MXPA05006384A

MXPA05006384A - Anticuerpo humanizado (h14.18) del anticuerpo 14.18 de raton enlazado a gd2 y su fusion con il-2.

Info

Publication number: MXPA05006384A
Application number: MXPA05006384A
Authority: MX
Inventors: Lo Kin-Ming
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2002-12-17
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2005-08-29
Also published as: ATE471946T1; DK1572748T3; EP1572748A1; BRPI0317376B8; US20100210831A1; WO2004055056A1; AU2003298187B2; AU2003298187A1; PT1572748E; CN1726227A; JP2006521085A; KR101086660B1; BR0317376A; CN100432105C; PL377337A1; JP4494977B2; US20040203100A1; CA2510180C; CA2510180A1; EP1572748B1

Abstract

La invencion proporciona un anticuerpo humanizado H14.18 que se enlaza a un glicoesfingolipido GD2 de superficie de celula humana. El anticuerpo comprende regiones variables modificadas, mas especialmente, regiones de estructura modificadas que reducen su inmunogenicidad cuando se administran a un humano. El anticuerpo se puede acoplar al agente terapeutico tal como IL-2 y usarse en el tratamiento del cancer.

Description

ANTICUERPO HUMANIZADO (H14.18) DEL ANTICUERPO 14.18 DE RATON ENLAZADO A GD2 Y SU FUSION CON IL-2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en forma general a anticuerpos modificados. Más particularmente, la invención se relaciona a anticuerpos modificados con inmunogenicidad reducida que enlazan específicamente el glicoesfingolípido de superficie de célula humana GD2, y su uso como agentes terapéuticos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ha sido importante el progreso en el desarrollo de terapias basadas en anticuerpos durante años. Por ejemplo, los investigadores han identificado no solamente una variedad de marcadores específicos de cáncer sino también una variedad de anticuerpos que enlazan específicamente a aquellos marcadores. Los anticuerpos se pueden usar para suministrar ciertas moléculas, por ejemplo, una toxina o una porción estimuladora inmune, por ejemplo, una citocina, a una célula de cáncer que expresa el marcador como para eliminar selectivamente la célula de cáncer. El anticuerpo 14.18 es un anticuerpo monoclonal derivado de ratón dirigido contra el glicoesfingolípido de superficie de célula GD2. El GD2 es un disialogangliósido que normalmente sólo se expresa en un nivel importante en los miembros de superficie exterior de las células neuronales, donde su REF: 163962 exposición al sistema inmune está limitada por la barrera cerebral de sangre. Muchas células de tumor, en contraste, tienen niveles anormales de expresión de superficie de célula de glicoesfingolípido . Por ejemplo, el GD2 se expresa en las superficies de un amplio rango de células de tumor que incluyen neuroblastomas , meduloblastomas , astrocitomas , melanomas, cáncer de pulmón de célula pequeña, osteosarcomas y otros sarcomas de tejido suave. Así, el GD2 es un marcador específico de tumor conveniente para direccionamiento a dominios de proteína estimuladora inmune para células de tumor para el propósito de aumentar una respuesta inmune efectiva contra las células de tumor para destruirlas . Mientras que el anticuerpo de ratón 14.18 (anticuerpo ml4.18) puede ayudar al direccionamiento de estos dominios de proteína a células de tumor, sus secuencias de aminoácido derivadas de ratón pueden perjudicar el efecto terapéutico deseado. Cuando se administran a un paciente, los anticuerpos pueden tener una inmunogenicidad asociada en el mamífero hospedero. Es más probablemente que ocurra cuando los anticuerpos no son autólogos . Consecuentemente, la efectividad de las terapias a base de anticuerpos a menudo está limitada por una respuesta inmunogénica dirigida contra el anticuerpo terapéutico. Esa respuesta inmunogénica comúnmente se incrementa cuando el anticuerpo se suministra en todo o en parte de un mamífero diferente al mamífero hospedero, por ejemplo, cuando el anticuerpo se deriva de un ratón y el receptor es un humano. Para uso clínico en humanos, puede ser útil modificar anticuerpos derivados de ratón a anticuerpos humanos parecidos más cercanamente, como para reducir o minimizar la inmunogenicidad del anticuerpo derivado de ratón. La inmunogenicidad del anticuerpo derivado de ratón se puede reducir por la creación de un anticuerpo quimérico en el cual las regiones constantes de un anticuerpo humano se fusionan a dominios variables de ratón. Sin embargo, los dominios variables de ratón que permanecen generalmente todavía son inmunogénicos en humanos, y así pueden dañar la eficacia de una terapia con base en anticuerpos . Algunos planteamientos para reducir la inmunogenicidad, tales como "enchapado" y "humanización" involucran la introducción de muchas sustituciones de aminoácidos y muchas rompen el enlazamiento de un anticuerpo a un antígeno. El anticuerpo ml4.18 se enlaza a GD2 con afinidad moderada. Por lo tanto, las mutaciones que bajan significativamente la afinidad de ml4.18 para GD2 se espera que hagan esto menos efectivo para propósitos terapéuticos en humanos. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica para anticuerpos terapéuticos que puedan dirigir efectivamente GD2 y tengan inmunogenicidad reducida cuando se administran a humanos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN Generalmente, la presente invención provee una forma modificada del anticuerpo ml4.18 gue es menos inmunogénico en humanos, pero todavía mantiene la afinidad de enlazamiento de mi .18 para el GD2 humano. Más particularmente, la invención provee una forma humanizada del anticuerpo ml4.18 (anticuerpo hul4.18) en el cual varios aminoácidos específicos de ratón en una o más de las regiones de cuerpo de trabajo han sido sustituidas con diferentes aminoácidos para reducir su inmunogenicidad en humanos . La invención también provee fusiones del anticuerpo hul4.18 para una o más porciones gue no son inmunoglobulina para mejorar los efectos de la terapia inmune de direccionamiento . En un aspecto, la presente invención provee una región variable de anticuerpo que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, la cual define una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (región VL) . En otro aspecto, la invención se relaciona a una región variable de anticuerpo que incluye la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, la cual define una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (región VH) . En una modalidad, la invención provee una región variable de anticuerpo en la cual la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 gue se enlaza a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. Las secuencias de aminoácido se pueden enlazar, tal como por un enlace de bisulfuro o un enlace de péptido . En otro aspecto, la invención se relaciona a una región variable de anticuerpo que enlaza específicamente a GD2 e incluyé por lo menos 1-23 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 1-25 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o 67-98 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Estas secuencias, definen regiones de estructura en las regiones variables de inmunoglobulina del anticuerpo hul4.18. Las regiones de estructura se describen en mayor detalle aba o . Un aspecto de la invención se relaciona a un método para direccionar una célula con GD2 en su superficie e incluye la administración de una región variable de anticuerpo de la presente invención a un paciente. En una modalidad, la célula direccionada es una célula de tumor. Más aspectos de la invención incluyen un ácido nucleico que codifica la variable de anticuerpo de región o una célula que incluye este ácido nucleico, cualquiera de los cuales se puede administrar a un paciente o ser usado para producción de proteína in vitro. La invención también provee un polipéptido que incluye una región variable de anticuerpos de la invención y una porción Fe que comprende por lo menos un dominio CH2, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido, las células que incluyen los ácidos nucleicos, y los métodos para direccionamiento de una célula con GD2 sobre su superficie por administración del polipéptido, el ácido nucleico, o la célula para un paciente. En algunas modalidades de la invención, la porción Fe se deriva de IgGl . La región variable de anticuerpo se puede ligar, con o sin una intervención de la porción Fe, a una porción que no es de inmunoglobulina. Específicamente, la porción que no es de inmunoglobulina puede ser una citocina, tal como una interleucina, un factor ematopoyético, una linfocina, un interferón, o una quimiocina. La interleucina puede ser, por ejemplo, interleucina-2 o interleucina-12. El factor hematopoyético y linfocina puede ser, por ejemplo, el factor de estimulación de colonias de macrófagos y granulocito (GM-CSF) y una linfotoxina, respectivamente. El interferón puede ser, por ejemplo, interferón-a, interferón-ß , o interferón-?. En algunas modalidades de la invención, la proteína de fusión incluye una segunda porción que no es de inmunoglobulina, tal como una segunda citocina. En una modalidad particular, la proteína de fusión incluye una región variable de anticuerpo, IL-2, e IL-12. Se entiende que las características de las diferentes modalidades descritas aquí no son mutuamente exclusivas y pueden existir en varias combinaciones y permutaciones. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1A muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de acuerdo con la invención. La Figura IB muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de acuerdo con la invención. Las Figuras 2A-2D muestran la secuencia de nucleótidos de un vector de expresión, que incluye los constructos de ácido nucleico que codifican una cadena ligera de inmunoglobulina y una proteína de fusión IL-2 de cadena pesada de inmunoglobulina de acuerdo con la invención. La Figura 3A muestra la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de inmunoglobulina de acuerdo con la invención.

La Figura 3B muestra la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de inmunoglobulina de acuerdo con la invención. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee una forma modificada de anticuerpo ml4.18 que es menos inmunogénica en humanos, pero todavía capaz de enlazar específicamente al GD2 humano . La inmunogenicidad reducida se provee por una o más secuencias de aminoácidos alteradas en los dominios variables de inmunoglobulina. El anticuerpo es útil para tratar tumores GD2 positivos, particularmente cuando se fusionan a una citocina u otro modulador inmune. Como se usan aquí, los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se entiende que significan (i) un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal) , (ii) antígeno que enlaza porciones de estos, incluyendo, por ejemplo, un fragmento de Fab, un fragmento de Fab' , un fragmento (Fab'), un fragmento Fv, un anticuerpo de cadena simple que enlaza el sitio, un sFv, (iii) anticuerpos bi-específicos y antígenos que enlazan porciones de estos, y (iv) anticuerpos muíti-específieos y antígenos que enlaza porciones de estos. Como se usan aquí, los términos "enlaza específicamente", "específicamente enlazado" y "que enlaza específicamente" se entiende que significan que el anticuerpo tiene una afinidad que enlaza para un antígeno de por lo menos alrededor de 105 M" , más preferiblemente, por lo menos alrededor de 107 M"1, más preferiblemente por lo menos alrededor de 108 M"1, y más preferiblemente .por lo menos alrededor de 1010 M"1. Como se usan aquí, los términos "Regiones de Estructura" y FRs" se entienden para significar regiones de una región variable de inmunoglobulina adyacente a las Regiones de Determinantes de la complementariedad (CDR por sus siglas en inglés) . Las CDR son las porciones de una región variable de inmunoglobulina que interactúa primariamente con un antígeno. Como se muestra en la FIG. 1, las regiones VH y VL contienen cuatro FR y están localizadas dentro de las porciones encajonadas de las secuencias de aminoácido. En particular, con referencia a la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 1A (SEQ ID NO: 1), las cadenas ligeras FR se definen por las secuencias de aminoácido de Aspl para Cys23 (huVLFRl) , de His39 a His 54 (huVLFR2), de Gly62 a Cys93 (huVLFR3), y de Phel04 a Lysll3 (huVLFR4) . Con referencia a la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. IB (SEQ ID NO: 2) , las FR de cadenas pesadas se definen por las secuencias de aminoácido de Glul a Ser25 (huVHFRl) , de Trp36 a Gly49 (huVHFR2), de Arg67 a Ser98 (huVHFR3), y de Trp 103 a Serll3 (huVHFR4) . Secuencias de proteínas de la invención. La presente invención presenta anticuerpos que enlazan, específicamente preferiblemente, al glicoesfingolípido de superficie de célula humana GD2 y han modificado regiones derivadas del anticuerpo ml4.18. Las secuencias de aminoácidos VH o VL (o ambas) están modificadas o humanizadas para reducir su inmunogenicidad cuando se administran a un humano. De acuerdo con la invención, el anticuerpo ml4.18 se puede humanizar, por e emplo, por el uso de métodos de desinmunización en el cual los epítopos de célula T potencial se eliminan o debilitan para introducción de mutaciones que reducen el enlazamiento de un epítopo de péptido a una molécula de Clase II MHC (ver, por ejemplo, WO 98/52976 y WO 00/34317) . Alternativamente, los epítopos de célula T no humanos mutan de manera que ellos corresponden a los mismos epítopos humanos que están presentes en anticuerpos humanos (ver, por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,712,120). La presente invención provee anticuerpos GD2 que tienen regiones VL y VH que incluyen por lo menos una secuencia FR humanizada, de esa manera se reduce la inmunogenicidad cuando se administra a humanos . I . Regiones Variables de Cadenas Pesadas y Ligeras . Como se mencionó anteriormente, el hul4.18 incluye regiones variables humanizadas derivadas del anticuerpo ml4.18 que mantienen un enlace específico del antígeno GD2 de humano. En algunas modalidades de la invención, la región VL del anticuerpo ml4.18 incluye el siguiente polipéptido: D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C-R-S-S-Q-S-L-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-H- -Y-L-Q- -P-G-Q-S-P-K-L-L-I-H-K-V-S-N-R-F-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L- -I-S-R-V-E-A-E-D-L-G-V-Y-F-C-S-Q-S-T-H-V-P-P-L-T-F-G-A-G-T-K-L-E-L-K (SEQ ID NO: 1) . En modalidades particulares, el anticuerpo hul4.18 incluye una cadena ligera FRl que se define por los residuos 1 a 23 de SEQ ID NO: 1, a saber, D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C (huVLFRl) . En otras modalidades de la invención, la región VH del anticuerpo ml4.18 incluye el siguiente polipéptido: E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E- -P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S-G-S-S-F-T-G-Y-N-M-N-W-V-R-Q-N-I-G-K-S-L-E-W-I-G-A-I-D-P-Y-Y-G-G-T-S-Y-N-Q- -F-K-G-R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L- -S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S-G-M-E-Y- -G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S- (SEQ ID NO: 2).

En modalidades particulares, el anticuerpo hul4.18 incluye una cadena pesada FRl que se define por residuos 1 a 25 de SEQ ID NO: 2, a saber E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S (huVHFRl) . En más modalidades de la invención, el anticuerpo ml4.18 incluye una cadena pesada FR3 que está representado por residuos 67 a 98 de SEQ ID NO: 2, a saber R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L-L-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S- (huVHFR3) . Varias combinaciones de las modalidades anteriores también están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo hul4.18 puede incluir la secuencia VL establecida en SEQ ID NO: 1 y la secuencia VH establecida en SEQ ID NO: 2. Las regiones VL y VH se pueden ligar por un enlace de bisulfuro o un enlace de péptido, dependiendo de cómo estén construidas sus secuencias de ácido nucleico. En general, las regiones v están ligadas por un enlace de bisulfuro cuando sus secuencias se codifican en construcciones de ADN separadas. En contraste, las regiones V están enlazadas comúnmente por un enlace .de péptido cuando sus secuencias están codificadas en una construcción de ADN de cadena simple.

La presente invención también contempla un anticuerpo que enlaza específicamente GD2 e incluye por lo menos una porción de las regiones V humanizadas. Por ejemplo, el anticuerpo hul4.18 puede incluir una región VL como se definió por la SEQ ID NO: 1 y una región VH que tiene por lo menos un FR humanizado, tal como huVHFRl ó huVHFR2. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede incluir una región VH como se definió por SEQ ID NO: 2 y una región VL que tiene por lo menos un FR humanizado, tal como VLFRl . EL anticuerpo hul4.18 también puede incluir una región VH que tiene por lo menos un FR humanizado y/o una región Vi que tiene por lo menos un FR humanizado. En ciertas modalidades de la invención, la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada pueden ser acopladas, respectivamente, a una región constante de cadena ligera y una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina tienen regiones constantes que están designadas como cadenas ya sea kappa o lambda. En una modalidad particular de la invención, la región constante de cadena ligera es una cadena kappa. Las regiones constantes de cadena pesada, y varias modificaciones y combinaciones de estas se discuten a continuación en detalle. II . Porción Fe Los dominios variables de anticuerpo de la presente invención se fusionan opcionalmente a una porción Fe. Como se usó aquí, la porción Fe abarca dominios derivados de la región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina, preferiblemente una inmunoglobulina de humano, incluyendo un fragmento, análogo, variante, imitante o derivado de la región constante. La región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina se define como un homólogo de polipéptido producido sintéticamente o que ocurre naturalmente a por lo menos una porción de la región Terminal C de la cadena pesada, que incluye el CHl, bisagra, CH2, CH3 , y, para algunas clases de cadena pesada, los dominios CH4. La región de ^bisagra" une el dominio CHl a la región CH2-CH3 de una porción Fe. La región constante de las cadenas pesadas de todas las inmunoglobulinas mamíferas exhibe una amplia similitud de secuencia de aminoácidos. Las secuencias de ADN para estas regiones de inmunoglobulina son bien conocidas en la técnica. (Ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores, (1989) J. Immunol . Meth. 125:191) . En la presente invención, la porción Fe común incluye por lo menos un dominio CH2. Por ejemplo, la porción Fe puede incluir la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina completa (CHl-bisagra-CH2-CH3 ) .

Alternativamente, la porción Fe puede incluir toda o una porción de la región de bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. La región constante de una inmunoglobulina es responsable de muchas funciones efectoras de anticuerpo importantes, que incluyen enlazamiento del receptor Fe (FcR) y fijación de complemento. Existen cinco clases mayores de la región constante de cadena pesada, clasificadas como IgA, IgG, IgD, igE, e IgM, cada una con funciones efectoras características designadas por el isotipo. igG, por ejemplo, se separa en cuatro isotipos ?: ??, ?2, Y3, y ?4, también conocidos como IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, respectivamente. Las moléculas IgG pueden interactuar con clases múltiples de receptores celulares que incluyen tres clases de receptores Fcy (FcyR) específico para la clase IgG de anticuerpo, a saber FcyRl, FcyRII, y FcyRllI . Las secuencias importantes para el enlazamiento de IgG a los receptores FcyR se han reportado por estar en los dominios CH2 y CH3. La vida media del de un anticuerpo está influenciada por la capacidad de ese anticuerpo para enlazar a un receptor Fe (RcR) . Similarmente, la vida media del suero de proteínas de fusión de inmunoglobulina también está influenciada por la incapacidad para enlazar a los receptores (Gillies y colaboradores, Cáncer Research (1999) 59:2159-66). Los dominios CH2 y CH3 de lgG2 e IgG4 tienen afinidad de enlazamiento indetectable o reducida para receptores Fe comparada con aquellos de IgGl. En consecuencia, la vida media del suero del anticuerpo caracterizado se puede aumentar mediante el uso del dominio CH2 y/o CH3 de los isotipos IgG2 o IgG4. Alternativamente, el anticuerpo puede incluir un dominio CH2 y/o CH3 de IgGl o IgG3 con modificación en uno o más aminoácidos en estos dominios para reducir la afinidad de enlazamiento para receptores Fe (ver, por ejemplo, la solicitud de Patente de EUA 09/256,156, publicada en EUA como publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0105294-Al) . La región de bisagra de la porción Fe normalmente une la terminación C del dominio CHl de la región constante de cadena pesada. Cuando se incluye en las proteínas de la presente invención, la bisagra es homologa a una región de inmunoglobulina que ocurre naturalmente y comúnmente incluye residuos de cisteína que ligan dos cadenas pesadas mediante enlaces de bisulfuro como en las inmunoglobulinas naturales. Las secuencias respectivas de las regiones de bisagra para inmunoglobulina de humano y de ratón se puede encontrar en ANTIBODY E GI EERING, a PRACTICAL GUIDE, (Borrebaeck, ed. , W. H. Freeman and Co., 1992). Las regiones de bisagra apropiadas para la presente invención se pueden derivar de IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4, y otros isotipos de inmunoglobulina. El isotipo IgGl tiene dos enlaces de bisulfuro en la región de bisagra que permite formación de enlazamiento de bisulfuro eficiente y consistente. Por lo tanto, una región de bisagra preferida de la presente invención se deriva de IgGl. Opcionalmente, la mayoría de la Terminal N de una bisagra IgGl se muta para mejorar la expresión y ensamble de proteínas de fusión de anticuerpo o anticuerpos de la invención (ver, por ejemplo, la solicitud de Patente de EUA No. 10/093,958, publicada como publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-00444423-A1) .

En contraste a IgGl, la región de bisagra de IgG4 se conoce por formar enlaces de bisulfuro intercadena ineficientemente (Angal y colaboradores, (1993), Mol. Immunol. 30:105-8). También, la región de bisagra IgG2 tiene cuatro enlaces de bisulfuro que tienden a promover la oligomerización y posiblemente enlazamiento de bisulfuro incorrecto durante la secreción en sistemas recombinantes . Una región de bisagra apropiada para la presente invención se puede derivar de la región de bisagra IgG4, conteniendo preferentemente una mutación que mejora la formación correcta de enlaces de bisulfuro entre porciones derivadas de cadena pesada (Angal y colaboradores, (1993), Mol. Immunol. 30/1/ : 105-8) . Otra región de bisagra preferida se deriva de una bisagra IgG2 en la cual las primeras dos ciste nas se mutan cada una a otro aminoácido, tal como, en orden de preferencia general, serina, alanina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, lisina, histidina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glicina, metionina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, triptofano o selenociste na (ver, por ejemplo, la publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0044423-Al) . Una porción Fe fusionada a una región variable de anticuerpo de la invención puede contener dominios CH2 y/o CH3 y una región de bisagra que se deriva de isotipos de anticuerpo diferentes. Por ejemplo, la porción Fe puede contener dominios CH2 y/o CH3 de IgG2 o IgG4 y una región de bisagra de IgGl. El ensamble de tales porciones Fe híbridas se describe en la publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0044423-A1. Cuando se fusiona a una región variable de anticuerpo de la invención, la porción Fe preferiblemente contiene una o más modificaciones de aminoácido que generalmente extienden la vida media del suero de una proteína de fusión Fe. Tales modificaciones del aminoácido incluyen mutaciones que disminuyen o eliminan sustancialmente el enlazamiento del receptor Fe o la actividad de fijación del complemento. Por ejemplo, un tipo de tal mutación remueve el sitio de glicosilación de la porción Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina. En IgGl, el sitio de glicosilación es Asn297 (ver, por ejemplo, la solicitud de Patente de EUA 10/310,719, publicada como publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0166163-A1) . III. Región de Unión de Fusión Las regiones de variable de anticuerpo de la presente invención se pueden ligar o fusionar opcionalmente a una porción que no es de inmunoglobulina directa o indirectamente, tal como a través de un péptido enlazador (por ejemplo, (Gly-Ser)3(SEQ ID NO: 3)). La inmunogenicidad de las proteínas de fusión desglosadas se puede reducir por daño a la capacidad de la unión de fusión o al epítopo de unión para interactuar con un receptor de célula T, como se describe en la publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0166877-Al . Aún en una fusión entre dos proteínas humanas, por ejemplo, la Fe humana e IL-2 humana, la región que rodea la unión de fusión o el epítopo de unión incluye una secuencia de péptido que normalmente no está presente en el cuerpo humano y, así, ese puede ser inmunogénico . La inmunogenicidad del epítopo de unión se puede reducir, por ejemplo, mediante introducción de uno o más sitios de glicosilación cerca de la unión de fusión, o por identificación de un epítopo de célula T candidato que abarca la unión como se describe en la publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0166877-Al y que cambia un aminoácido cercano a la unión para reducir la capacidad del epítopo de célula T candidato para interactuar con un receptor de célula T. La vida media de suero de la proteína también se puede aumentar por introducción de mutaciones en la región de unión de fusión. Por ejemplo, en una proteína que incluye un dominio CH3 fusionado a una porción que no es de inmunoglobulina, la lisina de terminación C del dominio CH3 se puede cambiar a otro aminoácido, tal como alanina, el cual puede proveer un aumento sustancial en la vida media del suero de la proteína de fusión que resulta. En ciertas modalidades, es deseable el desdoblamiento proteolítico de la unión de fusión. En consecuencia, la región intergénica puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de desdoblamiento proteolítico. Este sitio, interpuesto entre la inmunoglobulina y la citocina, se puede designar para liberación proteolítica de la citocina en el sitio de direccionamiento . Por ejemplo, es bien conocido que la plasmina y tripsina desdoblan después de residuos de lisina y arginina en sitios que son accesibles para las proteasas . Otras endoproteasas de sitio específico y las secuencias- de aminoácidos que reconocen son bien conocidas .

IV. Tratamiento de enfermedad humana con proteínas de fusión de anticuerpo hu!4.18 Las regiones variables de anticuerpo de la invención se pueden anexar a un agente de diagnóstico y/o un agente terapéutico . El agente se puede fusionar al anticuerpo para producir una proteína de fusión. Alternativamente, el agente se puede acoplar químicamente al anticuerpo para producir un inmunoconjugado . El agente puede ser, por ejemplo, una toxina, radioetiqueta, agente de imagen, porción inmunoestimuladora o lo similar. La región variable de anticuerpo de la invención se puede anexar a un citocina. Las citocinas preferidas incluyen interleucinas tales como interleucina-2 (IL-2) , 11-4, 11-5, 11-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 e IL-18, factores hematopoyéticos tales como el factor de estimulación de colonia de macrófago de granulocito (GM-CSF) , factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) y eritropoyetina, factores de necrosis de tumor (T F) tales como TNF, linfocinas tales como linfotoxina, reguladores de procesos metabólicos tales como leptina, interferones tales como interferón , interferón ß, e interferón ? y quimiocinas . Preferiblemente, la proteína de fusión de citocina de anticuerpo o el inmunoconjugado despliegan actividad biológica de citocina. En una modalidad, el dominio variable de anticuerpo se fusiona a IL-2. Preferiblemente, varios aminoácidos dentro de la porción IL-2 se imitan para reducir la toxicidad, como se describe en la publicación de solicitud de Patente de EUA 2003-0166163-Al . Por ejemplo, las figuras 3A y 3B muestran las secuencias de aminoácidos de una modalidad particular de una proteína de fusión de anticuerpo de acuerdo con la invención. Específicamente, la FIG. 3A muestra la secuencia de péptido de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada que incluye una región variable y constante. La FIG. 3B muestra la secuencia de péptido de una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada enlazada a IL-2. Los polipéptidos proveen una proteína de fusión de anticuerpo humanizada capaz de enlazar específicamente a GD2 y estimular el sistema inmune. Opcionalmente, los complejos de proteína pueden incluir además un segundo agente, tal como una segunda citocina. En una modalidad, una proteína de fusión de anticuerpo hul4.18 incluye IL-12 e IL-2. La construcción de complejos de proteína que contienen un dominio de inmunoglobulina y dos, citocinas diferentes se describe en detalle en la Patente de EUA No. 6, 617,135. Las proteínas de fusión de la presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedad humana, tal como cáncer. Cuando se tratan tumores humanos, es particularmente útil administrar una proteína de fusión de anticuerpo IL-2 que comprende las regiones V de la invención por infusión o inyección subcutánea, usando dosis de 0.1 a 100 miligramos/metro2/paciente . En una modalidad preferida, es particularmente útil administrar una proteína de fusión de anticuerpo IL-2 que comprende las regiones V de la invención por infusión o inyección subcutánea, usando dosis de 1 a 10 miligramos/metro2/paciente . Estudios clínicos han demostrado que después de la administración de hul .18-IL-2 , la proteína de fusión conserva su capacidad para activar células sensibles a través del receptor IL-2 y retiene su capacidad para enlazar a células de tumor GD2 positivas y para suministrar IL-2 a su superficie. Además, la administración de la proteína de fusión hul4.18-lL-2 a pacientes con cáncer resultó en estabilización de la progresión de la enfermedad sorpresivamente en un gran número de pacientes (ver Ejemplo 1) . Las composiciones farmacéuticas de la invención "se pueden usar en formas de dosificación sólida, semisólida o líquida, tal como, por ejemplo, pildoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, o lo similar, preferiblemente en formas de unidad de dosis apropiadas para administración de dosis precisas . Las composiciones incluyen un portador o excipiente farmacéutico convencional y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, etc. Tales excipientes pueden incluir otras proteínas, tales como, por ejemplo, proteínas de plasma o albúmina de suero humano. Los métodos actuales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos o serán palpables para aquellos expertos en la técnica. La composición o formulación a ser administrada, en cualquier caso, contendrá una cantidad del (os) componente (s) activo (s) en una cantidad efectiva para lograr el efecto deseado en el sujeto que se trata. La administración de la composición de aquí puede ser vía cualquiera de los modos aceptados de administración para agentes que exhiben tal actividad. Estos métodos incluyen administración oral, pareriteral o cutánea y otras formas sistémicas . La inyección intravenosa en un portador farmacéuticamente aceptable es un método preferido de administración (ver E emplo 1) .

La cantidad de compuesto activo administrado, por supuesto, dependerá del sujeto que es tratado, la severidad de la afección, la manera de administración, y el juicio del médico que prescribe. Ácidos Nucleicos de la Invención I . Construcciones de anticuerpo hu!4.18 La invención también presenta ácidos nucleicos capaces de expresar cada uno de los tipos de proteínas anteriores. Estos incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2; una región VL de anticuerpo hul4.18 que incluye la secuencia de aminoácidos huVLFRl; una región VH de anticuerpo hul4.18 que incluye la secuencia de aminoácidos huVHFRl; una región VH de anticuerpo hul4.18 que incluye la secuencia de aminoácidos huVHFR3 y proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo hul4.18 que incluye por lo menos una de las secuencias FR humanizadas anteriores y uno o más agentes terapéuticos. Los anticuerpos hul4.18 de esta invención se pueden producir por técnicas de ingeniería genética; esto es, por formación de una construcción de ácido nucleico que codifica un anticuerpo específica GD2 que contiene los FR deseados ' de la presente invención. En una modalidad, la construcción de gen que codifica el anticuerpo presentado incluye, en la orientación 5' a 3', un segmento de ADN el cual codifica una región variable de cadena pesada que incluye por lo menos un FR humanizado ahí dentro y un segmento de ADN que codifica una región constante de cadena pesada. En otra modalidad, otro segmento de ADN que codifica una citocina se fusiona a la terminación 3' del segmento de ADN que codifica la región constante de cadena pesada. En una modalidad diferente, la construcción de gen incluye, en la orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica una región variable de cadena pesada que incluye por lo menos un FR humanizado y un segmento de ADN que codifica citocina. Alternativamente, un ácido nucleico de la invención puede incluir, en la orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica una región variable de cadena ligera que incluye por lo menos un FR humanizado ahí dentro y un segmento de ADN que codifica una citocina. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica una citocina se une en estructura a la terminación 3 ' de un gen que codifica una región constante (por ejemplo, exon CH3), ya sea directamente o a través de una región intergénica (por ejemplo, por los enlazadores apropiados, tales como por codificación del ADN (Gly -Ser ) 3 (SEQ ID NO: 3)) . II . Expresión de construcciones de anticuerpo hu!4.18 Las proteínas que codifican ácido nucleico de la presente invención se pueden ensamblar o insertar en uno o más vectores de expresión para introducción en una célula receptora apropiada donde se expresa. La introducción de ácidos nucleicos en vectores de expresión se puede lograr por técnicas de biología molecular estándar. Los vectores de expresión preferidos incluyen aquellos de los cuales la proteína codificada se puede expresar en cualquier célula de bacteria o mamífero. De acuerdo con la invención, una cadena pesada de una región variable de anticuerpo preferiblemente se coexpresa en la misma célula con una cadena ligera correspondiente. Para proteínas de fusión que comprenden cadenas de polipéptido múltiple, se puede usar más de un vector de expresión. Los métodos de co-transfección que usan, por ejemplo, dos vectores de expresión, frecuentemente resultan en ambos vectores que son suministrados a una célula de direccionamiento . Alternativamente, algunas veces es útil usar un vector simple que codifica una pluralidad de polipéptidos para co-expresión en la misma célula. Por ejemplo, las FIGS. 2A-2D muestran la secuencia de ácido nucleico de un vector simple que codifica ambas cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina de acuerdo con la invención. El vector también incluye un ácido nucleico que codifica IL-2 fusionado a la terminación 3 ' de la cadena pesada de inmunoglobulina. Así, cuando se introduce en una célula, este vector solo puede proveer una proteína de fusión de anticuerpo IL-2 humanizada que enlaza específicamente GD2 y estimula la función inmune.

Además, puede ser conveniente expresar las proteínas de la presente invención como moléculas de cadena simple. Por ejemplo, una región variable de anticuerpo se puede expresar como un anticuerpo de cadena simple o sFv opcionalmente fusionado a una proteína de no inmunoglobulina. En otra modalidad, una cadena pesada (con o sin una citocina fusionada) se combina con una contraparte de cadena ligera (o pesada) (con o sin una citocina fusionada) para formar inmunocon ugados monovalentes y divalentes . Las líneas de célula receptora preferiblemente son células linfoides, tales como un mieloma (o hibridoma) . Los mielomas pueden sintetizar, ensamblar, y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes transfectados y pueden glicosilar proteínas . Una célula receptora particularmente preferida es la mieloma Sp2/0, la cual normalmente no produce inmunoglobulina endógena. Cunado es transfectada, la célula producirá solamente inmunoglobulinas codificadas por las construcciones de gen transfectadas . Los mielomas transfectados pueden crecer en cultivo o en el peritoneo de ratones donde los inmunoconjugados se pueden recuperar del fluido de ascitos . Otras células linfoides tales como linfocitos B también se pueden usar como células receptoras. Existen varios métodos para transfección de células linfoides con vectores que contienen las construcciones de ácido nucleico que codifican la cadena Ig quimérica. Una forma preferida de introducción de un vector en células linfoides es por fusión de esferoblasto. (ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores, (1989) Biotechnol . 7:798-804). Métodos alternativos incluyen eletroporación o precipitación de fosfato de calcio. Otros métodos útiles de producción de los conjugados incluyen la preparación de una secuencia ARN que codifica el constructo y su traducción en un sistema in vivo o in vitro apropiado. Una vez expresadas, las proteínas de la invención se pueden cosechar por procedimientos de purificación de proteína estándar (ver, por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,650,150) .

III . Tratamiento de cáncer por terapia génica Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar como agentes de terapia génica para tratamiento de cáncer y otras enfermedades en las cuales es deseable direccionar el sistema inmune a un tipo de célula específico. Por ejemplo, las células pueden ser apartadas de un humano o animal, y se puede transfectar dentro de las células uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de la presente invención. Las células son luego introducidas nuevamente en el humano o animal. Las células transfectadas pueden ser células normales o de cáncer. Alternativamente, un ácido nucleico se puede introducir en las células in situ. El humano o animal monta luego una respuesta inmune a las células de cáncer, la cual puede curar o disminuir la severidad del cáncer. Una región variable de anticuerpo de la invención, acoplada a elementos reguladores apropiados para promover la expresión en células de mamíferos, puede ser transfectada en las células por cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo vía fosfato de calcio, una ^pistola de genes", vectores de adenovirus, liposomas catiónicos , vectores retrovirales , o cualquier otro método de transfección eficiente. En una modalidad particular de la invención, un anticuerpo hul4.18 se usa para suministrar selectivamente una citocina a una célula de direccionamiento in vivo de manera que la citocina pueda ejercer un efecto biológico localizado tal como una respuesta inflamatoria local, estimulación del crecimiento y activación de la célula T, o actividad ADCC. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo se administra en el sistema circulatorio de un sujeto que alberga la célula de direccionamiento. La invención se ilustra además por los ejemplos no limitantes. EJEMPLOS Ejemplo 1 Purificación y formulación de hul4.18-IL2 En un estudio, hul4.18-IL2 se expresó de las células NS/O, el sobrenadante del cultivo de tejido se cosechó, y la proteína hul4.18-IL2 se purificó usando, en secuencia cromatografía de columna de resina mezclada Abx, cromatografía de Proteína A recombinante, y cromatografía de columna Q Sepharose, seguido por diafiltración de flujo tangencial Pellicon 2 para cambio de solución amortiguadora en solución amortiguadora de formulación. Los detalles de estos pasos de purificación se describen a continuación. Los pasos de inactivación y remoción del virus no fueron necesarios para la purificación per se, pero se usaron para satisfacer consideraciones reguladoras . Dos litros de sobrenadante de cultivo de tejido NS/0 que contiene hul4.18 se ajustaron a pH 5.9 con ácido acético 1M y se aplicaron a una columna Abx (J. T. Baker) ; se lavaron con 10 m MES, 100 mM de acetato de sodio pH 6.2; y se eluyeron con 500 MM de acetato de sodio de pH 7. Este material se cargó en una columna de Proteína A recombinante (Pharmacia) ; se lavó con 100 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl pH 7; se lavó con 100 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl pH 6; se lavó con 10 mM de fosfato de sodio pH 7; y se eluyó con 100 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl pH 3.5. El pH del material eluído fue 4.2. Para promover la inactivación del virus, este pH se redujo a 3.8 y la preparación se incubó por 30 minutos, después de lo cual el pH se neutralizó a 7 con NaOH 1M. Para remover ácido nucleico, este material se cargó en una columna Q sepharose (Pharmacia) y se lavó con 100 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl pH 7. El ácido nucleico se enlazó a la columna, mientras la proteína se encontró a través del flujo y se lavó, lo cual se repitió hasta que el A280 regresó a la línea base. La diafiltración Pellicon 2 (Millipore) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, de manera que el material de hul4.18 final se localizó en la siguiente formulación. 1. Manitol 4% 2. Clorohidrato de Arginina USP/NF 100 mM 3. Ácido Cítrico USP-FCC 5 mM 4. Polisorbato 80 0.01% (w.v) El pH de la solución amortiguadora de formulación se ajustó a 7 con NaOH 1 M. Como un paso final, la preparación se filtró a través de una membrana Viresolve 180 (Millipore) , la cual tiene un peso molecular de corte de 180,000 Daltones. Esto tuvo el efecto de "pulir" el material de manera que como un resultado, se retiraron los dímeros agregados y los oligómeros de mayor orden. Ejemplo 2 Actividad anti-tumor de la Proteína de Fusión hul4.18-IL-2 observada en Pruebas Clínicas de Fase I Para evaluar la seguridad y eficacia de hul4.18-11-2 , se realizó una prueba clínica de Fase I . Los pacientes idóneos confirmaron histológicamente el melanoma que se consideró incurable quirúrgica y médicamente. Estos pacientes pudieron tener ya sea medida o evaluada la enfermedad metastática, o pudieron no tener evidencia de enfermedad después de resección quirúrgica de metástasis distante o enfermedad recurrente regionalmente . Los pacientes con recurrencias locales o regionales múltiples (dos o más) se incluyeron solamente si ellos tuvieron evidencia anterior del ganglio linfático involucrado y si cada recurrencia se separó en tiempo por al menos 2 meses . Todos los pacientes necesitaron tener funciones de médula de hueso adecuadas (definido por el total de células de sangre blancas (WBC) > 3,500/ml, o granulocitos totales >2000/ml, plaquetas > 100,000/mil, y hemoglobina >10.0 g/dl) , adecuada función de hígado [definida por un aspartato de aminotransferasa (AST) <3 x normal y una bilirrubina total < 2.0 mg/dl] , y función renal adecuada (definida por una creatinina de suero <2.0 mg/dl o un margen de creatinina de >60 mi/minuto) . Todos los pacientes tuvieron un estatus de realización de electrocorticografía (ECOG) de 0 ó 1 y una esperanza de vida de por lo menos 12 semanas . Los pacientes que previamente recibieron quimioterapia, terapia de radiación, u otra terapia inmunosupresora dentro de las 4 semanas previas al estudio se excluyeron. Los pacientes pudieron tener metástasis de sistema nervioso central (CNS) anterior si se trataron y estuvieron estables por lo menos 4 semanas antes de iniciar el estudio. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.

Esta prueba de fase I se diseñó como un estudio para escalar la dosis, no aleatorio de etiqueta abierta en el cual los grupos de 3, a 6 pacientes recibieron hul4.18-IL-2 en uno de los niveles de dosis siguiente: 0.8, 1.6, 3.2, 4.8, 6.0 ó 7.5 mg/m2/dia. El hul4.18-11-2 se administró en un paciente hospitalizado base como una infusión intravenosa de 4 horas (IV) por 3 días consecutivos durante la primer semana de cada curso. La proteína de fusión hul4.18-IL-2 se administró a pacientes en una formulación que comprende 4% de anitol, HC1 de Arginina, 100 mM; Citrato 5m ; y 0.01% de Tween 80, en pH 7. Los pacientes se dieron de alta del hospital, si estaban estables, aproximadamente 24 horas después de completar la tercera infusión. Se clasificaron los eventos adversos y toxicidades como por NCI Common Toxicity Criteria (versión 2.0) y la University of Wisconsin Comprehensive Cáncer Center Toxicity Grading Scale for IL-2 (estatus de realización, peso ganado, y temperatura) . La toxicidad de límite de dosis (DLT) se definió como la ocurrencia de toxicidad de grado 3 ó 4 diferente a la linfopenia de grado 3, hiperbilirrubinemia, hipofosfatemia, o hiperglicemia. La dosis máxima tolerada ( TD) se definió como el nivel de dosis en el cual de dos a seis pacientes tuvieron DLT durante el curso 1. Los pacientes con toxicidades relativas al tratamiento de grado 3 se requirieron para recuperar por lo menos a 1 grado antes de que ellos pudieran reanudar el tratamiento en una reducción de dosis del 50% para curso 2. Los pacientes con progresión de enfermedad =25% se retiraron del estudio. ? los pacientes con enfermedad estable se les administró el curso 2. Las propiedades farmacocinéticas de hul4.18-IL-2 se evaluaron en los pacientes. Cuando los niveles de hul .18-IL-2 se evaluaron en muestras seriales de todos los 33 pacientes seguidos inmediatamente de la primer infusión de 4 horas (día 1, curso 1), se encontró que la vida media es de 3.7 horas (+/- SD de 0.9 h) . Esto es intermedio entre las vidas medias de sus 2 componentes (aproximadamente 45 minutos para IL-2 y 3 días para el anticuerpo ml4.18 quimérico), y comparable con aquel que se observó para la vida media de ml4.18-IL-12 quimérico en ratones. Siguiendo a la depuración de hul4.18-IL-2 del suero de estos pacientes, no se pudieron detectar los componentes del anticuerpo ni el IL-2 ni el hul4.18. El pico del suero y el área bajo la curva (AUC) durante el curso 1 mostraron un incremento dependiente de dosis importante (p<0.001) . Los treinta y tres pacientes se trataron en este estudio. La tabla 1 lista los resultados clínicos. Dos pacientes (6%) completaron solamente los primeros 2 de 3 días de curso 1. Uno de estos pacientes (dosis nivel 3) tuvo un grado 3 de hiperbilirrubinemia en el día 2 de tratamiento, y el otro paciente (dosis de nivel 6) tuvo un grado 3 de hipoxia e hipotensión que requirió tratamiento para ser mantenido. Todos estos pacientes tuvieron progresión de enfermedad y no recibieron un segundo curso de terapia. Diecinueve pacientes (58%) tuvieron enfermedad estable después del primer curso de terapia y recibieron un segundo curso de terapia. Cinco pacientes (15% de todos los pacientes) requirieron una reducción de dosis del 50% para el curso 2 secundario a eventos adversos en el curso 1. Diecisiete pacientes (52% de todos los pacientes) completaron el curso 2. Un paciente (dosis nivel 4) declinó para recibir la infusión final durante el curso 2, y un paciente (dosis nivel 6) tuvo la infusión final durante el curso 2 mantenida debido a hipotensión. Ocho pacientes (24% de todos los pacientes) tuvieron enfermedad estable seguida del segundo curso de tratamiento. Los resultados indican que el. hul4.18 provocó estabilización de progresión de enfermedad sorpresivamente en un gran número de pacientes . Ocho de los 33 pacientes mantuvieron enfermedad estable después de 2 cursos de terapia, y 4 de esos 8 pacientes continuaron sin evidencia de enfermedad progresiva (1 con enfermedad estable y 3 sin evidencia de enfermedad) por 20-52 meses desde que se completó el protocolo de terapia. Cinco de los 33 pacientes sometidos al estudio con enfermedad no medible continuaron con resección quirúrgica de recurrencias o metástasis. Dos de estos cinco pacientes tuvieron progresión de enfermedad, mientras que los 3 pacientes restantes continuaron sin evidencia de enfermedad (20-52 meses) . Estos hallazgos son consistentes con la hipótesis de que el beneficio clínico de una intervención inmunoterapéutica es más probable en un paciente con una carga de tumor menor. Un paciente adicional tuvo una disminución objetiva en un nodulo de pulmón siguiendo dos cursos de terapia, pero la respuesta de enfermedad general se marcó como progresión de enfermedad debida al crecimiento en un nodo distante. El nodo se resecciona después de la terapia de hul4.18-IL-2 y el paciente se mantuvo libre de progresión de enfermedad por más de 3 años .

TABLA 1 Resultados Clínicos Estimulación in vivo por hul4.18-IL-2 en una prueba clínica de Fase I. Los pacientes tratados con hul4.18-IL-2 también se examinaron para indicaciones de estimulación inmune. Ocurrió una linfopenia de sangre periférica en los días 2-4, y esto fue seguido por una linfocitosis de reenlazamiento en los días 5-22. Ambos cambios fueron dependientes de dosis (p<0.01 y p<0.05, respectivamente) . Las cuentas de linfocitos en los días 5, 8, 15 y 22 fueron significativamente mayores que la línea base para el' curso 1. La cuenta de linfocito de línea base para el curso 2 (día 29 del curso 1) se aumentó sobre la cuenta de linfocito de línea base para el curso 1, indicando que los efectos del primer curso de tratamiento están todavía presentes en el día 29. Además, las cuentas de linfocitos durante el curso 2 en los días 5, 8 y 15 son mayores que los valores correspondientes para los días 5, 8 y 15 durante el curso 1 para estos 12 pacientes . El fenotipo de superficie de célula de linfocito mostró una expansión de linfocitos CD16+ y CD56+ (marcadores de célula eliminadora natural (NK) ) después de la primera semana de terapia de hul4.18-IL-2. Este efecto todavía estuvo presente en el día 29 del curso 1 (día 1, curso 2) . Para los pacientes 19-33 (que recibieron 4.8-7.5 ' mg/m2/día) , el fenotipo de superficie de célula de linfocito se determinó en los días 15 y 22 además de los días 1 y 8. Este análisis demostró que el aumento de las células de co-expresión CD56 y CD56/CD16 permaneció significativamente elevado (p<0.0a) en los días 8, 15 y 22. Como una medida de activación inmune, se obtuvieron los niveles de proteína reactiva C (CRP) para pacientes 13-33 y el receptor IL-2 soluble (sIL-2R) para los 31 pacientes que completaron el curso 1. Se presentó un incremento importante en el CRP medio en los días de tratamiento 3-5 en ambos cursos 1 y 2 comparado con la línea base para cada curso. Este incremento en CRP regresó a los niveles de línea base por el día 8 de cada curso de tratamiento. El nivel de sIL-2R se aumentó significativamente sobre la línea base iniciando 24 horas después de la infusión de hul .18-IL-2 durante ambos cursos 1 y 2, lo cual persistió hasta el día 8. El incremento en SIL-2R se encontró que es dependiente de dosis (p=0.014) . Los valores de SIL-2R para el curso 2 se incrementaron comparados con los valores que corresponden en el curso 1 para los días 1-5 para pacientes que recibieron la misma dosis en ambos cursos (p<0.05). La línea de célula de neuroblastoma LA-N-5 que expresa GD2 y enlaza hul .18-IL-2 se usó para evaluar la función NK activada de IL-2 y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para 31 pacientes que completan el curso 1. Hubo un incremento importante en la eliminación mediada por linfocitos del día 8 comparada con el día 1 para estos dos ensayos . Los 12 pacientes que recibieron el curso 2 en la misma dosis como en el curso 1, mostraron resultados ADCC que fueron muy similares a aquellos obtenidos durante el curso 1. El único parámetro que se encontró que es diferente para el curso 2 del curso 1 fue eliminación incrementada en la presencia de IL-2 en el día 1, indicando que la eliminación aumentada en este ensayo permaneció elevada en el día 29 (día 1, curso 2) . Debido a que el LA-N-5 objetivo es relativamente resistente a las células NK frescas, esto es útil para la medición de la eliminación aumentada de IL-2, y ADCC. Sin embargo, la eliminación débil de LA-N-5 mediada por PBMC fresca en medio (sin IL-2 suplemental in vitro) no fue significativamente mayor en el día 8 que en el día 1. Para los pacientes 19-33, los ensayos NK estándar se realizaron en los días 1, 8, 15 y 22, usando la línea de célula de direccionamiento K562 susceptible de NK. Se observó un incremento importante en la lisis de NK de las células de direccionamiento K562, cuando se evaluaron ya sea en medio o en la presencia de IL-2, en los días 8 y 22 cuando se compararon con el día 1. Las muestras de suero de los pacientes seleccionados también se evaluaron para determinar la actividad de IL-2 funcional del anticuerpo anti-GD2 funcional. La línea de célula Tf-lb sensible a IL-2 demostró proliferación inducida de IL-2 con suero de paciente obtenido después de infusión de hul .18-IL-2. Un aumento progresivo en la proliferación se vio durante las primeras 4 horas después de la infusión de 4 horas. Los valores regresaron a la línea base por 16 horas después de esta infusión, consistente con la vida media del suero para hul4.18-IL-2 de aproximadamente 4 horas. Las muestras de suero para estos puntos de tiempo también se examinaron por citometría de flujo para la presencia de la inmunocitocina hul .18-IL-2 intacta (IC) que retiene su componente IL-2 y su actividad de anticuerpo anti-GD2. El hul4.18-IL-2 capaz de enlazar la línea de célula M21 (GD2 positivo) fue detectable en muestras de suero de paciente que siguen de una infusión de IC. La cantidad de IC disponible para enlazar a M21 progresivamente aumentó durante las primeras 4 horas después de la infusión de 4 horas, y disminuyó después de eso, nuevamente consistente con la vida media de aproximadamente 4 horas. Finalmente, los ensayos in vitro se realizaron con especímenes de pacientes para determinar si la administración de hul4.18-IL-2 resulta en condiciones in vivo consistentes con aquellas necesarias para lograr ADCC. Las PBMC del día- 8 muestran ADCC aumentado en células de direccionamiento GD2+ cuando hul4.18-IL-2 se agrega al ensayo citotóxico. Este mismo ensayo de ADCC se realizó con PBMC del día 8, sin embargo en lugar de agregar hul4.18-IL-2 al ensayo, se agregó el suero del paciente obtenido antes o después de administración de hul4.18-1L-2. El PBMC obtenido de pacientes en el día 8 del curso 2 estuvieron disponibles para mediar la eliminación aumentada de la línea de célula LA-N-5 en la presencia del suero obtenido después de la administración de ul .18-IL-2 , comparada con aquella observada con el suero obtenido antes de infusión. Así la circulación de hul4.19-IL-2 en pacientes después de administración IV está disponible para facilitar ADCC con PBMC activado in vivo por hul4.18-IL-2 de ese mismo paciente. En resumen, estos resultados indican que hubo cambios inmunológicos asociados con esta terapia hul .18-IL-2 que incluyen aumento en el conteo de linfocitos, un aumento en el porcentaje de PBMC CD16+ y CD56+, un aumento en la lisis de NK, y un aumento en ADCC. La evidencia adicional para activación inmune incluye un aumento en los niveles de suero de CRP y de IL-2R. Los análisis de laboratorio de suero y PBMC mostraron que 'la circulación de molécula ul .18-IL-2 en suero de paciente después de administración IV mantuvo su capacidad para activar células sensibles de IL-2 a través del receptor IL-2 y mantuvo su capacidad para enlazar a células de tumor positivas GD2, y suministrar IL-2 a su superficie, como se detectó por la citometría de flujo. Las células se activaron in vivo basadas en su capacidad para mediar la función de NK y ADCC in vitro. Además, las células NK activadas in vivo por el hul4.18-IL-2 administrado a estos pacientes fue capaz de mediar el ADCC facilitado por la circulación de hul4.18-IL-2 en el suero de estos mismos pacientes. Así, las condiciones para lograr la activación inmune se lograron en todos los pacientes en este estudio.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una región variable de anticuerpo caracterizada porgue comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N0:1. 2. Una región variable de anticuerpo caracterizada porgue comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. 3. La región variable de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2 caracterizada porgue comprende además la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. 4. La región variable de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porgue las secuencias de aminoácidos están ligadas por un enlace de bisulfuro. 5. La región variable de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porgue las secuencias de aminoácido están ligadas por un enlace de péptido. 6. Una región variable de anticuerpo caracterizada porgue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 2, y aminoácidos 67-98 de SEQ ID NO: 2, en donde la región variable de anticuerpo senlaza específicamente a GD2. 7. La región variable de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos incluye aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 1. 8. La región variable de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos incluye aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 2. 9. La región variable de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos incluye aminoácidos 67-98 de SEQ ID NO: 2. 10. Un polipeptido caracterizado porque comprende una región variable de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y una porción Fe que comprende por lo menos un dominio de CH2. 11. El polipeptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la porción Fe se deriva de igGl. 12. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica una región variable de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-9 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ú 11. 13. Una célula caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12. 1 . Un método para direccionamiento de una célula con GD2 en su superficie, el método caracterizado porque comprende: administración de una región variable de anticuerpo de acuerdo con cualesquiera de las reivindicaciones 1-9 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ú 11. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la célula es una célula de tumor. 16. Una proteína de fusión caracterizada porque comprende una región variable de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-9 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ú 11 ligado a una porción que no es de inmunoglobulina. 17. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la porción que no es de inmunoglobulina es una citocina. 18. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la citocina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, un factor hematopoyético, una linfocina, un interferón, y una quimiocina. 19. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la interleucina se selecciona del grupo que consiste de interleucina-2 (IL-2) e interleucina-12 (IL-12) . 20. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el factor hematopoyético es factor de estimulación de colonia de macrófago de granulocito (GM-CSF) . 21. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la linfocina es una linfotoxina . 22. La proteína de f sión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el interferón se selecciona del grupo que consiste de interferón-a, interferón-ß, e interferón-?. 23. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 16 caracterizada porque comprende una segunda porción que no es de inmunoglobulina . 24. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la proteína de fusión comprende IL-2 e IL-12. 25. El uso de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 o una célula de conformidad con la reivindicación 13 para la fabricación de un medicamento.