JP2938572B2

JP2938572B2 - エリトロポエチン類似体

Info

Publication number: JP2938572B2
Application number: JP7507153A
Authority: JP
Inventors: エリオツト，ステイーブン・ジー; ビルン，トーマス・イー
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 1999-08-23
Anticipated expiration: 2014-08-23
Also published as: SK50295A3; ATE155796T1; NO951445L; FI117136B; HU220334B; UA49793C2; CN1105030A; SI0640619T2; DK0640619T3; CA2147124C; DE10199059I1; FI951792A; FI951792A0; DE69404401T3; CZ291229B6; WO1995005465A1; DK0640619T4; NO323104B1; AU677097B2; AU7632794A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は1992年９月８日出願の米国特許出願第70/94
2,126号の一部継続出願である。本発明は、少なくとも
１つのグリコシレーション部位の付加または少なくとも
１つのグリコシレーション部位の転移を有するエリトロ
ポエチン類似体に関する。本発明はまた、該エリトロポ
エチン類似体をコードするDNA配列、並びに、類似体発
現用組換えプラスミド及び宿主細胞に関する。

発明の背景エリトロポエチン（EPO）は、赤血球系前駆細胞から
赤血球への成熟に関与する糖タンパク質ホルモンであ
る。エリトロポエチンは、血流中の赤血球のレベル調節
に必須である。天然産生エリトロポエチンは、胎内期の
肝臓及び成人の腎臓によって産生され、血液中を循環
し、骨髄で赤血球の産生を刺激する。貧血の原因はほと
んど例外なく腎不全であり、腎臓からのエリトロポエチ
ンの産生が低下する。エリトロポエチンをコードする遺
伝子で形質転換した宿主細胞にタンパク質産物を発現さ
せる遺伝子工学技術によって産生された組換えエリトロ
ポエチンが、慢性腎不全を原因とする貧血の治療に使用
されたときに有効であることが知見されている。

通常はヒト尿中に低レベルのエリトロポエチンが存在
しているが、再生不能性貧血患者では高レベルの尿エリ
トロポエチンが検出される。Miyakeら、J.Biol.Chem.,2
52,5558（1977）は、ヒト尿エリトロポエチンを精製す
るために再生不能性患者の尿を出発物質として使用し
た。しかしながら今日まで、尿エリトロポエチンが治療
的に有効であると照明されたことはない。

エリトロポエチンをコードする遺伝子の同定、クロー
ニング及び発現は、Linの米国特許第4,703,008号に記載
されている。該特許の記載内容は本明細書に含まれるも
のとする。Laiらの米国特許第4,667,016号は、細胞培地
から組換えエリトロポエチンを精製する方法に関する記
載を含んでいる。組換えプラスミド上のエリトロポエチ
ン遺伝子を含む哺乳類宿主細胞に生物活性組換えエリト
ロポエチンを発現させこれを回収することによって、治
療用途に適した量のエリトロポエチンが初めて入手可能
になった。更に、遺伝子配列が解明され、精製タンパク
質をより多量に入手することが可能になったので、この
タンパク質の作用機序もいっそうよく判ってきた。

真核細胞によって産生される多くの細胞表面タンパク
質及び分泌タンパク質は１つまたはそれ以上のオリゴ糖
基によって修飾される。グリコシレーションと呼ばれる
この修飾は、タンパク質の物性に著明な影響を与え、ま
た、タンパク質の安定、分泌に重要であり、タンパク質
の細胞内局在（subcellular localization）にも重要で
ある。適正なグリコシレーションは生物活性に不可欠で
ある。実際、真核生物のある種の遺伝子は、細胞性タン
パク質グリコシレーションプロセスをもたない細菌（例
えば大腸菌）中で発現されたとき、タンパク質を産生す
るが、このタンパク質は、グリコシレーション欠如が原
因で活性を殆どまたは全く有することなく回収される。

グリコシレーションは、ポリペプチド主鎖に沿った特
定位置に生じ、通常は２つの型、即ちＯ−結合及びＮ−
結合に分類される。配列Asn−Ｘ−Ser/Thr（式中、Ｘは
プロリン以外の任意のアミノ酸を示し得る）の一部を形
成するとき、Ｏ−結合オリゴ糖はセリンまたはトレオニ
ン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラギン残基
に結合する。Ｎ−結合オリゴ糖とＯ−結合オリゴ糖との
構造並びに各結合中で観察される糖残基は異なってい
る。双方に共通に観察される１種類の糖はＮ−アセチル
ノイラミン酸（本文中では以後シアル酸と呼ぶ）であ
る。シアル酸は通常は、Ｎ−結合オリゴ糖及びＯ−結合
オリゴ糖の双方の末端残基であり、負電荷を有すること
によって糖タンパク質に酸性を与え得る。

ヒト尿由来エリトロポエチン及びヒトエリトロポエチ
ンのアミノ酸配列１−165を有する組換えエリトロポエ
チン（哺乳類細胞中で発現）の双方は、３つのＮ−結合
オリゴ糖鎖と１つのＯ−結合オリゴ糖鎖とを含んでお
り、これらの鎖は合計で糖タンパク質の総分子量の約40
％を構成している。Ｎ−結合糖タンパク質は、24、38及
び83位のアスパラギン残基に生じ、Ｏ−結合糖タンパク
質は126位のセリン残基に生じる（Laiら、J.Biol.Chem.
261,3116（1986）;Broudyら、Arch.Biochem.Biophys.26
5,329（1988））。オリゴ糖鎖は、末端シアル酸残基に
よって修飾されることが判明した。シアル酸残基を完全
に除去するためにグリコシル化エリトロポエチンを酵素
処理すると、in vivo活性は低下するがin vitro活性は
影響を受けない（Lowyら、Nature 185,102（1960）;Gol
dwasserら、J.Biol.Chem.249,4202（1974））。この挙
動は、肝臓のアシアログリコプロテイン結合タンパク質
との相互作用によってアシアロエリトロポエチンが血流
から速やかに除去されるためであると説明されている
（Morrellら、J.Biol.Chem.243,155（1968）;Briggs
ら、Am.J.Physiol.227,1385（1974）;Ashlellら、Metho
ds Enzymol.50,287（1978））。従って、エリトロポエ
チンは、肝臓の結合タンパク質との結合を阻害するよう
にシアル化されたときにのみin vivo生物活性を有して
いる。

エリトロポエチンのオリゴ糖鎖中のその他の成分の役
割は十分に解明されていない。部分的に脱グリコシル化
されたエリトロポエチンはグリコシル化形態に比較する
とin vivo活性が顕著に低下しているがin vitro活性を
維持していることが判明した（Dordalら、、Endocrinol
ogy116,2293（1985）;Lin特許、前出）。しかしながら
別の研究によれば、グリコシレーション部位であるアス
パラギンまたはセリン残基の突然変異誘発によってＮ−
結合オリゴ遠鎖またはＯ−結合オリゴ糖鎖を単独でまた
は一緒に除去すると、哺乳類細胞中で産生された変異エ
リトロポエチンのin vitro活性が急激に低下する（Dube
ら、J.Biol.Coem.263,17516（1988）。

エリトロポエチンのような糖タンパク質は、等電点電
気泳動（IFF）のような技術を用いて種々の荷電形態に
分離され得る。いくつかの研究グループは、粗エリトロ
ポエチン調製物及び部分精製エリトロポエチン調製物の
IEF試験を報告している（Lukowskyら、J.Biochemm50,90
9（1972）;Sheltonら、Biochem.Med.12,45（1975）;Fuh
rら、Biochem.Biophys.Res.Comm.98,930（1981））。こ
れらの研究では、IEFによって識別されたエリトロポエ
チン活性分画はせいぜい３つか４つであり、どの分画も
炭水化物含量に関する特性は決定されなかった。更に、
分画の等電点とそれらの生物活性との相関関係も全く解
明されなかった。

Miyakeら、前出、に記載されたヒト尿由来の尿エリト
ロポエチンの精製中に、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーから得られた２つのエリトロポエチン分
画、即ち分画II及び分画III Aが同様の比活性を有する
ことが報告された。分画II及び分画III Aに関するその
後の炭水化物分析では、分画IIが分画III Aよりも大き
い平均シアル酸含量を有することが判明した（Dordal
ら、前出）。

本発明の１つの目的は、所定のシアル酸含量及び生物
活性を有するエリトロポエチンの分離及び単離されたイ
ソ形（isoform）を提供することである。かかる分子を
含有する医薬組成物は治療的にも有益であろう。

発明の概要本発明は、少なくとも１つの付加的グリコシレーショ
ン部位を含むアミノ酸配列から成るヒトエリトロポエチ
ン類似体に関する。該類似体は、グリコシレーション部
位が付加された結果として、ヒトエリトロポエチンより
も多数の炭水化物鎖を有し高いシアル酸含量を有してい
る。本発明はまた、少なくとも１つのグリコシレーショ
ン部位の転移を含むアミノ酸配列から成るエリトロポエ
チン類似体を提供する。また、エリトロポエチンのカル
ボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸から成る付
加部を有しこの付加部が少なくとも１つのグリコシレー
ション部位を提供するような類似体も本発明に包含され
る。本発明は更に、かかるエリトロポエチン類似体をコ
ードするDNA配列、並びに、類似体を発現させる組換え
プラスミド及び宿主細胞を包含する。

図面の簡単な説明図１は、個々の組換えエリトロポエチンイソ形の分析
用等電点電気泳動ゲルを示す。ゲルレーン１〜11は、レ
ーン１の低酸性（高pI）からレーン11の高酸性（低pI）
までのイソ形を示す。また、イソ形９〜14の混合物を含
む精製組換えエリトロポエチンをゲルの左端及び右端の
レーンに示す。

図２は、各エリトロポエチンイソ形のシアル酸の数と
各イソ形のin vivo比活性との関係を、エリトロポエチ
ンポリペプチド1mgあたりの単位（units）で示す。図2A
では、各エリトロポエチンイソ形の濃度を、Bradfordタ
ンパク質アッセイによって測定した。図2Bでは、濃度を
280nmの吸光度によって測定し、図2Cでは、濃度をRIAに
よって測定した。

図３は、種々の条件下のアニオン交換クロマトグラフ
ィーによって調製した組換えエリトロポエチンイソ形の
所定の混合物の分析用等電点電気泳動ゲルを示す。ゲル
レーン１〜６の各々は、150mMの酢酸,ph4.7、150mMの酢
酸（非緩衝）、200mMの酢酸,pH4.7、250mMの酢酸,pH4.
7、300mMの酢酸,pH4.7または300mMの酢酸（非緩衝）を
夫々用いてＱ−セファロース高速流カラムを洗浄した後
の高塩洗浄液中に溶出したエリトロポエチンイソ形を示
す。また、Laiら、前出、の実施例２に記載の手順を修
正し、DEAE−アガロースクロマトグラフィーに代えてＱ
−セファロースクロマトグラフィーを用いて得られたイ
ソ形混合物を含む精製組換えエリトロポエチンをゲルの
左端レーンに示す。

図４は、Ｑ−セファロースのカラムに使用した細胞馴
化培地に、漸減pH及び漸増イオン強度の勾配を与えるこ
とによって得られらエリトロポエチンイソ形８〜12の分
離を示す。分画２から分画40までの偶数番号の分画のア
リコートを分析用等電点電気泳動に掛けた。また、Lai
ら、前出、の実施例２に記載の手順を修正し、DEAE−ア
ガロースクロマトグラフィーに代えてＱ−セファロース
クロマトグラフィーを用いて得られたイソ形混合物を含
む精製組換えエリトロポエチンをゲルの左端レーンに示
す。

図５は、ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列を示
す。□はＮ−結合炭水化物鎖が結合したアスパラギン残
基を示し、＊は、Ｏ−結合炭水化物鎖で修飾されたセリ
ン残基を示す。

図6A、6B及び6Cは、ヒトエリトロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミドの作製に使用された一連のク
ローニング段階を示す。これらの類似体は図５に示すよ
うな付加的グリコシレーション部位を与えるアミノ酸変
異を有している。

図７は、ヒト配列エリトロポエチン及び図示のエリト
ロポエチン類似体のCOS細胞上清のウェスタンブロット
分析を示す。類似体［Asn⁹,Ser¹¹］EPO、［Asn⁶⁹］EP
O、［Asn¹²⁵,Ser¹²⁷］EPO及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPOを
実施例６に記載の手順で構成する。比較のために、付加
的炭水化物鎖を含まない追加の類似体［Pro¹²⁵,Th
r¹²⁷］EPO及び［Asn¹²⁶,Ser¹²⁸］EPOを示している。

図８は、Ｎ−グリカナーゼ処理後のヒト配列エリトロ
ポエチン及び図示のエリトロポエチン類似体のCOS細胞
上清のウェスタンブロット分析を示す。類似体［Th
r¹²⁵］EPO及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPOを実施例６に記載
の手順で構築した。比較のために、類似体［Val¹²⁶］EP
O、［Pro¹²⁴］EPO、［Pro¹²⁵］EPO、［Thr¹²⁷］EPO、
［Pro¹²⁵,Ser¹²⁷］EPO及び［Thr¹²⁵,Ser¹²⁷］EPOを示し
ている。

図９は、［Thr¹²⁵］突然変異を含むエリトロポエチン
cDNAでトランスフェクトしたCHO細胞の増殖を支持した
細胞培地のＱ−セファロース及びC4逆相クロマトグラフ
ィーによって得られたプール２、３及び４の等電点電気
泳動ゲルを示す。更に、Laiら、前出、の実施例２に記
載の手順を修正し、DEAE−アガロースクロマトグラフィ
ーに代えてＱ−セファロースクロマトグラフィーを用い
て得られたイソ形の混合物を含む精製組換えエリトロポ
エチンをゲルの左端及び右端のレーンに示す。

図10は、組換えヒトエリトロポエチン（rHuEPO）及び
選択された類似体のCOS細胞上清のウェスタンブロット
分析を示す。類似体の構築は実施例６に記載されてい
る。類似体N9、N14、N18、N19、N21、N24及びN29は、ゲ
ル移動度の遅延によって照明されるように少なくとも１
つの付加的炭水化物鎖を有する。

図11は、Ｎ−グリカナーゼ消化中の組換えヒトエリト
ロポエチン及びEPO N14類似体のCOS細胞上清のウェスタ
ンブロット分析を示す。０、４、12及び45分消化後及び
一夜消化後を測定時点とした。

図12は、EPO N14類似体イソ形調製物の等電点電気泳
動ゲルを示す。等電点の低いイソ形プールは１分子あた
り概して６〜12個のシアル酸を有するEPO N14類似体を
含み、中間のイソ形プールは１分子あたり概して10〜15
個のシアル酸を有する類似体N14を含み、高いイソ形プ
ールは１分子あたり概して12〜17個のシアル酸を有する
EPO N14類似体を含んでいる。

図13は、ラットに静注後の組換えヒトエリトロポエチ
ン、単離イソ形14及びEPO N14類似体（イソ形15−17）
の薬物動態を示す。

図14は、種々の量の非標識rHuEPO、単離イソ形14また
はEPO N14類似体の存在下でエリトロポエチン受容体に
結合する¹²⁵I標識組換えヒトエリトロポエチンの低温置
換アッセイを示す。

図15は、EPO N14の高イソ形プール（0.036及び0.0712
μｇ）、単離イソ形（0.036及び0.0712μｇ）、EPO177
の低イソ形プール（0.0712μｇ）及びrHuEPO（0.071μ
ｇ）の活性を比較するマウスヘマトクリット試験を示
す。

発明の詳細な説明本発明はエリトロポエチンのイソ形を提供する。本発
明によって得られる特定のエリトロポエチンイソ形及び
それらの特性は、出発物質のソース次第で様々に異なる
であろう。例えば、尿由来ヒトエリトロポエチンイソ形
は、組換えエリトロポエチンイソ形と比べて異なる。好
ましい実施態様において、本発明は、エリトロポエチン
１分子あたり１〜14から成るグループから選択された特
定数（即ち０より大きい所定数）のシアル酸を有するエ
リトロポエチンイソ形に関する。好ましい数は、９、1
0、11、12、13または14である。別の実施態様において
は、この数は14よりも大きく、好ましくは16〜23であ
る。

本明細書中で使用される「エリトロポエチンイソ形」
なる用語は、単一等電点（pI）を有し且つ同じアミノ酸
配列を有するエリトロポエチン調製物を意味する。本明
細書中で使用される「エリトロポエチン」なる用語は、
天然エリトロポエチン、尿由来ヒトエリトロポエチン、
及び、天然エリトロポエチンに十分に類似したアミノ酸
配列及びグリコシレーションを有しており骨髄細胞によ
る網状赤血球及び赤血球細胞の産生を増進するin vivo
生物特性を有している非天然ポリペプチドを意味する。

尿由来ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列を有する
組換えエリトロポエチンの個別のイソ形は１〜14個のシ
アル酸を有するエリトロポエチン分子に対応しているこ
と、及び、精製された組換えエリトロポエチン中に存在
するイソ形の各々は該イソ形が有しているシアル酸の数
に関連したin vivo活性を有していることが知見され
た。

好ましい実施態様において、エリトロポエチンは、ヒ
ト以外の真該宿主細胞にトランスフェクトされた外因性
DNA配列の発現産物である。即ち、好ましい実施態様に
おいて、エリトロポエチンは、「組換えエリトロポエチ
ン」である。組換えエリトロポエチンは、参照によって
本明細書に含まれるLin名義の米国特許第4,703,008号に
記載の手順に従って有利に産生される。組換えエリトロ
ポエチンは、参照によって本明細書に含まれるLaiら名
義の米国特許第4,667,016号の実施例２に記載の汎用手
順に従って精製されるか、または、Laiらの実施例２に
記載の手順を修正しDEAE−アガロースクロマトグラフィ
ーに代えてＱ−セファロースクロマトグラフィーを用い
る処理によって精製され得る。

Laiら、前出、の実施例２に従って精製されたエリト
ロポエチンは、IEFによって分析すると主として６つの
イソ形を含んでいる。更に、実施例４に記載のクロマト
グラフィー手順を用いて、より高い酸性度を有する少な
くとも１つの追加のイソ形が検出された。（IEFゲル上
で＞14シアル酸に泳動するより高度に酸性のこのイソ形
は、ある種の電荷がシアリダーゼ消化に対して耐性を示
すので非シアル酸負電荷を含んでいるであろう）。これ
らのイソ形の相互間の違いはシアル酸含量の違いに基づ
く。このことは、実施例に示すように、10個のイソ形を
分取用IEFによって単離し、そのうちの５つのイソ形の
シアル酸含量を測定することによって照明される。シア
ル酸含量を検定したイソ形のうちの５つのイソ形が９、
10、11、12または13個のシアル酸残基を含むことが知見
された。

エリトロポエチンの相対的in vivo比活性とイソ形５
〜11のエリトロポエチン１分子あたりのシアル酸残基の
数との間には関係がある（本明細書では各イソ形をエリ
トロポエチン分子あたりのシアル酸の数に基づいて命名
する）。イソ形11〜14は、ほぼ等しい相対的in vivo比
活性を有している。イソ形５〜14のin vivo活性を、低
酸素症でない（exhypoxic）赤血球増加症マウスのバイ
オアッセイによって検定し、各イソ形の存在量をBradfo
rdタンパク質アッセイ、280nmの吸光度またはエリトロ
ポエチン用ラジオイムノアッセイ（RIA）によって測定
する。単位/mlで示されるRIAの測定値（Egrieら、Immon
obiclogy172,213（686））を、RIAによって測定された
精製エリトロポエチンの平均比活性即ち212,770単位/mg
エリトロポエチンポリペプチドによって除算すると、単
離イソ形またはイソ形混合物のタンパク質濃度が、1ml
あたりのエリトロポエチンポリペプチドのmgとして得ら
れる。実施例に示すように、相対的in vivo比活性は、
イソ形５からイソ形11まで段階的に増加する（表２）。

本明細書中のin vivo比活性なる用語は、相対的in vi
vo比活性の測定値を意味しており、絶対的in vivo比活
性の測定値を意味しない。本願では、同じアッセイを使
用し、同じ内部標準も含めた同じ条件及び同じ種類の動
物を使用し、比活性の計算に同じデータ分析を使用し、
同じタンパク質含量測定アッセイを使用して検定された
イソ形の相対的活性を比較するためにのみ比活性を使用
する。任意のイソ形について報告されたin vivo比活性
は該イソ形の固有値即ち絶対的な値を示すものではな
い。

本発明はまた、２種以上のエリトロポエチンイソ形か
ら成る組成物を提供する。１つの実施態様では、組成物
が、エリトロポエチン１分子あたり所定数よりも多いシ
アル酸、例えばエリトロポエチン１分子あたり11よりも
多いシアル酸、または１分子あたり12よりも多いシアル
酸を有するイソ形の混合物、例えばイソ形12、13及び14
の混合物から成る。別の実施態様では、組成物が、エリ
トロポエチン１分子あたり所定数、例えば１分子あたり
９以上12未満のシアル酸を有するイソ形の混合物、例え
ばイソ形９、10及び11の混合物から成る。本発明はま
た、イソ形を同じ相対量または異なる相対量で含むエリ
トロポエチンイソ形の組成物を提供する。例えば、イソ
形９、10及び11の混合物には、これらのイソ形が1:1:
1、2:3:1または20:20:1のような種々の割合で存在し得
る。

好ましくは、組成物が、４種未満のイソ形の混合物、
例えばイソ形11、12及び13の混合物、または12と14との
混合物、または７と13との混合物から成る。

本発明はまた、エリトロポエチンイソ形の混合物を産
生するために、選択されたエリトロポエチンイソ形を同
時に単離する方法を提供する。これらの方法は、分取用
等電点電気泳動のような技術による個々のイソ形の単
離、またはイオン交換クロマトグラフィーもしくは等電
点クロマトグラフィーのような技術による１分子あたり
所定数（例えば11よりも多い数）のシアル酸を有するイ
ソ形の混合物の調製を含む。これらの技術はすべて、電
荷によるタンパク質の分離に基づく技術である。

概して、イオン交換クロマトグラフィー及び等電点ク
ロマトグラフィーでは、粗ヒトエリトロポエチン（細胞
馴化培地）または精製物質を、エリトロポエチンイソ形
の一部または前部が樹脂に結合し得る条件下で使用す
る。粗エリトロポエチン調製物の場合は、pH約７のカラ
ムにタンパク質を添加するのが好ましく、精製調製物の
場合はpH7以下約pH4までのカラムにタンパク質を添加し
得る。pH4の緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液のpH及び
塩濃度を増加させるかまたは漸減pH及びpH約４の漸増イ
オン強度の勾配を使用することによって、イオン交換カ
ラムに結合したエリトロポエチンイソ形を溶出させる。
等電点クロマトグラフィーの場合は、漸減pHの勾配を用
いるかまたはカラムを高濃度の塩で洗浄することによっ
てカラムからイソ形を溶出させる。

好ましい実施態様では、イオン交換クロマトグラフィ
ーを用いて個々のイソ形を単離する。一例として、実施
例８に記載のようなイオン交換クロマトグラフィーを用
いてイソ形14を単離した。

また、ヒトエリトロポエチンのいくつかの類似体も本
発明に包含される。本明細書中で使用される「ヒトエリ
トロポエチン類似体」なる表現は、ヒトエリトロポエチ
ンのアミノ酸配列中に１つまたはそれ以上の変異を有し
その結果としてシアル酸結合部位の数が増加したエリト
ロポエチンを意味する。類似体は、グリコシレーション
可能な部位を増加させるかまたは変異させるアミノ酸残
基の付加、欠失または置換を有する部位特異的突然変異
誘発によって作製される。このような類似体は、ヒトエ
リトロポエチンよりも多い数の炭水化物鎖を有し得る。

本発明のエリトロポエチン類似体は、少なくとも１つ
の付加的グリコシレーション部位を含むアミノ酸配列か
ら成る。ヒトエリトロポエチン中で観察されるレベルを
上回るシアル酸レベルを有する類似体は、生物活性に必
要な二次または三次コンホメーションを妨害しないグリ
コシレーション部位を付加することによって作製され
る。好ましくは、ヒトエリトロポエチン類似体は、１、
２または３個の付加的なＮ−グリコシレーション部位ま
たはＯ−グリコシレーション部位を有しており、１、２
または３個の付加的なＮ−結合またはＯ−結合炭水化物
鎖が付加される。例えば、69位のロイシンをアスパラギ
ンで置換すると、配列Asn−Leu−Serが形成され、これ
は第４のＮ−グリコシレーション部位として作用する。
このような変異は通常は１分子あたり４個以下の付加的
シアル酸を提供し得る。付加的Ｏ−グリコシレーション
部位を生じさせる変異の例は、125位のアラニンからト
レオニン、124位及び125位の夫々のアラニンからプロリ
ン及びトレオニンへの変異である。１つまたはそれ以上
の付加的Ｎ−結合及びＯ−結合鎖を有する類似体、例え
ば表５に記載の類似体NO1及びNO2を構築してもよい。当
業者には明らかであろうが、本発明は付加的グリコシレ
ーション部位を有するヒトエリトロポエチンの他の多く
の類似体を包含する。

グリコシレーション部位に増加した炭水化物結合レベ
ルを有する類似体も本発明に包含される。このような類
似体は通常、Ｎ−結合またはＯ−結合部位の極めて近傍
に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。これらの
アミノ酸変異の結果として、炭水化物修飾を有するエリ
トロポエチンポリペプチドの割合が増加しているであろ
う。グリコシレーション部位は天然産生でもよくまたは
突然変異によって生じてもよい。例えば、類似N13は、8
8位にグコシレーション部位が導入されても付加的炭水
化物鎖を生じない。しかしながら、87位に置換セリン残
基及び置換バリン残基を夫々有する類似体N14及びN18
は、88位に付加的炭水化物鎖を有している。

本発明はまた、エリトロポエチンのカルボキシ末端か
ら延長する１つまたはそれ以上のアミノ酸を有しカルボ
キシ末端延長部が少なくとも１つの付加的炭水化物部位
を与える類似体を提供する。１つの実施態様では、ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（HCG）のカルボキシ末端の28個
のアミノ酸をヒトエリトロポエチンの166位のアルギニ
ン残基に融合させることによって類似体を構築した。HC
G−カルボキシ末端フラグメントは４つのＯ−グリコシ
レーション部位を有している（Kesslerら、J.Biol.Che
m.254,7907（1979））。

表３、４及び５は、付加的なＮ−結合及び／またはＯ
−結合炭水化物鎖部位を有するエリトロポエチン類似体
の一覧である。類似体は、Ｎ−結合部位を生じるうよう
にヒトエリトロポエチンポリペプチド鎖中の種々の位置
で置換されたAsn−Ｘ−Ser/Thr配列を有しているかまた
はＯ−結合部位を生じるように導入されたセリンもしく
はトレオニン残基を有している。

表６は、SDSゲル上の糖タンパク質の泳動によって証
明されるように（実施例７）、少なくとも１つの付加的
なＮ−結合もしくは１つの付加的なＯ−結合炭水化物鎖
が付加されているか、または付加的なＮ−結合及びＯ−
結合鎖が同時に付加されている類似体の一覧である。表
３〜６から明らかなように、１つ以上の付加的な炭水化
物結合部位を有する類似体が必ずしも付加的な炭水化物
鎖を有するエリトロポエチン分子になるとは限らない。
例えば、123位及び125位のトレオニン残基の置換の結果
としてはＯ−結合炭水化物鎖が付加されるが、その他の
位置のセリンまたはトレオニンの置換は付加的なＯ−結
合鎖を有する類似体を生じない（表４参照）。しかしな
がら、ヒトエリトロポエチンアミノ酸配列中の30、51、
57、69、88、89、136及び138位のアスパラギン残基の置
換の結果としては、これらの部位にＮ−結合鎖が付加さ
れる。HCGポリペプチドフラグメントをヒトエリトロポ
エチンの166位のアルギニン残基に融合させると、少な
くとも２つの付加的Ｏ−結合炭水化物鎖を有するエリト
ロポエチン−HCG融合分子が得られる。

本発明のエリトロポエチン類似体はまた、少なくとも
１つのグリコシレーション部位の転位を含むアミノ酸配
列を有するエリトロポエチンを包含する。本明細書中で
使用されるグリコシレーション部位の転位（rearrangem
ent）という表現は、ヒトエリトロポエチン中の１つま
たはそれ以上のグリコシレーション部位の欠失及び１つ
またはそれ以上の非天然グリコシレーション部位の付加
を意味する。類似体R1、R2及びR3は、かかる転位の例で
あり、夫々24、38または83位のＮ−結合部位の欠失及び
88位のＮ−結合部位の付加によって構築された。しかし
ながら、その他の多数種の炭水化物部位の転位が可能で
あり、得られる類似体は、ヒトエリトロポエチンに比べ
て増加した数のグリコシレーション部位を有していても
よく有していなくてもよい。

類似体R1、R2及びR3のin vivo生物活性を分析し、結
果を表７に示す。Asn88にＮ−結合鎖を導入すると、生
物活性は、３つの天然産生Ｎ−結合部位のいずれかが欠
失したエリトロポエチンまで回復した。これらの結果
は、生物活性に有意な影響を与えることなく有用な類似
体を作製するために、エリトロポエチン中の炭水化物鎖
の位置を変更してもよいことを示す。

また、付加的なＮ−結合及び／またはＯ−結合鎖部位
を有するエリトロポエチン類似体、少なくとも１つの炭
水化物鎖結合部位の転位を有する類似体、エリトロポエ
チンのカルボキシ末端から延長する１つまたはそれ以上
のアミノ酸を有する類似体をコードするDNA配列も本発
明に包含される。炭水化物結合部位を生成させ変異させ
る目的でヒトエリトロポエチンDNA配列中に変異を導入
する手順は実施例６に開示されている。

これらのエリトロポエチン類似体は、組換えDNA技術
によって産生された外因性DNA配列の発現産物でもよ
く、または合成産物でもよい。外因性DNA配列として
は、エリトロポエチン類似体をコードするcDNA、ゲノム
DNAまたは化学合成DNAがある。これらの類似体の発現に
有用な組換えDNAプラスミド及び真核性宿主細胞も提供
される。発現ベクターとしては、クローニングされたDN
A配列を真核性宿主細胞中で発現させ得る任意ベクタ
ー、特にCOS及びCHO細胞中で発現させるために使用され
るベクターがある。かかるベクターの例としては、本明
細書の実施例６に記載のプラスミドpEC及びpDECΔがあ
る。エリトロポエチン類似体を発現するCOS及びCHO宿主
細胞の培養は当業者に公知の手順を用いて行った。

エリトロポエチン類似体に由来の単離イソ形及びイソ
形混合物は、上述のヒトエリトロポエチンイソ形の調製
方法を用いて得られる。これらの方法としては、等電点
電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及び等電点ク
ロマトグラフィーがある。エリトロポエチン類似体に由
来の個々のイソ形またはイソ形混合物を調製するために
はイオン交換クロマトグラフィーを使用するのが好まし
い。

エリトロポエチンの炭水化物鎖の数、従ってエリトロ
ポエチン１分子あたりのシアル酸の数が増加すると、溶
解度の増加、タンパク質分解に対する耐性の強化、免疫
原性の低下、血清半減期の延長及び生物活性の増加など
の有利な特性が与えられるであろう。

エリトロポエチン類似体を発現するCHO細胞からの馴
化培地でin vivo生物活性を分析し、結果を表６に示
す。試験したいくつかの類似体はヒトエリトロポエチン
の３倍以上の活性を有していた。特に、30位または88位
に付加的なＮ−結合炭水化物鎖を有する類似体はヒトエ
リトロポエチンの２〜３倍高い活性を示し、ヒトエリト
ロポエチンをHCGポリペプチドフラグメントに融合した
結果得られた付加的なＯ−結合部位を有する類似体は２
杯以上の活性を有している。

付加的な炭水化物鎖を有する２つのエリトロポエチン
類似体を精製し、異なるシアル酸含量を有するイソ形の
混合物を単離した（実施例８）。Thr¹²⁵及びSer⁸⁷Asn⁸⁸
Thr⁹⁰（EPO N14）類似体を個別の３つのイソ形分画に分
離し、各分画毎のin vivo生物活性を測定した。表８に
与えた結果は、より高いシアル酸含量を有するEPO N14
イソ形分画がより大きいin vivo活性を有することを示
す。

EPO N14類似体及び組換えヒトエリトロポエチンの高
シアル酸イソ形（イソ形９〜14）のプールを、受容体結
合アッセイ、薬物動態実験及びマウスのヘマトクリット
増加測定実験で試験した。これらのアッセイの結果は、
シアル酸含量、クリアランス半減期及び処理マウスのヘ
マトクリット増加能力の間に直接的関係があることを示
す。従って、図13、図14及び図15に示すように、EPO N1
4の高シアル酸イソ形プールは、単離イソ形14または組
換えヒトエリトロポエチンに比較して、同様に強力な受
容体結合を示すことはなかったが、in vivo半減期の有
意な延長及びヘマトクリット増加の促進を示した。

本発明の別の実施態様は、ヒトエリトロポエチンイソ
形、または１分子あたり特定数よりも多いシアル酸、例
えば１分子あたり10よりも多いシアル酸を有するエリト
ロポエチン類似体を優先的に合成する哺乳類（例えばチ
ャイニーズハムスター卵巣、CHO）宿主細胞に関する。
エリトロポエチン分子は、分子のシアル酸含量を限定し
得るＮ−結合またはＯ−結合オリゴ糖構造を有してい
る。例えば、４つの受容部をもつ（４枝の）Ｎ−結合オ
リゴ糖は概して４つのシアル酸結合可能部位を与える
が、４枝形のアスパラギン結合部位に置換し得る２枝ま
たは３枝のオリゴ糖鎖は通常は２個または３個以下のシ
アル酸と結合できるだけである。Ｏ−結合オリゴ糖は通
常、２つのシアル酸結合部位を与える。従って、エリト
ロポエチン分子は、３つのＮ−結合部位全部が４枝であ
るならば合計14個のシアル残基を受容し得る。組換えエ
リトロポエチンに４枝の鎖を優先的に付加しこれによっ
て最大数のシアル酸結合部位を提供し得る細胞を哺乳類
細胞培養物からスクリーニングする。

尿エリトロポエチンのＮ−結合オリゴ糖は、ガラクト
ースに対してa2,3及びa2,6の双方の結合でシアル酸を含
有している（Takeuchiら、J.Biol.Chem.263,3657（198
8））。典型的には、α2,3結合のシアル酸はマンノース
a1,6ブランチ上のガラクトースに付加され、α2,6結合
のシアル酸はマンノースa1,3ブランチ上のガラクトース
に付加される。これらのシアル酸を付加する酵素（β−
ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ及びβ
−ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼ）は
夫々、マンノースα1,6ブランチ及びマンノースα1,3ブ
ランチにシアル酸を極めて効率的に付加する。

ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）欠失チャイニーズ
ハムスター卵巣（CHO）細胞は、組換えエリトロポエチ
ンのような組換え糖タンパク質産生のための常用の宿主
細胞である。これらの細胞は酵素β−ガラクトシドα2,
6シアリルトランスフェラーゼを発現せず、従ってこれ
らの細胞中で産生された糖タンパク質のＮ−結合オリゴ
糖にα2,6結合でシアル酸を付加しない。（Mutsaers
ら、Eur.J.Biochem.156,651,（1986）;Tateuchiら、J.C
hromatogr.400,207（1987））。その結果、CHO細胞中で
産生された組換えエリトロポエチンは、ガラクトースに
対し2,6結合するシアル産を欠失している（Sasakiら、
（1987）、前出;Takeuchiら、（1987）、前出）。

本発明の別の実施態様においては、ヒトエリトロポエ
チンまたはエリトロポエチン類似体が、ガラクトースに
対しα2,6結合でシアル酸を取り込むために機能性β−
ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼ遺伝子
でトランスフェクトされたCHO細胞中で産生される。得
られたイソ形は、ガラクトースへのα2,3及びα2,6結合
の双方を有するシアル酸を含有するであろう。修飾CHO
細胞またはその他の哺乳類宿主細胞を作製する技術の記
載に関しては、Leeら、J.Biol.Chem.264,13848（1989）
を参照されたい。該文献の記載内容は本明細書に含まれ
るものとする。

治療有効量の特定のイソ形またはイソ形混合物を、エ
リトロポエチン治療に有用な適当な希釈剤、アジュバン
ト及び／または担体と共に含む医薬組成物も本発明の範
囲に包含される。治療有効量のエリトロポエチン類似体
を適当な希釈剤、アジュバント及び／または担体ととも
に含む医薬組成物も本発明の範囲に包含される。本明細
書中で使用される「治療有効量」なる用語は、所与の症
状及び投与養生法に対して治療効果を与える量を意味す
る。ヒトエリトロポエチンのイソ形またはエリトロポエ
チン類似体の投与は非経口経路によるのが好ましい。選
択される特定経路は治療される病状次第である。ヒトエ
リトロポエチンのイソ形またはエリトロポエチン類似体
は好ましくは、ヒト血清アルブミンのような適当な担
体、緩衝生理食塩水溶液のような適当な希釈剤及び／ま
たは適当なアジュバントを含む製剤の一部として投与さ
れる。必要な投与量は、患者のヘマトクリットを増加さ
せるため十分な量であり、治療される病状の重症度、使
用される投与法などに従って加減できる。

以下の実施例は、本発明をより十分に説明するために
与えられたものであるが、本発明の範囲をを限定すると
理解されてはならない。実施例で使用したin vivoバイ
オアッセイに使用したエリトロポエチン標準は、部分精
製した尿エリトロポエチン標準に対して標準化したもの
である。従って、相対的なin vivo比活性だけを測定し
ている。また、使用したエリトロポエチン標準を既存の
いかなる国際標準にも直接相関させなかったので、in v
ivo比活性を、「IU/ml」、「IU/mg」及び「IU/A₂₈₀」で
なく「単位/ml」、「単位/mg」及び「単位/A₂₈₀」で示
している。

実施例1:組換えエリトロポエチンイソ形の単離 Linら、前出、の記載に従って組換えエリトロポエチ
ンを産生する。第１及び第３のイソ形単離用の出発物質
として使用される組換えエリトロポエチンを、Laiら名
義の特許、前出、の実施例２に記載の手順で精製する。
第２及び第５のイソ形単離用の出発物質を、Ｑ−セファ
ロースを用いるように修正したLaiら、前出、に記載の
方法に従って精製する。これらの調製物は、尿由来ヒト
エリトロポエチンと同じアミノ酸配列を有する組換えエ
リトロポエチンのイソ形混合物を含有し、主としてイソ
形９〜14を含有している。第４のイソ形調製用の出発物
質は、Laiらの実施例２のアニオン交換カラムの5mMの酢
酸/1mMのグリシン/6Mの尿素洗浄の間に溶出する物質で
ある。この分画は、９個以下のシアル酸を有するイソ形
を含有しており、分取用等電点電気泳動手順に使用する
前にLaiらの実施例２に記載されたようなゲル濾過クロ
マトグラフィーによって更に精製した。第６のイソ形調
製用の出発物質としては４〜13個のシアル酸残基を有す
る組換えエリトロポエチンの精製調製物を使用した。こ
の物質は、出発物質中に存在するイソ形をほぼ保持する
イオン交換カラムを用いるように修正した（pH8.4の塩
化ナトリウム勾配によって組換えエリトロポエチンを溶
出させ酢酸／尿素洗浄液を削除する）Laiらの実施例２
の手順で精製した。

本質的にLKB Application Note198に記載の顆粒状ゲ
ルベッド（Ultrodex,LKB）を用いた分取用等電点電気泳
動によって異なる６つの個別イソ形を調製した。Pharma
lyte（Pharmacia）2.5−５アンホライト（Pharmacia）
を使用し、ゲルベッドは5Mの尿素を含有している。

第１の調製では、6.8mlの20mMのクエン酸ナトリウム/
100mMの塩化ナトリウム,pH7.0中の約20mgの組換えエリ
トロポエチンをゲルに添加し、８ワットで約16時間フォ
ーカシングする。等電点電気泳動後、ゲルベッドの紙接
触プリントによってゲル内のイソ形バンドを可視化す
る。プリントを作成し、次いで定着溶液（40％メタノー
ル/10％酢酸/10％TCA3.5％スルホサリチル酸）を３回交
換して浸漬（各回約10分間、室温）させることによって
定着し、40％メタノール/10％酢酸（30〜60℃）で１回
（約10分間）処理し、0.125％クーマシーブルーＲ−250
/40％メタノール/10％酢酸中で60℃で15分間染色し、次
いで7.5％メタノール/10％酢酸中で脱色して、分離され
たイソ形を可視化する。イソ形を含有する顆粒状ゲルベ
ッドの領域（樹脂の〜50％）を取り出し、水（〜16ml）
を添加し、スラリーを5.5×24.5インチのトレーに注
ぎ、正味重量〜40gまで蒸発させる。この調製物を２回
目にフォーカシングし、前回と同様にゲルベッドの接触
プリントを作成する。識別可能な６つのイソ形の各々を
含むゲル部分をゲルベッドから取り出す。

ゲルからイソ形を溶出させるために、10mMのTris−HC
l,pH7.0/5mMのChapsを含有する溶液を各イソ形に添加し
てスラリーを調製する。スラリーを小カラムに入れ、Tr
is−Chaps緩衝液で洗浄する。素通り分（flow throug
h）を収集し、20％エタノール/10mMのTris−HCl,pH7.0
中で平衡させたVydac C4逆相樹脂を収容した小カラム
（オープンカラム構造）に別々に導入する。20％エタノ
ール/10mMのTris−HCl,pH7.0、35％エタノール/10mMのT
ris−HCl,pH7.0及び65％エタノール/10mMのTris−HCl,p
H7.0によってカラムを段階的に展開させる。65％エタノ
ール/10mMのTrisに溶出する分画を、10mMのTris−HCl,p
H7.0によって1:1に希釈し、濃縮し、次いでCentricon−
10（Amicon）微量濃縮装置（microconcentrator）を用
いて、緩衝液を10mMのTris−HCl,pH7.0と交換する。5M
の尿素を含むポリアクリルアミドゲル中で、Servalyte3
−５アンホライン（Serva）を用い、本質的にLKBテクニ
カルノート250に記載された手順で、この調製物を分析
用等電点電気泳動にかける。

第２の調製では、6.5mlの脱イオン水中の約26mgの組
換えエリトロポエチンをゲルに添加し、2.5ワットで35
分間及び10ワットで約17時間フォーカシング処理する。
ゲルベッドで観察された泳動タンパク質バンドを11個の
異なるプールとして取り出す。各プールを脱イオン水で
約7.5mlにし、得られた各プールの20mlの上清を上述の
ような分析用等電点電気泳動にかける。各プールに5ml
の1.5MのTris−HCl,pH8.8を添加し、スラリーの各々を
小カラムに導入し、液相を流通させる。樹脂を約３倍容
の0.5MのTris−HCl,pH7で洗浄し、洗浄液を素通り分と
合わせる。カットオフ分子量10,000ダルトンのAmicon使
い捨て限外濾過デバイスを用いて、溶出液を濃縮し、緩
衝液を20mMのクエン酸ナトリウム/100mMの塩化ナトリウ
ム,pH7.0と交換する。濃縮した溶液（約0.5ml）を次
に、カットオフサイズ0.22ミクロンの酢酸セルロースフ
ィルターに通す。分析用等電点電気泳動に基づいて、５
つのプールが単一イソ形10、11、12、13及び14を主とし
て含むことが知見される。

第３の調製では、21.8mlの蒸留水中の約30mgの組換え
エリトロポエチンをゲルに添加し、２ワットで25分間、
10ワットで20時間及び15ワットで15分間フォーカシング
処理する。個々のイソ形に対応するタンパク質バンドを
肉眼で観察しゲルベッドから取り出す。ゲル単離したイ
ソ形に蒸留水を添加してスラリーを調製し、得られた上
清を分析用等電点電気泳動によって分析する。等量の1M
のTris−HCl,pH7.2を各スラリーに添加し、懸濁液を個
別の小カラムに入れ、液相をカラムに通過させてイソ形
を溶出させる。カットオフ分子量10,000ダルトンのAmic
on使い捨て限外濾過デバイスを用いて、各素通り分を濃
縮し、緩衝液を20mMのクエン酸ナトリウム/100mMの塩化
ナトリウム,pH7.0と交換する、分析用等電点電気泳動ゲ
ルは、単一イソ形９、10、11、12、13及び14を主として
含むプールが得られることを示した。

第４のイソ形調製では、イソ形３〜９を含むエリトロ
ポエチン（上述の手順調製）を出発物質として使用し
た。調製物１〜３に関する上記の記載とほぼ同様に行う
分取用等電点電気泳動に先立って、等電点の低い出発物
質により適したアンホライト範囲を与えるために、アン
ホライト（Pharmalyte2.5−５）をRotofor（Bio−Rad,R
ichmond,CA）液相等電点電気泳動槽中で予め分画した。
予分画は、6.7mlのPharmalyte2.5−５を15gの尿素と混
合し、容量50mlまで純水を添加することによって行っ
た。この混合物をRotofor内で0.1Mのリン酸及び0.1Mの
水酸化ナトリウムを夫々陽極液及び陰極液として用い10
ワット、１℃で５時間半処理することによって分画し
た。pH測定値4.5〜約６を有するアンホライト分画をフ
ラットベッド等電点電気泳動に使用した。

Centrieluter（Amicon,Danvers,MA）及びカットオフ
分子量10,000のCentricon（Amicon）を用い、以下のパ
ラメーター、即ち、0.18のTris緩衝液pH8.8、100ボル
ト、25〜30mA、３時間を用いてイソ形からアンホライト
を除去した。次に、Sephadex G−25（Pharmacia）を用
いたゲル濾過によってイソ形の緩衝液を0.1Mの塩化ナト
リウムに交換した。得られた５つのプールの分析用等電
点電気泳動は、これらのプールがイソ形４、５、６及び
８を含むことを示した。イソ形４は複数のバンドとして
溶出し、これはこのイソ形がある程度分解されたことを
示す。

第５のイソ形調製は、フラットベッド等電点電気泳動
手順にプレフォーカシング段階を加えることによって修
正した。この修正では、タンパク質を電気泳動前にアン
ホライト／尿素ゲル混合物に添加せず、ゲルベッド中で
pH勾配を作成した後に等電点電気泳動装置に添加した。
75分間（1500ボルト−時）のプレフォーカシング後、2.
25〜4.25cmのゲルベッド切片を陰極から取り出し、エリ
トロポエチン溶液と混合し、ゲルベッドに戻した。等電
点電気泳動後、イソ形10、11、12、13及び14がゲルベッ
ドから溶出し、Centricon−10（Amicon）デバイスを用
いた限外濾過によってこれらのイソ形をアンホライトか
ら分離した。

プレフォーカシング段階は、イソ形調製物の紫外線吸
光特性を出発組換えエリトロポエチンの特性にいっそう
近いものにするために加えた修正である。スペクトル特
性のこのような改良は、単離イソ形の280nm及び260nmの
吸光度の比として現れる。調製物２及び３（プレフォー
カシング非使用）で得られたイソ形の場合には280nmの
吸光度と260nmの吸光度との平均比（A₂₈₀/a₂₆₀）が1.36
±0.11であるが、調製物５及び６（プレフォーカシング
使用）の場合にはA₂₈₀/a₂₆₀比が1.68±0.20である。イ
ソ形＃14を計算から除外すると、調製物２及び３並びに
調製物５及び６の平均A₂₈₀/a₂₆₀比は夫々、1.39±0.11
及び1.74±0.09である。（イソ形14は、最小量で存在し
従ってアンホライト成分の微量夾雑によって干渉され易
い、またはフラットベッド等電点電気泳動手順中に電極
に最も近い、などの理由で、最も変則的なスペクトルを
有するであろう）。（アニオン交換樹脂としてＱ−セフ
ァロースを用いるように修正した）Laiらの実施例２に
従って調製した組換えエリトロポエチンの平均A₂₈₀/a
₂₆₀比は1.91±0.04である。

上述のごとく、イソ形調製物＃６の出発物質は、イソ
形４〜13を含む組換えエリトロポエチン調製物であっ
た。アンホライトを第４の調製と同様にRotofor装置内
でプレフォーカシングした。pH測定値3.7〜4.8を有する
アンホライト分画をフラットベッド等電点電気泳動に使
用した。処理＃５と同様にフラットベッドをプレフォー
カシングし、アンホライト担体を除去するために限外濾
過（Centricon−10）した後、イソ形９、10、11、12及
び13が得られた。

実施例2:組換えエリトロポエチンイソ形のシアル酸含量実施例１に記載のごとく単離したイソ形及びLaiら、
前出、に記載の手順で精製したエリトロポエチン（イソ
形９〜14の混合物）の緩衝液を0.10〜0.15Mの塩化ナト
リウムに交換し、Jourdianら、J.Biol.Chem.246,430（1
971）、の手順の修正手順によってシアル酸含量を分析
する。0.35Mの硫酸で80℃で30分間加水分解することに
よって糖タンパク質からシアル酸残基を開裂し、分析前
に水酸化ナトリウムで溶液を中和する。エリトロポエチ
ンタンパク質の存在量を推定するために、Bio−Radによ
って供給されるアッセイ試薬及び微量法手順を用い、ヒ
トエリトロポエチンのアミノ酸配列を有する組換えエリ
トロポエチンを標準として用いてBradfordタンパク質ア
ッセイ（Bradford Anal.Biochem.72,248（1976）を行
う。その結果を、エリトロポエチン１モルあたりのシア
ル酸のモル数として表１に示す。１分子あたりのシアル
酸の数に従って低酸性（イソ形９）から高酸性（イソ形
14）の範囲までイソ形を命名する。イソ形９〜13は図１
のゲルレーン６〜10に示されている。イソ形14はシアル
酸含量を正確に測定するために十分な量で得られないた
め、このイソ形のシアル酸含量はIEFゲル上の泳動を他
のイソ形に比較することによって推定する。イソ形５〜
８（調製物＃４）のシアル酸含量は測定しなかったがIE
Fゲル上の移動度から同様にして推定する。

実施例3:組換えエリトロポエチンイソ形の活性実施例１に記載のごとく単離したイソ形について、組
換えエリトロポエチンの存在量を測定するために、280n
mの吸光度、Bradfordタンパク質アッセイ及びエリトロ
ポエチン用RIAによって検定する。低酸素症でない赤血
球増加症マウス（exhypoxic polycythemic mouse）のバ
イオアッセイ（Cotesら、Nature191,1065（1961））を
用い、相対的in vivo生物活性を測定する。エリトロポ
エチン用ラジオイムノアッセイを用いてエリトロポエチ
ンタンパク質の存在量を定量する場合、大量のシアル酸
を含有するイソ形では免疫反応性の見かけの減少が生
じ、そのためエリトロポエチン濃度が過小評価され従っ
て大抵の陰性イソ形の相対的in vivo比活性が過大評価
されるので、ある種のイソ形では他の定量法よりも高い
相対的in vivo比活性の値が得られた。単位/mlで表され
たマウスバイオアッセイの測定値を対応タンパク質濃度
によって除算すると、エリトロポエチンポリプペチド1m
gあたりの単位で表されるin vivo比活性が算出される。
これらの比活性を表２に示す。

表２において、「ｎ」は、比活性値の測定に用いた個
別のイソ形調製物の数である。多くの場合、イソ形調製
物の各々に複数のin vivoアッセイを実施した。同じin
vivoデータを用いて３つのカラム全部の比活性を計算
し、単位/mgエリトロポエチンポリペプチドを、280nmの
吸光度、ラジオイムノアッセイ力価またはBradfordタン
パク質アッセイ結果から決定した。イソ形９〜14を含有
する精製組換えエリトロポエチンをBradfordタンパク質
アッセイの標準として使用した。Bradfordアッセイを行
うときには足りなくなっていた調製物もいくつかあった
ので、Bradfordタンパク質アッセイを用いた計算では
「ｎ」が少ないものもある。

Laiら、前出、に記載の手順に従って精製されイソ形
９〜14の混合物を含有するエリトロポエチンをRIA及びi
n vivoアッセイ用標準として使用する。

単位/mgエリトロポエチンポリペプチドで表された相
対的比活性に、エリトロポエチンポリペプチド0.807mg/
A₂₈₀を乗算することによって、単位/A₂₈₀に変換し得
る。この変換係数は、エリトロポエチンの吸光係数（1.
345mg/A₂₈₀）に、エリトロポエチン糖タンパク質含量
（約60重量％、Davisら、Biochemistry26,2633（198
7））を乗算して算出されたエリトロポエチンポリペプ
チドmg/A₂₈₀である（即ち、エリトロポエチン1.345mg/A
₂₈₀×ポリペプチド0.60mg/mgエリトロポエチン＝ポリペ
プチド0.807mg/A₂₈₀）。更に、単位/mgエリトロポエチ
ンポリペプチドで表された比活性に、ポリペプチド0.60
mg/mgエリトロポエチン糖タンパク質という係数を乗算
すると、比活性を単位/mgエリトロポエチ糖タンパク質
で表すことができる。

表２のデータは図2A、図2B及び図2Cのグラフにも示さ
れている。これらのデータは、エリトロポエチンの相対
的in vivo活性がイソ形＃11まではシアル酸含量の関数
として増加することを示す。イソ形11〜14は本質的に同
じ相対的in vivo生物活性を有している。（このことは
イソ形14の濃度をBradfordアッセイを用いて表すときに
極めて明らかである。イソ形14に関してはBradford値が
最も正確であろう。何故なら、得られる結果が概して低
レベルであるためA₂₈₀による測定は難しく、またRIAは
まさに上述のような陰性形態の反応性減少が最も明白に
生じるからである）。シアル酸の含量が多いほどエリト
ロポエチンイソ形の相対的in vivo比活性が大きい理由
は恐らく、これらの形の血流中の半減期がより長いから
であろう。イソ形９及び13を放射性ヨウ素（¹²⁵I）で標
識し、ラット中でのクリアランス率を測定した。血流中
の半減期はイソ形13のほうがイソ形９よりもかなり長か
った。

実施例4:Q−セファロースクロマトグラフィーによる組
換えエリトロポエチンイソ形混合物の選択 Linら、前出、に記載の手順に従って組換えエリトロ
ポエチンを産生した細胞馴化培地を濃縮し、10mMのTri
s,pH7.2に対し透析濾過する。ウシ血清アルブミンを標
準として用いるBradfordマイクロタンパク質アッセイに
よってタンパク質濃度を測定する。40mgの総タンパク質
を含有する19.6mlの溶液をCuSO₄中で20μＭにし、カッ
トオフサイズ0.45ミクロンのフィルターで濾過し、４℃
の10mMのTris,pH6.8〜7.0で平衡化しておいたＱ−セフ
ァロースFast Flow（Pharmacia）を充填したベッドボリ
ューム4ml（高さ1.05cm×直径2.2cm）のカラムに充填す
る。試料を添加した後、カラム容量の２杯の同じ緩衝液
でカラムを洗浄する。カラムの流速は約1m1/分である。
所定のエリトロポエチンイソ形混合物を選択するために
この手順を用いる個別の６個のカラムを準備する。

カラム容量の６〜９倍の低pH緩衝液でカラムを洗浄す
る。緩衝液は、カラム＃１では、NaOHでpH4.7に調整し
た150mMの酢酸、1mMのグリシン、20μＭのCuSO₄、6Mの
尿素から成り、カラム＃２では、NaOHでpH4.7に調整し
た200mMの酢酸、1mMのグリシン、20μＭのCuSO₄、6Mの
尿素から成り、カラム＃３では、NaOHでpH4.7に調整し
た250mMの酢酸、1mMのグリシン、20μＭのCuSO₄、6Mの
尿素から成り、カラム＃４では、NaOHでpH4.7に調整し
た300mMの酢酸、1mMのグリシン、20μＭのCuSO₄、6Mの
尿素から成り、カラム＃５では、150mMの酢酸、1mMのグ
リシン、20μＭのCuSO₄、6Mの尿素から成り、カラム＃
６では、300mMの酢酸、1mMのグリシン、20μＭのCuS
O₄、6Mの尿素から成る。カラム容量の８〜11倍の10mMの
Tris−HCl、55mMのNaCl、20μＭのCuSO₄,pH7によって各
カラムを洗浄することによってカラムのpHを約７に上げ
る。10mMのTris−HCl、140mMのNaCl、20μＭのCuSO₄,pH
7.0で洗浄することによって、所定のエリトロポエチン
イソ形混合物をカラムから溶出させる。

各カラムから溶出したイソ形プールを濃縮し、Amicon
Centricon−10微量濃縮装置を用いて溶媒を水に交換す
る。これらの濃縮プールの分析用等電点電気泳動の結果
を図３に示す。ゲルレーン１〜６は、カラム１〜６から
夫々溶出した所定のエリトロポエチンイソ形混合物を示
す。図３の右端のゲルレーンに示す「イソ形混合物」
は、上述のようなＱ−セファロースカラムに添加される
細胞培地を示す。5mMの酢酸、1mMのグリシン、20μＭの
CuSO₄、6Mの尿素でカラムを洗浄し、上述の手順を用い
てエリトロポエチンイソ形混合物をカラムから溶出させ
る。溶出したこのイソ形混合物を分析用等電点電気泳動
に掛ける前にLaiら、前出、に記載の手順に従って更に
精製する。

実施例5:Q−セファロース上の低pH勾配を用いる組換え
エリトロポエチンイソ形の分画別の手順では、pH漸減及びイオン強度漸増の勾配を用
いてエリトロポエチンイソ形を分離する。濃縮し透析濾
過したエリトロポエチン含有培地を、ゲル1mlあたり総
タンパク質約40mgの割合でＱ−セファロースカラムに充
填する。次に、カラム容量の約２杯の10mMのTris−HCl,
pH7.0でカラムを洗浄し、次いでカラム容量の約10倍の2
mMの酢酸/1mMのグリシン/20μＭのCuSO₄/6Mの尿素（pH
約4.8）で洗浄して、夾雑タンパク質及び約７個未満の
シアル酸残基を含むエリトロポエチンイソ形を除去す
る。6Mの尿素/1mMのグリシン/20μＭのCuSO₄中の約2mM
の酢酸から出発して40mMの酢酸/6Mの尿素/1mMのグリシ
ン/20μＭのCuSO₄（pH約４）に到達する勾配を用いて、
約８個から約12個のシアル酸を含むイソ形をカラムから
溶出させる。勾配の総容量はカラム容量の約40倍であ
り、約１カラム容量の各分画を容器に収集する。この容
器は、収集した分画が低pHに長期間接触することを防止
するために、pHを６〜8.5の範囲に維持する十分な量のT
ris緩衝液を収容している。分画のアリコートを分析用
等電点電気泳動にかけて分離をモニターする。

図４は、この手順によって達成されたイソ形８〜11の
分離を示す。勾配の終端でカラムに結合して維持された
イソ形12〜14は、10mMのTris−HCl、140mMのNaCl、20mM
のCuSO₄（pH7.0）から成る緩衝液で洗浄することによっ
て溶出させる。（勾配中で分離したかまたは塩化ナトリ
ウム溶液によって溶出した）イソ形を、Laiらの実施例
２に記載のような逆相クロマトグラフィー及びゲル濾過
クロマトグラフィーで順次処理して夾雑タンパク質を除
去する。

実施例6:ヒトエリトロポエチン類似体の構築ヒトエリトロポエチンアミノ酸配列内部の既存の炭水
化物結合部位の位置を図５に示す（SEQ ID.NO:26）。エ
リトロポエチンの付加的グリコシレーション部位の作製
手順を図6A−Ｃに要約し以下に説明する。

in vivo突然変異誘発に使用するために以下のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成した。

下線を付したコドンは、野生型アミノ酸が括弧内のア
ミノ酸によって置換された不敵性領域を示す。

Asn4にＮ−グリコシレーション部位を付加するために
［Asn⁴,Ser⁶］EPOを構築した。Asn9にNpグリコシレーシ
ョン部位を付加するために［Asn⁹,Ser¹¹］EPOを構築し
た。Asn69にＮ−グリコシレーション部位を付加するた
めに［Asn⁶⁹］EPOを構築した。Asn125にＮ−グリコシレ
ーション部位を付加するために［Asn¹²⁵,Ser¹²⁷］EPOを
構築した。Thr125にＯ−グリコシレーション部位を付加
するために［Thr¹²⁵］EPO及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPOを
構築した。

in vitro突然変異誘発に使用するために以下のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成した。

［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,Thr¹³¹］EPO: ［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPO cDNAから出発し、オリゴヌク
レオチドプライマー５′AGATCCGACCＡＣＣGCTGCTCCAC
3′（SEQ ID.NO:16）を使用して、［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr
¹²⁶］EPOを作製する。次にオリゴヌクレオチドプライマ
ー５′TGCTCCACTCACAACAATCACTG3′（SEQ ID.:17）を使
用して、［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,Thr¹³¹］EPOを作製す
る。

Asn69にＮ−グリコシレーション部位を付加しこの部
位のＮ−グリコシレーションを強化するために［Asn⁶⁹,
Thr⁷¹］EPO及び［Ser⁶⁸,Asn⁶⁹,Thr⁷¹］EPOを構築する。
Asn125にＮ−グリコシレーション部位を付加しこの部位
のグリコシレーションを強化するために［Asn¹²⁵,Thr
¹²⁷］EPO、［Asn¹²⁵,Thr¹²⁷,Thr¹³¹］EPO、［Pro¹²⁴,As
n¹²⁵,Ser¹²⁷］EPO及び［Pro¹²⁴,Asn¹²⁵,Thr¹²⁷］EPOを
構築する。Thr125にＯ−グリコシレーション部位を付加
しこの部位のグリコシレーションを強化するために、
［Thr¹²⁵,Thr¹²⁶］EPO及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,Ser
¹³¹］EPOを構築する。

in vitro突然変異誘発用エリトロポエチンDNAのソー
スは、プラスミドHu13、pUC8中のヒトエリトロポエチン
cDNAクローンであった（Lawら、Proc Natl.Aced.Sci.8
3,6920（1986））。Hu13に由来のプラスミドDNAを、Bst
E II及びBgl II制限酵素で消化し、得られたDNAフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動にかけ、810塩基対（b
p）のエリトロポエチンDNAフラグメントを、GeneClean
^TMキット及び製造業者によって提供された手順（BIO10
1,Inc.）を用いてゲルから単離した。Lin特許、前出、
に記載されているように、プラスミドpBRgHuEPOは、エ
リトロポエチンゲノム遺伝子をpBR322の誘導体に挿入さ
れたBamH Iフラグメントとして含む。pBRgHuEPOを同じ
くBstE II及びBgl IIで消化し、6517bpのベクターフラ
グメントを回収した。２つのフラグメントを結合してIG
Tlが得られた。pEC−１を構築するために、pDSVL（Lin
特許、前出、に記載及び図5Bに図示）をBamH Iで消化
し、エリトロポエチンcDNA含有のIGT1に由来の2,8キロ
塩基（kb）の単離BamH IフラグメントをIGT1に結合し
た。

in vitro突然変異誘発用の一本鎖DNAを作製するため
に、pEC−１をBmaH I及びBgl IIで消化し、820bpのエリ
トロポエチンcDNAフラグメントを単離した。このフラグ
メントをm13mp18のBamH I部位に結合してm13−EC−１を
作製した。Kunkelら、Methods in Enzymol.154,367（19
87）及びMessing、Methods in Enzymol.101,20（1983）
に記載された手順でm13−EC−１に感染させた大腸菌RZ1
032株の上清から一本鎖DNAを回収した。in vitro突然変
異誘発のために、約１μｇの一本鎖DNAと0.2ピコモルの
上記合成プライマーの１つとを、６μｌの緩衝液（250m
MのTris,pH7.8、50mMのMgCl₂及び50mMのジチオトレイト
ール）と混合した。プライマーを鋳型にアニーリングす
るために、反応容量を水で10μｌに調整し、混合物を65
℃で５分間加熱し、次いで室温まで放冷した。伸長反応
のために、各2.5μｌのdTTP、dATP、dGTP、dCTP及びATP
（すべて10μＭ）を添加し、次いで１μｌ（１単位）の
大腸菌DNAポリメラーゼ（Klenowフラグメント）と１μ
ｌ（１単位）のT4DNAリガーゼとを添加した。次に混合
物を14℃で１夜インキュベートし、記載された手順（Me
ssing、前出）で大腸菌JM109（Yanisch−Perronら、Gen
e33,103（1985））の形質転換に使用した。

識別用ハイブリダイゼーションによって突然変異クロ
ーンを同定するために、栄養寒天上のプラークをGene S
creenフィルター（New England Nuclear）に移した。フ
ィルターを加熱ランプ下に乾燥し、次いで１％SDS含有
の６×SSC中で60℃で１時間インキュベートした。ハイ
ブリダイゼーションのために、上記オリゴヌクレオチド
プライマー（８ピコモル）を、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ及びγ³²P−標識ATPで末端標識し、フィルターと共
に６×SSC、0.5％SDS及び100mg/mlのサケ精子DNA中で、
［Asn¹²⁴］突然変異のためには37℃、［Asn⁴,Ser⁶］突
然変異のためには55℃、［Thr¹²⁵］及び［Pro¹²⁴,Thr
¹²⁵］突然変異のためには65℃並びに［Asn⁹,Ser¹¹］及
び［Asn¹⁶³,Ser¹⁶⁵］突然変異のためには70℃で、一夜
インキュベートした。翌日、フィルターを６×SSCによ
って室温で３階洗浄し、オートラジオグラフィーにかけ
た。必要な場合には、野生型エリトロポエチンcDNA配列
を有するプラークへのハイブリダイゼーションがほとん
どまたは全く検出されなくなるまで温度を上げながら６
×SSC中でフィルターを洗浄した。これらの条件下で陽
性のハイブリダイゼーションシグナルを与えたクローン
を同定し、純粋なクローンを単離するためにJM109に再
度トランスフェクトした。ジデオキシチェーンターミネ
ーション配列分析は、アスパラギン、セリン、トレオニ
ン及びプロリン残基への突然変異が存在することを示し
た。

［Asn⁴,Ser⁶］、［Asn⁹,Ser¹¹］、［Asn⁶⁹］、［Asn
¹²⁴］、［Asn¹²⁵］、［Ser¹²⁷］、［Asn¹⁶³,Ser¹⁶⁵］、
［Thr¹²⁵］及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］のような変異を含む
二本鎖m13−EC−1DNAを沸騰法（Holmesら、Anal.Bioche
m117,193（1981））によって、トランスフェクトJM109
細胞から回収した。DNAをBstE II及びXho IIによって消
化し、810bpのエリトロポエチンDNAフラグメントを単離
した。pEC−１をBstE IIで消化し次いでBgl IIで部分消
化し、得られたフラグメントの５′末端を、10mMのTri
s,pH8中の細菌性アルカリホスファターゼによって60℃
で60分間脱リン酸処理した。810bpのBstE II−Bgl IIフ
ラグメントが欠失した7kbのベクターフラグメントを単
離し、上記のエリトロポエチンフラグメントに結合し
た。得られたプラスミド（pEC−Ｘと命名、このＸは類
似体番号）は指定位置に変異アミノ酸残基を有するエリ
トロポエチン類似体をコードするDNAを含んでいる。

または、アミノ酸残基41−55を欠失させるin vitro突
然変異誘発によってエリトロポエチン類似体（pEC34）
を構築した。この結果としては、より小さい（775bp
の）EPO含有BstE II−Bgl IIフラグメントが得られた。
このフラグメントを上述のようにpEClに挿入した。エリ
トロポエチン類似体をクローニングするために、上述の
ようにpEC34をBstE IIで消化し、Bgl IIで部分消化し、
脱リン酸化し、ベクターを単離した。7kbのベクターフ
ラグメントを次に、上記のエリトロポエチンフラグメン
トに結合した。pEC34と共にクローニングすることによ
って組換え体と単なる再閉鎖とを容易に識別し得る。再
閉鎖の場合には類似体よりも小さいBstE II−Bgl IIフ
ラグメントが生じ、これらはアガロースゲル上で識別が
容易である。

これらの汎用手順を使用して表３、４及び５に示すエ
リトロポエチン類似体を構築した。各類似体毎にDNA配
列変異を示している。また、突然変異誘発に使用したオ
リゴヌクレオチドプライマーはヒトエリトロポエチンの
配列に相補正の配列を有していた。

プラスミドpDSα２の誘導体であるpDECΔにエリトロ
ポエチンcDNAを挿入することによってpDEC−Ｘ（Ｘは類
似体番号）と命名されたプラスミドを構築した。発現ベ
クターpDSα２はPCT特許出願No.WO90/14363に概説され
ている。pDECΔはpDSα２から以下の段階によって誘導
された。

（１）pDSα２のDNAをHind IIIで消化し、Hind III付着
末端を大腸菌のDNAポリメラーゼ（Klenowフラグメン
ト）及びdNTPで処理し、平滑末端化ベクターを再結合す
ることによって、pDSα２のHind III部位を欠失させ
た。得られたプラスミドはpDSα２ΔＨであった。

（２）pDSα２ΔＨをSal Iで消化し、これに、SV40スプ
ライスシグナルをスプライスシグナルの３′端に結合し
たSal Iリンカーと共に有する合成オリゴヌクレオチド
を結合した。合成オリゴヌクレオチドは以下の配列（SE
Q ID.NO:18）を有していた。

得られたプラスミドはpDSα２ΔＨスプライスであっ
た。

（３）pDSα２ΔＨスプライスをSal Iで消化し、T4DNA
ポリメラーゼ及びdNTPで付着末端を処理することによっ
て平滑末端化した。820bpのBamH I−Bgl IIヒトエリト
ロポエチンcDNAフラグメントを同じ方法で平滑末端化
し、プラスミドに結合した。得られたプラスミドはpDEC
p−１であった。

（４）pDECをKpn I及びPvu IIで消化し、付着末端をmun
g beanヌクレアーゼで処理することによって平滑末端化
した。切除したKpnI−Pvu IIフラグメントを欠失させる
ためにプラスミドを再結合させてプラスミドpDECΔを得
た。

BstE IIで完全消化し次いでBgl IIで部分消化するこ
とによってpDECΔからpDEC−Ｘプラスミドを作製した。
エリトロポエチンコーディング配列の欠失したベクター
フラグメントを単離し、所望のプラスミドを含む810bp
のBstE II−Bgl IIIフラグメントに結合した。

複数のアミノ酸変異を有するいくつかの類似体の構築
を以下に詳細に説明する。

pDEC（N47）及びpDEC（N48）の構築 asn30thr32va187asn88及びthr90突然変異を含むpDEC
（N47）を、pDEC（N18）及びpDEC（N4）から構築した。
pDEC（N18）をHind II及びBgl IIで消化し、445bpのフ
ラグメントを単離した。pDEC（N4）をBstE II及びHind
IIIで消化し、377bpのフラグメントを単離した。これら
の２つのフラグメントを、上述のようにBstE II及びBgl
IIで切断したpDECΔに結合してpDEC（N47）を得た。

asn69thr71ser87asn88及びthr90突然変異を含むpDEC
（N48）を、pDEC（N14）及びpDEC（N11）から構築し
た。pDEC（N14）をHind II及びBgl IIで消化し、445bp
のフラグメントを単離した。pDEC（N11）をBstE II及び
Hind IIで消化し、377bpのフラグメントを単離した。こ
れらの２つのフラグメントを、上述のようにBstE II及
びBgl IIで切断したpDECΔに結合してpDEC（N48）を得
た。

pDEC（062）の構築（HCG−エリトロポエチン融合） pEC1と、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端
の28個のアミノ酸（ser−ser−ser−ser−lys−ala−pr
o−pro−pro−ser−leu−pro−ser−pro−ser−arg−le
u−pro−gly−pro−ser−asp−thr−pro−ile−leu−pr
o−gln）（SEQ ID.NO:25）（Pierceら、Ann.Rev.Bioche
m.50,465（1981））を含む107塩基対のStu I−Bgl II合
成DNAリンカーとからpDEC（062）を組立てた。リンカー
の配列を以下に示す。

pEC1をStu I及びBgl IIで消化し、610bpのDNAフラグ
メントを単離した。合成リンカーをATP及びポリヌクレ
オチドキナーゼによってリン酸化し、pEClフラグメント
と共に、上述のように予めBstE IIで消化しBgl IIで部
分消化したpDECΔに結合した。

pDEC（NO1）の構築 pDEC（062）（HCG−EPO）及びpDEC（N14）（Ser⁸⁷Asn
⁸⁸Thr⁹⁰）からpDEC（NO1）を組立てた。pDEC177をStu I
及びBgl IIで消化し、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰突然変異を含む6
10bpのDNAフラグメントをgene−cleanで単離した。pDEC
（062）をStu I及びBgl IIで消化し、107塩基対のフラ
グメントを単離した。これらの２つのDNAフラグメント
を、上述のように予めBstE IIで消化しBgl IIで部分消
化したpDECΔに結合した。

pDEC（NO2）の構築 pDEC（062）（HCG−EPO）及びpDEC（N47）（Asn³⁰Thr
³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰）からpDEC（NO2）を組立てた。pDEC
（N47）をStu I及びBgl IIで消化し、Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷A
sn⁸⁸Thr⁹⁰突然変異を含む610bpのDNAフラグメントを、G
eneClean^TMで単離した。pDEC（062）をStu I及びBgl II
で消化し、107塩基対のフラグメントを単離した。これ
らの２つのDNAフラグメントを、上述のように予めBstE
IIで消化しBgl IIで部分消化したpDECΔに結合した。

pDEC（N16）（Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²）の構築 pDEC（N14）（Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰）及びpDEC258（Ala
¹⁶²）からpDEC（N16）を組立てた。pDEC258は上述のin
vitro突然変異誘発手順を用いて構築し、162位のAGGコ
ドンをGCGに変異させた。pDEC（N14）をStu I及びBgl I
Iで消化し、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰突然変異を含む610bpのDNA
フラグメントをGeneClean^TMで単離した。pDEC258をStu
I及びBgl IIで消化し、210塩基対のフラグメントを単離
した。これらの２つのDNAフラグメントを、上述のよう
に予じめBstE IIで消化しBgl IIで部分消化したpDECΔ
に結合した。

pDEC（R1）、（R2）及び（R3）の構築 pDEC（N14）からグリコシレーション部位を除去する
ために、ser⁸⁷asn⁸⁸及びthr⁹⁰突然変異を含むm13−EPO
（N14）を、以下のプライマーを用いて上述のようにin
vitro突然変異誘発した。

得られたプラスミドを、pDEC（R1）（gln²⁴ser⁸⁷asn
⁸⁸thr⁹⁰）、pDEC（R2）（gln³⁸ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰）及びp
DEC（R3）（gln⁸³ser⁸⁷asn⁸⁸thr⁹⁰）と命名した。ま
た、m13EC−１を上記オリゴヌクレオチドプライマーでi
n vitro突然変異誘発すると、pEC10（gln²⁴）及びpEC8
（gln³⁸）が得られた。プライマーを用いてpEC9（gln⁸³）を構築した。

ヒトエリトロポエチンのcDNAクローン、［Asn⁴,Se
r⁶］EPO、［Asn⁹,Ser¹¹］EPO、［Asn⁶⁹］EPO、［As
n¹²⁴］EPO、［Asn¹²⁵,Ser¹²⁷］EPO、［Asn¹⁶³,Ser¹⁶⁵］
EPO、［Thr¹²⁵］EPO及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPOに対応す
る類似体のcDNAクローン、並びに、表３、４及び５に記
載の類似体のcDNAクローンを、エレクトロポレーション
によってCOS−１細胞（ATCC NO.CRL−1650）に移入し
た。半集密状態のシャーレからCOS−１細胞を採取し、
培地（５％のウシ胎仔血清と１％のＬ−グルタミン／ペ
ニシリン／ストレプトマシン（Irvine Scientific）と
を含むダルベッコの改良必須培地）で洗浄し、４×10⁶
細胞/mlで再浮遊させた。1mlの細胞をエレクトロポレー
ションキュベット（Bio−Rad）に移し、100〜200μｇの
担体DNAと２〜20μｇのエリトロポエチン類似体コーデ
ィングプラスミドDNAとの存在下に、25μファラッド及
び1600ボルトでBio−Rad Gene Pulserによってエレクト
ロポレートした。エレクトロポレートした細胞を5mlの
培地中で60mmの組織培養皿あたり２×10⁶細胞で平板培
養した。２〜４時間の平板培養後、培地を5mlの新鮮培
地に交換した。エレクトロポレーションの３〜５日後に
馴化培地を収集した。

実施例7:エリトロポエチン類似体のキャラクタリゼーシ
ョン A.炭水化物付加の測定実施例６に記載のようなエリトロポエチン類似体cDNA
でトランスフェクトしたCOS細胞から得られた５〜20単
位を含有する量のCOS細胞上清を、ウサギ抗エリトロポ
エチンポリクローナル抗体と共に室温で一夜免疫沈降さ
せた。リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）中の20〜80μｌ
の1:1プロテインＡ−セファロースを免疫沈降物に添加
し、室温で１時間インキュベートした。試料を遠心し、
PBSで洗浄し、指示されている場合にはＮ−結合炭水化
物鎖を除去するためにペレットをＮ−グリカナーゼで処
理した。試料を、15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって分析し、ニトロセルロースに移し、マウ
ス抗エリトロポエチンモノクローナル抗体混合物を用い
て文献に記載のウェスタン分析（Burnetteら、Anal.Bio
chem.112,195−203（1981）;Elliottら、Gene79,167−1
80（1989））によって処理した。このような抗体の１
つ、9G8Aは、Elliottら、（1989）Blood74,Supp.1,A.12
28に記載されている。

［Asn⁶⁹］EPO及び［Asn¹²⁵,Ser¹²⁷］EPOのcDNAでトラ
ンスフェクトしたCOS細胞上清の分析によれば、ヒト配
列エリトロポエチンに比べてタンパク質サイズが増大し
ていた。このサイズ増加は、付加的なＮ−結合炭水化物
鎖の指標となる（図７）。

［Thr¹²⁵］EPO及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPOのcDNAでト
ランスフェクトしたCOS細胞上清をＮ−グリカナーゼで
処理すると、ヒト配列エリトロポエチンに比べてタンパ
ク質サイズが増大していることが判明した。このサイズ
増加は、付加的なＯ−結合炭水化物鎖の指標となる（図
８）。選択されたその他の類似体のウェスタンブロット
分析を図10に示す。

EPOに結合したＮ−結合炭水化物鎖の数を測定するた
めに、Ｎ−グリカナーゼによる部分消化を実施した。類
似体またはrHuEPOをCHO細胞中で発現させ、無血清の馴
化培地を収集した。試験管に40単位のEPO（H₂Oで15μｌ
の量に調整）を入れ、各試験管に10μｌの0.5％SDSを添
加し、各試料を３分間沸騰させた。次いで、以下の成
分、即ち10.8μｌの0.5MのNaPO₄,pH8.6、５μｌの7.5％
のnonidet P40及び1.5μｌの250単位/mlのＮ−グリカナ
ーゼ（Genzyme）を添加した。試料を37℃で指定時間イ
ンキュベートした。SDS−PAGE試料緩衝液（上記参照）
を添加して反応を停止させ、次いで抗EPOポリクローナ
ル抗体及び抗ウサギVectastain^TMキット（Vector labor
atories）を用い、４−クロロナフトールを基質としてS
DS−PAGEウェスタン分析（10％アクリルアミド）処理し
た。この方法によるヒトエリトロポエチン及び類似体N1
4のＮ−結合鎖の分析を図11に示す。

B.エリトロポエチン類似体活性アッセイ Egrieら、前出、に従ってRIAを実施した。CLINIGEN^TM
EIAキット（Ｒ及びＤシステム）を製造業者から提供さ
れた手順で用いてEIAを実施した。低酸素症でない赤血
球増加症マウスのバイオアッセイ（Cotesら、前出）を
用い、エリトロポエチン類似体を発現するCHO細胞の上
清または後術するようなCHO細胞馴化培地から得られた
精製エリトロポエチンを用いてエリトロポエチン類似体
のin vivo生物活性を測定した。

Iscoveら、J.Cell Physiol.83,309−320（1974）に記
載の方法に修正を加えた赤血球系コロニー形成アッセイ
によって、in vitroエリトロポエチン活性を測定した。
ヒト骨髄細胞の単核細胞を、ficoll−paqueクッション
で部分精製し、Iscove培地中で洗浄後、付着細胞を除去
するために平板培養した。培養培地は0.9％のメチルセ
ルロースを含有していたがウシ血清アルブミンは全く含
んでいなかった。８〜10日間培養後に赤血球系コロニー
数を測定した。

実施例６に記載のようなCOS細胞にトランスフェクト
され発現されたエリトロポエチン類似体を、粗COS細胞
上清中でRIA、EIA及び赤血球系コロニー形成アッセイを
用いて分析した。これらのアッセイによれば、精製ヒト
配列エリトロポエチンは、RIA活性と同等のin vitro活
性を有している。類似体［Asn⁶⁹］EPO、［Thr¹²⁵］EPO
及び［Pro¹²⁴,Thr¹²⁵］EPOはRIA活性と同等のin vitro
活性を示し、これは（前項Ａで測定したような）付加的
炭水化物鎖を有する証拠となる。［Thr¹²⁵］EPO及び類
似体N4、N11、N14、N16、N18、N47、N48、062、N01及び
NO2を更に分析するために、エリトロポエチン類似体を
コードするcDNAクローンをCHO細胞にトランスフェクト
し、CHO細胞上清をRIAまたはEIA及びin vivo生物アッセ
イにかけた。結果を表６に示す。CHO細胞上清中で発現
された類似体R1、R2及びR3のin vivo活性を表７に示
す。

表６の脚注^ａ実施例7Aに記載のようなSDSゲル中の類似体ポリペプ
チドの移動度に基づいて、付加的なＮ−結合鎖の数を推
定した。^ｂエリトロポエチン類似体の量に対する類似体のin viv
o活性の比。マウス赤血球増加症のバイオアッセイを用
い、CHO細胞上清中の類似体の活性を測定した。CHO細胞
上清中のエリトロポエチン類似体の量を本明細書中に記
載のようなRIAまたはEIAによって測定した。^ｃ実施例7Aに記載のようなＮ−グリカナーゼによる部分
消化後のSDS−ゲル中の糖タンパク質の泳動を試験する
ことによって付加的炭水化物鎖の数を確認した。^d Ser¹²⁶のＯ−結合鎖はヒトエリトロポエチン分子の70
％に存在する。^e O−グリコシレーションが減少した類似体分子の70％未
満はSer¹²⁶に炭水化物鎖を有している。^f 60％を上回るThr¹²³EPO分子が２つのＯ−結合鎖を有し
ている。約40％のThr¹²⁵EPO分子が２つのＯ−結合鎖を
有している。80％を上回るPro¹²⁴Thr¹²⁵EPO分子が２つ
のＯ−結合鎖を有している。^ｇこれらの類似体は少なくとも３つのＯ−結合鎖を有し
ており、４個または５個有することもある。HCG単独で
は４個のＯ−結合鎖を有することが判っている。

N.T.試験せず。

C.エリトロポエチン類似体に由来のイソ形混合物の調製［Thr¹²⁵］EPO（EPO050）実施例６の［sectionA］に記載のようにエリトロポエ
チン類似体［Thr¹²⁵］EPOを構築した。［Thr¹²⁵］突然
変異を含むプラスミドpECをBstE II及びBgl IIで開裂
し、フラグメントをpDECΔ［pDSα２の誘導体］（実施
例６に記載）に結合することによって、［Thr¹²⁵］突然
変異を含む810bpのエリトロポエチンcDNAフラグメント
を単離した。

［Thr¹²⁵］エリトロポエチンcDNAを含むプラスミドpD
ECΔをDHFR欠失CHO細胞にトランスフェクトした。770ml
のCHO細胞馴化培地を、カットオフ分子量10,000ダルト
ンの膜を用いて濃縮し、10mMのTris−HCl,pH8.6に対し
最終容量34mlまで透析濾過した。濃縮物の17mlのアリコ
ートを、同じ緩衝液で平衡させたＱ−セファロースFast
Flowカラム（ベッドボリューム5ml）に充填し、10mMの
Tris−HCl,pH8.6中Ｏ−250mMのNaClの直線勾配で溶出さ
せた。カラム分画のアリコートを、非処理でまたはＮ−
グリカナーゼで消化後、SDS−PAGEまたはIEFによって分
析し、分画のイソ形及び／または炭水化物組成に基づい
てプールを作製した（２、３及び４と命名）。各プール
をVydac C4カラム（214TPB2030;直径1cm;ベッドボリュ
ーム1.8〜2.5ml;0.34ml/分）に充填し、10mMのTris−HC
l,pH7.0中のカラム容量の２倍の20％エタノールで洗浄
した。10mMのTris,pH7.0中の2O−94％のエタノールの直
線勾配でカラムを溶出させた。プールを作製し、10mMの
Tris−HCl,pH7.0に希釈し、Ｑ−セファロースFast Flow
カラムに充填した。10mMのTris−HCl,pH7.0中で洗浄
後、試料を20mMのクエン酸ナトリウム、250mMのNaCl,pH
7.0で溶出させた。精製した［Thr¹²⁵］プールをIEFによ
って分析し図９に示す。更に、上述の方法（Cotesら、
前出）でこれらのプールのin vivo生物活性を分析し、
結果を表８に示す。

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO（EPO N14）調製方法１イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィー及びゲル濾過クロマトグラフィーから成る３段階手
順を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階
中に、高レベルのシアル酸を含むイソ形の混合物を与え
る分画をプールした。逆相クロマトグラフィー中に、類
似体を凝集物と共に含むかまたは凝集物を伴わずに含む
追加の２つのプールを作製した。精製手順を以下に詳細
に説明する。

1.EPO N14類似体を発現するCHO細胞の馴化培地を採集
し、YM10膜（Amicon）と共に撹拌槽を用いて約2.5倍に
濃縮し、10mMのTris,pH8.5に対し透析濾過した。

2.濃縮培地を、10mMのTris,pH8.5中で平衡化させたＱ−
セファロースFF（Pharmacia）カラムに、流速0.2cm/分
で、樹脂1mlあたりA₂₈₀が〜12となるように充填した。

3.充填後、カラム容量（CV）の３倍の10mMのTris,pH8.5
でカラムを洗浄し、50CV中のＯ−0.5MのNaCl/10mMのTri
s,pH8.5の勾配で溶出させた。1CVの分画を収集した。

4.各分画の試料をIEFゲルpH3〜５に添加した。IEF上の
イソ形分布に基づいて、主としてイソ形11〜18を含む分
画プールを作製した。EDTAを最終濃度1mMまでプールに
添加した。

5.20％エタノール/10mMのTris,pH7.0中で平衡化させた
逆相C4カラム（Vydac）に、イソ形プールを流速2.5cm/
分で樹脂1mlあたりA₂₈₀が〜５となるように充填した。
カラムを1CVの20％エタノール/10mMのTris,pH7.0で洗浄
し、30CV中の20〜94％エタノール/10mMのTris,pH7.0の
勾配で流速1cm/分で溶出させた。0.2CVの分画を収集し
た。

6.各分画の試料を非還元性12％SDS−PAGEによって分析
した。SDSゲル上に観察された凝集物の存在に基づいて
個々の２つのプールを作製した。プール＃１はEPO類似
体を含んでいたが凝集物を含んでいなかった。プール＃
２はEPO類似体と凝集物とを含んでいた。

7.Centricon10（Amicon）を用いてプール＃１を約65倍
に濃縮し、プール＃２を約250倍に濃縮した。各プール
の緩衝液を20mMのクエン酸ナトリウム/100mMのNaCl,pH
7.0に交換した。

8.20mMのクエン酸ナトリウム/100mMのNaCl,pH7.0中で平
衡化させたHPLC BioSil SEC−250（BioRad）カラムで各
プールを個別に精製した。プールを流速2.26cm/分で樹
脂1mlあたりA₂₈₀が＜６となるように充填した。類似体
モノマーに対応するピークを各処理試料から収集した。

9.各プールの吸光度を測定し、各プールの一部分を濃縮
してSDS−PAGE及びIEFゲルで分析した。プール＃１はイ
ソ形15−17の分布を有しており、このプールを薬物動態
試験及び受容体結合試験に使用した。

調製方法２イオン交換クロマトグラフィー、逆相HPLC及びヒドロ
キシルアパタイトクロマトグラフィーから成る３段階手
順を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階
中に、類似体を、異なるイソ形混合物を含む３つのプー
ルに分割した。精製手順を以下に詳細に説明する。

1.EPO N14を発現するCHO細胞の上清を採集し、Filtro M
ini−Ultrasette正接流デバイスを用いて約10倍に濃縮
し、10mMのTris,pH8.5に対し透析濾過した。

2.10mMのTris,pH8.5中に平衡化させたＱ−セファロース
FF（Pharmacia）カラムに濃縮培地を流速0.2cm/分で樹
脂1mlあたりA₂₈₀が〜10となるように充填した。

4.各分画の試料をIEFゲル,pH3〜５で泳動した。IEFによ
って測定したイソ形分布に基づいて個々の３つの分画プ
ールを調製した。低イソ形プール（イソ形４〜12）、中
イソ形プール（イソ形５〜15）及び高イソ形プール（イ
ソ形６〜18）を作製した。

5.各イソ形プールをVydac C4逆相HPLCカラムで個別に精
製した。アセトニトリルが毎分１％の割合で増加する0.
1％TFA/H₂Oから0.1％TFA/75％アセトニトリルまでの勾
配でカラムを展開させた。

6.各プールから類似体のピークを収集し、４倍容の80mM
のTris−HCl/20mMのTris塩基で希釈し、次いで濃縮し、
溶媒耐性Centricon3を用いて緩衝液を10mMのTris,pH7.2
に交換した。

7.各試料を1mlあたりのA₂₈₀が２になるまで10mMのTris,
pH7.2で希釈し、等量の4MグアニジンHCl（GuHCl）、10m
MのCHAPS、10mMのTris,pH7.2を添加して、試料の採集濃
度を1mlあたりのA₂₈₀が１になるようにした。各試料を2
MのGuHCl、5mMのCHAPS、10mMのTris,pH7.2で平衡化させ
たヒドロキシルアパタイトミニカラムに充填した。平衡
緩衝液でカラムを洗浄し、1CVの素通り分画を収集し
た。

8.分画の吸光度を測定し、プールを作製し、Centricon1
0を用いて緩衝液を10mMのTris,pH7.2に交換した。各プ
ールの吸光度を測定した。

最終プールをSDS−PAGE及びIEFゲルで分析した。IFE
ゲルを図12に示す。RIA及びin vivo活性アッセイを実施
例7Aに記載の手順で行った。最終イソ形プールのin viv
o活性を表８に示す。マウスのヘマトクリット増加を測
定する試験に高シアル酸イソ形プールを使用した。

実施例8:EPO N14類似体の生物学的特性 EPO N14類似体のイソ形プール、組換えヒトエリトロ
ポエチン（rHuEPO）及び単離rHuEPOイソ形14の活性i.v.
薬物動態アッセイ、受容体結合アッセイ及びヘマトクリ
ット試験で比較した。EPO N14イソ形プールは、実施例7
Cに記載の手順で調製した。rHuEPOは、Laiら、前出、に
従って調製した。rHuEPOイソ形14は、以下の手順で調製
した。イソ形10、11、12、13、14及び15の混合物から成
るrHuEPOを、10mMのTris,pH7.2中で平衡化させたＱ−セ
ファロースFast Flowカラム（寸法＝直径2.2cm×高さ3.
4cm）に充填した。充填カラムを2mMの酢酸/6Mの尿素
（緩衝液「Ａ」）に平衡化させ、イソ形13及び14の精製
を最適にするように設計された多相勾配を実施した。勾
配は、750ml中０％−7.3％の800mM酢酸/6M尿素（緩衝液
「Ｂ」）、750ml中7.3％−11.4％の緩衝液Ｂ、1250ml中
11.4％−26.8％の緩衝液Ｂ、1250ml中26.8％−62.4％の
緩衝液Ｂ、次いで700ml中62.4％−100％の緩衝液Ｂであ
った。12.5mlの分画を収集し、アンモニア水で中和し、
次いでポリアクリルアミドゲル中の等電点電気泳動によ
って検定した。純粋なイソ形14を含む分画を一緒にプー
ルし、YM−10膜を備えたAmicon撹拌槽で濃縮し、緩衝液
を水に交換した。

A.i.v.薬物動態 EPO N14類似体（イソ形15〜17）及び単離イソ形14の
薬物動態パラメーターをrHuEPOのものと比較するために
個々の２つの試験を実施した。

各試験で、１μCiの¹²⁵I−単離イソ形14、¹²⁵I−EPO
N14類似体または¹²⁵I−組換えヒトエリトロポエチン（A
mersham）を、頚動脈カニューレによって体重310〜378g
の雄スプレーグ・ドーリーラットに静注した。投与後の
種々の時点に、0.3mlの血液を採取し、遠心によって血
清を調製した。0.1mlの各血清試料中の¹²⁵I−EPO（組換
えヒト、単離イソ形14またはEPO N14類似体）濃度を、9
0％エタノールと共に４℃で一夜インキュベーション後
に測定した。各血清試料中のエタノール沈殿した¹²⁵I−
EPOをガンマカウンタでカウントし、得られた薬物動態
グラフを図13に示す。PCNONLIN4.0非線形回帰分析（Sta
tistical Consultants,1992）を用いて各ラットの薬物
動態パラメーターを測定し、各グループの結果を平均化
した。EPO N14類似体及び単離イソ形14の薬物動態試験
の結果を表９にまとめる。

表９に示すように、EPO N14類似体の血清クリアラン
スは組換えヒトエリトロポエチンの計算値に比較して有
意な差を示す。組換えヒトエリトロポエチンは、単離イ
ソ形14の3.97時間及びEPO N14類似体の4.36時間に比べ
て3.10時間という最も速いベータ半減期を示した。組換
えヒトエリトロポエチングループはまた、単離イソ形14
の2.40時間及びEPO N14類似体の3.03時間に比べて1.78
時間という最速のクリアランス半減期を有していた。

B.受容体結合アッセイ EPO N14類似体（イソ形15〜17）とエリトロポエチン
受容体との相互作用を、ヒト赤白血病OCIMI細胞（Papay
annopoulouら、Blood64（supp.1）,116a（1984））を用
いた低温置換アッセイで試験した。受容体との結合にお
いて¹²⁵I−rHuEPOと競合するEPO N14の必要量を決定す
るために、漸増濃度の非標識EPO N14を一定濃度の¹²⁵I
−rHuEPOと共にOCIM1細胞とインキュベートした。比較
として、漸増濃度の非標識rHuEPOも一定濃度の¹²⁵I−rH
uEPOと競合させた。

非標識EPO N14をアッセイ緩衝液に希釈し、0.03ng、
0.1ng、0.3ng、1.0ng、3.0ng、10.0nm及び30.0ng（ペプ
チド質量に基づく）の量で添加した。全部のアッセイ管
に、0.5ngの¹²⁵I−組換えヒトEPOを添加し、次いで約0.
5×10⁶のOCIM1細胞を添加した。アッセイ管を次に、振
盪水浴中で37℃で２時間インキュベートした。インキュ
ベーションの後、OCIM1細胞に結合した¹²⁵I−rHuEPOか
ら未結合の125I−rHuEPOを分離するために、溶液をジブ
チルフタレート／ビーフタレート油溶液中で遠心した。
細胞ペレットを単離し、細胞に結合した¹²⁵I−rHuEPOを
ガンマカウンティングによって測定した。細胞に特異的
に結合したカウント数を計算し、競合物質の非存在下で
¹²⁵I−rHuEPOの50％結合に競合するために必要な非標識
タンパク質の濃度を線形回帰分析によって決定した。

３つのアッセイの結果は、OCIM1細胞への¹²⁵I−rHuEP
Oの結合を50％減少させるために平均2.67±0.73ngの非
標識EPO N14ペプチドが必要であることを示した。同じ
３つのアッセイにおいて、0.5ngの¹²⁵I−rHuEPO結合と
競合するために必要な非標識rHuEPOは平均0.51±0.15ng
であった。これらの結果に基づくと、EPO受容体への結
合において¹²⁵I−rHuEPOと競合するためには、非標識ｒ
−HuEPO（ｐ＜0.01）の5.25倍のEPO N14が必要であっ
た。

エリトロポエチン受容体との結合に関してEPO N14類
似体、単離イソ形14及び組換えエリトロポエチンを直接
比較するために追加実験を実施した。この実験の結果
は、EPO N14類似体が受容体に対して単離イソ形14より
も低い親和性を有していることを示した。受容体との結
合において¹²⁵I−rHuEPOと競合するためには、非標識イ
ソ形14の約２倍過剰のEPO N14類似体が必要であった
（図14）。

C.ヘマトクリット試験（実施例7Cに記載の調製物２から得られた）EPO N14
の高イソ形プール及び低イソ形プール、単離イソ形14並
びに組換えヒトEPOの処理マウスヘマトクリット増加能
力を比較するためにin vivo試験を実施した。この試験
で使用したEPO N14の高イソ形プール及び低イソ形プー
ルのイソ形分布を図12に示す。

CD1マウス（約30g）に、0.25％マウス血清アルブミン
中で調製された上記調製物の１つ、またはプラシーボ
（0.25％マウス血清アルブミンを含むPBS）を毎週３回
ずつ合計６週間腹腔内注射した。ペプチド質量に基づく
エリトロポエチン調製物の投与量は、30gのマウスがEPO
N14の高プール、EPO N14の低プール、イソ形14及びｒ
−HuEPO標準の各々を投与あたり0.071μｇ受容する量と
した。EPO N14の高プール及びイソ形14の場合には、ペ
プチド投与量を投与あたり0.036μｇとした追加グルー
プも試験した。眼窩後方から採血することによって全部
のマウスのヘマトクリットの基線量を測定しその後毎週
２回測定した。実験の終了後、全部の動物から血清を収
集し、注射物質に対する抗体を検定した。抗体中和が陰
性であると判定された動物で得られたデータを以後の分
析に使用した。

図15に示すように、EPO N14の高イソ形プールで処理
した動物は、他の調製物に比較して最高の群平均ヘマト
クリットに達した。イソ形14、組換えヒトEPO及びEPO N
14の低イソ形プールではヘマトクリットが増加していた
が増加の程度はもっと低かった。

種々のエリトロポエチン調製物をより定量的に比較す
るために、ヘマトクリット増加の平均初期速度（０〜11
日）、グラフ下方の面積（０〜39日）及び総ヘマトクリ
ット増加を計算した（表10）。これらの判定基準のいず
れによっても、EPO N14の高イソ形プールは、試験した
他の調製物のどれよりもペプチドの基準質量で活性であ
ると考えられる。EPO N14の高イソ形プール及びイソ形1
4は組換えヒトEPOよりも活性であった。EPO N14の低プ
ールはどの分析物と比較したときにも最低の活性を有し
ていた。

本発明を好ましい実施態様に基づいて説明してきた
が、本発明は、開示された実施態様に限定されることな
く、逆に、請求の範囲の思想及び範囲に包含される種々
の修正及び均等を包含する。請求の範囲は、かかる修正
及び均等をすべて包含する最も広い範囲に解釈されるべ
きである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献欧州公開428267（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．254［16 ］（1979）ｐ．7909−7914 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．263［33 ］（1988）ｐ．17516−17521 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列中88
位のトリプトファンがアスパラギンで置換された少なく
とも１つの付加的グリコシレーション部位を含み且つこ
の部位に炭水化物鎖が結合しているエリトロポエチン活
性を有するヒトエリトロポエチン類似体であって、［Va
l⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰］EPO、［Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰］EPO、［Ser
⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²］EPO、［Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr
⁹⁰］EPO、並びにこれらのEPO類似体と同等の活性を有し
これらのEPO類似体のアミノ酸配列中の１個以上のアミ
ノ酸が置換、欠矢又は付加された変異体から選択される
ことを特徴とする、前記類似体。
【請求項２】ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列中30
位のアラニンがアスパラギンで置換されていることを特
徴とする請求項１に記載のヒトエリトロポエチン類似
体。
【請求項３】［Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰］EPOである
ことを特徴とする請求項１に記載のヒトエリトロポエチ
ン類似体。
【請求項４】請求項３に記載のヒトエリトロポエチン類
似体をコードするDNA。
【請求項５】請求項４に記載のDNAを含むベクターでト
ランスフェクトされた真核宿主細胞。
【請求項６】請求項５に記載の真核宿主細胞を培養する
ことにより得られる、エリトロポエチン活性を有する糖
タンパク質。
【請求項７】治療有効量の請求項１、２若しくは３に記
載のエリトロポエチン類似体、又は請求項６に記載のエ
リトロポエチン活性を有する糖タンパク質を、医薬とし
て許容される希釈剤、アジュバント又は担体と共に含
む、赤血球細胞の産生を増進するための医薬組成物。