CN115997115A - 用于表征流式细胞仪数据中的溢出扩散的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
提供了表征在针对第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的方法。在一些实施例中，方法包括根据数据相对于第一荧光染料的强度来划分荧光流式细胞仪数据。在实施例中，方法还包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差，以及通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数。还提供了用于表征在针对第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的系统和计算机可读介质。
Description
交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年5月6日提交的美国临时专利申请第63/020,758号和2020年9月10日提交的美国临时专利申请第63/076,611号的优先权，所述申请的公开内容通过引用全部并入本文。
前言
流式细胞术是用于表征生物材料(例如血液样本的细胞或另一种类型的生物样本或化学样本中的感兴趣的粒子)并通常对生物材料进行分选的技术。流式细胞仪通常包括用于接收流体样本(例如血液样本)的样本储存器和包含鞘液的鞘储存器。流式细胞仪将流体样本中的粒子(包括细胞)作为细胞流传输至流动池，同时也将鞘液引导至流动池。为了表征流动流的成分，流动流被光照射。流动流中材料的变化，例如形态或荧光标记的存在，可能会引起观察到的光的变化，并且这些变化允许表征和分离。例如，流体悬浮液中的粒子(例如分子、分析物结合珠或单个细胞)穿过检测区域，在该检测区域中粒子暴露于激发光(通常来自一个或更多个激光器)，并且粒子的光散射和荧光特性被测量。粒子或其成分通常用荧光染料标记以便于检测。通过使用光谱上不同的荧光染料来标记不同的粒子或成分，可以同时检测多种不同的粒子和成分。在一些实施方式中，分析仪中包括多个检测器，对于待测量的每个散射参数有一个检测器，并且对于待检测的每种不同的染料有一个或更多个检测器。例如，一些实施例包括光谱配置，其中每种染料使用多于一个传感器或检测器。获得的数据包括针对每个光散射检测器和荧光发射所测量的信号。
流式细胞仪还可以包括用于记录测量的数据和分析数据的装置。例如，可以使用连接到检测电子设备的计算机执行数据存储和分析。例如，数据能够以表格形式存储，其中每行对应于一个粒子的数据，并且列对应于每种测量的特征。使用标准文件格式(如“FCS”文件格式)存储来自粒子分析仪的数据有助于使用单独的程序和/或机器分析数据。使用当前的分析方法，数据通常以一维直方图或二维(2D)图表显示以便于可视化，但也可以使用其他方法来可视化多维数据。
使用流式细胞仪测量的参数通常包括由粒子主要沿向前方向以窄角度散射的激发波长处的光(称为前向散射(FSC))，由粒子沿与激发激光器正交的方向散射的激发光(称为侧向散射(SSC))，以及从在光谱波长范围内测量信号的一个或更多个检测器中的荧光分子发射的光或由在该特定检测器或检测器的阵列中主要检测到的荧光染料发射的光。不同的细胞类型能够通过其光散射特性和荧光发射来识别，所述荧光发射是通过用荧光染料标记的抗体或其他荧光探针标记各种细胞蛋白或其他成分而产生的。
流式细胞仪和扫描细胞仪都可从例如BD Biosciences(加利福尼亚州圣何塞)购得。流式细胞术在以下中进行了描述：例如，Landy等人(eds.),Clinical Flow Cytometry,Annals of the New York Academy of Sciences第677卷(1993)；Bauer等人(eds.),Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications,Williams&Wilkins(1993)；Ormerod(ed.),Flow Cytometry:APractical Approach,Oxford Univ.Press(1994)；Jaroszeski等人(eds.),Flow Cytometry Protocols,Methods in Molecular Biology第91号,Humana Press(1997)；以及Practical Shapiro,Flow Cytometry,第四版,Wiley-Liss(2003)；其全部通过引用并入本文.荧光成像显微镜在以下中进行了描述：例如,Pawley(ed.),Handbook of Biological Confocal Microscopy,第2版,Plenum Press(1989)，其通过引用并入本文。
在从一个或更多个检测器接收到流式细胞仪数据后，通常会对其进行数据分析处理，通过该数据分析处理，用户能够对其理解。然而，流式细胞仪数据分析通常会因溢出而变得复杂，溢出是其中指示特定荧光染料的粒子调制光被一个或更多个未被配置为测量该参数的检测器接收的现象。因此，光可能“溢出”，并被偏离目标的检测器检测到。溢出能够通过解混来校正，其中通过求解一组方程式来计算新的每种荧光染料强度值，该一组方程式通过观察到的溢出水平将荧光染料强度值与测量的检测器值相关联。当检测器数量等于未混合的荧光染料的数量时，解混通常被称为“补偿”。图1A描绘了示出常规的溢出补偿过程的流程图。在步骤101中，识别针对特定荧光染料呈阳性和阴性的荧光流式细胞仪数据的群体。在步骤102中，计算包含溢出系数的荧光溢出矩阵，溢出系数量化溢出将信号添加到荧光流式细胞仪数据的程度。在步骤103中，基于荧光溢出矩阵对荧光流式细胞仪数据进行数学调整，以补偿溢出。尽管解混可以校正每种荧光染料对每种其它荧光染料的强度贡献，但不能校正噪声贡献，即通过溢出对荧光流式细胞仪数据贡献的误差。这种噪声称为“溢出扩散”。在某些情况下，溢出扩散噪声是相长的，这会导致信号强度高于否则将观察到的信号强度，而在其他情况下，噪声是相消的，导致强度降低。
用于量化溢出扩散的常规方法涉及计算溢出扩散系数，如Nguyen等人(2013).Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance andaiding in multicolor panel design.Cytometry Part A,83(3),306-315中所描述的；其公开内容通过引用并入本文。然而，常规溢出扩散系数的一个限制在于它们需要识别对特定参数呈阳性的样本(即，从感兴趣的荧光染料发出光)的流式细胞仪数据的群体，以及对于相同参数呈阴性(即，从感兴趣的荧光染料不发出光)的流式细胞仪数据的群体。例如，图1B示出根据Nguyen等人(2013)计算溢出扩散系数所需的阳性100b群体和阴性100a群体的识别。类似地，图2描绘了用于共同执行溢出补偿和溢出扩散表征的常规工作流程。在识别荧光流式细胞仪数据的阳性群体和阴性群体(步骤101)、计算荧光溢出矩阵(步骤102)和溢出补偿(步骤103)之后，可以计算包含溢出扩散系数的溢出扩散矩阵(步骤201)。然而，与荧光溢出矩阵102的计算一样，溢出扩散矩阵的计算201需要识别阳性群体和阴性群体，这对于用户来说是通常容易出错且耗时的任务。
发明内容
因此，发明人已经意识到，需要用于在流式细胞仪数据分析中表征溢出扩散的有效的解决方案。
本发明的各方面包括用于表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的方法。在一些实施例中，方法包括接收针对第一荧光染料和第二荧光染料中的每一者而收集的流式细胞仪数据，以评估从第一荧光染料发射的光在针对第二荧光染料而收集的荧光流式细胞仪数据中导致误差的程度。在接收到流式细胞仪数据之后，该方法的实施例还包括根据数据相对于第一荧光染料的强度将荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点。该方法的实施例还包括：基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差。在实施例中，估计调零的标准偏差包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零(σ0)的假设，计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差，以及基于σ0调整从第二荧光染料发射的观察到的光的标准偏差(σ)。在实施例中，估计调零的标准偏差涉及计算第一线性回归，该第一线性回归包括计算从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根与从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的线性拟合。在实施例中，σ0取自第一线性回归中计算的线性拟合的y截距。该方法的实施例还包括通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数。在一些实施例中，计算第二线性回归涉及针对每个所划分的分位点计算调零的标准偏差与从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。在某些实施例中，溢出扩散系数取自调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间所计算的线性拟合的斜率。在实施例中，以这种方式获得的溢出扩散系数针对第一荧光染料和第二荧光染料的每个组合进行计算，即，使得源自每种荧光染料的溢出针对每种其它荧光染料进行表征，并在溢出扩散矩阵中进行组合。该方法的实施例还可以包括基于溢出扩散矩阵调整荧光流式细胞仪数据。
本发明的各方面还涉及一种系统，该系统包括被配置为获得荧光流式细胞仪数据的粒子分析仪部件，以及处理器，该处理器包括可操作地耦合到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令当被处理器执行时，使该处理器表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。在一些实施例中，该处理器被配置成接收针对第一荧光染料和第二荧光染料中的每一者收集的荧光流式细胞仪数据，以评估从第一荧光染料发射的光在针对第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中导致误差的程度。接收到数据后，处理器可以被配置为根据数据相对于第一荧光染料的强度将荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点。在实施例中，处理器还被配置成基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差。在实施例中，估计零调准标准偏差包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零(σ0)的假设，计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差；以及基于σ0调整由第二荧光染料发射的观察到的光的标准偏差(σ)。在实施例中，估计调零的标准偏差涉及计算第一线性回归，该第一线性回归包括计算从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根与从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的线性拟合。在实施例中，σ0取自第一线性回归中计算的线性拟合的y截距。处理器还可以被配置为通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数。在一些实施例中，计算第二线性回归涉及针对每个所划分的分位点中计算调零的标准偏差与从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。在某些实施例中，溢出扩散系数取自调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间所计算的线性拟合的斜率。在实施例中，以这种方式获得的溢出扩散系数针对第一荧光染料和第二荧光染料的每个组合进行计算，即，使得源自每种荧光染料的溢出针对每种其它荧光染料进行表征，并在溢出扩散矩阵中进行组合。处理器还可以被配置为基于溢出扩散矩阵调整荧光流式细胞仪数据。
本公开的各方面还包括具有用于实践本主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。在一些实施例中，非暂时性存储介质包括指令，所述指令用于：接收包含从至少第一荧光染料和第二荧光染料收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据；根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度来划分荧光流式细胞仪数据；基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对每个所述划分的分位点估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散；将为每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数组合在溢出扩散矩阵中；以及基于溢出扩散矩阵调整荧光流式细胞仪数据。
附图说明
当结合附图阅读时，从以下详细描述中可以最好地理解本发明。附图中包括以下图：
图1A描绘了示出用于溢出补偿的常规过程的流程图。
图1B描绘了根据用于溢出补偿和溢出扩散矩阵计算的常规过程的识别荧光流式细胞仪数据的阳性群体和阴性群体的图形表示。
图2描绘了用于结合溢出扩展矩阵的计算来执行溢出补偿的常规过程。
图3描绘了第一线性回归的图形表示。
图4描绘了第二线性回归的图形表示。
图5A描绘了根据本方法的实施例计算的溢出扩展矩阵。
图5B描绘了根据常规过程计算的溢出扩展矩阵。
图6描绘了根据AutoSpill算法演示溢出补偿的过程的流程图。
图7描绘了结合AutoSpill算法演示执行即时方法的实施例的过程的流程图。
图8描绘了结合常规溢出补偿算法演示执行即时方法的实施例的过程的流程图。
图9描绘了根据某些实施例的流式细胞仪。
图10描绘了根据某些实施例的处理器的一个示例的功能框图。
图11描绘了根据某些实施例的计算系统的框图。
图12描绘了根据即时方法的实施例对补偿的数据和未补偿的数据执行的回归分析。
图13描绘了根据即时方法计算的溢出扩展矩阵与常规溢出扩展矩阵之间的一致性水平。
图14描述了对荧光流式细胞仪数据执行第一线性回归的效果。
具体实施方式
提供了用于表征在针对第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的方法。在一些实施例中，方法包括根据数据相对于第一荧光染料的强度划分荧光流式细胞仪数据。在实施例中，方法还包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对每个所划分的分位点估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数。也提供了用于表征在针对从第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的系统和计算机可读介质。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为实施例当然可能有所变化。还应当理解，由于本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制。
在提供值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的至下限单位的十分之一的每个中间值以及该范围内的任何其他所述或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，但要服从所述范围内的任何特定排除的限制。当所述范围包括一个或两个极限时，不包括这些极限中的一个或两个的范围也包含在本发明中。
本文出现的某些范围，在数值前面加有术语“大约”。术语“大约”用于为其后面的确切数字以及接近或近似于术语后面的数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其呈现的上下文中提供了具体列举的数字的实质等同的数字。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也能够用于本发明的实践或测试，但现在描述具有代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用方式并入本文，如同每个单独的出版物或专利均被专门地和单独地指示以引用方式并入本文，并以引用方式加入本文以公开和描述引用这些出版物的方法和/或材料。对任何出版物的引用是为了在提交日期之前进行公开，不应被解释为承认本发明无权根据现有发明提前发布。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。
应注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。还应注意的是，权利要求书可以被草拟以排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求元素或使用“否定”限制时使用“单独”、“仅”等专有术语的先行依据。
阅读本公开后，本领域技术人员将清楚的是，本文描述和说明的每个单独实施例都具有分立的部件和特征，这些部件和特征可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合。任何所述方法都可以按照列举的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
虽然为了语法流动性和功能解释，已经或将要对系统和方法进行描述，但应明确理解，除非根据35U.S.C.§112明确表述，否则权利要求绝不应被解释为必然受到“手段”或“步骤”约束的限制，而应在司法等同原则下赋予由权利要求提供的定义的全部含义和等同物，并且如果权利要求是根据35U.S.C.§112明确提出的，则应根据35U.S.C.§112赋予其全部法定等同物。
用于表征在荧光流式细胞仪数据中的溢出扩散的方法
如上所述，本公开的各方面包括用于表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的方法。在实施例中，方法包括接收荧光流式细胞仪数据。“荧光流式细胞仪数据”是指关于由粒子分析仪中的任意数量的荧光检测器收集的流动池中样本(例如，细胞、粒子)的参数的信息。在实施例中，荧光流式细胞仪数据包括来自多种不同荧光染料的信号，多种不同荧光染料例如2至40种不同的荧光染料，包括3至30种不同的荧光染料，例如3至20种不同的荧光染料，且在一些实例中包括3至5种不同的荧光染料。在一些实施例中，多种不同的荧光染料包括2种或更多种不同的荧光染料，包括3种或更多种、4种或更多种，5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、25种或更多种以及30种或更多种不同的荧光染料。荧光流式细胞仪数据可以通过任何方便的协议(包括下面描述的协议)获得。
在一些实施例中，方法包括基于所确定的样本中分析物(例如，细胞、粒子)的参数(例如，荧光性)生成一个或更多个群体簇。如本文所用，分析物(例如细胞或其他粒子)的“群体”或“亚群体”通常指具有与一个或更多个测量的荧光参数相关的特性(例如，光学特性、阻抗特性或时间特性)的一组分析物，从而使得测量的参数数据在数据空间中形成簇。因此，群体被视为数据中的簇。反之，每个数据簇通常被解释为对应于特定类型的细胞或分析物的群体，尽管通常也观察到与噪声或背景相对应的簇。簇可能以维度的子集例如相对于测量的荧光参数(即，荧光性)的子集来定义，其对应于仅在从样本的测量中提取的测量参数或特征的子集中存在差异的群体。
在一些实施例中，荧光流式细胞仪数据包括在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的强度信号。换言之，从第一荧光染料发射的光由被配置为收集从第二荧光染料发射的光的检测器收集。如前言部分所述，在收集点(即，荧光流式细胞仪数据被一个或更多个荧光检测器接收的点)处的荧光流式细胞仪数据经受溢出扩散。溢出是其中指示特定荧光染料的粒子调制光被一个或更多个未被配置为测量该参数的检测器接收的现象。因此，光可能“溢出”，并被偏离目标的检测器检测到。因此，溢出扩散是由溢出引起的荧光流式细胞仪数据中存在的噪声。因此，在一些实施例中，由于一个或更多个检测器无意中检测到某些波长的光，因此未经调整的流式细胞仪数据是错误的。在这种情况下，从第一荧光染料发出的光将信号添加到被配置为检测来自第二荧光染料的光的检测器，即，第一荧光染料引起溢出。因此，由检测器收集的由此产生的流式细胞仪数据由于从第一荧光染料发射的光的存在而经受溢出扩散。
在接收到流式细胞仪数据之后，本发明的实施例包括划分流式细胞仪数据。本文所述的“划分”是指将数据分配到多个不同的组中。在一些实例中，划分荧光流式细胞仪数据包括将流式细胞仪数据分配到分位点。“分位点”以其常规意义引用以描述将频率分布分割为相等组的一组值中的每一个，每个组包含总群体的相同分量。因此，在实施例中，每个分位点包含与每个其他分量相同分量的荧光流式细胞仪数据点。在某些实施例中，根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度来划分荧光流式细胞仪数据。换言之，与单个荧光流式细胞仪数据点相关联的由第一荧光染料发射的光的强度决定了该数据点被划分到哪个分位点。在实施例中，根据相对于第一荧光染料的数据的强度来划分荧光流式细胞仪数据包括在相同的分位点中分配与针对第一萤光染料接收的光的相似强度相关联的数据点。
荧光流式细胞仪数据可以分配到任何方便的数量的不同的分位点中。在一些实施例中，将荧光流式细胞仪数据分配到其中的分位点的数量可以缩放到荧光流式细胞仪数据的大小，即存在多少数据点。在一些实施例中，较大的流式细胞仪数据集被划分到较多的不同的分位点中，而较小的流式细胞仪数据集则被划分到较少的不同的分位点中。在其他实施例中，荧光流式细胞仪数据通常被划分到默认数量的分位点中。在这些实施例中，可以改变分位点的默认数量以与流式细胞仪数据集的不同大小相配。改变分位点的默认数量可能涉及减少流式细胞仪数据被分配到其中的分位点的数量，以确保每个分位点具有足够数量的数据点，用于估计每个分位点内数据点的标准偏差。在某些实施例中，分位点的默认数量为256。在一些实施例中，当呈现较小的流式细胞仪数据集时，分位点的数量可能减少到低至8个分位点。因此，在一些实施例中，分位点的数量为8至256。
在对荧光流式细胞仪数据进行划分之后，本发明的实施例包括针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差。“调零的”是指针对包含在分位点内的流式细胞仪数据点计算的标准偏差，该标准偏差已被调整以反映从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设。为了估计调零的标准偏差，本发明的实施例包括针对每个分位点计算从第一荧光染料发射的光的强度的中值。本发明的实施例还包括计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差(σ)。在一些实施例中，从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差是稳健的标准偏差，即，该标准偏差抵抗离群效应。在某些实施例中，基于从第一荧光染料收集的光的强度为零(σ0)的假设，随后使用从第一荧光染料发射的光的强度的中值和从第二荧光染料发射的光的标准偏差来估计从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差。
在实施例中，估计σ0包括执行第一线性回归。在实施例中，执行第一线性回归包括计算从第一荧光染料发射的光的强度的中值的平方根和从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差(σ)之间的线性拟合。在实施例中，从第一荧光染料发射的光的强度的中值的平方根沿x轴绘制，并且从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差沿y轴绘制。在一些实施例中，使用普通最小二乘回归模型执行第一线性回归。普通最小二乘回归模型在例如，Hutcheson,G.D.(1999).Ordinary least-squares regression；Hutcheson,G.D.Themultivariate social scientist(第56-113页)中进行了描述，通过引用并入本文。在其他实施例中，使用加权最小二乘模型执行第一线性回归。加权最小二乘模型在例如Strutz,T.(2015).Data Fitting and Uncertainty:A practical introduction to weightedleast squares and beyond中进行了讨论，通过引用并入本文。在其他实施例中，通过稳健线性模型执行第一线性回归。稳健线性模型在例如Andersen,R.(2008).Modern methodsfor robust regression中进行了描述，通过引用并入本文。
在计算线性拟合之后，本发明的实施例包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过确定线性拟合的y截距来计算σ0。换言之，当从第一荧光染料发射的光的中值荧光为零时(即，当线与y轴相交时)从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差被作为σ0。例如，图3描述了第一线性回归。沿着x轴302绘制从第一荧光染料发射的光的强度的中值的平方根，并沿着y轴301绘制从第二荧光染料发射的光的强度标准偏差。为流式细胞仪数据点304计算线性拟合303。基于从第一荧光染料收集的光的强度为零(σ0)的假设，将值305(在该值305处，线性拟合303拦截y轴301)作为从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计。在通过第一线性回归估计σ0之后，本发明的实施例还包括基于σ0的估计值计算调零的标准偏差。在这样的实施例中，调零的标准偏差由σ2和
之间的差的平方根即
确定。
本发明的各方面还包括获得溢出扩散系数。在某些实施例中，获得溢出扩散系数包括量化由检测器针对第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据受到由同一检测器从第一荧光染料同时收集的的光的影响的程度。在某些实例中，经受溢出扩散的荧光流式细胞仪数据受到信号强度的影响，所述信号强度高于否则将观察到的信号强度(即溢出扩散噪声是相长的)。在其他实例中，经受溢出扩散的荧光流式细胞仪数据受到信号强度的影响，所述信号强度低于否则将观察到的信号强度(即溢出扩散噪声是相消的)。在实施例中，获得溢出扩散系数涉及执行第二线性回归。在这样的实施例中，执行第二线性回归包括针对每一个所划分的分位点计算调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。在实施例中，沿y轴绘制调零的标准偏差，并沿x轴绘制从第一荧光染料收集的光的中值强度。溢出扩散系数随后从调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间所计算的线性拟合的斜率获得。在一些实施例中，使用普通最小二乘回归模型执行第二线性回归。在其他实施例中，使用加权最小二乘模型执行第二线性回归。在其它实施例中，第二线性回归通过稳健线性模型执行。在某些实施例中，第一线性回归和第二线性回归二者均由加权最小二乘模型执行。在其他实施例中，第一线性回归和第二线性回归均由稳健线性模型执行。
例如，图4描绘了第二线性回归的图形表示。沿y轴401绘制调零的标准偏差，并沿x轴402绘制从第一荧光染料收集的光的中值强度。基于荧光流式细胞仪数据404计算线性拟合403。从线性拟合403的斜率405获得溢出扩散系数。
因此，在实施例中，如本文所述的溢出扩散系数能够根据公式1计算：
如公式1所示，SS是溢出扩散系数；σ是从第二荧光染料收集的光的标准偏差；σ0是基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计；以及F是从第一荧光染料收集的光的中值强度。因此，溢出扩散系数测量由给定荧光检测器收集的荧光流式细胞仪数据受到与特定荧光染料相关的光的存在的影响的程度。换言之，溢出扩散系数估计由给定检测器收集的从相关荧光染料发射的光对荧光流式细胞仪数据贡献的误差(即噪声)。在实施例中，对于给定的第一荧光染料和第二荧光染料对，较高的溢出扩散系数对应于更多的溢出扩散。在实施例中，溢出扩散系数是在不识别相对于特定荧光染料呈阳性(即，确实表现出相关参数)和阴性(即，不表现出相关参数)的荧光流式细胞仪数据的群体情况下获得的的。
在一些实施例中，第一线性回归和第二线性回归在组合线性回归中进行组合。在这样的实施例中，组合线性回归被配置为基于从第一荧光染料收集的光的强度为零(σ0)的假设来计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差，并同时获得溢出扩散系数。在实施例中，组合线性回归被配置为计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的平方和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。在一些实施例中，通过加权最小二乘模型执行组合线性回归。在其他实施例中，通过稳健线性模型执行组合线性回归。
本发明的实施例还包括针对第一荧光染料和第二荧光染料的每种可能的组合计算溢出扩散系数，从而能够确定在每个检测器处收集的荧光流式细胞仪数据如何受到与每种荧光染料相关联的光的存在的影响。换言之，本发明的各方面包括计算多个溢出扩散系数(例如，如上所述)，使得针对每对可能的第一荧光染料和第二荧光染料提供溢出扩散系数。在实施例中，针对每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩展系数组合在溢出扩散矩阵中。在某些实施例中，溢出扩散矩阵演示了由其对应的检测器对特定荧光染料的检测如何受到来自其他荧光染料的溢出的影响。在实施例中，如本文所述的包含溢出扩散系数的溢出扩散矩阵表征了在不识别相对于所述荧光染料呈阳性和阴性的荧光流式细胞仪数据的群体的情况下针对每种其他荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中源自每种荧光染料的溢出扩散效应。例如，图5A呈现了溢出扩展矩阵的一个实施例，该溢出扩展矩阵为23种不同的荧光染料提供溢出扩展系数(例如，如上所述获得)。矩阵中的每一列对应于被配置为检测23种不同荧光染料中的一种的检测器，并且矩阵中的每一行对应于被检测的流式细胞仪数据的参数。列和行相交的单元填充有针对该对第一荧光染料和第二荧光染料而计算的溢出扩散系数，该溢出扩散系数指示所讨论的荧光染料(即，第一荧光染料)对相关检测器(即，对从第二荧光染料发射的光的检测)贡献误差的程度。荧光染料引起溢出扩散的总程度能够通过对它的行中的所有值求和来近似，而检测器受溢出扩散的影响的总程度则能够通过对它的列中的所有值求和来计算。在一些实施例中，溢出扩散系数被求和以计算总扩散效应(即，溢出扩散对荧光流式细胞仪数据的特定子集的累积效应)。
如上所述，在实施例中，如本文所述的溢出扩散矩阵填充有溢出扩散系数，所述溢出扩散系数是在不识别荧光流式细胞仪数据相对于每种相关荧光染料的阳性群体和阴性群体的情况下计算的。然而，在一些实施例中，如本文所述的溢出扩散矩阵填充有溢出扩散系数，所述溢出扩散系数近似于在识别了荧光流式细胞仪数据相对于每种相关的荧光染料的阳性群体和阴性群体的情况下计算的溢出扩散系数，即，它们近似于如Nguyen等人(2013)所教导的计算的溢出扩散系数。例如，图5B描绘了基于用于计算图5A所示溢出扩散矩阵的相同数据集计算的常规的溢出扩散矩阵(即，需要识别荧光流式细胞仪数据相对于每种相关的荧光染料的阳性群体和阴性群体的溢出扩散矩阵)。当将如本文所述计算的溢出扩展矩阵(图5A所示)与常规计算的溢出扩散矩阵(图5B所示)进行比较时，观察到针对每个荧光染料-荧光染料对两个矩阵之间的关于溢出扩散的幅度高度一致。
本公开的各方面还包括调整荧光流式细胞仪数据以考虑溢出扩散。通过“调整”意味着改变数据，使其更准确地量化流动池中被照射的样本(例如细胞、粒子)中荧光染料的存在。在一些实施例中，调整荧光流式细胞仪数据使得其不再包括由溢出扩散引起的误差。在实施例中，调整荧光流式细胞仪数据包括生成溢出扩散被调整的群体。在某些实施例中，生成溢出扩散被调整的群体包括从流式细胞仪数据的相关群体中减去溢出扩散的幅度，即，抵消受溢出扩散影响的信号的影响。在某些实施例中，溢出扩散的幅度由溢出扩散矩阵确定。在一些实施例中，调整流式细胞仪数据包括从流式细胞仪数据的相关部分中减去总扩散效应。
本发明的一些实施例还包括补偿荧光流式细胞仪数据的溢出。如上文在前言部分中所讨论的，溢出是其中指示特定荧光染料的粒子调制光被一个或更多个未被配置为测量该参数的检测器接收的现象。因此，补偿在数学上从荧光流式细胞仪数据中消除了这种重叠。可以使用任何方便的方法来补偿荧光流式细胞仪数据的溢出。在一些实施例中，可以执行解混。解混使用单染色参考对照来分离荧光群并识别与每种荧光染料相关的光谱。在其他实施例中，通过AutoSpill算法执行溢出补偿。AutoSpill是由FlowJo有限责任公司(Becton Dickinson的子公司)开发的算法，用于计算溢出并生成由溢出系数组成的荧光溢出矩阵，溢出系数在数学上表征从一种荧光染料发射的光将信号添加到针对另一种荧光染料收集的流式细胞仪数据的程度。AutoSpill在Roca等人(2020).AutoSpill:a method forcalculating spillover coefficients in high-parameter flow cytometry.bioRxiv中进行了描述，通过引用并入本文。AutoSpill结合了细胞的自动选通、基于稳健线性回归的初始溢出矩阵计算和迭代细化以减少误差。AutoSpill根据线性回归的斜率确定溢出系数，该线性回归将主要通道(在单色对照中分配给染料的通道)中的荧光作为因变量，并将次要通道中的荧光(即由另一个检测器收集的光)作为自变量。没有溢出对应于该回归中的零斜率。此外，AutoSpill迭代地细化溢出矩阵并重新计算补偿，从而将溢出矩阵中的误差和补偿中的误差降低到可忽略的量级。例如，图6描绘了表示AutoSpill算法600的样例工作流程。在步骤601中，通过使用线性回归(例如，如上所述)获得溢出系数来计算荧光溢出矩阵。在步骤602中，基于在步骤601中计算的荧光溢出矩阵来补偿荧光流式细胞仪数据。
在本发明的一些实施例中，结合补偿荧光流式细胞仪数据的溢出来计算由溢出扩散系数(如上所述获得)组成的溢出扩散矩阵。这可以在识别或不识别荧光流式细胞仪数据关于每种相关的荧光染料的阳性群体和阴性群体的情况下进行。在一些实施例中，在不识别阳性群体和阴性群体的情况下，结合溢出补偿来执行溢出扩展矩阵的计算。在这样的实施例中，溢出矩阵和溢出补偿的计算通过AutoSpill执行。例如，图7描述了涉及AutoSpill的工作流程。因为AutoSpill执行消除了对识别阳性群体和阴性群体的需要的线性回归，所以步骤101(上文关于图1A至图1B和图2所述)不是必须的。这样，AutoSpill执行荧光溢出矩阵的计算(步骤601)，并基于计算的荧光溢出矩阵对荧光流式细胞仪数据进行补偿(步骤602)。在样本被补偿之后，使用本文描述的溢出扩展系数来计算溢出扩展矩阵(步骤701)。在一些实施例中，如果需要，可以另外调整荧光流式细胞仪数据，以考虑由溢出引起的数据中存在的误差。
在其他实施例中，在识别阳性群体和阴性群体的情况下，结合溢出补偿来执行溢出扩散矩阵的计算。在这样的实施例中，溢出补偿可以由除AutoSpill之外的算法执行。在实施例中，通过解混来执行补偿。例如，图8描述了其中流式细胞仪数据的阳性群体和阴性群体被识别(步骤101)的工作流程。在群体被识别之后，可以以常规的方式进行荧光溢出矩阵的计算(步骤102)和基于荧光溢出矩阵对荧光流式细胞仪数据的补偿(步骤103)。在补偿之后，如本文所描述的计算溢出扩展矩阵(步骤701)。在一些实施例中，如果需要，可以另外调整荧光流式细胞仪数据，以考虑由溢出引起的数据中存在的误差。虽然步骤701不需要识别流式细胞仪数据的阳性群体和阴性群体，但为了溢出补偿，进行这种识别。
如上所述，可以使用任何方便的协议获得本发明的方法中使用的荧光流式细胞仪数据。在一些实施例中，用光源照射具有粒子的样本，并且检测来自样本的光，以至少部分地基于检测到的光的测量产生相关粒子的群体。在一些实例中，样本是生物样本。术语“生物样本”以其常规意义使用，是指整个生物体、植物、真菌或动物组织、细胞的子集或在某些实例中可在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐血、尿液、阴道液和精液中发现的组成部分。因此，“生物样本”是指天然生物体或其组织的子集，以及从该生物体或其子集制备的匀浆、裂解液或提取物，包括但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管和泌尿生殖道、眼泪、唾液、奶、血细胞、肿瘤、器官。生物样本可以是任何类型的生物组织，包括健康组织和患病组织(例如，癌组织、恶性组织、坏死组织等)。在某些实施例中，生物样本是液体样本，例如血液或其衍生物例如血浆、眼泪、尿液、精液等，其中在一些实例中，样本是血液样本，包括全血，例如从静脉穿刺或手指针刺获得的血液(其中血液可以与或可以不与任何试剂(例如防腐剂、抗凝剂等)在化验之前结合)。
在某些实施例中，样本的来源是“哺乳动物”或“哺乳类”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物纲内的生物，包括食肉目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人类、黑猩猩和猴子)。在一些实例中，受试者是人类。所述方法可以应用于从两种性别和处于任何发育阶段的人类受试者(即新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)获得的样本，其中在某些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。虽然本发明可以应用于来自人类受试者的样本，但应理解，该方法也可针对来自其他动物受试者(即“非人类受试者”)(例如但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜和马)的样本来执行。
在实施本主题方法时，具有粒子的样本(例如，在流式细胞仪的流动流中)被来自光源的光照射。在一些实施例中，光源是宽带光源，其发射具有宽的波长范围的光，宽的波长范围例如跨越50nm或更宽、例如100nm或更宽、例如150nm或更宽、例如200nm或更宽、例如250nm或更宽、例如300nm或更宽、例如350nm或更宽、例如400nm或更宽以及包括跨越500nm或更宽。例如，一个合适的宽带光源发射波长从200nm到1500nm的光。合适的宽带光源的另一示例包括发射波长从400nm至1000nm的光的光源。在方法包括用宽带光源照射的情况下，感兴趣的宽带光源协议可以包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定光纤耦合宽带光源、具有连续光谱的宽带LED、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白色光源、多LED集成的白色光源以及其他宽带光源或其任何组合。
在其他实施例中，方法包括用发射特定波长或窄的波长范围的窄带光源照射，例如用发射窄波长范围(例如50nm或更小，例如40nm或更小，例如30nm或更小，例如25nm或更小，例如20nm或更小、例如15nm或更小，例如10nm或更小、例如5nm或更小，例如2nm或更小)内的光的光源照射，并且包括用发射特定波长的光(即单色光)的光源照射。在方法包括用窄带光源照射的情况下，感兴趣的窄带光源协议可以包括但不限于：窄波长LED、耦合到一个或更多个光学带通滤波器的激光二极管或宽带光源、衍射光栅、单色仪或其任何组合。
本发明的各方面包括用荧光检测器收集荧光。在一些实例中，荧光检测器可以被配置为检测来自荧光分子的荧光发射，所述荧光分子例如为与流动池中的粒子相关的标记的特定结合成分(例如，与感兴趣的标记专门结合的标记抗体)。在某些实施例中，方法包括用一个或更多个荧光检测器检测来自样本的荧光，一个或更多个荧光检测器为例如2个或更多、例如3个或更多、例如4个或更多，例如5个或更多、例如6个或更多、例如7个或更多、例如8个或更多、例如9个或更多、例如10个或更多、例如15个或更多并且包括25个或更多的荧光检测器。在实施例中，每个荧光检测器被配置为生成荧光数据信号。来自样本的荧光可以被每个荧光检测器独立地在200nm至1200nm的波长范围内的一个或更多个上检测到。在一些实例中，方法包括在波长范围内检测来自样本的荧光，该波长范围为例如200nm至1200nm、例如300nm至1100nm、例如400nm至1000nm、例如500nm至900nm，并且包括600nm至800nm。在其他实例中，方法包括用每个荧光检测器在一个或更多个特定波长下检测荧光。例如，可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任意组合中的一个或更多个处检测荧光，这取决于本主题光检测系统中不同荧光检测器的数量。在某些实施例中，方法包括检测与样本中存在的某些荧光染料的荧光峰值波长相对应的光的波长。在实施例中，从一个或更多个荧光检测器(例如，一个或更多个检测通道)接收荧光流式细胞仪数据，所述一个或更多个荧光检测器为例如2个或更多、例如3个或更多、例如4个或更多、例如5个或更多、例如6个或更多，并且包括8个或更多荧光检测器(如，8个或更多个检测通道)。
用于表征在荧光流式细胞仪数据中的溢出扩散的系统
本公开的各方面包括用于分类荧光流式细胞仪数据的系统。在实施例中，荧光流式细胞仪数据被聚类，针对溢出扩散进行调整，并被划分使得单独的群体被不同地分类。在一些实施例中，系统包括被配置为产生荧光流式细胞仪数据的粒子分析仪和被配置为分析荧光流式池仪数据的处理器。
在一些实施例中，本主题粒子分析仪具有流动池和激光器，该激光器被配置为照射流动池中的粒子。在实施例中，激光器可以是任何方便的激光器，例如连续波激光器。例如，激光器可以是二极管激光器，例如紫外二极管激光器、可见光二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施例中，激光器可以是氦氖(HeNe)激光器。在一些实例中，激光器是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他的实例中，本主题流式细胞仪包括染料激光器，如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器。在另外的实例中，感兴趣的激光器包括金属-蒸气激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其它实例中，本主题流式细胞仪包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、氧化镱激光器或铈掺杂激光器及其组合。
本发明的各方面还包括被配置为检测前向散射光的前向散射检测器。根据需要，本主题流式细胞仪中的前向散射检测器的数量可以变化。例如，本主题粒子分析器可以包括1个前向散射检测器或多个前向散射检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个并且包括5个或更多个。在某些实施例中，流式细胞仪包括1个前向散射检测器。在其他实施例中，流式细胞仪包括2个前向散射检测器。
用于检测收集的光的任何方便的检测器可以用于本文描述的前向散射检测器。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，诸如：有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他检测器。在某些实施例中，使用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2、例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
如果本主题粒子分析仪包括多个前向散射检测器，则每个检测器可以是相同的，或者检测器集合可以是不同类型的检测器的组合。例如，在本主题粒子分析仪包括两个前向散射检测器的情况下，在一些实施例中，第一前向散射检测器是CCD型器件，并且第二前向散射检测器(或成像传感器)是CMOS型器件。在其他实施例中，第一前向散射检测器和第二前向散射检测器二者都是CCD型器件。在另外的实施例中，第一前向散射检测器和第二前向散射检测器都是CMOS型器件。仍在其它实施例中，第一前向散射检测器是CCD型器件，并且第二前向散射检测器是光电倍增管(PMT)。在其他实施例中，第一前向散射检测器是CMOS型器件，并且第二前向散射检测器是光电倍增管。在其他实施例中，第一前向散射检测器和第二前向散射检测器二者都是光电倍增管。
在实施例中，前向散射检测器被配置为连续地或以离散间隔测量光。在一些实例中，感兴趣的检测器被配置为连续地测量收集的光。在其他实例中，感兴趣的检测器被配置为以离散间隔进行测量，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及每1000毫秒或以其他间隔测量光。
本发明的实施例还包括位于流动池和前向散射检测器之间的光色散/分离器模块。感兴趣的光色散装置包括但不限于彩色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、分色镜、衍射光栅、单色仪及其组合以及其他波长分离装置。在一些实施例中，带通滤波器位于流动池和前向散射检测器之间。在其他实施例中，多于一个带通滤波器位于流动池和前向散射检测器之间，多于一个带通滤波器为例如2个或更多个、3个或更多个，4个或更多个并且包括5个或更多个。在实施例中，带通滤波器的最小带宽范围为2nm至100nm，例如3nm至95nm、例如5nm至95mm、例如10nm至90nm、例如12nm至85nm、例如15nm至80nm，并且包括具有最小带宽范围为20nm至50nm波长的带通滤波器并将具有其他波长的光反射到前向散射检测器。
本发明的某些实施例包括被配置为检测光(例如，从粒子的表面和内部结构折射和反射的光)的侧向散射波长的侧向散射检测器。在其他实施例中，流式细胞仪包括多个侧向散射检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个并且包括5个或更多个。
用于检测收集的光的任何方便的检测器可以用于本文描述的侧向散射检测器。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，诸如：有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他检测器。在某些实施例中，使用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2、例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
当本主题粒子分析仪包括多个侧向散射检测器时，每个侧向散射检测器可以是相同的，或者侧向散射检测器集合可以是不同类型检测器的组合。例如，在本主题粒子分析器包括两个侧向散射检测器的情况下，在一些实施例中，第一侧向散射检测器是CCD型器件，并且第二侧向散射检测器(或成像传感器)是CMOS型器件。在其他实施例中，第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器二者都是CCD型器件。在另外的实施例中，第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器二者都是CMOS型器件。在其它实施例中，第一侧向散射检测器是CCD型器件，并且第二侧向散射检测器是光电倍增管(PMT)。在其他实施例中，第一侧向散射检测器是CMOS型器件，并且第二侧向散射检测器是光电倍增管。在其他实施例中，第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器二者都是光电倍增管。
本发明的实施例还包括位于流动池和侧向散射检测器之间的光色散/分离器模块。感兴趣的光色散装置包括但不限于彩色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、分色镜、衍射光栅、单色仪及其组合，以及其他波长分离装置。
在实施例中，本主题粒子分析仪还包括被配置为检测一个或更多个荧光波长的光的荧光检测器。在其他实施例中，粒子分析仪包括多个荧光检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个并且包括20个或更多个。
用于检测收集的光的任何方便的检测器可以用于本文描述的荧光检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，诸如：有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他检测器。在某些实施例中，使用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2、例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
如果本主题粒子分析仪包括多个荧光检测器，则每个荧光检测器可以是相同的，或者荧光检测器集合可以是不同类型检测器的组合。例如，在本主题粒子分析仪包括两个荧光检测器的情况下，在一些实施例中，第一荧光检测器是CCD型器件，并且第二荧光检测器(或成像传感器)是CMOS型器件。在其他实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器二者都是CCD型器件。在另外的实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器二者都是CMOS型器件。在其它实施例中，第一荧光检测器是CCD型器件，并且第二荧光检测器是光电倍增管(PMT)。在其他实施例中，第一荧光检测器是CMOS型器件，并且第二荧光检测器是光电倍增管。在其他实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器二者都是光电倍增管。
本发明的实施例还包括位于流动池和荧光检测器之间的光色散/分离器模块。感兴趣的光色散装置包括但不限于彩色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、分色镜、衍射光栅、单色仪及其组合，以及其他波长分离装置。
在本公开的实施例中，感兴趣的荧光检测器被配置为测量在一个或更多个波长处收集的光，例如在2个或更多个波长处、例如在5个或更多个不同的波长处、例如在10个或更多个不同的波长处、例如在25个或更多个不同的波长处、例如在50个或更多个不同的波长处、例如在100个或更多个不同的波长处、例如在200个或更多个不同的波长处、例如在300个或更多个不同的波长处收集的光，并且包括测量由流动流中的样本在400个或更多个不同的波长处发射的光。在一些实施例中，如本文所描述的流式细胞仪中的2个或更多个检测器被配置为测量波长相同或重叠的所收集的光。
在一些实施例中，感兴趣的荧光检测器被配置为测量在波长范围(例如，200nm至1000nm)内的收集的光。在某些实施例中，感兴趣的检测器被配置为在波长范围内收集光谱。例如，粒子分析仪可以包括一个或更多个检测器，一个或更多个检测器被配置为在200nm至1000nm的波长范围的一个或更多个内收集光谱。在另一些实施例中，感兴趣的检测器被配置为测量由流动流中的样本在一个或更多个特定波长下发射的光。例如，粒子分析仪可以包括一个或更多个检测器，一个或更多个检测器被配置为测量450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任意组合中的一个或更多个处的光。在某些实施例中，一个或更多个检测器可以被配置为与特定荧光团配对，例如在荧光测定中与样本一起使用的荧光团。
合适的流式细胞术系统可以包括但不限于Ormerod(ed.),Flow Cytometry:APractical Approach,Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等人(eds.),FlowCytometry Protocols,Methods in Molecular Biology第91号,Humana Press(1997)；Practical Flow Cytometry,第三版,Wiley-Liss(1995)；Virgo等人(2012)Ann ClinBiochem.Jan；49(pt 1):17-28；Linden等人,Semin Throm Hemost.2004年10月；30(5):502-11；Alison等人.J Pathol,2010年12月；222(4):335-344；以及Herbig等人(2007)CritRev Ther Drug Carrier Syst.24(3):203-255中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞术系统包括BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSCantoTM II流式细胞仪、BD AccuriTM流式细胞仪、BD AccuriTM C6Plus流式细胞仪、BD Biosciences FACSCelestaTM流式细胞仪、BD BiosciencesFACSLyricTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVerseTM流式细胞仪、BD BiosciencesFACSymphonyTM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessaTM流式细胞仪、BD BiosciencesLSRFortessaTM X-20流式细胞仪、BD Biosciences FACSPrestoTM流式细胞仪、BDBiosciences FACSViaTM流式细胞仪和BD Biosciences FACSCaliburTM细胞分选仪、BDBiosciences FACSCountTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyricTM细胞分选仪、BDBiosciences ViaTM细胞分选仪、BD Biosciences InfluxTM细胞分选仪、BD BiosciencesJazzTM细胞分选仪、BD Biosciences AriaTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSAriaTMII细胞分选仪、BD Biosciences FACSAriaTM III细胞分选仪、BD Biosciences FACSAriaTMFusion细胞分选仪以及BD Biosciences FACSMelodyTM细胞分选仪、BD BiosciencesFACSymphonyTM S6细胞分选仪等。
在一些实施例中，主题系统是流式细胞仪系统，如美国专利号10,663,476、10,620,111、10,613,017、10,605,713、10,585,031、10,578,542、10,578,469、10,481,074、10,302,545、10,145,793、10,113,967、10,006,852、9,952,076、9,933,341、9,726,527、9,453,789、9,200,334、9,097,640、9,095,494、9,092,034、8,975,595、8,753,573、8,233,146、8,140,300、7,544,326、7,201,875、7,129,505、6,821,740、6,813,017、6,809,804、6,372,506、5,700,692、5,643,796、5,627,040、5,620,842、5,602,039、4,987,086、4,498,766中所描述的那些流式细胞仪系统，其公开内容通过引用全部并入本文。
在某些情况下，本发明的流式细胞术系统被配置为通过使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像对流动流中的粒子进行成像，例如在Diebold等人Nature Photonics第7(10)卷，806-810(2013)中描述的以及在美国专利号9,423,353、9,784,661、9,983,132、10,006,852、10,078,045、10,036,699、10,222,316、10,288,546、10,324,019、10,408,758、10,451,538、10,620,111以及美国专利公布号2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/0275042、2019/0376895和2019/0376894中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。
在某些实施例中，本主题系统还包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，当所述指令由处理器执行时，使处理器表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。在实施例中，处理器被配置为接收荧光流式细胞仪数据。在实施例中，荧光流式细胞仪数据包括来自多个不同荧光染料的信号，诸如，例如2至20种不同的荧光染料，并且包括3至5种不同的荧光染料。在一些实施例中，多种不同的荧光染料包括2种或更多种不同的荧光染料，包括3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种以及20种或更多种不同的荧光染料。荧光流式细胞仪数据可以通过任何方便的协议获得。
在一些实施例中，荧光流式细胞仪数据包括在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的强度信号。换言之，从第一荧光染料发出的光由被配置成收集从第二荧光染料发射的光的检测器收集。如前言部分所描述的，在收集点(即它被一个或更多个荧光检测器接收的点)处的荧光流式细胞仪数据经受溢出扩散。溢出是其中指示特定荧光染料的粒子调制光被一个或更多个未被配置为测量该参数的检测器接收的现象。因此，光可能“溢出”，并被偏离目标的检测器检测到。因此，溢出扩散是由溢出引起的在荧光流式细胞仪数据中存在的噪声。因此，在一些实施例中，由于一个或更多个检测器无意检测到某些波长的光，未经调整的流式细胞仪数据是错误的。在这种情况下，从第一荧光染料发射的光将信号添加到被配置为检测来自第二荧光染料的光的检测器，即，第一荧光染料引起溢出。因此，由检测器收集的由此引起的流式细胞仪数据由于从第一荧光染料发射的光的存在而经受溢出扩散。
在接收到荧光流式细胞仪数据之后，处理器可以被配置为划分荧光流式细胞仪数据。在某些情况下，划分荧光流式细胞仪数据包括将流式细胞仪数据分配到分位点。在实施例中，每个分位点包含与每个其他分量相同分量的荧光流式细胞仪数据点。在某些实施例中，根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度来划分荧光流式细胞仪数据。换言之，与单个荧光流式细胞仪数据点相关联的由第一荧光染料发射的光的强度决定了该数据点被划分到哪个分位点。在实施例中，根据相对于第一荧光染料的数据的强度来划分荧光流式细胞仪数据包括在相同的分位点中分配与针对第一荧光染料接收的光的相似强度相关联的数据点。
在实施例中，处理器被配置为将荧光流式细胞仪数据分配到任何方便的数量的不同分位点中。在一些实施例中，将荧光流式细胞仪数据分配到其中的分位点的数量可以缩放到荧光流式细胞仪数据的大小，即存在多少数据点。在一些实施例中，较大的流式细胞仪数据集被划分到更多的不同的分位点中，而较小的流式细胞仪数据集则被划分到更少的不同的分位点中。在其他实施例中，荧光流式细胞仪数据通常被划分到默认数量的分位点中。在这些实施例中，分位点的默认数量可以改变以与流式细胞仪数据集的不同大小相配。改变分位点的默认数量可能涉及减少流式细胞仪数据被分配到其中的分位点的数量，以确保每个分位点具有足够数量的数据点，用于估计每个分位点内数据点的标准偏差。在某些实施例中，分位点的默认数量为256。在一些实施例中，当呈现较小的流式细胞仪数据集时，分位点的数量可能减少到低至8个分位点。因此，在一些实施例中，分位点的数量为8至256。
在荧光流式细胞仪数据已经被划分之后，处理器可以被配置针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差。为了估计调零的标准偏差，本发明的实施例包括针对每个分位点计算从第一荧光染料发射的光的强度的中值。本发明的实施例还包括计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差(σ)。在一些实施例中，从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差是稳健的标准偏差，即，所述标准偏差抵抗离群效应。在某些实施例中，基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，随后使用从第一荧光染料发射的光的强度的中值和从第二荧光染料发射的光的标准偏差来估计从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差(σ0)。
在实施例中，估计σ0包括执行第一线性回归。在实施例中，执行第一线性回归包括计算从第一荧光染料发射的光的强度的中值的平方根和从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差(σ)之间的线性拟合。在实施例中，从第一荧光染料发射的光的强度的中值的平方根沿x轴绘制，并且从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差沿y轴绘制。在一些实施例中，使用普通最小二乘回归模型执行第一线性回归。在其他实施例中，使用加权最小二乘模型执行第一线性回归。在其他实施例中，通过稳健线性模型执行第一线性回归。
在计算线性拟合之后，处理器可以被配置为基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设通过确定线性拟合的y截距来来计算σ0。换言之，当从第一荧光染料发射的光的中值荧光为零时(即，当线与y轴相交时)从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差被作为σ0。在通过第一线性回归估计σ0后，本发明的实施例还包括基于σ0的估计值计算调零的标准偏差。在这样的实施例中，调零的标准偏差由σ2和
之间的差的平方根即
确定。
处理器还可以被配置成获得溢出扩展系数。在某些实施例中，获得溢出扩散系数包括量化由检测器针对第二荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据受到由同一检测器同时收集的来自第一荧光染料的光的影响的程度。在一些实例中，经受溢出扩散的荧光流式细胞仪数据受到信号强度的影响，所述信号强度高于否则将观察到的信号强度(即溢出扩散噪声是相长的)。在其他实例中，经受溢出扩散的荧光流式细胞仪数据受到信号强度的影响，所述信号强度低于否则将观察到的信号强度(即溢出扩散噪声是相消的)。在实施例中，获得溢出扩散系数涉及执行第二线性回归。在这样的实施例中，执行第二线性回归包括针对每一个所划分的分位点计算调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。在实施例中，沿y轴绘制调零的标准偏差(即因变量)，并沿x轴绘制从第一荧光染料收集的光的中值强度(即自变量)。随后从调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间所计算的线性拟合的斜率获得溢出扩散系数。在一些实施例中，使用普通最小二乘回归模型执行第二线性回归。在其他实施例中，使用加权最小二乘模型执行第二线性回归。在其它实施例中，第二线性回归通过稳健线性模型执行。在某些实施例中，第一线性回归和第二线性回归二者均由加权最小二乘模型执行。在其他实施例中，第一线性回归和第二线性回归二者均通过稳健线性模型执行。
因此，在实施例中，如本文所描述的溢出扩散系数能够根据公式1计算：
如公式1所示，SS是溢出扩散系数；σ是从第二荧光染料收集的光的标准偏差；σ0是基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计；以及F是从第一荧光染料收集的光的中值强度。因此，溢出扩散系数测量由给定荧光检测器收集的荧光流式细胞仪数据受到与特定荧光染料相关的光的存在的影响的程度。换言之，溢出扩散系数估计由给定检测器收集的从相关荧光染料发射的光对荧光流式细胞仪数据贡献的误差(即噪声)。在实施例中，对于给定的第一荧光染料和第二荧光染料对，较高的溢出扩散系数对应于更多的溢出扩散。在实施例中，溢出扩散系数是在不识别荧光流式细胞仪数据相对于特定荧光染料呈阳性(即，确实表现出相关参数)和阴性(即，不表现出相关参数)的群体的情况下获得的。
在一些实施例中，第一线性回归和第二线性回归在组合线性回归中进行组合。在这样的实施例中，组合线性回归被配置为基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设来计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差(σ0)，并同时获得溢出扩散系数。在实施例中，组合线性回归被配置为计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的平方与从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。在一些实施例中，通过加权最小二乘模型执行组合线性回归。在其他实施例中，通过稳健线性模型执行组合线性回归。
处理器也可以被配置为针对第一荧光染料和第二荧光染料的每种可能的组合计算溢出扩散系数，从而能够确定在每个检测器处收集的荧光流式细胞仪数据如何受到与每种荧光染料相关的光的存在的影响。换言之，本发明的各方面包括计算多个溢出扩散系数(例如，如上所述)，使得针对每对可能的第一荧光染料和第二荧光染料提供溢出扩散系数。在实施例中，针对每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数组合在溢出扩散矩阵中。在某些实施例中，溢出扩散矩阵演示了由其对应的检测器对特定荧光染料的检测如何受到来自其他荧光染料的溢出的影响。在实施例中，如本文所描述的包含溢出扩散系数的溢出扩散矩阵表征了在不识别荧光流式细胞仪数据相对于荧光染料呈阳性和阴性的群体的情况下针对每种其他荧光染料收集的荧光流式细胞仪数据中源自每种荧光染料的溢出扩散效应。矩阵中的每一列对应于被配置为检测不同荧光染料中的一种的检测器，并且矩阵中的每一行对应于被检测的流式细胞仪数据的参数。列和行相交的单元填充有针对该对第一荧光染料和第二荧光染料而计算的溢出扩散系数，该溢出扩散系数指示所讨论的荧光染料(即，第一荧光染料)对相关检测器(即，对从第二荧光染料发射的光的检测)贡献误差的程度。荧光染料引起的溢出扩散的总程度能够通过对它的行中的所有值求和来近似，而检测器受溢出扩散的影响的总程度则能够通过对它的列中的所有值求和来计算。在一些实施例中，溢出扩散系数被求和以计算总扩散效应(即，溢出扩散对荧光流式细胞仪数据的特定子集的累积效应)。
如上所述，在实施例中，如本文所描述的溢出扩散矩阵填充有溢出扩散系数，所述溢出扩散系数是在不识别荧光流式细胞仪数据相对于每种相关的荧光染料的阳性群体和阴性群体的情况下计算的。然而，在一些实施例中，如本文所描述的溢出扩散矩阵填充有溢出扩散系数，所述溢出扩散系数近似于在识别荧光流式细胞仪数据相对于每种相关的荧光染料的阳性群体和阴性群体的情况下计算的溢出扩散系数，即，它们近似于如Nguyen等人(2013)所教导的计算的溢出扩散系数。
处理器还可以被配置为调整荧光流式细胞仪数据以考虑溢出扩散。在一些实施例中，调整荧光流式细胞仪数据，使得其不再包括由溢出扩散引起的误差。在实施例中，调整荧光流式细胞仪数据包括生成溢出扩散被调整的群体。在某些实施例中，生成溢出扩散被调整的群体包括从流式细胞仪数据的相关群体中减去溢出扩散的幅度，即，抵消受到溢出扩散影响的信号的影响。在某些实施例中，溢出扩散的幅度由溢出扩散矩阵确定。在一些实施例中，调整流式细胞仪数据包括从流式细胞仪数据的相关部分中减去总扩散效应。
在一些实施例中，处理器被配置为补偿荧光流式细胞仪数据的溢出。可以使用任何方便的方法来补偿荧光流式细胞仪数据的溢出。在一些实施例中，可以执行解混。解混使用单染色参考对照来分离荧光群并识别与每种荧光染料相关的光谱。在其他实施例中，通过AutoSpill算法执行溢出补偿。
在本发明的一些实施例中，结合补偿荧光流式细胞仪数据的溢出来计算由溢出扩散系数(如上所述获得的)组成的溢出扩散矩阵。这可以在识别或不识别荧光流式细胞仪数据关于每种相关的荧光染料的阳性群体和阴性群体的情况下进行。在一些实施例中，在不识别阳性群体和阴性群体的情况下进行，结合溢出补偿来执行溢出扩散矩阵的计算。在这样的实施例中，通过AutoSpill执行溢出矩阵和溢出补偿的计算。在一些实施例中，如果需要，可以另外调整荧光流式细胞仪数据，以考虑由溢出引起的数据中存在的误差。
在其他实施例中，在识别阳性群体和阴性群体的情况下，结合溢出补偿来执行溢出扩散矩阵的计算。在这样的实施例中，可以通过除AutoSpill之外的算法执行溢出补偿。在实施例中，通过解混来执行补偿。在一些实施例中，如果需要，可以另外调整荧光流式细胞仪数据，以考虑由溢出引起的数据中存在的误差。
图9示出了根据本发明的说明性实施例的用于流式细胞术的系统900。系统900包括流式细胞仪910、控制器/处理器990和存储器995。流式细胞仪910包括一个或更多个激发激光器915a-915c、聚焦透镜920、流动室925、前向散射检测器930、侧向散射检测器935、荧光收集透镜940、一个或更多个分束器945a-945g、一个或更多个带通滤波器950a-950e、一个或更多个长通(“LP”)滤波器955a-955b以及一个或更多个荧光检测器960a-960f。
激发激光器915a-c以激光束的形式发射光。在图9的示例系统中，从激发激光器915a-915c发射的激光束的波长分别为488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导通过分束器945a和分束器945b中的一个或更多个。分束器945a透射488nm的光并反射633nm的光。分束器945b透射UV光(波长为10nm至400nm的光)并反射488nm和633nm的光。
然后，激光束被引导到聚焦透镜920，聚焦透镜920将激光束聚焦到流动室925内液体流的样本的粒子所位于的部分上。流动室是液流系统的一部分，该液流系统将流中的粒子(通常一次一个)引导到聚焦的激光束以进行询问。流动室能够包括台式细胞仪中的流动池或空气流细胞仪(stream-in-air cytometer)中的喷嘴尖端。
来自激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收以及根据粒子的特性(例如其尺寸、内部结构以及附着至粒子或者自然存在于粒子上或粒子中的一种或更多种荧光分子的存在)在不同波长下再发射与样本中的粒子相互作用。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可以经由分束器945a-945g、带通滤波器950a-950e、长通滤波器955a-955b和荧光收集透镜940中的一个或更多个被路由到前向散射检测器930、侧向散射检测器935和一个或更多个荧光检测器960a-960f中的一个或更多个。
荧光收集透镜940收集从粒子-激光束相互作用发射的光，并将该光朝向一个或更多个分束器和滤波器路由。带通滤波器，例如带通滤波器950a-950e，允许窄范围的波长通过滤波器。例如，带通滤波器950a是510/20滤波器。第一个数字表示光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤波器在光谱带中心的每一侧延伸10nm，或从500nm延伸到520nm。短通滤波器透射波长等于或短于指定波长的光。长通滤波器，例如长通滤波器955a-955b，透射波长等于或长于指定光波长的光。例如，作为670nm长通滤波器的长通滤波器955a透射等于或长于670nm的光。通常选择滤波器以优化检测器对特定荧光染料的特异性。滤波器能够被配置为使得透射到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
分束器沿不同方向引导不同波长的光。分束器能够通过诸如短通和长通的滤波器特性来表征。例如，分束器905g是620SP分束器，意思是分束器945g透射620nm或更短的光波长，并沿不同方向反射大于620nm的光波长。在一个实施例中，分束器945a-945g能够包括光学镜，例如分色镜。
前向散射检测器930偏离穿过流动池的直射光束的轴线而定位，并被配置为检测衍射光，该衍射光是主要沿向前方向穿过或围绕粒子传播的激发光。前向散射检测器检测到的光的强度取决于粒子的总体尺寸。前向散射检测器能够包括光电二极管。侧向散射检测器935被配置为检测来自粒子表面和内部结构的折射光和反射光，并且旨在随着粒子结构的复杂性的增加而增加。来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射能够由一个或更多个荧光检测器960a-960f检测。侧向散射检测器935和荧光检测器能够包括光电倍增管。在前向散射检测器930、侧向散射检测器935和荧光检测器处检测到的信号能够由检测器转换成电信号(电压)。该数据能够提供关于样本的信息。
在操作中，细胞仪的操作由控制器/处理器990控制，并且来自检测器的测量数据能够存储在存储器995中并由控制器/处理器990处理。尽管没有明确示出，但控制器/处理器990耦合到检测器以接收来自其的输出信号，并且也可以耦合到流式细胞仪900的电气和机电部件以控制激光器、流体流动参数等。也可以系统中提供输入/输出(I/O)功能997。存储器995、控制器/处理器990和I/O 997可以完全作为流式细胞仪910的组成部分提供。在这样的实施例中，显示器也可以形成I/O功能997的一部分，用于向细胞仪900的用户呈现实验数据。可选地，存储器995和控制器/处理器990以及I/O功能的部分或全部可以是例如通用计算机的一个或更多个外部设备的一部分。在一些实施例中，存储器995和控制器/处理器990的部分或全部能够与细胞仪910进行无线或有线通信。结合存储器995和I/O 997，控制器/处理器990能够被配置为执行与流式细胞仪实验的制备和分析相关的各种功能。
图9所示的系统包括六个不同的检测器，其检测如从流动池925到每个检测器的光束路径中的滤波器和/或分数器的配置所定义的六个不同波段(其可在本文中称为给定检测器的“过滤窗口”)的荧光。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子会发出自己特征波段的光。可以选择用于实验的特定荧光标记及其相关的荧光发射波段以与检测器的过滤窗口大体上重合。然而，随着提供更多的检测器，以及更多的标签的使用，过滤窗口和荧光发射光谱之间的完美对应是不可能的。一般来说，尽管特定荧光分子的发射光谱的峰值可能位于一个特定检测器的过滤窗口内，但该标签的一些发射光谱也会与一个或更多个其他检测器的过滤窗口重叠。这可以称为溢出。I/O 997能够被配置成接收关于流式细胞仪实验的数据，该实验具有荧光标记面板和具有多个标记的多个细胞群体，每个细胞群体具有多个标记的子集。I/O 997还能够被配置为接收将一个或更多个标记分配给一个或更多个细胞群体的生物数据；接收标记密度数据；接收发射光谱数据；接收将标签分配给一个或更多个标记的数据；以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据，如标记光谱特性和流式细胞仪配置数据也能够存储在存储器995中。控制器/处理器990能够被配置为评估标签至标记的一个或更多个分配。
本领域技术人员将认识到，根据本发明的实施例的流式细胞仪不限于图9所示的流式细胞仪，而是能够包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以具有任意数量的激光器、分束器、滤波器和在各种波长下和各种不同配置下的检测器。
图10示出了用于分析和显示数据的处理器1000的一个示例的功能框图。处理器1000能够被配置为实现用于控制生物事件的图形显示的各种过程。流式细胞仪1002能够被配置为通过分析生物样本(例如，如上所述)来获取荧光流式细胞仪数据。该装置能够被配置为向处理器1000提供生物事件数据。在流式细胞仪1002和处理器1000之间能够包括数据通信信道。数据可以通过数据通信信道提供给处理器1000。处理器1000能够被配置为向显示器1006提供包括绘图(例如，如上所述)的图形显示。处理器1000还能够被配置为在由显示设备1006所显示的荧光流式细胞仪数据群体周围呈现门(gate)，例如覆盖在图上。在一些实施例中，门能够是在单参数直方图或双变量图上绘制的一个或更多个感兴趣图形区域的逻辑组合。在一些实施例中，显示器能够用于显示分析物参数或饱和检测器数据。
处理器1000还能够被配置为与门外的荧光流式细胞仪数据中的其他事件不同地在显示设备1006上在门内显示荧光流式细胞仪数据。例如，处理器1000能够被配置为将包含在门内的荧光流式细胞仪数据的颜色渲染得与门外的荧光流式细胞仪数据的颜色不同。以这种方式，处理器1000可以被配置为渲染不同的颜色以代表每个唯一的数据群体。显示设备1006能够被实现为监视器、平板电脑、智能手机或被配置为呈现图形界面的其他电子设备。
处理器1000能够被配置为从第一输入设备接收识别门的门选择信号。例如，第一输入设备能够被实现为鼠标1010。鼠标1010能够向处理器1000发起门选择信号，以识别要在显示设备1006上显示的群体或通过显示设备1006操纵的群体(例如，当光标位于所需门上或在门里时，通过点击门)。在一些实现中，第一设备能够被实现为键盘1008或用于向处理器1000提供输入信号的其他装置，例如触摸屏、触笔、光学检测器或语音识别系统。一些输入设备能够包括多个输入功能。在这样的实施方式中，输入功能中的每个都能够被视为输入设备。例如，如图10所示，鼠标1010能够包括鼠标右键和鼠标左键，鼠标右键和鼠标左键中的每一个都能够生成触发事件。
触发事件能够使处理器1000改变荧光流式细胞仪数据的显示方式、数据的哪些部分实际显示在显示设备1006上，以及/或者向进一步的处理提供输入，例如选择感兴趣的群体进行分析。
在一些实施例中，处理器1000能够被配置为检测何时由鼠标1010发起门选择。处理器1000还能够被配置为自动修改绘图可视化以促选通过程。该修改能够基于处理器1000接收的数据的特定分布。
处理器1000能够连接到存储设备1004。存储设备1004能够被配置为从处理器1000接收和存储数据。存储设备1004还能够被配置为允许由处理器1000检索数据，例如荧光流式细胞仪数据。
显示设备1006能够被配置为从处理器1000接收显示数据。显示数据能够包括荧光流式细胞仪数据的绘图和勾画绘图部分的门。显示设备1006还能够被配置为根据从处理器1000接收的输入以及来自设备1002、存储设备1004、键盘1008和/或鼠标1010的输入来改变呈现的信息。
在一些实现中，处理器1000能够生成用户界面以接收用于分选的示例事件。例如，用户界面能够包括用于接收示例事件或示例图像的控件。示例事件或图像或示例门能够在采集样本的事件数据之前或基于样本的一部分的初始事件集来提供。
计算机控制系统
本公开的各方面还包括计算机控制系统，其中所述系统还包括用于完全自动化或部分自动化的一个或更多个计算机。在一些实施例中，系统包括计算机，该计算机具有其上存储有计算机程序的计算机可读存储介质，其中计算机程序在加载到计算机上时包括以下指令：所述指令用于接收包含从至少第一荧光染料和第二荧光染料收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据；根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度来划分荧光流式细胞仪数据；基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的亮度的调零的标准偏差；通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散；将针对每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数组合在溢出扩散矩阵中；以及基于溢出扩散矩阵调整荧光流式细胞仪数据。
在实施例中，所述系统被配置为在用于分析流式细胞仪数据的软件或分析工具(例如
(Ashland，OR))内分析数据。
是FlowJo有限责任公司(BectonDickinson的子公司)开发的用于分析流式细胞仪数据的软件包。该软件被配置为管理流式细胞仪数据并在其上产生图形报告(https://www(dot)flowjo(dot)com/learn/flowjo-university/flowjo)。能够在数据分析软件或工具(例如
)中通过适当的手段(例如手动选通、集群分析或其他计算技术)进行分析初始数据。即时系统或其一部分能够实现为用于分析数据的软件的软件部件，例如
在这些实施例中，根据本公开的计算机控制系统可以用作现有软件包(例如
)的软件“插件”。
在实施例中，所述系统包括输入模块、处理模块和输出模块。本主题系统可以包括硬件和软件部件，其中硬件部件可以采用一个或更多个平台的形式，例如服务器的形式，使得系统的功能元件，即执行系统的特定任务(例如管理信息的输入和输出、处理信息等)的那些元件，可以通过软件应用在表示系统的一个或更多个计算机平台上或者跨该一个或更多个计算机平台来执行。
系统可以包括显示器和操作员输入设备。操作员输入设备可以是，例如键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，其可以访问其上存储有用于执行本主题方法的步骤的指令的存储器。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元以及许多其他设备。处理器可以是市售处理器，也可以是已经或将要可用的其他处理器之一。处理器以众所周知的方式执行操作系统和操作系统与固件和硬件的接口，并便于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，这些计算机程序可以用如本领域所熟知的各种编程语言(例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言，以及它们的组合)编写。操作系统通常与处理器协作来协调并执行计算机的其他部件的功能。操作系统还根据已知技术提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理、通信控制和相关服务。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，处理器包括模拟电子器件，其允许用户基于第一光信号和第二光信号手动将光源与流动流对准。在一些实施例中，处理器包括提供反馈控制例如负反馈控制的模拟电子器件。
系统存储器可以是各种已知或未来的存储器存储设备中的任何一种。示例包括任何常用的随机存取存储器(RAM)、磁介质诸如常驻硬盘或磁带、光学介质诸如读写致密盘、闪存设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是各种已知的或未来的设备中的任何一种，包括致密盘驱动器、磁带驱动器、可移除硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常分别从程序存储介质(未示出)读取和/或向程序存储介质写入，例如，致密盘、磁带、可移除硬盘或软盘。这些程序存储介质中的任何一种，或现在正在使用或将来可能开发的其他介质，都可以被视为计算机程序产品。应当理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也称为计算机控制逻辑，通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。
在一些实施例中，描述了一种计算机程序产品，该计算机程序包括其中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。当控制逻辑被处理器或计算机执行时，使处理器执行本文描述的功能。在其他实施例中，一些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中实现。实现硬件状态机以执行本文所述的功能对于相关领域的技术人员将是显而易见的。
存储器可以是处理器在其中能够存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁、光或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他合适的固定或便携式设备)。处理器可以包括通用数字微处理器，其从携带必要程序代码的计算机可读介质适当地编程。编程能够通过通信信道远程提供给处理器，或者使用那些与存储器连接的任何设备预先保存在计算机程序产品(诸如存储器或其它一些便携式或固定的计算机可读存储介质)中。例如，磁盘或光盘能够承载编程，并且可以由磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统也包括编程，例如以计算机程序产品的形式、用于实践上述方法的算法的形式。根据本发明的编程能够记录在计算机可读介质上，例如能够由计算机直接读取和访问的任何介质上。此类介质包括但不限于：磁存储介质，如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，诸如CD-ROM；电存储介质，诸如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合，例如磁/光存储介质。
处理器还可以访问通信信道以与远程位置的用户通信。远程位置是指用户不直接与系统接触，并将输入信息从外部设备(例如连接到广域网(WAN)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信信道的计算机，包括移动电话(即智能手机))中继到输入管理器。
在一些实施例中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一设备通信的接收器和/或发射器。通信接口能够被配置为用于有线通信或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信(例如，射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、
通信协议和蜂窝通信诸如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM)。
在一个实施例中，通信接口被配置为包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或诸如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电连接端口的接口，以允许在本主题系统和诸如被配置为类似的互补数据通信的计算机终端(例如，在医生办公室或医院环境中)的其它外部设备之间进行数据通信。
在一个实施例中，通信接口被配置为用于红外通信、
通信或任何其他合适的无线通信协议，以使本主题系统能够与其他设备通信，例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理、或者用户可以结合使用的任何其他通信设备。
在一个实施例中，通信接口被配置为通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、连接到因特网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接或在WiFi热点处连接到因特网的WiFi连接，利用因特网协议(IP)提供用于数据传输的连接。
在一个实施例中，本主题系统被配置为通过通信接口与服务器设备无线通信，例如，使用诸如802.11或
协议或IrDA红外协议的通用标准与服务器设备无线通信。服务器设备可以是另一便携式设备，例如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本电脑；或者是更大的设备，例如台式电脑、电器等。在一些实施例中，服务器设备具有显示器(例如液晶显示器(LCD))以及输入设备，例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。
在一些实施例中，通信接口被配置为使用上述通信协议和/或机制中的一个或更多个与网络或服务器设备自动或半自动地传送存储在主题系统中的数据，例如存储在可选数据存储单元中的数据。
输出控制器可以包括用于各种已知显示设备中的任何一种的控制器，用于向用户(无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的)呈现信息。如果显示设备之一提供视觉信息，则该信息通常可以逻辑地和/或物理地组织为图像元素的阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在系统和用户之间提供图形输入和输出接口以及用于处理用户输入的各种已知或未来软件程序中的任何一种。计算机的功能元件可以通过系统总线彼此通信。这些通信中的一些可以在替代实施例中使用网络或其他类型的远程通信来完成。根据已知技术，输出管理器也可以例如通过因特网、电话或卫星网络向远程位置的用户提供由处理模块生成的信息。输出管理器对数据的呈现可以根据各种已知的技术来实现。作为示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件，或其他形式的数据。数据可以包括因特网URL地址，以便用户可以从远程源检索附加的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。本主题系统中存在的一个或更多个平台可以是任何类型的已知的计算机平台或将来要开发的类型，尽管它们通常是称为服务器的计算机类。然而，它们也可以是主机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的线缆或包括无线系统的其他通信系统(无论是联网的还是其他的)来连接。它们可能位于同一地点，也可能在物理上分开。可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或制造，可以在任何计算机平台上采用各种操作系统。适当的操作系统包括Windows NT、Windows XP、Windows 7、Windows 8、iOS、Sun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGI IRIX、Siemens Reliant Unix以及其他。
图11描绘了根据某些实施例的示例计算设备1100的一般架构。图11中描绘的计算设备1100的一般架构包括计算机硬件部件和软件部件的布置。然而，没有必要为了提供使能的公开而示出所有这些通常常规的元件。如图所示，计算设备1100包括处理单元1110、网络接口1120、计算机可读介质驱动器1130、输入/输出设备接口1140、显示器1150和输入设备1160，所有这些都可以通过通信总线彼此通信。网络接口1120可以提供到一个或更多个网络或计算系统的连接。因此，处理单元1110可以经由网络从其他计算系统或服务接收信息和指令。处理单元1110还可以与存储器1170通信，并通过输入/输出设备接口1140进一步为可选显示器1150提供输出信息。例如，作为可执行指令存储在分析系统的非暂时性存储器中的分析软件(例如，如
的数据分析软件或程序)，能够向用户显示流式细胞术事件数据。输入/输出设备接口1140还可以接受来自可选输入设备1160的输入，例如键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏操纵杆、加速度计、陀螺仪或其他输入设备。
存储器1170可以包含处理单元1110为了实现一个或更多个实施例而执行的计算机程序指令(在一些实施例中被分组为模块或部件)。存储器1170通常包括RAM、ROM和/或其他永久性、辅助性或非暂时性计算机可读介质。存储器1170可以存储操作系统1172，该操作系统1172提供计算机程序指令以供处理单元1110在计算设备1100的一般管理和操作中使用。数据可以存储在数据存储设备1190中。存储器1170还可以包括用于实现本公开的各方面的计算机程序指令和其他信息。
计算机可读存储介质
本公开的各方面还包括具有用于实践本主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。可以在一台或更多台计算机上使用计算机可读存储介质，以实现用于实践本文所述方法的系统的完全自动化或部分自动化。在一些实施例中，根据本文描述的方法的指令能够以“编程”的形式编码到计算机可读介质上，其中本文使用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和数据以供执行和处理的任何非暂时性存储介质。合适的非暂时性存储介质的示例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光光盘、固态磁盘和网络连接存储(NAS)，无论这些设备是否在计算机内部或外部。在一些实例中，可以在集成电路设备上提供指令。在某些实例中，感兴趣的集成电路设备可以包括可重新配置的现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)或复杂可编程逻辑器件(CPLD)。包含信息的文件能够“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”意味着记录信息，以便日后计算机可以访问和检索。本文所描述的计算机实现的方法能够使用编程来执行，该编程能够用任意数量的计算机编程语言中的一种或更多种来编写。这些语言包括，例如：Java(Sun Microsystems，Inc.，Santa Clara，CA)、Visual Basic(MicrosoftCorp.，Redmond，WA)和C++(AT&T Corp.，Bedminster，NJ)以及任何其他语言。
在一些实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括存储在其上的计算机程序，其中计算机程序在加载到计算机上时包括以下指令：所述指令用于接收包含从至少第一荧光染料和第二荧光染料收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据；根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度来划分荧光流式细胞仪数据；基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散；将针对每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数组合在溢出扩散矩阵中；以及基于溢出扩散矩阵调整荧光流式细胞仪数据。
在实施例中，系统被配置为在用于分析流式细胞仪数据的软件或分析工具(例如
(Ashland，OR))内分析数据。能够在数据分析软件或工具(例如
)中通过适当的手段(例如手动选通、集群分析或其他计算技术)分析初始数据。本系统或其一部分能够实现为用于分析数据的软件的软件部件，例如
在这些实施例中，根据本公开的计算机控制系统可以用作现有软件包(例如
)的软件“插件”。
计算机可读存储介质可以用于具有显示器和操作员输入设备的一个或更多个计算机系统。操作员输入设备可以是例如：键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，其可以访问其上存储有用于执行本主题方法的步骤的指令的存储器。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元以及许多其他设备。处理器可以是市售处理器，也可以是已经或将要可用的其他处理器之一。处理器以众所周知的方式执行操作系统和操作系统与固件和硬件的接口，并便于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，这些计算机程序可以用如本领域所熟知的各种编程语言编写，例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言，以及它们的组合。操作系统还根据已知技术提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理、通信控制和相关服务。
实用性
本主题设备、方法和计算机系统可以用于期望提高生物样本中的分析物(例如，细胞、粒子)的参数确定的分辨率和准确性的各种应用中。例如，本公开可用于分析受溢出扩散影响的数据。因为流式细胞术通常涉及由多个检测器收集多个荧光参数，所以由于相同的光被多个检测器检测到而导致检测到的荧光强度可能会错误地增加。因此，本公开在分析流式细胞仪数据期间使用，该流式细胞仪数据包含来自多种荧光染料的信号。本主题设备、方法和计算机系统特别适用于表征流式细胞仪数据中的溢出扩散，该流式细胞仪数据具有定义不明确的阳性群体和阴性群体。在一些实施例中，本主题方法和系统提供完全自动化的协议，使得对数据的调整只需要很少的(如果有的话)人工输入。
本公开能够用于表征多种类型的分析物，特别是与医疗诊断或护理患者的方案相关的分析物，包括但不限于：蛋白质(包括游离蛋白质和结合到结构(例如细胞)表面的蛋白质)、核酸、病毒颗粒等。此外，样本能够来自体外来源或体内来源，并且样本能够是诊断样本。
套件
本公开的各方面还包括套件，其中套件包括存储介质，例如：软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光光盘、固态盘和网络连接存储(NAS)。这些程序存储介质中的任何一种或目前正在使用或将来可能开发的其他介质，都可以包含在本主题套件中。在实施例中，程序存储介质包括以下的指令：所述指令用于将荧光流式细胞仪数据聚类为群体、确定群体的溢出扩散、基于溢出扩散调整流式细胞仪数据以及确定调整后的流式细胞仪数据之间的划分(例如，如上所述)。在实施例中，包含在本主题套件中或其一部分中提供的计算机可读介质上的指令能够被实现为用于分析数据的软件的软件部件，例如
在这些实施例中，根据本公开的计算机控制系统可以用作现有软件包(例如
)的软件“插件”。
除了上述部件之外，本主题套件还可以包括(在一些实施例中)指令，例如用于将插件安装到现有软件包(如
)。这些指令可能以多种形式存在于本主题套件中，其中一条或更多条可能存在于套件中。这些指令可以呈现的一种形式是作为合适的介质或基底上的打印信息，例如，在套件包装中、在包装插页等中其上打印有信息的一张或多张纸。这些指令的另一种形式是其上记录了信息的计算机可读介质，例如软盘、致密盘(CD)、便携式闪存驱动器等。可能存在的这些指令的另一种形式是网站地址，该网站地址可以通过互联网访问被移除站点的信息。
实验性的
数据集
MM1数据集(小鼠脾细胞)：对于单染色对照，用载玻片破坏C57Bl/6小鼠的脾细胞，通过100μm筛网过滤，并溶解红细胞。根据制造商的说明，用Foxp3转录因子染色缓冲液组(Transcription Factor Staining Buffer Set)(eBioscience)固定和渗透细胞，并在4℃下用可固定活性染料eFluor780(eBioscience)或以下抗体染色过夜：抗CD4-BV421、抗CD24-BV510、抗CD3-BV570、抗CD4-BV605、抗CD3-BV650、抗CD4-BV711、抗CD4-BV785、抗CD3-AF488/抗CD4-AF488/抗TCRβ-AF488、抗CD4-PerCP-Cy5.5、抗CD4-PE-594、抗CD8-PE-Cy7、抗MHC-II-AF700(全部均为Biolegend)、抗CD19-BV750、抗CD3-BB630-P/抗Thy1.2-BB630-P、抗CD45.2-BB660-P2/抗CD3-BB660-P2、抗TCRb-BB790-P/抗CD45-BB790-P、抗CD4-BUV395、抗CD4-BUV496、抗CD3-BUV563、抗CD3-BUV615-P、抗CD19-BUV661、抗CD21-BUV737、抗CD8-BUV805(全部均为BD Biosciences)、抗CD4-PE/抗CD3-PE/抗CD8-PE、抗IgM-PE-Cy5、抗CD3-PE-Cy5.5或抗CD4-APC/抗CD8-APC(全部均为eBioscience)。对于某些荧光团，在同一补偿对照中使用了多种抗体，用斜线表示。在Symphony流式细胞仪(BD Biosciences)上采集样本。
HS1数据集(人类PBMC)：使用Ficoll-Paque密度离心法(MP生物医学)从人类健康供体的肝素化血液样本中分离外周血单核细胞(PBMC)，该外周血单核细胞被冷冻，然后储存在液氮中。将冷冻的PBMC解冻并计数，并将细胞浓度调整为1×106，用于每个单色对照。将细胞接种在V形底96孔板中，用PBS(Fisher Scientific)洗涤一次，并用活/死标记和针对表面标记的荧光染料缀合抗体染色：抗CD8-BUV805、抗CD4-BUV496、抗CD95-BUV737、抗CD4-BUV615-P、抗CD28-BB660-P、抗CD4-BB630、抗CD4-BV750-P、抗CD31-BV480、抗CXCR5-BV650、抗CD4-PE、抗CD4-PE-Cy5(全部均为BD Biosciences)；抗CD3-PerCP-Vio700(Miltenyi Biotec)；抗CD3-FITC、抗CD4-PE-Cy5.5、抗CCR7-PE-Cy7、抗CD4-eFluor780(全部均为eBioscience)；抗CD4-BV786、抗CD4-BV711、抗CD4-BV605、抗HLA-DR-BV570、抗CD127-BV421、抗CD4-PE/Dazzle 594、抗CD4-AF647(全部均为BioLegend)。
根据制造商的说明，样本在4℃下染色60分钟，在PBS/1％ FBS(Tico Europe)中洗涤两次，然后用Foxp3转录因子染色缓冲液组(eBioscience)固定和渗透。细胞在4℃下储存过夜，然后在Symphony流式细胞仪上用Diva软件(BD Biosciences)采集。针对每个样本采集最少5×104个事件。
HS2数据集(人类PBMC)：与HS1组一样，处理来自人类健康供体的冷冻PBMC，并用活/死标记和针对以下表面标记的荧光染料缀合抗体染色：抗CD8-BUV805、抗CD4-BUV496、抗CD-95-BUV737、抗CD28-BB660-P、抗ICOS-BB630、抗CXCR3-BV785、抗PD-1-BV750-P、抗CXCR5-BV650、抗CCR2-BV605(全部均为BD Biosciences)；抗CD3-PerCP-Vio700(MiltenyiBiotec)；抗CD45RA-FITC、抗CD14-PE-Cy5.5、可固定活性染料eFluor780(全部均为eBioscience)；抗CD25-BV711、抗CD31-BV480、抗HLA-DR{BV570、抗CD127{BV421、抗CCR4-PE/Dazzle 594、抗CCR-7-PE-Cy7(全部均为BioLegend)。
根据制造商的说明，样本在4℃下染色60分钟，在PBS/1％ FBS(Tico Europe)中洗涤两次，然后用Foxp3转录因子染色缓冲液组(eBioscience)固定和渗透。在4℃下用抗Ki67-BUV615-P、抗CTLA-4-PE-Cy5、抗RORt-PE(BD Biosciences)和抗FOXP3-AF647(BioLegend)抗人类细胞内抗体对细胞染色过夜。在Symphony流式细胞仪(BDBiosciences)上采集样本。
Be1数据集(珠)：超压缩电珠(UltraComp eBead)。补偿珠(ThermoFisher)用于优化Symphony流式细胞仪的多色流式细胞分析的荧光补偿设置。超压缩电珠使用以下荧光染料标记的抗人类抗体染色：抗CD8-BUV805、抗CD4-BUV496、抗CD86-BUV737、抗CD141-BUV615-P、抗CD56-BUV563、抗CD16-BUV395、抗CD123-BB660-P、抗CD80-BB630、抗CD21-BV785、抗CD27-BV750-P、抗BAFF-R-BV650、抗CD94-BV605、抗CD40-APC-R700(全部均为BDBiosciences)；抗CD3-PerCP-Vio700(MiltenyiBiotec)；抗CD57-FITC、抗CD14-PE-Cy5.5、可固定活性染料eFluor780(全部均为eBioscience)；抗CD24-BV711、抗CD19-BV480、抗HLA-DR-BV570、抗IgM-BV421、抗CD11c-APC、抗CD38-PE/Dazzle594、抗CD10-PE-Cy5、抗IgD-PE-Cy7(全部均为BioLegend)。
初始选通
使用包装彩色片v.1.3-9进行细分，而使用包装字段v.10.3和sp v.1.4-1进行密度估计和空间运算。针对每个对照组根据前向散射和侧向散射(FSC-A和SSC-A参数)通过事件的二维密度独立计算初始门。为了可靠地检测感兴趣的群体，进行了两步细分以分离所需的密度峰。首先，根据极值(1％和99％)调整数据。然后，在二维密度的软估计上，通过移动平均值(窗口大小3)在数值上定位最大值。在这些密度最大值上进行第一次细分，并选择对应于最高的最大值的切片，忽略接近FSC-A和SSC-A较低值的峰值。通过使用所选切片中包含的事件的中位数和3倍的平均绝对偏差来选择FSC-A/SSC-A平面中的矩形区域。其次，对该区域进行更精细的二维密度估计，然后再次对最大值(窗口大小2)进行数值检测，并根据最大值进行细分。最后，门被定义为包围点的凸包，被包围的点的密度大于阈值(默认值为最大值的33％)且属于包含最高的最大值的切片。
方法
溢出扩散的表征在R v.3.6.3中使用包装flowCore v.1.50.0、流工作空间(flow-Workspace)v.3.32.0和ggplot2 v.3.3.0实现。溢出扩散定义为一个参数中荧光强度的标准偏差因另一个参数的荧光强度增加而增加。对于对应于主要检测器的单色对照中的一对阳性群体和阴性群体，通过将主要检测器中的荧光强度与次要检测器中的荧光的标准偏差进行比较，能够计算溢出扩散系数(Nguyen等人，2013)。
SSM系数的常规公式
表征了由来自参数P的溢出而在参数C中引起的标准偏差的增量(Nguyen等人，2013)，
其中σpositive和σnegative分别是阳性群体和阴性群体中C-荧光的标准偏差，并且Fpositive-Fnegative是它们之间P-荧光强度的差异。虽然常规算法使用阳性群体和阴性群体中荧光的中值和稳健标准偏差来估计述数量，但为了线性回归，当P-荧光(F)等于零时，假设阴性为理论量，而标准差为未知量(σ0)。这导致将F与σ相关的以下公式，该公式适用于通过线性回归估计σ0：
斜率β不等于溢出扩散系数
除了σ0等于零的唯一情况。
为了为回归提供数据，对参数P的单一颜色-颜色对照的事件按分位点进行划分。对于具有大量事件的对照，使用256个分位点，但可以使用少至8个分位点来确保每个分位点中有足够的事件来可靠地估计标准偏差。对于每个其他参数C，计算荧光的稳健标准差(第84个百分位减去中值)作为σ的估计，并且计算中值荧光被计算作为F的估计。F值可能是负的和/或接近于零，因此它们在回归之前经过由
定义的类似平方根的变换，而不是简单的平方根函数。由此得到的回归提供了σ0的估计。
使用σ0的估计，为每个分位点计算由
所定义的调零的标准偏差σ′的估计，并且这些调整后的标准偏差为第二回归提供了数据，
该回归的计算不需要截距项，因为σ0的调整迫使它为零。
结果
这里，使用分位点划分和线性回归来估计Nguyen等人观察到的线性关系，从而允许包含在原始方法的阳性群体和阴性群体之上、之下或其中的事件。在主要检测器中对每个单色对照的事件进行分位点划分，并在每个次要检测器中针对每个分位点窗估计自体荧光水平的标准偏差。接下来，使用两个线性回归来估计，首先是零荧光下的标准偏差，然后是溢出扩散系数。使用F测试被认为不显著的系数被替换为零，任何负系数也是如此。事实上，大多数分位点是常规阳性群体和阴性群体的子样本，但包括额外的分位点提高了估计溢出扩散效应的精度，因为所有这些事件都符合相同的线性关系，假设所有这些事件都在流式细胞仪的比例和线性范围内(图12)。如图12所示，在没有明确定义阳性群体和阴性群体的情况下，针对对照组MM1(左)和HS1(右)在每组的一个单色对照的选通的事件上进行回归分析，其中主要通道和次要通道分别在y轴和x轴上指示。未补偿数据点以蓝色显示，并且补偿数据点以黑色显示。未补偿数据的回归用虚线显示，而补偿数据的回归用实线显示。
结果，补偿矩阵成功正交化单色对照中存在的荧光信号的数据集的溢出扩散被精准地估计(图13)。如图13所示，针对对照组MM1(左)和HS1(右)，在本方法和通常的溢出扩展矩阵算法之间进行了结果比较，显示了两种计算之间的小差异。值以差值绝对值的对数尺度显示，以正值(实线)和负值(虚线)分隔。
调整步骤(第一回归)消除了初始估计中由σ0引起的微小二次效应，从而允许更准确地估计SS系数。如果跳过这一调整步骤，也就是说，如果将β'作为溢出扩散系数，则扩散效应将持续被低估。在这种情况下，与常规SSM算法的比较将显示明显的负偏差(图14)。包括调整步骤消除了这种偏差。
如图14所示，针对对照组MM1(左)和HS1(右)在本方法和通常的SSM算法之间获得的结果进行了比较，但忽略了本方法中的第一线性回归，这导致用它获得的系数出现系统性向下偏差。比例尺和线代码与图13中的相同。
尽管有所附权利要求，本公开也由以下条款定义：
1、一种表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的方法，所述方法包括：
根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度，将所述荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点，所述荧光流式细胞仪数据包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号；
基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及
通过第二线性回归从所述调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。
2、根据条款1所述的方法，其中第一线性回归包括计算从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根与从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的线性拟合。
3、根据条款2所述的方法，其中估计所述调零的标准偏差还包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过确定从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根和从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的所计算的线性拟合的y截距来计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差，以及基于所确定的y截距调整从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差。
4、根据条款1至3中任一项所述的方法，其中第二线性回归包括针对每个所划分的分位点计算所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
5、根据条款4所述的方法，其中计算溢出扩散系数包括获得所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的所计算的线性拟合的斜率。
6、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述溢出扩散系数根据公式1计算：
其中：
SS是溢出扩散系数；
σ是从第二荧光染料收集的光的标准偏差；
σ0是基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计；以及
F是从第一荧光染料收集的光的中值强度。
7、根据前述条款中任一项所述的方法，其中第一线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
8、根据前述条款中任一项所述的方法，其中第二线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
9、根据条款1至6中任一项所述的方法，其中第一线性回归和第二线性回归是加权最小二乘模型。
10、根据条款1至6中任一项所述的方法，其中第一线性回归和第二线性回归是稳健线性模型。
11、根据条款1所述的方法，还包括将第一线性回归和第二线性回归组合在组合线性回归模型中，所述组合线性回归模型被配置为计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的平方与从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
12、根据条款11所述的方法，其中所述组合线性回归模型被配置为基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设来计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差，并同时获得所述溢出扩散系数。
13、根据条款11或12所述的方法，其中所述组合线性回归模型选自加权最小二乘模型和稳健线性模型。
14、根据前述条款中任一项所述的方法，其中分位点的数量基于所述荧光流式细胞仪数据的大小来确定。
15、根据条款14所述的方法，其中分位点的数量为8到256。
16、根据前述条款中任一项所述的方法，还包括接收包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据。
17、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述荧光流式细胞仪数据是从由多种不同的荧光染料发射的光收集的。
18、根据条款17所述的方法，其中所述多种不同的荧光染料为3至30种不同的荧光染料。
19、根据条款17或18所述的方法，还包括针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算溢出扩散系数。
20、根据条款17至19中任一项所述的方法，其中针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数被组合在溢出扩散矩阵中。
21、根据条款20所述的方法，还包括基于所述溢出扩散矩阵调整流式细胞仪数据。
22、根据前述条款中任一项所述的方法，还包括计算荧光溢出矩阵。
23、根据条款22所述的方法，其中所述荧光溢出矩阵是在不需要识别针对特定荧光染料呈阳性的荧光流式细胞仪数据群体和针对特定荧光染料呈阴性的荧光流式细胞仪数据群体的情况下确定的。
24、根据条款22所述的方法，还包括识别针对特定荧光染料呈阳性的荧光流式细胞仪数据群体和针对特定荧光染料呈阴性的荧光流式细胞仪数据群体。
25、根据条款22至24中任一项所述的方法，还包括基于荧光溢出矩阵补偿流式细胞仪数据的溢出。
26、一种系统，包括：
粒子分析仪部件，其被配置为获得荧光流式细胞仪数据；以及
处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器：
根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度，将所述荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点，所述荧光流式细胞仪数据包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号；
基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及
通过第二线性回归从所述调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。
27、根据条款26所述的系统，其中第一线性回归包括计算从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根与从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的线性拟合。
28、根据条款27所述的系统，其中估计所述调零的标准偏差还包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过确定从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根和从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的所计算的线性拟合的y截距来计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差，以及基于所确定的y截距调整从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差。
29、根据条款26至28中任一项所述的系统，其中第二线性回归包括针对每一个所划分的分位点计算所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
30、根据条款29所述的系统，其中计算溢出扩散系数包括获得所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的所计算的线性拟合的斜率。
31、根据条款26至30中任一项所述的系统，其中所述溢出扩散系数根据公式1计算：
其中：
SS是溢出扩散系数；
σ是从第二荧光染料收集的光的标准偏差；
σ0是基于从第一荧光染料收集的光强度为零的假设，从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计；以及
F是从第一荧光染料收集的光的中值强度。
32、根据条款26至31中任一项所述的系统，其中第一线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
33、根据条款26至32中任一项所述的系统，其中第二线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
34、根据条款26至31中任一项所述的系统，其中第一线性回归和第二线性回归是加权最小二乘模型。
35、根据条款26至31中任一项所述的系统，其中第一线性回归和第二线性回归是稳健线性模型。
36、根据条款26所述的系统，还包括将第一线性回归和第二线性回归组合在组合线性回归模型中，所述组合线性回归模型被配置为计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的平方与从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
37、根据条款36所述的系统，其中所述组合线性回归模型被配置为基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设来计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差，并同时获得所述溢出扩散系数。
38、根据条款36或37所述的系统，其中所述组合线性回归模型选自加权最小二乘模型和稳健线性模型。
39、根据条款26至38中任一项所述的系统，其中分位点的数量基于所述荧光流式细胞仪数据的大小来确定。
40、根据条款39所述的系统，其中分位点的数量为8到256。
41、根据条款26至40中任一项所述的系统，还包括接收包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据。
42、根据条款26至41中任一项所述的系统，其中所述荧光流式细胞仪数据是从由多种不同的荧光染料发射的光收集的。
43、根据条款42所述的系统，其中所述多种不同的荧光染料为3至30种不同的荧光染料。
44、根据条款42或43所述的系统，还包括针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算溢出扩散系数。
45、根据条款42至44中任一项所述的系统，其中针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数被组合在溢出扩散矩阵中。
46、根据条款45所述的系统，还包括基于所述溢出扩散矩阵调整流式细胞仪数据。
47、根据条款26至46中任一项所述的系统，还包括计算荧光溢出矩阵。
48、根据条款47所述的系统，其中所述荧光溢出矩阵是在不需要识别针对特定荧光染料呈阳性的荧光流式细胞仪数据群体和针对特定荧光染料呈阴性的荧光流式细胞仪数据群体的情况下确定的。
49、根据条款47所述的系统，还包括识别针对特定荧光染料呈阳性的荧光流式细胞仪数据群体和针对特定荧光染料呈阴性的荧光流式细胞仪数据群体。
50、根据条款47至49中任一项所述的系统，还包括基于荧光溢出矩阵补偿流式细胞仪数据的溢出。
51、一种非暂时性计算机可读存储介质，其包括存储在其上的指令，所述指令用于通过包含以下的方法来表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散：
根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度，将所述荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点，所述荧光流式细胞仪数据包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号；
基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及
通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。
52、根据条款51所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中第一线性回归包括计算从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根与从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的线性拟合。
53、根据条款52所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中估计所述调零的标准偏差还包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过确定从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根和从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的所计算的线性拟合的y截距来计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差，以及基于所确定的y截距调整从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差。
54、根据条款51至53中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中第二线性回归包括针对每一个所划分的分位点计算所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
55、根据条款54所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中计算溢出扩散系数包括获得所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的所计算的线性拟合的斜率。
56、根据条款51至55中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述溢出扩散系数根据公式1计算：
其中：
SS是溢出扩散系数；
σ是从第二荧光染料收集的光的标准偏差；
σ0是基于从第一荧光染料收集的光强度为零的假设，从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计；以及
F是从第一荧光染料收集的光的中值强度。
57、根据条款51至56中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中第一线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
58、根据条款51至57中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中第二线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
59、根据条款51至56中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中第一线性回归和第二线性回归是加权最小二乘模型。
60、根据条款51至56中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，第一线性回归所述和第二线性回归是稳健线性模型。
61、根据条款51所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括将第一线性回归和第二线性回归组合在组合线性回归模型中，所述组合线性回归模型被配置为计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的平方与从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
62、根据条款61所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述组合线性回归模型被配置为基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设来计算从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差，并同时获得所述溢出扩散系数。
63、根据条款61或62所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述组合线性回归模型选自加权最小二乘模型和稳健线性模型。
64、根据条款51至63中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中分位点的数量基于所述荧光流式细胞仪数据的大小来确定。
65、根据条款64所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中分位点的数量为8到256。
66、根据条款51至65中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括接收包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据。
67、根据条款51至66中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述荧光流式细胞仪数据是从由多种不同的荧光染料发射的光收集的。
68、根据条款67所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述多种不同的荧光染料为3至30种不同的荧光染料。
69、根据条款67或68所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算溢出扩散系数。
70、根据条款67至69中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数被组合在溢出扩散矩阵中。
71、根据条款70所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括基于所述溢出扩散矩阵调整流式细胞仪数据。
72、根据条款51至71中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括计算荧光溢出矩阵。
73、根据条款72所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述荧光溢出矩阵是在不需要识别针对特定荧光染料呈阳性的荧光流式细胞仪数据群体和针对特定荧光染料呈阴性的荧光流式细胞仪数据群体的情况下确定的。
74、根据条款72所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括识别针对特定荧光染料呈阳性的荧光流式细胞仪数据群体和针对特定荧光染料呈阴性的荧光流式细胞仪数据群体。
75、根据条款72至74中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括基于荧光溢出矩阵补偿流式细胞仪数据的溢出。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过图示和示例的方式对上述发明进行了一些详细描述，但是根据本发明的教导，本领域普通技术人员很容易理解，在不脱离所附权利要求的精神或范围的前提下，可以对其进行一些改变和修改。
因此，上述说明仅说明本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，尽管这里没有明确描述或示出，但这些布置体现了本发明的原理，并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人对本领域的进一步发展所贡献的概念，并且应理解为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本文中描述本发明的原理、方面和实施例以及其具体示例的所有陈述旨在包括其结构和功能等效物。此外，预期此类等效物包括当前已知的等效物和未来开发的等效物，即，无论结构如何，开发的执行相同功能的任何元件。此外，本文所公开的任何内容都无意专门向公众开放，无论该公开是否在权利要求书中明确描述。
因此，本发明的范围不限于本文所示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。在权利要求中，35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(f)明确定义为，仅当权利要求中的限制开始时描述了确切短语“用于……的装置”或确切短语“用于……的步骤”时，才援引该权利要求的限制；如果在权利要求的限制中未使用该确切短语，则不会援引35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)。
Claims (15)
1.一种表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散的方法，所述方法包括：
根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度，将所述荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点，所述荧光流式细胞仪数据包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号；
基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及
通过第二线性回归从调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一线性回归包括计算从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根与从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的线性拟合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中估计所述调零的标准偏差还包括基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过确定从第一荧光染料收集的光的中值强度的平方根和从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差之间的所计算的线性拟合的y截距来计算从第二荧光染料发射的光的强度的标准偏差，以及基于所确定的y截距调整从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中第二线性回归包括针对每一个所划分的分位点计算所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的线性拟合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中计算所述溢出扩散系数包括获得所述调零的标准偏差和从第一荧光染料收集的光的中值强度之间的所计算的线性拟合的斜率。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溢出扩散系数根据公式1计算：
其中：
SS是溢出扩散系数；
σ是从第二荧光染料收集的光的标准偏差；
σ0是基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，从第二荧光染料收集的光的强度的标准偏差的估计；以及
F是从第一荧光染料收集的光的中值强度。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第二线性回归选自普通最小二乘模型、加权最小二乘模型和稳健线性模型。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中分位点的数量基于所述荧光流式细胞仪数据的大小来确定。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括接收包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号的荧光流式细胞仪数据。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光流式细胞仪数据是从由多种不同的荧光染料发射的光收集的。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算溢出扩散系数。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中针对所述多种荧光染料中的每对第一荧光染料和第二荧光染料计算的溢出扩散系数被组合在溢出扩散矩阵中。
14.一种系统，包括：
粒子分析仪部件，其被配置为获得荧光流式细胞仪数据；以及
处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器：
根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度，将所述荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点，所述荧光流式细胞仪数据包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号；
基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及
通过第二线性回归从所述调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。
15.一种非暂时性计算机可读存储介质，其包括存储在其上的指令，所述指令用于通过包括以下的方法来表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散：
根据荧光流式细胞仪数据相对于第一荧光染料的强度，将所述荧光流式细胞仪数据划分为多个分位点，所述荧光流式细胞仪数据包括从由第一荧光染料和第二荧光染料发射的光收集的强度信号；
基于从第一荧光染料收集的光的强度为零的假设，通过第一线性回归针对所划分的分位点中的每一个估计从第二荧光染料收集的光的强度的调零的标准偏差；以及
通过第二线性回归从所述调零的标准偏差获得溢出扩散系数，以表征在针对第二荧光染料获得的流式细胞仪数据中源自第一荧光染料的溢出扩散。
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