ES2966846T3

ES2966846T3 - Parámetros para su uso en la discriminación de partículas

Info

Publication number: ES2966846T3
Application number: ES20783677T
Authority: ES
Inventors: Matthew Bahr; Eric D Diebold; Jonathan Lin; Keegan Owsley
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2024-04-24
Anticipated expiration: 2040-03-12
Also published as: US20220187182A1; CN113544490A; JP2022526714A; US11988589B2; US11268890B2; EP3867627A1; WO2020205200A1; JP7466563B2; EP3867627B1; US20200309664A1; EP3867627A4

Abstract

Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos para caracterizar partículas de una muestra en una corriente de flujo. Los métodos según ciertas realizaciones incluyen detectar luz de una muestra que tiene células en una corriente de flujo, generar una imagen de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación y determinar si el objeto en la corriente de flujo es un agregado en función de la imagen generada. También se describen sistemas que tienen un procesador con memoria acoplada operativamente al procesador que tiene instrucciones almacenadas en él, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador genere una imagen de un objeto en un flujo de flujo y determine si el objeto es un agregado. También se proporcionan dispositivos de circuito integrado (por ejemplo, conjuntos de puertas programables en campo) que tienen programación para practicar los métodos en cuestión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Parámetros para su uso en la discriminación de partículas

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud está relacionada con la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con n.° de serie US-62/826.646, presentada el 29 de marzo de 2019.

Introducción

Los sistemas de clasificación de partículas de tipo flujo, como los citómetros de flujo de clasificación, se utilizan para clasificar partículas en una muestra de fluido basándose en al menos una característica medida de las partículas. En un sistema de clasificación de partículas de tipo flujo, las partículas, tales como moléculas, perlas unidas a analitos o células individuales, en una suspensión fluida pasan en una corriente por una región de detección en la que un sensor detecta partículas contenidas en la corriente del tipo que va a clasificarse. El sensor, al detectar una partícula del tipo que va a clasificarse, activa un mecanismo de clasificación que aísla selectivamente la partícula de interés. Para clasificar partículas en la muestra, un mecanismo de carga de gotas carga gotitas de la corriente de flujo que contienen un tipo de partícula que va a clasificarse con una carga eléctrica en el punto de ruptura de la corriente de flujo. Las gotas pasan a través de un campo electrostático y se desvían basándose en la polaridad y la magnitud de la carga de la gota hacia uno o más recipientes colectores. Las gotas descargadas no son desviadas por el campo electrostático.

En la clasificación de partículas, los agregados (por ejemplo, agrupaciones de células) pueden ser componentes destacados de las muestras, lo que afecta la precisión y reproducibilidad de los protocolos de clasificación. Además, la caracterización errónea de un agregado de células como una célula individual reduce el rendimiento general y la pureza de las células clasificadas, lo que puede ser perjudicial en particular cuando la pureza es crítica para el uso final de una composición de células clasificadas (por ejemplo, como agente terapéutico). La aglomeración puede ocurrir debido a una alteración incompleta de los tejidos por descomposición mecánica o enzimática en células individuales, por el uso de fijadores a base de alcohol que inducen la agrupación o por centrifugación. La agrupación también puede ocurrir como un atributo inherente de ciertos tipos de células, como los queratinocitos. El documento US 2005/148099 A1 divulga un aparato de inmunoensayo que incluye una sección de preparación de muestras de medición para preparar una muestra de medición mezclando una muestra con partículas portadoras en las que se inmoviliza un anticuerpo o un antígeno contra un analito, un detector para detectar información interna e información de tamaño de partículas contenidas en la muestra de medición y un controlador para identificar las partículas portadoras basándose en la información interna obtenida y para calcular un grado de agregación de las partículas portadoras identificadas basándose en la información de tamaño obtenida. También se describe un método de inmunoensayo.

Resumen

Los aspectos de la presente descripción incluyen métodos para caracterizar partículas de una muestra en una corriente de flujo. Los métodos según ciertas realizaciones incluyen detectar luz de una muestra que tiene células en una corriente de flujo, generar datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación y determinar si el objeto en la corriente de flujo es un agregado basándose en los datos espaciales. También se describen sistemas que tienen un procesador con memoria acoplada operativamente al procesador que tiene instrucciones almacenadas en ella, que cuando el procesador las ejecuta, hacen que el procesador genere datos espaciales de un objeto en una corriente de flujo y determine si el objeto es un agregado. También se proporcionan dispositivos de circuito integrado (por ejemplo, matrices de puertas programables en campo) que tienen programación para practicar los métodos en cuestión.

En realizaciones, la luz de una muestra en una corriente de flujo se detecta en una región de interrogación y se generan una o más imágenes (por ejemplo, imágenes codificadas en frecuencia) de objetos en la corriente de flujo. En algunas realizaciones, los objetos de los que se obtienen imágenes en la región de interrogación incluyen células. En algunas realizaciones, los métodos incluyen detectar uno o más de absorción de luz, dispersión de luz, emisión de luz (por ejemplo, fluorescencia) de la muestra en la corriente de flujo. En algunos casos, los datos espaciales de uno o más objetos en la muestra se generan a partir de la absorción de luz detectada (por ejemplo, datos de imágenes de campo claro). En otros casos, los datos espaciales de uno o más objetos en la muestra se generan a partir de la dispersión de la luz detectada (por ejemplo, datos de imágenes de dispersión frontal, datos de imágenes de dispersión lateral). En aún otros casos, los datos espaciales de uno o más objetos en la muestra se generan a partir de la fluorescencia detectada (por ejemplo, datos de imágenes de marcadores fluorescentes). En todavía otros casos, los datos espaciales de uno o más objetos en la muestra se generan a partir de una combinación de dos o más de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y fluorescencia detectada.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen determinar el tamaño del objeto basándose en los datos espaciales. En otras realizaciones, los métodos incluyen determinar el centro de masa del objeto basándose en los datos espaciales. En aún otras realizaciones, los métodos incluyen determinar la excentricidad del objeto basándose en los datos espaciales. En determinadas realizaciones, se calcula un momento de imagen basándose en los datos espaciales. En algunos casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen generar una imagen de un objeto en el flujo en una región de interrogación. En algunas realizaciones, la imagen es una imagen en escala de grises del objeto. Los métodos según determinadas realizaciones incluyen calcular un momento de imagen del objeto a partir de la imagen generada. En algunos casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, una o más propiedades del objeto se determinan basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada. Por ejemplo, los métodos pueden incluir determinar el tamaño del objeto, el centro de masa, la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o un eje vertical o una combinación de los mismos. En algunos casos, los métodos incluyen evaluar uno o más del tamaño, centro de masa y excentricidad del objeto y determinar si el objeto es un agregado de células. En ciertos casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y centro de masa determinados del objeto. En otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y la excentricidad determinados del objeto. En aún otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En todavía otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño, centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En ciertos casos, los métodos incluyen comparar una primera imagen del objeto con una segunda imagen del objeto y determinar una o más propiedades del objeto basándose en la comparación entre la primera imagen del objeto con la segunda imagen del objeto.

Para determinar si el objeto es un agregado de células, en ciertos casos, los métodos incluyen: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y los datos espaciales; y 2) evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En algunas realizaciones, la dispersión de la luz incluye luz dispersada hacia adelante desde el objeto. En otras realizaciones, la dispersión de la luz incluye luz dispersada lateralmente desde el objeto. En ciertas realizaciones, los métodos incluyen evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz para uno o más del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada; y 2) evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En algunas realizaciones, la dispersión de la luz incluye luz dispersada hacia adelante desde el objeto. En otras realizaciones, la dispersión de la luz incluye luz dispersada lateralmente desde el objeto. En ciertas realizaciones, los métodos incluyen evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz para uno o más del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso.

En determinadas realizaciones, los métodos incluyen generar una máscara de imagen del objeto. Para generar una máscara de imagen según algunos casos, los métodos incluyen generar una imagen en escala de grises del objeto en la corriente de flujo, determinar un valor umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises, comparar cada píxel de la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad de píxel determinado y convertir cada píxel en un valor de píxel binario. En un ejemplo, los métodos incluyen detectar la absorción de luz (por ejemplo, datos de imágenes de campo claro) de la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel de la imagen en escala de grises es mayor que el valor umbral. En otro ejemplo, los métodos incluyen detectar la dispersión de luz desde la célula en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral. En aún otro ejemplo, los métodos incluyen detectar fluorescencia desde la célula en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral. En algunas realizaciones, la máscara de imagen se genera a partir de píxeles que tienen un valor de píxel binario de 1. En otras realizaciones, la máscara de imagen se genera a partir de píxeles que tienen un valor de píxel binario de 0.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen determinar el tamaño del objeto, el centro de masa o la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o un eje vertical basándose en la máscara de imagen generada. En estas realizaciones, uno o más de estos parámetros de la máscara de imagen se utilizan para evaluar si el objeto es una célula individual o es un agregado de células. En un ejemplo, los métodos incluyen evaluar el tamaño y el centro de masa del objeto a partir de la máscara de imagen para determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células. En otro ejemplo, los métodos incluyen evaluar la excentricidad a lo largo de un eje horizontal o un eje vertical y el tamaño del objeto de la máscara de imagen para determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células. En aún otro ejemplo, los métodos incluyen evaluar la excentricidad a lo largo de un eje horizontal o un eje vertical y el centro de masa de la máscara de imagen para determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen identificar que el objeto es un agregado de células. En algunos casos, los métodos incluyen determinar que el objeto es un agregado de células horizontal donde dos o más células están alineadas entre sí a través de un eje horizontal de la corriente de flujo. En otros casos, los métodos incluyen determinar que el objeto es un agregado de células vertical donde dos o más células están alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, eje longitudinal) de la corriente de flujo. En aún otros casos, los métodos incluyen determinar que el objeto es un agregado de células combinado que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal y que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen calcular los datos espaciales a partir de datos de fluorescencia codificados en frecuencia del objeto. En algunos casos, el cálculo de los datos espaciales del objeto incluye realizar una transformada de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En un ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier (FT) de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier discreta (DFT) de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En otro ejemplo más, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier de corto tiempo (STFT) de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En todavía otro ejemplo, los datos espaciales se calculan con un amplificador de bloqueo digital para heterodinar y demultiplexar los datos de fluorescencia codificados en frecuencia.

Los métodos según determinadas realizaciones también incluyen clasificar el objeto. En algunas realizaciones, el objeto se identifica como una célula individual y se clasifica en una primera ubicación de recogida de componentes de muestra. En otras realizaciones, el objeto se identifica como un agregado de células y se clasifica en una segunda ubicación de recogida de componentes de muestra. En algunos casos, la primera ubicación de recogida de componentes de muestra incluye un recipiente de recogida de muestras y la segunda ubicación de recogida de componentes de muestra incluye un recipiente de recogida de residuos.

Los aspectos de la presente descripción también incluyen sistemas para caracterizar partículas de una muestra (por ejemplo, células en una muestra biológica). Los sistemas según ciertas realizaciones incluyen una fuente de luz configurada para irradiar una muestra que tiene células en una corriente de flujo, un sistema de detección de luz que tiene un fotodetector y un procesador que tiene una memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en la misma, que cuando el procesador las ejecuta hacen que el procesador genere datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación y determine si el objeto en la corriente de flujo es un agregado de células basándose en los datos espaciales. En realizaciones, el sistema de detección de luz incluye uno o más fotodetectores para detectar absorción de luz, dispersión de luz, fluorescencia o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un procesador con memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella, que cuando las ejecuta el procesador hacen que el procesador determine el tamaño del objeto basándose en los datos espaciales. En otras realizaciones, la memoria incluye instrucciones para determinar el centro de masa del objeto basándose en los datos espaciales. En aún otras realizaciones, la memoria incluye instrucciones para determinar la excentricidad del objeto basándose en los datos espaciales. En determinadas realizaciones, la memoria incluye instrucciones para calcular un momento de imagen basándose en los datos espaciales. En algunos casos, la memoria incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, la memoria incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, la memoria incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, la memoria incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un procesador con memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella, que cuando las ejecuta el procesador hacen que el procesador genere una imagen de un objeto en la corriente de flujo. En algunas realizaciones, la memoria incluye instrucciones para generar una imagen en escala de grises del objeto en la corriente de flujo. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para generar la imagen a partir de la absorción de luz detectada (por ejemplo, datos de imágenes de campo claro) del objeto en la corriente de flujo. En otras realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para generar la imagen a partir de la dispersión de luz detectada (por ejemplo, datos de imagen de dispersión directa, datos de imagen de dispersión lateral) del objeto en la corriente de flujo. En aún otras realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para generar la imagen a partir de la fluorescencia detectada (por ejemplo, datos de imágenes de marcadores fluorescentes) del objeto en la corriente de flujo. En todavía otros casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para generar una imagen del objeto a partir de una combinación de dos o más de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y fluorescencia detectada.

En algunas realizaciones, la memoria incluye instrucciones que, cuando las ejecuta el procesador, hacen que el procesador calcule un momento de imagen del objeto a partir de la imagen generada. En algunos casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

Los sistemas de interés también pueden incluir una memoria que tiene instrucciones que, cuando las ejecuta el procesador, hacen que el procesador determine una o más propiedades del objeto en la corriente de flujo basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada. En estas realizaciones, la memoria puede incluir instrucciones para determinar el tamaño del objeto, el centro de masa del objeto o la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o un eje vertical o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para evaluar uno o más del tamaño, centro de masa y excentricidad del objeto y determinar si el objeto es un agregado de células. En un ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y centro de masa determinados del objeto. En otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y la excentricidad determinados del objeto. En aún otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En todavía otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño, centro de masa y excentricidad determinados del objeto. En ciertos casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para comparar una primera imagen del objeto con una segunda imagen del objeto y determinar una o más propiedades del objeto basándose en la comparación entre la primera imagen del objeto con la segunda imagen del objeto.

En ciertos casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y los datos espaciales; y 2) evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En algunas realizaciones, los sistemas están configurados para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión frontal. En otras realizaciones, los sistemas están configurados para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión lateral. En ciertas realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz para uno o más del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso.

En ciertos casos, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada; y 2) evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En algunas realizaciones, los sistemas están configurados para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión frontal. En otras realizaciones, los sistemas están configurados para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión lateral. En ciertas realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz para uno o más del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso.

En ciertas realizaciones, los sistemas de interés también incluyen una memoria que tiene instrucciones que, cuando las ejecuta el procesador, hacen que el procesador genere una máscara de imagen del objeto. En estas realizaciones, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para: 1) generar una imagen en escala de grises del objeto en la corriente de flujo; 2) determinar un valor umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises; 3) comparar cada píxel de la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad de píxel determinado y 4) convertir cada píxel en un valor de píxel binario. En un ejemplo, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para detectar la absorción de luz (por ejemplo, datos de imagen de campo claro) de la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel de la imagen en escala de grises es mayor que el valor umbral. En otro ejemplo, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para detectar la dispersión de la luz desde la célula en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad del píxel es menor que el valor umbral. En aún otro ejemplo, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para detectar la fluorescencia de la célula en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad del píxel es menor que el valor umbral. En algunas realizaciones, el sistema está configurado para generar la máscara de imagen a partir de píxeles que tienen un valor de píxel binario de 1. En otras realizaciones, el sistema está configurado para generar la máscara de imagen a partir de píxeles que tienen un valor de píxel binario de 0.

Los sistemas objeto están configurados, según determinados casos, para discriminar entre objetos en la muestra. En algunos casos, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para determinar el tamaño del objeto, el centro de masa o la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o eje vertical basándose en la máscara de imagen generada. En estos casos, el sistema objeto utiliza uno o más de estos parámetros de la máscara de imagen para evaluar si el objeto es una célula individual o es un agregado de células. En un ejemplo, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para evaluar el tamaño y el centro de masa del objeto a partir de la máscara de imagen y determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células. En otro ejemplo, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para evaluar la excentricidad a lo largo de un eje horizontal o eje vertical y el tamaño del objeto a partir de la máscara de imagen y determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células. En aún otro ejemplo, el sistema incluye un programa informático que tiene instrucciones para evaluar la excentricidad a lo largo de un eje horizontal o eje vertical y el centro de masa del objeto a partir de la máscara de imagen y determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células.

En algunas realizaciones, los sistemas de interés incluyen una memoria que tiene instrucciones que, cuando las ejecuta el procesador, hacen que el procesador identifique que el objeto es un agregado de células. En algunos casos, los sistemas están configurados para clasificar el objeto como un agregado de células horizontal donde dos o más células están alineadas entre sí a través de un eje horizontal de la corriente de flujo. En otros casos, los sistemas están configurados para clasificar el objeto como un agregado de células vertical donde dos o más células están alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, eje longitudinal) de la corriente de flujo. En aún otros casos, los sistemas están configurados para clasificar el objeto como un agregado de células combinado que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal y que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, los sistemas de interés incluyen una memoria que tiene instrucciones que, cuando las ejecuta el procesador, hacen que el procesador calcule los datos espaciales a partir de datos de fluorescencia codificados en frecuencia del objeto. En algunos casos, el cálculo de los datos espaciales del objeto incluye realizar una transformada de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En un ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier (FT) de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier discreta (DFT) de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En otro ejemplo más, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier de corto tiempo (STFT) de los datos de fluorescencia codificados en frecuencia. En todavía otro ejemplo, los datos espaciales se calculan con un amplificador de bloqueo digital para heterodinar y demultiplexar los datos de fluorescencia codificados en frecuencia.

Los sistemas de interés están configurados para clasificar partículas de una muestra (por ejemplo, una muestra biológica) en la corriente de flujo. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen además un componente de clasificación de partículas que tiene un subsistema de entrega de fluido de muestra y un subsistema de entrega de fluido envolvente que está en comunicación fluida con una entrada del componente de clasificación de partículas y uno o más recipientes de recogida de muestras para recibir el objeto clasificado desde la corriente de flujo. En ciertos casos, se determina que el objeto es un agregado de células y el componente de clasificación está configurado para dirigir el agregado de células a una salida de recogida de residuos (por ejemplo, un conducto o recipiente de residuos). En otros casos, se determina que el objeto es una célula individual y el componente de clasificación se configura para dirigir la célula individual a un recipiente de recogida de muestras.

Los aspectos de la presente descripción también incluyen dispositivos de circuito integrado programados para: generar datos espaciales de un objeto en una corriente de flujo en una región de interrogación; y determinar si el objeto en la corriente de flujo es un agregado de células basándose en los datos espaciales. En algunas realizaciones, los dispositivos de circuito integrado están programados para clasificar el objeto, tal como en un recipiente de recogida de residuos cuando se determina que el objeto es un agregado de células o en un recipiente de recogida de muestras cuando se determina que el objeto es una célula individual. Los dispositivos de circuito integrado de interés pueden incluir, en ciertos casos, una matriz de puertas programables en campo (FPGA), un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) o un dispositivo lógico programable complejo (CPL<d>).

Los dispositivos de circuito integrado según ciertas realizaciones están programados para generar datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales a partir de señales de datos de un detector de absorción de luz (por ejemplo, datos de imágenes de campo claro). En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales a partir de señales de datos de un detector de dispersión de luz (por ejemplo, datos de imágenes de dispersión directa, datos de imágenes de dispersión lateral). En aún otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales a partir de señales de datos de un detector de emisión de luz (por ejemplo, datos de imágenes de marcadores fluorescentes). En todavía otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales del objeto a partir de una combinación de dos o más de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y fluorescencia detectada.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el tamaño del objeto basándose en los datos espaciales. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el centro de masa del objeto basándose en los datos espaciales. En aún otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar la excentricidad del objeto basándose en los datos espaciales. En determinadas realizaciones, se calcula un momento de imagen basándose en los datos espaciales. En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen del objeto a partir de la imagen generada. En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar una o más propiedades del objeto en la corriente de flujo basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada. En estas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el tamaño del objeto, el centro de masa del objeto o la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o un eje vertical o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar uno o más del tamaño, centro de masa y excentricidad del objeto y determinar si el objeto es un agregado de células. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y centro de masa determinados del objeto. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y la excentricidad determinados del objeto. En aún otro ejemplo, los sistemas incluyen el dispositivo de circuito integrado que está programado para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En todavía otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño, centro de masa y excentricidad determinados del objeto. En ciertos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar una primera imagen del objeto con una segunda imagen del objeto y determinar una o más propiedades del objeto basándose en la comparación entre la primera imagen del objeto con la segunda imagen del objeto.

En ciertos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y los datos espaciales; y 2) evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión frontal. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión lateral. En ciertas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz para uno o más del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso.

En ciertos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada; y 2) evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión frontal. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar señales de salida de un detector de luz de dispersión lateral. En ciertas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar las señales de salida del detector de dispersión de luz para uno o más del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso.

En ciertas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar una máscara de imagen del objeto. En estas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para: 1) generar una imagen en escala de grises del objeto en la corriente de flujo; 2) determinar un valor umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises; 3) comparar cada píxel de la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad de píxel determinado y 4) convertir cada píxel en un valor de píxel binario. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para recibir señales de datos desde un detector de absorción de luz (por ejemplo, datos de imagen de campo claro) y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel de la imagen en escala de grises es mayor que el valor umbral. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para recibir señales de datos desde un detector de dispersión de luz y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral. En aún otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para recibir señales de datos desde un detector de fluorescencia y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar la máscara de imagen a partir de los píxeles que tienen un valor de píxel binario de 1. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar la máscara de imagen a partir de píxeles que tienen un valor de píxel binario de 0.

En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el tamaño del objeto, el centro de masa o la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o eje vertical basándose en la máscara de imagen generada. En estos casos, el dispositivo de circuito integrado utiliza señales de datos correspondientes a uno o más de estos parámetros de la máscara de imagen para evaluar si el objeto es una célula individual o es un agregado de células. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar el tamaño y el centro de masa del objeto a partir de la máscara de imagen y determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar la excentricidad a lo largo de un eje horizontal o eje vertical y el tamaño del objeto a partir de la máscara de imagen y determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células. En otro ejemplo más, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar la excentricidad a lo largo de un eje horizontal o eje vertical y el centro de masa del objeto a partir de la máscara de imagen y determinar si el objeto es una célula individual o un agregado de células.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para identificar que el objeto es un agregado de células. En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para clasificar el objeto como un agregado de células horizontal donde dos o más células están alineadas entre sí a través de un eje horizontal de la corriente de flujo. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para clasificar el objeto como un agregado de células vertical donde dos o más células están alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, eje longitudinal) de la corriente de flujo. En aún otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para clasificar el objeto como un agregado de células de combinación que tiene dos o más células alineadas entre sí a través de un eje horizontal y que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.

Breve descripción de las figuras

La invención puede entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

FIGURAS 1Ay1Brepresentan imágenes de agregados de células según ciertas realizaciones.FIGURA 1Arepresenta una imagen de un agregado de células orientado verticalmente que tiene dos células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.FIGURA 1Brepresenta una imagen de un agregado de células orientado horizontalmente que tiene dos células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal.

FIGURAS 2A y 2Brepresentan el uso de excentricidad calculada para discriminar entre una célula individual y un agregado de células según ciertas realizaciones.FIGURA 2Arepresenta una célula individual obtenida como imagen.FIGURA 2Brepresenta un agregado de células obtenido como imagen.

FIGURA 3representa un diagrama de flujo para obtener imágenes y caracterizar una partícula en una corriente de flujo según ciertas realizaciones.

Descripción detallada

Los aspectos de la presente descripción incluyen métodos para caracterizar partículas de una muestra en una corriente de flujo. Los métodos según ciertas realizaciones incluyen detectar luz de una muestra que tiene células en una corriente de flujo, generar una imagen de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación y determinar si el objeto en la corriente de flujo es un agregado basándose en la imagen generada. También se describen sistemas que tienen un procesador con memoria acoplada operativamente al procesador que tiene instrucciones almacenadas en ella que, cuando el procesador las ejecuta, hacen que el procesador genere una imagen de un objeto en una corriente de flujo y determine si el objeto es un agregado. También se proporcionan dispositivos de circuito integrado (por ejemplo, matrices de puertas programables en campo) que tienen programación para practicar los métodos en cuestión.

Antes de que la presente invención se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden variar, naturalmente. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene por objeto describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluya uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.

Ciertos intervalos se presentan en el presente documento con valores numéricos precedidos por el término “ aproximadamente” . El término “ aproximadamente” se utiliza en el presente documento para proporcionar soporte literal para el número exacto que precede, así como un número cercano o aproximado al número que precede al término. Para determinar si un número está cerca de o aproximadamente a un número específicamente recitado, el número no recitado cercano o aproximado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporcione el equivalente sustancial del número específicamente recitado.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.

Ha de señalarse que tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la recitación de los elementos de la las reivindicaciones, o el uso de una limitación “ negativa” .

Como se resumió anteriormente, la presente descripción proporciona sistemas y métodos para determinar si un objeto en una corriente de flujo es un agregado de células.

Al describir con mayor detalle realizaciones de la descripción, primero se describen con mayor detalle métodos para generar datos espaciales del objeto en una corriente de flujo y determinar si el objeto es un agregado de células basándose en los datos espaciales. A continuación, se describen sistemas para caracterizar objetos en una corriente de flujo y separar partículas en una muestra en tiempo real. También se proporcionan dispositivos de circuito integrado, tales como matrices de puertas programables en campo que tienen programación para generar datos espaciales del objeto en la corriente de flujo, clasificar el objeto como un agregado de células o una célula individual y clasificar el agregado de células o una célula individual.

Métodos para caracterizar partículas en una muestra

Los aspectos de la presente descripción incluyen métodos para caracterizar partículas de una muestra (por ejemplo, células en una muestra biológica). En la práctica de métodos según ciertas realizaciones, una muestra que tiene células en una corriente de flujo se irradia con una fuente de luz y se detecta la luz de la muestra para generar datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación y para determinar si el objeto es un agregado de partículas (por ejemplo, un agregado de células) basándose en los datos espaciales. En realizaciones, los métodos incluyen discriminar entre células individuales y un agregado de dos o más células basándose en los datos espaciales del objeto. El término “datos espaciales” se utiliza en el presente documento para describir señales de datos que codifican posiciones espaciales de la región de interrogación irradiada de la corriente de flujo. Como se describe con mayor detalle a continuación, en algunas realizaciones los datos espaciales se calculan a partir de datos de fluorescencia codificados en frecuencia del objeto en la corriente de flujo, tal como realizando una transformada de datos de fluorescencia codificados en frecuencia (por ejemplo, realizando una transformada de Fourier o calculando los datos espaciales con un amplificador de bloqueo digital para heterodinar y demultiplexar los datos de fluorescencia codificados en frecuencia). En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica. El término “ muestra biológica” se utiliza en su sentido convencional para referirse a un organismo completo, planta, hongos o un subconjunto de tejidos animales, células o partes componentes que puedan encontrarse en ciertos casos en la sangre, el moco, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido cefalorraquídeo, la saliva, el lavado broncoalveolar, el líquido amniótico, la sangre del cordón amniótico, la orina, el fluido vaginal y el semen. Como tal, una “ muestra biológica” se refiere tanto al organismo nativo como al subconjunto de sus tejidos, así como a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir del organismo o un subconjunto de sus tejidos, que incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones de la piel, tractos respiratorio, gastrointestinal, cardiovascular y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Las muestras biológicas pueden ser cualquier tipo de tejido orgánico, incluyendo tanto tejido sano como enfermo (p. ej., canceroso, maligno, necrótico, etc.). En determinadas realizaciones, la muestra biológica es una muestra líquida, tal como sangre o derivado de la misma, p. ej., plasma, lágrimas, orina, semen, etc., donde en algunos casos la muestra es una muestra de sangre, que incluye sangre completa, tal como sangre obtenida de punción venosa o punción digital (donde la sangre puede o no combinarse con cualquier reactivo antes del ensayo, tales como conservantes, anticoagulantes, etc.).

En determinadas realizaciones, la fuente de la muestra es un “ mamífero” o “ de la clase Mammalia” , donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase Mammalia, incluyendo los órdenes carnívoros (p. ej., perros y gatos), rodeores (p. ej., ratones, cobayas y ratas), y primates (p. ej., seres humanos, chimpancés y monos). En algunos casos, los sujetos son seres humanos. Los métodos pueden aplicarse a muestras obtenidas de sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier paso de desarrollo (es decir, neonatos, lactantes, juveniles, adolescentes, adultos), donde en determinadas realizaciones el sujeto humano es un juvenil, adolescente o adulto. Si bien la presente invención se puede aplicar a muestras de un sujeto humano, debe entenderse que los métodos también pueden realizarse en muestras de otros sujetos animales (es decir, en “ sujetos no humanos” ), tales como, pero sin limitarse a, aves, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.

Al practicar los métodos objeto, una muestra que tiene células (por ejemplo, en una corriente de flujo de un citómetro de flujo) se irradia con luz desde una fuente de luz. En algunas realizaciones, la fuente de luz es una fuente de luz de banda ancha, que emite luz con una amplia gama de longitudes de onda, tal como, por ejemplo, que abarca 50 nm o más, tal como 100 nm o más, tal como 150 nm o más, tal como 200 nm o más, tal como 250 nm o más, tal como 300 nm o más, tal como 350 nm o más, tal como 400 nm o más, e incluyendo abarcar 500 nm o más. Por ejemplo, una fuente de luz de banda ancha adecuada emite luz con longitudes de onda de 200 nm a 1500 nm. Otro ejemplo de una fuente de luz de banda ancha adecuada incluye una fuente de luz que emite luz con longitudes de onda de 400 nm a 1000 nm. Cuando los métodos incluyen irradiar con una fuente de luz de banda ancha, los protocolos de fuente de luz de banda ancha de interés pueden incluir, pero sin limitarse a, una lámpara de halógeno, lámpara de arco de deuterio, lámpara de arco de xenón, fuente de luz de banda ancha acoplada con fibra estabilizada, un LED de banda ancha con espectro continuo, un diodo emisor superluminiscente, un diodo emisor de luz semiconductor, una fuente de luz blanca LED de amplio espectro, una fuente de luz blanca integrada multiLED, entre otras fuentes de luz de banda ancha, o cualquier combinación de las mismas.

En otras realizaciones, los métodos incluyen irradiar con una fuente de luz de banda estrecha que emite una longitud de onda particular o un intervalo estrecho de longitudes de onda, tal como, por ejemplo, con una fuente de luz que emite luz en un intervalo estrecho de longitudes de onda como un intervalo de 50 nm o menos, tal como 40 nm o menos, tal como 30 nm o menos, tal como 25 nm o menos, tal como 20 nm o menos, tal como 15 nm o menos, tal como 10 nm o menos, tal como 5 nm o menos, tal como 2 nm o menos, e incluyendo fuentes de luz que emiten una longitud de onda específica de luz (es decir, luz monocromática). Cuando los métodos incluyen irradiar con una fuente de luz de banda estrecha, los protocolos de fuente de luz de banda estrecha de interés pueden incluir, pero sin limitarse a, un LED de longitud de onda estrecha, un diodo láser o una fuente de luz de banda ancha acoplada a uno o más filtros de paso de banda ópticos, rejillas de difracción, monocromadores o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, los métodos incluyen irradiar la corriente de flujo con uno o más láseres. Como se analizó anteriormente, el tipo y la cantidad de láseres variarán dependiendo de la muestra así como de la luz deseada recogida y pueden ser un láser pulsado o un láser de onda continua. Por ejemplo, el láser puede ser un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, un láser de argón, un láser kriptón, un láser de xenón, un láser de nitrógeno, un láser de CO2, un láser de CO, un láser excímero de argón-flúor (ArF), un láser excímero de kryptón-flúor (KrF), un láser excímero de cloro de xenón (XeCI), o un láser excímero de xenón (XeF), o una combinación de los mismos; un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina; un láser de metal-vapor, tal como un láser de helio-cadmio (HeCd), un láser de helio-mercurio (HeHg), un láser de helio-selenio (HeSe), un láser de helio-plata (HeAg), un láser de estroncio, un láser de neón-cobre (NeCu), un láser de cobre o un láser de oro, y combinaciones de los mismos; un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, un láser NdCrYAG, un láser Er:YAG, un láser Nd:YLF, un láser Nd:YVO4, un láser Nd:YCa4O(BO3)3, un láser Nd:YCOB, un láser de zafiro de titanio, un láser de tulio YAG, un láser de iterbio YAG, un láser de iterbio2O3, o láseres dopados con cerio, y combinaciones de los mismos; un láser de diodo semiconductor, un láser semiconductor bombeado ópticamente (OPSL), o una implementación de frecuencia duplicada o frecuencia triplicada de cualquiera de los láseres mencionados anteriormente.

La muestra en la corriente de flujo puede irradiarse con una o más de las fuentes de luz mencionadas anteriormente, tales como 2 o más fuentes de luz, tales como 3 o más fuentes de luz, tales como 4 o más fuentes de luz, tales como 5 o más fuentes de luz, e incluyendo 10 o más fuentes de luz. La fuente de luz puede incluir cualquier combinación de tipos de fuentes de luz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos incluyen irradiar la muestra en la corriente de flujo con una matriz de láseres, tal como una matriz que tenga uno o más láseres de gas, uno o más láseres de tinte, y uno o más láseres de estado sólido.

La muestra puede irradiarse con longitudes de onda que varían de 200 nm a 1500 nm, tal como de 250 nm a 1250 nm, tal como de 300 nm a 1000 nm, tal como de 350 nm a 900 nm, e incluyendo de 400 nm a 800 nm. Por ejemplo, cuando la fuente de luz es una fuente de luz de banda ancha, la muestra puede irradiarse con longitudes de onda de 200 nm a 900 nm. En otros casos, donde la fuente de luz incluye una pluralidad de fuentes de luz de banda estrecha, la muestra puede irradiarse con longitudes de onda específicas en el intervalo de 200 nm a 900 nm. Por ejemplo, la fuente de luz puede ser una pluralidad de LED de banda estrecha (1 nm-25 nm) que cada uno emite de forma independiente luz con un intervalo de longitudes de onda entre 200 nm a 900 nm. En otras realizaciones, la fuente de luz de banda estrecha incluye uno o más láseres (tales como una matriz láser), y la muestra se irradia con longitudes de onda específicas que varían de 200 nm a 700 nm, tal como con una matriz láser que tiene láseres de gas, láseres excímero, láseres de tinte, láseres de vapor de metal, y láser de estado sólido como se describió anteriormente.

Cuando se emplea más de una fuente de luz, la muestra puede irradiarse con las fuentes de luz de forma simultánea o secuencial, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, la muestra puede irradiarse simultáneamente con cada una de las fuentes de luz. En otras realizaciones, la corriente de flujo se irradia secuencialmente con cada una de las fuentes de luz. Cuando se emplea más de una fuente de luz para irradiar la muestra secuencialmente, el tiempo que cada fuente de luz irradia la muestra puede ser independientemente 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, tal como 10 microsegundos o más, tal como 30 microsegundos o más, e incluyendo 60 microsegundos o más. Por ejemplo, los métodos pueden incluir irradiar la muestra con la fuente de luz (p. ej., láser) durante una duración que varía de 0,001 microsegundos a 100 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 75 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos, e incluyendo de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En realizaciones donde la muestra se irradia secuencialmente con dos o más fuentes de luz, la duración de la muestra que se irradia por cada fuente de luz puede ser igual o diferente.

El período de tiempo entre la irradiación por cada fuente de luz también puede variar, según se desee, separado independientemente por un retardo de 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, tal como de 10 microsegundos o más, tal como de 15 microsegundos o más, tal como de 30 microsegundos o más, e incluyendo de 60 microsegundos o más. Por ejemplo, el período de tiempo entre la irradiación por cada fuente de luz puede variar de 0,001 microsegundos a 60 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 35 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos, e incluyendo de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En determinadas realizaciones, el período de tiempo entre la irradiación por cada fuente de luz es de 10 microsegundos. En realizaciones donde la muestra se irradia secuencialmente por más de dos (es decir, 3 o más) fuentes de luz, el retardo entre la irradiación por cada fuente de luz puede ser igual o diferente.

La muestra puede irradiarse continuamente o en intervalos discretos. En algunos casos, los métodos incluyen irradiar la muestra en la muestra con la fuente de luz de forma continua. En otros casos, la muestra se irradia con la fuente de luz en intervalos discretos, tal como irradiar cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Dependiendo de la fuente de luz, la muestra puede irradiarse desde una distancia que varía tal como 0,01 mm o más, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más, e incluyendo 50 mm o más. Además, el ángulo o irradiación también puede variar, oscilando de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75°, e incluyendo de 30° a 60°, por ejemplo en un ángulo de 90°.

Al practicar los métodos objeto, se mide la luz de la muestra irradiada, tal como recogiendo luz de la muestra en un intervalo de longitudes de onda (por ejemplo, 200 nm - 1000 nm). En realizaciones, los métodos pueden incluir uno o más de medir la absorción de luz por la muestra (por ejemplo, datos de luz de campo claro), medir la dispersión de la luz (por ejemplo, datos de luz de dispersión frontal o lateral) y medir la emisión de luz por la muestra (por ejemplo, datos de luz de fluorescencia).

La luz de la muestra puede medirse en una o más longitudes de onda, tal como en 5 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 10 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 25 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 50 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 100 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 200 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 300 o más longitudes de onda diferentes, e incluyendo medir la luz recogida en 400 o más longitudes de onda diferentes.

La luz puede recogerse en uno o más de los intervalos de longitud de onda de 200 nm-1200 nm. En algunos casos, los métodos incluyen medir la luz de la muestra en intervalo de longitudes de onda, tal como de 200 nm a 1200 nm, tal como de 300 nm a 1100 nm, tal como de 400 nm a 1000 nm, tal como de 500 nm a 900 nm, e incluyendo de 600 nm a 800 nm. En otros casos, los métodos incluyen medir la luz recogida en una o más longitudes de onda específicas. Por ejemplo, la luz recogida puede medirse a uno o más de 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm, y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, los métodos que incluyen medir longitudes de onda de luz que corresponden a la longitud de onda máxima de fluorescencia de determinados fluoróforos.

La luz recogida puede medirse continuamente o en intervalos discretos. En algunos casos, los métodos incluyen tomar mediciones de la luz de forma continua. En otros casos, la luz se mide en intervalos discretos, tal como medir la luz cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Las mediciones de la luz recogida pueden realizarse una o más veces durante los métodos objeto, tal como 2 o más veces, tal como 3 o más veces, tal como 5 o más veces, e incluyendo 10 o más veces. En ciertas realizaciones, la luz de la muestra se mide 2 o más veces, promediando los datos en ciertos casos.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen ajustar adicionalmente la luz de la muestra antes de detectar la luz. Por ejemplo, la luz de la fuente de muestra puede pasar a través de una o más lentes, espejos, estenopos, hendiduras, rejillas, refractores de luz, y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, la luz recogida pasa a través de una o más lentes de enfoque, para reducir el perfil de la luz. En otros casos, la luz emitida desde la muestra pasa a través de uno o más colimadores para reducir la divergencia del haz de luz.

En determinadas realizaciones, los métodos incluyen irradiar la muestra con dos o más haces de luz de frecuencia desplazada. Como se describió anteriormente, se puede emplear un componente generador de haz de luz que tenga un láser y un dispositivo acústico-óptico para desplazar la frecuencia de la luz láser. En estas realizaciones, los métodos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con el láser. Dependiendo de las longitudes de onda de luz deseadas producidas en el haz láser de salida (por ejemplo, para su uso al irradiar una muestra en una corriente de flujo), el láser puede tener una longitud de onda específica que varía de 200 nm a 1500 nm, tal como de 250 nm a 1250 nm, tal como de 300 nm a 1000 nm, tal como de 350 nm a 900 nm e incluyendo de 400 nm a 800 nm. El dispositivo acústico-óptico puede irradiarse con uno o más láseres, tal como 2 o más láseres, tal como 3 o más láseres, tal como 4 o más láseres, tal como 5 o más láseres e incluyendo 10 o más láseres. Los láseres pueden incluir cualquier combinación de tipos de láseres. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con una matriz de láseres, tal como una matriz que tenga uno o más láseres de gas, uno o más láseres de tinte, y uno o más láseres de estado sólido.

Cuando se emplea más de un láser, el dispositivo acústico-óptico puede irradiarse con los láseres de forma simultánea o secuencial, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el dispositivo acústico-óptico puede irradiarse simultáneamente con cada uno de los láseres. En otras realizaciones, el dispositivo acústico-óptico se irradia secuencialmente con cada uno de los láseres. Cuando se emplea más de un láser para irradiar el dispositivo acústico-óptico secuencialmente, el tiempo que cada láser irradia el dispositivo acústico-óptico puede ser independientemente 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, tal como 10 microsegundos o más, tal como 30 microsegundos o más, e incluyendo 60 microsegundos o más. Por ejemplo, los métodos pueden incluir irradiar el dispositivo acústico-óptico con el láser durante una duración que varía de 0,001 microsegundos a 100 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 75 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos, e incluyendo de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En realizaciones donde el dispositivo acústico-óptico se irradia secuencialmente con dos o más láseres, la duración del dispositivo acústico-óptico que irradia por cada láser puede ser igual o diferente.

El período de tiempo entre la irradiación por cada láser también puede variar, según se desee, separado independientemente por un retardo de 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, tal como de 10 microsegundos o más, tal como de 15 microsegundos o más, tal como de 30 microsegundos o más, e incluyendo de

60 microsegundos o más. Por ejemplo, el período de tiempo entre la irradiación por cada fuente de luz puede variar de 0,001 microsegundos a 60 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 35 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos, e incluyendo de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En determinadas realizaciones, el período de tiempo entre la irradiación por cada láser es de 10 microsegundos. En realizaciones donde el dispositivo acústico-óptico se irradia secuencialmente por más de dos (es decir, 3 o más) láseres, el retardo entre la irradiación por cada láser puede ser el mismo o diferente.

El dispositivo acústico-óptico puede irradiarse continuamente o en intervalos discretos. En algunos casos, los métodos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con el láser de forma continua. En otros casos, el dispositivo acústico-óptico se irradia con el láser en intervalos discretos, tal como irradiar cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Dependiendo del láser, el dispositivo acústico-óptico puede irradiarse desde una distancia que varía tal como 0,01 mm

o más, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como

2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más, e incluyendo 50 mm o más. Además, el ángulo o irradiación también puede variar, oscilando de 10° a 90°, tal como de

15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75°, e incluyendo de 30° a 60°, por ejemplo en un ángulo de 90°.

En realizaciones, los métodos incluyen aplicar señales de accionamiento por radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar rayos láser desviados angularmente. Se pueden aplicar dos o más señales de accionamiento por radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar un rayo láser de salida con el número deseado de rayos láser desviados angularmente, tal como 3 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 4 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 5 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 6 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 7 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 8 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 9 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 10 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 15 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 25 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 50 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia e incluyendo 100 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia.

Los rayos láser desviados angularmente producidos por las señales de accionamiento por radiofrecuencia tienen cada uno una intensidad basada en la amplitud de la señal de accionamiento por radiofrecuencia aplicada. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la aplicación de señales de accionamiento por radiofrecuencia que tienen amplitudes suficientes para producir rayos láser desviados angularmente con una intensidad deseada. En algunos casos, cada señal de accionamiento por radiofrecuencia aplicada tiene independientemente una amplitud de aproximadamente 0,001 V a aproximadamente 500 V, tal como de aproximadamente 0,005 V a aproximadamente 400 V, tal como de aproximadamente 0,01 V a aproximadamente 300 V, tal como de aproximadamente 0,05 V. a aproximadamente 200 V, tal como de aproximadamente 0,1 V a aproximadamente 100 V, tal como de aproximadamente 0,5 V a aproximadamente

75 V, tal como de aproximadamente 1 V a 50 V, tal como de aproximadamente 2 V a 40 V, tal como de aproximadamente

3 V a aproximadamente 30 V e incluyendo de aproximadamente 5 V a aproximadamente 25 V. Cada señal de accionamiento por radiofrecuencia aplicada tiene, en algunas realizaciones, una frecuencia de aproximadamente

0,001 MHz a aproximadamente 500 MHz, tal como de aproximadamente 0,005 MHz a aproximadamente 400 MHz, tal como de aproximadamente 0,01 MHz a aproximadamente 300 MHz, tal como de aproximadamente 0,05 MHz a aproximadamente 200 MHz, tal como de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 100 MHz, tal como de aproximadamente 0,5 MHz a aproximadamente 90 MHz, tal como de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente

75 MHz, tal como de aproximadamente 2 MHz a aproximadamente 70 MHz, tal como de aproximadamente 3 MHz a aproximadamente 65 MHz, tal como de aproximadamente 4 MHz a aproximadamente 60 MHz e incluyendo de aproximadamente 5 MHz a aproximadamente 50 MHz.

En estas realizaciones, los rayos láser desviados angularmente en el rayo láser de salida están separados espacialmente. Dependiendo de las señales de accionamiento por radiofrecuencia aplicadas y del perfil de irradiación deseado del rayo láser de salida, los rayos láser desviados angularmente pueden estar separados por 0,001 |μm o más, tal como por 0,005 μm o más, tal como por 0,01 μm o más, tal como por 0,05 μm o más, tal como por 0,1 μm o más, tal como por 0,5 μm o más, tal como por 1 μm o más, tal como por 5 μm o más, tal como por 10 μm o más, tal como por 100 μm o más, tal como por 500 μm o más, tal como por 1000 μm o más e incluyendo por 5000 μm o más. En algunas realizaciones, los rayos láser desviados angularmente se superponen, tal como con un rayo láser adyacente desviado angularmente a lo largo de un eje horizontal del rayo láser de salida. La superposición entre rayos láser adyacentes desviados angularmente (tal como superposición de puntos de rayo) puede ser una superposición de 0,001 μm o más, tal como una superposición de 0,005 μm o más, tal como una superposición de 0,01 μm o más, tal como una superposición de 0,05 μm o más, tal como una superposición de 0,1 μm o más, tal como una superposición de 0,5 μm o más, tal como una superposición de 1 μm o más, tal como una superposición de 5 μm o más, tal como una superposición de 10 μm o más e incluyendo un solapamiento de 100 μm o más.

En ciertos casos, la corriente de flujo se irradia con una pluralidad de haces de luz de frecuencia desplazada y se obtiene una imagen de una célula en la corriente de flujo mediante imágenes de fluorescencia usando emisión etiquetada por radiofrecuencia (FIRE) para generar una imagen codificada en frecuencia, tal como las descritas en Diebold, y col. Nature Photonics Vol. 7(10); 806-810 (2013), así como se describe en las patentes estadounidenses números 9.423.353; 9.784.661 y 10.006.852 y las publicaciones de patentes estadounidenses números 2017/0133857 y 2017/0350803.

En realizaciones, los métodos incluyen generar datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo a partir de la luz detectada. Los datos espaciales del objeto pueden generarse a partir de la absorción de luz detectada, la dispersión de luz detectada, la emisión de luz detectada o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, los datos espaciales del objeto se generan a partir de la absorción de luz detectada de la muestra, tal como a partir de un detector de luz de campo claro. En otros casos, los datos espaciales del objeto se generan a partir de la dispersión de luz detectada de la muestra, tal como a partir de un detector de dispersión lateral, un detector de dispersión frontal o una combinación de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, los datos espaciales del objeto se generan a partir de la luz emitida desde la muestra, como la luz de los fluoróforos añadidos a la muestra. En todavía otros casos, los datos espaciales del objeto se generan a partir de una combinación de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y emisión de luz detectada.

En determinadas realizaciones, los datos espaciales se calculan a partir de datos codificados en frecuencia (por ejemplo, datos de fluorescencia codificados en frecuencia). En la invención, los datos codificados en frecuencia se generan detectando luz de un objeto irradiado con una pluralidad de haces de luz de frecuencia desplazada y un haz de oscilador local. En un ejemplo, una pluralidad de posiciones a través (de un eje horizontal) de la corriente de flujo se irradian mediante un rayo láser que incluye un haz oscilador local y una pluralidad de rayos láser desplazados por radiofrecuencia de modo que diferentes ubicaciones a través de la corriente de flujo son irradiadas por el haz de oscilador local y uno de los haces desplazados por radiofrecuencia. En algunos casos, el oscilador local es un haz de luz de un láser de frecuencia desplazada. En este ejemplo, cada ubicación espacial a través de la partícula en la corriente de flujo estácaracterizada poruna frecuencia de latido diferente que corresponde a la diferencia entre la frecuencia del haz de oscilador local y la frecuencia del haz desplazado por radiofrecuencia en esa ubicación. En la invención, los datos codificados en frecuencia del objeto incluyen frecuencias de latido codificadas espacialmente a través de un eje horizontal de la partícula en la corriente de flujo.

En realizaciones, los datos espaciales se pueden calcular a partir de los datos codificados en frecuencia realizando una transformada de datos codificados en frecuencia. En un ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier (FT) de los datos codificados en frecuencia. En otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier discreta (DFT) de los datos codificados en frecuencia. En aún otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier de corto tiempo (STFT) de los datos codificados en frecuencia. En todavía otro ejemplo, los datos espaciales se calculan con un amplificador de bloqueo digital para heterodinar y demultiplexar los datos codificados en frecuencia.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen generar una imagen de un objeto en la corriente de flujo a partir de la luz detectada. La imagen del objeto puede generarse a partir de la absorción de luz detectada, la dispersión de luz detectada, la emisión de luz detectada o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, la imagen del objeto se genera a partir de la absorción de luz detectada de la muestra, tal como a partir de un detector de luz de campo claro. En estos casos, la imagen del objeto se genera basándose en datos de imagen de campo claro de la célula en la corriente de flujo. En otros casos, la imagen del objeto se genera a partir de la dispersión de luz detectada de la muestra, tal como a partir de un detector de dispersión lateral, un detector de dispersión frontal o una combinación de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En estos casos, la imagen del objeto se genera basándose en datos de imagen de luz dispersa. En aún otros casos, la imagen del objeto se genera a partir de la luz emitida desde la muestra, como la luz de los fluoróforos añadidos a la muestra. En estos casos, la imagen del objeto se genera basándose en datos de imágenes fluorescentes (es decir, datos de imágenes de compuestos fluorescentes sobre o dentro de la célula). En todavía otros casos, la imagen del objeto se genera a partir de una combinación de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y emisión de luz detectada.

Se pueden generar una o más imágenes del objeto a partir de la luz detectada. En algunas realizaciones, se genera una única imagen a partir de cada forma de luz detectada. Por ejemplo, se genera una primera imagen del objeto a partir de la absorción de luz detectada; se genera una segunda imagen del objeto a partir de la dispersión de luz detectada y una tercera imagen del objeto se genera a partir de la emisión de luz detectada. En otras realizaciones, se generan dos o más imágenes a partir de cada forma de luz detectada, tal como 3 o más, tal como 4 o más, tal como 5 o más e incluyendo 10 o más imágenes o una combinación de las mismas.

En determinadas realizaciones, los métodos incluyen generar una máscara de imagen del objeto en la corriente de flujo. En estas realizaciones, la máscara de imagen puede generarse primero a partir de una imagen en escala de grises del objeto en la corriente de flujo. El término “ escala de grises” se utiliza en el presente documento en su sentido convencional para referirse a imágenes del objeto en la corriente de flujo que se componen de tonos de gris variables que se basan en la intensidad de la luz en cada píxel. En realizaciones, se determina un umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises donde el valor umbral de intensidad de píxel se usa para convertir cada píxel en un valor binario que se usa para generar la máscara de imagen del objeto, como se describe con mayor detalle a continuación. En algunas realizaciones, el umbral de intensidad de píxel se determina minimizando la variación intraclase de la imagen en escala de grises y calculando un umbral de intensidad de píxel que se basa en la variación intraclase minimizada. En algunas realizaciones, el umbral de intensidad de píxel se determina con un algoritmo donde los datos de luz detectada incluyen dos clases de píxeles siguiendo un histograma bimodal (que tiene píxeles de primer plano y píxeles de fondo), calculando un umbral óptimo que separa las dos clases de modo que su variación intraclase combinada sea mínima. En otras realizaciones, los métodos incluyen calcular un umbral óptimo que separa las dos clases de modo que su variación intraclase sea máxima.

Al generar la máscara de imagen, cada píxel de la imagen en escala de grises del objeto se compara con el valor umbral de intensidad determinado y se convierte en un valor de píxel binario. Cada píxel en la imagen en escala de grises del objeto se puede comparar con el valor umbral de intensidad determinado en cualquier orden que se desee. En algunas realizaciones, los píxeles a lo largo de cada fila horizontal en la imagen en escala de grises del objeto se comparan con el valor umbral de intensidad determinado. En algunos casos, cada píxel se compara con el valor umbral de intensidad determinado desde el lado izquierdo de la imagen en escala de grises del objeto hasta el lado derecho de la imagen en escala de grises del objeto. En otros casos, cada píxel se compara con el valor umbral de intensidad determinado desde el lado derecho de la imagen en escala de grises del objeto hasta el lado izquierdo de la imagen en escala de grises del objeto. En otras realizaciones, los píxeles a lo largo de cada columna vertical en la imagen en escala de grises del objeto se comparan con el valor umbral de intensidad determinado. En algunos casos, cada píxel se compara con el valor umbral de intensidad determinado desde la parte superior de la imagen en escala de grises del objeto hasta la parte inferior de la imagen en escala de grises del objeto a lo largo de cada columna vertical. En otros casos, cada píxel se compara con el valor umbral de intensidad determinado desde la parte inferior de la imagen en escala de grises del objeto hasta la parte superior de la imagen en escala de grises del objeto a lo largo de cada columna vertical.

Dependiendo del tamaño del objeto en la corriente de flujo del que se está obteniendo una imagen y de la óptica utilizada para recoger la luz de la muestra (descrita con mayor detalle a continuación), todos o parte de los píxeles en la imagen en escala de grises del objeto se pueden comparar con el valor umbral de intensidad. Por ejemplo, al practicar los métodos objeto, el 50 % o más de los píxeles en la imagen en escala de grises del objeto se pueden comparar con el valor umbral de intensidad, tal como el 60 % o más, tal como el 70 % o más, tal como el 80 % o más, tal como el 90 % o más, tal como el 95 % o más, tal como el 97 % o más e incluyendo el 99 % o más de los píxeles en la imagen en escala de grises del objeto. En determinadas realizaciones, todos (100 % de) los píxeles de la imagen en escala de grises del objeto se comparan con el valor umbral de intensidad.

Como se resumió anteriormente, cada píxel de la imagen en escala de grises del objeto se convierte en un valor de píxel binario. Dependiendo del tipo de luz detectada, a cada píxel se le asigna un valor de píxel binario de 1 o un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, los métodos incluyen detectar la absorción de luz (por ejemplo, datos de imágenes de campo claro) de la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises del objeto cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel de la imagen en escala de grises del objeto es mayor que el valor umbral de intensidad. En otro ejemplo, los métodos incluyen detectar la dispersión de luz del objeto en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad. En aún otro ejemplo, los métodos incluyen detectar la fluorescencia del objeto en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises del objeto cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor del umbral de intensidad.

Cuando se asigna un valor de píxel binario a cada píxel en la imagen en escala de grises del objeto a través de una fila horizontal, en algunas realizaciones los métodos incluyen además determinar el primer píxel a través de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 1 y determinar el último píxel en la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 1. En un ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel del lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel del lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otro ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel del lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel del lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otras realizaciones, los métodos incluyen además determinar el primer píxel a través de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 0 y determinar el último píxel en la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel del lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel del lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0. En otro ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel del lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel del lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0.

Cuando se asigna un valor de píxel binario a cada píxel en la imagen en escala de grises del objeto a lo largo de una columna vertical, en algunas realizaciones los métodos incluyen además determinar el primer píxel a lo largo de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 1 y determinar el último píxel a lo largo de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 1. En un ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otro ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otras realizaciones, los métodos incluyen además determinar el primer píxel a lo largo de una columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 0 y determinar el último píxel en la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0. En otro ejemplo, los métodos incluyen determinar el primer píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen evaluar una o más características del objeto basándose en los datos espaciales. Por ejemplo, los métodos pueden incluir determinar el tamaño del objeto, el centro de masa del objeto, la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o eje vertical o una combinación de los mismos basándose en los datos espaciales. En algunos casos, los métodos incluyen evaluar uno o más del tamaño, centro de masa y excentricidad basándose en los datos espaciales del objeto y determinar si el objeto es un agregado de células. En ciertos casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y centro de masa del objeto. En otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y la excentricidad determinados del objeto. En aún otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En todavía otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño, centro de masa y la excentricidad determinados del objeto.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen evaluar una o más características del objeto basándose en la imagen generada. Por ejemplo, los métodos pueden incluir determinar el tamaño del objeto, el centro de masa del objeto, la excentricidad del objeto a lo largo de un eje horizontal o eje vertical o una combinación de los mismos basándose en la imagen generada. En algunos casos, los métodos incluyen evaluar uno o más del tamaño, centro de masa y excentricidad basándose en la imagen generada del objeto y determinar si el objeto es un agregado de células. En ciertos casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y centro de masa del objeto. En otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño y la excentricidad determinados del objeto. En aún otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En todavía otros casos, se determina que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño, centro de masa y la excentricidad determinados del objeto.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen además calcular un momento de imagen del objeto. El término “ momento de imagen” se utiliza en el presente documento en su sentido convencional para referirse a un promedio ponderado de los datos espaciales o intensidades de píxel en una imagen (por ejemplo, imagen generada o máscara de imagen generada). Como se describe a continuación, el momento de imagen determinado se puede utilizar para calcular la intensidad total de los píxeles del objeto, el área total ocupada por el objeto, el centroide (es decir, el centro geométrico) del objeto así como la orientación del objeto (por ejemplo, en la imagen o máscara de imagen). En algunas realizaciones, el momento de imagen se calcula según:

donde m es el momento de imagen calculado a lo largo del eje x; y n es el momento de imagen calculado a lo largo del eje y. En algunos casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje horizontal. En aún otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de primer orden del objeto a lo largo de un eje vertical. En todavía otros casos, los métodos incluyen calcular un momento de imagen de segundo orden del objeto a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, una o más propiedades del objeto se determinan basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. Por ejemplo, los métodos pueden incluir determinar el tamaño de la célula, el centro de masa de la célula o la excentricidad de la célula basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. En estas realizaciones, los métodos incluyen calcular uno o más momentos de imagen y luego determinar la característica de la célula usando tanto el momento de imagen calculado como los datos espaciales.

En algunas realizaciones, una o más propiedades del objeto se determinan basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada. Por ejemplo, los métodos pueden incluir determinar el tamaño de la célula, el centro de masa de la célula o la excentricidad de la célula basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada del objeto (por ejemplo, imagen o máscara de imagen). En estas realizaciones, los métodos incluyen calcular uno o más momentos de imagen y luego determinar la característica de la célula usando tanto el momento de imagen calculado como la imagen del objeto.

En algunos casos, el centro de masa puede calcularse a partir del momento de imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, el centro de masa del objeto puede determinarse a partir del momento de imagen calculado y de la imagen generada según:

Centro de masa =

En otros casos, la orientación del objeto puede calcularse a partir del momento de la imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, la orientación del objeto puede determinarse a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

En todavía otros casos, la excentricidad del objeto puede calcularse a partir del momento de imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, la excentricidad del objeto puede determinarse a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

En algunas realizaciones, los métodos incluyen evaluar uno o más de: 1) el tamaño calculado del objeto; 2) el centro de masa del objeto; y 3) la excentricidad del objeto e identificar si el objeto es un agregado de partículas (por ejemplo, un agregado de células) o una sola partícula (por ejemplo, una célula individual). En algunos casos, se determina que el objeto es un agregado basándose en el tamaño calculado del objeto. En un ejemplo, el tamaño calculado del objeto se compara con un tamaño predeterminado para las células de interés para clasificar el objeto como una partícula única (por ejemplo, una célula individual) o un agregado. En este ejemplo, el tamaño predeterminado se puede determinar usando una muestra de calibración estándar o datos de tamaño de referencia. En otro ejemplo, el tamaño calculado del objeto se compara con un valor umbral de modo que cuando se determina que el objeto tiene un tamaño mayor que el valor umbral, el objeto se clasifica como un agregado.

En otros casos, se determina que el objeto es un agregado basándose en el centro de masa calculado del objeto. En un ejemplo, el centro de masa calculado del objeto se compara con un centro de masa predeterminado para que las células de interés clasifiquen el objeto como una sola partícula (por ejemplo, una célula individual) o un agregado. En este ejemplo, el centro de masa predeterminado se puede determinar usando una muestra de calibración estándar o datos del centro de masa de referencia de las células de interés.

En aún otros casos, se determina que el objeto es un agregado basándose en la excentricidad calculada del objeto. En un ejemplo, la excentricidad calculada del objeto se compara con una excentricidad predeterminada para que las células de interés clasifiquen el objeto como una sola partícula (por ejemplo, una célula individual) o un agregado. En este ejemplo, la excentricidad predeterminada se puede determinar usando una muestra de calibración estándar o datos de excentricidad de referencia de las células de interés.

En ciertos casos, el objeto se identifica como un agregado basándose en el tamaño y centro de masa determinados del objeto. En otros casos, el objeto se identifica como un agregado basándose en el tamaño y la excentricidad determinados del objeto. En aún otros casos, el objeto se identifica como un agregado basándose en el centro de masa y la excentricidad determinados del objeto. En todavía otros casos, se identifica que el objeto es un agregado de células basándose en el tamaño, centro de masa y la excentricidad determinados del objeto.

Para determinar si el objeto es un agregado (por ejemplo, un agregado de células), en ciertos casos, los métodos incluyen: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y los datos espaciales; y 2) evaluar una señal de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En estas realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser una salida del detector de dispersión de luz frontal o una salida del detector de dispersión de luz lateral o una combinación de las mismas. En realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser un ancho del pulso de señal, una altura del pulso de señal y un área del pulso de señal o una combinación de los mismos. En un ejemplo, los métodos incluyen evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales y evaluar el ancho del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo, los métodos incluyen evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales y evaluar la altura del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En aún otro ejemplo, los métodos incluyen evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales y evaluar el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz.

En ciertos casos, los métodos incluyen: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada; y 2) evaluar una señal de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En estas realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser una salida del detector de dispersión de luz frontal o una salida del detector de dispersión de luz lateral o una combinación de las mismas. En realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser un ancho del pulso de señal, una altura del pulso de señal y un área del pulso de señal o una combinación de los mismos. En un ejemplo, los métodos incluyen evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar el ancho del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo, los métodos incluyen evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar la altura del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En aún otro ejemplo, los métodos incluyen evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz.

En determinadas realizaciones, los métodos incluyen: 1) evaluar cada uno del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz, seguido de 2) evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. En estas realizaciones, las señales de salida del detector de dispersión de luz se pueden recoger desde uno o más de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas en los métodos objeto según estas realizaciones se recogen desde un detector de dispersión lateral. En otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas en los métodos objeto se recogen desde un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas en los métodos objeto se recogen tanto de un detector de dispersión lateral como de un detector de dispersión frontal.

En determinadas realizaciones, los métodos incluyen: 1) evaluar cada uno del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz, seguido de 2) evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada. En estas realizaciones, las señales de salida del detector de dispersión de luz se pueden recoger desde uno o más de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas en los métodos objeto según estas realizaciones se recogen desde un detector de dispersión lateral. En otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas en los métodos objeto se recogen desde un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas en los métodos objeto se recogen tanto de un detector de dispersión lateral como de un detector de dispersión frontal.

En algunos casos, los métodos incluyen determinar que el objeto es un agregado de células horizontal donde dos o más células están alineadas entre sí a través de un eje horizontal de la corriente de flujo, tal como 3 o más células, tal como 4 o más células e incluyendo 5 o más células. En otros casos, los métodos incluyen determinar que el objeto es un agregado de células vertical donde dos o más células están alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, eje longitudinal) de la corriente de flujo, tal como 3 o más células, tal como 4 o más células e incluyendo 5 o más células. En aún otros casos, los métodos incluyen determinar que el objeto es un agregado de células combinado que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal y que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.

Las Figuras 1A y 1B representan imágenes de agregados de células de imagen obtenida según determinadas realizaciones. La Figura 1A representa un agregado de células orientado verticalmente que tiene dos células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, a lo largo del eje longitudinal de la corriente de flujo). En algunas realizaciones, el objeto en la Figura 1A se puede identificar como un agregado de células alineado verticalmente basándose en un momento de imagen de segundo orden calculado a lo largo del eje y. La Figura 1B representa un agregado de células orientado horizontalmente que tiene dos células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal (es decir, ortogonal al eje longitudinal de la corriente de flujo). En algunas realizaciones, el objeto en la Figura 1B se puede identificar como un agregado de células alineado horizontalmente basándose en un momento de imagen de segundo orden calculado a lo largo del eje x.

Las Figuras 2A y 2B representan el uso de imágenes y la excentricidad calculada para discriminar entre una célula individual y un agregado de células según ciertas realizaciones. La Figura 2A representa una célula individual y la Figura 2B representa un agregado de 4 células. Basándose en las señales de salida del detector de dispersión de luz, la célula individual en la Figura 2A y el agregado de células en la Figura 2B exhiben parámetros de señal de salida similares (por ejemplo, ancho del pulso, altura del pulso y área del pulso de señal de salida). Al generar las imágenes representadas en las Figuras 2A y 2B y calcular la excentricidad, el objeto en la Figura 2A puede identificarse correctamente como una célula individual según los métodos objeto y el objeto en la Figura 2B puede identificarse correctamente como un agregado de células.

La Figura 3 representa un diagrama de flujo para obtener imágenes y caracterizar un objeto en una corriente de flujo según ciertas realizaciones. En el paso 301, se detecta luz (absorción de luz, luz dispersada o emisión) de un objeto en la corriente de flujo. En el paso 302, se generan datos espaciales del objeto. En el paso 303, se genera una imagen (por ejemplo, una imagen en escala de grises) del objeto. En el paso 304, se determina un umbral de intensidad de píxel basándose en los píxeles de la imagen. En ciertas realizaciones, en el paso 305, cada píxel de la imagen se convierte en un valor de píxel binario comparando la intensidad de cada píxel con el umbral de intensidad de píxel determinado. Luego se genera una máscara de imagen usando los valores de píxeles binarios en el paso 306. Una o más propiedades del objeto de imagen obtenida se determinan a partir de los datos espaciales, la imagen generada (o máscara de imagen) en el paso 307. Basándose en las propiedades determinadas, el objeto se identifica como un agregado (por ejemplo, un agregado de células) o una sola partícula (por ejemplo, una célula individual) en el paso 308. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz (ancho del pulso, altura del pulso y área del pulso) se evalúan (paso 309) y también se usan para identificar el objeto.

Como se resumió anteriormente, los métodos de la presente descripción también incluyen clasificar el objeto basándose en los datos espaciales, la imagen generada, la máscara de imagen generada, un momento de imagen calculado, una o más propiedades determinadas del objeto (por ejemplo, tamaño, centro de masa, excentricidad) o una combinación de los mismos. El término “ clasificación” se usa en el presente documento en su sentido convencional para referirse a separar componentes (por ejemplo, gotitas que contienen células, gotitas que contienen partículas no celulares tales como macromoléculas biológicas) de una muestra y, en algunos casos, entregar los componentes separados a uno o más recipientes de recogida de muestras. Por ejemplo, los métodos pueden incluir clasificar 2 o más componentes de la muestra, tal como 3 o más componentes, tal como 4 o más componentes, tal como 5 o más componentes, tal como 10 o más componentes, tal como 15 o más componentes e incluyendo la clasificación de 25 o más componentes de la muestra. En algunas realizaciones, el objeto se identifica como una célula individual y se clasifica en una primera ubicación de recogida de componentes de muestra. En otras realizaciones, el objeto se identifica como un agregado de células y se clasifica en una segunda ubicación de recogida de componentes de muestra. En algunos casos, la primera ubicación de recogida de componentes de muestra incluye un recipiente de recogida de muestras y la segunda ubicación de recogida de componentes de muestra incluye un recipiente de recogida de residuos.

Para clasificar el objeto de la muestra en la corriente de flujo, los métodos incluyen adquisición, análisis y registro de datos, tal como con una computadora, donde múltiples canales de datos registran datos de cada detector utilizado para generar la imagen o máscara de imagen del objeto (por ejemplo, detectores de dispersión, fotodetectores de campo claro o detectores de fluorescencia). En estas realizaciones, el análisis incluye clasificar y contar partículas de modo que cada partícula esté presente como un conjunto de valores de parámetros digitalizados. Los sistemas objeto (descritos a continuación) se pueden configurar para que se activen en un parámetro seleccionado con el fin de distinguir las partículas de interés del fondo y el ruido.

Después, una subpoblación de interés particular (por ejemplo, células individuales) puede analizarse adicionalmente mediante “ activación” basándose en los datos recogidos para toda la población. Para seleccionar una activación adecuada, los datos se representan gráficamente para obtener la mejor separación de subpoblaciones posible. Este procedimiento se puede realizar representando gráficamente el momento de imagen o una o más de las propiedades determinadas (por ejemplo, tamaño, centro de masa, excentricidad). En otras realizaciones, los métodos incluyen representar gráficamente la dispersión de luz frontal (FSC) frente a la dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC) en un diagrama de puntos bidimensional. En aún otras realizaciones, los métodos incluyen representar gráficamente una o más de las propiedades determinadas (por ejemplo, tamaño, centro de masa, excentricidad) frente a una o más de dispersión de luz frontal (FSC) y dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC). En todavía otras realizaciones, los métodos incluyen activar la población de partículas para la dispersión de luz frontal (FSC) y la dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC), seguido de activar basándose en una o más de las propiedades determinadas (por ejemplo, tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en la imagen del objeto. En todavía otras realizaciones, los métodos incluyen activar la población de partículas basándose en una o más de las propiedades determinadas (por ejemplo, tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en la imagen del objeto, seguido de activar la población de partículas para la dispersión de luz frontal (FSC) y dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC). En aún otras realizaciones, los métodos incluyen evaluar las señales de salida de dispersión de luz frontal (FSC) y dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC) y una o más de las propiedades determinadas (por ejemplo, tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en la imagen del objeto y clasificar el objeto como una sola partícula (por ejemplo, una célula individual) o un agregado (por ejemplo, un agregado de células), seguido de activar basándose en la clasificación del objeto.

Entonces se selecciona una subpoblación de objetos (es decir, aquellas células individuales dentro de la puerta) y se excluyen las partículas que no están dentro de la puerta. Cuando lo desee, se puede seleccionar la puerta dibujando una línea alrededor de la subpoblación deseada usando un cursor en la pantalla de un ordenador. Solo aquellas partículas dentro de la puerta se analizan más a fondo trazando los otros parámetros para estas partículas, como la fluorescencia. Cuando se desee, el análisis anterior puede configurarse para producir recuentos de las partículas de interés en la muestra.

En algunas realizaciones, los métodos para clasificar componentes de una muestra incluyen clasificar partículas (por ejemplo, células en una muestra biológica) con un módulo de clasificación de partículas que tiene placas deflectoras, como se describe en la publicación de patente estadounidense n.° 2017/0299493, presentada el 28 de marzo de 2017. En determinadas realizaciones, las células de la muestra se clasifican utilizando un módulo de decisión de clasificación que tiene una pluralidad de unidades de decisión de clasificación, como las descritas en la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/803.264, presentada el 8 de febrero de 2019.

Sistemas para caracterizar partículas en una muestra

Como se resumió anteriormente, los aspectos de la presente descripción incluyen un sistema para caracterizar partículas de una muestra (por ejemplo, células en una muestra biológica). Los sistemas según ciertas realizaciones incluyen una fuente de luz configurada para irradiar una muestra que tiene células en una corriente de flujo, un sistema de detección de luz que tiene un fotodetector y un procesador que tiene una memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en la misma, que cuando el procesador las ejecuta hacen que el procesador genere datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación y determine si el objeto en la corriente de flujo es un agregado de células basándose en los datos espaciales.

Los sistemas de interés incluyen una fuente de luz configurada para irradiar una muestra en una corriente de flujo. En realizaciones, la fuente de luz puede ser cualquier fuente de luz de banda ancha o de banda estrecha adecuada. Dependiendo de los componentes en la muestra (por ejemplo, células, perlas, partículas no celulares, etc.), la fuente de luz puede configurarse para emitir longitudes de onda de luz que varía, oscilando de 200 nm a 1500 nm, tal como de 250 nm a 1250 nm, tal como de 300 nm a 1000 nm, tal como de 350 nm a 900 nm, e incluyendo de 400 nm a 800 nm. Por ejemplo, la fuente de luz puede incluir una fuente de luz de banda ancha que emite luz con longitudes de onda de 200 nm a 900 nm. En otros casos, la fuente de luz incluye una fuente de luz de banda estrecha que emite una longitud de onda que oscila de 200 nm a 900 nm. Por ejemplo, la fuente de luz puede ser un LED de banda estrecha (1 nm - 25 nm) que emite luz que tiene una longitud de onda que oscila entre 200 nm y 900 nm.

En algunas realizaciones, la fuente de luz es un láser. Los láseres de interés pueden incluir láseres pulsados o láseres de onda continua. Por ejemplo, el láser puede ser un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, un láser de argón, un láser kriptón, un láser de xenón, un láser de nitrógeno, un láser de CO2, un láser de CO, un láser excímero de argón-flúor (ArF), un láser excímero de kryptón-flúor (KrF), un láser excímero de cloro de xenón (XeCI), o un láser excímero de xenón (XeF), o una combinación de los mismos; un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina; un láser de metal-vapor, tal como un láser de helio-cadmio (HeCd), un láser de helio-mercurio (HeHg), un láser de helio-selenio (HeSe), un láser de helio-plata (HeAg), un láser de estroncio, un láser de neón-cobre (NeCu), un láser de cobre o un láser de oro, y combinaciones de los mismos; un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, un láser NdCrYAG, un láser Er:YAG, un láser Nd:YLF, un láser Nd:YVO4, un láser Nd:YCa4O(BO3)3, un láser Nd:YCOB, un láser de zafiro de titanio, un láser de tulio YAG, un láser de iterbio YAG, un láser de iterbio2O3, o láseres dopados con cerio, y combinaciones de los mismos; un láser de diodo semiconductor, un láser semiconductor bombeado ópticamente (OPSL), o una implementación de frecuencia duplicada o frecuencia triplicada de cualquiera de los láseres mencionados anteriormente.

En otras realizaciones, la fuente de luz es una fuente de luz no láser, tal como una lámpara, que incluye, entre otras, una lámpara halógena, una lámpara de arco de deuterio, una lámpara de arco de xenón, un diodo emisor de luz, tal como un LED de banda ancha con espectro continuo, diodo emisor superluminiscente, diodo emisor de luz semiconductor, fuente de luz blanca LED de amplio espectro, multi-LED integrado. En algunos casos, la fuente de luz no láser es una fuente de luz de banda ancha estabilizada acoplada a fibra, una fuente de luz blanca, entre otras fuentes de luz o cualquier combinación de las mismas.

En ciertas realizaciones, la fuente de luz es un generador de haces de luz que está configurado para generar dos o más haces de luz de frecuencia desplazada. En algunos casos, el generador de haces de luz incluye un láser, un generador de radiofrecuencia configurado para aplicar señales de accionamiento por radiofrecuencia a un dispositivo acústico-óptico para generar dos o más rayos láser desviados angularmente. En estas realizaciones, el láser puede ser un láser pulsado o un láser de onda continua. Por ejemplo, los láseres en generadores de haces de luz de interés pueden ser un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, un láser de argón, un láser de kriptón, un láser de xenón, un láser de nitrógeno, un láser de CO2, un láser de CO, un láser excímero de argón-flúor (ArF), un láser excímero de kriptón-flúor (KrF), un láser excímero de xenón-cloro (XeCI), o un láser excímero de xenón-flúor (XeF), o una combinación de los mismos; un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina; un láser de metal-vapor, tal como un láser de heliocadmio (HeCd), un láser de helio-mercurio (HeHg), un láser de helio-selenio (HeSe), un láser de helio-plata (HeAg), un láser de estroncio, un láser de neón-cobre (NeCu), un láser de cobre o un láser de oro, y combinaciones de los mismos; un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, un láser NdCrYAG, un láser Er:YAG, un láser Nd:YLF, un láser Nd:YVO4, un láser Nd:YCa4O(BO3)3, un láser Nd:YCOB, un láser de zafiro de titanio, un láser de tulio YAG, un láser de iterbio YAG, un láser de iterbio2O3, o láseres dopados con cerio, y combinaciones de los mismos.

El dispositivo acústico-óptico puede ser cualquier protocolo acústico-óptico conveniente configurado para cambiar la frecuencia de la luz láser usando ondas acústicas aplicadas. En determinadas realizaciones, el dispositivo acústicoóptico es un deflector acústico-óptico. El dispositivo acústico-óptico en el sistema objeto está configurado para generar rayos láser desviados angularmente a partir de la luz del láser y las señales de accionamiento por radiofrecuencia aplicadas. Las señales de accionamiento por radiofrecuencia se pueden aplicar al dispositivo acústico-óptico con cualquier fuente de señal de accionamiento por radiofrecuencia adecuada, tal como un sintetizador digital directo (DDS), un generador de formas de onda arbitrarias (AWG) o un generador de pulsos eléctricos.

En realizaciones, un controlador está configurado para aplicar señales de accionamiento por radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para producir el número deseado de rayos láser desviados angularmente en el rayo láser de salida, tal como que está configurado para aplicar 3 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 4 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 5 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 6 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 7 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 8 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 9 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 10 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 15 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 25 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia, tal como 50 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia e incluyendo que está configurado para aplicar 100 o más señales de accionamiento por radiofrecuencia.

En algunos casos, para producir un perfil de intensidad de los rayos láser desviados angularmente en el rayo láser de salida, el controlador está configurado para aplicar señales de accionamiento por radiofrecuencia que tienen una amplitud que varía tal como de aproximadamente 0,001 V a aproximadamente 500 V, tal como de aproximadamente 0,005 V a aproximadamente 400 V, tal como de aproximadamente 0,01 V a aproximadamente 300 V, tal como de aproximadamente 0,05 V. a aproximadamente 200 V, tal como de aproximadamente 0,1 V a aproximadamente 100 V, tal como de aproximadamente 0,5 V a aproximadamente 75 V, tal como de aproximadamente 1 V a 50 V, tal como de aproximadamente 2 V a 40 V, tal como de aproximadamente 3 V a aproximadamente 30 V e incluyendo de aproximadamente 5 V a aproximadamente 25 V. Cada señal de accionamiento por radiofrecuencia aplicada tiene, en algunas realizaciones, una frecuencia de aproximadamente 0,001 MHz a aproximadamente 500 MHz, tal como de aproximadamente 0,005 MHz a aproximadamente 400 MHz, tal como de aproximadamente 0,01 MHz a aproximadamente 300 MHz, tal como de aproximadamente 0,05 MHz a aproximadamente 200 MHz, tal como de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 100 MHz, tal como de aproximadamente 0,5 MHz a aproximadamente 90 MHz, tal como de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 75 MHz, tal como de aproximadamente 2 MHz a aproximadamente 70 MHz, tal como de aproximadamente 3 MHz a aproximadamente 65 MHz, tal como de aproximadamente 4 MHz a aproximadamente 60 MHz e incluyendo de aproximadamente 5 MHz a aproximadamente 50 MHz.

En ciertas realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un rayo láser de salida con rayos láser desviados angularmente que tienen un perfil de intensidad deseado. Por ejemplo, la memoria puede incluir instrucciones para producir dos o más rayos láser desviados angularmente con las mismas intensidades, tales como 3 o más, tales como 4 o más, tales como 5 o más, tales como 10 o más, tales como 25 o más, tal como 50 o más e incluyendo que la memoria puede incluir instrucciones para producir 100 o más rayos láser desviados angularmente con las mismas intensidades. En otras realizaciones, puede incluir instrucciones para producir dos o más rayos láser desviados angularmente con diferentes intensidades, tal como 3 o más, tal como 4 o más, tal como 5 o más, tal como 10 o más, tal como 25 o más, tal como 50 o más e incluyendo la memoria que puede incluir instrucciones para producir 100 o más rayos láser desviados angularmente con diferentes intensidades.

En ciertas realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un rayo láser de salida que tiene una intensidad creciente desde los bordes hasta el centro del rayo láser de salida a lo largo del eje horizontal. En estos casos, la intensidad del rayo láser desviado angularmente en el centro del haz de salida puede oscilar entre el 0,1 % y aproximadamente el 99 % de la intensidad de los rayos láser desviados angularmente en el borde del rayo láser de salida a lo largo del eje horizontal, tal como de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 95 %, tal como de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 90 %, tal como de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 85 %, tal como de aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 80 %, tal como de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 75 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, tal como de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 65 %, tal como de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 60 %, tal como de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 55 % e incluyendo de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 % de la intensidad de los rayos láser desviados angularmente en el borde del rayo láser de salida a lo largo del eje horizontal. En otras realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un rayo láser de salida que tiene una intensidad creciente desde los bordes hasta el centro del rayo láser de salida a lo largo del eje horizontal. En estos casos, la intensidad del rayo láser desviado angularmente en los bordes del haz de salida puede oscilar entre el 0,1%y aproximadamente el 99%de la intensidad de los rayos láser desviados angularmente en el centro del rayo láser de salida a lo largo del eje horizontal, tal como de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 95 %, tal como de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 90 %, tal como de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 85 %, tal como de aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 80 %, tal como de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 75 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, tal como de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 65 %, tal como de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 60 %, tal como de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 55 % e incluyendo de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 % de la intensidad de los rayos láser desviados angularmente en el centro del rayo láser de salida a lo largo del eje horizontal. En aún otras realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un rayo láser de salida que tiene un perfil de intensidad con una distribución gaussiana a lo largo del eje horizontal. En todavía otras realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada operativamente al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en ella que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un rayo láser de salida que tiene un perfil de intensidad de sombrero de copa a lo largo del eje horizontal.

En realizaciones, los generadores de haz de luz de interés pueden configurarse para producir rayos láser desviados angularmente en el rayo láser de salida que están separados espacialmente. Dependiendo de las señales de accionamiento por radiofrecuencia aplicadas y del perfil de irradiación deseado del rayo láser de salida, los rayos láser desviados angularmente pueden estar separados por 0,001 pm o más, tal como por 0,005 pm o más, tal como por 0,01 pm o más, tal como por 0,05 pm o más, tal como por 0,1 pm o más, tal como por 0,5 pm o más, tal como por 1 pm o más, tal como por 5 pm o más, tal como por 10 pm o más, tal como por 100 pm o más, tal como por 500 pm o más, tal como por 1000 pm o más e incluyendo por 5000 pm o más. En algunas realizaciones, los sistemas están configurados para producir rayos láser desviados angularmente en el rayo láser de salida que se superponen, tal como con un haz láser adyacente desviado angularmente a lo largo de un eje horizontal del haz láser de salida. La superposición entre rayos láser adyacentes desviados angularmente (tal como superposición de puntos de rayo) puede ser una superposición de 0,001 pm o más, tal como una superposición de 0,005 pm o más, tal como una superposición de 0,01 pm o más, tal como una superposición de 0,05 pm o más, tal como una superposición de 0,1 pm o más, tal como una superposición de 0,5 pm o más, tal como una superposición de 1 pm o más, tal como una superposición de 5 pm o más, tal como una superposición de 10 pm o más e incluyendo un solapamiento de 100 pm o más.

En ciertos casos, los generadores de haces de luz configurados para generar dos o más haces de luz de frecuencia desplazada incluyen módulos de excitación por láser como se describe en las patentes estadounidenses números 9.423.353; 9.784.661 y 10.006.852 y las publicaciones de patentes estadounidenses números 2017/0133857 y 2017/0350803.

En realizaciones, los sistemas incluyen un sistema de detección de luz que tiene uno o más fotodetectores para detectar y medir la luz de la muestra. Los fotodetectores de interés pueden configurarse para medir la absorción de luz (por ejemplo, para datos de luz de campo claro), la dispersión de luz (por ejemplo, datos de luz de dispersión frontal o lateral), la emisión de luz (por ejemplo, datos de luz de fluorescencia) de la muestra o una combinación de las mismas. Los fotodetectores de interés pueden incluir, pero sin limitarse a, sensores ópticos, tales como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodos de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores o fotodiodos de puntos cuánticos, y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En determinadas realizaciones, la luz de una muestra se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada de semiconductores (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen complementarios de semiconductores de óxido metálico (CMOS), o sensores de imagen de semiconductores de óxido metálico de tipo N (NMOS).

En algunas realizaciones, los sistemas de detección de luz de interés incluyen una pluralidad de fotodetectores. En algunos casos, el sistema de detección de luz incluye una pluralidad de detectores de estado sólido tal como fotodiodos. En ciertos casos, el sistema de detección de luz incluye una matriz de fotodetectores, tal como una matriz de fotodiodos. En estas realizaciones, la matriz de fotodetectores puede incluir 4 o más fotodetectores, tal como 10 o más fotodetectores, tal como 25 o más fotodetectores, tal como 50 o más fotodetectores, tal como 100 o más fotodetectores, tal como 250 o más fotodetectores, tal como 500 o más fotodetectores, tal como 750 o más fotodetectores e incluyendo 1000 o más fotodetectores. Por ejemplo, el detector puede ser una matriz de fotodiodos que tiene 4 o más fotodiodos, tal como 10 o más fotodiodos, tal como 25 o más fotodiodos, tal como 50 o más fotodiodos, tal como 100 o más fotodiodos, tal como 250 o más fotodiodos, tal como 500 o más fotodiodos, tal como 750 o más fotodiodos e incluyendo 1000 o más fotodiodos.

Los fotodetectores pueden disponerse en cualquier configuración geométrica según se desee, donde las disposiciones de interés incluyen, entre otras, una configuración cuadrada, una configuración rectangular, una configuración trapezoidal, una configuración triangular, una configuración hexagonal, una configuración heptagonal, una configuración octogonal, una configuración nonagonal y una configuración decagonal, una configuración dodecagonal, una configuración circular, una configuración ovalada y configuraciones con dibujos irregulares. Los fotodetectores en la matriz de fotodetectores pueden estar orientados con respecto al otro (como se hace referencia en un plano X-Z) en un ángulo que oscila de 10° a 180°, tal como de 15° a 170°, tal como de 20° a 160°, tal como de 25° a 150°, tal como de 30° a 120° e incluyendo de 45° a 90°. La matriz de fotodetectores puede tener cualquier forma adecuada y puede tener una forma rectilínea, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapecios, triángulos, hexágonos, etc., formas curvilíneas, por ejemplo, círculos, óvalos, así como formas irregulares, por ejemplo, una porción de base parabólica acoplada a una porción superior plana. En determinadas realizaciones, la matriz de fotodetectores tiene una superficie activa de forma rectangular.

Cada fotodetector (por ejemplo, fotodiodo) en la matriz puede tener una superficie activa con un ancho que oscila de 5 |μm a 250 pm, tal como de 10 pm a 225 pm, tal como de 15 pm a 200 pm, tal como de 20 pm a 175 pm, tal como de 25 pm a 150 pm, tal como de 30 pm a 125 pm e incluyendo de 50 pm a 100 pm y una longitud que oscila de 5 pm a 250 pm, tal como de 10 pm a 225 pm, tal como de 15 pm a 200 pm, tal como de 20 pm a 175 pm, tal como de 25 pm a 150 pm, tal como de 30 pm a 125 pm e incluyendo de 50 pm a 100 pm, donde el área de superficie de cada fotodetector (p. ej., fotodiodo) en la matriz oscila de 25 pm2 a 10000 pm2, tal como de 50 pm2 a 9000 pm2, tal como de 75 pm2 a 8000 pm2, tal como de 100 pm2 a 7000 pm2, tal como de 150 pm2 a 6000 pm2 e incluyendo de 200 pm2 a 5000 pm2.

El tamaño de la matriz de fotodetectores puede variar dependiendo de la cantidad e intensidad de la luz, el número de fotodetectores y la sensibilidad deseada y puede tener una longitud que oscila de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluyendo de 5 mm a 25 mm. El ancho de la matriz de fotodetectores también puede variar, oscilando de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluyendo de 5 mm a 25 mm. Como tal, la superficie activa de la matriz de fotodetectores puede oscilar de 0,1 mm2 a 10000 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 5000 mm2, tal como de 1 mm2 a 1000 mm2, tal como de 5 mm2 a 500 mm2, e incluso de 10 mm2 a 100 mm2.

Los fotodetectores de interés están configurados para medir la luz recogida en una o más longitudes de onda, tal como en 2 o más longitudes de onda, tal como en 5 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 10 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 25 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 50 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 100 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 200 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 300 o más longitudes de onda diferentes, e incluyendo medir la luz emitida por una muestra en la corriente de flujo en 400 o más longitudes de onda diferentes.

En algunas realizaciones, los fotodetectores están configurados para medir la luz recogida en un intervalo de longitudes de onda (por ejemplo, 200 nm - 1000 nm). En determinadas realizaciones, los fotodetectores de interés se configuran para recoger espectros de luz en un intervalo de longitudes de onda. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir uno o más detectores configurados para recoger espectros de luz en uno o más de los intervalos de longitud de onda de 200 nm-1000 nm. En aún otras realizaciones, los detectores de interés están configurados para medir la luz de la muestra en la corriente de flujo en una o más longitudes de onda específicas. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir uno o más detectores configurados para medir luz en uno o más de 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm, y cualquier combinación de los mismos.

El sistema de detección de luz está configurado para medir luz de manera continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los fotodetectores de interés están configurados para tomar mediciones de la luz recogida de forma continua. En otros casos, el sistema de detección de luz está configurado para tomar mediciones en intervalos discretos, tal como medir la luz cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

En realizaciones, los sistemas están configurados para analizar la luz de la muestra irradiada y generar datos espaciales del objeto en la corriente de flujo. Los sistemas de interés pueden incluir sistemas controlados por ordenador donde los sistemas incluyen además uno o más ordenadores para automatización completa o automatización parcial de un sistema para practicar los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático cuando se carga en el ordenador incluye instrucciones para irradiar una celda de flujo que tiene una muestra en una corriente de flujo con una fuente de luz y detectar luz de la celda de flujo con un sistema de detección de luz que tiene una pluralidad de fotodetectores y que genera datos espaciales del objeto en la corriente de flujo y determina si el objeto es un agregado (por ejemplo, un agregado de células) basándose en los datos espaciales.

En algunas realizaciones, los sistemas están configurados para generar una imagen de un objeto en la corriente de flujo en tiempo real, tal como por ejemplo para que uno o más componentes de la muestra se puedan clasificar basándose en la imagen generada. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático cuando se carga en el ordenador incluye instrucciones para irradiar una celda de flujo que tiene una muestra en una corriente de flujo con una fuente de luz y detectar luz de la celda de flujo con un sistema de detección de luz que tiene una pluralidad de fotodetectores y que genera una imagen de un objeto en la corriente de flujo y determina si el objeto obtenido en imagen es un agregado (por ejemplo, un agregado de células) basándose en la imagen generada.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático, cuando se carga en el ordenador, incluye además instrucciones para generar una imagen de un objeto en la corriente de flujo a partir de la luz detectada. La imagen puede generarse a partir de la absorción de luz detectada, la dispersión de luz detectada, la emisión de luz detectada o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, la imagen del objeto en la corriente de flujo es una imagen en escala de grises. En algunos casos, la imagen en escala de grises se genera por el sistema objeto a partir de la absorción de luz detectada en la muestra, tal como desde un detector de luz de campo claro. En estos casos, la imagen en escala de grises se genera basándose en los datos de la imagen de campo claro de la célula en la corriente de flujo. En otros casos, la imagen en escala de grises se genera por el sistema objeto a partir de la dispersión de luz detectada en la muestra, tal como desde un detector de dispersión lateral, un detector de dispersión frontal o una combinación de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En estos casos, la imagen en escala de grises se genera basándose en datos de imagen de luz dispersada. En aún otros casos, la imagen en escala de grises se genera por el sistema objeto a partir de la luz emitida desde la muestra, tal como la luz de los fluoróforos añadidos a la muestra. En estos casos, la imagen en escala de grises se genera basándose en datos de imágenes fluorescentes (es decir, datos de imágenes de compuestos fluorescentes sobre o dentro de la célula). En todavía otros casos, la imagen en escala de grises se genera por el sistema objeto a partir de una combinación de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y emisión de luz detectada.

Los sistemas objeto pueden configurarse para generar una o más imágenes del objeto a partir de la luz detectada. En algunas realizaciones, se genera una única imagen a partir de cada forma de luz detectada. Por ejemplo, se genera una primera imagen del objeto a partir de la absorción de luz detectada; se genera una segunda imagen del objeto a partir de la dispersión de luz detectada y una tercera imagen del objeto se genera a partir de la emisión de luz detectada. En otras realizaciones, se generan dos o más imágenes a partir de cada forma de luz detectada, tal como 3 o más, tal como 4 o más, tal como 5 o más e incluyendo 10 o más imágenes o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático, cuando se carga en el ordenador, incluye además instrucciones para generar una máscara de imagen del objeto. En estas realizaciones, los sistemas incluyen memoria con instrucciones para determinar un valor umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises. En algunas realizaciones, el programa informático incluye instrucciones que, cuando se ejecutan por el procesador, hacen que el procesador determine el valor umbral de intensidad de píxel de la imagen en escala de grises minimizando la variación intraclase de la imagen en escala de grises y calculando un umbral de intensidad de píxel que se basa en la variación intraclase minimizada (o donde la variación entre clases es máxima).

Los sistemas incluyen memoria con instrucciones para comparar cada píxel en la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad determinado y convertir cada píxel en un valor de píxel binario. En algunas realizaciones, la memoria incluye instrucciones para comparar píxeles a lo largo de cada fila horizontal en la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad determinado. En algunos casos, la memoria incluye instrucciones para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde el lado izquierdo de la imagen en escala de grises hasta el lado derecho de la imagen en escala de grises. En otros casos, la memoria incluye instrucciones para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde el lado derecho de la imagen en escala de grises hasta el lado izquierdo de la imagen en escala de grises. En otras realizaciones, la memoria incluye instrucciones para comparar píxeles a lo largo de cada columna vertical en la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad determinado. En algunos casos, la memoria incluye instrucciones para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde la parte superior de la imagen en escala de grises hasta la parte inferior de la imagen en escala de grises a lo largo de cada columna vertical. En otros casos, la memoria incluye instrucciones para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde la parte inferior de la imagen en escala de grises hasta la parte superior de la imagen en escala de grises a lo largo de cada columna vertical.

Dependiendo del tipo de luz detectada, a cada píxel se le asigna un valor de píxel binario de 1 o un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para detectar la absorción de luz (por ejemplo, datos de imagen de campo claro) de la corriente de flujo y asignar un valor de píxel de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel de 0 cuando la intensidad de píxel de la imagen en escala de grises es mayor que el valor umbral de intensidad. En otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para detectar la dispersión de luz del objeto en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad. En aún otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para detectar la fluorescencia del objeto en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad.

Cuando el sistema objeto asigna un valor de píxel binario a cada píxel en la imagen en escala de grises a través de una fila horizontal, en algunas realizaciones los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar adicionalmente el primer píxel a través de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 1 y determinar el último píxel de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 1. En un ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otras realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar adicionalmente el primer píxel a través de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 0 y determinar el último píxel en la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0. En otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0.

Cuando se asigna un valor de píxel binario a cada píxel en la imagen en escala de grises a lo largo de una columna vertical, en algunas realizaciones los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar adicionalmente el primer píxel a lo largo de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 1 y determinar el último píxel a lo largo de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 1. En un ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otras realizaciones, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar adicionalmente el primer píxel a lo largo de una columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 0 y determinar el último píxel en la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0. En otro ejemplo, los sistemas incluyen un programa informático que incluye instrucciones para determinar el primer píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático, cuando se carga en el ordenador, incluye además instrucciones para determinar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir memoria que tiene instrucciones para determinar el tamaño de la célula, el centro de masa de la célula o la excentricidad de la célula basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. En estas realizaciones, los sistemas están configurados para calcular uno o más momentos de imagen y luego determinar la característica de la célula utilizando tanto el momento de imagen calculado como los datos espaciales.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático, cuando se carga en el ordenador, incluye además instrucciones para determinar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir una memoria que tiene instrucciones para determinar el tamaño de la célula, el centro de masa de la célula o la excentricidad de la célula basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada del objeto (por ejemplo, imagen o máscara de imagen). En estas realizaciones, los sistemas están configurados para calcular uno o más momentos de imagen y luego determinar la característica de la célula usando tanto el momento de imagen calculado como la imagen del objeto.

En algunos casos, el centro de masa puede calcularse a partir del momento de imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, los sistemas pueden configurarse para determinar el centro de masa del objeto a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

Centro de masa =

En otros casos, la orientación del objeto puede calcularse a partir del momento de la imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, los sistemas pueden configurarse para determinar la orientación del objeto a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

En todavía otros casos, la excentricidad del objeto puede calcularse a partir del momento de imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, los sistemas pueden configurarse para determinar la excentricidad del objeto a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

En determinadas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa informático almacenado en el mismo, donde el programa informático, cuando se carga en el ordenador, incluye además instrucciones para evaluar uno o más de: 1) el tamaño calculado del objeto; 2) el centro de masa del objeto; y 3) la excentricidad del objeto e identificar si el objeto es un agregado de partículas (por ejemplo, un agregado de células) o una sola partícula (por ejemplo, una célula individual). En algunos casos, los sistemas están configurados para determinar que el objeto es un agregado basándose en el tamaño calculado del objeto. En otros casos, los sistemas están configurados para determinar que el objeto es un agregado basándose en el centro de masa calculado del objeto. En aún otros casos, los sistemas están configurados para determinar que el objeto es un agregado basándose en la excentricidad calculada del objeto.

En ciertos casos, los sistemas incluyen una memoria con instrucciones para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y los datos espaciales; y 2) evaluar una señal de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En estas realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser una salida del detector de dispersión de luz frontal o una salida del detector de dispersión de luz lateral o una combinación de las mismas. En realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser un ancho del pulso de señal, una altura del pulso de señal y un área del pulso de señal o una combinación de los mismos. En un ejemplo, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales y evaluar el ancho del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales y evaluar la altura del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo más, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales y evaluar el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz.

En determinadas realizaciones, los sistemas incluyen una memoria con instrucciones para: 1) evaluar cada uno del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz, seguido de 2) evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. En estas realizaciones, las señales de salida del detector de dispersión de luz se pueden recoger desde uno o más de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas por los sistemas objeto según estas realizaciones se recogen de un detector de dispersión lateral. En otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen de un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen tanto de un detector de dispersión lateral como de un detector de dispersión frontal.

En ciertos casos, los sistemas incluyen una memoria con instrucciones para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada; y 2) evaluar una señal de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En estas realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser una salida del detector de dispersión de luz frontal o una salida del detector de dispersión de luz lateral o una combinación de las mismas. En realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser un ancho del pulso de señal, una altura del pulso de señal y un área del pulso de señal o una combinación de los mismos. En un ejemplo, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar el ancho del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar la altura del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo más, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz.

En determinadas realizaciones, los sistemas incluyen una memoria con instrucciones para: 1) evaluar cada uno del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz, seguido de 2) evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada. En estas realizaciones, las señales de salida del detector de dispersión de luz se pueden recoger desde uno o más de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas por los sistemas objeto según estas realizaciones se recogen de un detector de dispersión lateral. En otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen de un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen tanto de un detector de dispersión lateral como de un detector de dispersión frontal.

En algunos casos, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células horizontal donde dos o más células están alineadas entre sí a través de un eje horizontal de la corriente de flujo, tal como 3 o más células, tal como 4 o más células e incluyendo 5 o más células. En otros casos, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células vertical donde dos o más células están alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, eje longitudinal) de la corriente de flujo, tal como 3 o más células, tal como 4 o más células e incluyendo 5 o más células. En aún otros casos, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para determinar que el objeto es un agregado de células combinado que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal y que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen una memoria que tiene instrucciones para calcular los datos espaciales a partir de los datos codificados en frecuencia del objeto en la corriente de flujo. En estas realizaciones, los sistemas están configurados para calcular los datos espaciales realizando una transformada de datos codificados en frecuencia. En un ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier (FT) de los datos codificados en frecuencia. En otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier discreta (DFT) de los datos codificados en frecuencia. En aún otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier de corto tiempo (STFT) de los datos codificados en frecuencia. En todavía otro ejemplo, los datos espaciales se calculan con un amplificador de bloqueo digital para heterodinar y demultiplexar los datos codificados en frecuencia.

Los sistemas de clasificación según algunas realizaciones pueden incluir una pantalla y un dispositivo de entrada del operador. Los dispositivos de entrada del operador pueden ser, por ejemplo, un teclado, un ratón o similares. El módulo de procesamiento incluye un procesador que tiene acceso a una memoria con instrucciones almacenadas en la misma para realizar los pasos de los métodos objeto. El módulo de procesamiento puede incluir un sistema operativo, un controlador de interfaz gráfica de usuario (GUI), una memoria de sistema, dispositivos de almacenamiento de memoria, y controladores de entrada-salida, memoria caché, una unidad de respaldo de datos, y muchos otros dispositivos. El procesador puede ser un procesador disponible comercialmente o puede ser uno de otros procesadores que están o estarán disponibles. El procesador ejecuta el sistema operativo y el sistema operativo interactúa con el firmware y el hardware de una manera bien conocida, y facilita el procesador en la coordinación y ejecución de las funciones de diversos programas informáticos que pueden escribirse en una variedad de lenguajes de programación, tales como Java, Perl, C++, otros lenguajes de alto nivel o bajo nivel, así como combinaciones de los mismos, como se conoce en la técnica. El sistema operativo, típicamente en cooperación con el procesador, coordina y ejecuta funciones de los otros componentes del ordenador. El sistema operativo también proporciona planificación, control de entrada-salida, gestión de archivos y datos, gestión de memoria, y control de comunicación y servicios relacionados, todo según técnicas conocidas. El procesador puede ser cualquier sistema analógico o digital adecuado. En algunas realizaciones, el procesador incluye electrónica analógica que proporciona control de retroalimentación, tal como por ejemplo control de retroalimentación negativa.

La memoria del sistema puede ser cualquiera de una variedad de dispositivos de almacenamiento de memoria conocidos o futuros. Los ejemplos incluyen cualquier memoria de acceso aleatorio (RAM) comúnmente disponible, un medio magnético, tal como un disco duro o cinta residente, un medio óptico, tal como un disco compacto de lectura y escritura, dispositivos de memoria flash, u otro dispositivo de almacenamiento de memoria. El dispositivo de almacenamiento de memoria puede ser cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos o futuros, que incluyen una unidad de disco compacto, una unidad de cinta, una unidad de disco duro extraíble, o una unidad de disquete. Tales tipos de dispositivos de almacenamiento de memoria típicamente leen de, y/o escriben a, un medio de almacenamiento de programas (no mostrado), tal como, respectivamente, un disco compacto, una cinta magnética, un disco duro extraíble o un disquete. Cualquiera de estos medios de almacenamiento de programas, u otros ahora en uso o que pueden desarrollarse posteriormente, pueden considerarse un producto de programa informático. Como se apreciará, estos medios de almacenamiento de programas típicamente almacenan un programa de software de ordenador y/o datos. Los programas de software informático, también llamados lógica de control informático, típicamente se almacenan en la memoria del sistema y/o en el dispositivo de almacenamiento de programas utilizado junto con el dispositivo de almacenamiento de memoria.

En algunas realizaciones, se describe un producto de programa informático que incluye un medio utilizable por ordenador que tiene almacenada lógica de control (programa informático, incluido código de programa) en el mismo. La lógica de control, cuando la ejecuta el procesador del ordenador, hace que el procesador realice las funciones descritas en la presente memoria. En otras realizaciones, algunas funciones se implementan principalmente en hardware, utilizando, por ejemplo, una máquina de estado de hardware. La implementación de la máquina de estado de hardware para realizar las funciones descritas en el presente documento, será evidente para los expertos en las técnicas relevantes.

La memoria puede ser cualquier dispositivo adecuado en donde el procesador pueda almacenar y recuperar datos, tales como dispositivos de almacenamiento magnéticos, ópticos o de estado sólido (incluidos discos magnéticos u ópticos, cintas o RAM, o cualquier otro dispositivo adecuado, ya sea fijo o portátil). El procesador puede incluir un microprocesador digital de propósito general adecuadamente programado a partir de un medio legible por ordenador que lleva el código de programa necesario. La programación se puede proporcionar de forma remota al procesador a través de un canal de comunicación, o se puede guardar previamente en un producto de programa informático, como una memoria o algún otro medio de almacenamiento portátil o fijo legible por ordenador usando cualquiera de esos dispositivos en conexión con la memoria. Por ejemplo, un disco magnético u óptico puede llevar la programación y puede ser leído por un escritor/lector de disco. Los sistemas de la invención también incluyen programación, p. ej., en forma de productos de programas informáticos, algoritmos para su uso en la práctica de los métodos descritos anteriormente. Las instrucciones y los algoritmos descritos en el presente documento pueden grabarse en cualquier medio legible por ordenador conveniente, p. ej., cualquier medio que pueda leerse y accederse directamente por un ordenador. Dichos medios incluyen, pero sin limitarse a: medios de almacenamiento magnético, como disquetes, medios de almacenamiento en discos duros y cintas magnéticas; medios de almacenamiento óptico como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico como RAM y ROM; unidad flash portátil; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.

El procesador también puede tener acceso a un canal de comunicación para comunicarse con un usuario en una ubicación remota. Por ubicación remota se entiende que el usuario no está directamente en contacto con el sistema, y transmite información de entrada a un gestor de entrada desde un dispositivo externo, tal como un ordenador conectado a una red de área amplia (“WAN” ), una red telefónica, una red satelital, o cualquier otro canal de comunicación adecuado, incluyendo un teléfono móvil (es decir, teléfono inteligente).

En algunas realizaciones, los sistemas según la presente descripción pueden configurarse para incluir una interfaz de comunicación. En algunas realizaciones, la interfaz de comunicación incluye un receptor y/o transmisor para comunicarse con una red y/u otro dispositivo. La interfaz de comunicación se puede configurar para comunicación por cable o inalámbrica, incluyendo, pero sin limitarse a, comunicación por radiofrecuencia (RF) (p. ej., identificación por radiofrecuencia (RFID), protocolos de comunicación Zigbee, WiFi, infrarrojos, bus serie universal (USB) inalámbrico, banda ultra ancha (UWB), protocolos de comunicación Bluetooth®, y comunicación celular, tal como acceso múltiple por división de código (CDMA) o el sistema global para comunicaciones móviles (GSM).

En una realización, la interfaz de comunicación se configura para incluir uno o más puertos de comunicación, p. ej., puertos o interfaces físicas, tales como un puerto USB, un puerto RS-232, o cualquier otro puerto de conexión eléctrica adecuado para permitir la comunicación de datos entre los sistemas objeto y otros dispositivos externos, tales como un terminal informático (por ejemplo, en la consulta de un médico o en el entorno hospitalario) que se configure para una comunicación de datos complementaria similar.

En una realización, la interfaz de comunicación se configura para comunicación infrarroja, comunicación Bluetooth®, o cualquier otro protocolo de comunicación inalámbrica adecuado para permitir que los sistemas objeto se comuniquen con otros dispositivos, tales como terminales y/o redes informáticas, teléfonos móviles habilitados para comunicación, asistentes digitales personales, o cualquier otro dispositivo de comunicación que el usuario pueda utilizar de manera conjunta.

En una realización, la interfaz de comunicación se configura para proporcionar una conexión para la transferencia de datos utilizando el protocolo de internet (IP) a través de una red de teléfono celular, servicio de mensajes cortos (SMS), conexión inalámbrica a un ordenador personal (PC) en una red de área local (LAN) que esté conectada a internet, o conexión WiFi a internet en un punto de conexión WiFi.

En una realización, los sistemas objeto se configuran para comunicarse de forma inalámbrica con un dispositivo servidor a través de la interfaz de comunicación, p. ej., usando un estándar común, tal como 802.11 o el protocolo de RF Bluetooth®, o un protocolo de infrarrojos IrDA. El dispositivo servidor puede ser otro dispositivo portátil, tal como un teléfono inteligente, asistente digital personal (PDA) o un ordenador portátil; o un dispositivo mayor, tal como un ordenador de sobremesa, aparato, etc. En algunas realizaciones, el dispositivo servidor tiene una pantalla, tal como una pantalla de cristal líquido (LCD), así como un dispositivo de entrada, tal como botones, un teclado, un ratón o una pantalla táctil.

En algunas realizaciones, la interfaz de comunicación se configura para comunicar automáticamente o semiautomáticamente datos almacenados en los sistemas objeto, p. ej., en una unidad de almacenamiento de datos opcional, con una red o dispositivo de servidor utilizando uno o más de los protocolos y/o mecanismos de comunicación descritos anteriormente.

Los controladores de salida pueden incluir controladores para cualquiera de una variedad de dispositivos de visualización conocidos para presentar información a un usuario, ya sea que una persona o una máquina, ya sea local o remota. Si uno de los dispositivos de visualización proporciona información visual, esta información típicamente puede organizarse lógica y/o físicamente como una matriz de elementos de imagen. Un controlador de interfaz gráfica de usuario (GUI) puede incluir cualquiera de una variedad de programas informáticos conocidos o futuros para proporcionar interfaces gráficas de entrada y salida entre el sistema y un usuario, y para procesar entradas de usuario. Los elementos funcionales del ordenador pueden comunicarse entre sí a través del bus del sistema. Algunas de estas comunicaciones pueden lograrse en realizaciones alternativas mediante el uso de una red u otros tipos de comunicaciones remotas. El gestor de salida también puede proporcionar información generada por el módulo de procesamiento a un usuario en una ubicación remota, p. ej., a través de Internet, teléfono o red satelital, según técnicas conocidas. La presentación de datos por el gestor de salida puede implementarse según una variedad de técnicas conocidas. Como algunos ejemplos, los datos pueden incluir documentos SQL, HTML o XML, correo electrónico u otros archivos, o datos en otras formas. Los datos pueden incluir direcciones URL de Internet para que un usuario pueda recuperar SQL, HTML, XML u otros documentos 0 datos adicionales de fuentes remotas. La una o más plataformas presentes en los sistemas objeto pueden ser cualquier tipo de plataforma informática conocida o un tipo que se desarrolle en el futuro, aunque típicamente serán de una clase de ordenador comúnmente denominado servidores. Sin embargo, también pueden ser un ordenador central, una estación de trabajo u otro tipo de ordenador. Pueden conectarse a través de cualquier tipo conocido o futuro de cableado u otro sistema de comunicación que incluya sistemas inalámbricos, ya sea en red o de otro modo. Pueden ubicarse conjuntamente o pueden estar físicamente separados. Pueden emplearse diversos sistemas operativos en cualquiera de las plataformas informáticas, posiblemente dependiendo del tipo y/o marca de la plataforma informática elegida. Los sistemas operativos apropiados incluyen Windows 10, Windows NT®, Windows XP, Windows 7, Windows 8, iOS, Sun Solaris, Linux, OS/400, Compaq Tru64 Unix, SGI IRIX, Siemens Reliant Unix, Ubuntu, Zorin OS y otros.

En ciertas realizaciones, los sistemas objeto incluyen uno o más componentes de ajuste ópti

como la luz irradiada sobre la muestra (por ejemplo, de un láser) o la luz recogida de la muestra (por ejemplo, dispersada, fluorescente). Por ejemplo, el ajuste óptico puede ser para aumentar las dimensiones de la luz, el foco de la luz o colimar la luz. En algunos casos, el ajuste óptico es un protocolo de ampliación para aumentar las dimensiones de la luz (por ejemplo, punto de haz), tal como aumentar las dimensiones en un 5 % o más, tal como en un 10 % o más, tal como en un 25 % o más, tal como en un 50 % o más e incluyendo aumentar las dimensiones en un 75 % o más. En otras realizaciones, el ajuste óptico incluye enfocar la luz para reducir las dimensiones de la luz, tal como en un 5 % o más, tal como en un 10 % o más, tal como en un 25 % o más, tal como en un 50 % o más, e incluyendo reducir las dimensiones del punto del haz en un 75 % o más. En determinadas realizaciones, el ajuste óptico incluye colimar la luz. El término “ colimar"’ se utiliza en su sentido convencional para referirse al ajuste ópticamente de la colinealidad de propagación de luz, o reducir la divergencia por la luz de un eje común de propagación. En algunos casos, la colimación incluye estrechar la sección transversal espacial de un haz de luz (por ejemplo, reducir el perfil del haz de un láser).

En algunas realizaciones, el componente de ajuste óptico es una lente de enfoque con una relación de aumento de desde 0,1 a 0,95, tal como una relación de aumento de desde 0,2 a 0,9, tal como una relación de aumento de desde 0,3 a 0,85, tal como una relación de aumento de desde 0,35 a 0,8, tal como una relación de aumento de desde 0,5 a 0,75, e incluyendo una relación de aumento de desde 0,55 a 0,7, por ejemplo, una relación de aumento de 0,6. Por ejemplo, la lente de enfoque es, en ciertos casos, una lente acromática doble de demagnificación con una relación de aumento de aproximadamente 0,6. La longitud focal de la lente de enfoque puede variar, variando de 5 mm a 20 mm, tal como de 6 mm a 19 mm, tal como de 7 mm a 18 mm, tal como de 8 mm a 17 mm, tal como de 9 mm a 16, e incluyendo una longitud focal que varía de 10 mm a 15 mm. En determinadas realizaciones, la lente de enfoque tiene una longitud focal de aproximadamente 13 mm.

En otras realizaciones, el componente de ajuste óptico es un colimador. El colimador puede ser cualquier protocolo de colimación conveniente, tal como uno o más espejos o lentes curvas, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el colimador está en determinados casos una única lente de colimación. En otros casos, el colimador es un espejo de colimación. En aún otros casos, el colimador incluye dos lentes. En otros casos más, el colimador incluye un espejo y una lente. Cuando el colimador incluye una o más lentes, la longitud focal de la lente de colimación puede variar, variando de 5 mm a 40 mm, tal como de 6 mm a 37,5 mm, tal como de 7 mm a 35 mm, tal como de 8 mm a 32,5 mm, tal como de 9 mm a 30 mm, tal como de 10 mm a 27,5 mm, tal como de 12,5 mm a 25 mm, e incluyendo una longitud focal que varía de 15 mm a 20 mm.

En algunas realizaciones, los sistemas objeto incluyen una boquilla de celda de flujo que tiene un orificio de boquilla configurado para hacer fluir una corriente de flujo a través de la boquilla de celda de flujo. La boquilla de celda de flujo objeto tiene un orificio que propaga una muestra fluídica a una región de interrogación de muestra, donde en algunas realizaciones, la boquilla de celda de flujo incluye una porción cilíndrica proximal que define un eje longitudinal y una porción troncocónica distal que termina en una superficie plana que tiene el orificio de la boquilla que es transversal al eje longitudinal. La longitud de la parte cilíndrica proximal (medida a lo largo del eje longitudinal) puede variar en el intervalo de 1 mm a 15 mm, tal como de 1,5 mm a 12,5 mm, tal como de 2 mm a 10 mm, tal como de 3 mm a 9 mm, e incluyendo de 4 mm a 8 mm. La longitud de la parte frustocónica distal (medida a lo largo del eje longitudinal) también puede variar, variando de 1 mm a 10 mm, tal como de 2 mm a 9 mm, tal como de 3 mm a 8 mm, e incluyendo de 4 mm a 7 mm. El diámetro de la cámara de boquilla de celda de flujo puede variar, en algunas realizaciones, variando de 1 mm a 10 mm, tal como de 2 mm a 9 mm, tal como de 3 mm a 8 mm, e incluyendo de 4 mm a 7 mm.

En ciertos casos, la cámara de boquilla no incluye una parte cilindrica, y toda la cámara de boquilla de la celda de flujo tiene forma frustocónica. En estas realizaciones, la longitud de la cámara de boquilla frustocónica (medida a lo largo del eje longitudinal transversal al orificio de boquilla) puede variar de 1 mm a 15 mm, tal como de 1,5 mm a 12,5 mm, tal como de 2 mm a 10 mm, tal como de 3 mm a 9 mm, e incluyendo de 4 mm a 8 mm. El diámetro de la parte proximal de la cámara de boquilla frustocónica puede variar de 1 mm a 10 mm, tal como de 2 mm a 9 mm, tal como de 3 mm a 8 mm, e incluyendo de 4 mm a 7 mm.

En realizaciones, la corriente de flujo de muestra emana de un orificio en el extremo distal de la boquilla de la celda de flujo. Dependiendo de las características deseadas de la corriente de flujo, el orificio de boquilla de celda de flujo puede ser cualquier forma adecuada donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero sin limitarse a: formas de sección transversal rectilíneas, p. ej., cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilíneas, p. ej., círculos, óvalos, así como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabólica acoplada a una parte superior plana. En determinadas realizaciones, la boquilla de celda de flujo de interés tiene un orificio circular. El tamaño del orificio de boquilla puede variar, en algunas realizaciones variando de 1 pm a 20000 pm, tal como de 2 pm a 17500 pm, tal como de 5 pm a 15000 pm, tal como de 10 pm a 12500 pm, tal como de 15 pm a 10000 pm, tal como de 25 pm a 7500 pm, tal como de 50 pm a 5000 pm, tal como de 75 pm a 1000 pm, tal como de 100 pm a 750 pm, e incluyendo de 150 pm a 500 pm. En determinadas realizaciones, el orificio de boquilla es de 100 pm.

En algunas realizaciones, la boquilla de celda de flujo incluye un puerto de inyección de muestra configurado para proporcionar una muestra a la boquilla de celda de flujo. En realizaciones, el sistema de inyección de muestra se configura para proporcionar un flujo de muestra adecuado a la cámara de boquilla de celda de flujo. Dependiendo de las características deseadas de la corriente de flujo, la velocidad de muestra transportada a la cámara de boquilla de la celda de flujo mediante el puerto de inyección de muestra puede ser de 1 pl/s o más, tal como 2 pl/s o más, tal como 3 pl/s o más, tal como 5 pl/s o más, tal como 10 pl/se o más, tal como 15 pl/s o más, tal como 25 pl/s o más, tal como 50 pl/s o más, tal como 100 pl/s o más, tal como 150 pl/s o más, tal como 200 pl/s o más, tal como 250 pl/s o más, tal como 300 pl/s o más, tal como 350 pl/s o más, tal como 400 pl/s o más, tal como 450 pl/s o más e incluyendo 500 pl/s o más. Por ejemplo, el caudal de muestra puede oscilar de 1 pl/s a aproximadamente 500 pl/s, tal como de 2 pl/s a aproximadamente 450 pl/s, tal como de 3 pl/s a aproximadamente 400 pl/s, tal como de 4 pl/s a aproximadamente 350 pl/s, tal como de 5 pl/s a aproximadamente 300 pl/s, tal como de 6 pl/s a aproximadamente 250 pl/s, tal como de 7 pl/s a aproximadamente 200 pl/s, tal como de 8 pl/s a aproximadamente 150 pl/s, tal como de 9 pl/s a aproximadamente 125 pl/s e incluyendo de 10 pl/s a aproximadamente 100 pl/s.

El puerto de inyección de muestra puede ser un orificio colocado en una pared de la cámara de boquilla, o puede ser un conducto colocado en el extremo proximal de la cámara de boquilla. Cuando el puerto de inyección de muestra es un orificio colocado en una pared de la cámara de boquilla, el orificio del puerto de inyección de muestra puede ser de cualquier forma adecuada, donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero sin limitarse a: formas de sección transversal rectilíneas, p. ej., cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilíneas, p. ej., círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabólica acoplada a una parte superior plana. En ciertas realizaciones, el puerto de inyección de muestra tiene un orificio circular. El tamaño del orificio del puerto de inyección de muestra puede variar dependiendo de la forma, en ciertos casos, con una abertura que oscila de 0,1 mm a 5,0 mm, por ejemplo, de 0,2 a 3,0 mm, por ejemplo, de 0,5 mm a 2,5 mm, tal como de 0,75 mm a 2,25 mm, tal como de 1 mm a 2 mm e incluyendo de 1,25 mm a 1,75 mm, por ejemplo 1,5 mm.

En ciertos casos, el puerto de inyección de muestra es un conducto colocado en un extremo proximal de la cámara de boquilla de celda de flujo. Por ejemplo, el puerto de inyección de muestra puede ser un conducto colocado para tener el orificio del puerto de inyección de muestra en línea con el orificio de boquilla de celda de flujo. Cuando el puerto de inyección de muestra es un conducto colocado en línea con el orificio de boquilla de celda de flujo, la forma de sección transversal del tubo de inyección de muestra puede ser cualquier forma adecuada donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero sin limitarse a: formas de sección transversal rectilíneas, p. ej., cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilíneas, p. ej., círculos, óvalos, así como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabólica acoplada a una parte superior plana. El orificio del conducto puede variar dependiendo de la forma, en ciertos casos, con una abertura que oscila de 0,1 mm a 5,0 mm, por ejemplo, de 0,2 a 3,0 mm, por ejemplo, de 0,5 mm a 2,5 mm, tal como de 0,75 mm a 2,25 mm, tal como de 1 mm a 2 mm, e incluyendo de 1,25 mm a 1,75 mm, por ejemplo, de 1,5 mm. La forma de la punta del puerto de inyección de muestra puede ser la misma o diferente de la forma de sección transversal del tubo de inyección de muestra. Por ejemplo, el orificio del puerto de inyección de muestra puede incluir una punta biselada que tiene un ángulo de bisel que varía de 1 ° a 10°, tal como de 2° a 9°, tal como de 3° a 8°, tal como de 4° a 7°, e incluyendo un ángulo de bisel de 5°.

En algunas realizaciones, la boquilla de celda de flujo también incluye un puerto de inyección de fluido envolvente configurado para proporcionar un fluido envolvente a la boquilla de celda de flujo. En realizaciones, el sistema de inyección de fluido envolvente se configura para proporcionar un flujo de fluido envolvente a la cámara de boquilla de celda de flujo, por ejemplo, junto con la muestra para producir una corriente de flujo laminado de fluido envolvente que rodea la corriente de flujo de muestra. Dependiendo de las características deseadas de la corriente de flujo, la velocidad de fluido envolvente transportada a la cámara de boquilla de celda de flujo por el puede ser de 25 pL/s o más, tal como de 50 pL/s o más, tal como de 75 pL/s o más, tal como de 100 pL/s o más, tal como de 250 pL/s o más, tal como de 500 pL/s o más, tal como de 750 pL/s o más, tal como de 1000 pL/s o más, e incluyendo de 2500 |jL/s o más. Por ejemplo, el caudal de fluido envolvente puede oscilar de 1 |jl/s a aproximadamente 500 |jl/s, tal como de 2 jl/s a aproximadamente 450 jl/s , tal como de 3 jl/s a aproximadamente 400 jl/s , tal como de 4 jl/s a aproximadamente 350 jl/s , tal como de 5 jl/s a aproximadamente 300 jl/s , tal como de 6 jl/s a aproximadamente 250 jl/s , tal como de 7 jl/s a aproximadamente 200 jl/s , tal como de 8 jl/s a aproximadamente 150 jl/s , tal como de 9 jl/s a aproximadamente 125 jl/s e incluyendo de 10 jl/s a aproximadamente 100 jl/s.

En algunas realizaciones, el puerto de inyección de fluido envolvente es un orificio colocado en una pared de la cámara de boquilla. El orificio del puerto de inyección de fluido envolvente puede ser de cualquier forma adecuada, donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero sin limitarse a: formas de sección transversal rectilíneas, p. ej., cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilíneas, p. ej., círculos, óvalos, así como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabólica acoplada a una parte superior plana. El tamaño del orificio del puerto de inyección de muestra puede variar dependiendo de la forma, en ciertos casos, con una abertura que oscila de 0,1 mm a 5,0 mm, por ejemplo, de 0,2 a 3,0 mm, por ejemplo, de 0,5 mm a 2,5 mm, tal como de 0,75 mm a 2,25 mm, tal como de 1 mm a 2 mm e incluyendo de 1,25 mm a 1,75 mm, por ejemplo 1,5 mm.

Los sistemas objeto, en ciertos casos, incluyen una región de interrogación de muestra en comunicación fluida con el orificio de la boquilla de la celda de flujo. En estos casos, una corriente de flujo de muestra emana de un orificio en el extremo distal de la boquilla de la celda de flujo y las partículas en la corriente de flujo pueden irradiarse con una fuente de luz en la región de interrogación de la muestra. El tamaño de la región de interrogación puede variar dependiendo de las propiedades de la boquilla de flujo, tal como el tamaño del orificio de la boquilla y el tamaño del puerto de inyección de muestra. En realizaciones, la región de interrogación puede tener una anchura que es 0,01 mm o más, tal como 0,05 0 más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 2 mm o más, tal como 3 mm o más, tal como 5 mm o más e incluyendo 10 mm o más. La longitud de la región de interrogación también puede variar, oscilando en algunos casos a lo largo de 0,01 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 1,5 mm o más, tal como 2 mm o más, tal como 3 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 o más, tal como 15 mm o más, tal como 20 mm o más, tal como 25 mm o más e incluyendo 50 mm o más.

La región de interrogación puede estar configurada para facilitar la irradiación de una sección transversal plana de una corriente de flujo que emana o puede estar configurada para facilitar la irradiación de un campo difuso (por ejemplo, con un láser o lámpara difusa) de una longitud predeterminada. En algunas realizaciones, la región de interrogación incluye una ventana transparente que facilita la irradiación de una longitud predeterminada de una corriente de flujo que emana, tal como 1 mm o más, tal como 2 mm o más, tal como 3 mm o más, tal como 4 mm o más, tal como 5 mm o más e incluyendo 10 mm o más. Dependiendo de la fuente de luz utilizada para irradiar la corriente de flujo que emana (como se describe a continuación), la región de interrogación puede configurarse para pasar luz que oscila de 100 nm a 1500 nm, tal como de 150 nm a 1400 nm, tal como de 200 nm a 1300 nm, tal como de 250 nm a 1200 nm, tal como de 300 nm a 1100 nm, tal como de 350 nm a 1000 nm, tal como de 400 nm a 900 nm e incluyendo de 500 nm a 800 nm. Como tal, la región de interrogación puede formarse a partir de cualquier material transparente que pase el intervalo deseado de longitud de onda, incluyendo, entre otros, vidrio óptico, vidrio de borosilicato, vidrio Pyrex, cuarzo ultravioleta, cuarzo infrarrojo, zafiro así como plástico, tal como policarbonatos, poli(cloruro de vinilo) (PVC), poliuretanos, poliéteres, poliamidas, poliimidas o copolímeros de estos termoplásticos, tales como PETG (poli(tereftalato de etileno) modificado con glicol), entre otros materiales plásticos poliméricos, incluyendo poliéster, donde los poliésteres de interés pueden incluir, pero son sin limitarse a poli(tereftalatos de alquileno) tal como poli(tereftalato de etileno) (PET), PET de calidad para botellas (un copolímero elaborado a base de monoetilenglicol, ácido tereftálico y otros comonómeros tal como ácido isoftálico, ciclohexeno dimetanol, etc.), poli(tereftalato de butileno) (PBT) y poli(tereftalato de hexametileno); poli(adipatos de alquileno) tal como poli(adipato de etileno), poli(adipato de 1,4-butileno) y poli(adipato de hexametileno); poli(suberatos de alquileno) tal como poli(suberato de etileno); poli(sebacatos de alquileno) tal como poli(sebacato de etileno); poli(£-caprolactona) y poli(p-propiolactona); poli(isoftalatos de alquileno) tal como poli(isoftalato de etileno); poli(2,6-naftalendicarboxilatos de alquileno) tal como poli(2,6-naftalendicarboxilato de etileno); poli(sulfonil-4,4'-dibenzoatos de alquileno) tal como poli(sulfonil-4,4'-dibenzoato de etileno); poli(dicarboxilatos de p-fenilen alquileno) tal como poli(dicarboxilatos de p-fenilen etileno); poli(dicarboxilatos de trans-1,4-ciclohexanodiil alquileno) tal como poli(dicarboxilato de trans-1,4-ciclohexanodiil etileno); poli(dicarboxilatos de 1,4-ciclohexano-dimetilen-alquileno) tal como poli(dicarboxilato de 1,4-ciclohexano-dimetilen-etileno); poli(dicarboxilatos de [2.2.2]-biciclooctano-1,4-dimetilen alquileno) tal como poli(dicarboxilato de [2.2.2]-biciclooctano-1,4-dimetilen etileno); polímeros y copolímeros de ácido láctico tal como (S)-polilactida, (R,S)-polilactida, poli(tetrametilglicolida) y poli(lactida-coglicolida); y policarbonatos de bisfenol A, 3,3'-dimetilbisfenol A, 3,3',5,5'-tetraclorobisfenol A, 3,3',5,5'-tetrametilbisfenol A; poliamidas tal como poli(p-fenilen tereftalamida); poliésteres, por ejemplo, poli(tereftalatos de etileno), por ejemplo, Mylar™ poli(tereftalato de etileno); etc. En algunas realizaciones, los sistemas objeto incluyen una cubeta colocada en la región de interrogación de la muestra. En realizaciones, la cubeta puede pasar luz que oscila de 100 nm a 1500 nm, tal como de 150 nm a 1400 nm, tal como de 200 nm a 1300 nm, tal como de 250 nm a 1200 nm, tal como de 300 nm a 1100 nm, tal como de 350 nm a 1000 nm, tal como de 400 nm a 900 nm e incluyendo de 500 nm a 800 nm.

En algunas realizaciones, los sistemas objeto incluyen un componente de clasificación de partículas para clasificar las células de la muestra. En ciertos casos, el componente de clasificación de partículas es un módulo de clasificación de partículas como los descritos en la publicación de patente estadounidense n.° 2017/0299493, presentada el 28 de marzo de 2017, y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/752.793 presentada el 30 de octubre de 2018. En determinadas realizaciones, el componente de clasificación de partículas incluye uno o más deflectores de gotas como los descritos en la publicación de patente estadounidense n.° 2018/0095022, presentada el 14 de junio de 2017.

En algunas realizaciones, los sistemas objeto son sistemas de citometría de flujo. Los sistemas de citometría de flujo adecuados pueden incluir, pero sin limitarse a, los descritos en Ormerod (ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Pulse (1997); Jaroszeski y col. (eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology No. 91, Conferencia Humana (l997); Practical Flow Cytometry, 3a ed., Wiley-Liss (1995); Virgo, y col. (2012) Ann Clin Biochem. Ene;49(pt 1):17-28; Linden, y col., Semin Throm Hemost. octubre de 2004;30(5):502-11; Allison, y col. J Pathol, diciembre de 2010; 222(4):335-344; y Herbig, y col. (2007) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 24(3):203-255. En ciertos casos, los sistemas de citometría de flujo de interés incluyen citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™ II, citómetro de flujo BD Accuri™, citómetro de flujo BD Biosciences FACSCelesta™, citómetro de flujo BD Biosciences FACSLyric™, citómetro de flujo BD Biosciences FACSVerse™, citómetro de flujo BD Biosciences FACSymphony™, citómetro de flujo BD Biosciences LSRFortessa™, citómetro de flujo BD Biosciences LSRFortess™ X-20 y clasificador de células BD Biosciences FACSCalibur™, un clasificador de células BD Biosciences FACSCount™, clasificador de células BD Biosciences FACSLyric™ y clasificador de células BD Biosciences Via™, clasificador de células BD Biosciences Influx™, clasificador de células BD Biosciences Jazz™, clasificadores de células BD Biosciences Aria™ y clasificador de células BD Biosciences FACSMelody™ o similares.

En algunas realizaciones, los sistemas de clasificación de partículas objeto son sistemas de citometría de flujo, tal como los descritos en las patentes estadounidenses n.° 10.006.852; 9.952.076; 9.933.341; 9.784.661; 9.726.527; 9.453.789; 9.200.334; 9.097.640; 9.095.494; 9.092.034; 8.975.595; 8.753.573; 8.233.146; 8.140.300; 7.544.326; 7.201.875; 7.129.505; 6.821.740; 6.813.017; 6.809.804; 6 .372.506; 5.700.692; US-5.643.796; 5.627.040; 5.620.842; 5.602.039.

En ciertos casos, los sistemas objeto son sistemas de citometría de flujo configurados para obtener imágenes de partículas en una corriente de flujo mediante obtención de imágenes de fluorescencia utilizando emisión etiquetada por radiofrecuencia (FIRE), como los descritos en Diebold, y col. Nature Photonics Vol. 7(10); 806-810 (2013), así como se describe en las patentes estadounidenses números 9.423.353; 9.784.661 y 10.006.852 y las publicaciones de patentes estadounidenses números 2017/0133857 y 2017/0350803.

Dispositivos de circuito integrado

Los aspectos de la presente descripción también incluyen dispositivos de circuito integrado programados para generar datos espaciales de un objeto en una corriente de flujo y para determinar si el objeto es un agregado (por ejemplo, un agregado de células) basándose en los datos espaciales. En ciertas realizaciones, los dispositivos de circuito integrado objeto están configurados para clasificar el objeto. En algunas realizaciones, los dispositivos de circuito integrado de interés incluyen una matriz de puertas programables en campo (FPGA). En otras realizaciones, los dispositivos de circuito integrado incluyen un circuito integrado de aplicación específica (ASIC). En aún otras realizaciones, los dispositivos de circuito integrado incluyen un dispositivo lógico programable complejo (CPLD).

Los dispositivos de circuito integrado según ciertas realizaciones están programados para generar datos espaciales de un objeto en la corriente de flujo. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales a partir de señales de datos de un detector de absorción de luz (por ejemplo, datos de imágenes de campo claro). En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales a partir de señales de datos de un detector de dispersión de luz (por ejemplo, datos de imágenes de dispersión directa, datos de imágenes de dispersión lateral). En aún otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales a partir de señale s de datos de un detector de emisión de luz (por ejemplo, datos de imágenes de marcadores fluorescentes). En todavía otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar datos espaciales del objeto a partir de una combinación de dos o más de absorción de luz detectada, dispersión de luz detectada y fluorescencia detectada.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar una imagen del objeto en la corriente de flujo a partir de la luz detectada. La imagen puede generarse a partir de la absorción de luz detectada, la dispersión de luz detectada, la emisión de luz detectada o cualquier combinación de los mismos. Los dispositivos de circuito integrado objeto pueden programarse para generar una o más imágenes del objeto a partir de la luz detectada. En algunas realizaciones, se genera una única imagen a partir de cada forma de luz detectada. Por ejemplo, se genera una primera imagen del objeto a partir de la absorción de luz detectada; se genera una segunda imagen del objeto a partir de la dispersión de luz detectada y una tercera imagen del objeto se genera a partir de la emisión de luz detectada. En otras realizaciones, se generan dos o más imágenes a partir de cada forma de luz detectada, tal como 3 o más, tal como 4 o más, tal como 5 o más e incluyendo 10 o más imágenes o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para generar una máscara de imagen del objeto. En estas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar un valor umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el valor umbral de intensidad de píxel a partir de la imagen en escala de grises minimizando la variación intraclase de la imagen en escala de grises y calculando un umbral de intensidad de píxel que se basa en la variación intraclase minimizada (o donde la variación entre clases es máxima).

El dispositivo de circuito integrado está programado para comparar cada píxel en la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad determinado y para convertir cada píxel en un valor de píxel binario. En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar píxeles a lo largo de cada fila horizontal en la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad determinado. En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde el lado izquierdo de la imagen en escala de grises hasta el lado derecho de la imagen en escala de grises. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde el lado derecho de la imagen en escala de grises hasta el lado izquierdo de la imagen en escala de grises. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar píxeles a lo largo de cada columna vertical en la imagen en escala de grises con el valor umbral de intensidad determinado. En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde la parte superior de la imagen en escala de grises hasta la parte inferior de la imagen en escala de grises a lo largo de cada columna vertical. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para comparar píxeles con el valor umbral de intensidad determinado desde la parte inferior de la imagen en escala de grises hasta la parte superior de la imagen en escala de grises a lo largo de cada columna vertical.

Dependiendo del tipo de luz detectada, a cada píxel se le asigna un valor de píxel binario de 1 o un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para detectar la absorción de luz (por ejemplo, datos de imagen de campo claro) de la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel de la imagen en escala de grises es mayor que el valor umbral de intensidad. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para detectar la dispersión de luz del objeto en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad de píxel es menor que el valor umbral de intensidad. En aún otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para detectar la fluorescencia del objeto en la corriente de flujo y asignar un valor de píxel binario de 1 a cada píxel en la imagen en escala de grises cuando la intensidad de píxel es mayor que el valor umbral de intensidad y asignar un valor de píxel binario de 0 cuando la intensidad del píxel es menor que el valor umbral de intensidad.

Cuando el sistema objeto asigna un valor de píxel binario a cada píxel de la imagen en escala de grises a través de una fila horizontal, en algunas realizaciones el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel a través de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 1 y determinar el último píxel en la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 1. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel a través de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 0 y determinar el último píxel en la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde el lado izquierdo de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde el lado derecho de la fila horizontal que tiene un valor de píxel binario asignado de 0.

Cuando se asigna un valor de píxel binario a cada píxel en la imagen en escala de grises a lo largo de una columna vertical, en algunas realizaciones el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel a lo largo de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 1 y determinar el último píxel a lo largo de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 1. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1 y determinar el último píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 1. En otras realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel a lo largo de una columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 0 y determinar el último píxel en la columna vertical que tiene un valor de píxel binario de 0. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde la parte superior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el primer píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0 y determinar el último píxel desde la parte inferior de la columna vertical que tiene un valor de píxel binario asignado de 0.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada. Por ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar el tamaño de la célula, el centro de masa de la célula o la excentricidad de la célula basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada del objeto (por ejemplo, imagen o máscara de imagen). En estas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular uno o más momentos de imagen y luego determinar la característica de la célula usando tanto el momento de imagen calculado como la imagen del objeto.

En algunos casos, el centro de masa puede calcularse a partir del momento de imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, el dispositivo de circuito integrado puede programarse para determinar el centro de masa del objeto a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

Centro de masa =

En otros casos, la orientación del objeto puede calcularse a partir del momento de la imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar la orientación del objeto a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

En todavía otros casos, la excentricidad del objeto puede calcularse a partir del momento de imagen y la imagen generada del objeto. Por ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar la excentricidad del objeto a partir del momento de imagen calculado y la imagen generada según:

En determinadas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar uno o más de: 1) el tamaño calculado del objeto; 2) el centro de masa del objeto; y 3) la excentricidad del objeto e identificar si el objeto es un agregado de partículas (por ejemplo, un agregado de células) o una sola partícula (por ejemplo, una célula individual). En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado basándose en el tamaño calculado del objeto. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado basándose en el centro de masa calculado del objeto. En aún otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado basándose en la excentricidad calculada del objeto.

En ciertos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para: 1) evaluar una o más propiedades del objeto basándose en el momento de la imagen calculado y la imagen generada; y 2) evaluar una señal de salida del detector de dispersión de luz del objeto en la región de interrogación de la corriente de flujo. En estas realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser una salida del detector de dispersión de luz frontal o una salida del detector de dispersión de luz lateral o una combinación de las mismas. En realizaciones, la señal de salida del detector de dispersión de luz puede ser un ancho del pulso de señal, una altura del pulso de señal y un área del pulso de señal o una combinación de los mismos. En un ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar el ancho del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar la altura del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz. En otro ejemplo más, el dispositivo de circuito integrado está programado para evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada y evaluar el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz.

En determinadas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para: 1) evaluar cada uno del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz, seguido de 2) evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y los datos espaciales. En estas realizaciones, las señales de salida del detector de dispersión de luz se pueden recoger desde uno o más de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas según estas realizaciones se recogen de un detector de dispersión lateral. En otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen de un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen tanto de un detector de dispersión lateral como de un detector de dispersión frontal.

En determinadas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para: 1) evaluar cada uno del ancho del pulso, la altura del pulso y el área del pulso de una señal de salida del detector de dispersión de luz, seguido de 2) evaluar una o más propiedades del objeto (tamaño, centro de masa, excentricidad) basándose en el momento de imagen calculado y la imagen generada. En estas realizaciones, las señales de salida del detector de dispersión de luz se pueden recoger desde uno o más de un detector de dispersión lateral y un detector de dispersión frontal. En algunos casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas según estas realizaciones se recogen de un detector de dispersión lateral. En otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen de un detector de dispersión frontal. En aún otros casos, las señales de salida del detector de dispersión de luz utilizadas se recogen tanto de un detector de dispersión lateral como de un detector de dispersión frontal.

En algunos casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado de células horizontal donde dos o más células están alineadas entre sí a través de un eje horizontal de la corriente de flujo, tal como 3 o más células, tal como 4 o más células. e incluyendo 5 o más células. En otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado de células vertical donde dos o más células están alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical (es decir, eje longitudinal) de la corriente de flujo, tal como 3 o más células, tal como 4 o más células e incluyendo 5 o más células. En aún otros casos, el dispositivo de circuito integrado está programado para determinar que el objeto es un agregado de células combinadas que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje horizontal y que tiene dos o más células alineadas entre sí a lo largo de un eje vertical.

En algunas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular los datos espaciales a partir de los datos codificados en frecuencia del objeto en la corriente de flujo. En estas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para calcular los datos espaciales realizando una transformada de datos codificados en frecuencia. En un ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier (FT) de los datos codificados en frecuencia. En otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier discreta (DFT) de los datos codificados en frecuencia. En aún otro ejemplo, los datos espaciales se calculan realizando una transformada de Fourier de corto tiempo (STFT) de los datos codificados en frecuencia. En todavía otro ejemplo, los datos espaciales se calculan con un amplificador de bloqueo digital para heterodinar y demultiplexar los datos codificados en frecuencia.

En ciertas realizaciones, el dispositivo de circuito integrado está programado para tomar una decisión de clasificación (como se ha descrito anteriormente) basándose en la imagen generada o basándose en un parámetro calculado (por ejemplo, centro de masa, excentricidad, etc.). En estas realizaciones, el análisis incluye clasificar y contar partículas de modo que cada partícula esté presente como un conjunto de valores de parámetros digitalizados. El dispositivo de circuito integrado objeto puede programarse para activar un componente de clasificación basándose en un parámetro seleccionado para distinguir las partículas de interés del fondo y el ruido.

Kits

Los aspectos de la presente descripción incluyen, además, kits, donde los kits incluyen uno o más dispositivos de circuito integrado descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir además programación para los sistemas objeto, tal como en forma de un medio legible por ordenador (por ejemplo, unidad flash, almacenamiento USB, disco compacto, DVD, disco Blu-ray, etc.) o instrucciones para descargar la programación desde un protocolo web de internet o servidor en la nube. Los kits pueden incluir además instrucciones para poner en práctica los métodos objeto. Estas instrucciones pueden encontrarse en los kits objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden encontrarse en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden presentarse es como información impresa sobre un medio o sustrato adecuado, p. ej., una pieza o piezas de papel sobre la que se imprima la información, en la envoltura del kit, en un prospecto, y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, p. ej., un disquete, un disco compacto (CD), una unidad flash portátil, y similares, en el que se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que pueden estar presentes es una dirección de sitio web que pueda utilizarse a través de internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

Utilidad

Los sistemas, métodos y sistemas informáticos objeto se usan en una variedad de aplicaciones donde es deseable analizar y clasificar componentes de partículas en una muestra en un medio fluido, tal como una muestra biológica. En algunas realizaciones, los sistemas y métodos descritos en el presente documento se usan en la caracterización por citometría de flujo de muestras biológicas marcadas con etiquetas fluorescentes. En otras realizaciones, los sistemas y métodos se usan en espectroscopia de luz emitida. Además, los sistemas y métodos objeto se usan para aumentar la señal obtenible a partir de la luz recogida de una muestra (por ejemplo, en una corriente de flujo). En determinados casos, la presente descripción se usa para mejorar la medición de luz recogida de una muestra que se irradia en una corriente de flujo en un citómetro de flujo. Las realizaciones de la presente descripción se usan donde sea conveniente proporcionar un citómetro de flujo con precisión mejorada de clasificación de células, recogida de partículas mejorada, eficiencia de carga de partículas, carga de partículas más precisa, y deflexión de partículas mejorada durante la clasificación de células.

Las realizaciones de la presente descripción encuentran también uso en aplicaciones en donde pueden desearse células preparadas a partir de una muestra biológica para investigación, pruebas de laboratorio o para su uso en terapia. En algunas realizaciones, los métodos y dispositivos objeto pueden facilitar la obtención de células individuales preparadas a partir de una muestra biológica fluídica o tisular diana. Por ejemplo, los métodos y sistemas en cuestión facilitan la obtención de células a partir de muestras de fluidos o tejidos para su uso como muestra de investigación o diagnóstico para enfermedades tales como el cáncer. Asimismo, los métodos y sistemas en cuestión pueden facilitar la obtención de células a partir de muestras fluídicas o tisulares para su uso en terapia. Los métodos y dispositivos de la presente descripción permiten separar y recoger células de una muestra biológica (por ejemplo, órgano, tejido, fragmento de tejido, fluido) con mayor eficiencia y bajo coste en comparación con los sistemas de citometría de flujo tradicionales.

Claims

REIVINDICACIONES

i .Un método para determinar si un objeto en una corriente de flujo es un agregado de células, comprendiendo el método:

detectar luz de una muestra que comprende células en una corriente de flujo;

generar datos codificados en frecuencia de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación para obtener datos espaciales que comprenden frecuencias codificadas espacialmente a través del objeto; y

determinar si el objeto en la corriente de flujo es un agregado de células basándose en los datos espaciales.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la detección de luz de la muestra en la corriente de flujo comprende detectar la dispersión de luz de la muestra en la corriente de flujo.
3. El método según la reivindicación 2, en donde el método comprende detectar luz dispersada frontalmente de la muestra en la corriente de flujo o luz dispersada lateralmente de la muestra en la corriente de flujo.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además determinar el tamaño del objeto basándose en los datos espaciales.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además determinar el centro de masa del objeto basándose en los datos espaciales.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además determinar la excentricidad del objeto basándose en los datos espaciales.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además calcular un momento de imagen del objeto basándose en los datos espaciales.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además generar una imagen del objeto a partir de los datos espaciales.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el método comprende determinar que el objeto es una célula individual o determinar que el objeto es un agregado de células que comprende dos o más células.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el método comprende generar una imagen codificada en frecuencia.
11. El método según la reivindicación 10, en donde la generación de la imagen codificada en frecuencia comprende irradiar la corriente de flujo con un primer haz de luz de frecuencia desplazada y un segundo haz de luz de frecuencia desplazada.
12. El método según la reivindicación 11, en donde el primer haz de luz de frecuencia desplazada comprende un haz de oscilador local (LO) y el segundo haz de luz de frecuencia desplazada comprende un haz de peine de radiofrecuencia.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además clasificar el objeto.
14. Un sistema que comprende:

una fuente de luz configurada para irradiar una muestra que comprende células en una corriente de flujo;

un sistema de detección de luz que comprende un fotodetector; y

un procesador que comprende una memoria acoplada operativamente al procesador en donde la memoria comprende instrucciones almacenadas en ella que, cuando se ejecutan por el procesador, hacen que el procesador:

genere datos codificados en frecuencia de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación para producir datos espaciales que comprenden frecuencias codificadas espacialmente a través del objeto; y

determine si el objeto en la corriente de flujo es un agregado de células basándose en los datos espaciales según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. Un circuito integrado programado para:

generar datos codificados en frecuencia de un objeto en la corriente de flujo en una región de interrogación para producir datos espaciales que comprenden frecuencias codificadas espacialmente a través del objeto; y

determinar si el objeto en la corriente de flujo es un agregado de células basándose en los datos espaciales según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.