CN107074928B - 新型猫促红细胞生成素受体激动剂 - Google Patents

Abstract

本说明书公开了促红细胞生成素受体激动剂、包含所述促红细胞生成素受体激动剂的组合物和药物，所述促红细胞生成素受体激动剂、组合物和药物的方法和用途，以及促红细胞生成素受体激动剂、组合物和药物用于治疗贫血症的方法和用途。

Description

新型猫促红细胞生成素受体激动剂

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35U.S.C.§119(E)要求优先权，并有权享受2014年9月18日提交的美国临时专利申请62/052,407的申请日的权益，在此通过引用的方式明确将其内容全部并入本文中。

序列表的引用

经USPTO EFS-WEB服务器提交的以下电子版序列表的全部内容，如MPEP§1730II.B.2(A)(C)中所授权和阐述的，在此通过引用的方式整体并入本文中用于所有目的。序列表在电子提交的文本文件上标识如下：文件名：SEQLIST-3IPAG3-0003WO；创建日期：2014年9 月15日；大小(字节)：17KB。

介绍

非再生性贫血(NRA)是猫、狗和其它哺乳动物中的一种严重疾病，并且没有足够的治疗方法。促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白类激素，为调节红细胞生成(红血细胞产生)的最重要激素。重组人EPO产品例如非糖基化的

和糖基化的

(达贝泊汀，Darbepoetin)已经可商业化购买用于治疗人NRA。人EPO是一种高度糖基化的蛋白，分子量为30.4kD。EPO基因的5个外显子编码193个氨基酸，其中有27个氨基酸随后被切除，产生166个氨基酸长度的肽，但循环肽含有165个氨基酸。成熟的EPO循环肽结构包括165 个氨基酸的骨架，以及三个连接到在氨基酸第24、38和83位的天冬酰胺的N-连接糖链和一个连接到Ser¹²⁶的O-连接糖链。165个氨基酸占了EPO分子量的60％，糖链占40％。糖链具有延伸和柔性结构，因此它们可能覆盖分子的大部分表面。

糖链残基允许形成许多可能的异构体并且显著有助于激素在体内的血清半衰期和生物活性。唾液酸含量提高的异构体具有更长的血清半衰期和降低的受体结合亲和力。对于EPO来说，血清半衰期是体内活性的主要决定因素。达贝泊汀(Darbepoetin)是通过两个氨基酸残基的定点突变产生，含有两个额外的N-连接糖链。相对血清半衰期、受体结合亲和力和生物活性如图1所说明。

据估计，在美国有超过50-100万的家猫患有NRA。基于一项兽医调查，许多病症与猫 NRA相关，且/或可导致猫NRA发生，包括慢性肾衰竭(51％)、癌症(16％)、逆转录病毒疾病(11％)、甲状腺机能亢进(5％)、炎症性肠病(4％)以及其他各种慢性病症(6％)或多种其他病症(6％)。与人类相似，慢性肾脏疾病和癌症是NRA的两个主要原因。

猫NRA目前还未得到充分治疗。内部调查表明，目前可用的NRA治疗包括

或其他非糖基化人重组EPO(39％)、糖基化重组EPO

(5.7％)、皮质类固醇(32.5％)、输血(6.7％)、合成代谢类固醇(1.4％)以及其他各种治疗(5.3％)。然而，在一些猫中常常产生抗人类蛋白质的抗体，其导致严重的病症，包括在25-30％猫中发生的纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)。

在猫中可能具有低的PRCA发生率，估计低于 10％，但这一比例仍然是显著的。第二最常用的选择是类固醇，其常导致严重的副作用和可疑的治疗功效。输血不方便并且昂贵。因此，目前对于猫的NRA治疗来说仍存在迫切的未满足的兽医需求。

迄今为止，通过商业途径还不能获取猫的物种特异性EPO。猫EPO与人EPO仅有大约83％相似。生产重组猫EPO，并在猫中测试。不幸的是，观察到红细胞再生障碍性贫血以与重组人EPO相似的比率发生。因此，添加未修饰的重组猫EPO不会解决这种未满足的兽医需求。

基于肽的促红细胞生成素受体(EpoR)激动剂也已有开发，如美国专利6,703,480中所公开的。在小型临床试验中，基于肽的EpoR激动剂也显示对于人的红细胞再生障碍性贫血有效。因为基于肽的EpoR激动剂不与EPO具有任何序列相似性，所以认为其不会诱导红细胞再生障碍性贫血。然而，在兽医应用中使用基于肽的EpoR激动剂的研究还未见有报道。此外，超敏反应在使用聚乙二醇化的基于肽的EpoR的少数患者中也有报道。

本说明书公开了猫、狗和其它哺乳动物的新型EpoR激动剂。在一个实施例中，对猫EPO 进行修饰以添加一个、两个、三个和/或更多个N-连接糖基化位点，与猫EPO或人EPO相比，其具有更低的免疫原性和更长的血清半衰期。在另一个实施例中，肽EpoR激动剂与猫IgG Fc 融合形成融合蛋白，所述融合蛋白在治疗猫NRA中是安全和有效的。

概述

本说明书一方面公开了一种修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。通过添加或重新定位至少一个糖基化位点获得所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素可以为猫促红细胞生成素或犬促红细胞生成素或其变体。添加的或重新定位的糖基化位点可以位于哺乳动物促红细胞生成素的羧基末端区域，或插入位于哺乳动物促红细胞生成素序列中的氨基酸之间。所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素可进一步包含人绒毛膜促性腺激素的片段和/或至少一个连接到所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的额外糖链。

本说明书的其它方面公开了一种编码所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的核酸序列以及包含所述核酸序列的载体和含有所述载体的宿主。

本说明书的其它方面公开了一种包含所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的组合物。所述组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

本说明书的其它方面公开了所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素在制备用于治疗非再生性贫血(NRA)的药物中的用途。

本说明书的其它方面公开了一种在哺乳动物中治疗非再生性贫血(NRA)的方法。本文公开的治疗方法包含向有需要的受试者施用有效量的所公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。受治疗的哺乳动物可以是猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类动物或猪。

本说明书的其它方面公开了所述修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素用于治疗非再生性贫血(NRA)的用途。

本说明书的其它方面公开了一种融合蛋白，其包含肽、接头和Fc片段，所述肽通过接头与Fc片段融合。所公开的肽可以是氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少70％序列同一性的的肽，氨基酸序列为SEQ ID NO：5或者序列与SEQ ID NO：5具有至少70％序列同一性的的猫EPO，氨基酸序列为SEQ ID NO：6或者与SEQ ID NO：6具有至少70％序列同一性的修饰的猫EPO。所公开的Fc片段具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的序列。所述肽的C末端可以通过接头与Fc片段的N末端融合，或者所述肽的N末端可以通过接头与Fc片段的C末端融合。

本说明书的其它方面公开了一种编码所述融合蛋白的核酸序列以及包含所述核酸序列的载体和含有所述载体的宿主。

本说明书的其它方面公开了一种包含所述融合蛋白的组合物。所述组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

本说明书的其他方面公开了所述融合蛋白在制备用于治疗非再生性贫血(NRA)的药物中的用途。

本说明书的其他方面公开了一种在哺乳动物中治疗非再生性贫血(NRA)的方法。本文所公开的治疗方法包括向有需要的受试者施用有效量的所公开的融合蛋白。受治疗的哺乳动物可以是猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类动物或猪。

本说明书的其他方面公开了所述融合蛋白用于治疗非再生性贫血(NRA)的用途。

附图说明

图1显示了修饰的重组EPO(rHuEPO)的生物化学和生物学性质，其含有4个和5个N-连接糖链。

图2A- B 显示了本文公开的一个实施例，其中EpoR激动剂肽可选地通过肽接头与Fc结构域的N末端或C末端融合。

图3显示了克隆的分批培养结果。

图4A显示了活细胞密度随时间的变化曲线图；图4B显示细胞百分比活力随时间的变化曲线图；图4C显示了滴度水平随时间的变化。

图5显示了TF1 EPO生物学活性测定的结果。

发明详述

本文公开了EpoR蛋白激动剂，其为修饰的非人类哺乳动物EPO，包含具有至少一个添加的和/或至少一个重新定位的糖基化位点的非人类哺乳动物促红细胞生成素序列。所公开的 EpoR蛋白激动剂具有降低的诱导红细胞再生障碍性贫血发生的可能性并且在血清中具有更长的半衰期，允许每周给药。所述EpoR蛋白激动剂引发、促进或增强生物学活性。例如，EpoR 蛋白激动剂可以是生物活性配体，其结合与其互补的生物活性受体并激活后者，从而在受体中引起生物学反应或增强受体的预先存在的生物学活性。

非再生性贫血(NRA)涉及红细胞产生减少。贫血为红血细胞(红细胞)数量低于正常的病症，可以有许多临床表现。受影响的动物常遭受精力水平下降、牙龈苍白或发黄、心率增加以及运动受限困扰。猫NRA可由慢性肾脏疾病、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒以及癌症引起。

纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA或RCA)或成红细胞减少症是指影响红细胞前体而非白细胞前体的一类贫血。在PRCA中，骨髓停止产生红细胞。预先用例如重组人EPO治疗猫可导致产生抗外部人EPO和内源猫EPO的抗体，其可引起猫RCA发生。

本文公开的EpoR蛋白激动剂为修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其具有至少一个额外的糖基化位点和/或至少一个重新定位的糖基化位点。比天然促红细胞生成素相比，所添加的糖基化位点可使糖链数更多，唾液酸含量更高。本发明还提供包含包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。本发明还包括包含在促红细胞生成素的羧基末端添加一个或多个氨基酸的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述添加提供至少一个糖基化位点。

本说明书涵盖修饰的非人类哺乳动物EPO。修饰的非人类促红细胞生成素与天然哺乳动物EPO或天然哺乳动物EPO的片段具有足够的同源性，使得修饰的EPO对哺乳动物EpoR有激动剂活性。一方面，修饰的EPO具有非天然存在的氨基酸序列和/或非天然存在的糖基化模式。哺乳动物EPO可来自一种哺乳动物，包括猫、犬、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类动物、猪、西伯利亚虎、大熊猫或太平洋海象。

本文所述的修饰可以基于核苷酸或氨基酸水平上的序列差异。修饰的核酸和/或氨基酸序列是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而与天然序列不同的序列。在一个实施例中，修饰为点突变。本文的修饰也可包括添加在天然宿主生物体中不存在的糖基化、截短蛋白(即，蛋白片段)和/或结合或以其它方式连接到额外的氨基酸、核苷酸或核苷酸序列、核酸适配体、标签、药物、抗体等。

在一个实施例中，本文公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素可以具有1-17个氨基酸添加、缺失或取代。一方面，修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素具有至少1个、至少 2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。取代可以是保守的或者非保守的。另一方面，修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素可以具有最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多 12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。另一方面，修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素可以具有1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、 1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、 2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、 3-5、3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、 5-15、5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、 6-10、6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、 8-14、8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、 10-15、10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、 12-14、12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。

在一个实施例中，本发明修饰的非人类哺乳动物EPO包括由符号Xaa^数字表示的一组取代，其中Xaa是待取代的氨基酸的三字母密码，并且数字是氨基酸基于哺乳动物EPO序列取代入其中的位置。在该实施例的一些方面，哺乳动物促红细胞生成素是猫促红细胞生成素，其中用天冬酰胺残基取代在第30、51、57、69、88、89、137或139位中的任一个或多个位置处的氨基酸残基。在该实施例的其他方面，哺乳动物促红细胞生成素是猫促红细胞生成素，其中用丝氨酸或苏氨酸残基取代第126位的氨基酸残基。

在一个实施例中，哺乳动物促红细胞生成素是猫促红细胞生成素。在该实施例的一方面，猫EPO为具有SEQ ID NO：5所示序列的猫EPO、其片段或其变体，其中第18位的Xaa选自 E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的其他方面，本文公开的猫EPO与SEQ IDNO：5可能具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的又一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO：5可以具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17 个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的再一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO：5可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多 9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为 K或不存在。在该实施例的另一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ IDNO：5可以具有例如 1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、 2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、 3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、 4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、 7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、 11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或者非保守的。

在该实施例的一方面，猫EPO为具有SEQ ID NO：6所示序列的猫EPO、其片段或其变体，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的其他方面，本文公开的猫EPO为与SEQ ID NO：6具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％序列同一性的猫EPO，其中第18位的Xaa选自E 或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的又一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO：6可以具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的再一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO： 6可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14 个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E 或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的另一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO：6可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、 1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、 2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-17、4-16、 4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、 5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、6-9、6-8、6-7、 7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、 8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、 10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-17、 13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或者非保守的。

在另一个实施例中，修饰的哺乳动物促红细胞生成素是犬促红细胞生成素。在该实施例的一方面，修饰的犬EPO为具有SEQ ID NO：10所示序列的犬EPO，或其片段或其变体。在该实施例的一些方面，本文公开的犬EPO与SEQ ID NO：10可以具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在该实施例的又一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：10可以具有例如至少1个、至少2个、至少3 个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11 个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的再一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：10可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多 10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的另一方面，本文公开的犬EPO 相对于SEQ ID NO：10可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、 1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、 2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、 3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、 5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、 6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、 8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、 10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、 12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

在另一个实施例中，修饰的哺乳动物促红细胞生成素是犬促红细胞生成素。在该实施例的一方面，修饰的犬EPO为具有SEQ ID NO：11所示序列的犬EPO、其片段或其变体。在该实施例的一些方面，本文公开的犬EPO与SEQ ID NO：11可以具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在该实施例的又一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：11可以具有例如至少1个、至少2个、至少3 个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11 个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的再一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：11可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多 10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的另一方面，本文公开的犬EPO 相对于SEQ ID NO：11可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、 1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、 2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、 3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、 5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、 6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、 8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、 10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、 12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

本文公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素可以是糖基化的或非糖基化的。亦即，一个或多个糖残基或糖链可以连接到修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的糖基化位点。这种糖基化可以在修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的翻译和装配期间或之后通过酶促糖基化进行。通常糖基化位点的结构针对糖残基或聚合物的连接。“聚合物”是通过两个或两个以上单体的共价连接形成的分子，其中单体中没有一个是氨基酸残基。该术语旨在涵盖通过体外糖基化连接的糖分子或链，体外糖基化亦即在体外进行的合成糖基化，其通常涉及将糖分子共价连接到多肽的连接基团，交联剂可选择性地使用。

在一个实施例中，糖的连接为O-连接或N-连接。O-连接的糖苷通常连接在特定的氨基酸残基，诸如丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸。在一个实施例中，丝氨酸或苏氨酸的添加或重新定位可给哺乳动物促红细胞生成素添加一个糖基化位点。N-连接的糖苷链通常连接在特定的氨基酸序列，诸如Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys。如在本文中使用的Xaa可以是任何氨基酸。

本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO包括至少一个额外的和/或至少一个重新定位的糖基化位点。在一个实施例中，将糖基化位点添加到哺乳动物促红细胞生成素，产生本文公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。这种添加可以通过在哺乳动物促红细胞生成素的任一末端添加氨基酸残基，通过在哺乳动物促红细胞生成素的内部氨基酸之间添加氨基酸残基，或者通过用可连接糖苷链的氨基酸取代哺乳动物促红细胞生成素中的一个或多个氨基酸残基来完成。

在一个实施例中，糖基化位点在哺乳动物促红细胞生成素内重新定位，产生本文公开的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。亦即，天然蛋白质中的糖基化位点的氨基酸被不能用糖链糖基化的氨基酸取代，并且在其他地方添加糖基化位点以获得修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素序列。

在一个实施例中，猫EpoR蛋白激动剂是修饰的猫EPO，其包括至少一个额外的糖基化位点和/或至少一个重新定位的糖基化位点。在该实施例的一些方面，EpoR蛋白激动剂为猫EPO 或本文公开的修饰的猫EPO，其具有以下取代氨基酸组中的一组：Asn³⁰Thr³²EPO、Asn⁵¹Thr⁵³ EPO、Asn⁵⁷Thr⁵⁹EPO、Asn⁶⁹EPO、Asn⁶⁹Thr⁷¹EPO、Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹EPO、Val⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹²EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Ala¹⁶³EPO、Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹EPO、Asn¹³⁷Thr¹³⁹EPO、Asn¹³⁹Thr¹⁴¹EPO、Thr¹²⁶EPO或Pro¹²⁵Thr¹²⁶EPO。在该实施例的其他方面，EpoR蛋白激动剂为猫EPO或本文公开的修饰的猫EPO，其具有以下取代组中的一组或多组：Ser⁸⁷Asn⁸⁸和/或Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸。

在该实施例的一些方面，EpoR蛋白激动剂是SEQ ID NO：5的猫EPO，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在，所述猫EPO具有以下取代氨基酸组中的一组：Asn³⁰Thr³²EPO、Asn⁵¹Thr⁵³EPO、Asn⁵⁷Thr⁵⁹EPO、Asn⁶⁹EPO、Asn⁶⁹Thr⁷¹EPO、 Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹EPO、Val⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹² EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁸Ala¹⁶³EPO、Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸EPO、Asn⁸⁹ile⁹⁰Thr⁹¹EPO、Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹EPO、Asn¹³⁷Thr¹³⁹EPO、Asn¹³⁹Thr¹⁴¹EPO、Thr¹²⁶EPO或Pro¹²⁵Thr¹²⁶EPO。在该实施例的其它方面，EpoR蛋白激动剂是SEQ ID NO：5的猫EPO，其中第18位的 Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在，所述猫EPO具有以下取代组中的一组或多组：Ser⁸⁷Asn⁸⁸和/或Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸。

在一个实施例中，哺乳动物促红细胞生成素是猫EPO或本文公开的修饰的猫EPO，其修饰是通过缺失一个或多个连接N-连接糖链的糖基化位点并通过在氨基酸第88位添加连接N- 连接糖链的糖基化位点进行的。在该实施例的一方面，存在以下氨基酸取代组中的一组： Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸、Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸或Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸。

在又一个实施例中，EpoR蛋白激动剂具有SEQ ID No.6的氨基酸序列，其中第18位的 Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的一些方面，EpoR蛋白激动剂与SEQ ID NO：6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。

也可将额外序列添加到哺乳动物促红细胞生成素，以获得修饰的非人类哺乳动物EPO。例如，在一个实施例中，糖基化序列包含哺乳动物绒毛膜促性腺激素的片段或与其具有至少 70％序列同源性的序列。一方面，哺乳动物绒毛膜促性腺激素的片段为来自哺乳动物绒毛膜促性腺激素羧基末端(也称为“C-末端”)区域的片段或与其具有至少70％序列同源性的序列。一方面，哺乳动物绒毛膜促性腺激素的羧基末端包含位于C末端的至少50％的蛋白质。在一个实施例中，哺乳动物绒毛膜促性腺激素的羧基末端包括来自C-末端的至少40％的蛋白质、来自C-末端的至少30％的蛋白质、来自C-末端的至少25％的蛋白质、来自C-末端的至少20％的蛋白质或者来自C-末端的至少10％的蛋白质。

本文公开的哺乳动物EPO可选地包括信号序列。在该实施例的一方面，本文公开的信号序列包括来自人EPO的信号序列(SEQ ID NO：9)、来自猫EPO的信号序列(SEQ ID NO：12) 或者来自犬EPO的信号序列(SEQ ID NO：13)以及另外常规公认的信号序列。例如，SEQID NO：11为包括信号序列(氨基酸1-26)的犬EPO。

在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素为人绒毛膜促性腺激素。在该实施例的一方面，绒毛膜促性腺激素包含SEQ ID NO：8，或与SEQ ID NO：8具有例如至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少87％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在该实施例的一方面，绒毛膜促性腺激素包含相对于SEQ ID NO：8具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、 1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5或4-5个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列。

本说明书还公开了编码所述修饰的非人类哺乳动物EPO的核酸序列。所述核酸序列可以包括内含子或可以是cDNA。核酸序列还可以编码在翻译后被切除的序列。核酸可以是DNA 或RNA。本文所述的核酸还可以包括编码序列的互补序列。

本说明书还公开了一种包含肽、接头和Fc片段的融合蛋白，其中所述肽通过接头与Fc 片段融合。本文公开的肽可以是具有以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中第13位的Xaa是色氨酸、1-萘基丙氨酸或2-萘基丙氨酸，或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有例如至少70％、至少75、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列，其中第13位的Xaa为色氨酸、1-萘基丙氨酸或2-萘基丙氨酸。在该实施例的一方面，本文公开的肽包含相对于SEQ ID NO：1具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、 1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5或4-5个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列，其中第 13位的Xaa为色氨酸、1-萘基丙氨酸或2-萘基丙氨酸。

本文公开的肽可以是如本文所公开的猫EPO。在该实施例的一些方面，本文公开的猫EPO 可以是SEQ ID NO：5，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在，或是与氨基酸序列SEQ ID NO：5具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 87％、至少90％、至少91个％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的另一方面，本文公开的猫EPO为相对于SEQ ID NO：5具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15 个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失的猫EPO，其中第18位的Xaa选自E或 G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的又一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO：5可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多 14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。在该实施例的再一方面，本文公开的猫EPO相对于SEQ ID NO：5可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、 1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、 4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、5-14、 5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、6-9、 6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、 10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、 12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或不存在。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

本文公开的肽可以是修饰的猫EPO。本文公开的修饰的猫EPO可以为SEQ ID NO：6，或与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在该实施例的另一方面，本文公开的修饰的猫EPO相对于SEQ ID NO：6可以具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少 4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少 12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的又一方面，本文公开的修饰的猫EPO相对于SEQ ID NO：6可以具有例如最多17 个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14个、最多15个、最多 16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的再一方面，本文公开的修饰的猫 EPO相对于SEQ ID NO：6可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、 1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、 2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、 3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、 5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、 6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、 8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、 10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、 12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

本文公开的肽可以是修饰的犬EPO。本文公开的犬EPO可以是SEQ ID NO：10、其片段或其变体。在该实施例的一些方面，本文公开的犬EPO与SEQ ID NO：10可以具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在该实施例的又一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：10可以具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16 个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的又一方面，本文公开的犬EPO相对于 SEQ ID NO：10可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多 13个、最多14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的另一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：10可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、 1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、 2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、 3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、 4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、 6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、 7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、 9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、 11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、 15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

本文公开的肽可以是修饰的犬EPO。本文公开的犬EPO可以是SEQ ID NO：11、其片段或其变体。在该实施例的一些方面，本文公开的犬EPO与SEQ ID NO：11可以具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在该实施例的又一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：11可以具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16 个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的又一方面，本文公开的犬EPO相对于 SEQ ID NO：11可以具有例如最多17个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多 13个、最多14个、最多15个、最多16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的另一方面，本文公开的犬EPO相对于SEQ ID NO：11可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、 1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、 2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、 3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、 4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、 6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、 7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、 9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、 11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、 15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

在一个实施例中，本文公开的肽选自美国专利6,703,480中公开的氨基酸序列，其全部内容在此通过引用的方式明确并入本文中。在一个实施例中，本文公开的肽是SEQ IDNO：1，其中第13位的Xaa是色氨酸、1-萘基丙氨酸或2-萘基丙氨酸。

如本文所用的术语“Fc片段”或“免疫球蛋白Fc区”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白质，不包括免疫球蛋白的重轻链可变区、重链恒定区 1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。其可以进一步包括在重链恒定区的铰链区。另外，本文公开的免疫球蛋白Fc区可以含有Fc区的部分或全部，包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，但重轻链可变区除外，只要其具有基本上与天然蛋白质相似或比天然蛋白质更佳的生理功能即可。此外，免疫球蛋白Fc区可以是在CH2和/或CH3氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的片段。亦即，本文公开的免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2 结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3 结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，以及6)重链恒定区和轻链恒定区中各结构域的二聚体。

本文公开的免疫球蛋白Fc区包括天然的氨基酸序列及其修饰的序列(突变体)。修饰的氨基酸序列为由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。

此外，可能有Fc的其他变体，包括其中缺失能够形成二硫键的区域或在天然Fc形式的N 末端消除某些氨基酸残基或另外添加甲硫氨酸残基的变体。进一步地，为了去除效应子功能，在补体结合位点例如C1q结合位点和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点可以发生缺失。制备免疫球蛋白Fc区的这些序列变体的技术公开于WO 97/34631和WO96/32478中。

上述Fc变体为生物学活性与本文公开的Fc区相同或者结构稳定性例如耐热、pH等得到改善的变体。

此外，这些Fc区可以从分离自猫和包括狗、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其它动物的天然形式获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物获得的其重组体、变体或衍生物。本文中，它们可以通过从人或动物机体分离完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab和Fc区，而胃蛋白酶处理导致pF′c和F(ab)2片段产生。对这些片段可以进行例如尺寸排阻色谱层析以分离Fc或pF′c。优选地，猫来源的Fc区是从微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。

此外，本文公开的免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过本领域常见的方法诸如化学方法、酶法和使用微生物的基因工程方法来实现。从Fc区去除糖链导致对第一补体成分C1的C1q部分的结合亲和力急剧下降，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，因此在体内不会诱导不必要的免疫反应发生。在这方面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可能更适合作为药物载剂用于本文公开的客体。

如本文所用的术语“去糖基化”是指从Fc区酶促去除糖基部分，术语“非糖基化”意指通过优选大肠杆菌的原核生物以非糖基化形式产生Fc区。

另外，免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM或者通过其组合或其杂合制备的Fc区。在一个实施例中，免疫球蛋白Fc区衍生自哺乳动物IgG或IgM，IgG、IgM 是人血液中最丰富的蛋白质之一，免疫球蛋白Fc区最优选衍生自IgG，IgG已知可延长配体结合蛋白的半衰期。在一个实施例中，免疫球蛋白Fc区是衍生自猫IgG、IgA、IgE或IgM的 Fc区。

另一方面，如本文所用的术语“组合”意指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接形成二聚体或多聚体。亦即，二聚体或多聚体可以由两种或两种以上选自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段组成的组的片段形成。

同时，模拟抗体的Fc片段或Fc区可经修饰以增加其与新生儿Fc受体(FcRN)的亲和力并进一步延长其体内半衰期。如上所述，Fc可以用作载剂来延长治疗肽的体内半衰期。Fc融合蛋白具有范围从几天到超过一周的体内半衰期。同时，全抗体分子也可以用作治疗肽的载剂。抗体分子可以具有3周以上的体内半衰期。

此外，可对Fc结构域进行修饰以进一步延长抗体分子或Fc融合蛋白的体内半衰期。例如，如美国专利7217798中所公开的，将突变T250Q/M428L引入IgG1分子导致IgG1分子的血清半衰期显著增加。也已进行其它突变以增加Fc与FcRN的结合亲和力并延长血清半衰期，诸如美国专利8,394,925中所公开的。

也可以对Fc区进行另一种被称作“杵和臼”的修饰以形成异源二聚体。抗体分子具有重链和轻链。将两种不同的肽与抗体分子融合非常方便。Fc融合蛋白常为同源二聚体。然而也可构建异源二聚体。例如，美国专利7,642,228公开了使用杵和臼理念可以构建抗体和Fc融合蛋白的异源二聚体。

本文公开的Fc片段可以是猫IgG1a Fc、猫IgG1b Fc、猫IgG2 Fc、犬IgG1a Fc、犬IgG1b Fc或犬IgG2 Fc。本文公开的Fc片段可以是具有以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4，或者与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4氨基酸序列具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。本文公开的Fc片段可以是具有以下氨基酸序列的肽：N-末端第1至第8 个氨基酸可能缺少的SEQ ID NO：2、N-末端第1至第8个氨基酸可能缺少的SEQ ID NO：3或 N-末端第1到第8个氨基酸可能缺少的SEQ ID NO：4。

在该实施例的又一方面，本文公开的Fc片段相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4可以具有例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的再一方面，本文公开的Fc片段相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4可以具有例如最多17 个、最多16个、最多15个、最多14个、最多13个、最多12个、最多11个、最多10个、最多9个、最多10个、最多11个、最多12个、最多13个、最多14个、最多15个、最多 16个或最多17个氨基酸添加、取代或缺失。在该实施例的另一方面，本文公开的Fc片段相对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4可以具有例如1-17、1-16、1-15、1-14、 1-13、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-17、2-16、2-15、2-4、2-13、 2-12、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-17、3-16、3-15、3-4、3-13、3-12、3-10、 3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-10、4-9、4-8、4-7、 4-6、4-5、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-5、6-17、6-16、 6-15、6-14、6-13、6-12、6-10、6-9、6-8、6-7、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-10、 7-9、7-8、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-10、8-9、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、 9-12、9-10、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、 11-12、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-17、13-16、13-15、13-14、14-17、14-16、14-15、 15-17、15-16或16-17个氨基酸添加、取代或缺失。这些添加、取代或缺失可以添加或不添加糖基化位点。取代可以是保守的或非保守的。

在另一个实施例中，Fc片段可经修饰以去除其糖基化位点。此外，本文所述的融合蛋白也可以包括添加糖基化、截短蛋白(即，蛋白片段)或者融合、结合或以其他方式连接额外氨基酸、核苷酸或核苷酸序列、核酸适配体、标签、药物、抗体等的蛋白。

Fc结构域可经进一步修饰以去除其N-糖基化位点。此外，可对Fc结构域进行修饰以进一步延长抗体分子或Fc融合蛋白在体内的半衰期。例如，如美国专利7217798中所公开的，将突变T250Q/M428L引入人IgG1分子导致IgG1分子的血清半衰期显著增加。也已进行其它突变以增加Fc与FcRN的结合亲和力并延长血清半衰期，诸如美国专利8394925中所公开的。本说明书进一步包含编码所述Fc融合蛋白的DNA序列以及重组质粒和用于表达的宿主细胞。

在一个实施例中，进一步修饰Fc片段使融合蛋白的体内半衰期进一步延长例如至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施例的一方面，当与使用未经修饰的 Fc片段序列构建的融合蛋白相比较时，所述融合蛋白的半衰期延长至少50％。在另一实施例中，治疗剂及其变体具有2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、 2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月或者更长时间的半衰期。

本文公开的融合蛋白也可利用接头可选地融合或连接到本文公开的Fc片段。一个氨基酸接头实例包括GGGGS(SEQ ID NO：7)，在(GGGGS)n中，n为1、2、3或4。在一个实施例中，本文公开的肽与Fc结构域的N-末端或C-末端融合(图2A-B )。

在一个实施例中，将本文公开的EpoR蛋白激动剂制成制剂，并用作药物来治疗由包括慢性肾脏衰竭、癌症、病毒感染以及由抗重组人EPO抗体导致的红细胞再生障碍性贫血的病症导致的NRA。

术语“分离的蛋白质”是指当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞物质或培养基或者当通过化学合成时基本上不含化学物质前体或其它化学物质的蛋白质。

如本文所用的术语“序列同源性”或“序列同一性”是指两个多肽序列之间的序列同一性百分比。为了测定两个多肽序列之间的同一性百分比，将这两个序列的氨基酸序列进行比对，优先使用Clustal W算法(Thompson，J D，Higgins D G，Gibson T J，1994，Nucleic Acids Res.22(22)： 4673-4680)以及BLOSUM 62评分矩阵(HenikoffS和HenikoffJ.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：10915-10919)，将空位开放罚分设为10，空位延伸罚分设为0.1，使得两个序列之间获得最高顺序匹配，其中一个序列的至少50％总长度参与了比对。其他可用于比对序列的方法为Needleman和Wunsch的比对方法(J.Mol.Biol.，1970，48：443)，Smith和Waterman(Adv. Appl.Math.，1981，2：482)修改了该方法，使得在两个序列之间获得最高顺序匹配，并在两个序列之间测定相同氨基酸的数目。其他计算两个氨基酸序列之间百分比同一性的方法为本领域一般公认的方法，且包括例如由Carillo和Lipton(SIAM J.Applied Math.，1988，48：1073)所描述的方法以及计算分子生物学(Lesk编辑，Oxford University Press，New York，1988， Biocomputing：Informatics and Genomics Projects)中所描述的方法。通常，计算机程序将用于这些计算。可用在这方面的计算机程序包括但不限于GCG(Devereux等人，Nucleic Acids Res.，1984，12：387)BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Molec.Biol.，1990：215：403)。在一方面，无论是基于局部序列或是基于全部序列，本发明修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白与另一个序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

若在局部序列基础上，位置由未修饰或天然序列的区域或者未修饰或天然序列的特异性识别基序来确定。在一方面，所述位置为未修饰或天然序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少 18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个或至少75个核酸或氨基酸。

如本文所用的术语“变体”包括本文公开的氨基酸和核苷酸序列的修饰物或化学等价物，其与本文公开的蛋白质或核酸分子以基本上相同的方式执行基本上相同的功能。例如，本文公开的蛋白质的变体包括但不限于保守性氨基酸取代。本文公开的蛋白质的变体也包括对本文公开的蛋白质进行的添加和缺失。此外，变异的肽和变异的核苷酸序列包括类似物及其化学衍生物。

本发明中的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素或融合蛋白可以具有氨基酸添加、缺失或者取代。修饰的氨基酸序列为由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。在一个实施例中，修饰为点突变。在一方面，修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素不具有天然存在的序列。类似地，在一方面，融合蛋白的P 是非天然存在的氨基酸序列。

氨基酸取代可以是保守的或非保守的。如本文所用的“保守氨基酸取代”为一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替换的一种取代。本领域已对具有相似侧链的氨基酸残基家族作了限定，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、 Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，在两个方向上都可以交换。蛋白质和肽中一般不改变所述蛋白质或肽的活性的氨基酸交换在本领域是已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。

术语“肽的衍生物”是指具有通过功能侧基的反应化学衍生的一个或多个残基的肽。这种衍生分子包括例如其中游离氨基已经衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以衍生化形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-咪唑- 苄基组氨酸。衍生物还包括含有20种标准氨基酸中的一个或多个天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；鸟氨酸可以取代赖氨酸。

如本文所用的术语“核酸序列”是指核苷或核苷酸单体的序列，这些核苷或核苷酸单体由天然存在的碱基、糖或糖间(intersugar)(骨架)键组成。此术语也包括修饰或取代的序列，其包含非天然存在的单体或其部分。本文公开的核酸序列可为脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并可包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。所述序列也可含有修饰的碱基。所述修饰碱基的实例包括氮杂(aza)和脱氮(deaza) 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及黄嘌呤和次黄嘌呤。

本发明中修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白可通过常规方法例如重组来制备。如本文所用的术语“重组体”是指通过选自哺乳动物表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统和细菌表达系统的生物宿主产生的多肽。

因此，本文公开的核酸分子可以以已知的方式插入确保本文公开蛋白质良好表达的合适表达载体中。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒或修饰的病毒(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体与所用的宿主细胞相容即可。表达载体“适于转化宿主细胞”，这意指表达载体含有本文公开的核酸分子以及基于待用于表达的宿主细胞选择的调节序列，所述调节序列可操作地与核酸分子连接。可操作地连接旨在表明核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。

本说明书因此考虑了一种重组表达载体，其含有本文公开的核酸分子或其片段以及用于插入的蛋白质序列转录和翻译的必要调控序列。合适的调控序列可衍生自各种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因，例如，参见Goeddel，Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述的调控序列。适当调控序列的选择取决于如下所选择的宿主细胞，并且可由本领域普通技术人员容易完成。此类调控序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，根据所选择的宿主细胞和所采用的载体，可将其它序列如复制起点、额外的 DNA限制性位点、增强子和赋予转录可诱导性的序列插入表达载体中。

本文公开的重组表达载体也可含有选择性标记基因，其有助于筛选用本文公开的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择性标记基因的实例为编码蛋白质的基因，蛋白质如赋予对某些药物有抗性的G418和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分(例如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG)。通过选择性标记蛋白如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶的浓度变化来监测选择性标记基因的转录。如果选择性标记基因编码赋予抗生素抗性如新霉素抗性的蛋白质，则可以用G418筛选转化体细胞。已插入选择性标记基因的细胞将存活下来，而其他细胞会死亡。这使得可能显现和测定本文公开的重组表达载体的表达，特别是确定突变对表达和表型的影响。应了解，选择性标记可以引入与感兴趣的核酸分开的载体上。

重组表达载体还可含有编码融合部分的基因，所述融合部分提供增强的重组蛋白表达；提高的重组蛋白溶解度，并通过在亲和纯化中作为配体帮助纯化靶重组蛋白。例如，可以将蛋白水解切割位点添加至靶重组蛋白，以允许在融合蛋白纯化后将融合部分与重组蛋白分开。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，Australia)、pMal(NewEngland Biolabs， Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A与重组蛋白融合。

可将重组表达载体引入宿主细胞中以产生转化宿主细胞。术语“用...转化”、“用...转染”、“转化”和“转染”旨在覆盖通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞。如本文所用的术语“转化宿主细胞”旨在还包括已经用本文公开的重组表达载体转化的能够糖基化的细胞。核酸可通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化来转化原核细胞。举例来说，可经由常规技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体、电穿孔或显微注射将核酸引入哺乳动物细胞中。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人 (Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001) 以及其他的实验室教科书中查找到。

合适的宿主细胞包括多种真核宿主细胞和原核细胞。例如，本文公开的蛋白质可在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞可在Goeddel，Gene ExpressionTechnology： Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1991)中查找到。此外，本文公开的蛋白质可在原核细胞如大肠杆菌(Zhang等人，Science 303(5656)：371-3(2004))中表达。除此之外，可以使用基于假单胞菌的表达系统如荧光假单胞菌(美国专利申请公开号US 2005/0186666，Schneider，Jane C等人)。

适合于实施所公开的方法的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母属或克鲁维酵母菌属以及曲霉菌属的各物种。酿酒酵母中的表达载体的实例包括pYepSec1(Baldari. 等人，Embo J.6：229-234(1987))、pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell30：933-943(1982))、pJRY88 (Schultz等人，Gene 54：113-123(1987))和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)。用于酵母和真菌转化的方案为本领域普通技术人员所熟知(参见Hinnen等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 75：1929(1978)；Itoh等人，J.Bacteriology 153：163(1983)以及Cullen等人 (Bio/Technology 5：369(1987))。

适合于实施所公开的方法的哺乳动物细胞尤其包括：COS(例如，ATCC编号CRL1650或 1651)、BHK(例如，ATCC编号CRL 6281)、CHO(ATCC编号CCL 61)、HeLa(例如， ATCC编号CCL 2)、293(ATCC编号1573)和NS-1细胞。用于在哺乳动物细胞中指导表达的适当表达载体一般包括启动子(例如，衍生自病毒物质，如多瘤病毒、2型腺病毒、巨细胞病毒和猿猴病毒40)以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8 (Seed，B.，Nature 329：840(1987))和pMT2PC(Kaufman等人，EMBO J.6：187-195(1987))。

考虑到本文提供的教导，也可容易地实现启动子、终止子和用于将适当类型的表达载体引入植物、鸟类和昆虫细胞的方法。例如，在一个实施例中，本文公开的蛋白质可由植物细胞表达(参见Sinkar等人，J.Biosci(Bangalore)11：47-58(1987)，其评述了发根农杆菌载体的使用；另参见Zambryski等人，Genetic Engineering，Principles andMethods，Hollaender和Setlow(编辑)，第vI卷，第253-278页，Plenum Press，New York(1984)，其描述了用于植物细胞的表达载体的使用，所述载体包括PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034等)。

适合实施所公开方法的昆虫细胞包括来自家蚕(Bombyx)、粉纹夜蛾(Trichoplusia)或灰翅夜蛾(Spodotera)物种的细胞和细胞系。可用于在培养的昆虫细胞(SF 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell.Biol.3：2156-2165(1983))和pVL 系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.D.，Virology 170：31-39(1989))。PCT/US/02442中描述了适合本文公开的重组蛋白表达的一些杆状病毒昆虫细胞表达系统。

或者，本文公开的蛋白质也可在非人类转基因动物如大鼠、兔、绵羊和猪中表达(Hammer 等人Nature 315：680-683(1985)；Palmiter等人Science 222：809-814(1983)；Brinster等人Proc. Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442(1985)；Palmiter和BrinsterCell 41：343-345(1985)以及美国专利4,736,866)。

本文公开的蛋白质也可使用蛋白质化学中熟知的技术通过化学合成来制备，例如固相合成 (Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.85：2149-2154(1964)；Frische等人，J.Pept.Sci.2(4)：212-22 (1996))或均相溶液中的合成(Houbenweyl，Methods ofOrganic Chemistry，ed.E.Wansch，第15 I和II卷，Thieme，Stuttgart(1987))。

包含与其它分子(如蛋白质)偶联的本文公开蛋白质的N-末端或C-末端融合蛋白可通过重组技术融合来制备。所得融合蛋白含有与本文所述的选定蛋白或标记蛋白融合的本文公开蛋白质。本文公开的重组蛋白也可通过已知技术与其他蛋白偶联。例如，可使用如WO 90/10457 中所述的异双功能含硫接头、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫-丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺基-5 硫代乙酸酯来偶联蛋白。可用于制备融合蛋白或偶联物的蛋白质的实例包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白、激素、生长因子、凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、脑内啡、转铁蛋白、蛙皮素、脱唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血球凝集素(HA)和截短myc。

因此，本说明书提供了一种包含核酸序列的重组表达载体，所述核酸序列编码本文公开的蛋白质，例如轻重链互补决定区、轻重链可变区、结合蛋白(如抗体及抗体片段)、本文公开的免疫偶联物和本文公开的新型分离蛋白。本说明书进一步提供一种包含本文公开的重组表达载体的宿主细胞。

此外，本发明的多肽序列能够通过包括带正电荷或带负电荷的氨基酸序列、含有半胱氨酸的氨基酸序列、抗生物素蛋白、链霉亲和素、葡萄球菌蛋白A的功能片段、GST、His标签、 FLAG标签或Lex A，选择性结合到固体支持物上。如所附实施例中所述的，本文公开的由单链抗体例示的多肽也可以用允许容易纯化和检测的N-末端FLAG标签和/或C-末端His标签表达。FLAG标签可以包括8个氨基酸。然而，包含在所附实例中使用的FLAG的缩短版本的 FLAG标签也是合适的，例如氨基酸序列Asp-Tyr-Lys-Asp。因此，本发明的肽可以包括在用于纯化分析物或者用于检测取自受试者的样品中的分析物的试剂盒中。本发明的肽因而也可用于诊断NRA或其他病症。

如本文所用的术语“样品”是指可以测定EpoR的来自受试者的任何液体、细胞或组织样品，亦即，来自生物体的任何生物组织或分泌物质。样品的实例包括血液、黏液、精液、尿、器官组织、手指和脚趾甲、毛发、皮肤细胞、粪便、乳液、泪液、胆汁、骨髓和组织样品，其来自器官，包括：肺、肝、肾、心脏、膀胱、食道、胃、乳房、前列腺、动脉、静脉、淋巴结、淋巴管、舌、唾液腺、大肠、小肠、脑垂体、松果腺、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴、阴茎、睾丸、脾、脑、脊髓、鼻、咽、喉、气管、眼、耳和肠。

如本文所用的术语“复性”是指蛋白质结构呈现其功能形状或构象的过程。它是多肽从无规卷曲折叠成特征和功能性三维结构的物理过程，在碱性pH(通常为pH 8.0-10.0，优选 pH8.5-10.0，更优选pH8.5-9.6)、低温(通常为0.0℃至10.0℃，优选2.0℃至8.0℃)下发生，优选在适当浓度的氧化还原对存在下，且/或在氧存在下，且/或在适宜浓度的催化剂如铜离子存在下发生。

本发明公开内容还涉及用本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白治疗受试者。术语“受试者”是疑似患有贫血的那些个体，其包括但不限于哺乳动物，包括猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类动物、猪或患有NRA或具有NRA发生可能性的其他家畜。在一个实施例中，受试者是猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类动物或者猪。然而，包括并不限于将用本文公开的融合蛋白或者药物组合物治疗的任何非人受试者。在该实施例的另一方面，用本文公开的修饰的非人类哺乳细胞EPO或融合蛋白治疗受试者是用于兽医治疗。向怀疑患有贫血的受试者施用包括本文公开的新型蛋白质的药物组合物，从而有效治疗该受试者。

由于EPO已经显示对血管内皮细胞具有促有丝分裂和趋化作用以及对中枢胆碱能神经元有作用(参见，例如Amagnostou等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：5978-5982和Konishi 等人(1993)Brain Res.609：29-35)，本文公开的化合物也可以用于治疗受试者各种血管疾病，例如促进伤口愈合、侧支冠状血管(如可能在心肌梗塞后出现的那些血管)生长、创伤、血管移植后治疗以及一般特征为与其它神经活性物质例如神经递质相比，乙酰胆碱的绝对水平低或者乙酰胆碱的相对水平低的各种神经性疾病。

在另一方面，本说明书提供一种用于预防或治疗NRA的药物组合物(亦称“治疗剂”)，其包含融合蛋白和修饰的猫EPO蛋白。

如本文所用的术语“制剂”是指组合在一起的本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO和融合蛋白以及赋形剂，其可以施用并能够结合相应受体并启动信号转导通路，结果产生所需活性。只要本发明中修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白保留结合相应受体与配体的能力，制剂可选择性地包含其他试剂。

在一个实施例中，向受试者施用第一治疗剂，并在稍后的日期，向同一受试者施用第二治疗剂。在一个实施例中，在向受试者施用第二治疗剂的同时，将第一治疗剂也施用给该受试者。

在该实施例的一些方面，缓释治疗递送平台以基本上零级释放动力学特征在一段时间内释放本文公开的治疗剂，例如，给药后约7天、给药后约15天、给药后约30天、给药后约45 天、给药后约60天、给药后约75天或给药后约90天。在该实施例的其他方面，缓释治疗递送平台以基本上零级释放动力学特征在一段时间内释放本文公开的治疗剂，例如，给药后至少 7天、给药后至少15天、给药后至少30天、给药后至少45天、给药后至少60天、给药后至少75天或给药后至少90天。

在该实施例的一些方面，缓释治疗递送平台以基本上一级释放动力学特征在一段时间内释放本文公开的治疗剂，例如，给药后约7天、给药后约15天、给药后约30天、给药后约45 天、给药后约60天、给药后约75天或给药后约90天。在该实施例的其他方面，缓释治疗递送平台以基本上一级释放动力学特征在一段时间内释放本文公开的治疗剂，例如，给药后至少 7天、给药后至少15天、给药后至少30天、给药后至少45天、给药后至少60天、给药后至少75天或给药后至少90天。

在一个实施例中，本文所公开的治疗剂可以为任何所需浓度。在该实施例的一些方面，本文公开的治疗剂的浓度可以为例如至少0.00001mg/mL、至少0.0001mg/mL、至少0.001 mg/mL、至少0.01mg/mL、至少0.1mg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少100mg/mL、至少200mg/mL、至少500mg/mL、至少700mg/mL、至少1,000mg/mL或至少1,200mg/mL。在该实施例的其他方面，本文所公开的治疗剂在溶液中的浓度可以为例如最多1,000mg/ml、最多1,100mg/ml、最多1,200mg/ml、最多1,300mg/ml、最多1,400mg/ml、最多1,500mg/ml、最多2,000mg/ml、最多2,000mg/ml或最多3,000mg/ml。在该实施例的其他方面，本文公开的治疗剂的浓度可以在以下范围内：例如约0.00001mg/mL 到约3,000mg/mL、约0.0001mg/mL到约3,000mg/mL、约0.01mg/mL到约3,000mg/mL、约 0.1mg/mL到约3,000mg/mL、约1mg/mL到约3,000mg/mL、约250mg/mL到约3,000mg/mL、约500mg/mL到约3,000mg/mL、约750mg/mL到约3,000mg/mL、约1,000mg/mL到约 3,000mg/mL、约100mg/mL到约2,000mg/mL、约250mg/mL到约2,000mg/mL、约500mg/mL 到约2,000mg/mL、约750mg/mL到约2,000mg/mL、约1,000mg/mL到约2,000mg/mL、约 100mg/mL到约1,500mg/mL、约250mg/mL到约1,500mg/mL、约500mg/mL到约1,500mg/mL、约750mg/mL到约1,500mg/mL、约1,000mg/mL到约1,500mg/mL、约100mg/mL到约 1,200mg/mL、约250mg/mL到约1,200mg/mL、约500mg/mL到约1,200mg/mL、约750mg/mL 到约1,200mg/mL、约1,000mg/mL到约1,200mg/mL、约100mg/mL到约1,000mg/mL、约 250mg/mL到约1,000mg/mL、约500mg/mL到约1,000mg/mL、约750mg/mL到约1,000mg/mL、约100mg/mL到约750mg/mL、约250mg/mL到约750mg/mL、约500mg/mL到约750mg/mL、约100mg/mL到约500mg/mL、约250mg/mL到约500mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.0001mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.001mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.01mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.1mg/mL、约0.00001mg/mL到约1mg/mL、约0.001mg/mL到约0.01mg/mL、约0.001mg/mL到约0.1mg/mL、约0.001mg/mL到约1mg/mL、约0.001mg/mL到约10mg/mL 或约0.001mg/mL到约100mg/mL。本文公开的治疗剂在本文公开的药物组合物中的最终浓度可以为任何所需浓度。在该实施例的一方面，药物组合物中治疗剂的最终浓度可以为治疗有效量。在该实施例的其他方面，药物组合物中治疗剂的最终浓度可以为例如至少0.00001mg/ml、至少0.0001mg/ml、至少0.001mg/ml、至少0.01mg/ml、至少0.1mg/ml、至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少200mg/ml、至少500mg/ml、至少700mg/ml、至少1,000mg/ml或者至少1,200mg/ml。在该实施例的其他方面，本文公开的癌症治疗剂在溶液中的浓度可以为例如最多1,000mg/ml、最多1，100mg/ml、最多1,200mg/ml、最多1,300mg/ml、最多1,400mg/ml、最多1,500mg/ml、最多2,000mg/ml、最多2,000mg/ml或最多3,000mg/ml。在该实施例的其他方面，药物组合物中治疗剂的最终浓度可以在以下范围内：约0.00001mg/mL到约3,000mg/mL、约0.0001mg/mL到约3,000mg/mL、约0.01mg/mL到约3,000mg/mL、约0.1mg/mL到约3,000mg/mL、约1mg/mL到约3,000mg/mL、约250mg/mL 到约3,000mg/mL、约500mg/mL到约3,000mg/mL、约750mg/mL到约3,000mg/mL、约 1,000mg/mL到约3,000mg/mL、约100mg/mL到约2,000mg/mL、约250mg/mL到约2,000mg/mL、约500mg/mL到约2,000mg/mL、约750mg/mL到约2,000mg/mL、约1,000mg/mL到约 2,000mg/mL、约100mg/mL到约1,500mg/mL、约250mg/mL到约1,500mg/mL、约500mg/mL 到约1,500mg/mL、约750mg/mL到约1,500mg/mL、约1,000mg/mL到约1,500mg/mL、约 100mg/mL到约1,200mg/mL、约250mg/mL到约1,200mg/mL、约500mg/mL到约1,200mg/mL、约750mg/mL到约1,200mg/mL、约1,000mg/mL到约1,200mg/mL、约100mg/mL到约 1,000mg/mL、约250mg/mL到约1,000mg/mL、约500mg/mL到约1,000mg/mL、约750mg/mL 到约1,000mg/mL、约100mg/mL到约750mg/mL、约250mg/mL到约750mg/mL、约500mg/mL 到约750mg/mL、约100mg/mL到约500mg/mL、约250mg/mL到约500mg/mL、约0.00001mg/mL 到约0.0001mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.001mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.01mg/mL、约0.00001mg/mL到约0.1mg/mL、约0.00001mg/mL到约1mg/mL、约0.001mg/mL到约 0.01mg/mL、约0.001mg/mL到约0.1mg/mL、约0.001mg/mL到约1mg/mL、约0.001mg/mL到约10mg/mL或约0.001mg/mL到约100mg/mL。

在一方面，本文公开的治疗剂的浓度通常可在约50mg/ml到约1,000mg/ml之间。在该实施例的一些方面，本文公开的治疗剂的治疗有效量可例如从约50mg/mL到约100mg/mL、从约50mg/mL到约200mg/mL、从约50mg/mL到约300mg/mL、从约50mg/mL到约400mg/mL、从约50mg/mL到约500mg/mL、从约50mg/mL到约600mg/mL、从约50mg/mL到约700mg/mL、从约50mg/mL到约800mg/mL、从约50mg/mL到约900mg/mL、从约50mg/mL到约1,000mg/mL、从约100mg/mL到约200mg/mL、从约100mg/mL到约300mg/mL、从约100mg/mL到约 400mg/mL、从约100mg/mL到约500mg/mL、从约100mg/mL到约600mg/mL、从约100mg/mL 到约700mg/mL、从约100mg/mL到约800mg/mL、从约100mg/mL到约900mg/mL、从约 100mg/mL到约1,000mg/mL、从约200mg/mL到约300mg/mL、从约200mg/mL到约400mg/mL、从约200mg/mL到约500mg/mL、从约200mg/mL到约600mg/mL、从约200mg/mL到约 700mg/mL、从约200mg/mL到约800mg/mL、从约200mg/mL到约900mg/mL、从约200mg/mL 到约1,000mg/mL、从约300mg/mL到约400mg/mL、从约300mg/mL到约500mg/mL、从约 300mg/mL到约600mg/mL、从约300mg/mL到约700mg/mL、从约300mg/mL到约800mg/mL、从约300mg/mL到约900mg/mL、从约300mg/mL到约1,000mg/mL、从约400mg/mL到约 500mg/mL、从约400mg/mL到约600mg/mL、从约400mg/mL到约700mg/mL、从约400mg/mL 到约800mg/mL、从约400mg/mL到约900mg/mL、从约400mg/mL到约1,000mg/mL、从约500mg/mL到约600mg/mL、从约500mg/mL到约700mg/mL、从约500mg/mL到约800mg/mL、从约500mg/mL到约900mg/mL、从约500mg/mL到约1,000mg/mL、从约600mg/mL到约 700mg/mL、从约600mg/mL到约800mg/mL、从约600mg/mL到约900mg/mL或从约600mg/mL 到约1,000mg/mL。

在又一方面，本文公开的治疗剂的量按重量计通常可在约0.01％到约45％之间。在该实施例的一些方面，本文公开的治疗剂的量按重量计可例如从约0.1％到约45％、从约0.1％到约 40％、从约0.1％到约35％、从约0.1％到约30％、从约0.1％到约25％、从约0.1％到约20％、从约0.1％到约15％、从约0.1％到约10％、从约0.1％到约5％、从约1％到约45％、从约1％到约40％、从约1％到约35％、从约1％到约30％、从约1％到约25％、从约1％到约20％、从约 1％到约15％、从约1％到约10％、从约1％到约5％、从约5％到约45％、从约5％到约40％、从约5％到约35％、从约5％到约30％、从约5％到约25％、从约5％到约20％、从约5％到约 15％、从约5％到约10％、从约10％到约45％、从约10％到约40％、从约10％到约35％、从约 10％到约30％、从约10％到约25％、从约10％到约20％、从约10％到约15％、从约15％到约 45％、从约15％到约40％、从约15％到约35％、从约15％到约30％、从约15％到约25％、从约15％到约20％、从约20％到约45％、从约20％到约40％、从约20％到约35％、从约20％到约30％、从约20％到约25％、从约25％到约45％、从约25％到约40％、从约25％到约35％或从约25％到约30％。

如本文所用的术语“预防”意指抑制、阻止或延缓疾病发生的所有行为。在本说明书中，“预防”意指通过施用本文公开的偶联物来抑制、阻止或延缓贫血的发生。

如本文所用的术语“治疗”意指使一种或多种疾病症状已经得到缓解、改善或减轻的所有行为。在本说明书中，“治疗”意指通过施用本文公开的新型蛋白质，NRA症状得到缓解、改善或减轻。

如本文所用的术语“施用(给药)”意指通过某种适当的方法将一定量的预定物质引入患者体内。本文公开的组合物可以经由任何常见途径施用，例如但不限于腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内给药，只要组合物能够到达所需组织即可。然而，由于肽在口服给药后就被消化，因此口服给药组合物中的活性成分应当被包衣或配制成制剂以防在胃中降解。

本文公开的组合物可以与药学上可接受的载剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和基质材料组合配制成各种剂型。

例如，对于口服给药，药物组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆或糯米纸囊剂(wafer)。对于可注射制剂，可将药物组合物配制入单剂量形式的安瓿或多剂量容器。也可将药物组合物配制成溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊及长效制剂。

本文公开的药物组合物进一步可为选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊、混悬剂、内用液体、乳剂、糖浆剂、无菌水溶液、非水溶剂、冻干制剂和栓剂组成的组的任何制剂。

本文公开的药物组合物可进一步包括药学上可接受的赋形剂或稀释剂。如本文所用的术语“药学上可接受的”意指组合物足以达到治疗效果且没有有害副作用，并可容易地根据疾病类型、受试者物种、年龄、体重、健康状况、性别以及药物敏感性、给药途径、给药模式、给药频率、治疗持续时间、与本文公开的组合物组合或同时使用的药物以及医学中已知的其他因素来确定。

对于口服给药，药物组合物可以包括但不限于载剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香料。对于可注射制剂，药物组合物可包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于用于局部给药的制剂，载剂可以包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。

用于药物组合物的载剂的实例包括生理盐水、有机溶剂、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，用于药物制剂的赋形剂或稀释剂可进一步包括填充剂、抗凝剂、增溶剂、抗氧化剂、润滑剂、保湿剂、香料和防腐剂。在一个实施例中，可通过与药学上可接受的各种载剂混合来获得药物组合物。为了提高稳定性或吸收性，可以使用碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白或其它稳定剂。

药物组合物可进一步配制成适合受试者机体的单一剂型。例如，根据制药领域的经典方法，将药物组合物配制成可用于肽药物的制剂，以便通过口服或肠胃外途径施用，例如通过皮肤、静脉内、肌内、动脉内、髓内、髓内、脑室内、肺、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、结肠内、局部、舌下、阴道或直肠给药，但不限于此。

本文公开的药物组合物的给药剂量和频率通过活性成分的类型以及各种因素(例如，待治疗的疾病、给药途径、受试者物种、年龄、性别和体重以及疾病严重性)来确定。

本文公开给药方法的时间选择包括在受试者已经诊断患有NRA之前、基本上同时或之后施用本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白，以及在一种或多种NRA不良症状及 NRA引起的病理特征异常或发展之前、基本上同时或之后给药。本文公开的方法、组合物和用途也包括在确认由NRA引起或与NRA相关的不良症状、病症、身体不适或疾病或者起因于NRA的病理特征之前、基本上同时或之后，向受试者施用修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白。NRA受试者可能患有NRA或者有NRA目前症状一段时间：1-5、5-10、10-20、20-30、 30-50、50-100小时，天，周，月或年。

本文公开的组合物可与具有所需治疗、有益、附加、协同或互补活性或效应的任何化合物、试剂、药物、疗法或其他治疗方案或计划相联合。例示性的联合组合物和治疗方法包括第二活性物，例如与治疗骨髓疾病、蜱病、脓肿、癌症、肾衰竭、有毒化学品暴露、辐射暴露、铅中毒及遗传性NRA相关的药物或试剂。此类药物、试剂、治疗和疗法可在本文公开的任何其他方法(例如，另外医治NRA受试者的治疗方法，或预防性治疗NRA受试者的方法)之前、基本上同时或之后施用或执行。此外，药物组合物可单独施用或与其他对贫血尤其是NRA显示有预防或治疗效果的药物制剂联合或同时施用。

本文公开的组合物可以联合组合物形式施用或者单独施用给个体，例如同时或连续或顺次 (之前或之后)施用第二活性物。因此，本说明书提供了一些联合方式，其中一种方法或用途与任何化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗计划、过程、药品或组合物联合使用，例如与治疗骨髓疾病、蜱病、脓肿、癌症、肾衰竭、有毒化学品暴露、辐射暴露、铅中毒及遗传性NRA 相关的药物或试剂。所述化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗计划、过程、药品或组合物可在将一种或多种本发明修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白或其子序列、部分或修饰物，或者编码本发明修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白或其子序列、部分或修饰物整体或一部分的核酸施用给受试者之前、基本上同时或之后施用或执行。联合实施例的非限制性具体实例因此包括上述或其他化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗计划、过程、药品或组合物。

本文公开的组合物的总有效剂量可以以单剂量施用给受试者，或可以根据分次治疗计划以多个剂量施用一段时间。例如，剂量可以确定为受试者整个生命期内的总剂量、预期治疗期内的总剂量、每月总剂量、每周总剂量或每日总剂量。

在一个实施例中，本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白的给药期为1天、2 天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4 周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8 个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

给药剂量可以是单剂量或累积剂量(连续用药)，并且可以容易地由本领域技术人员确定。例如，治疗贫血症可以包含一次性施用足够剂量的本文公开组合物。作为非限制性实例，足够剂量的本文公开组合物可例如以单次注射或沉积或者单次口服的方式一次性施用给受试者。或者，治疗可以包含在一段时间范围内进行足够剂量的本文公开组合物的一次性给药，例如每天，每几天、周、月或年一次。作为非限制性实例，本文公开的抗原或组合物可以每周一次或两次施用给受试者。给药时间选择可根据不同受试者而变化，这取决于诸如受试者症状严重程度之类的因素。例如，可以每月一次将足够剂量的本文公开抗原或组合物施用给受试者一段不确定的时间，或直到该受试者不再需要治疗。本领域普通技术人员应认识到，可在整个治疗进程中监测受试者的状况，并且可相应调整施用的足够量的本文公开组合物。

在一个实施例中，本文公开的肽的总日剂量可以是每1kg患者体重约0.01μg到5mg(即μg/kg或mg/kg)。在一个实施例中，总日剂量为至少0.01μg/kg、至少0.05μg/kg、至少0.1μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少5μg/kg、至少0.01mg/kg、至少0.05mg/kg、至少0.1mg/kg、至少0.5mg/kg、至少1mg/kg、至少1.5mg/kg、至少2mg/kg、至少2.5mg/kg、至少3mg/kg、至少3.5mg/kg、至少4mg/kg、至少4.5mg/kg或至少5mg/kg。在一方面，最高日剂量为最多5mg/kg、最多4.5mg/kg、最多4.0mg/kg、最多3.5mg/kg、最多3mg/kg、最多2.5mg/kg、最多2mg/kg、最多1.5mg/kg、最多1mg/kg、最多0.5mg/kg、最多0.1mg/kg、最多0.05mg/kg、最多10μg/kg、最多5μg/kg、最多1μg/kg、最多0.05μg/kg或最多0.1μg/kg。在又一个方面，本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白的日剂量可为约0.05μg/kg到5mg/kg、0.1μg/kg到5mg/kg、 1μg/kg到5mg/kg、50μg/kg到5mg/kg、0.1mg/kg到5mg/kg或1mg/kg到5mg/kg。在再一方面，修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白的日剂量可为约0.01μg/kg到2mg/kg、0.05μg/kg到 2mg/kg、0.1μg/kg到2mg/kg、1μg/kg到2mg/kg、5μg/kg到2mg/kg、10μg/kg到2mg/kg、50μg/kg 到2mg/kg、100μg/kg到2mg/kg、0.5mg/kg到2mg/kg或1mg/kg到2mg/kg。在该实施例的其他方面，足够量的本文公开的修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白为足以减轻贫血相关症状例如至少1周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6 个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月的剂量。

然而，除药物组合物的给药途径和治疗频率之外，修饰的非人类哺乳动物EPO或融合蛋白有效剂量的确定需考虑各种因素包括受试者的物种、年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食以及分泌率。鉴于此，所属领域的技术人员可以容易地确定适合本文公开的药物组合物的特定用途的有效剂量。本文公开的药物组合物不特别限制制剂、给药途径和方式，只要其显示有益效果即可。

当与天然EPO(即具有天然存在EPO氨基酸序列的全长氨基酸序列的EPO)给药相比较时，本文公开的药物组合物预期具有更长的疗效和效价体内持续时间，从而显著减少其给药量和频率。在一个实施例中，本文公开的组合物及其衍生物或变体的半衰期为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14 小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、 1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、 4个月或更长时间。

在一个实施例中，给个体提供一种治疗计划，其中将药物组合物按周期性安排施用给受试者，且通过电子通知告知该个体按周期性安排施用治疗剂。在该实施例的一方面，电子通知是通过电子邮件、短信、即时消息或通过另一种电子通知方法来进行的。在一个实施例中，个体通过收到电话、信件、隔夜快递(包括但不限于联邦快递和UPS)或其他通知方法被告知按周期性安排施用目前公开的治疗剂。

本说明书的各方面也可以如下所描述：

1.一种修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点。

2.如实施例1所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素包含与选自由猫促红细胞生成素或犬促红细胞生成素组成的组的序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

3.如实施例1或2所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素包含与猫促红细胞生成素或犬促红细胞生成素的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

4.如实施例1-3中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素包含与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中第18位的Xaa选自E或G，SEQ ID NO：5或SEQID NO：6中第116位的Xaa为K或者不存在。

5.如实施例1-4中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素包含约3个到约5个、约3个到约8个、约3个到约10个、约3个到约12 个、约3个到约15个或约3个到约17个氨基酸添加、缺失或取代。

6.如实施例1-5中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述糖基化位点具有Asn-Xaa-Ser/Thr结构，其中Xaa为任一种氨基酸。

7.如实施例1-6中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述糖基化位点是用于连接N-连接糖链的位点。

8.如实施例1-7中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述糖基化位点包含丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸。

9.如实施例1-8中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述糖基化位点是用于连接O-连接糖链的位点。

10.如实施例1-9中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述糖基化位点位于哺乳动物促红细胞生成素的羧基末端区域。

11.如实施例1-9中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中将所述糖基化位点插入哺乳动物促红细胞生成素序列中的氨基酸之间。

12.如实施例1-11中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述糖基化位点进一步包含人绒毛膜促性腺激素的片段。

13.如实施例12所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述人绒毛膜促性腺激素的片段为SEQ ID NO：8，或与SEQ ID NO：8具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：8具有1、2、 3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5或4-5个氨基酸添加、缺失或取代的氨基酸序列。

14.如实施例1-13中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其进一步包含至少一个连接的额外糖链。

15.如实施例1-14中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为猫促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；其中在 SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6中，用天冬酰胺残基取代第30、51、57、69、88、89、137或 139位中的任一个或多个位置处的氨基酸残基。

16.如实施例1-15中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为猫促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；其中在 SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6中，用丝氨酸或苏氨酸残基取代第126位的氨基酸残基。

17.如实施例1-14中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为猫促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中第18位的Xaa选自E或G；第116位的Xaa为K或者不存在；其中在 SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6中，存在以下氨基酸取代组中的一组或多组：Asn³⁰和Thr³²， Asn⁵¹和Thr⁵³，Asn⁵⁷、Thr⁵⁹和Asn⁶⁹，Asn⁶⁹和Thr⁷¹，Ser⁶⁸、Asn⁶⁹和Thr⁷¹，Val⁸⁷和Asn⁸⁸， Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，Ser⁸⁷、Asn⁸⁸和Gly⁸⁹，Ser⁸⁷、Asn⁸⁸和Thr⁹²，Ser⁸⁷、Asn⁸⁸和Ala¹⁶³，Asn⁶⁹、Thr⁷¹、 Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，Asn³⁰、Thr³²、Val⁸⁷和Asn⁸⁸，Asn⁸⁹、Ile⁹⁰和Thr⁹¹，Ser⁸⁷、Asn⁸⁹、Ile⁹⁰和Thr⁹¹， Asn¹³⁷和Thr¹³⁹，Asn¹³⁹和Thr¹⁴¹，Thr¹²⁶，Pro¹²⁵和Thr¹²⁶，或其任何组合。

18.如实施例17所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为猫促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；或与SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；其中在SEQ ID NO： 5或SEQID NO：6中，存在以下取代组中的一组或多组：Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，及/或Asn³⁰、Thr³²、 Val⁸⁷和Asn⁸⁸。

19.如实施例17所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为猫促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在，并存在以下氨基酸取代组中的一组：Gln²⁴、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，Gln³⁸、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，或Gln⁸³、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸。

20.如实施例1-14中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的猫促红细胞生成素，其中第18位的 Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在，其通过缺失连接N连接糖链的一个或多个糖基化位点并通过添加一个在SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸第88位连接N连接糖链的糖基化位点进行修饰。

21.如实施例1-14中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为犬促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：10或SEQ IDNO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中在SEQ ID NO：10中，用天冬酰胺残基取代第 30、51、57、69、88、89、137或139位中的任一个或多个位置处的氨基酸残基，其中在SEQID NO：11中，用天冬酰胺残基取代第56、77、83、95、114、115、163或165位中的任一个或多个位置处的氨基酸残基。

22.如实施例1-14及21中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为犬促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中在SEQ IDNO：10中，用丝氨酸或苏氨酸残基取代第126位的氨基酸残基，其中在SEQ ID NO：11中，用丝氨酸或苏氨酸残基取代第152位的氨基酸残基。

23.如实施例1-14中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为犬促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：10或SEQ IDNO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中在SEQ ID NO：10中，存在以下氨基酸取代组中的一组或多组：Asn³⁰和Thr³²，Asn⁵¹和Thr⁵³，Asn⁵⁷和Thr⁵⁹，Asn⁶⁹，Asn⁶⁹和Thr⁷¹，Ser⁶⁸、Asn⁶⁹和Thr⁷¹，Val⁸⁷和Asn⁸⁸，Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，Ser⁸⁷、Asn⁸⁸和Gly⁸⁹，Ser⁸⁷、Asn⁸⁸和Thr⁹²，Ser⁸⁷、Asn⁸⁸和Ala¹⁶³，Asn⁶⁹、Thr⁷¹、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，Asn³⁰、Thr³²、Val⁸⁷和Asn⁸⁸，Asn⁸⁹、Ile⁹⁰和Thr⁹¹，Ser⁸⁷、Asn⁸⁹、Ile⁹⁰和Thr⁹¹，Asn¹³⁷和Thr¹³⁹，Asn¹³⁹和Thr¹⁴¹，Thr¹²⁶，及/或Pro¹²⁵和Thr¹²⁶，其中在SEQ ID NO：11中，存在以下氨基酸取代组中的一组或多组：Asn⁵⁶和Thr⁵⁸，Asn⁷⁷和 Thr⁷⁹，Asn⁸³和Thr⁸⁵，Asn⁶⁹，Asn⁹⁵和Thr⁹⁷，Ser⁹⁴、Asn⁹⁵和Thr⁹⁷，Val¹¹³和Asn¹¹⁴，Ser¹¹³和 Asn¹¹⁴，Ser¹¹³、Asn¹¹⁴和Gly¹¹⁵，Ser¹¹³、Asn¹¹⁴和Thr¹¹⁸，Ser¹¹³、Asn¹¹⁴和Ala¹⁸⁹，Asn⁹⁵、Thr⁹⁷、Ser¹¹³和Asn¹¹⁴，Asn⁵⁶、Thr⁵⁸、Val¹¹³和Asn¹¹⁴，Asn¹¹⁵、Ile¹¹⁶和Thr¹¹⁷，Ser¹¹³、Asn¹¹⁵、Ile¹¹⁶和Thr¹¹⁷，Asn¹⁶³和Thr¹⁶⁵，Asn¹⁶⁵和Thr¹⁶⁷，Thr¹⁵²，及/或Pro¹⁵¹和Thr¹⁵²。

24.如实施例23所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为犬促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，其中在SEQ ID NO：10中，存在以下取代组中的一组或多组：Ser⁸⁷和Asn⁸⁸及或Asn³⁰、Thr³²、Val⁸⁷和Asn⁸⁸，其中在SEQ ID NO：11中，存在以下取代组中的一组或多组：Ser¹¹³和Asn¹¹⁴及/或Asn⁵⁶、Thr⁵⁸、Val¹¹³和Asn¹¹⁴。

25.如实施例23所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为犬促红细胞生成素，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中存在以下氨基酸取代组中的一组：Gln²⁴、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，Gln³⁸、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸，或Gln⁸³、Ser⁸⁷和Asn⁸⁸；或者具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列，其中存在以下氨基酸取代组中的一组：Gln⁵⁰、Ser¹¹³和 Asn¹¹⁴，Gln⁶⁴、Ser¹¹³和Asn¹¹⁴，或Gln¹⁰⁹、Ser¹¹³和Asn¹¹⁴。

26.如实施例1-14中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其中所述哺乳动物促红细胞生成素为SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的犬促红细胞生成素，其通过缺失连接N连接糖链的一个或多个糖基化位点并通过添加一个在SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11 的氨基酸第88位连接N连接糖链的糖基化位点进行修饰。

27.一种编码修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的核酸序列，所述修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点。

27.一种核酸序列，其编码如实施例1-27中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。

28.一种核酸序列，其编码包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQID NO：11氨基酸序列的修饰的猫促红细胞生成素，或编码与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

29.一种载体，其包含：

a)编码修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的核酸序列，所述修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点，和

b)可操作地与所述核酸序列连接的启动子。

30.一种载体，其包含：

a)核酸序列，其编码如实施例1-26中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的氨基酸序列，或者如实施例27-28中所述的核酸序列，和

b)可操作地与所述核酸序列连接的启动子。

31.一种宿主细胞，其包含如实施例29或30所述的载体。

32.一种组合物，其包含：

a)修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点，和

b)药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

33.一种组合物，其包含：

a)如实施例1-26中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，或如实施例29 或30所述的载体，和

b)药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

34.修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素在制备用于治疗非再生性贫血(NRA)的药物中的用途，所述修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点。

35.如实施例1-26中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素或如实施例29 或30所述的载体在制备用于治疗非再生性贫血(NRA)的药物中的用途。

36.一种在哺乳动物中治疗非再生性贫血(NRA)的方法，其包含向有需要的受试者施用有效量的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素或包含修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的组合物，所述修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点。

37.一种在哺乳动物中治疗非再生性贫血(NRA)的方法，其包含向有需要的受试者施用有效量的如实施例1-26中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素或者如实施例 32或33所述的组合物。

38.修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素用于治疗非再生性贫血(NRA)的用途，所述修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素包含哺乳动物促红细胞生成素序列以及至少一个添加或重新定位的糖基化位点。

39.如实施例1-26中任一项所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素或者如实施例 32或33所述的组合物用于治疗非再生性贫血(NRA)的用途。

40.如实施例34或35所述的方法或者如实施例38或39所述的用途，其中所述哺乳动物为猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类或猪。

41.一种融合蛋白，其包含肽、接头和Fc片段，其中：

a)所述肽为SEQ ID NO：1；与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；具有氨基酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的猫EPO，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；与SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少 99％序列同一性的序列，其中第18位的Xaa选自E或G，第116位的Xaa为K或者不存在；具有氨基酸序列SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的犬EPO；或与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；

b)所述Fc片段具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；

其中所述肽通过接头与所述Fc片段融合。

42.如实施例41所述的融合蛋白，其中所述肽的C末端是通过接头与Fc片段的N末端融合。

43.如实施例42所述的融合蛋白，其中所述肽的N末端是通过接头与Fc片段的C末端融合。

44.一种核酸序列，其编码如实施例40-42中任一项所述的融合蛋白。

45.一种载体，其包含如实施例44所述的核酸序列以及可操作地与所述核酸序列连接的启动子。

46.一种宿主细胞，其包含如实施例45所述的载体。

47.一种组合物，其包含：

a)如实施例40-42中任一项所述的融合蛋白或如实施例45所述的载体，和

b)药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

48.如实施例40-3429中任一项所述的融合蛋白或如实施例45所述的载体在制备用于治疗非再生性贫血(NRA)的药物中的用途。

49.一种在哺乳动物中治疗非再生性贫血(NRA)的方法，其包含向有需要的受试者施用有效量的如实施例37-39中任一项所述的融合蛋白或如实施例47所述的组合物。

50.如实施例40-3429中任一项所述的融合蛋白或如实施例47所述的组合物用于治疗非再生性贫血(NRA)的用途。

51.如实施例49所述的方法或者如实施例50所述的用途，其中所述哺乳动物为猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、反刍动物、雪貂、非人灵长类或猪。

实例

提供以下非限制性实例仅用于说明性目的，以便于更全面地理解目前考虑的代表性实施例。这些实例不应解释为限制本说明书中描述的任何实施例，其包括与本文公开的治疗病症的化合物、药物组合物或方法或用途相关的实例。

实例1-生产修饰的猫EPO

合成具有修饰Val⁸⁷Asn⁸⁸的修饰猫EPO的DNA(SEQ ID NO：14)，并将其克隆入细菌表达载体中。通过DNA测序证实包含修饰的猫EPO DNA基因的完整表达构建体(命名为ASKBH01)。所述表达构建体通过转化入DH10B大肠杆菌中并培养细胞过夜进行扩增。通过无内毒素质粒试剂盒(来自

)制备并纯化表达构建体的DNA。

通过将表达构建体电穿孔转染入GS^-/-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，并使用不含谷氨酰胺的选择性培养基(

CD CHO融合生长培养基)筛选转染的CHO细胞，获得稳定表达修饰的猫EPO蛋白的细胞系。以这种方式，建立32个稳定的微池(minipool)，并且基于分批和补料分批培养中的表达水平选择前导微池。图3显示在第一轮分批培养克隆选择期间，分批细胞培养物的ELISA效价结果。通过有限稀释及使用克隆培养基进行单克隆，基于分批和补料分批培养中的产量和细胞生长情况，从132个阳性克隆中选择两个前导单克隆(总共960个孔)。将前导克隆扩增并以0.5×10⁶个细胞/mL、共300mL接种在2L摇瓶中，然后将细胞在37℃、5％CO₂、70％HMR条件下培养，并以120rpm振荡。在第3、6、7、8和9 天，使用5％Acti

Feed A+0.5％Feed B(来自GE Health)饲喂培养物。每隔一天监测细胞活力、活细胞密度，在第11天收获培养物。细胞生长曲线、活力和滴度见图4A-C 。

通过以2000rpm离心10分钟并接着过滤使约600mL细胞培养液变澄清来收获修饰的猫 EPO蛋白。将澄清的上清液浓缩至约100mL，并换液至10mM Tris缓冲液(pH 7.1)中。在UFDF步骤中，使用30kDa截留分子量的Pellicone II UF膜包。将UFDF收获液等分，并冻存于-80℃直至进一步纯化。

将含有修饰的猫EPO的UFDF溶液解冻，并在中性pH条件下加载到填充有Q琼脂糖凝胶FF树脂的柱中。该柱直径2cm、床高约1.5cm。用10mM Tris，pH7.1缓冲液洗柱，然后用 2mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素，20mM CuSO₄，pH4.8进行第二次洗柱以除去宿主细胞杂质及有约7个或更少唾液酸的猫EPO异构体。用40mM乙酸，1mM甘氨酸，6M尿素，20mM CuSO₄，pH 4.0进一步洗柱。此步骤除去额外的细胞杂质以及含有约8个至约12个唾液酸的猫EPO异构体。色谱和SDS-PAGE分析显示，与可能含有唾液酸水平较低的修饰猫EPO的部分相比，含有12个以上唾液酸的异构体表达水平显著。

使用反相色谱层析、第二阴离子交换色谱层析、尺寸排阻色谱层析和/或羟磷灰石色谱层析进一步纯化含有12个或者更多个唾液酸的洗脱液以获得高纯度，其中聚体含量低于0.5％，优选低于0.2％，且进一步优选低于0.1％。

实例2-生产EpoR激动剂肽-Fc融合蛋白

合成GGTYSCHFGPLTBVCRPQGG-接头-猫IgGla Fc融合蛋白的DNA并将其克隆入细菌表达载体。通过DNA测序证实包含GGTYSCHFGPLTBVCRPQGG-接头-猫IgG1a Fc融合蛋白基因的完整表达构建体。所述表达构建体通过转化入DH10B大肠杆菌中并培养细胞过夜进行扩增。通过无内毒素质粒试剂盒(来自

)制备并纯化表达构建体的DNA。或者，将融合蛋白回收在不溶包涵体(IB)中。然后溶解包涵体，并在pH8.0-10.0(优选8.5-9.5)、温度0-8℃条件下复性融合蛋白。

将表达构建体转染入GS^-/-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，并如实例1中所讨论的获得稳定细胞池。如实例1中所讨论的，表达并收获GGTYSCHFGPLTBVCRPQGG-接头-猫IgG1a Fc融合蛋白。对收获的GGTYSCHFGPLTBVCRPQGG-接头-猫IgG1a Fc融合蛋白通过包括蛋白 A亲和层析、离子交换、羟磷灰石和/或疏水性相互作用的色谱层析步骤进行纯化。将纯化后原液按配方制备并冻干。

实例3-分析修饰的猫EPO中唾液酸含量

采用如以前所述的OPD标记方法测定重组的修饰猫EPO的唾液酸含量，参见例如Anumula，K.R.，Rapid quantitative determination of sialic acids inglycoproteins by High-Performance Liquid Chromatography with a sensitivefluorescence detection.Anal.Biochem. 230(1)：24-30(1995)。简言之，在0.5M NaHSO₄中于80℃下处理纯化的rhEPO 20分钟，将唾液酸从纯化的rhEPO脱离下来，然后于80℃下用OPD(邻苯二胺二盐酸盐；Sigma)衍生化 40分钟。用C18反相柱(Shim-pack CLC-ODS；Shimadzu，Kyoto，Japan)分离OPD标记的唾液酸，并用荧光检测器(474型号；Waters)检测，发射波长为230nm，激发波长为425nm。

实例4-分析重组修饰猫EPO中N-连接多糖的唾液酸化水平

为释放出N-连接多糖，将纯化的修饰猫EPO(50μg)重悬在N-聚糖酶反应缓冲液中，所述反应缓冲液包含20mM磷酸钠、0.02％叠氮化钠、0.1％SDS和50mM β-巯基乙醇(pH7.5)。通过在沸水中煮5分钟使rhEPO变性，并添加0.75％NP-40。将混合物与2单位N-糖苷酶F(Roche)一起在37℃下孵育过夜以从rhEPO释放N-连接多糖。接着使用GLYCOCLEAN^TM R 试剂盒除去肽和洗涤剂，并使用GLYCOCLEAN^TM H试剂盒(

Hayward， CA)除去盐。使用SIGNAL^TM标记试剂盒

对纯化的N-连接多糖进行2-AB(2- 氨基苯甲酰胺)衍生化，并使用GLYCOCLEAN^TMS试剂盒除去未反应的2-AB试剂。以上实验步骤按照生产商说明书进行操作。根据唾液酸的数量使用阴离子交换柱(TSKgel DEAE-5PW， 7.5mm x75mm；Tosoh，Tokyo，Japan)将2-AB衍生化的N-连接多糖从rhEPO分离。洗脱液和梯度条件如先前所述(Llop等人，2007)。样品在柱温30℃、流速0.4mL/min条件下用0％ (v/v)到100％(v/v)溶剂A(溶剂A：50％500mM甲酸铵(pH 4.5)、30％水和20％乙腈 (ACN)；溶剂B：80％水、20％乙腈)线性梯度洗脱35min，并通过荧光检测器(474型号； Waters)进行检测，发射波长为330nm，激发波长为420nm。通过比对标准品2-AB牛胎球蛋白N-连接多糖文库

中的峰确定每个峰中的唾液酸数量。

实例5-细胞活性测定：TF-1细胞增殖试验

将TF-1细胞维持在由RPMI-1640培养基组成的完全培养基中进行培养，所述RPMI-1640 培养基补充有2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素、5％FBS和2ng/ml重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。将细胞培养在培养瓶中，并在5％CO₂的加湿培养箱中进行37℃培养。在96 孔板的第一孔中，用200mL检测培养基将修饰的重组猫EPO样品稀释至2x(200ng/ml)。对 12个孔，进行连续2x稀释(从第一孔取100μL加入第二孔的100μL培养基中等等)。样品检测至少进行3次重复。收集TF-1细胞，以1200rpm离心7min。用10mL检测培养基重悬细胞，再重复离心并重悬细胞2次，除去生长因子。用检测培养基将细胞稀释至100,000个细胞/mL，每孔加入100μl(10,000个细胞/孔)，培养3天(37℃，5％CO₂)。每孔加入20mL阿尔玛蓝 (Alamar Blue)，孵育6h(37℃，5％CO₂)。使用酶标仪检测荧光值(激发波长545nm，发射波长590nm)。图5显示了来自实例1初始纯化的洗脱组分的细胞活性测定数据。使用R&DSystems的重组犬促红细胞生成素(cEPO)样品作为该分析的对照品。如上文所讨论的，预期该洗脱池含有唾液酸水平更高(12个或更多)的猫EPO。该洗脱池与对照品狗EPO相比显示更高的EC₅₀值。这与先前报道一致，其中具有更高水平糖基化的人EPO类似物在体外结合和细胞活性检测中显示EC₅₀值更高，参见，例如Angus M Sinclair：“Erythropoiesisstimulating agents：approaches to modulate activity”.Biologics.2013；7：161-174。

实例6-体内活性研究

每周用0.05～0.1mg/kg融合蛋白或1μg/kg修饰的猫EPO对猫皮下给药一次，共计进行6 周。在实验开始时测定所有猫的血细胞比容值，并在其后每周测定2次。实验结束时，收集所有动物的血清并检测针对注入产品的抗体。

最后，应当理解，尽管通过参考特定实施例突出了本说明书的一些方面，但是本领域技术人员将容易了解，这些公开的实施例仅仅说明了本文公开的标的物的原理。因此，应当理解，除非明确说明，否则所公开的标的物决不限于本文所述的具体化合物、组合物、制品、装置、方法、方案和/或试剂等。此外，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本说明书的精神的情况下，可以根据本文的教导进行某些改变、修改、置换、变更、增加、删减及其子组合。因此，希望将所附权利要求和以后引入的权利要求解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的改变、修改、置换、变更、增加、删减及其子组合。

本文描述了本发明的某些实施例，包括发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。当然，在阅读前述描述之后，这些所描述的实施例的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人希望本领域技术人员适当地采用这些变化，并且本发明人意图以不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述标的物的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或另外上下文明显矛盾，否则本发明包括上述实施例的所有可能变化形式的任何组合。

本发明的替代实施例、元件或步骤的分组不应被解释为限制。各组成员可以单独地或者以与本文公开的其他组成员任意组合形式提及和要求保护。可以预期，出于方便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，可认为说明书含有经修饰的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示特征、项目、数量、参数、性质、术语等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。如本文所用的术语“约”意指如此限定的特征、项目、数量、参数、性质或术语包括高于和低于所述特征、项目、数量、参数、性质或术语的值的正负百分之十的范围。因此，除非有相反指出，否则本说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可以变化的近似值。例如，由于质谱仪器在确定给定分析物的质量时可以稍微变化，因此在离子质量或离子质量/电荷比的上下文中的术语“约”是指+/-0.50原子质量单位。不试图限制等同原则应用于权利要求的范围，每个数字显示起码应当至少根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。

关于实施例或实施例一方面的术语“可能”或“可以”的使用还带有“可能不”或“不可以”的替代含义。因此，如果本说明书公开了实施例或实施例一方面可能或可以被包括为本发明标的物的部分，则否定限制或排除性附带条件也被明确地表示，意味着实施例或实施例一方面可能不或不可以被包括为本发明标的物的部分。类似地，关于实施例或实施例一方面的术语“可选择性地”的使用意味着此实施例或此实施例一方面可能被包括为本发明标的物的部分，或者可能不被包括为本发明标的物的部分。这样的否定限制或排除性附带条件是否适用将基于在所要求保护的标的物中是否引用否定限制或排除性附带条件。

尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和值是近似值，但是在具体实例中尽可能精确报道了阐述的数值范围和值。然而，任何数值范围或值固有地含有由在它们各自的试验测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。本文中值的数值范围的叙述仅仅旨在用作单独提及落在该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另有说明，否则将数值范围的每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。

在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”、“所述”和类似表述被解释为覆盖单数和复数，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。此外，对于标识的元件，诸如“第一”、“第二”、“第三”等的序数指示符用于在元件之间进行区分，并且不指示或暗示这些元件的所需或有限数量，并且不指示这些元件的特定位置或顺序，除非另有具体说明。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文另有说明或另外上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如或例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，不对所要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言不应被解释为指示任何对于本发明的实践而言必要但未要求保护的要素。

可以进一步使用“由...组成”或“基本上由...组成”表述将本文公开的具体实施例限制在权利要求中。当在权利要求中使用时，无论是提交还是按照修改添加，过渡术语“由...组成”排除没有在权利要求中指定的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤，以及不会实质影响基本和新颖特征的那些材料或步骤。所要求保护的本发明的实施例在本文中得到本质或明确的描述，并能够实现。

将本说明书中引用和确认的所有专利、专利公开文件和其它出版物整体通过引用的方式单独和明确地并入本文中，以描述和公开例如在可能联系本发明使用的这些出版物中所述的组合物和方法。提供这些出版物仅仅是因为它们在本申请的申请日之前公开。在这方面，任何内容都不应被解释为承认发明人无权由于在先发明或任何其他原因而先于这样的公开。关于这些文件内容的日期或表示的所有陈述是基于申请人可获得的信息，且并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

最后，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。因此，本发明不限于精确示出和描述的内容。

序列表

<110> 奥美药业有限公司

卢建丰

吕越峰

王爱君

何东苟

K. 肖恩贝克

姚宸

<120> 新型猫促红细胞生成素受体激动剂

<130> 3IPAG3.0003WO

<150> 62/052,407

<151> 2014-09-18

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 与EPOR激动剂肽相关的人工序列

<220>

<221> 变体

<222> (13)..(13)

<223> 第13位的氨基酸选自Trp、1-萘基丙氨酸或2-萘基丙氨酸

<400> 1

Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Xaa Val Cys Arg

1 5 10 15

Pro Gln Gly Gly

20

<210> 2

<211> 237

<212> PRT

<213> 家猫

<220>

<221> 可变序列

<222> (1)..(8)

<223> 第1-8位的氨基酸各自可以存在或不存在

<400> 2

Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys

1 5 10 15

Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro

20 25 30

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

35 40 45

Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr

50 55 60

Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg

65 70 75 80

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile

85 90 95

Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

100 105 110

Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys

115 120 125

Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu

130 135 140

Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe

145 150 155 160

His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu

165 170 175

Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly

180 185 190

Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln

195 200 205

Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser

210 215 220

His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 家猫

<220>

<221> 可变序列

<222> (1)..(8)

<223> 第1-8位的氨基酸各自可以存在或不存在

<400> 3

Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys

1 5 10 15

Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro

20 25 30

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

35 40 45

Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr

50 55 60

Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg

65 70 75 80

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile

85 90 95

Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

100 105 110

Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Asp Lys

115 120 125

Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu

130 135 140

Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu

165 170 175

Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly

180 185 190

Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg Trp Gln

195 200 205

Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser

210 215 220

His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 4

<211> 237

<212> PRT

<213> 家猫

<220>

<221> 可变序列

<222> (1)..(8)

<223> 第1-8位的氨基酸各自可以独立存在或不存在

<400> 4

Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ile Glu Ser Lys Thr Gly Glu Gly Pro Lys

1 5 10 15

Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

20 25 30

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

35 40 45

Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asn Val Gln Ile Thr

50 55 60

Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala Lys Thr Arg Pro Arg

65 70 75 80

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile

85 90 95

Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

100 105 110

Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys

115 120 125

Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu

130 135 140

Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe

145 150 155 160

His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu

165 170 175

Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly

180 185 190

Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln

195 200 205

Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser

210 215 220

His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 5

<211> 166

<212> PRT

<213> 家猫

<220>

<221> 可变序列

<222> (18)..(18)

<223> 第18位的氨基酸可选自E或G

<220>

<221> 可变序列

<222> (116)..(116)

<223> 第116位的氨基酸可为K或不存在

<400> 5

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Xaa Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly

20 25 30

Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Xaa Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Arg Gly Asp Arg

165

<210> 6

<211> 166

<212> PRT

<213> 家猫

<220>

<221> 可变序列

<222> (18)..(18)

<223> 第18位的氨基酸可选自E或G

<220>

<221> 可变序列

<222> (116)..(116)

<223> 第116位的氨基酸可为K或不存在

<400> 6

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Xaa Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Asn Glu Thr

20 25 30

Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ala Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Xaa Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Arg Gly Asp Arg

165

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<220>

<221> 重复序列

<222> (1)..(5)

<223> 该序列可以通过重复2-4次来延伸

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 绒毛膜促性腺激素片段

<400> 8

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25

<210> 9

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 信号序列

<222> (1)..(27)

<400> 9

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly

20 25

<210> 10

<211> 166

<212> PRT

<213> 家犬

<400> 10

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly

20 25 30

Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Arg Gly Asp Arg

165

<210> 11

<211> 192

<212> PRT

<213> 家犬

<400> 11

Met Gly Ala Cys Glu Cys Pro Ala Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln

100 105 110

Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu

115 120 125

Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala

130 135 140

Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr

145 150 155 160

Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg

165 170 175

Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg

180 185 190

<210> 12

<211> 26

<212> PRT

<213> 家猫

<220>

<221> 信号序列

<222> (1)..(26)

<400> 12

Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly

20 25

<210> 13

<211> 40

<212> PRT

<213> 家犬

<220>

<221> 信号序列

<222> (1)..(40)

<400> 13

Met Cys Glu Pro Ala Pro Pro Lys Pro Thr Gln Ser Ala Trp His Ser

1 5 10 15

Phe Pro Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly

35 40

<210> 14

<211> 593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的猫EPO的DNA序列，包括5'-Hind III和

3'-Pac I限制性核酸内切酶切割位点

<400> 14

aagcttatgg gttcctgtga atgccctgcc ctcctcctcc tgctgtccct gttgttgctc 60

cccctcggac tcccggtcct gggcgcgccc ccaagactga tctgcgattc acgcgtgctg 120

gagcggtaca ttcttgaggc tcgggaagcc gagaacgtga ccatgggttg taacgagact 180

tgctcgttct ccgaaaacat taccgtgccg gacaccaagg tcaacttcta cacctggaaa 240

cggatggacg tgggacagca agccgtggaa gtgtggcagg ggcttgccct gctgtccgag 300

gccatcctgc gcggccaggc cctgctggcc aactcaagcc aggtcaacga gactctgcaa 360

cttcacgtgg ataaggccgt gtcgagcctg aggagcctca cctcgctcct gcgggcactg 420

ggagcccaga aggaagccac ttccctgcct gaagcaacat ccgctgcgcc gctgaggacc 480

tttactgtgg acacgctgtg caagctgttc cgcatctact ccaatttcct gcgggggaag 540

ctgaccttgt ataccggaga agcgtgccgc agaggcgaca gatagttaat taa 593

Claims (15)

1.一种修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，其包含SEQ ID NO:6的序列，其中SEQID NO:6中第18位的Xaa为E，第116位的Xaa为K或者不存在。

2.一种核酸序列，其编码如权利要求1所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素。

3.一种载体，其包含：

a)核酸序列，其编码如权利要求1所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素的氨基酸序列，或者如权利要求2所述的核酸序列，和

b)可操作地与所述核酸序列连接的启动子。

4.一种宿主细胞，其包含如权利要求3所述的载体。

5.一种组合物，其包含：

a)如权利要求1所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素，或如权利要求3所述的载体，和

b)药学上可接受的载剂。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述的载剂为稀释剂或佐剂。

7.如权利要求1所述的修饰的非人类哺乳动物促红细胞生成素或如权利要求3所述的载体在制备用于治疗猫非再生性贫血(NRA)的药物中的用途。

8.一种融合蛋白，其包含肽、接头和Fc片段，其中：

a)所述肽为具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的猫EPO，其中第18位的Xaa为E，第116位的Xaa为K或者不存在；和

b)所述Fc片段具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；

其中所述肽通过接头与所述Fc片段融合。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其中所述肽的C末端是通过接头与Fc片段的N末端融合，或其中所述肽的N末端是通过接头与Fc片段的C末端融合。

10.一种核酸序列，其编码如权利要求8或9所述的融合蛋白。

11.一种载体，其包含如权利要求10所述的核酸序列和可操作地与所述核酸序列连接的启动子。

12.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的载体。

13.一种组合物，其包含：

a)如权利要求8或9所述的融合蛋白，或如权利要求11所述的载体，和

b)药学上可接受的载剂。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述的载剂为稀释剂或佐剂。

15.如权利要求8或9所述的融合蛋白或如权利要求11所述的载体在制备用于治疗猫非再生性贫血(NRA)的药物中的用途。

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