CN117242329A - 对流式细胞仪数据进行分类的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了对流式细胞仪数据进行分类的方法。感兴趣的方法包括：接收第一门和流式细胞仪数据、扩展第一门以生成第二门、以及确定由第一门和第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类。在实施例中，方法还涉及记录被分类的流式细胞仪数据的子集并且可选地基于所记录的数据调整第一门和/或第二门。在一些情况下，本主题的方法包括基于第一门和第二门对与被分类的流式细胞仪数据相关联的颗粒进行分选。还提供了用于实践本发明的系统和计算机可读存储介质。

Description

对流式细胞仪数据进行分类的方法和系统
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求享有2021年6月4日提交的美国临时专利申请序列号63/196,848的申请日的优先权；该申请的公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
生物体液中分析物的表征已成为生物研究、医学诊断以及患者整体健康和保健评估的重要组成部分。检测生物体液(例如人血液或血液衍生产品)中的分析物可以提供可以在确定患有多种疾病的患者的治疗方案中发挥作用的结果。
流式细胞术是一种用于表征并经常对生物材料(例如血液样品的细胞或另一种类型的生物或化学样品中的感兴趣的颗粒)进行分选的技术。流式细胞仪通常包括用于接收流体样品(例如血液样品)的样品储存器和包含鞘液的鞘液储存器。流式细胞仪将流体样品中的颗粒(包括细胞)作为细胞流输送至流动池，同时还将鞘液引导至流动池。为了表征流动流的成分，用光照射流动流。流动中材料的变化(例如形态或荧光标签的存在)可能会导致观察到的光发生变化，并且这些变化允许表征和分离。为了表征流动流中的成分，光必须作用于流动流并被收集。流式细胞仪中的光源能够变化，并且可以包括一个或更多个广谱灯、发光二极管以及单波长激光器。光源与流动流对齐，并且收集并量化来自被照射颗粒的光学响应。
通过向流式细胞仪添加分选或收集功能实现了生物颗粒的分离。通过机械或电去除从样品流中单独分离被检测为具有一种或更多种期望特性的分离流中的颗粒。常见的流分选技术利用液滴分选，其中包含线性分离颗粒的流动流被断裂成液滴。包含感兴趣的颗粒的液滴带电并通过电场偏转到收集管中。通常，流中线性分离的颗粒在他们通过位于喷嘴尖端正下方的观察点时被表征。一旦颗粒被识别为满足一个或更多个期望标准，就可以预测其到达液滴断裂点并从流中断裂为液滴的时间。理想情况下，在包含所选颗粒的液滴从流动流中即将断裂之前，对流动流施加短暂的电荷，然后在液滴断裂后该电荷立即接地。待分选的液滴在从流动流中断裂时保持电荷，并且所有其他液滴均不带电。
使用流式细胞仪测量的参数通常包括：由颗粒沿着主要前向方向以窄角度散射(称为前向散射(FSC))的激发波长下的光；由颗粒沿与激发激光器正交的方向散射(称为侧向散射(SSC))的激发光；以及一个或更多个检测器(其测量在光谱波长范围内的信号)中的从荧光分子发射的光，或者由主要在该特定检测器或检测器阵列中检测到的荧光染料发射的光。不同的细胞类型能够通过其光散射特性和荧光发射来识别，荧光发射是由于利用被荧光染料标记的抗体或其他荧光探针标记各种细胞蛋白或其他组分而产生的。
流式细胞仪还可以包括用于记录测量数据并分析数据的装置。例如，可以使用连接到检测电子器件的计算机来执行数据存储和分析。例如，数据可以以表格形式存储，其中每一行对应于一个颗粒的数据，并且列对应于测量特征中的每一个特征。使用标准文件格式(例如“FCS”文件格式)来存储来自粒子分析器的数据有利于使用单独的程序和/或机器来分析数据。使用当前的分析方法，数据通常以一维直方图或二维(2D)图显示，以便于可视化，但也可以使用其他方法来可视化多维数据。
虽然流式细胞仪数据通常包含大量数据点(即事件)，但通常的情况是用户仅对流式细胞仪数据的特定部分感兴趣。例如，样本可以包括单核细胞、粒细胞和淋巴细胞，但用户可能只对淋巴细胞数据感兴趣。在对流式细胞仪数据进行分类的传统方法中，用户通常必须确定用于将感兴趣的事件与其他事件分离的理想边界(即，门)。由于理想边界通常不是一目了然的，因此用户可能需要尝试增加或减小存储门的大小，以达到所需的纯度水平。
发明内容
因为用于对流式细胞仪数据进行门控的常规方法涉及关于不同数据群之间的理想边界的相当大的模糊性，所以发明人已经认识到需要用于对流式细胞仪数据进行分类的新方法和系统。本发明的实施例满足了这种需求和其他需求。
本发明的方面包括用于对流式细胞仪数据进行分类的方法。感兴趣的方法包括：接收具有顶点集合的第一门和流式细胞仪数据、扩展第一门以生成第二门、以及确定由第一门和第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类。在一些情况下，扩展第一门包括调整第一门的每个顶点，使得顶点与第一门的质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。在其他情况下，扩展第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法(例如，将第一门的顶点与扩展圆的顶点相加)。本方法的实施例还包括记录被分类的流式细胞仪数据的子集。在某些实施例中，所记录的流式细胞仪数据的子集包括由第二门包含的流式细胞仪数据集合。在其他实施例中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由第二门包含的流式细胞仪数据集合与由第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的流式细胞仪数据的随机样本。在一些情况下，随机样本可以包括距第一门在给定距离内的流式细胞仪数据的随机样本。在某些情况下，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括随机样本与由第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。该方法的实施例还包括用降维算法(例如，tSNE)处理所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集，并将所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集与表型相关联。在一些情况下，方法还包括基于对所记录的流式细胞仪数据的子集的分析来调整第一门和/或第二门的顶点。在一些实施例中，方法还包括基于第一门和第二门经由分选流式细胞仪来分选颗粒。还提供了用于实践本主题的方法的计算机可读存储介质。
本公开的方面还包括用于实践本发明的系统。感兴趣的系统包括用于获取流式细胞仪数据的粒子分析器(例如，流式细胞仪)和处理器，该处理器被配置为：接收第一门和流式细胞仪数据，扩展第一门以生成第二门，以及确定由第一门和第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类。在一些情况下，扩展第一门包括调整第一门的每个顶点，使得顶点与第一门的质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。在其他情况下，扩展第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法(例如，将第一门的顶点与扩展圆的顶点相加)。在某些实施例中，处理器还包括用于记录被分类的流式细胞仪数据子集的指令。在某些实施例中，所记录的流式细胞仪数据的子集包括由第二门包含的流式细胞仪数据集合。在其他实施例中，所记录的被分类的流式细胞仪数据子集包括由第二门包含的流式细胞仪数据集合与由第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的流式细胞仪数据的随机样本。在一些情况下，随机样本可以包括距第一门在给定距离内的流式细胞仪数据的随机样本。在某些情况下，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括随机样本与由第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。在一些情况下，本系统中的流式细胞仪是被配置为对样品中的颗粒进行差异性分选的分选流式细胞仪。在这种情况下，分选流式细胞仪可以被配置为基于第一门和第二门来对颗粒进行分选。例如，分选流式细胞仪可以被配置为将与由第一门包含的流式细胞仪数据集合相关联的颗粒分选到第一收集器皿中，并且将与由第二门包含的流式细胞仪数据集合和由第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集所包含的流式细胞仪数据相关联的颗粒分选到第二收集器皿中。
附图说明
当结合附图阅读时，可以从以下详细描述中最好地理解本发明。附图中包括以下图：
图1描绘了根据某些实施例扩展第一门以生成第二门。
图2描绘了根据某些实施例经由闵可夫斯基加法(Minkowski addition)扩展第一门。
图3描绘了根据某些实施例确定要记录的流式细胞仪数据的子集。
图4描绘了根据某些实施例的用于对流式细胞仪数据进行分类的流程图。
图5描绘了根据某些实施例的流式细胞术系统的功能框图。
图6描绘了根据某些实施例的分选控制系统。
图7A至图7B描绘了根据某些实施例的颗粒分选仪系统的示意图。
图8描绘了根据某些实施例的计算系统的框图。
具体实施方式
提供了对流式细胞仪数据进行分类的方法。感兴趣的方法包括：接收第一门和流式细胞仪数据、扩展第一门以生成第二门、以及确定由第一门和第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类。在实施例中，方法还涉及记录已分类的流式细胞仪数据的子集并且可选地基于所记录的数据调整第一门和/或第二门。在一些情况下，本主题的方法包括基于第一门和第二门对与已分类的流式细胞仪数据相关联的颗粒进行分选。还提供了用于实践本发明的系统和计算机可读存储介质。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，其当然可以变化。还应当理解，由于本发明的范围将仅由所附权利要求书限制，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制。
在提供值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的直至其下限单位的十分之一的每个中间值以及在规定范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在该较小范围内，并且也包含在本发明中，但受所述范围内任何明确排除限制的约束。如果所述范围包括一个界限或两个界限，则不包括其中一个或两个界限的范围也包括在本发明中。
本文通过在数值前面加上术语“大约”来表示某些范围。在本文中，术语“大约”用于为其前面的确切数字以及接近或近似术语之前的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似特定的引用数字时，接近或近似的未引用数字可以是一个数字，该数字在它出现的上下文中提供了与特定的引用数字基本等效的数字。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中也能够使用与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文，就如同每个单独的出版物或专利都被明确和单独地指示以引用的形式并入本文，并且通过引用并入本文以与引用出版物结合来公开和描述方法和/或材料。任何出版物的引用均为了其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本发明由于现有发明而无权先于该等出版物进行公布。此外，所提供的出版日期可能不同于实际出版日期，可能需要单独确认。
应当注意，除非上下文另有明确说明，否则在本文和所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。还需指出的是，权利要求书可以被起草为排除任意可选内容。因此，本声明旨在作为在叙述权利要求要素或使用“否定”限制时使用“只”、“仅”等排他性术语的先行基础。
在阅读本公开时，对本领域技术人员而言将明显的是，本文所描述和示出的每个单独的实施例都具有离散的组件和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，这些组件和特征可以很容易地与其它几个实施例中的任何一个的特征分离或组合。任何所描述的方法都能按照所描述的事件的顺序或任何其他逻辑上可行的顺序来执行。
虽然为了语法的流畅性而通过功能解释对装置和方法进行了描述或将进行描述，但应明确理解，除非根据35U.S.C.§112进行了明确表述，否则不应将权利要求解释为必须以任何方式受到“手段”或“步骤”限制的约束，而应在等同司法原则下赋予权利要求书所提供的定义的全部含义和等同物，并且在根据35U.S.C.§112对权利要求作出明确表述的情况下，根据35U.S.C.§112赋予其全部的法定等同物。
对流式细胞仪数据进行分类的方法
如上所述，本发明的方面包括用于对流式细胞仪数据进行分类的方法。“流式细胞仪数据”是指关于已由粒子分析器中的任意数量的检测器收集的样本颗粒的特征的信息。如本文所讨论的，“粒子分析器”是能够基于某些(例如，光学)参数来表征颗粒的分析工具(例如，流式细胞仪)。“颗粒”是指生物样品的离散成分，例如分子、分析物结合的珠子、单个细胞等。
感兴趣的方法包括基于所确定的样品中分析物(例如颗粒)的参数(例如荧光)对一个或更多个群体簇进行分类。如本文所使用的，分析物(例如细胞或其他颗粒)的“群体”或“亚群体”通常是指一组分析物，该一组分析物相对于一个或更多个测量参数具有特性(例如光学特性、阻抗特性或时间特性)，使得测量参数数据在数据空间中形成簇。通过流式细胞术分析细胞(或其他颗粒)而获得的数据通常是多维的，其中每个细胞对应于由测量的参数定义的多维空间中的点。在实施例中，数据由来自多个不同参数的信号组成，多个不同参数为例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、并且包括20个或更多个。因此，群体被识别为数据中的簇。相反，每个数据簇通常被解释为对应于特定类型的细胞或分析物的群体，但是通常也观察到对应于噪声或背景的簇。簇可以以维度的子集来定义，例如相对于测量参数(例如，荧光染料)的子集来定义，其对应于仅在测量参数的子集或从样品的测量值中提取的特征方面不同的群体。
本方法的方面包括接收具有顶点集合的第一门。如本文所讨论的，“门”通常指的是识别感兴趣的数据子集的分类器边界。在细胞术中，门能够界定一组特别感兴趣的事件(即群体)。换句话说，门限定了用于对流式细胞仪数据的群体进行分类的边界。在实施例中，门识别表现出相同或相似参数集的流式细胞仪数据。另外，“门控”一般是指使用针对给定的数据集合定义的门对数据进行分类的过程，其中门能够是与布尔逻辑相结合的一个或更多个感兴趣区域。用于门控的方法的示例已经在例如美国专利号4,845,653、5,627,040、5,739,000、5,795,727、5,962,238、6,014,904、6,944,338和8,990,047中进行了描述，所述美国专利中的每一个都通过引用并入本文。
在一些实施例中，第一门是由用户绘制的门。在这种实施例中，用户可以定义区域的边界(例如，在二维空间中)，在该区域内流式细胞仪数据可以被分配特定的分类。例如，绘制第一门可以包括将多边形叠加到代表流式细胞仪数据的二维绘图上。在其他实施例中，第一门由细胞术领域中的其他技术人员预先建立。例如，可以从已经在先前尝试对流式细胞仪数据进行分类时使用的门数据库接收第一门。在一些实施例中，第一门由顶点集合限定。如本文所讨论的，“顶点”是多维(例如，二维)空间内的点，所述顶点在连接时形成门的边界。
在实施例中，方法包括接收流式细胞仪数据、计算每个分析物的参数、以及基于所计算的参数将分析物聚类在一起。例如，实验可以包括由几种荧光团或荧光标记抗体标记的颗粒，并且颗粒组可以由与一个或更多个荧光测量对应的群体来定义。在该示例中，第一组可以由针对第一荧光团的特定范围的光散射来定义，第二组可以由针对第二荧光团的特定范围的光散射来定义。如果分别在x轴和y轴上表示第一荧光团和第二荧光团，则如果信息要以图形方式显示，则可能会出现两个不同颜色编码的群体来定义每组颗粒。如何表示数据由每个数据点(即事件)相对于定义每个门的顶点集的位置来确定。可以在门内对任何数量的分析物进行分类，包括5种或更多种分析物，例如10种或更多种分析物、例如50种或更多种分析物、例如100种或更多种分析物、例如500种分析物并且包括1000种或更多种分析物。在某些实施例中，该方法将在样品中检测到的稀有事件(例如，样品中的稀有细胞，例如癌细胞)一起分组在簇中。在这些实施例中，所生成的分析物簇可以包括10种或更少的分析物，例如9种或更少并且包括5种或更少的指定分析物。
可以从任何合适的源接收流式细胞仪数据。在一些实施例中，从存储设备的存储器接收流式细胞仪数据。在这种实施例中，流式细胞仪数据可能已预先生成并保存在存储设备的存储器中以供后续调用和分析。在其他实施例中，实时接收流式细胞仪数据。换句话说，在流式细胞仪的操作期间生成的流式细胞仪数据可以随后(例如，立即)填充具有第一门的数据空间(例如，二维绘图)。在一些情况下，可以操作流式细胞仪来生成数据直到满足记录标准。本文讨论的“记录标准”是当被满足时促使流式细胞仪操作和数据收集终止的条件。可以采用任何合适的记录标准。在某些情况下，记录标准是时间限制。当记录标准是时间限制时，在经过规定的时间量(例如，从10秒至3小时)之后停止流式细胞仪数据收集。在另外的情况下，记录标准是事件总数。在这种情况下，在已经分析一定数量的颗粒(例如，由用户指定)之后停止流式细胞仪数据收集。在另外的情况下，记录标准是群体内的事件数量。在这种情况下，在已经分析了特定群体(例如，表现出某种表型)内的一定数量的颗粒(例如，由用户规定的)之后停止流式细胞仪数据收集。
在某些实施例中，根据需要，通过将颗粒暴露于激发光并在一个或更多个检测通道中测量每个颗粒的荧光来检测和唯一地识别颗粒。用于识别颗粒和与其相关联的结合复合物的检测通道中发出的荧光可以在用单一光源激发后进行测量，或者可以在用不同光源激发后进行单独测量。如果使用单独的激发光源来激发颗粒标签，则可以选择标签使得所有标签都可由所使用的激发光源中的每一个来激发。
在实施例中，从前向散射光检测器接收流式细胞仪数据。感兴趣的前向散射光检测器可以产生有关颗粒总体尺寸的信息。在实施例中，从侧向散射光检测器接收流式细胞仪数据。感兴趣的侧向散射光检测器检测从颗粒的表面和内部结构折射和反射的光，其往往随着颗粒结构复杂性的增加而增加。在实施例中，从荧光检测器接收流式细胞仪数据。感兴趣的荧光光检测器被配置为检测来自荧光分子的荧光发射，所述荧光分子为例如与流动池中的颗粒相关联的被标记的特异性结合成员(例如与感兴趣的标记物特异性结合的被标记的抗体)。在某些实施例中，方法包括用一个或更多个荧光检测器检测来自样品的荧光，一个或更多个荧光检测器为例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个、例如7个或更多个、例如8个或更多个、例如9个或更多个、例如10个或更多个、例如15个或更多个并且包括25个或更多个荧光检测器。
某些实施例中的方法还包括例如使用计算机进行数据采集、分析和记录，其中多个数据通道记录针对当每个颗粒穿过颗粒分选模块的样品询查区域时由每个颗粒发射的光散射和荧光，记录来自每个检测器的数据。在这些实施例中，分析包括对颗粒进行分类和计数，使得每个颗粒呈现为数字化参数值集合。本主题的系统可以被设置为关于选定的参数触发，以便将感兴趣的颗粒与背景和噪声区分开。“触发”指的是用于检测参数的预设阈值并且可以用作用于检测颗粒通过光源的手段。检测到超过所选参数的阈值的事件会触发采集颗粒的光散射和荧光数据。对于介质中产生低于阈值的响应的被测定颗粒或其他成分，不采集数据。触发参数可以是检测到由颗粒通过光束引起的前向散射光。然后流式细胞仪检测并收集颗粒的光散射和荧光数据。根据需要，针对每个颗粒记录的数据被实时分析或存储在数据存储和分析装置例如计算机中。
在接收到第一门和流式细胞仪数据之后，方法还包括扩展第一门以生成第二门。“扩展”第一门意味着增加了该门所包含的数据空间区域。可以采用任何方便的机制来进行门扩展。在一些实施例中，基于一个或更多个门顶点到门的质心的距离以及在一些情况下每个门顶点到门的质心的距离来扩展第一门。术语“质心”以其常规意义使用，指的是门的几何中心。在一些实施例中，感兴趣的方法包括计算第一门的质心。例如可以通过确定第一门的每个顶点的算术平均位置来计算质心。在计算质心之后，该方法的实施例还包括调整一个或更多个门顶点，并且在一些情况下调整第一门的每个顶点，使得顶点与质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。换句话说，每个顶点与质心的距离增加。可以采用任何合适的百分比来扩展第一门。例如，该百分比可以为0.5％至25％，例如1％至20％、并且包括2％至10％。
图1描绘了通过增加门顶点距门的质心的距离来扩展第一门。如图1所示，第一门101被扩展，使得生成第二门102。在扩展第一门101的过程中，第一门101上的顶点104距质心103的距离增大，使得产生经扩展的顶点105。为了产生经扩展的顶点105，顶点104与质心103的水平差异和垂直差异(示出为虚线)增加一定百分比。虽然图1中没有描绘，但是第一门101中的每个顶点以相同的方式扩展，使得生成第二门102。
在另外的实施例中，扩展第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。在这种实施例中，将构成第一门的顶点集合与扩展对象的顶点相加，以生成第二门。“扩展对象”是指具有期望赋予第一门以生成第二门的特征(即，尺寸和形状)的几何图形。为了将第一门扩展给定的幅度，可以选择具有特定尺寸的扩展对象。换句话说，第一门扩展的程度与扩展对象的尺寸成比例。可以采用任何方便的几何图形作为扩展对象，包括但不限于圆形、椭圆形、新月形、三角形、正方形或矩形，以及不规则形状，例如耦合到平坦顶部部分的抛物线底部部分。在一些实施例中，扩展对象是扩展圆。例如，当A代表构成第一门的顶点集合(即位置向量)并且B代表构成扩展对象(例如扩展圆)的顶点集合(即位置向量)时，第二门的顶点可以通过将A中的每个顶点与B中的每个顶点相加来计算。换句话说，第二门的顶点可以在由A+B＝{a+b|a∈A，b∈B}产生的集合中找到。随后可以在二维绘图上渲染该顶点集合并连接该顶点集合，使得产生并直观地表示第二门。
图2描绘了通过闵可夫斯基加法扩展第一门。如图2所示，扩展第一门201使得生成第二门202。第一门201中的每个顶点与扩展圆203的顶点相加(例如，如上所述)。扩展圆203的半径决定了第一门201扩展的程度。由于扩展圆203的曲线性质，第二门202在第一门具有更锐利边缘的一些区域中具有圆形轮廓。
在生成第二门之后，本发明的方面还包括确定由第一门和第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类。换句话说，被第一门的边界包围的流式细胞仪数据构成第一流式细胞仪数据集合，而被第二门的边界包围的流式细胞仪数据构成第二流式细胞仪数据集合。因为第二门是第一门的扩展版本并且因此也包含所述第一门内的每个数据点，所以除了位于第一门和第二门的边界之间的数据点之外，第二流式细胞仪集合还包括第一流式细胞仪数据集合。因此，在一些实施例中，当流式细胞仪数据相对于第一门和第二门中的任一个或两者的关系被建立时，流式细胞仪数据可以被描述为“被分类的”。
在一些实施例中，对流式细胞仪数据进行分类包括在粒子分析器中确定与被照射的颗粒(例如，细胞)相关联的表型。在一些情况下，针对第一门和/或第二门所包含的流式细胞仪数据点的群体或亚群体，确定表型。换句话说，第一门和/或第二门所包含的所有流式细胞仪数据可以与颗粒的特定亚型或表型相关联。可以基于相关群体或亚群体中的流式细胞仪数据相对于任意数量的不同参数呈阳性或阴性来确定表型。例如，当被分析的颗粒包括一种或更多种荧光染料时，可以通过评估颗粒组相对于每种荧光染料呈阳性或阴性来确定流式细胞仪数据群体的表型。在某些实施例中，流式细胞仪数据的群体是它们相对于层次结构的状态。本文所述的“层次结构”定义了将流式细胞仪数据分组为特定群体并与表型相关联的标准。在一些实施例中，层次结构建立对于相同参数为阳性或阴性的数据点的共享特征。例如，用于聚类T细胞的层次结构可以通过确定细胞相对于CD4和CD8的存在呈阳性或阴性来进行。对于CD4呈阳性但对于CD8呈阴性的细胞是“CD4 T细胞”，而对于两种标记物均呈阳性的细胞是“双阳性T细胞”，依此类推。
本发明的实施例还包括记录被分类的流式细胞仪数据的子集。“记录子集”意味着选择被分类的流式细胞仪数据的一部分用于存储和/或进一步分析。所记录的流式细胞仪数据的子集可以用于例如评估第一门、第二门或第一门和第二门两者对属于特定群体的流式细胞仪数据进行准确门控的适用性。用户随后可以检查所记录的流式细胞仪数据的子集并相应地调整门边界。
可以记录被分类的流式细胞仪数据的任何合适的子集。在某些情况下，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由第二门包含的流式细胞仪数据集合。换句话说，记录第二门边界内的所有流式细胞仪数据，包括被第一门包含的流式细胞仪数据。当需要生成所记录的包括第二门所包含的流式细胞仪数据集合的流式细胞仪数据的子集时，该方法的某些实施例包括将所记录的子集中的所有数据与相关表型相关联，即，每个数据点被确定为给定颗粒子类型的一部分。
在另外的实施例中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括在第二门所包含的流式细胞仪数据集合与第一门所包含的流式细胞仪数据集合的差集内的流式细胞仪数据的随机样本。本文所述的术语“差集”是指由第二门包含但不由第一门包含的流式细胞仪数据集合。例如，当A代表由第一门包含的流式细胞仪数据集合且B代表由第二门包含的流式细胞仪数据集合时，差集由确定。在产生差集之后，可以从差集获得随机样本(例如，简单随机样本)。随机样本可以是任何所需的大小。在一些实施例中，随机样本包括在差集内的一定百分比的被分类的流式细胞仪数据。换句话说，随机样本内的数据点的数量可以等于差集内的数据点的数量的百分比。可以采用任何方便的百分比。在某些情况下，差集内的被分类的流式细胞仪数据的百分比为1％至99％，例如30％至70％，并且包括40％至60％。在一些实施例中，该百分比是50％。在其他实施例中，随机样本包括相对于由第一门包含的流式细胞仪数据集合内的数据点的数量而确定的差集内的一定比例的被分类的流式细胞仪数据。在这种实施例中，随机样本内的数据点的数量可以等于由第一门包含的数据点的数量的百分比。例如，在一些情况下，第一门所包含的数据点的数量的百分比可以为1％至99％，例如30％至70％，并且包括40％至60％。
在另外的情况下，除了如上所述确定的所记录的流式细胞仪数据的子集之外或者代替如上所述确定的所记录的流式细胞仪数据的子集，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括距第一门在给定距离内的流式细胞仪数据的随机样本。可以采用距与第一门相距的任何方便的距离。在一些情况下，距第一门相距的距离由用户确定，例如通过在第一门周围绘制区域或输入距离值来确定。在某些情况下，流式细胞仪数据的样本是通过分层采样确定的。如本文所讨论的，“分层采样”是指涉及从分区划分群体中采样的统计技术。在这种实施例中，存在于距第一门特定距离内的流式细胞仪数据可以被认为是第一层。存在于第一距离和更远的第二距离之间的流式细胞仪数据可以被认为是第二层等。可以从每个层获得随机样本以生成所记录的流式细胞仪数据的子集。在一些情况下，由于第一层与由第一门定义的感兴趣群体的接近性，第一层在采样中相对于第二层和随后的层可以被更重地加权可以具有更大的权重。
在另外的情况下，除了如上所述确定的所记录的流式细胞仪数据的子集之外，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集还包括流式细胞仪数据的全集的随机样本。流式细胞仪数据的“全集”是指接收到的流式细胞仪数据的全部。
在一些实施例中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括随机样本和由第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。术语“并集”以其常规意义使用，用于描述包含一批集合的每个元素的集合。用于计算并集的随机样本可以通过上述任何机制获得(例如，差集内的一定百分比的被分类的流式细胞仪数据、距第一门在给定距离内的流式细胞仪数据的随机样本等)。在某些实施例中，用于计算并集的随机样本是第二门所包含的流式细胞仪数据集合与第一门所包含的流式细胞仪数据集合的差集内的流式细胞仪数据的随机样本。例如，如果A代表第一门所包含的流式细胞仪数据集合，并且B代表随机样本，则并集由A∪B＝{x：x∈A or x∈B}确定。
图3示出了描述确定记录的流式细胞仪数据的子集的表格。在“第一门”行中，实心块表示被分类为由第一门包含的流式细胞仪数据(即事件)的存在。在“第二门”行中，实心块表示被分类为被第二(即扩展的)门包含的流式细胞仪数据的存在。由于第二门是第一门的扩展版本，因此第二门包含第一门内的流式细胞仪数据以及附加事件。在“差集”行中，实心块表示由第二门包含但不由第一门包含的流式细胞仪数据的存在。在“差集的50％”行中，实心块表示随机样本是从差集内的流式细胞仪数据的50％中获得的。在“要记录的事件”行中，实心块表示将第一门包含的事件与从差集内的流式细胞仪数据的50％获得的随机样本组合(即，在并集中)，以便生成所记录的流式细胞仪数据的子集。
在获得被分类的流式细胞仪数据的子集以供记录之后，该方法的实施例包括用降维算法处理所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集。术语“降维”在本文中以其常规意义使用，指的是操纵数据集合使得所考虑的不同变量的数量减少。可以采用任何合适的降维技术。在一些实施例中，降维包括执行主成分分析(principal component analysis，PCA)，其将较高维度数据映射到较低维度空间(例如，二维)，使得较低维度空间中的数据的方差最大化。可以使用任何合适的降维算法。在一些实施例中，通过t分布随机邻域嵌入(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE)算法来执行降维。Laurens vander Maaten&Geoffrey Hinton.Visualizing Data using t-SNE.Journal of MachineLearning Research,2008中描述了t-SNE算法，其通过引用并入本文。在一些实施例中，通过统一流形逼近和投影(Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP)算法来执行降维。Leland McInnes,John Healy&James Melville.UMAP:Uniform ManifoldApproximation and Projection for Dimension Reduction.ARXIV,2018中描述了UMAP算法，其通过引用并入本文。在一些实施例中，通过TriMap算法执行降维。Ehsan Amid&Manfred K.Warmuth TriMap:Large-scale Dimensionality Reduction UsingTriplets.ARXIV,2019中描述了TriMap算法，其通过引用并入本文。
在某些实施例中，本主题的方法还包括基于对所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集的分析来调整门顶点。用户可以例如分析所记录的流式细胞仪数据的子集并确定第一和/或第二门包含与感兴趣的群体无关的不可接受数量的事件。为了增加流式细胞仪数据的纯度，用户可以随后减小门的尺寸，使得不期望的事件被排除在经调整的门的边界之外。在另一个示例中，用户可以分析所记录的流式细胞仪数据的子集并确定希望门包含更多事件。为了增加事件的数量，用户可以增加门的尺寸，使得更多的事件被包括在经调整的门的边界中。在一些情况下，调整门的顶点，使得门的形状改变，即，将流式细胞仪数据的某个亚群包括在门中或从门中排除。第一门、第二门或第一门和第二门两者的顶点可由用户根据需要调整。在某些情况下，方法包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集调整第一门的顶点。在另外的实例中，方法包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集调整第二门的顶点。在另外的实例中，方法包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整第一门和第二门两者的顶点。
在基于对所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集的分析来调整门顶点的实施例中，感兴趣的方法还可以包括基于经调整的门对流式细胞仪数据进行重新分类。因此，本主题的方法的实施例包括确定由经调整的第一门和/或经调整的第二门包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类。方法还可以包括记录由经调整的一个或多个门产生的被分类的流式细胞仪数据的子集。所记录的流式细胞仪数据的子集可以通过上述机制中的任何机制来建立，例如确定由第二门所包含的流式细胞仪数据集合和第一门所包含的流式细胞仪数据集合的差集内的流式细胞仪数据的随机样本。
图4提供了描绘根据本公开的某些实施例的用于对流式细胞仪数据进行分类的示例性步骤的流程图。在步骤401中，用户识别感兴趣的流式细胞仪数据群体或亚群体并提供第一门。如上所述，第一门可以例如由用户绘制或者从预先建立的门中选择。在步骤402中，用户提供要产生第二(即，扩展的)门的指令，并提供用于门扩展的参数，例如要用于扩展门的机制(例如，从质心扩展、闵可夫斯基加法)。在步骤403中，用户将颗粒样品加载到流式细胞仪中并开始实时收集流式细胞仪数据。当在步骤404中生成并接收流式细胞仪数据时，在步骤405中相对于第一门和/或第二门对数据进行分类(例如，如上所述)。在步骤406中，对第二门所包含的流式细胞仪数据进行随机采样，例如通过确定由第二门包含的流式细胞仪数据集合和由第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的流式细胞仪数据的随机样本。在步骤407中，在步骤406中确定的流式细胞仪数据的子集随后被记录/保存以用于进一步分析。在用户在步骤408中停止记录流式细胞仪数据之后，用户在步骤409中基于对所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集的分析来调整门顶点。
用于对流式细胞仪数据进行分类的本主题的方法可以针对任何所期望数量的流式细胞仪数据的群体或亚群体重复。在某些情况下，流式细胞仪数据可以拥有多个可识别的群体或亚群体，例如2个或更多个群体、3个或更多个群体、4个或更多个群体、5个或更多个群体、6个或更多个群体、7个或更多个群体、8个或更多群体、9个或更多群体、10个或更多群体、并且包括20个或更多群体。因此，根据需要，相对于这些群体中的任何一个或这些群体的任何组合来执行经由第一门和第二(即扩展的)门对流式细胞仪数据的分类。流式细胞仪数据的多个群体的分类可以顺序执行(即，一次对一个群体中的数据进行分类)或同时执行(即，同时对多个群体中的数据进行分类)。在某些情况下，对流式细胞仪数据的多个群体的分类是顺序执行的。在其他情况下，流式细胞仪数据的多个群体的分类是同时执行的。
感兴趣的方法可以另外包括基于第一门和第二门经由分选流式细胞仪对样品中的颗粒进行分选。换句话说，与流式细胞仪数据对应的颗粒可以基于数据相对于第一门和第二门的状态被分选到一系列收集器皿中。例如，该方法的实施例包括将与由第一门包含的流式细胞仪数据集合相关联的颗粒分选到第一收集器皿中。在一些实施例中，与未被第一门包含的流式细胞仪数据相关联的颗粒可以被转移至废物收集器皿。在其他实施例中，与由第二门包含的流式细胞仪数据集合和由第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集包含的流式细胞仪数据相关联的颗粒被分选到第二收集器皿中。在某些情况下，被分选到第二收集器皿中的颗粒可以被认为是“边界”情况，其不能被整齐地分类，但可能拥有足够数量的感兴趣的颗粒，以至于不希望丢弃它们。某些实施例还包括对第二收集器皿内的颗粒进行重新分选以获得更高产率的感兴趣的颗粒。在其他实施例中，与被第二门包含的流式细胞仪数据相关联的所有颗粒被分选到相同的收集器皿中。
用于收集颗粒的合适的收集器皿可以包括但不限于：试管、锥形管、多室器皿例如微量滴定板(例如96孔板)、离心管、培养管、微量管、盖、比色皿、瓶子、线性聚合物器皿和袋子以及其他类型的器皿。颗粒可以分选到任何方便数量的收集器皿中，例如2个或更多个收集器皿、3个或更多个收集器皿、4个或更多个收集器皿、5个或更多个收集器皿、6个或更多个收集器皿、并且包括7个或更多个收集器皿。
在一些情况下，本方法中分析的样品是生物样品。术语“生物样品”以其常规意义使用，是指在某些情况下可以在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液中发现的整个生物体、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集。因此，“生物样品”是指天然生物体或其组织的子集，以及从生物体或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。生物样品可以是任何类型的生物组织，包括健康组织和患病组织(例如，癌性组织、恶性组织、坏死组织等)。在某些实施例中，生物样品是液体样品，例如血液或其衍生物，例如血浆、眼泪、尿液、精液等，其中在一些情况下，样品是血液样品，包括全血，例如通过静脉穿刺或指尖采血获得的血液(血液在检测前可能会或可能不会与任何试剂例如防腐剂、抗凝剂等混合)。
在一些实施例中，样品的来源是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中这些术语广泛地用于描述哺乳动物纲内的生物体，包括食肉动物目(例如，狗和猫)、啮齿动物目(例如，小鼠、豚鼠、和大鼠)、和灵长类动物目(例如人类、黑猩猩、和猴子)。在一些情况下，受试者是人类。该方法可以应用于从两种性别和处于任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的人类受试者获得的样品，其中在一些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。虽然本发明可以应用于来自人类受试者的样品，但应当理解，该方法也可以对来自其他动物受试者(即，“非人类受试者”)(例如但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜和马)的样品进行。
可以根据多种参数(例如通过将特定荧光标签附着到感兴趣的细胞上而识别的表型特征)对感兴趣的细胞进行靶向表征。在一些实施例中，系统被配置为偏转被确定为包括目标细胞的分析液滴。可以使用本主题方法来表征多种细胞。感兴趣的靶细胞包括但不限于干细胞、T细胞、树突细胞、B细胞、粒细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、病毒细胞(例如，HIV细胞)、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和红系细胞。感兴趣的靶细胞包括具有便利的细胞表面标记或抗原的细胞，细胞表面标记或抗原可以通过便利的亲和剂或其缀合物捕获或标记。例如，靶细胞可以包括细胞表面抗原，例如CD11b、CD123、CD14、CD15、CD16、CD19、CD193、CD2、CD25、CD27、CD3、CD335、CD36、CD4、CD43、CD45RO、CD56、CD61、CD7、CD8、CD34、CD1c、CD23、CD304、CD235a、T细胞受体α/β、T细胞受体γ/δ、CD253、CD95、CD20、CD105、CD117、CD120b、Notch4、Lgr5(N端子)、SSEA-3、TRA-1-60抗原、二唾液酸神经节苷脂GD2和CD71。在一些实施例中，靶细胞选自含有HIV的细胞、Treg细胞、抗原特异性T细胞群、肿瘤细胞或来自全血、骨髓或脐带血的造血祖细胞(CD34+)。
感兴趣的方法还可以包括在研究、实验室测试或治疗中采用颗粒。在一些实施例中，本主题的方法包括获得从目标流体或组织生物样品制备的个体细胞。例如，本主题的方法包括从流体或组织样品中获取细胞，以用作疾病(例如癌症)的研究或诊断样品。同样，本主题的方法包括从流体或组织样品中获取细胞以用于治疗。细胞治疗方案是可以制备包括例如细胞和组织的活细胞材料并将其引入受试者作为治疗处理的方案。可以通过给予流式细胞术分选样品来治疗的状况包括但不限于血液疾病、免疫系统疾病、器官损伤等。
典型的细胞治疗方案可包括以下步骤：样品采集、细胞分离、基因修饰、体外培养和扩增、细胞收获、样品体积减小和洗涤、生物保存、储存以及将细胞引入受试者。该方案可以开始于从受试者的源组织收集活细胞和组织，以产生细胞和/或组织样品。可以通过任何合适的程序收集样品，任何合适的程序包括例如向受试者施用细胞动员剂、从受试者抽血、从受试者取出骨髓等。在收集样品后，可以通过几种方法进行细胞富集，所述方法包括例如基于离心的方法、基于过滤的方法、淘析、磁力分离方法、荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)等。在一些情况下，富集的细胞可以通过任何便利的方法例如核酸酶介导的基因编辑进行基因修饰。经基因修饰的细胞可以在体外培养、激活和扩增。在一些情况下，细胞被保存，例如冷冻保存，并被储存以供未来使用，在未来使用的情况下，细胞被解冻，然后施用于患者，例如，细胞可以被输注到患者体内。
对流式细胞仪数据进行分类的系统
本发明的方面还包括用于对流式细胞仪数据进行分类的系统。感兴趣的系统包括用于获得流式细胞仪数据的粒子分析器(例如，流式细胞仪)以及被配置为经由第一门和第二门对流式细胞仪数据进行分类的处理器。感兴趣的粒子分析器可以包括：用于传输流动流中的颗粒的流动池、用于在询查点处照射流动流中的颗粒的光源、以及用于检测颗粒调制光的颗粒调制光检测器。
如本文所讨论的，“流动池”以其常规意义描述，是指包含流动通道的部件(例如比色皿)，该流动通道具有用于输送鞘液中的颗粒的液体流动流。感兴趣的比色皿包括具有延伸穿过其中的通道的器皿。流动流可以包括从样品管注入的液体样品。感兴趣的流动池包括光可达流动通道。在一些情况下，流动池包括允许光通过的透明材料(例如，石英)。在一些实施例中，流动池是空气流式(stream-in-air)流动池，其中，颗粒的光询查发生在流动池外部(即，在自由空间中)。
在一些情况下，流动流被配置为在询查点处用来自光源的光进行照射。配置有流动通道的流动流可以包括从样品管注入的液体样品。在某些实施例中，流动流可以包括狭窄的、快速流动的液体流，该液体流被布置成使得在其中输送的线性分离的颗粒以单列方式彼此分离。本文讨论的“询查点”是指流动池内颗粒被来自光源的光照射例如用于分析的区域。询查点的尺寸可以根据需要变化。例如，当0μm表示光源发射的光的轴线时，询查点的范围可以为-100μm至100μm，例如-50μm至50μm、例如-25μm至40μm、并且包括-15μm至30μm。
在流动池中照射颗粒后，可以观察到颗粒调制光。“颗粒调制光”是指在用来自光源的光照射颗粒之后从流动流中的颗粒接收的光。在一些情况下，颗粒调制光是侧向散射光。如本文所讨论的，侧向散射光是指从颗粒的表面和内部结构折射和反射的光。在另外的实施例中，颗粒调制光包括前向散射光(即，主要沿前向方向穿过颗粒或围绕颗粒行进的光)。在又一些情况下，颗粒调制光包括荧光(即，在用激发波长光照射之后从荧光染料发射的光)。
如上所述，本发明的方面还包括光源，该光源被配置为在询查点处照射经过流动池的颗粒。可以采用任何便利的光源作为本文描述的光源。在一些实施例中，光源是激光器。在实施例中，激光器可以是任何便利的激光器，例如连续波激光器。例如，激光器可以是二极管激光器，例如紫外线二极管激光器、可见光二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施例中，激光器可以是氦-氖(HeNe)激光器。在一些情况下，激光器是气体激光器，例如氦-氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)准分子激光器、氪-氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙-氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，本主题的流式细胞仪包括染料激光器，例如二苯乙烯激光器、香豆素激光器或罗丹明(rhodamine)激光器。在又一些情况下，感兴趣的激光器包括金属-蒸气激光器，例如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖-铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他情况下，本主题的流式细胞仪包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或铈掺杂激光器及其组合。
根据某些实施例的激光光源还可以包括一个或更多个光学调节部件。在某些实施例中，光学调节部件位于光源和流动池之间，并且可以包括能够改变来自光源的照射的空间宽度或照射的一些其他特性(例如，照射方向、波长、光束宽度、光束强度和焦点)的任何装置。光学调节协议可以包括调节光源的一种或更多种特性的任何便利的装置，包括但不限于透镜、反射镜、滤光器、光纤、波长分离器、针孔、狭缝、准直协议及其组合。在某些实施例中，感兴趣的流式细胞仪包括一个或更多个聚焦透镜。在一个示例中，聚焦透镜可以是去放大透镜(de-magnifying lens)。在其他实施例中，感兴趣的流式细胞仪包括光纤。
在光学调节部件被配置为移动的情况下，光学调节部件可以被配置为连续地或以离散间隔移动，例如以0.01μm或更大的增量移动、例如以0.05μm或更大、例如0.1μm或更大、例如0.5μm或更大、例如1μm或更大、例如10μm或更大、例如100μm或更大、例如500μm或更大、例如1mm或更大、例如5mm或更大、例如10mm或更大并且包括25mm或更大的增量移动。
可以采用任何位移协议来移动光学调节部件结构，例如耦合至可移动支撑台或直接与电机致动平移台、导螺杆平移组件、齿轮平移装置(例如采用步进电机、伺服电机、无刷电机、有刷直流电机、微步进驱动电机、高分辨率步进电机以及其他类型的电机)耦合。
光源可以定位在距离流动池任何合适的距离处，例如光源和流动池间隔0.005mm或更远、例如0.01mm或更远、例如0.05mm或更远、例如0.1mm或更远、例如0.5mm或更远、例如1mm或更远、例如5mm或更远、例如10mm或更远、例如25mm或更远并且包括100mm或更远的距离。另外，光源可以相对于流动池以任何合适的角度定位，例如以10度至90度、例如15度至85度、例如20度至80度、例如25度至75度并且包括30度至60度的角度定位，例如以90度角定位。
在一些实施例中，感兴趣的光源包括被配置为提供用于离散照射流动流的激光的多个激光器，例如被配置为提供用于离散照射流动流的激光的2个或更多个激光器、例如3个或更多个激光器、例如4个或更多个激光器、例如5个或更多个激光器、例如10个或更多个激光器、并且包括15个或更多个激光器。根据用于照射流动流的光的期望波长，每个激光器可以具有200nm至1500nm例如250nm至1250nm、例如300nm至1000nm、例如350nm至900nm并且包括400nm至800nm的特定波长。在某些实施例中，感兴趣的激光器可以包括405nm激光器、488nm激光器、561nm激光器和635nm激光器中的一个或更多个。
如上所述，感兴趣的粒子分析器还可以包括一个或更多个用于检测颗粒调制光强度数据的颗粒调制光检测器。在一些实施例中，一个或多个颗粒调制光检测器包括被配置为检测前向散射光的一个或更多个前向散射光检测器。例如，本主题的粒子分析器可以包括1个前向散射光检测器或多个前向散射光检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、并且包括5个或更多个前向散射光检测器。在某些实施例中，粒子分析器包括1个前向散射光检测器。在其他实施例中，粒子分析器包括2个前向散射光检测器。
用于检测所收集的光的任何便利的检测器可以用在本文描述的前向散射光检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源-像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热测定器、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合、以及其他检测器。在某些实施例中，用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2、例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
在实施例中，前向散射光检测器被配置为连续地或以离散间隔测量光。在一些情况下，感兴趣的检测器被配置为连续测量所收集的光。在其他情况下，感兴趣的检测器被配置为以离散间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或者以其他一些间隔测量光。
在另外的实施例中，一个或更多个颗粒调制光检测器可以包括用于检测侧向散射光波长(即，从颗粒的表面和内部结构折射和反射的光)的一个或更多个侧向散射光检测器。在一些实施例中，粒子分析器包括单个侧向散射光检测器。在其他实施例中，粒子分析器包括多个侧向散射光检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、并且包括5个或更多个侧向散射光检测器。
用于检测所收集的光的任何便利的检测器可以用在本文描述的侧向散射光检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源-像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热测定器、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合、以及其他检测器。在某些实施例中，用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2、例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
在实施例中，本主题的粒子分析器还包括被配置为检测一种或更多种荧光波长的光的荧光检测器。在其他实施例中，粒子分析器包括多个荧光检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、并且包括20个或更多个荧光检测器。
用于检测所收集的光的任何便利的检测器可以用在本文描述的荧光检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源-像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热测定器、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合、以及其他检测器。在某些实施例中，用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2、例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
当本主题的粒子分析器包括多个荧光检测器时，每个荧光检测器可以是相同的，或者荧光检测器的集合可以是不同类型的检测器的组合。例如，在本主题的粒子分析器包括两个荧光检测器的情况下，在一些实施例中，第一荧光检测器是CCD型装置并且第二荧光检测器(或成像传感器)是CMOS型装置。在其他实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器都是CCD型装置。在又一些实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器都是CMOS型装置。在其他实施例中，第一荧光检测器是CCD型装置并且第二荧光检测器是光电倍增管(PMT)。在又一些实施例中，第一荧光检测器是CMOS型装置并且第二荧光检测器是光电倍增管。在又一些实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器都是光电倍增管。
在本公开的实施例中，感兴趣的荧光检测器被配置为测量在一种或更多种波长下所收集的光，例如在2种或更多种波长下、例如在5种或更多种不同波长下、例如在10种或更多种不同波长下、例如在25种或更多种不同波长下、例如在50种或更多种不同波长下、例如在100种或更多种不同波长下、例如在200种或更多种不同波长下、例如在300种或更多种不同波长下所收集的光，并且包括测量在400种或更多种不同波长下由流动流中的样品发射的光。在一些实施例中，如本文所述的粒子分析器中的2个或更多个检测器被配置为测量所收集的光的相同或重叠波长。
在一些实施例中，感兴趣的荧光检测器被配置为测量在一定波长范围(例如，200nm～1000nm)内收集的光。在某些实施例中，感兴趣的检测器被配置为收集一定波长范围内的光谱。例如，粒子分析器可以包括一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器被配置为收集200nm～1000nm波长范围中的一个或更多个波长范围内的光谱。在又一些实施例中，感兴趣的检测器被配置为测量由流动流中的样品以一个或更多个特定波长发射的光。例如，粒子分析器可以包括一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器被配置为测量450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任何组合中的一个更多个波长下的光。在某些实施例中，一个或更多个检测器可以被配置为与特定荧光团配对，例如在荧光测定中与样品一起使用的那些荧光团。
在一些实施例中，粒子分析器包括位于流动池和一个或多个颗粒调制光检测器之间的一个或更多个波长分离器。术语“波长分离器”在本文中以其常规意义使用，是指被配置为将从样品收集的光分离到预定光谱范围内的光学部件。在一些实施例中，粒子分析器包括单个波长分离器。在其他实施例中，粒子分析器包括多个波长分离器，例如2个或更多个波长分离器、例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个、例如7个或更多个、例如8个或更多个、例如9个或更多个、例如10个或更多个、例如15个或更多个、例如25个或更多个、例如50个或更多个、例如75个或更多个并且包括100个或更多个波长分离器。在一些实施例中，波长分离器被配置为通过使具有预定光谱范围的光通过并反射一个或更多个剩余光谱范围的光，将从样品收集的光分离到预定光谱范围中。在其他实施例中，波长分离器被配置为通过使具有预定光谱范围的光通过并吸收一个或更多个剩余光谱范围的光，将从样品收集的光分离到预定光谱范围中。在又一些其他实施例中，波长分离器被配置为将从样品收集的光空间衍射到预定的光谱范围内。每个波长分离器可以是任何便利的光分离协议，例如一个或更多个二向色镜、带通滤光器、衍射光栅、分束器或棱镜。在一些实施例中，波长分离器是棱镜。在其他实施例中，波长分离器是衍射光栅。在某些实施例中，本主题的光检测系统中的波长分离器是二向色镜。
在一些实施例中，本主题的流式细胞仪与可编程逻辑结合操作，所述可编程逻辑可以以硬件、软件、固件或其任何组合实现，以便对流式细胞仪数据进行分类。例如，当可编程逻辑以软件实现时，颗粒分类可以至少部分地通过计算机可读数据存储介质来实现，该计算机可读数据存储介质包括程序代码，该程序代码包括指令，所述指令在被执行时，被配置为接收具有顶点集合的第一门以及来自流式细胞仪的流式细胞仪数据、扩展第一门以生成第二门、并确定第一门和第二门中的每一个所包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪进行分类。
可编程逻辑可以采用任何方便的机制来扩展第一门。在一些实施例中，基于每个门顶点到门的质心的距离来扩展第一门。例如可以通过确定第一门的每个顶点的算术平均位置来计算质心。在计算质心之后，可编程逻辑可以被配置为调整第一门的每个顶点，使得顶点与质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。换句话说，每个顶点与质心的间隔距离增加。在附加实施例中，扩展第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。在这种实施例中，将构成第一门的顶点集合与扩展对象的顶点相加，以便生成第二门。为了将第一门扩展给定的幅度，可以选择具有特定尺寸的扩展对象。换句话说，第一闸门扩展的程度与扩展对象的尺寸成比例。可以采用任何方便的几何图形作为扩展对象，包括但不限于圆形、椭圆形、新月形、三角形、正方形或矩形以及不规则形状，例如耦合到平坦顶部部分的抛物线底部部分。在一些实施例中，扩展对象是扩展圆。例如，当A代表构成第一门的顶点集合(即位置向量)，并且B代表构成扩展对象(例如扩展圆)的顶点集合(即位置向量)时，第二门的顶点可以通过将A中的每个顶点与B中的每个顶点相加来计算。换句话说，第二门的顶点可以在由Y产生的集合中找到。随后可以在二维绘图上渲染该顶点集合并将该顶点集合连接起来，从而产生并直观地表示第二门。
可编程逻辑的实施例还可以被配置为记录被分类的流式细胞仪数据的子集(例如，如方法部分中所讨论的)。所记录的流式细胞仪数据的子集可以用于例如评估第一门、第二门或第一门和第二门两者对属于特定群体的流式细胞仪数据进行准确门控的适用性。用户随后可以检查记录的流式细胞仪数据的子集并相应地调整门边界。
本主题的可编程逻辑可以在多种设备中的任意设备中实现，例如专门编程的事件处理计算机、无线通信设备、集成电路设备等。在一些实施例中，可编程逻辑可以由专门编程的处理器来执行，该处理器可以包括一个或更多个处理器，例如一个或更多个数字信号处理器(DSP)、可配置微处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、或其他等效的集成或分立逻辑电路。计算设备的组合例如DSP和微处理器的组合、多个微处理器、与DSP核结合的一个或更多个微处理器、或至少部分数据连接中的任何其他这样的配置，可以实现本文描述的特征中的一个或更多个特征。
如上所述，本主题的流式细胞仪的方面包括被配置为在流动流中传播颗粒的流动池。可以采用将流体样品传播到样品询查区域的任何便利的流动池，其中，在一些实施例中，流动池包括圆柱形流动池、截头锥形流动池或包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和远端截头锥形部分的流动池，该远端截头锥形部分终止于具有横向于纵向轴线的孔口的平坦表面。
在一些实施例中，样品流动流从流动池远端处的孔口流出。根据流动流的期望特性，流动池孔口可以是任何合适的形状，其中，感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)、以及不规则形状(例如耦合到平坦顶部部分的抛物线底部部分)。在某些实施例中，感兴趣的流动池具有圆形孔口。喷嘴孔口的尺寸可以变化，在一些实施例中，喷嘴孔口的尺寸为1μm至10000μm，例如25μm至7500μm、例如50μm至5000μm、例如75μm至1000μm、例如100μm至750μm并且包括150μm至500μm。在某些实施例中，喷嘴孔口为100μm。
在一些实施例中，流动池包括被配置为向流动池提供样品的样品注射端口。样品注射端口可以是定位在内腔室的壁中的孔口或者可以是定位在内腔室的近端处的导管。当样品注射端口是定位在内腔室的壁中的孔口时，样品注射端口的孔口可以是任何合适的形状，其中，感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)、以及不规则形状(例如耦合到平坦顶部部分的抛物线底部部分)。在某些实施例中，样品注射端口具有圆形孔口。样品注射端口的孔口的尺寸可根据形状而变化，在某些情况下，具有0.1mm至5.0mm的开口，例如0.2mm至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、例如0.75mm至2.25mm、例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm例如1.5mm的开口。
在某些情况下，样品注射端口是定位在流动池内腔室的近端处的导管。例如，样品注射端口可以是导管，其定位成使样品注射端口的孔口与流动池孔口对齐。当样品注射端口是与流动池孔口对齐的导管时，样品注射管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中，感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)、以及不规则形状(例如耦合到平平坦顶部部分的抛物线底部部分)。导管的孔口可根据形状而变化，在某些情况下，导管的孔口具有0.1mm至5.0mm的开口，例如0.2mm至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、例如0.75mm至2.25mm、例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm例如1.5mm的开口。样品注射端口的尖端的形状可以与样品注射管的横截面形状相同或不同。例如，样品注射端口的孔口可以包括斜尖端，其倾斜角度为1度至10度，例如2度至9度、例如3度至8度、例如4度至7度并且包括5度的倾斜角度。
在一些实施例中，流动池还包括被配置为向流动池提供鞘液的鞘液注射端口。在实施例中，鞘液注射系统被配置为向流动池内腔室提供鞘液流，鞘液流例如与样品结合以产生围绕样品流动流的鞘液的分层流动流。根据流动流的期望特性，鞘液输送到流动池腔室的速率可以是25μL/s至2500μL/s，例如50μL/s至1000μL/s、并且包括75μL/s或更高至750μL/s。
在一些实施例中，鞘液注射端口是定位在内腔室的壁中的孔口。鞘液注射端口孔口可以是任何合适的形状，其中，感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)、以及不规则形状(例如耦合到平坦顶部部分的抛物线底部部分)。样品注射端口的孔口的尺寸可根据形状而变化，在某些情况下，具有0.1mm至5.0mm的开口，例如0.2mm至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、例如0.75mm至2.25mm、例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm例如1.5mm的开口。
在一些实施例中，系统还包括与流动池流体连通的泵，以将流动流传播通过流动池。可以采用任何便利的流体泵协议来控制流动流流过流动池。在某些情况下，系统包括蠕动泵，例如具有脉冲阻尼器的蠕动泵。本主题的系统中的泵被配置为以适合于对来自流动流中的样品的光进行多光子计数的速率输送流体通过流动池。例如，系统可以包括泵，该泵被配置为使样品以1nL/min至500nL/min的速率流过流动池，该速率为例如1nL/min至250nL/min、例如1nL/min至100nL/min、例如2nL/min至90nL/min、例如3nL/min至80nL/min、例如4nL/min至70nL/min、例如5nL/min至60nL/min并且包括10nL/min至50nL/min。在某些实施例中，流动流的流速为5nL/min至6nL/min。
合适的流式细胞术系统可以包括但不限于以下文献中所描述的流式细胞术系统：Ormerod(ed.),Flow Cytometry:A Practical Approach,Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等人(eds.),Flow Cytometry Protocols,Methods in Molecular BiologyNo.91,Humana Press(1997)；Practical Flow Cytometry,第三版,Wiley-Liss(1995)；Virgo等人(2012)Ann Clin Biochem.Jan；49(pt 1):17-28；Linden等人,Semin ThromHemost.2004年10月；30(5):502-11；Alison等人，JPathol,2010年12月；222(4):335-344；以及Herbig等人(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3):203-255，其公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞术系统包括BD BiosciencesFACSCantoTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSCantoTMII流式细胞仪、BD AccuriTM流式细胞仪、BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪、BD Biosciences FACSCelestaTM流式细胞仪、BDBiosciences FACSLyricTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVerseTM流式细胞仪、BDBiosciences FACSymphonyTM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessaTM流式细胞仪、BDBiosciences LSRFortessaTM X-20流式细胞仪、BD Biosciences FACSPrestoTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSViaTM流式细胞仪和BD Biosciences FACSCaliburTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSCountTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyricTM细胞分选仪、BDBiosciences ViaTM细胞分选仪、BD Biosciences InfluxTM细胞分选仪、BD BiosciencesJazzTM细胞分选仪、BD Biosciences AriaTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSAriaTMII细胞分选仪、BD Biosciences FACSAriaTMIII细胞分选仪、BD Biosciences FACSAriaTMFusion细胞分选仪和BD Biosciences FACSMelodyTM细胞分选仪、BD BiosciencesFACSymphonyTM S6细胞分选仪等。
在一些实施例中，本主题的系统是流式细胞术系统，例如以下专利中描述的那些流式细胞术系统：美国专利号10,663,476、10,620,111、10,613,017、10,605,713、10,585,031、10,578,542、10,578,469、10,481,074、10,302,545、10,145,793、10,113,967、10,006,852、9,952,076、9,933,341、9,726,527、9,453,789、9,200,334、9,097,640、9,095,494、9,092,034、8,975,595、8,753,573、8,233,146、8,140,300、7,544,326、7,201,875、7,129,505、6,821,740、6,813,017、6,809,804、6,372,506、5,700,692、5,643,796、5,627,040、5,620,842、5,602,039、4,987,086、4,498,766，其公开内容通过引用整体并入本文。
在某些情况下，本发明的流式细胞术系统被配置为用于通过使用射频标记发射的荧光成像(fluorescence imaging using radiofrequency tagged emission，FIRE)来对流动流中的颗粒进行成像，例如Diebold等人,Nature Photonics第7(10)卷；806-810(2013)中描述的以及美国专利号9,423,353、9,784,661、9,983,132、10,006,852、10,078,045、10,036,699、10,222,316、10,288,546、10,324,019、10,408,758、10,451,538、10,620,111以及美国专利公开号2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/0275042、2019/0376895和2019/0376894所描述的，其公开内容通过引用并入本文。
图5示出了根据本发明的示例性实施例的用于流式细胞术的系统500。系统500包括流式细胞仪510、控制器/处理器590和存储器595。流式细胞仪510包括一个或更多个激发激光器515a-515c、聚焦透镜520、流动室525、前向散射检测器530、侧向散射检测器535、荧光收集透镜540、一个或更多个分束器545a-545g、一个或更多个带通滤光器550a-550e、一个或更多个长通(“LP”)滤光器555a-555b、以及一个或更多个荧光检测器560a-560f。
激发激光器515a至515c发射激光束形式的光。在图5的示例系统中，从激发激光器515a-515c发射的激光束的波长分别是488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导穿过分束器545a和545b中的一个或更多个。分束器545a透射488nm的光并反射633nm的光。分束器545b透射UV光(波长范围为10nm至400nm的光)并反射488nm和633nm的光。
然后，激光束被引导至聚焦透镜520，聚焦透镜520将光束聚焦到流动室525内样品颗粒所处的流动流的一部分上。流动室是流体系统的一部分，其将流中的颗粒引导(通常一次引导一个)到聚焦激光束进行询查。流动室能够包括台式细胞仪中的流动池或空气流式(stream-in-air)细胞仪中的喷嘴尖端。
来自一个或多个激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收与样品中的颗粒相互作用，并根据颗粒的特性例如其尺寸、内部结构以及附着于颗粒上或颗粒中或天然存在于颗粒上或颗粒中的一种或多种荧光分子的存在而以各种不同的波长重新发射。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可以通过分束器545c-545g、带通滤光器550a-550e、长通滤光器555a-555b和荧光收集透镜540中的一个或更多个被路由到前向散射检测器530、侧向散射检测器535和一个或更多个荧光检测器560a-560f中的一个或更多个。
荧光收集透镜540收集由于颗粒-激光束相互作用而发射的光并将该光朝向一个或更多个分束器和滤光器路由。带通滤光器，例如带通滤光器550a-550e，允许窄范围的波长通过滤光器。例如，带通滤光器550a是510/20滤光器。第一个数字表示光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤光器在光谱带中心的每一侧延伸10nm，或从500nm延伸至520nm。短通滤光器透射波长等于或短于特定波长的光。长通滤光器，例如长通滤光器555a-555b，透射波长等于或长于特定光波长的光。例如，作为670nm长通滤光器的长通滤光器555b透射等于或长于670nm的光。通常选择滤光器来优化检测器对特定荧光染料的特异性。滤光器能够被配置为使得传输到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
前向散射检测器530定位成稍微轴向偏离通过流动池的直射光束，并且被配置为检测衍射光，该激发光主要在前向方向上穿过颗粒或围绕颗粒传播。前向散射检测器检测到的光的强度取决于颗粒的总体尺寸。前向散射检测器能够包括光电二极管。侧向散射检测器535被配置为检测来自颗粒的表面和内部结构的折射光和反射光，其趋于随着颗粒结构复杂性的增加而增加。来自与颗粒相关联的荧光分子的荧光发射能够由一个或更多个荧光检测器560a-560f检测。侧向散射检测器535和荧光检测器能够包括光电倍增管。在前向散射检测器530、侧向散射检测器535和荧光检测器处检测到的信号能够由检测器转换成电信号(电压)。该数据能够提供有关样品的信息。
本领域技术人员将认识到，根据本发明实施例的流式细胞仪不限于图5中描绘的流式细胞仪，而是可以包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以具有任意数量的处于各种波长并且具有各种不同构造的激光器、分束器、滤光器和检测器。
在操作中，细胞仪操作由控制器/处理器590控制，并且来自检测器的测量数据能够存储在存储器595中并由控制器/处理器590处理。尽管未明确示出，但控制器/处理器590耦合到检测器以接收来自检测器的输出信号，并且还可以耦合到流式细胞仪510的电气和机电部件以控制激光器、流体流动参数等。系统中还可以设置输入/输出(I/O)能力597。存储器595、控制器/处理器590和I/O 597可以完全被设置为流式细胞仪510的集成部分。在这种实施例中，显示器也可以形成用于向细胞仪510的用户呈现实验数据的I/O能力597的一部分。替代地，存储器595和控制器/处理器590以及I/O能力中的一些或全部可以是一个或更多个外部设备(例如通用计算机)的一部分。在一些实施例中，存储器595和控制器/处理器590中的一些或全部能够与细胞仪510进行无线或有线通信。控制器/处理器590连同存储器595和I/O 597能够被配置为执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功能。
图5所示的系统包括六个不同的检测器，所述六个不同的检测器检测六个不同波长带(在本文中可以被称为给定检测器的“滤光窗口”)中的荧光，该波长带由从流动池525到每个检测器的光束路径中的滤光器和/或分光器的配置所定义。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子会以其自己的特征波长带发射光。用于实验的特定荧光标签及其相关的荧光发射带可以被选择为与检测器的滤光窗口大体一致。I/O 597能够被配置为接收关于具有一组荧光标签和带有多个标记的多个细胞群体的流式细胞仪实验的数据，每个细胞群体具有所述多个标记的子集。I/O 597还能够被配置为接收将一个或更多个标记分配给一个或更多个细胞群体的生物数据、标记密度数据、发射光谱数据、将标签分配给一个或更多个标记的数据、以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据，例如标签光谱特征和流式细胞仪配置数据也能够存储在存储器595中。控制器/处理器590能够被配置为评估标签对标记的一种或更多种分配。
在一些实施例中，本主题的系统是被配置为利用封闭的颗粒分选模块来分选颗粒的颗粒分选系统，例如2017年3月28日提交的美国专利公开第2017/0299493号中所描述的，其公开内容为通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块对样品的颗粒(例如，细胞)进行分选，例如2019年12月23日提交的美国专利公开第2020/0256781号中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，用于分选样品组分的系统包括具有偏转板的颗粒分选模块，例如2017年3月28日提交的美国专利公布第2017/0299493号中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。
图6示出了用于分析和显示生物事件的分选控制系统(例如处理器600)的一个示例的功能框图。处理器600能够被配置为实现用于控制生物事件的图形显示的各种过程。
流式细胞仪或分选系统602能够被配置为获取生物事件数据。例如，流式细胞仪能够生成流式细胞仪事件数据(例如，颗粒调制光数据)。流式细胞仪602能够被配置为向处理器600提供生物事件数据。在流式细胞仪602和处理器600之间能够包括数据通信通道。能够经由数据通信通道向处理器600提供生物事件数据。
处理器600能够被配置为从流式细胞仪602接收生物事件数据。从流式细胞仪602接收的生物事件数据能够包括流式细胞仪事件数据。处理器600能够被配置为向显示设备606提供包括生物事件数据的第一绘图的图形显示。处理器600还能够被配置为将感兴趣的区域渲染为例如覆盖在第一绘图上的、围绕由显示设备606示出的生物事件数据群体的门(例如第一门)。在一些实施例中，门能够是在单个参数直方图或双变量图上绘制的一个或更多个感兴趣的图形区域的逻辑组合。在一些实施例中，显示器能够用于显示颗粒参数或饱和检测器数据。
处理器600还能够被配置为在显示设备606上在门内以与门外的生物事件数据中的其他事件不同的方式显示生物事件数据。例如，处理器600能够被配置为将门内包含的生物事件数据的颜色呈现为与门外的生物事件数据的颜色不同。显示设备606能够被实现为监视器、平板计算机、智能手机或被配置为呈现图形界面的其他电子设备。
处理器600能够被配置为从第一输入设备接收识别门的门选择信号。例如，第一输入设备能够被实现为鼠标610。鼠标610能够向处理器600发起门选择信号，以识别要在显示设备606上显示或经由显示设备606操纵的门(例如，通过当光标位于所需的门时，在门上或门中点击)。在一些实现中，第一设备能够被实现为键盘608或用于向处理器600提供输入信号的其他装置，例如触摸屏、触笔、光学检测器或语音识别系统。一些输入设备能够包括多种输入功能。在这种实现中，输入功能均能够被认为是输入设备。例如，如图6所示，鼠标610能够包括鼠标右键和鼠标左键，鼠标右键和鼠标左键的每一个都能够生成触发事件。
触发事件能够使处理器600改变数据显示的方式、数据的哪些部分实际上显示在显示设备606上，和/或提供输入以进行进一步处理，例如为了颗粒分选选择感兴趣的群体。
在一些实施例中，处理器600能够被配置为检测鼠标610何时发起门选择。处理器600还能够被配置为自动修改绘图可视化以促进门控过程。该修改能够基于处理器600接收到的生物事件数据的特定分布。在一些实施例中，处理器600扩展第一门使得生成第二门(例如，如上所述)。
处理器600能够连接至存储设备604。存储设备604能够被配置为从处理器600接收并存储生物事件数据。存储设备604还能够被配置为从处理器600接收并存储流式细胞术事件数据。存储设备604还能够被配置为允许处理器600检索生物事件数据，例如流式细胞术事件数据。
显示设备606能够被配置为从处理器600接收显示数据。显示数据能够包括生物事件数据的绘图和概述绘图的部分的门。显示设备606还能够被配置为根据从处理器600接收的输入结合来自流式细胞仪602、存储设备604、键盘608和/或鼠标610的输入来改变所呈现的信息。
在一些实现中，处理器600能够生成用户界面来接收示例事件以进行分选。例如，用户界面能够包括用于接收示例事件或示例图像的机制。能够在收集样品的事件数据之前或基于样品的一部分的初始事件集来提供示例事件或图像或示例门。
图7A是根据本文提出的一个实施例的颗粒分选仪系统700(例如，流式细胞仪602)的示意图。在一些实施例中，颗粒分选仪系统700是细胞分选仪系统。如图7A所示，液滴形成换能器702(例如压电振荡器)耦合到流体导管701，流体导管701能够耦合到、能够包括或者能够是喷嘴703。在流体导管701内，鞘液704流体动力学地将包括颗粒709的样品流体706聚焦到移动流体柱708(例如流)中。在移动流体柱708内，颗粒709(例如，细胞)排列成单行以穿过由照射源712(例如，激光器)照射的监测区域711(例如，激光-流相交的地方)。液滴形成换能器702的振动使移动流体柱708分裂成多个液滴710，所述多个液滴710中的一些包含颗粒709。
在操作中，检测站714(例如，事件检测器)识别感兴趣的颗粒(或感兴趣的细胞)何时穿过监测区域711。检测站714馈入定时电路728，定时电路728又馈入闪充电路730。在由定时的液滴延迟(Δt)通知的液滴断裂点处，能够将闪充电荷施加到移动流体柱708，使得感兴趣的液滴携带电荷。感兴趣的液滴能够包括一个或更多个待分选的颗粒或细胞。然后能够通过激活偏转板(未示出)以将液滴偏转到诸如收集管或者多孔或微孔样品板的器皿中来对带电液滴进行分选，其中，孔或微孔能够与特别感兴趣的液滴相关联。如图7A所示，液滴能够被收集在排放容器738中。
检测系统716(例如，液滴边界检测器)用于在感兴趣的颗粒经过监测区域711时自动确定液滴驱动信号的相位。示例性的液滴边界检测器在美国专利第7,679,039号中描述，其全部内容通过引用并入本文。检测系统716允许仪器准确地计算液滴中每个检测到的颗粒的位置。检测系统716能够馈入幅度信号720和/或相位718信号，幅度信号720和/或相位718信号又馈入(经由放大器722)幅度控制电路726和/或频率控制电路724。幅度控制电路726和/或频率控制电路724又控制液滴形成换能器702。幅度控制电路726和/或频率控制电路724能够被包括在控制系统中。
在一些实现中，分选电子器件(例如，检测系统716、检测站714和处理器740)能够与存储器耦合，该存储器被配置为存储检测到的事件和基于检测到的事件的分选决策。分选决策能够包含在颗粒的事件数据中。在一些实现中，检测系统716和检测站714能够被实现为单个检测单元或通信地耦合，使得事件测量能够由检测系统716或检测站714之一收集并提供给非收集元件。
图7B是根据本文呈现的一个实施例的颗粒分选仪系统的示意图。图7B所示的颗粒分选仪系统700包括偏转板752和754。能够经由倒钩中的流充电线施加电荷。这产生了包含颗粒709的液滴流710用于分析。能够用一个或更多个光源(例如，激光器)照射颗粒以生成光散射和荧光信息。例如通过分选电子器件或其他检测系统(图7B中未示出)来分析颗粒的信息。能够独立地控制偏转板752和754以吸引或排斥带电液滴，从而将液滴朝向目的收集器皿(例如，772、774、776或778之一)引导。如图7B所示，能够控制偏转板752和754以沿着第一路径762朝向器皿774引导颗粒或者沿着第二路径768朝向器皿778引导颗粒。如果颗粒不是感兴趣的颗粒(例如，没有表现出特定分选范围内的散射或照射信息)，则偏转板可以允许颗粒继续沿着流动路径764。这种不带电的液滴可以例如经由抽吸器770进入废物容器。
能够包括分选电子器件以启动收集测量值、接收颗粒的荧光信号、并确定如何调整偏转板以引起颗粒的分选。图7B所示的实施例的示例实现方式包括由Becton,Dickinsonand Company(新泽西州富兰克林湖)商业提供的BD FACSAriaTM系列流式细胞仪。
计算机控制系统
本公开的方面还包括计算机控制系统，其中该系统包括用于完全自动化或部分自动化的一台或更多台计算机。在一些实施例中，系统包括计算机，该计算机具有其上存储有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，其中计算机程序在加载到计算机上时包括用于接收具有顶点集合的第一门以及接收流式细胞仪数据的指令。感兴趣的计算机程序还包括用于扩展第一门以生成第二门以及确定第一门和第二门中的每一个所包含的流式细胞仪数据集合以对流式细胞仪数据进行分类的指令。
计算机系统可以采用任何便利的机制来扩展第一门。在一些实施例中，基于每个门顶点到门的质心的距离来扩展第一门。例如可以通过确定第一门的每个顶点的算术平均位置来计算质心。在计算质心之后，实施例还包括调整第一门的每个顶点，使得顶点与质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。换句话说，每个顶点与质心间隔的距离增加。在另外的实施例中，扩展第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。在这种实施例中，将构成第一门的顶点集合与扩展对象的顶点相加，以生成第二门。为了将第一门扩展给定的幅度，可以选择具有特定尺寸的扩展对象。换句话说，第一门扩展的程度与扩展对象的尺寸成比例。可以采用任何方便的几何图形作为扩展对象，包括但不限于圆形、椭圆形、新月形、三角形、正方形或矩形以及不规则形状，例如耦合到平坦顶部部分的抛物线底部部分。在一些实施例中，扩展对象是扩展圆。例如，当A代表构成第一门的顶点集合(即位置向量)，并且B代表构成扩展对象(例如扩展圆)的顶点集合(即位置向量)时，第二门的顶点可以通过将A中的每个顶点与B中的每个顶点相加来计算。换句话说，第二门的顶点可以在由A+B＝{a+b|a∈A，b∈B}产生的集合中找到。随后可以在二维绘图上渲染该顶点集合并将该顶点集合连接起来，从而产生并直观地表示第二门。
计算机系统的实施例还可以被配置为记录被分类的流式细胞仪数据的子集(例如，如方法部分中所讨论的)。所记录的流式细胞仪数据的子集可以用于例如评估第一门、第二门或第一门和第二门两者对属于特定群体的流式细胞仪数据进行准确门控的适用性。用户随后可以检查记录的流式细胞仪数据的子集并相应地调整门边界。
系统可以包括显示器和操作员输入设备。操作员输入设备可以是例如键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器访问存储器，该存储器具有存储在其上的用于执行本主题的方法的步骤的指令。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元以及许多其他设备。处理器可以是市售处理器，也可以是已经或将要可用的其他处理器之一。处理器执行操作系统并且操作系统以众所周知的方式与固件和硬件接口，并便于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，这些计算机程序可以用本领域已知的各种编程语言(例如Java、Perl、C++、Python、其他高级或低级语言以及它们的组合)编写。操作系统(通常与处理器协作)协调并执行计算机的其他部件的功能。操作系统还根据已知技术提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关服务。在一些实施例中，处理器包括提供反馈控制(例如负反馈控制)的模拟电子器件。
系统存储器可以是各种已知或未来的存储器存储设备中的任何一种。示例包括任何常用的随机存取存储器(RAM)、磁介质(例如常驻硬盘或磁带)、光学介质(例如读写光盘)、闪存设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是各种已知的或未来的设备中的任何一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从和/或向程序存储介质(未示出)(例如，光盘)读取和/或写入。这些程序存储介质中的任何一种或现在使用或将来可能开发的其他程序存储介质都可以被认为是计算机程序产品。应当理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(也称为计算机控制逻辑)通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。
在一些实施例中，描述了计算机程序产品，包括其中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。控制逻辑在由计算机的处理器执行时使处理器执行本文描述的功能。在其他实施例中，一些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中实现。实现硬件状态机以执行本文所述的功能对于相关领域的技术人员来说将是显而易见的。
存储器可以是处理器能够在其中存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁、光或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他合适的设备，无论是固定的还是便携式的)。处理器可以包括通用数字微处理器，该通用数字微处理器从携带必要程序代码的计算机可读介质适当编程。编程能够通过通信信道远程提供给处理器，或者使用与存储器连接的那些设备中的任一个预先保存在计算机程序产品中，例如一些其他便携式或固定计算机可读存储介质或存储器。例如，磁盘或光盘可以携载编程，并且能够由磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括编程(例如，用于实践上述方法的计算机程序产品、算法形式的编程)。根据本发明的编程能够记录在计算机可读介质上(例如记录在能够由计算机直接读取和访问的任何介质上)。这种介质包括但不限于：磁存储介质，如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，如CD-ROM；电存储介质，如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合，例如磁/光存储介质。
处理器还可以访问通信信道以与远程位置处的用户通信。远程位置是指用户不直接与系统接触，并将输入信息从外部设备(例如连接到广域网(WAN)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信信道的计算机，包括移动电话(即智能手机))中继到输入管理器。
在一些实施例中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一设备通信的接收器和/或发射器。通信接口能够被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信(例如，射频识别(RFID))、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、通信协议和蜂窝通信例如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM)。
在一个实施例中，通信接口被配置为包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或接口(如USB端口、USB-C端口、RS-232端口或任何其他合适的电气连接端口)，以允许本主题的系统与被配置用于类似的补充数据通信的其他外部设备(例如计算机终端(例如，在医生办公室或医院环境中))之间的数据通信。
在一个实施例中，通信接口被配置用于红外通信、通信或任何其他合适的无线通信协议，以使本主题的系统能够与其他设备(例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助手，或者用户可以结合使用的任何其他通信设备)通信。/>
在一个实施例中，通信接口被配置为提供连接，以通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、与连接到互联网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接或在WiFi热点处与互联网的WiFi连接，利用互联网协议(IP)进行数据传输。
在一个实施例中，本主题的系统被配置为通过通信接口例如使用诸如802.11或RF协议或IrDA红外协议与服务器设备无线通信。服务器设备可以是另一个便携式设备，例如智能电话、个人数字助手(PDA)或笔记本电脑等；或大型设备，例如台式电脑、电器等。在一些实施例中，服务器设备具有显示器(例如液晶显示器(LCD))以及输入设备(例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏)。
在一些实施例中，通信接口被配置为使用上述通信协议和/或机制中的一个或更多个与网络或服务器设备自动或半自动地传送存储在本主题的系统中(例如存储在可选数据存储单元中)的数据。
输出控制器可以包括用于向用户(无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的)呈现信息的各种已知显示设备中的任何一种的控制器。如果显示设备之一提供视觉信息，则该信息通常可以在逻辑上和/或物理上被组织为图片元素的阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在系统与用户之间提供图形输入和输出接口以及用于处理用户输入的各种已知或未来软件程序中的任何一种。计算机的功能元件可以经由系统总线彼此通信。这些通信中的一些可以在替代实施例中使用网络或其他类型的远程通信来实现。根据已知技术，输出管理器还可以例如通过互联网、电话或卫星网络向远程位置的用户提供由处理模块生成的信息。输出管理器对数据的呈现可以根据各种已知技术来实现。作为一些示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件，或其他形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，使得用户可以从远程源检索附加的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。本主题的系统中存在的一个或更多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或将要开发的类型，尽管它们通常将是计算机一类(通常称为服务器)。然而，它们也可以是大型计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的线缆或包括无线系统的其他通信系统(无论是联网的还是以其他方式)连接。它们可以位于同一位置，也可以在物理上分开。可以在任何计算机平台上采用各种操作系统，这可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或品牌。适当的操作系统包括XP、/>7、8、/>10、/> AndroidTM、/>Oracle/>等。
图8描绘了根据某些实施例的示例计算设备800的总体架构。图8中描绘的计算设备800的总体架构包括计算机硬件和软件部件的布置。然而，为了提供有利的公开，没有必要示出所有这些通常常规的元件。如图所示，计算设备800包括处理单元810、网络接口820、计算机可读介质驱动器830、输入/输出设备接口840、显示器850和输入设备860，所有这些都可以通过通信总线彼此通信。网络接口820可以提供到一个或更多个网络或计算系统的连接性。因此，处理单元810可以经由网络从其他计算系统或服务接收信息和指令。处理单元810还可以与存储器870通信以及从存储器870通信，并且还可以经由输入/输出设备接口840提供用于可选显示器850的输出信息。例如，作为可执行指令存储在分析系统的非暂时性存储器中的分析软件(例如，数据分析软件或程序，诸如)可以向用户显示流式细胞术事件数据。输入/输出设备接口840还可以接受来自可选输入设备860(例如键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏手柄、加速度计、陀螺仪或其他输入设备)的输入。
存储器870可以包含处理单元810执行以实现一个或更多个实施例的计算机程序指令(在一些实施例中分组为模块或部件)。存储器870通常包括RAM、ROM和/或其他持久性、辅助性或非暂时性计算机可读介质。存储器870可以存储操作系统872，操作系统872提供由处理单元810在计算设备800的一般管理和操作中使用的计算机程序指令。数据可以存储在数据存储设备890中。存储器870还可以包括用于实现本公开的方面的计算机程序指令和其他信息。
实用性
本主题的粒子分析器、方法和计算机系统可用于需要分析和可选地分选流体介质中的样品(例如生物样品)中的颗粒成分并且然后存储所分选的产品例如以供以后使用(例如用于治疗用途)的各种应用。本发明特别可以用于需要对流式细胞仪数据的特定群体中的流式细胞仪数据进行分类(例如，表型)的情况。例如，本发明的粒子分析器、方法和计算机系统可用于促进针对流式细胞仪数据的特定群体或亚群体确定合适的门，尤其是在这种合适的门不是一目了然的数据集合中。本发明的实施例还可用于需要提供一种在细胞分选过程中具有改进的细胞分选精度、增强的颗粒收集、颗粒充电效率、更准确的颗粒充电和增强的颗粒偏转的流式细胞仪。
本发明的实施例可用于可能期望从生物样品制备的细胞用于研究、实验室测试或用于治疗使用的情况。在一些实施例中，本主题的方法和设备可以有助于获得从目标流体或组织生物样品制备的个体细胞。例如，本主题的方法和系统有利于从流体或组织样品中获得细胞，以用作疾病(例如癌症)的研究或诊断样品。同样，本主题的方法和系统可以有利于从流体或组织样品中获得细胞以用于治疗。与传统的流式细胞术系统相比，本公开的方法和设备允许以增强的效率和低成本从生物样品(例如，器官、组织、组织片段、流体)分离和收集细胞。
套件
本公开的方面还包括套件，其中套件包括存储介质，例如磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光光盘、固态磁盘和网络附加存储(networkattached storage，NAS)。这些程序存储介质中的任何一个或者现在使用的或以后可能开发的其他程序存储介质可以包括在本主题的套件中。在实施例中，程序存储介质包括用于经由第一门和第二门对流式细胞仪数据进行分类的指令。在实施例中，包含在本主题的套件中提供的计算机可读介质指令或其一部分上能够被实现为用于分析数据的软件的软件组件。在这些实施例中，根据本公开的计算机控制系统可以用作现有软件包的软件“插件”。
除了上述组件之外，本主题的套件还可以包括(在一些实施例中)指令，例如用于将插件安装到现有软件包的指令。这些指令可能以各种形式存在于本主题的套件中，其中一种或更多种可能存在于套件中。这些指令可以存在的一种形式是以印刷信息存在于合适的介质或基底上，例如，印刷有信息的一张或更多张纸上、套件的包装中、包装插入物中等。这些指令的另一种形式是其上已经记录了信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。可能存在的这些指令的另一种形式是网站地址，该网站地址可以用于通过互联网访问远程网站的信息。
尽管有所附权利要求，本公开还由以下条款限定：
1、一种对流式细胞仪数据进行分类的方法，所述方法包括：
接收：
包括顶点集合的第一门；和
流式细胞仪数据；
扩展所述第一门以生成第二门；以及
确定所述第一门和所述第二门中的每一个所包含的流式细胞仪数据集合以对所述流式细胞仪数据进行分类。
2、根据条款1所述的方法，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括：计算所述第一门的质心。
3、根据条款2所述的方法，还包括调整所述第一门的每个顶点，使得所述顶点与所述质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。
4、根据条款3所述的方法，其中，所述百分比为1％至20％。
5、根据条款1所述的方法，其中，扩展所述第一门以生成所述第二门包括闵可夫斯基加法。
6、根据条款5所述的方法，其中，所述闵可夫斯基加法包括将所述第一门的顶点与扩展圆相加。
7、根据前述条款中任一项所述的方法，还包括记录被分类的流式细胞仪数据的子集。
8、根据条款7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合。
9、根据条款7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
10、根据条款9所述的方法，其中，所述随机样本包括所述差集内一定百分比的所述被分类的流式细胞仪数据。
11、根据条款10所述的方法，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为30％至70％。
12、根据条款11所述的方法，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为50％。
13、根据条款9所述的方法，其中，所述随机样本包括相对于由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合内的数据点的数量而确定的所述差集内的一定比例的被分类的流式细胞仪数据。
14、根据条款7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括距所述第一门在给定距离内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
15、根据条款7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括流式细胞仪数据的全集的随机样本。
16、根据条款9至15中任一项所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括所述随机样本与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。
17、根据条款7至16中任一项所述的方法，还包括用降维算法处理所记录的被分类的流式细胞仪的子集。
18、根据条款17所述的方法，其中，所述降维算法包括t分布随机邻域嵌入(tSNE)。
19、根据条款7至18中任一项所述的方法，还包括将所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集与表型相关联。
20、根据条款7至19中任一项所述的方法，还包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整所述第一门的顶点。
21、根据条款7至20中任一项所述的方法，还包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整所述第二门的顶点。
22、根据前述条款中任一项所述的方法，还包括基于所述第一门和所述第二门经由分选流式细胞仪对样品中的颗粒进行差异性分选。
23、根据条款22所述的方法，还包括将与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合相关联的颗粒分选到第一收集器皿中。
24、根据条款23所述的方法，还包括将与由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合和由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集所包含的流式细胞仪数据相关联的颗粒分选到第二收集器皿中。
25、一种系统，包括：
流式细胞仪，其用于获取流式细胞仪数据；和
处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在被所述处理器执行时，使所述处理器：
接收：
包括顶点集合的第一门；和
来自所述流式细胞仪的所述流式细胞仪数据；
扩展所述第一门以生成第二门；和
确定所述第一门和所述第二门中的每一个所包含的流式细胞仪数据集合以对所述流式细胞仪数据进行分类。
26、根据条款25所述的系统，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括：计算所述第一门的质心。
27、根据条款26所述的系统，其中，所述处理器还包括用于调整所述第一门的每个顶点使得所述顶点与所述质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比的指令。
28、根据条款27所述的系统，其中，所述百分比为1％至20％。
29、根据条款25所述的系统，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。
30、根据条款29所述的系统，其中，所述闵可夫斯基加法包括将所述第一门的顶点与扩展圆相加。
31、根据条款25至30中任一项所述的系统，其中，所述处理器还包括用于记录被分类的流式细胞仪数据的子集的指令。
32、根据条款31所述的系统，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合。
33、根据条款31所述的系统，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
34、根据条款33所述的系统，其中，所述随机样本包括所述差集内一定百分比的所述被分类的流式细胞仪数据。
35、根据条款34所述的系统，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为30％至70％。
36、根据条款35所述的系统，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为为50％。
37、根据条款33所述的系统，其中，所述随机样本包括相对于由所述第一门包含的所述流式细胞仪数据集合内的数据点的数量而确定的一定比例的所述差集内的被分类的流式细胞仪数据。
38、根据条款31所述的系统，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括距所述第一门在给定距离内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
39、根据条款31所述的系统，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括流式细胞仪数据的全集的随机样本。
40、根据条款33至39中任一项所述的系统，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括所述随机样本与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。
41、根据条款31至40中任一项所述的系统，其中，所述处理器还包括用于利用降维算法处理所记录的被分类的流式细胞仪的子集的指令。
42、根据条款41所述的系统，其中，所述降维算法包括t分布随机邻域嵌入(tSNE)。
43、根据条款31至42中任一项所述的系统，其中，所述处理器还包括用于将所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集与表型相关联的指令。
44、根据条款31至43中任一项所述的系统，其中，所述处理器还包括用于基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集调整所述第一门的顶点的指令。
45、根据条款31至44中任一项所述的系统，其中，所述处理器还包括用于基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集调整所述第二门的顶点的指令。
46、根据条款25至45中任一项所述的系统，其中，所述流式细胞仪是被配置对样品中的颗粒进行分选的分选流式细胞仪。
47、根据条款46的系统，其中，所述分选流式细胞仪被配置为基于所述第一门和所述第二门来对所述颗粒进行分选。
48、根据条款47所述的系统，其中，所述分选流式细胞仪被配置为将与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合相关联的颗粒分选到第一收集器皿中。
49、根据条款48所述的系统，其中，所述分选流式细胞仪被配置为将与由所述第二门包含的所述流式细胞仪数据集合和由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集所包含的流式细胞仪数据相关联的颗粒分选到第二收集器皿中。
50、一种非暂时性计算机可读存储介质，包括存储在其上的指令，所述指令用于通过以下方法对流式细胞仪数据进行分类，所述方法包括：
接收：
包括顶点集合的第一门；和
流式细胞仪数据；
扩展所述第一门以生成第二门；以及
确定所述第一门和所述第二门中的每一个所包含的流式细胞仪数据集合以对所述流式细胞仪数据进行分类。
51、根据条款50所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括：计算所述第一门的质心。
52、根据条款51所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述方法还包括调整所述第一门的每个顶点，使得所述顶点与所述质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。
53、根据条款52所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述百分比为1％至20％。
54、根据条款50所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。
55、根据条款54所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述闵可夫斯基加法包括将所述第一门的顶点与扩展圆相加。
56、根据条款50至55中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述方法还包括记录被分类的流式细胞仪数据的子集。
57、根据条款56所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合。
58、根据条款56所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合与由所述第一门包含的所述流式细胞仪数据集合的差集内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
59、根据条款58所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述随机样本包括所述差集内一定百分比的所述被分类的流式细胞仪数据。
60、根据条款59所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为30％至70％。
61、根据条款60所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为50％。
62、根据条款58所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述随机样本包括相对于由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合内的数据点的数量而确定的所述差集内的一定比例的被分类的流式细胞仪数据。
63、根据条款56所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括与距所述第一门在给定距离内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
64、根据条款56所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括流式细胞仪数据的全集的随机样本。
65、根据条款58至64中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括所述随机样本与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。
66、根据条款56至65中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述方法还包括用降维算法处理所记录的被分类的流式细胞仪的子集。
67、根据条款66所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述降维算法包括t分布随机邻域嵌入(tSNE)。
68、根据条款56至67中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述方法还包括将所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集与表型相关联。
69、根据条款56至68中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述方法还包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整所述第一门的顶点。
70、根据条款56至69中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，还包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整所述第二门的顶点。
71、一种方法，包括：
将以下项输入到处理器：
流式细胞仪数据；和
包括顶点集合的第一门，其中，所述处理器被配置为自动扩展所述第一门以生成第二门；以及
从所述处理器接收所输出的由所述第一门和所述第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合。
72、根据条款71所述的方法，其中，自动扩展所述第一门以生成第二门包括：计算所述第一门的质心。
73、根据条款72所述的方法，还包括调整所述第一门的每个顶点，使得所述顶点与所述质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。
74、根据条款73的方法，其中，所述百分比为1％至20％。
75、根据条款71所述的方法，其中，自动扩展所述第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。
76、根据条款75所述的方法，其中，所述闵可夫斯基加法包括将所述第一门的顶点与扩展圆相加。
77、根据条款71至76中任一项所述的方法，其中，所输出的流式细胞仪数据包括被分类的流式细胞仪数据的子集。
78、根据条款77所述的方法，其中，所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合。
79、根据条款77所述的方法，其中，所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
80、根据条款79的方法，其中，所述随机样本包括所述差集内一定百分比的所述被分类的流式细胞仪数据。
81、根据条款80所述的方法，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为30％至70％。
82、根据条款81所述的方法，其中，所述差集内所述被分类的流式细胞仪数据的百分比为50％
83、根据条款79的方法，其中，所述随机样本包括相对于由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合内的数据点的数量而确定的所述差集内的一定比例的被分类的流式细胞仪数据。
84、根据条款77所述的方法，其中，所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集包括距所述第一门在给定距离内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
85、根据条款77所述的方法，其中，所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集包括流式细胞仪数据的全集的随机样本。
86、根据条款79至85中任一项所述的方法，其中，所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集包括所述随机样本与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的并集。
87、根据条款77至86中任一项所述的方法，还包括用降维算法处理所输出的被分类的流式细胞仪的子集。
88、根据条款87所述的方法，其中，所述降维算法包括t分布随机邻域嵌入(tSNE)。
89、根据条款71至88中任一项所述的方法，还包括将所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集与表型相关联。
90、根据条款71至89中任一项所述的方法，还包括基于所输出的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整所述第一门的顶点。
91、根据条款71至90中任一项所述的方法，还包括基于所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集来调整所述第二门的顶点。
92、根据条款71至91中任一项所述的方法，还包括基于所述第一门和所述第二门经由分选流式细胞仪对样品中的颗粒进行差异性分选。
93、根据条款92的方法，还包括将与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合相关联的颗粒分选到第一收集器皿中。
94、根据条款93所述的方法，还包括将与由所述第二门包含的所述流式细胞仪数据集合和由所述第一门包含的所述流式细胞仪数据集合的所述差集所包含的流式细胞仪数据相关联的颗粒分选到第二收集器皿中。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过图示和示例的方式对上述发明进行了一些详细描述，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。
因此，前面仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种装置，这些装置尽管本文没有明确描述或示出，但体现了本发明的原理，并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人对本领域的进一步发展所贡献的概念，并且应理解为不限于这样具体列举的示例和条件。此外，本文中引用本发明的原理、方面和实施例以及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等效物。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物和未来开发的等效物(即，无论结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件)。此外，本文所披露的任何内容均无意专门向公众开放，无论这种公开是否在权利要求书中明确记载。
因此，本发明的范围不旨在限于本文所示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。在权利要求书中，35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)被明确定义为仅当权利要求书的此类限制的开头记载了确切短语“用于……的装置”或确切短语“用于……的步骤”时，权利要求中的限制才调用35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)；如果在权利要求中的限制中没有使用该确切短语，则不调用35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)。

Claims (15)

1.一种对流式细胞仪数据进行分类的方法，所述方法包括：
接收：
包括顶点集合的第一门；和
流式细胞仪数据；
扩展所述第一门以生成第二门；以及
确定由所述第一门和所述第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对所述流式细胞仪数据进行分类。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括：计算所述第一门的质心。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括调整所述第一门的每个顶点，使得所述顶点与所述质心的水平差异和垂直差异增加一定百分比。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述百分比为1％至20％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，扩展所述第一门以生成第二门包括闵可夫斯基加法。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述闵可夫斯基加法包括将所述第一门的顶点与扩展圆相加。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括记录被分类的流式细胞仪数据的子集。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括由所述第二门包含的流式细胞仪数据集合与由所述第一门包含的流式细胞仪数据集合的差集内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括距所述第一门在给定距离内的所述流式细胞仪数据的随机样本。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集包括流式细胞仪数据的全集的随机样本。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，还包括将所记录的被分类的流式细胞仪数据的子集与表型相关联。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括基于所述第一门和所述第二门经由分选流式细胞仪对样品中的颗粒进行差异性分选。
14.一种系统，包括：
流式细胞仪，其用于获取流式细胞仪数据；以及
处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在被所述处理器执行时，使所述处理器：
接收：
包括顶点集合的第一门；和
来自所述流式细胞仪的所述流式细胞仪数据；
扩展所述第一门以生成第二门；以及
确定由所述第一门和所述第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合以对所述流式细胞仪数据进行分类。
15.一种方法，包括：
将以下项输入到处理器：
流式细胞仪数据；和
包括顶点集合的第一门，其中，所述处理器被配置为自动扩展所述第一门以生成第二门；以及
从所述处理器接收所输出的由所述第一门和所述第二门中的每一个包含的流式细胞仪数据集合。
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