KR20120089863A - “개선된 당화반응 최종 생성물에 대한 수용체”에 결합하기 위한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 "개선된 당화반응 최종 생성물에 대한 수용체"(RAGE)에 대한 특이적인 결합을 허용하도록 배열된 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체, 당해 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들), RAGE에 대한 항체를 생산하는 세포, 임의로 RAGE-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 상기에 정의한 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 RAGE-관련 질환 또는 장애의 진단 방법에 관한 것이다.

Description

“개선된 당화반응 최종 생성물에 대한 수용체”에 결합하기 위한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 및 방법{POLYPEPTIDES FOR BINDING TO THE “RECEPTOR FOR ADVANCED GLYCATION ENDPRODUCTS”AS WELL AS COMPOSITIONS AND METHODS INVOLVING THE SAME}
본 발명은 "개선된 당화반응 최종 생성물에 대한 수용체"(RAGE)에 대한 특이적인 결합을 허용하도록 배열된 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체, 당해 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들), RAGE에 대한 항체를 생산하는 세포, 임의로 RAGE-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 상기에 정의한 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 RAGE-관련 질환 또는 장애의 진단 방법에 관한 것이다.
개선된 당화반응 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체는 1992년 니퍼(Neeper) 등에 의해 최초로 확인된 면역글로불린 상과(super family)의 35kD 막관통 수용체(transmembrane receptor)이다(참조: Neeper et al., 1992, J.Biol.Chem. 267: 14998-15004). 이는 면역글로불린 상과의 다중-리간드 세포 표면 구성원이다. RAGE는 세포외 도메인, 단일 막-스패닝 도메인(membrane-spanning domain), 및 세포질성 테일(cytosolic tail)로 이루어져 있다. 수용체의 세포외 도메인은 하나의 V-형 면역글로불린 도메인에 이어 2개의 C-형 면역글로불린 도메인으로 이루어져 있다. 세포질성 도메인은 시그날 형질도입에 관여하며 막관통 도메인은 세포막 내에서 수용체를 고정시킨다. 가변 도메인은 RAGE 리간드에 결합한다. RAGE는 또한 가용성 형태(sRAGE)로 존재한다.
RAGE의 명칭은 장기간 고혈당 상태에서 형성되는 비-효소적으로 변경된 단백질의 이종 그룹인 개선된 당화반응 최종 생성물(AGE)에 결합하는 이의 능력으로부터 유래한다. 그러나, AGE는 단지 부수적인 병원성 리간드일 수 있다. AGE 이외에, RAGE도 다른 리간드에 결합할 수 있으므로 흔히 패턴 인식 수용체로서 언급된다. 그러나, RAGE는 사이토킨 분비, 증가된 세포 산화제 스트레스, 신경돌기 돌출(outgrowth) 및 세포 이주를 포함하는 각종 세포 반응을 초래하는 내인성 분자의 몇가지 상이한 부류에 결합하는 특정한 패턴-인식 수용체이다. RAGE의 공지된 리간드는 S100/칼그래눌린(calgranulin), 혈청 아밀로이드(SAA)(피브릴 형태), β-아밀로이드 단백질(Αβ), 및 고 이동성 그룹 박스-1 염색체 단백질 1(HMGB1, 또한 암포텐으로 공지됨)을 포함하는 아밀로이드 침착물 및 전-염증성 매개인자의 특징인 β-시트 피브릴(β-sheet fibril)를 갖는 단백질을 포함한다. HMGB-1은 쥐 패혈증의 2개 모델에서 치사율의 말기 매개인자인 것으로 밝혀졌으며, RAGE와, HMGB1과 같은 리간드 사이의 상호작용은 패혈증 및 다른 염증성 질환의 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
RAGE는 폐, 심장, 신장, 골격근 및 뇌를 포함하는 많은 상이한 조직에서 많은 세포 유형, 예를 들면, 내피 세포 및 평활근 세포, 대식구 및 림프구에 의해 발현된다. 발현은 류마티스 관절염 및 당뇨병성 신장병증과 같은 만성 염증 상태에서 증가된다.
다수의 유의적인 사람 장애가 RAGE에 대한 리간드의 증가된 생산 또는 RAGE 자체의 증가된 생산과 관련되어 있다. 당뇨병 또는 다른 만성 장애에서 RAGE 리간드의 향상된 수준으로 인하여, 당해 수용체는 당뇨병성 합병증, 알츠하이머병 및 심지어 일부 종양과 같은 염증성 질환 범위에서 유발 효과를 갖는 것으로 가설화되어 있다.
또한, RAGE는 혈관 손상으로부터 초래되는 것으로 고려되는 몇가지 만성 질환에 연결되어 왔다. 발병은, RAGE가 핵 인자 카파 B(NF-κΒ)의 활성화를 알리는 경우 리간드 결합을 포함하도록 가설화되어 있다. NF-κB는 염증에 관여하는 몇가지 유전자를 조절한다. 흥미롭게도, RAGE 자체는 또한 NF-κΒ에 의해 상향-조절될 것이다. 다량의 RAGE 리간드가 존재하는 상태(예를 들면, 당뇨병에서 AGE 또는 알츠하이머병에서 아밀로이드-β-단백질)가 제공되면, 이는 만성 염증을 초래하는 양성 피드백 주기(feed-back cycle)를 확립한다. 이러한 만성 상태는 이후에 기관 손상 또는 심지어 기관 부전으로 끝나는 치명적인 방식으로 미세- 및 거대혈관구조를 변경시키는 것으로 여겨진다. RAGE와 연결되어 있는 질환은 류마티스 및 건선 관절염 및 내장 질환, 암, 당뇨병 및 당뇨병성 신장병증, 아밀로이드증, 심혈관병, 패혈증, 죽상경화증, 말초 혈관 질환, 심근경색, 울혈성 심부전, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신장병증 및 알츠하이머병을 포함하는 많은 만성 염증성 질환이다.
지속적으로 효과적인 치료제는 많은 이들 장애에 이용할 수 없다. 이러한 RAGE-관련 장애에 대해 안전하고 효과적인 치료를 하는 것이 유리할 수 있다. 한가지 접근법은 RAGE에 결합하는 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체의 사용을 포함한다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 유리한 특성을 제공하는 다수의 모노클로날 항체(mAB)가 동정되었다. 특히, 항-RAGE 모노클로날 항체가 결합 상수, 교차-반응성, 도메인 맵핑(domain mapping) 및 시험관내 기능적 데이터(경쟁 ELISA)를 포함하는 실험 데이터 세트를 기준으로 확인되었다. 이러한 데이터를 기준으로 하여, 다음 기준을 충족하는 23개의 mAb가 선택되었다.
결합 상수 KD ≤ 1 .0 x 10-9 M 및 koff ≤ 2.0 x 10-3 s-1
숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, 항체의 결합 특성은 가변 도메인에 의해 매개된다. 항원에 대한 결합을 위해서는, 중쇄로부터의 적합한 가변 도메인 및 경쇄로부터의 공동-작용하는 가변 도메인이 존재하여 배열됨으로써 상호-작용하도록 하는 것이 필수적이다. 가변 도메인은 또한 FV 영역으로 언급되며 항원에 대한 결합을 위해 가장 중요한 영역이다. 보다 상세하게는, 가변 루프, 즉 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 상의 각각 3개는 항원에 대한 결합에 관여한다. 이들 루프는 상보성 결정 영역(CDR)으로 언급된다. 3개의 루프는 VL의 경우 L1, L2 및 L3으로 및 VH의 경우 H1, H2 및 H3으로 언급된다. 그러나, 중쇄로부터의 가변 도메인 및 경쇄로부터의 공동-작용하는 가변 도메인의 상이한 배열의 다양성은 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 중쇄로부터의 적합한 가변 도메인 및 경쇄로부터 공동-작용하는 가변 도메인의 동정은 본 발명에 필수적이다. 따라서, 이들의 서열은 위에서 명시한 23개 항체에 대해 동정되었다.
따라서, 제1 국면에서 본 발명은 적어도 2개의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체에 관한 것이며, 여기서, 적어도 2개의 아미노산 서열은
- 서열 번호 1 및 서열 번호 24,
- 서열 번호 2 및 서열 번호 25,
- 서열 번호 3 및 서열 번호 26,
- 서열 번호 4 및 서열 번호 27,
- 서열 번호 5 및 서열 번호 28,
- 서열 번호 6 및 서열 번호 29,
- 서열 번호 7 및 서열 번호 30,
- 서열 번호 8 및 서열 번호 31,
- 서열 번호 9 및 서열 번호 32,
- 서열 번호 10 및 서열 번호 33,
- 서열 번호 11 및 서열 번호 34,
- 서열 번호 12 및 서열 번호 35,
- 서열 번호 13 및 서열 번호 36,
- 서열 번호 14 및 서열 번호 37,
- 서열 번호 15 및 서열 번호 38,
- 서열 번호 16 및 서열 번호 39,
- 서열 번호 17 및 서열 번호 40,
- 서열 번호 18 및 서열 번호 41,
- 서열 번호 19 및 서열 번호 42,
- 서열 번호 20 및 서열 번호 43,
- 서열 번호 21 및 서열 번호 44,
- 서열 번호 22 및 서열 번호 45, 및/또는
- 서열 번호 23 및 서열 번호 46이고;
여기서, 이들 서열은 "개선된 당화반응 최종 생성물"(RAGE)에 대한 특이적인 결합을 허용하도록 정렬되어 있다.
본 발명에 따라서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체는 위에서 정의한 바와 같은 적어도 2개의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체를 포함한다. 서열 번호 1 내지 23의 서열은 경쇄의 가변 도메인이고 서열 번호 24 내지 46의 서열은 확인된 항체의 중쇄의 가변 도메인이다(서열 분석에 의해 측정). 경쇄의 우세한 가변 도메인에 상응하는 중쇄의 가변 도메인의 서열 번호는 경쇄의 상기 가변 도메인의 서열 번호에 23을 더하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 5의 경쇄의 가변 도메인에 상응하는 중쇄의 가변 도메인의 서열 번호는 서열 번호 28(5 + 23)이다.
본 발명에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체가 위에서 정의한 바와 같은 2개의 공동-작용하는 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 것은 필수적이다. 이들이 적합한 방식으로 배열된 경우, 당해 배열은 RAGE에 대한 특이적인 결합을 허용한다. 다양한 상이한 항체 양식이 지금까지 개발되거나 동정되어 왔다. 이들 중 어느 하나 또는 임의의 다른 적합한 배열도, 양식 또는 배열이 RAGE에 대한 특이적인 결합을 허용하는 한, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체에 사용될 수 있다.
상기 서열 번호 또는 이의 변이체에 의해 정의된 것으로서, 2개의 서열은 하나의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 복합체에서 배열될 수 있다. 이들이 하나의 폴리펩타이드내에서 배열되는 경우, 2개 서열은 링커 서열, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해, 예를 들면, 융합 단백질로서 연결될 수 있다. 이들이 폴리펩타이드 복합체에 배열되는 경우, 2개 이상의 폴리펩타이드는 수소 결합, 이온 결합, 반데르 바알스 힘(Van der Waals force), 및 소수성 상호작용을 포함하는 비-공유 결합 에 의해 서로 결합된다. 상기 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 구성하거나 또는 이의 일부일 수 있다.
폴리펩타이드(또한 단백질로서 공지됨)는 직쇄로 배열된 α-아미노산으로 이루어진 유기 화합물이다. 중합체 쇄내의 아미노산은 인접한 아미노산 잔기의 카복실 그룹과 아미노 그룹 사이의 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된다. 일반적으로, 유전 암호는 20개의 표준 아미노산을 규정한다. 합성 후 또는 심지어 합성 동안, 단백질내 잔기는 번역 후 변형에 의해 화학적으로 변형될 수 있으며, 이는 단백질의 물리적 및 화학적 특성, 폴딩(folding), 안정성, 활성 및 궁극적으로 기능을 변경시킨다.
본원에 정의된 것으로서 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 RAGE를 선택적으로 인식하고 이에 특이적으로 결합한다. 본원에서 용어 "선택적인" 또는 "특이적인"의 사용은, 기재된 폴리펩타이드 또는 이의 복합체가, 폴리펩타이드/복합체가 RAGE-특이적인 결합 부위(예를 들면, 분자가 작용기에 결합하거나 2개의 기능을 발휘하도록 설계되며, 이중 적어도 하나가 RAGE에 특이적으로 결합하는 것인 이특이적이거나 이작용성인 분자에서와 같은)에 대해 추가의, 명백한 특이성을 부여하기 위해 보충된 특정 예들을 제외하고는, RAGE 이외의 다른 것에 대한 유의적인 결합을 나타내지 않는다. 구체적인 양태에서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 RAGE에 1.2 x 10-6 이하의 KD로 결합한다. 구체적인 양태에서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 RAGE에 5 x 10-7 이하, 2 x 10-7 이하 또는 1 x 10-7 이하의 KD로 결합한다. 추가의 양태에서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 RAGE에 1 x 10-8 이하의 KD로 결합한다. 다른 양태에서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 RAGE에 5 x 10-9 이하, 또는 1 x 10-9 이하의 KD로 결합한다. 추가의 양태에서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 RAGE에 1 x 10-10 이하의 KD, 1 x 10-11 이하의 KD 또는 1 x 10-12 이하의 KD로 결합한다. 구체적인 양태에서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 상기 KD에서 다른 단백질에 결합하지 않는다.
KD는 ka(특정 결합 분자-표적 단백질 상호작용의 연합 속도; 또한 kon 으로 언급됨)에 대한 kd(특정 결합 분자-표적 상호작용의 해리 속도; 또한 koff로 언급됨)의 비, 또는 몰 농도(M)로 나타내는 kd/ka로부터 수득된 해리 상수를 말한다. KD 값은 당해 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 결합 분자의 KD를 측정하는 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, Biacore(TM)(제조원: GE Healthcare Life Sciences) 시스템과 같은 바이오센서 시스템(참조: 실시예 5 및 표 2)을 사용하는 것이다. 다른 방법은 도 2 및 실시예 2에 나타나 있다.
RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 RAGE/리간드 상호작용을 용량-의존적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다(참조: 도 4, 실시예 3 및 실시예 4 및 표 1). 따라서, RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 RAGE에 대한 리간드 결합을 방해하는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 어떠한 RAGE-특이적인 폴리펩타이드 또는 이의 복합체에 의한 억제 정도는 대조군에 대해 통계적 비교로, 또는 당해 분야에서 이용가능한 어떠한 대안 방법을 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 구체적인 양태에서, 억제율은 적어도 약 10% 억제이다. 다른 양태에서, 억제율은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%이다.
폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 상기 서열의 기능적으로 활성인 변이체도 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적으로 활성인 변이체는 RAGE에 결합하고, 임의로 RAGE를 억제하는 능력을 포함하는 완전한 단백질에 의해 나타나는 것과 유사한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 변이체의 활성(예를 들면, KD로 임의로 표현된 결합 활성)이 서열 변경없이 펩타이드/복합체의 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 70%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80%, 필수적으로 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%에 이르는 양인 경우, 변이체는 본 발명의 내용에서 기능적으로 활성이다. RAGE에 대한 결합 활성을 측정하기 위한 적합한 방법은 실시예에 제공된다. 기능적으로 활성인 변이체는 제한된 수의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 서열 번호 1 내지 23 중 어느 서열의 기능적으로 활성인 변이체는 서열 번호 1 내지 23의 각각의 서열의 상보성 결정 영역 L3 (CDR L3), 바람직하게는 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3을 포함하고/하거나; 서열 번호 24 내지 46 중 어느 서열의 기능적으로 활성인 변이체는 서열 번호 24 내지 46의 각각의 서열의 상보성 결정 영역 H3(CDR H3), 바람직하게는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함한다. 가장 바람직한 양태에서, 서열 번호 1 내지 23 중 어느 서열의 기능적으로 활성인 변이체는 서열 번호 1 내지 23의 각각의 서열이 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3을 포함하고; 서열 번호 24 내지 46 중 어느 서열의 기능적으로 활성인 변이체는 서열 번호 24 내지 46의 각각의 서열의 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함한다. 또한, 서열들 중 하나는 임의의 서열 변경이 없는 서열 번호 1 내지 46일 수 있고, 나머지는 본원에 정의한 바와 같은 변이체일 수 있다.
가변 영역의 서열내 CDR을 확인하는 상이한 방법은 기술되어 왔다. 또한, 당해 목적을 위해 사용될 수 있는 일련의 소프트웨어 프로그램이 공지되어 있다. 그러나, 다음 세트의 규칙이 서열 번호 1 내지 46의 서열에 적용되어 이들 서열내 CDR을 확인하여 왔다[참조: 또한 www.bioinf.org.uk; MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262 (5): 732-745; Antibody Engineering Lab Manual, Chapter "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg]. CDR을 갖는 서열은 도 1에 나타나 있다.
CDR-L1
출발 대략 24번 잔기
이전 잔기 항상 Cys
이후 잔기 항상 Trp. 전형적으로 Trp-Tyr-GIn이지만, 또한, Trp-Leu-GIn, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu이다.
길이 10 내지 17개 잔기
CDR-L2
출발 L1의 말기 이후 항상 16개 잔기
이전 잔기 일반적으로 Ile-Tyr이지만, 또한, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe
길이 항상 7개 잔기
CDR-L3
출발 L2의 말단 이후 항상 33개 잔기
이전 잔기 항상 Cys
이후 잔기 항상 Phe-Gly-XXX-Gly (서열 번호 47)
길이 7 내지 11개 잔기
CDR-H1
출발 대략 26번 잔기(Cys 이후 항상 4개)
이전 잔기 항상 Cys-XXX-XXX-XXX (서열 번호 48)
이후 잔기 항상 Trp. 전형적으로 Trp-Val이지만, 또한, Trp-Ile, Trp-Ala
길이 10 내지 12개 잔기
CDR-H2
출발 CDR-H1의 말단 이후 항상 15개 잔기
이전 잔기 전형적으로 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (서열 번호 49)이지만
다수의 변이체
이후 잔기 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala
길이 9 내지 12개 잔기
CDR-H3
출발 CDR-H2의 말단 이후 항상 33개 잔기(항상 Cys 이후 2개)
이전 잔기 항상 Cys-XXX-XXX(전형적으로 Cys-Ala-Arg)
이후 잔기 항상 Trp-Gly-XXX-Gly (서열 번호 50)
길이 3 내지 25개 잔기
위에서 상세히 기술한 바와 같이, VH 및 VL내에서 하나의 항체로부터 다른 항체 및 덜 가변성인 골격 영역까지 최대 서열 변이성을 나타내는 초가변 영역이 존재한다. 폴딩(folding)은 초가변 영역을 함께 가져와서 항원-결합 포켓(antigen-binding pocket)을 형성한다. 항체와 항원 사이의 가장 근접한 접촉의 이들 부위는 항체의 특이성을 매개하는 항체의 CDR이다. 따라서, 이들은 항원 결합에 특히 중요하다. 비록 기능적으로 활성인 변이체가 모든 3개의 CDR을 포함하는 것이 바람직하다고 해도, 일부 항체의 경우 CDR-L3 및 CDR-H3은 특이성을 부여하기에 충분함이 밝혀졌다. 따라서, 하나의 양태에서, CDR-L3 및 CDR-H3의 존재만이 의무적이다. 어떠한 경우에도, CDR은 본원에서 RAGE인, 항원에 대해 특이적인 결합을 허용하도록 배열되어야 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, CDR(CDR-L3 및 -H3; 또는 CDR-L1, -L2, -L3, -H1, -H2 및 -H3)은 우세한 가변 도메인의 골격내에, 즉, VL의 골격내 L1, L2 및 L3, 및 VH의 골격내 H1, H2 및 H3로 정렬된다. 이는, 임의의 적합한 방법에 의해 또는 도 1에 나타낸 바와 같이 확인된 CDR이 나타낸 이웃으로부터 제거되어 다른(제2의) 가변 도메인내로 이동됨으로써 제2의 가변 도메인의 CDR을 치환할 수 있음을 의미한다. 실례를 위해 서열 번호 1 및 24의 CDR을 사용하여 서열 번호 2 및 27의 CDR을 대체시킬 수 있다. 또한, 도 1에 나타내지 않은 가변 도메인의 골격을 사용할 수 있다. 다양한 가변 도메인 또는 항체 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 목적한 CDR이 삽입된 가변 도메인은 어떠한 배선 또는 재정렬된 사람 가변 도메인으로부터도 수득될 수 있다. 가변 도메인은 또한 합성적으로 생산될 수 있다. CDR 영역은 재조합체 DNA 기술을 사용하여 각각의 가변 도메인내로 도입될 수 있다. 이를 달성할 수 있는 하나의 수단은 문헌(참조: Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783)에 기술되어 있다. 가변 중쇄 도메인은 가변 경쇄 도메인과 쌍을 이루어 항원 결합 부위를 제공할 수 있다. 또한, 독립된 영역(예를 들면, 가변 중쇄 도메인 단독)을 사용하여 항원을 결합시킬 수 있다.
최종적으로, 다른 양태에서, CDR은, 이웃이 CDR을 정렬하여 RAGE에 특이적인 결합을 허용하는 한 비 가변 도메인 이웃에 이동시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체의 바람직한 양태에서, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및/또는 서열 번호 23의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체는 경쇄(VL)의 가변 도메인이다.
또한 또는 추가로, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45 및/또는 서열 번호 46의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체는 중쇄(VH)의 가변 도메인이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체는 항체이다.
천연적으로 존재하는 항체는 염기성 구조를 공유하는 면역글로불린으로서도 공지되어 있는 구형의 혈장 단백질(약 150 kDa)이다. 이들은 아미노산 잔기에 첨가된 당 쇄를 가지므로, 이들은 당단백질이다. 각각의 항체의 염기성 작용 단위는 면역글로불린(Ig) 단량체(단지 하나의 Ig 단위 함유)이며; 분비된 항체는 또한 IgA와 마찬가지로 2개의 Ig 단위를 갖는 이합체성, 경골 어류 IgM과 같이 4개의 Ig 단위를 갖는 사합체성, 또는 포유동물 IgM과 같이 5개의 Ig 단위를 갖는 오합체성일 수 있다. 본 발명에서, 적합한 양식의 예는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 공지된 항체 아이소타입을 포함하는 천연적으로 존재하는 항체의 양식을 포함한다.
Ig 단량체는 시스테인 잔기들 사이에 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄인, 4개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 "Y"-형태 분자이다. 각각의 중쇄는, 약 440개 아미노산 길이이며; 각각의 경쇄는, 약 220개 아미노산 길이이다. 중쇄 및 경쇄 각각은 이들의 폴딩을 안정화시키는 쇄간 디설파이드 결합을 함유한다. 각각의 쇄는 Ig 도메인이라고 불리우는 구조적 도메인으로 구성되어 있다. 이들 도메인은 약 70 내지 110개의 아미노산을 함유하며 이들의 크기 및 기능에 따라 상이한 범주(예를 들면, 가변 또는 V, 및 불변 또는 C)로 분류된다. 이들은, 2개의 베타 쉬이트(beta sheet)가 "샌드위치" 형태를 생성하여 보존된 시스테인과 다른 하전된 아미노산 사이의 상호작용에 의해 서로 유지된 특징적인 면역글로불린을 갖는다.
α, δ, ε, γ, 및 μ로 나타낸 포유동물 Ig 중쇄의 5개 유형이 존재한다. 존재하는 중쇄의 유형은 항체의 아이소타입을 정의하며; 이들 쇄는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체에서 발견된다.
명확한 중쇄는 크기 및 조성에 있어서 상이한데; α 및 γ는 대략 450개 아미노산을 함유하며 δ는 대략 500개 아미노산을 함유하는 반면, μ 및 ε은 대략 550개 아미노산을 함유한다. 각각의 중쇄는 2개의 영역, 즉 불변 영역(CH) 및 가변 영역(VH)을 갖는다. 하나의 종에서, 불변 영역은 동일한 아이소타입의 모든 항체에서 동일하지만 상이한 아이소타입의 항체에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ은 3개의 직렬(tandem) Ig 도메인, 및 유연성을 부가하기 위한 힌지 영역(hinge region)을 가지며; 중쇄 μ 및 ε은 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 중쇄의 가변 영역은 상이한 B 세포에 의해 생산된 항체에 있어 상이하지만 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생산된 모든 항체에 대해 동일하다. 각각의 중쇄의 가변 영역은, 대략 110개 아미노산 길이이며 단일 Ig 도메인으로 구성된다.
포유동물에서, λ 및 κ로 나타낸 2개 유형의 면역글로불린 경쇄가 존재한다. 경쇄는 2개의 연속적인 도메인: 1개의 불변 도메인(CL) 및 1개의 가변 도메인(VL)을 갖는다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개 아미노산이다. 각각의 항체는 항상 동일한 2개의 경쇄를 함유하며; 경쇄의 단지 1개 유형 κ 또는 λ가 포유동물내 항체당 존재한다. ι 쇄와 같은 경쇄의 다른 유형은 연골 어류 및 경골 어류와 같은 하등 척추동물에서 발견된다.
천연적으로 존재하는 항체 외에, 항체 단편을 포함하는 인공 항체 양식이 개발되어 왔다. 이들 중 일부는 다음에 기술되어 있다. 그러나, 상기 폴리펩타이드(들)을 포함하거나 이들로 이루어져서 RAGE에 대한 특이적인 결합을 허용하는 임의의 다른 항체도 또한 본 발명에 포함된다.
비록 모든 항체의 일반적인 구조가 매우 유사하다고 해도, 제공된 항체의 독특한 특징은 위에서 상세히 기술한 바와 같이 가변(V) 영역에 의해 결정된다. 보다 구체적으로, 가변 루프, 경쇄(VL)상의 각각 3개 및 중쇄(VH) 상의 3개는 항원에 대한 결합, 즉, 이의 항원 특이성에 관여한다. 이들 루프는 상보성 결정 영역(CDR)으로 언급된다. VH 및 VL 도메인 둘다로부터의 CDR은 항원-결합 부위에 기여하므로, 이는 최종 항원 특이성을 결정하는, 어느 하나가 아닌 중쇄 및 경쇄의 조합이다.
따라서, 본원에 사용된 것으로서 용어 "항체"는 천연적으로 존재하는 항체와 구조적 유사성을 가지며 RAGE에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 의미하며, 여기서, 결합 특이성은 예를 들면, 도 1에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1 내지 46의 CDR에 의해 결정된다. 따라서, "항체"는 완전한 길이 또는 전체의 항체, 항원 결합 단편(항체 구조로부터 물리적으로 또는 개념적으로 기원한 단편), 상기한 것들 중 어느 하나의 유도체, 키메라 분자, 다른 폴리펩타이드와 상기한 것들 중의 어느 하나의 융합체, 또는 RAGE에 선택적으로 결합하고 임의로 RAGE의 기능을 억제하는 임의의 대안의 구조/조성을 포함하나, 이에 한정되지 않는, RAGE에 대한 특이적인 결합을 갖는 면역글로불린-기원의 구조에 관한 것으로 의도된다. 항체는 적어도 하나의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 항원 결합 단편은, 도메인 둘다가 함께 특이적인 항원에 결합할 수 있는 방식으로 정렬된, 적어도 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인으로 이루어진다.
"전장" 또는 "완전한" 항체는 (1) 중쇄 측면에서 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 가변 영역; 및 (2) 경쇄의 측면에서, 하나의 도메인, CL을 포함하는 경쇄 불변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 디설파이드 결합에 의해 서로-연결된 2개의 중(H) 및 2개의 경(L) 쇄를 포함하는 단백질을 말한다. 용어 "완전한 항체"와 관련하여, 임의의 항체는 심지어 각각의 도메인이 전체 도메인 구조를 변화시키지 않는 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 추가의 변형을 포함할 수 있는 경우에도, 천연적으로 존재하는 항체(즉, 3개 또는 4개의 불변 도메인의 중쇄 및 1개의 불변 도메인의 경쇄, 및 각각의 가변 도메인을 포함하는)의 전형적인 전체 도메인 구조를 갖는 것을 의미한다.
"항체 단편"은 또한 상기 정의한 적어도 하나의 항원 결합 단편을 함유하며, 단편이 기원하는 완전한 항체와 동일한 기능 및 특이성을 필수적으로 나타낸다. 파파인을 사용한 제한된 단백질용해성 분해는 Ig 프로토타입을 3개의 단편으로 분해한다. 각각 1개의 전체 L 쇄 및 약 1/2의 H 쇄를 함유하는 2개의 동일한 아미노 말단 단편은 항원 결합 단편(Fab)이다. 크기가 유사하지만 이들의 쇄간 디설파이드 결합과 함께 중쇄 둘다의 카복실 말단 절반을 함유하는 제3의 단편은 결정화가능한 단편(Fc)이다. Fc는 탄수화물, 상보체-결합, 및 FcR-결합 부위를 함유한다. 제한된 펩신 분해는 Fab 조각 및 H-H 쇄간 디설파이드 결합을 포함하는, 힌지 영역을 함유하는 단일의 F(ab')2 단편을 생성한다. F(ab')2는 항원 결합에 대해 2가이다. F(ab')2의 디설파이드 결합은 분해되어 Fab'를 수득할 수 있다. 또한, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 함께 융합되어 단일쇄 가변 단편(scFv)을 형성할 수 있다.
완전한 크기의 항체의 제1 세대는 일부 문제점들을 나타내었으므로, 많은 제2 세대 항체들이 항체의 단편들만을 포함하여 왔다. 가변 도메인(Fv)은 하나의 VL 및 하나의 VH로 이루어진 완전한 항원-결합 도메인을 갖는 최소의 단편이다. 유일한 결합 도메인을 갖는 이러한 단편은 예를 들면, 세균 및 진핵 세포내에서 효소적 시도 또는 관련된 유전자 단편의 발현에 의해 생성될 수 있다. 상이한 접근법은, 예를 들면, Fv 단편 단독 또는 Fv 및 제1의 불변 도메인을 포함하는 "Y"의 상부 아암(arm) 중 하나를 포함하는 'Fab'-단편에 사용될 수 있다. 이들 단편은 일반적으로 단일쇄 Fv(scFv)의 생산을 초래하는 2개의 쇄 사이에 폴리펩타이드 결합을 도입시킴으로써 안정화된다. 또한, 디설파이드-결합된 Fv(dsFv) 단편이 사용될 수 있다. 단편의 결합 도메인은 임의의 불변 도메인과 조합되어 전장의 항체를 생산하거나 다른 단백질 및 폴리펩타이드와 융합될 수 있다.
재조합체 항체 단편은 단일쇄 Fv(scFv) 단편이다. 일반적으로, 이는 이의 항원에 대해 고 친화성이며 각종 숙주내에서 발현될 수 있다. 이들 및 다른 특징은, scFv 단편이 의약에 적용될 뿐 아니라 생물공학 적용에도 유효하도록 한다. 위에서 상세히 설명한 바와 같이, scFv 단편에서, VH 및 VL 도메인은 발현 및 폴딩 효능을 개선시키는 친수성 및 유연성 펩타이드 링커와 결합된다. 일반적으로 약 15개 아미노산의 링커가 사용되며 이중 (Gly4Ser)3 링커가 가장 흔히 사용되어 왔다. scFv 분자는 사용된 링커에 따라서 용이하게 단백질분해적으로 분해될 수 있다. 유전 공학 기술의 개발로, 이들 제한은 기능 및 안정성의 개선에 촛점을 맞춘 연구에 의해 실제적으로 극복될 수 있었다. 예는, VH-VL 이합체가 쇄간 디설파이드 결합에 의해 안정화된 디설파이드-안정화된(또는 디설파이드-결합된) Fv 단편의 생성이다. 시스테인은 VL 및 VH 도메인 사이의 계면에 도입되어, 2개의 도메인을 함께 유지하는 디설파이드 브릿지를 형성한다.
scFv의 해리는 이합체[디아바디(diabody)], 삼합체[트리아바디(triabody)] 또는 TandAb 및 플렉시바디(Flexibody)와 같은 보다 큰 응집체로 복합체화될 수 있는 단량체성 scFv를 생성한다.
2개의 결합 도메인을 지닌 항체는 단순한 폴리펩타이드 연결(scFv)2을 갖는 2개의 scFv의 결합을 통하거나 2개의 단량체(디아바디)의 이합체화를 통해 생성될 수 있다. 가장 단순한 설계는 동일하거나 유사(2가 디아바디)할 수 있거나 명확한 항원에 대해 특이성을 갖는(이특이적 디아바디) 2개의 기능적 항원-결합 도메인을 갖는 디아바디이다. 이들 이특이적 항체는 예를 들면, 표적 세포에 대한 신규한 효과기 기능(예를 들면 세포독성 T 세포)의 보충을 허용하여, 이들을 의약에 적용시키기에 매우 유용하도록 한다.
최근에, 중쇄의 4개의 가변 도메인 및 경쇄의 4개의 가변 도메인을 포함하는 항체 양식이 개발되었다. 이들의 예는 4가의 이특이적 항체(TandAb 및 Flexibody, 제조원: 독일 하이델베르크 소재의 Affimed Therapeutics AG)를 포함한다. 이특이적 디아바디와는 대조적으로, 이특이적 TandAb는 단지 1개의 폴리펩타이드로 이루어진 동종이합체이다. 2개의 상이한 쇄로 인하여, 디아바디는 3개의 상이한 이합체를 생성할 수 있으며 이 중 1개만이 기능성이다. 따라서, 이러한 동종 생성물을 생산하여 정제하는 것은 보다 더 간단하고 저렴하다. 또한, TandAb는 생체내에서 보다 우수한 결합 특성(다수의 결합 부위를 2회 소유) 및 생체내 증가된 안정성을 나타낸다. 플렉시바디(Flexibody)는 세포 표면에서 서로 약간 떨어져 있는 2개 분자를 결합시키기 위한 고도의 유연성을 갖는 다가 분자를 생성하는 scFv와 디아바디 다합체 모티프의 조합이다. 2개 이상의 기능성 항원-결합 도메인이 존재하며 이들이 명확한 항원에 대해 특이성을 갖는 경우, 항체는 다특이적이다.
요약하면, 특정한 기재된 서열이 삽입될 수 있거나, 대안으로 이의 필수적인 부분을 형성할 수 있는 특이적인 면역글로불린은 본 발명의 특정 양태를 형성하는 다음의 항체 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다: Fab[가변 경쇄(VL), 가변 중쇄(VH), 불변 경쇄(CL) 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인을 지닌 1가 단편], F(ab')2[힌지 영역에서 디설파이드 브릿지 또는 대안에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편], Fv[VL 및 VH 도메인], scFv[단일쇄 Fv, 여기서 VL 및 VH는 링커, 예를 들면, 펩타이드 링커에 의해 결합되어 있다], 이특이적 항체 분자[항체 또는 수용체 리간드와 같이 다른 펩타이드 또는 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체보다 상이한 결합 특이성을 갖는 제2의 기능적 잔기에 연결된 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 항체 분자], 이특이적 단일쇄 Fv 이합체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디(CH3에 결합된 scFv).
Fv, scFv, 디아바디 분자 또는 도메인 항체(Domantis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정 항체 분자는 디설파이드 브릿지를 혼입시켜 VH 및 VL 도메인을 연결함으로써 안정화시킬 수 있다. 이특이적 항체는 통상의 기술을 사용하여 생산할 수 있으며, 이러한 기술들 중의 특이적인 방법은 화학적 생산, 또는 하이브리드(하이브리도마)로부터의 생산 및 BiTETM 기술(상이한 특이성의 항원 결합 영역과 펩타이드 링커를 소유하는 분자) 및 노브-인투-홀(knobs-into-holes) 가공을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 기술을 포함한다.
따라서, 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디설파이드-연결된 Fv, scFv, (scFv)2, 2가 항체, 이특이적 항체, 다특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 미니바디일 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 사람화된 항체이다. 모노클로날 항체는 단일 모 세포의 모든 클론인 면역 세포의 1개 유형에 의해 생산되기 때문에 동일한 일특이적인 항체이다. 키메라 항체는, 1개 종의 면역글로불린의 적어도 1개 영역이 유전 공학에 의해 다른 종의 면역글로불린의 다른 영역에 융합되어 이의 면역원성을 감소시킨 항체이다. 예를 들면, 쥐 VL 및 VH 영역은 사람 면역글로불린의 나머지 부분에 융합될 수 있다. 특정 유형의 키메라 항체는 사람화된 항체이다. 사람화된 항체는 비-사람 항체의 CDR을 암호화하는 DNA를 사람 항체-생산 DNA와 합침으로써 생산된다. 이후에, 단지 CDR은 비-사람이므로, 수득되는 DNA 작제물을 사용하여 일반적으로 비-사람 비경구 항체 또는 키메라 항체와 같이 면역원성이 아닌 항체를 발현시키고 생산할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체는 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다.
본 발명의 항체와 관련하여 상기 기술한 바와 같이, 천연적으로 존재하는 항체의 각각의 중쇄는 2개 영역, 즉, 불변 영역 및 가변 영역을 갖는다. 면역글로불린의 부류 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 각각 정의하는 포유동물 면역글로불린 중쇄: γ, δ, α, μ 및 ε의 5개 유형이 존재한다.
여기에는, 혈청에서 이들의 풍부성(IgG1이 가장 풍부하다)의 순서로 명명된, 사람에서 4개의 IgG 소부류(IgG1, 2, 3 및 4)가 존재한다. IgG의 소부류의 이들의 Fc 영역 사이에 약 95% 유사성이 존재한다고 해도, 힌지 영역의 구조는 비교적 상이하다. 중쇄 둘다의 Fab 아암(arm)(단편 항원 결합) 및 2개의 카복시-말단 도메인 CH2 및 CH3 사이의 당해 영역은 분자의 유연성을 결정한다. 상부 힌지(아미노-말단을 향함) 분절은 Fab 아암(Fab-Fab 유연성)과 각각의 개개 Fab의 회전 유연성 사이의 각도의 가변성을 허용한다. 하부 힌지 영역(카복시-말단을 향함)의 유연성은 Fc 영역에 대한 Fab-아암의 위치(Fab-Fc 유연성)를 결정한다. 힌지-의존성 Fab-Fab 및 Fab-Fc 유연성은 상보체 할성화 및 Fc 수용체 결합과 같은 추가의 효과기 기능을 개시하는데 있어 중요할 수 있다. 따라서, 힌지 영역의 구조는 4개의 IgG 부류 각각에 이들의 유일한 생물학적 프로파일을 제공한다.
힌지 영역의 길이 및 유연성은 IgG 소부류에서 변한다. IgG1의 힌지 영역은 아미노산 216 내지 231번을 포함하며, 이는 매우 유연하므로, Fab 단편은 이들의 대칭 축에 대해 회전하여 2개의 중쇄간 디설파이드 브릿지 중 첫번째에 중심을 둔 구(sphere)내에서 움직일 수 있다. IgG2는 12개 아미노산 잔기와 4개의 디설파이드 브릿지와 함께, IgG1보다 짧은 힌지를 갖는다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기를 결여하며, 이는 비교적 짧고 여분의 중쇄간 디설파이드물 브릿지에 의해 안정화된 견고한 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 이들 특성은 IgG2 분자의 유연성을 제한한다. IgG3은 62개 아미노산(21개의 프롤린 및 11개의 시스테인)을 함유하며 비유연성의 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하는 이의 유일하게 확장된 힌지 영역(IgG1 힌지와 같이 약 4배의 길이)에 의해 다른 소뷰류와는 상이하다. IgG3에서 Fab 단편은 Fc 단편으로부터 비교적 멀리 떨어져 있어 유연성이 보다 큰 분자를 제공한다. IgG3에서 신장된 힌지는 또한 다른 소부류와 비교하여 고 분자량에 관여한다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1의 영역보다 짧으며 이의 유연성은 IgG1과 IgG2의 유연성의 중간이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 서열 번호 1 내지 46의 상기 서열 중 어느 기능적으로 활성인 변이체는 나타낸 서열 대신에 사용할 수 있다. 예를 들면, 변이체는, 당해 변이체가
a) 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99%의 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열로 이루어진 기능적으로 활성인 단편이거나;
b) 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99% 서열 동질성을 갖는 기능적으로 활성인 변이체이거나;
c) 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열 및 1 내지 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 훨씬 더 바람직하게는 최대 1 내지 25개, 더욱 더 바람직하게는 최대 1 내지 10개, 가장 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)로 이루어진다는 점에서 정의될 수 있다.
a)에서 정의된 단편은 서열 번호 1 내지 46 중 어느 서열로부터 하나 이상의 결실에 의해 기원하는 것을 특징으로 한다. 결실(들)은 C-말단적으로, N-말단적으로 및/또는 내부적으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개, 훨씬 더 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 더욱 더 바람직하게는 1 또는 2개, 가장 바람직하게는 1개의 결실(들)에 의해 수득된다. 본 발명의 기능적으로 활성인 단편은 RAGE에 결합하고, 임의로 RAGE를 억제하는 능력을 포함하는, 완전한 단백질에 의해 나타낸 것과 유사한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 단편의 활성이 서열이 변경되지 않은 항원의 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 특별하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%에 이르는 양인 경우, 항원의 단편은 본 발명과 관련하여 기능적으로 활성이다. RAGE에 대한 결합 활성을 측정하기에 적합한 방법은 실시예에서 제공된다.
b)에서 정의된 변이체는 서열 번호 1 내지 46 중 어느 서열로부터 결실, 첨가 및/또는 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 기원하는 것을 특징으로 한다. 변형(들)은 C-말단적으로, N-말단적으로 및/또는 내부적으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개, 훨씬 더 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 더욱 더 바람직하게는 1 또는 2개, 가장 바람직하게는 1개의 변형(들)에 의해 수득된다. 본 발명의 기능적으로 활성인 변이체는 RAGE에 결합하고, 임의로 RAGE를 억제하는 능력을 포함하는, 완전한 단백질에 의해 나타나는 것과 유사한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 단편의 활성이 서열이 변경되지 않은 항원의 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 특별하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 까지의 양에 이르는 경우, 항원의 단편은 본 발명과 관련하여 기능적으로 활성이다.
c)에서 정의된 변이체는, 이것이 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열과 1 내지 50개의 추가의 아미노산 잔기(들)로 이루어진다는 점을 특징으로 한다. 결실(들)은 C-말단적으로, N-말단적으로 및/또는 내부적으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개, 훨씬 더 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 더욱 더 바람직하게는 1 또는 2개, 가장 바람직하게는 1개의 첨가(들)에 의해 수득된다. 기능적으로 활성인 변이체는 상기와 같이 추가로 정의된다[b)의 변이체 참조].
(b) 및/또는 (c)의 추가의 아미노산 잔기(들)은 천연적으로 존재하거나 달리 존재하는 L- 및/또는 D-아미노산일 수 있는 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 타이로신과 같은 임의의 천연적으로 존재하는 아미노산이다.
그러나, 아미노산은 또한 변형되거나 특이한 아미노산일 수 있다. 이들의 예는 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로익산, 2-아미노헵타노산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리시넴, N-에틸아스파라긴, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, 6-N-메틸라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신 또는 오르니틴이 있다. 또한, 아미노산은 번역 후 변형과 같은 변형에 적용될 수 있다. 변형의 예는 아세틸화, 아미드화, 블록화, 포르밀화, -카복시글루탐산 하이드록실화, 당화, 메틸화, 포스포릴화 및 설페이트화를 포함한다. 하나 이상의 추가의 또는 이종 아미노산 잔기가 펩타이드내에 존재하는 경우, 아미노산 잔기는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
서열 동질성의 퍼센트는 예를 들면, 서열 정렬에 의해 측정할 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 각종 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들면, 문헌(참조: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 또는 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.US. A. 85: 2444, 1988)에 기술되어 있다.
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)이 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI, 메릴랜드주 베쎄스다 소재) 및 인터넷을 포함하는 몇가지 공급원으로부터 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용하기 위해 이용가능하다. 서열 번호 1 내지 46 중 어느 서열의 변이체도 전형적으로 디폴트 매개변수(default parameter)에 대해 설정된 갭화된(gapped) blastp인, NCBI Blast 2.0을 사용하여 특징화된다. 적어도 30개의 아미노산의 아미노산 서열의 비교를 위해, Blast 2 서열 기능을 디폴트 매개변수, (11의 갭 존재 비용, 및 1의 잔기 갭 비용 당)에 대해 설정된 디폴트 BLOSUM62 매트릭스를 사용하는 것이 이용된다. 짧은 펩타이드(대략 30개보다 적은 아미노산)를 정렬하는 경우에, 정렬은 t 디폴트 매개변수(개방 갭 9, 연장 갭 1 패널티)로 설정된 PAM30 매트릭스를 이용하는, Blast 2 서열 기능을 사용하여 수행한다. 15개 이하의 아미노산과 같은 이러한 짧은 윈도우(short window)에 걸친 서열 동질성을 측정하는 방법은 메릴랜드주 베쎄스다에 소재한 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)에서 운영하는 웹사이트에 기재되어 있다.
보다 바람직한 양태에서, 위에서 정의한 바와 같은 기능적으로 활성인 변이체는 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열로부터 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환에 의해 기원한다.
당해 분야의 통상의 기술자가 인식하게 되는 바와 같이, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사하거나 우수한(의도된 목적을 위해) 기능적 및/또는 화학적 특성을 부여하는 것으로 교체하는 치환이다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체된 것인 경우가 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가진 아미노산을 포함한다. 이러한 변형은, 비록 이들이 이러한 특성을 개선시킬 수 있다고 해도, 폴리펩타이드(복합체)의 결합 또는 기능적 억제 특성을 유의적으로 감소시키거나 변경시키도록 설계되어 있지 않다. 치환시키기 위한 목적은 유의적이지 않으며 잔기를 분자의 구조, 분자의 전하 또는 소수성, 또는 분자의 크기를 유지하거나 향상시키기에 보다 우수할 수 있는 것으로 교체하는 것을 포함할 수 있으나 어떠한 방식으로도 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 덜 바람직한 잔기를 동일한 극성 또는 전하 중 하나로 치환시키는 것이 단순히 요구될 수 있다. 이러한 변형은 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 당해 분야에 공지된 표준 기술로 도입시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가가 보존적 아미노산 치환을 달성하는 하나의 특이적인 수단은 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이다. 이후에, 변경된 폴리펩타이드를 당해 분야에서 이용가능하거나 실시예에 기술된 기능적 검정을 사용하여 유지되거나 우수한 기능에 대해 시험한다. 본 발명의 보다 바람직한 양태에서, 서열 번호 1 내지 46 중 어느 서열에서 다수의 보존적 치환은 최대 20, 19, 18, 27, 26, 15, 14, 13, 12 또는 11개, 바람직하게는 최대 10, 9, 8, 7 또는 6개, 특히 최대 5, 4, 3개, 특히 2 또는 1개이다.
본 발명의 다른 국면은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들)에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 분자는 mRNA 또는 cRNA와 같은 RNA의 형태, 또는 예를 들면, 클로닝에 의해 수득되거나 화학적 합성 기술에 의해 생산되거나 또는 이의 조합에 의해 수득된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 3중 가닥, 2중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 또한 센스 가닥으로 공지된 암호화 가닥일 수 있거나 또한 안티-센스 가닥으로 언급되는 비-암호화 가닥일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 핵산 분자는 또한 다른 단일 가닥 및 2중 가닥 DNA 중에서, 단일 가닥 및 2중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 2중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥, 또는 보다 전형적으로 2중 가닥, 또는 3중 가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 또는 단일 가닥 및 2중 가닥 영역의 혼합물인 RNA를 말한다. 또한, 본원에 사용된 것으로서 핵산 분자는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 둘다를 포함하는 3중 가닥 영역을 말한다.
핵산은 또한 유전 암호의 변성의 결과인 서열을 포함한다. 20개의 천연 아미노산이 존재하며, 이들 중 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 정의된다. 따라서, 모든 뉴클레오타이드 서열은 위에서 정의한 바와 같은 펩타이드(들)을 생성하는 본 발명에 포함된다.
또한, 핵산은 하나 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있다. 이러한 핵산은 또한, 예를 들면, 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안전성 및 반감기를 증가시키기 위한 리보스-포스페이트 골격 내에서, 변형을 함유할 수 있다. 따라서, 안전성 또는 다른 이유로 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA는, 이러한 특징이 본원에서 의도되어 있으므로 "핵산 분자"이다. 또한, 이노신과 같은 특정 염기, 또는 2개의 예만을 명명하기 위한 트리틸화된 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA도 본 발명의 내용 내의 핵산 분자이다. 매우 다양한 변형이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 본원에 사용되는 것으로서 용어 핵산 분자는 핵산 분자의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태, 및 특히 단순 세포 및 복합 세포를 포함하는 세포 및 바이러스의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태를 포함한다. 예를 들면, 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환을 달성함으로써 위에서 정의한 바와 같은 항원 또는 이의 단편 또는 기능적 활성 변이체를 암호화하는 어떠한 핵산 분자도 본 발명에 의해 포함된다.
또한, 단편 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자 중 어느 것도 표준 클로닝 기술과 같은 표준 기술을 사용하여 어떠한 바람직한 조절 서열, 리더 서열(leader sequence), 이종 마커 서열 또는 이종 암호화 서열에 기능적으로 연결시킴으로써 융합 단백질을 생성할 수 있다.
본 발명의 핵산은 일반적으로 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 및/또는 폴리머라제 및/또는 리가제 및/또는 리콤비나제에 의한 핵산의 조작 또는 핵산을 생산하기 위해 숙련가에게 공지된 다른 방법에 의해 시험관내에서 또는 배양물내 세포속에서 기본적으로 형성될 수 있다.
바람직한 양태에서, 핵산(들)은 벡터내에 위치한다. 벡터는 숙주 세포내에서 이것이 복제하도록 허용하는 핵산 서열, 예를 들면, 복제 오리진, 하나 이상의 치료학적 서열 및/또는 선택가능한 마커 유전자, 및 암호화된 단백질의 전사, 번역 및/또는 분비를 지시하는 조절 성분과 같은 당해 분야에 공지된 다른 유전 성분을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입하거나, 형질전환하거나 감염시키는데 사용함으로써 세포가 세포에 대해 천연적인 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 세포에 핵산의 도입을 달성하는데 도움을 주는 물질, 예를 들면, 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 피막 등을 포함한다. 표준 분자 생물학 기술에 의해 단백질 발현을 위한 다수 유형의 적절한 발현 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 벡터는 곤충을 포함하는 통상의 벡터 유형, 예를 들면, 바큘로바이러스 발현, 또는 효모, 진균, 세균 또는 바이러스 발현 시스템 중에서 선택된다. 다수 유형이 당해 분야에 공지되어 있는, 다른 적절한 발현 벡터 또한 당해 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터를 수득하기 위한 방법은 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]. 하나의 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 및 아데노바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
당해 방법에 의한 형질감염에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 세균 세포를 포함한다. 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)의 각종 균주는 생물공학 분야에서 숙주 세포로서 널리 공지되어 있다. 비. 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 다른 바실러스 등도 또한 당해 방법에서 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 효모 세포의 많은 균주 또한 본 발명의 펩타이드의 발현을 위한 숙주 세포로서 이용가능하다. 다른 진균 세포 또는 스포도프테라 프루기페데라(Spodoptera frugipedera: Sf9) 세포와 같은 곤충 세포도 또한 발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 달리는, 사람 293 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 원숭이 COS-1 세포주 또는 스위스, BALB/c 또는 NIH 마우스로부터 기원한 쥐 3T3 세포와 같은 포유동물 세포도 사용될 수 있다. 여전히 다른 적합한 숙주 세포, 및 형질감염, 배양, 증폭, 스크리닝, 생산 및 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드(들) 또는 폴리펩타이드 복합체는 본 발명의 핵산을 적합한 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 숙주 세포는 예를 들면, 전사 조절 서열의 조절 하에 본 발명의 핵산을 함유하는 적어도 하나의 발현 벡터를 사용한 전기천공(electroporation)과 같은 통상의 수단에 의해 형질감염시킬 수 있다. 이후에, 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포를 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양한다. 발현된 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적절한 수단에 의해 세포(또는 세포외적으로 발현된 경우 배양 배지로부터) 회수되고, 분리되며 임의로 정제된다. 예를 들면, 단백질은 세포 용해 후 가용성 형태로 분리되거나 공지된 기술을 사용하여 예를 들면, 구아니딘 클로라이드 속에서 추출된다. 경우에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드(들)은 융합 단백질로서 생산된다. 이러한 융합 단백질은 상기 기술된 것들이다. 또한, 예를 들면, 선택된 숙주 세포내에서 단백질의 발현을 향상시키거나 정제를 개선시키기 위해 융합 단백질을 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 분자는 HPLC, FPLC 등을 사용한 정상상 또는 역 상(reverse phase)과 같은 액체 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 무기 리간드 또는 모노클로날 항체 사용); 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chramatography); 고정된 금속 킬레이트 크로마토그래피; 겔 전기 영동 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 통상의 방법들 중 어느 것을 사용하여서도 추가로 정제할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 영역에서 벗어남이 없이 가장 적절한 분리 및 정제 기술을 선택할 수 있다. 이러한 정제는 미생물의 다른 단백질성 및 비-단백질성 물질로부터 실질적으로 유리된 형태의 항원을 제공한다.
본 발명의 다른 국면은 본 발명에 따른 항체를 생산하는 세포에 관한 것이다.
다른 단백질로서 본 발명의 폴리펩타이드는 일련의 세포 발현 시스템 속에서 시험관내에서 생산될 수 있다. 이들은 CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소로부터 기원), 효모[사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피키아(Pichia)], 사상 진균, 형질전환 식물, 및 이. 콜라이를 포함할 수 있다.
초기에, 이. 콜라이 발현 시스템의 용도는 주로 항체 단편의 생산으로 한정되어 왔다. 이들 단편은 이. 콜라이내에서 성공적으로 발현되고 분비되어 왔다. Fab는 진단 적용, 치료제, 및 전장의 모노클로날 항체 내로의 재혼입이 예정된 가변 영역을 시험하는데 흔히 사용된다. 이. 콜라이 생산에 있어서 다른 성공적인 적용은 기능성 단백질과 Fab의 융합이다. 항원 표적화-특이적인 Fab 영역은 기능적 단백질 서열로 융합된다. 세포 사멸이 향상된 표적화된 치료제의 생성은 이러한 시도 중 하나의 적용이다. 항체 단편을 포함하는 다른 전략은 Fc 영역에 대한 수용체 단편(수용체-결합 단편)과 같은 융합 표적 특이적인 단백질 도메인을 포함한다. 항체의 Fc 단편은 면역계의 활성화와 함께 긴 혈청 반감기에 관여된다. Fc 융합의 적용은 융합 파트너의 결합 활성과 Fc 영역의 활성화의 조합에 의존한다. 그러나, 이. 콜라이 내에서 Fc 영역의 생산은 세균 내에서 Fc 단편을 효과적으로 발현하는 것의 곤란성으로 인하여 문제가 될 수 있다. 이는, 이. 콜라이 내에서 완전한 모노클로날 항체의 생산이 달성하기 힘든 목표로 남은 이유를 설명할 수 있다. 하기 기술한 바와 같이, 이. 콜라이 내에서 단편 및 완전한 모노클로날 항체 둘다의 발현을 위한 개선된 방법이 개발되어 왔다. 포유동물 세포 기관(machinery)이 글리코실화와 같은 항체 생산 속성에 중요하지만, 많은 기회들이 효과적인 이. 콜라이 항체 생산 시스템에 존재한다. 번역 가공을 사용하여 이. 콜라이내에서 효과적으로 항체 및 항체 단편의 발현을 위한 유전자를 최적화시켜왔다. 번역 가공은 드믄 코돈의 제거, RNA 2차 구조의 장애 제거(smoothing out), 항체 mRNA를 번역하는 동안 리보솜의 단계별 역학에 영향을 미치는 해독 휴지 시그날(translation pause signal)의 확인 및 조작과 같은 산업 표준 기술을 포함한다. 목적한 항체를 암호화하는 유전자의 조작 후, 재설계된 유전자 작제물은 중쇄 및 경쇄 성분들 둘다를 포함할 수 있는 적절한 벡터 내로 도입된다.
다른 양태에서, 세포는 널리-공지된 통상의 기술에 의해 생성된 바람직한 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주이다. 본 발명의 내용에서, 하이브리도마 세포는 RAGE에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있다. 하이브리도마 세포는 정상의 활성화된, 항체-생산 B 세포를 흑색종 세포와 융합시켜 생성할 수 있다. 특히, 하이브리도마 세포는 다음과 같이 생산할 수 있다: B-세포를 관련 항원으로 시험한 동물의 비장으로부터 제거한다. 이후에, 이들 B-세포를 배양물 속에서 무기한으로 성장시킬 수 있는 흑색종 종양 세포와 융합시킨다. 당해 융합은 세포 막을 보다 더 침투가능하도록 함으로써 수행된다. 암 세포인, 융합된 하이브리드 세포(하이브리도마라고 칭함)는 신속하게 및 무기한으로 증식할 것이며 다량의 목적한 항체를 생산할 것이다. 이들은 선택하여 후속적으로 제한 희석에 의해 클로닝하여야 한다. 인터류킨-6(예를 들면 브리클론)을 함유하는 보충 배지가 당해 단계를 위해 일반적으로 필수적이다. 선택은 새로이 융합된 주요 하이브리도마 세포를 선택-배지, 구체적으로 1 x 농도의 HAT를 함유하는 배지 속에서 약 10 내지 14일 동안 배양함을 통해 수행된다. HAT를 사용한 후 HT 함유 배지를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 클로닝은 양성 주요 하이브리도마 세포의 확인 후 발생한다.
본 발명의 다른 국면은 RAGE에 결합할 수 있고 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함할 수 있는 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이의 복합체) 및 항체는 의학, 치료요법, 진단 뿐 아니라 또한 예를 들면, 검출, 정제, 표지화(labeling) 등을 위한 과학 및 조사를 포함하는 다양한 적용에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드(복합체)에 추가의 성분을 첨가하는 것이 필수적일 수 있다. 특히, 분자의 검출을 위한 마커를 이에 가하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 마커는 태그(예를 들면, 6개의 His(또는 HexaHis) 태그, Strep 태그, HA 태그, c-myc 태그 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그), 형광성 마커(예를 들면, FITC, 플루오레세인, 로다민, Cy 염료 또는 Alexa), 효소 표지(예를 들면, 페니실리나제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제), 방사성 표지(예를 들면, 3H, 32P, 35S, 125I 또는 14C)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 폴리펩타이드(복합체)를 지지체, 특히 어레이, 비드[예를 들면, 유리 또는 자기(magnetic)], 섬유, 필름 등과 같은 고체 지지체에 가할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함하는 결합 분자, 및 추가의 성분을 적합한 추가 성분을 선택함으로써 의도된 용도로 조정할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 국면은 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩타이드 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제는 통상적이며 완충제, 안정화제, 희석제, 방부제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 본원에 기재된 폴리펩타이드/핵산의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술하고 있다. 약제학적 조성물 중의 활성 성분(폴리펩타이드 또는 핵산)의 내용물은, 이것이 치료 또는 예방에 유용한 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 총 조성물당 0.0000001 내지 10 중량%를 함유한다.
일반적으로, 담체 또는 부형제의 특성은 사용되는 투여의 특정 방식에 의존할 것이다. 예를 들면, 비경구 제형은 일반적으로 비히클(vehicle)로서 물, 생리학적 염수, 균형을 이룬 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약제학적으로 및 생리학적으로 허용되는 유액을 포함하는 주사가능한 유액을 포함한다. 고체 조성물(예를 들면, 산제, 환제, 정제 또는 캅셀제 형태)의 경우, 통상적인 무-독성 고체 담체는 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 외에도, 투여될 약제학적 조성물은 소량의 무-독성 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 방부제, 및 예를 들면, 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트와 같은 pH 완충제 등을 함유할 수 있다.
일반적으로, 적절한 양의 약제학적으로 허용되는 염을 담체 속에 사용하여 제형이 등장성이 되도록 한다. 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 시트레이트, 포스페이트, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 염-형성 대-이온(counter-ion), 예를 들면, 나트륨 및 칼륨; 저 분자량(>10개 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 히스티딘, 글루타민, 라이신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 글리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물; 단당류; 이당류; 다른 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함하는 항산화제; 및/또는 방부제, 예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸을 포함하는, 허용되는 부형제, 담체 또는 안정화제는 바람직하게는 사용된 용량 및 농도에서 무-독성이다.
바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 보조제와 같은 면역자극 물질을 추가로 포함한다. 보조제는 투여 방법을 기초로 선택될 수 있으며 무기 오일-계 보조제, 예를 들면, 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant) 및 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant), 몬타나이드 불완전 세픽 보조제(Montanide incomplete seppic adjuvant)(예: ISA), 수중유 에멀젼 보조제, 예를 들면, Ribi 보조제 시스템, 무라밀 디펩타이드를 함유하는 신탁스 보조제 제형(syntax adjuvant formulation), 또는 알루미늄 염 보조제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 보조제는 무기 오일계 보조제, 가장 바람직하게는 ISA206(SEPPIC, 프랑스, 파리)이다. 보다 바람직한 양태에서, 면역조절 물질은 다중 양이온성(polycationic) 중합체, 특히 폴리아르기닌, 면역조절성 데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 같은 다중 양이온성 펩타이드, 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프(motif), 필수적으로 KLKLLLLLKLK (서열 번호 51)을 함유하는 펩타이드, 신경활성 화합물, 특히 사람 성장 호르몬, 명반, 보조제, 또는 이의 조합물을 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 조합은 다중 양이온성 중합체 및 면역조절성 데옥시뉴클레오타이드의 조합물 또는 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프를 함유하는 펩타이드 및 면역조절성 데옥시뉴클레오타이드 중 어느 하나이다. 보다 바람직한 양태에서, 다중 양이온성 중합체는 다중양이온성 펩타이드이다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 양태에서, 면역조절성 물질은 적어도 하나의 면역조절성 핵산이다. 면역조절성 핵산은 예를 들면, 천연 또는 인공의 CpG 함유 핵산, 비-척추동물로부터 기원하거나 정의된 염기 내용(예를 들면, 제WO 96/02555에 기술된 바와 같이)에서 메틸화되지 않은 사이토신-구아닌 디뉴클레오타이드(CpG)를 함유하는 짧은 올리고뉴클레오타이드(ODN)의 형태의 핵산의 짧은 구간(stretch)이다. 달리는, 또한 예를 들면, 제WO 01/93903호에 기술된 바와 같은 이노신 및 사이티딘을 기초로 한 핵산, 또는 데옥시-이노신 및/또는 데옥시유리딘 잔기를 함유하는 데옥시핵산(제WO 01/93905호 및 제WO 02/095027호에 기술됨)이 본 발명에서 면역조절성 핵산으로 바람직하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상이한 면역조절성 핵산의 혼합물을 본 발명에서 사용한다. 또한, 상술한 다중 양이온성 화합물을 앞에서 언급한 바와 같이 면역조절성 핵산 중 어느 것과 합할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조합은 제WO 01/93905호, 제WO 02/32451호, 제WO 01/54720호, 제WO 01/93903호, 제WO 02/13857호 및 제WO 02/095027호 및 호주 특허원 제A 1924/2001호에 기술된 것에 따른다.
약제학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩타이드 또한 핵산을 포함하나; 이는 또한 본 발명의 상이한 폴리펩타이드 및/또는 핵산을 함유하는 칵테일(cocktail)(즉, 단순한 혼합물)도 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드(들)은 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드와 함께 염을 형성할 수 있는 적합한 산 및 염기는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며, 무기 및 유기 산 및 염기를 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 조성물은 숙련가에게 공지되거나 본원에 정의된 바와 같이, 바람직하게는 패혈증, 패혈성 쇼크, 리스테리아증, 류마티스 및 건선 관절염 및 내장 질환(intestinal bowel disease)을 포함하는 염증성 질환, 암, 관절염, 크론병(Crohn's disease), 만성 급성 염증성 질환, 심혈관 질환, 발기 부전, 당뇨병, 당뇨병의 합병증, 혈관염, 신장병, 망막병증, 신경병증, 아밀로이드증, 죽상경화증, 말초 혈관 질환, 심근경색, 울혈성 심부전, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병 신장병증 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 특히 당뇨병 및/또는 염증성 장애로 이루어진 그룹 중에서 선택된 RAGE-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위해 의도되거나 사용된다.
본 발명의 다른 국면은
(a) 대상체로부터 채취한 시료를 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체 또는 결합 분자와 접촉시키는 단계; 및
(b) RAGE의 양을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서, 대조군과 비교하여 RAGE 수용체의 변경된 양이 RAGE-관련 질환 또는 장애의 지표인, 위에서 정의한 바와 같은 RAGE-관련 질환 또는 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 정상 및 비정상 수준의 측정을 포함하여, 세포 및 조직 또는 체액 속에서 본 발명의 폴리펩타이드 또는 결합을 사용하여 RAGE 또는 RAGE 수준을 검출하기 위한 정량적 및 진단 검정과 같은 진단 검정에 관한 것이다. 숙주로부터 기원한 시료 속에서, 폴리펩타이드 또는 항체의 수준을 측정하는데 사용될 수 있는 검정 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이러한 검정 방법은 방사선 면역검정, 경쟁적-결합 검정, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 검정을 포함한다. 이들 중에서, ELISA가 흔히 바람직하다. ELISA 검정은 초기에 폴리펩타이드, 특히 RAGE, 바람직하게는 모노클로날 항체에 대해 특이적인 항체를 제조함을 포함한다. 또한, 모노클로날 항체에 결합하는 리포터 항체(reporter antibody)가 일반적으로 제조된다. 리포터 항체는 방사선 활성, 형광성 또는 효소 시약, 예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 효소와 같은 검출가능한 시약에 부착된다.
본 발명은 본원에 기술된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않는데, 그 이유는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 양태만을 기술할 목적이며 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 및 첨부된 특허청구의 범위에 사용된 것으로서, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 유사하게, 단어 "포함하다", "함유하다" 및 "포괄하다"는 배타적이라기 보다는 포괄적인 것으로 해석되어야 한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명의 분야에서 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다고 해도, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기술되어 있다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 설명하지만, 실시예들은 단지 실례를 설명할 목적으로 포함되고 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
도 1: CDR을 갖는 경쇄(좌측) 및 중쇄(우측)의 가변 영역.
도 2: 15nM에서 LP08062(Rage)를 사용하여 시험한 항Rage 하이브리도마의 ka/kd.
도 3: 선택된 항RAGE 모노클로날 항체의 Kd 범위.
도 4: RAGE S100A6 상호작용의 억제.
도 5: RAGE 513_LP08062(상부) 및 501-4 RAGE-1 050908 b의 바이아코어 분석(Biacore analysis).
실시예:
실시예 1: 항체의 생성 및 확인
항체의 생성 및 확인은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 방법에 따라 달성하여 왔다. 이러한 방법은 예를 들면, 다음 문헌에 기재되어 있다: (i) Handbook of therapeutic antibodies Wiley-VCH, Weinheim; ISBN-10:3-527-31453-9; ISBN-13:978-3-527-31453-9-; 및/또는 (ii) Therapeutic monoclonal antibodies: from bench to clinic; ISBN: 978-0-470-11791-0; 및/또는 (iii) Current protocols in Immunology; John Wiley and Sons, Inc.; 2009년 10월 1일 마지막 업데이트됨.
실시예 2: 유리한 항체의 선택
이용가능한 항체들 중에서 "상위 23" 항체들을 확인하고
- 결합 상수(KD ≤ 1.0 E-9 M 및 koff ≤ 2.0 E-3 s-1 ) 및
- 래트, 마우스 및 사이노(Cyno) sRAGE와의 교차 종 반응성을 기초로 선택하였다.
항-rage 모노클로날 항체의 가변 영역에 대한 다음 아미노산 서열을 측정하였다:
단백질 56 RAGE-1
VL 56: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 1
1 divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg invawyqqkp gqspkaliys
51 asyrysgvpd rftgsgsgtd ftliisnvqs edlaeyfcqq ynnyprtfgg
101 gtkleik
VH 56: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 115 aa; 서열 번호 24
1 qvqlqqsgpe lvkpgasvri sckasgytft syfihwvkqr pgqglewigw
51 iypgnvntky nekfkdkatl tadkssstay mqlsnltsed savyfcvrgq
101 lgdywgqgit ltvss
단백질 95 RAGE-1
VL 95: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 109 aa; 서열 번호 2
1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftglt
51 ggtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf
101 gggtkltvl
VH 95: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 115 aa; 서열 번호 25
1 qvqlqqpgae lvkpgasvkl sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewige
51 snpsngrtny nekfknkatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarap
101 yygfdywgqg ttltvss
단백질 130 RAGE-1
VL 130: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 106 aa; 서열 번호 3
1 qivltqspai msaspgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwisdt
51 sklasgvpar fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpptfggg
101 tkleik
VH 130: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 26
1 evqlvesggg lvkpggslkl scaasgftfs syvmswvrqs pekrlewvae
51 issggsytyy pdtvtgrfti srdndkntly lemsslrsed tamyycarpp
101 ygkdamdywg qgtsvtvss
단백질 140 RAGE-1
VL 140: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 108 aa; 서열 번호 4
1 qivltqspai msaspgekvt iscsasssvs ymywyqqkpg sspkpwiyrt
51 snlasgvpar fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqy hsyppmytfg
101 ggtkleik
VH 140: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 121 aa; 서열 번호 27
1 qvqlqqpgae lvkpgasvrl sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewige
51 inpsngrtny nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycardg
101 lgyrpiamdy wgqgtsvtvs s
단백질 152 RAGE-1
VL 152: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 110 aa; 서열 번호 5
1 divltqspas lavslgqrat iscrasksvg tsdssymhwy qqkpgqppkl
51 liylasnles gvparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqhsrelyt
101 fgggtkleik
VH 152: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 115 aa; 서열 번호 28
1 dvqlqesgpd lvkpsqslsl tctvtgysit sgyswhwirq fpgnklewmg
51 yihysgstny npslksrisi trdtsknqff lqlnsvtted tatyycargg
101 dfaywgqgtl vtvsa
단백질 158 RAGE-1
VL 158: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 113 aa; 서열 번호 6
1 sdvvltqtpl slpvnigdqa sisckstksl lnsdgftyld wylqkpgqsp
51 qlliylvsnr fsgvpdrfsg sgsgtdftlk isrveaedlg vyycfqsnyl
101 pltfgggtkv eik
VH 158: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 29
1 qiqlvqsgpe lkkpgetvki sckasgytft dysmhwvkqa pgkglkwmgw
51 intetgepty addfkgrfaf sletsastay llinnlkted tatyfcardy
101 lyyyamdywg qgtsvtvss
단백질 164 RAGE-1
VL 164: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 7
1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvg tyvswyqqkp eqspklliyg
51 asnrytgvpd rftgsgsatd ftltissvqa edladyhcgq sytypytfgg
101 gtkleik
VH 164: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 116 aa; 서열 번호 30
1 qvqlqqpgse lvrpgasvkl sckasgytft nywmhwvkqr pgqglewign
51 iypgsgstny dekfkskatl tvdtssstay mqlssltsed savyyctrlr
101 rgiaywgqgt Ivtvsa
단백질 166 RAGE-1
VL 166: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 112 aa; 서열 번호 8
1 nimmtqspss lavsagekvt msckssqsvl yssnqknyla wyqqkpgqsp
51 klliywastr esgvpdrftg sgsgtdftlt issvqaedla vyychqylss
101 ytfgggtkle ik
VH 166: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 31
1 qvqlqqsgpe lvkpgtsvri sckasgytft syyihwvkqr pgqglewigw
51 iypgnvitny hekfkgkasl tadkssstay mqlssltsed savyfcared
101 pfaywgqgtl vtvsa
단백질 173 RAGE-1
VL 173: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 9
1 divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg tnvawyqqkp gqspkaliys
51 asyrysgvpd rftgsgsgtd ftltisnvqs edlaeyfcqq ynsypltfga
101 gtkleik
VH 173: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 120 aa; 서열 번호 32
1 evkleesggg lvqpggsmkl scvasgftfs nywmnwvrqs pekglewvae
51 irlksnnyat hyaesvkgrf tisrddskss vylqmndlra edpgiyycir
101 dygnyamdhw gqgtsvtvss
단백질 183 RAGE-1
VL 183: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 10
1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvg tyvswyqqkp eqspklliyg
51 asnrytgvpd rftgsgsatd ftltissvqa edladyhcgq sysypytfgg
101 gtkleik
VH 183: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 116 aa; 서열 번호 33
1 evqlqqsgtv larpgasvkm sckasgysft sywmhwvkqr pgqglewiga
51 ifpgnsdtty nqkfkgkakl tavtsastay melssltned savyyctglr
101 rgfpywgqgt Ivtvsv
단백질 184 RAGE-1
VL 184: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 111 aa; 서열 번호 11
1 divltqspas lavslgqrat iscrasksvs tsgysymhwy qqkpgqppkl
51 liylashles gvparfsgsg sgtdfslnih pveeedaaty ycqhsrelpw
101 tfgggtklei k
VH 184: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 120 aa; 서열 번호 34
1 qvqlqqsgae lvrpgtsvkv sckasgyaft nyliewvkqr pgqglewigm
51 inpgsggtny nekfkgkatl tadkssstay mqlssltsdd savyfcargr
101 gghyryfdvw gagttvtvss
단백질 210 RAGE-1
VL 210: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 110 aa; 서열 번호 12
1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli
51 ggtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhfwv
101 fgggtkltvl
VH 210: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 35
1 hseiqlqqtg pelvkpgasv kisckasgys ftdyimvwvk qshgkslewi
51 gtinpyygst synlkfkgka tltvdkssst anmqlnslts edsavyycar
101 lrlyamdywg qgtsvtvss
단백질 240 RAGE-1
VL 240: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 113 aa; 서열 번호 13
1 sdvvltqtpl slpvsigdqa sisckstksl lnsdgftyld wylqkpgqsp
51 qlliylvsnr fsgvpdsfsg sgsgtdftlk isrveaedlg vyycfqsnyf
101 pltfgggttl eik
VH 240: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 36
1 qiqlvqsgpe lkkpgetvki sckasgytft dysmhwvkqa pgkglkwmgw
51 intetgepty addfkgrfaf sletsastay lqinnlkned tatyfcardy
101 lyyyamdywg qgtsvtvss
단백질 250 RAGE-1
VL 250: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 14
1 divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg tnvawyqqkp gqspkaliys
51 asyrysgvpd rftgsgsgtd ftltisnvqs edlaeffcqq ynsypltfga
101 gtklelk
VH 250: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 120 aa; 서열 번호 37
1 evkleesggg lvqpggsmkl scvasgftfs nywmnwvrqs pekglewvae
51 irlksnnyat hyaesvkgrf tisrddskss vylqmnnlra edtgiyfcir
101 dygnyamdyw gqgtsvtvss
단백질 253 RAGE-1
VL 253: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 113 aa; 서열 번호 15
1 divmsqspss lavsvgekvt msckssqtll yssnqknyla wyqqkpgqsl
51 klliywastr esgvpdrfag sgsgtdftlt issvkaedla vyycqqyfgy
101 pytfgggtkl eik
VH 253: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 118 aa; 서열 번호 38
1 qvqlqqsgpe lvkpgasvri sckasgytft dyyihwvkqr pgqglewigw
51 iypgnvitky nekfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcaryd
101 ydyamdywgq gtsvtvss
단백질 259 RAGE-1
VL 259: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 109 aa; 서열 번호 16
1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli
51 ggtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf
101 gggtkltvl
VH 259: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 117 aa; 서열 번호 39
1 qvqlqqsgae lvrpgtsvkv sckasgyaft nylidwvnqr pgqglewigv
51 inpgsggtny nekftgkatl tadkssstay mqlssltsdd savyfcarrr
101 vdtmdywgqg tsvtvss
단백질 283 RAGE-1
VL 283: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 109 aa; 서열 번호 17
1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli
51 rgtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf
101 gggtkltvl
VH 283: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 118 aa; 서열 번호 40
1 qvqlqqsgae lvrpgtsvkv sckasgyaft nyliewvkqr pgqglewigv
51 inpgsggtny serfkgkatl tadkssstay mqlssltsdd savyfcasyr
101 ydggmdywgq gtsvtvss
단백질 316 RAGE-1
VL 316: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 111 aa; 서열 번호 18
1 divltqspas lavslgqrat iscrasksvs isgysylhwn qqkpgqspkl
51 liylasnles gvparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqhsrelpy
101 tfgggtklei k
VH 316: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 118 aa; 서열 번호 41
1 qvqlqqsgpe lvrpgasvkm sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewigm
51 idpsnsetrl nqkfkdkatl nvdkssntay mqlssltsed savyycarnf
101 ygsslrvwga gttvtvss
단백질 326 RAGE-1
VL 326: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 108 aa; 서열 번호 19
1 divmtqsqkf mstsvgdrvs itckasqnvg tavawyqqkp gqspklliys
51 asnrytgvpd rftgsgsgtd ftltisnmqs edladyfcqq yssyplltfg
101 agtklelk
VH 326: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 42
1 evklvesggg lvkpggslkl scaasgfafs sydmswvrqt pekrlewvat
51 issggsytsy pdsvqgrfti srdnarntly lqmsslrsed talyycassq
101 lppyamdywg qgtsvtvss
단백질 347 RAGE-1
VL 347: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 20
1 diqmtqsssy lsvsIgGrvt itckasdrin ywlawyqqkp gnaprllisg
51 attletgvps rfsgsgsgkd ytlsitslqt edvatyycqq ywstpytfgg
101 gtklelk
VH 347: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 118 aa; 서열 번호 43
1 qvqlqqsgae lakpgasvkm scrasgytft dywmhwvkqr pgqglewigf
51 inpstvytey ipkfkdkatl tadkssstay mqlssltsed savyycarsd
101 ggwyfdvwga gttvtvss
단백질 499 RAGE-1
VL 499: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 107 aa; 서열 번호 21
1 divmtqshkf mstsvgdrvs itckasqdvs tavawyqqkp gqspklliys
51 asyrytgvpd rftgsgsgtd ftftissvqa edlavyycqq hyntprtfgg
101 gtkleik
VH 499: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 113 aa; 서열 번호 44
1 evqlqqsgtv larpgasvkm sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewiga
51 iypgdsdtyy nqkfkgkakl tavtststay melssltned savyyctrnw
101 dywgqgttlt vss
단백질 501-4 RAGE-1
VL 501-4: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 109 aa; 서열 번호 22
1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli
51 ggtnnrapdv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf
101 gggtkltvl
VH 501-4: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 120 aa; 서열 번호 45
1 evmlvdsggg lvkpggslkl scaasgftfr syamswvrqt pekrlewvat
51 issggsytyy pdsvrgrftt srdngkntly lqmsslrsed tamyycarhg
101 gnysawftyw gqgtlvtvsa
단백질 529 RAGE-1
VL 529: 경쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 109 aa; 서열 번호 23
1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli
51 ggtnnrspgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhlvf
101 gggtkltvl
VH 529: 중쇄에 대한 가변 영역; 전체 분자 길이: 119 aa; 서열 번호 46
1 hseiqlqqtg pelvkpgasv kisckasgys ftdyimlwvk qshgkslewi
51 gninpyygst fynlkfkgka tltvdkssst aymqlnslts edsavyycar
101 sdywyfdvwg agttvtvss
실시예 3: S100A12 및 S100A6를 사용한 경쟁 ELISA에 있어서 선택된 mAb의 특성화
S100A12 경쟁 ELISA 검정을 위해, 웰을 S100A12로 0.5 ㎍/웰에서 피복하였다. 이후에, 10㎍/mL에서 RAGE-Fc 및 10㎍/mL에서 경쟁하는 mAb를 실온에서 30분 동안 예비-항온처리하였다. 혼합물을 S100A12-피복된 플레이트로 이동시키고 실온에서 2시간 동안 교반 하에 항온처리하였다. 결합된 RAGE-Fc를 항-hIgG Fc-특이적인-POD로 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 사용하여 450 nm에서 검출하였다. 시험한 27개 항체 중 어느 것도 RAGE-Fc/S100A12 상호작용에 있어서 길항제 활성을 나타내지 않았다.
S100A6 경쟁 ELISA 검정을 위해, 웰을 S100A6으로 0.5㎍/웰에서 피복하였다. 이후에, 10㎍/mL에서 RAGE-Fc 및 10㎍/mL에서 경쟁하는 mAb를 실온에서 30분 동안 예비-항온처리하였다. 혼합물을 S100A6-피복된 플레이트로 이동시키고 실온에서 2시간 동안 교반 하에 항온처리하였다. 결합된 RAGE-Fc를 항-hIgG Fc-특이적인-POD로 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 사용하여 450 nm에서 검출하였다. 27개의 항체 중 7개가 RAGE-Fc/S100A6 상호작용을 파괴할 수 있음이 밝혀질 수 있었다(15 내지 35% 억제).
5개의 mAb(>20%의 억제 효과를 나타냄; LP08103; LP08104; LP08105; LP08108 및 LP08122D)의 경우 RAGE-S100A6 결합(IC50)의 억제의 용량-의존성을 시험하였다. 이를 위해, S100A6을 사용한 피복을 위에 기술한 바와 같이 수행하였다. 10μg/mL에서 RAGE-Fc를 경쟁하는 mAb(100 ㎍/ml에서 시작하여 2-배 일련 희석)와 함께 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 결합은 450nm에서 TMB1 성분 HRP를 사용하여 항 IgG Fc-특이적인 항체 퍼옥시다제 접합체에 의해 검출하였다.
다음의 IC50 값들은 시험한 항체에 대해 수득하였다(참조: 또한 도 4):
56 RAGE-1 (LP08103): IC50 = 1.16 [0.47; 2.80] ㎍/mL (7.73nM)
240 RAGE-1 (LP08108): IC50 = 6.66 [4.33; 10.20] ㎍/mL (44.4nM)
166 RAGE-1 (LP08122): IC50 = 8.33 [6.20; 11.20] ㎍/mL (55.5nM)
158 RAGE-1 (LP08105): IC50 = 6.79 [5.01; 9.21 ] ㎍/mL (45.3nM)
대조군 XT-M4 (LP08130): IC50 = 5.20 [3.18; 8.53] ㎍/mL (34.6nM)
152 RAGE-1(LP08104)을 사용하여 용량 효과는 수득되지 않았다.
요약하면, 4개의 mAb는 hRAGE-S100A6 상호작용을 50%의 최대 억제 효과로 파괴하였다.
실시예 4: 경쟁 검정에서 확인된 mAb의 특성화
경쟁 검정을 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 작업 과정에 따라 수행하였다. 이러한 작업 과정은 실시예 1에 나열된 바와 같은 안내서 내에 포함된다. 경쟁 검정의 결과는 표 1에 편집되어 있다.
Figure pct00001
경쟁 ELISA 검정은
- 5개의 mAb가 hRAGE-S100B 상호작용, 즉
158 RAGE-1 (LP08105)을 IC50 = 0.109 [0.071; 0.166] ㎍/mL(0.72 nM)으로
240 RAGE-1 (LP08108)을 IC50 = 0.123 [0.073; 0.204] ㎍/mL (0.82 nM)으로
166 RAGE-1 (LP08122)을 IC50 = 0.128 [0.093; 0.176] ㎍/mL (0.85 nM)으로
253 RAGE-1 (LP08127)을 IC50 = 0.108 [0.082; 0.131 ] ㎍/mL (0.72 nM)으로
326 RAGE-1 (LP08137)을 IC50 = 0.097 [0.064; 0.148] ㎍/mL (0.64 nM)으로
XT-M4(LP08130)을 IC50 = 0.208 [0.117; 0.368] ㎍/mL (1.37 nM)으로 강력하게 차단하고,
- 2개의 mAb가 hRAGE-HMGB1 상호작용, 즉
158 RAGE-1 (LP08105)을 IC50 = 0.290 [0.189; 0.447] ㎍/mL (1.39 nM)으로
240 RAGE-1 (LP08108)을 IC50 = 0.310 [0.270; 0.463] ㎍/mL (2.06 nM)으로
XT-M4 (LP08130)을 IC50 = 0.272 [0.168; 0.439] ㎍/mL (1.79 nM)으로 차단하며,
- 4개의 mAb가 hRAGE-S100A6 상호작용, 즉
56 RAGE-1 (LP08103)을 IC50 = 1.16 [0.47; 2.80] ㎍/mL (7.73 nM)으로
240 RAGE-1 (LP08108)을 IC50 = 6.66 [4.33; 10.20] ㎍/mL (44.4 nM)으로
166 RAGE-1 (LP08122)을 IC50 = 8.33 [6.20; 11.20] ㎍/mL (55.5 nM)으로
158 RAGE-1 (LP08105)을 IC50 = 6.79 [5.01 ; 9.21] ㎍/mL (45.3 nM)으로
XT-M4 (LP08130)을 IC50 = 5.20 [3.18; 8.53] ㎍/mL (34.6 nM)으로 파괴함을 나타내었다.
실시예 5: 바이아코어 검정(Biacore Assay)에서 mAb의 특징화
당해 검정은 CM5 칩 상에서 고정된 항-마우스 Fc IgG를 사용한 포획 검정을 기초로 한다. 항-Fc 항체의 고정화를 위해 HBS-EP를 작동 완충액(running buffer)으로 사용하였다. CM5 칩에 대한 표준 아민 커플링을 11분의 접촉 시간 및 10μl/분의 유속에서 수행하였다. 10mM 아세트산나트륨 pH 5.0을 고정화 완충액으로 사용하였다. 단백질 농도(항-마우스 Fc, Biacore BR-1008-38)는 100㎍/mL이었다.
결합 분석을 위해 작동 완충액 속에서 1/10(유속 5μl/분)로 희석된 SN 항-RAGE mAb 및 작동 완충액 속에서 15 nM(유속 50μl/분)으로 희석된 sRAGE (V-C1 -C2) 로트(lot) LP08062를 각각 분석물 및 리간드로서 사용하였다(작동 완충액: HBS-P + BSA 12mg/mL + CM 덱스트란 12mg/mL 및 재생 용액: 10mM 글리신 pH 1.7). 랭뮤어(Langmuir) 1:1 분석을 핏팅 모델(fitting model)로서 사용하였다. 결과를 표 2에 요약해서 나타낸다.
Figure pct00002
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> POLYPEPTIDES FOR BINDING TO THE "RECEPTOR FOR ADVANCED GLYCATION ENDPRODUCTS" AS WELL AS COMPOSITIONS AND METHODS INVOLVING THE SMAE <130> DE2009/203 <150> EP 09290778.1 <151> 2009-10-09 <150> EP 09290845.8 <151> 2009-11-05 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for light chain <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for light chain <400> 2 Gln 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Thr 65 70 75 80 Ala Asn Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Leu Arg Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 36 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 37 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Phe Cys Ile Arg Asp Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val Ile Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Asp Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Val Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Tyr Arg Tyr Asp Gly Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 41 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Phe Tyr Gly Ser Ser Leu Arg Val Trp Gly Ala Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 42 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Gln Leu Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Asn Pro Ser Thr Val Tyr Thr Glu Tyr Ile Pro Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 44 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asn Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 45 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 45 Glu Val Met Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Gly Asn Tyr Ser Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region for heavy chain <400> 46 His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Thr Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Leu 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif after CDR-L3 <220> <221> Variant <222> (3)..(3) <223> Xaa = any amino acid <400> 47 Phe Gly Xaa Gly 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif before CDR-H1 <220> <221> Variant <222> (2)..(2) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> Variant <222> (3)..(3) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> Variant <222> (4)..(4) <223> Xaa = any amino acid <400> 48 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif before CDR-H2 <400> 49 Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 <210> 50 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Claims (15)

  1. 적어도 2개의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체로서,
    상기 적어도 2개의 아미노산 서열이
    - 서열 번호 1 및 서열 번호 24,
    - 서열 번호 2 및 서열 번호 25,
    - 서열 번호 3 및 서열 번호 26,
    - 서열 번호 4 및 서열 번호 27,
    - 서열 번호 5 및 서열 번호 28,
    - 서열 번호 6 및 서열 번호 29,
    - 서열 번호 7 및 서열 번호 30,
    - 서열 번호 8 및 서열 번호 31,
    - 서열 번호 9 및 서열 번호 32,
    - 서열 번호 10 및 서열 번호 33,
    - 서열 번호 11 및 서열 번호 34,
    - 서열 번호 12 및 서열 번호 35,
    - 서열 번호 13 및 서열 번호 36,
    - 서열 번호 14 및 서열 번호 37,
    - 서열 번호 15 및 서열 번호 38,
    - 서열 번호 16 및 서열 번호 39,
    - 서열 번호 17 및 서열 번호 40,
    - 서열 번호 18 및 서열 번호 41,
    - 서열 번호 19 및 서열 번호 42,
    - 서열 번호 20 및 서열 번호 43,
    - 서열 번호 21 및 서열 번호 44,
    - 서열 번호 22 및 서열 번호 45, 및/또는
    - 서열 번호 23 및 서열 번호 46이고;
    여기서, 이들 서열이 "개선된 당화반응 최종 생성물에 대한 수용체"(Receptor for Advanced Glycation Endproducts: RAGE)에 대한 특이적인 결합을 허용하도록 정렬되어 있는, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1 내지 23 중 어느 서열의 기능적으로 활성인 변이체가 서열 번호 1 내지 23의 각각의 서열의 상보성 결정 영역 L3(CDR L3), 바람직하게는 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3을 포함하고/하거나; 여기서 서열 번호 24 내지 46 중 어느 서열의 기능적으로 활성인 변이체가 서열 번호 24 내지 46의 각각의 서열의 상보성 결정 영역 H3(CDR H3), 바람직하게는 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    i) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및/또는 서열 번호 23의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체가 경쇄(VL)의 가변 도메인이고/이거나;
    ii) 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45 및/또는 서열 번호 46의 아미노산 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체가 중쇄(VH)의 가변 도메인인, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체가 항체인, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디설파이드-결합된 Fv, scFv, (scFv)2, 2가 항체, 이특이적 항체, 다특이적 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및/또는 미니바디(minibody)인, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체가 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgGI 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적으로 활성인 변이체가
    a) 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99%의 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열로 이루어진 기능적으로 활성인 단편이거나;
    b) 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99% 서열 동질성을 갖는 기능적으로 활성인 변이체이거나;
    c) 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열 및 1 내지 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 더 바람직하게는 최대 1 내지 25개, 훨씬 더 바람직하게는 최대 1 내지 10개, 가장 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)로 이루어진, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기능적으로 활성인 변이체가 서열 번호 1 내지 46 중 어느 아미노산 서열로부터 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 유도되는, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들).
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산(들)이 벡터 내에 위치하는, 핵산(들).
  11. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항체를 생산하는 세포.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함하고 RAGE에 결합할 수 있는 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 및/또는 제9항에 따른 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 의약으로서의 용도를 위한 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 패혈증, 패혈성 쇼크, 리스테리아증(listeriosis), 류마티스 및 건선 관절염 및 내장 질환(intestinal bowel disease)을 포함하는 염증성 질환, 암, 관절염, 크론병(Crohn's disease), 만성 급성 염증성 질환, 심혈관 질환, 발기 부전, 당뇨병, 당뇨병의 합병증, 혈관염, 신장병, 망막병증, 신경병증, 아밀로이드증, 죽상경화증, 말초 혈관 질환, 심근경색, 울혈성 심부전, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병 신장병증 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 특히 당뇨병 및/또는 염증성 장애로 이루어진 그룹 중에서 바람직하게 선택된 RAGE-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 조성물.
  15. (a) 대상체로부터 채취한 시료를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체 또는 제12항에 따른 결합 분자와 접촉시키는 단계; 및
    (b) RAGE의 양을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서, 대조군과 비교하여 RAGE 수용체의 변경된 양이 RAGE-관련 질환 또는 장애의 지표인, 제13항에 정의한 바와 같은 RAGE-관련 질환 또는 장애를 진단하는 방법.
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