ES2105442T5 - Analogos de eritropoyetina con sitios adicionales de glicosilacion. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN ANALOGOS DE LA ERITROPOYETINA QUE TIENEN AL MENOS UNA REGION ADICIONAL PARA LA GLICOSILACION Y UNA REDISPOSICION DE LA MENOS UNA REGION PARA LA GLICOSILACION. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN DICHOS ANALOGOS DE ERITROPOYETINA Y A PLASMIDOS RECOMBINANTES Y CELULAS HUESPEDES PARA LA EXPRESION DE LOS ANALOGOS.

Description

Análogos de eritropoyetina con sitios adicionales de glicosilación.

La presente invención se refiere a análogos de la eritropoyetina que tienen, al menos, un sitio adicional para la glicosilación o análogos de la eritropoyetina que tienen una supresión de uno o más sitios de glicosilación de la eritropoyetina humana y una adición de un número igual de sitios de glicosilación que no se encuentran en la naturaleza. La invención también se refiere a secuencias de ADN que codifican dichos análogos de la eritropoyetina, y a plásmidos recombinantes y células hospedantes para la expresión de los análogos.

Fundamentos de la invención

La eritropoyetina (EPO) es una hormona de glicoproteína implicada en la maduración de las células progenitoras eritroides para dar eritrocitos. Es esencial en la regulación de los niveles de glóbulos rojos de la sangre en circulación. La eritropoyetina que se encuentra en la naturaleza es producida por el hígado durante la vida del feto y por el riñón en los adultos, y circula en la sangre y estimula la producción de glóbulos rojos de la sangre en la médula ósea. La anemia es casi invariablemente una consecuencia de un fallo renal debido a la producción disminuida de eritropoyetina en el riñón. Se ha encontrado que la eritropoyetina recombinante, producida por técnicas de ingeniería genética, que implican la expresión de una proteína producto en una célula hospedante, transformada con el gen que codifica la eritropoyetina, es eficaz cuando se usa en el tratamiento de la anemia resultante de un fallo renal crónico.

Niveles bajos de eritropoyetina están normalmente presentes en la orina humana, mientras que los individuos que padecen anemia aplásica presentan niveles elevados de eritropoyetina en la orina. La purificación de la eritropoyetina de la orina humana por Miyake et al., en J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977), utilizó, como material de partida, orina de individuos afectados de anemia aplásica. Actualmente, sin embargo, la eritropoyetina de la orina no ha demostrado ser terapéuticamente útil.

La identificación, clonación y expresión de genes que codifican la eritropoyetina están descritas en la patente de los EE.UU. Nº 4.703.008. otorgada a Lin, cuya descripción se incorpora en la presente por su referencia. Una descripción de un método para la purificación de la eritropoyetina recombinante en un medio celular está incluida en la patente de los EE.UU. Nº 4.667.016, otorgada a Lai et al. La expresión y recuperación de la eritropoyetina recombinante biológicamente activa, en células hospedantes de mamíferos que contienen el gen de la eritropoyetina, sobre plásmidos recombinantes, ha permitido disponer, por primera vez, de cantidades de eritropoyetina adecuadas para sus aplicaciones terapéuticas. Adicionalmente, el conocimiento de la secuencia del gen y la disponibilidad de cantidades grandes de la proteína purificada, han conducido a una mejor comprensión del modo de acción de esta proteína.

Muchas proteínas de la superficie celular y proteínas de secreción, producidas por células eucarióticas, están modificadas con uno o más grupos de oligosacáridos. Esta modificación, denominada glicosilación, puede afectar espectacularmente a las propiedades físicas de las proteínas y puede también ser importante en la estabilidad, secreción y localización subcelular de las proteínas. Una adecuada glicosilación puede ser esencial para la actividad biológica. En efecto, algunos genes de organismos eucarióticos, cuando se expresan en bacterias (por ejemplo, E. coli) que carecen de procesos celulares para la glicosilación de las proteínas, suministran proteínas que se recuperan con poca o nula actividad, debido a su falta de glicosilación.

El documento EP-A-428267 describe análogos de la eritropoyetina humana con uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana, que dan como resultado un aumento en el número de sitios para la ligación del ácido siálico. Los análogos tienen un número mayor de cadenas de carbohidrato que la eritropoyetina humana.

La glicosilación tiene lugar en posiciones específicas, a lo largo de la cadena polipeptídica principal y es generalmente de dos tipos: los oligosacáridos unidos a través de O se ligan a residuos de serina o treonina, mientras que los oligosacáridos unidos a través de N se ligan a residuos de asparagina, cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido, salvo la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos unidos a través de N y de los unidos a través de O, así como los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Una clase de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos, es el ácido N-acetilneuramínico (en lo sucesivo designado como ácido siálico). El ácido siálico es usualmente el residuo terminal tanto de los oligosacáridos unidos a través de N como de los unidos a través de O, y debido a su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glicoproteína.

Tanto la eritropoyetina humana derivada de la orina, como la eritropoyetina recombinante (expresada en células de mamífero), que tienen la secuencia de aminoácidos 1-165 de la eritropoyetina humana, contienen tres cadenas de oligosacáridos unidas a través de N, y una cadena de oligosacárido unida a través de O, que en conjunto representan aproximadamente 40% del peso molecular total de la glicoproteína. La glicosilación por unión a través de N tiene lugar en residuos de asparagina situados en las posiciones 24, 38 y 83, mientras que la glicosilación por unión a través de O tiene lugar en un residuo de serina situado en la posición 126 (Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Se ha puesto de manifiesto que las cadenas de oligosacáridos están modificadas con residuos terminales de ácido siálico. El tratamiento enzimático de la eritropoyetina glicosilada para eliminar todos los residuos de ácido siálico, conduce a una pérdida de la actividad in vivo, pero no afecta a la actividad in vitro (Lowy et al., Nature 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Este comportamiento ha sido explicado por la rápida desaparición de la circulación, de la eritropoyetina desprovista de residuos de ácido siálico, por interacción con la proteína hepática de fijación de glicoproteínas desprovistas de ácidos siálicos (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1385 (1974); Ashwell et al., Methods in Enzymol. 50, 287 (1978)). Por consiguiente, la eritropoyetina sólo posee actividad biológica in vivo cuando está sialilada, para evitar su unión con la proteína hepática de fijación.

El papel de los otros componentes en las cadenas de oligosacáridos de la eritropoyetina no está bien definido. Se ha puesto de manifiesto que la eritropoyetina parcialmente desglicosilada tiene muy reducida su actividad in vivo, en comparación con la forma glicosilada, pero conserva su actividad in vitro (Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); patente de Lin, ut supra). En otro estudio, sin embargo, la eliminación de las cadenas de oligosacáridos unidas a través de N o unidas a través de O, separadamente o conjuntamente, por mutagénesis de los residuos de asparagina o serina, que son los sitios de glicosilación, reduce fuertemente la actividad in vitro de la eritropoyetina alterada, que se produce en células de mamífero (Dube et al., J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)).

Las glicoproteínas tales como la eritropoyetina pueden separarse en formas con cargas diferentes, usando técnicas como la del enfoque isoeléctrico (IEF). Varios grupos han dado a conocer estudios por IEF de preparaciones de eritropoyetina bruta y parcialmente purificada (Lukowsky et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al., Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). En estos estudios, se distinguieron por IEF, a lo sumo, tres o cuatro fracciones que tienen actividad de eritropoyetina, y ninguna de ellas fue caracterizada respecto a su contenido de carbohidrato. Además, no se hizo ninguna correlación entre los puntos isoeléctricos de las fracciones y su actividad biológica.

Durante la purificación de la eritropoyetina humana derivada de la orina, discutida en Miyake et al., ut supra, se dio a conocer que dos fracciones de eritropoyetina procedentes de la cromatografía con hidroxiapatito, designadas como II y IIIA, tienen actividades específicas similares. Un análisis posterior del carbohidrato de las fracciones II y IIIA reveló que la fracción II tenía un contenido medio de ácido siálico mayor que la fracción IIIA (Dordal et al., ut supra).

Un objetivo de la presente invención es proporcionar isoformas separadas y aisladas de eritropoyetina, que tengan un contenido de ácido siálico definido y una actividad biológica aumentada. Las composiciones farmacéuticas que contengan tales moléculas, tendrían una acción terapéutica beneficiosa.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a análogos de la eritropoyetina humana que comprenden una secuencia de aminoácidos que incluye, al menos, un sitio adicional para la glicosilación. Los sitios para la glicosilación añadidos pueden conducir a un mayor número de cadenas de carbohidrato, y a un contenido de ácido siálico más alto, que en la eritropoyetina humana. Se crean también análogos de la eritropoyetina que comprenden secuencias de aminoácidos que incluyen una supresión de uno o más sitios de glicosilación y una adición de un número igual de sitios de glicosilación que no se encuentran en la naturaleza. Se incluyen asimismo análogos que comprenden una adición de uno o más aminoácidos al extremo carboxi-terminal de la eritropoyetina, en el que la adición proporciona, al menos, un sitio de glicosilación. La invención abarca, además, secuencias de ADN que codifican tales análogos de la eritropoyetina, así como plásmidos recombinantes y células hospedantes para la expresión de los análogos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un gel de enfoque isoeléctrico analítico de las isoformas de eritropoyetina recombinante separadas. Las pistas del gel 1 a 11 muestran isoformas que van desde la menos ácida (pH más alto), en la pista 1, hasta la más ácida (pH más bajo), en la pista 11. La eritropoyetina recombinante purificada, que contiene una mezcla de isoformas 9 a 14, se muestra también en las pistas de la extrema izquierda y derecha del gel.

La Figura 2 muestra la relación entre el número de ácidos siálicos por isoforma de eritropoyetina y la actividad específica in vivo de cada isoforma, expresada en unidades por mg de polipéptido de eritropoyetina. En la Figura 2A, la concentración de cada isoforma de eritropoyetina se determinó por el ensayo de proteínas de Bradford; en 2B, la concentración se determinó por absorbancia a 280 nm; en 2C, la concentración se determinó por radioinmunoensayo (RIA).

La Figura 3 muestra un gel de enfoque isoeléctrico analítico de mezclas definidas de isoformas de eritropoyetina recombinante, preparadas por cromatografía de intercambio aniónico, en diferentes condiciones. Las pistas del gel 1 a 6 representan, respectivamente, isoformas de eritropoyetina eluidas en un lavado con alta concentración de sal, después de lavar la columna de sefarosa Q de flujo rápido con ácido acético 150 mM, pH 4,7, ácido acético 150 mM (no tamponado), ácido acético 200 mM, pH 4,7, ácido acético 250 mM, pH 4,7, ácido acético 300 mM, pH 4,7, o ácido acético 300 mM (no tamponado). La eritropoyetina recombinante purificada que contiene una mezcla de isoformas, tal como se obtiene usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 de Lai et al., ut supra, excepto que la cromatografía en DEAE-agarosa se reemplaza por cromatografía en sefarosa Q, se muestra también en la pista de la extrema izquierda del gel.

La Figura 4 muestra la separación de las isoformas de eritropoyetina 8 a 12, realizada sometiendo el medio celular condicionado, aplicado a una columna de sefarosa Q, a un gradiente de pH decreciente y fuerza iónica creciente. Porciones de las fracciones de número par, desde la Fracción 2 a la Fracción 40, se sometieron a enfoque isoeléctrico analítico. La eritropoyetina recombinante purificada que contiene una mezcla de isoformas, tal como se obtiene usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 de Lai et al., ut supra, excepto que la cromatografía en DEAE-agarosa se reemplaza por cromatografía en sefarosa Q, se muestra también en la pista de la extrema izquierda del
gel.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana. Los cuadrados indican residuos de asparagina a los que se ligan cadenas de carbohidrato unidas a través de N y un asterisco indica el residuo de serina modificado con una cadena de carbohidrato unida a través de O.

Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran la serie de etapas de clonación usadas en la generación de plásmidos para la construcción y análisis de análogos de la eritropoyetina humana. Estos análogos tienen aminoácidos alterados como se muestra en la Figura 5, que proporcionan sitios de glicosilación adicionales.

La Figura 7 muestra un análisis de transferencia Western de sobrenadantes de células COS de la secuencia de eritropoyetina humana y de los análogos de la eritropoyetina indicados. Los análogos [Asn^{9}, Ser^{11}] EPO, [Asn^{69}] EPO, [Asn^{125}, Ser^{127}] EPO, y [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO se construyen como se describe en el Ejemplo 6. Con fines de comparación, se muestran también otros análogos [Pro^{125}, Thr^{127}] EPO y [Asn^{126}, Ser^{128}] EPO, que no contienen cadenas de carbohidrato adicionales.

La Figura 8 muestra un análisis de transferencia Western de sobrenadantes de células COS de la secuencia de eritropoyetina humana y de los análogos de la eritropoyetina indicados, después de un tratamiento con N-glicanasa. Los análogos [Thr^{125}] EPO y [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO se construyeron como se describe en el Ejemplo 6. Con fines de comparación, se muestran también los análogos [Val^{126}] EPO, [Pro^{124}] EPO, [Pro^{125}] EPO, [Thr^{127}] EPO, [Pro^{125}, Ser^{127}] EPO y [Thr^{125}, Ser^{127}] EPO.

La Figura 9 muestra un gel de enfoque isoeléctrico de los combinados 2, 3 y 4 obtenidos por cromatografía en sefarosa Q y cromatografía de fase inversa en C4, del medio celular que sirvió de soporte para el crecimiento de células CHO transfectadas con el cADN de eritropoyetina que contiene la mutación [Thr^{125}]. La eritropoyetina recombinante purificada que contiene una mezcla de isoformas, obtenida usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 de Lai et al., ut supra, excepto que la cromatografía en DEAE-agarosa se reemplaza por cromatografía en sefarosa Q, se muestra también en las pistas de la izquierda y la derecha del gel.

La Figura 10 muestra un análisis de transferencia Western de sobrenadantes de células COS de eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) y análogos seleccionados. La construcción de los análogos se describe en el Ejemplo 6. Los análogos N9, N14, N18, N19, N21, N24 y N39 tienen, al menos, una cadena de carbohidrato adicional, como se pone de manifiesto por la movilidad más lenta del gel.

La Figura 11 muestra un análisis de transferencia Western de sobrenadantes de células COS de eritropoyetina humana recombinante y del análogo EPO N14, durante la digestión con N-glicanasa. Los puntos temporales se tomaron al cabo de 0, 4, 12 y 45 minutos y después de la digestión a lo largo de la noche.

La Figura 12 muestra un gel de enfoque isoeléctrico de preparaciones de isoformas del análogo EPO N14. El combinado de isoformas bajo contiene un análogo EPO N14, que tiene, en su mayoría, 6 a 12 ácidos siálicos por molécula; el combinado de isoformas medio contiene un análogo N14, que tiene, en su mayoría, 10 a 15 ácidos siálicos por molécula; y el combinado de isoformas alto contiene un análogo EPO N14, que tiene, en su mayoría, 12 a 17 ácidos siálicos por molécula.

La Figura 13 muestra la farmacocinética de la eritropoyetina humana recombinante, isoforma 14 aislada y análogo EPO N14 (isoformas 15 a 17), después de su inyección intravenosa en ratas.

La Figura 14 muestra un ensayo de desplazamiento en frío de la fijación de eritropoyetina humana recombinante, marcada con ^{125}I, al receptor de eritropoyetina, en presencia de cantidades variadas de rHuEPO no marcada, isoforma 14 aislada o análogo EPO N14.

La Figura 15 muestra un estudio del hematocrito de ratón, que compara la actividad del combinado de isoformas alto de EPO N14 (0,036 y 0,0712 \mug), isoforma 14 aislada (0,036 y 0,0712 \mug), combinado de isoformas bajo de EPO 177 (0,0712 \mug) y rHuEPO (0,071 \mug).

Descripción detallada de la invención

La presente invención crea isoformas de eritropoyetina. Las isoformas de eritropoyetina específicas, obtenidas conforme a la presente invención, y sus propiedades, pueden variar dependiendo de la fuente del material de partida. Por ejemplo, las isoformas de eritropoyetina humana derivada de la orina son diferentes de las isoformas de eritropoyetina recombinante. En una realización preferida, la invención se refiere a una isoforma de eritropoyetina que tiene un número específico (esto es, un número fijado, mayor que 0) de ácidos siálicos por molécula de eritropoyetina, estando dicho número seleccionado del grupo que consta de 1 a 14. Ventajosamente, dicho número es 9, 10, 11, 12, 13 ó 14. En otra realización, dicho número es mayor que 14, ventajosamente 16 a 23.

La expresión "isoforma de eritropoyetina", tal como se usa en la presente invención, se refiere a preparaciones de eritropoyetina que tienen un único punto isoeléctrico (pI), y que tienen la misma secuencia de aminoácidos. El término "eritropoyetina", tal como se usa en la presente invención, incluye la eritropoyetina que se encuentra en la naturaleza, eritropoyetina humana derivada de la orina, así como polipéptidos que no se encuentran en la naturaleza, que tienen una secuencia de aminoácidos y una glicosilación suficientemente duplicativa de la eritropoyetina que se encuentra en la naturaleza, para permitir la posesión de propiedades biológicas in vivo, que hacen que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y glóbulos rojos de la sangre.

Se ha encontrado que las isoformas discretas de eritropoyetina recombinante que tienen la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana derivada de la orina, corresponden a moléculas de eritropoyetina que tienen de 1 a 14 ácidos siálicos, y cada isoforma presente en la eritropoyetina recombinante purificada tiene una actividad in vivo que está relacionada con el número de ácidos siálicos que posee la isoforma.

En una realización preferida, la eritropoyetina es el producto de la expresión de una secuencia de ADN exógena que se ha utilizado para transfectar una célula hospedante eucariótica no humana; es decir, en una realización preferida, la eritropoyetina es "eritropoyetina recombinante". La eritropoyetina recombinante se produce ventajosamente conforme a los procedimientos descritos en la patente de los EE.UU. Nº 4.703.008, otorgada en propiedad común a Lin y al solicitante de la presente; dicha patente se incorpora a la presente por su referencia. La eritropoyetina recombinante puede purificarse conforme a los procedimientos generales descritos en el Ejemplo 2 de la patente de los EE.UU. Nº 4.667.016, otorgada en propiedad común a Lai et al. y al solicitante de la presente (dicha patente se incorpora a la presente por su referencia), o alternativamente, conforme al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 de Lai et al., en el que la cromatografía en DEAE-agarosa, se reemplaza por cromatografía en sefarosa Q.

La eritropoyetina purificada conforme al Ejemplo 2 de Lai et al., ut supra, contiene de modo predominante seis isoformas, cuando se analiza por IEF. Además, se ha detectado, al menos, una isoforma adicional de mayor acidez, empleando los procedimientos cromatográficos descritos en el Ejemplo 4. (Esta forma más ácida, que migra conforme a un número mayor de 14 ácidos siálicos en un gel de IEF, puede contener cargas negativas que no son de ácido siálico, como se pone de manifiesto por la resistencia de alguna de las cargas a la digestión con sialidasa). Estas isoformas difieren entre sí por su contenido de ácido siálico. Como se pone de manifiesto en los Ejemplos, esto se demuestra aislando diez de estas isoformas por IEF preparativa y determinando el contenido de ácido siálico de cinco de ellas. En las isoformas ensayadas para determinar el contenido de ácido siálico, se ha encontrado que las cinco isoformas contenían 9, 10, 11, 12 ó 13 residuos de ácido siálico.

Hay una relación entre la actividad específica relativa in vivo de la eritropoyetina y el número de residuos de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, en las isoformas 5 a la 11 (cada isoforma se designa aquí por el número de ácidos siálicos por molécula de eritropoyetina). Las isoformas 11 a la 14 tienen aproximadamente la misma actividad específica relativa in vivo. Las isoformas 5 a 14 se ensayaron, para determinar la actividad in vivo, por el bioensayo de policitemia exhipóxica en ratón, y la cantidad de cada isoforma presente se determina por el ensayo de proteínas de Bradford, absorbancia a 280 nm ó por el radioinmunoensayo (RIA) de la eritropoyetina. Las determinaciones por RIA (Egrie et al., Immunobiology 172, 213 (1986)), expresadas en unidades/ml, se dividen por 212.770 unidades/mg de polipéptido de eritropoyetina, que es la actividad específica media de la eritropoyetina purificada determinada por RIA, para dar concentraciones de proteína de las isoformas aisladas o de las mezclas de isoformas, expresadas en mg de polipéptido de eritropoyetina/ml. Como se pone de manifiesto en los Ejemplos, las actividades específicas relativas in vivo crecen gradualmente desde la isoforma 5 a la isoforma 11 (véase la Tabla 2).

Las actividades específicas in vivo a las que se hace referencia en la presente invención, son medidas de actividades específicas relativas in vivo; es decir, no son medidas de actividades específicas absolutas in vivo. Para los fines de esta aplicación, las actividades específicas se usan únicamente para comparar actividades relativas de isoformas que han sido ensayadas empleando el mismo procedimiento, y en las mismas condiciones, incluido el mismo estándar interno, el mismo tipo de animales, haciendo el mismo análisis de los datos empleados para calcular la actividad específica, así como el mismo ensayo para determinar el contenido de proteína. No se pretende que cualquier valor comunicado para la actividad específica in vivo de cualquier isoforma, represente un valor inherente o absoluto propio de dicha isoforma.

Esta invención también crea composiciones que comprenden dos o más isoformas de eritropoyetina. En una realización, las composiciones comprenden una mezcla de isoformas que tienen más de un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula de eritropoyetina, por ejemplo, más de 11 ácidos siálicos por molécula de eritropoyetina, ó más de 12 ácidos siálicos por molécula, por ejemplo, una mezcla de las isoformas 12, 13 y 14. En otra realización, las composiciones comprenden mezclas de isoformas que tienen un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula de eritropoyetina, por ejemplo, menos de 12, pero más de 8 ácidos siálicos por molécula, como, por ejemplo, en una mezcla de las isoformas 9, 10 y 11. La invención también proporciona composiciones de isoformas de eritropoyetina, en las que las cantidades relativas de las isoformas son iguales o diferentes. Por ejemplo, una mezcla de las isoformas 9, 10 y 11 podría tener las isoformas presentes en una variedad de relaciones, tales como 1:1:1, 2:3:1 ó 20:20:1.

Ventajosamente, las composiciones comprenden mezclas de menos de cuatro isoformas, por ejemplo, una mezcla de las isoformas 11, 12 y 13, ó una mezcla de 12 y 14, ó una mezcla de 7 y 13.

Con el fin de producir mezclas de isoformas de eritropoyetina, esta invención también crea métodos para aislar simultáneamente isoformas seleccionadas de eritropoyetina. Estos métodos incluyen el aislamiento de isoformas individuales por técnicas tales como el enfoque isoeléctrico preparativo, o la preparación de mezclas de isoformas que tienen un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula (por ejemplo, más de 11), mediante técnicas tales como la cromatografía de intercambio iónico o el cromato-enfoque. Todas estas técnicas tienen como base la separación de las proteínas según sus cargas.

En general, la cromatografía de intercambio iónico y el cromato-enfoque implican la aplicación de eritropoyetina humana bruta (medio celular condicionado) o de material purificado, a una resina de columna, en condiciones que permitan fijar algunas o todas las isoformas de eritropoyetina a la resina. En el caso de preparaciones de eritropoyetina bruta, es preferible aplicar la proteína a la columna a un pH de aproximadamente 7, mientras que si se trata de preparaciones purificadas, la proteína puede aplicarse a la columna a un pH comprendido entre 7 y 4. Después de lavar la columna con tampón a aproximadamente pH 4, las isoformas de eritropoyetina que se mantienen unidas en la columna de intercambio iónico, se eluyen aumentando el pH y la concentración de sal del tampón, o aplicando un gradiente de pH decreciente y fuerza iónica creciente a aproximadamente pH 4. Para el cromato-enfoque, las isoformas se eluyen de la columna por un gradiente de pH decreciente o por lavado de la columna con una alta concentración de sal.

En una realización preferida, las isoformas individuales se aíslan usando cromatografía de intercambio iónico. Por ejemplo, la isoforma 14 se aisló usando cromatografía de intercambio iónico, como se describe en el Ejemplo 8.

También están abarcados por la invención ciertos análogos de la eritropoyetina humana. Tal como se usa en la presente invención, la expresión "análogo de la eritropoyetina humana" se refiere a eritropoyetina con uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana, que dan como resultado un aumento del número de sitios para la ligación del ácido siálico. Los análogos se generan por mutagénesis dirigida al sitio, que incluye adiciones, supresiones o sustituciones de residuos de aminoácidos, que aumentan o alteran los sitios disponibles para la glicosilación. Tales análogos pueden tener un número mayor de cadenas de carbohidrato que la eritropoyetina humana.

Los análogos de la eritropoyetina de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos que incluye, al menos, un sitio adicional para la glicosilación. Análogos que tienen niveles de ácido siálico mayores que los encontrados en la eritropoyetina humana, se generan por adición de sitios de glicosilación que no perturben la conformación secundaria o terciaria requerida para la actividad biológica. Ventajosamente, el análogo de eritropoyetina humana tiene 1, 2 ó 3 sitios adicionales para N-glicosilación u O-glicosilación, dando como resultado la incorporación de 1, 2 ó 3 cadenas de carbohidrato adicionales unidas a través de N ó unidas a través de O. Por ejemplo, una leucina en la posición 69 se reemplaza por una asparagina, para dar la secuencia Asn-Leu-Ser, que sirve como un cuarto sitio para la N-glicosilación. Un cambio de esta clase puede generalmente proporcionar hasta cuatro ácidos siálicos adicionales por molécula. Ejemplos de cambios que generan sitios de O-glicosilación adicionales son: alanina en la posición 125 por treonina; y alaninas en las posiciones 124 y 125 por prolina y treonina, respectivamente. Pueden construirse análogos que tengan una o más cadenas adicionales unidas a través de N y unidas a través de O, por ejemplo, los análogos NO1 y NO2 descritos en la Tabla 5. Como se reconocerá por los expertos en la técnica, la presente invención incluye otros muchos análogos de la eritropoyetina humana que tienen sitios adicionales para la glicosilación.

La invención también abarca los análogos que tienen niveles aumentados de ligación de carbohidrato en un sitio de glicosilación. Tales análogos implican usualmente la sustitución de uno o más aminoácidos que están en la proximidad inmediata de un sitio de unión a través de N o de un sitio de unión a través de O. Como consecuencia de estos cambios de aminoácidos, una mayor proporción de polipéptidos de eritropoyetina tendrá una modificación en la cantidad de carbohidratos. Los sitios de glicosilación pueden ser de los que se encuentran en la naturaleza o generados por mutación. Por ejemplo, el análogo N13 no genera una cadena de carbohidrato adicional, aun cuando se haya introducido un sitio de glicosilación en la posición 88. Sin embargo, los análogos N14 y N18, que tienen respectivamente residuos de serina y de valina sustituidos en la posición 87, tienen una cadena de carbohidrato adicional en la posición 88.

La invención también crea análogos que tienen uno o más aminoácidos que se extienden desde el extremo carboxi-terminal de la eritropoyetina y en los que esta prolongación carboxi-terminal proporciona, al menos, un sitio adicional para una cadena de carbohidrato. En una realización, se construyó un análogo por fusión de 28 aminoácidos carboxi-terminales de la gonadotropina coriónica humana (HCG) al residuo de arginina en la posición 166 de la eritropoyetina humana. El fragmento carboxi-terminal de HCG tiene cuatro sitios para O-glicosilación (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254, 7907 (1979)).

Las Tablas 3, 4 y 5 presentan listas de análogos de la eritropoyetina que tienen sitios adicionales para cadenas de carbohidrato unidas a través de N y/o unidas a través de O. Los análogos tienen la secuencia Asn-X-Ser/Thr sustituida en varias posiciones de la cadena polipeptídica de la eritropoyetina humana, para crear sitios de unión a través de N, o tienen introducidos residuos de serina o treonina, para crear sitios de unión a través de O.

La Tabla 6 presenta una lista de los análogos, que incorporan, al menos, una cadena de carbohidrato adicional, unida a través de N, ó una cadena de carbohidrato adicional, unida a través de O, o que incorporan simultáneamente cadenas adicionales unidas a través de N y unidas a través de O, como se pone de manifiesto por la migración de las glicoproteínas en los geles de SDS (Ejemplo 7). Como puede observarse en las Tablas 3 a 6, los análogos que tienen uno o más sitios adicionales para la ligación de carbohidratos, no necesariamente conducen a moléculas de eritropoyetina que tienen cadenas de carbohidrato adicionales. Por ejemplo, la sustitución de residuos de treonina en las posiciones 123 y 125 dio como resultado la adición de una cadena de carbohidrato unida a través de O, mientras que la sustitución de serina o treonina en otras posiciones no condujo a análogos con cadenas adicionales unidas a través de O (véase la Tabla 4). Sin embargo, la sustitución de residuos de asparagina en las posiciones 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 y 138 de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana, dio como resultado la adición de una cadena unida a través de N en dichos sitios. La fusión de un fragmento de polipéptido de HCG al residuo de arginina en la posición 166 de la eritropoyetina humana condujo a una molécula de fusión eritropoyetina-HCG, que tiene, al menos dos cadenas de carbohidrato adicionales unidas a través de O.

Los análogos de la eritropoyetina de la presente invención también abarcan eritropoyetina que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una readaptación de, al menos, un sitio para glicosilación. Una readaptación de un sitio para glicosilación, tal como se usa en la presente invención, se refiere a la supresión de uno o más sitios de glicosilación en la eritropoyetina humana y la adición de uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran en la naturaleza. Los análogos R1, R2 y R3 son ejemplos de tales readaptaciones, y se construyeron suprimiendo los sitios de unión a través de N en las posiciones 24, 38 ó 83, respectivamente, y la adición de un sitio de unión a través de N en la posición 88. Sin embargo, son posibles otros numerosos tipos de readaptaciones de los sitios para carbohidratos, y los análogos resultantes pueden o no tener un número mayor de sitios de glicosilación que la eritropoyetina humana.

Los análogos R1, R2 y R3 se analizaron para determinar su actividad biológica in vivo y los resultados se presentan en la Tabla 7. La introducción de una cadena unida a través de N en Asn 88 restableció la actividad biológica de la eritropoyetina que tiene suprimido uno cualquiera de los tres sitios de unión a través de N que se encuentran en la naturaleza. Estos resultados indican que las posiciones de las cadenas de carbohidrato en la eritropoyetina pueden cambiarse para generar análogos útiles, sin afectar de modo significativo a la actividad biológica.

La presente invención abarca también secuencias de ADN que codifican análogos de la eritropoyetina que tienen sitios adicionales para cadenas unidas a través de N y/o unidas a través de O, análogos que tienen una readaptación de, al menos, un sitio de ligación para una cadena de carbohidrato, y análogos que tienen uno o más aminoácidos que se extienden desde el extremo carboxi-terminal de la eritropoyetina. Los procedimientos empleados para introducir cambios en la secuencia de ADN de la eritropoyetina humana, con el fin de crear y alterar los sitios de ligación para los carbohidratos, se describen en el Ejemplo 6.

Estos análogos de la eritropoyetina pueden ser el producto de la expresión de una secuencia de ADN exógena, es decir, producidos mediante la tecnología del ADN recombinante, o pueden ser productos sintetizados. Una secuencia de ADN exógena comprende cADN, ADN genómico o ADN sintetizado químicamente, que codifica un análogo de la eritropoyetina. También se ofrecen los plásmidos de ADN recombinante y las células hospedantes eucarióticas útiles para la expresión de dichos análogos. Los vectores de expresión incluyen cualquier vector que sea capaz de expresar secuencias de ADN clonadas en una célula hospedante eucariótica, particularmente los vectores utilizados para la expresión en células COS y CHO. Los ejemplos de tales vectores incluyen los plásmidos pEC y pDEC\Delta, descritos en el Ejemplo 6 de la memoria descriptiva. El cultivo de las células hospedantes COS y CHO que expresan análogos de la eritropoyetina se realizó usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Las isoformas aisladas y las mezclas de isoformas derivadas de análogos de la eritropoyetina se obtienen utilizando los métodos descritos anteriormente para preparar isoformas de la eritropoyetina humana. Estos métodos pueden incluir el enfoque isoeléctrico, la cromatografía de intercambio iónico y el cromato-enfoque. Preferiblemente, la cromatografía de intercambio iónico se utiliza para preparar isoformas individuales y mezclas de isoformas derivadas de análogos de la eritropoyetina.

El aumento del número de cadenas de carbohidrato en la eritropoyetina, y por tanto, el número de ácidos siálicos por molécula de eritropoyetina, puede conferir propiedades ventajosas, tales como solubilidad aumentada, mayor resistencia a la proteolisis, inmunogenicidad reducida, semivida del suero aumentada y actividad biológica aumentada.

Los medios condicionados de células CHO que expresan análogos de la eritropoyetina se analizaron para determinar la actividad biológica in vivo, y los resultados se presentan en la Tabla 6. Varios de los análogos ensayados tenían una actividad que era tres veces, o más, superior a la de la eritropoyetina humana. En particular, los análogos que tienen una cadena de carbohidrato adicional unida a través de N en la posición 30 ó en la 88, presentan una actividad 2 ó 3 veces mayor que la eritropoyetina humana, mientras que los análogos que tienen cadenas adicionales unidas a través de O, como resultado de la fusión de la eritropoyetina humana con el fragmento polipeptídico de HCG, tienen, al menos, una actividad doble.

Se purificaron dos análogos de la eritropoyetina que tienen cadenas de carbohidrato adicionales y se aislaron mezclas de isoformas que tienen diferentes contenidos de ácido siálico (Ejemplo 8). Los análogos Thr^{125} y Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} (EPO N14) se separaron en tres fracciones de isoformas separadas y se determinaron las actividades biológicas in vivo para cada una de las fracciones. Los resultados presentados en la Tabla 8 demuestran que las fracciones de isoformas de EPO N14 que tienen mayor contenido de ácido siálico tienen una mayor actividad in vivo.

Un combinado de isoformas ricas en ácido siálico del análogo EPO N14 y de eritropoyetina humana recombinante (isoformas 9-14) se estudió en ensayos de fijación al receptor, experimentos farmacocinéticos y experimentos para determinar el aumento del hematocrito de ratones. Los resultados de estos ensayos indican que hay una relación directa entre el contenido de ácido siálico, la semivida de desaparición y la capacidad de aumentar el hematocrito de los ratones tratados. Así, como se muestra en las figuras 13, 14 y 15, el combinado de isoformas ricas en ácido siálico de EPO N14 tenía una semivida in vivo significativamente más larga y promovía un mayor aumento en el hematocrito, que la isoforma 14 aislada o la eritropoyetina humana recombinante, aun cuando el combinado de isoformas ricas en ácido siálico de N14 no se fijaba tan fuertemente al receptor.

Otra realización de la invención se refiere a las células hospedantes de mamífero (por ejemplo, de ovario de hámster chino, CHO) que sintetizan de modo preferencial isoformas de eritropoyetina humana o análogos de la eritropoyetina que tienen más de un determinado número de ácidos siálicos por molécula, por ejemplo, más de 10 ácidos siálicos por molécula. Las moléculas de eritropoyetina tienen estructuras de oligosacáridos unidos a través de N y unidos a través de O que pueden limitar el contenido de ácido siálico de la molécula. Por ejemplo, los oligosacáridos tetraantenarios (de cuatro ramas) unidos a través de N suministran, en la mayoría de los casos, cuatro sitios posibles para la ligación del ácido siálico, mientras que las cadenas de oligosacáridos bi- y triantenarios, que pueden reemplazar a la forma tetraantenaria en los sitios de unión a través de la asparagina, tienen generalmente, a lo sumo, dos o tres ácidos siálicos ligados. Los oligosacáridos unidos a través de O suministran generalmente dos sitios para la ligación de ácido siálico. Así, las moléculas de eritropoyetina pueden acomodar un total de 14 residuos de ácido siálico, con tal que los tres oligosacáridos unidos a través de N sean tetraantenarios. Los cultivos de células de mamífero se someten a escrutinio para detectar las células que incorporan preferentemente cadenas tetraantenarias a la eritropoyetina recombinante, maximizando de esta forma el número de sitios para la ligación de ácido siálico.

Los oligosacáridos unidos a través de N de la eritropoyetina de la orina contienen ácido siálico tanto en una unión \alpha 2,3, como en una \alpha 2,6, a galactosa (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Típicamente el ácido siálico en la unión \alpha 2,3 se añade a la galactosa sobre la rama \alpha 1,6 de manosa y el ácido siálico en la unión \alpha 2,6 se añade a la galactosa sobre la rama \alpha 1,3 de manosa. Las enzimas que incorporan estos ácidos siálicos (\beta-galactósido \alpha 2,3 sialiltransferasa y \beta-galactósido \alpha 2,6 sialiltransferasa) tienen la máxima eficiencia para incorporar el ácido siálico a las ramas \alpha 1,6 de manosa y \alpha 1,3 de manosa, respectivamente.

Las células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofoliato reductasa (DHFR) constituyen un tipo de célula hospedante utilizado comúnmente para la producción de glicoproteínas recombinantes, incluyendo la eritropoyetina recombinante. Estas células no expresan la enzima \beta-galactósido \alpha 2,6 sialiltransferasa y por tanto, no incorporan ácido siálico en la unión \alpha 2,6 a los oligosacáridos unidos a través de N de las glicoproteínas producidas en estas células (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al., J. Cromatogr. 400, 207 (1987)). Por consiguiente, la eritropoyetina recombinante producida en las células CHO carece de ácido siálico en la unión 2,6 a galactosa (Sasaki et al. (1987), ut supra; Takeuchi et al. (1987), ut supra).

En otra realización de la presente invención, se produce eritropoyetina humana o un análogo de la eritropoyetina en células CHO que están transfectadas con un gen funcional de \beta-galactósido \alpha 2,6 sialiltransferasa, para producir la incorporación del ácido siálico en la unión \alpha 2,6 a galactosa. Las isoformas resultantes contendrán ácido siálico que tiene uniones \alpha 2,3 y \alpha 2,6 a galactosa. Véase Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989), que se incorpora a la presente por su referencia, para una descripción de técnicas destinadas a la creación de células CHO u otras células hospedantes de mamífero modificadas.

La invención abarca también composiciones farmacéuticas, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una isoforma específica o mezcla de isoformas, junto con un diluyente, un coadyuvante y/o un vehículo adecuados, útiles en la terapia con eritropoyetina. También están incluidas las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo de la eritropoyetina, junto con un diluyente, un coadyuvante y/o un vehículo adecuados. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente invención, se refiere a la cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección y un régimen de administración dados. La administración de isoformas de eritropoyetina humana o análogos de la eritropoyetina se hace preferiblemente por vías parenterales. La vía específica elegida dependerá de la afección que se esté tratando. La administración de isoformas de eritropoyetina humana o de análogos de la eritropoyetina se hace preferiblemente como parte de una formulación que contiene un vehículo adecuado, tal como seroalbúmina humana, un diluyente adecuado, tal como una solución salina tamponada, y/o un coadyuvante adecuado. La dosificación requerida incluirá cantidades suficientes para elevar el hematocrito de los pacientes y variará dependiendo de la gravedad de la afección que se esté tratando, del método de administración empleado y similares.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar de modo más completo la invención, pero no ha de entenderse que limitan su alcance. El estándar de eritropoyetina usado en los bioensayos in vivo utilizados en los Ejemplos, es un estándar de eritropoyetina recombinante que se normalizó frente a un estándar de eritropoyetina de orina parcialmente purificada. Por consiguiente, sólo se están midiendo actividades específicas relativas in vivo. Así pues, las actividades específicas in vivo se expresan en "unidades/ml", "unidades/mg" y "unidades/A_{280}", y no en "IU/ml", "IU/mg" y "IU/A_{280}", porque el estándar de eritropoyetina empleado no ha sido directamente correlacionado con ningún estándar internacional existente.

Ejemplo 1 Aislamiento de isoformas de eritropoyetina recombinante

La eritropoyetina recombinante se produce como se describe en Lin, ut supra. La eritropoyetina recombinante empleada como material de partida para los aislamientos de la primera y la tercera isoformas, se purifica conforme al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 de Lai et al. (en propiedad común con el solicitante de la presente), ut supra. El material de partida para el aislamiento de la segunda y la quinta isoformas se purifica conforme a Lai et al., ut supra, usando la modificación de la cromatografía en sefarosa Q. Estas preparaciones contienen una mezcla de isoformas de eritropoyetina recombinante que tienen la misma secuencia de aminoácidos que la eritropoyetina humana derivada de la orina y contienen predominantemente las isoformas 9 a 14. El material de partida para la preparación de la cuarta isoforma es el material que se eluye durante el lavado con ácido acético 5 mM/glicina 1 mM/urea 6 M, de la columna de intercambio aniónico del Ejemplo 2 de Lai et al. Esta fracción contiene isoformas con un número de ácidos siálicos igual o menor que 9 y fue ulteriormente purificada por cromatografía de penetrabilidad en gel, como se describe en el Ejemplo 2 de Lai et al., antes de su uso en el procedimiento de enfoque isoeléctrico preparativo. La preparación de la sexta isoforma empleó como material de partida una preparación purificada de eritropoyetina recombinante, que tiene de 4 a 13 residuos de ácido siálico. Este material se purificó como en el Ejemplo 2 de Lai et al., excepto por una modificación en la columna de intercambio iónico (elución de la eritropoyetina recombinante con un gradiente de cloruro de sodio a pH 8,4 y omisión del lavado con una mezcla de ácido acético y urea), con lo que se consigue la retención de la mayoría de las isoformas presentes en el material de partida.

Se realizan seis preparaciones diferentes de isoformas individuales, por enfoque isoeléctrico preparativo en un lecho de gel granulado (Ultrodex, LKB), esencialmente como en la Nota de Aplicación 198 de LKB. Se utilizan anfolitos (Pharmalyte 2.5-5, Pharmacia), y el lecho de gel contiene urea 5 M.

En la primera preparación, se aplican al gel aproximadamente 20 mg de eritropoyetina recombinante en 6,8 ml de citrato de sodio 20 mM/cloruro de sodio 100 mM, pH 7,0, y se enfoca a 8 vatios durante aproximadamente 16 horas. Después del enfoque isoeléctrico, las bandas de las isoformas en el gel se visualizan por una impresión de contacto del lecho de gel en papel. Se hace la impresión y se fija seguidamente por inmersión en 3 cambios (aproximadamente 10 minutos cada vez, temperatura ambiente) de solución de fijación (metanol al 40%/ácido acético al 10%/TCA al 10%/ácido sulfosalicílico al 3,5%), se somete a un cambio (aproximadamente 10 minutos) de metanol al 40%/ácido acético al 10% (30-60ºC), se tiñe durante 15 minutos a 60ºC en azul Coomassie R-250 al 0,125%/metanol al 40%/ácido acético al 10%, y se destiñe luego en metanol al 7,5%/ácido acético al 10%, a fin de visualizar las isoformas separadas. Se retira la región del lecho de gel granulado que contiene las isoformas (\sim50% de la resina), se añade agua (\sim16 ml), y la suspensión se vierte en una bandeja de 14 \times 62 cm y se evapora hasta \sim40 g de peso neto. Esta preparación se somete a enfoque una segunda vez, y se hace, como antes, una impresión de contacto del lecho de gel. La porción del gel que contiene cada una de las seis isoformas discernibles se retira del lecho de gel.

Para eluir las isoformas procedentes del gel, se añade a cada isoforma una solución que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 7,0/Chaps 5 mM, a fin de generar una suspensión. Las suspensiones se ponen en pequeñas columnas y se lavan con el tampón de Tris-Chaps. Se recogen los líquidos que fluyen a través de las columnas y se aplican separadamente a pequeñas columnas (configuración de columna abierta), que contienen resina de fase inversa Vydac C4, equilibrada en etanol al 20%/Tris-HCl 10 mM, pH 7,0. Las columnas se desarrollan por etapas con etanol al 20%/Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, etanol al 35%/Tris-HCl 10 mM, pH 7,0 y etanol al 65%/Tris-HCl 10 mM, pH 7,0. La fracción que se eluye con etanol al 65%/Tris-HCl 10 mM se diluye 1:1 con Tris-HCl 10 mM, pH 7,0 y se somete a concentración y luego a intercambio de tampón a Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, usando un microconcentrador Centricon-10 (Amicon). El enfoque isoeléctrico analítico de esta preparación se realiza esencialmente como se describe en la nota técnica 250 de LKB, usando 3-5 anfolinas Servalyte (Serva) en un gel de poliacrilamida que contiene urea 5 M.

En una segunda preparación, se aplican al gel aproximadamente 26 mg de eritropoyetina recombinante en 6,5 ml de agua desionizada, y se enfoca a 2,5 vatios durante 35 minutos y a 10 vatios durante aproximadamente 17 horas. Las bandas de la proteína sometida a enfoque, que son visibles en el lecho de gel, se retiran en forma de 11 combinados diferentes. Cada combinado se completa hasta aproximadamente 7,5 ml con agua desionizada, y 20 ml de cada uno de los sobrenadantes del combinado resultante se someten a enfoque isoeléctrico analítico, como se describe anteriormente. A cada uno de los combinados se le añaden 5 ml de Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 y las suspensiones se colocan, cada una, en una pequeña columna y se deja fluir la fase líquida a través de la misma. La resina se lava con aproximadamente tres volúmenes de Tris-HCl 0,5 M, pH 7, y la solución de lavado se combina con el líquido que había fluido a través de la columna. Los eluidos se concentran y se someten a intercambio de tampón a citrato de sodio 20 mM/cloruro de sodio 100 mM, pH 7,0, utilizando dispositivos desechables de ultrafiltración Amicon, que tienen un límite de separación de 10.000 D de peso molecular. Las soluciones concentradas (aproximadamente 0,5 ml) se pasan luego a través de un filtro de acetato de celulosa, con un límite de separación de 0,22 \mum. Sobre la base del enfoque isoeléctrico analítico, se encuentran cinco combinados que contienen predominantemente las isoformas individuales 10, 11, 12, 13 y 14.

En una tercera preparación, se aplican al gel aproximadamente 30 mg de eritropoyetina recombinante en 21,8 ml de agua destilada, y se enfoca a 2 vatios durante 25 minutos, a 10 vatios durante 20 horas y a 15 vatios durante 15 minutos. Las bandas de la proteína correspondientes a las isoformas individuales se observan visualmente y se retiran del lecho de gel. Se añade agua destilada a las isoformas aisladas del gel para generar una suspensión y los sobrenadantes resultantes se analizan por enfoque isoeléctrico analítico. Un volumen igual de Tris-HCl 1 M, pH 7,2, se añade a cada suspensión, las suspensiones se colocan en pequeñas columnas separadas y se deja que la fase líquida fluya a través de la columna para eluir las isoformas. Cada fase que fluye a través de la columna se concentra y se somete a intercambio de tampón a citrato de sodio 20 mM/cloruro de sodio 100 mM, pH 7,0, utilizando dispositivos desechables de ultrafiltración Amicon, que tienen un límite de separación de 10.000 D de peso molecular. Un gel de enfoque isoeléctrico analítico reveló que se obtuvieron combinados que contienen predominantemente las isoformas individuales 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

Una cuarta preparación de isoforma utilizó como material de partida eritropoyetina que contiene las isoformas 3 a 9 (preparadas como se describe anteriormente). Antes del enfoque isoeléctrico preparativo, realizado esencialmente como se describe para las preparaciones 1-3 anteriores, los anfolitos (Pharmalyte 2.5-5) se fraccionaron con carácter previo en una célula de enfoque isoeléctrico en fase líquida Rotofor (Bio-Rad, Richmond, CA), para suministrar un intervalo de anfolitos más adecuado a los puntos isoeléctricos más bajos del material de partida. El fraccionamiento previo se realizó mezclando 6,7 ml de Pharmalyte 2.5-5 con 15 g de urea y añadiendo agua purificada, para llevar el volumen a 50 ml. Esta mezcla se fraccionó en el Rotofor a 10 vatios, 1ºC, durante 5,5 horas, usando ácido fosfórico 0,1 M e hidróxido de sodio 0,1 M como anolito y catolito, respectivamente. Las fracciones de anfolito que tienen valores medidos del pH entre 4,5 y aproximadamente 6 se utilizaron en el enfoque isoeléctrico en lecho plano.

Los anfolitos se retiraron de las isoformas utilizando un eluidor Centri (Amicon, Danvers, MA) y un Centricon (Amicon) con un límite de separación de 10.000 D de peso molecular, empleando los siguientes parámetros: 0,18 de tampón Tris, pH 8,8, 100 V, 25-30 mA, durante 3 horas. Las isoformas se sometieron luego a intercambio de tampón a cloruro de sodio 0,1 M, por penetrabilidad en gel, utilizando Sephadex G-25 (Pharmacia). El enfoque isoeléctrico analítico de los cinco combinados resultantes indicó que contenían las isoformas 4, 5, 6, 7 y 8. La isoforma 4 se desplazaba formando varias bandas, que indican que puede haber sufrido cierta degradación.

La quinta preparación de isoforma se modificó por la adición de una etapa de enfoque previo, al procedimiento de enfoque isoeléctrico en lecho plano. En esta modificación, la proteína no se añadió a la mezcla de anfolito, urea y gel antes de la electroforesis, sino que se añadió al aparato de enfoque isoeléctrico, después de la generación del gradiente de pH en el lecho de gel. Después de un enfoque previo de 75 minutos (1500 V-h), se retiró la sección de lecho de gel de 2,25-4,25 cm desde el cátodo, se mezcló con la solución de eritropoyetina y se añadió de nuevo al lecho de gel. Después del enfoque isoeléctrico, las isoformas 10, 11, 12, 13 y 14 se eluyeron del lecho de gel y se separaron de los anfolitos por ultrafiltración, usando dispositivos Centricon-10 (Amicon).

La modificación citada, de adición de un enfoque previo, se realizó para hacer que las características de absorbancia en el ultravioleta de las preparaciones de isoformas fuesen más similares a la de la eritropoyetina recombinante de partida. Esta mejora en las características espectrales puede verse en la relación de las absorbancias a 280 y a 260 nm, correspondiente a las isoformas aisladas. La media de la relación entre la absorbancia a 280 nm y la de 260 nm (A_{280}/A_{260}), para las isoformas de las preparaciones 2 y 3 (no sometidas a enfoque previo), es 1,36\pm0,11, mientras que la relación media A_{280}/A_{260} para las preparaciones 5 y 6 (con enfoque previo) es 1,68\pm0,20. Si se excluye del cálculo la isoforma #14, las relaciones medias A_{280}/A_{260} son 1,39\pm0,11 y 1,74\pm0,09, para las preparaciones 2 y 3, y 5 y 6, respectivamente. (La isoforma 14 puede tener el espectro más atípico, porque está presente en las cantidades más pequeñas, y está, por consiguiente, más sujeta a interferencias por la contaminación de vestigios de componentes de los anfolitos, o porque es la más próxima al electrodo durante el procedimiento de enfoque isoeléctrico en lecho plano). La relación media A_{280}/A_{260} para la eritropoyetina recombinante, preparada conforme al Ejemplo 2 de Lai et al. (modificado como se describe anteriormente, por el uso de sefarosa Q como resina de intercambio aniónico), es 1,91\pm0,04.

Como se describe anteriormente, el material de partida para la preparación de isoforma #6 fue una preparación de eritropoyetina recombinante que contiene las isoformas 4 a 13. Los anfolitos se enfocaron previamente en el aparato Rotofor, como en la cuarta preparación. Para el enfoque isoeléctrico en lecho plano, se emplearon fracciones de anfolitos que tienen valores del pH medidos entre 3,7 y 4,8. El lecho plano se sometió a enfoque previo como en el caso #5, y las isoformas 9, 10, 11, 12 y 13 se obtuvieron después de una ultrafiltración (Centricon-10) para separar los anfolitos portadores.

Ejemplo 2 Contenido de ácido siálico de las isoformas de eritropoyetina recombinante

Las isoformas aisladas como se describe en el Ejemplo 1 y la eritropoyetina purificada conforme a los procedimientos descritos en Lai et al., ut supra (mezcla de isoformas 9 a 14) se someten a intercambio de tampón a cloruro de sodio 0,10-0,15 M, y se analizan para determinar el contenido de ácido siálico, mediante una modificación del procedimiento de Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Los residuos de ácido siálico se escinden de las glicoproteínas por hidrólisis con ácido sulfúrico 0,35 M, a 80ºC, durante 30 minutos, y las soluciones se neutralizan con hidróxido de sodio antes del análisis. A fin de estimar la cantidad de la proteína eritropoyetina presente, se realiza un ensayo de proteínas de Bradford (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)), usando eritropoyetina recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana como estándar, y empleando los reactivos de ensayo y el procedimiento de micro-método suministrados por Bio-Rad. Los resultados, expresados como moles de ácidos siálicos por mol de eritropoyetina, se presentan en la Tabla 1. Las isoformas se designan conforme al número de ácidos siálicos por molécula, y comprenden desde la menos ácida (Isoforma 9) a la más ácida (Isoforma 13). Las isoformas 9 a 13 se muestran en las pistas 6 a 10 del gel de la Figura 1. Las cantidades de Isoforma 14 son insuficientes para medir con precisión el contenido de ácido siálico. El contenido de ácido siálico de esta isoforma se deduce de su migración en los geles de IEF en relación con otras isoformas. El contenido de ácido siálico de las isoformas 5 a 8 (preparación #4) no ha sido medido, pero se deduce, análogamente, de su migración en los geles de IEF.

TABLA 1

1

Ejemplo 3 Actividad de las isoformas de eritropoyetina recombinante

Las isoformas aisladas como se describe en el Ejemplo 1 se ensayan por la absorbancia a 280 nm, por el ensayo de proteínas de Bradford y por el radioinmunoensayo (RIA) de la eritropoyetina, a fin de determinar la cantidad de eritropoyetina recombinante presente. El bioensayo de policitemia exhipóxica en ratón (Cotes et al., Nature 191, 1065 (1961)) se usa para determinar la actividad biológica relativa in vivo. La cuantificación de la cantidad de la proteína eritropoyetina presente usando el RIA de la eritropoyetina, produjo resultados que indican una actividad específica relativa in vivo más alta para ciertas isoformas, debido a una inmunorreactividad claramente disminuida de las isoformas que contienen grandes cantidades de ácido siálico, que conduce a una subestimación de la concentración de eritropoyetina y por consiguiente, a una sobre-estimación de la actividad específica relativa in vivo, para las isoformas más negativas. Las determinaciones por el bioensayo en el ratón, expresadas en unidades/ml, se dividen por las correspondientes concentraciones de proteína, para dar actividades específicas in vivo expresadas en unidades/mg de polipéptido de eritropoyetina. Estas actividades específicas se presentan en la Tabla 2.

En dicha Tabla 2, "n" es el número de preparaciones de isoformas independientes que contribuyen al valor de la actividad específica. En la mayoría de los casos, se realizaron varios ensayos in vivo sobre cada preparación de isoforma. Los mismos datos in vivo contribuyen a los cálculos de la actividad específica para las tres columnas, en las que las unidades/mg de polipéptido de eritropoyetina se determinaron por la absorbancia a 280 nm, a partir de las potencias del radioinmunoensayo y a partir de los resultados del ensayo de proteínas de Bradford, respectivamente. La eritropoyetina recombinante purificada que contiene las isoformas 9 a 14 se usó como estándar en el ensayo de proteínas de Bradford. El valor de "n" puede ser más bajo para el cálculo hecho usando el ensayo de proteínas de Bradford, puesto que algunas preparaciones ya no estaban disponibles cuando se realizaron los ensayos de Bradford.

La eritropoyetina purificada conforme a los procedimientos descritos en Lai et al., ut supra, y que contiene una mezcla de las isoformas 9 a 14, se usa como estándar para los radioinmunoensayos y para los ensayos in vivo.

Las actividades específicas relativas, expresadas en unidades/mg de polipéptido de eritropoyetina, pueden convertirse en unidades/A_{280} multiplicando por 0,807 mg de polipéptido de eritropoyetina/A_{280}. El factor de conversión se deduce de multiplicar el coeficiente de extinción de la eritropoyetina (1,345 mg/A_{280}) por el contenido de proteína de la glicoproteína de eritropoyetina (aproximadamente 60% en peso, Davis et al., Biochemistry 26, 2633, (1987)), para obtener mg de polipéptido de eritropoyetina/A_{280} (es decir, 1,345 mg de eritropoyetina/A_{280} \times 0,60 mg de polipéptido/mg de eritropoyetina = 0,807 mg de polipéptido/A_{280}). Adicionalmente, las actividades específicas expresadas en unidades/mg de polipéptido de eritropoyetina pueden multiplicarse por el factor 0,60 mg de polipéptido/mg de glicoproteína de eritropoyetina, para dar actividades específicas expresadas en unidades/mg de glicoproteína de eritropoyetina.

2

Los datos de la Tabla 2 se presentan también gráficamente en las Figuras 2A, 2B y 2C. Estos datos ponen de manifiesto que la actividad relativa in vivo de la eritropoyetina crece en función del contenido de ácido siálico hasta la isoforma #11. Las isoformas 11 a 14 tienen esencialmente la misma bioactividad relativa in vivo. (Esto es más evidente cuando la concentración de la isoforma 14 se expresa usando el valor del ensayo de Bradford. El valor de Bradford puede ser más preciso para la isoforma 14, debido a los niveles generalmente bajos obtenidos y a la dificultad que esto origina en la determinación por medio de A_{280}, y a la reactividad más claramente disminuida en el RIA de las formas muy negativas, discutida anteriormente). La mayor actividad específica relativa in vivo de las isoformas de eritropoyetina que tienen más ácido siálico es muy probablemente debida a una semivida en circulación más larga de estas formas. Las isoformas 9 y 13 se marcaron con yodo radiactivo (^{125}I) y se determinó su velocidad de desaparición en ratas. La semivida en circulación fue significativamente más larga para la isoforma 13 que para la isoforma 9.

Ejemplo 4 Selección de mezclas de isoformas de eritropoyetina recombinante por cromatografía en sefarosa Q

Medios celulares condicionados de la producción de eritropoyetina recombinante conforme a los procedimientos descritos en Lin, ut supra, se concentran y se diafiltran frente a Tris 10 mM, pH 7,2. La concentración de proteína se determina por el ensayo de microproteínas de Bradford, usando seroalbúmina bovina como estándar. Una solución de 19,6 ml de volumen que contiene 40 mg de proteína total, se hace 20 \muM en CuSO_{4}, se filtra a través de un filtro con un límite de separación de 0,45 \mum y se carga en una columna con un volumen de lecho de 4 ml (1,05 cm de altura \times 2,2 cm de diámetro), rellena de sefarosa Q de flujo rápido (Pharmacia), que ha sido equilibrada con Tris 10 mM, pH 6,8 a 7,0, a 4ºC. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lava con dos volúmenes de columna del mismo tampón. La velocidad de flujo en la columna es aproximadamente 1 ml/min. Se montan seis columnas separadas usando este procedimiento, para seleccionar mezclas definidas de isoformas de eritropoyetina.

Las columnas se lavan con 6 a 9 volúmenes de columna de un tampón de bajo pH que consta de: Columna #1, ácido acético 150 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M, ajustada a pH 4,7 con NaOH; Columna #2, ácido acético 200 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M, ajustada a pH 4,7 con NaOH; Columna #3, ácido acético 250 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M, ajustada a pH 4,7 con NaOH; Columna #4, ácido acético 300 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M, ajustada a pH 4,7 con NaOH; Columna #5, ácido acético 150 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M; Columna #6, ácido acético 300 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M. El pH de las columnas se sube a aproximadamente pH 7, lavando cada una de ellas con 8 a 11 volúmenes de columna de Tris-HCl 10 mM, NaCl 55 mM, CuSO_{4} 20 \muM, pH 7. Las mezclas definidas de isoformas de eritropoyetina se eluyen de las columnas por lavado con Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, CuSO_{4} 20 \muM, pH 7,0.

Los combinados de isoformas eluidos de cada columna se concentran y se someten a un intercambio del disolvente en agua, usando un microconcentrador Centricon-10 de Amicon. Los resultados del enfoque isoeléctrico analítico de estos combinados concentrados se muestran en la Figura 3. Las pistas 1 a 6 del gel representan mezclas definidas de isoformas de eritropoyetina, eluidas de las columnas 1 a 6, respectivamente. La "mezcla de isoformas" que aparece en la pista del gel de la extrema derecha de la Figura 3 representa un medio celular que se aplica a una columna de sefarosa Q como se describe anteriormente, la columna se lava con ácido acético 5 mM, glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M, y la mezcla de isoformas de eritropoyetina se eluye de la columna usando los procedimientos descritos anteriormente. Esta mezcla de isoformas eluida se purifica ulteriormente, conforme a los procedimientos descritos en Lai et al., ut supra, antes del enfoque isoeléctrico analítico.

Ejemplo 5 Fraccionamiento de isoformas de eritropoyetina recombinante empleando un gradiente de pH decreciente en sefarosa Q

En otro procedimiento, las isoformas de eritropoyetina se separan empleando un gradiente de pH decreciente y fuerza iónica creciente. El medio que contiene eritropoyetina, concentrado y diafiltrado, se carga en una columna de sefarosa Q, a una relación de aproximadamente 40 mg de proteína total por ml de gel. La columna se lava luego con aproximadamente dos volúmenes de columna de Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, y luego con aproximadamente 10 volúmenes de columna de ácido acético 2 mM/glicina 1 mM/CuSO_{4} 20 \muM/urea 6 M (pH aproximadamente 4,8), para eliminar las proteínas contaminantes y las isoformas de eritropoyetina que contienen menos de aproximadamente 7 residuos de ácido siálico. Las isoformas que contienen de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 ácidos siálicos se eluyen de la columna utilizando un gradiente que comienza con ácido acético aproximadamente 2 mM en urea 6 M/ glicina 1 mM/CuSO_{4} 20 \muM, y va hasta ácido acético 40 mM/ urea 6 M/glicina 1 mM/CuSO_{4} 20 \muM (pH aproximadamente 4). El volumen total del gradiente es aproximadamente 40 volúmenes de columna y se recogen fracciones de aproximadamente 1 volumen de columna cada una, en vasijas que contienen un volumen de tampón Tris suficiente para llevar el pH al intervalo de 6 a 8,5, de modo que se evite un largo tiempo de exposición a pH bajo de las fracciones recogidas. Porciones de las fracciones se someten a enfoque isoeléctrico analítico para hacer el seguimiento de la separación. La Figura 4 muestra la separación de las isoformas 8 a 11, que puede conseguirse por este procedimiento. Las isoformas 12 a 14, que permanecen unidas a la columna al final del gradiente, se eluyen por lavado con un tampón que consta de Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, CuSO_{4} 20 mM (pH 7,0). Las isoformas (separadas durante el gradiente o eluidas por la solución de cloruro de sodio) se liberan de las proteínas contaminantes por cromatografía de fase inversa, seguida de cromatografía de penetrabilidad en gel, como se describe en el Ejemplo 2 de Lai et al.

Ejemplo 6 Construcción de análogos de eritropoyetina humana

Las posiciones de los sitios de ligación de carbohidratos existentes dentro de la secuencia de aminoácidos de la
eritropoyetina humana se muestran en la Figura 5 (SEQ ID. NO: 26). Los procedimientos para generar sitios de gli-
cosilación adicionales para la eritropoyetina se resumen en las Figuras 6A-C y se describen a continua-
ción.

Los siguientes cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron para su uso en mutagénesis in vitro:

[Asn^{4}, Ser^{6}] EPO:

5' CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA 3'

(SEQ ID NO: 1)

[Asn^{9}, Ser^{11}] EPO:

5' ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT 3'

(SEQ ID. NO: 2)

[Asn^{69}] EPO:

5' GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG 3'

(SEQ ID. NO: 3)

[Asn^{124}] EPO:

5' TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC 3'

(SEQ ID. NO: 4)

[Asn^{125}, Ser^{127}] EPO:

5' CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAC 3'

(SEQ ID. NO: 5)

[Asn^{163}, Ser^{165}] EPO:

5' AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAGGTG 3'

(SEQ ID. NO: 6)

[Thr^{125}] EPO:

5' TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC 3'

(SEQ ID. NO: 7)

[Pro^{124}, Thr^{125}] EPO:

5' CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC 3'

(SEQ ID. NO: 8)

Los codones subrayados muestran las regiones faltas de emparejamiento, en las que los aminoácidos indicados entre corchetes reemplazan a los aminoácidos de tipo silvestre.

[Asn^{4}, Ser^{6}] EPO se construyó para añadir un sitio de N-glicosilación en Asn 4. [Asn^{9}, Ser^{11}] EPO se construyó para añadir un sitio de N-glicosilación en Asn 9. [Asn^{69}] EPO se construyó para añadir un sitio de N-glicosilación en Asn 69. [Asn^{125}, Ser^{127}] EPO se construyó para añadir un sitio de N-glicosilación en Asn 125. [Thr^{125}] EPO y [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO se construyeron para añadir un sitio de O-glicosilación en Thr 125.

\newpage

Los siguientes cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron para su uso en mutagénesis in vitro:

[Asn^{69}, Thr^{71}] EPO:

5' GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC 3'

(SEQ ID. NO: 9)

[Ser^{68}, Asn^{69}, Thr^{71}] EPO:

5' CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC 3'

(SEQ ID. NO: 10)

[Asn^{125}, Thr^{127}] EPO:

5' CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC 3'

(SEQ ID. NO: 11)

[Asn^{125}, Thr^{127}, Thr^{131}] EPO:

5' ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT 3'

(SEQ ID. NO: 12)

[Pro^{124}, Asn^{125}, Ser^{127}] EPO:

5' CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC 3'

(SEQ ID. NO: 13)

[Pro^{124}, Asn^{125}, Thr^{127}] EPO:

5' CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC 3'

(SEQ ID. NO: 14)

[Thr^{125}, Thr^{126}] EPO:

5' CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA 3'

(SEQ ID. NO: 15)

[Pro^{124}, Thr^{125}, Thr^{126}, Thr^{131}] EPO:

Partiendo de [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO cADN, el cebador de oligonucleótido

5' AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC 3'

(SEQ ID. NO: 16)

se usa para generar [Pro^{124}, Thr^{125}, Thr^{126}] EPO. El cebador de oligonucleótido

5' TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG 3'

(SEQ ID. NO: 17)

se usa seguidamente para generar [Pro^{124}, Thr^{125}, Thr^{126}, Thr^{131}] EPO.

[Asn^{69}, Thr^{71}] EPO y [Ser^{68}, Asn^{69}, Thr^{71}] EPO se construyen para añadir un sitio de N-glicosilación en Asn 69 y para intensificar la N-glicosilación en dicho sitio. [Asn^{125}, Thr^{127}] EPO, [Asn^{125}, Thr^{127}, Thr^{131}] EPO, [Pro^{124}, Asn^{125}, Ser^{127}] EPO y [Pro^{124}, Asn^{125}, Thr^{127}] EPO se construyen para añadir un sitio de N-glicosilación en Asn 125 y para aumentar la glicosilación en dicho sitio. [Thr^{125}, Thr^{126}] EPO y [Pro^{124}, Thr^{125}, Thr^{126}, Ser^{131}] EPO se construyen para añadir un sitio de O-glicosilación en Thr 125 y para aumentar la glicosilación en dicho sitio.

La fuente del ADN de eritropoyetina para la mutagénesis in vitro fue el plásmido Hu13, un clon de cADN de eritropoyetina humana en pUC 8 (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). El ADN de plásmido derivado de Hu13 se digirió con las enzimas de restricción BstEII y BglII, los fragmentos de ADN resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de eritropoyetina de 810 pares de bases (pb) se aisló del gel utilizando un estuche GeneClean® y los procedimientos suministrados por el fabricante (BIO 101, Inc.). El plásmido pBRgHuEPO contiene el gen genómico de la eritropoyetina como un fragmento BamHI insertado en un derivado de pBR322, como se describe en la patente otorgada a Lin en propiedad común con el solicitante de la presente, ut supra. pBRgHuEPO se digirió también con BstEII y BglII, y se recuperó el fragmento del vector de 6517 pb. La ligación de los dos fragmentos conduce a IGT1. Para construir pEC-1, se digirió pDSVL (descrito en la patente otorgada a Lin en propiedad común con el solicitante de la presente, ut supra, y mostrado en la Figura 5B) con BamHI y se ligó a él el fragmento aislado BamHI de 2,8 kilobases (kb) de IGT1, que contiene cADN de eritropoyetina.

A fin de generar el ADN de cadena simple para la mutagénesis in vitro, se digirió pEC-1 con BamHI y BglII y se aisló el fragmento de cADN de eritropoyetina de 820 pares de bases. Éste se ligó al sitio BamHI de m13mp18 para dar m13-EC-1. Se recuperó el ADN de cadena simple de los sobrenadantes de la cepa RZ1032 de E. coli, infectada por m13-EC-1, como se describe en Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987), y Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 (1983). Para la mutagénesis in vitro, aproximadamente 1 \mug del ADN de cadena simple y 0,2 pmol de uno de los cebadores sintéticos descritos anteriormente, se mezclaron con 6 \mul de tampón (Tris 250 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 50 mM y ditiotreitol 50 mM). Para reasociar el cebador al molde, el volumen de reacción se ajustó a 10 \mul con agua, la mezcla se calentó a 65ºC durante 5 minutos y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. Para la reacción de prolongación, se añadieron 2,5 \mul de cada uno de dTTP, dATP, dGTP, dCTP y ATP (todos a la concentración 10 \muM), seguidos de 1 \mul (1 unidad) de ADN polimerasa de E. coli (fragmento Klenow) y 1 \mul (1 unidad) de ADN ligasa de T4. La mezcla se incubó seguidamente a lo largo de la noche a 14ºC y se utilizó para transformar E. coli JM 109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)), como se describe en Messing, ut supra.

Para identificar los clones mutantes por hibridación diferencial, placas sobre agar nutriente se transfirieron a filtros Gene Screen (New England Nuclear). Los filtros se secaron bajo una lámpara de calor y se incubaron seguidamente durante una hora en 6\times SSC, que contiene SDS al 1%, a 60ºC. Para la hibridación, el cebador de oligonucleótido anterior (8 pmol) se marcó en el extremo con polinucleótido quinasa de T4 y ATP marcado en \gamma con ^{32}P, y se incubó con los filtros, a lo largo de la noche, en 6\times SSC, SDS al 0,5% y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón, a 37ºC para la mutación [Asn^{124}], a 55ºC para la mutación [Asn^{4}, Ser^{6}], a 65ºC para las mutaciones [Thr^{125}] y [Pro^{124}, Thr^{125}], y a 70ºC para las mutaciones [Asn^{9}, Ser^{11}] y [Asn^{163}, Ser^{165}]. Al día siguiente, los filtros se lavaron tres veces con 6\times SSC a temperatura ambiente, y se sometieron a autorradiografía. En caso necesario, los filtros se lavaron a continuación con 6\times SSC, a temperaturas crecientes, hasta que se detectó que era escasa o nula la hibridación con placas que tienen la secuencia de cADN de eritropoyetina de tipo silvestre. Se identificaron los clones que dieron señales de hibridación positivas en estas condiciones y se utilizaron para una nueva transfección de JM109, a fin de aislar un clon puro. El análisis de secuencias por el método didesoxi de terminación de la cadena indicó que estaban presentes las mutaciones a residuos de asparagina, serina, treonina y prolina.

Los ADN de cadena doble de m13 EC-1 que llevan los cambios [Asn^{4}, Ser^{6}], [Asn^{9}, Ser^{11}], [Asn^{69}], [Asn^{124}], [Asn^{125}], [Ser^{127}], [Asn^{163}, Ser^{165}], [Thr^{125}] y [Pro^{124}, Thr^{125}] se recuperaron de las células transfectadas de JM109, por el método de la ebullición (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)). Los ADN se digirieron con BstEII y XhoII y se aislaron los fragmentos de ADN de eritropoyetina de 810 pares de bases. pEC-1 se digirió con BstEII, realizándose a continuación una digestión parcial con BglII, y los extremos 5' de los fragmentos resultantes se defosforilaron con fosfatasa alcalina bacteriana en Tris 10 mM, pH 8, a 60ºC, durante 60 minutos. Se aisló el fragmento del vector de 7 kb, al que le falta el fragmento BstEII-BglII de 810 pb, y se ligó a los fragmentos de eritropoyetina anteriores. Los plásmidos resultantes (designados como pEC-X, donde X es el número del análogo) contienen ADN que codifica los análogos de la eritropoyetina que tienen alterados los residuos de aminoácidos en las posiciones indicadas.

Alternativamente, se construyó un análogo de la eritropoyetina (pEC34) por mutagénesis in vitro, que suprimió los residuos de aminoácidos 41-55. Esto dio como resultado un EPO más pequeño (775 pb) que contiene el fragmento BstEII-BglII. El fragmento se insertó en pEC1 como se describe anteriormente. Para clonar los análogos de la eritropoyetina, se digirió pEC34 con BstEII, se digirió parcialmente con BglII, se defosforiló y se aisló el vector como se describe anteriormente. El fragmento del vector de 7 kb se ligó entonces a los fragmentos de eritropoyetina como se describe anteriormente. La clonación con pEC34 permite una fácil discriminación entre recombinantes y simples productos formados al volverse a cerrar el plásmido ("reclosures"), que conducen a un fragmento BstEII-BglII más pequeño que los análogos, y éstos pueden diferenciarse fácilmente sobre geles de agarosa.

Estos procedimientos generales se utilizaron para construir los análogos de la eritropoyetina que se presentan en las Tablas 3, 4 y 5. Los cambios en la secuencia de ADN para cada uno de los análogos están indicados; por otra parte, los cebadores de oligonucleótidos empleados para la mutagénesis tenían secuencias complementarias de las de la eritropoyetina humana.

TABLA 3 Análogos de la eritropoyetina que tienen sitios para cadenas de carbohidrato unidas a través de N

3

TABLA 3 (continuación)

4

TABLA 3 (continuación)

5

TABLA 3 (continuación)

\vskip1.000000\baselineskip

6

TABLA 4 Análogos de la eritropoyetina que tienen sitios para cadenas de carbohidrato unidas a través de O

7

TABLA 4 (continuación)

8

TABLA 4 (continuación)

9

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Análogos de la eritropoyetina que tienen sitios para cadenas de carbohidrato unidas a través de N y de O

10

Los plásmidos designados como pDEC-X (donde X es el número del análogo) se construyeron insertando cADN de eritropoyetina en pDEC\Delta, que es un derivado del plásmido pDS\alpha2. El vector de expresión pDS\alpha2 está descrito, de modo general, en la Solicitud PCT Nº WO 90/14363. pDEC\Delta se derivó de pDS\alpha2 por las siguientes etapas:

1) El sitio HindIII de pDS\alpha2 se suprimió por digestión de ADN de pDS\alpha2 con HindIII, tratamiento de los extremos cohesivos de HindIII con ADN polimerasa de E. coli (fragmento Klenow) y dNTPs, y nueva ligación del vector de extremos romos. El plásmido resultante fue pDS\alpha2\DeltaH

2) pDS\alpha2\DeltaH se digirió con SalI y se ligó a él un oligonucleótido sintético que tiene una señal de corte y empalme de SV40 con un enlazador SalI ligado al extremo 3' de la señal de corte y empalme. El oligonucleótido sintético tenía la siguiente secuencia (SEQ ID. NO: 18):

11

El plásmido resultante fue pDS\alpha2\DeltaH con la señal de corte y empalme.

3) pDS\alpha2\DeltaH con la señal de corte y empalme se digirió con SalI y se sometió a un tratamiento de sus extremos cohesivos con ADN polimerasa de T4 y DNTPs, con lo que dichos extremos se hacen romos. Un fragmento de cADN de eritropoyetina humana BamHI-BglII, de 820 pb, se trató por el mismo método para hacer romos sus extremos, y se ligó al plásmido. El plásmido resultante fue pDEC-1.

4) pDEC se digirió con KpnI y PvuII y se sometió a un tratamiento de sus extremos cohesivos con nucleasa de frijol Mung, con lo que dichos extremos se hacen romos. El plásmido se volvió a ligar, para suprimir el fragmento cortado KpnI-PvuII, dando como resultado el plásmido pDEC\Delta.

Los plásmidos pDEC-X se prepararon a partir de pDEC\Delta, por digestión completa con BstEII, seguida de una digestión parcial con BglII. Se aisló el fragmento del vector al que faltan las secuencias que codifican la eritropoyetina y se ligó a los fragmentos BstEII-BglII, de 810 pb, que contienen el plásmido deseado.

A continuación se describen los detalles de la construcción de algunos análogos que tienen múltiples cambios de aminoácidos.

Construcción de pDEC(N47) y pDEC(N48)

pDEC(N47) que contiene las mutaciones Asn30 Thr32 Val87 Asn88 y Thr90, se construyó a partir de pDEC(N18) y pDEC(N4). pDEC(N18) se digirió con HindII y BglII, y se aisló un fragmento de 445 pares de bases. pDEC(N4) se digirió con BstEII y HindIII, y se aisló un fragmento de 377 pares de bases. Estos dos fragmentos se ligaron en pDEC\Delta, cortado con BstEII y BglII, como se describe anteriormente, dando como resultado pDEC(N47).

pDEC(N48) que contiene las mutaciones Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 y Thr90, se construyó a partir de pDEC(N14) y pDEC(N11). pDEC(N14) se digirió con HindII y BglII, y se aisló un fragmento de 445 pares de bases. pDEC(N11) se digirió con BstEII y HindII, y se aisló un fragmento de 377 pares de bases. Estos dos fragmentos se ligaron en pDEC\Delta, cortado con BstEII y BglII, como se describe anteriormente, dando como resultado pDEC(N48).

Construcción de pDEC(O62) (Fusión HCG-eritropoyetina)

pDEC(O62) se ensambló a partir de pEC1 y un enlazador de ADN sintético StuI-BglII, de 107 pares de bases, que contiene los 28 aminoácidos carboxi-terminales de la gonadotropina coriónica humana (ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln) (SEQ ID. NO: 25) (Pierce et al., Ann. Rev. Biochem. 50, 465 (1981)). La secuencia del enlazador es como sigue:

12

pEC1 se digirió con StuI y BglII y se aisló el fragmento de ADN de 610 pares de bases. El enlazador sintético se fosforiló con ATP y polinucleótido quinasa y se ligó con el fragmento de pEC1 en pDEC\Delta, previamente digerido con BstEII y parcialmente digerido con BglII, como se describe anteriormente.

Construcción de pDEC(NO1)

pDEC(NO1) se ensambló a partir de pDEC(O62) (HCG-EPO) y pDEC(N14) (Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}). pDEC177 se digirió con StuI y BglII, y el fragmento de ADN de 610 pares de bases, que contiene las mutaciones Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}, se aisló con Gene-Clean®. pDEC(O62) se digirió con StuI y BglII y se aisló el fragmento de 107 pares de bases. Estos dos fragmentos de ADN se ligaron en pDEC\Delta, previamente digerido con BstEII y parcialmente digerido con BglII, como se describe anteriormente.

Construcción de pDEC(NO2)

pDEC(NO2) se ensambló a partir de pDEC(O62) (HCG-EPO) y pDEC(N47) (Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90}). pDEC(N47) se digirió con StuI y BglII, y el fragmento de ADN de 610 pares de bases, que contiene las mutaciones Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90}, se aisló con Gene-Clean®. pDEC(O62) se digirió con StuI y BglII y se aisló el fragmento de 107 pares de bases. Estos dos fragmentos de ADN se ligaron en pDEC\Delta, previamente digerido con BstEII y parcialmente digerido con BglII, como se describe anteriormente.

Construcción de pDEC(N16) (Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162})

pDEC(N16) se ensambló a partir de pDEC(N14) (Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}) y pDEC258 (Ala^{162}). pDEC258 se construyó utilizando los procedimientos para la mutagénesis in vitro descritos anteriormente, y cambiando el codón AGG por GCG en la posición 162. pDEC(N14) se digirió con StuI y BglII, y el fragmento de ADN de 610 pares de bases, que contiene las mutaciones Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}, se aisló con Gene-Clean®. pDEC258 se digirió con StuI y BglII y se aisló un fragmento de 210 pares de bases. Estos dos fragmentos de ADN se ligaron en pDEC\Delta, previamente digerido con BstEII y parcialmente digerido con BglII, como se describe anteriormente.

Construcción de pDEC(R1), (R2) y (R3)

Para eliminar los sitios de glicosilación de pDEC(N14), m13-EPO(N14) que contiene las mutaciones Ser^{87} Asn^{88} y Thr^{90} se sometió a mutagénesis in vitro, como se describe anteriormente, utilizando los siguientes cebadores:

	5' GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG 3'	GLN24
	(SEQ ID. NO: 21)
	5' CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC 3'	GLN38
	(SEQ ID. NO: 22)
	5' CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G 3'	GLN83
	(SEQ ID. NO: 23)

Los plásmidos resultantes se designaron pDEC(R1) (gln^{24} ser^{87} asn^{88} thr^{90}), pDEC(R2) (gln^{38} ser^{87} asn^{88} thr^{90}) y pDEC(R3) (gln^{83} ser^{87} asn^{88} thr^{90}). m13EC-1 se sometió también a mutagénesis in vitro con los citados cebadores de oligonucleótido, dando como resultado pEC10 (gln^{24}) y pEC8 (gln^{38}). pEC9 (gln^{83}) se construyó usando el cebador

	5' CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC 3'	GLN83
	(SEQ ID. NO: 24)

Los clones de cADN de eritropoyetina humana y de los análogos correspondientes a [Asn^{4}, Ser^{6}] EPO, [Asn^{9}, Ser^{11}] EPO, [Asn^{69}] EPO, [Asn^{124}] EPO, [Asn^{125}, Ser^{127}] EPO, [Asn^{163}, Ser^{165}] EPO, [Thr^{125}] EPO y [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO, y los clones de cADN de los análogos descritos en las Tablas 3, 4 y 5, se transfirieron a células COS-1 (ATCC No. CRL-1650) por electroporación. Se recogieron las células COS-l en platos semiconfluentes, se lavaron con un medio esencial modificado de Dulbecco, que contiene suero de ternera fetal al 5% y L-glutamina/penicilina/estreptomicina al 1% (Irvine Scientific) y se volvieron a poner en suspensión, a razón de 4 \times 10^{6} células/ml. Un ml de células se transfirió a una cubeta de electroporación (Bio-Rad) y se sometió a electroporación con un pulsador de genes Bio-Rad, a 25 \muF y 1600 V, en presencia de 100 a 200 \mug de ADN portador y 2 a 20 \mug de ADN de plásmido que codifica el análogo de la eritropoyetina. Las células sometidas a electroporación se dispusieron en placas, a razón de 2 \times 10^{6} células por cada 60 mm de plato de cultivo de tejido, en 5 ml de medio. Dos a cuatro horas después de haberlas dispuesto en las placas, se reemplazó el medio con 5 ml de medio fresco. El medio condicionado se recogió 3 a 5 días después de la electroporación.

Ejemplo 7 Caracterización de los análogos de la eritropoyetina A. Determinación de la adición de carbohidratos

Un volumen de sobrenadante que contiene de 5 a 20 unidades de células COS transfectadas con cADNs de análogos de la eritropoyetina, como se describe en el Ejemplo 6, se sometió a inmunoprecipitación, a lo largo de la noche, a temperatura ambiente, con un anticuerpo policlonal de conejo anti-eritropoyetina. Se añadieron al inmunoprecipitado 20 a 80 \mul de proteína A-sefarosa (1:1), en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron, se lavaron con PBS y, cuando era indicado, el sedimento se trató con N-glicanasa, para eliminar las cadenas de carbohidrato unidas a través de N. Las muestras se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 15%, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis Western, como se describe en Burnette et al., Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981); Elliot et al., Gene 79, 167-180 (1989), usando una mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón anti-eritropoyetina. Uno de estos anticuerpos, 9G8A, está descrito en Elliot et al. (1989) Blood 74, Supl. 1, A. 1228.

El análisis de los sobrenadantes de células COS transfectadas con ADN de [Asn^{69}] EPO y [Asn^{125}, Ser^{127}] EPO, reveló un tamaño de la proteína aumentado, en comparación con la secuencia de la eritropoyetina humana. Este tamaño aumentado es indicativo de una cadena de carbohidrato adicional, unida a través de N (Figura 7). El tratamiento con N-glicanasa de los sobrenadantes de células COS transfectadas con el cADN de [Thr^{125}] EPO y [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO, reveló un tamaño de la proteína aumentado, en comparación con la secuencia de la eritropoyetina humana. Este tamaño aumentado es indicativo de una cadena de carbohidrato adicional, unida a través de O (Figura 8). El análisis por transferencia Western de otros análogos seleccionados, se muestra en la Figura 10.

Para determinar el número de cadenas de carbohidrato unidas a través de N, ligadas a EPO, se realizaron digestiones parciales con N-glicanasa. Los análogos ó rHuEPO se expresaron en células CHO y se recogió el medio condicionado, libre de suero. Los tubos contenían 40 unidades de EPO (volumen ajustado a 15 \mul con H_{2}O). A cada tubo se le añadieron 10 \mul de SDS al 0,5%, y cada muestra se hirvió durante 3 minutos. A continuación, se añadieron los siguientes componentes: 10,8 \mul de NaPO_{4} 0,5 M, pH 8,6, 5 \mul de nonidet P40 al 7,5% y 1,5 \mul de N-glicanasa de 250 unidades/ml (Genzyme). Las muestras se incubaron durante los tiempos indicados, a 37ºC. La reacción se detuvo por la adición de tampón para muestra de SDS-PAGE (véase anteriormente) y a continuación se sometió a análisis Western SDS-PAGE (acrilamida al 10%), usando un anticuerpo policlonal anti-EPO y un estuche Vectastain® anti-conejo (laboratorios Vector), con 4-cloronaftol como sustrato. Un análisis de las cadenas unidas a través de N, realizado conforme a este método, se muestra en la Figura 11, para la eritropoyetina humana y el análogo N14.

B. Ensayos para determinar la actividad de análogos de la eritropoyetina

Se realizaron radioinmunoensayos (RIAs) conforme a Egrie et al., ut supra. Los EIAs (inmunoensayos enzimáticos) se realizaron con el estuche de EIA CLINIGEN® (R and D Systems), usando los procedimientos suministrados por el fabricante. La actividad biológica in vivo de análogos de la eritropoyetina se determinó en sobrenadantes de células CHO que expresan un análogo de la eritropoyetina o en eritropoyetina purificada, obtenida del medio condicionado de células CHO, como se describe a continuación, utilizando el bioensayo de policitemia exhipóxica en ratón (Cotes et al., ut supra).

La actividad de la eritropoyetina in vitro se determinó por el ensayo de formación de colonias eritroides, como se describe en Iscove et al., J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974), con modificaciones. Las células mononucleadas procedentes de células de médula ósea humana, se purificaron parcialmente en un cojín de ficoll y se lavaron en medio Iscove, antes de disponerlas en placas para retirar las células adherentes. El medio de cultivo contenía metil-celulosa al 0,9% y no incluía nada de seroalbúmina bovina. Las colonias eritroides se calificaron al cabo de 8 a 10 días de cultivo.

Los análogos de la eritropoyetina, transfectados y expresados en células COS, como se describe en el Ejemplo 6, se analizaron en sobrenadantes brutos de células COS, utilizando RIA, EIA y un ensayo de formación de colonias eritroides. La secuencia de eritropoyetina humana purificada tiene una actividad in vitro que era comparable a la actividad RIA, tal como se determina por los ensayos antes mencionados. Los análogos [Asn^{69}] EPO, [Thr^{125}] EPO y [Pro^{124}, Thr^{125}] EPO mostraban una actividad in vitro que era comparable a la actividad RIA, haciendo evidente la existencia de cadenas de carbohidrato adicionales (tal como se determina en la Sección A). [Thr^{125}] EPO y los análogos N4, N11, N14, N16, N18, N47, N48, O62, NO1 Y NO2 se analizaron ulteriormente, utilizando un clon de cADN que codifica el análogo de la eritropoyetina para la transfección de células CHO, y sometiendo los sobrenadantes de células CHO a RIA ó EIA, y a ensayos biológicos in vivo. Los resultados se presentan en la Tabla 6. Las actividades in vivo correspondientes a los análogos R1, R2 y R3, expresados en sobrenadantes de células CHO, se presentan en la Tabla 7.

TABLA 6 Análogos de la eritropoyetina que tienen cadenas de carbohidrato adicionales

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13

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Notas de la tabla 6

^{a}El número de cadenas adicionales unidas a través de N se estimó sobre la base de la movilidad de los polipéptidos análogos en geles de SDS, como se describe en el Ejemplo 7A.

^{b}Relación entre la actividad in vivo del análogo y la cantidad de análogo de la eritropoyetina. Las medidas de la actividad se hicieron en sobrenadantes de células CHO de análogos, empleando el bioensayo de policitemia en ratón. Las cantidades de análogos de la eritropoyetina en sobrenadantes de células CHO se determinaron por RIA ó EIA, como se describe en el texto.

^{c}La confirmación del número de cadenas de carbohidrato adicionales se hizo examinando la migración de las glicoproteínas en geles de SDS, después de una digestión parcial con N-glicanasa, como se describe en el Ejemplo 7A.

^{d}La cadena unida a través de O en Ser^{126} está presente en el 70% de las moléculas de eritropoyetina humana.

^{e}Los análogos que tienen O-glicosilación reducida poseen una cadena de carbohidrato en Ser^{126} en menos del 70% de las moléculas.

^{f}Thr^{123} EPO tiene dos cadenas unidas a través de O en más del 60% de las moléculas. Thr^{125} EPO tiene dos cadenas unidas a través de O en aproximadamente el 40% de las moléculas. Pro^{124}Thr^{125} EPO tiene dos cadenas unidas a través de O en más del 80% de las moléculas.

^{g}Estos análogos tienen, al menos, tres cadenas unidas a través de O y pueden tener cuatro o cinco. Es sabido que HCG sola tiene cuatro cadenas unidas a través de O.

n.t. significa "no ensayado".

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TABLA 7 Actividad de eritropoyetina humana y análogos que tienen readaptaciones de los sitios de carbohidratos

14

La relación entre la actividad in vivo y RIA ó EIA se determinó como se describe en la nota a de la Tabla 6.

C. Preparación de mezclas de isoformas derivadas de análogos de la eritropoyetina

[Thr^{125}] EPO (EPO O50)

El análogo de la eritropoyetina [Thr^{125}] EPO se construyó como se describe en la Sección A del Ejemplo 6. Se aisló un fragmento de cADN de eritropoyetina de 810 pares de bases, que lleva la mutación [Thr^{125}], escindiendo el plásmido pEC, que contiene la mutación [Thr^{125}], con BstEII y BglII, y ligando el fragmento a pDEC\Delta [un derivado de pDS\alpha2] (descrito en el Ejemplo 6).

El plásmido pDEC\Delta que contiene cADN de [Thr^{125}] eritropoyetina se utilizó para la transfección de células CHO deficientes en DHFR. Se concentró un volumen de 770 ml de medio condicionado de células CHO, utilizando una membrana con un límite de separación de 10.000 D de peso molecular, y se diafiltró frente a Tris-HCl 10 mM, pH 8,6, a un volumen final de 34 ml. Una porción de 17 ml del concentrado se cargó en una columna de sefarosa Q de flujo rápido (de 5 ml de volumen de lecho), equilibrada en el mismo tampón y eluida en un gradiente lineal de NaCl 0 a 250 mM, en Tris-HCl 10 mM, pH 8,6. Porciones de las fracciones de columna, no tratadas o digeridas con N-glicanasa, se analizaron por SDS-PAGE ó IEF y se prepararon combinados (designados como 2, 3 y 4), basados en la composición de isoformas y/o carbohidrato de las fracciones. Cada combinado se cargó en una columna Vydac C4 (214TPB 2030; 1 cm de diámetro; 1,8 a 2,5 ml de volumen de lecho; 0,34 ml/min) y se lavó con dos volúmenes de columna de etanol al 20% en Tris-HCl 10 mM, pH 7,0. Las columnas se eluyeron con gradientes lineales de etanol al 20-94%, Tris-HCl 10 mM, pH 7,0. Se prepararon los combinados, se diluyeron en Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, y se cargaron en columnas de sefarosa Q de flujo rápido. Después de un lavado en Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, las muestras se eluyeron con citrato de sodio 20 mM y NaCl 250 mM, pH 7,0. Los combinados de [Thr^{125}] purificado se analizaron por IEF y se muestran en la Fig. 9. Estos combinados se analizaron también para determinar su actividad biológica in vivo como se describe anteriormente (Cotes et al., ut supra) y los resultados se presentan en la Tabla 8.

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO (EPO N14)

Prep. 1

El análogo EPO N14 se purificó utilizando un procedimiento en tres etapas que consta de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa y cromatografía de penetrabilidad en gel. Durante la etapa de intercambio iónico, las fracciones se reunieron para dar una mezcla de isoformas que tienen altos niveles de ácido siálico. Durante la fase de cromatografía de fase inversa, se prepararon dos combinados adicionales, que contienen el análogo con o sin agregado. Los detalles de la purificación se presentan a continuación.

1. Se recolectó un medio condicionado de células CHO que expresan el análogo EPO N14 y se concentró aproximadamente 2,5 veces, usando un agitador celular con membrana YM10 (Amicon), y se diafiltró frente a Tris 10 mM, pH 8,5.

2. El medio concentrado se cargó, a razón de \sim12 A_{280}/ml de resina, en una columna de sefarosa Q de flujo rápido (Pharmacia), equilibrada en Tris 10 mM, pH 8,5, a una velocidad de flujo de 0,2 cm/min.

3. Después de la carga, la columna se lavó con tres volúmenes de columna (CV) de Tris 10 mM, pH 8,5, y se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 a 0,5 M y Tris 10 mM, pH 8,5, en 50 volúmenes de columna. Se recogieron fracciones de 1 volumen de columna.

4. Una muestra de cada fracción se aplicó a un gel de IEF, pH 3-5. Sobre la base de la distribución de isoformas, tal como se determina por IEF, se preparó un combinado de fracciones, que contiene en su mayor parte las isoformas 11 a 18. Se añadió EDTA al combinado, a una concentración final de 1 mM.

5. El combinado de isoformas se cargó, a razón de \sim5 A_{280}/ml de resina, en una columna C4 de fase inversa (Vydac), equilibrada en etanol al 20%/Tris 10 mM, pH 7,0, a una velocidad de flujo de 2,5 cm/min. La columna se lavó con 1 volumen de columna de etanol al 20%/Tris 10 mM, pH 7,0, y se eluyó con un gradiente de etanol al 20-94%/Tris 10 mM, pH 7,0, en 30 volúmenes de columna, a una velocidad de flujo de 1 cm/min. Se recogieron fracciones de 0,2 volúmenes de columna.

6. Una muestra de cada fracción se analizó por PAGE con SDS al 12% no reductor. Se prepararon dos combinados separados, basados en la presencia del agregado observado en los geles con SDS. El combinado #1 contenía el análogo EPO pero no el agregado. El combinado #2 contenía ambos, el análogo EPO y el agregado.

7. El combinado #1 se concentró aproximadamente 65 veces, y el combinado #2 aproximadamente 250 veces, utilizando Centricon 10 (Amicon). Cada combinado se sometió a intercambio de tampón a citrato de sodio 20 mM/NaCl 100 mM, pH 7,0.

8. Cada combinado se purificó individualmente en una columna de HPLC BioSil SEC-250 (Bio-Rad), equilibrada en citrato de sodio 20 mM/NaCl 100 mM, pH 7,0. Los combinados se cargaron a razón de menos de 6 A_{280}/ml de resina, a una velocidad de flujo de 2,26 cm/min. En cada experimento, se recogieron los picos correspondientes a análogos monoméricos.

9. Se midió la absorbancia de cada combinado, y una porción de cada combinado se concentró para su análisis por SDS-PAGE y en geles de IEF. El combinado #1 tenía una distribución de las isoformas 15 a 17 y se utilizó para estudios de farmacocinética y de fijación al receptor.

Prep. 2

El análogo EPO N14 se purificó utilizando un procedimiento en tres etapas que consta de cromatografía de intercambio iónico, HPLC de fase inversa y cromatografía con hidroxiapatito. Durante la etapa de intercambio iónico, el análogo se dividió en tres combinados, que contienen diferentes mezclas de isoformas. Los detalles de la purificación se presentan a continuación.

1. Se recolectaron los sobrenadantes de células CHO que expresan el análogo EPO N14 y se concentraron aproximadamente 10 veces, usando un dispositivo de flujo tangencial Filtron Mini-Ultrasette, y se diafiltraron frente a Tris 10 mM, pH 8,5.

2. El medio concentrado se cargó, a razón de \sim10 A_{280}/ml de resina, en una columna de sefarosa Q de flujo rápido (Pharmacia), equilibrada en Tris 10 mM, pH 8,5, a una velocidad de flujo de 0,2 cm/min.

3. Después de la carga, la columna se lavó con tres volúmenes de columna (CV) de Tris 10 mM, pH 8,5, y se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 a 0,5 M y Tris 10 mM, pH 8,5, en 50 volúmenes de columna. Se recogieron fracciones de 1 volumen de columna.

4. Una muestra de cada fracción se aplicó a un gel de IEF, pH 3-5. Sobre la base de la distribución de isoformas, tal como se determina por IEF, se prepararon tres combinados de fracciones separados. Se hizo un combinado de isoformas bajo (isoformas 4 a 12), un combinado de isoformas medio (isoformas 5 a 15) y un combinado de isoformas alto isoformas 6 a 18).

5. Cada combinado de isoformas se purificó individualmente en una columna de HPLC de fase inversa Vydac C4. La columna se desarrolló con un gradiente de TFA al 0,1%/H_{2}O a TFA al 0,1%/acetonitrilo al 75%, a una velocidad de 1% de aumento del acetonitrilo por minuto.

6. El pico del análogo correspondiente a cada combinado se recogió y diluyó con 4 volúmenes de Tris-HCl 80 mM/base Tris 20 mM, a continuación se concentró y se sometió a intercambio de tampón a Tris 10 mM, pH 7,2, usando Centricon 3 resistente al disolvente.

7. Cada muestra se diluyó a 2 A_{280}/ml en Tris 10 mM, pH 7,2, y se le añadió un volumen igual de guanidina HCl (GuHCl) 4 M, CHAPS 10 mM, Tris 10 mM, pH 7,2, para una concentración final de la muestra de 1 A_{280}/ml. Cada muestra se cargó en una minicolumna de hidroxiapatito, equilibrada con GuHCl 2 M, CHAPS 5 mM, Tris 10 mM, pH 7,2. La columna se lavó con tampón de equilibrado y se recogieron fracciones de 1 volumen de columna de los líquidos que fluyen a través de ella.

8. Se midió la absorbancia de las fracciones y se prepararon combinados, sometiéndolos a intercambio de tampón a Tris 10 mM, pH 7,2, empleando Centricon 10. Se midió la absorbancia de cada combinado.

Los combinados finales se analizaron por SDS-PAGE y con geles de IEF. Los geles de IEF se muestran en la Figura 12. Los ensayos de actividad RIA e in vivo se realizaron como se describe en el Ejemplo 7A. La actividad in vivo de los combinados de isoformas finales se presenta en la Tabla 8. El combinado de isoformas de alto contenido de ácido siálico se utilizó en experimentos destinados a determinar el aumento del hematocrito de ratones.

TABLA 8 Actividad de isoformas de análogos de la eritropoyetina

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm}  ^{a} Los mg de péptido de
eritropoyetina se calcularon a partir de A _{280}  de los combinados
de isoformas de Ser ^{87} Asn ^{88} Thr ^{90}  EPO, usando un
coeficiente de extinción de 0,93 para una solución de 1
mg/ml.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{150mm}  ^{b} No
se dan las desviaciones estándar correspondientes a los combinados
de isoformas de Thr ^{125}  EPO, porque los ensayos de actividad se
hicieron una o dos
veces.\end{minipage} \cr}

Ejemplo 8 Propiedades biológicas del análogo EPO N14

Las actividades de los combinados de isoformas del análogo EPO N14, eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) e isoforma 14 de rHuEPO aislada, se compararon en ensayos farmacocinéticos i.v., ensayos de fijación al receptor y estudios de hematocritos. Los combinados de isoformas de EPO N14 se prepararon como se describe en el Ejemplo 7C. rHuEPO se preparó conforme a Lai et al., ut supra. La isoforma 14 de rHuEPO se purificó como sigue: rHuEPO que consta de una mezcla de las isoformas 10, 11, 12, 13, 14 y 15, se cargó en una columna de sefarosa Q de flujo rápido (dimensiones: 2,2 cm de diámetro \times 3,4 cm de altura), equilibrada en Tris 10 mM, pH 7,2. La columna cargada se equilibró a ácido acético 2 mM/urea 6 M (tampón "A"), aplicándose luego un gradiente multifásico diseñado para optimizar la purificación de las isoformas 13 y 14. El gradiente fue: ácido acético 800 mM al 0% a 7,3%/urea 6 M (tampón "B") en 750 ml, tampón "B" al 7,3% a 11,4% en 750 ml, tampón "B" al 11,4% a 26,8% en 1250 ml, tampón "B" al 26,8% a 62,4% en 1250 ml, y luego tampón "B" al 62,4% a 100% en 700 ml. Se recogieron fracciones de 12,5 ml, se neutralizaron con hidróxido amónico y se ensayaron seguidamente por enfoque isoeléctrico en geles de poliacrilamida. Las fracciones que contienen la isoforma 14 pura se combinaron, se concentraron con un agitador celular Amicon, equipado con una membrana YM-10, y a continuación se sometieron a intercambio de tampón a agua.

A. Farmacocinética I.V

Se realizaron dos estudios separados para comparar los parámetros farmacocinéticos del análogo EPO N14 (isoformas 15 a 17) y de la isoforma 14 aislada, con rHuEPO.

En cada estudio, 1 \muCi de la isoforma 14 aislada (marcada con ^{125}I), o del análogo EPO N14 (marcado con ^{125}I), o de eritropoyetina humana recombinante (marcada con ^{125}I) (Amersham), se inyectó por vía intravenosa, en una cánula carótida, a ratas macho Sprague-Dawley, que pesan entre 310 y 378 g. A diversos tiempos después de la administración, se recogió 0,3 ml de sangre y se preparó suero por centrifugación. Se determinó seguidamente la concentración de ^{125}I-EPO (sea la recombinante humana, la isoforma 14 aislada o el análogo EPO N14) en 0,1 ml de cada muestra de suero, después de una incubación a lo largo de la noche, a 4ºC, con etanol al 90%. La ^{125}I-EPO de cada muestra de suero, precipitada en etanol, se sometió a contaje en un contador gamma, y las curvas farmacocinéticas resultantes se muestran en la Figura 13. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron, para cada rata, usando el análisis de regresión no lineal PCNONLIN 4.0 (Statistical Consultants, 1992), y se promediaron los resultados para cada grupo. Los resultados de los estudios farmacocinéticos del análogo EPO N14 y de la isoforma 14 aislada, se resumen en la Tabla 9.

Como se ve en la Tabla 9, hay una diferencia significativa en la desaparición del análogo EPO N14 en el suero, cuando se compara con la calculada para la eritropoyetina humana recombinante. La eritropoyetina humana recombinante presentó la semivida beta más rápida de 3,10 h, en comparación con las 3,97 h para la isoforma 14 aislada y las 4,36 h para el análogo EPO N14. El grupo de la eritropoyetina humana recombinante también tenía la semivida de desaparición más rápida de 1,78 h, comparada con las 2,40 h para la isoforma 14 aislada y las 3,03 h para el análogo EPO N14.

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(Tabla pasa a página siguiente)

16

B. Ensayos de fijación al receptor

La interacción del análogo EPO N14 (isoformas 15 a 17) con el receptor de eritropoyetina se estudió mediante un ensayo de desplazamiento en frío, usando células OCIM1 de eritroleucemia humana (Papayannopoulou et al. Blood 64 (supl. 1), 116a (1984)). Concentraciones crecientes de EPO N14 no marcado se incubaron con células OCIM1, junto con una concentración constante de ^{125}I-rHuEPO, para determinar la cantidad de EPO N14 requerida para competir con ^{125}I-rHuEPO en la fijación al receptor. A modo de comparación, se hicieron también competir concentraciones crecientes de rHuEPO no marcado con una concentración constante de ^{125}I-rHuEPO.

El EPO N14 no marcado se diluyó en el tampón del ensayo y se añadió en cantidades de 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng y 30,0 ng (referidas a masa de péptido). Se añadió 0,5 ng de ^{125}I-EPO recombinante humana a todos los tubos de ensayo, seguido de la adición de aproximadamente 0,5\times10^{6} células OCIM1. Los tubos de ensayo se incubaron seguidamente a 37ºC, en un baño de agua con agitación, durante 2 horas. Después de la incubación, las soluciones se centrifugaron a través de una solución oleosa de ftalato/bi-ftalato de dibutilo, para separar la ^{125}I-rHuEPO no unida de la ^{125}I-rHuEPO unida a las células OCIM1. Se aislaron los sedimentos celulares, y la cantidad de ^{125}I-rHuEPO unida a las células se determinó por contaje gamma. Se determinaron las cuentas unidas específicamente a las células, y la concentración de proteína no marcada requerida para competir al 50% de la fijación de ^{125}I-rHuEPO en ausencia de competidor se determinó por análisis de regresión lineal.

Los resultados de tres ensayos indicaron que se requería una media de 2,67\pm0,73 ng del péptido EPO N14 no marcado, para reducir al 50% la unión de ^{125}I-rHuEPO a las células OCIM1. En los tres mismos ensayos, se requería una media de 0,51\pm0,15 ng de rHuEPO no marcada para competir con la unión de 0,5 ng de ^{125}I-rHuEPO. Sobre la base de estos resultados, se requería un exceso de EPO N14 de 5,25 veces para competir en la unión de ^{125}I-rHuEPO al receptor de EPO, en comparación con la rHuEPO no marcada (p<0,01).

Se realizó un experimento adicional para hacer una comparación directa entre el análogo EPO N14, la isoforma 14 aislada y la eritropoyetina recombinante, para su fijación al receptor de eritropoyetina. Los resultados de este experimento indican que el análogo EPO N14 tenía una afinidad más baja para el receptor que la isoforma 14 aislada. Se requería un exceso del análogo EPO N14 de aproximadamente 2 veces para competir en la unión de ^{125}I-rHuEPO al receptor, en comparación con la isoforma 14 no marcada (Figura 14).

C. Estudio de hematocritos

Se realizó un estudio in vivo para comparar la capacidad de los combinados de isoformas de EPO N14 alto y bajo (de la prep. 2 descrita en el Ejemplo 7C), la isoforma 14 aislada y la EPO humana recombinante, para aumentar el hematocrito de ratones tratados. La distribución de isoformas de los combinados de isoformas de EPO N14 alto y bajo, utilizados en este estudio, se muestra en la Figura 12.

Ratones CD1 (de aproximadamente 30 g) se inyectaron por vía intraperitoneal, tres veces por semana durante un total de seis semanas, con una de las preparaciones citadas, preparada en seroalbúmina de ratón al 0,25%, o con placebo (PBS con seroalbúmina de ratón al 0,25%). La dosificación de las preparaciones de eritropoyetina se refirió a la masa del péptido, de modo que un ratón de 30 g recibía 0,071 \mug de péptido/dosis, para el combinado alto de EPO N14, el combinado bajo de EPO N14, la isoforma 14 y el estándar de rHuEPO. Se incluyó un grupo de dosificación adicional de 0,036 \mug de péptido/dosis, para el combinado alto de EPO N14 y la isoforma 14. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron en la línea de base y posteriormente dos veces por semana, por sangrías retro-orbitales. A la conclusión del experimento, se recogió suero de todos los animales y se ensayó para la detección de los anticuerpos frente al producto inyectado. Los datos de los animales que se consideraron negativos en anticuerpos neutralizantes, se utilizaron para análisis posteriores.

Como se muestra en la Figura 15, los animales tratados con el combinado alto de isoformas de EPO N14 consiguieron los hematocritos más altos, como media del grupo, en comparación con las otras preparaciones. La isoforma 14, la EPO recombinante humana y el combinado bajo de isoformas de EPO N14 aumentaron el hematocrito en menor extensión.

A fin de comparar las diferentes preparaciones de eritropoyetina de una forma más cuantitativa, se calcularon la tasa inicial media de aumento del hematocrito (0-11 días), el área bajo la curva (0-39 días) y el aumento total del hematocrito (Tabla 10). Por cualquiera de estos criterios, el combinado alto de isoformas de EPO N14 resulta ser más activo, referido a una masa de péptido, que cualquier otra de las preparaciones ensayadas. Tanto el combinado alto de isoformas de EPO N14, como la isoforma 14, eran más activos que la EPO recombinante humana. El combinado bajo de isoformas de EPO N14 tenía la actividad más baja, cualquiera que fuera el análisis utilizado para la comparación.

17

Aunque la invención se ha descrito en lo que se consideran sus realizaciones preferidas, no ha de limitarse a las realizaciones descritas, sino que, por el contrario, pretende cubrir diversas modificaciones y equivalentes, incluidas dentro del espíritu y el alcance de las reivindicaciones anexas, a cuyo alcance hay que otorgarle la interpretación más amplia, de modo que abarque tales modificaciones y equivalentes en su totalidad.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Amgen Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Análogos de la eritropoyetina

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TITULAR: Amgen Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Amgen Center, 1840 DeHavillan Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Thousand Oaks

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 91320-1789

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEÍBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 184 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC

\hfill

23

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser}

\sac{Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 193 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

18

Claims (14)

1. Un análogo de la eritropoyetina humana que tiene, al menos, un sitio adicional para N-glicosilación en un residuo de asparagina en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 30, 51, 57, 88, 89, 136 y 138, y en el que al menos una cadena de carbohidrato adicional, unida a través de N, está ligada en una cualquiera de dichas posiciones de aminoácidos.

2. El análogo de la reivindicación 1, que es el producto de la expresión de una secuencia exógena de ADN.

3. Un análogo de la eritropoyetina humana que es:

Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO.

4. Un análogo de la eritropoyetina humana, seleccionado del grupo que consta de:

Asn^{30}Thr^{32} EPO;

Asn^{51}Thr^{53} EPO;

Asn^{57}Thr^{59} EPO;

Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO;

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO;

Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90} EPO;

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92} EPO;

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162} EPO;

Asn^{69}Thr^{7l}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO;

Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91} EPO;

Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91} EPO;

Asn^{136}Thr^{138} EPO; y

Asn^{138}Thr^{140} EPO.

5. Un análogo de la eritropoyetina humana que comprende una prolongación de uno o más aminoácidos desde el extremo carboxi-terminal de la eritropoyetina, en el que la prolongación incluye, al menos, un sitio de glicosilación.

6. El análogo de la reivindicación 5, en el que la prolongación comprende un fragmento de péptido derivado del extremo carboxi-terminal de la gonadotropina coriónica humana.

7. El análogo de la reivindicación 6, seleccionado del grupo que consta de:

(a)

eritropoyetina humana que tiene la secuencia de aminoácidos Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln, que se extiende desde el extremo carboxi-terminal;

(b)

el análogo de (a) que comprende, además, Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO; y

(c)

el análogo de (a) que comprende, además, Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO.

8. Un análogo de la eritropoyetina humana que comprende una supresión de uno o más sitios de glicosilación en la eritropoyetina humana y una adición de un número igual de sitios de glicosilación que no se encuentran en la naturaleza, por medio de lo cual se cambian las posiciones de las cadenas de carbohidratos.

9. El análogo de la reivindicación 8, en el que el sitio de glicosilación que no se encuentra en la naturaleza es un sitio de carbohidrato unido a través de N, en la posición del aminoácido 88 de la eritropoyetina humana.

10. El análogo de la reivindicación 9, seleccionado del grupo que consta de:

Gln^{24}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO;

Gln^{38}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO; y

Gln^{83}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO.

11. Un análogo de la eritropoyetina humana que tiene un sitio adicional para O-glicosilación en la posición del aminoácido 123 y en el que una cadena de carbohidrato adicional unida a través de O está ligada en dicha posición de aminoácido.

12. Una secuencia de ADN que codifica un análogo de la eritropoyetina humana conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Una célula hospedante eucariótica transfectada con una secuencia de ADN conforme a la reivindicación 12, en una forma que permite que la célula hospedante exprese un análogo de la eritropoyetina humana.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo de la eritropoyetina conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, junto con un diluyente, coadyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.