルに同一のシグナルが与え られた場合、その二次元事象ベクトルは全て等式（Ｘ＝Ｙ）で表された対角線上 に配置される。２つのセンサーチャネルの感受性が一部重なっており、互いに相 関関係の無いシグナルが入力された場合は、偶発的なチャンネル混線により接合 分布は対角線に近い形の広がりを示すであろう（非補正データ）。電気的補正（ 混線要素からの除去）は、センサーチャネルと混線相互作用の数が増加するほど 困難になる。この発明で使用するために実施したもっと実際的なアプローチは、 多次元空間中の集団のベクトルの主方向に向いている葉巻型アトラフターを適用 し、生の補正していない事象ベクトルを直接集団化することである。中心線の両 端の指定は、集団を二次元投影スキャッタープロットへ投影し、二次元位置探索 装置を用いた際に末端の２つの座標が同時に適合するようにして行われる。ｃｒ の指定は、満足のいく値を二次元位置探索装置に引き出して行われる。

図１を参照すると、葉巻型アトラフターに対する中心（３）、半径（４）および 軌跡帯が示されている。図２は、分類過程中のこれらの要素の動きを示している 。

伸びた形の集団に（葉巻型よりも）適合していて少し異なる図形に楕円形がある 。ここに述べられているアトラフターに楕円形の境界面が付随しているものを楕 円形アトラフターと呼ぶことにする。

楕円形の方向軸はその２つの中心ベクトルｆ、とｆ２によって定められる。事象 の近似値はこの２つの中心からの２つのユークリッド距離の合計で算出され、楕 円半径ｅｒは事象を算入するためのこの合計の上限を指定する。

事象ｅ１に対する楕円型アトラフター相互作用ゲート制御機能ｇ（ｅ、）は以下 のように定められる： ｇ（ｅυ＝ｄｉｓｔａｎｃｅ　（ｅ＋、ｆｌ）’＋ｄｉｓｔａｎｃｅ　（ｅ＋、 ｆ２）　＜ｅ　ｒ方向軸の中間点ｍｐは楕円形の中心で、その部分座標系の原点 となっている。

主要軸とゲート制御機能の指定のみが、楕円型アトラフターが葉巻型アトラフタ ーと異なる２点である。葉巻型アトラフターの場合と同様に、中心点に適用され る位置的デルタは、楕円形が方向、大きさおよび形を保てるように各点に適用す アトラフター分類幾何学の目的は、標的とする集団の事象の雲がその重心に散開 している時にそれを適当に囲むことにある。その相互作用幾何学の目的は、アト ラフターが集団を発見できるであろう（そして他のものはほとんど発見しないで あろう）”検索領域“を指定することにある。これらの２つの幾何学は異なる目 的のために機能するので、ある場合には相互作用と分類に役立つ幾何学をカスタ マイズすることが有利である。

球面アトラフターは、“相互作用半径”と異なる“メンバー半径“を適用する可 能性がある。アトラフターの相互作用とメンバー境界を指定するのに他の幾何学 を導入することもできる（すなわち、正方形、方形、斜方形、楕円あるいはマウ スで任意に描いた領域）。一般には、標的とする集団の実際の大きさ、形に近い 集団メンバー境界が選択される。アトラフター相互作用境界は、１）重心が見つ かるような検索領域を定め、２）隣接する集団から可能性のある相互作用を除く ようにして選択される。

アトラフターは、入力されるパラメーターの組に対して定められる。各個体群を 集団化するのにもし有用であるならば、入力されるパラメーターの異なる組に対 しては、真なるアトラフターを指定してもよい。入力される事象のベクトルのパ ラメーターのうちどれを算入しどれを算入しないかを示すために、各アトラフタ ー中にマスク、Ｍまたは二者択一のスイッチが用意されている。アトラフターエ ンジンはどのようなＮ次元空間にも指定できるので、単にＭを指定するという要 求を越える装飾を要することなくいくつかのパラメーターの組に指定できる。

アトラフターエンジンの基本になるベクトル操作は、マスクによって阻止された パラメーターを完全に透明な状態であたかも存在しないかのように取り扱う等の 方法で行われる。パラメーターマスクの利点としては、１）最も明確な集団の限 定を可能にするパラメーターの組で、集団のデータを指定することができる点、 ２）明確なはずの集団を不鮮明にしてしまうパラメーターを無視することができ る点、モして３）様々な段階の次元崩壊における分類を可能にする点、が挙げら れる。最後の利点を得るには、１つの事象を多数のアトラフターによって分類さ れることが要求されている。

図３および４を参照すると、成人健常者の志願者の末梢血液をＥＤＴＡを含んだ 真空の血液収集管に採取した。赤血球は、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＩＩＩＣＯ、およびＥ ＤＴＡを含む溶解液中で溶解した。溶解した細胞は遠心して落とした後、取り除 いた。

残った細胞をＰＢＳを含む試験管に移した。この試験管に順番に、Ｌｅｕ　４　 ＦＩＴＣ（抗ＣＤ３　；　ＢＤＩＳ）、Ｌｅｕ　１１　＋　１９　ＰＥ　（抗Ｃ Ｄ１６．　ＣＤ５６　；　ＢＤＩＳ）　、およびＬｅｕ　１２　Ｐｅ窒bｐ （抗ＣＤ１９　；　ＢＤＩＳ）を加えた。これらの抗体はそれぞれ１９２８球、 ＮＫ細胞および８９２８球を標識する。インキュベーションした後、洗浄した細 胞をコンソートＦＡＣ３ｃａｎ　リサーチ　ソフトウェア（ＢＤＩＳ　）を備え たＦＡＣ３ｃａｎブランドフローサイトメーター（、ＢＤＩＳ　）にかけた。デ ータの入力、保存はりストモードで行われた。１５．０００の事象を記録した。

図３を参照すると、各個体群のアトラフターの設定位置Ｓ、および半径ｒまたは ｃｒは、公知の発表されたデータに基づき、分析の前に決定した。８９２８球に は球面アトラフターを適用し、ＮＫ細胞および１９２８球には葉巻型アトラフタ ーを利用した。散乱値（Ａ）　、ＰＥ対ＦＩＴＣ蛍光（Ｂ）およびＰｅｒＣｐ対 ＦＩＴＣ蛍光（Ｃ）をめるためにデータを分析した際、各個体群の予想される位 置を示すために、各アトラフターがマウスで描かれた。ドツトプロット上に挿入 されている灰色のドツトは、集合を形成していない事象を表している。（他の態 様では、即時の分析においてもリストモードの分析においても、このような集合 を形成していない事象は示す必要がないことは理解されよう。）図４を参照する と、記録された事象が全て分析された分類の結果が示されている。ＦＳＣ，５Ｓ ＣＳＰＥ蛍光の対数、ＦＩＴＣ蛍光の対数およびＰｅｒＣＰ蛍光の対数のパラメ ーターが算出され、各事象ベクトルに組み込まれている。８９２８球については 、７５７の細胞（または集団化された全ての事象のおよそ１９％）が、この集団 に含まれていた。１９２８球については、２５９６の細胞（または集団化された 全ての事象のおよそ６６％）が、この集団に含まれていた：そして、５８７の事 象がＮＫ細胞の集団に含まれていた。すべてのアトラフターに対するデータ分析 が同時に行われたことは注目に値する。図４は、分析後の各アトラフターの二次 元投影を示す。

図５および６を参照すると、ＡＩＤＳ患者（図５）と成人健常者の志願者の血液 を、ＥＤＴＡを含んだ真空の血液収集管に採取した。各試料を三等分した。それ ぞれについて、５０．０００個の蛍光マイクロビーズ、滴定濃度の抗体、それに 緩衝液を併せて４００μｌにした混合物を用意した。一方の部谷試料に対する抗 体は、Ｌｅｕ４ＰＥ／ＣＹ５とＬｅｕ　３ａ　ＰＥから構成された。（Ｃｙ５は Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅａｓから購入した。） 他方の部分試料に対する抗体は、Ｌｅｕ　４　ＰＥ／Ｃｙ５とＬｅｕ２ａ　ＰＥ から構成された。（Ｌｅｕ　２ａは、抗ＣＤ８モノクローナル抗体で、ＢＤＩＳ から入手可能である。）各混合物に５０μｌの血液を加えた。各部分試料を３０ 分間インキュベートし、ポルテックスした後、ＦＡＣＳカウント　ブランドフロ ーサイトメーターにかけた。データの入力、保存はリストモードで行った。大部 分の赤血球細胞は除けるようにＰＥ／Ｃｙ５チャネルに蛍光限界を設けたが、限 界はＣＤ４−とＣＤ８“アトラフターの予想される端の値よりはずっと左に外れ るようにした。

ビーズ、ＣＤ４−とＣＤ４”あるいはＣＤ８−とＣＤ８″″の集団に対しては、 楕円型アトラフターを適用した。ＣＤ８細胞の分析過程で生じる問題の一つに、 ＣＤ８細胞はＣＤ４細胞と異なり陽性と陰性の集団にはっきりと区別できるよう に分化しないということがある。少数のＣＤ８細胞の集団は″かすんで”見える 。これらのかすんだ細胞はＣＤ８“細胞であり、もし絶対的な正確さを期すなら ば真人に含めなければならない。

この問題を解決するために新しい集団化法が開発された。上位の（すなわち、Ｃ Ｄ８”　）集団と下位の（すなわち、ＣＤ８−　）集団を結ぶ“バイブ”を描（ 。このバイブは、二次元プロットにおいて、片側は上位の集団境界の左端から下 位の集団の左端まで伸び、もう片側は上位の集団境界の右端から下位の集団の右 端まで伸びている。バイブの集団境界を囲んでいる軌跡の内側に存在する事象は 全て、ＣＤ８かすみ細胞（ＣＤ８”’）を含むかどうか、また、残骸物による侵 害がないかどうか、ＰＱＡによるチェックを受ける。

蛍光標識細胞の分析過程において、蛍光コントロールビーズ、および／または参 照ビーズを含む特別なケースを取り扱うために、上述したバイブ法の他にさらに 新しい方法が開発された。この場合、ビーズのベクトル平均を正確にめるために 円形の二次元ビーズビークアトラフターが用いられ、そしてその結果は、細胞個 体群集団が存在する可能性の最も高い位置を、ベクトルの一定のズレによって予 測するのに用いられる。そのねらいは、ビーズピークの位置から装置の光学系統 の変動と感度を明らかにすることである。ビーズピークのどのような変動も細胞 集団の同様の変動を示唆しているので、ビーズピークの配置のあらゆるズレは設 定位置を同様の量と方向だけ移動させる要因となる。これは、ビーズピークを確 立するために初めにビーズのみを分析する二段階過程か、または、実際の試料の データを取得する前にコントロールチューブの分析をする方法によって達成され るであろう。前者の場合、ビーズピークの確立には円形アトラフターを適用し、 分析過程では楕円型アトラフターを適用する。

図５（Ａ）および５（Ｂ）は、−人のＡＩＤＳ患者由来の血液について各集団に 含まれる集団と事象の最終位置を示している。図５（Ａ）では集団中の大半の事 象は、　ＣＤ４−またはＣＤ８−の集合の中に含まれる。ＣＤ４　”かＣＤ４− のＴリンパ細胞、あるいはビーズの集団の外に位置する事象はほとんどない。図 ５（Ｂ）では、事象はＣＤ４”細胞に類似した分布をしている：しかし、蛍光の かすみを示すＣＤ８’細胞を収得するためにバイブ領域が適用される。表１は各 集団に含まれる事象と集団化していない非赤血球細胞の数を示している。

ビーズ　６７２９　０ｒｂ、ビーズ　４　ビーズ　１７２２９　０ｒｂ、ビーズ 　１７ＣＤ４”　８７４　０ｒｂ、ＣＤ４”　５６　ＣＤ８°　５１０１　０ｒ ｂ、　ＣＤ　８　”　４２６ＣＤ４１５７９　０ｒｂ、ＣＤ４−２２３　ＣＤ８ −　１５４８　０ｒｂ、ＣＤ８−　２２７ＣＤ８””５８６　０ｒｂ、ＣＤ８’ °′″１１７このデータに基づいて、血液１μｍあたりのＣＤ４“細胞数を算出 すると１５６となった；同じ＜　ＣＤ３＋細胞数は、ＣＤ４チユーブ中で９７２ 、ＣＤ８チユーブ中で９７８であった。そして、同じ＜　ＣＤ８”細胞数は７６ ９であった。軌跡奇生（Ｏｒｂ、　）の細胞が少ないということは、集団の健全 性を表している。

図５のデータを図６のデータと比較することによって、この発明がＰＱＡを行つ ている様子がわかる。例えば、図６（Ａ）では、ＣＤ４−の集団に残骸物や赤血 球細胞が混入していることが伺えるが、図５（Ａ）では、赤血球細胞／残骸物と ＣＤ４−細胞が分離されている。この問題は表２にも現れていて、ＣＤ４−とＣ Ｄ８−に対する軌跡帯上に存在する事象の数が、集団が完全である場合に予想さ れる数よりも多くなっている。このデータから考えると、図６の試料は排除すべ きものでビーズ　９４６８　０ｒｂ、ビーズ　１　ビーズ　１７４５３　０ｒｂ 、ビーズ　１３ＣＤ４′″２５０１　０ｒｂ、ＣＤ４−　６９　ＣＤ８”　７１ ３　０ｒｂ、ＣＤ８”　８２ＣＤ４−１５１９　０ｒｂ、ＣＤ４−７６３　ＣＤ ８−　２５０１　０ｒｂ、ＣＤ８−　３４３ＣＤ８ｄｌ′″１８９　０ｒｂ、Ｃ Ｄ８”″１７３表２には、この発明のもう一つの局面が示されている。それは、 ＣＤ４チユーブでもＣＤ８　チューブでも、ＣＤ４”″の数が２５００を越える と計算を停止していることである。ＣＤ４″″の事象が２５００を越えると自動 的にＣＤ４“の窓が閉鎖してしまうようにあらかじめ装置を設定しておいたため である。ＣＤ８チユーブ中のＣＤ８−細胞についても同様である。

この明細書中に述べられている刊行物および特許出願は全て、この発明が関与す る分野における通常の知識を有する者のレベルを示唆している。それらの刊行物 および特許出願は全て、各個別刊行物または特許出願が参考文献として引用され ていることを明確にかつ個別に明示しているものとして引用されている。

請求の範囲の思想あるいは範囲を離れることなしに、この発明に多く変更および 修正を施すことができることは、この分野の通常の知識を有する者にとって明ら かである。

ＦＳＣ Ｌｅｕ４／ＦＩＴＣ Ｌｅｕ４／ＦＩＴＣ ５Ｃ Ｌｅｕ４／ＦＩＴＣ Ｌｅｕ４／ＦＩＴＣ ＣＤ３　ＰＥ／Ｃ，５ ＣＤ３　ＰＥ／Ｃｙ５ ＣＤ３　ＰＥ／Ｃ）１５ ＣＤ３　ＰＥ／Ｃｙ５

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）試料に存在すると期待される各集団に対し、自動集団化操作を行う前に 集団にメンバーを瘍属させるように、形、大きさ、方向は固定されているが位置 は固定されていない幾何学的な境界面を固定し；ｂ）各集団について適当な初期 位置と半径を設定し；ｃ）収集された各パラメーターの値からなる各被分析粒子 のベクトルを座標系に変換し； ｄ）各ベクトルの近接値がベクトルの中心地からの半径よりも短いならば、その ベクトルを加えてベクトル平均を算出し；ｅ）ベクトル平均を算出するためにあ らかじめ定めた数のベクトルをベクトル総計に加えた後、中心値をベクトル平均 として算出し；ｆ）ベクトル平均を算出するためにあらかじめ定めた数のベクト ルが加えられるまでｃ）一ｅ）の過程を繰り返し；ｇ）最後に算出された中心地 に基づき最終的な幾何学的境界面を設定し：そして ｈ）続く全ての粒子ベクトルについて最終境界面に対して内側に含まれるか外側 に位置するかを比較する； 過程から成る、粒子試料中の各粒子についてマルチパラメーターデーターを収集 し、粒子を１つあるいはそれ以上の集団に分類する自動集団化の方法。
2. ２．１つあるいはそれ以上の集団について過程ｂ）において軌跡帯を設定する請 求項１に記載の方法。
3. ３．粒子が細胞を含む請求項１に記載の方法。
4. ４．ａ）試料に存在すると期待される各集団に対し、自動集団化操作を行う前に 、集団にメンバーを帰属させるように、形、大きさ、方向は固定されているが位 置は固定されていない幾何学的境界面を設定し；ｂ）期待される各集団について 適当な初期位置、半径および軌跡を設定しｃ）分析する各細胞当たり少なくとも ２つのパラメーターを有するデーターが記録されるように、フローサイトメトリ ーを用いて細胞を分析し；ｄ）記録された各パラメーターの値から成る各被分析 細胞のベクトルを座標系に変換し； ｅ）各ベクトルの近接値がベクトルの中心地からの半径よりも短いならば、その ベクトルを加えてベクトル平均を算出し；ｆ）ベクトル平均を算出するためにあ らかじめ定めた数のベクトルをベクトル総計に加えた後、中心値をベクトル平均 として算出し；ｇ）ベクトル平均を算出するためにあらかじめ定めた数のベクト ルが加えられるまでｃ）−ｅ）の過程を繰り返し；ｈ）最後に算出された中心地 に基づき最終的な幾何学的境界面を設定し；そして ｉ）続く全ての粒子ベクトルについて最終境界面に対して内側に含まれるか外側 に位置するかを比較する； 過程から成る、フローサイトメトリー法によって各細胞に対するマルチパラメー ターを収集し、試料中の細胞を２つあるいはそれ以上の集団に分類する、血液細 胞の自動集団化法。
5. ５．集団の数が２つである請求項４に記載の方法。
6. ６．記録されるパラメーターが少なくとも２つの蛍光放射の測定値を含む請求項 ４に記載の方法。
7. ７．細胞がＴリンパ球を含む請求項４に記載の方法。
8. ８．集団が少なくともＣＤ４＋とＣＤ４−細胞並びにＣＤ８＋とＣＤ８−細胞を 含む請求項４に記載の方法。
9. ９．過程ａ）の前に、互いに識別できる放射波長を有する少なくとも１つのマー カーで細胞が標識されている請求項４に記載の方法。
10. １０．試料中の細胞が少なくとも１つの免疫蛍光マーカーで標識されている請求 項９に記載の方法。
11. １１．集団が、リンパ球、単球、顆粒性白血球、血小板および赤血球から成るグ ループから選択される請求項４に記載の方法。
12. １２．いずれかの集団が、副集団に分割される請求項１１に記載の方法。
13. １３．集団の数が少なくとも３つである請求項４に記載の方法。
14. １４．１つあるいはそれ以上の集団が、蛍光ビーズ集団を含む請求項１３に記載 の方法。
15. １５．変動に対して補正をするために、細胞の分析の前にビーズ集団を試料とし て分析する請求項１４に記載の方法。
16. １６．ＣＤ８＋とＣＤ８−の集団の間にパイプ領域を設ける請求項８に記載の方 法。
17. １７．各集団について軌跡帯を設定する請求項４に記載の方法。