ES2233974T3

ES2233974T3 - Anticuerpo contra la cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana.

Info

Publication number: ES2233974T3
Application number: ES96930357T
Authority: ES
Inventors: Masamichi Koike; Akiko Furuya; Kazuyasu Nakamura; Akihiro Iida; Hideharu Anazawa; Nobuo Hanai; Kiyoshi Takatsu
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-09-11
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2016-09-11
Also published as: ATE283926T1; US6538111B1; HK1005096A1; KR100259828B1; US7179464B2; DE69633973T2; CA2205007A1; EP0811691B1; US6018032A; CA2205007C; US20050272918A1; WO1997010354A1; CN1241944C; EP0811691A4; CN1189190A; US20030096977A1; DE69633973D1; AU690474B2; JP3946256B2; US7238354B2

Abstract

Anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con una cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana, en el que el anticuerpo se une a un epítopo en las posiciones 1-313 de la secuencia de aminoácidos N-terminal de una cadena alfa del receptor de la interleucina-5 humana y que inhibe una actividad biológica de la interleucina-5 humana.

Description

Anticuerpo contra la cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana.

Campo técnico

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y anticuerpos humanizados que se unen específicamente a la cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana y que por tanto son útiles para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades tales como el asma bronquial crónica. La invención también se refiere a hibridomas y transformantes que producen los anticuerpos, a un método para detectar inmunológicamente una cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana mediante los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos humanizados, así como a un método para diagnosticar y tratar enfermedades tales como el asma bronquial crónica mediante los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos humanizados.

Antecedentes de la técnica

La interleucina 5 (denominada en lo sucesivo "IL-5") es una clase de linfocina secretada por las células T, los mastocitos y otras células. Se sabe que la IL-5 murina actúa como un factor de diferenciación y crecimiento para las células B y los eosinófilos. Se sabe que la IL-5 humana actúa principalmente como un factor de diferenciación y crecimiento para eosinófilos (Advances in Immunology, 57, 145 (1994); Blood, 79, 3101 (1992)). La IL-5 muestra su acción a través de un receptor específico (receptor de IL-5) que se expresa en la superficie de una célula tal como un eosinófilo. Se ha demostrado que los receptores de la IL-5 humana y murina (denominados en lo sucesivo "IL-5R") están ambos compuestos de dos clases diferentes de proteínas, una cadena \alpha (denominada en lo sucesivo "IL-5R \alpha") y una cadena \beta (denominada en lo sucesivo "IL-5R \beta"). Además, se sabe que la unión de IL-5 a IL-5R es mediante IL-5R \alpha y que IL-5R \beta sola no puede unirse a IL-5 (EMBO J., 9, 4367 (1990); en el mismo lugar, 10, 2833 (1991); J. Exp. Med., 177, 1523 (1993); en el mismo lugar., 175, 341 (1992); Cell, 66, 1175 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 7041 (1992)). Además, se sabe que IL-5R \beta es un componente de los receptores para la interleucina 3 (denominada en lo sucesivo "IL-3"), el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos y otros (denominado en lo sucesivo "GM-CSF") (Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 9655 (1990); Cell, 66, 1165 (1991)).

Se sabe que los eosinófilos aumentan en las enfermedades alérgicas representadas por el asma bronquial crónico. Se observa infiltración significativa de eosinófilos en las vías respiratorias de un paciente con asma bronquial crónica. El eosinófilo contiene unas proteínas granulares citotóxicas cuyo depósito se observa en los tejidos de las vías respiratorias de un paciente con asma bronquial crónica o en los sitios de lesión de un paciente con dermatitis atópica. Estos hechos indican que el eosinófilo desempeña un papel importante en la patogenia de los trastornos alérgicos, tales como en el asma bronquial crónica, la dermatitis atópica y similares (Adv. Immunol., 39, 177 (1986); Immunol. Today, 13, 501 (1992)). Por tanto, el estudio de la cinética de los eosinófilos es útil para el diagnóstico clínico. Por otra parte, la IL-5 humana actúa específicamente sobre los eosinófilos, por lo que se cree que el IL-5R se expresa específicamente en los eosinófilos y, por tanto, puede utilizarse como un marcador específico para los eosinófilos humanos. Además, IL-5R \beta es un receptor para citocinas tales como IL-3, GM-CSF y otros, por lo que se cree que IL-5R \alpha es un marcador específico para eosinófilos. Por tanto, los eosinófilos pueden detectarse específicamente mediante la tinción inmunocítica utilizando un anticuerpo anti-cadena \alpha del IL-5R humana (denominado en lo sucesivo "anticuerpo anti-hIL-5R \alpha"). Sin embargo, en la actualidad no se conoce ningún anticuerpo anti-hIL-5R \alpha que pueda detectar específicamente eosinófilos.

Se observó eosinofilia significativa en ratones transgénicos para IL-5 (J. Exp. Med., 172, 1425 (1990); en el mismo lugar, 173, 429 (1991); Int. Immunol., 2, 965 (1990)). La infiltración de eosinófilos en tejidos se suprimió por la administración de un anticuerpo anti-IL-5 en modelos animales de asma (Am. Rev. Resir. 147, 543 81993); en el mismo sitio, 148, 1623 (1993)). Estos fenómenos indican que la IL-5 realmente desempeña un papel importante en la eosinofilia y en la infiltración de eosinófilos in vivo. También se ha notificado que la IL-5 se expresa en los tejidos mucosos de las vías respiratorias de un paciente humano con asma bronquial crónico y en los sitios de lesión de un paciente con dermatitis atópica (J. Clin. Inves., 87, 1541 (1991); J. Exp. Med., 173, 775 (1991)). Investigaciones adicionales demuestran que la IL-5 muestra in vitro acción de potenciación de la viabilidad en los eosinófilos humanos (J. Immunol., 143, 2311 (1989)) y que la IL-5 es un activador selectivo de eosinófilos (J. Exp. Med., 167, 219 (1988)).

Por tanto, se espera que los anticuerpos que se unen al IL-5R y que pueden inhibir la actividad biológica de IL-5, inhiban la actividad de los eosinófilos, siendo así útiles en el tratamiento de las enfermedades alérgicas tales como el asma bronquial crónica. Se produjeron anticuerpos anti-IL-5R \alpha de ratón que pueden inhibir la actividad biológica de IL-5 utilizando como antígeno células dependientes de IL-5 que expresan un gran número de IL-5R murino en sus superficies (publicación denominada Kokai (solicitud de patente japonesa publicada y no examinada) número 108497/91; Int. Immunol., 2, 181 (1990)). Sin embargo, en el caso de los humanos, no se conocen células que expresen un gran número de IL-5R y se notifica que la expresión de IL-5R es muy baja en eosinófilos (Cell. Immunol., 133, 484 (1991)). Por tanto, los anticuerpos anti-IL-5R \alpha humano que tienen funciones comparables a las de los anticuerpos anti-IL-5R \alpha de ratón son difíciles de producir mediante métodos similares a los utilizados para producir estos últimos. Un anticuerpo designado como "\alpha 16" se describe como un anticuerpo contra la IL-5R \alpha humana en EMBO J., 14, 3395 (1995) pero este anticuerpo no tiene ninguna actividad de neutralización para IL-5R \alpha.

El gen de la IL-5R \alpha humana se obtuvo preparando una biblioteca de ADNc a partir de eosinófilos humanos (J. Exp. Med., 175 341 (1992)) o una célula HL-60 promielocítica humana (Cell, 66, 1175 (1991); publicación denominada Kokai número 78772/94) y rastreando la biblioteca utilizando como sonda un ADN oligo que se ha sintetizado partiendo de la base de ADNc de la IL-5R \alpha murina o una secuencia de aminoácidos parcial de la IL-5R \alpha murina (publicación denominada Kokai, número 54690/94, EMBO J., 9, 4367 (1990)). La transferencia del ADNc a la célula huésped dio como resultado la creación de una célula que tenía la hIL-5R \alpha expresada en su superficie, pero el nivel de expresión de hIL-5R en esta célula era muy bajo (\leq10^{4} moléculas) (J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)). Por tanto, si se intenta producir anticuerpos anti-hIL-5R \alpha utilizando esta célula como inmunógeno, se encontrará que la cantidad relativa de hIL-5R \alpha es muy pequeña, en comparación con la de las proteínas de una célula huésped y que la cantidad de proteína absoluta de hIL-5R \alpha también es muy pequeña. Además, se observa aproximadamente un 80% de homología en un nivel de aminoácidos entre la IL-5R \alpha murina y la IL-5R \alpha humana y la IL-5 murina puede unirse al IL-5R humano con gran afinidad (J. Exp. Med., 175, 341 (1992). Estos hechos indican que la IL-5R \alpha humana tiene una inmunogenicidad inferior para los ratones o las ratas utilizados comúnmente como animales que han de inmunizarse. De hecho, casi todos los intentos por preparar anticuerpos anti-hIL-5R \alpha utilizando células que expresan hIL-5R \alpha como inmunógeno resultaron un fracaso.

En la clonación de ADNc de IL-5R a partir de una biblioteca de ADNc de eosinófilos humanos, se ha obtenido ADNc que codifica para la IL-5R \alpha humana soluble (denominada en lo sucesivo "shIL-5R \alpha") que corresponde a la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal (1-313) de IL-5R \alpha que es deficiente en la región transmembrana y en lo sucesivo (J. Exp. Med., 175, 341 (1992)). Cuando se usa shIL-5R \alpha como un inmunógeno para producir un anticuerpo anti-hIL-5R \alpha, la shIL-5R \alpha debe tener la misma conformación tridimensional que la de hIL-5R \alpha expresada en la superficie celular y debe ser secretada y producida por una célula huésped eucariota con el fin de obtener un anticuerpo anti-hIL-5R \alpha que pueda inhibir la actividad biológica de IL-5. Además, se ha encontrado que la eficacia en la producción de una proteína varía significativamente dependiendo del péptido señal (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 35, 2584 (1990)), por lo que es necesario seleccionar un péptido señal apropiado para la secreción y la producción de la proteína.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha encontrado que el ARNm que se cree que codifica sólo para shIL-5R \alpha se expresa en eosinófilos. Se ha confirmado que el IL-5R murino se expresa no sólo en eosinófilos, sino también en células B y que el ARNm que se cree que codifica sólo para una región extracelular de IL-5R \alpha (denominada en lo sucesivo "smIL-5R \alpha") se expresa en esas células, así como en el caso de humanos. Además, se ha notificado que smIL-5R \alpha se detectó en la sangre de ratones transplantados con la línea celular de leucemia de células B (BCL 1) crónica murina que expresa IL-5R (BCL1) o ratones modelo de enfermedades autoinmunitarias humanas (J. Immunol. Method. 167, 289 (1994)). Esto indica la posibilidad de que el aumento en el número de células que expresan IL-5R y su activación pueden reflejarse en la cantidad de smIL-5R \alpha secretadas en la sangre. Se cree que el IL-5R humano que ha de expresarse en eosinófilos en una cantidad limitada y que el aumento en el número de eosinófilos y su activación pueden reflejarse potencialmente en la cantidad de shIL-5R \alpha en la sangre. Por tanto, se espera que la determinación cuantitativa de shIL-5R \alpha sea útil en el diagnóstico clínico.

Se cree que cualquier anticuerpo monoclonal aislado que se una específicamente a IL-5R \alpha humana es útil en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades alérgicas. Sin embargo, debe observarse que si se administra a un humano un anticuerpo monoclonal derivado de un animal no humano, generalmente se reconoce como materia extraña, de manera que se produce un anticuerpo contra el anticuerpo monoclonal derivado de animal no humano en el cuerpo humano, se produce una reacción con el anticuerpo monoclonal derivado de animal no humano administrado que da lugar a un efecto secundario (J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1933); Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 1242 (1985)), se produce el aclaramiento prematuro del anticuerpo monoclonal derivado de animal no humano (J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988)), o se reduce el efecto terapéutico del anticuerpo monoclonal (J. Immunol., 135, 1530 (1985); Cancer Res., 46, 6489 (1986)).

Con el fin de resolver estos problemas, se han hecho intentos para convertir los anticuerpos monoclonales derivados de animal no humano en anticuerpos quiméricos humanos o anticuerpos injertados con CDR humanos (anticuerpos humanos reconstituidos) mediante técnicas genéticas recombinantes. Un anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo del que la región variable (denominada en lo sucesivo "región V") se deriva de un anticuerpo de animal no humano y la región constante (denominada en lo sucesivo "región C") se deriva de un anticuerpo humano (Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851 (1984). Se ha notificado que cuando se administra un anticuerpo quimérico humano a un humano, apenas se producen anticuerpos contra el anticuerpo monoclonal derivado de animal no humano y se aumenta la semivida en la sangre en un factor de 6 (Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 4220 (1989)). Un anticuerpo injertado con CDR humano es un anticuerpo humano del que la CDR (región determinante de la complementaridad) se sustituye con la CDR de un anticuerpo derivado de animal no humano (Nature, 321, 522 (1986)). Se ha notificado con experimentos en monos que un anticuerpo injertado con CDR humano tiene una inmunogenicidad inferior, aumentándose la semivida en sangre en un factor de 4-5, en comparación con un anticuerpo de ratón (J. Immunol., 147, 1352 (1991)). Sin embargo, no hay informes acerca de un anticuerpo humanizado contra hIL-5R \alpha.

Cuando un anticuerpo humanizado que se une específicamente a la hIL-5R \alpha humana se administra a un humano, se espera que no dé lugar a la producción de un anticuerpo contra un anticuerpo monoclonal derivado de animal no humano, reduciendo así el efecto secundario y prolongando la semivida en sangre, lo que finalmente conduce a un efecto terapéutico importante contra enfermedades alérgicas, tales como el asma bronquial crónica, la dermatitis atópica y similares.

Como resultado de los recientes progresos en las técnicas de ingeniería genética y de proteínas, se están preparando moléculas de anticuerpo más pequeñas tal como anticuerpos de cadena sencilla (Science, 242, 423 (1988)) y anticuerpos estabilizados con disulfuro (Molecular Immunology, 32, 249 (1995)). Puesto que los anticuerpos de cadena sencilla y los anticuerpos estabilizados con disulfuro tienen pesos moleculares más pequeños que los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos humanizados, son eficaces en la transición a los tejidos y en el aclaramiento de la sangre y está en marcha su aplicación a la tecnología de formación de imágenes y a la preparación de complejos con toxinas para dar esperanzas en la eficacia terapéutica (Cancer Research, 55, 318 (1995)). Si se produce un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo estabilizado con disulfuro que se une específicamente a una cadena \alpha de IL-5R humana, se prevén importantes efectos diagnósticos y terapéuticos contra las enfermedades alérgicas y similares. Sin embargo, no hay informes acerca de un anticuerpo de cadena sencilla y un anticuerpo estabilizado con disulfuro contra una cadena \alpha de IL-5R humana.

FASEB J., Vol. 9, Nº 6, pág. A 1502 (D1) enseña la expresión del receptor de la IL-5 en eosinófilos humanos y el uso de anticuerpos monoclonales para detectar el receptor de la IL-5 expresado. (D1) describe que los anticuerpos monoclonales, 7G8, 17A11 y 5G12 reconocen epítopos diferentes del receptor. El cálculo de la reactividad del anticuerpo puede llevarse a cabo utilizando un dominio extracelular soluble de la cadena \alpha de IL-5R humana. Sin embargo, (D1) ni describe ni sugiere que los 3 anticuerpos tengan una actividad biológica que se describe como una característica técnica esencial del anticuerpo monoclonal reivindicado en la presente solicitud. Además, (D1) no describe ni sugiere un método de obtención de dicho anticuerpo reivindicado.

El documento de Yamaguchi et al., Int. Immunol. Vol. 2, Nº 2, 1992, 181-187 (D2) describe la generación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de la interleucina 5 murina (receptor de mIL-5). Los anticuerpos generados se caracterizan por inhibir la actividad biológica de IL-5. Según el método descrito en (D2) para la generación de anticuerpos con especificidad por el mIL-5R, se inmunizaron ratas con preparaciones de membrana de células T88-M. Se sabe que la línea celular murina T88-M expresa niveles extremadamente altos de IL-5R en la superficie celular. Se sabía en la técnica que la eficacia de la inmunización de un animal con un antígeno es directamente dependiente de la cantidad y de la calidad del antígeno utilizado para la inmunización. El antígeno utilizado según el método de (D2) ha de evaluarse como un antígeno de gran calidad que se administra al animal, lo que promueve el desarrollo de anticuerpos específicos debido a su complejidad. Se prepararon hibridomas, que producen anticuerpos monoclonales específicos contra IL-5R mediante la fusión de células de mieloma murinas con células del bazo de las ratas inmunizadas. Por tanto, la disposición de anticuerpos monoclonales con especificidad por el receptor de la interleucina 5 murina que se describe en (D2) se permitió sólo por la existencia de las células T88-M y la expresión de IL-5R en la superficie celular en densidad extremadamente alta.

Los documentos EP-A 0 492 914 (D3) y EP-B1 475 746 (D4) describen IL-5R humanos y murinos y una cadena \alpha recombinante del receptor de la interleucina-5 humana o de partes del mismo. Además, (D3) y D4) describen secuencias de ADN que codifican para dichos receptores o cadena \alpha y las células huésped transformadas con vectores que comprenden dichas secuencias de ADN. (D3) y (D4) ni describen ni sugieren la modificación de un vector tal como se describe en la presente solicitud, lo que permite la expresión de alta densidad requerida de la cadena \alpha de IL-5R en las células transfectadas.

Descripción de la invención

Los inventores encontraron que los anticuerpos contra una cadena \alpha de hIL-5R que reconocen un epítopo en las posiciones 1-313 de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la cadena \alpha de IL-5R humana que corresponde a la región extracelular deficiente en la región transmembrana en lo sucesivo, reaccionan específicamente con la cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana con tinción inmunocítica e inhiben la actividad biológica de la interleucina 5. Estos anticuerpos pueden utilizarse para el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades alérgicas mencionadas anteriormente.

Por tanto, la presente invención proporciona anticuerpos que reaccionan específicamente con una cadena \alpha de IL-5R humana. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos estabilizados con disulfuro y similares. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser de cualquier clase, siempre que reaccionen específicamente con una cadena \alpha de hIL-5R. Se prefieren los producidos mediante el método explicado más adelante. En resumen, la proteína hIL-5R \alpha se prepara como un antígeno y se administra para inmunizar animales tales como ratones, ratas, hámsteres, conejos y similares, utilizados para preparar hibridomas, induciendo así a las células plasmáticas que tienen una especificidad antigénica. Las células plasmáticas se funden con las células del mieloma para preparar hibridomas que pueden producir anticuerpos monoclonales, y los hibridomas se cultivan para obtener los anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha deseados. Puede utilizarse cualquier anticuerpo monoclonal siempre que reconozca un epítopo en las posiciones 1-313 desde los aminoácidos del extremo N-terminal de una cadena \alpha de IL-5R humana y reaccione específicamente con la cadena \alpha de IL-5R humana con tinción inmunocítica. Alternativamente, puede utilizarse cualquier anticuerpo monoclonal, siempre que reconozca un epítopo en las posiciones 1-313 de los aminoácidos del extremo N-terminal de la cadena \alpha de IL-5R humana e inhiba la actividad biológica de la IL-5 humana. Los anteriores anticuerpos monoclonales se ejemplifican mediante el anticuerpo monoclonal KM1257 producido por el hibridoma KM1257 (FERM BP-5133). Los últimos anticuerpos monoclonales se ejemplifican por KM1259 producido por el hibridoma KM1259 (FERM BP-5134) y KM1486 producido por el hibridoma KM1486 (FERM
BP-5651).

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención reaccionan inmunológicamente con una cadena \alpha de
IL-5R humana, una célula que tiene una cadena \alpha de IL-5R humana expresada en la superficie, un eosinófilo humano y similares. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención reaccionan inmunológicamente con una cadena \alpha de IL-5R humana soluble. Por tanto, la presente invención también proporciona un método para detectar y determinar inmunológicamente una cadena \alpha de IL-5R humana, una célula que tiene una cadena \alpha de IL-5R humana expresada en la superficie, un eosinófilo humano y una cadena \alpha de IL-5R humana soluble. Los resultados de la detección y determinación pueden utilizarse en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades alérgicas tales como el asma bronquial crónica, la dermatitis atópica, y similares.

La presente invención también proporciona anticuerpos humanizados que tienen menores efectos secundarios con una semivida prolongada que los anticuerpos monoclonales y que inhiben la actividad biológica de IL-5 de una forma más deseada que la terapéutica. El término "anticuerpo humanizado" de la presente invención es el término general para los anticuerpos quiméricos humanos y los anticuerpos injertados con CDR humanos.

El término "anticuerpo quimérico humano" significa un anticuerpo que consiste en una región variable en una cadena pesada (denominada en lo sucesivo "VH") y una región variable en una cadena ligera (denominada en los sucesivo "VL") de un anticuerpo de animal no humano, así como una región constante en una cadena pesada (denominada en lo sucesivo "CH") y una región constante en una cadena ligera (denominada en lo sucesivo "CL") de un anticuerpo humano. El término "anticuerpo injertado con CDR humano" significa un anticuerpo en el que las secuencias de CDR de VH y VL de un anticuerpo humano se sustituyen con secuencias CDR de VH y VL de un anticuerpo de animal no humano, respectivamente. Un anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de hIL-5R que inhibe la actividad biológica de IL-5 puede expresarse y producirse mediante un procedimiento que comprende las etapas de obtener ADNc que codifique para VH y VL de un hibridoma que produce un anticuerpo que puede inhibir la actividad biológica de IL-5, insertar los ADNc respectivos en un vector de expresión en células animales que contienen un gen que codifica para la CH del anticuerpo humano y la CL del anticuerpo humano para construir así un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano y transfectar el vector de expresión en una célula animal. El anticuerpo quimérico humano y el anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invención pueden estar en cualquier clase de inmunoglobulina (Ig) y están preferiblemente en una clase de IgG. Además, puede utilizarse cualquier región C de las subclases de IgG de inmunoglobulina tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Ejemplos de anticuerpo quimérico humano de la presente invención incluyen un anticuerpo del que la VH contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 27, CH es el anticuerpo IgG1 humano, VL contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 29 y CL es \kappa de anticuerpo humano. Un ejemplo específico es un anticuerpo designado "KM1399". Un ejemplo específico de anticuerpo quimérico humano del que la CH es el anticuerpo humano IgG4 es un anticuerpo designado "KM7399". KM1399 puede producirse, por ejemplo mediante KM1399 transformante (FERM BP-5650). KM7399 puede producirse, por ejemplo, mediante KM 7399 transformante (FERM BP-5649).

El anticuerpo injertado con CDR humano anti-cadena \alpha de hIL-5R que inhibe la actividad biológica de IL-5 puede expresarse y producirse mediante un procedimiento que comprende las etapas de construir ADNc que codifiquen para una región V en la que las secuencias de CDR de VH y VL de cualquier anticuerpo humano se sustituyan con las secuencias de CDR de VH y VL, respectivamente, de un anticuerpo de animal no humano que puede inhibir la actividad biológica de IL-5, insertar los ADNc respectivos en un vector para la expresión en células animales que contiene un gen que codifica para la CH del anticuerpo humano y la CL del anticuerpo humano para construir así un vector de expresión del anticuerpo injertado con CDR humano, y transfectar el vector de expresión en una célula animal. Ejemplos de anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invención incluyen un anticuerpo del que VH contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 83, CH es el anticuerpo humano IgG1, VL contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 71, y CL es \kappa de anticuerpo humano. Un ejemplo específico es un anticuerpo designado "KM8399". Un ejemplo específico de anticuerpo injertado con CDR humano del que la CH es el anticuerpo humano IgG4, es un anticuerpo designado "KM9399". KM8399 puede producirse, por ejemplo, mediante KM8399 transformante (FERM BP-5648). KM 9399 puede producirse, por ejemplo, mediante KM9399 transformante (FERM BP-5647).

El anticuerpo humanizado de la presente invención reacciona inmunológicamente con una cadena \alpha de IL-5R humana, una célula que tiene una cadena \alpha de IL-5R humana expresada en la superficie, un eosinófilo humano y similares. Por tanto, el anticuerpo humanizado de la presente invención puede utilizarse en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades alérgicas, tales como el asma bronquial crónica, la dermatitis atópica y similares.

Además, la presente invención proporciona anticuerpos de cadena sencilla (Fv de cadena sencilla; denominado en lo sucesivo "scFv") y anticuerpos estabilizados con disulfuro (Fv estabilizado con disulfuro; denominado en lo sucesivo "dsFv") que muestran capacidad para unirse a una cadena \alpha de IL-5R humana.

El término "anticuerpo de cadena sencilla (scFv)" significa un polipéptido representado por la fórmula VH-L-VL o VL-L-VH en el que una cadena sencilla de VH y una cadena sencilla de VL se unen mediante una secuencia de unión (linker) peptídica apropiada (denominada en lo sucesivo como "L"). Puede utilizarse cualquier anticuerpo monoclonal anti-cadena \alpha de IL-5R humana o anticuerpos injertados con CDR humanos como VH y VL en el scFv de la presente invención.

El termino "anticuerpo estabilizado con disulfuro (dsFv)" significa un anticuerpo preparado para unir mediante un puente disulfuro dos polipéptidos en los que cada uno de los residuos de aminoácido en VH y VL se sustituye con residuos de cisteína. Los residuos de aminoácidos que han de sustituirse con residuos de cisteína pueden seleccionarse partiendo de la base de una estructura estérica supuesta de un anticuerpo según el método descrito por Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). Pueden utilizarse o bien anticuerpos monoclonales de ratón anti-cadena \alpha IL-5R humana o anticuerpos injertados con CDR humanos como VH o VL en el anticuerpo estabilizado con disulfuro de la presente invención.

El anticuerpo de cadena sencilla que tiene capacidad para unirse a una cadena \alpha IL-5R humana puede expresarse y producirse mediante un procedimiento que comprende las etapas de obtener ADNc que codifique para VH y VL de un hibridoma que produce un anticuerpo que puede reaccionar con la cadena \alpha de IL-5R humana, construir un vector de expresión del anticuerpo de cadena sencilla y transfectar el vector de expresión en una célula de E. coli, levadura o animal. Ejemplos de anticuerpo de cadena sencilla derivado de anticuerpo monoclonal de la presente invención incluyen un anticuerpo del que la VH contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 27 y VL contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 29. Ejemplos de anticuerpo de cadena sencilla derivado de anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invención incluyen un anticuerpo del que VH contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 83 y VL contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 71.

El anticuerpo estabilizado con disulfuro que tiene capacidad para unirse a una cadena \alpha de IL-5R humana puede expresarse y producirse mediante un procedimiento que comprende las etapas de obtener ADNc que codifique para VH y VL de un hibridoma que produce un anticuerpo que puede reaccionar con la cadena \alpha de IL-5R humana, insertar el ADNc en un vector de expresión apropiado y transfectar el vector de expresión en una célula de E. coli, levadura o animal. Ejemplos de anticuerpo de cadena sencilla derivado de anticuerpo monoclonal de la presente invención incluyen un anticuerpo del que la VH contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 27 y VL contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 29. Ejemplos de anticuerpo estabilizado con disulfuro derivado de anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invención incluyen un anticuerpo del que VH contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 83 y VL contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 71.

A continuación se explicará en detalle un método para producir un anticuerpo monoclonal anti-cadena \alpha de IL-5R humana que reaccione específicamente con una cadena \alpha de IL-5R humana o que inhiba la actividad biológica de la IL-5 humana, y un método para producir un anticuerpo humanizado anti-cadena \alpha de IL-5R humana, un anticuerpo de cadena sencilla anti-cadena \alpha de IL-5R humana y un anticuerpo estabilizado con disulfuro anti-cadena \alpha de IL-5R humana, que inhiben todos la actividad biológica de la IL-5 humana, así como un método para detectar y determinar una cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana mediante dichos anticuerpos.

1. Producción de anticuerpo monoclonal anti-hIL-5R \alpha (1) Preparación del antígeno

Una célula que tiene hIL-5R \alpha expresada en la superficie celular o una fracción de membrana celular de la misma, o una célula CTLL-2 (célula T dependiente de interleucina 2) que exprese hIL-5R \alpha (h5 R) o una fracción de membrana celular de la misma, pueden usarse como un antígeno para producir un anticuerpo monoclonal anti-hIL-5R \alpha. CTLL-2 (h5 R) es una célula que expresa hIL-5R \alpha que se creó insertando un ADNc que codifica para una secuencia de longitud completa de un hIL-5R \alpha clonado previamente (J. Exp. Med., 175, 341 (1992)) en un vector de expresión para células animales tales como pCAGGS (Gene, 108, 193 (1991)) y transfectando el vector de expresión en la línea celular CTLL-2 de células T murinas.

Para la expresión de una célula huésped procariota tal como E. coli., puede insertarse un fragmento parcial o de longitud completa de ADNc que codifica para hIL-5R \alpha en un vector de expresión tal como pGEX comercialmente disponible (Pharmacia), el sistema pET (Novagen), pMKex1 que se describe en la sección (11) del ejemplo 1 más adelante, o similares, y la secuencia hIL-5R \alpha de longitud completa o un fragmento parcial de la misma puede expresarse como tal o como una proteína de fusión. Tras la ruptura de la célula, la proteína expresada por E. coli puede purificarse por electroforesis de SDS-poliacrilamida, cromatografía de afinidad basada en la naturaleza de la proteína de fusión, o similares.

En el método de expresar la secuencia hIL-5R \alpha de longitud completa o un fragmento parcial de la misma, o bien como tal o como una proteína de fusión, pueden utilizarse células huésped eucariotas tales como células de insectos, células de mamíferos y similares.

En el caso de utilizar una célula de mamífero, se inserta una longitud completa o un fragmento parcial de ADNc que codifica para hIL-5R \alpha en un vector tal como pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pAGE210 que se describe en la sección (1) del ejemplo 1 más adelante, o similar, para construir así un vector de expresión para la proteína. Con el fin de expresar eficazmente la secuencia hIL-5R \alpha de longitud completa codificada por el ADNc o un fragmento parcial de la misma, o bien como tal o como una proteína de fusión, la secuencia nucleotídica que codifica para un péptido señal en el ADNc se sustituye preferiblemente por la secuencia nucleotídica que codifica para un péptido señal de una proteína que puede expresarse a alto nivel en una célula huésped eucariota. Se utilizan preferiblemente péptidos señal conocidos de proteínas, incluyendo los de la hormona de crecimiento humano, el anticuerpo quimérico KM871 anti-gangliósido GD3 (publicación denominada Kokai de solicitud de patente número 304989/93) y similares.

El vector de expresión así construido puede transfectarse en células huésped mediante un método conocido tal como electroporación (publicación denominada Kokai de solicitud de patente número 257891/90; Cytotechnology, 3, 133 (1990)), el método de lipofectina (Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413 (1987)) o similares. El cultivo de las células en un medio apropiado puede dar como resultado la producción de la secuencia hIL-5R \alpha de longitud completa o un fragmento parcial de la misma, o bien como tal o como una proteína de fusión en las células o en el sobrenadante del cultivo. Se utiliza preferiblemente un medio libre de suero porque puede facilitar la purificación del fragmento parcial o de la proteína de fusión de hIL-5R \alpha producida en el sobrenadante del cultivo.

En el caso de utilizar una célula de insecto, se inserta una longitud completa o un fragmento parcial de ADNc que codifica para hIL-5R \alpha utilizando un kit Baculo Gold Starter (Pharmingen) para preparar un baculovirus recombinante y se infectan las células de insecto Sf9, Sf21 (Pharmingen) o similares con el virus recombinante, de manera que se produzca una secuencia hIL-5R \alpha de longitud completa o un fragmento parcial de la misma, o bien como tal o como una proteína de fusión en las células o en el sobrenadante del cultivo (Bio/Technology, 6, 47 (1988)).

La secuencia hIL-5R \alpha de longitud completa o un fragmento parcial o la proteína de fusión de la misma producidos por las células de animal o insecto, pueden purificarse a partir del sobrenadante de cultivo o similar mediante un método conocido de purificación de proteínas tal como precipitación de proteínas por sales, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico o similares, y utilizarse como antígeno. Particularmente en el caso en el que se produce hIL-5R \alpha como una proteína de fusión con una región constante de las inmunoglobulinas, se purifica preferiblemente utilizando una columna de afinidad que tiene fijada en la misma la proteína A que tiene una afinidad específica por la región constante de las inmunoglobulinas.

(2) Inmunización del animal y preparación de células que producen anticuerpos

Puede utilizarse cualquier animal, tal como ratones, ratas, hámsteres, conejos y similares, como animales que han de inmunizarse, siempre que puedan utilizarse para preparar hibridomas. En el presente documento se explicará una realización en la que se utilizan ratones o ratas. Los ratones y las ratas de 3-20 semanas de edad se inmunizan con
shIL-5R \alpha o CTLL-2 que tiene hIL-5R \alpha expresada en la superficie (J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)) como un antígeno, y las células que producen anticuerpos se recogen de los bazos, los nódulos linfáticos y la sangre periférica de los animales. La inmunización se lleva a cabo administrando a los animales el antígeno, junto con un adyuvante apropiado tal como el adyuvante completo de Freund o una combinación de gel de hidróxido de aluminio y vacuna antitosferínica por vía subcutánea, intravenosa o intraperitoneal. El antígeno se administra 5-10 veces a intervalos de 1-2 semanas tras la primera administración. Se extrae sangre del plexo venoso oftálmico en los días 3-7 tras cada administración y el suero se examina para determinar una reactividad con el antígeno mediante enzimoinmunoanálisis ("Enzyme Immunoassay (ELISA)", publicado por Igakushoin, 1976).

Un ratón o rata cuyo suero muestra un título de anticuerpo satisfactorio para shIL-5R \alpha o las células que tienen hIL-5R \alpha expresadas en la superficie, que se utilizan para la inmunización, puede utilizarse como una fuente de células que producen anticuerpos.

Con el fin de realizar la fusión de una célula del bazo con una célula de mieloma, se extrae el bazo del ratón inmunizado en el día 3-7 tras la administración final de la sustancia antigénica y se recogen las células del bazo. El bazo se corta en trozos en un medio MEM (medio esencial mínimo) (Nissui Pharmaceuticals) y se dispersa con unas pinzas. Tras la centrifugación (1.200 rpm, 5 min), se elimina el sobrenadante. El precipitado se trata con un tampón Tris-cloruro de amonio (pH 7,65) durante 1-2 minutos para eliminar los eritrocitos y se lava con medio MEM 3 veces para preparar los esplenocitos para su uso en la fusión celular.

(3) Preparación de las células de mieloma

Se utiliza una línea celular establecida de un ratón o una rata como una célula de mieloma. Ejemplos incluyen las líneas celulares de mieloma P3-X62Ag8-U1 (P3-U1) (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Europ. J.
Immunol., 6, 511 (1976)), SP2/0-Ag14 (SP-2) (Nature, 276, 269 (1978)), P3-X63-Ag8653 (653) (J. Immunol., 123, 1548 (1979)) y P3-X63-Ag8 (X63) (Nature, 256, 495 (1975)) que se deriva del ratón tolerante a la 8-azaguanina (BALB/c). Estas líneas celulares pueden subcultivarse en medio con 8-azaguanina que es medio RPMI-1640 complementado con glutamina (1,5 mM), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-6}M), gentamicina (10 \mug/ml) y suero bovino fetal (FCS) (CSL, 10%) (denominado en lo sucesivo "medio normal"), que se complementa adicionalmente con 8-azaguanina (15 \mug/ml). Deben subcultivarse en un medio normal 3-4 días antes de la fusión celular para garantizar un recuento de células de al menos 2 x 10^{7} células en el día de la fusión celular.

(4) Fusión celular

Las células que producen los anticuerpos descritas en 1 (2) y las células de mieloma descritas en 1 (3) se lavan meticulosamente con medio MEM o PBS (solución salina tamponada con fosfato) (1,83 g de fosfato de disodio, 0,21 g de fosfato de monopotasio, 7,65 g de cloruro de sodio, 1 L de agua destilada, pH 7,2). Estas células se mezclan de manera que una razón del recuento de células de las células que producen anticuerpos con respecto a las células mieloma sea de 5-10:1. Tras la centrifugación (1.200 rpm, 5 min), el sobrenadante se elimina. Las células precipitadas se dispersan y entonces se añade una disolución mixta compuesta de etilenglicol 1000 (PEG-1000 (2 g), MEM (2 ml) y dimetilsulfóxido (DMSO) (0,7 ml) a las células en una cantidad de 0,2-1 ml/10^{8} células que producen anticuerpos mientras se agita. Se añade un medio MEM (1-2 ml) varias veces a intervalos de 1-2 minutos y después se añade un medio MEM adicional de manera que el volumen total sea de 50 ml. Tras la centrifugación (900 rpm, 5 min), se elimina el sobrenadante. Las células se dispersan suavemente y después se suspenden suavemente en 100 ml de medio HAT (un medio normal complementado con hipoxantina 10^{-4} M, timidina 1,5 x 10^{-6} M y aminopterina 4 x 10^{-7} M) por succión y soplado con una pipeta.

La suspensión de células se dispensa en placas de cultivo de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se cultiva en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 7-14 días.

Tras el cultivo, se examina una alícuota del sobrenadante del cultivo mediante enzimoinmunoanálisis que se describe en 1 (5) para seleccionar un pocillo que sea reactivo específicamente con una proteína recombinante, tal como una proteína de fusión con shIL-5R \alpha o hIL-5R \alpha descritas en 1 (1). Posteriormente, se repite dos veces la clonación mediante dilución limitante. Se utiliza un medio HAT libre de aminopterina en la primera clonación y un medio normal en la segunda clonación. Se selecciona una célula que muestra un alto título de anticuerpos de manera estable como una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de ratón o rata anti-hIL-5R \alpha.

(5) Selección de anticuerpo monoclonal de ratón o rata anti-IL-5R \alpha humana

Se selecciona un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales de ratón o rata anti-hIL-5R \alpha según un método descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14 (1988) por el método de medición descrito más adelante. Mediante el método, puede determinarse la actividad del anticuerpo anti-hIL-5R \alpha en el sobrenadante del cultivo de los transformantes que producen un anticuerpo humanizado anti-hIL-5R \alpha, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo estabilizado con sulfuro que se van a describir más adelante o las actividades de todos los anticuerpos anti-hIL-5R \alpha purificados.

Se recubre una placa apropiada con shIL-5R \alpha o una proteína recombinante, tal como una proteína de fusión con hIL-5R \alpha descrita en 1 (1). La placa se hace reaccionar con un anticuerpo primario que es el sobrenadante del cultivo de hibridoma o el anticuerpo purificado que se va a obtener en 1 (6) y se hace reaccionar con un anticuerpo secundario que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón o un anticuerpo anti-inmunoglobulina de rata que se marca con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente o un compuesto radiactivo. Posteriormente, se lleva a cabo una reacción según la clase específica de marcador, por la que se selecciona un hibridoma que es reactivo específicamente con hIL-5R \alpha como un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales de ratón anti-hIL-5R \alpha.

Si el sobrenadante del cultivo de los transformantes que producen un anticuerpo estabilizado con disulfuro, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo humanizado anti-hIL-5R \alpha, o un anticuerpo purificado de los mismos, se hace reaccionar como anticuerpo primario, se utiliza un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente o un compuesto radiactivo como anticuerpo secundario y se lleva a cabo una reacción según la clase específica del marcador para la detección.

Se recubre una placa apropiada con shIL-5R \alpha o una proteína recombinante, tal como una proteína de fusión con una proteína recombinante hIL-5R \alpha descrita en 1 (1). Cualquiera del sobrenadante del cultivo de hibridoma, el sobrenadante del cultivo de los transformantes que producen un anticuerpo estabilizado con disulfuro, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo humanizado anti-hIL-5R \alpha, o un anticuerpo purificado de los mismos, se mezcla y se hace reaccionar con la IL-5 humana marcada con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente o un compuesto radiactivo. Posteriormente, se lleva a cabo una reacción según la clase específica del marcaje, de manera que se determine una actividad en la inhibición de la unión de la IL-5 humana a la IL-5R \alpha. Este método se utiliza para detectar hibridomas para seleccionar uno que tenga una elevada actividad inhibitoria contra la IL-5
humana.

(6) Producción de anticuerpo monoclonal de ratón o rata

Se trata un ratón de 8-10 semanas de edad o un ratón desnudo con pristano. Más específicamente, se administra al ratón por vía intraperitoneal pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano, 0,5 ml) y se cría durante 2 semanas. Se administran al ratón por vía intraperitoneal líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpo monoclonal de ratón o rata anti-hIL-5R \alpha (tal como se ha obtenido en 1 (3)) en una cantidad de 2 x 10^{7} - 5 x 10^{6} células/ratón. El hibridoma produjo ascitis de origen tumoral tras 10-21 días tras la administración. La ascitis se recoge del ratón y se centrifuga (3.000 rpm, 5 min) para eliminar una parte sólida. El precipitado se obtiene mediante precipitación de proteínas con sales y se aplica a una columna para una precipitación con ácido caprílico, o una columna de DEAE-Sepharose, una columna de proteína A o una columna Cellulofine GSL2000 (Biochemical Industry) para recoger fracciones de IgG o IgM. Estas fracciones se utilizan como un anticuerpo monoclonal purificado.

La subclase del anticuerpo se determina utilizando un kit de tipado de anticuerpo monoclonal de ratón o rata. La masa de la proteína se calcula mediante un método de Lowry o a partir de la absorbancia a 280 nm.

2. Producción de anticuerpo humanizado anti-IL-5R \alpha humana (1) Construcción del vector de expresión de anticuerpo humanizado

Con el fin de producir un anticuerpo humanizado a partir de un anticuerpo de animal no humano, se prepara un vector de expresión de anticuerpo humanizado. El vector de expresión de anticuerpo humanizado es un vector para la expresión en células animales en las que se han transfectado los genes que codifican para las regiones CH y CL, las regiones C de un anticuerpo humano. Tal vector de expresión se construye insertando dos genes, uno que codifica para CH de un anticuerpo humano y el otro que codifica para CL de un anticuerpo humano, en un vector de expresión para células animales. Puede utilizarse cualquier región C de un anticuerpo humano tal como C\gamma 1 y C\gamma 4 de una cadena H de anticuerpo humano, C\kappa de una cadena L de anticuerpo humano y similares. Puede utilizarse un ADN cromosómico que consista en un(os) exón(es) y un(os) intrón(es) o ADNc como un gen que codifica para una región C de un anticuerpo humano. Puede utilizarse cualquier vector de expresión como vectores de expresión para células animales, siempre que puedan incorporar y expresar un gen que codifique para una región C de un anticuerpo humano. Ejemplos son pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274, (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981)) y pSG1 \beta d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)). Un promotor y un potenciador (enhancer) que van a utilizarse en la preparación de un vector de expresión para células animales se ejemplifica mediante un promotor temprano y un potenciador de SV40 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), un promotor y un potenciador de las LTR (repeticiones terminales largas) del virus de la leucemia murina de Moloney (Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987)), un promotor (Cell, 41, 479 (1985)) y un potenciador (Cell, 33, 717 (1983)) de la cadena H de las inmunoglobulinas, y similares.

El vector de expresión del anticuerpo humanizado puede ser o bien de un tipo en el que un gen que codifica para una cadena H de anticuerpo y un gen que codifica para una cadena L de anticuerpo existen en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). En lo que se refiere a la facilidad de la construcción de un vector de expresión de anticuerpo humanizado, la facilidad de introducción en células animales, el equilibrio entre las cantidades de expresión de las cadenas H y L de anticuerpo en las células animales y por otros motivos, un tipo tándem de vector de expresión de anticuerpo humanizado es más preferido (J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)).

(2) Preparación de ADNc que codifica para VH y VL de anticuerpo de animal no humano

Se obtiene ADNc que codifica para VH y VL de un anticuerpo de animal no humano, tal como un anticuerpo monoclonal de ratón anti-cadena \alpha de IL-5R humana, por ejemplo, tal como sigue:

Se extrae ARNm de una célula que produce anticuerpos monoclonales anti-cadena \alpha de IL-5R humana, tal como un hibridoma que produce anticuerpos de ratón anti-cadena \alpha de IL-5R humana y se utilizan para sintetizar ADNc. El ADNc sintetizado se inserta en un vector, tal como un fago o un plásmido para preparar una biblioteca de ADNc. A partir de la biblioteca, con una parte en la región V o C de un anticuerpo de animal no humano, tal como un anticuerpo de ratón que se utiliza como sonda, se aísla separadamente un plásmido o fago recombinante que contiene ADNc que codifica para VH y un plásmido o fago recombinante que contiene ADNc que codifica para VL. Se determinan las secuencias nucleotídicas completas de VH y VL de un anticuerpo de interés que existe en el plásmido o fago recombinante y se deducen las secuencias completas de aminoácidos de VH y VL a partir de secuencias nucleotídicas.

(3) Construcción de vector de expresión de anticuerpo quimérico humano

Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano insertando ADNc que codifica para VH y VL de un anticuerpo de animal no humano en una región aguas arriba del gen que codifica para CH y CL del anticuerpo humano en el vector de expresión del anticuerpo humanizado que se ha construido en 2 (1). Por ejemplo, se crea de manera preliminar un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para la clonación del ADNc que codifica para VH y VL de un anticuerpo de animal no humano, en una región aguas arriba de un gen que codifica para CH y CL del anticuerpo humano en un vector de expresión del anticuerpo quimérico. En el sitio de clonación, se inserta el ADNc que codifica para una región V de un anticuerpo de animal no humano mediante un ADN sintético (véase más adelante) para preparar un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano. El ADN sintético consiste en una secuencia nucleotídica en el extremo 3' de una región V del anticuerpo de animal no humano y una secuencia nucleotídica en el extremo 5' de una región C del anticuerpo humano y se preparan mediante un sintetizador de ADN, de manera que tiene sitios de enzimas de restricción apropiados en ambos extremos.

(4) Identificación de secuencias de CDR de anticuerpo de animal no humano

VH y VL que forman un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo consisten en 3 regiones determinantes de la complementaridad (CDR) que tienen una amplia variedad de secuencias que unen VH y VL a 4 regiones framework (marco) (denominadas en lo sucesivo "regiones FR") que tienen secuencias relativamente conservadas (Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico), US Dept. Health and Human Services, 1991). La secuencia de aminoácidos de las CDR respectivas (secuencia CDR) puede identificarse por comparación con las secuencias de aminoácidos de las regiones V de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).

(5) Construcción de ADNc que codifica para la región V del anticuerpo injertado con CDR humano

El ADNc que codifica para VH y VL de un anticuerpo injertado con CDR humano puede obtenerse tal como sigue:

En la primera etapa, para cada VH y VL, se selecciona la secuencia de aminoácidos de FR en una región V de un anticuerpo humano para la que ha de injertarse la CDR en una región V de un anticuerpo de animal no humano de interés. Puede utilizarse cualquier secuencia de aminoácidos de FR en las regiones V derivada de anticuerpos humanos como las secuencias de aminoácidos de FR en las regiones V de los anticuerpos humanos. Por ejemplo, pueden utilizarse las secuencias de aminoácidos de FR en las regiones V de anticuerpos humanos, registradas en Banco de Datos de Proteínas, y las secuencias de aminoácidos comunes a los subgrupos de FR en las regiones V de anticuerpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Con el fin de producir un anticuerpo injertado con CDR humano que tenga una actividad excelente, se desea una secuencia de aminoácidos que tenga alta homología con la secuencia de aminoácidos de una región V de un anticuerpo de animal no humano de interés. En la segunda etapa, una secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada de FR en una región V de un anticuerpo humano se liga a una secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de CDR en una región V de un anticuerpo de animal no humano y se diseña una secuencia de ADN que codifica para las secuencias de aminoácidos de VH y VL. Con el fin de obtener una secuencia de ADN diseñada para construir un gen de región variable del anticuerpo injertado a CDR, se diseñan varios ADN sintéticos para cada hebra, de manera que se cubra la secuencia completa de ADN. Utilizando ADN sintéticos, se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (denominada en lo sucesivo "PCR"). Para cada hebra, se diseñan preferiblemente 6 ADN sintéticos en vista de la eficacia de la reacción de la PCR y de las longitudes de ADN que pueden sintetizarse. Tras la reacción, se subclonan los fragmentos amplificados en vectores apropiados y se determinan sus secuencias nucleotídicas, obteniéndose así un plásmido que contiene ADNc que codifica para una secuencia de aminoácidos de una región V de cada hebra de un anticuerpo injertado con CDR humano de interés. Alternativamente, el ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos de una región V de cada hebra de un anticuerpo injertado con CDR humano de interés puede construirse sintetizando las secuencias completas de la hebra sentido y antisentido utilizando ADN sintético que consiste en aproximadamente 100 bases y se someten a hibridación y ligado.

(6) Modificación de la secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo injertado a CDR humano

Se sabe que si se prepara un anticuerpo injertado con CDR humano injertando simplemente sólo la CDR en una región V de un anticuerpo de animal no humano de interés entre los FR en una región V de un anticuerpo humano, su actividad es inferior a la del anticuerpo de animal no humano original (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)). Por tanto, entre las secuencias de aminoácidos de FR en una región V de un anticuerpo humano, se modifica un residuo de aminoácido que tome parte en la unión directa a un antígeno, un residuo de aminoácido que interaccione con un residuo de aminoácido en CDR, o un residuo de aminoácido que pueda tomar parte en el mantenimiento de la estructura estérica de un anticuerpo, para dar un residuo de aminoácido que se encuentra en el anticuerpo de animal no humano original, de manera que se aumente la actividad del anticuerpo injertado con CDR humano. Para la identificación eficaz del residuo de aminoácido, se construye la estructura estérica de un anticuerpo y se analiza mediante cristalografía de rayos X, modelización por ordenador, o similares. Sin embargo, todavía no se ha establecido ningún método para producir un anticuerpo injertado con CDR humano que pueda aplicarse a cualquiera de los anticuerpos y, por tanto, en la actualidad deben realizarse diversos intentos caso por caso.

La modificación de la secuencia de aminoácidos seleccionada de FR en una región V de un anticuerpo humano puede llevarse a cabo utilizando diversos cebadores para mutación por PCR descrita en 2 (5). Los fragmentos amplificados obtenidos mediante la PCR se subclonan en los vectores apropiados y se determinan sus secuencias nucleotídicas, obteniéndose así un vector que contiene ADNc en el que se ha introducido una mutación de interés (denominado en lo sucesivo "vector con sustitución de secuencia de aminoácidos").

Alternativamente, la modificación de una secuencia de aminoácidos en una región estrecha puede llevarse a cabo mediante métodos de mutagénesis por PCR utilizando cebadores para la mutación que consisten en 20-35 bases. Más específicamente, se sintetiza un cebador de mutación de sentido (en codón codificante) y un cebador de mutación de antisentido (en codón complementario) que consisten en 20-35 bases y que contienen secuencias de ADN que codifican para el residuo de aminoácido que ha de modificarse, y se utilizan para llevar a cabo PCR de 2 etapas utilizando como molde un plásmido que contiene ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos de una región V que ha de modificarse. Los fragmentos amplificados finalmente se subclonan en vectores apropiados y se determinan sus secuencias nucleotídicas, obteniéndose así un ADNc que contiene el vector con modificación en la secuencia de aminoácidos en el que se ha introducido una mutación de interés.

(7) Construcción de vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano

Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano insertando el ADNc que codifica para VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humano obtenido en 2 (5) y 2 (6) en una región aguas arriba del gen que codifica para CH y CL del anticuerpo humano en el vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en 2 (1). Por ejemplo, si se introducen sitios de reconocimiento para enzimas apropiadas en los extremos de los ADN sintéticos en 5' y 3' durante la PCR para la construcción de ADNc que codifica para las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humano, el ADNc puede insertarse en una región aguas arriba de un gen que codifica para una región C de un anticuerpo humano deseado, tal como se expresa en una forma apropiada.

(8) Expresión transitoria de anticuerpos humanizados y evaluación de sus actividades

Con el fin de evaluar eficazmente las actividades de una amplia variedad de anticuerpos humanizados, el vector de expresión del anticuerpo quimérico humano descrito en 2 (3) y el vector de expresión del anticuerpo injertado con CDR humano descrito en 2 (7), o sus vectores modificados, pueden transfectarse en células COS-7 (ATCC CRL1651) y pueden expresarse los anticuerpos humanizados transitoriamente (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pág. 283, 1991), seguido por la determinación de sus actividades.

Ejemplos del método para transfectar el vector de expresión en una célula COS-7 incluyen un método de DEAE-dextrano (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, págs. 283, 1991), un método de lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413 (1987) y similares.

Tras la transfección del vector, pueden determinarse las actividades de los anticuerpos humanizados en el sobrenadante del cultivo mediante enzimoinmunoanálisis (ELISA) descrito en 1 (5) y similares.

(9) Expresión estable de anticuerpos humanizados y evaluación de sus actividades

Los transformantes que producen un anticuerpo humanizado de manera estable pueden obtenerse transfectando en células huésped apropiadas el vector de expresión de anticuerpo quimérico humano descrito en 2 (3) y el vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano descrito en 2 (7).

Ejemplos del método para transfectar el vector de expresión en células huésped incluyen la electroporación (publicación denominada Kokai número 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)) y similares.

Puede utilizarse cualquier célula como célula huésped en la que va a transfectarse el vector de expresión de anticuerpo humanizado, siempre que puedan expresar un anticuerpo humanizado. Ejemplos son la célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), la célula P3x63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), las células CHO que son defectuosas en el gen de la dihidrofolato reductasa (denominado en lo sucesivo "gen DHFR" (Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980) y la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag20 de rata (ATCC CRL1662, denominada en lo sucesivo "célula YB2/0").

Tras la transfección del vector, los transformantes que expresan un anticuerpo humanizado de manera estable se seleccionan según el método descrito en la publicación denominada Kokai número 257891/90, utilizando un medio RPMI1640 que contiene G418 y FCS. El anticuerpo humanizado puede producirse y acumularse en un medio de cultivo cultivando los transformantes seleccionados en un medio. La actividad del anticuerpo humanizado en el medio de cultivo se determina por el método descrito en 1 (5) o similares. La producción del anticuerpo humanizado por los transformantes puede aumentarse por el método descrito en la publicación denominada Kokai número 257891/90, utilizando un sistema de amplificación del gen DHFR o similares.

El anticuerpo humanizado puede purificarse del sobrenadante de cultivo de los transformantes utilizando una columna de proteína A (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Capítulo 8, 1988). Puede utilizarse cualquier otro método convencional para la purificación de proteínas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede purificarse mediante una combinación de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración y similares. El peso molecular de la cadena H o la cadena L del anticuerpo humanizado purificado o la molécula de anticuerpo como un todo se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Nature, 227, 680, (1970)), Western blot (inmunotransferencia) (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Capítulo 12, 1988) y similares.

La reactividad del anticuerpo humanizado purificado y la actividad de inhibición del anticuerpo humanizado contra IL-5 pueden determinarse por el método descrito en 1 (5).

(10) Método de utilización del anticuerpo humanizado

El anticuerpo humanizado de la presente invención puede unirse específicamente a una cadena \alpha de IL-5R humana, inhibiendo así la actividad biológica de IL-5. Por tanto, se espera que el anticuerpo humanizado de la presente invención inhiba la función de los eosinófilos que están controlados en su diferenciación y crecimiento por la IL-5. En consecuencia, el anticuerpo humanizado de la presente invención será útil en el tratamiento de enfermedades en las que los eosinófilos se asocian con sus patogenias. Puesto que casi todas las partes del anticuerpo humanizado de la presente invención se derivan de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano, se espera, no sólo que muestre inmunogenicidad en el cuerpo humano, sino que también mantenga su efecto durante un largo periodo de tiempo. El anticuerpo humanizado de la presente invención puede utilizarse o bien solo o en combinación con al menos un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado se disuelve en solución salina fisiológica o en una disolución acuosa de glucosa, lactosa, manitol o similares para preparar una composición farmacéutica. Alternativamente, el anticuerpo humanizado se liofiliza mediante un método convencional y se añade cloruro de sodio para preparar una inyección de una forma en polvo. Si es necesario, la presente composición farmacéutica puede contener cualquier aditivo que sea bien conocido en el campo de las preparaciones farmacéuticas, tal como una sal farmacéuticamente aceptable y similares.

La presente composición farmacéutica puede administrarse a mamíferos incluyendo a humanos a una dosis de 0,1-20 mg/kg/día del anticuerpo humanizado, que puede variar dependiendo de la edad y de los estados del paciente y similares. La administración se realiza una vez al día (dosis única o administración continua), 1-3 veces a la semana o una vez cada 2-3 semanas por inyección intravenosa.

3. Producción de anticuerpo de cadena sencilla anti-IL-5R \alpha humana (1) Construcción del vector de expresión de anticuerpo de cadena sencilla

Puede construirse un vector para la expresión de un anticuerpo de cadena sencilla de un anticuerpo de animal no humano o un anticuerpo de cadena sencilla de un anticuerpo injertado con CDR humano, insertando en un vector de expresión de anticuerpo de cadena sencilla los ADNc que codifican para VH y VL de un anticuerpo de animal no humano o un anticuerpo injertado con CDR humano que se describe en 2 (2), 2 (5) y 2 (6). Puede utilizarse cualquier vector de expresión como vectores de expresión de anticuerpo de cadena sencilla, siempre que puedan incorporar y expresar los ADNc que codifican para VH y VL de un anticuerpo de animal no humano o un anticuerpo injertado con CDR humano. Ejemplos son pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981) y pSG1 \beta d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)). Puede seleccionarse un huésped para su uso en la expresión de un anticuerpo de cadena sencilla de entre E. coli, levadura y células animales y similares. En este caso, debe seleccionarse un vector de expresión que sea compatible con el huésped específico. El anticuerpo de cadena sencilla puede secretarse de la célula y transportarse a la región periplasmática o mantenerse dentro de la célula insertando un ADNc que codifica para un péptido señal apropiado en el vector de expresión.

Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo de cadena sencilla en el que se ha insertado ADNc que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla de interés insertando el ADNc que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla que consiste en VH-L-VL o VL-L-VH (en el que L es una secuencia de unión peptídica) en el vector de expresión seleccionado en una región aguas abajo de un promotor apropiado y un péptido señal.

El ADNc que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla puede obtenerse uniendo un ADNc que codifica para VH con un ADNc que codifica para VL a través de un ADN sintético que codifica para una secuencia de unión peptídica que tiene sitios de reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas en ambos extremos. Es importante optimizar el péptido de unión, de manera que su adición no interfiera con la unión de VH y VL a un antígeno. Por ejemplo, puede utilizarse la secuencia de unión descrita por Pantoliano et al. (Biochemistry, 30, 10117 (1991)) y sus versiones modificadas.

(2) Expresión de anticuerpo de cadena sencilla y evaluación de su actividad

Un transformante que produce un anticuerpo de cadena sencilla de interés puede obtenerse transfectando el vector de expresión de anticuerpo de cadena sencilla construido en 3 (1) en una célula huésped apropiada por electroporación (publicación denominada Kokai número 257891/90; Cytotechnology 3, 133 (1990)) o similares. Tras la transfección del vector de expresión, puede determinarse la actividad del anticuerpo de cadena sencilla en el sobrenadante de cultivo mediante el método descrito en 1 (5) o similares.

La recogida y purificación del anticuerpo de cadena sencilla de la presente invención puede llevarse a cabo mediante una combinación de técnicas conocidas. Por ejemplo, si el anticuerpo de cadena sencilla se excreta en un medio, puede concentrarse mediante ultrafiltración y su recogida y purificación pueden llevarse a cabo entonces mediante cromatografía de afinidad con el antígeno o cromatografía de intercambio iónico o filtración en gel. Si el anticuerpo de cadena sencilla se transporta a la región periplasmática de la célula huésped, puede concentrarse por ultrafiltración tras la aplicación de un choque osmótico y su recogida y purificación pueden llevarse a cabo entonces mediante cromatografía de afinidad con el antígeno o cromatografía de intercambio iónico o filtración en gel. Si el anticuerpo de cadena sencilla es insoluble y existe como un gránulo (es decir, cuerpo de inclusión), su recogida y purificación pueden llevarse a cabo mediante la lisis de la célula, centrifugación repetida y lavado para aislamiento del gránulo, solubilización con guanidina-HCl, una operación para devolver la estructura del anticuerpo de cadena sencilla a una estructura activa y la posterior purificación de una molécula activa.

La actividad del anticuerpo de cadena sencilla purificada puede determinarse por el método descrito en 1 (5) o similares.

(3) Método de utilización del anticuerpo de cadena sencilla

El anticuerpo de cadena sencilla de la presente invención puede unirse específicamente a una cadena \alpha de IL-5R humana e inhibir la actividad biológica de IL-5. Por tanto, se espera que el anticuerpo de cadena sencilla de la presente invención inhiba la función de los eosinófilos que están controlados en su diferenciación y crecimiento por la IL-5. En consecuencia, el anticuerpo de cadena sencilla de la presente invención será útil en el tratamiento de enfermedades en las que los eosinófilos se asocian con sus patogenias. El anticuerpo de cadena sencilla de la presente invención puede utilizarse o bien solo o en combinación con al menos un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el anticuerpo de cadena sencilla se disuelve en solución salina fisiológica o en una disolución acuosa de glucosa, lactosa, manitol o similares para preparar una composición farmacéutica. Alternativamente, el anticuerpo de cadena sencilla se liofiliza mediante un método convencional y se añade cloruro de sodio para preparar una inyección de una forma en polvo. Si es necesario, la presente composición farmacéutica puede contener cualquier aditivo que sea bien conocido en el campo de las preparaciones farmacéuticas, tal como una sal farmacéuticamente aceptable y similares.

La presente composición farmacéutica puede administrarse a mamíferos incluyendo a humanos a una dosis de 0,1-20 mg/kg/día del anticuerpo de cadena sencilla, lo que puede variar dependiendo de la edad y de los estados del paciente y similares. La administración se realiza una vez al día (dosis única o administración continua), 1-3 veces a la semana o una vez cada 2-3 semanas por inyección intravenosa.

4. Producción de anticuerpo estabilizado con disulfuro anti-IL-5R \alpha humana (1) Producción de anticuerpo estabilizado con disulfuro

Puede producirse un anticuerpo estabilizado con disulfuro mediante un procedimiento que comprende las etapas de proporcionar ADNc que codifica para VH y VL de un anticuerpo de animal no humano o ADNc que codifica para VH y VL de un anticuerpo injertado con CDR humano, modificar la secuencia de ADN que corresponde a un residuo de aminoácido en una posición apropiada en el ADNc respectivo con una secuencia de ADN correspondiente a un residuo de cisteína, expresar el ADNc modificado y purificar el péptido resultante y luego formar un puente disulfuro. La modificación del residuo de aminoácido en un residuo de cisteína puede llevarse a cabo mediante un método de mutagénesis utilizando PCR, tal como se ha descrito en 2 (5).

Puede construirse un vector de expresión de la cadena H de anticuerpo estabilizado con disulfuro y un vector de expresión de la cadena L de anticuerpo estabilizado con disulfuro insertando el ADNc resultante que codifica para VH modificada y VL modificada en vectores de expresión apropiados. Puede utilizarse cualquier vector de expresión como vector de expresión de anticuerpo estabilizado con disulfuro, siempre que pueda incorporar y expresar los ADNc que codifican para VH modificado y VL modificado. Por ejemplo, pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981) y pSG1 \beta d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)) y similares. Un huésped utilizado para expresar un vector de expresión de la cadena L de un anticuerpo estabilizado con disulfuro y un vector de expresión de la cadena H de anticuerpo estabilizado con disulfuro para la formación de un anticuerpo estabilizado con disulfuro puede seleccionarse de entre E. coli, levadura y células animales y similares. En este caso, debe seleccionarse un vector de expresión que sea compatible con el huésped específico. El anticuerpo estabilizado con disulfuro puede secretarse de la célula y transportarse a la región periplasmática o mantenerse dentro de la célula insertando un ADNc que codifica para un péptido señal apropiado en el vector de expresión.

(2) Expresión de anticuerpo estabilizado con disulfuro y evaluación de su actividad

Un transformante que produce una cadena H de anticuerpo estabilizado con disulfuro o una cadena L de anticuerpo estabilizado con disulfuro de interés puede obtenerse transfectando en una célula huésped el vector de expresión de la cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro o el vector de expresión de la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro que se construyeron en 4 (1) por electroporación (publicación denominada Kokai número 257891/90; Cytotechnology 3, 133 (1990)) o similares. Tras la introducción del vector de expresión, puede confirmarse la expresión de la cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro o de la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro en el sobrenadante de cultivo o similares mediante el método descrito en 1 (5).

La recogida y purificación de la cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro o de la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro puede llevarse a cabo mediante combinaciones de técnicas conocidas. Por ejemplo, si la cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro o la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro se excreta en un medio, pueden concentrarse mediante ultrafiltración y su recogida y purificación pueden llevarse a cabo entonces mediante varios tipos de cromatografía o filtración en gel. Si la cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro o la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro se transporta a la región periplasmática de la célula huésped, pueden concentrarse por ultrafiltración tras la aplicación de un choque osmótico a la célula y su recogida y purificación pueden llevarse a cabo entonces mediante varios tipos de cromatografía o filtración en gel. Si la cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro o la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro es insoluble y existe como un gránulo (es decir, cuerpo de inclusión), su recogida y purificación pueden llevarse a cabo mediante la lisis de las células, centrifugación repetida y lavado para aislamiento del gránulo, solubilización con guanidina-HCl y la posterior realización de varios tipos de cromatografía o filtración en gel.

La cadena H del anticuerpo estabilizado con disulfuro y la cadena L del anticuerpo estabilizado con disulfuro purificadas se mezclan y se someten a un procedimiento de nuevo plegamiento para obtener una estructura activa (Molecular Immunology, 32, 249 (1995)), formando así un puente disulfuro. Posteriormente, puede purificarse el anticuerpo estabilizado con disulfuro mediante cromatografía de afinidad con antígeno o cromatografía de intercambio iónico o filtración en gel. La actividad del anticuerpo estabilizado con disulfuro puede determinarse por el método descrito en 1 (5) o similares.

(3) Método de utilización del anticuerpo estabilizado con disulfuro

El anticuerpo estabilizado con disulfuro de la presente invención puede unirse específicamente a una cadena \alpha de IL-5R humana inhibiendo así la actividad biológica de IL-5. Por tanto, se espera que el anticuerpo estabilizado con disulfuro de la presente invención inhiba la función de los eosinófilos que están controlados en su diferenciación y crecimiento por la IL-5. En consecuencia, el anticuerpo estabilizado con disulfuro de la presente invención será útil en el tratamiento de enfermedades en las que los eosinófilos se asocian con sus patogenias. El anticuerpo estabilizado con disulfuro de la presente invención puede utilizarse o bien solo o en combinación con al menos un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el anticuerpo de cadena sencilla o el anticuerpo estabilizado con disulfuro se disuelve en solución salina fisiológica o en una disolución acuosa de glucosa, lactosa, manitol o similares para preparar una composición farmacéutica. Alternativamente, el anticuerpo estabilizado con disulfuro se liofiliza mediante un método convencional y se añade cloruro de sodio para preparar una inyección de una forma en polvo. Si es necesario, la presente composición farmacéutica puede contener cualquier aditivo que sea bien conocido en el campo de las preparaciones farmacéuticas, tal como una sal farmacéuticamente aceptable y similares.

La presente composición farmacéutica puede administrarse a mamíferos incluyendo a humanos a una dosis de 0,1-20 mg/kg/día del anticuerpo estabilizado con disulfuro, lo que puede variar dependiendo de la edad y de los estados del paciente y similares. La administración se realiza una vez al día (dosis única o administración continua), 1-3 veces a la semana o una vez cada 2-3 semanas por inyección intravenosa.

5. Método para la detección y la determinación de la cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana utilizando un anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana (1) Tinción inmunocítica utilizando el anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana

Cuando los inmunocitos son células suspendidas, se utilizan como tales en el siguiente tratamiento. Cuando los inmunocitos son células adherentes, se separan con tripsina en EDTA y después se utilizan en el siguiente tratamiento. Los inmunocitos se suspenden en un tampón de tinción inmunocítica (PBS que contiene 1% de BAS, 0,02% de EDTA y 0,05% de azida sódica) o similares y se administra en una cantidad de 1 x 10^{5} - 2 x 10^{6} células. El sobrenadante de cultivo del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana obtenido en 1 (4), el sobrenadante de cultivo del transformante de anticuerpo humanizado anti-IL-5R \alpha humana obtenido en 2 (9) o el anticuerpo purificado obtenido en 1 (6) o 2 (9), o el producto obtenido mediante el marcaje del anticuerpo purificado con una sustancia de marcaje apropiada (por ejemplo, biotina) mediante un método conocido (KOUSOKOUTAIHOU (Methods for Enzimes and Antibodies), publicado por Gakusai Kikau, 1985) y diluyendo el anticuerpo marcado con un tampón de tinción inmunocítica o un 10% de tampón de tinción de inmunocitos que contiene suero animal a una concentración de 0,1-50 \mug/ml se administra en una cantidad de 20-500 \mul y se hace reaccionar en hielo durante 30 minutos. Cuando el sobrenadante de cultivo del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-5R \alpha humana obtenido en 1 (4), el transformante de anticuerpo humanizado anti-IL-5R \alpha humana obtenido en 2 (9) o el anticuerpo purificado obtenido en 1 (6) o 2 (9) se han hecho reaccionar, las células se lavan con un tampón de tinción inmunocítica tras la finalización de la reacción y se administra un tampón de tinción inmunocítica que contiene aproximadamente 0,1-50 \mug/ml de un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón, anticuerpo anti-inmunoglobulina de rata o anticuerpo anti-inmunoglobulina humana, que se han marcado con un fluorocromo tal como FITC o ficoeritrina, en una cantidad de 50-500 \mul, seguido por la reacción en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Cuando se ha hecho reaccionar el anticuerpo monoclonal marcado con biotina, se administra estreptavidina marcada con fluorocromo, tal como FITC o ficoeritrina, en una cantidad de 50-500 \mul y la reacción se lleva a cabo en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Cuando se ha hecho reaccionar el anticuerpo monoclonal marcado con un fluorocromo tal como FITC o ficoeritrina, se administra un tampón de tinción inmunocítica que contiene aproximadamente 0,1-50 \mug/ml del anticuerpo monoclonal en una cantidad de 50-500 \mul y la reacción se lleva a cabo en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. En cada uno de estos casos, la mezcla de reacción se lava meticulosamente con un tampón de tinción inmunocítica tras la reacción y se somete a un análisis con un separador de células.

(2) Prueba para la inhibición del crecimiento de las células dependientes de IL-5 humana utilizando anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana

Con el fin de mostrar la actividad de inhibición biológica del anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana obtenido, se examina el efecto sobre el crecimiento de las células dependientes de IL-5 humana utilizando células dependientes de IL-5 humana. Ejemplos del método de evaluación incluyen la incorporación de timidina marcada con tritio en las células, métodos de desarrollo de color utilizando kits de recuento de células y similares. A continuación se explicará un método de desarrollo de color utilizado en la presente invención.

Se suspenden células CTLL-2 (h5R) (1 x 10^{4}) en un medio normal (50 \mul) y se administran en una placa de cultivo de 96 pocillos. A la placa se añaden 25 \mul de una disolución del anticuerpo purificado (0,01-50 \mug/ml) obtenido en 1 (6) o 2 (9) y un medio normal que contiene 0,4-40 ng/ml de IL-5 humana y la mezcla se cultiva en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24-72 horas. Posteriormente, se añade una disolución del kit de recuento de células a 10 \mul/pocillo y el cultivo continúa en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 4 horas. Tras la finalización del cultivo, se determina la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas de pocillos Emax (Molecular Device) y se calcula la actividad de inhibición del crecimiento de las células CTLL-2 (h5R) del anticuerpo respectivo.

(3) Supresión de supervivencia de eosinófilos humanos por el anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana

Se preparan fracciones de leucocitos polimorfonucleares humanos que contienen eosinófilos procedentes de sangre periférica humana con un medio de separación de corpúsculo comercialmente disponible, tal como Polimorphprep (Nikomed) o Percoll (Pharmacia). Las fracciones se suspenden en un medio normal y las células resultantes se administran en una placa de cultivo de 96, 48 ó 24 pocillos en una cantidad de 1 x 10^{6} - 1 x 10^{7} células/pocillo, seguido por la adición de IL-5 humana hasta una concentración final de 0,001-10 ng/ml. Se añade el sobrenadante de cultivo del hibridoma que produce anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana obtenido en 1 (4) o el sobrenadante de cultivo del transformante de anticuerpo humanizado anti-IL-5R \alpha humana obtenido en 2 (9) o el anticuerpo purificado obtenido en 1 (6) ó 2 (9) y la mezcla se cultiva en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 2 - 5 días. Tras la finalización del cultivo, se prepara una muestra de células de cada pocillo y se tiñe mediante el método de tinción May-Grünwald-Giemsa (SENSHOKUHOU NO SUBETE (Techniques for Staining, publicado por Ishiyaku Shuppan Cor., Ltd., 1988) o similar y se determina el porcentaje de eosinófilos. La ausencia o presencia de actividad del anticuerpo monoclonal en la supresión de la potenciación de la viabilidad de los eosinófilos humanos dependientes de IL-5 se confirma comparando el porcentaje de eosinófilos en ausencia de anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana con el que hay en presencia del anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana.

(4) Determinación de shIL-5R \alpha utilizando anticuerpo monoclonal

Se recubre una placa con 0,1-50 \mug/ml de anticuerpo purificado obtenido en 1 (6) ó 2 (9) como un anticuerpo primario. La placa recubierta se hace reaccionar con 0,1 - 10.000 ng/ml de shIL-5R \alpha purificada obtenida en 1 (1) o con una muestra tal como suero humano. La placa se lava meticulosamente y después se hace reaccionar con un anticuerpo secundario que es un anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana que reconoce un epítopo distinto al que reconoce el anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana que se selecciona para su uso como el anticuerpo primario a partir de los anticuerpos purificados obtenidos en 1 (6) ó 2 (9). El anticuerpo secundario se marcó con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente, un compuesto radioactivo o similar, antes de la reacción. Posteriormente, se lleva a cabo una reacción según la marca. Se construye la curva de calibración partiendo de la base de la reactividad con el shIL-5R purificado y se calcula la concentración de shIL-5R en la muestra.

(5) Detección de shIL-5R \alpha por Western blot (inmunotransferencia)

La shIL-5R \alpha purificada obtenida en 1 (1) se somete a electroforesis en SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) y después a inmunotransferencia en una membrana de difluoruro de polivinilideno (denominada en lo sucesivo "membrana de PVDF", Millipore). La membrana de PVDF se sumerge en PBS complementado con 1-10% de albúmina sérica bovina (BSA) y se deja reposar a 4ºC durante la noche para su bloqueo, seguido por lavado meticuloso con PBS que contiene el 0,05% de Tween. La membrana de PVDF se sumerge en el sobrenadante de cultivo del hibridoma obtenido en 1 (5) o en una disolución del anticuerpo purificado obtenido en 1 (6) a temperatura ambiente durante 2 horas y se lava meticulosamente con PBS que contiene el 0,05% de Tween. La membrana de PVDF se sumerge en una disolución de un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón o anticuerpo anti-inmunoglobulina de rata como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora y se lava meticulosamente con PBS que contiene el 0,05% de Tween. El anticuerpo secundario se marcó preliminarmente con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente, un compuesto radiactivo o similar. Tras la eliminación completamente de la disolución de lavado, se lleva a cabo una reacción según la marca en el anticuerpo secundario y se hace una comprobación para determinar la reactividad con una proteína que concuerda con el peso molecular de la shIL-5R \alpha purificada.

(6) Inmunoprecipitación de shIL-5R \alpha

Se diluye un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón o un anticuerpo anti-inmunoglobulina de rata 10-1000 veces con PBS u otro tampón. Las diluciones se administran en una placa de plástico ELISA de 96 pocillos a 50-200 \mul/pocillo y se dejan reposar a 4ºC durante la noche o a temperatura ambiente durante al menos 2 horas, por lo que se adsorben en la placa. La placa se lava con PBS. Se administra PBS que contiene el 1-10% de BSA y similar en la placa a 300 \mul/pocillo y se deja reposar a 4ºC durante la noche o a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para lograr el bloqueo. La placa se lava con PBS. Se añade el sobrenadante de cultivo del hibridoma obtenido en 1 (5) o una disolución del anticuerpo purificado obtenido en 1 (6) (0,01-50 \mug/ml) a 50-200 \mul/pocillo y se deja estar a 4ºC durante la noche, adsorbiéndose así el anticuerpo en la placa. Tras lavar la placa, la shIL-5R \alpha obtenida en 1 (1) se diluye con PBS o similar que contiene el 1% de BSA hasta una concentración de 0,1-100 \mug/ml y las diluciones se administran a 50-200 \mul/pocillo, seguido por reacción a 4ºC durante la noche. Tras lavar la placa con PBS o similar que contiene el 0,05% de Tween, se administra un tampón de muestra 1X - 5X para SDS-PAGE a 50-200 \mul/pocillo y se agita a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Tras la dilución opcional con PBS, se añade la disolución a cada carril en una cantidad de 5-25 \mul/pocillo, y se somete a SDS-PAGE, seguido por inmunotransferencia en una membrana de PVDF o similar mediante un método convencional. La membrana de PVDF se somete a Western blot tal como se describe en 5 (5) detectando así shIL-5R \alpha.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAGE210.

La figura 2 muestra el mapa de restricción del plásmido pCAGGS-h5R.25.

La figura 3 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAI234.

La figura 4 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAI230.

La figura 5 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAI282.

La figura 6 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pAI283 y pAI285.

La figura 7 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pAI284 y pAI289.

La figura 8 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pAI294 y pAI295.

La figura 9 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pAI299 y pAI301.

La figura 10 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAI292.

La figura 11 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAI297.

La figura 12 muestra las etapas para la construcción del plásmido pMKexI.

La figura 13 muestra las etapas para la construcción del plásmido pAI263.

La figura 14 muestra las reactividades de unión del anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana KM1257 y KM2259 con una proteína de fusión de la región constante de la inmunoglobulina humana con IL-5R \alpha humana en un enzimoinmunoanálisis.

La figura 15 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSA.

La figura 16 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSAE.

La figura 17 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSH-S.

La figura 18 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSK-H.

La figura 19 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pBSH-SA y pBSK-HA.

La figura 20 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pBSH-SAE y pBSK-HAE.

La figura 21 muestra las etapas para la construcción de los plásmidos pBSH-SAEE y pBSK-HAEE.

La figura 22 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSK-HAEESa1.

La figura 23 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSX-S.

La figura 24 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSX-SA.

La figura 25 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSSC.

La figura 26 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSMo.

La figura 27 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSMoS.

La figura 28 muestra las etapas para la construcción del plásmido pChilgLA1S.

La figura 29 muestra las etapas para la construcción del plásmido pMohC\kappa.

La figura 30 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSMoSaI.

La figura 31 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBSMoSaIS.

La figura 32 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBShC\gamma1.

La figura 33 muestra las etapas para la construcción del plásmido pMohC\gamma1.

La figura 34 muestra las etapas para la construcción del plásmido pMo\gamma1SP.

La figura 35 muestra las etapas para la construcción del plásmido pMo\kappa\gamma1SP.

La figura 36 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKANTEX93.

La figura 37 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKANTEX1259H.

La figura 38 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKANTEX1259.

La figura 39 muestra los patrones de electroforesis en SDS-PAGE (en gel con gradiente del 4-15%) del anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM1399. La izquierda de la figura muestra el patrón de electroforesis en condiciones no reductoras y la derecha de la figura en condiciones reductoras. En el lado izquierdo, M es un carril de marcadores de alto peso molecular y 1 es un carril de KM1399. En el lado derecho, M es un carril de marcadores de bajo peso molecular y 1 es un carril de KM1399.

La figura 40 muestra las actividades de inhibición del anticuerpo de ratón anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM1259, y el anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM1399, frente a la unión de IL-5 humana a una cadena \alpha de IL-5 humana. El eje vertical del gráfico representa la actividad de inhibición y el eje horizontal, la concentración de anticuerpo. \bullet se refiere a la actividad de KM1259 y \medcirc a la actividad de KM1399.

La figura 41 muestra las etapas para la construcción del plásmido pT1259.

La figura 42 muestra los resultados de la evaluación de la actividad partiendo de la base de la expresión transitoria de un anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana utilizando el plásmido PT1259. El eje vertical del gráfico representa la actividad de inhibición frente a la unión de la IL-5 humana a la cadena \alpha de IL-5R humana y el eje horizontal representa el factor de dilución para el sobrenadante de cultivo de expresión transitoria.

La figura 43 muestra las etapas para la construcción del plásmido phKM1259HV0.

La figura 44 muestra las etapas para la construcción del plásmido phKM1259LV0.

La figura 45 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKANTEX1259HV0.

La figura 46 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKANTEX1259HV0LV0.

La figura 47 muestra los patrones de electroforesis en SDS-PAGE (en gel con gradiente del 4-15%) del anticuerpo injertado con CDR humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM8397. La izquierda de la figura muestra el patrón de electroforesis en condiciones no reductoras y la derecha de la figura en condiciones reductoras. M es un carril de marcadores de peso molecular y 1 es un carril de KM8397.

La figura 48 muestra las actividades del anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM1399, y el anticuerpo injertado con CDR humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM8397, en la unión a una cadena \alpha de IL-5 humana. El eje vertical del gráfico representa la actividad de unión a la cadena \alpha de IL-5 humana y el eje horizontal, una concentración de anticuerpo. \bullet se refiere a la actividad de KM1399 y \medcirc a la actividad de KM8397.

La figura 49 muestra los resultados de la evaluación de las actividades de diversas versiones modificadas de anticuerpos injertados con CDR humanos anti-cadena \alpha de IL-5R humana en los sobrenadantes de cultivo de expresión transitoria en la inhibición de la unión de la IL-5 humana a la cadena \alpha de IL-5 humana. El eje vertical del gráfico representa la actividad inhibitoria y el eje horizontal indica los nombres de las muestras. La actividad inhibitoria se expresa en términos relativos, tomándose la actividad del anticuerpo quimérico KM1999 como 100.

La figura 50 muestra las actividades de diversas versiones modificadas de anticuerpos injertados con CDR humanos anti-cadena \alpha de IL-5R humana en la unión a una cadena \alpha de IL-5. El eje vertical de cada gráfica representa la actividad en la unión a la cadena \alpha de IL-5 humana y el eje horizontal, la concentración de anticuerpo. En el gráfico superior, \bullet se refiere a la actividad de KM1399; \medcirc, HV.0LV.0; \blacksquare, HV.2LV.0; \boxempty, HV.0LV.3; y \blacktriangle, HV.3LV.3.
En el otro gráfico, \bullet se refiere a la actividad de KM1399; \medcirc, HV.0LV.0; \blacksquare, HV.3LV.0; \boxempty, HV.0LV.4; y \blacktriangle, HV.1LV.4, \Delta, HV.2LV,4; y X, HV,3LV.4.

La figura 51 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBShC\gamma4.

La figura 52 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKANTEX1259\gamma4 y pKANTEX1259HV3LV
0\gamma4.

La figura 53 muestra patrones de electroforesis en SDS-PAGE (en gel con gradiente del 4-15%) del anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM7399, de una subclase de IgG4 de anticuerpos humanos y el anticuerpo injertado con CDR humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM9399 de una subclase de IgG4 de anticuerpos humanos. La izquierda de la figura muestra el patrón de electroforesis en condiciones no reductoras y la derecha de la figura en condiciones reductoras. En el lado izquierdo, M es un carril de marcadores de alto peso molecular, 1 es un carril de KM9399 y 2 es un carril de KM7399. En el lado derecho, M es un carril de marcadores de bajo peso molecular, 1 es un carril de KM9399 y 2 es un carril de KM7399.

La figura 54 muestra la actividad del anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM1399 de una subclase IgG1 de anticuerpos humanos, del anticuerpo quimérico humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM7399, de una subclase IgG4 de anticuerpos humanos, el anticuerpo injertado con CDR humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM8399, de una subclase IgG1 de anticuerpos humanos y el anticuerpo injertado con CDR humano anti-cadena \alpha de IL-5R humana, KM9399 de una subclase de IgG4 de anticuerpos humanos, en la unión a una cadena \alpha de IL-5 humana. El eje vertical del gráfico representa la actividad de unión a la cadena \alpha de IL-5 humana y el eje horizontal, una concentración de anticuerpo. \medcirc se refiere a la actividad de KM1399; \bullet, KM7399; \boxempty, KM8399; y \blacksquare, KM9399.

La figura 55 muestra los resultados del análisis de flujo citométrico de las reactividades de los anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 y KM9399 con una célula CTLL-2 transfectada con el gen de IL-5R humana.

La figura 56 muestra los resultados del examen de la acción inhibitoria de los anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 y KM9399 contra el crecimiento dependiente de la IL-5 de una célula CTLL-2 transfectada con el gen de IL-5R humana.

La figura 57 muestra los resultados del análisis de flujo citométrico de la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana KM1259 con los eosinófilos humanos.

La figura 58 muestra los resultados del examen de la acción inhibitoria de los anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 y KM9399 para la supervivencia de los eosinófilos humanos.

La figura 59 muestra los resultados de la evaluación de un sistema de determinación cuantitativa de la IL-5R \alpha humana soluble utilizando el anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana, KM1257, y KM1257 marcado con biotina.

La figura 60 muestra los resultados de la detección de shIL-5R \alpha por Western Blot utilizando los anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana KM1257, KM1259 y KM1486.

La figura 61 muestra los resultados de la inmunoprecipitación de shIL-5R \alpha utilizando los anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana KM1257, KM1259 y KM1486.

Mejor modo de llevar a cabo la invención Ejemplo 1 1. Preparación de antígenos (1) Construcción de vector de expresión para célula animal, pAGE210

El vector de expresión para célula animal, pAGE210, se construyó tal como se describe más adelante utilizando vectores de expresión para célula animal, pAGE207 (publicación denominada Kokai número 46841/94) y pAGE148 (publicación denominada Kokai número 205694/94).

Se disolvieron 3 \mug del plásmido pAGE207 o pAGE148 en 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de ditiotreitol (denominado en lo sucesivo "DTT"). A la mezcla resultante se añadieron 10 unidades de cada una de ClaI y KpnI (ambas fabricadas por Takara Shuzo; a menos que se indique lo contrario, las enzimas de restricción utilizadas más adelante en el presente documento son las fabricadas por Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron de pAGE207 aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de ADN de 4,7 kb que contenía el promotor temprano y el potenciador de SV40 (denominado en lo sucesivo "P_{SE}"), un gen de resistencia a higromicina y un gen de resistencia a ampicilina y se recuperaron de pAGE148 aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de ADN de 4,3 kb que contenía un gen de la dihidrofolato reductasa (denominada en lo sucesivo "dhfr").

El fragmento ClaI-KpnI obtenido de pAGE207 (50 ng) y el fragmento KpnI-ClaI obtenido de pAGE148 (50 ng) se disolvieron en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4 [un tampón que contiene 66 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de DTT y 0,1 mM de adenosina trifosfato (denominada en lo sucesivo "ATP"]. A la mezcla resultante se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4 (Takara Shuzo) y se realizó el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante preparado se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAG210 mostrado en la figura 1.

(2) Obtención de ADNc de shIL-5R \alpha en un casete para la construcción de un vector de expresión de shIL-5R \alpha

Con el fin de construir un vector de expresión de shIL-5R \alpha, se llevó a cabo la modificación de la región que no se traduce de 5' y 3' del ADNc de shIL-5R \alpha y la introducción de una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción utilizando el método de la PCR [Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning, 14.2, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] según los procedimientos descritos más adelante.

El plásmido pCAGGS-h5R.25 se obtiene insertando ADNc de shIL-5R \alpha en el plásmido conocido pGAGGS [Gene, 108, 193 (1991)], tal como se muestra en la figura 2 [J. Exp. Med., 175, 341 (1992)]. Se añadieron 3 \mug del plásmido pCAGGS-h5R.25 a 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT. Después, se añadieron a la misma 10 unidades de EcoRI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de 1,4 kb que contenía ADNc de shIL-5R \alpha.

A continuación, 1 ng del fragmento de ADN obtenido anteriormente se disolvió en 50 \mul de tampón de PCR [un tampón que contiene 50 mM de cloruro de potasio, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM de cloruro de magnesio, 0,2 mM de desoxiadenosina trifosfato (denominada en lo sucesivo "dATP"), 0,2 mM de desoxiguanosina trifosfato (denominada en lo sucesivo "dGTP"), 0,2 mM de desoxicitosina trifosfato (denominada en lo sucesivo "dCTP") y 0,2 mM de desoxitimidina trifosfato (denominada en lo sucesivo "dTTP")]. A la mezcla resultante se añadieron 50 pmoles de cada uno de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 1 y un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 2 [ambos sintetizados con un sintetizador automático de ADN; Modelo 380A (Applied Biosystems Co., Ltd.)] y se añadieron 1,6 unidades de ADN polimerasa Vent (New England BioLabs, Inc.) y se realizó PCR a través de 30 ciclos en una serie de condiciones de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos utilizando un cliclador térmico de ADN de Perkin Elmer (esto también se utilizó para las otras reacciones de la PCR). Tras la finalización de la reacción, se añadieron 2 \mul de un tampón que contiene 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de magnesio, 500 mM de cloruro de sodio y 10 mM de DTT, 8 \mul de agua destilada y 10 unidades de HindIII a 10 \mul de la mezcla de reacción y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después, se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol [Maniatis et al (eds.), Molecular Cloning, E.10, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] y se volvieron a disolver en 20 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT. A la mezcla resultante, se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de 1,0 kb.

En una etapa separada, se disolvieron 3 \mug del plásmido pUC19 (Pharmacia Biotech) en 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT. A la mezcla resultante se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento HindIII/BamHI de pUC19.

Se disolvieron 100 ng del fragmento HindIII/BamHI de pUC19 y 50 ng del fragmento de ADNc de shIL-5R \alpha en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después, se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pA1234 mostrado en la figura 3.

(3) Construcción de un vector de expresión de IL-5R \alpha humana soluble

El vector de expresión de shIL-5R \alpha, pAI230, se construyó tal como se describe más adelante ligando el fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 obtenido en la subsección (1) del ejemplo 1 con el fragmento HindIII-BamHI que contiene el ADNc de shIL-5R \alpha de pAI234 obtenido en la subsección (2) del ejemplo 1.

En resumen, se añadieron 3 \mug de pAGE210 a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después, se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de ADN de 9,0 kb.

Se añadieron 3 \mug de pAI234 a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después, se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de 1,0 kb.

Posteriormente, se disolvieron 300 ng del fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 y 50 ng del fragmento HindIII-BamHI de pAI234 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, a los que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después, se realizó el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI230 mostrado en la figura 4.

(4) Modificación de la secuencia señal

Con el fin de producir shIL-5R \alpha eficazmente en células animales, se modificó la secuencia señal del ADNc que codifica para shIL-5R \alpha según los procedimientos descritos más adelante introduciendo una secuencia de reconocimiento de EcoRV en el ADNc en el extremo 3' de la secuencia señal y sustituyendo posteriormente la secuencia señal original con una secuencia señal de una hormona de crecimiento humana [Science, 205, 602 (1979)] o un anticuerpo quimérico anti-gangliósido GD3, KM871, (publicación denominada Kokai número Hei 5-304989) utilizando ADN sintéticos.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pAI234 obtenido en la subsección (2) del ejemplo 1 a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de 1,0 kb.

En una etapa separada, se añadieron 3 \mug del plásmido pUC19 a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HincII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después, se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se recuperaron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento HincII de pUC19.

Aproximadamente 1 ng del fragmento de ADN obtenido anteriormente se disolvió en 50 \mul de tampón de PCR, a los que se añadieron 50 pmoles de cada uno de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 2 y un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 3 y se añadieron 1,6 unidades de ADN polimerasa Vent. Se llevó a cabo la PCR a través de 30 ciclos en una serie de condiciones de 94ºC durante 1 minuto, 48ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento ADNc de 0,5 \mug de aproximadamente 0,9 kb que codifica para una parte de hIL-5R \alpha. Se disolvieron 50 ng de este ADN y 100 ng del fragmento HincII de pUC19 en 20 \mul del tampón ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI280 mostrado en la figura 5. Se añadieron 3 \mug del plásmido pAI280 así obtenido a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de XbaI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después, se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,8 \mug de un fragmento de ADN de 2,8 kb.

En una etapa separada, se añadieron 3 \mug del plásmido pAI234 en 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de XbaI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento de ADN de 0,8 kb.

Posteriormente, se disolvieron 200 ng de XbaI/BamHI de pAI280 y 50 ng de XbaI-BamHI de pAI234 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI282 mostrado en la figura 5. Se añadieron 3 \mug del plásmido pAI282 a 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de EcoRV y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de 0,9 kb.

Se disolvió 1 \mug de cada uno de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 4 y un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 5 en 10 \mul de agua destilada. La mezcla resultante se calentó a 95ºC durante 5 minutos y después se enfrío hasta temperatura ambiente durante 30 minutos para hibridación. Se disolvieron 100 ng del fragmento HindIII-BamHI de pUC19 obtenido en la subsección (2) del ejemplo 1, 50 ng del fragmento EcoRV-BamHI de pAI282 y 50 ng de los ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº 4 y 5 que habían hibridado tal como se describió anteriormente, en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, a los que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después, se realizó el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI283 mostrado en la figura 6.

Se disolvió 1 \mug de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 6 y un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 9 en 10 \mul de agua destilada. La mezcla resultante se calentó a 95ºC durante 5 minutos y después se enfrío hasta temperatura ambiente durante 30 minutos para hibridación. A esta mezcla de reacción se añadieron 2,5 \mul de un tampón que contiene 500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de DTT y 1 mM de EDTA, 2,5 \mul de solución de ATP 10 mM, 9 \mul de agua destilada y 5 unidades de polinucleótido cinasa de T4 (Takara Shuzo), y se llevó a cabo fosforilación a 37ºC durante 2 horas. De manera separada, se disolvió 1 \mug de cada uno de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 7 y un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 8 en 10 \mul de agua destilada. La mezcla resultante se calentó a 95ºC durante 5 minutos y después se enfrío hasta temperatura ambiente durante 30 minutos para hibridación.

Se disolvieron 100 ng del fragmento HindIII-BamHI de pUC19, 50 ng del fragmento EcoRV-BamHI de pAI282 y 50 ng de cada uno de los ADN sintéticos preparados anteriormente, en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, a los que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después, se realizó el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI285 mostrado en la figura 6.

(5) Construcción de vectores de expresión de shIL-5R \alpha modificados de secuencia señal

Los vectores de expresión de IL-5R \alpha humana soluble, pAI284 y pAI289, se construyeron tal como se describe más adelante ligando el fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 obtenido en la subsección (1) del ejemplo 1 con el fragmento HindIII-BamHI que contiene el ADNc de IL-5R \alpha humana soluble de pAI283 o pAI285 obtenidos en la subsección (4) del ejemplo 1.

En resumen, se añadieron 3 \mug de cada uno de pAI283 y pAI285, por separado, a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después, se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de 1,0 kb para cada plásmido utilizado.

Se disolvieron 300 ng del fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 y 50 ng del fragmento HindIII-BamHI de pAI283 y pAI285 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, a los que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después, se realizó el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así los plásmidos pAI284 y pAI289 mostrados en la figura 7.

(6) Preparación de una proteína de fusión compuesta de IL-5R \alpha humana y la región constante de la inmunoglobulina humana

Se preparó una proteína de fusión en la que la región extracelular de IL-5R \alpha humana se unió a la región constante de una inmunoglobulina humana (denominada en lo sucesivo "Fc") a través de una secuencia de unión que tiene una secuencia de aminoácidos de (Gly-Ser-Gly)_{4} (esta proteína de fusión se denomina en lo sucesivo "hIL-5R \alpha-Fc"), según los procedimientos descritos más adelante.

Como ADNc que codifica para la región constante de una inmunoglobulina humana, se utilizó la parte del vector de expresión de la cadena H del anticuerpo quimérico humano, pChiIgHB2 (publicación denominada Kokai número Hei 5-304989) que codifica para la región constante de la IgG1 humana. En primer lugar, se disolvió aproximadamente 1 ng de pChiIgHB2 en 50 \mul de tampón de PCR. A esta disolución se añadieron 50 pmol de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 10 y un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 11 y 1,6 unidades de la ADN polimerasa Vent. A continuación, se llevó a cabo la PCR a través de 30 ciclos en una serie de condiciones de 94ºC durante 1 minuto, 48ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos. Tras la finalización de la reacción, se añadieron 2,5 \mul de un tampón que contiene 200 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de cloruro de magnesio, 1000 mM de cloruro de potasio y 10 mM, 2,5 \mul de agua destilada y 10 unidades de BamHI a 20 \mul de la mezcla de reacción y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras la finalización de la reacción, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de ADN de 0,7 kb que contenía un ADNc que codifica para la región constante de la IgG1 humana.

Aproximadamente 1 ng de pAI283 obtenido en la subsección (4) del ejemplo 1 se disolvió en 50 \mul de tampón de PCR, a los que se añadieron 50 pmoles de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 12 y 50 pmoles de un ADN sintético que tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID Nº: 13 y se añadieron 1,6 unidades de ADN polimerasa Vent. A continuación, se llevó a cabo la PCR a través de 30 ciclos en una serie de condiciones de 94ºC durante 1 minuto, 48ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos. Tras la finalización de la reacción, se añadieron 2,5 \mul de un tampón que contiene 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de magnesio, 500 mM de cloruro de sodio y 10 mM de DTT, 2,5 \mul de agua destilada y 10 unidades de BamHIII a 20 \mul de la mezcla de reacción y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras la finalización de la reacción, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa. Después, se recuperaron aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de ADN de 1,0 kb que contenía un ADNc que codifica para la región extracelular de la hIL-5R \alpha.

Se disolvieron 50 ng del fragmento de ADN de 0,7 kb que contenía el ADNc que codifica para la región constante de la IgG1 humana, 50 ng del fragmento de ADN que contenía el ADNc que codifica para la región extracelular de la hIL-5R \alpha y 100 ng del fragmento HindIII-BamHI de pUC19 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI294 mostrado en la figura 8.

En una etapa separada, se llevó a cabo la reacción de PCR en condiciones similares a las descritas anteriormente utilizando pAI285 obtenido en la subsección (4) del ejemplo 1 como molde y utilizando también ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 13 y 14, como cebadores. Tras la finalización de la reacción, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente, se recuperaron aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de ADN de 1,0 kb que contenía el ADNc que codifica para la región extracelular de IL-5R \alpha humana. Se disolvieron 50 ng del fragmento de ADN obtenido, 50 ng del fragmento de ADN de 0,7 kb que contenía el ADNc que codifica para la región constante de la IgG1 humana y 100 ng del fragmento HindIII-BamHI de pUC19 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después, se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI295 mostrado en la figura 8.

(7) Construcción de un vector de expresión de proteína de fusión

Se construyó un vector de expresión de hIL-5R \alpha-Fc, pAI299, tal como se describe más adelante ligando el fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 obtenido en la subsección (1) del ejemplo 1 al fragmento HindIII-BamHI de pAI294 obtenido en la subsección (6) del ejemplo 1 que contenía el ADNc que codifica para hIL-5R \alpha-Fc.

En resumen, se añadieron 3 \mug de plásmido pAI294 a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT. A la mezcla resultante se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,4 \mug de un fragmento de ADN de 1,7 kb que contenía un ADNc que codifica para una proteína de fusión compuesta de IL-5R \alpha humana y la región constante de la inmunoglobulina humana.

Se disolvieron 100 ng del fragmento HindIII/BamHI de pAGE210 y 50 ng del fragmento HindIII-BamHI de pAI294 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pAI299 mostrado en la figura 9.

Además, se construyó un vector de expresión de hIL-5R \alpha-Fc, pAI301, de manera similar, ligando el fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 al fragmento HindIII-BamHI de pAI295 obtenido en la subsección (6) del ejemplo 1 que contenía el ADNc que codifica para hIL-5R \alpha-Fc.

(8) Preparación de un virus recombinante para la expresión de shIL-5R \alpha en células de insecto

Para la producción de una proteína en células de insecto, se prepara un virus recombinante que inserta un gen de interés. La preparación de tal virus se lleva a cabo mediante un procedimiento en el que se incorpora un ADNc que codifica para un gen de interés en un plásmido especial denominado "vector de transferencia" y un procedimiento posterior en el que la cepa salvaje de un virus y el vector de transferencia se cotransfectan en las células de insecto para obtener un virus recombinante por recombinación homóloga. Los procedimientos descritos anteriormente se realizaron utilizando el kit BaculoGold Starter (Cat. Nº PM-21001K) fabricado por Pharmingen según el manual del fabricante.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pAI285 obtenido en la subsección (4) del ejemplo 1 o de PAI294 obtenido en la subsección (6) en el ejemplo 1, a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de HindIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se volvieron a disolver en 20 \mul de un tampón de ADN polimerasa I [tampón que contiene 5 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de sulfato de magnesio, 0,01 mM de DTT, 5 \mug/ml de albúmina sérica bovina, 0,08 mM de dATP, 0,08 mM de dGTP, 0,08 mM de dCTP y 0,08 mM de dTTP]. A la mezcla resultante se añadieron 5 unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 22ºC durante 30 minutos, por lo que los extremos 5' cohesivos generados por la digestión con HindIII se volvieron extremos romos. Además, la mezcla de reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. Al precipitado se añadieron 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT y 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras someter la mezcla de reacción a electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug del fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb que contenía el ADNc que codifica para shIL-5R \alpha y aproximadamente 0,3 \mug del fragmento de ADN de 1,7 kb que contiene el ADNc que codifica para la proteína de fusión compuesta de IL-5 \alpha humana y la región constante de la inmunoglobulina humana.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pVL1393 que contiene el kit BaculoGold Starter (Pharmigen) a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de EcoRI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvieron en 20 \mul del tampón de ADN polimerasa I al que se añadieron 5 unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli y se hicieron reaccionar a 22ºC durante 30 minutos, por lo que los extremos 5' cohesivos generados por la digestión con EcoRI se volvieron extremos romos. Además, la mezcla de reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. Al precipitado se añadieron 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT y 10 unidades de BgIII y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron aproximadamente 0,9 \mug de un fragmento de ADN de aproximadamente 9,6 kb.

A continuación, se disolvieron 200 ng del fragmento EcoRI (extremo romo)-BgIII así obtenido de pVL1939 y 50 ng del fragmento HindIII (extremo romo)-BamHI de pAI285 o pAI294 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así los plásmidos pAI292 y pAI297 mostrados en las figuras 10 y 11, respectivamente.

La preparación posterior de un virus recombinante se llevó a cabo tal como se describe más adelante, transfectando en una célula de insecto Sf9 (obtenida de Pharmigen), cultivada en medio de insecto TMN-FH (Pharmigen), un ADN de baculovirus lineal (ADN de baculovirus BaculoGold; Pharmigen) y se preparó ADN del vector de transferencia por el método de la lipofectina [TANPAKUSHITSU, KAKUSAN, KOHSO (Protein, Nucleic Acid, Enzyme), 37, 2701 (1992).

En resumen, se disolvió 1 \mug de pAI292 o pAI297 y 20 ng del ADN lineal de baculovirus en 12 \mul de agua destilada, a los que se añadieron una mezcla de 6 \mul de lipofectina y 6 \mul de agua destilada y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. En una etapa separada, se suspendieron 1 x 10^{5} células Sf9 en 2 ml de medio Sf900-II (Gibco) y se colocaron en una placa de plástico de cultivo celular lineal de 35 mm de diámetro. A esta placa se añadió un volumen total de la mezcla descrita anteriormente de ADN de plásmido, ADN lineal de baculovirus y lipofectina, y las células se cultivaron a 27ºC durante 3 días. A continuación, se tomó 1 ml del sobrenadante de cultivo que contenía un virus recombinante. Se añadió 1 ml de medio Sf900-II fresco a la placa y las células se cultivaron a 27ºC durante otros 3 días. Después se obtuvieron 1,5 ml adicionales del sobrenadante de cultivo que contenían un virus recombinante.

Posteriormente, el virus recombinante así obtenido se propagó con el objeto de utilizarlo en la expresión de proteínas, según los procedimientos descritos más adelante.

En resumen, se suspendieron 2 x 10^{7} células Sf9 en 10 ml de medio Sf900-II, se colocaron en un matraz de 175 cm^{2} (Greiner) y se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir que las células se adhirieran al matraz. Después, se extrajo el sobrenadante y se añadieron al matraz 15 ml de medio de insecto TMN-FH fresco y 1 ml del sobrenadante de cultivo obtenido anteriormente que contenía el virus recombinante. A continuación, las células se cultivaron a 27ºC durante 3 días. Después del cultivo, se centrifugó el sobrenadante a 1.500 x g durante 10 minutos para eliminar las células. De esta manera, se obtuvo una disolución viral que va a utilizarse para la expresión de proteínas.

Con respecto a la disolución así obtenida del virus recombinante, se calculó el título viral mediante el método descrito anteriormente (Manual del kit BaculoGold Starter; Pharmigen). Se suspendieron algunas (6 x 10^{6}) células Sf9 en 4 ml de medio Sf900-II, se colocaron en una placa de cultivo celular de plástico de 60 mm de diámetro y se dejaron a temperatura ambiente durante una hora para permitir que las células se adhirieran a la placa. Tras eliminar el sobrenadante, se añadieron a la placa 400 \mul de un medio Sf900-II fresco y la disolución de virus recombinante descrita anteriormente diluida 10.000 veces con medio Sf900-II y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, se extrajo el medio y se vertieron en la placa 5 ml de un medio que contiene 1% de agarosa de punto de fusión bajo (Agarplaque Agarose; Pharmigen) (un medio que se puede obtener mezclando 1 ml de solución acuosa esterilizada de Agarplaqueplus Agarose al 5% y 4 ml de medio de insecto TMN-FH y manteniendo la mezcla a 42ºC). Tras dejar la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos, se envolvió la placa con cinta de vinilo para evitar la sequedad. Después, se colocó la placa en un recipiente de plástico hermético y las células se cultivaron a 27ºC durante 6 días. Tras añadir 1 ml de PBS que contiene 0,01% de Rojo Neutro a la placa y de cultivar las células un día adicional, se contó el número de placas formadas. A partir de las operaciones descritas anteriormente, se encontró que cada disolución de virus recombinante contenía aproximadamente 1 x 10^{7} unidades formadoras de placa (UFP)/ml de virus.

(9) Expresión de shIL-5R \alpha o hIL-5R \alpha-Fc en células animales

La introducción de un plásmido en células animales se llevó a cabo según el método de Miyaji et al., utilizando electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].

En resumen, se transfectaron 4 \mug de pAI289 obtenido en la subsección (5) del ejemplo 1 o pAI301 obtenido en la subsección (7) del ejemplo 1, en 4 x 10^{6} células CHO deficientes en el gen dhfr [Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980)], que después se suspendieron en 40 ml de RPMI1640-FCS (10) [medio RPMI1640 que contiene el 10% de FCS, 1/40 volumen de 7,5% de NaHCO_{3}, 3% de disolución de L-glutamina 200 mM (Gibco) y 0,5% de disolución de penicilina / estreptomicina (Gibco; que contiene 5000 unidades/ml de penicilina y 5000 \mug/ml de estreptomicina); fabricado por Nissui Pharmaceuticals] y se administraron en una placa de microtitulación de 96 pocillos (200 \mul/pocillo). Después de que las células se cultivaran en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 24 horas, se añadió higromicina (Gibco) para dar una concentración de 0,5 mg/ml. Después, las células se cultivaron durante 1-2 semanas adicionales. Las células se recuperaron de aquellos pocillos que llegaron a ser confluentes con el aspecto de las colonias de transformantes y se suspendieron en medio RPMI1640-FCS (10) que contiene 0,5 mg/ml de higromicina y 50 nM de metotrexato (denominado en adelante MTX) para dar una densidad celular de 1-2 x 10^{5} células/ml. La suspensión celular se administró a una placa de 24 pocillos (2 ml/pocillo) y las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 1-2 semanas para producir así clones resistentes a MTX 50 nM.

Los clones resistentes a MTX 50 nM así obtenidos se suspendieron en medio RPMI1640-FCS (10) que contiene 0,5 mg/ml de higromicina y 200 nM de MTX para dar una densidad celular de 1-2 x 10^{5} células/ml. La suspensión celular se administró a una placa de 24 pocillos (2 ml/pocillo) y las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 1-2 semanas para producir así clones resistentes a MTX 200 nM.

Además, los clones resistentes a MTX 200 nM así obtenidos se suspendieron en medio RPMI1640-FCS (10) que contiene 0,5 mg/ml de higromicina y 500 nM de MTX para dar una densidad de 1-2 x 10^{5} células/ml. La suspensión celular se administró a una placa de 24 pocillos (2 ml/pocillo) y las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 1-2 semanas para producir así clones resistentes a MTX 500 nM.

Los transformantes anteriores se suspendieron en un medio libre de suero para células CHO, medio CHO-S-SFMII (Gibco), para dar una densidad celular de 1-2 x 10^{5} células/ml y la suspensión celular se administró a matraces de 225 cm^{2} (Greiner) en una cantidad de 100 ml/matraz. Las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 5-7 días y el medio de cultivo se recuperó cuando se logró la confluencia.

La purificación de hIL-5R \alpha a partir del sobrenadante de cultivo se realizó tal como sigue. A un litro de medio de cultivo de transformante derivado de pAI289, se añadieron 29,2 g de cloruro de sodio y 20 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,4). A continuación se ajustó el pH de la mezcla resultante hasta 7,4 con disolución de hidróxido de sodio 1 N. Se empaquetó una columna con aproximadamente 10 ml de gel de Concanavalina A - Sepharose (Pharmacia) y después se lavó con 50 ml de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro de sodio a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Tras el lavado, la mezcla que contenía shIL-5R \alpha preparada como se describe anteriormente se aplicó a la columna de Concanavalina A - Sepharose a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Después, se lavó la columna con 80 ml de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro de sodio a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. A continuación, la proteína adsorbida en Concanavalina A - Sepharose se eluyó y, simultáneamente, el eluato se fraccionó en fracciones de 1 ml (fracciones 1-30) con 15 ml de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro de sodio y 15 ml de un tampón que contiene 0,5 M de \alpha-metilmanósido, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro de sodio, cambiando linealmente la concentración de \alpha-metilmanósido desde 0 hasta 0,5 M. Además, se aplicaron a la columna 20 ml de un tampón que contiene 1 M de \alpha-metilmanósido, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro sódico y el eluato se fraccionó en fracciones de 2 ml (fracciones 31-40). La concentración de proteína de cada fracción se midió utilizando un kit de medición de concentración de proteínas (Bio-rad) y se recuperaron las fracciones 10-40 que tenían alta concentración de proteínas. La disolución de proteínas resultante se concentró en un factor de aproximadamente 10 utilizando Centricon-30 (Amicon), se colocó en un tubo de diálisis y se dializó contra PBS. De esta manera se obtuvo shIL-5R \alpha purificada (concentración de proteína: 4 mg/ml; 3,5 ml).

En una etapa separada, se obtuvo hIL-5R \alpha-Fc tal como sigue. Se empaquetó una columna con aproximadamente 5 ml de gel de Proteína A - Sepharose y después se lavó con 50 ml de PBS. Tras el lavado, se aplicó 1 litro de medio de cultivo de transformantes derivados de pAI301 descrito anteriormente a la columna de Proteína A -
Sepharose a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Después, se lavó la columna con 50 ml de PBS. A continuación, se aplicaron 20 ml de tampón citrato 0,1 M (pH 3,0) a la columna para eluir así la proteína adsorbida en Proteína A - Sepharose y, simultáneamente, el eluato se fraccionó en fracciones de 1 ml. A cada una de las fracciones se añadieron 0,15 ml de Tris-HCl 2 M (pH 9,0) para ajuste del pH. La concentración de proteína de cada fracción se midió utilizando un kit de medición de concentración de proteínas (Bio-rad) y se recuperaron aquellas fracciones que tenían alta concentración de proteínas. La disolución de proteínas resultante se colocó en un tubo de diálisis y se dializó contra PBS. De esta manera se obtuvo hIL-5R \alpha-Fc purificada (concentración de proteína: 1,8 mg/ml;
5,5 ml).

(10) Expresión de shIL-5R \alpha o hIL-5R \alpha-Fc en células de insecto

La expresión de shIL-5R \alpha y hIL-5R \alpha-Fc se llevó a cabo mediante los procedimientos descritos más adelante según el manual adjunto al kit BaculoGold Starter (Pharmigen).

La recuperación de shIL-5R \alpha y hIL-5R \alpha-Fc de los medios de cultivo se realizó utilizando Concanavalina A - Sepharose y Dietilaminoetilo (DEAE) - Sepharose, o Proteína A - Sepharose (todos fabricados por Pharmacia Biotech), respectivamente.

Se obtuvo shIL-5R \alpha tal como sigue. En resumen, se suspendieron 6 x 10^{6} células Sf9 en 45 ml de medio de insectos Grace (Gibco) que contiene el 10% de FCS en un matraz de 225 cm^{2} (Greiner) y se cultivaron a 27ºC durante 3-4 días. Tras eliminar el sobrenadante de cultivo, se añadieron al matraz 30 ml de medio de insectos Grace fresco que contiene el 10% de FCS y se añadió 1 ml de una disolución en la que estaba contenido el virus recombinante derivado del vector de transferencia pAI292 obtenido en 1(8) del ejemplo 1 a una concentración de aproximadamente 1 x 10^{7} UFP/ml. Las células se cultivaron a 27ºC durante un día adicional. Después, tras la eliminación del sobrenadante de cultivo, se añadieron 45 ml de medio Sf900-II fresco y las células se cultivaron durante 2-3 días. Tras la finalización del cultivo, se recuperó el sobrenadante de cultivo y se centrifugó a 1.500 x g durante 10 minutos para obtener así un sobrenadante. Al medio de cultivo resultante se añadió cloruro de sodio para dar una concentración final de 0,5 M. Después se añadió 1/50 volumen de 1 M de Tris-HCl (pH 7,4) y se ajustó el pH de la mezcla resultante hasta 7,4 con disolución de hidróxido de sodio 1 N.

Se empaquetó una columna con aproximadamente 10 ml de gel de Concanavalina A - Sepharose y se lavó con 50 ml de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro de sodio a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Tras el lavado, se aplicaron 500 ml del medio de cultivo que contenía shIL-5R \alpha preparado tal como se describió anteriormente a la columna de Concanavalina A - Sepharose a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Después, se lavó la columna con 80 ml de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro de sodio a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. A continuación, se aplicaron a la columna 60 ml de un tampón que contiene 1 M de \alpha-metilmanósido, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4) y 0,5 M de cloruro sódico para eluir así la proteína adsorbida en Concavalina A - Sepharose y, simultáneamente, se fraccionó el eluato en fracciones de 2 ml. La concentración de proteína de cada fracción se midió utilizando un kit de medición de concentración de proteínas (Bio-rad). Se recuperaron aquellas fracciones con alta concentración de proteínas en una cantidad total de 44 ml y se dializaron contra 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4). Además, se realizaron operaciones similares con 900 ml de medio de cultivo que contenía shIL-5R \alpha preparado tal como se ha descrito anteriormente, con el fin de recuperar aquellas fracciones con alta concentración de proteínas en una cantidad total de 40 ml, que se dializaron contra 20 mM Tris-HCl (pH 7,4).

Tras la diálisis, se combinaron las dos disoluciones de proteínas y se aplicaron a una columna empaquetada con 10 ml de gel de dietilaminoetilo (DEAE) - Sepharose para tener la proteína adsorbida. La elusión de shIL-5R \alpha de la columna se llevó a cabo cambiando linealmente la concentración de cloruro de sodio desde 0 hasta 0,5 M. De esta manera, aquellas fracciones con alta concentración de shIL-5R \alpha se recuperaron en una cantidad total de 4 ml. Esta disolución de proteínas se colocó en un tubo de diálisis y se dializó contra PBS. De esta manera se obtuvo una shIL-5R \alpha purificada (concentración de proteínas: 400 \mug/ml; 4,5 ml).

En una etapa separada, se obtuvo hIL-5R \alpha-Fc tal como sigue. En resumen, se suspendieron 6 x 10^{6} células Sf9 en 45 ml de medio de insectos Grace (Gibco) que contiene el 10% de FCS en un matraz de 225 cm^{2} (Greiner) y se cultivaron a 27ºC durante 3-4 días. Tras eliminar el sobrenadante de cultivo, se añadieron al matraz 30 ml de medio de insectos Grace fresco que contiene el 10% de FCS y se añadió 1 ml de una disolución en la que estaba contenido el virus recombinante derivado del vector de transferencia pAI297 obtenido en 1(8) del ejemplo 1 a una concentración de aproximadamente 1 x 10^{7} UFP/ml. Las células se cultivaron a 27ºC durante un día adicional. Después, tras la eliminación del sobrenadante de cultivo, se añadieron 45 ml de medio Sf900-II fresco y las células se cultivaron durante 2-3 días. Tras la finalización del cultivo, se recuperó el sobrenadante de cultivo y se centrifugó a 1.500 x g durante 10 minutos para obtener así un sobrenadante.

Se empaquetó una columna con aproximadamente 5 ml de gel de Proteína A - Sepharose y se lavó con 50 ml de PBS. Tras el lavado, se aplicaron 450 ml del medio de cultivo que contenía shIL-5R \alpha-Fc tal como se describió anteriormente a la columna de Proteína A - Sepharose a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Entonces, la columna se lavó con 50 ml de PBS. Después, 20 ml de tampón citrato 0,1 M (pH 3,0) se aplicaron a la columna para eluir así la proteína adsorbida en Proteína A - Sepharose y, simultáneamente, fraccionar el eluato en fracciones de 1 ml. A cada una de las fracciones se añadieron 0,15 ml de Tris-HCl 2 M (pH 9,0) para ajustar el pH. La concentración de proteína de cada fracción se midió utilizando un kit de medición de concentración de proteínas (Bio-rad) y se recuperaron aquellas fracciones con alta concentración de proteínas. La disolución de proteínas así obtenida se concentró en un factor de aproximadamente 3 utilizando Centricon-30 (Amicón), colocado en un tubo de diálisis y se dializó contra PBS. De esta manera se obtuvo shIL-5R \alpha-Fc (concentración de proteínas: 0,4 mg/ml; 1,8 ml).

(11) Expresión de un fragmento parcial de shIL-5R \alpha en E. coli

La expresión de un fragmento parcial de shIL-5R \alpha en E. coli se realizó insertando un fragmento de ADN que contenía un ADNc que codifica para un fragmento parcial de shIL-5R \alpha en el vector de expresión de E. coli, pMKex1, que se va a describir más adelante, de manera que se construya pAI263 y se transforme E coli con pAI263.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pGHA2 (publicación denominada Kokai número Sho 60-221091) a 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de EcoRI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol. A estos fragmentos de ADN se añadieron 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, y se añadieron 10 unidades de ClaI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug del fragmento de EcoRI-ClaI de pGHA2 que contiene la región promotora.

Se añadieron 3 \mug del plásmido pTerm2 (publicación denominada Kokai número 227075/90) a 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de EcoRI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Los fragmentos de ADN se recuperaron de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol. A estos fragmentos de ADN se añadieron 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, y se añadieron 10 unidades de NsiI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron aproximadamente 0,8 \mug del fragmento de EcoRI-NsiI de pTerm2.

Se disolvieron 50 ng del fragmento EcoRI/ClaI de pGHA2, 100 ng del fragmento EcoRI/NsiI de pTerm2 y 100 ng de un ADN sintético mostrado en la SEQ ID Nº: 15 en 20 \mul de la disolución de ADN ligasa de T4, a la que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pMKex1 mostrado en la figura 12.

En una etapa separada, se añadieron 3 \mug de pAI234 obtenido en la figura 3 a 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de PstI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvieron en 20 \mul de tampón ADN polimerasa I de T4 [un tampón que contiene 33 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 66 mM de acetato de potasio, 10 mM de acetato de magnesio, 0,5 mM de DTT y el 0,01% de BSA]. A la mezcla resultante se añadieron 5 unidades de ADN polimerasa I de T4 (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 12ºC durante 15 minutos, por lo que los extremos 5' cohesivos generados por la digestión por PstI se volvieron extremos romos. La mezcla de reacción se sometió a extracción en fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. Al precipitado se añadieron 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT y 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de ADN de aproximadamente 0,7 kb que contiene un ADNc que codifica para un fragmento de shIL-5R \alpha.

Se disolvieron 3 \mug del vector de expresión para E. coli, pMKex1, obtenido en la figura 12, en 30 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de potasio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de BamHI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvieron en 30 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de EcoRV y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se recuperaron aproximadamente 1,5 \mug de fragmentos de ADN de la mezcla de reacción mediante precipitación con etanol.

Se disolvieron 50 ng del ADNc así obtenido que codifica para un fragmento de shIL-5R \alpha y 100 ng del fragmento EcoRV/BamHI así obtenido de pMKex1 en 20 \mul del tampón ADN ligasa de T4, al que se añadieron 200 unidades de ADN ligasa de T4. Después se llevó a cabo el ligado a 12ºC durante 16 horas. Utilizando el ADN de plásmido recombinante así preparado, se transformó la cepa de E. coli JM109 para obtener así el plásmido pA1263 mostrado en la figura 13.

El plásmido anterior pAI263 se transfectó en E. coli (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), que se cultivó en 400 ml de medio LB (Luria-Bertani) que contiene 200 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante 4 horas. Después se añadieron 0,5 mM de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) y las células se cultivaron a 37ºC durante otras 2 horas. Se centrifugaron 400 ml de medio de cultivo a 3.000 x g durante 15 minutos. El precipitado que contenía las células de E. coli se suspendió en 100 ml de tampón I [10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM de EDTA, 150 mM de cloruro de sodio]. Tras una nueva centrifugación, el precipitado se suspendió en 7 ml de tampón I y se sonicó para romper las células. La suspensión resultante se centrifugó a 10.000 xg durante 30 minutos y el precipitado se disolvió en 500 \mul de tampón de muestra de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS [6 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 2% de SDS, 10% de glicerol, 5% de 2-mercaptoetanol y se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida. De esta manera, se obtuvo un fragmento de shIL-5R \alpha que tenía un peso molecular de aproximadamente 27 kD.

(12) Preparación de una fracción de membrana celular a partir de células que expresan IL-5R \alpha humana

La preparación de un componente de membrana a partir de células CTLL-2 transfectadas con el gen de hIL-5R \alpha [J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)] o células CTLL-2 control [ATCC TIB 214] se llevó a cabo tal como se describe más adelante.

En resumen, las células se centrifugaron (1.200 rpm, 5 min.), se lavaron con PBS dos veces y después se suspendieron en tampón de ruptura celular [20 mM de HEPES (pH 7,4), 1 mM de EDTA, 0,5 mM de PMSF, 250 mM de sacarosa] y se rompieron con un homogeneizador. Tras la ruptura, las células se centrifugaron a 5.500 rpm durante 15 minutos para eliminar el precipitado. Las células se centrifugaron adicionalmente a 35.000 rpm para recuperar las fracciones de membrana celular como un precipitado.

2. Inmunización de animales y preparación de células que producen anticuerpos

Se administraron 50 \mug de cada uno de los antígenos obtenidos en las subsecciones (9), (10), (11) o (12) de la sección 1 del ejemplo 1, independientemente, a ratones BALB/c hembras de 5 semanas de edad o a ratas SD hembras, junto con 2 mg de gel de aluminio y 1 x 10^{9} células de vacuna antitosferínica (Chiba Prefectural Serum Research Institute). Dos semanas tras la administración, se administraron 50 \mug de la proteína una vez a la semana en un total de 4 veces. Se recogieron muestras de sangre del plexo venoso de los fondos de ojo o de la vena de la cola y se examinó el título de anticuerpos del suero de las mismas por enzimoinmunoanálisis descrito más adelante en el punto 3. Se extrajeron los bazos 3 días después de la inmunización final de aquellos ratones o ratas que mostraron un título de anticuerpos suficiente. En este experimento de inmunización, la fracción de membrana celular obtenida en la subsección (12) de la sección 1 del ejemplo 1 se utilizó como antígeno para inmunizar 13 ratones y 5 ratas. Sin embargo, no se observó un aumento notable en el título de anticuerpos en estos animales. Además, no se observó una elevación satisfactoria en el título de anticuerpos en las 5 ratas inmunizadas con shIL-5R \alpha obtenida en la subsección (9) de la sección 1 del ejemplo 1 o en las 10 ratas inmunizadas con shIL-5R \alpha obtenida en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1.

El bazo se corta en trozos en un medio MEM (Nissui Pharmaceuticals), se dispersa con unas pinzas y se centrifuga (1.200 rpm, 5 min). Después, se elimina el sobrenadante y el resto se trata con un tampón Tris-cloruro de amonio (pH 7,65) durante 1-2 minutos para eliminar los eritrocitos y se lava con medio MEM 3 veces. Los esplenocitos resultantes se utilizan para la fusión celular.

3. Enzimoinmunoanálisis

La medición de antisueros o sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma derivadas de ratones o ratas inmunizadas con shIL-5R \alpha obtenida en las subsecciones (9) o (10) de la sección 1 del ejemplo 1 se realizó según los dos métodos descritos más adelante utilizando como antígeno hIL-5R \alpha-Fc obtenido de un sobrenadante de cultivo de células de insecto, tal como se describe en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1.

(A): A una placa EIA de 96 pocillos (Greiner), se administraron por separado hIL-5R \alpha-Fc diluido hasta 1 \mug/ml con PBS y un antígeno control, el anticuerpo quimérico anti-GD3, KM871, que tienen una región constante de Ig humana común, en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se dejaron a 4ºC durante la noche para tener las proteínas adsorbidas. Tras el lavado, se añadió a la placa PBS (100 \mul/pocillo) que contenía el 1% de albúmina sérica bovina (BSA) (denominado en lo sucesivo 1% de BSA-PBS) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear así los grupos activos que quedaban. Tras desechar el 1% de BSA-PBS, se administró a los pocillos (50 \mul/pocillo) un antisuero derivado de rata o ratón inmunizados y sobrenadante de cultivo de un hibridoma y se hicieron reaccionar durante 2 horas. Tras el lavado con Tween-PBS, se añadió inmunoglobulina de conejo marcada con peroxidasa anti-ratón o inmunoglobulina anti-rata (DAKO) a la placa (50 \mul/pocillo), se hicieron reaccionar durante 1 hora y se lavó con Tween-PBS. Después, se dejó que la mezcla resultante desarrollara color utilizando disolución de sustrato ABTS (una disolución obtenida disolviendo 550 mg de la sal diamónica de 2,2' azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) en 1 L de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de su uso) para medir la absorbancia a una DO (densidad óptica) de 415 nm (NJ2001; Japan Intermed).

(B): Además, para el objeto de seleccionar un anticuerpo monoclonal que tiene actividad neutralizante contra IL-5 con una probabilidad mayor, se realizó detección para determinar la actividad de inhibir la unión a un receptor de la IL-5 mediante los procedimientos siguientes utilizando una IL-5 humana marcada con biotina y shIL-5R \alpha-Fc obtenido del sobrenadante de cultivo celular de insecto en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1. La IL-5 humana utilizada para el marcaje con biotina se preparó según el método descrito en Journal of Immunological Method, 125, 233 (1989).

El marcaje con biotina de la IL-5 humana se realizó según el protocolo asociado con un reactivo de marcaje con biotina (Biotin-LC-Hydrazide) (Pierce) por los procedimientos siguientes. En primer lugar, se aplicaron 1,6 mg/ml de IL-5 humana disuelta en PBS a una columna PD10 (Pharmacia) equilibrada con un tampón de marcaje (100 mM de acetato de sodio, 0,02% de NaN_{1}, pH 5,5) para el intercambio de sal y se recuperó 1 ml de una fracción que tenía alta concentración de proteínas. A 0,5 ml de esta disolución de IL-5 humana, se añadió 1 ml de un tampón de marcaje que contiene 30 mM de ácido metaperyódico y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras se protegía de la luz. Tras la finalización de la reacción, la mezcla de reacción se aplicó a una columna de PD10 equilibrada con un tampón de marcaje para eliminar el ácido metaperyódico sin reaccionar. De esta manera, se recuperaron 1,5 ml de una fracción que tiene alta concentración de proteínas. A esta fracción, se añadieron 20 \mul de tampón de marcaje que contiene 5 mM de reactivo de marcaje de biotina, tal como se describió anteriormente, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la finalización de la reacción, se añadieron 50 \mul de tampón de terminación de la reacción (0,1 M de Tris, pH 7,5) y después se aplicó la mezcla de reacción a una columna de PD10 equilibrada con 0,05% de PBS que contiene NaN_{1} para intercambiar las sales y, simultáneamente, eliminar los reactivos sin reaccionar. La IL-5 humana marcada con biotina así obtenida se almacenó a 4ºC.

La shIL-5R \alpha-Fc obtenida del sobrenadante de cultivo de células de insecto en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1, se diluyó hasta una concentración de 5 \mug/ml con PBS, se administró a una placa EIA de 96 pocillos (Greiner) (50 \mul/pocillo) y se dejó a 4ºC durante la noche para tener las proteínas adsorbidas. Tras el lavado con PBS, se añadió a la placa PBS (100 \mul/pocillo) que contenía el 1% de albúmina sérica bovina (BSA) (1% de BSA-PBS) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear así los grupos activos que quedaban. Después, la placa se lavó con Tween-PBS. A continuación se añadió a la placa cada uno de un antisuero derivado de rata o ratón inmunizados y sobrenadante de cultivo del hibridoma y la IL-5 humana marcada con biotina descrita anteriormente, en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se hicieron reaccionar a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, la placa se lavó con Tween-PBS y después se añadieron 50 \mul/pocillo de avidina marcada con peroxidasa (Nippon Reizo) diluída 4000 veces con 1% de BSA-PBS y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con Tween-PBS, se añadieron 50 \mul/pocillo de disolución de sustrato ABTS para permitir que se desarrollara color y se midió la absorbancia a una DO de 415 nm.

Con respecto a la medición de antisueros y sobrenadantes de cultivo de hibridomas derivados de aquellos ratones o ratas inmunizados con el fragmento hIL-5R \alpha obtenido en la subsección (11) de la sección 1 del ejemplo 1, el fragmento hIL-5R \alpha producido por E. coli en la subsección (11) de la sección 1 del ejemplo 1 se utilizó como antígeno. De una manera similar a la descrita anteriormente, la shIL-5R \alpha producida por E. coli y una proteína celular de E. coli (antígeno control) se adsorbieron en placas por separado. Utilizando las placas así preparadas, se examinó la reactividad de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas y antisueros de ratones o ratas inmunizados.

Además, con respecto a la medición de los antisueros y sobrenadantes de cultivo de hibridomas derivados de aquellos ratones o ratas inmunizados con la fracción de membrana celular de células que expresan hIL-5R \alpha obtenido en la subsección (12) de la sección 1 del ejemplo 1, la fracción de membrana celular obtenida en la subsección (12) de la sección 1 del ejemplo 1 se utilizó como antígeno. De una manera similar a la descrita anteriormente, la fracción de membrana celular de las células que expresan IL-5R \alpha y una fracción de membrana celular de células control se adsorbieron en placas por separado. Utilizando las placas así preparadas, se examinó la reactividad de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas y antisueros de ratones o ratas inmunizados.

4. Preparación de células de mieloma de ratón

Se cultivó una línea celular de mieloma de ratón resistente a 8-azaguanina, P3-U1, en un medio normal y se fijaron no menos de 2 x 10^{7} células y se sometieron a fusión celular como una línea parental.

5. Preparación de hibridomas

Los esplenocitos de ratón o rata obtenidos en la sección 2 del ejemplo 1 y las células de mieloma obtenidas en la sección 4 del ejemplo 1 se mezclaron a una razón de 10:1 y la mezcla se centrifugó (1.200 rpm, 5 min). Después, se desechó el sobrenadante y las células precipitadas se dispersaron suficientemente. A las células resultantes, se añadió una disolución mezclada compuesta de 2 g de polietilenglicol-1000 (PEG-1000), 2 ml de medio MEM y 0,7 ml de DMSO en una cantidad de 0,2 a 1 ml por 10^{8} esplenocitos de ratón, seguido por la adición de porciones de 1 a 2 ml de medio MEM a intervalos de 1 a 2 minutos a 37ºC. Después, se añadió medio MEM para dar un volumen total de 50 ml. Tras la centrifugación (900 rpm, 5 min), se desechó el sobrenadante y las células se dispersaron suavemente. Después, las células se suspendieron suavemente en 100 ml de medio HAT mediante succión y se liberaron con una pipeta.

Esta suspensión celular se administró en una placa de cultivo de 96 pocillos (100 \mul/pocillo) y se cultivaron en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 10-14 días. El sobrenadante de cultivo resultante se examinó mediante el enzimoinmunoanálisis descrito en la sección 3 del ejemplo 1, y se seleccionaron aquellos pocillos que mostraron reacción específica con hIL-5R \alpha-Fc preparado a partir de sobrenadante de cultivo de células de insecto o con shIL-5R \alpha producida por E. coli. Además, el medio se sustituyó con medio HT y un medio normal, y la clonación se repitió dos veces. Como resultado, se establecieron las líneas celulares de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana.

Como resultado de la detección de aproximadamente 4000 clones de hibridoma obtenidos de 6 ratones u 8 ratas inmunizadas con el fragmento hIL-5R \alpha obtenido en la subsección (11) de la sección 1 del ejemplo 1, se obtuvo un anticuerpo monoclonal anti IL-5R \alpha humana y se designó como KM1074. Su reactividad con IL-5R \alpha era extremadamente débil en comparación con la de los anticuerpos monoclonales anti- IL-5R \alpha humana KM1257 y KM1259, tal como se describe más adelante.

En una etapa separada, se obtuvieron hibridomas de 12 ó 6 animales que mostraban un alto título de anticuerpos y que se seleccionaron de 15 ó 20 ratones inmunizados con shIL-5R \alpha obtenida en la subsección (9) de la sección 1 del ejemplo 1 o shIL-5R \alpha obtenida en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1. Como resultado de la detección de más de 10000 clones de hibridoma, se establecieron 81 clones de hibridoma que producían un anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana y que mostraban una reactividad específica con células que expresan hIL-5R \alpha cuando se probaron por el método descrito más adelante en la sección 1 del ejemplo 3. Entre estos, el anticuerpo monoclonal que mostró la reactividad más fuerte en el método de tinción inmunocítica descrito más tarde en la sección 1 del ejemplo 3 más tarde, fue KM1257. El hibridoma KM1257 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japón; más adelante en el presente documento, la sentido es la misma para este instituto) el 13 de junio de 1995 con el número de registro FERM BP-5133. De esos 81 clones, sólo seis clones mostraron una fuerte actividad de inhibición frente a la actividad biológica de IL-5 que se describe más tarde en la sección 2 del ejemplo 3. Entre estos seis clones, los anticuerpos monoclonales que muestran la actividad de inhibición más fuerte fueron KM1259 y KM1486. El hibridoma KM1259 se depositó con el número de registro FERM BP-5134 el 13 de junio de 1995, y el hibridoma KM1486 se depositó con el número de registro FERM BP-5651 el 3 de septiembre de 1996, ambos en el National Institute of Biosciencie and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology.

Las reactividades de los anticuerpos monoclonales KM1257, KM1259 y KM1486 se muestran en la figura 14. La subclase de cada anticuerpo se determinó mediante un enzimoinmunoanálisis utilizando un kit de tipado de subclase. Como resultado, las clases de anticuerpo de KM1257, KM1259 y KM1486 fueron todas IgG1.

6. Purificación de anticuerpos monoclonales

La línea celular de hibridoma obtenida en 5 anteriormente se administró por vía intraperitoneal a ratones desnudos (Balb/c) hembra tratados con pristano, de 8 semanas de edad, a una dosis de (5-20 x 10^{6} células/ratón). El hibridoma produjo ascitis de origen tumoral de 10 a 21 días tras la administración. Se recogió la ascitis de aquellos ratones en los que se acumuló ascitis (1-8 ml/ratón), se centrifugó (3.000 rpm, 5 min) para eliminar los sólidos y después se purificó mediante el método de precipitación con ácido caprílico (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) para obtener el anticuerpo monoclonal purificado.

Ejemplo 2 Preparación de anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana 1. Construcción del vector de expresión pKANTEX93 de anticuerpo humanizado tipo casete en tándem

Se construyó un vector de expresión de anticuerpo humanizado tipo casete en tándem, pKANTEX93, para expresar un anticuerpo humanizado de la IgG1 de anticuerpos humanos, tipo \kappa en células animales y en las que se transfectaron un ADNc que codifica para una VH de anticuerpo humanizado y un ADNc que codifica para una VL de anticuerpo humanizado aguas arriba de un ADNc que codifica para C\gamma de anticuerpos humanos y un ADNc que codifica para C\kappa de anticuerpos humanos, respectivamente, tal como se describe más adelante basándose en el plásmido pSE1UK1SEd1-3 descrito en la publicación denominada Kokai número 257891/90. El vector de expresión de anticuerpo humanizado construido se utilizó para la expresión de anticuerpos quiméricos humanos y anticuerpos injertados con CDR humanos en células animales.

(1) Modificación de los sitios de restricción ApaI y EcoRI presentes en la señal de poli(A) y en la señal de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo

La modificación de los sitios de restricción ApaI y EcoRI presentes en la señal de poli(A) y de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo del plásmido pSE1UK1SEd1-3 se realizó tal como se describe más adelante, con el fin de permitir la construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano o un vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano (= anticuerpo humanizado), insertando en un vector de expresión de anticuerpo humanizado la región variable de un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado con CDR humano en un casete utilizando un fragmento NotI-Apal (VH) y un fragmento EcoRI-SplI (VL).

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene) a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y los extremos 3' cohesivos generados por la digestión con ApaI se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo) y los fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit DNA Ligation (Takara Shuzo). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSA mostrado en la figura 15.

Adicionalmente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSA así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y los extremos 5' cohesivos generados por la digestión con EcoRI se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo) y los fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit DNA Ligation (Takara Shuzo). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSAE mostrado en la figura 16.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSAE así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 20 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT. La mezcla resultante se dividió en 2 porciones de 10 \mul. A una porción se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacII (Toyobo) y a la otra porción se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo). Entonces, ambas mezclas se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Ambas mezclas de reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron un fragmento HindIII-SacII de aproximadamente 2,96 kb y un fragmento kPnI-HindIII de aproximadamente 2,96 kb, cada uno en aproximadamente 0,3 \mug.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pSE1UK1SEd1-3 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacII (Toyobo) y 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT. A la mezcla resultante se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron un fragmento HindIII-SacII de aproximadamente 2,42 kb y un fragmento kPnI-HindIII de aproximadamente 1,98 kb, cada uno en aproximadamente 0,2 \mug.

Después, se disolvieron 0,1 \mug del fragmento HindIII-SacII del plásmido pSE1UK1SEd1-3 y 0,1 \mug del fragmento HindIII-SacII de pBSAE obtenido anteriormente, en agua esterilizada, para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSH-S mostrado en la figura 17. Además, se disolvieron 0,1 \mug del fragmento KpnI-HindIII del plásmido pSE1UK1SEd1-3 y 0,1 \mug del fragmento KpnI-HindIII de pBSAE obtenido anteriormente, en agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSK-H mostrado en la figura 18.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug de cada uno de los plásmidos así obtenidos pBSH-S y pBSK-H, por separado, a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Ambas mezclas de reacción se precipitaron con etanol y los extremos 3' cohesivos generados por la digestión con ApaI se volvieron romos usando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo) y los fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit DNA Ligation (Takara Shuzo). Utilizando cada una de las disoluciones de ADN de plásmido recombinante así obtenidas, se transformó E. coli HB101 para obtener los plásmidos pBSH-SA y pBSK-HA mostrados en la figura 19.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug de los plásmidos pBSH-SA y pBSH-HA así obtenidos, por separado, a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 10 minutos, de manera que el plásmido se digiriera parcialmente. A continuación, ambas mezclas de reacción se precipitaron con etanol. Una vez que los extremos 5' cohesivos generados por la digestión con EcoRI se volvieron romos usando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo), ambas mezclas de reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron un fragmento de aproximadamente 5,38 kb y un fragmento de aproximadamente 4,94 kb, cada uno en aproximadamente 0,5 \mug. Después, se disolvió 0,1 \mug de cada uno de los fragmentos así recuperados, por separado, en agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando cada una de las disoluciones de ADN de plásmido recombinante así obtenidas, se transformó E. coli HB101 para obtener los plásmidos pBSH-SAE y pBSK-HAE mostrados en la figura 20.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug de cada uno de los plásmidos así obtenidos pBSH-SAE y pBSK-HAE, por separado, a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Ambas mezclas de reacción se precipitaron con etanol y los extremos 5' cohesivos generados por la digestión con EcoRI se volvieron romos usando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo) y los fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit DNA Ligation (Takara Shuzo). Utilizando cada una de las disoluciones de ADN de plásmido recombinante así obtenidas, se transformó E. coli HB101 para obtener los plásmidos pBSH-SAEE y pBSK-HAEE mostrados en la figura 21. Se hicieron reaccionar 10 \mug de cada uno de los plásmidos así obtenidos, por separado, según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech) para determinar así la secuencia de bases. Como resultado, se confirmó que ambos sitios de restricción ApaI y EcoRI se habían eliminado por la modificación descrita anteriormente.

(2) Introducción de un sitio de restricción SalI en la parte aguas abajo que consiste en la señal de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo, en la señal de poli(A) del gen de \beta-globina de conejo y en la señal de poli(A) del gen de expresión temprana de SV40

Con el fin de garantizar que los promotores de expresión para las cadenas H y L del anticuerpo humano en un vector de expresión de anticuerpo humanizado puedan sustituirse por cualquier promotor, se transfectó un sitio de restricción SalI en la parte aguas abajo que consiste en la señal de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo, en la señal de poli(A) del gel de \beta-globina de conejo y en la señal de poli(A) del gen de expresión temprana de SV40 del plásmido pSE1UK1SEd1-3, tal como se describe más adelante.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSK-HAEE obtenido en la subsección (1) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción NaeI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 20 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 9,0) y 1 mM de cloruro de magnesio, a los que se añadió 1 unidad de fosfatasa alcalina (E. coli C75, Takara Shuzo) y se hizo reaccionar a 37ºC durante 1 hora para desfosforilar los extremos 5'. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. El precipitado se disolvió en 20 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético disódico (denominado en lo sucesivo "tampón TE"). Se añadió 1 \mul de la mezcla y 0,1 \mug de una secuencia de unión de SalI fosforilada (Takara Shuzo) a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul, y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener plásmidos pBSK-HAEESal mostrados en la figura 22. Diez \mug de cada uno de los plásmidos así obtenidos se hicieron reaccionar según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech) para determinar así la secuencia de bases. Como resultado, se confirmó que un sitio de restricción SalI se había transfectado en la parte aguas abajo que consiste en la señal de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo, en la señal de poli(A) del gen de \beta-globina de conejo y en la señal de poli(A) del gen de expresión temprana de SV40.

(3) Modificación del sitio de restricción ApaI presente en la señal de poli(A) del gen de la timidina cinasa del virus Herpex simple (denominado en lo sucesivo "HSVtk")

La modificación del sitio de restricción ApaI presente en la señal de poli(A) del gen HSVtk localizado aguas abajo del gen de la kanamicina fosfotransferasa de Tn5 en el plásmido pSE1UK1SEd1-3 se llevó a cabo tal como se describe más adelante.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSA obtenido en la subsección (1) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacII (Toyobo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperó aproximadamente 1 \mug de un fragmento SacII-XhoI de aproximadamente 2,96 kb.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pSE1UK1SEd1-3 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacII (Toyobo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se recuperó aproximadamente 1 \mug de un fragmento SacII-XhoI de aproximadamente 4,25 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento SacII-XhoI de pBSA y el fragmento SacII-XhoI del plásmido pSE1UK1SEd1-3 tal como se obtuvieron anteriormente a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul, y después se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSX-S mostrado en la figura 23.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSX-X así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y los extremos 3' cohesivos generados por la digestión con ApaI se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo) y los fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit DNA Ligation (Takara Shuzo). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSX-SA mostrado en la figura 24. Diez \mug del plásmido así obtenido se hicieron reaccionar según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech) para determinar así la secuencia de bases. Como resultado, se confirmó que el sitio de restricción ApaI de la señal de poli(A) del gen HSVtk se había eliminado.

(4) Construcción de una unidad de expresión de la cadena L de un anticuerpo humanizado

El plásmido mMohC\kappa que tiene una unidad de expresión de la cadena L de un anticuerpo humanizado, en la que un ADNc que codifica para la región constante de la cadena L de tipo \kappa (C\kappa) humana se colocó aguas abajo del promotor/potenciador de la secuencia repetida terminal del virus de la leucemia murina de Moloney y en el que podía insertarse un ADNc que codifica para VL de un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado con CDR humano en un casete, se construyó tal como se describe más adelante.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene) a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de cloruro de sodio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ClaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y los extremos cohesivos generados por las digestiones con SacI y ClaI se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo). A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento de ADN de aproximadamente 2,96 kb. Después, se añadieron 0,1 \mug del fragmento de ADN recuperado a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron usando la ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSSC mostrado en la figura 25.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSSC así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento KpnI-XhoI de aproximadamente 2,96 kb.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pAGE147 descrito en la publicación denominada Kokai número 205694/94 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento KpnI-XhoI de aproximadamente 0,66 kb que contenía el promotor/potenciador de la secuencia repetida terminal del virus de la leucemia murina de Moloney.

Posteriormente, se disolvieron 0,1 \mug del fragmento KpnI-XhoI de pBSSC y 0,1 \mug del fragmento KpnI-XhoI del plásmido pAGE147, tal como se obtuvieron anteriormente, en agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSMo mostrado en la figura 26.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSMo obtenido anteriormente a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento KpnI-HindIII de aproximadamente 3,62 kb.

Posteriormente, se sintetizaron dos ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 16 y 17, respectivamente, utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, Applied Biosystems). Después, se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los ADN sintéticos obtenidos a 15 \mul de agua esterilizada y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. La mezcla de reacción de dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A esta mezcla, se añadieron 2 \mul de un tampón 10x [500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de DTT] y 2 \mul de ATP 10 mM. Además, se añadieron 10 unidades de polinucleótido cinasa de T4 (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos para fosforilar los extremos 5'. A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento KpnI-HindIII (3,66 kb) del plásmido pBSMo tal como se obtuvo anteriormente y 0,05 \mug de los ADN sintéticos fosforilados a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSMoS mostrado en la figura 27. Diez \mug del plásmido así obtenido se hicieron reaccionar según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech) para determinar así la secuencia de bases. Como resultado, se confirmó que se habían transfectado los ADN sintéticos de interés.

Posteriormente, se disolvieron 3 \mug del plásmido pChilgLA1 descrito en la publicación denominada Kokai número 304989/93 en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de las enzimas de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y EcoRV (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento EcoRI-EcoRV de aproximadamente 9,70 kb. Posteriormente, se sintetizaron dos ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 18 y 19, respectivamente, utilizando sintetizadores automáticos de ADN (380A, Applied Biosystems). Después, se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los ADN sintéticos obtenidos a 15 \mul de agua esterilizada y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. La mezcla de reacción de dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A esta disolución, se añadieron 2 \mul de un tampón 10x [500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de DTT] y 2 \mul de ATP 10 mM. Además, se añadieron 10 unidades de polinucleótido cinasa de T4 (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos para fosforilar los extremos 5'. A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-EcoRV (9,70 kb) del plásmido pChilgLA1 tal como se obtuvo anteriormente y 0,05 \mug de los ADN sintéticos fosforilados a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pChilgLA1S mostrado en la figura 28.

Posteriormente, se disolvieron 3 \mug del plásmido pBSMoS, tal como se obtuvo anteriormente, en 10 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de cloruro de potasio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HpaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 1 \mug de un fragmento HpaI-EcoRI de aproximadamente 3,66 kb. Posteriormente, se disolvieron 10 \mug del plásmido pChilgLA1S obtenido anteriormente en 10 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 50 mM de acetato de potasio, 10 mM de acetato de magnesio, 1 mM de DTT y 100 \mug/ml de BSA, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción NlaIV (New England Biolabs) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento NlaIV-EcoRI de aproximadamente 0,41 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug de cada uno del fragmento HpaI-EcoRI de pBSMoS y el fragmento NlaIV-EcoRI de pChilgLA1S, tal como se obtuvieron anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron usando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pMohC\kappa mostrado en la figura 29.

(5) Construcción de una unidad de expresión de cadena H de anticuerpo humanizado

El plásmido mMohC\gamma 1 que tiene una unidad de expresión de la cadena H de un anticuerpo humanizado, en la que un ADNc que codifica para la región constante de la cadena H de tipo IgG1 humana (C\gamma 1) se colocó aguas abajo del promotor/potenciador de la secuencia repetida terminal del virus de la leucemia murina de Moloney y en el que podía insertarse un ADNc que codifica para VH de un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado con CDR humano en un casete, se construyó tal como se describe más adelante.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSMo obtenido en la subsección (4) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 30 mM de acetato de sodio (pH 5,0), 100 mM de cloruro de sodio, 1 mM de acetato de zinc y 10% de glicerol, a los que se añadieron 10 unidades de la nucleasa Mung Bean (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 10 minutos. La mezcla de reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. A continuación, los extremos cohesivos se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo) y los fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit DNA Ligation (Takara Shuzo). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB1010 para obtener el plásmido pBSMoSal mostrado en la figura 30. Diez \mug del plásmido así obtenido se hicieron reaccionar según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech) para determinar así la secuencia de bases. Como resultado, se confirmó que el sitio de restricción XhoI situado aguas arriba del promotor/potenciador de la secuencia repetida terminal del virus de la leucemia murina de Moloney se había eliminado.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSMosal, tal como se obtuvo anteriormente, a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento KpnI-HindIII de aproximadamente 3,66 kb.

Posteriormente, se sintetizaron dos ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 20 y 21, respectivamente, utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, Applied Biosystems). Después, se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los ADN sintéticos obtenidos a 15 \mul de agua esterilizada y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. La mezcla de reacción de dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A esta disolución se añadieron 2 \mul de un tampón 10x [500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de DTT] y 2 \mul de ATP 10 mM. Además, se añadieron 10 unidades de polinucleótido cinasa de T4 (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos para fosforilar los extremos 5'. A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento KpnI-HindIII (3,66 kb) del plásmido pBSMoSal, tal como se obtuvo anteriormente, y 0,05 \mug de los ADN sintéticos fosforilados a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBSMoSalS mostrado en la figura 31. Diez \mug del plásmido así obtenido se hicieron reaccionar según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech) para determinar así la secuencia de bases. Como resultado, se confirmó que se habían transfectado los ADN sintéticos de interés.

Posteriormente, se disolvieron 10 \mug del plásmido pChilgHB2 descrito en la publicación denominada Kokai número 304989/93 en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción Eco52I (Toyobo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 30 mM de acetato de sodio (pH 5,0), 100 mM de cloruro de sodio, 1 mM de acetato de zinc y 10% de glicerol, a los que se añadieron 10 unidades de la nucleasa Mung Bean (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 10 minutos. La mezcla de reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. A continuación, los extremos cohesivos se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo). Tras precipitación con etanol, el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,7 \mug de un fragmento ApaI-extremo romo de aproximadamente 0,99 kb.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene) a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y al precipitado se añadieron 10 \mul de un tampón que contiene 33 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM de acetato de magnesio, 66 mM de acetato de potasio, 0,5 mM de DTT y 10 \mug/ml de BSA, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SmaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento ApaI-SmaI de aproximadamente 3,0 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-extremo romo del plásmido pChilgHB2, tal como se obtuvo anteriormente, y 0,1 \mug del fragmento ApaI-SmaI de pBluescript SK(-) a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando la ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pBShC\gamma1 mostrado en la figura 32.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pBShC\gamma1, tal como se obtuvo anteriormente, a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SpeI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Después, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento ApaI-SpeI de aproximadamente 1,0 kb.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSMoSalS, tal como se obtuvo anteriormente, a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SpeI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento ApaI-SpeI de aproximadamente 3,66 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug de cada uno del fragmento ApaI-SpeI de pBShC\gamma 1 y el fragmento ApaI-SpeI de pBSMoSalS, tal como se obtuvieron anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron usando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pMohC\gamma 1 mostrado en la figura 33.

(6) Construcción del vector de expresión pKANTEX93 de anticuerpo humanizado tipo casete en tándem

Se construyó un vector de expresión de anticuerpo humanizado tipo casete en tándem, pKANTEX93, tal como sigue utilizando varios plásmidos obtenidos en las subsecciones (1)-(5) de la sección 1 del ejemplo 2.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSH-SAEE obtenido en la subsección (1) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SalI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento HindIII-SalI de aproximadamente 5,42 kb.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pBSK-HAEE obtenido en la subsección (1) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,8 \mug de un fragmento KpnI-HindIII de aproximadamente 1,98 kb que contenía la señal de poli(A) de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo, la señal de poli(A) del gen de expresión temprana de SV40 y el promotor del gen de expresión temprana de SV40.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pMohC\gamma 1 obtenido en la subsección (5) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SalI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,8 \mug de un fragmento KpnI-SalI de aproximadamente 1,66 kb que contenía la unidad de expresión de la cadena H del anticuerpo humanizado.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug de cada uno del fragmento HindIII-SalI de pBSH-SAEE, el fragmento KpnI-HindIII de pBSK-HAEE y el fragmento KpnI-SalI de pMohC\gamma 1 tal como se obtuvieron anteriormente a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pMo\gamma 1SP mostrado en la figura 34.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pMo\gamma 1SP así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de cada una de las enzimas de restricción SalI (Takara Shuzo) y XhoI y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento SalI-XhoI de aproximadamente 9,06 kb.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pBSK-HAEESal obtenido en la subsección (2) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SalI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,7 \mug de un fragmento KpnI-SalI de aproximadamente 1,37 kb, que contenía la señal de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo, la señal de poli(A) de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo y la señal de poli(A) del gen de expresión temprana de SV40.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pMohC\kappa obtenido en la subsección (4) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción KpnI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,7 \mug de un fragmento KpnI-XhoI de aproximadamente 1,06 kb, que contenía la unidad de expresión de la cadena L del anticuerpo humanizado.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug de cada uno del fragmento SalI-Xhol de pMo\gamma 1SP, el fragmento KpnI-SalI de pBSK-SAEE-Sal y el fragmento KpnI-XhoI de pMohC\kappa, tal como se obtuvieron anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pMo\kappa \gamma 1SP mostrado en la figura 35.

Posteriormente, se disolvieron 3 \mug del plásmido pMo\kappa \gamma 1SP así obtenido en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacII (Toyobo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 10 minutos, de manera que los fragmentos de ADN se digirieran parcialmente. Después, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento SacII-XhoI de aproximadamente 8,49 kb.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSX-SA obtenido en la subsección (3) de la sección 1 del ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SacII (Toyobo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción XhoI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento SacII-XhoI de aproximadamente 4,25 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug de cada uno del fragmento SacII-XhoI de pMo\gamma 1SP y el fragmento SacII-XhoI de pBSX-SA, tal como se obtuvieron anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pKANTEX93 mostrado en la figura 36.

2. Aislamiento y análisis de los ADNc que codifican para anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana (1) Aislamiento de ARNm de hibridomas que producen anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana

Utilizando Fast Track, un kit de extracción de ARNm fabricado por Invitrogen, se aisló ARNm de 1 x 10^{8} células de cada una de las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales de ratón anti-IL-5R \alpha humana KM1257, KM1259 y KM1486 (lo que corresponde a los hibridomas FERM BP-5133, FERM BP-5134 y FERM BP-5651, respectivamente) según las instrucciones adjuntas al kit.

(2) Preparación de bibliotecas de ADNc para la cadena H y L a partir de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de ratón anti-IL-5R \alpha humana

Utilizando el kit cDNA Synthesys (Pharmacia Biotech) y según las instrucciones adjuntas al kit, se sintetizó un ADNc que tiene un adaptador para EcoRI en ambos extremos de manera separada a partir de 5 \mug de cada uno de los ARNm obtenidos a partir de KM1257, KM1259 y KM1486 en la subsección (1) de la sección 2 del ejemplo 2. Se disolvieron aproximadamente 6 \mug de cada ADNc en 10 \mul de agua esterilizada y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,1 \mug de cada uno de un fragmento de ADNc de aproximadamente 1,5 kb que corresponde al ADNc que codifica para la cadena H del anticuerpo tipo IgG y un fragmento de aproximadamente 1,0 kb que corresponde a la cadena L de las inmunoglobulinas. Después se disolvieron 0,1 \mug del fragmento de ADNc de aproximadamente 1,5 kb o del fragmento de ADNc de aproximadamente 1,0 kb y 1 \mug del vector ZAPII de Lambda [tal como se ha tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera tras escisión con EcoRI; Stratagene) en 11,5 \mul de tampón ligasa de T4, a los que se añadieron 175 unidades de ADN ligasa de T4 y se incubaron a 12ºC durante 24 horas, seguido por incubación a temperatura ambiente durante otras 2 horas. Utilizando 4 \mul de cada mezcla de reacción, se empaquetaron los ADNc en un fago \lambda utilizando Giga Pack Gold (Stratagene) mediante métodos convencionales (Molecular Cloning, 2.95, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Los fagos \lambda resultantes infectaron a la cepa de E. coli XL1-Blue [Biotechniques, 5, 376 (1987)] en Giga Pack Gold mediante métodos convencionales (Molecular Cloning, 2.95-107. Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) para obtener aproximadamente 4000 clones de fagos de cada una de la biblioteca de ADNc para cadena H y la biblioteca de ADNc para cadena L de KM157, KM1259 y KM1489.

(3) Clonación de los ADNc que codifican para las cadenas H y L a partir de hibridomas que producen anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana

Los fagos recombinantes preparados en la subsección (2) de la sección 2 del ejemplo 2 se fijaron en un filtro de nitrocelulosa mediante métodos convencionales (Molecular Cloning, 2.12. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). El ADNc que codifica para la región C de la Ig de ratón {la cadena H era un fragmento del ADNc para C\gamma 1 de ratón [Cell, 18, 559 (1979)] y la cadena L era un fragmento del ADNc para C\kappa de ratón [Cell, 22, 197 (1989)]} se marcaron utilizando sistemas de marcaje y detección directa de ácidos nucleicos con ECL (electroquimioluminiscencia) (Amersham). Utilizando los ADNc marcados como sondas, se detectaron fagos recombinantes. Posteriormente, según las instrucciones adjuntas al vector ZAPII de Lambda (Stratagene), los clones del fago se sustituyeron con el plásmido pBluescriptSK(-). Finalmente, se obtuvieron los plásmidos siguientes: plásmido recombinante pKM1257H que comprende un ADNc que codifica para la cadena H de KM1257 y el plásmido recombinante pKM1257L que comprende ADNc que codifica para la cadena L de KM1257; el plásmido recombinante pKM1259H que comprende un ADNc que codifica para la cadena H de KM1259 y el plásmido recombinante pKM1259L que comprende un ADNc que codifica para la cadena L de KM1259; y el plásmido recombinante pKM1486H que comprende un ADNc que codifica para la cadena H de KM1486 y el plásmido recombinante pKM1486L que comprende un ADNc que codifica para la cadena L de KM1486.

(4) Determinación de las secuencias de bases para las regiones V de los ADNc que codifican para las cadenas H y L de anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana

La secuencia de bases para la región V de cada uno de los ADNc que codifican para las cadenas H y L de anticuerpos monoclonales de ratón anti-IL-5R \alpha humana, tal como se obtienen en la subsección (3) de la sección 2 del ejemplo 2, se analizó haciendo reaccionar 10 \mug del plásmido resultante según las instrucciones adjuntas al kit AutoRead Sequencing (Pharmacia Biotech) y después se sometió a electroforesis con el secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia Biotech). A partir de la secuencia de bases así determinada para cada uno de los ADNc, se determinaron las secuencias de aminoácidos para las regiones V de las cadenas L y H de KM1257, KM1259 y KM1486. Las SEQ ID Nº: 22 y 23 muestran la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H de KM1257; las SEQ ID Nº: 24 y 25 muestran las de la cadena L de KM1257; las SEQ ID Nº: 26 y 27 muestran las de la cadena H de KM1259; las SEQ ID Nº: 28 y 29 muestran las de la cadena L de KM1259; las SEQ ID Nº: 30 y 31 muestran las de la cadena H de KM1486; y las SEQ ID Nº: 32 y 33 muestran las de la cadena L de KM1486.

(5) Identificación de las secuencias de CDR para las cadenas H y L de anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana

La secuencia de CDR para cada cadena H y aquellas para cada cadena L se identificaron a partir de las secuencias de aminoácidos para las regiones V de las cadenas H y L de cada anti-IL-5R \alpha humana de ratón como el anticuerpo monoclonal determinado en la subsección (4) de la sección 2 del ejemplo 2, comparando las secuencias anteriores de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de la región V para anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Las SEQ ID Nº: 34, 35 y 36 muestran las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena H de KM1257. Las SEQ ID Nº: 37, 38 y 39 muestran las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena L de KM1257. Las SEQ ID Nº: 40, 41 y 42 muestran las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena H de KM1259. Las SEQ ID Nº: 43, 44 y 45 muestran las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena L de KM1259. Las SEQ ID Nº: 46, 47 y 48 muestran las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena H de KM1486. Las SEQ ID Nº: 49, 50 y 51 muestran las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la cadena L de KM1486.

3. Preparación del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana

Se preparó un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana derivado del anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana, KM1259, que tiene actividad para inhibir la actividad biológica de la IL-5 humana, tal como se describe más adelante.

(1) Construcción del vector de expresión pKANTEX1259 para el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana

Se construyó tal como sigue un vector de expresión, pKANTEX1259, para un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, utilizando el vector de expresión de anticuerpo humanizado, pKANTEX93, construido en la sección 1 del ejemplo 2 y los plásmidos pKM1259H y pKM1259L obtenidos en la sección 2 del ejemplo 2.

En resumen, se añadieron 3 \mug del vector de expresión de anticuerpo humanizado pKANTEX93 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT, 100 \mug/ml de BSA y el 0,01% de Triton X-100, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción NotI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 12,75 kb. Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pKM1259H a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción BanI (Toyobo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT, 100 \mug/ml de BSA y el 0,01% de Triton X-100, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción NotI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento BanI-NotI de aproximadamente 0,41 kb.

Posteriormente, se sintetizaron dos ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 52 y 53, respectivamente, con un sintetizador automático de ADN (380A, Applied Biosystems). Después, se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los ADN sintéticos obtenidos a 15 \mul de agua esterilizada y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. La mezcla de reacción de dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos, a la que se añadieron 2 \mul de un tampón 10x [500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de DTT] y 2 \mul de ATP 10 mM. Además, se añadieron 10 unidades de polinucleótido cinasa de T4 y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos para fosforilar así los extremos 5'.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI del vector de expresión de anticuerpo humanizado, pKANTEX93, 0,1 \mug del fragmento BanI-NotI del plásmido pKM1259H y 0,05 \mug de los ADN sintéticos fosforilados, tal como se obtuvieron anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pKANTEX1259H mostrado en la figura 37.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pKANTEX1259H así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT y 100 \mug/ml de BSA, a los que se añadieron 10 unidades de las enzimas de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y SplI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 13,20 kb.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido pKM1259L a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción AvaII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó en etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento AvaII-EcoRI de aproximadamente 0,38 kb.

Posteriormente, se sintetizaron dos ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 54 y 55, respectivamente, con un sintetizador automático de ADN (380A, Applied Biosystems). Después, se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los ADN sintéticos obtenidos a 15 \mul de agua esterilizada y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. Tras dejar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadieron 2 \mul de un tampón 10x [500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de cloruro de magnesio, 50 mM de DTT] y 2 \mul de ATP 10 mM. Además, se añadieron 10 unidades de polinucleótido cinasa de T4 y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos para fosforilar así los extremos 5'.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del plásmido pKANTEX1259H, 0,1 \mug del fragmento AvaII-EcoRI del plásmido pKM1259L y 0,05 \mug de los ADN sintéticos fosforilados, tal como se obtuvieron anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pKANTEX1259 mostrado en la figura 38.

(2) Expresión del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5 \alpha humana en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL1581) utilizando pKANTEX1259

La transfección del vector de expresión pKANTEX1259 de anticuerpo quimérico humano anti-IL-5 \alpha humana en células YB2/0 se llevó a cabo según el método de Miyaji et al. por electroporación [Cytotechnology, 3, 133, (1990)].

En resumen, se transfectaron 4 \mug de pKANTEX1259 obtenido en la subsección (1) de la sección 3 del ejemplo 2 en 4 x 10^{6} células YB2/0. Después se administró RPMI1640-FCS(10) en una placa de microtitulación de 96 pocillos (200 \mul/pocillo). Las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas. Después, se añadió geneticina (denominada en lo sucesivo "G418"; Gibco) para dar una concentración de 0,5 mg/ml y las células se cultivaron durante otras 1-2 semanas. Los sobrenadantes de cultivo se recuperaron de aquellos pocillos que llegaron a ser confluentes con el aspecto de las colonias de transformantes que tenían resistencia a G418. La actividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana en los sobrenadantes se determinó por el método ELISA 1 ó 2, tal como se describe a continuación.

Método ELISA 1

El shIL-5R \alpha-Fc obtenido a partir de un sobrenadante de cultivo de células de insecto en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1 se diluyó con PBS hasta una concentración de 5 \mug/ml o menos. El diluyente se administró a una placa de EIA de 96 pocillos (Greiner) (50 \mug/pocillo), que se dejó a 4ºC durante la noche para permitir que se adsorbiera la proteína. Tras el lavado de la placa, se añadió PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1% (BSA) (1% de BSA-PBS) a la placa en una cantidad de 100 \mug/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear así los grupos activos restantes. Tras desechar el 1% de BSA-PBS, se añadieron a la placa los sobrenadantes de cultivo del transformante o varios anticuerpos purificados anti-IL-5 \alpha humana a una concentración de 40 \mug/ml, en una cantidad de 25 \mul/pocillo. Además, se añadió a la placa la IL-5 humana marcada con biotina (0,4 \mug/ml) preparada en la sección 3 del ejemplo 1 en una cantidad de 25 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 4 horas. Tras el lavado con 0,05% de Tween-PBS, se añadió avidina D marcada con peroxidasa (Nippon Reizo) diluida 4000 veces con 1% de BSA-PBS en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con 0,05% de Tween-PBS, se añadió una disolución de sustrato ABTS [preparada disolviendo 550 mg de la sal diamónica de 2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) en 1 L de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de su uso] a 50 \mul/pocillo para permitir el desarrollo de color. A continuación se midió la absorbancia (DO) a 415 nm. El valor de la absorbancia en ausencia de un anticuerpo se consideró como una inhibición del cero por ciento, y se calcularon las inhibiciones en porcentaje de anticuerpos contra la IL-5 marcada con biotina mediante la fórmula siguiente para evaluar cada muestra.

Inhibición de unión en porcentaje = 100 - \frac{A-C}{B-C} \ x \ 100

en la que

A: valor de DO en presencia de un anticuerpo

B: valor de DO en ausencia de un anticuerpo

C: valor de DO en ausencia de IL-5 humana marcada con biotina

Método ELISA 2

La shIL-5R \alpha obtenida a partir de un sobrenadante de cultivo de células de insecto en la subsección (10) de la sección 1 del ejemplo 1 se diluyó con PBS hasta una concentración de 2 \mug/ml o menos. El diluyente se administró a una placa de EIA de 96 pocillos (Greiner) (50 \mul/pocillo), que se dejó a 4ºC durante la noche para permitir que se adsorbiera la proteína. Tras el lavado de la placa, se añadió PBS que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (1% de BSA-PBS) a la placa, en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear así los grupos activos restantes. Tras desechar el 1% de BSA-PBS, se añadieron a la placa los sobrenadantes de cultivo del transformante o varios anticuerpos purificados anti-IL-5 \alpha humana a una concentración de 50 \mug/ml, en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras el lavado con 0,05% de Tween-PBS, se añadió anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa (American Qualex International, Inc.) diluido 500 veces con 1% de BSA-PBS, en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con 0,05% de Tween-PBS, se añadió una disolución de sustrato ABTS [preparada disolviendo 550 mg de la sal diamónica de 2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) en 1 L de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de su uso] a 50 \mul/pocillo para permitir el desarrollo de color. A continuación, se midió la absorbancia (DO) a 415 nm.

Aquellos transformantes en los que se observó actividad de anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana en sus sobrenadantes de cultivo se suspendieron en medio RPMI1640-FCS(10) que contiene 0,5 mg/ml de G418 y 50 nM de MTX (Sigma) y se cultivaron en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 1-2 semanas, para inducir así que el transformante tenga resistencia a MTX 50 nM. Cuando el transformante llegó ser confluente en los pocillos, se midió la actividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana en el sobrenadante, mediante cualquiera de los métodos ELISA descritos anteriormente. Aquellos transformantes en los que se observó actividad se cultivaron adicionalmente de una manera similar a la descrita anteriormente, aumentando la concentración de MTX hasta 100 nM y hasta 200 nM. Por tanto, el transformante podía crecer en medio RPMI1640-FCS(10) que contiene 0,5 mg/ml de G418 y 200 nM de MTX y que producía un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana. El transformante así obtenido se sometió a clonación mediante las aplicaciones del método de dilución limitante para obtener así un transformante final que produce anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana. Como ejemplo específico del transformante que produce anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana puede darse KM1399 (FERM BP-5650). El anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana producido por esta cepa se designó como KM1399. El transformante KM1399 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, el 3 de septiembre de 1996 con el número de registro FERM BP-5650. La productividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, en el clon transformante KM1399 fue aproximadamente de 5 \mug/10^{5} células/24 horas.

(3) Purificación del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, a partir del sobrenadante de cultivo

El anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, obtenido en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2 se suspendió en medio GIT (Nippon Pharmaceuticals) que contiene 0,5 mg/ml de G418 y 200 mM de MTX para dar una concentración de 1-2 x 10^{5} células/ml, y se administró en porciones de 200 ml a matraces de 175 cm^{2} (Greiner). Las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 5-7 días, y el sobrenadante de cultivo se recuperó cuando cada matraz llegó a ser confluente. A partir de aproximadamente 1,0 litro del sobrenadante de cultivo, se obtuvieron aproximadamente 3 mg del anticuerpo quimérico humano purificado anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, utilizando una columna Procep A (Bioprocessing). Aproximadamente 4 \mug del anticuerpo quimérico humano purificado anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, se sometieron a electroforesis según métodos conocidos [Nature, 227, 680 (1970)] para llevar a cabo análisis de peso molecular. Los resultados se muestran en la figura 39. Tal como se muestra en la figura 39, el peso molecular de la cadena H de los anticuerpos fue de aproximadamente 50 kDa y el de la cadena L de los anticuerpos fue de aproximadamente 25 kDa en condiciones reductoras. Por tanto, se confirmó la expresión de las cadenas H y L con los pesos moleculares correctos. Por otra parte, en condiciones no reductoras, el peso molecular del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, fue de aproximadamente 140 kDa. Por tanto, se confirmó la expresión de un anticuerpo quimérico humano de peso molecular correcto compuesto por dos cadenas H y dos cadenas L. Además, las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal para las cadenas H y L del anticuerpo quimérico humano purificado anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, se analizaron con un secuenciador de proteínas (470A, Applied Biosystems) mediante el método de Edman automático. Como resultado, se obtuvieron las secuencias de aminoácidos correctas esperadas.

(4) Reactividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, con IL-5R \alpha humana (método ELISA 1)

Se determinaron las reactividades del anticuerpo de ratón anti-IL-5R \alpha humana, KM1259, y el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, con la IL-5R \alpha humana mediante el método ELISA 1 descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2. Los resultados se muestran en la figura 40. Tal como se observa a partir de la figura 40, el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, demostró tener una fuerte reactividad con IL-5R \alpha humana, lo que fue comparable con la reactividad del anticuerpo de ratón anti-IL-5R \alpha humana, KM1259.

4. Expresión transitoria del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana en células COS-7 (ATCC CRL1651)

Con el fin de evaluar las actividades de diversas versiones de anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana que se describirá después más rápidamente, se examinó tal como sigue la expresión transitoria de un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana en células COS-7, utilizando pKANTEX1259 y un vector modificado del mismo por el método de lipofectamina.

(1) Construcción de un vector mejorado de pKANTEX1259

Dado que la eficacia de la expresión transitoria de un gen en células animales depende del número de copias del vector de expresión transfectado en las mismas, se supuso que un vector de expresión más pequeño conduciría a una mejor eficacia de la expresión. Por tanto, se construyó tal como sigue un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R-\alpha humana más pequeño, pT1259, eliminando algunas regiones de pKANTEX1259 que se creía que no influían en la expresión de un anticuerpo.

En resumen, se añadieron 3 \mug del plásmido pKANTEX1259 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción MluI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y los extremos 5' cohesivos generados por la digestión con la enzima de restricción se volvieron romos utilizando el kit DNA Blunting (Takara Shuzo). La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento de ADN de aproximadamente 9,60 kb. A continuación se añadieron 0,1 \mug del fragmento de ADN recuperado a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para recuperar así el plásmido pT1259 mostrado en la figura 41.

(2) Expresión transitoria del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana utilizando pT1259

Se dispersaron células COS-7 a una concentración de 1 x 10^{5} células/ml en una placa de 6 pocillos (2 ml/pocillo) y se cultivaron a 37ºC durante la noche. A 100 \mul de OPTI-MEM (Gibco), se añadieron 2 \mug de pT1259, seguido por la adición de una disolución obtenida añadiendo 10 \mul del reactivo lipofectamina (Gibco) a 100 \mul de medio OPTI-MEM (Gibco). La mezcla resultante se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 40 minutos para formar así un complejo de ADN-liposoma. Las células COS-7 descritas anteriormente se lavaron con 2 ml de medio OPTI-MEM (Gibco) dos veces y se añadió a las mismas la disolución que contenía el complejo de ADN-liposoma. Después, las células se cultivaron a 37ºC durante 7 horas. Tras la eliminación del fluido de cultivo, se añadieron 2 ml de medio DMEM (Gibco) que contenía el 10% de FCS y las células se cultivaron a 37ºC. A las 72 horas desde el comienzo del cultivo, se recuperó el sobrenadante de cultivo y se evaluó la actividad de un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana en el sobrenadante de cultivo mediante el método ELISA 1 descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2. Tal como se muestra en la figura 42, se observó actividad dependiente de la concentración en el sobrenadante de cultivo de las células COS-7 en las que se había transfectado pT1259. Por tanto, se confirmó la expresión de un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana. A partir de estos resultados, se ha demostrado que es posible evaluar las actividad de anticuerpos humanizados derivados de varios factores de expresión en un sistema de expresión transitorio preparando un vector pKANTEX93 mejorado de pequeño tamaño y transfectando entonces el vector en células COS-7. Además, con el fin de comparar correctamente las actividades de los diversos anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana que se va a describir más adelante, se determinó la concentración del anticuerpo formado por la expresión transitoria en el sobrenadante de cultivo mediante el método ELISA descrito en la subsección (3) de la sección 4, más adelante.

(3) Determinación de la concentración de anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo de expresión transitoria mediante ELISA

A una placa de microtitulación de 96 pocillos, se administró una disolución obtenida diluyendo anticuerpo de cabra anti-IgG humana (cadena \gamma) (Institute of Medicine & Biology) 400 veces con PBS (50 \mul/pocillo) y se hizo reaccionar a 4ºC durante la noche. Tras la eliminación de la disolución de anticuerpo, se añadieron 100 \mul/pocillo de 1% de BSA-PBS y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora para bloquear así los grupos activos restantes. Tras desechar el 1% de BSA-PBS, se añadieron 50 \mul/pocillo del sobrenadante de cultivo de expresión transitoria o el anticuerpo quimérico humano purificado anti-IL-5 \alpha humana, KM1399, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, se retiró la mezcla y la placa se lavó con 0,05% de Tween-PBS. Después, se añadieron a la placa 50 \mul/pocillo de una disolución obtenida diluyendo anticuerpo de ratón anti-cadena L \kappa humana marcado con peroxidasa (Zymed) 500 veces con 1% de BSA-PBS y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con 0,05% de Tween-PBS, se añadieron 50 \mul/pocillo de una disolución de sustrato ABTS [obtenida disolviendo 550 mg de la sal diamónica de 2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) en 1 L de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de su uso] para permitir el desarrollo de color. A continuación se midió la absorbancia a una DO de 415 nm.

5. Preparación de un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana

Se preparó un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana tal como se describe más adelante; el anticuerpo tenía una actividad comparable a la del anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-5R \alpha humana, KM1259, y a la del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, teniendo ambos actividad para inhibir la actividad biológica de la IL-5 humana.

(1) Construcción de ADNc que codifica para VH de un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basado en la secuencia consenso para la VH de anticuerpos humanos conocidos

Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) clasificaron varias VH de anticuerpos humanos conocidos en los subgrupos 1-III (HSG I-III) basándose en la homología de la secuencia FR e identificaron la secuencia consenso para cada subgrupo. Por tanto, los presentes inventores decidieron diseñar una secuencia de aminoácidos para una VH de anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, basándose en esas secuencias consenso. En primer lugar, con el fin de seleccionar una secuencia consenso que va a utilizarse como base, se examinó la homología entre la secuencia FR para la VH del anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-5R \alpha humana, KM1259, y la secuencia de FR de la secuencia consenso de una VH de anticuerpo humano de cada subgrupo (tabla 1).

TABLA 1

Homología (%) entre la secuencia FR para la VH de KM1259 de ratón y la
secuencia FR de la secuencia consenso de la VH de anticuerpo
humano de cada subgrupo
HSGI	HSGII	HSGIII
72,1	50,6	55,2

Como resultado, se confirmó que la VH de KM1259 de ratón tiene la mayor homología con el subgrupo I en la secuencia FR. Por tanto, se diseñó la secuencia de aminoácidos para una VH de anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basándose en la secuencia consenso del subgrupo I, y se construyó un ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos anterior, tal como se describe más adelante utilizando PCR.

En resumen, se sintetizaron 6 ADN sintéticos que tenían las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 56-61, respectivamente, con un sintetizador automático de ADN (380A; Applied Biosystem). Cada uno de los ADN sintetizados se añadió a 50 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de cloruro de potasio, 1,5 mM de cloruro de magnesio, 0,001% de gelatina, 200 \muM de dNTP, 0,5 \muM del cebador RV de M13 (Takara Shuzo), 0,5 \muM del cebador M4 de M13 (Takara Shuzo) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq TaKaRa (Takara Shuzo) para dar una concentración final de 0,1 \muM. Después, la mezcla resultante se cubrió con 50 \mul de aceite mineral y se colocó en un ciclador térmico de ADN (PJ480; Perkin Elmer). A continuación, se llevó a cabo la PCR a través de 30 ciclos, consistiendo cada ciclo en 94ºC durante 2 minutos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 20 \mul de tampón TE. Después, la mezcla se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento amplificado de aproximadamente 0,48 kb.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene) a 10 \mul de un tampón que contiene 33 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM de acetato de magnesio, 66 mM de acetato de potasio, 0,5 mM de DTT y 100 \mug/ml de BSA, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción SmaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 20 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 9,0) y 1 mM de cloruro de magnesio, a los que se añadió 1 unidad de fosfatasa alcalina (E. coli C75, Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora para desfosforilar así los extremos 5'. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a extracción con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. El precipitado se disolvió en 20 \mul de tampón TE.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento amplificado obtenido por PCR y 0,1 \mug del fragmento SmaI de pBluescriptSK(-) a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101. A partir de 10 clones transformantes se preparó ADN de plásmido individualmente y se determinó la secuencia de bases del mismo. Como resultado, se obtuvo el plásmido phKM1259HV0 mostrado en la figura 43, que comprende un ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos para una VH del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de interés. La secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos para la VH del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana contenida en phKM1259HV0 (denominada en lo sucesivo "HV.0") se muestran en SEQ ID Nº: 62 y 63.

(2) Construcción de un ADNc que codifica para la VL de un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basado en la secuencia consenso para VL de anticuerpos humanos conocidos

Kabat et al. clasificaron varias VL de anticuerpos humanos conocidos en los subgrupos 1-IV (HSG I-IV) basándose en la homología de la secuencia FR e identificaron la secuencia consenso para cada subgrupo. Por tanto, los presentes inventores decidieron diseñar una secuencia de aminoácidos para una VL de anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, basándose en esas secuencias consenso. En primer lugar, con el fin de seleccionar una secuencia consenso que va a utilizarse como base, se examinó la homología entre la secuencia FR para la VH del anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-5R \alpha humana, KM1259, y la secuencia FR de la secuencia consenso de una VL de anticuerpo humano de cada subgrupo (tabla 2).

TABLA 2

Homología (%) entre la secuencia FR para la VL de KM1259 de ratón y la secuencia FR
de la secuencia consenso de la VL de anticuerpo humano de cada subgrupo
HSGI	HSGII	HSGIII	HSGIV
73,8	57,5	60,0	65,0

Como resultado, se confirmó que la VL de KM1259 de ratón tiene la mayor homología con el subgrupo I en la secuencia FR. Por tanto, se diseñó la secuencia de aminoácidos para una VL de anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basándose en la secuencia consenso del subgrupo I, y se construyó un ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos anterior, tal como se describe más adelante utilizando PCR.

En resumen, se sintetizaron 6 ADN sintéticos que tenían las secuencias de bases mostradas en SEQ ID Nº: 64-69, respectivamente, con un sintetizador automático de ADN (380A; Applied Biosystem). Cada uno de los ADN sintetizados se añadió a 50 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de cloruro de potasio, 1,5 mM de cloruro de magnesio, 0,001% de gelatina, 200 \muM de dNTP, 0,5 \muM del cebador RV de M13 (Takara Shuzo), 0,5 \muM del cebador M4 de M13 (Takara Shuzo) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq TaKaRa (Takara Shuzo) para dar una concentración final de 0,1 \muM. Después, la mezcla resultante se cubrió con 50 \mul de aceite mineral y se colocó en un ciclador térmico de ADN (PJ480; Perkin Elmer). A continuación, se llevó a cabo la PCR a través de 30 ciclos, consistiendo cada ciclo en 94ºC durante 2 minutos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en 20 \mul de tampón TE. Después, la mezcla se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento amplificado de aproximadamente 0,43 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento amplificado obtenido anteriormente por PCR y 0,1 \mug del fragmento SmaI de pBluescriptSK(-), obtenido en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101. A partir de 10 clones transformantes, se preparó ADN de plásmido individualmente y se determinó la secuencia de bases del mismo. Como resultado se obtuvo el plásmido phKM1259LV0 mostrado en la figura 44, que comprende un ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos para una VL del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de interés. La secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos para la VL del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana contenida en phKM1259LV0 (denominada en lo sucesivo "LV.0") se muestran en SEQ ID Nº: 70 y 71.

(3) Construcción del vector de expresión para un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, pKANTEX1259HV0LV0, basado en la secuencia consenso de las regiones V de anticuerpos humanos conocidos

Se construyó, tal como se describe más adelante, un vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, pKANTEX1259HV0LV0, utilizando el vector de expresión de anticuerpo humanizado pKANTEX93 obtenido en la sección 1 del ejemplo 2, el plásmido phKM1259HV0 obtenido en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2 y el plásmido phKM1259LV0 obtenido en la subsección (2) de la sección 5 del ejemplo 2.

En resumen, se añadieron 5 \mug del plásmido phKM1259HV0 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT, 100 \mug/ml de BSA y 0,01% de Triton X-100, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción NotI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 0,44 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI del vector de expresión de anticuerpo humanizado pKANTEX93 obtenido en la subsección (1) de la sección 3 del ejemplo 2 y 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI del plásmido phKM1259HV0 obtenido anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando la ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener así el plásmido pKANTEX1259HV0 mostrado en la figura 45.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pKANTEX1259HV0 así obtenido a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT y 100 \mug/ml de BSA, a los que se añadieron 10 unidades de cada una de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y la enzima de restricción SplI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 13,20 kb.

Posteriormente, se añadieron 5 \mug del plásmido phKM1259LV0 a 10 \mul de un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT y 100 \mug/ml de BSA, a los que se añadieron 10 unidades de cada una de la enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo) y la enzima de restricción SplI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 0,39 kb.

Posteriormente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del plásmido pKANTEX1259HV0 obtenido anteriormente y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del plásmido phKM1259LV0 obtenido anteriormente, a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101 para obtener así el plásmido pKANTEX1259HV0LV0 mostrado en la figura 46.

(4) Expresión de un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basándose en la secuencia consenso de las regiones V de un anticuerpo humano conocido en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL1581) utilizando pKANTEX1259HV0LV0

La expresión de un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basándose en la secuencia consenso de las regiones V del anticuerpo humano conocido en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL1581) se llevó a cabo utilizando pKANTEX1259HV0LV0 según el método descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2.

Como resultado, se obtuvo KM8397 como un transformante que producía un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana basándose en la secuencia consenso de las regiones V del anticuerpo humano conocido. El anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana producido por la cepa se designó como KM8397. La productividad del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, en el transformante KM8397 fue de aproximadamente 4 \mug/10^{6} células/24 horas.

(5) Purificación del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, a partir de sobrenadante de cultivo

El clon KM8397 que produce anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, obtenido en la subsección (4) de la sección 5 del ejemplo 2, se cultivó según el método descrito en la subsección (3) de la sección 3 del ejemplo 2 y se purificó para obtener así aproximadamente 2 mg de KM8397. Aproximadamente 4 \mug del anticuerpo injertado con CDR humano purificado anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, se sometieron a electroforesis según el método descrito en la subsección (3) de la sección 3 del ejemplo 2, con el fin de examinar su peso molecular. Los resultados se muestran en la figura 47. Tal como se muestra en la figura 47, el peso molecular de la cadena H del anticuerpo fue de aproximadamente 50 kDa y el de la cadena L del anticuerpo fue de aproximadamente 25 kDa en condiciones reductoras. Por tanto, se confirmó la expresión de las cadenas H y L con los pesos moleculares correctos. Por otra parte, en condiciones no reductoras, el peso molecular del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, es de aproximadamente 140 kDa. Por tanto, se confirmó la expresión de un anticuerpo injertado con CDR humano de peso molecular correcto compuesto por dos cadenas H y dos cadenas L. Además, las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal para las cadenas H y L del anticuerpo injertado con CDR humano purificado anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, se analizaron con un secuenciador de proteínas (470A, Applied Biosystems) mediante el método de Edman automático. Como resultado, se obtuvieron las secuencias de aminoácidos correctas esperadas.

(6) Reactividad del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, con IL-5R \alpha humana (método ELISA 2)

Se determinaron las reactividades del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, y el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, con IL-5R \alpha humana mediante el método ELISA 2 descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2. Los resultados se muestran en la figura 48. Tal como se muestra en la figura 48, se demostró que la reactividad del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, con IL-5R \alpha humana era aproximadamente la mitad de la reactividad del anticuerpo quimérico humano anti- IL-5R \alpha humana, KM1399.

6. Aumento de la actividad por modificación de la secuencia de aminoácidos para la región V del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397

La reactividad del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, con IL-5R \alpha humana, disminuyó hasta aproximadamente la mitad de la reactividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399. Por tanto, la actividad de KM8397 aumentó modificando la secuencia de aminoácidos para la región V de la misma por los métodos descritos más adelante.

(1) Modificación de la secuencia de aminoácidos para la VH del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397

Mediante la mutación de los aminoácidos de la VH del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, mostrado en la SEQ ID Nº: 63, se prepararon diversas versiones modificadas de la VH del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana. Los aminoácidos que se iban a mutar se seleccionaron al azar con referencia a un modelo estructural tridimensional informatizado para la región V del anticuerpo de ratón anti-IL-5R \alpha humana, KM1259. Como en el método para transfectar una mutación, se obtuvo un plásmido que comprende un ADNc que codifica para una versión modificada de la VH de interés del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando cebadores para la mutación.

En realidad, se obtuvo un plásmido phKM1259HV1 que comprende un ADNc que codifica para la versión 1 modificada de VH (denominada en lo sucesivo "HV.1") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 74, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando la secuencia mostrada en SEQ ID Nº: 72 como cebador para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases SEQ ID Nº: 56, 57, 58, 59, 72 y 61, respectivamente. En la secuencia de aminoácidos de HV.1, se han sustituido la tirosina en la posición 95 y la alanina en la posición 97 localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 63 por leucina y glicina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena H del anticuerpo de ratón KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo de ratón y el anticuerpo quimérico humano.

Además, se obtuvo un plásmido phKM1259HV2 que comprende un ADNc que codifica para la versión 2 modificada de la VH (denominada en lo sucesivo "HV.2") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 78, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando las secuencias mostradas en SEQ ID Nº: 72, 75 y 76 como cebadores para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases SEQ ID Nº: 56, 57, 75, 76, 72 y 61, respectivamente. En la secuencia de aminoácidos de HV.2, se han sustituido el ácido glutámico en la posición 46, la treonina en la posición 74, la tirosina en la posición 95 y la alanina en la posición 97, localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 63, por alanina, arginina, leucina y glicina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena H del anticuerpo de ratón KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo de ratón y el anticuerpo quimérico humano.

Además, se obtuvo un plásmido phKM1259HV3 que comprende un ADNc que codifica para la versión 3 modificada de VH (denominada en lo sucesivo "HV.3") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 83, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando la secuencia mostrada en SEQ ID Nº: 79, 80 y 81 como cebadores para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases de SEQ ID Nº: 56, 57, 79, 80, 81 y 61, respectivamente. En la secuencia de aminoácidos de HV.3, se han sustituido la alanina en la posición 40, el ácido glutámico en la posición 46, la arginina en la posición 67, la alanina en la posición 72, la treonina en la posición 74, la alanina en la posición 79, la tirosina en la posición 95 y la alanina en la posición 97, localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 63 por arginina, alanina, lisina, serina, arginina, valina, leucina y glicina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena H del anticuerpo de ratón KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo de ratón y el anticuerpo quimérico humano.

A medida que la versión avanza desde HV.0 hasta HV.4 de uno en uno, el número de aminoácidos derivados de anticuerpo monoclonal implicados en la modificación aumenta con el número de versión creciente desde HV.0 hasta HV.3.

(2) Modificación de la secuencia de aminoácidos para la VL del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397

Mediante la mutación de los aminoácidos de la VL del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, mostrado en la SEQ ID Nº: 71, se prepararon diversas versiones modificadas de la VL del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana. Los aminoácidos que se iban a mutar se seleccionaron al azar con referencia a un modelo estructural 3D informatizado para la región V del anticuerpo anti-IL-5R \alpha humana, KM1259. Como en el método para transfectar una mutación, se obtuvo un plásmido que comprende un ADNc que codifica para una versión modificada de la VL de interés del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando cebadores para la mutación.

En realidad, se obtuvo un plásmido phKM1259LV1 que comprende un ADNc que codifica para la versión 1 modificada de VL (denominada en lo sucesivo "LV.1") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 88, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando las secuencias mostradas en SEQ ID Nº: 84, 85 y 86 como cebadores para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases de SEQ ID Nº: 64, 65, 84, 85, 68 y 86, respectivamente. En la secuencia de aminoácidos de LV.1, se han sustituido la glutamina en la posición 37, la lisina en la posición 45 y la fenilalanina en la posición 98 localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 71 por arginina, ácido glutámico y valina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena L del anticuerpo de ratón KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo de ratón y el anticuerpo quimérico humano.

Además, se obtuvo un plásmido phKM1259LV2 que comprende un ADNc que codifica para la versión 2 modificada de VL (denominada en lo sucesivo "LV.2") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 92, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando las secuencias mostradas en SEQ ID Nº: 85, 86, 89 y 90 como cebadores para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases de SEQ ID Nº: 64, 65, 89, 85, 90 y 86, respectivamente.

En la secuencia de aminoácidos para LV.2, se han sustituido la treonina en la posición 22, la glutamina en la posición 37, la lisina en la posición 45, la serina en la posición 77 y la fenilalanina en la posición 98, localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 71, por glicina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico y valina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo de ratón y el anticuerpo quimérico humano.

Además, se obtuvo un plásmido phKM1259LV3 que comprende un ADNc que codifica para la versión 3 modificada de VL (denominada en lo sucesivo "LV.3") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 98, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando las secuencias mostradas en SEQ ID Nº: 85, 93, 94, 95 y 96 como cebadores para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases de SEQ ID Nº: 64, 93, 94, 85, 95 y 96, respectivamente. En la secuencia de aminoácidos de LV.3, se han sustituido la serina en la posición 7, la prolina en la posición 8, la treonina en la posición 22, la glutamina en la posición 37, la glutamina en la posición 38, la lisina en la posición 45, la serina en la posición 77, la tirosina en la posición 87 y la fenilalanina en la posición 98 localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 71 por alanina, treonina, glicina, arginina, lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, fenilalanina y valina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo monoclonal y el anticuerpo quimérico humano.

Además, se obtuvo un plásmido phKM1259LV4 que comprende un ADNc que codifica para la versión 4 modificada de VL (denominada en lo sucesivo "LV.4") del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana mostrado en la SEQ ID Nº: 103, llevando a cabo los procedimientos descritos en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando las secuencias mostradas en SEQ ID Nº: 93, 96, 99, 100 y 101 como cebadores para la mutación y utilizando ADN sintéticos que tienen las secuencias de bases de SEQ ID Nº: 64, 93, 99, 100, 101 y 96, respectivamente. En la secuencia de aminoácidos de LV.4, se han sustituido la serina en la posición 7, la prolina en la posición 8, la treonina en la posición 22, la glutamina en la posición 37, la glutamina en la posición 38, la prolina en la posición 44, la lisina en la posición 45, la fenilalanina en la posición 71, la serina en la posición 77, la tirosina en la posición 87 y la fenilalanina en la posición 98 localizadas en la FR de SEQ ID Nº: 71 por alanina, treonina, glicina, arginina, lisina, valina, ácido glutámico, tirosina, ácido aspártico, fenilalanina y valina, respectivamente, que son los aminoácidos encontrados en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal KM1259 y esto se hace con el fin de conservar la reactividad con la IL-5R \alpha humana reconocida en el anticuerpo monoclonal y el anticuerpo quimérico humano.

Como resultado, a medida que la versión avanza desde LV.0 hasta LV.4 uno por uno, el número de aminoácidos derivados de anticuerpo monoclonal implicados en la modificación aumenta con el número de versión creciente desde LV.0 hasta LV.4.

(3) Preparación de anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana que tienen diversas versiones modificadas de la región V

Utilizando el vector de expresión de anticuerpo humanizado pKANTEX93 construido en la sección 1 del ejemplo 2 y los diversos plásmidos que comprenden los ADNc que codifican para las diversas versiones modificadas de la región V del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana obtenidos en las subsecciones (1) y (2) de la sección 5 del ejemplo 2, se construyeron vectores para la expresión de los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana que tienen varias versiones modificadas de la región V, mediante el método descrito en la subsección (3) de la sección 5 del ejemplo 2. La tabla 3 muestra las combinaciones de las diversas versiones modificadas de la región V utilizadas en los vectores de expresión construidos y la designación de esos vectores de expresión.

TABLA 3

1

Entre estos vectores de expresión, se modificó un total de 13 vectores pKANTEX1259HV0LV0, pKANTEX
1259HV1LV0, pKANTEX1259HV2LV0, pKANTEX1259HV0LV1, pKANTEX1259HV1LV1, pKANTEX1259HV
2LV1, pKANTEX1259HV0LV2, pKANTEX1259HV1LV2, pKANTEX1259HV2LV2, pKANTEX1259HV0LV3,
pKANTEX1259HV1LV3, pKANTEX1259HV2LV3 y pKANTEX1259HV3LV3 en vectores de expresión transitorios por el método descrito en la subsección (1) de la sección 4 del ejemplo 2. Utilizando estos vectores de expresión transitorios y según el método descrito en la subsección (2) de la sección 4 del ejemplo 2, se realizó la expresión transitoria de los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana que tienen diversas versiones modificadas de la región V. Como control, se llevó a cabo simultáneamente la expresión transitoria del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399. Se determinó la actividad de unión para la IL-5R \alpha humana de un anticuerpo en el sobrenadante de cultivo mediante el método ELISA 1 descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2, y se determinó la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo mediante el método ELISA descrito en la subsección (3) de la sección 4 del ejemplo 2. Utilizando dos métodos ELISA, las actividades de los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana que tienen varias versiones modificadas de la región V, se muestran en la figura 49 como valores relativos en los que la actividad del anticuerpo quimérico humano KM1399 se toma como 100. En la figura 49, se representan varias versiones modificadas de anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana mediante una combinación de VH y VL. A partir de la figura 49, se reconoce una tendencia con VH, de manera que la actividad aumenta a medida que la modificación avanza desde HV.0 hasta HV.3. Con respecto a VL, se reconoce una tendencia de manera que la reactividad es alta en LV.0 y LV.3 pero baja en LV.1 y LV.2. Después, se realizó una evaluación de la actividad más exacta de los anticuerpos injertados con CDR humanos con anti-IL-5R \alpha humana que comprenden combinaciones de LV.0 y varias VH modificadas; LV.3 y HV.0; LV3 y HV.3; y LV4, que es una versión modificada adicional de LV.3, y varias VH modificadas utilizando anticuerpos purificados, tal como sigue.

En resumen, utilizando los 10 vectores de expresión para los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana descritos anteriormente, es decir, pKANTEX1259HV0LV0, pKANTEX1259HV1LV0, pKANTEX1259HV2
LV0, pKANTEX1259HV3LV0, pKANTEX1259HV0LV3, pKANTEX1259HV3LV3, pKANTEX1259HV0LV4,
pKANTEX1259HV1LV4, pKANTEX1259HV2LV4 y pKANTEX1259HV3LV4 y según el método descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2, los anticuerpos de interés se expresaron en células YB2/0 para obtener así transformantes que producen diversos anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana a un nivel de productividad de 2-4 \mug/10^{6} células/24 h. Los transformantes que producen diversos anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana se cultivaron y se purificaron mediante los métodos descritos en la subsección (3) de la sección 3 del ejemplo 2 para obtener así 1-2 mg cada uno de los diversos anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana. Aproximadamente 4 \mug de cada uno de los diversos anticuerpos injertados con CDR humanos purificados anti-IL-5R \alpha humana se sometieron a electroforesis mediante el método descrito en la subsección (3) de la sección 3 del ejemplo 2 para medir sus pesos moleculares. En condiciones reductoras, el peso molecular de la cadena H del anticuerpo es de aproximadamente 50 kDa y el de la cadena L del anticuerpo, de aproximadamente 25 kDa en cada uno de los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana. Por tanto, se confirmó la expresión de las cadenas H y L con los pesos moleculares correctos. En condiciones no reductoras, el peso molecular del anticuerpo es de aproximadamente 140 kDa en cada uno de los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana. Por tanto, se confirmó la expresión de anticuerpos injertados con CDR humanos, estando compuesto cada uno por dos cadenas H y dos cadenas L del tamaño correcto. Además, se analizaron las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal para las cadenas H y L de los diversos anticuerpos injertados con CDR humanos purificados anti-IL-5R \alpha humana con un secuenciador de proteínas (470A, Applied Biosystems) por el método de Edman automático. Como resultado, se espera que se obtengan las secuencias de aminoácidos correctas en cada uno de esos anticuerpos.

La reactividad con la IL-5R \alpha humana en los diversos anticuerpos injertados con CDR humanos purificados anti-IL-5R \alpha humana obtenidos anteriormente se determinó mediante el método ELISA 2 descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2 y los resultados se muestran en la figura 50. En la figura 50, se representan varias versiones modificadas de anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana mediante una combinación de VH y VL. Tal como se muestra en la figura 50, de los 10 anticuerpos injertados con CDR humanos purificados anti-IL-5R \alpha humana, HV.3LV.0 y HV.3LV.4 demostraron tener una reactividad con IL-5R \alpha humana tan fuerte como la reactividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399.

Cuando se comparan las secuencias de aminoácidos para los anticuerpos injertados con CDR humanos anti-IL-5R \alpha humana, HV.3LV.0 y HV.3LV.4, que muestran una reactividad con la IL-5R \alpha humana tan fuerte como la reactividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, ambos tienen la misma secuencia de aminoácidos que se muestra como HV.3 para VH, pero tienen diferentes secuencias de aminoácidos para VL, es decir, mostradas como LV.0 y LV.4. Mientras que LV.0 es una secuencia obtenida injertando simplemente la CDR en la FR de un anticuerpo humano, LV.4 es una secuencia obtenida convirtiendo 11 residuos de aminoácidos dentro de la FR de un anticuerpo humano en aquellos residuos de aminoácidos encontrados en el anticuerpo monoclonal, con el fin de aumentar la actividad. Sin embargo, a partir de los resultados mostrados en la figura 50, la modificación de los residuos de aminoácidos realmente hace pocas contribuciones al aumento de la actividad. Basándose en estos hechos, HV.3LV.0 que tiene una reactividad con la IL-5R \alpha humana tan fuerte como la reactividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, y que se espera que sea menos antigénico contra los humanos puesto que la sustitución de aminoácidos derivada del anticuerpo monoclonal es menor, se ha seleccionado como un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana. HV.3LV.0 se designó como KM8399, y el transformante KM8399 que produce un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8399, se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology el 3 de septiembre de 1996 con el número de registro FERM BP-5648.

En la preparación del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8399, se han tenido en cuenta las siguientes cuestiones. Tal como se observa en la preparación de otros anticuerpos injertados con CDR humanos, la actividad en el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8397, que se obtuvo simplemente injertando sólo la CDR del anticuerpo monoclonal anti-IL-5R \alpha humana, KM1259, en la FR de un anticuerpo humano, disminuyó hasta aproximadamente 1/2 de la actividad del anticuerpo monoclonal KM1259. Por tanto, se modificaron varios aminoácidos dentro de la FR de las regiones V de las cadenas H y L por los aminoácidos encontrados en el anticuerpo monoclonal KM1259, y se examinaron para determinar un aumento en la actividad. Con respecto a VH, la actividad aumentó a medida que avanzaba la modificación. Por otra parte, con respecto a VL, la modificación de un pequeño número de aminoácidos dio como resultado una disminución de la actividad; aunque la actividad puede aumentarse al aumentar el número de aminoácidos modificados, la actividad sólo aumentó hasta el nivel de VL no modificada. Aunque la causa de este hecho todavía no puede aclararse completamente sin más análisis detallado (por ejemplo, análisis cristalino por rayos X), probablemente está implicada la interacción entre VH y VL de un anticuerpo y los resultados de tal interacción variarían dependiendo del anticuerpo utilizado. Debido a tales problemas, no se ha establecido todavía un método eficaz para preparar un anticuerpo injertado con CDR humano que pueda aplicarse a cualquier anticuerpo, y se requieren pruebas de ensayo y error tal como se realizan en el presente ejemplo. Mediante la acumulación de tales pruebas de ensayo y error, podría establecerse un método más eficaz para preparar anticuerpos injertados con CDR humanos. El presente ejemplo muestra el primer caso de preparación satisfactoria de un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana y por tanto, proporciona sugerencias para la preparación eficaz de anticuerpos injertados con CDR humanos.

7. Preparación de anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos (1) Aislamiento y análisis de un ADNc que codifica para la región C (C\gamma 4) de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos

Se separaron 1,1 x 10^{7} células B a partir de 200 ml de sangre periférica de un voluntario sano utilizando el anticuerpo anti-CD19 recubierto por DynaBeads (perlas magnéticas) (DYNABEADS M-450 Pan-B(CD19); Nippon Dyner) y DETACHaBEAD (Nippon Dyner), según las instrucciones adjuntas. Después, se obtuvo ARNm a partir de las células separadas utilizando el kit de purificación de ARNm Quick Prep. (Pharmacia Biotech) según las instrucciones adjuntas. Para todo el ARNm obtenido, se sintetizó el ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Time Saver (Pharmacia Biotech) según las instrucciones adjuntas. Después, se realizó una PCR tal como se describe en la subsección (1) de la sección 5 del ejemplo 2, utilizando todos el ADNc obtenido anteriormente y utilizando, como cebadores, ADN sintéticos mostrados en SEQ ID Nº: 104 y 105, que son homólogos a los lados 5' y 3' de un ADNc que codifica para el anticuerpo C\gamma 4 humano [Nucleic Acid Research, 14, 1789 (1986)]. Los cebadores del lado 5' y del lado 3' utilizados en la PCR se han diseñado para que tengan secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción ApaI y BamHI en sus extremos terminales 5', de manera que el ADNc que va a obtenerse pueda insertarse fácilmente en el vector de expresión del anticuerpo humanizado. La mezcla de reacción tras la PCR se purificó con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y después se añadió a 30 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT. A la mezcla resultante, se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de cloruro de potasio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción BamHI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 1,0 kb.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBluescriptSK(-) (Stratagene) a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de cloruro de potasio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción BamHI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 2 \mug de un fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 3,0 kb.

Después, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI amplificado por PCR obtenido anteriormente y 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI de pBluescriptSK(-) obtenido anteriormente a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando la disolución de ADN de plásmido recombinante así obtenida, se transformó E. coli HB101. A partir de 10 clones transformantes, se preparó cada ADN de plásmido y se determinó la secuencia de bases del mismo.

Como resultado, se obtuvo el plásmido pBShC\gamma4 mostrado en la figura 51, que comprende un ADNc de interés que codifica para el anticuerpo humano C\gamma 4.

(2) Construcción de un vector de expresión para anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos

Se construyó un vector de expresión para anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana, de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos, tal como se describe más adelante, utilizando el plásmido pBShC\gamma4 que comprende un ADNc que codifica para el anticuerpo humano C\gamma4 obtenido en la subsección (1) de la sección 7 del ejemplo 2, el vector de expresión pKANTEX1259 para el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, obtenido en la subsección (1) de la sección 3 del ejemplo 2 y el vector de expresión pKANTEX1259HV3LV0 para el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8399, obtenido en la subsección (3) de la sección 6 del ejemplo 2.

En resumen, se añadieron 4 \mug del plásmido pBShC\gamma4 que comprende un ADNc que codifica para el anticuerpo humano C\gamma 4 a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se precipitó con etanol y el precipitado se añadió a 10 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de cloruro de potasio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción BamHI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 1 \mug de un fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 1,0 kb.

Posteriormente, se añadieron 3 \mug del vector de expresión pKANTEX1259 para el anticuerpo tipo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM1399, y el vector de expresión pKANTEX1259HV3LV0 para el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM8399, individualmente a 10 \mul de un tampón que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción ApaI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Ambas mezclas de reacción se precipitaron con etanol y los precipitados se añadieron individualmente a 10 \mul de un tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM de cloruro de potasio, 10 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de DTT, a los que se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción BamHI (Takara Shuzo) y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 1 hora. Ambas mezclas de reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para recuperar así aproximadamente 2 \mug de un fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 12,59 kb a partir de cada mezcla de reacción.

Una combinación de 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI del plásmido pBShC\gamma 4 y 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamI del plásmido pKANTEX1259, y otra combinación de 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI del plásmido pBShC\gamma 4 y 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI del plásmido pKANTEX1259HV3LV0, se añadieron individualmente a agua esterilizada para dar un volumen total de 20 \mul y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (Pharmacia Biotech). Utilizando cada una de las disoluciones de ADN de plásmido recombinante así obtenidas, se transformó E. coli HB101 para obtener así el vector de expresión pKANTEX1259\gamma 4 para un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 y el vector de expresión pKANTEX1259HV3LV0\gamma 4 para un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, mostrados en la figura 52.

(3) Expresión de anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL1581)

La expresión de anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana en células YB2/0 se llevó a cabo mediante el método descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2, utilizando el vector de expresión pKANTEX1259\gamma 4 para un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 y el vector de expresión pKANTEX1259
HV3LV0\gamma 4 para un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, obtenidos en la subsección (2) de la sección 7 que se obtuvieron en el ejemplo 2.

Como resultado, se obtuvo como un transformante que produce un anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, KM7399 (FERM BP-5649) y el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 producido por esta cepa se designó como KM7399. El transformante KM7399 que produce el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM7399, se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology el 3 de septiembre de 1996 con el número de registro FERM BP-5649. La productividad del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana, KM7399, en el transformante KM7399 fue de aproximadamente 3 \mug/10^{6} células/24 h.

Además, se obtuvo como un transformante que produce un anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, KM9399 (FERM BP-5647) y el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 producido por esta cepa se designó como KM9399. La productividad del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM9399, en el transformante KM9399 fue de aproximadamente 7 \mug/10^{6} células/24 h. El transformante KM9399 que produce el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana, KM9399, se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology el 3 de septiembre de 1996 con el número de registro FERM BP-5647.

(4) Purificación de anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos a partir de sobrenadantes de cultivo

El transformante KM7399 que produce el anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 y el transformante KM9399 que produce el anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, que se obtuvieron en la subsección (3) de la sección 7 del ejemplo 2, se cultivaron y se purificaron según los métodos descritos en la subsección (3) de la sección 3 del ejemplo 2 para obtener así aproximadamente 1 mg de KM7399 y aproximadamente 5 mg de KM9399. Aproximadamente 4 \mug de cada uno de los anticuerpos humanizados purificados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, KM7399 y KM9399, se sometieron a electroforesis según el método descrito en la subsección (3) de la sección 3 del ejemplo 2 para examinar sus pesos moleculares. Los resultados se muestran en la figura 53. Tal como se muestra en la figura 53, el peso molecular de la cadena H de cada anticuerpo es de aproximadamente 50 kDa y el de la cadena L de cada anticuerpo, de aproximadamente 25 kDa, en condiciones reductoras. Por tanto, se confirmó la expresión de cadenas H y cadenas L de peso molecular correcto. En condiciones no reductoras, el peso molecular de cada anticuerpo humanizado anti-IL-5R \alpha humana es de aproximadamente 140 kDa. Por tanto, se confirmó la expresión de un anticuerpo injertado con CDR humano del tamaño correcto compuesto de dos cadenas H y dos cadenas L. Además, se analizaron las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal para las cadenas H y L de los anticuerpos humanizados purificados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, KM7399 y KM9399, con un secuenciador de proteínas (470A, Applied Biosystems) por el método de Edman automático. Como resultado, se espera que se obtengan las secuencias correctas de aminoácidos.

(5) Reactividades de los anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos con la IL-5R \alpha humana (método ELISA 2)

Se determinaron las reactividades del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG1 de anticuerpos humanos, KM1399, del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG1 de anticuerpos humanos, KM8399, del anticuerpo quimérico humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, KM7399, y del anticuerpo injertado con CDR humano anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4, KM9399, con la IL-5R \alpha humana mediante el método ELISA 2 descrito en la subsección (2) de la sección 3 del ejemplo 2. Los resultados se muestran en la figura 54. Tal como se observa a partir de la figura 54, los anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG4 de anticuerpos humanos demostraron tener una reactividad con la IL-5R \alpha humana tan fuerte como la reactividad de los anticuerpos humanizados anti-IL-5R \alpha humana de la subclase IgG1.

Ejemplo 3 1. Confirmación de la especificidad de los anticuerpos anti-hIL-5R \alpha

La especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hIL-5R \alpha y de los anticuerpos humanizados anti-hIL-5R \alpha se confirmó mediante los procedimientos siguientes, utilizando tinción inmunocítica.

En resumen, se suspendieron 5 x 10^{5} células obtenidas transfectando un gen de IL-5R humana en células CTLL-2 (ATCC TIB 214) [denominadas en lo sucesivo "CTLL-2(h5R)"] [J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)] o 5 x 10^{5} células CTLL-2 como control, en un tampón de tinción inmunocítica (PBS que contiene 1% de BSA, 0,02% de EDTA y 0,05% de azida sódica) y se administraron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (100 \mul/pocillo). Tras centrifugar a 350 x g durante 1 minuto a 4ºC, se desechó el sobrenadante. A continuación, se añadieron 50 \mul del tampón de tinción inmunocítica que contiene 10 \mug/ml de un anticuerpo hIL-5R \alpha a cada pocillo y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 30 minutos. Tras la reacción, se añadió tampón de tinción inmunocítica (200 \mul/pocillo) y se centrifugó a 350 x g durante 1 minuto a 4ºC y después se eliminó el sobrenadante para lavar las células. La operación de lavado se repitió dos veces más. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 \mul del tampón de tinción inmunocítica que contiene anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón marcado con FITC o anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado con FITC (ambos fabricados por Wako Pure Chemical Industries, Ltd), diluido 30 veces con un tampón de tinción, y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 30 minutos. Tras la reacción, se repitió una operación de lavado similar tres veces. Después se analizaron las células con un citómetro de flujo (Coulter).

Los resultados se muestran en la figura 55. Los anticuerpos monoclonales KM1257, KM1259 y KM1486 y los anticuerpos humanizados KM1399, KM7399, KM8399 y KM9399 no reaccionaron con las células CTLL-2, pero reaccionaron específicamente con CTLL-2(h5R). Por tanto, ha quedado claro que los anticuerpos humanizados KM1399, KM7399, KM8399 y KM9399 reconocen específicamente hIL-5R \alpha.

2. Acción de los anticuerpos anti-IL-5R \alpha para inhibir la actividad biológica de la IL-5

Puesto que las células CTLL-2(h5R) muestran una respuesta de proliferación que depende de la IL-5 humana [J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)], se examinó el efecto de los anticuerpos anti-IL-5R \alpha sobre la proliferación de células dependientes de IL-5 humana en células CTLL-2(hTR). La proliferación celular se evaluó mediante un método desarrollo de color utilizando el kit Cell Counting (kit de recuento de células) (Dojin Chemical Laboratory).

En resumen, se suspendieron 1 x 10^{4} células CTLL-2(h5R) en 50 \mul de un medio normal y se administraron a placas de cultivo celular de 96 pocillos. Estas células se mezclaron con 25 \mul/pocillo de varios anticuerpos anti-IL-5R \alpha diluidos con medio normal a 40 \mug/ml y con 25 \mul/pocillo de un medio normal que contiene IL-5 humana a 0,4 ng/ml, tal como se prepara por el método descrito en la sección 3 del ejemplo 1 y se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 44 horas. Después, se añadieron 10 \mul/pocillo de la disolución del kit Cell Counting a la placa y las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} al 5% a 37ºC durante otras 4 horas. Tras la finalización del cultivo, se midió la absorbancia a 450 nm con Microwell Plate Reader Emax (Molecular Device). La actividad de inhibición de la proliferación de células CTLL-2(h5R) se calculó mediante la fórmula siguiente.

Inhibición de proliferación en porcentaje = 100 - \frac{A-C}{B-C} \ x \ 100

en la que

A: valor de DO en presencia de un anticuerpo

B: valor de DO en ausencia de un anticuerpo

C: valor de DO en ausencia de IL-5 humana

Los resultados se muestran en la figura 56. Los anticuerpos monoclonales KM1259 y KM1486 y los anticuerpos humanizados KM1399, KM7399, Km8399 y KM9399 inhibieron la proliferación dependiente de la IL-5 humana de las células CTLL-2(h5R). Sin embargo, tal actividad no se reconoció en el anticuerpo monoclonal KM1257.

3. Tinción inmunocítica de eosinófilos humanos

Se preparó una fracción de leucocitos polimorfonucleares a partir de sangre humana normal y se cultivaron durante 3 días en presencia de IL-5 humana para concentrar los eosinófilos. A continuación, se examinó la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hIL-5R \alpha con un citómetro de flujo.

En resumen, se administró Polimorphprep (Nicomed) en ocho tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml (4 ml/tubo) y cada uno se sembró en placa con 6 ml de sangre humana normal heparinizada. A continuación, los tubos se centrifugaron a 500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente para separar y recuperar los leucocitos polimorfonucleares. Los leucocitos polimorfonucleares se suspendieron en un medio normal para dar una concentración de 1,25 x 10^{7} células/10 ml y se administraron en 4 placas de cultivo celular en porciones de 10 ml. Después se añadió IL-5 humana a la suspensión celular hasta una concentración final de 2 ng/ml y las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 3 días. Tras la finalización del cultivo, las células se centrifugaron (1.200 rpm, 5 min) y se suspendieron en el tampón de tinción inmunocítica para dar una concentración de 5 x 10^{6} células/ml.

A continuación, se administraron 5 x 10^{6} células/ml a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Tras centrifugar la placa a 350 x g durante 1 minuto a 4ºC, se eliminó el sobrenadante. Después, se añadieron 50 \mul de tampón de tinción inmunocítica que contiene suero de ratón normal al 10% y se hizo reaccionar a 4ºC durante 30 minutos. Al tampón, se había añadido anticuerpo monoclonal KM1259 marcado con biotina mediante métodos convencionales ["KOSO-KOTAI-HO" (Enzyme Antibody Method), Gakusai Kikaku Co., 1985] o como control, el anticuerpo monoclonal KM341 anti-factor estimulador de colonias de granulocitos humanos marcado con biotina [Agr. Biol. Chem., 53, 1095 (1989)] a una concentración de 10 \mug/ml. Tras la reacción, se añadieron 200 \mul de tampón de tinción inmunocítica a cada pocillo y se centrifugó a 350 x g durante 1 minuto a 4ºC y después se eliminó el sobrenadante y se lavaron las células. La operación de lavado se repitió dos veces más. Después, se añadió estreptavidina marcada con ficoeritrina (Becton Dickinson) diluida 10 veces con el tampón de tinción inmunocítica (50 \mul/pocillo) y se hizo reaccionar a 4ºC durante 30 minutos. Tras la reacción, se repitió 3 veces una operación de lavado similar. A continuación, se realizó el análisis con un citómetro de flujo (Coulter) mediante la dispersión frontal y la dispersión de 90º para aquellas células que se reconocieron como leucocitos polimorfonucleares. Además, las mismas células se tiñeron mediante el método de tinción de May-Grunwald-Giemsa ["SEVSHOKUHOU NO SUBETE" (Review of Staining Methods), Ishiyaku Shuppan Co., 1988] y se observó para determinar los leucocitos polimorfonucleares. Como resultado, se confirmó que el 75% de las células eran eosinófilos.

La figura 57 muestra el histograma obtenido. El anticuerpo monoclonal KM1259 anti-IL-5R \alpha humana mostró una reactividad definitiva. Puesto que el 75% de las células analizadas demostraron ser eosinófilos, se confirmó que el anticuerpo monoclonal KM1259 anti-IL-5R \alpha humana tiene reactividad con los eosinófilos humanos.

4. Inhibición de supervivencia de eosinófilos humanos con anticuerpos anti-IL-5R \alpha

Se prepararon fracciones de leucocitos polimorfonucleares a partir de sangre humana normal y se examinó la acción de los anticuerpos anti-IL-5R \alpha en la supervivencia de los eosinófilos en presencia de IL-5 humana.

En resumen, se administró Polimorphprep (Nicomed) en quince tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml en porciones de 4 ml y cada uno se sembró en placa con 8 ml de sangre humana normal heparinizada. A continuación, los tubos se centrifugaron a 500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente para separar y recuperar los leucocitos polimorfonucleares.

Se preparó una disolución madre de Percoll añadiendo 1 volumen de una disolución de NaCl 1,5 M esterilizada a 9 volúmenes de disolución de Percoll (Pharmacia). Después, se preparó una disolución de Percoll al 80% añadiendo 2 volúmenes de solución salina fisiológica a 8 volúmenes de disolución madre de Percoll, y se preparó una disolución de Percoll al 60% añadiendo 4 volúmenes de solución salina fisiológica a 6 volúmenes de disolución madre de Percoll. Para eliminar los monocitos concomitantes, se administraron 5 ml de disolución de Percoll al 60% en cada uno de los tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml, se sembraron en placa con los leucocitos polimorfornucleares obtenidos previamente suspendidos en medio RPMI1640 y se centrifugaron a 500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente, para separar y recuperar los leucocitos polimorfonucleares precipitados. Además, para eliminar los eritrocitos concomitantes, se administraron 5 ml de disolución de Percoll al 80% en cada uno de dos tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml, se sembraron en placa con los leucocitos polimorfonucleares obtenidos previamente suspendidos en medio RPMI1640 y se centrifugaron a 500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente, para separar y recuperar los leucocitos polimorfonucleares suspendidos en la fase de Percoll.

Posteriormente, las células se administraron a una placa de cultivo celular de 48 pocillos a 2 x 10^{6} células/pocillo y se añadió IL-5 humana a una concentración final de 0,1 ng/ml. Además, se añadió cada uno de los diversos anticuerpos anti-IL-5R \alpha a una concentración final de 1 \mug/ml. Para cada anticuerpo, se cultivaron 2 pocillos y la disolución en cada pocillo se ajustó para tener un volumen final de 1 ml. Las células se cultivaron en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 3 días. Tras la finalización del cultivo, se recuperó el volumen total de la suspensión celular de cada pocillo y se centrifugó (3.000 rpm, 1 minuto) para recuperar las células. Las células así obtenidas se suspendieron en 100 \mul de PBS. Utilizando 50 \mul de esta suspensión, se prepararon muestras con un dispositivo de preparación de muestras celulares, Cytospin3 (Shandon). Tras teñir las muestras mediante el método de tinción de May-Grünwald-Giemsa, se observaron 200 células para cada muestra y se contó el número de eosinófilos.

Los resultados se muestran en la figura 58. Se encontró que los anticuerpos monoclonales KM1259 y KM1486 y los anticuerpos humanizados KM1399, KM7399, KM8399 y KM9399 tenían todos actividad para inhibir la prolongación del tiempo de supervivencia de los eosinófilos mediante la IL-5. Sin embargo, tal actividad no se reconoció en el anticuerpo monoclonal KM1257.

5. Detección de shIL-5R \alpha con anticuerpos anti-hIL-5R \alpha

El anticuerpo monoclonal KM1257 anti-IL-5R \alpha humana diluido con PBS hasta una concentración de 10 \mug/ml se administró en una placa de EIA de 96 pocillos (Greiner) (50 \mul/pocillo) y se dejó a 4ºC durante la noche para permitir que se adsorbiera el anticuerpo. Tras el lavado, se añadieron 100 \mul/pocillo de PBS que contiene albúmina sérica bovina al 1% (BSA) (1% de BSA-PBS) y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear los grupos activos restantes. Tras desechar el 1% de BSA-PBS, se añadió la shIL-5R \alpha purificada obtenida en la subsección (9) de la sección 1 del ejemplo 1 que se había diluido con 1% de BSA-PBS hasta una concentración de 1000-0,1 ng/ml y se hizo reaccionar a 4ºC durante la noche. Tras lavar con Tween-PBS, se añadió el anticuerpo monoclonal KM1259 anti-IL-5R \alpha humana marcado con biotina mediante métodos convencionales ["KOSO-KOTAI-HO" (Enzyme Antibody Method), Gakusai Kikaku Co., 1985] y se diluyó con 1% de BSA-PBS a una concentración de 1 \mug/ml (50 \mul/pocillo) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras el lavado con Tween-PBS, se añadió peroxidasa marcada con avidina (Nippon Reizo) diluida 4000 veces con 1% de BSA-PBS (50 \mul/pocillo) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con Tween-PBS, se añadió disolución de sustrato ABTS [sal diamónica de 2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) para permitir el desarrollo del color. Después, se midió la absorbancia a una DO de 415 nm (NJ2001; Japan Intermed).

Los resultados se muestran en la figura 59. Como resultado, ha quedado claro que shIL-5R \alpha puede medirse utilizando el anticuerpo monoclonal KM1257 anti-IL-5R \alpha humana y el anticuerpo monoclonal KM1259 anti-IL-5R \alpha humana.

6. Detección de shIL-5R \alpha por Western Blot

La shIL-5R \alpha descrita en la subsección (9) de la sección 1 del ejemplo 1 se desnaturalizó térmicamente en tampón de muestra SDS-PAGE que contiene 2-mercaptoetanol, o tampón de muestra SDS-PAGE que no contiene 2-mercaptoetanol. La mezcla resultante se sometió a electroforesis en un gel con gradiente de SDS-PAGE comercial (Atto) y después la proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana de PVDF se sumergió en PBS que contiene el 10% de BSA y se dejó a 4ºC durante la noche para el bloqueo. Tras la finalización del bloqueo, la membrana se lavó meticulosamente con PBS que contiene el 0,05% de Tween. Después, la membrana se sumergió en un sobrenadante de cultivo del hibridoma obtenido en la sección 5 del ejemplo 1 a temperatura ambiente durante 2 horas y se lavó meticulosamente con PBS que contiene el 0,05% de Tween. Además, la membrana de PVDF se sumergió a temperatura ambiente durante 1 hora en una disolución obtenida diluyendo anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) con 1% de BSA-PBS 1000 veces y lavando entonces meticulosamente con PBS que contiene el 0,05% de Tween. Tras el lavado, la disolución se extrajo meticulosamente, se aplicó el reactivo de ECL (Amersham) a la membrana de PVDF y se hizo reaccionar durante 1 minuto. Tras eliminar el reactivo en exceso, la membrana se intercaló entre dos películas de plástico y se colocó en un chasis ("cassette") de sensibilización de película de rayos X para sensibilizar así la película de ECL. De esta manera, se confirmó la reactividad de los anticuerpos.

Los resultados se muestran en la figura 60. KM1257 mostró reactividad, pero KM1259 y KM1486 no.

7. Inmunoprecipitación de shIL-5R \alpha

Se administró un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón (DAKO) diluido con PBS 50 veces a una placa de plástico de EIA de 96 pocillos (200 \mul/pocillo) y se dejó a 4ºC durante la noche para permitir que se adsorbiera el anticuerpo. Tras el lavado con PBS, se añadieron 300 \mul/pocillo del 1% de BSA-PBS y de dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora para realizar el bloqueo. Tras el lavado con PBS, se añadieron a cada pocillo 200 \mul de cada uno de un sobrenadante de cultivo de KM1257, KM1259 o KM1486 (son anticuerpos monoclonales anti-IL-5R \alpha humana obtenidos en los ejemplos anteriores) y se dejaron a 4ºC durante la noche para permitir que se adsorbiera el anticuerpo. Tras lavar la placa, la shIL-5R \alpha obtenida en la sección 1 del ejemplo 1 y diluida con PBS hasta una concentración de 10 \mug/ml se administró a cada pocillo en una cantidad de 50 \mul y se hizo reaccionar a 4ºC durante la noche. Tras lavar la placa con PBS que contiene el 0,05% de Tween, se añadió 5 X tampón de muestra SDS-PAGE sin 2-mercaptoetanol [0,31 M de Tris (pH 6,8), 10% de SDS, 50% de glicerol] o 5 x tampón de muestra SDS-PAGE que contiene 2-mercaptoetanol [0,31 M de Tris (pH 6,8), 10% de SDS, 50% de glicerol, 25% de 2-mercaptoetanol] (50 \mul/pocillo) y se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas mientras se agitaba. La mezcla de reacción se añadió a 200 \mul de PBS y se calentó en un bloque térmico. Después, utilizando un gel con gradiente de SDS-PAGE comercial (Atto), se separaron 25 \mul de la mezcla de reacción. Tras la finalización de la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana de PVDF se sometió a análisis de Western blot según el método descrito en la sección 6 del ejemplo 3 y utilizando KM1257, para detectar así la shIL-5R \alpha.

Los resultados se muestran en la figura 61. Ha quedado claro que la totalidad de KM1257, KM1259 y KM1486 inmunoprecipitan shIL-5R \alpha.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se proporcionan anticuerpos monoclonales KM1257, KM1259 y KM1486 que se unen específicamente a la cadena \alpha del receptor de la IL-5 humana, que se cree que se expresa específicamente en los eosinófilos humanos. Además, se proporcionan anticuerpos humanizados KM1399, KM8399, KM7399 y KM9399 que se unen específicamente a las cadenas \alpha del receptor de la IL-5 humana que se cree que se expresan específicamente en los eosinófilos humanos y que pueden inhibir la actividad biológica de la IL-5 humana. Los anticuerpos de la presente invención son útiles para la detección inmunológica de los eosinófilos humanos en la tinción inmunocítica y para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades alérgicas producidas por la inhibición de la actividad biológica de la IL-5. Debe observarse particularmente que los anticuerpos humanizados de la invención son inferiores en cuanto a la antigenicidad que los anticuerpos monoclonales y se espera que mantengan su efecto durante un largo periodo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): DIRECCIÓN: 6-1, Ohtemachi 1-chome

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Chiyoda-ku

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO. Tokio

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Japón

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 100

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpo contra la cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 106

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR UN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC (ordenador personal) compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAGCTTAC CATGATCATC GTGGCGCATG TA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGATCCCT ACTTACCCAC ATAAATAGGT TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATATCTC ACTTCTCCCA CCTGTCA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTCCACC ATGGAGTTTG GGCTCAGCTG GCTTTTTCTT GTCCTTGTTT TCAAAGGTGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGTGTGAC TTACTTCCTG ATGAAAAG

\hfill

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTCATCA GGAAGTAAGT CACACTGAAC ACCTTTGAAA ACAAGGACAA GAAAAAGCCA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGAGCCCA AACTCCATGG TGGA

\hfill

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTCCACC ATGGCTACAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG G

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 58 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGCTCTGC CTGCCCTGGC TTCAAGAGGG CAGTGCCGAC TTACTTCCTG ATGAAAAG

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTCATCA GGAAGTAAGT CGGCACTGCC CTCTTGAAGC CAGGGCAGGC AGAGCAGGCC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAA

\hfill

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGGAGCA GGGACGTCCG GGAGCCTGTA GCCATGGTGG A

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAGCGGCG GTTCCGGTGA GCCCAAATCT TGTGACAAA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAGCTTCC ACCATGGAGT TTGGGCTCAG CTGG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAGCTTCC ACCATGGAGT TTGGGCTCAG CTGG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGGAACCG CCGCTGCCCT TACCCACATA AATAGGTTG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAGCTTCC ACCATGGCTA CAGGCTCCCG GACG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 76 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATAAGCTA TGAAAACTAC AGCCTTGGAG GAAGCTTAAA TGAGCTCGAT ATCAAGGCCT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCGGGCGC CATGCA

\hfill

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTCAGTGT TAACTGAGGA GCAGGTGAAT TC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGAATTC ACCTGCTCCT CAGTTAACAC TGAGTGGTAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCGTACG GTGGCTGCAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGCAGCCA CCGTACG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGCGACTA GTGGGCCCGC GGCCGC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGCGGCG GGGGGCCCAC TAGTCGCGAG GTAC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS (secuencia codificante)

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..420

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 394 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..393

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 131 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25

\vskip1.000000\baselineskip

5

500

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..420

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 28

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 29

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 412 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..411

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 30

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 137 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 31

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 331 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..330

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 32

\vskip1.000000\baselineskip

14

140

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 33

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Gly Met Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro Asp Ser Leu Lys}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 36

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Phe Tyr Gly Asn Tyr Arg Ala Met Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 37

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp His Asn Gly Val Asn Phe Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 38

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 39

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 40

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Tyr Val Ile His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 41

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 44

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Thr Ser Arg Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 45

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 46

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Thr Tyr Met His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 47

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe Gln}

\sac{Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 48

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Arg Leu Arg Phe Phe Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 49

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 50

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 51

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Ile Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 52

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACCACTCT CACAGTCTCC TCAGCCAGTA CTAAGGGCC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 53

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAGTACTG GCTGAGGAGA CTGTGAGAGT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 54

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCAAGTTG GAAATAAAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 55

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACGTTTTA TTTCCAACTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 56

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGAAACAG CTATGACGCG GCCGCCACCA TGGAATGGAG TTGGATATTT CTCTTTCTCC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTCAGGAAC TGCAGGTGTC CACTCTGAGG TCCAGCT

\hfill

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 57

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGTGTAT CCAGAAGCCT TGCAGGAAAC CTTCACTGAA GCCCCAGGCT TCTTCACCTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCCAGAC TGCACCAGCT GGACCTCAGA GTGGAC

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 58

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTTCTGG ATACACATTC ACTAGTTATG TTATTCACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGCCTTGA GTGGATGGGA TATATTAATC CTTACA

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 59

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 98 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGGCTGT GCTCGTGGAC GTGTCTGCAG TGATTGTGAC TCTGCCTTTG AACCTCTCAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTACTTAGT CCCATCATTG TAAGGATTAA TATATCCC

\hfill

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 60

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCACGAGC ACAGCCTACA TGGAGCTCAG TTCGCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTGTA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACTGTGCG AGAGAAGGAA TTAGGTACTA TGGTCT

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 61

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 100 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTCCCAG TCACGACGGG CCCTTGGTGG AGGCTGAGGA GACTGTGACC AGGGTGCCTT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCCCAGTA GTCTCCCAGT AGACCATAGT ACCTAATTCC

\hfill

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 62

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..420

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 62

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 63

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 63

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 64

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGAAACAG CTATGACGAA TTCCACCATG ATGTCCTCTG CTCAGTTCCT TGGTCTCCTG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCTCTGTT TTCAAGACAT CAGATGT

\hfill

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 65

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGGTGACT CTGTCTCCTA CAGAGGCAGA CAGGGAGGAT GGAGACTGTG TCATCTGGAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCACATCTG ATGTCTTGAA AAC

\hfill

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 66

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGAGACAG AGTCACCATC ACTTGCGGGA CAAGTGAGGA CATTATCAAT TATTTAAACT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATCAACA GAAACCAGGG AAAGCCCCTA AG

\hfill

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 67

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 90 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCAGACCC GCTGCCACTG AACCTTGATG GGACTCCTGA CTGTAATCTT GATGTGTGGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATCAGGAG CTTAGGGGCT TTCCCTGGTT

\hfill

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 68

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGGCAGC GGGTCTGGAA CAGATTTCAC TCTCACCATT AGTAGTCTGC AACCTGAAGA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGCCACT TACTACTGCC AACAGGGT

\hfill

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 69

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTCCCAG TCACGACCGT ACGTTTTATT TCCACCTTGG TCCCTTGGCC GAACGTGTAC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGCGTAT AACCCTGTTG GCAGTAGTAA G

\hfill

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 70

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 70

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 71

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

19

190

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 72

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCACGAGC ACAGCCTACA TGGAGCTCAG TTCGCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTGTA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCTGTGGG AGAGAAGGAA TTAGGTACTA TGGTCT

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 73

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..420

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 73

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 74

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 74

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 75

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTTCTGG ATACACATTC ACTAGTTATG TTATTCACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGCCTTGC GTGGATGGGA TATATTAATC CTTACA

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 76

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 98 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGGCTGT GCTCGTGGAC CTGTCTGCAG TGATTGTGAC TCTGCCTTTG AACCTCTCAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTACTTAGT CCCATCATTG TAAGGATTAA TATATCCC

\hfill

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 77

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..420

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 77

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 78

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 78

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 79

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTTCTGG ATACACATTC ACTAGTTATG TTATTCACTG GGTGCGACAG AGGCCTGGTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGCCTTGC GTGGATGGGA TATATTAATC CTTACA

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 80

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 98 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGACTGT GCTCGTGGAC CTGTCTGAAG TGATTGTGAC TTTGCCTTTG AACCTCTCAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTACTTAGT CCCATCATTG TAAGGATTAA TATATCCC

\hfill

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 81

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCACGAGC ACAGTCTACA TGGAGCTCAG TTCGCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTGTA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCTGTGGG AGAGAAGGAA TTAGGTACTA TGGTCT

\hfill

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 82

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..420

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..57

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 82

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 83

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 83

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 84

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGAGACAG AGTCACCATC ACTTGCGGGA CAAGTGAGGA CATTATCAAT TATTTAAACT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATCGGCA GAAACCAGGG AAAGCCCCTG AA

\hfill

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 85

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 90 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCAGACCC GCTGCCACTG AACCTTGATG GGACTCCTGA CTGTAATCTT GATGTGTGGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATCAGGAG TTCAGGGGCT TTCCCTGGTT

\hfill

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 86

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTCCCAG TCACGACCGT ACGTTTTATT TCCACCTTGG TCCCTTGGCC GACCGTGTAC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGCGTAT AACCCTGTTG GCAGTAGTAA G

\hfill

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 87

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 87

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 88

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 88

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 89

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGAGACAG AGTCACCATC GGTTGCGGGA CAAGTGAGGA CATTATCAAT TATTTAAACT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATCGGCA GAAACCAGGG AAAGCCCCTG AA

\hfill

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 90

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGGCAGC GGGTCTGGAA CAGATTTCAC TCTCACCATT AGTGACCTGC AACCTGAAGA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGCCACT TACTACTGCC AACAGGGT

\hfill

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 91

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 91

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 92

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 92

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 93

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGGTGACT CTGTCTCCTA CAGAGGCAGA CAGGGAGGAT GTAGCCTGTG TCATCTGGAT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCACATCTG ATGTCTTGAA AAC

\hfill

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 94

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGAGACAG AGTCACCATC GGTTGCGGGA CAAGTGAGGA CATTATCAAT TATTTAAACT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATCGGAA GAAACCAGGG AAAGCCCCTG AA

\hfill

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 95

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGGCAGC GGGTCTGGAA CAGATTTCAC TCTCACCATT AGTGACCTGC AACCTGAAGA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGCCACT TACTTTTGCC AACAGGGT

\hfill

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 96

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTCCCAG TCACGACCGT ACGTTTTATT TCCACCTTGG TCCCTTGGCC GACCGTGTAC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGCGTAT AACCCTGTTG GCAAAAGTAA G

\hfill

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 97

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 97

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 98

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 98

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 99

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGAGACAG AGTCACCATC GGTTGCGGGA CAAGTGAGGA CATTATCAAT TATTTAAACT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATCGGAA GAAACCAGGG AAAGCCGTTG AA

\hfill

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 100

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 90 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCAGACCC GCTGCCACTG AACCTTGATG GGACTCCTGA CTGTAATCTT GATGTGTGGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATCAGGAG TTCAACGGCT TTCCCTGGTT

\hfill

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 101

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGGCAGC GGGTCTGGAA CAGATTATAC TCTCACCATT AGTGACCTGC AACCTGAAGA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGCCACT TACTTTTGCC AACAGGGT

\hfill

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 102

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..381

\vskip0.800000\baselineskip

(v): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..60

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 102

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 103

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 103

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 104

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 105

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN:/desc= "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG GCACTCATTT ACCCAGAGAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 106

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 313 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 106

34

35

Claims

1. Anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con una cadena \alpha del receptor de la interleucina 5 humana, en el que el anticuerpo se une a un epítopo en las posiciones 1-313 de la secuencia de aminoácidos N-terminal de una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana y que inhibe una actividad biológica de la interleucina-5 humana.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que pertenece a la subclase IgG1, siendo las secuencias de CDR en la región variable (región V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: Asp Tyr Gly Met Ala;

CDR2: Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro Asp Ser Leu Lys Gly; y

CDR3: Arg Gly Phe Tyr Gly Asn Tyr Arg Ala Met Asp Tyr;

y siendo las secuencias de CDR en la región V de la cadena ligera (cadena L) las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp His Asn Gly Val Asn Phe Met Asn;

CDR2: Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser; y

CDR3: Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr.

3. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, que es el anticuerpo monoclonal KM1257 producido por el hibridoma KM1257 (FERM BP-5133).

4. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que pertenece a la subclase IgG1, siendo las secuencias de CDR en la región V de la cadena H del anticuerpo las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: Ser Tyr Val Ile His;

CDR2: Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys Gly; y

CDR3: Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr;

y siendo las secuencias de CDR en la región V de la cadena L las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr Leu Asn;

CDR2: His Thr Ser Arg Leu Gln Ser, y

CDR3: Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr.

5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4, que es el anticuerpo monoclonal KM1259 producido por el hibridoma KM1259 (FERM BP-5134).

6. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que pertenece a la subclase IgG1, siendo las secuencias de CDR en la región V de la cadena H del anticuerpo las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: Asp Thr Tyr Met His;

CDR2: Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe Gln Ala; y

CDR3: Gly Leu Arg Leu Arg Phe Phe Asp Tyr;

CDR1: Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His;

CDR2: Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser; y

CDR3: Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Ile Thr.

7. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6, que es el anticuerpo monoclonal KM1486 producido por el hibridoma KM1486 (FERM BP-5651).

8. Hibridoma KM1257 (FERM BP-5133) que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.

9. Hibridoma KM1259 (FERM BP-5134) que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4.

10. Hibridoma KM1489 (FERM BP-5651) que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6.

11. Anticuerpo humanizado que reacciona específicamente con una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en las posiciones 1-313 de la secuencia de aminoácidos N-terminal de una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana y que inhibe una actividad biológica de la interleucina-5 humana.

12. Anticuerpo según la reivindicación 11, que pertenece a la clase de IgG de anticuerpos humanos.

13. Anticuerpo según la reivindicación 11, que es un anticuerpo quimérico humano.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo quimérico que comprende la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo de animal no humano, así como la región constante (región C) de la cadena H y la región C de la cadena L de un anticuerpo humano.

15. Anticuerpo según la reivindicación 14, en el que la región V de la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 27 y la región V de la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 29.

16. Anticuerpo según la reivindicación 14, en el que la región V de la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 31 y la región V de la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 33.

17. Anticuerpo según la reivindicación 15, que es el anticuerpo KM1399, producido por un transformante KM1399 (FERM BP-5650), en el que la región C de la cadena H del anticuerpo pertenece a una subclase IgG1 de anticuerpos humanos.

18. Anticuerpo según la reivindicación 15, que es el anticuerpo KM7399, producido por un transformante KM7399 (FERM BP-5649), en el que la región C de la cadena H del anticuerpo pertenece a la subclase IgG4 de anticuerpos humanos.

19. Transformante KM1399 (FERM BP-5650) que produce el anticuerpo según la reivindicación 17.

20. Transformante KM7399 (FERM BP-5649) que produce el anticuerpo según la reivindicación 18.

21. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR humano.

22. Anticuerpo según la reivindicación 21, en el que el anticuerpo injertado con CDR humano se obtiene sustituyendo secuencias de CDR en la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo humano por secuencias de CDR en la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo de animal no humano.

23. Anticuerpo según la reivindicación 22, en el que una secuencia de CDR en la región V de la cadena H del anticuerpo comprende una secuencia de CDR en la región V de la cadena H del anticuerpo según la reivindicación 4 y una secuencia de CDR en la región V de la cadena L del anticuerpo comprende una secuencia de CDR en la región V de la cadena L del anticuerpo según la reivindicación 4.

24. Anticuerpo según la reivindicación 22, en el que una secuencia de CDR en la región V de la cadena H del anticuerpo comprende una secuencia de CDR en la región V de la cadena H del anticuerpo según la reivindicación 6 y una secuencia de CDR en la región V de la cadena L del anticuerpo comprende una secuencia de CDR en la región V de la cadena L del anticuerpo según la reivindicación 6.

25. Anticuerpo según la reivindicación 23, que es el anticuerpo KM8399, producido por un transformante KM8399 (FERM BP-5648), en el que la región C de la cadena H del anticuerpo pertenece a la subclase IgG1 de anticuerpos humanos.

26. Anticuerpo según la reivindicación 23, que es el anticuerpo KM9399, producido por un transformante KM9399 (FERM BP-5647), en el que la región C de la cadena H del anticuerpo pertenece a la subclase IgG4 de anticuerpos humanos.

27. Transformante KM8399 (FERM BP-5648) que produce el anticuerpo según la reivindicación 25.

28. Transformante KM9399 (FERM BP-5647) que produce el anticuerpo según la reivindicación 26.

29. Anticuerpo de cadena sencilla que reacciona específicamente con una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en las posiciones 1-313 de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana y que inhibe una actividad biológica de la interleucina-5 humana.

30. Anticuerpo según la reivindicación 29, en el que el anticuerpo de cadena sencilla comprende la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo humanizado.

31. Anticuerpo de cadena sencilla según la reivindicación 29, en el que las secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L comprenden secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4.

32. Anticuerpo de cadena sencilla según la reivindicación 29, en el que las secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L comprenden secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5.

33. Anticuerpo estabilizado con disulfuro, que reacciona específicamente con una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en las posiciones 1-313 de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana y que inhibe una actividad biológica de la interleucina-5 humana.

34. Anticuerpo estabilizado con disulfuro según la reivindicación 33, que comprende la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo humanizado.

35. Anticuerpo estabilizado con disulfuro según la reivindicación 33, en el que las secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L comprenden las secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4.

36. Anticuerpo estabilizado con disulfuro según la reivindicación 33, en el que las secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L comprenden las secuencias de CDR en la región V de la cadena H y en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6.

37. Péptido que comprende una secuencia de CDR en la región V de la cadena H o en la región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, 4 ó 6, que tiene una reactividad con la cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana.

38. Composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 18, 21 a 26 ó 29 a 36, opcionalmente en combinación con medios adecuados para la detección.

39. Método in vitro para la detección inmunológica de una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana o de una célula que expresa dicho receptor en su superficie o para detectar eosinófilos humanos o para detectar y determinar una cadena \alpha del receptor de la interleucina-5 humana mediante una cualquiera de los anticuerpos según las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 18, 21 a 26 ó 29 a 36.

40. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 18, 21 a 26 ó 29 a 36, opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

41. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 18, 21 a 26 ó 29 a 36 para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir la eosinofilia y/o para tratar enfermedades alérgicas, preferiblemente el asma bronquial, para tratar enfermedades que impliquen eosinofilia, o para tratar enfermedades alérgicas.