SK280610B6 - Monoklonálna a humanizovaná monoklonálna protilátk - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka monoklonálnej alebo humanizovanej protilátky, alebo fragmentu, hybridómu, polypeptidu, izolovanej DNA, rekombinantného vektora, hostiteľskej bunky, spôsobu prípravy polypeptidu a farmaceutického prostriedku.

Doterajší stav techniky

Interleukín-5 (IL-5) je lymfokín vylučovaný aktivovanými T bunkami a je biologicky aktívny proti B bunkám a eozinofilom. Pretože IL-5 nahradzuje T lymfocyty v in vitro odpovediach protilátok na tymus-dependentné antigény, bol pôvodne nazývaný T bunky nahradzujúcim faktorom (TRF; Dutton a kol., Prog. Immunol. 1, 355 (1971), Schimpl a kol., Náture 237, 15 (1972)). Vzhľadom na to, že taktiež stimuluje diferenciáciu B lymfocytov na IgM a IgG plaky-tvoriace bunky a rast lymfatických B buniek in vitro, bol taktiež nazývaný rastovým faktorom B buniek II (BCGFII; Takatsu akol., J. Immunol. 124, 2414 (1980)).

Myší IL-5 tvorí 133 aminokyselinových zvyškov, vrátane signálnej sekvencie s 20 zvyškami a 3 potenciálnymi miestami pre N-glykozyláciu. Deglykozylácia neobsahuje biologickú aktivitu myšieho IL-5 a esej proliferácie B buniek (Tavemier a kol., DNA 8, 941 (1989)). Ľudský IL-5 tvorí 134 aminokyselinových zvyškov, vrátane signálnej sekvencie s 19 zvyškami a 2 potenciálnymi miestami pre N-glykozyláciu. Štruktúry oboch proteínov boli opísané (Yokota a kol., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 84, 7388 (1987) a Kinashi a koľ, Náture 324, 70 (1986)). Stupne homológie nukleotidovej a aminokyselinovej sekvencie myšieho a ľudského IL-5 sú 77 %, resp. 70 %.

Oba, tak myší, ako ľudský IL-5 existujú ako homodiméry spojené disulfidovými mostíkmi. Glykozylovaný rekombinantný ľudský IL-5 preto migruje pri elektroforéze v polyakrylamidovom géli s SDS so zdanlivou relatívnou molekulovou hmotnosťou 40 000 daltonov za neredukujúcich podmienok a so zdanlivou relatívnou molekulovou hmotnosťou 20 000 daltonov za redukujúcich podmienok (Tsujimoto a kol., J. Biochem. 106, 23 (1989)).

Klonovanie a expresia myšieho IL-5 bolo opísané, (napr. Kinashi a kol., Náture 324, 70 (1986) a Takatsu a kol., J. Immunol. 134, 382 (1985)). Ľudská IL-5 komplementárna DNA (cDNA) bola izolovaná použitím myšej IL-5 cDNA ako próby (Azuma a kol., Nucleic Acids Res. 14, 9149 (1986)).

IL-5 bol predstavený ako podporný a diferenciačný faktor eozinofilov. Zdá sa, že u človeka je aktivita IL-5 špecifická a postihuje primáme eozinofily. Ľudský IL-5 indukuje prekurzorové bunky eozinofilov tak, že z nich vznikajú maturované bunky. Navyše je možné predĺžiť životnosť eozinofilov izolovaných z krvného obehu tým, že je v kultivačnom médiu prítomný ľudský IL-5. Ľudský IL-5 taktiež stimuluje degranuláciu kultivovaných eozinofilov a uvoľňovanie toxických proteínov ako je hlavný bázický proteín (major basic proteín, MBP) a neurotoxíny odvodené z eozinofilov (eosinophil-derived neurotoxin, EDN) (Kita a kol., J. Immunol. 149, 629 (1992)).

Predpokladalo sa, že eozinofily zabíjajú parazity po bezprostrednom infikovaní a majú taktiež signifikantnú úlohu pri zápalových a alergických ochoreniach (pozri napr. Sanderson, Blood 79, 3101 (1992)). Zvýšené hladiny eozinofilov medzi obehovými leukocytmi boli pozorované bezprostredne po infekciách parazitmi a v určitých chronicky zápalových tkanivách, ako sú astmatické alveoly. Infiltrácia eozinofilu a uvoľnenie toxickej granuly z eozinofilov môže mať úlohu pri deštrukcii tkanív a môže vyvolať symptómy astmy.

Napr. Gleich a kol. (Adv. Immunol. 39, 177 (1986)) a Frigas a kol. (J. Allergy Clin. Immunol. 77, 527 (1986)) zistili, že vysokohustotné eozinofily a hlavný bázický proteín eozinofilov (MBP) sú asociované s bronchiálnou astmou a od toho odvodenými poškodenými tkanivami.

Nedávno bolo zistené (Coffman a kol., Intemational Patent Application Publication No. WO/O4979), že protilátky proti IL-5 môžu predchádzať alebo redukovať eozinofiliu, ktorá je spojená s určitými alergickými ochoreniami ako je astma. Monoklonálne protilátky, ktoré sa špecificky viažu na a neutralizujú biologickú aktivitu ľudského IL-5, sa dajú na tento účel použiť.

Monoklonálna protilátka proti IL-5 bola opísaná s tým, že má významný účinok pri parazitmi indukovanej reverznej eozinofflii experimentálnych zvierat (Schumacher a kol., J. Immunol. 141, 1576 (1988); Coffman akol., Science 245, 308 (1989)), čo naznačuje, že neutralizujúce protilátky je možné klinicky použiť pri zmierňovaní symptómov spojených s eozsinofíliou tým, že antagonizujú IL-5. Bolo zistené, že pri hlodavcoch alebo opiciach s experimentálne indukovanou eozinofíliou, na ktoré bolo pôsobené TRFK 5, krysou-anti-myšou IL-5 monoklonálnou protilátkou, bol eozinofil v oboch obehoch a bronchiálna laváž sa vrátila na normálnu úroveň. Tak môžu byť neutralizujúce monoklonálne protilátky účinnými antagonistmi.

Pretože je väčšina monoklonálnych protilátok pôvodom z hlodavcov, je zvýšená pravdepodobnosť, že budú imunogenné pri terapeutickom použití v humánnej medicíne, najmä pri dlhodobej aplikácii. K zmenšení tejto možnosti sú nutné rekombinantné alebo „humanizované“ protilátky proti ľudskému IL-5. Takéto protilátky je možno použiť na liečbu stavov spojených s eozinofíliou alebo na liečbu akéhokoľvek stavu, ktorý sa dá prisúdiť biologickej aktivite IL-5.

Počiatočné úsilie na zníženie imunogenicity protilátok z hlodavcov zahŕňalo produkciu chimérických protilátok, do ktorých boli včlenené myšie variabilné oblasti spolu s ľudskými konštantnými oblasťami (Liu a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3439 (1987)). Ukázalo sa však, že myši, ktorým boli injikované hybridy ľudských variabilných oblastí a myších konštantných oblastí, mali silnú odpoveď proti protilátke namierenou proti ľudskej variabilnej oblasti. To naznačuje, že v ľudskom systéme je možné ešte zvýšiť retenciu celej Fv oblasti hlodavcov v takých chimerických protilátkach proti ľudským anti-myším protilátkam.

Všeobecne sa predpokladá, že CDR slučky variabilných domén obsahujú väzbové miesta pre molekuly protilátok, a preto bolo pripojenie CDR slučiek hlodavcov do ľudských systémov (t. j. humanizácia) použité k ďalšej minimalizácii sekvencií pôvodom z hlodavcov (Jones a kol., Náture 321, 522 (1986); Verhoeyen a kol., Science 239, 1534 (1988)). Štúdie Kabata a kol. (J. Immunol. 147, 1709 (1991)) ukázali, že rezíduá rámcov variabilných domén protilátky sú začlenené v podpornej CDR slučke. Bolo taktiež zistené, že zmeny v podporných rezíduách rámcov v humanizovaných protilátkach môžu byť nutné k ochrane antigén-väzbovej afinity. Použitie CDR pripojení a ochrana rezídua rámca v mnohých humanizovaných konštrukciách protilátok boli opísané napr. Queen a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)), Gormanem a kol., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4181 (1991)) a Hodgsonem (Bio/Technology 9, 421 (1991)). Presné údaje o sekvenciách boli opísané iba pre niekoľko humanizovaných konštrukcií.

SK 280610 Β6

Pretože vysoký stupeň sekvenčnej identity medzi ľudskými a živočíšnymi protilátkami je dôležitý pre výber sekvencií ľudskej protilátky pre humanizáciu, pôvodné štúdie používali rôznu ľudskú sekvenciu pre ľahké a ťažké variabilné sekvencie zvierat. Boli použité sekvencie známych protilátok, alebo častejšie tieto protilátky so známymi štruktúrami podľa X-lúčovej kryštalografie, protilátky NEW a KOL. Pozri napr. Jones a koľ, Verhoeyen a koľ, Gorman a kol.

Metódy konštrukcie protilátok boli opísané, napr. pozri Boss a kol. (U. S. Patent No. 4,816,397), Cabilly a kol. (U. S. Patent No. 4,816,567), Law a kol. (European Patent Application Publication No. 438 310) a Winter (European Patent Application Publication No. 239 400).

Spoľahlivosť relatívne malého počtu protilátok so známymi kryštalografickými štruktúrami viedli k častému používaniu rozličných ľudských sekvencii ľahkých a ťažkých reťazcov rozličných protilátok, pretože i keď sú známe iba dve ľudské Fab kryštálové štruktúry, bolo zistené niekoľko kryštálových štruktúr ľudského ľahkého reťazca. Taký postup vyžaduje zmeny rezíduí rámca v ľudských ťažkých a ľahkých reťazcoch na zabezpečenie správnej asociácie reťazcov a preto limituje aplikovateľnosť hunabizácie.

Preto sú potrebné vylepšené metódy na prípravu humanizovaných protilátok, ktoré nie sú založené na relatívne málo známych kryštalografických štruktúrach.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je monoklonálna protilátka alebo fragment, ktorý sa špecificky viaže na ľudský interleukín-5, ktorá má ťažký reťazec variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky definovaný sekvenciou id. č. 1 a ľahký reťazec variabilnej oblasti definovaný sekvenciou id. č. 2 a ktorá je produkovaná hybridómom s identifikačnými charakteristikami bunkovej línie uloženej pod označením ATCC HB 10959.

Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku proti ľudskému interleukínu-5, ktorý má ťažký reťazec variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky je definovaný sekvenciou id. č. 1 a ľahký reťazec variabilnej oblasti je definovaný sekvenciou id. č. 2 uložený v ATCC HB 10959.

Polypeptid je charakterizovaný aminokyselinovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 1 alebo nukleotidovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 2.

Izolovaná DNA je charakterizovaná nukleotidovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 1 alebo nukleotidovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 2 a nukleotidovou sekvenciou kódujúcou aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 1 alebo sekvenciou id. č. 2.

Rekombinantný vektor zahŕňa DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 1 a sekvenciou id. č. 2.

Hostiteľské bunky zahŕňajú rekombinantný vektor obsahujúci DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 1 a sekvenciou id. č. 2.

Vynález opisuje aj spôsob prípravy polypeptidu, ktorý zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek obsahujúcich rekombinantný vektor, ktorý zahŕňa DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu id. č. 1 alebo id. č. 2 v podmienkach, pri ktorých dochádza k expresii DNA.

Vynález sa týka aj humanizovanej monoklonálnej protilátky alebo fragmentu, ktorý sa špecificky viaže na ľudský interleukín-5 a zahŕňa CDRs z ťažkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 1 a ľahkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 2.

Vynález sa týka aj farmaceutického prostriedku, ktorý zahŕňa humanizovanú monoklonálnu protilátku alebo fragment, ktorá sa špecificky viaže na ľudský interleukín-S a ktorá zahŕňa CDRs z ťažkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 1 a ľahkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 2.

Predkladaný vynález napĺňa predchádzajúce požiadavky použitím doteraz neopísaných humanizovaných protilátok a špecifických antagonistov protilátok ľudského IL-5 a farmaceutických prostriedkov s ich obsahom.

Predložený vynález poskytuje tiež spôsob výberu sekvencií ľudskej protilátky s cieľom použiť ako ľudských rámcov na humanizáciu živočíšnej protilátky zahŕňajúci:

a) porovnanie sekvencii ťažkého a ľahkého reťazca variabilnej oblasti živočíšnej monoklonálnej protilátky určenej pre humanizáciu s optimálne spojenými sekvenciami ťažkého a ľahkého reťazca variabilných oblasti ľudských protilátok s dostupnými údajmi o sekvenciách a tým určenie percent identity pre každú porovnávanú sekvenciu;

b) určenie počtu nejednoznačností v každej z takýchto sekvencii ľudskej protilátky;

c) porovnanie rozmiestnenie Pin-oblastí sekvencii živočíšnej protilátky s (1) každými takýmito sekvenciami ľudskej protilátky a s (2) ďalšími protilátkami, ktoré majú známe trojrozmerné štruktúry; a

d) výber sekvencie ľudskej protilátky s najlepšou kombináciou:

1. malý počet nejednoznačností v sekvencii a

2. vysoké percento identity a podobné rozmiestnenie Pin-oblastí založené na porovnaní so sekvenciami živočíšnej protilátky.

Tento vynález ďalej poskytuje spôsob určenia, ktoré rezíduum variabilnej oblasti živočíšnej monoklonálnej protilátky by malo byť vybrané pre humanizáciu, ktorý zahŕňa:

a) zistenie potenciálnych minimálnych a maximálnych rezíduí živočíšnej monoklonálnej protilátky, kde:

L takéto minimálne rezíduá obsahujú CDR štrukturálne slučky plus rezíduá potrebné k podpore a/alebo orientácii CDR štrukturálnych slučiek, a

2. takéto maximálne rezíduá obsahujú Kabat CDR plus CDR štrukturálne slučky, plus rezíduá potrebné k podpore a/alebo orientácii CDR štrukturálnych slučiek, plus rezíduá, ktoré patria k 10 A°CDR štrukturálnym slučkám a majú vodorozpustný dostupný povrch s 5 A°² alebo väčší;

b) prevedenie počítačového modelovania:

L sekvencii živočíšnej monoklonálnej protilátky určenej pre humanizáciu,

2. sekvencie rámca ľudskej protilátky a

3. všetkých možných rekombinantov protilátok obsahujúcich sekvenciu rámca ľudskej protilátky, do ktorej boli vložené minimálne a maximálne rezíduá podľa kroku a), a toto počítačové modelovanie využíva softvér vhodný k modelovaniu proteínov a využíva štrukturálne informácie štrukturálne charakterizovanej protilátky, ktorá má čo najviacej identickú sekvenciu k vybranej sekvencii rámca ľudskej protilátky;

c) porovnanie výsledkov získaných počítačovým modelovaním podľa kroku b); a

d) výber minimálnych alebo maximálnych rezíduí, ktoré produkujú rekombinantnú protilátku, ktorá má počítačom vymodelovanú štruktúru najbližšiu živočíšnej monoklonálnej protilátke. Výhodne je sekvencia rámca ľudskej protilátky vybraná, ako je opísané.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje monoklonálnu protilátku produkovanú hybridómom s identifikujúcimi charakteristikami bunkovej línie uloženej pod č. ATCC HB

10959 v Američan Type Culture Collection Accession a vlastný hybridom.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polypeptidy obsahujúce ťažký alebo ľahký reťazec variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu definovanú SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, komplementaritu určujúce oblasti CDR z takýchto variabilných oblastí a izolované DNA kódujúce takéto variabilné oblasti a CDR. Tieto DNA sa dajú použiť na konštrukciu väzbových prostriedkov, jednoreťazcových väzbových proteínov, polypeptidov, ktoré obsahujú jeden alebo viacej CDR a zachovávajú antigén-väzbovú aktivitu, a rekombinantných protilátok obsahujúcich takéto CDR, ktoré všetky sú súčasťou predkladaného vynálezu.

Tento vynález ďalej poskytuje farmaceutické prostriedky obsahujúce takúto monoklonálnu protilátku alebo rekombinantné protilátky, väzbové prostriedky, jednoreťazcové väzbové proteíny a polypeptidy; a fyziologicky prijateľný nosič.

Tu uvedený termín „DNA“ definuje molekuly obsahujúce deoxyribonukleotidy spojené v štandardnom od 5’ do 3' fosfodiesterovom spojení a zahŕňa oba menšie oligodeoxyribonukleotidy a väčšie deoxyribonukleové kyseliny.

Protilátky obsahujú zoskupenie polypeptidových reťazcov spojených disulfidickými mostíkmi. Dva hlavné polypeptidové reťazec opísané ako ľahký a ťažký reťazec tvoria všetky hlavné štrukturálne triedy (izotypy) protilátky. Ťažké i ľahké reťazce sú ďalej rozdelené do suboblastí, ktoré sú opísané ako variabilné a konštantné oblasti. Ťažké reťazce obsahujú jednu variabilnú oblasť a 3 alebo 4 rôzne konštantné oblasti a ľahké reťazce obsahujú jednu oblasť (rôznu od ťažkého reťazca) a jednu konštantnú oblasť (rôznu od oblastí ťažkého reťazca). Variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sú zodpovedné za väzbovú špecifrtu protilátky.

Tu uvedený termín „CDR štrukturálne slučky“ znamená oblasti troch ľahkých a troch ťažkých reťazcov vo variabilnej časti protilátky, ktoré spojujú β vlákna na väzbovú časť molekuly. Tieto slučky majú charakteristické kanonické štruktúry (Chothia a kol., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987); Chothia a kol., J. Mol. Biol. 227, 799 (1992)).

Termín „Kabat CDR“ sa vzťahuje k hypervariabilnej sekvencii protilátky na ťažkom a ľahkom reťazci, ako definoval Kabat a kol. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, 1987, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health).

Tu uvedený termín „ťažký reťazec variabilnej oblasti“ znamená polypeptid, ktorý má dĺžku zhruba od 110 do 125 aminokyselinových zvyškov, jeho aminokyselinová sekvencia zodpovedá sekvencii ťažkého reťazca monoklonálnej protilátky podľa predkladaného vynálezu počínajúc od N-konca aminokyselinového zvyšku ťažkého reťazca. Okrem toho termín „ľahký reťazec variabilnej oblasti“ znamená polypeptid, ktorý má dĺžku zhruba od 95 do 130 aminokyselinových zvyškov, jeho aminokyselinová sekvencia zodpovedá sekvencii ľahkého reťazca monoklonálnej protilátky podľa predkladaného vynálezu počínajúc od N-konca aminokyselinového zvyšku ľahkého reťazca.

Termíny Fab, Fc, F(ab)₂ a Fv sú použité v ich štandardných imunologických významoch (Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, kapitola 14, v Weir, Ed. Immunochemistry, 4th Ed. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986)).

Tu uvedený termín „monoklonálna protilátka“ znamená homogénnu populáciu imunoglobulínov, ktoré sú schopné špecifickej väzby na ľudský IL-5. Ľudský IL-5 môže mať jeden alebo viacej antigénnych determinantov obsahujúcich

1. peptidové antigénne determinanty, ktoré sa skladajú z jedného peptidického reťazca ľudského IL-5, 2. konformačné antigénne determinanty, ktoré sa skladajú z viacej ako jedného priestorovo blízkych peptidových reťazcov, ktorých vlastné aminokyselinové sekvencie sú umiestnené nesúvisle po sekvencii ľudského polypeptidu IL-5, 3. posttranslačné antigénové determinanty, ktoré sa skladajú alebo z celej štruktúry alebo z časti molekulárnych štruktúr kovalentne pripojených k ľudskému IL-5 po translácii, ako sú sacharidové skupiny atď. Protilátky podľa predkladaného vynálezu môžu byť zamerané proti jednému alebo viacerým takým determinantom.

Tu uvedený termín „väzbový prostriedok“ znamená prostriedok, ktorý sa skladá z dvoch polypeptidových reťazcov L, ktoré ak sú funkčne asociované, zaujímajú konformáciu s vysokou väzbovou aktivitou proti ľudskému IL-5, a 2. ktoré sú odvodené od hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky špecifické pre ľudský IL-5. Termín „funkčne asociované“ znamená, že dva polypeptidové reťazce môžu byť relatívne proti sebe postavené mnohými spôsobmi, vrátane postavenia, ktoré zaujímajú v natívnom fragmente protilátky, ako sú Fab alebo Fv, alebo génovou manipuláciou pripravené cystein obsahujúce peptidové spoje alebo iné spoje na C-konci.

Monoklonálne protilátky sa dajú pripraviť štandardnými spôsobmi, opísanými napr. Kohlcrcm a kol., (Náture 256, 495 (1975); Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)). V zásade je vždy živočích štandardným spôsobom imunizovaný s cieľom produkcie somatických buniek sekretujúcich protilátku. Tieto bunky sú následne odobrané z imunizovaného živočícha pre fúziu s bunkami myelómu.

Somatické bunky s potenciálom pre produkciu protilátok, najmä B bunky, sú vhodné pre fúziu s líniou buniek myelómu. Tieto somatické bunky môžu byť odvodené od lymfatických uzlín, slezinných tkanív alebo periferálnej krvi aktivovaných živočíchov. V typickom prípade podľa predkladaného vynálezu boli použité krysie slezinné bunky, pretože tieto bunky poskytujú relatívne vysoké percentá stabilných fúzií s líniami buniek myelómu myší. Namiesto nich by bolo možné použiť taktiež ľudské, myšie, králičie, ovčie alebo kozie bunky, alebo bunky iných druhov.

Špecializované línie buniek myelómu boli kultivované z lymfatických tumorov pre použitie v procedúrach pre fúziu k produkcii hybridómu (Kohler a Milstein, Eur. J. 1mmunol. 6, 511 (1976); Shulman a koľ, Náture 276, 269 (1978); Volk a kol., J. Virol. 42, 220 (1982)). Tieto bunkové línie boli kultivované najmenej na tri účely. Prvým je uľahčenie výberu fúzovaných hybridómov z nefúzovaných a podobne neobmedzene sa rozmnožujúcich buniek myelómu. To je obvykle realizované použitím myelómov s enzýmovou deficienciou, čo im znemožňuje rast v určitom selektívnom médiu a to podporuje rast hybridómov. Druhý dôvod vyplýva z inherentnej schopnosti buniek lymfatického nádoru produkovať ich vlastné protilátky. Predpokladom použitia monoklonálnych techník je získanie fúzovaných hybridných bunkových línií s neobmedzenou dĺžkou života, ktoré produkujú jednu požadovanú protilátku pod genetickou kontrolou zložiek hybridómu somatických buniek. K eliminácii produkcie protilátok nádorových buniek hybridómom sú použité línie buniek myelómu neschopné produkovať endogénne ľahké alebo ťažké imunoglobulínové reťazce. Tretí dôvod výberu týchto bunkových línií je ich vhodnosť a efektívnosť pri fúzii.

Mnoho línií buniek myelómov sa dá použiť k produkcii fúzovaných bunkových hybridov, vrátane napr. P3X63-Ag8, P3X63-AG8.653, P3/NSl-Ag4-1 (NS-1), Sp2/0-Agl4 a S194/5.XXO.Bu.l. P3X63-Ag8.a NS-1 bunkové línie boli opísané, pozri Kohler a Milstein (Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)). Shulman a kol. (Náture 276, 269 (1978)) vyvinuli Sp2/0-Agl4 líniu myelómu. S194/5.XXO.Bu.l línia bola opísaná, pozri Trowbridge (J. Exp. Med. 148,313(1979)).

Spôsoby generovania hybridov buniek sleziny produkujúce protilátku alebo buniek lymfatických uzlín a buniek myelómu obvykle zahŕňajú zmiešanie somatických buniek s bunkami myelómu v pomere 10 : 1 (i keď pomer sa môže líšiť od asi 20 : 1 do asi 1:1), resp. v prítomnosti činidla alebo činidiel (chemických, virálnych alebo elektrických), ktoré vyvolávajú íuziu bunkových membrán. Fúzne spôsoby boli opísané Kohlerom a Milsteinom pozri vyššie, pozri Gefter a kol. (Somatic Celí Genet 3, 231 (1977)) a Volkom a kol. (J. Virol. 42, 220 (1982)). Činidlá vyvolávajúce fúziu použité týmito bádateľmi boli Sendai vírus a polyetylénglykol (PEG).

Pretože fúzne procedúry produkujú životaschopné hybridy vo veľmi nízkej frekvencii (napr. ak sú slezinné bunky použité ako zdroj somatických buniek, získa sa iba jeden hybrid na zhruba každých 105 slezinných buniek), je nutné mať prostriedky k selekcii hybridov fúzovaných buniek zo zvyšných nefúzovaných buniek, najmä nefúzovaných buniek myelómu. Sú taktiež nutné prostriedky k detekcii požadovaných hybridómov produkujúcich protilátku medzi ostatnými výslednými hybridmi fúzovaných buniek.

Všeobecne je selekcia fúzovaných bunkových hybridov realizovaná kultivovaním buniek v médiu, ktoré podporuje rast hybridómu, ale zamedzuje rastu nefúzovaných buniek myelómu, ktoré by sa normálne delili neobmedzene. Somatické bunky použité pri fúzii sa nevyznačujú dlhou životnosťou v in vitro kultúre a nepredstavujú preto problém. V príklade podľa predkladaného vynálezu boli použité bunky myelómu, ktorým chýba hypoxantín-fosforibozyltransferáza (HPRT-negatívne). Selekcia proti týmto bunkám je tvorená v hypoxantín/aminopterín/tymidín (HAT) médiu, t. j. v médiu, kde hybridy fúzovaných buniek prežívajú vďaka HPRT-pozitívnemu genotypu slezinných buniek. Je možné i použitie buniek myelómu s rôznymi genetickými deftcienciami (senzitivita proti niektorým látkam atď.), ktoré môžu byť vyselektované v médiu podporujúcom rast genotypicky kompetentných hybridov.

Na selektívnu kultiváciu hybridov fúzovaných buniek je potrebné niekoľko týždňov. V ranej fáze tohto časového obdobia je nutné identifikovať tie hybridy, ktoré produkujú požadovanú protilátku, takže môžu byť následne klonované a množené. Všeobecne produkuje požadovanú protilátku asi 10 % získaných hybridov, i keď rozsah od asi 1 do 30 % nie je vzácny. Detekcia hybridov produkujúcich protilátku sa dá urobiť niektorým zo štandardných spôsobov, vrátane ELISA testov a RIA techník, ktoré boli opísané v literatúre (pozri napr. Kennet a kol. (Eds), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, str. 376 - 374, Plénum Press, New York, 1980).

Požadované hybridy fúzovaných buniek boli selektované a klonované do jednotlivých bunkových línií produkujúcich protilátku, pričom každú bunkovú líniu je možno množiť každým z dvoch štandardných spôsobov. Suspenzie buniek hybridómu je možno injikovať do histokompatibilného zvieraťa. Toto zviera bude produkovať nádorové bunky, ktoré sekretujú špecifickú monoklonálnu protilátku produkovanú hybridom fúzovaných buniek. Telové tekutiny zvierat, ako je sérum nebo ascitová kvapalina, sú odoberané s cieľom získať monoklonálne protilátky vo vysokých koncentráciách. Alternatívne je možné jednotlivé bunkové línie množiť in vitro v laboratórnych kultivačných nádobách. Kultivačné médium obsahujúce vysoké koncentrácie jednej špecifickej monoklonálnej protilátky je možno získavať dekantáciou, filtráciou alebo centrifugáciou a následne purifíkovať.

Monoklonálne protilátky je možno produkovať použitím dobre známych systémov fágových knihovní.

Použitie a generovanie fragmentov protilátok je dobre známe, napr. Fab fragmenty (Tijssen, Practice and Theoiy of Enzýme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985), Fv fragmenty (Hochman a kol., Biochemistry 12, 1130 (1973); Sharon a kol., Biochemistry 15, 1591 (1976); Ehrlich a kol., US Patent No. 4, 355,023), polovičky molekúl protilátok (Auditore-Hargreaves, US Patent No. 4,470,925). Navyše sa dajú takéto zlúčeniny a prostriedky podľa predkladaného vynálezu použiť na konštrukciu bi-špeciftckých protilátok známymi technikami, napr. ďalšími fúziami hybridómov (t. j. vznik tzv. quadrómov; Reading, US Patent No. 4,474,493) alebo chemickou reasociáciou polovičky molekúl (Brennan a kol., Science 229, 81 (1985)).

Hybridómy a monoklonálne protilátky proti ľudskému IL-5 môžu byť produkované ktorýmkoľvek zdrojom, napr. z komerčných alebo prírodných zdrojov, alebo aplikáciami chemických syntetických metód, alebo technológiou rekombinantnej DNA. Tu použitý názov „rekombinantný 1L-5“ znamená IL-5 produkovaný expresiou rekombinantnej DNA (cDNA) kódujúcej ten istý, tak prokaryotický ako eukaryotický expresný systém. Ďalej je možné génomickú DNA použiť na produkciu IL-5 v eukaryotických systémoch. Vyprodukovaný IL-5 môže a nemusí byť glykozylovaný.

Vzhľadom na to, že nukleotidová sekvencia DNA kódujúca tak myší, ako ľudský IL-5 je známa (pozri napr. Azuma a kol., Nucleic Acids Res. 14, 9149 (1986)), môžu byť takéto DNA syntetizované na tuhej fáze použitím fosforamiditového spôsobu podľa Matteucciho a kol. (J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)), podľa Yooa a kol. (J. Biol. Chem. 764, 17078 (1989)) alebo inými dobre známymi spôsobmi. To sa dá uskutočniť napr. tak, že sú syntetizované relatívne malé oligonukleotidy, ktoré sú ligované dohromady, analogicky spôsobu syntézy DNA kódujúcej IL-2 podľa Barra a kol. (Intemational Patent Application Publication No. Wo 85/02200).

Alternatívne je možno bunky schopné produkovať IL-5 stimulovať k produkcii IL-5 m-RNA, ktorá slúži ako templát na prípravu IL-5 cDNA štandardnými spôsobmi. Potom je možné konštruovať knihovne cDNA, v ktorých je možné identifikovať IL-5 cDNA použitím zmesi oligonukleotidových prób založené na známej informácii o sekvencii. Takúto cDNA je možno potom klonovať a exprimovať v jednom z mnohých expresných systémov baktérií, kvasiniek a cicavcov. Tento spôsob bol použitý na prípravu rekombinantného krysieho, myšieho alebo ľudského IL-5 (pozri napr. Tavemier a kol., DNA 8, 491 (1989), Minamitake a kol., J. Biochem. 107, 292 (1990), Uberla a kol., Cytokine 3, 72 (1991)). Ľudský IL-5 bol pripravený podľa všeobecne vlastnenej U.S. patentovej prihlášky (Serivé č. 07/615,061, vyplnenej 16. 11. 1990) expresiou cDNA kódujúcej ľudský IL-5 v bunkách ovárií čínskeho chrčka (CHO bunky). Tsujimoto a kol. (J. Biochem. 106, 23 (1989)) opisuje taktiež produkciu rekombinantného ľudského IL-5 CHO bunkami.

Podľa ďalšieho spôsobu sa dá zmes oligonukleotidových prób, ktorá vychádza zo známej informácie o sekvencii IL-5 použiť k identifikácii IL-5 génov v knihovniach génomových DNA, pripravených štandardnými spôsobmi. Takto identifikovanú DNA je možné vytiahnuť z knihovne štepením reštrikčnými endonukleázami, sekvenovaním a expresiou v eukaryotickom expresnom systéme alebo (po

SK 280610 Β6 následnej delécii intróna štandardnými spôsobmi, ak je to nutné) v prokaryotickom expresnom systéme. Týmto spôsobom Campbell a kol. (Proc. Acad. Natl. Sci. USA 84, 6629 (1987)) produkoval ľudský IL-5 v opičích obličkových bunkách (COS bunky).

Určite tak cDNA, ako i knihovne genómových DNA sa dajú skúmať aplikáciou štandardných expresných klonovacích spôsobov, namiesto použitia oligonukleotidových prób. Takto produkovaný IL-5 je detekovaný použitím známych imunochemických spôsobov a biotestov.

Polypeptidy IL-5 sa dajú taktiež pripraviť priamo použitím spôsobov syntézy peptidov, pozri Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)); IL-5 sa dá taktiež získať komerčne.

Sotva je hybridóm produkujúci žiadanú monoklonálnu protilátku získaný, dá sa použiť technika na získanie interšpecifických monoklonálnych protilátok, kde je väzbová oblasť species kombinovaná s neväzbovou oblasťou protilátky iného species (Liu a kol., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 84, 3439 (1987)). Napr. CDR z monoklonálnej protilátky hlodavca môžu byť vložené do ľudskej protilátky, a tak protilátku hlodavca „humanizovať“ (Riechmann a kol., Náture 332, 323 (1988)). Osobitne CDR môžu byť vložené do variabilnej oblasti ľudskej protilátky s alebo bez ľudských konštantných oblastí. Takýto spôsob bol použitý napr. pri humanizácii myšej monoklonálnej protilátky proti p55 (Tac) podčasti receptora ľudského interleukínu-2 (Queen a kol., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 86,10029 (1989)).

cDNA podľa predkladaného vynálezu, ktoré kódujú ľahké a ťažké reťazce variabilných oblastí monoklonálnych protilátok špecifických proti ľudskému IL-5 a CDR z takýchto protilátok je možné takým spôsobom zostaviť. Pozície CDR vo variabilných oblastiach protilátok sa dá určiť použitím mnohých dobre známych štandardných spôsobov. Napr. pozri Kabat a kol., publikoval pravidlá na určenie pozície CDR. CDR nájdené podľa týchto pravidiel sú tu nazývané „Kabat CDR“. Sú taktiež dostupné počítačové programy, ktoré sa dajú použiť na identifikáciu CDR štrukturálnych slučiek na základe aminokyselinových zvyškov zahrnutých do trojrozmerných slučiek väzbového miesta reťazcov protilátky, ako je opísané.

Tu použité spôsoby sú použiteľné pri humanizácii širokej škály živočíšnych protilátok. Bol použitý dvojkrokový postup, ktorý zahŕňa: a) výber sekvencii ľudskej protilátky, ktoré boli použité ako ľudský rámec pre humanizáciu a b) zistenie, ktoré rezíduá variabilných oblastí živočíšnej monoklonálnej protilátky by mali byť vybrané na vloženie do vybraného ľudského rámca.

Prvý krok zahŕňa výber najlepších dostupných sekvencií ľudského rámca pre tie sekvencie, pre ktoré sú tieto informácie známe. Tento spôsob výberu zahŕňa nasledujúce kritéria výberu:

1. Percentá identity.

Sekvencie ťažkých a ľahkých reťazcov variabilných oblastí živočíšnej monoklonálnej protilátky určenej pre humanizáciu sú optimálne zoradené a porovnané výhodne so všetkými známymi sekvenciami ťažkých a ľahkých reťazcov variabilných oblastí. To je v kontraste s predchádzajúcimi spôsobmi, ktoré sa veľmi spoliehajú na použitie len dvoch ľudských protilátok, NEW a KOL. Pre tieto protilátky sú známe štrukturálne informácie, pre ktoré sú odvodené označenia podľa iniciál pacientov, od ktorých boli získané. Štruktúra protilátky HIL je v súčasnosti taktiež známa (Brookhaven Code P8FAB).

Sotva sú sekvencie takto porovnané, zvyšné identity sú zaznamenané a sú určené percentá identít. Pri rovnosti ďal ších faktorov je nutné selektovať ľudskú protilátku, ktorá má najvyššie percento identity so živočíšnou protilátkou.

2. Nejednoznačnosť sekvencii.

Známe sekvencie reťazcov ľudskej protilátky sú potom vyhodnotené na prítomnosť neidentifikovaných rezíduí a/alebo nejednoznačností, ktoré sú sekvenčne nepravidelné. Najbežnejšie nepravidelnosti sú spôsobené chybnou identifikáciou kyslej aminokyseliny namiesto amidu aminokyseliny v dôsledku straty amoniaku v priebehu sekvenačnej procedúry, napr. nesprávna identifikácia zvyšku glutámovej kyseliny v prípade, že zvyšok aktuálne prítomný v proteíne bol zvyšok glutamínu. Nepravidelnosti sú identifikované examináciou pomocou databáz, ako je napr. pozri Kabat a kol. Pri rovnosti ďalších faktorov je nutné selektovať reťazec ľudskej protilátky, ktorá má čo najmenej takých nejednoznačností.

3. Rozmiestnenie Pin-oblastí.

Variabilné oblasti reťazca protilátky obsahujú intradoménové disulfidické mostíky. Vzdialenosť (počet rezíduí) medzi cysteinovými zvyškami zahŕňajúcimi tieto mostíky sa týka rozmiestnenia Pin-oblastí (Chothia a kol., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Pri rovnosti ďalších faktorov je najviacej žiaduce selektovať reťazec s rozmiestnením Pin-oblastí ľudskej protilátky s čo najpodobnejším alebo identickým so živočíšnou protilátkou. S cieľom uľahčiť počítačové modelovanie je taktiež žiaduce, aby bolo rozmiestnenie Pin-oblastí v ľudskej sekvencii podobné známej trojrozmernej štruktúre protilátky.

Selekcia ľudskej protilátky alebo protilátok s najlepšou celkovou kombináciou žiaducich charakteristík ako rámca pre humanizáciu živočíšnej protilátky je založená na predchádzajúcich kritériách. Dajú sa použiť ťažké a ľahké reťazce selektované z toho samého alebo rôznych ľudských protilátok.

Druhý krok podľa spôsobu podľa predkladaného vynálezu zahŕňa zisťovanie, ktorá zo sekvencii variabilných oblastí živočíšnej protilátky by mala byť vybraná pre vloženie do ľudského rámca. Tento spôsob selekcie je založený na nasledujúcich kritériách pre selekciu.

1. Selekcia rezíduí.

Dva typy potenciálnych rezíduí variabilných oblastí zo sekvencii živočíšnej protilátky sú vyhodnotené; prvé z nich sa nazývajú „minimálne rezíduá“. Tieto minimálne rezíduá zahŕňajú CDR štrukturálne slučky plus nejaké ďalšie požadované rezíduá podľa nálezu z počítačového modelovania s cieľom podpory a/alebo orientácie CDR štrukturálnych slučiek.

Ďalšie typy potenciálnych rezíduí variabilných oblastí sa nazývajú „maximálne rezíduá“, ktoré zahŕňajú minimálne rezíduá plus Kabat CDR, plus nejaké ďalšie požadované rezíduá zistené podľa nálezu z počítačového modelovania, ktoré patria k 10 A° CDR štrukturálnym slučkám a majú vodorozpustný dostupný povrch (Lee a kol., J. Biol. Chem. 55, 379 (1971)) s 5 A² alebo väčší. V príklade, pozri nižšie, boli selektované rezíduá spadajúce do rozsahu 5 A° CDR štrukturálnych slučiek.

2. Počítačové modelovanie.

S cieľom identifikácie potenciálnych rezíduí variabilných oblastí je uskutočnené počítačové modelovanie a) sekvencii variabilných oblastí živočíšnej protilátky, ktorá je vybraná pre humanizáciu, b) selektovaných sekvencii rámca ľudskej protilátky a c) všetkých možných rekombinantných protilátok, vrátane sekvencie rámca ľudskej protilátky, do ktorých boli vložené rôzne minimálne a maximálne rezíduá živočíšnej protilátky.

Počítačové modelovanie je realizované použitím softvéru vhodného na modelovanie proteínov a štruktúrnych informácií získaných z protilátky, ktorá a) má variabilné oblasti aminokyselinovej sekvencie čo najviac identickou s oblasťami živočíšnej protilátky a b) má známu trojrozmernú štruktúru. Ako príklad softvéru, ktorý sa dá použiť, je softvéru SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Protilátka, z ktorej sa dá štruktúrna informácia získať, môže, ale nemusí byť nutne ľudská protilátka. Pre príklad, pozri nižšie, bola použitá štruktúrna informácia získaná z myšej protilátky označovanej ako 1F19.

Výsledky predchádzajúcej analýzy počítačovým modelovaním štruktúry určili selekciu rekombinantných reťazcov obsahujúcich živočíšne variabilné oblasti s čo najväčšou podobnosťou so živočíšnou protilátkou určenou na humanizáciu.

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca čiastočne ťažké a úplne ľahké reťazce variabilných oblasti anti-ľudskej IL-5 monoklonálnej protilátky JES1-39D10, ktorých produkcia je opísaná, pozri nižšie, je definovaná vo Výpise sekvencií pod identifikačným č. sekvencie: 1, resp. 2. Aminokyselinové sekvencie predikované na základe týchto nukleotidových sekvencií sú taktiež definované pod identifikačným č. sekvencie: 1, resp. 2.

V nukleotidovej sekvencií definovanej pod identifikačným č. sekvencie: 1 (sekvencia ťažkého reťazca), boli zásady od 1 do 26 odvodené z priméru pre polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). Klonovaná sekvencia preto začínala 27 zásadou. Aminokyselinová sekvencia zodpovedajúca sekvencií s identifikačným č. 1 zodpovedá maturovanému polypeptidu V_H, nezahŕňa vedúce alebo prvých 14 rezíduí rámca 1. V nukleotidovej sekvencií definovanej identifikačným č. sekvencie: 2 (sekvencia ľahkého reťazca), zásady 1 a 2 boli odvodené z priméru pre PCR. Klonovaná sekvencia preto začínala 3 zásadou. Aminokyselinová sekvencia zodpovedá preto vedúcemu a maturovanému polypeptidu V_L.

CDR variabilných oblastí ťažkých reťazcov monoklonálnej protilátky JES1-39D10 stanovené spôsobom podľa Kabat a kol., pozri vyššie, zahŕňajú aminokyselinové rezíduá 26-30, 45-60 a 93-100 aminokyselinové sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 1. Ako bolo zistené počítačovou analýzou štruktúr slučiek väzbového miesta, pozri nižšie, zahŕňajú CDR štruktúrne slučky variabilných oblastí ťažkých reťazcov monoklonálnej protilátky JES1-39D10 aminokyselinové rezíduá 21-27, 47-50 a 93-101 aminokyselinové sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 1.

Nukleotidové sekvenci kódujúce predchádzajúci ťažký reťazec CDR zahŕňajú zásady 76-90, 133-180 a 277-300 (stanovené podľa Kabata) a 61-81, 139-150 a 277-303 (analýza slučky) nukleotidové sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 1.

CDR variabilných oblastí ľahkých reťazcov monoklonálnej protilátky JES1-39D10 zistené spôsobom podľa Kabat a kol., pozri vyššie, zahŕňajú aminokyselinové rezíduá 44-54, 70-76 a 109-117 aminokyselinové sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 2. Ako bolo zistené počítačovou analýzou štruktúr slučiek väzbového miesta, pozri nižšie, zahŕňajú CDR štruktúrne slučky variabilných oblastí ľahkých reťazcov monoklonálnej protilátky JES1-39D10 aminokyselinové rezíduá 46-51, 70-72 a 111-116 aminokyselinové sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 2.

Nukleotidové sekvencie kódujúce predchádzajúci ľahký reťazec CDR zahŕňajú zásady 130-162, 208-228 a 325-351 (zistené podľa Kabata) a zásady 136-222, 208-216 a 331-348 (analýza slučky) nukleotidové sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 2.

Z predchádzajúceho je vidieť, že takto zistené CDR sú kódované od 9 do 48 zásad. Použiteľná DNA na prípravu proteínu génovou manipuláciou zahŕňa preto od 12 do 333 zásad a od 9 do 384 zásad nukleotidových sekvencií definovaných identifikačnými č. sekvencií: 1 a 2. Konštantná oblasť je taktiež dôležitá pre selekciu izotypu na prípravu proteínu génovou manipuláciou.

Ak sú CDR podľa predkladaného vynálezu použité na prípravu humanizovaných protilátok vkladaním do ľudskej protilátky, môže byť žiaduce zahŕňať jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov, ktoré, i keď ležia mimo CDR, pravdepodobne s CDR alebo IL-5 interagujú (pozri Queen a kol.).

CDR podľa predkladaného vynálezu môžu taktiež tvoriť základ pre návrh nepeptidových mimetických zlúčenín, ktoré napodobujú funkčné vlastnosti protilátky JES1-39D10. Spôsob prípravy takýchto mimetických zlúčenín bol opísaný, pozri Saragovi a kol. (Science 253, 792 (1991)).

Navyše okrem základu pre humanizáciu protilátky je možno informáciu v sekvencií s identifikačným č.: 1 a 2 použiť na prípravu jednovláknových IL-5 väzbových proteínov zahŕňajúcich spojené CDR z ľahkých a/alebo ťažkých reťazcov variabilných oblastí, ako bolo opísané, pozri Bird a kol. (Science 242, 423 (1988)), alebo biosyntetických protilátku viažucich miest (BABS), ako bolo opísané, pozri Huston a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 5879 (1988)). Protilátky s jednou doménou zahŕňajúcou izolovanú variabilnú doménu ťažkého reťazca sa dájú taktiež pripraviť (Ward a kol., Náture 341, 544 (1989)) použitím informácie v sekvencií s identifikačným č.: L

Dve alebo viacej CDR podľa predkladaného vynálezu je možno taktiež spojiť dohromady v polypeptid, a to alebo priamo, alebo pomocou spojovacej sekvencie. Jednu alebo viacej CDR je možno taktiež vložiť do iného (neimunoglobulinového)polypeptidu alebo proteínu, ktorému týmto prepožičiava IL-5-väzbovú schopnosť.

Polypeptidy „zahŕňajúce ťažké alebo ľahké reťazce variabilných oblastí monoklonálnej protilátky, ktoré majú sekvenciu definovanú identifikačnými č. sekvencií: 1 alebo 2 alebo ich subsekvencie“ sú tu definované tak, že zahŕňajú všetky predchádzajúce CDR-zahŕňajúce prípady.

DNA, ktoré kódujú ťažké alebo ľahké reťazce variabilných oblastí protilátky JES1-39D10 alebo od neho odvodené CDR je možno pripraviť použitím štandardných spôsobov využitím informácie o sekvencií nukleovej kyseliny definovanej identifikačnými č. sekvencie: 1 a 2. Takéto DNA sa dajú chemicky syntetizovať, napr. na tuhej fáze použitím fosforamiditového spôsobu podľa Matteucciho a kol. (J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)), podľa Yooa a kol. (J. Biol: Chem. 764, 17078 (1989)) alebo inými dobre známymi spôsobmi.

Alebo alternatívne, vzhľadom na to, že sekvencia génu je známa a tak isto miesta špecifického štepenia mnohých dostupných reštrikčných endonukleáz, dá sa pomerne ľahko identifikovať a izolovať z genómovej DNA hybridómu gén, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku JES1-39D10, a štepiť DNA a získať žiadané sekvencie. PCR (Saiki a kol., Science 239, 487 (1988)) doložený, pozri Daugherty a kol. (Nucleic Acids Res. 19, 2471 (1991)) je možno taktiež použiť a získať totožný výsledok. Priméry použité pre PCR je možné, ak je to žiaduce, navrhnúť tak, aby vzniklo príslušné nové reštrikčné miesto, ktoré by uľahčilo následnú inkorporáciu do daného vektora.

Ešte ďalší spôsob získania DNA, ktoré kódujú ťažké alebo ľahké reťazce variabilných oblastí protilátky JES1-39D10 vyžaduje pripraviť cDNA použitím mRNA izolo

SK 280610 Β6 vanej z hybridómu, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku JES1-39D10, ako templát a klonovať takto získané variabilné oblasti použitím štandardných spôsobov (pozri napr. Wall a kol., Nucleic Acids Res. 5, 3113 (1978), Zalsut a kol., Nucleic Acids Res. 8, 3591 (1980), Cabilly a kol. Proc. Acad. Natl. Sci. USA 81, 3273 (1984), Boss a kol., Nucleic-Acids Res. 12, 3791 (1984), Amster a kol., Nucleic Acids Res. 8, 2055 (1980), Moore a kol., US Patent No. 4,642,234).

Je jasné, že vzhľadom na degeneráciu genetického kódu môže mnoho rôznych nukleotidových sekvencií kódovať CDR, polypeptidy a protilátky s aminokyselinovými sekvenciami, ktoré sú definované sekvenciami s identifikačnými č.: 1 a 2 a CDR z nich. Jednoducho humanizované protilátky s aminokyselinovými sekvenciami, ktoré sú definované, pozri nižšie, môžu byť kódované mnohými rôznymi DNA.

Jednotlivo použité kodóny sa dajú selektovať nielen pre výhodnú konštrukciu, ale i pre optimálnu expresiu v prokaryotickom alebo eukaryotickom systéme. Takéto funkčné ekvivalenty sú taktiež súčasťou predkladaného vynálezu. Ďalej je zrejmé, že sa môžu vytvoriť konzervatívne modifikované varianty polypeptidov a proteínov, v ktorých sú minoritné aminokyselinové substitúcie, pridané zvyšky alebo delécie, ktoré substanciálne nemenia biologickú funkciu (pozri Anfinsen, Science 181, 223 (1973), Grantman, Science 185, 862 (1974)).

Takéto konzervatívne modifikované varianty aminokyselinových sekvencií definovaných identifikačným č. sekvencie: 1 a 2 a humanizované protilátky opísané, pozri nižšie, sú taktiež zámerom predkladaného vynálezu. Je taktiež zrejmé, že napr. chemickou syntézou alebo použitím modifikovaných PCR primérov alebo miestne špecifickou mutagenéziou sa dá modifikovať DNA podľa predkladaného vynálezu a získať toľko variantov, koľko je potrebných.

Môže byť taktiež výhodne pripraviť viacej závažné modifikácie. Pozri napr. Roberts a kol. (Náture 328, 731 (1987)) pripravili protilátku so zvýšenou afinitou a špecifitou odstránením dvoch nabitých rezíduí na periférii spojovacieho miesta miestne špecifickou mutagenéziou.

Inzerciu DNA, ktoré kódujú ťažké a ľahké reťazce variabilných oblastí protilátky JES1-39D10 do vektora je možné ľahko uskutočniť, ak zahŕňajú konce obidvoch DNA a vektora kompatibilné reštrikčné miesta. Ak sa nedá toto zaručiť, môže byť nutné modifikovať konce DNA a/alebo vektora odštepením jednovláknových presahov ostrých koncov (generovaných štepením reštrikčnými endonukleázami)-za vzniku tupých koncov. Ten istý výsledok sa dá dosiahnuť doplnením jednovláknových koncov príslušnou DNA polymerázou. Alternatívne sa dá akékoľvek žiaduce miesto dosiahnuť tak, že je na koniec DNA priligovaná nukleotidová sekvencia (spojka, linkér). Takáto sekvencia (spojka, linkér) môže obsahovať špecifické oligonukleotidové sekvencie, ktoré definujú žiadané reštrikčné miesta. Štepený vektor a fragmenty DNA je možno taktiež modifikovať, ak je to žiaduce, pripojením homopolymérnych reťazcov na konce použitím PCR.

Farmaceutické prostriedky je možno pripraviť použitím protilátok, väzbových prostriedkov alebo jednovláknových väzbových proteínov podľa predkladaného vynálezu alebo anti-idiotypických protilátok pripravených proti monoklonálnym protilátkam s cieľom liečby ochorení spojených s IL-5. Fragmenty alebo protilátky ako sú Fab alebo Fv fragmenty, z toho izolované ľahké a ťažké reťazce fragmentov a krátke polypeptidy zahŕňajúce napr. individuálne CDR oblasti je možno použiť v takýchto prostriedkoch.

Niektoré z takýchto prostriedkov majú 1L-5-blokujúci alebo antagonistický účinok a môžu byť použité na potlačenie aktivity 1L-5. Takéto prostriedky zahŕňajú protilátky, väzbové prostriedky alebo jednovláknové väzbové proteiny podľa predkladaného vynálezu a fyziologicky prijateľný nosič.

Ďalšie prostriedky zahŕňajú anti-idiotypické protilátky pripravené použitím monoklonálnych protilátok podľa predkladaného vynálezu ako antigén a fyziologicky prijateľný nosič. Tieto anti-idiotypické protilátky, ktoré môžu byť monoklonálne, tak i polyklonálne a sú pripravované štandardnými spôsobmi, môžu napodobovať väzbovú aktivitu samého IL-5, a môžu byť preto užitočné ako agonisty alebo antagonisty IL-5.

Použiteľný farmaceutický nosič môže byť akákoľvek kompatibilná netoxická zlúčenina vhodná pre prenos prostriedku podľa predkladaného vynálezu do pacienta. V nosiči môžu byť zahrnuté sterilná voda, alkohol, tuky, vosky a inertné tuhé materiály. V nosiči môžu byť taktiež zahrnuté farmaceutický prijateľné adjuvans (pufrovacie agens, dispergačné agens). Všeobecne sú takéto prostriedky použiteľné pre parenterálnu administráciu takých látok známe, pozri napr. Remington s Pharmaceutical Science, (I5th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Alternatívne je možno prostriedky podľa predkladaného vynálezu dopraviť do pacientovho tela implantovateľnými systémami pre vnášanie látok, pozri Urquhart a kol. (Ann. Rev. pharmacol. Toxicol. 24,199 (1984)).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Predkladaný vynález sa dá lepšie pochopiť z opisov a príkladov, pozri nižšie, pripojených obrázkov, kde:

obr. 1 je schematické znázornenie plazmidu pSRSMPA5II.

Obr. 2 je schematické znázornenie plazmidu pDSRGMPA5H.

Obr. 3 je schematické znázornenie plazmidu pDSRGMPA5L.

Obr. 4 je schematické znázornenie plazmidu pSRSMPA5L.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad

Nasledujúci príklad je uvedený iba pre ilustráciu a predkladaný vynález nijako neobmedzuje. Percentá pre zmesi tuhých látok, kvapaliny v kvapalinách a tuhých látok v kvapalinách sú označené ako % hmotnostné, % objemové a % tuhej látky v kvapaline, pokiaľ sa neuvádza inakšie. Manipulácie s kultúrami buniek boli robené v sterilnom prostredí.

Všeobecné postupy a reagencie

Pokiaľ nie je uvedené inakšie, boli experimenty s rekombinantnou DNA uskutočnené podľa Maniatise a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoiy, 1982).

Minipreparácia plazmidovej DNA z cez noc saturovaných kultúr bola podľa Bimboima a kol. (Nucleic Acids Res 7, 1513 (1979)). Tento postup dovoľuje izolovať malé množstvá DNA z bakteriálnych kultúr na analytické účely. Pokiaľ nie je uvedené inakšie, boli maxipreparácie plazmi

SK 280610 Β6 dovej DNA uskutočnené podľa Clewella a kol. (J. Bacteriol.l 10, 1135(1972)).

Špecifické reštrikčné fragmenty získané štepením plazmidovej DNA boli izolované preparatívnou elektroforézou na agarózovom géli. Elektroforéza na géloch s rozmermi 9 x 5,5 cm bola uskutočnená pri 50 mA počas 1 hodiny v Tris-borátovom pufre (pozri Maniatis a kol., str. 454) a farbené roztokom s 0,5 pg/ml etídiumbromidu s cieľom vizualizácie DNA. Príslušné miesta gélov boli vyrezané a DNA bola z gélu elektroeluovaná (pozri Maniatis a kol., str. 164). Po elektroelúcii bola DNA extrahovaná fenolom (pozri Maniatis a kol., str. 458) a precipitovaná etanolom pri -20 °C (pozri Maniatis a kol., str. 461).

Reštrikčné enzýmy a T4 DNA ligáza boli získané od New England Biolabs (Beverly, MA). Superskript RNAza H’ reverzná transkriptáza bola získaná od BRL/GIBCO (Gaithersburg, MD), Taq DNA polymeráza bola získaná od Stratagene (LaJolla, CA), DNA polymeráza Klenow Fragment bola získaná od Pharmacia LKB Biotcchnology, Inc. (Piscataway, NJ), teľacia intestinálna fosfatáza bola získaná od Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) a RNAsin bola získaná od Promega (Madison, WI). Všetky enzýmy boli používané podľa inštrukcií poskytnutých od predajcu. Sequenase version 2.0 sekvenčný systém bola získaná od United States Biochemical (Cleveland, OH).

Deoxynukleotidové trifosfáty a oligo dT|₂._]8 priméry boli získané od Pharmacia LKB Biotechnology, hovädzí sérový albumín (BSA) bol získaný od Boehringer Mannheim Biochemicals a redestilovaný fenol od BRL/GIBCO.

Plazmidové vektory pSV.Sport a pUC19 a kompetentné E. coli línie DH5-alpha (Max Efficiency) boli získané od BRL/GIBCO. COS-7 bunky (ATCC CRL 1651) boli získané od Američan Type Culture Collection, Bethesda, MD. Média pre tkanivové kultúry, fetálne hovädzie sérum (FBS) a doplnky boli získané od BRL/GIBCO.

Rekombinantný ľudský IL-5 bol exprimovaný v bunkách ovárií čínskeho chrčka (CHO bunky) štandardným spôsobom použitím plazmidu pDSRG (ATCC 68233) a purifikovaný imunoafinitnou chromatografiou.

Králičie antisérum proti rekombinantnému ľudskému IL-5 bolo pripravené štandardným postupom. Biotinylovaný kozí anti-králičí IgG bol získaný od Vector Labs, Burlingame, CA, zatiaľ čo konjugát strcptavidín-alkalická fosfatáza bol získaný od BRL/GIBCO. Biotinylovaný králičí anti-krysí IgG bol získaný od JacksonLabs, West Grove, PA. Nitro-tetrazolium modrá (NBT) a 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BCIP) boli získané od BRL/GIBCO.

Veľmi citlivý ELISA AMPLIFICATION SYSTÉM použitý ako substrát pre mikrotitračné deky pre ELISA stanovenie bol získaný od BRL/GIBCO.

Bunkové kultúry

Bunky hybridómu produkujúceho monoklonálnu protilátku JES1-39D10 boli získané podľa Denburga a koľ, (Blond 77, 1462 (1991)) a spočiatku boli uchovávané v Dulbecco s Modificd Eaglc's médiu (DMEM/vysoký obsah glukózy, GIBCO, Bethesda, MD) doplnenom 5 % FSB, 2 mM glutamínom a 10 jednotkami/ml zmesou penicilín/streptomycín v komore vo zvlhčenej atmosfére s teplotou 37 °C s 5 % obsahom CO₂. Následne boli bunkové línie adaptované na kultúry bez séra nahradením séra IX HB101 doplnkom (Hana Biologics, Alameda, CA).

Charakterizácia monoklonálnej protilátky JES1-39D10 Purifikácia

Médium upravené pôsobením línie buniek produkujúcich protilátku 39D10.il (subklon ES1-39D10) bolo oddelené, filtrované a nanesené na antigénmi afmitnú kolónu pripravenú spojením rekombinantného ľudského IL-5 a Afigel-1 5^r živice (BioRad, Richmond, CA). Potom bola kolóna premytá postupne fosfátom-pufrovaným roztokom salinu (PBS) a PBS s 0,5 M NaCl a ekvilibrovaná roztokom PBS. Protilátka 39D10.il bola eluovaná z kolóny 0,2 M glycínovým tlmivým roztokom (pH = 2,95), po elúcii bol roztok protilátky okamžite neutralizovaný roztokom 1 M Tris-HCl (pH =8).

Purifikovaný proteín bol podrobený elektroforéze na 15 % polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) za redukujúcich podmienok, pozri Laemli (Náture 227, 680 (1970)), s cieľom separácie ľahkých a ťažkých reťazcov. Oba typy reťazcov boli regenerované z gélu prenesením na IMMOBILON^r membránu (PVDF membrána od Millipore, Bedford, MA) použitím elektroblotovacieho spôsobu, pozri Matsudaira (J. Biol. Chem. 261, 10035 (1987)).

Pásy zodpovedajúce ľahkým a ťažkým reťazcom boli vyrezané z membrány s následným farbením Coomassie Brilliant Blue a podrobené sekvenačnej procedúre od N-konca použitím proteín-peptidového sekvencéra Applied Biosystems Model 477A. Stanovenie sekvencie izolovaných ľahkých a ťažkých reťazcov blotovaných na IMMOBILON membránu bolo uskutočnené podľa Yuena a kol. (Biotechniques 7,74 (1989)).

Ťažké reťazce nie je možné sek venovať použitím štandardných podmienok, ľahké reťazce boli sekvenované v 15 cykloch. Porovnanie získaných sekvencií s publikovanými údajmi potvrdilo identitu ľahkého reťazca krysieho imunoglobulínu.

Stanovenie izotypu antigénu

Stanovenie izotypu antigénu JES1-39D10 bolo prevedené použitím kitu od Zymed (San Francisco, CA) a odhalilo, že ťažký reťazec bol gama 2a izotyp a ľahký reťazec bol kappa izotyp (y2a/x izotyp).

Účinok na biologickú aktivitu

Monoklonálna protilátka JES1-39D10 silno inhibuje biologickú aktivitu rekombinantného ľudského IL-5 (Denburg a koľ). Štúdie ukázali, že protilátka má tento účinok inhibovaním väzby IL-5 na jeho celuláme receptory.

PCR klonovanie

Návrh oligonukleotidového priméru a klonovacej stratégie

Skrátene sa dá povedať, že oligonukleotidové priméry boli pripravené tak, aby zodpovedali známym N- a C- sekvenciám koncov kappa ľahkých a ťažkých reťazcov krysieho IgG2a, pozri Reichman a kol. (Náture 332, 323 (1988)), Bruggeman a kol. (Proc. Acad. Natl. Sci. USA 83, 6075 (1986)), Hellman a kol. (Gene 40, 107 (1985)). Použitím týchto primérov boli izolované cDNA fragmenty kompletného ľahkého reťazca a skrátené ľahké reťazce metódou PCR pozri Saiki a kol. (Sciencc 239, 487 (1988)). cDNA fragmenty boli sekvenované a ich sekvencie boli potvrdené porovnaním s ďalšími klonmi generovanými PCR primérami navrhnutými pre iné oblasti cDNA. Vydedukované aminokyselinové sekvencie ľahkého reťazca boli overené sekvenovaním prvých 15 N-koncových zvyškov ľahkého reťazca JES1-39D10.

SK 280610 Β6

Syntéza oligonukleotidov

Oligonukleotidové priméry založené na IgG2a/kappa izotypu protilátky JES1-39D10 so sekvenciami definovanými výpisom sekvencii boli pripravené štandardným spôsobom pomocou zariadenia Applied BioSystems Model 380A alebo 380B Synthesizer.

Označenie primárov (prvé písmeno zodpovedá modelu použitého syntetizátora) a zodpovedajúce identifikačné čísla sekvencii sú uvedené, pozri ďalej:

Oligonukleotid	Identifikačné č. sekvencie
B2051 CC	3
B2031 CC	4
A2064CC	5
A2065CC	6
B2137CC	7
B2108CC	8
B2101CC	9
B 1852CC	10

Pre ťažký reťazec protilátky JES1-39D10 bol 5' koncový primér B2051CC odvodený od segmentu sekvencie krysieho IgG2a publikovanej Reichmannom a kol., pozri vyššie, zahŕňajúcej od 6 do 14 aminokyselinového zvyšku maturovaného ťažkého reťazca polypeptidu. S cieľom uľahčiť klonovanie boli na 5' koniec priméru pridané dve reštrikčné miesta: Xbal a HindlII. Návrh 3' konca priméru B2031CC bol založený na segmente publikovanej (Bruggemann a kol.) sekvencie krysieho IgG2a tri konštantné oblasti. S cieľom uľahčiť klonovanie boli na 3' koniec priméru pridané tri reštrikčné miesta: Smal, EcoRI a Sali.

Pre ľahký reťazec boli 5' a 3' konce sekvencie priméru odvodené od publikovanej sekvencie krysia kappa mRNA (Hellman a kol.). Primér A2064CC zahŕňa čiastočne 5' neprepisovanú oblasť a prvé dva nukleotidy translačného iniciačného kodónu. HindlII a BamHI miesta boli pridané pre uľahčenie klonovania. 3' koncový primér A2065CC bol založený na segmente publikovanej sekvencie 3' neprepisovanej oblasti (3' UTR) ľahkého reťazca krysieho kappa imunoglobulínu. Tento segment zahŕňa posledné dva nukleotidy stop kodónu a 22 3' UTR nukleotidov následne za 3' koncom stop kodónu. F.coRI a PstI miesta boli pridané na uľahčenie klonovania.

Reakčné podmienky PCR

Celková cytoplazmatická RNA bola izolovaná z línie buniek hybridómu produkujúceho protilátku JES1-39D10, pozri Cathala a kol. (DNA 2, 329 (1983)). Syntéza prvého vlákna cDNA bola uskutočnená izoláciou RNA ako templátu, pozri Larrick a kol. (Bio/Technology 7, 934 (1989)). cDNA produkt bol podrobený PCR v reakčnej zmesi s objemom 50 μΐ s prekrytím 50 μΐ parafínového oleja v 0,5 ml v eppendorf-skúmavke.

Reakčná zmes pre syntézu ťažkého reťazca obsahovala:

26,5 μΐ H₂O, 5 μΐ Taq (Thermus Aquaticus) DNA polymerázového tlmivého roztoku (finálna koncentrácia v reakcii: 10 mM Tris.HCl (pH = 8, 3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % (tuhej látky v objeme) želatíny), 5 μΐ 1,25 mM dNTP, 4 μΐ priméru B2051CC (60 pmol), 4 μΐ priméru B2031CC (60 pmol), 5 μΐ cDNA (obsahujúca polovicu prvého vlákna cDNA odvodenej z 3 - 6 pg celkovej RNA) a 0,5 μΐ Taq polymerázy (2,5 jednotiek). Reakčná zmes pre syntézu ľahkého reťazca bola podobná, ale ako priméry' boli použité A2064CC a A2065CC.

Reakcia bola prevedená v zariadení PHC-1 Thermocycler (Techne, princeton, NJ) pri 30 cykloch s nastavením:

1.5 min. 94 °C pre denaturáciu, 2 min. 50 °C pre aneláciu,

3.5 min. 72 °C pre syntézu. Na konci 30 cyklu bola reakčná zmes inkubovaná po ďalších 9 min. pri teplote 72 °C.

Reakčná zmes z PCR bola podrobená elektroľoréze v 1 % agaróza/Tris-borátovom géli s 0,5 pg/ml etídiumbromidu. Fragmenty DNA s očakávanými veľkosťami (približne 1, 5 kilozásady pre ťažký reťazec, približne 0,7 kilozásada pre ľahký reťazec) boli vyrezané z gélu a purifikované elektroelúciou.

Verifikácia klonov cDNA

Sekvenácia DNA

Po regenerácii z gélu, precipitáciou etanolom a štepení reštrikčnou endonukleázou boli predpokladané ťažké a ľahké reťazce cDNA generované PCR klonované do vhodného vektora pre sekvenáciu.

Predpokladané ťažké a ľahké reťazce cDNA boli klonované do vektora pUC19 v podobe HindlII/EcoRI a BamHI/Bstl fragmentov. Ligované plazmidy boli potom transformované do E. coli kmeňa DH5-alfa použitím štandardných metód. Kolónie transformantu boli izolované a pre sekvenovanie boli izolované plazmidové DNA z aspoň dvoch klonov pre každý ťažký a ľahký reťazec. Porovnanie takto získaných sekvencii variabilných oblastí (definovaných pre ťažký a ľahký reťazec identifikačným č. sekvencie: 1 a 2) s publikovanými sekvenciami imunoglobulínov ukázali vysoký stupeň homológie v rámci a umiestnení predpokladaných CDR zistených spôsobom podľa Kabat a kol., pozri vyššie. Ďalej N-koncová sekvencia aminokyselín predikovaná zo sekvencie cDNA ľahkého reťazca súhlasila s experimentálne zistenou N-koncovou sekvenciou ľahkého reťazca protilátky JES1-39D10.

Konštrukcia expresných plazmidov

Aby sa potvrdilo, že izolované cDNA kódovali proteíny, ktoré môžu špecificky viazať ľudský IL-5, boli cDNA kódujúce v plnom rozsahu predpokladaný ťažký reťazec protilátky JES1-39D10 rekonštruované PCR. Priméry B2137CC (identifikačné č. sekvencie: 7) a B2108CC (identifikačné č. sekvencie: 8) boli navrhnuté pre modifikáciu prvotne klonovaných vystrihnutých ťažkých reťazcov cDNA. Tieto priméry určovali sekvencie kódujúce vedúci peptid, 5 chýbajúcich zvyškov aminokyselín na N-konci variabilnej oblasti a chýbajúce zvyšky na C-konci konštantnej oblasti.

Vertebrálny iniciačný translačný konsensus sekvencie (Kozák, Nucleic Acids Res. 20, 8125 (1987)) boli pridané k 5' koncu kódujúcej cDNA pre zlepšenie translácie. Pre zlepšenie klonovania boli na 5' a 3' konce výslednej cDNA pridané Sali a EcoRI reštrikčné miesta.

Predpokladaná cDNA ľahkého reťazca bola pripravená taktiež použitím primérov B2101CC (identifikačné č sekvencie: 9) a B1852CC (identifikačné č. sekvencie: 10). To bolo prevedené s cieľom modifikovania reštrikčných miest na koncoch expresného plazmidu. Do cDNA bola taktiež vložená vertebrálna iniciačná translačná konsensus sekvencia.

Boli prevedené PCR a produkty DNA boli izolované, ako je opísané a DNA boli štepené Sali a EcoRI. cDNA ťažkých a ľahkých reťazcov boli potom separátne ligované do expresného vektora pSRS (ATCC 68234), ktorý bol taktiež podobne štepený. Plazmid pSRS obsahuje promótor SRa a SV40 origin replikácie umožňujúci replikáciu a expresiu cDNA inzertov v COS bunkách.

SK 280610 Β6

Transfekcia

Pred transfekciou boli COS bunky propagované v médiu DMEM/vysoký obsah glukózy, doplneným 10 % FBS a 6 mM glutamínom. Exponenciálne rastúce bunky boli trypsínované, omyté čerstvým médiom a resuspendované v čerstvom médiu pri hustote 2 x 10⁷ buniek/ml.

Elektroporácia bola uskutočnená na zariadení GENEPULSER (BioRad, Richmond, CA) podľa inštrukcií výrobcu. V krátkosti; 250 μΐ alikvóty suspenzie COS buniek boli rozdelené do každej kyvety. Do každej z kyviet bolo pridané 10 gg CIRCLEPREP (BiolOl, LaJolla, CA) purifikovanej plazmidovej DNA v objeme menšom ako 50 gl a roztok bol zmiešaný s bunkami. Použité vzorky DNA zahŕňali pSRS s inzertom cDNA ťažkého reťazca (pSRS-H), pSRS s inzertom cDNA ľahkého reťazca (pSRS-L), alikvotné zmesi (1 : l)pSRS-HapSRS-LanemodifikovanýpSRS.

Pôsobilo sa 0,2 V elektrickými pulzmi pri 960 gF s kapacitným extenderom. Bunky boli potom rozotrené na kultivačné misky s priemerom 60 mm s 5 ml čerstvého média a inkubované pri 37 °C a 5 % CO₂. Po 16 hodinách bolo médium odsaté a nahradené médiom bez séra. Bunky boli inkubované ďalších 72 hodín, po ktorých bolo médium odobrané.

Imunoblotovacia analýza

Médiá bez séra z transfekovaných buniek boli lOx koncentrované centrifugáciou v kyvetách CENTRICON (Amicon, Danvers, MA), a potom podrobené elektroforéze v 15 % SDS polyakrylamidovom géli (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) za neredukujúcich podmienok. Na ten istý gél boli nanesené dve identické súpravy vzoriek a dve zmesi markérov proteínov s identickou molekulovou hmotnosťou (obsahujúce 97,4, 68, 43, 29, 18,4 a 14,3 kilodaltonové proteíny.

Po elektroforéze boli separované pásy prenesené na nitrocelulózovú membránu použitím Semidry Electroblotteru (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA). Membrána bola inkubovaná pri teplote miestnosti s 3 % BSA v PBS, a potom rozstrihnutá na dva kusy. Každý kus obsahoval kompletnú súpravu vzoriek.

Jeden kus membrány bol použitý v prvej analýze k detekcii expresie krysieho IgG reťazca v kondicionovanom médiu. To bolo prevedené pri teplote miestnosti striedavo; lx s 1 : 200 riedeným biotinylovaným králičím anti-krysím IgG v TBST tlmivom roztoku (10 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl a 0,05 % TWEEN-20^R (monolaurát polyoxyetylénsorbitanu)) s 3 % BSA počas 45 min., 3x s TBST tlmivým roztokom samotným počas 15 min., lx s 1 : 10 000 zriedenou alkalickou fosfatázou konjugovanou so streptavidínom v TBST tlmivom roztoku počas 30 min., 3x s TBST tlmivým roztokom samotným počas 15 min. a lx so substrátom alkalickej fosfatázy (44 gl NBT a 33 gl BCIP v 10 ml tlmivom roztoku pre alkalickú fosfatázu obsahujúcom 10 mM Tris-HCl, pH = 9,100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) počas 10 až 30 min.. Membrána potom bola testovaná na farebnú zmenu po opláchnutí destilovanou vodou.

Druhý kus membrány bol použitý v druhej analýze k stanoveniu, či bol ľudský IL-5 väzbový proteín prítomný v niektorom kondicionovanom médiu. Na tento kus bolo postupne pôsobené: lxl gg/ml rekombinantným ľudským IL-5 v TBST tlmivom roztoku počas 1 hodiny, 3x TBST tlmivým roztokom samotným počas 15 min., lx s 1 : 3000 riedeným králičím antisérom proti rekombinantnému ľudskému IL-5 v TBST tlmivom roztoku počas 1 hodiny, 3x TBST tlmivým roztokom samotným počas 15 min., lx s 1 : : 200 riedeným biotinylovaným kozím anti-králičím IgG v

TBST tlmivom roztoku počas 1 hodiny, 3x TBST tlmivým roztokom samotným počas 15 min., lx s 1 : 10 000 zriedením alkalickej fosfatázy konjugovanej so streptavidínom v TBST tlmivom roztoku počas 30 min., 3x TBST tlmivým roztokom samotným počas 15 min. a lx substrátom alkalickej fosfatázy počas 30 min. Kus membrány bol potom testovaný na farebnú zmenu.

Výsledky prvej analýzy ukázali, že iba médium kondicionované transformantom kotransfekovaným obidvoma plazmidami pSRS-Η a pSRS-L poskytlo detegovateľné pásy. Rozmiestnenie pásov bolo zodpovedajúce pre imunoglobulíny. Sfarbenie indikujúce alebo nízke množstvá proteínu, alebo neschopnosť protilátky rozpoznať individuálne ťažké a ľahké reťazce nebolo pozorované vo vzorkách, ktoré obsahovali kondicionované médium z buniek transfekovaných samotným ťažkým alebo ľahkým reťazcom. V kondicionovanom médiu nebola očakávaná prítomnosť ťažkého reťazca, pretože obvykle nie je sekretovaný za absencie ľahkého reťazca (Bôle a kol., J. Celí Biol. 102, 1558 (1986)).

V druhej analýze bola pozorovaná silná IL-5 väzbová aktivita vo vzorku z média kondicionovaného transformantom kotransfekovaným obidvoma plazmidami pSRS-H a pSRS-L. Toto bolo zaznamenané ako hlavný farebný pás v neredukujúcom SDS géli migrujúci so zdanlivou molekulovou hmotnosťou okolo 160 kDa, čo je očakávaná veľkosť pre kompletnú molekulu protilátky.

ELISA test

Na stanovenie schopnosti rekombinantnej monoklonálnej protilátky špecificky viazať ľudský IL-5 bolo na misky pre imunoassay (EIA) s 96 jamkami nanesené po 50 gl alikvótoch samotný 3 % BSA alebo rekombinantný ľudský IL-5 (5 gg/ml, následne blokované roztokom BSA). Všetky nanesenia boli realizované pri 4 °C počas 2 hodín. 50 gľalikvóty média kondicionovaného rôznymi transformantmi opísaných COS buniek alebo bunkovou líniou hybridómu produkujúcou protilátku JES1-39D10 boli potom pridané do jamiek a misky boli inkubované pri 4 °C počas 2 hodín.

Po inkubácii bolo médium v jamkách postupne nahradené použitím 300 gl alikvótov pri teplote miestnosti: 3x TBST tlmivý roztok samotný počas 15 min., lx biotinylovaný králičí anti-krysi IgG počas 2 hodín, 3x TBST tlmivý roztok samotný počas 15 min., lx alkalická fosfatáza konjugovaná so streptavidínom v TBST tlmivom roztoku počas 30 min., 3x TBST tlmivý roztok samotný počas 15 min. a potom vyvinuté pomocou BRL ELISA AMPLIFICATION SYSTEM^R počas 5 až 15 min., všetky zriedenia reagencií boli ako pozri vyššie.

Výsledky tohto stanovenia ukázali, že obe protilátky, prírodná protilátka JES1-39D10 (z média kondicionovaného hybridónom) a rekombinantná protilátka (z média kondicionovaného transformantom kotransfekovaným obidvoma plazmidami pSRS-Η a pSRS-L) boli zachované v jamkách s IL-5, ako bolo zistené podľa silného zafarbenia. Žiadne signifikantné zafarbenie nebolo nájdené v kontrolných experimentoch (ktoré neobsahovali protilátku) za absencie IL-5 alebo ak boli testované vzorky kondicionované média buniek transekovaných samotnými vektormi kódujúcimi ťažké alebo ľahké reťazce.

Humanizácia protilátky

Modelovanie homológie

Použitím opísaných metód bolo zistené, že protilátky HIL a LAY boli optimálnymi kandidátmi ľudského rámca.

Najskôr boli skúmané páry ťažkého a ľahkého reťazca HIL a LAY a ich kombinácia.

Zoznam potenciálnych minimálnych a maximálnych JESI-39D10 rezíduí, ktoré by mohli byť vložené do rámcov, bol určený opísanými metódami, ako je znázornené v nasledujúcej tabuľke.

j—	Rezíduá1®
|VH mlnlmálnyvýpls	21-27,47-50.00,93-101
M maxlmôlnjvýpls “	19,28.29,30,32,40,45.40.51,52-50,71,89,92
Wmlnlmátnj výpis	45-51,68,70-72.84,91,109.110-115
iVLmaxlmálnjvýpls“	44,45,52-54.56,65,73-76,88,89,117

rezíduá pre V_H a V_L zodpovedajú číslam rezíduí v sekvenciách s identifikačným č. sekvencie: 1 a identifikačným č. sekvencie: 2.

^b) maximálne výpisy V_H a V_L zahŕňajú zodpovedajúce minimálne výpisy a ďalšie vyznačené rezíduá.

Špecifické konštrukty, opísané nižšie, zahŕňali nasledujúce rezíduá podľa tabuľky:

Humonlzovaná protilátka	Rezíduá
CMX5-1	Hl maximôlry vL LAY rnaximoinj
CMX5-2	v„ Hit maximáinf V, LAY maximänytbez šlrukturôloíCDRsmySky H·' naN-konel)
CMX&-3	LAY maxlmúlnj; V, LAY maxímúlny
CMX5-4	Vj HIL mlnlmálnj V, IAY minlmálnj
CMX5-5	V„ HlLien KabatCDR; V, lAYlenKabatCDR

Pretože zamýšľaným použitím humanizovaných protilátok bola neutralizácia biologickej aktivity rozpustného ľudského IL-5, bol vybraný γ4 ako konštantná oblasť pre humanizované protilátky, a to preto, že γ4 je najmenej potentný z 4 ľudských imunoglobulínových izotypov v dosiahnutí fixácie komplementov. Ľudský náprotivok krysieho χ izotypu bol vybraný pre konštantnú oblasť humanizovaných ľahkých reťazcov.

Konštrukcia humanizovanej protilátky CMX5-1

Syntetická CMX5-1 DNA bola konštruovaná použitím kombinácie PCR a bežných klonovacích techník. V oblasť bola rozdelená na tri segmenty, z ktorých každý bol určený tak, aby obsahoval určité reštrikčné miesta na 5' a 3' koncoch. Boli vybrané kodóny s relatívne vysokou hustotou výskytu v génoch cicavcov. Palindromické a repetitívne sekvencie boli odstránené alebo nahradené „tichými“ zmenami v navrhnutých oligonukleotidoch k minimalizácii tvorby neanticipovaných sekundárnych štruktúr, ktoré môžu spôsobiť zmeny usporiadaní sekvencie alebo delécie.

Oligonukleotidy zodpovedajúce úplnej variabilnej oblasti ťažkého reťazca (V_H) CMX5-1 boli syntetizované štandardnými metódami.

Určenie týchto oligonukleotidov a zodpovedajúce identifikačné č. sekvencie definujúce ich sekvencie sú:

Páry oligonukleotidov B2474CC a B2419CC, B2420CC a B2475CC, B2477CC a B2479CC boli tepelne denaturované, anelované a inkubované s Taq polymerázou alebo Pfu (Stratagene, LaJolla, CA). V PCR boli dva oligonukleotidy v každom páre komplementárne ku každému z 24 až 30 nukleotidom. Preto bol každý oligonukleotid templátom pre ďalší.

PCR boli realizované pri 18 cykloch, po ktorých boli tri výsledné DNA fragmenty zodpovedajúce trom konsekutívnym segmentom V_H označeným ako V_H1, V_H2 a V_H3 podrobené elektroforéze v agarózovom géli a puriflkované elektroelúciou.

Relatívne usporiadanie troch V_H DNA fragmentov, reštrikčné miesta pre klonovanie a mapa reštrikčných miest pre multiklonovanie klonovacieho vektora pSV.Sport boli:

Fragment	Reštrikčné miesta	PCRpriméy
v.i	EcoRI .Spel	B2474CC1B2419CC
V	Spel Xbal	B2420CC a B2475CC
V	EcoRI/Xbal JSall/Apal/SstI	B2477CC aB2479CC

Multiklonovacie miesto pSV.Sport PstI/KpnI/RsrII/-EcoRI/SmaI/SalI/SstI/SpeI/NotI/XbaI/BamHI/HindlII/SnaBI/MluI

Fragment VhI bol štepený enzýmami EcoRI a Spel a klonovaný do vektora pSV.Sport. Fragment V_L1 bol nato pripojený k V_H1 v pSV.Sport priamou inzerciou do miest Spel a Xbal. Fragment V_H3 bol samostatne klonovaný do pSV.Sport ako EcoRI/Xbal-Sall/Apal/SstI fragment. Tieto tri fragmenty boli verifikované sekvenovaním DNA. CMX5-1 V_H cDNA s plnou dĺžkou bol vytvorený najskôr pripojením V_H 3 ku genómovej DNA γ4 H-reťazca konštantnej oblasti (C_H) a potom pripojením V_H 3-C_H fragmentu k V_h1-V_h2, ako je opísané.

CMX5-1 V_L cDNA bol vytvorený podobne použitím šiestich syntetických oligonukleotidových primérov. Tieto oligonukleotidy a zodpovedajúce identifikačné č. sekvencie definujúce ich sekvencie sú:

Oligonukleotid B2425RCC B2426CC B2427CC B2458CC B2459CC B2460CC

Identifikačné č. sekvencie

Tri fragmenty označené V_L1, V_L2 a V_L3 boli odvodené z oligonukleotidových párov B2425RCC a B2426CC, B2427CC a B2458CC, B2459CC a B2460CC. Tieto fragmenty DNA, ktoré zodpovedajú trom konsekutívnym segmentom V_L boli puriflkované elektroforézou v agarózovom géli a elektroelúciou.

Relatívne usporiadanie troch V_L DNA fragmentov, reštrikčné miesta pre klonovanie a mapa reštrikčných miest pre multiklonovanie klonovacieho vektora pSV.Sport boli:

Oligonukleotid

B2474CC

B2419CC

B2420CC

B2475CC

B2477CC

B2479CC

Identifikačné č. sekvencie

Fragment	Reštrikčné miesu	PCRprimsy
v,.l	Pstl BstEH/Xbal	B2425R.CC » B2426CC
Vl2	PstI/BstEH BamHI	B2427CC a B2458CC
Y.3	BamHI Sali	B2459CC1B2460CC

Multiklonovacie miesto pUC19

EcoRI/SacI/KpnI/-SmaI/BamHI/XbaI/SalI/PstI/Sphl/HindlII

V_L1, V_l2 a V_l3 boli najskôr klonované samostatne do vektora pUC19 ako fragmenty Pstl-BstEII/Xbal, Pstl/BstEII-BamHI a BamHI-Sall. Identity týchto troch fragmentov boli verifikované sekvenovaním DNA. V_L1 a V_L2 boli potom spojené dohromady v pUC19 inzerciou V_L2 ako BstEII-BamHI fragment do vektora, ktorý už obsahoval V_L1.

Vytvorenie V_L cDNA bolo urobené najskôr pripojením V_L3 ku konštantnej oblasti ľahkého reťazca (C_L), a potom pripojením V_L1-V_L2 a V_L3-CL fragmentov, ako je opísané.

Na uľahčenie syntézy a sekrécie humanizovaných protilátok bol vedúci peptid pripojený k N-koncu obidvoch maturovaných H- a L-reťazcov polypeptidov. Sekvencie aminokyselín a polypeptidov tohto vedúceho peptidu sú totožné s vedúcim peptidom anti-CAMPATH-1 protilátok (pozri Reichmann a kol.). Kódujúca sekvencia vedúceho peptidu (pozri Reichmann a kol.) bola inkorporovaná do obidvoch fragmentov V_H1 a V_L1.

V snahe o konštrukciu DNA kódujúcu plnú dĺžku H-reťazca protilátky bol V_H syntetickej cDNA kombinovaný s ľudskou γ4 konštantnou oblasťou genómovej DNA (ATCC 57413) použitím reštrikčného štepenia Apal a ligácie. Táto procedúra začala digesciou plazmidu pSV.Šport obsahujúceho V_H3 enzýmom Nôti s následným pôsobením Klenow DNA polymerázy (Boehringer Mannheim) za vzniku tupých koncov. Výsledná DNA bola vyzrážaná etanolom, resuspcndovaná a štepená Apal. Táto štepená plazmidová DNA bola ligovaná s reštrikčným fragmentom Apal/Smal genómovej γ4 konštantnej oblasti.

V_H3-C_H genómová DNA bola potom vyštepená ako fragment Xbal/HindlII a vložená do pSV.Šport, ktorý už obsahoval Vh1-V_h2 a tým bolo ukončené vytvorenie DNA ťažkého reťazca s plnou dĺžkou.

V snahe o vytvorenie reťazcov protilátky boli plazmidy obsahujúce DNA H- a L-reťazca kotransfekované do COS buniek. Sekretovaný imunoglobulín bol nedetegovateľný, ale nasledovala analýza kondicionovaného média ELISA testom alebo Westem blotovaním. Alternatívne bola určená ľudská γ4 konštantná oblasť cDNA a konštruovaná za nahradenia genómovej DNA.

Šesť oligonukleotidových PCR primérov bolo syntetizovaných na tento účel štandardnými spôsobmi. Určenie týchto oligonukleotidov a zodpovedajúce identifikačné č. sekvencie definujúce ich sekvencie sú:

Oligonukleotid	Identifikačné č. sekvencie
B2491 CC	23
B2498CC	24
B2499CC	25
B2597CC	26
B2598CC	27
B2656CC	28

Priméry B2491CC, B2499CC a B2598CC zodpovedajú plus vláknu y4 konštantnej oblasti cDNA.

Priméry B2498CC,B2597CCa B2656CC zodpovedajú mínus vláknu. Použitím ľudskej γ4 genómovej DNA ako templátu boli pomocou PCR generované tri konsekutívne fragmenty dvojvláknovej DNA zahŕňajúce úplnú γ4 konštantnú oblasť kódujúcej cDNA.

Tri C_H DNA segmenty, reštrikčné miesta pre klonovanie a použité priméry boli:

Segment	Rertrikčoé imesti	PCR primery
C, A	Sál	EcoRI	B249lCCaB2498CC
C„B.	EcoRI	XkoVSaH	B2499CC aB2500CC
_	S*n/Xhol	Nôti	B259SCCaB2656CC

Segment A bol klonovaný do pUC19 ako reštrikčný fragment Sall-EcoRl. Segment C ako reštrikčný fragment Sall/Xhol-NotI bol klonovaný do pSV.Šport. Segment B ako fragment EcoRI-Xhol/Sall bol klonovaný do pSV. Šport, ktorý už obsahoval segment C. Všetka tri segmenty boli verifikované sekvenovaním DNA.

γ4 cDNA bola vytvorená vyštepením segmentu A enzýmami PstI a EcoRI a klonovaním tohto fragmentu do pSV. Šport, ktorý už obsahoval segmenty B a C. Reštrikčná mapa ľudskej γ4 C_H cDNA a jej relatívna pozícia v multiklonovacích miestach pSV.Sport je:

Λ B C

Patl/sall—-Scori------xhol--------Noti/Hlnain/snaBI/Mlui γ4 Ch cDNA bola vyštepená ako fragment Sali—HindlII k výmene genómového γ4 fragmentu v predtým opísanom konštrukte H-reťazca s plnou dĺžkou. Finálny produkt bol H-reťazec s plnou dĺžkou kódujúcej cDNA klonovaný do vektora pSV.Sport.

Aby bola zaistená stabilná transfekcia, bol plazmid pSV.Sport obsahujúci cDNA ťažkého reťazca s plnou dĺžkou štepený KpnI, a potom sa naň pôsobilo T4 polymerázou za vzniku tupých koncov a ďalej bol štepený SnaBI. Výsledný fragment DNA bol izolovaný elektroforézou v agarózovom géli a následnou purifikáciou použitím purifikačného kitu GENECLEAN^R DNA (Bio 101, LaJolla, CA) a ligáciou tupých koncov do plazmidu pSRS alebo pDSRG štepeného Smal. Finálne konštrukty boli označené ako pSRSMPA5H (obr. 1) apDSRGMPA5H (obr. 2).

Bolo už opísané, že N-koniec ťažkého (H) reťazca protilátky HIL bol chemicky blokovaný (Chiu a kol., Biochemistry 18, 554 (1977)). Glutamínový kodón bol považovaný za N-koncové rezíduum a bol použitý pre C rekombinantných protilátok CMX1, 2,4 a 5. V H reťazci protilátky CMX5-3 bol, následne po porovnaní N-koncového zvyšku H reťazca LAY so zodpovedajúcimi zvyškami ďalších ľudských sekvencii H reťazcov v podskupine III, ktorej je H reťazec LAY členom, N-koncový alanín H reťazca LAY nahradený zvyškom kyseliny glutámovej.

S cieľom uľahčenia konštrukcie L-reťazcov cDNA s plnou dĺžkou bol kodón zvyšku kyseliny glutámovej 105 nahradený kodónom kyseliny asparagovej za vzniku Sali reštrikčného miesta v blízkosti spojenia V_L a C_L. Táto modifikácia umožňuje substitúciu V_L variantov ako kaziet v CMX5-1 L-reťazci expresného plazmidu založenom na pSV.Sport.

cDNA ľudského kappa ľahkého reťazca bola najskôr konštruovaná na základe sekvenčných informácií ľudskej protilátky REI (Epp a kol., Eur. J. Biochem. 45, 513 (1974)). Z tohto dôvodu bolo pripravených sedem syntetických oligonukleotidových primérov určených a zodpovedajúcich identifikačným č. sekvencie, pozri ďalej:

Oligonukleotid	Identifikačné č. sekvencie
B2262CC	29
B2281CC	30
B2293CC	31
B2294CC	32
B2495CC	33
B2496CC	34
B2704CC	35

Štyri z týchto primérov boli syntetizované tak, aby obklopovali cDNA kappa ľahkého reťazca s plnou dĺžkou. Tieto oligonukleotidy (B2262CC, B2281CC, B2293CC a B2294CC) boli zmiešané a predĺžené jednou PCR. Po PCR bol produkt purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli a elektroelúciou, klonovaný do pUC19 a analyzovaný sekvenovaním DNA. Všetky sekvenované klony obsahovali chybne inkorporované zásady.

PCR priméry A2495CC a A2496CC boli potom syntetizované pre prípravu správnej konštantnej oblasti ľudského k L-reťazca. Sekvencia A2495CC obklopovala posledné štyri aminokyselinové kodóny ľudskej protilátky LAY V_L rámca a začiatok ľudskej κ konštantnej oblasti. Primér A2496CC zodpovedal C-koncu ľudskej κ konštantnej oblasti.

PCR bola realizovaná pomocou aberantného klonu L-reťazca s plnou dĺžkou a primárov A2495CC a A2496CC a PCR produkt bol klonovaný do vektora pSV.Sport. Sekvenačná analýza však ukázala, že konštrukt opäť obsahoval chybne inkorporované zásady. Táto nová chyba bola korigovaná ďalšou PCR použitím oligonukleotidových primárov A2495CC a B2704CC. Takto získaný produkt bol klonovaný ako reštrikčný fragment Sall/HindlII do pUC19, ktorý už mal V_L3 fragment. Takto bola získaná správna cDNA κ konštantnej oblasti ľahkého reťazca.

K vytvoreniu cDNA L reťazca s plnou dĺžkou boli vyštepené V_L1-V_L2 ako fragment HindlII/BamHI s tupými koncami a vložený do pUC19 štepeného Smal/BamHI a obsahujúceho V_L3-C_L fragment. Fragment ľahkého reťazca s plnou dĺžkou bol vyštepený ako fragment Pstl/EcoRI z pUC19 a samostatne klonovaný do expresného vektora pDSRG a pSRS za vzniku plazmidu označených ako pDSRGMPA5L (obr. 3) a pSRSMPA5L (obr. 4).

Aminokyselinové sekvencie ľahkého a ťažkého reťazca variabilných oblastí protilátky CMX5-1 sú definované vo výpise sekvencií identifikačným č. sekvencie: 36 a identifikačným č. sekvencie: 37. Pretože aminokyselinové zvyšky 1-19 týchto sekvencií zahŕňajú sekrečnú vedúcu sekvenciu, ktorá je štepená počas postranslačnej modifikácie, sú aktuálne sekvencie variabilnej oblasti definované sekvenciami s identifikačným č. sekvencie: 36 a s identifikačným č. sekvencie: 37, začínajúce zvyškom 20.

Konštrukcia humanizovanej protilátky CMX5-2

S cieľom konštrukcie humanizovanej protilátky CMX5-2 boli syntetizované komplementárne oligonukleotidy označené ako B3194CC aB3195CC (sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 38 a identifikačným č. sekvencie: 39) a anelované za vzniku fragmentu BglII/Spel pre nahradenie 42 bp fragmentu BglII/Spel CMX5-1 ťažkého reťazca v pSV.Sport. Nahradená oblasť bola verifikovaná sekvenovaním DNA.

Aminokyselinové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca variabilných oblastí protilátky CMX5-2 sú definované vo výpise sekvencií identifikačným č. sekvencie: 40 a identifikačným č. sekvencie: 41. Pretože aminokyselinové zvyšky 1-19 týchto sekvencií zahŕňajú sekrečnú vedúcu sekvenciu, ktorá je štepená počas postranslačnej modifikácie, sú aktuálne sekvencie variabilnej oblasti definované sekvenciami s identifikačným č. sekvencie: 40 a s identifikačným č. sekvencie: 41, začínajúce zvyškom 20.

Konštrukcia humanizovanej protilátky CMX5-3

S cieľom konštrukcie humanizovanej protilátky CMX5-3 boli syntetizované štyri oligonukleotidy s aminokyselinovou sekvenciou založenou na protilátke JES1-39D10 CDR a ľudských sekvencií LAY V_H rámca. Označenie a zodpovedajúce identifikačné č. sekvencie týchto oligonukleotidov boli:

Oligonukleotid	Identifikačné č. sekvencie
B2784CC	42
B2785CC	43
B2786CC	44
B2921 CC	45

PCR boli realizované použitím súpravy oligonukleotidov B2784CC, B2785CC, B2786CC a B2921CC a produkty boli štepené za vzniku fragmentov Pstl/Spel a Xbal/Sall. Tieto fragmenty DNA boli použité pre nahradenie fragmentov V_H1 a V_H3 protilátky CMX5-1 cDNA H reťazca v pSV.Sport.

Aminokyselinové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca variabilných oblastí protilátky CMX5-3 sú definované vo výpise sekvencií identifikačným č. sekvencie: 46 a identifikačným č. sekvencie: 47. Pretože aminokyselinové zvyšky 1-19 týchto sekvencií zahŕňajú sekrečnú vedúcu sekvenciu, ktorá je štepená počas postranslačnej modifikácie, sú aktuálne sekvencie variabilnej oblasti definované sekvenciami s identifikačným č. sekvencie: 46 a s identifikačným č. sekvencie: 47, začínajúce zvyškom 20.

Konštrukcia humanizovanej protilátky' CMX5-4

Protilátka CMX5-4 V_H bola konštruovaná analogickým spôsobom, ako bol spôsob použitý na konštrukciu protilátky CMXS-1. Boli syntetizované tri súpravy presahujúcich oligonukleotidov, ktorých označenie (identifikačné č. sekvencie) boli:

Oligonukleotid	Identifikačné číslo sekvencie
B2924CC	48
B2925CC	49
B2926CC	50
B2927CC	51
B2928CC	52
B2929CC	53

Použitím súpravy oligonukleotidov B2924CC a B2925CC, B2926CC a B2927CC, B2928CC a B2929CC boli syntetizované PCR extenznými reakciami tri zodpovedajúce fragmenty DNA. Tieto tri fragmenty boli klonované, sekvenované a spojené v pSV.Sport reštrikčnými štepeniami a ligáciami.

CMX5-4 V_L bol konštruovaný najskôr aneláciou oligonukleotidov označených ako B3094XYa B3094XY (definované identifikačným č. sekvencie: 54 a identifikačným č. sekvencie: 55), a potom predĺžením 3' koncov každého z oligonukleotidov pomocou PCR. Produkt bol purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli, štepený enzýmami BstEII a Sali a dosadený do fragmentu BstEII/Sall v protilátke CMX5-1 L reťazca cDNA.

Aminokyselinové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca variabilných oblastí protilátky CMX5-4 sú definované vo výpise sekvencií identifikačným č. sekvencie: 56 a identifikačným č. sekvencie: 57. Pretože aminokyselinové zvyšky 1-19 týchto sekvencií zahŕňajú sekrečnú vedúcu sekvenciu, ktorá je štepená počas postranslačnej modifikácie, sú aktuálne sekvencie variabilnej oblasti definované sekvenciami s identifikačným č. sekvencie: 56 a s identifikačným č. sekvencie: 57, začínajúce zvyškom 20.

Konštrukcia humanizovanej protilátky CMX5-5

CMX5-5 V_H DNA bol konštruovaný tak, že boli syntetizované dva fragmenty DNA použitím párov oligonukleotidov označených ako B3136CC a B3137CC a B3138CC a

SK 280610 Β6

B3202CC, ktorých sekvencie sú definované identifikačnými č: sekvencie sú definované v nasledujúcej tabuľke:

Oligonukleotid

B3136CC

B3137CC

B3138CC

B3202CC

Identifikačné č. sekvencie

Výsledné PCR fragmenty boli purifikované elektroforézou na agarózovom géli, štepené a dosadené do fragmentov Spel/BamHI a BamHI/SalI v cDNA V_H reťazca protilátky CMX5-1.

CMX5-5 V_L DNA bol konštruovaný nahradením V_L3 (fragment BamHI/SalI) protilátky CMX5-lv pSRS fragmentom generovaným PCR použitím primérov označených B3142CC a B3143CC (sekvencie definované identifikačným č. sekvencie: 62 a identifikačným č. sekvencie: 63) a templátu CMX5-1 L.

Aminokyselinové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca variabilných oblastí protilátky CMX5-5 sú definované vo výpise sekvencii identifikačným č. sekvencie: 64 a identifikačným č. sekvencie: 65. Pretože aminokyselinové zvyšky 1-19 týchto sekvencii zahŕňajú sekrečnú vedúcu sekvenciu, ktorá je štepená počas postranslačnej modifikácie, sú aktuálne sekvencie variabilnej oblasti definované sekvenciami s identifikačným č. sekvencie: 64 a s identifikačným č. sekvencie: 65, začínajúce zvyškom 20.

Expresia a purifikácia protilátky

Na expresiu humanizovaných protilátok bolo elektroporáciou kotransfekované 5 až 10 gg každého plazmidu, ktorý nesie L reťazec založený na pSRS a plazmide, ktorý nesie H reťazec založený na pSV.SPort do 5 x 10⁶ COS buniek. Bunky potom boli nanesené na kultivačné misky s priemerom 60 mm v prítomnosti kompletného média. Potom, čo sa bunky prichytili na misky (asi 6 hodin po transfekcii a nanesení) bolo médium odsiate a nahradené médiom bez séra. Kondicionované médium bolo odobrané po 72 hodinách.

Koncentrácia humanizovaných protilátok v kondicionovanom médiu boli určované pomocou ľudského IgG4 špecifických ELISA testov. Nunc imunomisky boli pokryté pri 4 °C počas 24 hodín myšinu anti-ľudskou IgG4-Fc monoklonálnou protilátkou (CalBiochem, LaJolla, CA), ktorá mala koncentráciu 5 pg/ml v 50 mM bikarbonátovom tlmivom roztoku s pH = 9,5. Misky potom boli blokované pri teplote miestnosti počas 90 minút preparátom BLOTTO, 5 % netučné sušené mlieko a 0,05 % objem. Tween 20 v Dulbecco modifikovanom PBS.

Po odmytí nadbytočného blokujúceho reagens boli postupne riedené vzorky v objeme 100 pl nanesené do jamiek misiek. Misky boli inkubované pri 37 °C počas 2 hodín, po ktorých boli vzorky odsaté ajamky boli trikrát premyté. Do každej jamky sa pridalo 100 pl peroxidázy konjugovanej s ovčím anti-ľudským IgG (H + L) (The Binding Site, San Diego, CA) a misky boli inkubované pri 37 °C počas 2 hodín. Misky potom boli trikrát premyté a do každej jamky sa pridalo 100 pl ABTS substrátu peroxidázy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) za vzniku farebného zafarbenia. Zafarbenie bolo spektrofotometricky zmerané pri 405 nm.

Kondicionované médiá pre všetkých päť humanizovaných protilátok boli pozitívne na ľudský IgG4. Opakované experimenty ukázali, že koncentrácie IgG4 boli podobné v médiu kondicionovanom po tri dny pre protilátky CMX5-1, CMX5-2 a CMX5-5 (zhruba 200 pg/ml). Koncentrácia IgG4 v CMX5-4 kondicionovanom médiu bola obvykle 2 až 3x vyššia. Hladiny IgG4 merané v kondicionovanom médiu obsahujúcom protilátku CMX5-3, čo zahŕňa V_H rámec z protilátky LA Y namiesto protilátky HIL, boli stále 5 až lOx nižšie ako hladiny merané pre protilátky CMX5-1, 2 a 5.

Na získanie väčších množstiev purifíkovaných humanizovaných protilátok boli rekombinantné CHO bunkové línie prispôsobené k produkcii protilátky CMX5-1. Plazmidy pSRSMPA5H a pDSRGMPA5L nesúce CMX5-1H- a L-reťazec boli kotransfekované v pomere 20 : 1 do CHO buniek a stabilné transfektanty boli selektované na rezistenciu k hypoxantínu a nedostatok tymidínu.

Zo 106 rezistentných klonov testovaných na sekréciu ľudského IgG4 pred pôsobením metotrexátu (MTX) bolo 65 testovaných klonov pozitívnych. Keď boli stabilné klony následne podrobené pôsobeniu MTX pre vznik amplifikácie génu, ukázalo sa tak, že väčšina klonov je k MTX veľmi rezistentných, a i keď sa na bunky pôsobilo MTX v koncentráciách 20, 60 a 200 nM, bola i pri najvyššej koncentrácii MTX pozorovaná iba slabá retardácia rastu buniek.

Jeden z lepšie produkujúcich klonov nazvaný CJA25 bol podrobený kontinuálnemu pôsobeniu MTX pri postupnom zvyšovaní koncentrácie MTX až do finálnej koncentrácie 1 mmol, pri ktorej bola stanovená úroveň expresie protilátky 15 pg/bunka/deň. Stabilita tejto bunkovej línie bola sledovaná kultiváciou buniek za absencie MTX počas viacej ako dvoch mesiacov, počas ktorej sa hladina expresie nezmenila.

V paralelnom experimente boli CHO bunky opäť kotransfekované pDSRGMPA5H a pSRSMPA5L, ale v pomere 1 : 20. Efektivita transfckcic bola stanovená 10 až lOOx nižšia, i keď podmienky boli skoro identické s podmienkami, pozri vyššie. Testovanie 40 klonov ukázalo, že 10 klonov bolo pozitívnych na sekréciu rekombinantného ľudského IgG4.

Hladiny protilátky JES1-39D10 boli merané podobným spôsobom s tým rozdielom, že kozia anti-krysia IgG Fc monoklonálna protilátka (Pierce, Rockford, IL) bola použitá ako záchytné reagens a ovčí anti-krysí IgG (H + L) konjugát peroxidázy (The Binding Site, San Diego, CA) bol použitý ako reagens na detekciu.

Protilátky z kondicionovaného média boli purifikované štandardnými spôsobmi použitím proteínu G alebo proteínu A/G (Pierce Chemical) pri afinitnej chromatografii, ako opisuje výrobca chromatografických materiálov. Purifikované protilátky mali čistotu vyššiu ako 99 %, ako bolo stanovené aminokyselinovou analýzou.

Protilátky v kondicionovanom médiu bez séra z JES1-39D10 hybridómu a z klonu CJA25 boli taktiež purifikované afinitnou chromatografiou použitím kolón s imobilizovaným ľudským IL-5, ktoré boli pripravené pripojením ľudského IL-5 k živici AFFIGEL-15¹ (BioRad, Richmond, CA).

Po nanesení kondicionovaného média z jedného zdroja bola kolom následne premývaná PBS a PBS s 0,5 M NaCl a reekvilibrovaná PBS. Ľudské IL-5-väzbové protilátky boli z kolóny eluované 0,2 M glycínom s pH = 2,95 a eluovaný proteín bol okamžite neutralizovaný 1 M Tris-HCl, pH 8.

Koncentrácia takto purifíkovaných protilátok bola stanovovaná UV absorpciou pri 280 nm využitím zistených molámych extinkčných koeficientov. Purifikované proteíny boli koncentrované, dialyzované proti PBS (pH = 7,2) a podrobené elektroforézou v polyakrylamidovom géli v prítomnosti SDS (SDS-PAGE; Laemmli, Náture 227, 680 (1970)) dvakrát v 10 - 20 % géli za redukujúcich podmie

SK 280610 Β6 nok. Po elektroforéze bol jeden gél farbený použitím Coomassie blue na vizualizáciu proteínových pásov. Proteíny boli s cieľom aminokyselinových analýz od N-konca regenerované z gélov blotovaním na IMMOBILON^R .

Tento jednokrokový purifikačný spôsob regenerácie proteínov poskytol proteín s čistotou väčšou ako 99 %, ako bolo stanovené pomocou SDS-PAGE. Za redukujúcich podmienok boli pozorované dva pásy so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 50 a 23,2 kDa, čo súhlasí so známymi molekulovými hmotnosťami H a L reťazcov imunoglobulínov.

Charakterizácia protilátky

Afinitné konštanty

Na stanovenie, či si humanizované protilátky zachovali schopnosť špecificky viazať ľudský IL-5, boli merané zdanlivé disociačne konštanty komplexov protilátka/antigén. To bolo prevedené nanesením myšieho anti-ľudského IgG4-Fc (5 μΐ/ml, 100 μΐ/miska) na misky pre ELISA testy v 50 mM bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH = 9,5.

Misky boli blokované preparátom BLOTTO pri teplote miestnosti, 3x omyté a inkubované pri 37 °C počas 2 hodín s jednou z alebo vo forme purifikovaných humanizovaných protilátok (100 μΐ/miska do finálnej koncentrácie 0,05 pg/ml) alebo vo forme kondicionovaného média (100 μΐ/miska).

Molekuly rekombinantnej protilátky z kondicionovaného média boli takto interakciami medzi konštantnými oblasťami a protilátkami, ktoré boli nanesené na misky, imobilizované na miskách tak, že variabilné oblasti testovaných protilátok boli orientované uniformným spôsobom, čo umožňuje priame a maximálne interakcie s antigénom.

S cieľom prevedenia experimentu na porovnanie bola paralelne testovaná protilátka JES1-39D10 a použitím kozieho anti-krysieho IgG Fc namiesto myšieho anti-ľudského lgG4-Fc ako zachytávacej protilátky.

Po trojnásobnom omytí misiek boli do misiek aplikované po 100 μΐ (konečný objem) série zriedených roztokov ľudského IL-5 inačeného izotopom ¹²⁵I v koncentráciách od 4000 pM do 2 pM. Všetky pokusy boli prevedené trikrát. Stanovenie pozadia väzbovej reakcie bolo urobené použitím 1000 molámeho nadbytku neznačeného ľudského IL-5 v kontrolných miskách. Reakcie sa ekvilibrovali pri teplote miestnosti počas dvoch hodín, po ktorých boli misky odsaté a 5x omyté TBST. Misky boli separované a zmeral sa obsah izotopu v miskách na prístroji Pharmacia LKB γ-čítač. Všetky kontrolné experimenty na nešpecifické väzby boli urobené dvakrát. Hodnoty získané pre viazaný ľudský IL-5 boli podrobené Scatchardovej analýze (použitím softvéru RADLIG) a boli stanovené hodnoty disociačnych konštánt (kd).

Výsledky tejto analýzy ukázali, že získané hodnoty kd humanizovaných protilátok CMX5-1, 2, 3 a 5 boli všetky v tom istom rozsahu a boli blízke hodnote stanovenej pre protilátku JES1-39D10. Zdanlivá hodnota kd pre CMX5-4 nemohla byť stanovená, pretože vo vzorke bola zistená veľmi nízka rádioaktivita a nebola pozorovaná odpoveď na dávku.

Testy kompetitívnej väzby

Na zistenie, či má humanizácia za následok zmeny väzbovej oblasti antigénu protilátky JES1-39D10 bol divoký typ protilátky označený biotínom pomocou testu X-NHS-biotin kit (Calbiochem, LaJolla, CA) s finálnou koncentráciou reagentu 20 mM. Produkt bol testovaný v priamom väzbovom ELISA teste k ľudskému IL-5 a použité koncentrácie, ktoré boli zhruba trojnásobkom 50 %, boli použité v testoch kompetivity. Táto koncentrácia zodpovedala zhruba 30 ng biotinylovanej protilátky JES1-39D10.

Test kompetivity bol urobený tak, že merala sa viažuca biotinylovaná protilátka nanesená na misky s ľudským IL-5 v prítomnosti neznačenej protilátky JES1-39D10 alebo protilátky CMX5-1, CMX5-2 alebo CMX5-5, pričom každá z nich bola puriíikovaná proteín A/G afínitnou chromatografiou.

E1A misky boli vystavené pôsobeniu 0,1 M NaHCO₃ s pH = 9,2 počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Potom bolo do každej jamky pridané 100 pg ľudského IL-5 v TBS. Misky boli inkubované cez noc pri 4 °C, a potom blokované 3 % BSA-TBS ml počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Do každej jamky sa potom pridalo 50 μΐ dvakrát postupne riedených kompetitívnych protilátok s vhodným množstvom biotinylovanej protilátky JES1-39D10 (taktiež v objeme 50 μΐ) a misky boli inkubované počas 1 hodiny pri teplote miestnosti.

Misky potom boli 5x opláchnuté TBS-Tween-20, inkubované s 1 pg/ml chrenovej peroxidázy (HRP) konjugovanej s streptavidínom počas 1 hodiny pri teplote miestnosti, 5x opláchnuté TBS-Tween-20 a vyvinuté s TMB, substrátom HRP. Absorbancia vzoriek bola meraná spektrofotometricky pri 450 nm.

Výsledky ukázali, že zatiaľ čo neznačená protilátka JES1-39D10 kompetovala so svojou biotinylovanou formou v pomere asi 1 : 1, ten istý stupeň kompetície protilátkami CMX5-1, 2 a 5 vyžadoval väčšie množstvo protilátok. Za predpokladu, že molámy pomer neznačenej k biotinylovanej protilátke JES1-39D10 je 1,0, sú moláme pomery protilátok CMX5-1, 2 a 5 k biotinylovanej JES1-39D10, potrebné na získanie toho istého stupňa väzbovej inhibície, 3,3, 1,4 a 1,4.

Inhibicia receptora viažuceho ľudský IL-5

Pri skúmaní schopnosti humanizovaných protilátok CMX5-1, 2 a 5 inhibovať väzbu značeného ľudského IL-5 na d-reťazci receptora rekombinantného ľudského IL-5 transfckovaných COS buniek zistilo sa, že všetky tri protilátky blokujú väzbu na receptor. Táto blokovacia aktivita bola pozorovaná pri použití nielen kondicionovaného média, ale i purifikovaných protilátok. S konštantnou 0,5 nM koncentráciou značeného IL-5, boli koncentrácie protilátok CMX5-1, 2 a 5 potrebné pre 50 % inhibíciu väzby na receptor (IC₅₀) stanovené ako 1,5 - 3,0, 0,35 - 0,7 a 0,5 - 1,1 nM pre jednotlivé protilátky. IC₅o pre divoký typ protilátky JES1-39D10 bola stanovená ako 0,15 - 0,55 nM.

Modifikácia ľahkého reťazca protilátky CMX5-5

Všetkých päť humanizovaných protilátok obsahovalo zvyšok asparagovej kyseliny v polohe 105 ľahkého reťazca v dôsledku modifikácií DNA, ktoré boli uskutočnené s cieľom uľahčenia klonovania. Pre obnovu natívnej sekvencie bol zvyšok kyseliny aparagovej v polohe 105 ľahkého reťazca protilátky CMX5-5 nahradený zvyškom kyseliny glutámovej. To bolo prevedené použitím syntetického oligonukleotidu označeného B3289CC (identifikačné č. sekvencie; 66) s aminokyselinovou sekvenciou zodpovedajúcou sekvencii spoja C-koncového peptidu V_L a N-koncového peptidu C_L so zmenou kodónu GAC na GAG. Táto zmena kodónu vytvorila Xhol reštrikčné miesto na mieste Sali.

Boli prevedené PCR s oligonukleoidovými primérami B3289CC a A2496CC (identifikačné č. sekvencie: 34) použitím ľahkého reťazca CMX5-5 ako templátu. Výsledný fragment bol purifíkovaný elektroforeticky, štepený a použitý pri nahradení Sall/EcoRI fragmentu v cDNA ľahkého reťazca CMX5-5 založenom na pSRS. Modifikovaná cDNA ľahkého reťazca CMX5-5 bola vyštepená z pSRS a klonovaná do pDSRG na stálu expresiu. Nový variant označený ako CMX5-OK1 sa skladá z ťažkého reťazca CMX5-2 a modifikovaného ľahkého reťazca CMX5-5. Ďalší variant označený ako CMX5-OK2 sa skladá z ťažkého reťazca CMX5-5 a modifikovaného ľahkého reťazca CMX5-5.

Biologické účinky

Inhibícia IL-5 indukovanej expresie

CD 11b Subklon HL-60 (ATCC CCL 240) bol uchovávaný v Iscoves Modified Dulbecco s Médium (JRH BioScience) s 10 % FBS, 2 mM glutamínom, penicilínom a streptomycínom. HL-60 je multipotentná ľudská promyelocytická bunková línia, ktorá v prítomnosti butyrátu alebo ľudského IL-5 produkuje bunky, ktoré majú fenotypické charakteristiky eozinofilov (Tomonaga a kol., Blood 67, 1433 (1986), Fabian a kol., Blood 80, 788 (1992)). Na povrchu eozinofilov, ktoré boli aktivované a vnesené do pľúc alergických pacientov (Georas a kol., Am. J. Resp. Celí Mol. Biol. 7, 261 (1992)) bolo pozorované zvýšenie expresie adhéznej molekuly bunky nazývanej CD1 lb/CDl 8.

Pred testom boli HL-60 bunky pripravené pre diferenciáciu týždenným predpestovaním v alkalickom médiu (pH = 7,6 - 7,8 upravené bikarbonátom sodným). Po vypestovaní boli bunky prenesené do 24-jamkových kultivačných misiek v koncentrácii 2 x 10⁵ buniek/ml, postupne riedené testované protilátky boli preinkubované s konštantným množstvom ľudského IL-5 pri teplote 37 °C počas 1 hodiny, a potom pridané k bunkám. Finálna koncentrácia IL-5 v kultúre bola 150 pM.

Po 72 hodinách boli bunky ccntrifugovanc a resuspendované na výslednú koncentráciu 1 x 10⁶ buniek/ml a 50 μΐ objemami (5 x 10⁴ buniek) boli vnesené do jamiek 96-jamkových mikrotitračných misiek. Bunky boli v miskách sušené a opláchnuté 70 % etanolom, a potom roztokom TBS-Tween-20 a blokované 10 % nízkotučným sušeným mliekom a 5 % BSA.

Pridala sa primárna protilátka (myší anti-ľudský CD 11 b; Becton-Dickinson, Braintree, MA). Po dvojhodinovej inkubácii pri 37 °C boli misky postupne omyté roztokmi 3xTBS-Tween-20, nechala sa naviazať sekundárna protilátka proti primárnej protilátke (Jackson, ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a 3x TBS-Tween-20. Špecificky viazaná protilátka bola nato detegovaná pomocou zariadenia ELISA Apmplification Systém (Gibco-BRL). Zistilo sa, že humanizaované protilátky CMX5-1, CMX5-2 a CMX5-5 sú schopné blokovať CD1 lb indukciu aktivity ľudského IL-5. Boli stanovené nasledujúce hodnoty IC₅₀:

Vzorkí	ICM (pM)	MclÁrny pomer CMXSAL-S	ICM CMX5/1Cm 39D10
CMX5-1	1467	7,3 :1	8,8
CMX5-2	467	2,3: 1	2.Í
CMX5-5	800	4 : 1	4,8
39D1O	166	0,83:1	í

Ako je vidieť z tabuľky, humanizované protilátky CMX5-2 a CMX5-5 sú oveľa potentncjšic ako protilátka CMX5-I.

Inhibícia eozinofílie myší indukovanej alergénom

S cieľom stanoviť, či sú humanizované protilátky schopné neutralizovať aktivitu IL-5 in vivo, boli mladé samčeky B6D2F1/J myší senzitizované (8 mg na zviera) albumínom precipitovaným kamencom. Po jednom týždni bola podaná druhá dávka. Okrem skupiny 5 nesenzitizovaných kontrolných myší obsahovali všetky ďalšie skupiny 6 myší.

Po 1 týždni od druhej dávky a zároveň pred imunizáciou boli senzitizované zvieratá intraperitoneálne injikované 0,5 ml roztoku testovanej protilátky. Každej skupine bolo podané: 0,1 mg protilátky JES1-39D10 na kg živej váhy, 1 mg protilátky JES1-39Ď10 na kg živej váhy, 1 mg protilátky CMX5-1 na kg živej váhy a 10 mg protilátky CMX5-1 na kg živej váhy. Protilátka označená ako TRFK 5, krysia anti-myší IL-5 monoklonálna protilátka (pozri Schumacher a kol.) bola použitá ako pozitívna kontrola. Kontrolným senzitizovaným myšiam bol podaný salin.

Zvieratá boli potom imunizované dvakrát aerosólom ovoalbumínu počas 1 hodiny. Po 24 hodinách boli odobrané vzorky bronchioalveolámych laváží, periferálnej krvi a pľúcneho tkaniva, farbené eozinofil-špecifickými farbivami, a potom bola pomocou mikroskopu určovaná distribúcia eozinofilov.

Zistilo sa, že myši, ktorým bola podaná protilátky CMX5-1 v množstve 10 mg na kilogram telesnej hmotnosti, mali značne redukovaný počet eozinofilov v tekutinách bronchiolveolámych laváží, zatiaľ čo iné bunkové typy mali menej kvantitatívnych zmien. Myši, ktorým bola podaná protilátka JES1-39D10, mali hladiny eozinofilov taktiež redukované.

Uloženie hybridomu

Bunková línia hybridomu (JES1-39D10.11) produkujúca monoklonálnu protilátku JES1-39D10 bola uložená 8. januára 1992 v Američan Type Culture Collection Accession (ATCC) pod č. ATCC HB 10959. Tieto vzorky boli pripravené v podmienkach požadovaných podľa dohody ATCC pre Depozit kultúr pre patentové účely (Culture Deposit for Patent Purposes), ktoré zaisťujú, že uložené línie budú prístupné US Commissioner of Patents and Tredemarks podľa 35 USC 122 a 37 CFR 1.14 a budú prístupné verejnosti vydaním U.S. patentu, a ktoré požadujú, že depozit bude udržovaný. Prístupnosť uložených kmeňov nie je myslená ako licencia k realizovaniu vynálezu v rozpore s právami garantovanými úradmi akejkoľvek vlády v súlade s jej patentovými zákonmi.

Je možné uskutočniť mnoho modifikácií a variantov tohto vynálezu bez toho, aby obišli jeho podstatu a rámec predkladaného vynálezu, ako je zrejmé tým, ktorí sa oboznámili s technikou. Špecifické spôsoby opísané tu sú uvedené iba ako príklady a vynález je obmedzený len termínmi uvedenými v patentových nárokoch.

Výpis sekvencii

L Všeobecné informácie:

i) predkladateľ: Chou., Chuan-Chu

Murgolo, Nicholas Abrams, John Jehn, Chung-Her Petro, Mary Silver, John Tindall, Stephen Windsor, William Závodný, Paul ii) názov vynálezu:

SK 280610 Β6 iii) počet sekvencii: 66 iv) adresa pre korešpondenciu:

a) adresa: Schering-Plough Corporation

b) One Giralda Farms

c) Mesto: Madison

d) Štát: New Jersey

e) Krajina: USA

f) PSČ: 07940-1000

v) Forma spracovania na počítači:

a) Typ média: Flopydisk

b) Počítač: Apple Macintosh

c) Operačný systém: Macintosh 6.0.5

d) Softvér: Microsoft Word 4.00B vi) Všeobecné údaje žiadosti:

a) Číslo žiadosti:

b) Dátum registrácie:

c) Hodnotenie:

vii) Predchádzajúce dátumy žiadosti:

a) Číslo žiadosti: 07/832,842

b) Dátum registrácie: 06. 02. 1992 viii) Zmocnenec/jednateľ:

a) Meno: Dulak, Norman C.

b) Registračné číslo: 31,608

c) Číslo odkazu/stručného výťahu: JB0233K ix) Telekomunikačná informácia:

a) Telefón: 201 822 7375

b) Telefax: 201 822 7039

c) Telex: 219165

2. Informácia o sekvencii č. 1:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 333 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: dvojvlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 1:

GAA TCT Glu Ser TGC ACT

GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCA TCA CAG ACC CTG TCT CTC ACC

48 96

Gly Gly GTC TCT

Gly Leu Vsi Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr

S GGG TTA Gly Leu

10 TCA TTA ACC AGC AAT AGT

15 GTG AAC TGG ATT

Cys

Thr

Val

Ser 20

Ser Leu

Thr 25

Sex

Asn

Ser

Val

Asn 30

Trp

íle

CG6

CAG

CCT

CC*

GGA

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

ATG

GGA

CTA

ATA

TGG

AGT

144

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Leu

11«

Trp

Ser

33

40

45

AAT

GGA

GAC

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

AAA

TCC

CGA

CTG

AGC

ATC

192

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

íle

Lys

Ser

Arg

Leu

Ser

íle

50

55

60

AGT

AGG

GAC

ACC

TCG

AAG

AGC

CAG

GTT

TTC

TTA

AAG

ATG

AAC

AGT

CTG

240

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Ser

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Met

Asn

Ser

Leu

«5

70

73

80

CAA

AGT

GAA

GAC

ACA

GCC

ATG

TAC

TTC

TGT

GCC

AGA

GAG

TAC

TAC

GGC

288

Gin

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Het

Tyr

Phe

cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

tyr

Gly

85

90

95

TAC

TTT

GAT

TAC

TGG

GGC

CAA

GGA

GTC

ATG

GTC

ACA

GTC

TCC

TCA

333

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

10C 105 110

2. Informácia o sekvencii č. 2:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 384 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: dvojvlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 2:

ATG GCT CTG CCC ACT CAG CTC CTG GGG TTG TTG TTG CTG TGG ATT ACA 48 Met Al· Val Pro Thr Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp íle Thr $ 10 15

GAT GCC ATA TGT

GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA GCT TCC CTG TCT

96

Asp Ale íle

Cy. 20

Asp

íle

Gin Het

Thr 25

Gin

Sex

Pro

Ale Ser 30

L.U Ser

GCA

TCT

CTG

GGA

GAA

ACT

ATC

TCC

ATC

GAA

TGT

CIA

GCA

AGT

GAG

GGC

144

Ala

Ser

Leu

Gly

Glu

Thr

11·

Ser

11«

Glu

Cy.

Leu

Al.

Ser

Glu

Gly

35

40

45

ATT

TCC

AGT

TAT

TTA

GCG

TGG

TAT

CAG

CAG

AAG

CCA

GGG

AAA

TCT

CCT

192

11«

Sex

sex

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pre

Gly

Ly.

Ser

Pre

50

55

60

CAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCA

AAT

AGC

TTG

G*A

ACT

GGG

GTC

CCA

TCA

240

Sln

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pre

Ser

65

70

75

80

CGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

tct

GCC

ACA

CAA

TAT

TCT

CTC

AAG

ATC

AGC

2SB

Arg

Pha

Ser

Gly

Sex

Gly

Ser

Ala

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

11«

Ser

85

90

95

AGC

ATG

CAA

CCT

GAA

GAT

GAA

GGG

GAT

TAT

TTC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

336

Ser

Het

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

cys

Gin

Gin

Sex

Tyr

100

105

110

AAG

TTT

CCG

AAC

ACG

TTT

GGA

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

CTG

AAA

CGG

314

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Luu

lys

Arg

115 120 12S

2. Informácia o sekvencii č. 3:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 39 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 3: AGTCTAGAAG CTTGAATCTG GAGGAGGCTT GGTACAGCC 39

2. Informácia o sekvencii č. 4:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 58 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 4: CAGCCCGGGA ATTCGTCGAC TCACTGCCAT GTTTCTTTCT TTACATTGAG CTTGCTGT

2. Informácia o sekvencii č. 5:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 36 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 5: GCAAGCTTGG ATCCAGACAG GACACAGGCC AGACAT36

2. Informácia o sekvencii č. 6:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 38 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 6: CACGAATTCT GCAGTGGCCAC CTCAGGACCT TTGGGTCT 38

2. Informácia o sekvencii č. 7:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 114 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 7: AGGCAGTCGA CGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT

TTAACACTTT 60 TAAATGGTAT CCAGTGTGAG GTGAAACTGT TGGAATCTGG AGGAGGCTTG GTAC 114

2. Informácia o sekvencii č. 8:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 131 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 8: ACTGAATTCT ATTTACCAGG AGAGTGGGAG AGACTCTTCT CAGTATGGTG GTTGTGCAGG 60 CCCTCATGCA GCACAGAACA CGTGAAAGTG TTTCCCTGCT GCCATGTTTC TTTCTTTACA 120 TTGAGCTTGC T 131

2. Informácia o sekvencii č. 9:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 66 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 9: AGCTGTCGAC GCCGCCACCA TGCGTTGTGC CACTCAGCTC CTGGGGTTGT TGTTGCTGTG 60 GATTAC 66

2. Informácia o sekvencii č. 10:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 48 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 10: AGCTCTAGAA TTCTGCAGTC AACACTCATT CCTGTTGAAG CTATTGAC 48

2. Informácia o sekvencii č. 11:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 102 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 11: GCTGAATTCG CCGCCACCAT GGGCTGGAGC TGTATCATCC TCTTCTTAGT AGCAACAGCT 60 ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CAAACTGGTA CAAGCTGGAG GT 102

2. Informácia o sekvencii č. 12:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 102 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 12: GCGTACTAGT TAATGATAAC CCAGAGACGA TGCAACTCAG TCGCAGAGAT CTTCCTGGCT 60 GTACGACGCC ACCTCCAGCT TGTACCAGTT TGACCTGGGA GT 120

2. Informácia o sekvencii č. 13:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 86 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 13: GTCAGACTAG TAATAGTGTG AACTGGATAC GGCAAGCACC TGGCAAGGGT CTGGAGTGGG 60 TGCACTAAT ATGGAGTAAT GGAGAC 86

2. Informácia o sekvencii č. 14:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 73 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 14: GTACTCTAGT GATTGTGAAT CGAGATTTGA TAGCTGAATT TATCTGTG TCTCCATTAC

TCCATATTAG TGC 73

2. Informácia o sekvencii č. 15:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 104 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 15: GCAGAATTCT AGAGACAATT CGAAGÁGCAC CCTATACATG CAGATGAACA GTCTGAGAACA GTCTGAGAAC 60 TGAAGATACT GCAGTCTACT TCTGTGCTCG TGAGTACTAT GGAT 104

2. Informácia o sekvencii č. 16:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 99 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 16: CTCGTCAGCT CGGGCCTTG GTCGACGCTG AGGAGACTGT GACTAGGACA CCTTGACCCC 60 AATAGTCGAA ATATCCATAG TACTCACGAG CACAGAAGT 99

2. Informácia sekvencii č. 17:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 94 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 17: AGAGCTGCAG CCGCCACCAT GGGATGGAGC TGTATCACC TCTTCTTGGT AGCAACAGCT 60 ACAGGTGTCC ACTCCGACAT CCAGATGACA CAGT 94

2. Informácia o sekvencii č. 18:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 83 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 18: AGCATCTAGA GGTGACCCTA TCTCCGACAG ATACAGACAG CGAACTTGGA GACTGTGTCA 60 TCTGGATGTC GGAGTGGACA CCT 83

2. Informácia o sekvencii č. 19:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 101 párov zásad

SK 280610 Β6

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 19: AGATCTGCAG GTCACCATCA CATGTCTAGC AAGTGAGGGC ATCTCCAGTT ACTTAGCGTG 60 GTACCAGCAG AAGCCCGGGC TAGCTCCTAA GCTCCTGATC T 101

2. Informácia o sekvencií č. 20:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 84 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 20: STGGCGGSTC CTGAGCCACT GAATCTTGAT GGTACTCCAG TCTGCAAGCT ATTCGCACCA 60 TAGACAGA GCTTAGGAGC TAGC 84

2. Informácia o sekvencií č. 21:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 81 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 21: CTCAGGATCC GCTACAGACT TCACGCTCAC GATCTCCAGC CTACAGCCTG AGATATCGA 60 GACGTATTAC TGTCAACAGT C 81

2. Informácia o sekvencií č. 22:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 76 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 22: GCATGCCGTC GACCTTGGTG CCTTGACCGA ATGTGTTCGG GAACTTATAC GACTGTTGAC 60 AGTAATACGT CGCGAT 76

2. Informácia o sekvencií č. 23:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 70 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 23: GCATCGCGTC GACCAAAGGT CCATCTGTGT TTCCGCTGGC GCCATGCTCC AGGAGCACCT 60 CCGAGAGCAC 70

2. Informácia o sekvencií č. 24:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 79 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 24: GACAGAATTC AGGTGCGGA CACGACGGAC ATGGAGGACC ATACTTCGAC TCAACTCCT 60 TGTCCACCTT GGTGTTGCT 79

2. Informácia o sekvencií č. 25:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 68 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 25: ACTGGAATTC CTAGGTGGAC CATCAGTCTT CCTGTTTCCG CCTAAGCCCA AGGACACTCT CATGATCT 68

2. Informácia o sekvencií č. 26:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 51 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 26: CAGGCTGTCG ACTCGAGGCT GACCTTTGGC TTTGGAGATG GTTTTCTCGA T 51

2. Informácia o sekvencií č. 27:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka:38 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 27: GTAAGCGTCG ACTCGAGAGC CACAGGTGTA CACCCTGC 38

2. Informácia o sekvencií č. 28:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 40 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 28: CGCTAGCGGC CGCTCATTTA CCCAGAGACA GGGAGAGGCT 40

2. Informácia o sekvencií č. 29:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 196 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 29: AGTGCGCTGC AGCCGCCACC ATGGGATGGA GCTGTATCAT CCTCTTCTTG GTAGCACAG 60 CTACAGGGT CCACTCCGAC ATCCAGATGA CACAGTCTCC AAGTTCCCTG TCTGCATCTG 120 TCGGAGATCG GGTCACAATC GAATGTCTAG CAAGTGAGGG CATTTCCAGT TATTTAGCGT 180 GGTATCAGCA GAAGCC 196

2. Informácia o sekvencií č. 30:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 213 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 30: ACCTTGGTAC CTTGTCCAAA CGTGTTCGGA AACTGTAAC TCTGTTGACA GTAATAATCT 60 CCTTCATCIT CAGGTGCAG GCTGGAGATC TTAAACGTGA AATCAGTGCC GGATCCACTG 120 CCACTGAACC GTGATGGGAC CCCAGTTTGC AAGCTATTTG CACCATAGAT CAGGAGTTTA 180 GGAGCTTTCC CTGGCTTCTG CTGATCCAC GCT 213

2. Informácia o sekvencii č. 31:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 190 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 31: GAACACGTTT GGACAAGGTA CCAAGGTCGA CATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT 60 CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA AGTGCCTCTG TTGTGTGCCT 120 GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA AGTACAGTGG AAGGTGGAA ACGCCCTCCA 180 ATCGGGTAAC 190

2. Informácia o sekvencii č. 32:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 207 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 32: GTCAGAATTC TAACACTCTC CCCTGTTGAA GCTCTTTGTG ACGGGCGAGC TCAGGCCCTG 60 ATGGGTGACT TCGCAGGCGT AGACTTTGTG TTTCTCGTAG TCTGCTTTGC TCAGCGTCAG 120 GGTGCTGCTG AGGCTGTAGG TGCTGTCCTT GCTGTCCTGC TCTGTGACAC TCTCCTGGGA 180 GTTACCCGAT TGGAGGGCGT TATCCAC 207

2. Informácia o sekvencii č. 33:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 32 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 33: GCATGCGTCG ACGTCAAACG GACTGTGGCT GC 32

2. Informácia o sekvencii č. 34:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 111 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 34: GATCAAGCTT GAATTCTAAC ACTCTCCTCT GTTGAAGCTC TTCGTGACTG GCGAGCTCAG 60 GCCTTGAGA GTGACTTCGA AGGCGTAGAC TTTGTGTTTC TCGTAGTCTG C 111

2. Informácia o sekvencii č. 35;

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 117 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 35: GAGTCAGTCC AAGCTTGAAT TCTAACACTC TCCTCTGTTG AAGCTCTTCG TGACTGGCGA 60 GCTCAGGCCT TGATGAGTGA CTTCGCAGGC GTAGACTTTG TGTTTCTCGT AGTCTGC 117

2. Informácia o sekvencii č. 36:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 116 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 36:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

•15

•10

•S

Val

His

Ser

Gin

val

Lys

Leu

Val

Gin

Ala

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

íle

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

15

20

25

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Kín

Trp

íle

Arg

Gin

Ala

Pre

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

v»i

Ala

Leu

Íle

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Sex

50

55

60

Ala

Íle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

Íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

¢5

70

75

Leu

Tyr

Met

Gin

Mtt

Asn

Ser

Leu

Arg

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

SO

85

90

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

v«l

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

111

115

2. Informácia o sekvencii č. 37:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 108 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 37:

«•t

Gly

Trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

‘15

•10

•S

Val

Ria

Ser

Asp

Zle

Gin

Het

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Sex

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

val

Thr

zle

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Zle

15

20

25

Ser

Sex

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gla

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pxe

Sex

Arg

50

$$

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

thr

ASp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

lys

60

1$

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2. Informácia o sekvencii č. 38:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 42 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 38: GATCTCTGCG ACTGAGTTGC ATCGCATCTG GGTTCACATT CT 42

2. Informácia o sekvencii č. 39:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) DÍžka: 42 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 39: CTAGAGAATG TGAACCCAGA TGCGATGCAA CTCAGTCGCA GA 42

SK 280610 Β6

2. Informácia o sekvencií č. 40:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 116 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 40:

Het

Gly

Trp

Sex

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

Val

His

Ser

Gin

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ala

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

íle

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

15

20

25

Ser

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

íle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Clu

Trp

Val

Ala

Leu

íle

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

50

55

50

Ala

Íle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

55

70

75

Leu

Tyr

Met

Gin

Met

Asn

Sex

Leu

Arg

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

80

85

90

Phe

Cya

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

no ns

2. Informácia o sekvencií č. 41:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 108 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 41:

Het

Gly

Trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

5

Val

Hla

Ser

Asp

íle

Gin

Met

Thx

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

íle

Thr

cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Íle

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gla

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Sex

ku

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

50

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

ASp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

55

70

75

Leu

Gin

Prô

Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

val

ASP

val

Lye

Arg

95

100

10$

2. Informácia o sekvencií č. 42:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 95 párov zásad

b) Typ; nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 42: GCAGCTGCAG CCGCCACCAT GGGCTGGAGC TGTATCATCC TCTTCTTAGT AGCAACAGCT 60 ACAGGTGTCC CTCCGAGGT CCAGCTGCTA GAGTC 95

2. Informácia o sekvencií č. 43: i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 108 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 43: AGACGAATTC ACTAGTAAT GATAACCCAG AGACTGCGCA ACTCAGTCGC AGAGATCCTC 60 CTGGCTGTAC GAGGCCACCT CCAGACTCTA GCAGCTGGAC CTCGGAGT 108

2. Informácia o sekvencií č. 44:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 103 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 44: AAGCGATCTA GAAATGACTC GAAGAACACC

CTATACCTAC AGATGAACGG TCTGCAGCT 60 GAAGTAAGTG CATCTACTT CTGTGCTCGT GAGTACTATG GAT 103

2. Informácia o sekvencií č. 45:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 93 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 45: ACGAGAAGCT TCATGTCGAC GCTGAGGAGA

CTGTGACTAG CGTACCTTGA CCCCAATAGT 60 CGAAATATCC ATAGTACTCA CGAGCACAGA AGT 93

2. Informácia o sekvencií č. 46:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 116 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 46:

Met Gly Trp Val His Ser

Ser Cys íle 11· Leu Phe Leu Val Ala Thr ALa Thr Gly

-15 Glu Val 1

Gin Leu Arg Leu 20

VM 5 ser

-10 Glu Ser Gly

-5 Gly Gly Leu Val Gin

10

ser Leu

pro

Gly Gly 15

Ser

Leu

cys

Λ13

val

ser 25

Gly

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

val

Aan

Txp

íle

Arg

Gin

Ala

Fro

Gly

Lya

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Leu

114

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

50

55

60

Ala

íle

Lya

Ser

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Aan

Aap

Ser

Lys

Asn

Thr

65

υ

75

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Cly

Leu

Gin

Ala

Glu

Val

Ser

Ala

íle

Tyr

80

85

90

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyx

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Aap

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 11S

2. Informácia o sekvencií č. 47:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 108 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 47:

SK 280610 Β6

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

•15

-10

•5

Hla

Ser

Asp

Zle

Gin

Het

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

val

1

5

10

Ser

V»1

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Íle

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Zle

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

Í0

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

xap

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

€5

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

lys

80

05

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

val

Asp

Val

Lya

Arg

SS 100 105

2. Informácia o sekvencií č. 48:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 97 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 48: GCTGACTGCA GCCGCCACCA TGGGCTGGAC CTGTATCATC CTCTTCTTAG TAGCAACAGC 60 TACAGGTGTC CACTCCCAGG TCAAACTGGT ACAAGCT 97

2. Informácia o sekvencií č. 49:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 108 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 49: CTAGAAGCTT ACTAGTTAAT GATAACCCAG ATGCGATGCA ACTCAGTCGC AGAGATCTTC 60 CTGGCTGTAC GACGCCACCT CCAGCTTGTA CCAGTTTGAC CTGGGAGT 108

2. Informácia o sekvencií č. 50:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 90 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 50: GGACGAATC ACTAGTAATG GTATGCACTG GGTACGGCAA GCACCTGGCA AGGGTCTGGA 60 GTGGGTTGCA GTAATATGGA GTAATGGATC 90

2. Informácia o sekvencií č. 51:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 85 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 51: ACTGCTCTAG AGATTGTGAA TCGTCCTTG ACTGAGTCAC CATAGTATGT TCGTGATCCA 60 TTACTCCATA TTACTGCAAC CCACT 85

2. Informácia o sekvencií č. 52:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 95 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 52: CGTACTCTAG AGACAATTCG AAGCGCACCC TTACATGCA GATGAACAGT CTGAGAACTG 60 AAGATACTGC TGTCTACTAC TGTGCTCGTG AGTAC 95

2. Informácia o sekvencií č. 53:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 100 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 53: ACGAGAAGCT TCATGTCGAC GCTGAGGAGA CTGTGACTAG GACACCTTGA CCCCAATAGT 60 CGAAATATCC ATAGTACTCA CGAGCACAGT AGTAGACAGC 100

2. Informácia o sekvencií č. 54:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 153 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 54: GCGATAGGTC ACCATCACAT GTCAAGCAAG TGAGGGCATC TCCAGTTACT TAAACTGGTA 60 TCGCAGAAG CCCGGGCTAG CTCCTAAGCT CCTGATCTAT GGTGCGAATA CCAGGGAGGC 120 TGGAGTACCA TCAAGATTCA GTGGCTCAGG CTC 153

2. Informácia o sekvencií č. 55:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 150 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 55: ACAGTCGTCG ACCTTGGTGC CTTGACCGAA TGTGTTCGGG AACTTATACG ACTGTTGACA 60 GTAATACGTC GCGATATCTT CAGGCTGTAG GCTGGAGATC GTGAGCGTGA AGTCTGTACC 120 GGAGCCTGAG CCACTGAATC TTGATGGTAC 150

2. Informácia o sekvencií č. 56:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 117 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 56:

Met Gly Trp ®·^Γ Zle II* *** ^{1—0 Va}^ Gly

-15 -10-5

V·! Hie S·* Gin V*1 Lys Leu Val Gin *1« Gly Gly Gly Val Val Gin s10

Pr© Gly Arg Ser Leu Arg Leu Sar Cys íle Ala Ser Gly Leu íer Leu 15 2025

Thr Ser Asn Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pre Gly Ly* Gly LOV 30 35 <045

Glu Trp Val Al* Val íle Trp Ser A*n Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Gly 50 SS60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg <5 7®

Thr Leu Tyr Met Gin Met Aan S·» Leu Arg Thr Glu Asp Thr Al* Val gg 8550

Tyr Tyr Cys Al* Arg Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 95 100105

Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser

110lis

SK 280610 Β6

2. Informácia o sekvencií č. 57:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 108 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 57:

Met

Gly

Trp

Ser

ey.

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

ThX

Gly

-15

*10

•5

Val

His

Ser

Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

Val

Gly

Asp

ΑΓψ

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Gin

Ala

Ser

Glu

Gly

íle

15

20

23

Sex

Sex

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

thr

Arg

Glu

Ala

Gly

Val

Pro

sex

Arg

50

55

60

Phe

Sex

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Sex

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

íle

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pre

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2. Informácia o sekvencií č. 58:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 98 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 58: GCATGACAGT AGATCTCTGC GACTGAGTTG CATCGCATCT GGGTTCACAT TCTCTAGTAA 60 TAGTGTGAAC TGGGTACGGC AAGCACCTGG CAAGGGTC 98

2. Informácia o sekvencií č. 59:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 113 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 59: ACGATCACTC TAGAGATTGT GAATCGAGAT TTGATAGCTG AATTATAATC TGTGTCTCCA 60 TTACTCCATA TTAGTGCAAC CCACTCCAGA CCCTTGCCAG GTGCTTGCCG TAC 113

2. Informácia o sekvencií č. 60:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 91 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 60: GCATGGACGT CTAGAGACAA TTCGAAGAGA ACCCTATACA TGCAGATGAA CAGTCTGAGA 60 ACTGAAGATA CTGCAGTCTA CTACTGTGCT C 91

CAAGTCGACG ACAAGCTTGT CGACGCTGAG GAGACTGTGA CTAGGACACC TTGACCCCAA 60 TAGTCGAAAT ATCCATAGTA CTCACGAGCA CAGTAGTAGA CTGCAGTATC TTCAGTTCTC 120

2. Informácia o sekvencií č. 62:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 28 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 62: ACAGTCCGTT TGACGTCGAC CTTGGTGC 28

2. Informácia o sekvencií č. 63:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 63 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 63: AGTGGCTCAG GATCCGGTAC CGACTTCACG TTCACGATCT CCAGCCTACA GCCTGAAGAT 60 ATC 63

2. Informácia o sekvencií č. 64:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 116 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 64:

Het

Gly

Trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

val

His

Ser

Gin

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ala

Gly

Cly

Gly

val

val

Gin

1

S

10

Pro

Gly

Arg

Sex

Leu

Arg

Leu

Sex

Cys

íle

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

15

20

25

Ser

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Leu

íle

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

ÄSp

Tyr

Asn

Ser

50

55

60

Ala

íle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Arg

Thr

65

70

75

Leu

Tyr

Met

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

103

val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 115

2. Informácia o sekvencií č. 65:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 108 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 65:

2. Informácia o sekvencií č. 61:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 120 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 61:

Met

Gly

trp

Ser

Cys

íle

íle

Leu

Phe

Leu

val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Ί5

-10

-S

Val

His

Ser

Mp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

S

10

Ser

Val

Gly

A*p

Arg

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

íle

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Lea

Ala

Tip

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pre

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Aap

Phe

Thr

Phe

Thr

íle

Str

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

ASp

íle

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

«5

»0

Phe

Prô

xsn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2. Informácia o sekvencii č. 66:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 40 párov zásad

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovosť: jedno vlákno

d) Topológia: lineárna xi) Opis sekvencie: Identifikačné číslo sekvencie: 66: AGCGAGCGCT CGAGGTCAAA CGGACTGTGG CTGCACCATC 40

Priemyselná využiteľnosť

Farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú protilátky, väzbové prostriedky alebo jednoreťazcové väzbové proteíny podľa predkladaného vynálezu alebo antiidiotypické protilátky proti monoklonálnym protilátkam je možné použiť na výrobu liečiv.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Monoklonálna protilátka alebo fragment, ktorý sa špecificky viaže na ľudský interleukín-5, ktorá má ťažký reťazec variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky definovaný sekvenciou id. č. 1 a ľahký reťazec variabilnej oblasti definovaný sekvenciou id. č. 2 a ktorá je produkovaná hybridómom s identifikačnými charakteristikami bunkovej línie uloženej pod označením ATCC HB 10959.
2. 2. Hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku proti ľudskému interleukínu-5, ktorý má ťažký reťazec variabilnej oblasti monoklonálnej protilátky definovaný sekvenciou id. č. 1 a ľahký reťazec variabilnej oblasti definovaný sekvenciou id. č. 2 uložený v ATCC HB 10959.
3. 3. Polypeptid charakterizovaný aminokyselinovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 1 alebo nukleotidovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 2.
4. 4. Izolovaná DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 1 alebo nukleotidovou sekvenciou definovanou sekvenciou id. č. 2.
5. 5. Izolovaná DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvenciou kódujúcou aminokyselinovú sekvenciu definované sekvenciou id. č. 1 alebo sekvenciou id. č. 2.
6. 6. Rekombinantný vektor zahŕňajúci DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 1 a sekvenciou id. č. 2.
7. 7. Hostiteľské bunky zahŕňajúce rekombinantný vektor obsahujúci DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 1 a sekvenciou id. č. 2.
8. 8. Spôsob prípravy polypeptidu podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek obsahujúcich rekombinantný vektor, ktorý zahŕňa DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 1 alebo id. č. 2 v podmienkach, pri ktorých dochádza k expresii DNA.
9. 9. Humanizovaná monoklonálna protilátka alebo fragment, ktorý sa špecificky viaže na ľudský interleukín-5 a zahŕňa CDRs z ťažkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 1 a ľahkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 2.
10. 10. Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa nároku 9, zahŕňajúca ťažký a/alebo ľahký reťazec variabilnej oblasti so súpravou maturovanej aminokyselinovej sekvencie definovanej začiatkom v sekvencii id. č. 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 alebo 65.
11. 11. Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa nároku 9, zahŕňajúca ťažký reťazec variabilnej oblasti s maturovanou aminokyselinovou sekvenciou definovanou v sekvencii id. č. 36 a ľahký reťazec variabilnej oblasti so súpravou aminokyselinovej sekvencie definovanej začiatkom v sekvencii id. č. 37.
12. 12. Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa nároku 9, zahŕňajúca ťažký reťazec variabilnej oblasti s maturovanou aminokyselinovou sekvenciou definovanou v sekvencii id. č. 40 a ľahký reťazec variabilnej oblasti so súpravou aminokyselinovej sekvencie definovanej začiatkom v sekvencii id. č. 41.
13. 13. Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa nároku 9, zahŕňajúca ťažký reťazec variabilnej oblasti s maturovanou aminokyselinovou sekvenciou definovanou v sekvencii id. č. 46 a ľahký reťazec variabilnej oblasti so súpravou aminokyselinovej sekvencie definovanej začiatkom v sekvencii id. č. 47.
14. 14. Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa nároku 9, zahŕňajúca ťažký reťazec variabilnej oblasti s maturovanou aminokyselinovou sekvenciou definovanou v sekvencii id. č. 56 a ľahký reťazec variabilnej oblasti so súpravou aminokyselinovej sekvencie definovanej začiatkom v sekvencii id. č. 57.
15. 15. Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa nároku 9, zahŕňajúca ťažký reťazec variabilnej oblasti s maturovanou aminokyselinovou sekvenciou definovanou v sekvencii id. č. 64 a ľahký reťazec variabilnej oblasti so súpravou aminokyselinovej sekvencie definovanej začiatkom v sekvencii id. č. 65.
16. 16. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa humanizovanú monoklonálnu protilátku alebo fragment podľa nároku 1, ktorá sa špecificky viaže na ľudský interleukín-5 a ktorá obsahuje CDRs z ťažkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 1 a ľahkého reťazca variabilnej oblasti definovaného sekvenciou id. č. 2.
17. 17. Polypeptid zahŕňajúci variabilnú oblasť humanizovanej monoklonálnej protilátky, ktorý má maturovanú aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 alebo 65.
18. 18. Izolovaná DNA zahŕňajúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 36, 37,40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 alebo 65.
19. 19. Rekombinantný vektor zahŕňajúci DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 alebo 65.
20. 20. Hostiteľská bunka zahŕňajúca rekombinantný vektor obsahujúci DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 alebo 65.
21. 21. Spôsob prípravy polypeptidu podľa nároku 3 alebo 8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek obsahujúcich rekombinantný vektor, ktorý zahŕňa DNA kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu definovanú sekvenciou id. č. 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 alebo 65 v podmienkach, pri ktorých dochádza k expresii DNA.