JPH07505767A - ヒトインターロイキン−５に対するヒト化モノクローナル抗体の設計，クローン化および発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイ±＞−５ｉ：＊セ１配監九化天ツク」じゴシ以炙困の採針、ク ローン化および発現 本発明は、ヒトインターロイキン−５に対するモノクローナル抗体のＨ鎖および ＬＪｌｉｌ可変領域ならびにそれらの相補性決定領域をコードする核酸、ならび にそのモノクローナル抗体を基礎とするヒト化抗体および結合蛋白質に関するも のである。

発明の背景 インターロイキン−５（ＩＬ−５）は活性Ｔ細胞により分泌され、Ｂ細胞および 好酸球に対して生物学的に活性である。ＩＬ−５は一腺依存性抗原各二対するイ ンビトロ抗体反応においてＴリンパ球を！換するので、以前はＴ細胞置換因子と 呼ばれた［ＴＲＦ；ダットン（Ｄｕｔｔｏｎ）ら、　Ｐｒｏｇ、Ｉ＋ｕｕｎｏ１ ．１：３５５（１９７１）；　シンプル（Ｓｃｈｉｍｐｌ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ 　２３７：１５（１９７２）］−それはまた、Ｂリン／Ｚ球力・らＩｇＭおよび ＩｇＧプラーク形成細胞への分化、ならびにＢ細胞リンホーマの増殖をインビト ロで促進するので、Ｂ細胞増殖因子Ｉｌとも呼ばれた［ＢＣＧＦ　Ｉ　Ｉ　；タ カツ（Ｔａｋａｔｓｕ）ら、　Ｊ、Ｉ＋＊＊ｕｎｏ１．１２４：２４１４（１９ ８０）］。

ネズミ（ｍｕ　ｒ　ｉ　ｎｅ）　Ｉ　Ｌ−５は１３３アミノ酸残基からなり、こ れ番ごは２０１ｉｌｌ！基のシグナル配列および３個の潜在Ｎ−グリコジル化部 位が含まれる。Ｂ細胞増殖アッセイにおいて、脱グリコジル化はネズミ［Ｌ−５ の生物学的活性に影響を及ぼさない［トラパーニール（Ｔｒａｖｅｒｎｉｅｒ） ら、　ＤＮＡ　８：４９１（１９８９月。ヒトＩＬ−５は１３４アミノ酸残基か らなり、これには１９残基のシグナル配ダ１１および２個の潜在Ｎ−グリコリル 化部位が含まれる。両蛋白質の構造６二つ（λで番まヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）　 ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ニア３８８（ １９８７）］およびキナシ（［１ｎ■ ｓｈｉ）ら［Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア０（１９８６）］が述べている。ヌクレ オチドおよびアミノ酸配列水準でのネズミＩＬ−５とヒトＩＬ−５の相同性の程 度は、それぞれ７７および７０％である。

ネズミおよびヒトＩＬ−５は両方とも、ジスルフィド結合１こより結合したホモ ダイマーとして存在する。従ってグリコリル化された組換えヒトＩＬ−５はＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル屯気泳動において、非還元性条件下では見掛けの分子 量４０．０００ダルトン、還元性条件下では２０−２２．０００ダルトンで泳動 する　［ソシモト　（Ｔｓｕｉ　ｉｍｏｔｏ）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ１０６ ：２３（１９８９）コ。

不ズＥＩＬ−５のクローン化および発現については、たとえば牛ナシ（Ｋｉｏａ ｓｈｉ）ら［Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア０（１９８６）］およびタカツ（Ｔａｋ ａｔｓｕ）ら［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：３８２（１９８５）］が述べ ている。ヒトＩＬ−５相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）は、ネズミ１１．−５　ｃＤ ＮＡをプローブとして用いて、アブ？　（Ａｚｕｍａ）ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１４：９１４９（１９８６〕］により単離された。

ＩＬ−５は奸＠球の維持および分化因子として作用することが示されている。

ヒトにおいてＩＬ−５の活性は特異的であり、主として好酸球に作用すると思わ れる。ヒトＩＬ−５は好酸球前駆細胞が成熟細胞になるのを誘導する。さらに培 地中にヒ）ＩＬ−５が存在する場合には、循環血液から中継された好酸球の生存 を延長させることができる。またヒＩＬ−５は、培養好酸球が脱顆粒反応し、主 要塩基性蛋白質（ＭＢＰ）および好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）などの毒性蛋白質 を放出するのを促進する［キク（Ｋｉｔａ）ら、　Ｊ、Ｉｎｍｕｎｏｌ、１４９ ：６２９（１９９２）］。

奸酸味は寄生虫を感染後に死滅させ、また炎症性およびアレルギー性疾患におい てＭＷな役割を演じることが示唆されている［たとえばサンダーソン（Ｓａｏｄ ｅｒｓｏｎ）　、　ＢｌＣＫ社７９：３１０１（１９９２）を参照されたい］。

寄生虫感染後に、また特定の慢性炎症組織、たとえば喘息性肺胞において、循環 白血球中の好酸球水準が上昇することが観察されている。好酸味の浸潤および好 酸球からの毒性顆粒の放出は、組織を破壊する作用を示し、また喘息の症状を悪 化させる場合がある。

たとえばグライヒ（Ｇｌｅｉｃｈ）ら［Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３９　： １７７　（１９８６）］およびフライガス（Ｆｒｉｇａｓ）ら［Ｊ、　Ａｌｌｅ ｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７７：５２７（１９８６月は、高密度 好酸球および好酸球主嬰塩基性蛋白質（ＭＢＰ）が気管支喘息および関連の組織 損傷に伴って生じることを示した。

最近、コツマンら（国際特許出願公開ＷＯ１０４９７９号明細書）は、ＩＬ−５ に対する抗体が特定のアレルギー性疾患、たとえば喘息に伴う好酸球増多症を予 防または軽減しうろことを示した。ヒトＩＬ−５に特異的に結合してその生物学 的活性を中和するモノクローナル抗体をこの目的に用いることができる。

ＩＬ−５に対するモノクローナル抗体は実験動物において寄生虫誘発性好酸球増 多症を回復させる顕著な効果をもっことが報告されており［シュマッヘル（Ｓｃ ｈｕｔｎａｃｈｅｒ）ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１：１５７６（１９ ８８）　；−７フマン（Ｃｏｆｆｍａｎンら、　５ｃｉｅｎモ■ ２４５：３０８（１９８９）］　、これは中和抗体がＩＬ〜５に拮抗することに より好酸球増多症関連の症状を軽減するのに臨床的に有用であろうということを 示唆する。事実、実験的に誘発された好酸球増多症を保有するげっ歯頚またはサ ルをＴＲＦＫ、すなわちラット抗マウス［１，−５モノクローナル抗体で治療す ると、循環および気管支洗浄の双方において好酸球数が正常水準に戻ることが見 出されたと報告されている。従って中和性モノクローナル抗体は有効なアンタゴ ニストとなる可能性がある。

しかし大部分のモノクローナル抗体はげっ菌類由来のものであるので、ヒトにお いて、特に長期間にわたって療法に用いた場合、それらは免疫原となる可能性か 高くなる。この可能性を少なくするために、ヒトＩＬ−５に対する組換えまたは ″ヒト化″抗体がめられている。このような抗体は好酸球増多症に付随する状態 の治療、またはＩＬ−５の生物学的活性に起因する他のいずれかの状態の治療に 用いることができるであろう。

げっ菌類抗体の免疫原性を低下させるための初期の努力は、マウス可変領域をヒ ト定常領域と融合させたキメラ抗体を調製するものであった［リウ（Ｌｉｕ）ら 。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：３４３９（ １９８７）］　、しかしヒト可可変域とマウス定常領域のハイブリッドを注射さ れたマウスは、ヒト可変領域に対して向けられた強い抗−抗体反応を生じること が示された。これは、ヒトの系においてこのようなキメラ抗体に全げっ菌類Ｆｖ 頭載を保有させると、やはりヒト抗マウス抗体を産生ずる可能性があることを示 唆する。

一般に可変頭載のＣＤＲループが抗体分子の結合部位を含むと考えられており、 げっ菌類配列をさらに少なくするためにヒト枠組み構造上へのげっ菌類ＣＤＲル ープのグラフト（すなわちヒト化）が試みられた［ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら 、　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２（１９８６）　：　ヘルヘーエン（Ｖｅｒｈ ｏｅｙｅｎ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４（１９８８）］。

カバト（Ｋａｂａｔ）らＩＪ、　Ｉｍｎｕｎｏｌ、　１４７：１７０９（１９９ １月による研究は、抗体可変領域の枠組み構造残基がＣＤＲループの支持に関与 していることを示した。抗原結合親和性を保守するためにはヒト化抗体の枠組み 構造支持残基を変化させる必要があることも見出された。多数のヒト化抗体構造 体においてＣＤＲグラフトの採用、および枠組み構造残基の保守が、たとえば下 記により報告されている　クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８６：１００２９（１９８９）］　、ゴボルマンＧ ｏｒｍａｎ）ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８８： ４１８１（１９９１月、およびホシソン（Ｈｃｘｉｇｓｏロンら［Ｂｉｏ／Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：４２１（１９９１）コ。正確な配列情報はわずかなヒト 化構造体について報告されているにすぎない。

ヒト化のためのヒト抗体配列を選ぶ際にはヒト抗体と動物抗体との間の高度の配 列同一性か重要であることは知られているか、従来の大部分の研究が動物のしお よびＨ可変配列の代わりに異なるヒト配列を用いていた。既知抗体の配列、また はより一般的には既知のＸ＆Ｉ楕遣をもつ抗体の配列、すなわち抗体ＮＥＷおよ びＫＯＬが用いられていた。たとえばジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（前掲）、ベ ルヘーエ：／　（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（前掲）、およびボルマン（Ｇｏｒｍ ａｎ）ら（前掲）を参照されたい。

抗体を工学的に調製する方法については、たとえばボスら（米国特許第４．８１ ６．３９７号明細書）、カビローら（米国特許第４．８１６．５６７号明細書） 、ローら（欧州特許出願公開第４３８　３１０号明細書）およびウィンター（欧 州特許出願公開第２３９　４００号明細書）が述へている。

Ｘ＆１１横遣が決定されている比較的わずかな抗体に依存するため、異なる抗体 からの異なるヒトＬ鎖およびＨ＆Ｉ配列がしばしば用いられる。ヒｈＦ、ｂ結晶 構造はわずか２種類が知られているにすぎないが、ヒトＬ鎖結晶構造は数種類が 決定されているからである。このような方法は、鎖の適正な結合を保証するため にヒト）１１！およびＬ鎖の枠組み構造残基を変化させる必要があり、従ってヒ ト化の利用性を制限する。

従って、比較的少数の既知の結晶学的構造に基づくものではないヒト化抗体を調 製するための改良法がめられている。

発明の概要 本発明はヒト化抗体を設計する新規方法、ヒトＩＬ−５の特異的抗体アンタゴニ スト、およびそれを含有する薬剤組成物を提供することにより、上記の要求を満 たすものである。

より詳細には、本発明は動物抗体のヒト化のためにヒト枠組み構造として用いら れるヒト抗体配列を選択するための下記を含む方法を提供する（ａ）ヒト化すべ き動物モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変頭載配列を、配列情報がそれに 関して得られるヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の適切に並んだ配列と比較し 、これにより比較した配列それぞれに関するパーセント一致率（ｐｅｒｃｅｎｔ 　１ｄｅｎｔｉｆｙ）を判定し。

（ｂ）これらのヒト抗体配列それぞれのアンビギュイティー数を判定し：（ｃ） 上記の動物抗体配列のピン領域スペーシング（Ｐｉｎ−ｒｅｇｉｏｎｓｐａｃｉ ｎｇ）を、（ｉ）上記のヒト抗体配列それぞれのものと、および（ｉｉ）既知の 三次元構造を有する他の抗体のものと比較し：そして（ｄ）（ｉ）配列アンビギ ュイティー数が低く、かつ（１１）上記の動物抗体配列との比較に基づいて、パ ーセント一致率が高く、かつビン領域スペーシングが類似する最良の組み合わせ を有するヒト抗体配列を選択する。

本発明はさらに、ヒト化のために選択すべき動物モノクローナル抗体の可変領域 残基を判定するための下記を含む方法を提供する（ａ）動物モノクローナル抗体 の可能性のある最小および最大残基を判定し、その際 （ｉ）上記の最小残基は、ＣＤＲ槽造ループ、ならびにこれらのＣＤＲ構造ルー プを支持および／または配向させるのに必要な残基を合わせたものからなり、 （１１）上記の最大残基は、カバトＣＤＲ，ならびにＣＤＲ構造ループ、ならび にこれらのＣＤＲ構造ループを支持および／または配向させるのに必要な残基、 ならびにＣＤＲ構造ループから約１０人以内にあり、かつ約５人２以上の水性溶 剤到達可能表面を保有する残基を合わせたものからなり。

（ｂ）下記のコンピューターモデリングを実施しくｉ）ヒト化すべき動物モノク ローナル抗体の配列、（１１）ヒト抗体枠組み構造配列 ならびに （ｉｉｉ）工程（ａ）の最小および最大残基が挿入された上記のヒト抗体枠組み 構造配列からなるすへての可能な組換え抗体。

このコンピューターモデリングが、蛋白質モデリングに適したソフトウェア、お よび選ばれたヒト抗体枠組み構造配列のものに最も良く一致する配列を有する構 造解明された抗体からの構造情報を用いて実施され：（ｃ）工程（ｂ）のコンピ ューターモデリングにおいて得られた結果を比較し。

そして （ｄ）上記の動物抗体のものに最も近似するコンピューターモデリングによる構 造を有する組換え抗体を与える最小または最大残基を選ぶ。

好ましくはヒト抗体枠組み構造配列は前記に従って選ばれる。

本発明はさらに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴ ＣＣＨＢ１０９５９で寄託された細胞系統の同定特性を有するハイブリトーマに より産生されるモノクローナル抗体、およびこのハイブリドーマ自体を提供する 。

本発明はさらに、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　・１および配列番号（ＳＥ Ｑ　Ｉ　Ｎｏ）：２により定められるアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗 体のＨ鎖またはＬ鎖可変領域を含むポリペプチド、それらの可変領域からの相補 性決定領域（ＣＤＲ）　、ならびにそれらの可変領域およびＣＤＲをコードする 中継されたＤＮＡを提供する。これらのＤＮＡを用いて、１または２以上のＣＤ Ｒを含み、かつ抗原結合活性を保持する、結合組成物、−重鎖結合蛋白質、ポリ ペプチド、およびそれらのＣＤＲを含む組換え抗体を形成することができ、これ らはすべて本発明の一部である。

本発明はさらに、これらのモノクローナル抗体、または組換え抗体、結合組成物 、−重鎖結合蛋白質、およびポリペプチド、ならびに生理学的に受容しうるキャ リヤーを含む、薬剤組成物を提供する。

図面の簡単な説明 本発明は以下の記載および実施例、ならびに添付の図面を参照することによって より容易に理解されるであろう 図１はプラスミドｐｓＲ８ＭＰＡ５Ｈの模式図である。

図２はプラスミド’ｐＤＳＲＧＭＰＡ５Ｈの模式図である。

図３はプラスミドｐＤＳＲＧＭＰＡ５Ｌの模式図である。

図４はプラスミドｐＳＲ３ＭＰＡ５Ｌの模式図である。

発明の説明 本明細書に引用する参考文献はすべてそれらの全体を参考として採用する。

本明細書において用いる用語″ＤＮＡ″は、標準的な５’　−３’　ホスホジエ ステル結合により結合したデオキシリボヌクレオチドからなる分子であると定め られ、比較的小型のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよび比較的大型のデオキ シリボ核酸の双方を含む。

抗体はジスルフィド橋により互いに結合したポリペプチド鎖のアセンブリーから なる。Ｌ鎖およびＨ鎖と呼ばれる２種類の主ポリペプチド鎖が、抗体のすべての 主構造群（インタイブ）を構成する。Ｈ鎖およびＬ鎖はさらに、可変領域および 定常領域と呼ばれるサブ領域に分けられる。Ｈ鎖は１個の可変領域および３また は４１！ｌの異なる定常領域からなり、Ｌ鎖は１個の可変領域（Ｈ鎖のものと異 なる）および１個の定常領域（Ｈ鎖のものと異なる）からなる。Ｈ鎖およびＬ鎖 の可変領域は抗体の結合特異性に関与する。

本明細書において用いる用語’　ＣＤＲ構造ループ′は、抗体の可変部において 分子の結合部上のβ鎖を架橋する３個のＬ鎖領域および３個のＨ鎖領域を意味す る。これらのループは特徴的な規定構造をもつ［チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら 、　Ｊ、ｌ［ｏＬ。

Ｒｉａｌ、　１９６：９０１（１９８７）　；チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら、 　Ｊ、ｌ［ｏｌ、Ｂｉｏｌ、２２７：７９９（１９９２月。

用語″カバトＣＤＲ″は、カバト（［ａｂａｔ）ら、　［５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　 ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ 、　’Ｍ４版、　１９８７．米国保健福祉省、国立衛生研究所］により定められ る、Ｈｌｌ！およびＬ路上の超可変抗体配列を意味する。

本明細書において用いる用語″Ｈｆｆｌ可変領域″は、Ｈ鎖のアミノ末端（Ｎ− 末端）アミノ酸残基から始まる長さ約１１０−１２５アミノ酸残基のポリペプチ ドであって、そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体のＨａのものに相 当するポリペプチドを意味する。同様に、用語″Ｌｍ可変萌域″は、［１のＮ− 末端アミノ酸残基から始まる長さ約９５−１３０アミノ酸残基のポリペプチドで あって、そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体のＬ鎖のものに相当す るポリペプチドを意味する。

用語Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ　（ａｂ）２、およびＦｖは、それらの標準的な免疫学的 意味で用いられる［クライン（Ｋｌｅｉｎ）　、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（シシ ン・ワイリー、ニューヨーク、　１９８２）　；パルハム（Ｐａｔｈａｍ）　、 第１４章、フィル（Ｗｅｉｒ）　Ｗ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｉ ４版（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリソシャーズ。

オ７クスフ才一ト、１９８６）　］。

本明細書において用いる用語″モノクローナル抗体″は、ヒトＩＬ−５に特異的 に結合しうる均質な免疫グロブリン集団を意味する。ヒトＩＬ−５は下記よりな る１または２以上の抗原決定基を有すると解される　（１）ヒトＩＬ−５内のペ プチド−重鎖からなるペプチド抗原決定基、（２）そのそれぞれのアミノ酸配列 がヒトＩＬ−５ポリペプチド配列に沿ってばらばらに位置する２以上の空間的に 連続したペプチド鎖からなるコンホメーショナル抗原決定基、および（３）翻訳 後にヒト■Ｌ−５に共有結合した分子構造の全体または一部からなる翻訳後抗原 決定基、たとえば炭水化物基など。本発明の抗体はこれらの抗原決定基のうち１ または２以上に対して特異的である。

本明細書において用いる用語″結合組成物″は、２本のポリペプチド鎖、すなわ ち（１）作動的に結合した（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｄ）場合に、ヒトＩＬ−５に対して高い結合親和性を有するコンホメーションを とるもの、および（２）ヒト［Ｌ−５に対して特異的なモノクローナル抗体を産 生ずるハイブリトーマに由来するものからなる組成物を意味する。用語″作動的 に結合した′は、これら２本のポリペプチド鎖が、天然抗体フラグメント、たと えばＦａｂもしくはＦｖにおける結合を含めた多様な手段により、またはカルボ キシル末端に遺伝子工学的に形成されたシスティン含有ペプチドリンカ−その他 のリンカ−により、結合するための配置を互いにとりうろことを示すものとする 。

モノクローナル抗体は、標準法、たとえばコーラ−（にｏｈｌｅｒ）ら［Ｎａｔ ｕｒｅ　２５６４９５（１９７５）　；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　 ６：５１１（１９７６）］が述べた方法により調製することができる。重賞的に は動物を標準法により免疫感作して、抗体分泌性の体細胞を産生させる。次いで これらの細胞を骨髄腫細胞へ融合させるために免疫感作動物から採取する。

抗体を産生ずる能力をもつ体細胞、特にＢ細胞が骨髄腫細胞系統との融合に適し ている。これらの体細胞は、感作動物のリンパ節、膵臓および末梢血に由来する ものであってもよい。本発明の実施形態においては、ラット膵臓細胞を用いる。

それは、一部はこれらの細胞がマウス骨髄腫細胞系統と比較的高い割合の安定な 融合体を生じるからである。しかし、その代わりにヒト、マウス、ウサギ、ヒツ ジもしくはヤギの細胞、または他の動物種からの細胞を用いることもできる。

リンパ球種からハイブリドーマ産生融合法に用いるための特別な骨髄腫細胞系統 が開発された［コーラ−およびミルシュタイン（にｏｈｌｅｒ、　１［１１ｓｔ ｅｉｎ）　、Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１（１９７６）　；シュルマン（Ｓｈｕｌａａｎ）ら 、　Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９（１９７８）　；フォーク（Ｙｏｌｋ）ら、 　ＪＪｉｒｏｌ、４２：２２０（１９８２月。これらの細胞系統は、少なくとも ３つの理由で開発された。第１は、融合ハイブリドーマを、融合しておらず同様 に無限に自己増殖する骨髄腫細胞から選別するのを容易にするためである。通常 はこれは、ハイブリトーマの増殖を支持する特定の選択培地においてそれらを増 殖不可能にする酵素欠損を伴う骨髄腫細胞を用いて達成される。第２の理由は、 リンパ球腫細胞がそれら自身の抗体を産生ずる固有の能力に由来する。モノクロ ーナル法を採用する目的は、名望する申−抗体をハイブリドーマの体細胞成分の 遺伝的制御下で産生ずる、無限の寿命をもつ融合ハイブリット細胞系統を得るこ とである。ハイブリトーマによる腫瘍細胞抗体の産生を排除するために、内在性 の免疫グロブリンＩＪＩＩおよびＨ鎖を産生じ得ない骨髄腫細胞系統を用いる。

これらの細胞系統を遍ふ第３の理由は、融合に対するそれらの適性および効率で ある。

多数の骨髄腫細胞系統を融合細胞ハイブリッドの調製に用いることができ、これ にはたとえばＰ３Ｘ６：３−Ａｇ３、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｐ３／Ｎ５ １−Ａｇ４−１　（ＮＳ−１）　、Ｓｐ２１０−ＡｇＬ４、および５１９４１５ ．ＸＸＯ，Ｂｕ、１が含まれる。Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８およびＮＳ−１細胞系統に ついてはコーラ−およびミルシュタイン（ｌ：ｏｈｌｃｒ、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ）　［Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．６：５１１（１９７６）］が述へている 。シュルマン（ＳｈｕＬｍａｏ）ら［Ｎａｔｕｒｅ　２Ｔ６：２６９（１９７８ ）コはＳ　ｐ　２１０−Ａｇ　１４骨髄腫細胞系統を開発した。５１９４１５． ＸＸＯ，Ｂｕ。

１系統はトラウブリソシ（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ）　［Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１ ４８：３１３（１９７９月により報告されている。

抗体を産生ずる膵臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのＩ・イブリットを 形成する方法は、通常は体細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ１０１の割合で（ただし この割合は約２０１−約１１に及びうる）、細胞膜の融合を促進する１または２ 以上の物質（化学物質、ウィルスまたは電気）の存在下に混合することによる。

融合法についてはコーラ−およびミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ、　ＭｉＬｓｔ ｅｉｎ）　（前掲）、ゲッター（Ｇｅｆｔｅｒ）ら（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ 　Ｇｅｎｅｔ、　３：２３１（１９７７月、ならびに〕ｔ−クｆｆｏｌｋ）ら、 　ＪＪｉｒｏＬ、４２：２２０（１９８２）］が述べている。これらの研究者た ちが用いた融合促進剤はセンダイウィルスおよびポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）であった。

融合法によれば生存ノ・イブリットが極めて低い頻度で得られるので（たとえば Ｎｖ！、１Ｉｉｌを体細胞源として用いる場合、はぼｌＸ１０３個のｐｐ臓細胞 につき１個のハイブリットが得られるにすぎない）、融合細胞ハイブリットを残 りの非融合細胞、特に非融合骨髄腫細胞から選択する手段を得ることが必須であ る。目的とする抗体産生ハイブリドーマを得られた他の融合細胞ハイブリッドの 中から検出する手段も必要である。

一般に融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドーマの増殖を支持するが、普 通は無限に分割し続ける非融合骨髄腫細胞の増殖を阻止する培地中で細胞を培養 することにより達成される。融合に用いた体細胞はインヒドロ培養では長期生存 性を維持せず、従って問題を生しない。本発明の実施例においてはヒポキサンチ ンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠如する（ＨＰＲＴ陰性）骨髄腫細胞を 用いた。これらの細胞に対する選択は、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミ ジン（ＨＡＴ）￥地、すなわち融合細胞ハイブリッドが牌１１１１１１胞のＨＰ ＲＴ陽性遺伝子型のため生き残る培地において行われる。遺伝子型において感応 性であるハイブリットの増殖を支持する培地中で選別しうる異なる遺伝子欠損（ 薬物感受性など）をもつ骨髄腫細胞の使用も可能である。

融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するためには数遍間が必要である。この期 間の初期に、目的とする抗体を産生ずるハイブリットを同定する必要があり、次 いでそれらをクローン化し、増殖させることかできる。一般に得られたハイブリ ットのほぼ１０％か目的抗体を産生ずるか、約１−約３０％であることが稀では ない。抗体産生ハイブリットの検出は幾つかの標準アッセイ法のいずれによって も達成することかでき、これには文献記載の酵素結合イムノア７セイ法およびラ ノオイムノア・／セイ法が含まれる（たとえばケネット（Ｋｅｎｎｅｔ）ら（′ ｔｆｍ者）。

ｉ［ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓ　：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌ盾■奄モ≠戟@＾ｎ ａｌ ｙｓｅｓ、　ｐ、３７６−３８４’、プレナム・プレス、ニューヨーク（１９８ ０）を参照されたい］。

目的とする融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞系統中へクロ ーン化されると、各細胞系統を２種類の標準法のいずれかによって増殖させるこ とができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性動物に注射することがで きる。次いで注射された動物は腫瘍を発現し、これが融合細胞ハイブリッドによ り産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する。動物の体液、たとえば血清 または腹水を採取して、モノクローナル抗体を高１度で得ることかできる。ある いは個々の細胞系統をインビトロで実験室用培養器内において増殖させることが できる。甲−の特異的モノクローナル抗体を高濃麿で含有するこの培地をデカン テーション、濾過または遠心分離によって採取し、次いで精製することができる 。

モノクローナル抗体は周知のファージライブラリー系を用いて調製することもで きる。

抗体のフラグメントの使用および形成は周知である・たとえばＦａｂフラグメン ト　［ティラセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）　、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅ ｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ@（エ ルゼビＩし、アムステルダム、　１９８５）　］、Ｆｖフラグメント［ホ・ンホ マン（Ｈｏｃｈａ＋ａｎ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２：１１３０（ １９７３）　ニジ２０ン（Ｓｈａｒｏｎ）　ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １５：P５ ９１（１９７６）　；エールリッヒら、米国特許第４．３５５．０２３号明細書 ］、および抗体半分子（オーディトール−！・−グリーブズ、米国特許第４．４ ７０．９２５号明細書）。さらにこれらの本発明化合物および組成物を用いて既 知の技術により、たとえばノ・イブリドーマをさらに融合させることにより　（ すなわちいわゆるクアトローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）を形成するために：リーデ ィング、米国特許ｍ４．４７４．＝１９３号明細書）、または半分子の化学的再 結合により［ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：８ １（１９８５）コ、二重特異性抗体を形成することができる。

ハイブリトーマおよびモノクローナル抗体は、いかなる供給源からのヒトＩＬ− ５に対しても、たとえば市販の、もしくは天然供給源からのもの、または化学的 合成法もしくは組換えＤＮＡ技術の適用によるものに対しても調製すること力・ できる。本明細書において組換えＩＬ−５’は、原核または真核細胞発現系１こ おいてＴＬ−５をコートする組換えＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）により産生されるＩＬ −５を意味するものと定められる。さらに真核細胞系においては、ゲノムＤＮＡ をＩＬ−５の産生に用いることかできる。産生されるＩ　Ｌ−５はグリコジル化 されていてもよく、グリコジル化されていなくてもよい。

不ズミおよびヒ日１．−５をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は知られてい るので［たとえばアズマ（＾ｚｕｍａ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、　１４：９１４９（１９８６）を参照されたいコ、それらのＤＮＡはマツ コーラ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら［Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ。

１．０３：３１８５（１９８１）コのホスホルアミダイト固体支持体法、ヨー（ Ｙｏｏ）ら［Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｆｆｌ、　７６ｔ１７０７８（１９８９）］の方法、または他の周知の方 法により化学的に合成することができる。これは、たとえば／・ルら（国際特許 出願公開ＷＯ８５１０２２００号明）ＩｌｌＩ１）かｌ　Ｌ−２をコードするＤ ＮＡを化学的に合成したように、比較的小型のオリゴヌクレオチドを合成し、そ れらを互いにリゲートすることにより実施しうる。

あるいはＩＬ−５を産生しうる細胞系統を刺激して、ＩＬ−５ｍＲＮＡを産生さ せ、これを標準法によりＩＬ−５ｃＤＮＡを産生させる鋳型として用いることが できる。次いでｃＤＮＡライブラリーを調製し、既知の配列情報に基づくオリゴ ヌクレオチドプローブ混合物を用いてこの中にＩＬ−５ｃＤＮＡを同定すること ができる。次いてこのｃＤＮＡを、利用しうる多数の細菌、酵母またはｌｌｌ１ ７Ｌ動物の発現系のいずれかにおいてクローン化し、発現させることができる。

この方法は組換えラット、マウスまたはヒトＩＬ−５の調製に利用されている［ たとえばトラベニール（Ｔｒａｖｅｎｉｅｒ）ら、ＤＮＡ　８：４９１（１９８ ９）　；ミナミタケ（Ｍｉｎａｍｉ　ｔａｋｅ）　ら、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １０７：２９２（１９９０）　；ウヘルラ（Ｕｂｅｒｌａ）　ら、　Ｃｙｔｏｋ ｉｎｅ　３ニA２ （１９９１）を参照されたい］。ヒトＩＬ−５は、同一出願人による米国特許出 １Ｉｉ（特許出ｉｌｉ第０７／６１５，０６１号明細書、１９９０年１１月１６ 日出願）中で、ヒトＩＬ−５をコートするｃＤＮＡをチャイニーズハムスター卵 巣（ＣＨＯ）細胞において発現させることにより調製された。ランモト（Ｔｓｕ ｊｉｍｏｔｏ）ら［Ｊ、Ｂｉ。

ｃｈｅｒｎ、　１０６：２３（１９８９）］　も、ＣＨＯ細胞における組換えヒ ト［Ｌ−５の産生について述へている。

さらに池の方法においては、既知のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチ ドプローブ混合物を用いて、標準法により調製されたゲノムＤＮＡライブラリー 中のＩＬ−５を同定することができる。こうして同定されたＤＮＡをライブラリ ーから制限エンドヌクレアーゼ開裂により切り取り、配列決定し、モして真核細 胞発現系において、またはく必要に応じて標準法によりイントロンを切除したの ち）原核細胞発現系において発現させることができる。この方法でキャンベル（ Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら［Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、λｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾ ８４：６６２９（１９８７）］は、ヒトＩＬ−５をサル腎ｆｆ１（ＣＯ３）ＩＩ Ｂ胞において産生している。

もちろんｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーは両方とも、オリゴヌクレオ チドプローブを用いる代わりに標準的な発現クローン化法を利用してスクリーニ ングすることができる。こうして調製されたＩＬ−５は、既知の免疫学的方法ま たはバイオアッセイを利用して検出される。

Ｉ　Ｌ−５ポリペプチドは、たとえばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ） 　［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ■、Ｓｏｃ、　８５：２１４９（１９６３）］の］後に従 って合成ペプチド化学により直接に調製することもでき、または１Ｌ−５は購入 することができる。

目的とするモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマが得られると、１つの 種の結合領域が他の種の抗体の非結合領域と結合した種間モノクローナル抗体を 調製する方法を用いることができる［リウ（Ｌｉｕ）ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、人ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４１３４３９（１９８７）］。たとえばけつ 歯歯上ノクローナル抗体からのＣＤＲをヒト抗体にグラフトし、これによりげっ 菌類抗体を″ヒト化′することかできる［リーヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら 、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２３２３（１９８８月。より詳細には、ヒト定常領域を 含むか、または含まないヒト抗体可変領域に上記のＣＤＲをグラフトすることか できる。この方法は、たとえばヒトインターロイキン−２レセプターのｐ５５（ Ｔａｃ）サブユニットに対するマウスモノクローナル抗体をヒト化するために用 いられている［クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：１００２９（１９８９月。

ヒｈｌＬ−５に対して特異的なモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域な らびにそれらの抗体からのＣＤＲをコードする本発明のｃＤＮＡを、このような 様式で工学的に調製することができる。抗体の可変領域内のＣＤＨの位置は、多 数の周知の標準法により決定しつる。たとえばカバト（にａｂａｔｏ）ら（前掲 ）はＣＤＲの位置を決定するための規則を発表した。これらの規則を用いて決定 されたＣＤＲを本明細書においては″カバトＣＤＲ″と呼ふ。たとえば後記のよ うに抗体鎖の三次元結合部位ループに関与するアミノ酸残基に基づいてＣＤＲ構 造ループを同定するために利用しうるコンピュータープログラムも得られる。

本明細書において用いられる方法は、多様な動物抗体のヒト化に利用しうる。

（ａ）ヒト化のためのヒト枠組み構造として用いるヒト抗体配列を選び、そして （ｂ）このヒト枠組み構造に挿入するために週ふべき動物モノクローナル抗体の 可変領域残基を決定することによる２段階法が採用される。

第１段階は、それに関する配列情報が得られるヒト枠組み構造配列のうち利用可 能な最良のものを選ぶことよりｌよる。この選択法は下記の選択基準に基づく（ １）パーセント一致率 ヒト化すべき動物モノクローナル抗体のＨ１！およびＬｍ可変領域の配列を最適 状態で配置し、奸ましくは既知のすへてのヒト抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域の配 列と比較する。これは、主として２種類のヒト抗体、ＮＥＷおよびＫＯＬの使用 のみに依存する先行技術方法と対照的である。これらの抗体に関しては構造情報 が得られ、その表示はそれらが由来するヒト患者のイニシャルである。現在では 抗体Ｈ１Ｌの構造も知られている（ブルックヘブン・コードＰ８ＦＡＢ）。

配列をこうして比較して、残基の一致率を記録し、パーセント一致率を決定する 。他の要素かすへて等しい場合、動物抗体との最高のパーセント一致率をもつヒ ト抗体を選ぶことが望ましい。

（２）配列アンビギ色歪デエニ 次いて上記の既知のヒト抗体鎖配列を、未同定残基および／またはアンビギュイ ティーの存在、すなわち配列不確定性につき評価する。これらの不確定性のうち 最も一般的なものは、配列決定処理に際してアンモニアが失われることによりア ミドアミノ酸の代わりに散性アミノ酸が誤同定されること、たとえば蛋白質中に 実際に存在する残基がグルタミン残基であった場合にグルタミン酸残基の誤同定 である。不確定性はカバト（［ａｂａｔｏ）ら（前掲）などのデータベースの検 査により確認される。他の要素がすへて等しい場合、このアンビギュイテイーが 可能な限り少ないヒト抗体鎖を選ぶことが望ましい。

（３）ビン領域スペーシング 抗体鎖可変領域はドメイン内ジスルフィド橋を含む。これらの橋を構成するシス ティン残基間の距ｌ１ｌｔ（残基の数）をピン領域スペーシングと呼ぶ［コチア （Ｃｈｏｔｈｉａ）ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９６：９０１（１９８７ ）］−他の要素がすべて等しい場合、選ばれたヒト抗体のビン領域スペーシング が動物抗体のものと類似するか、または等しいものを選ぶことが最も望ましい。

コンピューターモデリングを容易にするために、ヒト配列ピン領域スペーシング が既知の抗体三次元構造のものと類似することも望ましい。

以上の基準に基づいて、全体的に最良の望ましい特性の組み合わせをもつヒト抗 体（１種類または２種類以上）を動物抗体のヒト化のための枠組み構造として選 ぶ。選ばれたＨ鎖およびＬｆｌｌは同一または異なるヒト抗体のいずれに由来す るものであってもよい。

本発明の第２段階は、このヒト枠組み構造内ヘゲラフトさせるために選ぶへき動 物抗体の可変領域配列を決定することよりなる。この選択法は下記の選択基準２ 種類の可能な可変領域残基を動物抗体配列中において評価する。その第１はいわ ゆる″最小残基″である。これらの最小残基は、ＣＤＲ構造ループ、ならびにコ ンピューターモデリングにより示されるようにこのＣＤＲＩ造ループループおよ び／または配向させるために必要な付加的残基を合わせたものからなる。

他方の種類の可能な可変領域残基は″最大残基″と呼ばれる。それらは、最小残 基、およびカバトＣＤＲ，およびコンピューターモデリングにより示されるよう にＣＤＲ槽造ループ残基から約１０人以内にあり、か一つ水性溶剤到ａ可能表面 約５人２以上を保有する付加的残基を合わせたものからなる［り一化ｅｅ）ら、 Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、５５：３７９（１９７１）］　、後記の実施例においては 、ＣＤＲ構造ループ残基から５人以内にある残基が選ばれた。

（２）コンピューターモデリング 可能な可変領域残基を同定するために、（ａ）ヒト化すべき動物抗体の可変領域 残基、（ｂ）選ばれたヒト抗体枠組み構造配列、ならびに（ｃ）種々の最小およ び最大の動物抗体残基をグラフトさせたヒト抗体枠組み構造配列からなるすへて の可能な組換え抗体につき、コンビニーターモデリングを実施する。

コンピューターモデリングは、蛋白質モデリングに適したソフトウェア、ならび に（ａ）動物抗体のものに最も良く一致する可変領域アミノ酸配列を有し、か一 つ（ｂ）既知の三次元構造をもつ抗体からの構造情報を用いて実施される。使用 しうるソフトウェアの例は、５ＹＢＹＬバイオポリマー・モジュールソフトウェ ア（トリポス・アソシエーノ）である。それから構造情報が得られる抗体はヒト 抗体であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。後記の実施例にはＩＦ １９と表示されるネズミ抗体からの構造情報を用いた。

以上の分析において得られた情報に基づいて、その動物抗体のものに最も近似す るコンピューターモデリング構造を与える動物可変領域を含む組換え鎖をヒト化 のために選ぶ。

抗ヒト［Ｌ−５モノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０　（そのｒＡ製につい てはのちに記載する）の部分Ｈｌおよび完全り鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ のヌクレオチド配列は、配列表中にそれぞれ配列番号（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ）： １および２により定められる。これらのヌクレオチド配列から予想されるアミノ 酸配列も配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌおよび２中に定められる。

配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　・１により定められるヌクレオチド配列（Ｈ 鎖配列）中の塩基１−２６はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーから得 られた。従ってクローン化配列は塩基２７において開始する。配列番号（ＳＥＱ ＩＤＮＯ）：１からの対応するアミノ酸配列は、ｖｌＩの成熟ポリペプチドのも のであって、枠組み構造１のリーダー、すなわち最初の１４残基を含まないもの である。配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２により定められるヌクレオチド配 列（Ｌ鎖配列）中の塩基１および２はＰＣＲプライマーから得られた。従ってク ローン化配列は塩基３において開始する。対応するアミノ酸配列は、■１．のリ ーダーおよび成熟ポリペプチドのものである。

カバト（Ｋａｂａｔｏ）ら（前掲）の方法により決定されたモノクローナル抗体 ＪＥＳｌ−３９Ｄ１０のＨ鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ）１により定められるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６−３０．４５−６０お よび９３−１００からなる。後記の結合部位ループ構造のコンピューター分析に より決定されるように、モノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＨ鎮可変領 域のＣＤＲ構造ループは、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌにより定められ るアミノ酸配列のアミノ酸残基２１−２７．４７−５０および９３−１０１から なる。

上記のＨ鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ ）：１により定められるヌクレオチド配列の塩基７６−９０，１３３−１８０お よび２７７−３００　（カバト決定法）ならびに塩基６１−８１．１３９−１５ ０および２７７−３０３　（ループ分析法）からなる。

カバト（Ｋａｂａｔｏ）ら（前掲）の方法により決定されたモノクローナル抗体 ＪＥＳｔ−３９Ｄ１０（７）Ｌ鎖可変ｎ域（Ｄ　ＣＤ　Ｒハ、配列ｉｔ号（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ）２により定められるアミノ酸配列のアミノ酸残基４４−５４． ７０−７６および１０９−４１７からなる。後記の結合部位ループ構造のコンピ ューター分析により決定されるように、モノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１ ０のＬ鎖可変領域のＣＤＲ構造ループは、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２ により定められるアミノ酸配列のアミノ酸残基４６−５１．７０−７２および１ １１−１１６からなる。

上記のＬ鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮ ｏ）：２により定められるヌクレオチド配列の塩基１３０−１６２．２０Ｂ−２ ２８および３２５−３５１　（カバト決定法）ならびに塩基１３６−２２２．２ ０８−２１６および３３１−３４８　（ループ分析法）からなる。

以上から、こうして決定されたＣＤＲは９−４８塩基によりコートされることが 分かる。従って蛋白質の工学的調製に用いられるＤＮＡは、配列番号（ＳＥＱＩ ＤＮＯ）：Ｌおよび２により定められるヌクレオチド配列のそれぞれ約１２−３ ３３および約９−３８４塩基からなる。同様に重要なものは、蛋白質の工学的調 製に用いられるイソタイプの選択に用いる定常領域である。

本発明のＣＤＲをヒト抗体上へのグラフト形成によりヒト化抗体を調製するため に用いる場合、ＣＤＲ外ではあるが、ＣＤＲまたはｌ−５と相互作用すると思わ れる１個または２個以上のアミノ酸残基を含有させることが望ましいであろう（ クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、前掲）。

本発明のＣＤＲは、抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０の機能性を模倣した非ペプチド系 模擬化合物の設計の基礎にもなりうる。このような模擬化合物の調製法について はサラゴビ（Ｓａｒａｇｏｖｉ）ら［５ｃｉｅｎｃｅ　２５３ニア９２（１９９ １月が述べている。

抗体ヒト化の基礎を提供するほか、配列番号（ＳＥＱ　Ｈ）Ｎｏ）　・１および ２の情報を利用して、バード（Ｂｉｒｄ）ら［５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３ （１９８８）］が述べているＬ鎖および／またはＨ鎖可変領域からの結合ＣＤＲ からなる一重鎖ＩＬ−５結合蛋白質、またはヒユーストン（Ｈｏｓｔｏｎ）ら［ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：５８７９（ １９８８月か述べている生合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）を調製することができ る。ＩＭされたＨ鎖可変ドメインからなる単一ドメイン抗体［ワード（Ｔａｒｄ ）　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４（１９８９）］　も、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ）：ｌの情報を利用して調製することができる。

１または２以上の本発明ＣＤＲを直接に、またはリンカ−配列により互いに結合 させて、ポリペプチドにすることもできる。１または２以上のＣＤＲを他の（非 −免疫グロブリン）ポリペプチドまたは蛋白質中へ工学的に挿入し、これにより ＩＬ−５結合能をそのポリペプチドまたは蛋白質に付与することも可能である。

本明細書において′配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌもしくは２により定め られる配列またはそのサブ配列を有するモノクローナル抗体のＨｇＩ２またはＬ 鎖可変領域を含む″ポリペプチドは、以上のＣＤＲ含有形態をすへて包含すると 規定される。

抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＨ鎖およびＬ鎖可変領域またはそれらのＣＤＲをコ ードするＤＮＡは、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌおよび２中に得られる 核酸配列情報を利用して、標準法により調製することができる。たとえばそれら のＤＮＡは、たとえば？７ツーシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら［Ｊ、八ｍ、　Ｃｈ ｅｔ　Ｓｏｃ、　１０３：３１８５（１９８１月のホスホルアミダイト固体支持 体法、ヨー（Ｙｏｏ）ら［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　７６４１７０７８（１ ９８９月の方法、または他の周知の方法により化学的に合成することができる。

あるいは、遺伝子の配列および利用しうる多数の制限エンドヌクレアーゼの部位 特異性は知られているので、当業者はモノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０ を産生するハイブリドーマのゲノムＤＮＡから遺伝子を容易に同定し、かつ単離 し、そしてＤＮＡを開裂させて、目的配列を得ることができる。ＰＣＲ法［サイ キ（３ａｉｋｉ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７（１９８８）］　、た とえばドーエルティ、　−（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９：２４７１（１９９１）コにより示される方法を用いても 同し結果が得られる。適宜な新たな制限部位を導入し、特定のベクター中への取 り込みを容易にするために、所望によりＰＣＲに用いるプライマーを設計するこ とができる。

抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＨｌｍおよびＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを得 るためのさらに他の方法は、モノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０を産生ず るハイブリドーマから甲離されたｍＲＮＡを鋳型として用いてｃＤＮＡを調製し 、それからＦｒ＄法により可変領域をクローン化することを伴う［たとえばウオ ール（ｊａ　１１　）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、５：３１１ ３（１９７８）　；ツァルスート（Ｚａｌｓｕｔ）　ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：３５９１（１９８０）　；カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓモ堰B ＵＳＡ　８１：３２７３（１９８４）　ホス（Ｂｏｓｓ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３７９１（１９８４）　；Aム スター（Ａｍｓｔｅｒ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：２０ ５５（１９８０）　：ムーアら、米国特許第４．６４２．２３１ｉ号明細書を参 照されたい］。

もちろん遺伝子コートの縮重のため、多数の異なるヌクレオチド配列が、配列番 号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌおよび２ならびにその中のＣＤＲにより定められ るアミノ酸配列を有するＣＤＲ、ポリペプチドおよび抗体をコートしつる。同様 にｉ＆記のアミノ酸配列を有するヒト化抗体も多数の異なるＤＮＡによりコード しうる。

用いられる個々のコドンは、作成の簡便さ、および原核系または真核系における 最適な発現の両方につき選ぶことができる。これらの機能上の均等物も本発明の 一部である。さらに、生物学的機能を実質的に変化させないわずかなアミノ酸の 置換、付加または欠失のある、ポリペプチドおよび蛋白質の保守的に修飾された 変異体がありうることは当業者は知っているしアンフィンゼン（Ａｎｆｉｎｓｅ ｎ）　。

５ｃｉｅｎｃｅ　１８１：２２３（１９７３）　；グランサム（Ｇｒａｎｔｈａ ａ＋）　、５ｃｉｅｎｃｅ　１８５：８６２（１９７４月。

配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１および２により定められるアミノ酸配列な らびに後記のヒト化抗体がこのように保守的に修飾された変異体も、本発明によ り考慮される。たとえば化学合成によって、または修飾されたＰＣＲブイマーの 使用もしくは部位特異性突然変異形成によって、本発明のＤＮＡを修飾して所望 によりこのような変異体を形成することは、当業者が容易になＬうる範囲のもの である。

より実質的な修飾を行うことが有利な場合もある。たとえばロバーツ（Ｒｏｂｅ ｒｔｓ）ら［Ｎａｔｕｒｅ　３２８・７３１（１９８７）］は、部位特異的突然 変異誘発により結合部位の周辺の２個の帯電残基を除去することによって、親和 性および特異性の高められた抗体を調製した。

抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡをベク ターに挿入することは、それらのＤＮＡおよびベクターの末端が両方とも適合性 の制限部位を含む場合は容易に達成される。これが不可能である場合、制限エン ドヌクレアーゼ開裂により生じた一本鎖ＤＮＡオーバーハングを消化して平滑末 端を形成することによりＤＮＡおよび／またはベクターの末端を修飾するか、ま たは一本鎖末端を適宜なりＮＡポリメラーゼでフィルインすることによって同じ 結果を達成する必要があろう。あるいはヌクレオチド配列（リンカ−）を末端に リゲートすることにより、希望するいかなる部位をも形成することができる。

これらのリンカ−は、名望する制限部位を定める特異的オリゴヌクレオチド配列 を含むものであればよい。開裂したベクターおよびＤＮＡフラグメントを、必要 に応じてホモポリマーチイル形成またはＰＣＲにより修飾することもできる。

本発明の抗体、結合組成物、もしくは−重鎖結合蛋白質、またはこれらのモノク ローナル抗体に対して産生された抗イデイオタイプ抗体を用いて、Ｉ　Ｌ−５関 連疾患を治療するための薬剤組成物を調製することができる。これらの抗体のフ ラグメント、たとえばＦａｂまたはＦｖフラグメント、’１ｉｌｌｉされたＨ＆ ｌまたはＬ鎖もしくはそれらのフラグメント、およびたとえば個々のＣＤＲＩ域 からなる短いポリペプチドも、上記組成物中に使用しうる。

上記組成物のあるものは［Ｌ−５遮断または拮抗作用をもち、ＩＬ−５活性を抑 制するために用いることができる。それらの組成物は、本発明の抗体、結合組成 物または一本鎖結合蛋白質、および生理学的に受容しうるキャリヤーを含む。

他の組成物は、本発明のモノクローナル抗体を抗原として用いて調製された抗イ デイオタイプ抗体、および生理学的に受容しうるキャリヤーを含む。モノクロー ナルまたはポリクローナルのいずれであってもよく、標準法により調製されるこ れらの抗イデイオタイプ抗体は、ＩＬ−５自身の結合活性を模倣すると思われる 。従ってそれらは１Ｌ−５アゴニストまたはアンタゴニストとして有用となる可 能性がある。

有用な薬剤用キャリヤーは、本発明の組成物を患者に付与するのに適した適合性 、無毒性のいかなる物質であってもよい。無菌の水、アルコール、脂肪、ろう、 および不活性固体がキャリヤーに含まれる。薬剤学的に受容しうる佐剤（緩衝剤 。

分散剤）がこれらの薬剤組成物に含有されてもよい。一般にそれらの藁物の非経 口投与に有用な組成物は周知である。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、第１５版（マ・ツク・パブリジン グ・カンパニー、ペンシルベニア州イーストン、　１９８０）。あるいは本発明 組成物を植込み用ドラッグデリバリ−システムにより患者の体内へ導入すること ができる［アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、　２４：Ｌ９９（１９８４）］。

実施例 説明のために用いられる、下記の非限定的実施例では、固体混合物中の固形分％ 、液体中の液体％及び液体中の固形分％は、他に指示しない限り、それぞれ重量 ／重量、容量／容量及び重量／容量に基づいて記載する。細胞培養中は無菌条件 を維持した。

二股的方抹上試薯 他に記載しない限り、本質的に、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等のモレキ ュラークローニング　ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、１９８２．　コールド　ス プリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）が述べているように、標準組換えＤＮＡ方法を実施シタ。

飽和−晩培養物からのプラスミドＤＮＡの小規模単離はバーンボイム（Ｂｏｒｎ ｂｏｉ目）等の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７：１５１３（１ ９７９）］に従って実施した。この方法は、分析の目的のために、細菌培養物が らの少量のＤＮＡの分離を可能にする。他に指示しない限り、フレウェル（Ｃｌ ｅｗｅｌｌ）等が述べているように［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１０：１１３ ５　（１９７２）］、多量のプラスミドＤＮＡを製造した。

プラスミドＤＮＡの開裂によって誘導された特定制限酵素フラグメントをアガロ ース中での分取（ｐｒｅｐａｒａｔｊ　ｖｅ）電気泳動によって単離した。９ｘ ５　１／２ｃｍのサイズのゲルをトリスボレート緩衝液中で５０ｍＡにおいて１ 時間処理しくマニアティス等、上記文献４５４頁）　、ＤＮＡを可視化するため に臭化エチジウム０．５μｇ／ｍＩによって染色した。適当なゲル切片を切り取 り、ＤＮＡを電気溶離した（マニアティス等、上記文献１６４頁）。電気溶離（ ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）後に、ＤＮＡをフェノール抽出しくマニアティ ス等、上記文献１６４頁）　、−２０℃においてエタノール析出させた（マニア ティス等、上記文献４６１頁）。

制限酵素とＴ４ＤＮＡリガーゼとはニューイングランド　バイオラボス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　（マサチュセッッ州、ビバリー）から購入 した。スーパースクリプトＲＮＡ５ｅ　Ｈ−逆転写酵素はＢＲＬ／ＧｔＢＣＯ（ メリーランド州、ガイザースブルグ）から購入した。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラー ゼはストレイクジン（Ｓｔｒａｔａｇｅ口ｅ）（カリフォルニア州、ラジヲラ） から購入し、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントはファルマシアＬＫＢ バイオテクノロジー１＋　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ［Ｂ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　）　Ｃ−５−シャーシー州、ビス力夕ウエイ）から購入 し、ウシ騙ホスファターゼはベーリンゲル　マンハイム　バイオケミカルス（Ｂ 。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌｌａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｗ＋１ｃａｌｓ）　（イ ンディアナ州、インディアナポリス）から購入し、ＲＮＡ５ｉｎはプロメガ（Ｐ ｒｏｍｅｇａ）　（ウィスコンシン州、マデイソン）から購入した。全ての酵素 は製造者の指示に従って用いた。セクエナーゼ型式（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ｖｅ ｒｓｉｏｎ）２．　０配列系はユナイテッド　ステートス　バイオケミカル（Ｕ ｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）　（オハイオ州、クリー ブランド）から入手した。

デオキシヌクレオチド三リン酸とオリゴｄＴ＋ｚ−１ｇプライマーとはウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）はベーリンゲル　マンハイム　バイオケミカルスから入手 し、再蒸留フェノールはＢＲＥＬ／Ｇ　Ｉ　ＢＣＯから入手した。

プラスミドベクターのｐｓｖ、５ｐｏｒｔとｐＵｃ１９、及びコンピテント（Ｃ ｏｓｐｅｔｅｎｔ）大腸菌の菌株ＤＨ５−アルファ（マックス　エフイシエンシ −（Ｍａｘ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ））はＢＲＬ／ＧＩ　ＢＣＯから入手した。

Ｃ０８−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）はアメリカン　タイプ　カルチャー 　コレクション（メリーラント州、ベテスダ）から入手した。組織培養基、ウシ 胎児血清（ＦＢＳ）及び補助剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）はＢＲＬ／Ｇ［ＢＣＯ から入手した。

プラスミドｐＤＳＲＧ　（ＡＴＣＣ６８２３３）を用いる標準方法によって、中 国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組換えヒトＩＬ−５を表現させ、イムノアフ ィニティ　クロマトグラフィーによって精製した。

組換えヒトＩ　Ｌ−５に対するウサギ抗血清は標準方法によって製造した。バイ オチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧはベクター　ラプス（Ｖｅｃｔｏｒ　ｊａｂｓ） 　（カリフォルニア州、バーリンガム）から入手し、ストレプトアビジン−アル カリ性ホスファターゼ抱合体はＢＲＬ／ＧＩＢＣＯの製品であった。バイオチニ ル化つサギ抗ラット１ｇＧはシャクソン　ラプス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ） 　（ペンシルバニャ州、ウェストグローブ）から入手した。ニトロブルーテトラ ゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ ＢＣＩ　Ｐ）はＢＲＬ／ＧＩＢＣＯから入手した。

マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント　アッセイ） 測定の基質として用いる高感受性ＥＬｒＳＡ　ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　Ｓ ＹＳＴＥＭ　（登録商標）はＢＲＬ／ＧＩＢＣＯから入手した。

糠胞接ｌ モノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０を産生ずるハイブリドーマ細胞ライン をデンブルグ（Ｄｅｎｂｕｒｇ）等［Ｂｌｏｏｄ７７：１４６２　（１９９１） ］が述べているように製造し、最初は、５％Ｃｏｔを含む加湿３７℃室において ５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン及び１０単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイ シンを補ったダルベ−ｔ　：１７　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改質イーグル培地（Ｄ ＭＥＭ／高グルコース；ＧＩＢＣＯ，メリーランド州、ベテスダ）中に維持した 。その後、この細胞ラインを、血清の代わりにＩＸＨＢＩＯＩ補助剤（ハナ　バ イオロジクス（■ａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）。

カリフォルニア州、アラメダ）を用いることによる血清を含まない培養に適応さ せた。

モノクローナル　ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０の毘 抗体３９Ｄ１０．１１　（ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のサブクローン）を産生ずる細 胞ラインによるならし培地を回収し、濾過し、組換えヒトＩＬ−５をＡＦＦＩＧ ＥＬ−１５（登録商標）樹脂（Ｂ　ｉ　ｏＲａｄ、カリフォルニア州、リッチモ ンド）に結合させることによって製造した抗原アフイニテイ力ラムに供給した。

次に、カラムをリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）と０．５Ｍ　ＮａＣ＋含 有ＰＢＳによって連続的に洗浄し、ＰＢＳと平衡させた。抗体３９Ｄ１０．１１ をカラムから０．２Ｍグリシン緩衝液によって溶離させ、その後、溶離タンパク 質をＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８によって直接中和した。

精製タンパク質に本質的にレムリ（Ｌｉｅｆｌｌｉ）［Ｎａｔｕｒｅ２２７：６ ８０　（１９７０）］か述べているように還元性条件下で１５％ゲル中でのポリ アクリアミド　ゲル電気泳動を実施して、Ｈ鎖とＬ鎖とを分離させた。両路を本 質的にマツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）のエレクトロブロツチング法（ｅｌ ｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）　［Ｊ、Ｂ　ｉｏ　１．Ｃｈｅｍ 、２６１　：１００３５　（１，９８７）］を用いて、ＩＭＭＯＢ　Ｉ　ＬＯＮ 　（登録商標）膜（ミリボア（ｌｌｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチュセッツ州、ベ ッドフォードからのＰＶＤＦ膜）上への転移によって回収した。

クーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂ ｌｕｅ）による染色後にＨ鎖とＬ鎖とに対応するバンドを膜から切断し、アプラ イド　バイオシステムスモデル（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＊ｓ　Ｍ ｏｄｅｌ）　４７７　Ａタンパク質−ペプチド配列決定装置を用いたＮ−末端配 列決定のために処理した。ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ　（登録商標）股上にプロットし た単離Ｈ鎖とＬ鎖との配列決定を、本質的にユエン（Ｙｕｅｎ）等［Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ７：７４　（１９８９）］が述べているように実施した。

Ｈ鎖は標準条件下で配列決定することができなかった。ＬＳＩは１５サイクルま で配列決定された。得られた配列と発表データとの比較はラット　イムノグロブ リンＬ鎖の同定を実証した。

イソタイプ　！５Ｏ１ｌｎ シメド（Ｚｙｍｅｄ）　（カリフォルニア州、サンフランシスコ）からのキット を用いて実施した抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のイソタイプ化は、Ｈ鎖がガンマ２ ａイソタイプであり、Ｌ鎖がカッパイソタイプであることを明らかにした（γ２ ａ／にイソタイプ）。

生惣活性拉対土ゑ効釆 モノクローナル抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０は組換えヒトＩ　Ｌ−５の生物活性を 強力に阻害する（デンブルグ等、上記文献）。この抗体が［Ｌ−５のその細胞レ セプターへの結合を阻害することによってこの効果を生ずることを研究が示して いる。

旦Ωにダ旦二２化 オリゴヌクレオチドブライマー　とクローン　”簡単に説明すると、ラットＩｇ Ｇ２ａとカッパＨ鎖及びＬ鎖配列の既知のアミノ末端及びカルボキシル末端に一 致するオリゴヌクレオチドブライマーを製造した［ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａ ｎｎ）等、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３　（１９８８）；ブルッジマン（Ｂｒｕ ｇｇｉｍａｎｒ＋）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３ ：６０７５　（１９８６）；ヘルマン（■ｅｌ１ｍａｎ）等、Ｇｅｎｅ４０：１ ０７　（１９８５）］。これらのブブライマを用いて、完全なし鎖と先端切断し たＨ鎖とのｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ方法を用いて単離した［サイキ（Ｓａ ｉｋｉ）等、５ｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７　（１９８８）］、これらのｃＤＮ Ａフラグメントを配列決定し、ｃＤＮＡの種々な領域から設計されたＰＣＲプラ イマーを用いて形成した他のクローンとの比較によって確認した。Ｌ鎖の演縄さ れたアミノ酸配列はＪＥＳｒ−３９Ｄ１０Ｌ鎖の最初の１５Ｎ−末端アミノ酸残 基の配列決定によって実証した。

第１ゴヌクレオチドΔ 抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＩｇＧ２ａ／カッパイソタイプに基づいて、５ｅｑ ｕｅｎｃｅ　Ｌｉｓｔｉｎｇに定義された配列を有するオリゴヌクレオチドブラ イマーをアプライド　バイオシステムス　モデル３８０Ａ又は３８０Ｂ合成装置 ！！（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて標準方法によって合成した。

これらのプライマーの名称（最初の文字は使用合成装置モデルに一致する）と対 応する配列確認番号とは下記の通りである：庄呈互区ｌ上主±上　ＳＥ　ＩＤＮ ０　＋８２０５１ＣＣ３ ８２０３１ＣＣ４ Ａ２０６４ＣＣ５ Ａ２０６５ＣＣ６ ８２１３７ＣＣ７ ８２１０８ＣＣ８ ８２１０１ＣＣ９ ８１８５２ＣＣ１０ 抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＨ鎖に関しては、成熟Ｈ鎖ポリペプチドの第６アミ ノ酸〜第１４アミノ酸を含む、ライヒマン等の上記文献による既知ラットｔｇＧ ２ａ配列のセグメントから、５′末端プライマー８２０５１ＣＣを誘導した。

クローン化を容易にするために、２制限部位、ＸｂａｌとＨｉｎｄｌｌｌをこの プライマーの５゛末端に加えた。３°末端プライマー８２０３１ＣＣは既知ラッ ト１ｇＧ２ａ定常領域３配列（プルフジマン等。上記文献）のセグメントに基づ （ものであった。クローン化のために、３制限部位、Ｓｍａｌ、ＥｃｏＲＩ及び ５ａ１１を加えた。

Ｌ鎖に関しては、５゛及び３′末端プライマー配列の両方は既知ラット力ツノく ｍＲＮＡ配列（ベルマン等。上記文献）から誘導した。プライマーＡ２０６４Ｃ Ｃは部分５°非翻訳領域と、翻訳開始コドンの最初の２ヌクレオチドとを含む。

クローン化を容易にするためにＨｉｎｄｌｌｌとＢａｍＨ１部位を加えた。３゜ 末端プライマーＡ２０６５ＣＣは既知ラットカッパ免疫グロブリンＬ鎖３°非翻 訳領域（３°　ＵＴＲ）のセグメントに基づくものであった。このセグメントは 停止コドンの最後の２ヌクレオチドと、停止コドンの３゛に直接に２２３°　Ｕ ＴＲヌクレオチドとを含む。クローン化を容易にするためにＥｃｏＲＩとＰｓｔ １部位とを加えた。

ＰＣＲ反尺１津り 本質的にカタラ（Ｃａｔｈａｌａ）等が述べているように［ＤＮＡ２　：　３２ ９　（１９８３）］、抗体Ｊ　ＥＳ　ｌ−３９Ｄ１０を産生ずる／Ｘイブリドー マ細胞ラインから細胞質ＲＮＡ全体を取り出した。単離したＲＮＡを鋳型として 用いて、本質約１こラツリク（Ｌａｒｒｉｃ）等が述べているように［Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７°９３４（１９８９）］、第第１鎖ｃＤＮＡ成を実施し た。次に、ｃＤＮＡ生成物に対して０．５ｍｌエツベンドルフ管中で０．５μｌ パラフイン油オーツく一レイを用（１て５０μｍ量反応混合物中でのＰＣＲを実 施した。

Ｈ鎖合成のための反応混合物は８２０２６．５μｍと、Ｔａｑ　（サーマス　ア クアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ））　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラ ーゼ緩衝液［反応中の最終濃度：１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，５ ０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｈ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン］と、１ ．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ　５μｍと、プライマー８２０５１ＣＣ（６０ｐｍｏｌ） ４μｌと、プライマー８２０３１ＣＣ（６０ｐｍｏｌ）４ｕ１と、ｃＤＮＡ　（ 総ＲＮＡ３〜６μｇから誘導される第１鎖ｃＤＮＡの１／２を含有）５μｍと、 Ｔａｑポリメラーゼ（２，５単位）０．５μｍとを含有した。Ｌ鎖合成のための 反応混合物は、使用プライマーがＡ２０６４ＣＣとＡ２０６５ＣＣであること以 外は、同じであった。

反応はＰＨＣ−１サーモサイクラ−（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）　（テクネ（ Ｔｅｃｈｎｅ）、　ニューシャーシー州、プリンストン）において：変性のため に９４℃、１．５分間ニアニーリングのために５０℃、２分間：及び合成のため に７２℃、３．５分間の３０サイクルによって実施した。第３０サイクルの終了 時に、反応混合物を伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）のために７２℃においてさらに ９分間インキュベートした。

ＰＣＲ混合物に対して０．　５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む１％アガロース ／トリス−ボレート（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ）ゲル中での電気泳動を実施した 。予想サイズ（Ｈ鎖では約１．５キロベース、Ｌ鎖では約０．７キロベース）を 有するＤＮＡフラグメントをゲルから切断し、電気溶離によって精製した。

ｃＤＮＡクローンの 旦ＮΔΣ列決定 ゲルからの回収、エタノール析出及び制限エンドヌクレアーゼ開裂後に、ＰＣＲ 形成される推定Ｈ１ｌとＬｉ１ｃＤＮＡを配列決定のために適当なベクターにク ローン化した。

推定Ｈ鎖とＬｉ１ｃＤＮＡとをそれぞれ、Ｈｉｎｄｌｌｌ／ＥｃｏＲＩ及びＢａ ｍＨＩ／ＰｓｔｌフラグメントとしてｐＵｃ１９ベクターに別々にクローン化し た。連結したプラスミドを次に標準方法によって大腸菌菌株ＤＨ５−αに形質転 換させた。形質転換細胞コロニーを単離させ、これらの形質転換細胞から、それ ぞれＨ鎖とＬ鎖のための少なくとも２個のクローンからプラスミドＤＮＡを配列 決定のために製造した。これによって得られた（それぞれ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

１と２によってＨ鎖とＬ鎖として定義される）可変領域配列の既知免疫グロブリ ン配列との比較は、カバト等の上記文献の方法によって決定された、推定ＣＤＲ の枠組み構造と位置決め（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）とにおける高度の相同を明 らかにした。

さらに、Ｌ！ＩｃＤＮＡ配列から予測されるＮ−末端アミノ酸配列は、抗体ＪＥ Ｓ１−３９Ｄ１０のＬ鎖の実験的に決定されたＮ−末端配列と一致した。

表現ブ之乙主上構成 単離したｃＤＮＡがヒトＩＬ−５に特異的に結合することができるタンパク質を コードすることを実証するために、抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０の全長推定Ｈ鎖を ＰＣＲによって再構成した。プライ７−Ｂ２１３７ＣＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

・７）と８２１０８ＣＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）とを、初期クローン化先端 切断Ｈ鎖ｃＤＮＡを修飾するように設計した。これらのプライマーはリーダーペ プチド、可変領域のＮ−末端における５欠損（厘ｉｓｓｉｎｇ）アミノ酸残基及 び定常領域のＣ−末端における欠損残基をコードする配列を供給した。

翻訳を容易にするために、を椎動物の共通翻訳開始配列［Ｋｏｚａｋ、ＮｕｃＩ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、２０：８１２５　（１９８７）］をコーディング ｃＤＮＡの５′末端に加えた。クローン化を容易にするために、５ａｌｌとＥｃ ｏＲＩ制限部位を生成ｃＤＮＡの５′末端と３°末端とにそれぞれ導入した。

プライマー８２１０１ＣＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　９）とＢ１８５２ＣＣ（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）とを用いて、推定ＬｌｌｃＤＮＡをも再設計した。こ れは主として、表現プラスミド構成のために末端における制限部位を修飾するた めに実施した。を椎動物の共通翻訳開始配列もこのｃＤＮＡに導入した。

ＰＣＲを実施し、ＤＮＡ生成物を上記のように単離し、ＤＮＡを５ａｌＩとＥｃ ｏＲＩとによって開裂した。次にＨ＠とＬｉｃＤＮＡを別々に、同様に開裂した 表現ベクターｐＳＲ３（ＡＴＣＣ６８２３４）に結合させた。プラスミドｐｓＲ ３はＳＲαプロモーターと復製のＳＶ４０起点を含み、ＣＯ８細胞におけるＣＤ ＮＡインサートの複製と表現とを可能にする。

トランスフェクション トランスフェクションの前に、１０％ＦＢＳと６ｍＭグルタミンとを補ったＤＭ ＥＭ／グルコース中でＣＯ８細胞を増殖させた。指数関数的に増殖した細胞をト リプシン処理し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地中に２ｘｌＯ’細胞／ｍｌの 密炭で再懸濁させた。

ＧＥＮＥＰＵＬＳＥＲ（登録商標）（バイオラド、カリフォルニア州、リッチモ ンド）を用いて、製造者の指示に従って、エレクトロポレーションを実施した。

簡単に説明すると、ＣＯ８細胞懸濁液の２５０μｌアリコートを各キュベツトに 分配した。ＣＩＲＣＬＥＰＲＥＰ　（登録商標）（ＢｉｏｌＯｌ、カリフォルニ ア州、ラジョラ）精製プラスミドＤＮＡ約１０μｇを５０μｍ未満の量でキュベ ツトに加え、細胞と混合した。使用ＤＮＡサンプルはＨ鎖ｃＤＮＡインサート含 有ｐｓＲ３（ｐＳＲ３−Ｈ）　、Ｌｉ１ｃＤＮＡインサート含有ｐＳＲ３（ｐＳ Ｒ３−Ｌ）、ｐＳＲ３−ＨとｐＳＲ３−Ｌとの等量混合物、非修飾ｐＳＲ３を含 んだ。

０．２ｖｏｌｔ電気パルスを９６０μＦにおいて容量エクステングーによって供 給した。次に、細胞を６０ｍｍ培養皿で培養し、新鮮な培地５ｍｌを供給し、５ ％ＣＯ２インキユベ一ター中３７℃においてインキュベートした。１６時間後に 、培地を吸引によって除去し、無血清培地と取り替えた。インキュベーションを さらに７２時間続け、その後、培地を回収した。

ぞム２ブ旦ヱ１公折 トランスフェクテイツド（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞によるならし培地をＣ ＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）管（アミコン（＾＋＊１ｃｏｎ）、マサチュセッ ッ州、ダンバース）中での遠心分離によって約１０倍に濃縮した後に、これらの 培地に対して非還元性条件下で１５％プレキャスト（ｐｒｅｃａｓｔ）　Ｓ　Ｄ 　Ｓポリアクリルアミドゲル（インチグレイテッド　セパレイジョン　システム ズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

マサチュセッッ州、ハイドパーク）中で電気泳動を実施した。サンプルの同じ２ セツトを同じゲルに加えた。２つの同分子量マーカータンパク質混合物（９７゜ ４．６８．４３．２９．１８．４及び１４．３キロダルトンタンパク質を含む） もこのゲル中に加えた。

電気泳動後に、分離帯をセミ−ドライ　エレクトロプロッター（Ｓｅ■１−ｄｒ ｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ）　（インチグレイテッド　セパレイジョン 　システムズ、マサチュセッッ州、ハイドパーク）によってニトロセルロース膜 上に移した。この膜を次に室温においてＰＢＳ中の３％ＢＳＡを加えてインキュ ベートした後に、２片に切断した。各月はサンプルの完全なセットを含有した。

膜の１片をならし培地中のラットＩｇＧ鎖表現の検出するための第１分析に用い た。この分析は膜を次に室温において・３％ＢＳＡを含む、ＴＢＳＴ緩衝液［１ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＮａＣ１及び０．０５％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビクンモノラウレート ）］中のビオチニル化つサギ抗ラットＩｇＧの１　：　２００希釈物によって４ ５分間１回、ＴＢＳＴ緩衝液のみによって１５分間３回、ＴＢＳＴ緩衝液中のス トレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体の１＋１０．ＯＯＯ希釈物 によって３０分間１回、ＴＢＳＴ緩衝液のみによって１５分間３回、及びアルカ リ性ホスファターゼ基質（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９，１００ｍＭ 　ＮａＣＩ、５ｍＭ　ＭｇＣＩ２を含むアルカリ性ホスファターゼ緩衝液１０ｍ １中のＮＢＴ４４μｌとＢＣＩＰ３３μｌ）　によって１０〜３０分間１回処理 することによって達成された。この膜片を次に蒸留水によるすすぎ洗い後に発色 に関して試験した。

膜の他方の片を任意のならし培地中にヒトＩ　Ｌ−５結合タンパク質が存在する か否かを調へるための第２分析に用いた。この片を室温において　ＴＢＳＴ緩衝 液中の１μｇ／ｍ１組換えヒトｒＬ−５によって１時間１回、ＴＢＳＴ緩衝液の みによって１５分間３回、ＴＢＳＴ緩衝液中の組換えヒト１Ｌ−５に対するウサ ギ抗血清の１：３．ＯＯＯ希釈物によって１時間１回、ＴＢＳＴ緩衝液のみによ って１５分間３回、ＴＢＳＴ緩衝液中のビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧの１： ２００希釈物によって１時間１回、ＴＢＳＴ緩衝液のみによって１５分間３回、 ＴＢＳＴ緩衝液中のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体の１ ・１０．０００希釈物によって３０分間１回、ＴＢＳＴ緩衝液のみによって１５ 分間３回、及びアルカリ性ホスファターゼ基質によって連続的に処理した。次に 、この膜を発色に関して試験した。

第１分析の結果は、ｐＳＲ３−ＨとｐＳＲ３−Ｌの両プラスミドによって同時ト ランスフェクトした（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）形質転換細胞によるならし 培地のみが検出可能な帯を生じることを示した。帯のパターンは免疫グロブリン に関して予想された通りであった。Ｈ鎖又はＬ鎖のみによってトラスフエクトし た細胞からのならし培地を含むレーン（ｌｉｎｅ）には着色が観察されず、この ことはタンパク質が少量であるか又は抗体が個々のＨ鎖及びＬ鎖を識別できない ことを実証する。Ｈ鎖はＬｌｌの不存在下では通常分泌されないので、ならし培 地中に存在するとは考えられなかった［ボール（Ｂａｌｅ）等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ、１０２：１５５８（１９８６）］。

第２分析では、ｐＳＲ３−ＨとｐｓＲ３−Ｌの両プラスミドによって同時トラン スフェクトした形質転換細胞によるならし培地からのサンプル中に強いＩＬ−５ 結合活性が観察された。これは非還元性ＳＤＳゲル中で約１６０キロダルトンの 見かけの分子量すなわち、完全な抗体分子に予想されるサイズを有して移動する 主要な着色帯として認められた。

ｇへイムノソルベントアッセイ 組換えモノクローナル抗体がヒトＩＬ−５に特異的に結合することができること を実証するために、９６孔イムノアツセイ（ＥＩＡ）プレートに３％ＢＳＡのみ ５０μｍ又は組換えヒトＩＬ−５（５μｇ／ｍｌ、次にＢＳＡ溶液によって遮断 ）毫塗布した。全ての塗布は４℃において約２時間実施した。次に、上述した種 々のＣＯ８細胞の形質転換細胞による又は抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０産生ハイブ リトーマ細胞ラインによるならし培地のアリコート（５０Ａｔ＋）を孔に加え、 プレートを４℃において２時間インキュベートした。

インキュベーション後に、孔内の培地を室温において３００μ！アリコートを用 いて連続的に取り替え、ＴＢＳＴ緩衝液のみによって１５分間３回、ビオチニル 化つサギ抗ラットＩｇＧによって約２時間１回、ＴＢＳＴのみによって１５分間 ３回、ＴＢＳＴ中のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体によ って３０分間１回、ＴＢＳＴ緩衝液のみによって１５分間３回処理し、ＢＲＬＥ ＬＩＳＡ　ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴ［）Ｎ　ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）によって ５〜１５分間発色させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）、全ての試薬希釈度は上述した 通りであった。

このアッセイの結果は、天然ＪＥＳ　ｌ−３９Ｄ１０抗体（ハイブリドーマによ るならし培地から）と組換え抗体（ｐＳＲ３−ＨとｐｓＲ３−Ｌの両プラスミド によって同時トランスフェクトした形質転換細胞によるならし培地がら）の両方 が、強い発色によって実証されるように、ＩＬ−５を塗布した孔に保有されるこ とを示した。Ｉ　Ｌ−５が存在しない場合又は試験サンプルがＨ鎖若しくはＬ鎖 のミラコードするベクターによってトランスフェクトした細胞のならし培地であ る場合には、バックグラウンド対照（抗体タンパク質を含まず）を越える有意な 発色は観察されなかった。

抗体旦上北 桓同至デ呈２グ 上記方法によって、抗体ＨＩ　ＬとＬＡＹが最適ヒト枠組み構造候補であること が判明した。ＨＩＬ又はＬＡＹのＨ鎖とＬ銅対及びこれらの組合せを最初に追及 した。

枠組み構造配列にグラフトすることができる、可能な最小及び最大ＪＥＳＴ−３ ９Ｄ１０残基のリストが下記表に示す通りであることが、上記方法によって判明 した。

騒゛ Ｖｕ最小リスト　２１−２７．４７−５０．６６．９３−１０１Ｖｕ最大リスト ゝ、　１９．２８．２９．３０．３２．４０．４５．４６．５１．５２−６０． ７１．８９．９２■、最小リスト：　４６−５１．６８．７０−７２．８４．９ １．１０９．１１０−１１６ ｖ１最大リスト１　４４．４５．５２−５４．５６．６６．７３−７６．８８． ８９，１１７ ａｖｌｌとｖＬとの残基はそれぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１とＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ 。

、２における残基番号を意味する。

ｂ　ＶＮとＶ　＋、　の　リストは・応バリスト　の　六　むν　に八　の　は 　看　か゛の　＾　した立上化抗体−騒 ＣＭＸ５−Ｉ　Ｖ、ＨＩＬ最大；ＶＬ　ＬＡＹ最大ＣＭＸ５−２　Ｖ、ＨＩＬ最 大；ＭＬ　ＬＡＹ最大（小構造ＣＤＲループＨ−Ｉ　Ｎ−末端）ＣＭＸ５−３　 Ｖ、ＬＡＹ最大、ＶＬ　ＬＡＹ最大ＣＭＸ５−４　Ｖ、ＨＩＬ最大；Ｖ、ＬＡＹ 最大ＣＭＸ５−５　Ｖ、ＨＩＬカバト、ＶＬ　ＬＡＹカバトＣＤＲのみ　ＣＤＲ のみ ヒト化抗体の所定の用途は溶解性ヒトｌ　Ｌ−５の生物活性の中和であるので、 ヒト化抗体の定常領域としてγ４を選択した。この理由は補体固定（ｃｏ園ｐｌ ｅｍｅｏｔ　ｆｉｘａｔｉｏｎ）の誘発において４種のヒト免疫グロブリンイソ タイプの中で７４が最小効力であるからである。ヒト化し鎖の定常領域としてラ ットにイソタイプのヒトカウンターパート（ｃｏｕΩｔｅｒｐａｒｔ）を選択し た。

ヒトヒ　ＣＭＸ５−１の ＰＣＲと通常のクローン化方法との組合せを用いて、合成ＣＭＸ５−ＩＤＮＡを 構成した。■領域を３セグメントに分割し、各セグメントを５°末端と３°末端 における指定（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ）制限部位を含むように設計した。哺乳動 物遺伝子中に比較的高い頻度で出現するコドンを選択した。配列の転位又は欠失 を生ずる予想外の二次構造の形成を最小にするために、オリゴヌクレオチドの設 計の言及しない（ｓｉｌｅｎｔ）変化によって、回帰性（ｐａｌｉｎｄｒｏ鳳ｉ ｃ）配列と反復配列とを回避したが又は取り替えた。

ＣＭＸ５−１の全Ｈ鎖可変領域（Ｖｎ）に対応するオリゴヌクレオチドを標準方 法によって合成した。

これらのオリゴヌクレオチドの名称と、これらの配列を定義する対応５ＥＱＩＤ 　Ｎｏとは次の通りである： オリゴヌクレオチド　５ＥＩＤＮＯ ８２４７４ＣＣ１１ ８２４１９ＣＣ１２ ８２４２０ＣＣ１３ Ｂ２４７５ＣＣ１４ ８２４７７ＣＣ１５ Ｂ２４７９ＣＣ１６ オリゴヌクレオチド対のＢ２４７４ＣＣとＢ２４１９ＣＣ，Ｂ２４２０ＣＣとＢ ２４７５ＣＣ，Ｂ２４７７ＣＣとＢ２４７９ＣＣを熱変性させ（ｈｒａｔ−ｄｅ ａａｔｕｒｅｄ）、アニールし、Ｔａｑポリメラーゼ又はＰｆｕ　（ストレイタ ンン、カリフォルニア州、ラジョラ）と共にインキュベートした。ポリメラーゼ 鎖反応（ＰＣＲ）では、６対の２種オリゴヌクレオチドは約２４〜３０ヌクレオ チドによって相互に相補的であった。それ故、各ヌクレオチドを他方の鋳型とし て用いた。

ＰＣＲを１８サイクル実施し、その後、ｖＨｌ、Ｖ□２及びＶ工３と名付けられ た、ｖｌ、の３共通セグメントに対応する３生成りＮＡフラグメントをアガロー スゲル中で電気泳動し、電気溶離によって精製した。

３Ｖ、、ＤＮＡフラグメントの相対的順序、クローン化のための制限部位及びク ローン化ベクターｐｓｉ、５ｐｏｒｔのマルチクローン化部位マツプは次の通Ｖ 　ｓ　Ｉ　ＥｃｏＲＩ−−−−−−３ｐｅｌ　Ｂ２４７４ＣＣ＋Ｂ２４１９ＣＣ Ｖ　、、　２　５ｐｅｌ−−−−−−Ｘｂａｌ　Ｂ２４２０ＣＣ＋Ｂ２４７５Ｃ ＣＶ、３　ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ−−−−−−３ａｉｌ／ＡｐａＩ／５ｓｔＩ　 Ｂ２４７７ＣＣ＋Ｂ２４７９ＣＣ８ｖ、Ｓ　Ｏｒｔのマルチクローン化部Ｐｓｔ ｌ／ＫｐｎＩ／ＲｓｒＩＩ／ＥｃｏＲＩ／Ｓ＋ａｌ／５ａｌＩ／５ｓｔＩ／５ｐ ｅＩ／ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ／Ｂａ−■Ｉ／ｆｌｉｏｄ撃hＩ／５ｎａＢＩ／ １１ｕｌ フラグメントＶＨＩを酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｅ　Ｉによって制限し、ベクターｐ ＳＶ、５ｐｏｒｔにクローン化した。次に、フラグメントＶ、、２をｐＳＶ、５ ｐｏｒｔ中の■。１にＳｐｅ　１部位とＸｂａ１部位における方向性挿入によっ て結合させた。フラグメントＶ、３は別に、ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ　Ｔ−３ａ　Ｉ 　Ｉ／Ａｐａｌ／５ｓｔｌフラグメントとしてｐＳＶ、５ｐｏｒｔにクローン化 した。これらの３７ラグメントをＤＮＡ配列決定によって実証した。

以下でさらに詳述するように、γ４Ｈ鎖定常領域（Ｃ１ｌ）のゲノムＤＮＡに■ □３を最初に結合させ、次にこの■ｌＩ３　Ｃ□フラグメントをＶＨＩ−Ｖ□２ フラグメントを結合させることによって、全長ＣＭＸ５−ＩＶ、ｃＤＮＡを集成 した。

ＣＭＸ５−ＩＶＬｃＤＮＡを同様なやり方で、６種の合成オリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて構成した（ａｓｓｅ■ｂｌｅｄ）。これらのオリゴヌクレオチ ドと、これらの配列を定義する対応ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏとは次の通りである：オ リゴヌクレオチド　５ＥＩＤＮＯ Ｂ２４２５ＲＣＣ１７ ８２４２６ＣＣ１８ ８２４２７ＣＣ１９ ８２４５８ＣＣ２０ ８２４５９ＣＣ２１ ８２４６０ＣＣ２２ ＶＬＩ、ＭＬ２及びＭＬ３と名付けられた、３種フラグメントは、それぞれオリ ゴヌクレオチド対のＢ２４２５ＲＣＣとＢ２４２６ＣＣ，Ｂ２４２７ＣＣとＢ２ ４５８ＣＣ，Ｂ２４５９ＣＣとＢ２４６０ＣＣから誘導されたもノテあった。■ 、の３連続セグメントに対応する、これらのＤＮＡフラグメントをアガロースゲ ル電気泳動と電気溶離とによって精製した。

３ＶＬ　ＤＮＡフラグメントの相対的順序、クローン化のための制限部位及びク ローン化ベクターｐＵｃ１９のマルチクローン化部位マツプは次の通りであった ヱ乏ｌス２上　制服部位　ＰＣＲプライマーＶ　、Ｉ　ＰｓｔＩ−−−−−−Ｂ ｓｔＥＩＩ／ＸｂａＩ　Ｂ２４２５ＲＣＣ＋Ｂ２４２６ＣＣＶ　Ｌ　２　Ｐｓｔ Ｉ／ＢｓｔＥＩＩ−−−−−Ｂａｍｆｌｌ　Ｂ２４２７ＣＣ＋Ｂ２４５８ＣＣＶ 　Ｌ３　ＢａｍＢＩ−−−−−−３ａｌＩ　Ｂ２４５９ＣＣ＋Ｂ２４６０ＣＣＪ ）ＵＣｌ３のマルチクローン化部 ＥｃｏＲＩ／５ａｃｌ／ｌ［ｐｎｌ／ＳｍａＨＩ／ＢａｍＢＩ／ＸｂａＩ／５ａ ｌＩ／Ｐｓｔｌ／５ｐｈＩ／ＢｉｎｄＩＩＩ■Ｌ１、ＭＬ２及びＭＬ３をそれぞ れ、Ｐｓｔｌ−ＢｓｔＥＩＩ／Ｘｂａｌ、Ｐｓｔｌ／ＢｓｔＥＩＩ−ＢａｍＨＩ 及びＢａｍＨｒ−３ａｌ　１７ラグメントとしてベクターｐＵｃ１９に別々に最 初にクローン化した。３フラグメントの同定をＤＮＡ配列決定によって実証した 。次に、ＭＬ１を既に含むベクターにＭＬ２をＢｓ　ｔＥＩ　Ｉ−ＢａｍＨｒフ ラグメントとして挿入することによって、Ｖ　Ｌ　１とｖＬ２をｐＵｃ１９に一 緒に構成した。

全長Ｖ　Ｌｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの構成（ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、最初にＶ　Ｌ　３を Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）に結合させ、次に、以下でさらに詳述するように、Ｖｔｌ 　Ｖｔ、２フラグメントとＶ、３−ＣＬフラグメントとを結合させることによっ て実施された。

ヒト化抗体の合成と分泌とを容易にするために、成熟Ｈ鎖とＬ鎖ポリペプチドの 両方のアミノ末端にリーダーペプチドを結合させた。このリーダーのアミノ酸配 列とヌクレオチド配列は、抗ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体のリーダーの配列である（ ライヒマン等、上記文献）。リーダーペプチドのコード化配列（ライヒマン等、 上記文献）を７ラグメントｖｌ１１とＶ　Ｌ　１の両方に導入した。

全長抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡを構成しようと試みて、Ｖ＋＋合成ｃＤＮＡを ヒトγ４定常領域ゲノムＤＮＡ　（ＡＴＣＣ５７４１３）に、Ａｐａ　＋制限開 裂と結合を用いて結合させた。この操作は、■、、３含有プラスミドｐＳＶ、５ ｐｏｒｔをＮｏｔｌによって消化させることによって開始され、この後にクレノ ウＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンゲル　マンハイム）による処理によって、平滑 末端を形成した。生成りＮＡをエタノール析出させ、再懸濁させ、Ａｐａ＋によ って消化させた。この制限プラスミドＤＮＡをゲノムγ４定常領域のＡｐａｌ／ Ｓｍａ■制限フラグメントと結合させた。

Ｖｕ３　Ｃ１ｌゲノムＤＮＡを次にＸｂａｌ／Ｈｉｎｄｌ１１７ラグメントとし て切断して、既にＶｓｌ−Ｖｕ２を含むｐＳＶ、５ｐｏｒｔ中に挿入し、それに よって全長ＨｉｌＤＮＡの構成を完成する。

抗体路を製造しようと試みて、Ｈ＠ＤＮＡとＬ鎖ＤＮＡを含むプラスミドをＣＯ ８細胞中に同時トラスフエクトした。しかし、ならし培地の分析後にＥＬＩＳＡ 又はウエスタンブロツチングによって、分泌免疫グロブリンは検出不能であった 。代替え法として、ヒトγ４定常領域ｃＤＮＡを設計し、構成して、ゲノムＤＮ Ａと取り替えた。

このために標準方法によって６オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを合成した 。これらのオリゴヌクレオチドの名称と、これらの配列を定義する対応ＳＥＱ［ Ｄ　Ｎｏとは次の通りである： オリゴヌクレオチド　５ＥＩＤＮＯ ８２４９１ＣＣ２３ ８２４９８ＣＣ２４ ８２４９９ＣＣ２５ ８２４９７ＣＣ２６ ８２４９８ＣＣ２７ Ｂ２６５６ＣＣ２８ プライマーＢ２４９１ＣＣＳＢ２４９９ＣＣ及びＢ２４９８ＣＣはγ４定常領域 ｃＤＮＡのプラス鎖に相当する。ブライ７−Ｂ２４９８ＣＣＳＢ２５９７ＣＣ及 びＢ２６５６ＣＣはマイナス鎖に相当する。ヒト７４ゲノムＤＮＡを鋳型として 用いて、ｃＤＮＡをコードする全７４定常領域を含む３連続二本鎖ＤＮＡフラグ メントをＰＣＲによって形成した。

３Ｃ，ＤＮＡセグメント、クローン化のための制限部位及び使用プライマーは下 記の通りであった： フラグメント　［位　ＰＣＲプライマーＣｎＡ、　５ａｌＩ−−−−−−Ｅｃｏ ＲＩ　Ｂ２４９１ＲＣＣ＋Ｂ２４９８ＣＣＣ，、Ｂ、　’　ＥｃｏＲＩ−−−一 −ＸｂｏＩ／５ａｌｌ　Ｂ２４９９ＣＣ＋Ｂ２５００ＣＣＣ，Ｃ１５ａｌＩ／Ｘ ｈｏＩ　−−−−−−ＮｏｔＩ　Ｂ２５９８ＣＣ＋Ｂ２６５６ＣＣセグメントＡ をＳａ　ｌ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとしてｐＵｃ１９にクローン化し た。５ａｉｌ／Ｘｈｏｌ−Ｎｏｔｌ制限フラグメントとしてのセグメントＣは、 ｐＳＶ、５ｐｏｒｔにクローン化した。ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ／Ｓａ１■フラ グメントとしてのセグメントＢを、既にセグメントＣを含むｐ３Ｖ、５ｐｏｒｔ にクローン化した。３セグメントの全てをＤＮＡ配列決定によって確認した。

セグメントＡをＰｓｔｌとＥｃｏＲＩとによって切断し、このフラグメントを既 にセグメントＢとＣを含むｐＳＶ、５ｐｏｒｔにクローン化することによって構 成した。ヒトγ’　ＣＮ　ＣＤ　Ｎ　Ａの制限マツプとｐｓｉ、５ｐｏｒｔマル チクロ一ン化部位におけるそれらの相対的位置は下記の通りである・Ａ　Ｂ　Ｃ Ｐｓｔｌ／５ａｌＩ・・・・・・・・・ＥｃｏＲＩ・・・・・・・・・・ｘｂｏ Ｉ・・・・・・・・・・Ｎ０ｔＩ／■１ｏｄＩＩＩ／５ｎａaＩ／ｌ１ｌｕｌ 既述した全長Ｈ１ｌ構造のゲノムγ４フラグメントと取り替えるために、γ’　 ＣＨｃＤＮＡをＳａ　Ｉ　１−−−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントとして切 断した。最終生成物は、ベクターｐＳＶ、５ｐｏｒｔにクローン化された、ｃＤ ＮＡをコードする全長Ｈ鎖であった。

安定なトランスフェクションのために、全長Ｈ＠ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳ Ｖ、５ｐｏｒｔをＫｐｎ　Ｉによって消化させ、次に、Ｔ、ポリメラーゼによっ て処理して、末端を弱らせ（ｂｌｕｎｔ）、５ｎａＢＩによって消化させた。生 成りＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって単離させた後に、ＧＥ ＮＥＣＬＥＡＮ　（登録商標）ＤＮＡ精製キット（ＢｉｏｌＯｌ、カリフォルニ ア州、ランヨラ）によって精製し、平滑末端をＳｍａ　Ｉ処理プラスミドｐｓＲ ３又はｐＤＳＲＧに結合させた。最終構造をｐＳＲ３ＭＰＡ５Ｈ（図１）又はｐ ＤＳＲＧＭＰＡ５Ｈ（図２）と名付けた。

抗体ＨＩＬのＨ！ｌのアミノ末端が化学的にブロックされていることは既に報告 されている［チウ（Ｃｈｉｕ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５５４　（ １９７７）］。ググルタミン酸ンがアミノ末端残基として想定され、組換え抗体 ＣＭＸ１．２．４及び５のＨ鎖に用いられた。抗体ＣＭＸ５−３のＨ鎖では、Ｌ ＡＹ　Ｈ鎖アミノ末端残基の、ＬＡＹ　Ｈ鎖が１要素であるサブグループＩＩＩ の他のヒトＨ鎖配列の対応残基との比較に従って、ＬＡＹ　Ｈ鎖のＮ−末端アラ ニンをグルタミン酸残基と置換させた。

全長変異し鎖ｃＤＮＡの構成を容易にするために、グルタミン酸残基１０５のコ ドンをアスパラギン酸コドンと置換させて、ｖＬとＣＬの結合点（ｊｕｎｃｔｉ ｏｎ）近くに５ａｌｌ制限部位を形成した。この修飾はｐＳＶ、５ｐｏｒｔベ一 スドＣＭＸ５−ＩＬ鎖表現プラスミド中のカセットとしてのＶ、変異体（ｖａｒ ｉａｎｔ）の置換を可能にした。

ヒト抗体ＲＥＩからの配列情報に基づいてヒトにＬ鎖ｃＤＮＡを最初に構成した ［ニップ（Ｅｐｐ）等、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４５：５１３　（１９７ ４）］。このために、７種の合成オリゴヌクレオチドブライマーを製造した、こ れらの名称と対応ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、は下記の通りであった：オリゴヌクレオ チド　５ＥＩＤＮＯ ８２２６２ＣＣ２９ ８２２８１ＣＣ３０ ８２２９３ＣＣ３１ ８２２９４ＣＣ３２ Ａ２４９５ＣＣ，３３ Ａ２４９６ＣＣ３４ ８２７０４ＣＣ３５ オリゴヌクレオチドプライマーの４種は全長にＬｉ１ｃＤＮＡを含むように合成 した。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ２２６２ＣＣ，Ｂ２２８１ＣＣ，Ｂ２２ ９３ＣＣ及びＢ２２９４ＣＣ）を混合し、単一ポリメラーゼ鎖反応において伸長 させた。ＰＣＲ後に、生成物をアガロース電気泳動と電気溶離とによって精製し て、ｐＵｃ１９にクローン化し、ＤＮＡ配列決定によって分析した。全ての配列 決定クローンは間違って組込まれた（ｍｉｓｉ口ｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）塩基を 含有した。

次に、ＰＣＲプライマーのＡ２４９５ＣＣとＡ２４９６ＣＣとを合成して、正確 なヒトにＬ鎖定常領域を形成した。Ａ２４９５ＣＣの配列はヒトＬＡＹ抗体Ｖ、 枠組み構造の最後の４アミノ酸コドンとヒトに定常領域の開始点（ｂｅｇｉｎｎ ｉｎｇ）を含有した。プライマーＡ２４９６ＣＣはヒトに定常領域のカルボキシ ル末端に相当した。

異常型の（ａｂｅｒｒａｎｔ）全長り鎖クローンとプライ７−Ａ２４９５ＣＣと Ａ２４９６ＣＣとを用いて、ＰＣＲを実施し、ＰＣＲ生成物をベクターｐｕｓ、 ５ｐｏｒｔにクローン化した。しかし、配列決定分析は、この構造も間違って組 込まれた塩基を含有することを示した。この新しいエラーはオリゴヌクレオチド ブライマーＡ２４９５ＣＣとＡ２７０４ＣＣとを用いる付加的ＰＣＨによって修 飾された。

これによって得られた生成物は５ａｌＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントとし て、既に■Ｌ３フラグメントを含むｐＬｌｃ１９にクローン化した。このように して、正確なにＬ鎖定常領域ｃＤＮＡが得られた。

全長Ｌ１１１ｃＤＮＡを構成するために、ＶＬＩ　ＶＬ２を平滑末端Ｈｉｎｄｌ ｌｌ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切断し、ＶＬ３　ＣＬフラグメントを含む Ｓｍａ１／ＢａｍＨＩ開裂ｐＵＣ１９中に挿入した。全長し鎖フラグメントをｐ ｕｃ１９からＰｓｔｌ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして切断し、表現ベクターｐ ＤＳＲＧとｐｓＲｓとに別々にクローン化して、それぞれｐＤＳＲＧＭＰＡ５Ｌ 　（図３）とｐＳＲ３ＭＰＡ５Ｌ　（図４）と名付けられたプラスミドを形成し た。

抗体ＣＭＸ５−１のＨ鎖とＬｌ！可変領域のアミノ酸配列は配列一覧表において ＳＥｏ　１０　ＮＯ・３６とＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ・３７とによって、それぞれ定 義される。これらの配列のアミノ酸残基１〜１９は翻訳後プロセシング中に開裂 する分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基２０によって開始する 、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７との配列によって定義 される。

ヒトヒ　０ＭＸ５−２の ヒト化抗体ＣＭＸ５−２を構成するために、Ｂ５１９４ＣＣ及びＢ５１９５ＣＣ と名付けられた相補的オリゴヌクレオチド（それぞれ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

３８とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９とによって定義される配列）を合成し、アニー ルして、ＢｇＩ　Ｉ　Ｉ／Ｓｐｅ　Ｉフラグメントを形成して、ｐｓｉ、５ｐｏ ｒｔ中のＣＭＸ　５−Ｉ　Ｈ鎖の４２ｂｐＢｇｌｌｌ／５ｐｅｌフラグメントと 取り替えた。

取り替えた領域をＤＮＡ配列決定によって確認した。

抗体ＣＭＸ５−２のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列一覧表においてＳ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１とによって、それぞれ定義 される。これらの配列のアミノ酸残基１〜１９は翻訳後プロセシング中に開裂す る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基２０によって開始する、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１との配列によって定義さ れる。

ヒトヒ　０ＭＸ５−３の ヒト化抗体ＣＭＸ５　３Ｖｎを構成するために、抗体ＪＥＳ［−３９Ｄ１０ＣＤ Ｈに基づくアミノ酸配列とヒトＬＡＹ　ｖ□枠組み構造配列とを有する、４橿の オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドの名称と対応５Ｅ ＱＩＤ　Ｎｏ、は下記の通りであった：オリゴヌクレオチド　ｍ−上ＤＮΩ。

８２７８４ＣＣ４２ ８２７８５ＣＣ４３ ８２７８６ＣＣ４４ ８２９２１ＣＣ４５ オリゴヌクレオチドの組合せ、Ｂ２７８４ＣＣとＢ２７８５ＣＣ及びＢ２７８６ ＣＣとＢ２９２１ＣＣを用いて、ＰＣＲを実施して、生成物を制限して、Ｐｓｔ ｌ／５ｐｅｌフラグメントとＸｂａｌ／５ａｉｌフラグメントとを形成した。

これらのＤＮＡフラグメントを用いて、ｐｓｉ、５ｐｏｒｔ中の抗体ＣＭＸ５− ＩＨ鎖ｃＤＮＡのＶ。１とＶ　ｓ　３フラグメントとそれぞれ取り替えた。

抗体ＣＭＸ５−３のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列一覧表においてＳ ＥＱ　ＩＤ　Ｎ０＝４６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７とによって、それぞれ定義 される。これらの配列のアミノ酸残基１〜１９は翻訳後プロセシング中に開裂す る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基２０によって開始する、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７との配列によって定義さ れる。

ヒト　０ＭＸ５−４の 抗体ＣＭＸ５−１を構成するために用いた方法と同じ方法で、ヒト化抗体ＣＭＸ ５　４ＶＨを構成した。３対のオーバーラツプ　オリゴヌクレオチドをこのため に合成した、これらのオリゴヌクレオチドの名称（及び定義するＳＥＱ　ＩＤＮ ００）は下記の通りであった： 庄旦１ヱ之ｙ庄ヱ上　１旦ｑ−１旦−ＮΩ。

８２９２４ＣＣ４８ ８２９２５ＣＣ４９ ８２９２６ＣＣ５０ ８２９２７ＣＣ５１ ８２９２８ＣＣ５２ ８２９２９ＣＣ５３ オリゴヌクレオチドの組合せ、Ｂ２９２４ＣＣとＢ２９２５ＣＣ，Ｂ２９２６Ｃ ＣとＢ２９２７ＣＣ，及びＢ２９２４ＣＣとＢ２９２５ＣＣを用いて、ＰＣＲ伸 長反応によって対応３ＤＮＡフラグメントを合成した。これらの３７ラグメント をクローン化し、配列決定し、制限消化と結合とによってｐＳＶ、５ｐｏｒｔに 構成した。

Ｂ５０９３ＸＹとＢ５０９４ＸＹと名付けられたオリゴヌクレオチド（それぞれ 、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５によって定義される配 列）を最初にアニールし、次に各オリゴヌクレオチドの３′末端をＰＣＨによっ て伸長させることによって、０ＭＸ５−４ＶＬを構成した。この生成物をゲル精 製し、ＢｓｔＥＩＩと５ａｌｌ制限し、抗体０ＭＸ５−ＩＬ鎖ｃＤＮΔ中のＢｓ ｔＥＩｒ／５ａｉ１７ラグメントと取り替えるために用いた。

抗体ＣＭＸ５−４のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列一覧表においてＳ ＥＱ　［）　ＮＯ：５６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７とによって、それぞれ定義 される。これらの配列のアミノ酸残基１〜１９は翻訳後プロセシング中に開裂す る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基２０によって開始する、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７との配列によって定義さ れる。

互上化坑体旦ＭＸ呈二呈ｍ男成 り３１３６ＣＣとＢ５１３７ＣＣ１及びＢ５１３８ＣＣとＢ５２０２ＣＣなる名 称のオリゴヌクレオチド対を用いて２種ＤＮＡフラグメントを合成することによ って、０ＭＸ５−５Ｖ、ＤＮＡを構成した。これらのオリゴヌクレオチド配列は 配列一覧表において下記の通りに定義されるオリゴヌクレオチド　旦旦ｑ−上旦 −Ｎ旦。

８３１３６ＣＣ５８ ８３１３７ＣＣ５９ ８３１３８ＣＣ６０ Ｂ３２０２ＣＣ６１ 生成するＰＣＲフラグメントをゲル精製し、制限し、抗体ＣＭＸ５−１のｖＩＩ ｃＤＮＡ中の５ｐｅｌ／ＢａｍＨＩフラグメント及びＢａｍＨＩ／Ｓａ　ｌ　Ｉ フラグメントと取り替えるために用いた。

ｐＳＲ３中の０ＭＸ５−１のＶＬ３　（ＢａｍＨＩ／Ｓａ　Ｉ　１７ラグメント ）をＢ５１４２ＣＣとＢ５１４３ＣＣなる名称のプライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：６２とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３とによってそれぞれ定義される配列）と鋳 型ＣＭＸ５−ＩＬとを用いてＰＣＲ形成フラグメントと取り替えることによって 、０ＭＸ５−５ＶＬＤＮＡを構成シタ。

抗体ＣＭＸ５−５のＨ鎖とＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は配列一覧表においてＳ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６５とによって、それぞれ定義 される。これらの配列のアミノ酸残基１〜１９は翻訳後プロセシング中に開裂す る分泌リーダーを含むので、実際の可変領域配列は残基２０によって開始する、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４とＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・６５との配列によって定義さ れる。

抗体表現立積型 ヒト化抗体を表現するために、ｐｓＲｓベースドＬ鎖プラスミドとｐＳＶ、５ｐ ｏｒｔベースドＨ鎖プラスミド、各５〜１０μｇをエレクトロポレーションプロ トコールによって５ｘｌＯ’ＣＯ３細胞中に同時トランスフェクトした。次に、 これらの細胞を完全培地の存在下の６０ｍｍ培養皿中で培養した。細胞が沈降し て、皿に付着した後（トランス会りション及びブレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ ）の約６時間後）に、培地を吸引し、無血清培地と取り替えた。ならし培地を７ ２時間目に回収した。

ならし培地中のヒト化抗体の濃度をヒトＩｇＧ４−特異性酵素結合イムノソルベ ントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。ヌンク　イムノプレート（Ｎｕ ｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ）に、５０ｍＭ炭酸水素塩緩衝液（ｐｆ（９， ５）中の５　ｕ　ｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧ４−Ｆｃモノクローナル抗体（ カルバイオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州、ラショラ）を４ ℃において２４時間塗布した。次に、プレートを室温においてＢＬＯＴＴＯ（ダ ルベツコ改質リン酸塩緩衝生理食塩水中の５％脱脂ドライミルクと０．０５％（ ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）によって９０分間ブロックした。

過剰なブロッキング試薬（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）を洗い流した後 に、１００μｌ量の連続希釈サンプルをプレートの孔に供給した。このプレート を３７℃において２時間インキュベートし、その後、サンプルを吸引し、孔を３ 回洗浄した。ヒツン抗ヒ）　Ｉ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ抱合体（ザ 　バインディング　サイト（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ）、カリフォル ニア州すンジエゴ）１００μｌを番孔に加え、プレートを３７℃において２時間 インキュベートした。次に、プレートを３回洗浄し、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ 基質（ベーリンゲル　マンノ＼イム、インディアナ州、インディアナポリス）１ ００μｌを番孔に加えると、発色反応が生ずる。

プレートを４０５ｎｍにおいて分光測光的に読み取った。

全体で５種類のヒト化抗体のならし培地はヒトＩｇＧ４に関して陽性と試験され た。反復実験は、抗体ＣＭＸ５−１、ＣＭＸ５−２及びＣＭＸ５−５に対する３ 日間ならし培地（３−ｄａｙ　ｃｎｄｉｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ）では１ｇＧ４ の濃度が同じである（約２００μｇ／ｍ＋）ことを示した。ＣＭＸ５−４ならし 培地のＩｇＧ４濃度は通常約２〜３倍高かった。ＨＩＬ抗体の代わりにＬＡＹ抗 体からのＶ□枠組み構造を含む、抗体ＣＭＸ５−３含有ならし培地中で測定され るＩ　ｇＧ４レベルは、−貫して抗体ＣＭＸ５−１．２及び５に関して測定され た同レベルの約５〜１０分の１であった。

多量の精製ヒト化抗体を得るために、抗体ＣＭＸ５−１を産生ずる組換えＣＨＯ 細胞ラインを確立した。ＣＭＸ　５−Ｉ　Ｈ鎖とＬ鎖プラスミドのｐｓＲ３ＭＰ ５ＨとｐＤＳＲＧＭＰＡ５Ｌを２０：１の比でＣＨＯ細胞細胞間時トランスフェ クトし、ヒポキサンチンとチミジン欠除に対する耐性に関して安定なトランスフ ェクシントを選択した。

メトトレキセート（ＭＴＸ）処理の前にヒト１ｇＧ４分泌に関して分析した１０ ６耐性クローンの中の６５クローンが陽性と試験された。次に、これらの安定な りローンに対してメトトレキセート処理を実施して、遺伝子を増幅させた場合に 、クローンの大部分はこの薬物に対して高度に安定であるように思われた。細胞 を２０．６０．２００ｎＭレベルでＭＴＸによって処理した場合には、最高ＭＴ Ｘ濃度においてもごく僅かな細胞増殖遅延が観察されたにすぎなかった。

ＣＪＡ２５と名付けられた、良好な産生体クローンの１つを、１ｍＭの最終濃度 に達するまで段階的に上昇するＭＴＸ濃度によって連続的に処理した。１ｍＭＭ ＴＸにおける最終抗体表現レベルは約１５ｐｇ／細胞７日であると算出された。

ＭＴＸの不存在下で細胞を２力月間を越えて培養することによって、この細胞ラ インの安定性を監視したが、この期間中表現レベルが無変化に留まった。

並行実験では、ＣＨＯ細胞に再びｐＤＳＲＧＭＰＡ５ＨとｐＳＲ５ＭＰ５Ｌとを １．２０の比で同時トランスフェクトした。条件は上記条件と殆ど同じであると しても、トランスフェクション効率は１０〜１００分の１であることが判明した 。４０クローンのスクリーニングは１０クローンが組換えヒト１ｇＧ４分泌に関 して陽性であることを示した。

抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０抗体のレベルを同様なやり方で測定したが、この場合 にはヤギ抗うットＩｇＧＦｃモノクローナル抗体（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、 イリノイ州、ロックフォード）をキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）試薬として用 い、ヒツジ抗ラットＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ抱合体（ザ　バイデ ィング　サイト。

カリフォルニア州、サンシエゴ）を検出試薬として用いた。

ならし培地中の抗体をプロティンＧ又はプロティンＡ／Ｇ　（ピアース　ケミカ ル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ））アフイニテイ　りロマトグラフイーを 用いる標準方法によって、クロマトグラフィー物質の製造者が述べているように 精製した。アミノ酸組成分析による測定によって、この精製抗体は９９％より大 きい純度であった。

ＪＥ’５Ｉ−３９Ｄ１０ハイブリドーマとクローンＣＪＡ２５とからの無血清な らし培地中の抗体も固定化ヒトｒＬ−５を含むカラムを用いるアフイニテイ　ク ロマトグラフィーによって精製した。これらのカラムは精製ヒトＩ　Ｌ−５をＡ ＦＦＩＧＥＬ−１５（登録商標）樹脂（／＜イオラド、カリフォルニア州　＋Ｊ ツチモンド）に結合させることによって製造された。

供給源の１つからのならし培地を負荷させた後に、カラムを１ノン酸塩緩衝生理 食塩水ＣＰ　Ｂ　Ｓ）と、ＰＢＳ＋０．５Ｍ　ＮａＣ＋とによって連続的に洗浄 し、次にＰＢＳと再平衡化させた。次に、ヒトＩＬ−５結合抗体をカラム力１ら ０，２ＭグリシンからｐＨ２，９５において溶離させ、その後、溶離タン／＜り 質をＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８）によって直接中和した。

このように精製した抗体の濃度は確定モル吸光係数を用−Ａて２８０ｎｍｉこお 番するＵＶ吸収によって測定した。精製タンノくり質を濃縮し、リン酸塩緩衝生 理食塩水（ｐＨ７，２）に対して透析し、還元性条件下で二通りの１０〜２０％ ゲル中でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動［５ＤＳ− ＰＡＧＥ、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０　（１９７ ０）］ｌこさらした。

電気泳動後に、一方のゲルをクマーシーブルーによって染色し、タンパク質帯を 可視化した。並行して処理したゲル中のタンＩくり質をアミノ末端配列分析によ ってＩＭＭＯＢＩ　ＬＯＮ　（登録商標）ブロー）ティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ ）　ｌこよって回収した。

この一工程精製方法を用いて、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる測定（こよると、回収タ ンパク質は９９％より大きい純度であると算出された。還元性条件下でＣよ、そ れぞれ免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖の既知分子量と一致する、５０キロダルトン と２３．２キロダルトンの見かけの分子量を有する２帯か観察された。

恢体待法化 二ヱエ三天工定数 ヒト化抗体がヒ）ＩＬ−５に特異的に結合する能力を有する力）苦力１を判定す るために、抗体／抗原複合体の見かけの解離定数を測定した。こ粗ヨ酵素イムノ アッセイ　プレートに５０ｍＭ炭酸水素塩緩衝Ｍ（ｐＨ９，５）中のマウス抗ヒ トＩｇＧ４−Ｆｃ　（５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／孔）を塗布することによって 実施した。次に、プレートを室温おいてＢＬＯＴＴＯによって９０分間プロ・ツ クし、３回洗浄し、３７℃において、精製した（０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度 で１００μｌ／孔）又はならし培地として（１００μｌ／孔）の０ずれ力馬のヒ ト化抗体の一方と共に２時間インキュベートした。

ならし培地からの組換え抗体分子はこれによって、定常領域と予め塗布した抗体 との間の相互作用によって固定されるので、試験抗体の可変領域は抗原との直接 の最大相互作用を可能にするように均一に配向した。

比較の基準を提供するために、キャプチャー抗体としてネズミ抗ヒトＩ　ｇＧ４ −Ｆｃの代わりにヤギ抗ラットＩｇＧ−Ｆｃを用いて、抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１ ０を並行分析した。

プレートを３回洗浄した後に、４．ｏｏｏｐＭ〜２ｐＭの濃度における１２５１ 標識ヒト■Ｌ−５の希釈シリーズを各プレートの孔に１００μｌの最終量で塗布 した。全ての試験孔は３通りに処理した。対照孔に無標識ヒトＩ　Ｌ−５の１０ ００倍モル過剰量を用いることによって、バックグラウンド結合を測定した。反 応を室温において２時間平衡させ、この時点において孔を吸引し、ＴＢＳＴによ って５回洗浄した。次に、孔を分離し、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　 Ｌ　Ｋ　Ｂγカウンター内で計数した。全ての非特異的結合対照は２通りに処理 した。結合ヒトＩＬ−５に関して得られた数値をスカチャード（Ｓｃａｔｃｈａ ｒｄ）分析（ＲＡＤＬＩＧソフトウェアを用いる）して、解離定数（ｋ　ｄ）値 を得た。

この分析からの結果は、ヒト化抗体ＣＭＸ５−１．２．３及び５に関して得られ たｋｄ値は全て大体同じ範囲内であり、抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０の値に近似す ることを示した。放射能が殆ど検出されず、用量反応が観察されなかったので、 ＣＭＸ５−４の見かけのｋｄを測定することはできなかった。

競合結金盆析 ヒト化が抗体ＪＥＳ＋−３９Ｄ１０の抗原結合領域に変化を導入したか否かを判 定するために、最終２０ｍＭ試薬濃度によってＸ−ＮＨＳビオチンキット（カル バイオケム、カリフォルニア州、ラジョラ）を用いて、野生型抗体をビオチンで 標識した。生成物をヒトＩＬ−５に対する直接結合ＥＬｒＳＡによって分析し、 見かけの５０％点の約３倍である濃度を競合分析に用いた。この濃度はビオチニ ル化抗体ＪＥＳ　ｒ−３９Ｄ１０約３０ｎＨに相当した。

競合分析を実施し、この分析ではヒトＩＬ−５を塗布したプレートへのビオチニ ル化抗体の結合を無標識抗体ＪＥＳｒ−３９Ｄ１０又は抗体ＣＭＸ５−１．０Ｍ Ｘ５−２若しくは０ＭＸ５−５の存在下で測定し、各抗体は予めプロティンＡ／ Ｇアフィニティ　りロマトグラフィーによって精製した。

ＥＬＡプレートを室温におＩ−’て０−　ＬＭ　ＮａＨＣＯｓ　（ｐＨ９，２） ｉ：よって１時間処理した。次に、ＴＢＳ中ヒトＩＬ−５を１００μｇ／孔にお いて加えた。プレートを４℃において一晩インキユベートした後に、３％ＢＳＡ −ＴＢＳｍｌによって室温において１時間ブロックした。２倍希釈競合抗体５０ μｌ十適当量のビオチニル化抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０　（５０μｌ量において も）を６孔に加え、プレートを室温において１時間インキュベートした。

次に、プレートをＴＢＳ−ツイーン２ｏによって５回洗浄し、１μｇ／ｍｌポー スラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレプトマイシン抱合体と共に 室温において１時間インキュベートし、ＴＢＳ−ツイーン２ｏによって５回洗浄 し、ＨＲｌｌｌｔＴＭＢによって発色させた。次に、サンプルの吸光度を４５０ ｎｍにおいて分光測光的に測定した。

無標識抗体Ｊ　ＥＳ　ｌ−３９Ｄ１０はそのビオチニル化形と約１１の比におい て競合するが、抗体ＣＭＸ５−１．２及び５によって同じ競合度を得るにはさら に多量の抗体を必要とすることを結果が示した。無標識抗体ＪＥＳ＋−３９Ｄ１ ０対ビオチニル化抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のモル比が１．　０であるとすると 、同程度の結合阻害を生ずるために必要な、抗体ＣＭＸ５−１．２及び５対ビオ チニル化ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０＋７）モル比は、それぞれ３．３．１．４及び１ ．４テあると算出された。

ヒトＩ　Ｌ−５レセプター　Ａのｔ トランスフェクトＣＯ８細胞上の組換えヒトＩＬ−５レセプターα鎖に対する放 射能標識ヒトＩ　Ｌ−５の結合をヒト化抗体ＣＭＸ５−１．２及び５が阻害する 能力の研究では、３抗体の全てがレセプター結合を阻害することが判明した。こ の阻害活性はならし培地と精製抗体の両方を用いて観察された。一定の０．５μ Ｍ濃度の標識Ｉ　Ｌ−５によって、レセプター結合の５０％阻害（ＩＣ，。）を 惹起するために必要な、抗体ＣＭＸ５−１．２及び５の濃度はそれぞれ、１．５ 〜３゜０．０．３５〜０．７及び０．　５〜１．１μＭであると計算された。野 生型抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０のＩＤ５ｏは０．１５−０．５５μＭであると判 明した。

０ＭＸ５−５Ｌの１ ５種のヒト化抗体の全てが、クローン化を容易にするために実施したＤＮＡ修飾 のために、Ｌ鎖の位置１０５にアスパラギン酸残基を含有した。ネイティブ配列 を復元するために、位１ｔ１０５のアスパラギン酸残基を抗体ＣＭＸ５−５のＬ 鎖中のグルタミン酸残基と取り替えた。これは、ＶＬｎｏカルボキシル末端ペプ チドとＣＬのアミノ末端ペプチドとが結合し、ＧＡＣがＧＡＧコドンへ変化した 配列に相当するアミノ酸配列を有する、８３２８９ＣＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

６６）と名付けられた合成オリゴヌクレオチドを用いて、達成された。このコド ン変化は５ａｌｌの代わりにＸｈｏｌ制限部位を生じた。

鋳型として０ＭＸ５−５Ｌ鎖を用いて、オリゴヌクレオチドブライマーＢ５２８ ９ＣＣとＡ２４９６ＣＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４）４ｍよってＰＣＲを実施 した。生成りＮＡフラグメントをゲル精製し、制限し、ｐｓＲｓベースドＣＭＸ ５−５Ｌ鎖ｃＤＮＡ中のＳａ！Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントと取り替えるために 用いた。修飾ＣＭＸ５−５ＬｉｍｅＤＮＡをｐＳＲ３から切断し、安定な表現の ためｌ：ｐＤＳＲＧにクローン化した。０ＭＸ５−２Ｈ鎖と修飾ＣＭＸ５−５Ｌ 鎖とから成る新しい変異体を０ＭＸ５−ＯＫＩと名付けた。０ＭＸ５−５Ｈ鎖と 修飾ＣＭＸ　５−５　Ｌ鎖とから成る、他の新しい変異体を０ＭＸ５−ＯＫ２と 名付けた。

生惣学的効果 ＩＬ−５ＣＤ１１ｂの １０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充し たイスコーブス改良ダルベア１１７培地（Ｉｓｃｏｖｅｓ’　ｌ１ｏｄｉｆｉｅ ｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＪＲＨバイオサイエンス（Ｂｉ ｏＳｃｉｅｎｃｅ））中に、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）サブクローン を保持した。ＨＬ、−６０は強力な（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）ヒト前骨髄細胞 ラインであり、酪酸塩又はヒｌ−Ｉ　Ｌ−５の存在下で、好酸球の表現型特徴を 表す細胞を生ずる［トモナガ（Ｔｏｍｏｎａｇａ）等、Ｂｌｏｏｄ６７：１４３ ３　（１９８６）；ファビアン（Ｆａｂｉａｎ）等、Ｂｌｏｏｄ８０ニア８８　 （１９９２）］−活性化されて、アレルギー患者の肺に補充される好酸球の表面 ではＣＤ１１ｂ／ＣＤ１Ｂと呼ばれる細胞接着分子の表現増加が観察されている ［ゲオラス（Ｇｅｏｒａｓ）等、Ａｍ、Ｊ、Ｒｅ５ｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ、７：２６１　（１９９２）］。

アッセイの前に、ＨＬ−６０細胞をアルカリ性培地（ＮａＯＨ又は炭酸水素ナト リウムによってｐＨを７．６〜７．８に調節）中での１週間の増殖によって分化 のために処理した（ｐｒｉｍｅｄ）。増殖期間後に、細胞を２４孔培養皿に２ｘ ｌＯ’細胞／ｍｌの密度で移した。連続希釈した試験抗体を一定量のヒトＩＬ− ５と共に３７℃において１時間ブレインキュベートしてから、細胞に加えた。培 養物中のＩ　Ｌ−５の最終濃度は１５０μＭであった。

７２時間後に、細胞を遠心分離によって回収し、１ｘｌＯ’細胞／ｍ＋の濃度で 再懸濁させ、５０μｍ量（５ｘｌＯ’細胞）を９６孔マイクロタイタープレート の孔に分配した。細胞を孔の中で乾燥させ、７０％エタノールで洗浄し、次にＴ ＢＳ−ツイーン２０で洗浄し、１０％脱脂ドライミルクと５％ＢＳＡとによって ブロックした。

一次抗体（マウス抗ヒトＣＤ１１ｂ；ベクトンーディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ− Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、マサチュセッツ州、プレイントリー）を加えた。３７℃ において２時間インキュベートした後に、プレートをＴＢＳ−ツイーン２０によ る３回洗浄、−次抗体に対する二次抗体（シャクソン　イムノリサーチＵａｃｋ ｓｏｎ　Ｉ■ｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ベンンルベニア州、ウェストグロー ブ）の結合、再びＴＢＳ−ツイーン２０による３回洗浄によって連続的に処理し た。次に、特異的に結合した抗体をＥＬＩＳＡ　アンプリフィケーション　シス テムス（ＥＬＩＳＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｇｉｂ ｃｏ−ＢＲＬ）によって検出した。

ヒト化抗体ＣＭＸ５−１．ＣＭＸ５−２及び０ＭＸ５−５か全てヒトＩ　Ｌ−５ のＣＤ１１ｂ誘導活性を阻害しうろことが判明した。相対的ＩＣ，。は下記のよ うに算出された ＋Ｃ，，モル比　ＩＣ１ｏ　ＣＭＸ５／サンプル　ＡＬＭと　旦ＭＸ旦２土に旦 　土見■−＾旦旦１旦ＣＭＸ５−１　１４６７　７．ａ　１　ｓ、ａＣＭＸ５− ２　４６７　２．３：１　２．８ＣＭＸ５−５　８００　４：１　４．８３９Ｄ １０　１６６　０．８３：１　１表から分かるように、ヒト化抗体ＣＭＸ５−２ と０ＭＸ５−５は抗体ＣＭＸ５−１よりも強力であるように思われた。

アレルゲン　マウス　の ヒト化抗体がインビボにおけるＩＬ−５の活性を中和しつるが否かを判定するた めに、若い雄Ｂ６Ｄ２Ｆ１／Ｊマウスをミョウバン沈降オボアルブミンによって 、−匹につき８ｍｇを用いて感作した。１週間後に、ブースター投与した。５非 感作対照マウスの群を除いて、他の全ての群は６マウスを含有した。

ブースター投与後の１週間目かつ試験前に、感作動物に試験抗体を０．　５ｍｌ 量で腹腔内注入した。各群は下記の１種類を受容した：抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１ ０　０．１ｍｇ／体重ｋｇ、抗体ＪＥＳＩ−３９Ｄ１０　’１ｍｇ／体重ｋｇ、 抗体ＣＭＸ５−１　１ｍｇ／体重ｋｇ、及び抗体ＣＭＸ５−１　１０ｍｇ／体重 ｋｇ０ＴＲＦＫと名付けられた抗体、ラット抗マウスＩＬ−５モノクローナル抗 体（シュマーヘル（Ｓｃｈｕ■ａｃｈｅｒ）等、上記文献）を陽性対照として用 いた。対照の感作マウスは生理食塩水を受容した。

次に、動物をオボアルブミンエーロゾルによって１時間、２回試験した。試験の ２４時間後に、気管支肺胞洗浄（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ　ｌａｖａ ｇｅ）、末梢血及び肺組織の標本を採取し、固定し、好酸球特異的染色染料によ って発色させ、顕微鏡によって検査して、好酸球分布を調べた。

抗体ＣＭＸ５−１を１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で受容したマウスでは、それらの 気管支肺胞洗浄流体中の好酸球数が有意に減少することが判明したが、他の細胞 種類ではより軽度の変化が観察された。抗体ＪＥＳ　ｌ−３９Ｄ１０を受容した マウスも好酸球レベルの低下を示した。

ニヱノユ上二ヱ蚕肚 モノクローナル抗体Ｊ　ＥＳ　１−３９Ｄ１０を産生するハイブリドーマ細胞ラ イン（ＪＥＩ−３９Ｄ１０．１１）は１９９２年１月８日にアメリカン　タイプ カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）（メリーランド州、ロックビル）に寄託 され、受は入れ番号ＡＴＣＣＨＢ１０９５９を与えられた。これらの寄託は特許 目的のための培養物寄託に関するＡＴＣＣ協定に定められた条件下でなされ、こ の協定は寄託物が３５ＵＳＣ１２２及び３７ＣＦＲ１，１４に準じて米国特許局 長（ＵＳ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎｅｒ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ　ａｎｄ丁ｒａｄ ｅ＋５ａｒｋｓ）に入手可能であり、米国特許の発行後は公衆に入手可能になる ことを保証し、寄託物が維持されることを必要とする。寄託菌株の入手可能性を 政府の権限でその特許法に従って与えられる権利に違反して発明を実施するライ センスと解釈すべきではない。

当業者に自明であるように、本発明の要旨及び範囲から逸脱せずに、本発明の多 くの変更及び変化が実施可能である。ここに述べた特定の実施態様は例としての み提供するものであり、本発明は請求の範囲によってのみ限定されるものである 。

配列一覧表 （１）一般情報 （ｉ）出願人、チョウ、チュウアンーチュウ（Ｃｈｏｕ、　Ｃｈｕａｎ−Ｃｈｕ ）ムルゴロ、ニコラス（ｉｌｕｒｇｏｌｏ。Ｎ１ｃｈｏｌｕｓ）アブラムス、ジ ジン（Ａｂｒａｍｓ、　Ｊｏｈｎ）ジエーン、チュングハ−（Ｊｅｈｎ、Ｃｈｕ ｎｇ−１１ｅｒ）ペトロ、マリ−（Ｐｅｔｒｏ、　Ｍａｒｙ）シルバー、ジョン （Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊａｎ）チンダル、ステファン（Ｔｉｎｄａｌｌ、　５ｔｅ ｐｈｅｎ）ウィンドソア、ウィリアム（ｆｉｎｄｓｏｒ、　ｆｉｌｌｉａｍ）ザ ボドニー、ポール（Ｚａｖｏｄｎｙ、　Ｐａｕｌ）（ｔｉ）発明の名称：ヒト　 インターロイキン−５に対するヒト化モノクローナル抗体の設計、クローン化及 び表現 （ｉｉ）配列数＝６６ （ト）通信宛て先 （Ａ）　受（８人：シャーリング−ブラフ　コーポレーション（Ｓｃｈｅｒｉｎ ｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｂ）街：ワン　ギラルダ　ファ ームス（Ｃ）市：マジソン （Ｄ）州二ニューシャーシー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　０７９４０−１０００（マ）コンピューター読み取り可能形 ：（Ａ）　ｍ体１１１１：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータｍ：アップル 　マツキントラシュ（Ｃ）操作システム：マツキントラシュ６．０．　５（Ｄ） ソフトウエア二マイクロソフト　ワード４．　０ＯＢ（＠）本出願のデータ： （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の情報。

（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ、３８４塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー、線状 （Ｕ）配列表示：ＳＥＱ　ｒｐ　ＮＯ：２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情 報−（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ、３９塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｎ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＡＧＴＣＴＡＧ入ＡＧ　ＣＴＴ（ｓ へＡＴＣ丁Ｇ　ＧＡＧＧＪ！ＧＧＣτＴＧＧτ入ＣＡＧＣＣ３９（２）ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ・４の情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ・５８塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｙｊ）配列表示：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：４：ＣＡＧＣＣＣＧＧＧ＾　＾τＴＣ ＧＴＣＧＡＣ？ＣＡＣＴＧＣＣＡＴ　ＧＴττＣＴＴＴＣτ　丁ＴＡＣＡＴＴＧ ＡＧ　ＣＴＴＧＣＴＧＴ　T８ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の情報。

（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ・３６塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｘｉ）配列表示・ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５゜ＧＣＡＡＧＣＴτｃａ　＾丁ＣＣ ＡＧ入ＣＡＧ　Ｑ＾ＣＡＣＡＧＧＣＣ＾ＧＡＣ＾Ｔ３６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：６の情報。

（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トボロンーー線状 （ｊ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６ＣＡＣＧ入ＡＴ”ＣＴ　ＧＣＡＧＴＧ ＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＣＴ　ＴＴＧＧＧＴＣ丁　３８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯニアの情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　１１４塩基対 ＣＢ）種類　核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｙｊ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア。

（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ・１３１塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （Ｘｊ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９の情 報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ・６６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー二線状 隋）配列表示、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・９゜（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の情 報：（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ：４８塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｍ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１０゜八ＧＣＴＣτＡＧＡＡ　丁τＣＴ ＧＣＡＧＴＣｋｋｃＡｃＴｃＪττ　ＣＣＴＧ丁丁Ｇ入ＡＧ　ＣＴＣττＧ入Ｃ ４１１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の情報（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ・１０２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘｉ）配列表示　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１１：ＧＣＴ（、入Ａτ丁ＣＧ　ＣＣ ＧＣＣＡＣＣＡＴ　ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣτ丁 八Ｇτ　＾へＣＡＡＣＡＧＣH　６０ ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴ　ＣＡＡＡＣＴＧＧＴＡ　ＣＡＡＧ ＣＴＧＧＡＧ　ＧＴ　１０２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２の情報（ｉ）配列 特徴・ （Ａ）長さ、１０２塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖・−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘｉ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ３の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ　８６塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｉ）配列表示：３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１３・ＧＴＣＡＧｋＣＴＡＧ　丁＾ＡＴ ＡＧＴＧＴＧ　入入ＣテＧＧＡＴｋＣＧＧｃＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧ −、ＣＴＧＱＡＧＴＧＧＧ@６０ ττＧＣＡＣτ＾＾τ　＾τＧＧｋＧＴｋＡＴ　ＧＧＡＱＡＣ１１６（２）ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ＋１４の情報：（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ・７３塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｎ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＧＴ＾ＣＴＣ〒入Ｇλ　Ｇ＾τＴ ＧτＧλ＾τ　ＣＧλＧ＾丁Ｔ？Ｇ＾　Ｔ＾ＧＣ？ＧＡ入Ｔ？　ＡＴＡＡＴＣ丁 ＧＴＧ　ＴＣフＣ（Ｊτ丁`Ｃ６０ 丁ＣＣＡＴｋττ＾ＧＴＧＣ７３ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：１０４塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｘｊ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ６１７）情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ、９９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｘｊ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６：（２）ＳＥＱ　ｆＤ　ＮＯ：１ ７の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：９４塩基対 （Ｂ）櫂Ｗ：核酸 （Ｃ）鎖・−水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （Ｕ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７：ＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧ　ＣＣＧＣ ＣＡＣＣＡＴ　ＧＧＧＡ？ＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＩＪ？Ｃ？ＴＧＧ テ　ＡＧｃ八＾へＡＧＣＴ@６０ ＡＣＡＧＧＴＧＴ（ＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴ　ＣＣＡＧ＾τＧ＾ＧＡ　ＣＡＧτ 　９４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１８の情報−（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　８３塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｎ）配列表示・ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１８：ＡＧＣＡＴＣＴＡＧＡ　ＧＧＴＧ ＡＣＣＣＴＡ　ＴＣＴＣＣＱＡＣＡＧ　ＡＴＡＣＡＧＡＣＡＧ　ＣＱｕＣＴＴａ 　ＧＡＣＴＧＴＧτＣ入　U゜ 丁ＣＴＧＧへτＧ’ｒＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡ　ＣＣＴ　８３（２）ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ・１９の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：１０１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ＸＩ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９・（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ０の情報。

（１）配列特徴 （Ａ）長さ　８４塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘＪ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０八τＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧ ＣＣＡＣＴ　ＬｊＪ＋ＴＣＴＴＧ）＋Ｔ　ＧＧＴｋＣＴＣＣＡＧ　ＴＣ？ＧＣＡ ＡＧＣ−、ＡＴ”ｒｃＧｃ`ｃｃＡ　６０ 丁八へ八へＣＡＧＱＡ　ＧＣ丁τＡＧＧＡＧＣτλＧＣ８４（２）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ＋２１の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ・８１塩基対 ＣＢ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２１：ＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣ’ｒ ＡＣＡＧＡＣＴ　ＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴｋＣＡＧＣＣ τＧＡ＾Ｇ八丁入τＣＧＣ６O へＡＣＧτ入ττＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴ　ＣＨ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２２の情報。

（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さニア６塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｙｊ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２：ＧＣ入ＴＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣ ＴＴＧＧＴＧ　ＣＩＪＴＣＡＣＣＣＡ　ＡＴＧ？１ＪＴＣＧＧ　ＧＡＡＣＴＴＡ ＴＡＣＧＡＣＴＧＴＴＧＡＣf。

ＡＧ丁入＾τＡＣＧＴ　ＣＧＣＧ＾丁　７６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２３の 情報。

（セ）配列特徴・ （Ａ）長さ・７０塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖・−水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ＸＩ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２３・（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ４の情報工（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　７９塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ５１７）情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ、６８塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖・−水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （Ｕ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５ＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣτＡＧＧＴ ＧＧＡＣｃＡＴＣｋＧＴＣＴＴ　ＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧ　ＣＣＴＡＡＧＣＣＣ入 　ＡＧＧＡＣ＾ＣτＣＴＣＡＴＧ八τＣτ　６８ （２）ＳＥへ　ＩＤ　ＮＯ：２６の情報（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ＝５１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ＸＩ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２６ＣＡＧＧＪＧＴＣＧ　ＡＣ＋ｒＣ （ａＡＧＧｃで　Ｇ入ＣＣ〒τ丁ＧＧＣτττＧＧＡＧＡＴＧ　ＧＴ’！’？τ Ｃ丁ＣＧＡＴＳ１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７（７）情報：（ｉ）配列特徴 ： （Ａ）長さ　３８塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７：ｃｒ入Ａｃｃｃｔｃｃ　ＡＣＴ ＣＱＡＱＡＧＣＣｋＣＡＧＧＴＧＴｋ　ＣＡＣＣＣＴＧＣ３８（２）ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：２８の情報（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ　４０塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー：線状 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２９の情報（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ＝１９６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｍ）配列表示：ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：２９：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３０ の情報・（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ　２１３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ＸＩ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ １．（７）情報。

（１）配列特徴。

（Ａ）長さ　１９０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘＪ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ ２の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ　２０７塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （Ｕ）配列表示・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２（２）ＳＥＱ　［）ＮＯ：３３の情 報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ：３２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖−一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｘｉ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３：ＧＣＡＴＧＣＧＴＣＧ　ＡＣＧ ＴＣＡＡＡＣＧ　ＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴ　ＧＣ３２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ３４の情報：（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ：１１１塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｎ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４：ＧＡＴＣＡＡＧＣフ丁　ＱＡ＾丁 τＣτ入ＡＣＡＣＴＣ丁ＣＣＴＣＴ　ＧＴＴＧ入ＡＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧｋＣＴ Ｇ　ＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧ@６０ ＧＣＣＴＴＧＡＴＣＡ　ＧＴＧＡＣＴτ（ＧＣＡＧＧＣＧＴＡＧＡＣＴＴＴＧＴ ＧＴＴ？ＣＴＣＧＴ入ＧＴＣ）ＧＣＩＬ１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３５の情 報（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ・１１７塩基対 ＣＢ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３６ の情報。

（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：１１６アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子種類：タンパク質 （ｘｌ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６：Ｖａｌ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　Ｖａｎ　５ｅｒ　Ｓ＠ｒ（２）ＳＥＱ　ＩＩ）ＮＯ＋３７　ｃｏ情報・（ｉ ）配列特徴 （Ａ）長さ：１０８アミノ酸 （Ｂ）種類、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｘｉ）分子種類・タンパク質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７：Ｍ＠ｔ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅ ｒ　Ｃｙｓ　Ｘｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌ＠ｕ　！’Ｍ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈ ｒ　λ工１　τｈｔＧユｙＶａｌ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　 Ｍｅｔ　τｈｆ　Ｇｉｎ　Ｓｅｘ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　５ｅｒ　 Ｖａｌｌ　５　１゜ Ｓｅｒ　Ｖａ工Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｘ１＊　Ｔｈｘ　Ｃ ｙｓ　！ａｕ　Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ工１ｅｉｓ　２０　２５ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｔ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　 Ｌｙｓ　ｉ’ｚｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙ■ Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｔ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ａｓｎ　Ｓｅ＋：　Ｌｅｕ 　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　νａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　入ｚX Ｐｈｅ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｘ　ｋｓｐ　 Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｘ　Ｚｌｅ　Ｓｅｒ　５ａｒＬｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ工１ｅ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙ【Ｔｙｔ　Ｃｙａ　Ｇｉｎ　 Ｇｉｎ　Ｓｅｘ　Ｔｙｔ　Ｌｙｓｌｌｏ　ａｓ　９０ ｔｈ＠　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ｖａｎ　Ｌｙｓ　’Ａｒｇ９５　１ｏｏ　１０５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋３８の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ、４２塩基対 （Ｂ）種類−核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８：ＱＡＴＣＴＣＴＧＣＧ　ＡＣＴ ＧＡＧＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＣＴＧ　ＧＧττＣＡＣＡττＣτ　４２（２） ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３９の情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　４２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘｌ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９：ＣＴＡＧＡＧＡＡＴＧ　ＴＧＡ ＡＣＣＣＡＧＡ　ＴＧＣＧＡ？ＧＣＡＡ　ＣＴＣＡＧＴＣにＣＡ　ＧＡ　４２（ ２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４０１７）情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ：１１６アミノ酸 ＣＢ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （＋１）分子種類、タンノ（り質 （ｍ）配列表示：ＳＥＱ　［）　ＮＯ：４０：Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ 　Ｃｙｓ　ｒｌｅ　Ｘ１＠　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入１＆　Ｔｈｒ 　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｇ１’^ −Ｉｓ　−１０−５ Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　 入１ａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａ ｒｑ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　ＩＩｓ　入１ａ　Ｓ ａｔ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅｌｓ　２０　２５ Ｓｅｔ　Ｓｅｔ　八ｓｎ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　八ｓｎ　τｑＸＬｅ　入ｒｇ　Ｇｉ ｎ　入１ａ　ｆ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　１＜ｕＧｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａ ｌ　入１ａ　Ｌｅｕ　工ｌｅ　Ｔｒｐ　Ｓｅｘ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈ ｚ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ｈｓｎ　５ｅｒ５０　５５　６Ｇ Ａｌｌｌ　ｘｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ｐｈａ　丁ｈｒ　ＸＬｅ　Ｓｅｒ 　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｔ　τｈ■ ６５　７０　７ｓ Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ＾ｓｎ　Ｓｅｔ　Ｌａｕ　Ａｒｇτｈ ｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐτｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＴｙｒＰｈｅ　Ｃｙｓ　八１δ　 八ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｆ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　ｋｓｐ　Ｔｙｔ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　０１７ｇ５　１００　１０５ Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　５ｅｒ　５ｅｔ１１０　ｕｓ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１の情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ一１０８アミノ酸 （Ｂ）種類　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子種類　タンパク質 （ＸＪ）配列表示　ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：４１：Ｍｅｔ　ＧＬＹ　Ｔｒｐ　Ｓａ ｔ　Ｃｙｓ　ＩＬｅ　１１ｅ　Ｌａｕ　ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｔｈ ｆ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙｖａｌ　ＨＬｓ　Ｓｅｒ　入ｓｐ　Ｘ１ｅ　Ｇｉｎ 　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｓｅｘ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ 　Ｖａ１Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｎ　Ｔｈｆ　Ｉｌ＠　 丁ｈｆ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＧＬｕ　Ｇｌｙ　ＸＬｅＳｅｒ　Ｓ ｅｒ　Ｔｙｆ　Ｌａｕ　入１＆　Ｔｒｐ　Ｔ％　Ｇ工ｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ｐｉｏ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｌａｕ　ＩＬｅ　Ｔｙｔ 　Ｇｌｙ　入１ａ　入ｓｎ　Ｓｅｅ　ｌｚｕ　Ｇｉｎ　テｈｒ　Ｇｌｙ　ＶａＬ 　Ｐｙ：ｏ　Ｓａｔ　λｒ■ ｓ　ｏ　５５　６０ １？ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　入１＆　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ｐｈｅ　Ｔｈｆ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌ＠　Ｓａｔ　Ｓｅ■ ６５　’＋０　７５ しｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ｉｌａ　入１轟　Ｔｈｒ　丁ｙｒ　 Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓａｃ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ８０　８５　９Ｇ ｔｈ＠　Ｐｔｏ　八ｓｎ　Ｔｈｆ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｌ　入：ｑ９５　１ｏｏ　１０５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２の情報：（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ　９５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 −Ｃ）鎖・−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３ の情報：（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ　１０８塩基対 ＣＢ）種類　核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ ４の情報（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ、１０３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （幻）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４・入＾ＧＣ［、入↑ＣＴ人　ＧＡＡ ＡＴＧＡＣτｃｃ入ＡＧ入＾Ｃ＾ｃｃｃ丁Ａ丁八〇〇ＴＡＣへ〇へτＧ入＾ＣＧ Ｇ　ＴＣτＧＣ入＾ＧＣτ@６０ ＧＡＡＣ；ＴＡＡＧＴＧ　ＣＭＴＣＴＡＣＴＴ　ＣＴＧＴＯＣＴＣＧＴ　ＧＡＧ ＴＡＣＴＡＴＧ　ＧＡτ　１０３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４５の情報：（ｉ ）配列特徴： （Ａ）長さ、９３塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５：ＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴ　τＣ＾ τＧＴＣＧλＣＧＣＴＧ入ＧＧ＾Ｇ入　ＣτＧＴＧＡＣτＡＧ　ＣＧ丁ＡＯＣＴ τＧ＾　ＣＣＣＣλＡτＡＧ■@６０ ＣｅＴＡＴＣＣＡτＡＧＴＡＣＴＣＡ　ＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡ　ｋＧＴ　９３（ ２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６の情報：（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ、１１６アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉｉ）分子種類、タンパク質 （Ｕ）配列表示・ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４６Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　５ｅｒ　 Ｃｙｓ　ｍｌｅ　１１＠　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　入１１　Ｔｈｒ　 ＡＬａ　Ｔｈｒ　ＧＬｙＰｒｏ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｓｔｃ　Ｌｅｕ　Ａｃｑ　Ｌ ｅｕ　Ｓｅｔ　Ｃ１，＋３　ＡＬａ　ＶａＬ　Ｓｅｔ　ＧＬｙ　Ｌａｕ　Ｓｅｔ 　Ｌ■■ ｉｓ　２０　２５ τｈｒ　５ｅｒ　Ａｓｎ　５ａｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　’ｒｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ 　Ｇｉｎ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＬａｕＧＬｕ　Ｔｔｐ　Ｖ ａＬλＬａ　Ｌａｕ　Ｘｉｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｘ＾ｓｎ　Ｇｌｙ＾３ｐτｈｒ＾ｓ ｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　５ａｒｘｌａ　Ｘｉ＠　Ｌｙｓ　Ｓｅｘ　Ａｚｇ　Ｐｈｅ 　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　５ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ 　τｈｒＬ４ｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｍ＠ｔ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｇｉｎ　入Ｌａ　ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｓｉｒ　＾ユ島　工１ｅ　↑ｙｘＢＯ８５９ ０ Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　ＴｙＴ：　Ｔｙｚ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ 　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌ■ 〒ｈｔ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ（２）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：４７の情報・（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ、１０８アミノ酸 （Ｂ）種類、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （■）分子種類：タンパク質 （ｎ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７Ｍａｌ：　Ｇｌｙ　Ｔｔｐ　Ｓｅｔ 　Ｃｙｓ工Ｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｓｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａ工１τｈｒ＾ｌ ａ　Ｔｈｚ　ＧｌｙＶａｌ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ 　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｓａｒ　１ｊｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａ ■ ｌ　５　１０ ５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　＾ｒｇＶδｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｃ ｙｓ　Ｌａｕ　八Ｌａ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　ＧＬｙ　ｌ１ｅＳｅｔ　Ｓａｔ　Ｔｙ ｔ　Ｌａｕ　ＡＬａ　丁ｒｐ　Ｔｙｔ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ｐｆｏ　Ｌｙｓコｏ　３５　４０　４５ Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＺＬｅ　Ｔｙｔ　Ｇｌｙ　入ユａ　Ａｓｎ　５ｔｌＺ　Ｌａｕ 　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　ｓｅｔ　＾ｒX Ｐｈｅ　Ｓｓｚ　ＧＬｙ　Ｓｅｘ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　へ１晶　丁ｈｒ　Ａｓｐ　 ｔｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｓａｒ　５ａｒしａｕＧ工ｎ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｎ　へｓｐｙ工七　入１ａ　テｈｒ　Ｔｙｒ　ＴＹＫ　Ｃ２０Ｇｉｎ　 Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｌ７３ａｏ　ａｓ　ｓ。

ｐｈｅ　Ｐｘｏ　Ａａｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌ、ｙｓ　八ｒ９９５　Ｗｏｏ　１０５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８＋７）情報（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ　９７塩基対 ＣＢ）種類、核酸 （Ｃ）鎖、一本節 （Ｄ）トポロジー・線状 （ＸＩ）配列表示：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ・４８゜（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ ９の情報。

（１）配列特徴 （Ａ）長さ　１０８塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖　一本節 （Ｄ）トポロジー・線状 （ＸＩ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９・（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５ ０の情報←０配列特徴 （Ａ）長さ、９０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　一本節 （Ｄ）トポロジー　線状 （ＸＩ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５Ｏ−ＧＴＧＧＧＴＴＧＣＡ　Ｇτ入 Ａ丁八へｃｃ八へＧτ入＾τｃｃλτＣ９Ｃ）（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１ の情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　８５塩基対 ＣＢ）種類：核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （Ｘｉ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５ ２の情報：（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ、９５塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖、一本節 （Ｄ）トポロジー　線状 （幻）配列表示・ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３ の情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ、１００塩基対 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖　一本節 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｊ）配列表示：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５３：＾ＣＧＡＧＡＡＧＣτ　τＣＡ ＴＧτＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡ　ＣＴＧＴＣＡＣＴＡＧ　ＧＡＣＡＣＣＴ ＴＧＡ　ＣＣＣＣＡＡＴＡＧs　６０ ＣＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＴＡＧＴＡＣＴＣＡ　ＣＧＡＧＣＡＣＡＧＴ　ＡＧＴ八 ＧへＣＡＧＣ１００（２）ＳＥＱ　［）　ＮＯ：５４の情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ一１５３塩基対 （Ｂ）Ｎ類、核酸 （Ｃ）ｊｌｌ　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘｌ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５ の情報−（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　１５０塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖・−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｘＩ）配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５：ＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧ　ＣＣＡ ＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＯＴＡＣ１５０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６の 情報：（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　１１７アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （Ｘｌ）分子種類・タンパク質 （ｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６：Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｚ 　Ｃｙｓ　工ｌｅ　工１ｅ　Ｌ４ｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｔｈｒ 　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ−１ｓ　−１０ Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　 Ａｌａ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎ１５１゜ Ｐｒｏ　Ｇｌｌ／　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＸＡｕ　Ｓ酊　Ｃｙｓ　 工１ｅ　入１ａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　しｅｕ１５　、　２０　２ ５ Ｔｈｚ　Ｓｅｔ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　 Ｇｉｎ　入１ａ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＬａｕＧ１ｕ　Ｔｒｐ　Ｖ ａｎ　Ａｌａ　Ｖａｎ　ＸＬｅ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａ ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｔ　Ｇｌｙ＾ｓｐ　Ｓｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙ５　Ｇｌ ｙ　Ａｒｑ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　！工ａ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅ ｒ　Ｌｙｓ　八ｘｑＴｈｅＬｅｕＴｙｒＭｅｅＧｉｎＭｅｅ＾ａｎＳｅｒＬａｕ ＡｒｑＴｈｔＧ上ｕＡａｐＴｈｅＡｌａＶａｌ！１０　８５　９０ τｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 ＴｙＴ：　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｔｐ　Ｇｌｙ　Ｇ１■ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　５ｅｒ　５ｅｒ（２）ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：５７の情報：（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ、１０８アミノ酸 ＣＢ）種類−アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉｉ）分子種類：タンパク質 （ｉ）配列表示　ＳＥＱ　［）ＮＯ：５７：Ｍｅ＋：　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ 　Ｃｙ５１１＠　工１＠　Ｌ＠ｕ　ｔｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　τｈｒＧユｙＶａｌ　ＨＬ５　Ｓｅｒ　ｋｓｐ　ＸＬｅ　Ｇｉｎ　Ｍｅ ｔ　Ｔｈｚ　Ｇ工ｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｉ　Ｌｅｕ　Ｓｅｆ　Ｖａ ｌｌ　５　１０ Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｘｌｅ　Ｔｈｒ　 Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　入１ａ　Ｓｅｘ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔ ｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　丁ｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ｆ’ｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　八Ｌａ　Ｐｔｏ　Ｌｙ■ Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｘｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｚｇ　 ＧＬｕ　入Ｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　１）ｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｘ■ Ｓｏ　５５　６０ Ｐｈａ　ｓａｒ　ＧＩＹ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌｐ　 Ｐｈａ　Ｔｈｒ　ＩＪｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　５ｅｒＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ＾Ｌ＆τｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ 　Ｇｉｎ　Ｓｅｒτｙｔ　Ｌｙｓ８０　Ｂｓ　９０ Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｔ　 Ｌｙｓ　ＶａＬ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＬＹ３　＾ｒ９９５　Ｚｏｏ　１０５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８（７）情報・（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ、９８塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｎ）　配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８：ＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴ　ＡＧＡ ＴＣＴＣＴＧＣｃ入ｃＴＧＡＧＴ？Ｇ　ＣＡＴＣＧＣＡＴＣＴ　ＧＧＧＴＴＣＡ ＣＡＴ　ＴＣＴＣＴＡＧＴＡ`　６０ ＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧ　ＣＡＡＧＧ ＧＴＣ９Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９＋７）情報：（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ　１１３塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）ｍ　−水路 （Ｄ）トポロジー　線状 （３Ｊ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９：ＡＣＧＡＴＣＡＣＴＣＴＡＧＡ ＧＡＴＴＧＴ　ＧＡＡＴＣＧＡＧＡＴ　ＴＴＧＡＴＡＧＣＴＧ　入ＡＴＴＡＴＡ Ａ？ＣＴＧＴＧＴＣ？ＣＣＡ@６０ ＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡ　ＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡ　ＣＣＣＴ ＴＧＣＣＡＧ　ａｒｃｃｔｔｃｃｃｃ　ＴＡＣ１Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ６０（１’）ｔｊｌ報（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ、９１塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖　−水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （Ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０：ＧＣＪＴＧＧＡＣＧＴ　ＣτＡ ＧＡＧＡｃＡＡ　ＴＴＣＧＡＡＧＡＧＡ　ＡＣＣＣＴＡＴＡＣＡ　ＴＧＣＡＧＡ ＴＧ入Ａ　ＣＡＧＴｃτＧＡfＡ　６０ ＡＣＴＧ入ＡＧＡＴＡ　ＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡ　ＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴ　Ｃ９１ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１の情報（ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ　１２０塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖、−水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｘＩ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋６ ２の情報。

（ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　２８塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー二線状 （凋）配列表示＋ｓｇｑ　ＩＤ　Ｎｏ・６２゜ＡＣＡＧＴＣＣＧτテ　ＴＧＡＣ ＧＴＣＣ八ＣＣＴτＧＧへＧＣ２Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３の情報・（ ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ・６３塩基対 （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３：ｒＩ）ｚ　ｃｈｎ　Ｉｎ　ＮＯ１ ’ｉＦ＋の惰！ｇ＝（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４（７）情報：（ｉ）配列特 徴。

（Ａ）長さ　１１６アミノ酸 （Ｂ）種類　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｎ）分子種類　タンパク質 （ｉ）　配列表示：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：６４Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓａｗ 　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　工１＊　Ｌａｕ　Ｐ？ｌ＠　Ｌｅｕ　Ｖａｎ　Ａｌａ　Ｔｈ ｔ　八１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌ■ −１ｓ　−１０−５ ＶａＩ　ＨＬｓ　Ｓｅｒ　ＧＩｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　 入１ａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　Ｓｅｔ　Ａ ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎτりνａｌ　ｈｔｑ　Ｇｉｎ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　１＜ｕＧＬｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｉｌ ａ　Ｔｒｐ　Ｓ＠ｘ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　τｈ【Ａｓｐでｙｘ　入Ｂｎ　 Ｓｅ＋ｚ＾Ｌａ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　５＠ｒ　ｋｔｑ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　ＸＬｅ　 Ｓｅｘ　ｈｘｑ　Ａｓｐ　八ｓｎ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　丁ｈｘ６５　、　 ７０　７５ ｔａｕ　ＴＹＫ　’Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　八ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　入ｒｇ 　Ｔｈｚ　Ｇ工Ｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　入よｍ　Ｖａｌ　Ｔｙ■ ｇｏ　８５　９０ Ｔｙｔ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｔ　 Ｐｈ＠Ａｓｐ　Ｔｙｒτｔｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ９５　Ｗｏｏ　１０５ ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　５ｅｒ　５ｅｒ（２）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：６６の情報：（１，）ｂＷＷＩυＩＮＶυＪＶノ１ＭＷＫ・（ｉ）配列 特徴 （Ａ）長さ　１０８アミノ酸 ＣＢ）種類　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉｔ）分子種類、タンパク質 （Ｕ）　配列表示　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６５：Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓａ ｔ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｘｌ＠　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈ ｘ　入よａ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＶａｌ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　！ｉｓ　ＧＩｎ 　Ｍｅｔ、Ｔｈｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｘ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ 　Ｖａｌｌ　５　１０ Ｓｅｔ：　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｔ＋ｒ　Ｉｌａ　Ｔｈ ｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　λよａ　Ｓａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＸP＊ Ｓｅｒ　Ｓｅｔ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　 Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＬ＠ｕ　Ｌ、ａｕ　 Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　ＧＬｙ　入１ａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ｋｕ　ＧＩｎ　Ｔｈｚ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　＾ＫｑＳＯ５５６０ Ｐｈ＠　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　八ｓｐ　 Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｉ’ｈ＠　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｘ　５ａ■ Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｋｓｐ　！ｌ榔ｕａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙ ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　５ｅｓｒτｙｒ　ＬＹ３ｇｏ　ａｓ　ｓ。

Ｐｈ＠　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｈｆ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｘ　 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　＾ｒｇ（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ・４０塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖ニー水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｎ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６：ＡＧＣＧＡＧＣＧＣＴ　ＣＧＡＧ ＧＴＣＡＡＡ　ＣＧＧＡＣＴ（ａＴＧＧ　ＣＴＧＣＡＣＣ入τ（４０手続補正書 （方式） 平成　７年　２月２日 特１″Ｆ′庁長官　高　島　章　殿　１叫１、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９３１００７５９ 平成　５年特許願第５１４１０４号 ２、発明の名称 ヒトインターロイキン−５に対するヒト化モノクローナル抗体の設計、クローン 化および発現 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　シエリング・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　７年　１月３１日　（発送日）６、補正の対象 国際調査報告　。、７□ＢＩ　Ｑｊ／１１１１ｆｆ！。

フロントページの続き （５１）　ｉｎｔ、ｃｌ、６　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０２ １５１０９　ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ａ６１Ｋ　３９／３９５　ＡＢＡ　Ｕ　９２８４−４Ｃ９２８１−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ、ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ 、ＳＤ、ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ（７２）発明者　エイブラムス、ジョン・ニスア メリカ合衆国カリフォルニア用９４００２゜ベルモント、オーク・ノウル・ドラ イヴ（７２）発明者　ジエン、チュンーハーアメリカ合衆国ニューシャーシー州 ０８８２０゜エディソン、ドッグウッド・ドライヴ　７Ｉ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ｃ （７２）発明者　ペトロ、メアリー・イーアメリカ合衆国ニューシャーシー州０ ７４３５゜グリーン・ポンド、クリフサイド・レーン（７２）発明者　シルヴア ー、ジョン・イーアメリカ合衆国カリフォルニア用９５１３０゜サンノゼ、ター ンウッド・コート　３６３９（７２）発明者　ティンダル、ステイーブンアメリ カ合衆国ニューシャーシー州０７９４０゜マディソン、バーンズデール・ロード 　４゜（７２）発明者　ウィンザー、ウィリアム・ティーアメリカ合衆国ニュー シャーシー州０８８１６゜イースト・ブランズウィック、ゲージ・ロード　４６ （７２）発明者　ザヴオドニー、ボール・ジエイアメリカ合衆国ニューシャーシ ー州０７０９２゜マウンテンサイド、セントラル・アヴエニュー　２７９

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０ ９５９で寄託された細胞系統の同定特性を有するハイブリドーマにより産生され るモノクローナル抗体。
2. ２．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０ ９５９で寄託された細胞系統の同定特性を有するハイブリドーマ。
3. ３．配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：１もしくは配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ 〕：２により定められるアミノ酸配列またはそれらの配列のサブ配列を有する、 モノクローナル抗体の可変領域を含むポリペプチド。
4. ４．配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：１により定められるヌクレオチド配列の 約１２−３３３塩基、および配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：２により定めら れるヌクレオチド配列の約９−３８４塩基からなるか、またはそれらの配列の機 能性均等物である、単離されたＤＮＡ。
5. ５．請求の範囲第４項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
6. ６．請求の範囲第５項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
7. ７．請求の範囲第６項に記載の宿主細胞を該ＤＮＡが発現される条件下で培養す ることを含む、ポリペプチドの製法。
8. ８．ヒトインタ一口イキン−５に特異的に結合し、かつ請求の範囲第１項に記載 のモノクローナル抗体のＨ鎖またはし鎖可変領域のＣＤＲを含む、キメラまたは ヒト化モノクローナル抗体。
9. ９．アミノ酸残基２０から開始し、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：３６、３ ７、４０、４１、４６、４７、５６、５７、６４または６５により定められる配 列を有するＨ鎖および／またはＬ鎖可変領域を含む、請求の範囲第８項に記載の ヒト化モノクローナル抗体。
10. １０．請求の範囲第９項に記載のＨ鎖またはし鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
11. １１．請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
12. １２．請求の範囲第１１項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
13. １３．請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞を咳ＤＮＡが発現される条件下で培 養することを含む、ヒト化モノクローナル抗体の製法。
14. １４．請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１項に記載 のモノクローナル抗体のＨ鎖またはＬ鎖可変領域を含む、ヒトインター口イキン −５に特異的に結合する結合組成物、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル 抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖可変領域のＣＤＲを含む、ヒトインターロイキン −５に特異的に結合する−本鎖結合蛋白質、請求の範囲第１項に記載のモノクロ ーナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域を含む、ヒトインターロイキン−５に特異 的に結合するキメラモノクローナル抗体、ならびに請求の範囲第１項に記載のモ ノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域のＣＤＲを含む、ヒトインターロイ キン−５に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体よりなる群から選はれる ヒトＩＬ−５アンタゴニスト；ならびに生理学的に受容しうるキ†リヤーを含む 薬剤組成物。
15. １５．動物抗体のヒト化のためにヒト枠組み構造として用いられるヒト抗体配列 を選択するための下記を含む方法； （ａ）ヒト化すべき動物モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列を、 配列情報がそれに関して得られるヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の適切に並 んだ配列と比較し、これにより比較した配列それぞれに関するパーセント一致率 を判定し； （ｂ）これらのヒト抗体配列それぞれのアンビギュイティー数を判定し；（ｃ） 上記の動物抗体配列のピン領域スペーシングを、（ｉ）上記のヒト抗体配列それ ぞれのものと、および（ｉｉ）既知の三次元構造を有する他の抗体のものと比較 し；そして （ｄ）（ｉ）配列アンビギュイティー数が低く、かつ（ｉｉ）上記の動物抗体配 列との比較に基づいて、パーセント一致率が高く、かつピン領域スペーシングが 類似する最良の組み合わせを有するヒト抗体配列を選択する。
16. １６．ヒト化のために選択すべき動物モノクローナル抗体の可変領域残基を判定 するための下記を含む方法； （ａ）動物モノクローナル抗体の可能性のある最小および最大残基を判定し、そ の際； （ｉ）上記の最小残基は、ＣＤＲ構造ループ、ならびにこれらのＣＤＲ構造ルー プを支持および／または配向させるのに必要な残基を合わせたものからなり、 （ｉｉ）上記の最大残基は、カバトＣＤＲ、ならびにＣＤＲ構造ループ、ならび にこれらのＣＤＲ構造ループを支持および／または配向させるのに必要な残基、 ならびにＣＤＲ構造ループから約１０Ａ以内にあり、かつ約５Ａ２以上の水性溶 剤到達可能表面を保有する残基を合わせたものからなり；（ｂ）下記のコンピュ ーターモデリングを実施し：（ｉ）ヒト化すべき動物モノクローナル抗体の配列 、（ｉｉ）ヒト抗体手枠組み構造配列 ならびに （ｉｉｉ）工程（ａ）の最小および最大残基が挿入された上記のヒト抗体枠組み 構造配列からなるすべての可能な組換え抗体；このコンピューターモデリングが 、蛋白質モデリングに適したソフトウェア、および選ばれたヒト抗体枠組み構造 配列のものに最も良く一致する配列を有する構造解明された抗体からの構造情報 を用いて実施され；（ｃ）工程（ｂ）のコンピューターモデリングにおいて得ら れた結果を比較し；そして （ｄ）上記の動物抗体のものに最も近似するコンピューターモデリングによる構 造を有する組換え抗体を与える最小または最大残基を選ぶ。