CN1057534C

CN1057534C - 促红细胞生成素类似物

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Publication number: CN1057534C
Application number: CN94109128A
Authority: CN
Inventors: S·G·埃利奥特; T·E·伯恩
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-15
Publication date: 2000-10-18
Anticipated expiration: 2014-08-15
Also published as: UA49793C2; DK0640619T3; NO2007008I2; NO2007008I1; ATE155796T1; IL110669A; CZ291342B6; NO323104B1; IL192290A0; FI951792A0; CN1105030A; NO951445L; EP0640619A1; WO1995005465A1; AU7632794A; NO951445D0; EP0640619B2; CZ91795A3; RU95115239A; EP0640619B1

Abstract

公开了具有至少一个额外糖基化位点或至少一个糖基化位点重排的促红细胞生成素类似物。本发明还涉及编码所述促红细胞生成素类似物的DNA顺序，以及供类似物表达的重组质粒和宿主细胞。

Description

促红细胞生成素类似物

本发明涉及具有至少一个额外糖基化位点或至少有一个糖基化位点重排的促红细胞生成素类似物。本发明还涉及编码所述促红细胞生成素类似物的DNA顺序，以及供类似物表达的重组质粒和宿主细胞。

促红细胞生成素(EPO)是一种与红细胞祖先细胞成熟为红细胞的过程有关的糖蛋白激素。它是调节循环中的红血细胞水平所必需的。天然存在的促红细胞生成素在胎儿期由肝脏产生，成人则由肾脏产生，它在血液中循环，刺激骨髓中红血细胞的产生。贫血几乎都是由于肾脏产生的促红细胞生成素减少而造成肾衰竭的结果。现已发现，用遗传工程技术生产的重组促红细胞生成素可有效地用于治疗由慢性肾衰竭引起的贫血，这类技术涉及用编码促红细胞生成素的基因转化宿主细胞，再由该宿主细胞表达蛋白产物。

正常情况下，人尿中含低水平的促红细胞生成素，而患有再生障碍性贫血的个体尿中促红细胞生成素水平则升高。Miyake等人(J.Biol.Chem.，252：5558，1977)曾用再生障碍性贫血个体的尿液作原料来纯化人尿促红细胞生成素。但迄今为止尚未证实尿促红细胞生成素有治疗作用。

授予Lin的美国专利4,703,008描述了促红细胞生成素编码基因的鉴定、克隆和表达，该专利的公开内容在此列为参考。授予Lai等人的美国专利4,667,016描述了一种从细胞培养基中纯化重组促红细胞生成素的方法。由在重组质粒上含有促红细胞生成素基因的哺乳动物细胞宿主表达和回收生物活性重组促红细胞生成素，使人们第一次可以得到适于在医疗上应用的大量促红细胞生成素。此外，由于了解了基因顺序并能得到较大量的纯化蛋白，对该蛋白的作用机理也有了更深入的了解。

真核细胞产生的许多细胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一个或更多个寡糖基团修饰。这种称为糖基化的修饰作用能剧烈地影响蛋白的物理性质，对蛋白的稳定性、分泌和亚细胞定位也会起重要作用。正确的糖基化有时是生物活性所必需的。事实上，某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的细胞过程的细菌(如大肠杆菌)中表达时，所回收到的蛋白由于缺少糖基化而没有或几乎没有活性。

糖基化作用出现在多肽骨架的特异位置上，通常有两类：O连接的寡糖连在丝氨酸或苏氨酸残基上，而N连接的寡糖则连在作为顺序Asn-X-Ser/Thr一部分的天冬酰胺残基上，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。N连接和O连接的寡糖的结构以及每种类型中存在的糖残基都是不同的。共同存在于两类型中的一类糖是N-乙酰基神经氨酸(以下称为唾液酸)。唾液酸通常是N连接和O连接寡糖的末端残基，由于它带有负电荷，可能会使糖蛋白具有酸性。

具有人促红细胞生成素氨基酸顺序1-165的人尿促红细胞生成素和重组促红细胞生成素(在哺乳动物细胞内表达的)，都含有三个N连接寡糖链和一个O连接寡糖链，它们共占糖蛋白总分子量的约40％。N连接糖基化出现24、38和83位的天冬酰胺残基，而O连接糖基化则出现在126位的丝氨酸残基(Lai等，J.Biol.Chem.261：3116，1986；Broudy等，Arch.Biochem.Biophys.265：329，1988)。已证明寡糖链被末端唾液酸残基修饰。对糖基化促红细胞生成素进行酶处理而脱除所有的唾液酸残基后，导致体内活性丧失，但并不影响体外活性(Lowy等，Nature 185：102，1960；Goldwasser等，J.Biol.Chem.249：4202，1974)。这一现象曾被解释为：无唾液酸促红细胞生成素由于与肝无唾液酸糖蛋白结合蛋白相互作用而从循环中迅速清除(Morrell等，J.Biol.Chem.243：155，1968；Briggs等，Am.J.Physiol.227：1385，1974；Ashwell等，Methods Enzymol.50：287，1978)。因此，促红细胞生成素只有在被唾液酸化从而避免被肝结合蛋白结合时才具有体内生物活性。

促红细胞生成素的寡糖链中其他组分的作用还不十分确定。已证明，部分脱糖基化的促红细胞生成素与糖基化形式相比，体内活性大大降低，但却保留了体外活性(Dordal等，Endocrinology 116：2293，1985；Lin的上述专利)。但另一项研究则表明，如果使作为糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基发生突变，从而单独或共同脱除N连接或O连接的寡糖链，则会使在哺乳动物细胞中产生的突变蛋白的体外活性急剧下降(Dube等，J.Biol.Chem.263：17516，1988)。

糖蛋白如促红细胞生成素，可以用诸如等电聚焦(IEF)等技术分离成不同的带电荷形式。粗制及部分纯化的促红细胞生成素制备物的IEF研究已有多方报道(Lnkowsky等，J.Biochem.50：909，1972；Shelton等，Biochem.Med.12：45，1975；Fuhr等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98：930，1981)。在这些研究中用IEF最多鉴别出三个或四个具有促红细胞生成素活性的部分，但其碳水化合物含量都未得到鉴定。此外，没有对各部分的等电点与其生物活性之间作任何联系。

在Miyake等人(同上)所讨论的从人尿中纯化尿促红细胞生成素的过程中，据报道由羟磷灰石色谱法得到的两个促红细胞生成素部分具有相似的特异活性。这两个部分被定名为II和IIIA。随后对部分II和IIIA进行的碳水化合物分析表明，部分II的平均唾液酸含量比部分IIIA要高(Dordal等，同上)。

本发明的一个目的是提供具有确定唾液酸含量和生物活性的、经过分离的促红细胞生成素异构体。含有这些分子的药物组合物应具有医疗价值。

本发明涉及人促红细胞生成素类似物，这些类似物包含至少包括一个额外糖基化位点的氨基酸顺序。外加的糖基化位点会导致比人促红细胞生成素更大数目的碳水化合物链和更高的唾液酸含量。本发明还提供另一些促红细胞生成素类似物，这些类似物包含包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸顺序。还提供了在促红细胞生成素的羧基末端添加了一个或更多个氨基酸的类似物，其中这种添加作用提供了至少一个糖基化位点。本发明还包括编码这些促红细胞生成素类似物的DNA顺序，以及供类似物表达的重组质粒和宿主细胞。

图1显示了不同重组促红细胞生成素异构体的分析性等电聚焦凝胶。凝胶泳道1-11显示了由泳道1的校弱酸性(pI较高)向泳道11的较强酸性(pI较低)排布的异构体。在凝胶的最左边和最右边的泳道中还显示了含有异构体9-14混合物的纯化重组促红细胞生成素。

图2显示了每个促红细胞生成素异构体的唾液酸数目与每个异构体的体内特异活性的关系，以每mg促红细胞生成素多肽的单位数表示。在图2A中，每个促红细胞生成素异构体的浓度是用Bradford蛋白测定法测定的；在图2B中，该浓度是利用280nm处的光吸收测定的；在图2C中，该浓度是用RIA法测定的。

图3显示了各种重组促红细胞生成素异构体的确定混合物的分析性等电聚焦凝胶，这些异构体是用阴离子交换色谱法在不同条件下制备的。凝脉泳道1-6分别代表在用150mM乙酸pH4.7、150mM乙酸(未缓冲)、200mM乙酸pH4.7、250mM乙酸pH4.7、300mM乙酸pH4.7或300mM乙酸(未缓冲)洗涤Q-Sepharose快速流动柱后在高盐洗脱液中洗脱出的促红细胞生成素异构体。该凝胶最左边的泳道还示出了含有一种异构体混合物的纯化重组促红细胞生成素，所述异构体混合物是用Lai等人(同上)的实施例2所述的方法制得的，所不同的是用Q-Sepharose色谱法代替了DEAE-Agarose色谱法。

图4显示了促红细胞生成素异构体8-12的分离，分离方法是：将细胞条件培养基加到Q-Sepharose柱上，用pH递减而离子强度递增的梯度进行洗脱，从部分2到部分40的偶数部分中取等份试样进行分析性等电聚焦。该凝胶最左边的泳道还示出了含有一种异构体混合物的纯化重组促红细胞生成素，所述异构体混合物是用Lai等人(同上)的实施例2所述的方法制得的，所不同的是用Q-Sepharose色谱法代替了DEAE-Agarose色谱法。

图5显示了人促红细胞生成素的氨基酸顺序。方块表示连有N连接碳水化合物链的天冬酰胺残基，星号表示被O连接碳水化合物链修饰的丝氨酸残基。

图6A、6B和6C显示用于产生供构建和分析人促红细胞生成素类似物的质粒的系列克隆步骤。这些类似物有一些如图5所示的突变氨基酸，这些氨基酸提供了额外的糖基化位点。

图7显示了人顺序促红细胞生成素和所指出的促红细胞生成素类似物的COS细胞上清液Western印迹分析。类似物[Asn⁹，Ser¹¹]EPO、[Asn⁶⁹]EPO、[Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO是如实施例6所述构建的。还显示了不含额外碳水化合物链的其他类似物[Pro¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO和[Asn¹²⁶，Ser¹²⁸]EPO以进行比较。

图8显示了经N-聚糖酶处理后的人顺序促红细胞生成素和所指明的促红细胞生成素类似物的COS细胞上清液Western印迹分析。类似物[Thr¹²⁵]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO是如实施例6所述构建的。还显示了类似物[Val¹²⁶]EPO、[Pro¹²⁴]EPO、[Pro¹²⁵]EPO、[Thr¹²⁷]EPO、[Pro¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO和[Thr¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO以进行比较。

图9显示了由一种细胞培养基的Q-Sepharose和C4反相色谱得到的并集液2、3和4的等电聚焦凝胶，所述细胞培养基曾支持用含有[Thr¹²⁵]突变的促红细胞生成素cDNA转染的CHO细胞的生长。该凝胶左边和右边的泳道还示出了含有一种异构体混合物的纯化重组促红细胞生成素，所述异构体混合物是用Lai等人(同上)的实施例2所述的方法制得的，所不同的是用Q-Sepharose色谱法代替了DEAE-Agarose色谱法。

图10显示了重组人促红细胞生成素(rHuEPO)和选定的类似物的COS细胞上清液Western印迹分析。类似物的构建描述于实施例6。较低的凝胶迁移率证实了类似物N9、N14、N18、N19、N21、N24和N39具有至少一个额外碳水化合物链。

图11显示了重组人促红细胞生成素和EPO N14在N-聚糖酶消化过程中的COS细胞上清液Western印迹分析。时间点取在0、4、12和45分钟以及过夜消化后。

图12显示了EPO N14类似物异构体制备物的等电聚焦凝胶。低异构体并集液含有每分子多半有6-12个唾液酸的EPO N14类似物，中异构体并集液含有每分子多半有10-15个唾液酸的类似物N14，高异构体并集液含有每分子多半有12-17个唾液酸的EPO N14类似物。

图13显示了重组人促红细胞生成素、分离的异构体14和EPO N14类似物(异构体15-17)给大鼠静脉注射后的药代动力学。

图14显示了在不同量的未标记rHuEPO、分离的异构体14或EPO N14类似物存在下，¹²⁵I标记的重组人促红细胞生成素与促红细胞生成素受体结合的冷置换试验。

图15显示了小鼠血细胞比容试验，该试验比较了EPON14高异构体并集液(0.036和0.0712μg)、分离的异构体14(0.036和0.0712μg)、EPO177低异构体并集液(0.0712μg)和rHuEPO(0.071μg)的活性。

本发明提供促红细胞生成素异构体。按本发明得到的特定促红细胞生成素异构体及其性质，可能会随起始物的来源而变化。例如，得自尿的人促红细胞生成素的异构体不同于重组促红细胞生成素的异构体。在一个优选的实施方案中，本发明涉及每个促红细胞生成素分子含有特定数目(即大于0的定数)唾液酸的促红细胞生成素异构体，所述数目选自1-14。所述数目最好是9、10、11、12、13或14。在另一个实施方案中，所述数目大于14，最好是16-23。

这里所用的术语“促红细胞生成素异构体”是指具有单一等电点(pI)并具有相同氨基酸顺序的促红细胞生成素制备物。这里所用的术语“促红细胞生成素”包括天然存在的促红细胞生成素、来源于尿的人促红细胞生成素，以及某些非天然存在的多肽，这些多肽具有与天然存在的促红细胞生成素相似的氨基酸顺序和糖基化作用，其相似程度足以使其具有使骨髓细胞提高网织红细胞和红血细胞产量的体内生物学性质。

已经发现，具有得自尿的人促红细胞生成素氨基酸顺序的重组促红细胞生成素的不同异构体，相应于具有1-14个唾液酸的促红细胞生成素分子，而纯化的重组促红细胞生成素中所含的每一种异构体都具有与该异构体所具有的唾液酸数目相关的体内活性。

这一个优选实施方案中，促红细胞生成素是已转染到非人真核宿主细胞中的外源DNA顺序的表达产物，也就是说，在一个优选的实施方案中，促红细胞生成素是“重组促红细胞生成素”。重组促红细胞生成素最好按共同拥有的美国专利4,703,008(Lin)所述的方法制备，该专利在此列为参考。重组促红细胞生成素可以按共同拥有的Lai等人的美国专利4,667,016(在此列为参考)的实施例2所述的一般方法进行纯化，也可以按Lai等人的实施例2所述的方法，但用Q-Sepharose色谱法代替DEAE-Agarose色谱法来进行纯化。

按照Lai等人(同上)的实施例2纯化的促红细胞生成素，在用IEF法分析时主要含有6种异构体。此外，用实施例4所述的色谱法曾检测出至少一种酸性较强的额外并构体。(这个酸性较强的异构体在IEF凝胶上的迁移率＞14个唾液酸，可能含有非唾液酸负电荷，因为某些电荷能耐受唾液酸酶消化)。这些异构体的唾液酸含量彼此不同。如实施例中所表明的，用制备性IEF分离出其中的10种异构体，并测定其中5种的唾液酸含量，证实了上述结论。在测定过唾液酸含量的异构体中，发现5种异构体含有9、10、11、12或13个唾液酸残基。

异构体5-11(在这里每种异构体以每个促红细胞生成素分子的唾液酸数目命名)的促红细胞生成素相对体内比活与每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数目之间有某种关系。异构体11-14具有大致相同的相对体内比活。异构体5-14的体内活性用外缺氧(exhypoxic)红细胞增多小鼠生物测定法测定，每个异构体的含量则用Bradford蛋白测定法、280nm光吸收法或测定促红细胞生成素的放射免疫测定法(RIA)来测定。以单位/ml表示的RIA测定结果(Egrie等，Immunobiology 172：213，1986)除以212，770单位/mg促红细胞生成素多肽(纯化的促红细胞生成素用RIA法测定的平均比活)，就得到分离的异构体或异构体混合物的蛋白浓度，是以mg促红细胞生成素多肽/ml表示的。如实施例中所表明的，相对体内比活从异构体5到异构体11逐步增加(见表2)。

这里所提到的体内比活是相对体内比活的测定结果，而不是绝对体内比活的测定结果。就本申请的目的而言，比活只用于比校用相同测定法、采用相同条件测定的异构体相对活性，所谓相同条件包括相同的内标、相同的动物类型、计算比活时采用相同的数据分析方法、用相同的测定法测定蛋白含量。所报道的任何异构体的任何体内比活值都不代表该异构体的固有值或绝对值。

本发明还提供含有两种或更多种促红细胞生成素异构体的组合物。在一个实施方案中，这些组合物含有一种异构体混合物，其中的各异构体的每个促红细胞生成素分子中含有大于预定数目的唾液酸，如每个促红细胞生成素分子大于11个唾液酸或每分子大于12个唾液酸，例如异构体12、13和14的混合物。在另一个实施方案中，这些组合物含有另一些异构体混合物，其中的各异构体的每个促红细胞生成素分子中含有预定数目的唾液酸，例如每分子少于12个但多于8个唾液酸，例如异构体9、10和11的混合物。本发明还提供各异构体相对量相同或不同的促红细胞生成素异构体组合物。例如，异构体9、10和11混合物中的各异构体的量会是各种比例，例如1∶1∶1、2∶3∶1或20∶20∶1。

这些组合物最好含有少于4种异构体的混合物，例如异构体11、12和13的混合物、或12和14的混合物，或7和13的混合物。

为了制备促红细胞生成素异构体的混合物，本发明还同时提供了分离选定的促红细胞生成素异构体的方法。这些方法包括：用诸如制备性等电聚焦等技术分离单个异构体，或者用诸如离子交换色谱或色谱聚焦等技术制备每分子含有预定数目(如大于11个)唾液酸的异构体混合物。所有这些技术的原理都是根据电荷来分离蛋白质

一般来说，离子交换色谱和色谱聚焦涉及在能使某些或所有促红细胞生成素异构体与树脂结合的条件下，将粗制人促红细胞生成素(细胞条件培养基)或经过纯化的物质加到树脂柱上。对粗制促红细胞生成素制备物来说，优选在约pH7下将蛋白上柱；而对纯化制备物来说，则可在pH7至约pH4下将蛋白上柱。用约pH4的缓冲液洗柱后，提高缓冲液的pH和盐浓度，或采用pH递减而约pH4下的离子强度递增的梯度，洗脱出那些仍与离子交换柱结合的促红细胞生成素异构体。对色谱聚焦来说，用pH递减的梯度或通过用高浓度的盐洗柱而从柱中洗脱出异构体。

在一个优选的实施方案中，用离子交换色谱法分离单个异构体。例如，如实施例8所述用离子交换色谱法分离异构体14。

本发明还包括某些人促红细胞生成素类似物。这里所用的短语“人促红细胞生成素类似物”是指人促红细胞生成素氨基酸顺序中有一个或更多个变化的促红细胞生成素，这些变化导致唾液酸连接位点的数目增加。类似物是用定位诱变产生的，造成氨基酸残基的添加、缺失或置换，从而增加或改变可供糖基化的位点。这些类似物可以具有比人促红细胞生成素更多数目的碳水化合物链。

本发明的促红细胞生成素类似物包含包括至少一个额外糖基化位点的氨基酸顺序。唾液酸含量高于人促红细胞生成素的类似物是通过添加糖基化位点而产生的，而这些糖基化位点不干扰生物活性所需的二级或三级构象。人促红细胞生成素类似物最好有1、2或3个额外N-糖基化或O-糖基化位点，从而添加1、2或3个额外N连接或O连接碳水化合物链。例如，用天冬酰胺置换69位的亮氨酸，得到顺序Asn-Leu-Ser，该顺序就成为第4个N-糖基化位点。这样一种变化通常可为每分子提供最多4个额外唾液酸。产生额外O-糖基化位点的变化的例子有：125位的丙氨酸变为苏氨酸；124位和1 25位的丙氨酸交为脯氨酸。可以构建出具有一个或更多个额外N连接和O连接链的类似物，例如表5中所述的类似物NO1和NO2。本领域技术人员将会认识到，本发明包括具有额外糖基化位点的许多其他人促红细胞生成素类似物。

本发明还包括在某个糖基化位点碳水化合物连接量增加的类似物。这类类似物通常涉及与N连接或O连接位点很接近的一个或更多个氨基酸的置换。这些氨基酸变化的结果将使更大比例的促红细胞生成素多肽具有碳水化合物修饰。糖基化位点可以是天然存在的，也可以通过突变产生。例如，类似物N13即使在88位引入一个糖基化位点也不产生额外的碳水化合物链。然而，分别在87位置换上丝氨酸和缬氨酸残基的类似物N14和N18，则在88位有一个额外碳水化合物链。

本发明还提供从促红细胞生成素的羧基末端延伸出一个或更多个氨基酸的类似物，其中该羧基末端延伸提供至少一个额外碳水化合物位点。在一个实施方案中，通过使人绒毛膜促性腺激素(HCG)羧基末端的28个氨基酸与人促红细胞生成素166位的天冬氨酸残基融合而构建出一种类似物。HCG羧基末端片段有4个O-糖基化位点(Kessler等，J.Biol.Chem.254：7907，1979)。

表3、4和5列出了具有额外N连接和/或O连接碳水化合物链位点的促红细胞生成素类似物。这些类似物在人促红细胞生成素多肽链的不同位置上置换上了Asn-X-Ser/Thr顺序，从而产生了N连接位点，或者引入了丝氨酸或苏氨酸残基，从而产生了O连接位点。

表6列出了加入了至少一个额外N连接碳水化合物链或一个额外O连接碳水化合物链，或者同时加入了额外N连接链和O连接链的那些类似物，这些额外链的加入得到了糖蛋白在SDS凝胶上迁移现象的证实(实施例7)。由表3-6可见，具有一个或更多个额外碳水化合物连接位点的类似物并不一定使促红细胞生成素分子带有额外碳水化合物链。例如，在123位和125位置换上苏氨酸残基导致加入一个O连接的碳水化合物链，而在其他位置置换上丝氨酸或苏氨酸则不导致类似物带有额外O连接链(见表4)。但是，在人促红细胞生成素氨基酸顺序的30、51、57、69、88、89、136和138位置换上天冬酰胺残基，则导致在这些位点加入N连接链。HCG多肽片段与人促红细胞生成素166位的天冬酰胺残基的融合，产生一种至少有两个额外O连接碳水化合物链的促红细胞生成素-HCG融合分子。

本发明的促红细胞生成素类似物还包括其氨基酸顺序包括至少一个糖基化位点重排的促红细胞生成素。这里所用的糖基化位点重排是指人促红细胞生成素中一个或更多个糖基化位点的缺失，以及一个或更多个非天然存在的糖基化位点的加入。类似物R1、R2和R3是这种重排的例子，这些类似物是通过分别在24、38或83位缺失N连接位点和在88位加入一个N连接位点而构建的。但是，还可能有许多其他类型的碳水化合物位点重排，所产生的类似物的糖基化位点数目也许比人促红细胞生成素多，也许不比人促红细胞生成素多。

分析了类似物R1、R2和R3的体内生物活性，结果示于表7。在Asn88位引入一个N连接链，使得缺失了3个天然存在N连接位点中任一个的促红细胞生成素恢复了生物活性。这些结果表明，可以改变碳水化合物链在促红细胞生成素中的位置，从而产生有用的类似物而不显著影响生物活性。

本发明还包括一些DNA顺序，这些顺序编码具有额外N连接和/或O连接链位点的促红细胞生成素类似物、具有至少一个碳水化合物链连接位点重排的类似物、以及从促红细胞生成素的羧基末端延伸出一个或更多个氨基酸的类似物。为了产生和改变碳水化合物连接位点而在人促红细胞生成素DNA顺序中引入变化所用的方法，公开于实施例6中。

这些促红细胞生成素类似物可以是外源DNA顺序的表达产物，即通过重组DNA技术产生的，也可以是合成的产物。外源DNA顺序包括编码促红细胞生成素类似物的cDNA、基因组DNA或化学合成DNA。还提供了用于表达所述类似物的重组DNA质粒和真核宿主细胞。表达载体包括能够在真核宿主细胞中表达克隆DNA顺序的任何载体，特别是用于在COS和CHO细胞中表达的那些载体。这些载体的例子包括本说明书的实施例6中所述的质粒pEC和pDECΔ。表达促红细胞生成素类似物的COS和CHO宿主细胞的培养，用本领域技术人员已知的方法来进行。

来源于促红细胞生成素类似物的分离的异构体和异构体混合物，是用上述制备人促红细胞生成素异构体的方法制得的。这些方法可以包括等电聚焦、离子交换色谱和色谱聚焦。优选用离子交换色谱法来制备来源于促红细胞生成素类似物的单个异构体和异构体混合物。

增加促红细胞生成素上碳水化合物链的数目，并因此而增加每个促红细胞生成素分子的唾液酸数目，可以产生一些优越的性质，例如溶解度提高、更能耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半寿期增长、生物活性提高。

分析了表达促红细胞生成素类似物的CHO细胞条件培养基的体内生物活性，结果示于表6。所测试的若干类似物的活性比人促红细胞生成素高3倍或更多。具体地说，在30位或88位有一个额外N连接碳水化合物链的类似物显示出比人促红细胞生成素高2-3倍的活性；而由于人促红细胞生成素与HCG多肽片段融合而带有额外O连接链的类似物，其活性至少高二倍。

纯化出两个带有额外碳水化合物链的促红细胞生成素类似物，并分离出具有不同唾液酸含量的异构体混合物(实施例8)。将Thr¹²⁵和Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(EPO N14)类似物分离成三个独立的异构体部分，并测定了每个部分的体内生物活性。表8所示的结果证实，唾液酸含量较高的EPO N14异构体部分的体内活性较高。

在受体结合试验、药代动力学实验、以及测定小鼠血细胞比容增加的实验中，研究了EPO N14类似物的高唾液酸异构体并集液与重组人促红细胞生成素(异构体9-14)。这些试验的结果表明，唾液酸含量、清除半寿期与提高受处理小鼠血细胞比容的能力之间有直接的关系。例如，如图13、14和15所示，EPO N14高唾液酸异构体并集液与分离的异构体14或重组人促红细胞生成素相比，体内半寿期明显增长，也促使血细胞比容增加得更多，尽管N14高唾液酸异构体并集液与受体的结合不那么强。

本发明的另一实施方案涉及哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢，CHO)宿主细胞，该宿主细胞优先合成每分子含有高于特定数目的唾液酸(例如每分子大于10个唾液酸)的人促红细胞生成素异构体或促红细胞生成素类似物异构体。促红细胞生成素分子具有能限制该分子唾液酸含量的N连接和O连接寡糖结构。例如，四分支N连接寡糖最常见的是提供4个可能的唾液酸连接位点，而二分支和三分支寡糖能够在天冬酰胺连接位点取代四分支形式，通常至多只连有2个或3个唾液酸。O连接寡糖通常提供2个唾液酸连接位点。于是，假如所有三个N连接寡糖都是四分支的，则促红细胞生成素分子能容纳总共14个唾液酸残基。从哺乳动物细胞培养物中筛选出那些在重组促红细胞生成素上优先加入四分支链的细胞，从而尽量增多唾液酸连接位点的数目。

尿促红细胞生成素的N连接寡糖所含的唾液酸，既以α-2，3连键也以α-2，6连键与半乳糖相连(Takeuchi等，J.Biol.Chem.263：3657，1988)。一般来说，α-2，3连键的唾液酸是加到甘露糖α-1，6分支上的半乳糖上，而α-2，6连键的唾液酸是加到甘露糖α-1，3分支上的半乳糖上。加入这些唾液酸的酶(β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶和β-半乳糖苷α-2，6唾液酸转移酶)能最有效地分别将唾液酸加到甘露糖α-1，6分支和甘露糖α-1，3分支上。

二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是常用于生产包括重组促红细胞生成素在内的重组糖蛋白的宿主细胞。这些细胞不表达β-半乳糖苷α-2，6唾液酸转移酶，所以不会在这些细胞所产生的糖蛋白的N连接寡糖上加入α-2，6连键的唾液酸(Mutsaers等，Eur.J.Biochem.156：651，1986；Takeuchi等，J.Chromatogr.400：207，1987)。所以，CHO细胞中产生的重组促红细胞生成素缺少与半乳糖2，6连接的唾液酸(Sasaki等，1987，同上；Takeuchi等，1987，同上)。

在本发明的另一个实施方案中，人促红细胞生成素或促红细胞生成素类似物是在用功能性β-半乳糖苷α-2，6唾液酸转移酶基因转染的CHO细胞中产生的，从而使唾液酸以α-2，6连键掺入到半乳糖中。所得的异构体将含有以α-2，3和α-2，6连键与半乳糖连接的唾液酸。有关创建经过修饰的CHO细胞或其他哺乳动物宿主细胞的技术公开，参见Lee等，J.Biol.Chem.264：13848，1989，该文献在此列为参考。

本发明还包括一些药物组合物，这些组合物含有治疗有效量的特定异构体或异构体混合物，以及可用于促红细胞生成素治疗的合适稀释剂、助剂和/或载体。也包括含有治疗有效量的促红细胞生成素类似物及合适稀释剂、助剂和/或载体的药物组合物。这里所用的“治疗有效量”是指对给定病症和给药方案而言能产生疗效的量。人促红细胞生成素异构体或促红细胞生成素类似物优选以肠胃外途径给药。所选择的具体途径将取决于所治疗的病症。人促红细胞生成素异构体或促红细胞生成素类似物优选作为某种制剂的一部分给药，该制剂还含有合适的载体(如人血清清蛋白)、合适的稀释剂(如缓冲盐溶液)和/或合适的助剂。所需的剂量应是足以提高患者的血细胞比容的量，该剂量将随着所治疗症状的严重程度、采用的给药方法等而变化。

提供下列实施例更详细地说明本发明，但这些实施例不应误认为是限制发明范围。实施例中所采用的体内生物测定中所用的促红细胞生成素标准物是重组促红细胞生成素标准物，该标准物已相对于部分纯化的尿促红细胞生成素标准物标准化。因此，只测定相对体内比活。另外，体内比活以“单位/ml”、“单位/mg”和“单位/A₂₈₀”表示，而不以“IU/rnl”、“IU/mg”和“IU/A₂₈₀”表示，因为所用的促红细胞生成素标准物尚未与任何现有的国际标准直接相关。

实施例1：重组促红细胞生成素异构体的分离

如Lin(同上)所述制备重组促红细胞生成素。按照共同拥有的Lai等人专利(同上)的实施例2所述的方法，纯化作为第一次和第三次异构体分离的起始原料使用的重组促红细胞生成素。按照Lai等人(同上)的方法，用经过修改的Q-Sepharose色谱法纯化第二次和第五次分离的起始原料。这些制备物含有与来源于尿的人促红细胞生成素具有相同氨基酸顺序的重组促红细胞生成素的异构体混合物，主要含有异构体9-14。第四次异构体制备的起始原料，是Lai等人的实施例2中用5mM乙酸/1mM甘氨酸/6M脲洗涤阴离子交换柱过程中洗脱出的物质。该部分含有带少于或等于9个唾液酸的异构体，并用Lai等人的实施例2所述的凝胶过滤色谱法进行了进一步纯化，然后才用于制备性等电聚焦步骤。第六次异构体制备使用的起始原料是带有4-13个唾液酸残基的重组促红细胞生成素的纯化制备物。该物质按照Lai等人的实施例2进行纯化，但对离子交换柱的操作作了修改(用pH8.4的氯化钠梯度洗脱重组促红细胞生成素，并省去乙酸/脲洗涤)，使起始原料中所含的多数异构体得以保留。

基本上按照LKB Application Note 198，通过在粒状凝胶板(Ultrodex，LKB)中进行制备性等电聚焦而进行六次不同的单个异构体制备。使用Pharmalyte(Pharmacia)2.5-5两性电解质(Pharmacia)，凝胶板含有5M脲。

在第一次制备中，将6.8ml 20mM柠檬酸钠/100mM氯化钠pH7.0中的约20mg重组促红细胞生成素加到凝胶上，于8瓦下聚焦约16小时。等电聚焦后，用凝胶板的纸接触印迹来显现凝胶中的异构体条带。制得印迹后，在固定液(40％甲醇/10％乙酸/10％TCA/3.5％磺基水杨酸)中浸泡三次(每次约10分钟，室温)使之固定，用40％甲醇/10％乙酸(30-60℃)处理一次(约10分钟)，于60℃下在0.125％考马斯蓝R-250/40％甲醇/10％乙酸中染色15分钟，然在7.5％甲醇/10％乙酸中脱色，以显现出分离的异构体。取出粒状凝胶上含有异构体(～50％树脂)的区域，加入水(～16ml)，将该浆液倒入5.5×24.5英寸盘中，蒸发至净重～40g。该制备物进行第二次聚焦，并如上所述制备凝胶板的接触印迹。从凝胶板上取下含有6个可辨认异构体的凝胶部分。

为了从凝胶中洗脱出异构体，在每个异构体上加含有10mM Tris-HCl pH7.0/5mM Chaps的溶液，生成一种浆状物，将浆状物置于一些小柱中，用Tris-Chaps缓冲液洗涤。收集流出液，分别加到装有VydacC4反相树脂并在20％乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0中平衡过的小柱上(开放柱型)。用20％乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0、35％乙醇/10mMTris-HCl pH7.0和65％乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0将柱分步展开。在65％乙醇/10mM Tris中洗脱出的部分用10mMTris-HCl pH7.0以1∶1稀释，浓缩后，用Centricon-10(Amicon)微型浓缩器与10mM Tris-HCl pH7.0进行缓冲液交换。基本上如LKB Technical Note 250所述，在含有5M脲的聚丙烯酰胺凝胶中用Servalyte 3-5两性电解质(Serva)对上述制备物进行分析性等电聚焦。

在第二次制备中，将6.5ml去离子水中的约26mg重组促红细胞生成素加到凝胶上，于2.5瓦下聚焦25分钟，在10瓦下聚焦约17小时。取下凝胶板上可见的聚焦蛋白条带，成为11个不同的并集物。用去离子水将每个并集物调至约7.5ml，从每个所得并集物上清液中取20ml，如上所述进行分析性等电聚焦。在每个并集物中加入5ml 1.5M Tris-HCl pH8.8，将浆液分别置于一些小柱中，并使液相流过。将树脂用约三倍体积的0.5M Tris-HCl pH7洗涤，洗涤液与流出液合并。将流出液浓缩，用分子量截留值为10,000道尔顿的Amicon一次性超滤装置与20mM柠样酸钠/100mM氯化钠pH7.0进行缓冲液交换。然后使浓缩后的溶液(约0.5ml)通过截留孔径为0.22μm的乙酸纤维素滤膜。根据分析性等电聚焦的结果发现，5个并集物主要含有单一异构体10、11、12、13和14。

在第三次制备中，将21.8ml蒸馏水中的约30mg重组促红细胞生成素加到凝胶上，于2瓦下聚焦25分钟，于10瓦下聚焦20小时，于15瓦下聚焦15分钟。用肉眼观察相应于各异构体的蛋白条带，并从凝胶板上取下这些条带。在经过凝胶分离的异构体中加入蒸馏水，生成一种浆状物，所得上清液用分析性等电聚焦法进行分析。在每个浆状物中加入等体积的1MTris-HCl pH7.2，将悬浮液分别加到一些小柱中，并使液相过柱以洗脱异构体。将每份流出液浓缩，并用截留分子量为10,000道尔顿的Amicon一次性超滤装置与20mM柠檬酸钠/100mM氯化钠pH7.0进行缓冲液交换。分析性等电聚焦凝胶显示，所得到的并集物中主要含有单一异构体9、10、11、12、13和14。

第四次异构体制备使用含有异构体3-9的促红细胞生成素(如上所述制备)作为其起始原料。在基本上如前面对制备1-3所述进行制备性等电聚焦之前，在Rotofor(Bio-Rad，Richmond，CA)液相等电聚焦槽中使两性电解质(Pharmalyte2.5-5)预分级，所得到的两性电解质范围更适合起始原料的较低等电点。进行预分级的方法是：使6.7ml Pharmalyte2.5-5与15g脲混合，加入纯化水使体积达到50ml。在Rotofor中使该混合物于10瓦和1℃下分级5.5小时，分别用0.1M磷酸和0.1M氢氧化钠作阳极电解液和阴极电解液。在平板等电聚焦中使用测定pH在4.5和约6之间的两性电解质部分。

用Centrieluter(Amicon，Danvers，MA)和截留分子量为10,000的Centricon(Amicon)从异构体中除去两性电解质，操作时采用下列参数：0.18M Tris缓冲液pH8.8、100伏、25-30mA，3小时。然后用Sephadex G-25(Pharmacia)以凝胶过滤法使异构体与0.1M氯化钠进行缓冲液交换。所得的5个并集物的分析性等电聚焦结果表明它们含有异构体4、5、6、7和8。异构体4聚焦出好几个条带，表明它可能经历过某种程度的降解。

第五次异构体制备作了修改，在平板等电聚焦步骤中增加了预聚焦步骤。在这一修改中，蛋白不是在电泳前加到两性电解质/脲/凝胶混合物中，而是在凝胶中产生pH梯度后加到等电聚焦装置中的。预聚焦75分钟(1500伏-小时)后，从阴极端取下2.25-4.25cm的凝胶段，与促红细胞生成素溶液混合，再加回到凝胶板中。等电聚焦后，从凝胶板中洗脱出异构体10、11、12、13和14，并用Centricon-10(Amicon)装置用超滤法使其与两性电解质分离。

进行预聚焦这一修改是为了使异构体制备物的紫外吸收特性与起始的重组促红细胞生成素更为相似。在分离的异构体280nm和260nm光吸收的比例上可以看出这一光谱特性的改进。制备物2和3(未经预聚焦)的异构体280nm光吸收与260nm光吸收的平均比例(A₂₈₀/A₂₆₀)为1.36±0.11，而制备物5和6(经过预聚焦)的平均A₂₈₀/A₂₆₀比例为1.68±0.20。如果从计算中排除异构体14，则制备物2和3与5和6的平均A₂₈₀/A₂₆₀比例分别为1.39±0.11和1.74±0.09。(异构体14的光谱可能最不典型，因为它的含量最少，因此更易受两性电解质组分微量污染的干扰，或者因为它在平板等电聚焦过程中与电极最接近)。按照Lai等人的实施例2(如上所述作了修改，用Q-Sepharose作为阴离子交换树脂)制备的重组促红细胞生成素的平均A₂₈₀/A₂₆₀比例为1.91±0.04。

如上所述，第六次异构体制备的起始原料是含有异构体4-13的重组促红细胞生成素制备物。按第四次制备的方法在Rotofor装置中使两性电解质预聚焦。用测定pH在3.7和4.8之间的两性电解质部分进行平板等电聚焦。按第五次制备的方法对平板进行预聚焦，超滤(Centricon-10)除去载体两性电解质后得到异构体9、10、11、12和13。

实施例2：重组促红细胞生成素异构体的唾液酸含量

取如实施例1所述分离的异构体和按Lai等人同上)所述的方法纯化的促红细胞生成素(异构体9-14的混合物)，与0.10-0.15M氯化钠进行缓冲液交换，并用经过修改的Jourdian等人(J.Biol.Chem.246：430，1971)的方法分析唾液酸含量。用0.35M硫酸在80℃下水解30分钟，从糖蛋白上切上唾液酸残基，溶液用氢氧化钠中和，然后再进行分析。为了估测促红细胞生成素蛋白的含量，用具有人促红细胞生成素氨基酸顺序的重组促红细胞生成素作为标准物进行Bradford蛋白测定(Bradford，Anal.Biochem.72：248，1976)，并使用Bio-Rad提供的分析试剂和微量法操作步骤。结果示于表1，以每摩尔促红细胞生成素的唾液酸摩尔数表示。异构体按每个分子上的唾液酸数目命名，并从酸性最弱(异构体9)到酸性最强(异构体13)排布。异构体9-13示于图1的凝胶泳道6-10中。异构体14的量不足以准确测定唾液酸含量。该异构体的唾液酸含量由其在IEF凝胶上相对于其他异构体的迁移率来推测。异构体5-8(制备4)的唾液酸含量尚未测定，但也同样由其在IEF凝胶上的迁移率来推测。

表 1

促红细胞生成素异构体每摩尔促红细胞生成

素的唾液酸摩尔数

异构体13 12.9±0.5

异构体12 11.8±0.2

异构体11 11.0±0.2

异构体10 9.8±0.3

异构体9 8.9±0.6

异构体混合物(9-14) 11.3±0.2

实施例3：重组促红细胞生成素异构体的活性

利用280nm光吸收法、Bradford蛋白测定法和测定促红细胞生成素的RIA法，测定如实施例1所述分离的异构体中重组促红细胞生成素的含量。利用外缺氧红细胞增多小鼠生物测定法(Cotes等，Nature 191：1065，1961)，测定相对体内生物活性。利用测定促红细胞生成素的放射免疫测定法对促红细胞生成素蛋白含量进行定量，所得结果是某些异构体的相对体内比活较高，这是由于含有大量唾液酸的异构体的免疫反应性明显下降，导致对促红细胞生成素浓度估测偏低，因而对负电性最强的异构体的相对体内比活估测偏高。小鼠生物测定的测定结果(以单位/ml表示)除以相应的蛋白浓度，就得到体内比活，是以单位/mg促红细胞生成素多肽表示的。这些比活示于表2。

在表2中，“n”是对比活值有贡献的独立异构体制备物的数目。在大多数情况下，对每个异构体制备物进行多次体内测定。相同的体内数据对所有三栏的比活计算结果都有贡献。由280nm光吸收、放射免疫测定效力或Bradford蛋白测定结果确定每毫克促红细胞生成素多肽的活性单位数。在Bradford蛋白测定中，使用含有异构体9-14的纯化重组促红细胞生成素作标准物。对于用Bradford蛋白测定法进行的计算来说，“n”可能更小一些，因为某些制备物在进行Bradford测定时已不复存在。

在RIA测定和体内测定中，用作标准物的是按照Lai等人(同上)所述的方法纯化的、含有异构体9-14混合物的促红细胞生成素。

以单位/mg促红细胞生成素多肽表示的相对比活，可以换算成单位/A₂₈₀，换算方法是乘以0.807mg促红细胞生成素多肽/A₂₈₀。这一换算系数是把促红细胞生成素的消光系数(1.345mg/A₂₈₀)乘以促红细胞生成素糖蛋白的蛋白含量(约为60％(重量)，Davis等，Biochemistry 26：2633，1987)而推算的，得出mg促红细胞生成素多肽/A₂₈₀(即，1.345mg促红细胞生成素/A₂₈₀×0.60mg多肽/mg促红细胞生成素＝0.807mg多肽/A₂₈₀)。此外，以单位/mg促红细胞生成素多肽表示的比活，乘以系数0.60mg多肽/mg促红细胞生成素糖蛋白，就可以得到以单位/mg促红细胞生成素糖蛋白表示的比活。

表 2

U/mg多收 U/mg多肽 U/mg多肽异构体(Bradford蛋白测定) n (A₂₈₀) n (RIA) n14 289,400 3,100 2 205,800 37,700 2 366,700 55,900 213 307,600 30,600 4 258,700 59,500 5 337,200 40,200 512 275,200 55,600 4 258,400 41,700 5 287,700 42,600 511 282,700 41,100 3 255,800 67,300 4 251,400 62,700 410 188,000 1,900 1 170,300 34,500 3 171,900 31,600 39 - 96,600 46,700 2 113,600 39,600 28 65,200 3,800 1 70,600 4,100 1 61,000 3,500 17 46,200 5,800 1 50,300 6,300 1 42,800 5,400 15 16,600 1,700 1 18,300 1,900 1 15,500 1,600 1

表2的数据也图示在图2A、2B和2C中。这些数据表明，直到异构体11，促红细胞生成素的相对体内活性都作为唾液酸含量的函数而增加。异构体11-14具有基本相同的相对体内生物活性。(这一点在异构体14的浓度用Bradford测定值表示时最为明显。Bradford值对异构体14来说可能更为准确，因为其得量一般较低，因此难以用A₂₈₀法测定，而且如前面所讨论的，负电性很强的异构体在RIA中反应性的下降最明显)。含有较多唾液酸的促红细胞生成素异构体的相对体内比活校高，这很可能是由于这些异构体的循环半寿期较长。用放射性碘(¹²⁵I)标记异构体9和13，并测定其在大鼠体内的清除速度。异构体13的循环半寿期显著长于异构体9。

实施例4：用Q-Sepharose色谱法选择重组促红细胞生成素异构体混合物

取按照Lin(同上)所述的方法生产重组促红细胞生成素得到的细胞条件培养基，浓缩后用10mM Tris PH7.2透滤。用Bradford微量蛋白测定法测定蛋白浓度，用牛血清清蛋白作标准物。使19.6ml含40mg总蛋白的溶液含20μM CuSO₄，用截留孔径为0.45μm的滤膜过滤，再加到装填有Q-SepharoseFast Flow(Pharmacia)、床体积为4ml(高1.05cm×直径2.2cm)的柱上，该柱已用10mM Tris pH6.8-7.0在4℃下平衡过。上样后，用两个柱体积的相同缓冲液洗柱。柱的流速约为1ml/分。利用该方法设立6个独立的柱，以选择确定的促红细胞生成素异构体混合物。

用6-9个柱体积的低pH缓冲液洗柱，缓冲液的组成为：1号柱：150mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO₄、6M脲，用NaOH调至pH4.7；2号柱：200mM乙酸、1mM甘氨酸、20μMCuSO₄、6M脲，用NaOH调至pH4.7；3号柱：250mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO₄、6M脲，用NaOH调至pH4.7；4号柱：300mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO₄、6M脲，用NaOH调至pH4.7；5号柱：150mM乙酸、1mM甘氨酸、20μMCuSO₄、6M脲；6号柱：300mM乙酸、1mM甘氨酸、20μMCuSO₄、6M脲。用8-11个柱体积的10mM Tris-HCl、55mMNaCl、20μM CuSO₄ pH7洗涤每个柱，使柱的pH提高到约pH7。通过用10mM Tris-HCl、140mM NaCl、20μM CuSO₄pH7.0洗柱，从柱中洗脱出确定的促红细胞生成素异构体混合物。

将每个柱中洗脱出的异构体并集液浓缩，并且Centricon-10微型浓缩器与水进行溶剂交换。这些浓缩并集液的分析性等电聚焦的结果示于图3。凝胶泳道1-6分别代表从1-6号柱中洗脱出的确定促红细胞生成素异构体混合物。图3最右边的凝胶泳道中显示的“异构体混合物”代表如上所述加到Q-Sepharose柱上的细胞培养基，用5mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO₄、6M脲洗柱，利用上述方法从柱中洗脱促红细胞生成素异构体混合物。这个洗脱出的异构体混合物按Lai等人(同上)所述的方法进一步纯化，然后进行分析性等电聚焦。

实施例5：利用低pH梯度在Q-Sepharose上对重组促红细胞生成素异构体进行分级分离

在另一种方法中，利用pH递减但离子强度递增的梯度来分离促红细胞生成素异构体。将经过浓缩透滤的含促红细胞生成素的培养基，以约40mg总蛋白/ml凝胶的比例加到Q-Sepharose柱上。然后用约2个柱体积的10mM Tris-HClpH7.0洗柱，再用约10个柱体积的2mM乙酸/1mM甘氨酸/20μM CuSO₄/6M脲(pH约4.8)洗柱，除去污染蛋白和含少于约7个唾液酸残基的促红细胞生成素异构体。用从约2mM乙酸/6M脲/1mM甘氨酸/20μM CuSO₄起始上升到40mM乙酸/6M脲/1mM甘氨酸/20μM CuSO₄(pH约4)的梯度，从柱中洗脱出含约8至约12个唾液酸的异构体。梯度的总体积约为40个柱体积。将每部分约为1个柱体积的各部分收集在装有Tris缓冲液的容器中，缓冲液的体积足以使pH落在6-8.5范围内，从而避免了所收集的各部分长时间暴露于低pH下。从各部分中取等份试样进行分析性等电聚焦以监测分离过程。图4显示了可用该方法实现的异构体8-11的分离过程。用由10mM Tris-HCl、140mM NaCl、20mM CuSO₄(pH7.0)组成的缓冲液洗涤，洗脱出在梯度结束时仍与柱结合的异构体12-14。如Lai等人的实施例2所述，用反相色谱法及后续的凝胶过滤色谱法使异构体(在梯度中间分离的或被氯化钠溶液洗脱出的)脱除污染蛋白。

实施例6：人促红细胞生成素类似物的构建

人促红细胞生成素氨基酸顺序内现有碳水化合物连接位点的位置示于图5。使促红细胞生成素产生额外糖基化位点的方法概述于图6A-C，并叙述如下。

合成下列用于体外诱变的寡核苷酸引物：

[Asn⁴，Ser⁶]EPO：5′CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3′

[Asn⁹，Ser¹¹]EPO：5′ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3′

[Asn⁶⁹]EPO：5′GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3′

[Asn¹²⁴]EPO：5′TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3′

[Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO：5′CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3′

[Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵]EPO：5′AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3′

[Thr¹²⁵]EPO：5′TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3′

[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO：5′CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3′

划下线的密码子表示以括号中示出的氨基酸置换了野生型氨基酸的错配区。

构建[Asn⁴，Ser⁶]EPO以在Asn4位加入一个N-糖基化位点。构建[Asn⁹，Ser¹¹]EPO以在Asn9位加入一个N-糖基化位点。构建[Asn⁶⁹]EPO以在Asn69位加入一个N-糖基化位点。构建[Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]以在Asn125位加入一个N-糖基化位点。构建[Thr¹²⁵]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO以在Thr125位加入一个O-糖基化位点。

含成下列用于体外诱变的寡核苷酸引物：

[Asn⁶⁹，Thr⁷¹]EPO：5′GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3 ′

[Ser⁶⁸，Asn⁶⁹，Thr⁷¹]EPO：

5′CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′

[Asn¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO：5′CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3′

[Asn¹²⁵，Thr¹²⁷，Thr¹³¹]EPO：

5′ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3′

[Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO：

5′CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3′

[Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO：

5′CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3′

[Thr¹²⁵，Thr¹²⁶]EPO：5′CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3′

[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵，Thr¹²⁶，Thr¹³¹]EPO：

从[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO cDNA起始，用寡核苷酸引物5′AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3′产生[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵，Thr¹²⁶]EPO。用寡核苷酸引物5 TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3′产生[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵，Thr¹²⁶，Thr¹³¹]EPO。

构建[Asn⁶⁹，Thr⁷¹]EPO和[Ser⁶⁸，Asn⁶⁹，Thr⁷¹]EPO，以在Asn69位加入一个N-糖基化位点，并增强该位点的N-糖基化。构建[Asn¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO、[Asn¹²⁵，Thr¹²⁷，Thr¹³¹]EPO、[Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO和[Pro¹²⁴，Asn¹²⁵，Thr¹²⁷]EPO，以在Asn125位加入一个N-糖基化位点，并增强该位点的糖基化。构建[Thr¹²⁵，Thr¹²⁶]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵，Thr¹²⁶，Ser¹³¹]EPO，以在Thr125位加入一个O-糖基化位点，并增强该位点的糖基化。

用于体外诱变的促红细胞生成素DNA的来源是质粒Hu13，这是pUC8中的一个人促红细胞生成素cDNA克隆(Law等，Proc.Natl.Acad.Sci.83：6920，1986)。得自Hu13的质粒DNA用Bst E II和Bgl II限制酶消化，所得的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用制造厂家(BIO 101公司)提供的Gene Clean^TM试剂盒和方法，从凝胶中分离出810bp促红细胞生成素DNA片段。如共同拥有的Lin的专利(同上)中所述，质粒pBRgHuEPO含有促红细胞生成素基因组基因，该基因作为BamHI片段插入在一种pBR322衍生物中。pBRgHuEPO也用BstE II和Bgl II消化，回收到6517bp载体片段。连接这两个片段得到IGT1。为构建pEC-1，用BamHI消化pDSVL(描述于共同拥有的Lin的专利(同上)中，并示于图5B)，并在其中连入从含有促红细胞生成素cDNA的IGT1中分离出的2.8kb BamHI片段。

为了产生供体外诱变的单链DNA，用BamHI和Bgl II消化pEC-1，并分离出820bp促红细胞生成素cDNA片段。将其连入m13mp18的BamHI位点中，得到m13-EC-1。如文献所述(Kunkel等，Methods in Enzymol.154：367，1987；Messing，Methods in Enzymol.101：20，1983)，从用m13-EC-1感染的大肠杆菌RZ1032株的上清液中回收单链DNA。为进行体外诱变，将约1μg单链DNA和0.2皮摩尔的一种上述合成引物与6μl缓冲液(250mM Tris pH7.8、50mM MgCl₂、50mM二硫苏糖醇)混合。为使引物与模板退火，用水将反应体积调至10μl，将混合物在65℃下加热5分钟，然后冷却至室温。为进行伸长反应，加入各2.5μl的dTTP、dATP、dGTP、dCTP和ATP(均为10μM)，然后加入1μl(1单位)大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow片段)和1μl(1单位)T4 DNA连接酶。然后混合物于14℃下保温过夜，并如Messing(同上)所述用于转化大肠杆菌JM109(Yanish-Perron等，Gene 33：103，1985)。

为了用差示杂交法鉴定突变克隆，将营养琼脂上的噬斑转移到Gene Screen滤膜(New England Nuclear)上。将滤膜放在加热灯下干燥，然后在含有1％SDS的6×SSC中于60℃下保温1小时。为进行杂交，将上述寡核苷酸引物(8皮摩尔)用T4多核苷酸激酶和γ-³²P标记的ATP进行末端标记，并与滤膜一起在6×SSC、0.5％SDS和100mg/ml鲑精DNA中保温过夜，不同突变的保温温度如下：[Asn¹²⁴]突变37℃、[Asn⁴，Ser⁶]突变55℃、[Thr¹²⁵]和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]突变65℃、[Asn⁹，Ser¹¹]和[Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵]突变70℃。第二天，在室温下用6×SSC洗滤膜三次，然后进行放射自显影。如有必要，再用6×SSC在递增的温度下洗滤膜，直到检测不到或几乎检测不到与具有野生型促红细胞生成素cDNA顺序的噬斑的杂交为止。鉴定出在这些条件下给出阳性杂交信号的克隆，并将其再转染到JM109中，以分离纯克隆。双脱氧链终止顺序分析结果表明，存在转变为天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基的突变。

用沸腾法(Holmes等，Anal.Biochem.117：193，1981)，从JM109转染的细胞中回收带有[Asn⁴，Ser⁶]、[Asn⁹，Ser¹¹]、[Asn⁶⁹]、[Asn¹²⁴]、[Asn¹²⁵]、[Ser¹²⁷]、[Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵]、[Thr¹²⁵]和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]突变的双链m13 EC-1 DNA。用BstE II和Xho II消化这些DNA，并分离出810bp促红细胞生成素DNA片段。将pEC-1用BstE II消化，然后用Bgl II部分消化，所得片段的5′端用细菌碱性磷酸酶在10mM Tris pH8中于60℃下脱磷酸化60分钟。分离出缺少810bp BstE II-Bgl II片段的7kb载体片段，并使其与上述促红细胞生成素片段连接。所得的质粒(命名为pEC-X，其中X是类似物编号)含有编码促红细胞生成素类似物的DNA，而该类似物在指定位置上带有突变氨基酸残基。

另外一种方法是，用体外诱变法构建缺失氨基酸残基41-55的促红细胞生成素类似物(pEC34)。这样得到一个较小的(775bp)含BstE II-Bg1 II片段的EPO。如上所述将该片段插入pEC1中。为克隆促红细胞生成素类似物，如上所述用BstE II消化pEC34，用Bgl II部分消化，脱磷酸化后分离载体。然后如上所述使7kb载体片段与促红细胞生成素片段连接。用pEC34进行克隆便于区分重组体和简单的再闭环物。再闭环物产生小于类似物的BstE II-Bgl II片段，这些再闭环物在琼脂糖凝胶上很容易区分出来。

用这些一般方法构建表3、4和5中所示的促红细胞生成素类似物。给出了每个类似物的DNA顺序变化，否则就是用于诱变的寡核苷酸引物的顺序与人促红细胞生成素的顺序互补。

表 3

具有N连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物类似物编号氨基酸置换顺序变化

N1 Asn⁴Ser⁶ CGC→AAC

ATC→AGC

N2 Asn⁹Ser¹¹ AGC→AAC

GTC→AGC

N3 Asn¹⁹Thr²¹ GCC→AAC

GAG→ACG

N4 Asn³⁰Thr³² GCT→AAT

CAC→ACG

N5 Asn⁴² CCA→AAT

N6 Ser⁴²Asn⁴³Thr⁴⁵ CCA→TCA

GAC→AAC

AAA→ACA

N7 Ser⁴⁹ TAT→TCT

N8 Asn⁵¹Thr⁵³ TGG→AAT

AGG→ACG

N9 Asn⁵⁷Thr⁵⁹ GGG→AAC

CAG→ACG

N10 Asn⁶⁹ CTG→AAC

N11 Asn⁶⁹Thr⁷¹ CTG→AAC

TCG→ACA

N12 Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹ N11 加

GCC→TCC

N13 Asn⁸⁸Thr⁹⁰ TGG→AAT

CCC→ACC

N14 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ N13 加

CCG→TCG

N15 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹² N14 加

CAG→ACG

表 3(续)

具有N连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物类似物编号氨基酸置换顺序变化

N16 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶² N14 加

AGG→GCG

N17 Asn⁸⁸Ser⁹⁰ TGG→AAT

CCC→TCC

N18 Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ CCG→GTG

TGG→AAT

CCC→ACC

N19 Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰ CCG→TCG

TGG→AAT

GAG→GGG

CCC→ACC

N20 Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ GAG→AAC

CCC→ATC

CTG→ACG

N21 Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ N20 加

CCG→TCG

N22 Asn¹¹³Thr¹¹⁵ GGA→AAC

CAG→ACG

N23 Asn¹¹⁸Val¹²¹ GCC→AAC

CCT→GTT

N24 Asn¹²¹Ser¹²²Thr¹²³ CCT→AAT

CCA→TCA

GAT→ACT

N25 Asn¹²⁴ GCG→AAT

N26 Ser¹²²Asn¹²⁴ CCA→TCA

GCG→AAC

N27 Asn¹²⁵Ser¹²⁷ GCC→AAC

GCT→TCT

N28 Asn¹²⁵Thr¹²⁷ GCC→AAC

GCT→ACG

表 3(续)

具有N连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物类似物编号氨基酸置换顺序变化

N29 Leu¹²¹Ser¹²²Asn¹²⁵Thr¹²⁷ N28 加

CCT→CTT

CCA→TCA

N30 Thr¹²⁰Gly¹²²Leu¹²³Asn¹²⁵Thr¹²⁷ N28 加

TCC→ACC

CGC→GGG

GAT→CTC

N31 Asn¹²⁶Ser¹²⁸ TCA→AAT

GCT→TCT

N32 Asn¹²⁶Thr¹²⁸Val¹²⁹ TCA→AAT

GCT→ACT

CCA→GTA

N33 Leu¹²¹Ser¹²²Asn¹²⁶Thr¹²⁸Val¹²⁹ N32 加

CCT→CTT

CCA→TCA

N34 Thr¹²¹G1y¹²³Ser¹²⁵Asn¹²⁶Thr¹²⁸Val¹²⁹ N32 加

CCT→ACG

GAT→GGG

GCC→TCC

N35 Ser¹²⁹Asn¹³⁰ CCA→AGC

CTC→AAC

N36 Asn¹³² ACA→AAC

N37 Asn¹³⁴Thr¹³⁶ ACT→AAT

GAC→ACC

N38 Asn¹³⁵ GCT→AAT

N39 Asn¹³⁶Thr¹³⁸ GAC→AAC

TTC→ACC

N40 Asn¹³⁷Thr¹³⁹ ACT→AAT

CGC→ACC

N41 Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰ TTC→AAC

AAA→ACA

表 3(续)

具有N连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物类似物编号氨基酸置换顺序变化

N42 Asn¹⁴⁴ GTC→AAC

N43 Ser¹⁴³Thr¹⁴⁹Val¹⁵⁰ TTC→TCC

CTC→ACC

CGG→GTG

N44 G1y¹⁴⁸Thr¹⁴⁹ TTC→GGC

CTC→ACC

N45 Asn¹⁵⁵ CTG→AAT

N46 Asn¹⁶³Ser¹⁶⁵ ACA→AAT

N47 Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ N4和N18

N48 Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ N11和N14

表 4

具有O连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物类似物编号氨基酸置换顺序变化

O1 Ser⁶ ATC→AGC

O2 Ser⁷ TGT→TCC

O3 Ser⁸ GAC→AGC

O4 Ser¹¹ GTC→TCT

O5 Ser¹⁸ GAG→TCG

O6 Ser²³ GAG→TCG

O7 Ser²⁹ TGT→AGC

O8 Ser²⁹ TGT→TCT

O9 Ser³⁰ GCT→TCT

O10 Ser³³ TGC→TCA

O11 Ser³⁷ GAG→TCG

O12 Ser⁴⁹ TAT→TCT

O13 Ser⁶¹ GTA→TCA

O14 Ser⁶³ GTC→TCC

O15 Ser⁶⁷ CTG→TCG

O16 Ser⁶⁸ GCC→TCC

O17 Ser⁷⁰ CTG→TCG

O18 Ser⁷³ GCT→TCT

O19 Ser⁷⁴ GTC→TCT

O20 Ser⁷⁵ CTG→TCG

O21 Ser⁷⁹ GCC→TCC

O22 Ser⁸¹ TTG→TCG

O23 Ser⁸⁶ CAG→TCG

O24 Ser⁸⁷ CCG→TCG

O25 Ser⁹³ CTG→TCG

O26 Ser⁹⁸ GCC→TCC

O27 Ser⁹⁹ GTC→TCC

O28 Ser¹⁰² CTT→TCT

O29 Ser¹⁰³ CGC→AGT

表 4(续)

具有O连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物类似物编号氨基酸置换顺序变化

O30 Ser¹⁰⁵ CTC→AGC

O31 Ser¹⁰⁹ CTT→TCT

O32 Ser¹¹¹ GCT→TCT

O33 Ser¹¹² CTG→TCG

O34 Ser¹¹⁴ GCC→TCC

O35 Ser¹²⁸ GCT→TCT

O36 Ser¹⁵⁹ TCG→GAG

O37 Ser¹⁶¹ TGC→TCC

O38 Pro¹²⁵Ser¹²⁷ GCC→CCC

GCT→TCT

O39 Thr⁶² GAA→ACA

O40 Thr⁶⁴ TGG→ACG

O41 Thr⁶⁵ CAG→ACG

O42 Thr⁸⁸ TGG→ACG

O43 Thr⁹⁰ CCC→ACC

O44 Thr⁹² CAG→ACG

O45 Thr¹⁰⁰ AGT→ACT

O46 Thr¹¹⁰ CGG→ACG

O47 Thr¹¹⁵ CAG→ACG

O48 Thr¹²³ GAT→ACT

O49 Thr¹²⁴ GCG→ACG

O50 Thr¹²⁵ GCC→ACC

O51 Thr¹²⁵Ser¹²⁷ GCC→ACC

GCT→TCT

O52 Thr¹²⁵Thr¹²⁶ GCC→ACA

TCA→ACA

O53 Thr¹²⁶ TCA→ACC

O54 Thr¹²⁷ GCT→ACT

O55 Thr¹³⁰ CTC→ACC

表 4(续)

具有O连接碳水化合物链位

点的促红细胞生成素类似物

类似物编号氨基酸置换顺序变化

O56 Thr¹³¹ CGA→ACA

O57 Thr¹³⁶ GAC→ACC

O58 Thr¹⁴⁰ AAA→ACA

O59 Pro¹²⁴Thr¹²⁵ GCG→CCG

GCC→ACC

O60 Pro¹²⁴Thr¹²⁵Thr¹²⁶ O59 加

TCA→ACC

O61 Pro¹²⁴Thr¹²⁵Thr¹²⁶Thr¹³¹ O60 加

CGA→ACA

O62 HCG C末端延伸

表 5

具有N连接和O连接碳水化合物

链位点的促红细胞生成素类似物

类似物编号氨基酸置换顺序变化

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ N14和O62

NO1 HCG C末端延伸

Asn³⁰Thr³²Va¹⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ N47和O62

NO2 HCG C末端延伸把促红细胞生成素cDNA插入到pDECΔ中，构建出命名为pDEC-X(其中X是类似物编号)的质粒。pDECΔ是质粒pDSα2的衍生物，而表达载体pDSα2一般性描述于PCT申请WO 90/14363中。pDECΔ是由pDSα2用下列步骤得到的：

(1)用Hind III消化pDSα2 DNA，用大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow片段)和dNTP处理Hind III粘性末端，重新连接平末端载体，从而使pDSα2的Hind III位点缺失。所得质粒为pDSα2ΔH。

(2)用Sal I消化pDSα2ΔH，并在其中连入一个带有SV40拼接信号并在该拼接信号的3′端连有Sal I接头的合成寡核苷酸。该合成寡核苷酸具有下列顺序：

5′TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT

CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA

AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG

AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3′所得质粒为pDSα2ΔH拼接物。

(3)用Sal I消化pDSα2ΔH拼接物，并用T4 DNA聚合酶和dNTP处理粘性末端使其成为平末端。用同样的方法使820bp BamHI-Bgl II人促红细胞生成素cDNA片段成为平末端，并使其与质粒连接。所得质粒为pDEC-1。

(4)用Kpn I和Pvu II消化pDEC，并用绿豆核酸酶处理粘性末端而使其成为平末端。重新连接该质粒从而缺失切下的Kpn I-Pvu II片段，得到质粒pDECΔ。

用BstE II完全消化pDECΔ，然后用Bgl II进行部分消化，制得pDEC-X质粒。分离出缺少促红细胞生成素编码顺序的载体片段，并使其与含有所需质粒的810bp BstE II-BglII片段连接。

某些具有多个氨基酸变化的类似物的构建过程详述如下。

pDEC(N47)和pDEC(N48)的构建

由pDEC(N 18)和pDEC(N4)构建含有asn30 thr32 val87asr88和thr90突变的pDEC(N47)。用Hind II和Bgl II消化pDEC(N18)，并分离出一个445bp片段。用BstE II和Hind III消化pDEC(N4)，并分离出一个377bp片段。将这两个片段如上所述连入用BstE II和Bgl II切割过的pDECΔ中，得到pDEC(N47)。

由pDEC(N14)和pDEC(N11)构建含有asn69 thr71 ser87asn88和thr90突变的pDEC(N48)。用Hind II和Bgl II消化pDEC(N14)，并分离出一个445bp片段。用BstE II和Hind II消化pDEC(N11)，并分离出一个377bp片段。将这两个片段如上所述连入用BstE II和Bgl II切割过的pDECΔ中，得到pDEC(N48)。

pDEC(O62)(HCG-促红细胞生成素融合体)的构建

由pEC1和一个107bp Stu I-Bgl II合成DNA接头组装pDEC(O62)，所述DNA接头含有人绒毛膜促性腺激素羧基末端的28个氨基酸(ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln)(Pierce等，Ann.Rev.Biochem.50：465，1981)。该接头的顺序如下：

5′CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC-

3′GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG-

5′CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA

3′GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTGTTACTCTAG

用Stu I和Bgl II消化pEC1，并分离出610bp DNA片段。如上所述，用ATP和多核苷酸激酶使合成接头磷酸化，并与pEC1片段一起连入已预先用BstE II消化并用Bgl II部分消化的pDECΔ中。

pDEC(NO1)的构建

由pDEC(O62)(HCG-EPO)和pDEC(N14)(Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰)组装pDEC(NO1)。用Stu I和Bgl II消化pDEC177，并用Gene-Clean分离出含有Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰的610bp DNA片段。用Stu I和Bgl II消化pDEC(O62)，并分离出107bp片段。如上所述，将这两个DNA片段连入已预先用BstE II消化并用Bgl II部分消化的pDECΔ中。

pDEC(NO2)的构建

由pDEC(O62)(HCG-EPO)和pDEC(N47)(Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰)组装pDEC(NO2)。用Stu I和Bgl II消化pDEC(N47)，并用Gene Clean^TM分离出含有Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰突变的610bp DNA片段。用Stu I和Bgl II消化pDEC(O62)，并分离出107bp片段。如上所述，将这两个DNA片段连入预先用BstE II消化并用Bgl II部分消化的pDECΔ中。

pDEC(N16)(Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²)的构建

由pDEC(N14)(Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰)和pDEC258(Ala¹⁶²)组装pDEC(N16)。pDEC258的构建方法是：利用上述体外诱变法，将162位的AGG密码子变为GCG。用Stu I和Bgl II消化pDEC(N14)，并用Gene Clean^TM分离出含有Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰突变的610bp DNA片段。用Stu I和Bgl II消化pDEC258，并分离出一个210bp片段。如上所述，将这两个DNA片段连入预先用BstE II消化并用BglE II部分消化的pDECΔ中。

pDEC(R1)、(R2)和(R3)的构建

为除去pDEC(N14)中的糖基化位点，用下列引物对含有ser87asn88和thr90突变的m13-EPO(N14)进行如上所述的体外诱变：

5′GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3′ GLN24

5′CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3′ GLN38

5′CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3′ GLN83

所得质粒命名为pDEC(R1)(gln²⁴Ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰)、pDEC(R2)(gln³⁸ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰)和pDEC(R3)(gln⁸³ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰)。m13C-1也用上述寡核苷酸引物进行体外诱变，得到pEC10(gln²⁴)和pEC8(gln³⁸)。用下列引物构建pEC9(gln⁸³)：

5′CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3′ GLN83

取相应于[Asn⁴，Ser⁶]EPO、[Asn⁹，Ser¹¹]EPO、[Asn⁶⁹]EPO、[Asn¹²⁴]EPO、[Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO、[Asn¹⁶³，Ser¹⁶⁵]EPO、[Thr¹²⁵]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO的人促红细胞生成素和类似物的cDNA克隆，以及表3、4和5所述类似物的cDNA克隆，用电穿孔法转移到COS-1细胞(ATCC CRL-1650)中。从半汇合培养皿上收集COS-1细胞，用培养基(Dulbecco改良基本培养基，含有5％胎牛血清和1％L-谷氨酰胺/青霉素/链霉素(Irvine Scientific))洗涤，并以4×10⁶个细胞/ml再悬浮。将1ml细胞转移到电穿孔池(Bio-Rad)中，在100-200μg载体DNA和2-20μg编码促红细胞生成素类似物的质粒DNA存在下，用Bio-Rad Gene Pulser于25μF和1600V下进行电穿孔。电穿孔后的细胞以每个60mm组织培养皿2×10⁶个细胞接种到5ml培养基中。接种2-4小时后，培养基换用5ml新鲜培养基。电穿孔3-5天后收集条件培养基。

实施例7：促红细胞生成素类似物的鉴定

A.碳水化合物加入量的测定

从如实施例6所述用促红细胞生成素类似物cDNA转染的COS细胞中取含5-20单位的一份上清液，在室温下用兔抗促红细胞生成素多克隆抗体免疫沉淀过夜。在免疫沉淀物中加入20-80μl 1∶1蛋白A-Sepharose在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液，并于室温下保温1小时。将样品离心，用PBS洗涤，需要时用N-聚糖酶处理沉淀物，以脱除N连接碳水化合物链。样品用15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，转移到硝酸纤维素上，如文献所述(Burnette等，Anal.Biochem.112：195-203，1981；Elliott等，Gene 79：167-180，1989)，用小鼠抗促红细胞生成素单克隆抗体的混合物进行Western分析。一种这样的抗体9G8A描述于文献中(Elliott等，Blood 74：Supp.1，A.1228，1989)。

对用[Asn⁶⁹]EPO和[Asn¹²⁵，Ser¹²⁷]EPO cDNA转染的COS细胞上清液进行分析表明，蛋白大小比具有人顺序的促红细胞生成素有所增加。这种大小的增加表明有一个额外的N连接碳水化合物链(图7)。用N-聚糖酶处理用[Thr¹²⁵]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO cDNA转染的COS细胞上清液的结果表明，蛋白大小比具有人顺序的促红细胞生成素有所增加。这种大小的增加表明有一个额外的O连接碳水化合物链(图8)。其他选定类似物的Western印迹分析示于图10。

为测定与EPO相连的N连接碳水化合物链的数目，进行了部分N-聚糖酶消化。在CHO细胞中表达类似物或rHuEPO，并收集无血清条件培养基。各管含有40单位EPO(体积用H₂O调至15μl)。在每只管中加入10μl 0.5％SDS，将每个样品煮沸3分钟。然后加入下列组分；10.8μl 0.5MNaPO₄ pH8.6、5μl 7.5％Nonidet P40和1.5μl 250单位/毫升N-聚糖酶(Genzyme)。将样品于37℃下保温指定的时间。加入SDS-PAGE样品缓冲液(见上)停止反应，然后用抗EPO多克隆抗体和抗免Vectastain^TM试剂盒(Vector Laboratories)进行SDS-PAGE Western分析(10％丙烯酰胺)，用4-氯萘酚作底物。用该方法对人促红细胞生成素和类似物N14进行的N连接链的分析结果示于图11。

B.促红细胞生成素类似物活性的测定

按Egrie等人(同上)的方法进行RIA。用CLINIGEN^TMEIA试剂盒(R系统或D系统)，利用制造厂家提供的方法进行EIA。取表达促红细胞生成素类似物的CHO细胞的上清液，或者如下所述由CHO细胞条件培养基制得的纯化促红细胞生成素，利用外缺氧红细胞增多小鼠生物测定法(Cotes等，同上)测定促红细胞生成素类似物的体内生物活性。

用经过修改的Iscove等人所述的红细胞集落形成试验(JCell Physiol.83：309-320，1974)测定体外促红细胞生成素活性。在Ficoll-paque垫上部分纯化来自人骨髓细胞的单核细胞，并在接种前用Iscove培养基洗涤以去掉粘附的细胞。培养基含有0.9％甲基纤维素，且不含任何牛血清清蛋白。培养8-10天后计数红细胞集落。

利用RIA、EIA和红细胞集落形成试验，在粗制COS细胞上清液中分析如实施例6所述在COS细胞中转染和表达的促红细胞生成素类似物。经过上述测定法测定，纯化的人顺序促红细胞生成素的体外活性与RIA活性差不多。类似物[Asn⁶⁹]EPO、[Thr¹²⁵]EPO和[Pro¹²⁴，Thr¹²⁵]EPO的体外活性与RIA活性差不多，并给出带有额外碳水化合物链的证据(如A节中所测定的)。将编码促红细胞生成素类似物的cDNA克隆转染到CHO细胞中，对CHO细胞上清液进行RIA或EIA及体内生物测定，以此来进一步分析[Thr¹²⁵]EPO和类似物N4、N11、N14、N16、N18、N47、N48、O62、NO1和NO2。结果示于表6。在CHO细胞上清液中表达的类似物R1、R2和R3的体内活性示于表7。

表 6

带有额外碳水化合物链的促红细胞生成素类似物

体内活性^bEPO顺序 N连接链^a O连接链

RIA或EIA人 3^c 1^d 0.6Asn³⁰Thr³² 3至4^c n.t. 1.1Asn⁵¹Thr⁵³ 4 n.t. n.t.Asn⁵⁷Thr⁵⁹ 4 n.t. n.t.Asn⁶⁹ 4 减少^e n.t.Asn⁶⁹Thr⁷¹ 4 n.t. 0.25-0.7Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹ 4 n.t. n.t.Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ 4^c n.t. 1.8Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ 3至4^c 正常 1.0Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰ 4 n.t. n.t.Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹² 4 减少^e n.t.Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ 4 n.t. n.t.Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ 4 n.t. n.t.Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶² 4 n.t. 1.8Asn¹³⁶Thr¹³⁸ 3至4 n.t. n.t.Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰ 3至4 n.t. n.t.Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ 4至5 n.t. 0.025-0.25Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ 4至5^c 正常 1.8Thr¹²³ 3 1和2^f n.t.Thr¹²⁵ 3 1和2^f 0.7Pro¹²⁴Thr¹²⁵ 3 1和2^f n.t.HCG C末端延伸 3 至少3^g 1.0-1.3Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰HCG延伸 4 至少3^g 1.5Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰HCG延伸 4至5 至少3^g 0.8

表6附注

^a额外N连接链数目是如实施例7A所述根据类似物多肽在SDS凝胶上的迁移率来估测的。

^b类似物体内活性与促红细胞生成素类似物量的比例。活性测定是用小鼠血细胞增多生物测定法对类似物CHO细胞上清液进行的。CHO细胞上清液中促红细胞生成素类似物的量是如正文中所述用RIA或EIA法测定的。

^c如实施例7A所述，在经过部分N-聚糖酶消化后检验SDS凝胶中的糖蛋白迁移率，从而确认额外碳水化合物链的数目。

^d 70％的人促红细胞生成素分子上有Ser¹²⁶位的O连接链。

^e O-糖基化减少的类似物在不到70％的分子上有Ser¹²⁶位的碳水化合物链。

^f Thr¹²³EPO在多于60％的分子上有两个O连接链。Thr¹²⁵EPO在约40％的分子上有两个O连接链。Pro¹²⁴Thr¹²⁵EPO在多于80％的分子上有两个O连接链。

^g这些类似物有至少三个O连接链，可能有4个或5个。已知HCG本身有4个O连接链。

n.t.未测。

表 7

含有碳水化合物位点重排的人

促红细胞生成素和类似物的活性

体内活性EPO顺序 N连接链 RIA或EIA人 3 0.69Gln²⁴ 2 0.16Gln³⁸ 2 0.16Gln⁸³ 2 0.23Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(R1) 3 0.69Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(R2) 3 0.41Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(R3) 3 0.50Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ 3至4 1.48体内活性与RIA或EIA的比例如表6的附注a所述测定。

C.来源于促红细胞生成素类似物的异构体混合物的制备

[Thr¹²⁵]EPO(EPO O50)

如实施例6的A节所述构建促红细胞生成素类似物[Thr¹²⁵]EPO。用BstE II和Bgl II切割含有[Thr¹²⁵]突变的质粒pEC，并使该片段与pDECΔ(pDSα2的衍生物，描述于实施例6)连接，从而分离出带有[Thr¹²⁵]突变的810bp促红细胞生成素cDNA片段。

将含有[Thr¹²⁵]促红细胞生成素cDNA的质粒pDECΔ转染到DHFR缺陷型CHO细胞中。将770ml CHO细胞条件培养基用分子量截留值为10,000道尔顿的膜浓缩，并用10mMTris-HCl pH8.6透滤至终体积为34ml。从浓缩液中取17ml样品加到在相同缓冲液中平衡过的Q-Sepharose快速流动柱(床体积为5ml)上，并用0-250mM NaCl/10mM Tris-HClpH8.6线性梯度洗脱。从柱中流出的各部分中取未经处理的或用N-聚糖酶消化过的等份试样，用SDS-PAGE或IEF法进行分析，并根据各部分的异构体和/或碳水化合物组成合并出几个并集液(命名为2、3和4)。将每个并集液加到Vydac C4柱(214TPB 2030；直径为1cm；床体积为1.8-2.5ml；0.34ml/分)上，并用两个柱体积的20％乙醇/10mM Tris-HCl pH7.0洗涤。用20-94％乙醇/10mM Tris pH7.0线性梯度对柱进行洗脱。制出并集液，用10mM Tris-HCl pH7.0稀释，并加到Q-Sepharose快速流动柱上。用10mM Tris-HCl pH7.0洗涤后，用20mM柠檬酸钠/250mM NaCl pH7.0洗脱样品。纯化的[Thr¹²⁵]并集液用IEF法进行分析，结果示于图9。还如上所述(Cotes等，同上)分析了这些并集液的体内生物活性，结果示于表8。

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO(EPO N14)

制备1

用由离子交换色谱、反相色谱和凝胶过滤色谱组成的三步法纯化EPO N14类似物。在离子交换步骤中，合并某些部分得到具有高含量唾液酸的异构体混合物。在反相色谱过程中又制得两个并集液，其中含有带或不带聚集体的类似物。详细的纯化过程如下。

1.收集表达EPO N14类似物的CHO细胞条件培养基，用带有YM10膜的搅拌槽(Amicon)浓缩约2.5倍，并用10mMTris pH8.5透滤。

2.将浓缩后的培养基以0.2cm/分的流速以～12A₂₈₀/ml树脂加到Q-Sepharose FF(Pharmacia)柱上，该柱已用10mMTris pH8.5平衡过。

3.加样后，用3个柱体积的10mM Tris pH8.5洗柱，并用0-0.5M NaCl/10mM Tris pH8.5梯度洗脱50个柱体积。以1个柱体积为一个部分进行收集。

4.从每个部分中取样在pH3-5的IEF凝胶上进行等电聚焦。根据IEF上的异构体分布，制取主要含异构体11-18的并集液。在并集液中加入EDTA使其终浓度为1mM。

5.将异构体并集液以2.5cm/分的流速以～5A₂₈₀/ml树脂加到反相C4柱(Vydac)上，该柱已用20％乙醇/10mM TrispH7.0平衡过。用1个柱体积的20％乙醇/10mM Tris pH7.0洗柱，用20-94％乙醇/10mM Tris pH7.0以1cm/分的流速洗脱30个柱体积。以0.2个柱体积为一个部分进行收集。

6.从每个部分中取样用非还原性12％SDS-PAGE进行分析。根据SDS凝胶上是否观察到有聚集体存在制取两个独立的并集液。1号并集液含有EPO类似物但不含聚集体。2号并集液既含有EPO类似物也含有聚集体。

7.用Centricon 10(Amicon)将1号并集液浓缩约65倍，将2号并集液浓缩约250倍。每个并集液都与20mM柠檬酸钠/100mM NaCl pH7.0进行缓冲液交换。

8.每个并集液分别在已用20mM柠檬酸钠/100mM NaClpH7.0平衡过的HPLC Biosil SEC-250(BioRad)柱上进行纯化。以2.26cm/分的流速以＜6A₂₈₀/ml树脂加入并集液。每次洗脱中收集相应于单体类似物的峰。

9.测定每个并集液的光吸收，从每个并集液中取一部分进行浓缩以进行SDS-PAGE和IEF凝胶分析。1号并集液中有异构体15-17的分布，用该并集液进行药代动力学和受体结合研究。

制备2

用由离子交换色谱、反相HPLC和羟磷灰石色谱组成的三步法纯化EPO N14类似物。在离子交换步骤中，将类似物分成含不同异构体混合物的三个并集液。详细的纯化过程如下：

1.收集表达EPO N14的CHO细胞上清液，用FiltronMini-Ultrasette切向流动装置浓缩约10倍，并用10mM TrispH8.5透滤。

2.将浓缩后的培养基以0.2cm/分的流速以～10A₂₈₀/ml树脂加到已用10mM Tris pH8.5平衡过的Q＝Sepharose FF(Pharmacia)柱上。

3.加样后，用3个柱积的10mM Tris pH8.5洗柱，并用0-0.5M NaCl/10mM Tris pH8.5洗脱50个柱体积。以1个柱体积为一个部分进行收集。

4.从每个部分中取样在pH3-5的IEF凝胶上进行等电聚焦。根据由IEF测定的异构体分布，制得三个独立的并集液，即低异构体并集液(异构体4-12)、中异构体并集液(异构体5-15)和高异构体并集液(异构体6-18)。

5.每个异构体并集液分另在Vydac C4反相HPLC柱上进行纯化。用从0.1％TFA/H₂O到0.1％TFA/75％乙腈的梯度，以每分钟增加1％乙腈的速度使柱展开。

6.收集由每个并集液得到的类似物峰，用4倍体积的80mM Tris-HCl/20mM Tris碱稀释，然后用耐溶剂性Centricon3浓缩并与10mM Tris pH7.2进行缓冲液交换。

7.每个样品用10mM Tris pH7.2稀释至2A₂₈₀/ml，并加入等体积的4M盐酸胍(GuHCl)、10mM CHAPS、10mM TrispH7.2使样品的终浓度为1A₂₈₀/ml。将每个样品加到用2MGuHCl、5mM CHAPS、10mM Tris pH7.2平衡过的羟磷灰石小型柱上。用平衡缓冲液洗柱，以1个柱体积为一个部分收集流出液。

8.测定各部分的光吸收，制备并集液，并用Centricon10与10mM Tris pH7.2进行缓冲液交换。测定每个并集液的光吸收。

用SDS-PAGE和IEF凝胶分析最终的并集液。IEF凝胶示于图12。如实施例7A所述进行RIA和体内活性测定。最终异构体并集液的体内活性示于表8。在测定小鼠血细胞比容增加的实验中使用高唾液酸异构体并集液。

表 8

由促红细胞生成素类似物得到的异构体的活性

体内活性

EPO顺序异构体并集液 (U/mg肽^a)

Thr¹²⁵ 异构体 8-12 147,000^b

异构体 9-15 215,000^b

异构体 13-15 111,000^b

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ 异构体 7-12 132,000±17,000

异构体 10-14 233,000±39,000

异构体 12-17 272,000±14,000

^a用1mg/ml溶液的消光系数，由Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO异构体并集液的A₂₈₀计算促红细胞生成素肽的毫克数。

^b未示出Thr¹²⁵EPO异构体并集液的标准差，因为活性测定只进行一次或两次。

实施例8：EPO N14类似物的生物学性质

在静脉药代动力学试验、受体结合试验和血细胞比容研究中，比较了EPO N14类似物的异构体并集液、重组人促红细胞生成素(rHuEPO)和分离的rHuEPO异构体14的活性。如实施例7C所述制备EPO N14异构体并集液。按Lai等人(同上)所述制备rHuEPO。如下纯化rHuEPO异构体14：将由异构体10、11、12、13、14和15的混合物组成的rHuEPO加到已用10mM Tris pH7.2平衡过的Q-Sepharose快速流动柱(线度＝直径2.2cm×高3.4cm)上。加样后的柱用2mM乙酸/6M脲(“A”缓冲液)平衡，然后用为优化异构体13和14的纯化而设计的多相梯度进行洗脱。该梯度为：0％-7.3％800mM乙酸/6M脲(“B”缓冲液)750ml、7.3％-11.4％“B”缓冲液750ml、11.4％-26.8％“B”缓冲液1250ml、26.8％-62.4％“B”缓冲液1250ml、62.4％-100％“B”缓冲液700ml。以12.5ml为一部分进行收集，用氢氧化铵中和，然后用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定。将那些含有纯异构体14的部分合并在一起，用带有YM-10膜的Amicon搅拌槽浓缩，然后与水进行缓冲液交换。

A.静脉药代动力学

进行两项独立的研究，以把EPO N14类似物(异构体15-17)和分离的异构体14的药代动力学参数与rHuEPO作比较。

在每项研究中，通过重约310-378g的雄性Sprague-Dawley大鼠的颈动脉插管，静脉注射1μCi¹²⁵I-分离的异构体14、¹²⁵I-EPO N14类似物或¹²⁵I-重组人促红细胞生成素(Amersham)。在注射后的不同时间点采集0.3ml血，离心制备血清。于4℃下与90％乙醇一起保温过夜后，测定0.1ml的每个血清样品中¹²⁵I-EPO(重组人EPO、分离的异构体14或EPO N14类似物)的浓度。用γ计数器计数每个血清样品中乙醇沉淀的¹²⁵I-EPO，所得的药代动力学曲线示于图13。利用PCNONLIN4.0非线性回归分析(Statistical Consultants，1992)测定每只大鼠的药代动力学参数，并将每组的结果平均。EPO N14类似物和分离的异构体14的药代动力学研究结果概括于表9。

由表9可见，EPO N14类似物的血清清除率与重组人促红细胞生成素的血清清除率计算值相比有显著性差异。重组人促红细胞生成素的β半寿期最短，为3.10小时，而分离的异构体14为3.97小时，EPO N14类似物为4.36小时。重组人促红细胞生成素组的清除半寿期也最短，为1.78小时，而分离的异构体14为2.40小时，EPO N14类似物为3.03小时。

表 9

rHuEPO、rHuEPO异构体14和EPO N14(异构体15-17)静脉注射后的药代动

力学参数概括制备物半寿期(小时) AUC VD 清除速度常数清除率清除半寿期

(cpm-hr/ml) (mL/Kg)

α β 0-∞Hr. (小时^-1) (ml/kg-小时) (小时)rHuEPO 平均值 0.332 3.10 308901 44.9 0.400 6.14 1.78^*n＝6 标准差 0.155 0.54 69187 8.3 0.069 1.36 0.27异构体14 平均值 0.388 3.97 483329 36.5 0.288 3.80 2.40n＝4 标准差 0.066 0.40 53638 2.2 0.020 0.12 0.15EPO N14 平均值 0.422 4.36 692231 37.4 0.230 2.67 3.03n＝4 标准差 0.165 0.36 40355 1.9 0.021 0.17 0.27

*EPO N14药代动力学研究(重组人促红细胞生成素组n＝4)和分离的异构体

14药代动力学研究(重组人促红细胞生成素组n＝2)中重组人促红细胞生成素

组的平均数。

B.受体结合试验

用人红白血病OCIM1细胞进行冷置换试验(Papayannopoulou等，Blood 64(supp.1)：116a，1984)，研究EPO N14类似物(异构体15-17)与促红细胞生成素受体的相互作用。使浓度递增的未标记EPO N14和恒定浓度的¹²⁵I-rHuEPO一起与OCIM1细胞一起保温，测定与¹²⁵I rHuEPO竞争与受体的结合所需的EPO N14的量。作为对照，还使浓度递增的未标记rHuEPO与恒定浓度的¹²⁵I-rHuEPO竞争。

将未标记的EPO N14在测定缓冲液中稀释，并以0.03ng、0.1ng、0.3ng、1.0ng、3.0ng、10.0ng和30.0ng的量加入(按肽量计)。在所有测定管中加入0.5ng¹²⁵I-重组人EPO，然后加约0.5×10⁶个OCIM1细胞。然后将测定管在振荡水浴中于37℃下保温2小时。保温后，溶液通过对苯二甲酸二丁酯/单丁酯油溶液离心，从与OCIM1细胞结合的¹²⁵I-rHuEPO中分离出未结合的¹²⁵I-rHuEPO。分离出细胞沉淀物，用γ计数法测定与细胞结合的¹²⁵I-rHuEPO的量。计算出与细胞特异结合的计数，用线性回归分析法确定在不存在竞争物条件下竞争50％¹²⁵I-rHuEPO结合所需的未标记蛋白的浓度。

三次测定的结果表明，使¹²⁵I-rHuEPO与OCIM1细胞的结合减少50％所需的未标记EPO N14肽的量平均为2.67±0.73ng。在同样的三次测定中，竞争0.5ng¹²⁵I-rHuEPO的结合所需的未标记rHuEPO的量平均为0.51±0.15ng。根据这些结果，与未标记的r-HuEPO相比，竞争¹²⁵I-rHuEPO与EPO受体的结合需要5.25倍过量的EPO N14(p＜0.01)。

进行另一个实验以直接比较EPO N14类似物、分离的异构体14和重组促红细胞生成素与促红细胞生成素受体的结合。该实验的结果表明，EPO N14类似物与受体的亲和力低于分离的异构体14。与未标记的异构体14相比，竞争¹²⁵I-rHuEPO与受体的结合需要约2倍过量的EPO N14类似物(图14)。

C.血细胞比容研究

进行体内研究以比较EPO N14高和低异构体并集液(由实施例7C所述的制备2制得)、分离的异构体14以及重组人EPO增加受处理小鼠血细胞比容的能力。本研究中所用的EPON14高和低异构体并集液的异构体分布示于图12。

给CD1小鼠(约30g)腹膜内注射在0.25％小鼠血清清蛋白中配制的上述制备物之一，或注射安慰剂(含0.25％小鼠血清清蛋白的PBS)，每周注射三次，共注射六周。促红细胞生成素制备物的剂量按肽量计算，因此，对EPO N14高并集液、EPO N14低并集液、异构体14和r-HuEPO标准物来说，30g小鼠接受0.071μg肽/剂量。EPO N14高并集液和异构体14还包括0.036μg肽/剂量的另一个剂量组。在基线处用眶后放血法测定所有小鼠的血细胞比容，此后每周测定两次。该实验结束时，采集所有动物的血清，测定针对所注射产物的抗体。利用判定为中和抗体阴性的动物的数据进行后续的分析。

如图15所示，与其他制备物相比，用EPO N14高异构体并集液处理的动物所达到的按组平均的血细胞比容最高。异构体14、重组人EPO和EPO N14低异构体并集液增加血细胞比容的程度较低。

为了更定量地比较不同的促红细胞生成素制备物，计算了平均初始血细胞比容上升速率(0-11天)、曲线下面积(0-39天)和总血细胞比容增加(表10)。从其中的任何一个指标来看，EPO N14高异构体并集液按肽量计的活性都比所测试的任何其他制备物要高。EPO N14高异构体并集液和异构体14的活性都比重组人EPO要高。无论用任何分析方法进行比较，EPO N14低并集液的活性都是最低的。

表 10

EPO N14(高和低异构体并集液)、异构体14和rHuEPO对小鼠血细胞比容的影响制备物剂量(μg) 血细胞比容上升曲线下面积² 总血细胞比容增加³

速率¹(点/天) (血细胞比容点数)N14高并集液 0.071 1.46 619 25.4异构体 14 0.071 1.19 546 22.6N14高并集液 0.036 0.98 428 19.1异构体 14 0.036 0.76 284 10.7r-HuEPO 0.071 1.0 424 17.5N14低并集液 0.071 0.5 212 9.3

¹初始血细胞比容上升速率是用线性回归法在0-11天计算的。

²曲线下面积是在0-39天用梯形加和法计算的。

³总血细胞比容增加的计算方法是：第39天按组平均的血细胞比容减去基线处按组平均的血细胞比容。

虽然本发明已就其优选实施方案作了叙述，但本发明不应仅限于所公开的实施方案，相反，本发明应覆盖所附权利要求书的要旨和范围内所包括的各种修改和代换，权利要求书的范围应做最宽的解释以包容所有的这类修改和代换。

Claims

1.一种具有促红细胞生成素活性的人促红细胞生成素类似物，该类似物包括至少一个额外糖基化位点，在此位点中，人促红细胞生成素的氨基酸顺序的88位中的色氨酸被天冬酰胺取代，且此位点具有连接于其上的碳水化合物链，其中所述的类似物选自[Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO、[Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO、[Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²]EPO、[Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO，及其突变体，该突变体具有相当的活性，而且在EPO类似物的氨基酸顺序中具有一种或多种氨基酸的缺失、替换或添加。

2.权利要求1的类似物，其中在人促红细胞生成素的氨基酸顺序的30位中的丙氨酸被天冬酰胺所取代。

3.权利要求1或2的类似物，该类似物是[Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO。

4.编码权利要求3的人促红细胞生成素类似物的DNA。

5.一种真核宿主细胞，该宿主细胞用包含权利要求4的DNA的载体转染。

6.一种糖蛋白，它具有通过培养权利要求5的真核宿主细胞所产生的促红细胞生成素活性。

7.一种增加红细胞生成的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求1、2或3的人促红细胞生成素类似物、或具有权利要求6的促红细胞生成素活性的糖蛋白以及可药用的稀释剂、助剂或载体。