CN102686611A

CN102686611A - 与“渐进性糖化终产物受体”结合的多肽以及包括所述多肽的组合物和方法

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Publication number: CN102686611A
Application number: CN201080045826XA
Authority: CN
Inventors: J·胡贝尔; F·布朗谢; T·达布杜比; F·苏布里耶; I·弗肯; J·克鲁伊; K·赫尔梅尔; C·兰格
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-09-19
Also published as: CA2777237A1; AU2010305374A1; EP2486058A1; IL218968A0; WO2011042548A1; CL2012000886A1; MA33661B1; KR20120089863A; ECSP12011787A; RU2558301C2; MX2012004090A; BR112012007821A2; TN2012000138A1; ZA201202099B; JP2013507115A; US20120282637A1; RU2012118598A; PE20121689A1; CR20120139A

Abstract

本发明涉及包含排列成可供与“渐进性糖化终产物受体”(RAGE)特异性结合的至少两个氨基酸序列的多肽或多肽复合物、编码该多肽或多肽复合物的一种或多种核酸、产生抗RAGE抗体的细胞、包含至少一种上述定义的多肽或核酸的任选用于治疗RAGE相关疾病或病症的药物组合物和诊断RAGE相关疾病或病症的方法。

Description

与“渐进性糖化终产物受体”结合的多肽以及包括所述多肽的组合物和方法

渐进性糖化终产物受体(RAGE)是免疫球蛋白超家族的35kD跨膜受体，Neeper等人在1992年首次对其进行了表征(Neeper等，1992，J.Biol.Chem.267：14998-15004)。它是免疫球蛋白超家族的多配体细胞表面成员。RAGE由胞外域、单一跨膜域和胞质尾组成。受体的胞外域由一个V型免疫球蛋白结构域接着两个C型免疫球蛋白结构域组成。胞质结构域负责信号转导，跨膜域锚定细胞膜上的受体。可变结构域结合RAGE配体。RAGE还以可溶形式(sRAGE)存在。

RAGE的名称出自其结合渐进性糖化终产物(AGE)的能力，AGE是一类异质的非酶促改变的蛋白质，在长时间的高血糖状态中形成。然而，AGE可能仅仅是偶然的致病配体。除AGE以外，RAGE还能够结合其它配体，因此常被称为模式识别受体。然而，RAGE是独特的模式识别受体，其结合若干不同类别的内源分子，引起各种细胞反应，包括细胞因子分泌、细胞氧化剂应激增强、神经突增生和细胞迁移。RAGE的已知配体包括具有淀粉状蛋白沉积物和促炎介质特有的β折叠原纤维的蛋白质，包括S100/钙粒蛋白、血清淀粉状蛋白(SAA)(纤维形式(fibrillar form))、β-淀粉状蛋白(Aβ)和高迁移率族框1染色体蛋白1(high mobility group box-1 chromosomal protein 1，HMGB1，亦称amphotehn)。已经表明HMGB-1是在2个鼠脓毒症模型中的致死性的晚期介质，并且认为RAGE和配体(例如HMGB1)之间的相互作用在脓毒症和其它炎性疾病的发病机制中起重要作用。

在包括肺、心脏、肾、骨骼肌和脑在内的许多不同的组织中，许多细胞类型例如内皮细胞和平滑肌细胞、巨噬细胞和淋巴细胞表达RAGE。在慢性炎性状态(例如类风湿性关节炎和糖尿病性肾病)中表达增加。

许多重大的人类病症与RAGE的配体产生增加或与RAGE本身的产生增加有关。由于糖尿病或其它慢性病症中RAGE配体的水平升高，因此该受体被假设为在多种炎性疾病(例如糖尿病并发症、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)和甚至某些肿瘤)中具有致病作用。

另外，RAGE与被认为是由血管损害引起的若干慢性病有关。据假设，发病机制包括配体结合，配体结合之际核因子κB(NF-κB)的RAGE信号活化。NF-κB控制若干参与炎症的基因。有趣的是，RAGE本身又可被NF-κB上调。假定存在大量RAGE配体(例如糖尿病中的AGE或阿尔茨海默病中的淀粉状蛋白-β-蛋白)的病况，这便建立了导致慢性炎症的正反馈循环。因此认为这种慢性病况以致命方式改变微血管系统和大血管系统，最终结果是器官损害或甚至器官衰竭。与RAGE有关的疾病有许多慢性炎性疾病，包括类风湿性关节炎和银屑病性关节炎及肠病、癌症、糖尿病和糖尿病性肾病、淀粉样变性、心血管疾病、脓毒症、动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗死、充血性心力衰竭、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病和阿尔茨海默病。

对于这些病症中的多种无法获得持续有效的治疗药。对于这类RAGE相关病症，具有安全有效的治疗将是有益的。一种方法包括与RAGE结合的多肽(例如抗体)的使用。

出乎意料的是，已鉴定出提供有利特征的许多单克隆抗体(mAB)。具体地说，根据一套实验数据，包括结合常数、交叉反应性、结构域作图和体外功能数据(竞争ELISA)，已鉴定出抗RAGE单克隆抗体。根据上述数据，选出满足以下标准的23种mAb：

结合常数KD≤1.0x10-9M且koff≤2.0x10-3s-1

正如技术人员所知，抗体的结合特征由可变结构域介导。对于与抗原结合，存在合适的重链可变结构域和共同作用的轻链可变结构域并被排列成可供进行共同作用是必需的。可变结构域亦称为FV区，是与抗原结合的最重要的区域。更准确地讲，位于轻(VL)链和重(VH)链上的3个可变环负责与抗原结合。这些环称为互补决定区(CDR)。VL的3个环称为L1、L2和L3，而VH的称为H1、H2和H3。然而，重链可变结构域和共同作用的轻链可变结构域的多种不同排列是本领域已知的。因此，合适的重链可变结构域和共同作用的轻链可变结构域的鉴定是本发明所必需的。因此，已鉴定出上述23种抗体的序列。

因此，本发明的第一个方面涉及包含至少两个氨基酸序列或其功能活性变体的多肽或多肽复合物，其中至少2个氨基酸序列为

-SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：24，

-SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：25，

-SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：26，

-SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：27，

-SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28，

-SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：29，

-SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：30，

-SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：31，

-SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：32，

-SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：33，

-SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：34，

-SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：35，

-SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：36，

-SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：37，

-SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：38，

-SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：39，

-SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：40，

-SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：41，

-SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：42，

-SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：43，

-SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：44，

-SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：45，和/或

-SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：46，

其中这些序列排列成可供与“渐进性糖化终产物受体”(RAGE)特异性结合。

按照本发明，该多肽或多肽复合物包含至少两个上述氨基酸序列或其功能活性变体。SEQ ID NO：1-23的序列是所鉴定的抗体(按序列分析确定)的轻链可变结构域，而SEQ ID NO：24-46的序列是重链可变结构域。可通过轻链可变结构域的SEQ ID NO加23，来确定与主要的所述轻链可变结构域对应的重链可变结构域的SEQ ID NO。例如，与SEQ ID NO：5的轻链可变结构域对应的重链可变结构域的SEQ ID NO是SEQ ID NO：28(5+23)。

多肽或多肽复合物包含2个上文定义的共同作用的氨基酸序列或其功能活性变体对于本发明是必需的。如果它们以适当方式排列，则该排列可供与RAGE特异性结合。迄今已开发或鉴定出各种不同的抗体形式。这些中的任一种或任何其它合适的排列都可用于本发明的多肽或多肽复合物，只要形式或排列可供与RAGE特异性结合即可。

由上述SEQ ID NO限定的2个序列或其变体，可以一条多肽或以肽复合物排列。如果它们以一条多肽排列，则2个序列可通过接头序列(优选肽接头)连接，例如作为融合蛋白。如果它们以多肽复合物排列，则两条或更多条多肽通过非共价结合而彼此结合，非共价结合包括氢键、离子键、范德瓦尔斯力和疏水相互作用。上述序列或其功能活性变体可构成多肽或多肽复合物，或者可以是其组成部分。

多肽(亦称蛋白质)是由以直链排列的α-氨基酸组成的有机化合物。聚合物链中的氨基酸通过邻接氨基酸残基的羧基和氨基间的肽键结合在一起。遗传密码一般指定20个标准氨基酸。在合成后或甚至在合成期间，可通过翻译后修饰对蛋白质中的残基进行化学修饰，这会改变蛋白质的理化性质、折叠、稳定性、活性，并最终改变蛋白质的功能。

本文所限定的多肽或其复合物选择性识别并特异性结合RAGE。本文使用的术语“选择性”或“特异性”是指所公开的多肽或其复合物不会与非RAGE显著结合的事实，只是补充了多肽/复合物以赋予RAGE特异性结合部分额外独特的特异性的具体情况(像例如在双特异性或双功能分子中，其中把分子设计成结合或发挥两种功能，其中至少一种是特异性结合RAGE)除外。在具体实施方案中，RAGE特异性多肽或其复合物与人RAGE结合，其KD为1.2x10-6以下。在具体实施方案中，RAGE特异性多肽或其复合物与人RAGE结合，其KD为5x10-7以下、2x10-7以下或1x10-7以下。在另外的实施方案中，RAGE特异性多肽或其复合物与人RAGE结合，其KD为1x10-8以下。在其它实施方案中，RAGE特异性多肽或其复合物与人RAGE结合，其KD为5x10-9以下或1x10-9以下。在更多的实施方案中，RAGE特异性多肽或其复合物与人RAGE结合，其KD为1x10-10以下、KD为1x10-11以下或KD为1x10-12以下。在具体实施方案中，RAGE特异性多肽或其复合物不以上述KD与其它的蛋白质结合。

KD是指由kd(特定的结合分子-靶蛋白相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶蛋白相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(M)的kd/ka。可采用本领域充分确立的方法确定KD值。确定结合分子的KD的优选方法是通过应用表面等离振子共振，例如生物传感器系统，例如Biacore(TM)(GE Healthcare Life Sciences)系统(参见实施例5和表2)。另一种方法参见图2和实施例2。

已经表明，RAGE特异性多肽或其复合物剂量依赖性地抑制RAGE/配体相互作用(参见图4、实施例3和4及表1)。因此，RAGE特异性多肽或其复合物可通过其抵消配体与RAGE结合的能力进行表征。被任何RAGE特异性多肽或其复合物抑制的程度可在与对照的统计比较中或通过本领域可获得的任何备选方法定量测量。在具体实施方案中，抑制为至少约10％抑制。在其它实施方案中，抑制为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

多肽或其复合物还可包含上述序列的功能活性变体。本发明的功能活性变体的特征在于具有类似于完整蛋白质所显示的生物活性，包括与RAGE结合的能力和任选抑制RAGE的能力。在本发明的情况下，如果变体的活性(例如结合活性，任选表示为KD)相当于没有序列变化的肽/复合物的活性的至少10％、优选至少25％、更优选至少50％、甚至更优选至少70％、还更优选至少80％、尤其至少90％、特别至少95％、最优选至少99％，则变体具有功能活性。实施例中给出了测定RAGE的结合活性的合适方法。可通过有限数量的氨基酸取代、缺失和/或插入来获得功能活性变体。

在本发明的一个优选实施方案中，序列SEQ ID NO：1-23任一个的功能活性变体包含SEQ ID NO：1-23的各个序列的互补决定区L3(CDR L3)，优选CDR L1、CDR L2和CDR L3；和/或序列SEQ ID NO：24-46任一个的功能活性变体包含SEQ ID NO：24-46的各个序列的互补决定区H3(CDR H3)，优选CDR H1、CDR H2和CDR H3。在一个最优选的实施方案中，序列SEQ ID NO：1-23任一个的功能活性变体包含SEQ ID NO：1-23的各个序列的CDR L1、CDR L2和CDR L3；序列SEQ ID NO：24-46任一个的功能活性变体包含SEQ ID NO：24-46的各个序列的CDR H1、CDR H2和CDR H3。或者，一个序列可以是没有任何序列变化的SEQ ID NO：1-46，另一个可以是本文限定的变体。

鉴定可变区序列的CDR的不同方法已有记载。另外，已知可用于此目的的一系列软件程序。然而，将下面的一套规则应用于SEQ ID NO：1-46的序列以鉴定这些序列中的CDR(另参见www.bioinf.org.uk；MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.262(5)：732-745；Antibody Engineering Lab Manual，“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”一章，主编：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。具有所示CDR的序列见图1。

正如上文详细描述的一样，在VH和VL内有显示一个抗体与另一个之间具有最多序列变异性的超变区和较少变化的构架区。折叠使超变区一起形成抗原结合口袋。抗体和抗原之间最紧密接触的这些部位是介导抗体特异性的抗体的CDR。因此，它们对于抗原结合特别重要。虽然优选包含所有3个CDR的功能活性变体，但已发现对于一些抗体，CDR-L3和CDR-H3足以赋予特异性。因此，在一个实施方案中，仅CDR-L3和CDR-H3的存在是强制性的。在任何情况下，CDR必须排列成可供与抗原特异性结合，此处抗原为RAGE。

在本发明的一个优选实施方案中，CDR(CDR-L3和-H3；或CDR-L1、-L2、-L3、-H1、-H2和-H3)排列在通行可变结构域的构架中，即L1、L2和L3排列在VL构架中，而H1、H2和H3排列在VH构架中。这就意味着可将通过任何合适的方法鉴定或图1所示的CDR从所示区域移出，并转移到另一个(第二)可变结构域，从而取代第二可变结构域的CDR。举例来说，SEQ ID NO：1和24的CDR可来用置换SEQ ID NO：2和27的CDR。另外，可使用图1中未显示的可变结构域的构架。多种可变结构域或抗体序列是本领域已知的，并可用于此目的。例如，可从任何种系或重排的人可变结构域获得目标CDR插入其中的可变结构域。可变结构域还可以合成产生。可采用重组DNA技术将CDR区引入相应的可变结构域。可实现该目的的一种方法记载于Marks等，1992，Bio/Technology 10：779-783。可变重链结构域可与可变轻链结构域配对以提供抗原结合部位。另外，可使用独立的区域(例如仅可变重链结构域)结合抗原。

最后，在另一个实施方案中，可将CDR转移到非可变结构域区域，只要该区域使CDR排列得可供与RAGE特异性结合即可。

在本发明的多肽或多肽复合物的一个优选实施方案中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和/或SEQ ID NO：23的氨基酸序列或其功能活性变体是轻链可变结构域(VL)。

备选地或此外，SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和/或SEQ ID NO：46的氨基酸序列或其功能活性变体是重链可变结构域(VH)。

在本发明的一个优选实施方案中，多肽或多肽复合物是抗体。

天然存在的抗体是球状血浆蛋白(约150kDa)，亦称免疫球蛋白，具有共同的基础结构。将糖链加到氨基酸残基上时，它们便是糖蛋白。每个抗体的基本功能单位是免疫球蛋白(Ig)单体(只含1个Ig单位)；分泌抗体还可以是具有2个Ig单位的二聚体像IgA、具有4个Ig单位的四聚体像硬骨鱼IgM或具有5个Ig单位的五聚体，像哺乳动物IgM。在本发明中，合适形式的实例包括天然存在的抗体的形式，包括称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的抗体同种型。

Ig单体是由4条多肽链组成的“Y”形分子；2条相同的重链和2条相同的轻链通过半胱氨酸残基之间的二硫键连接。每条重链长约440个氨基酸；每条轻链长约220个氨基酸。重链和轻链各含有稳定其折叠的链内二硫键。每条链由称为Ig结构域的结构域组成。这些结构域含有约70-110个氨基酸，并根据其大小和功能归为不同的类别(例如可变或V，以及恒定或C)。它们具有特征性的免疫球蛋白折叠，其中2个β折叠产生“夹层”形状，通过保守的半胱氨酸和其它带电氨基酸之间的相互作用保持在一起。

哺乳动物Ig重链有5种类型，用α、δ、ε、γ和μ表示。存在的重链类型界定了抗体的同种型；这些链分别存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中。

截然不同的重链在大小和组成上不同；α和γ含有约450个氨基酸，δ约500个氨基酸，而μ和ε有约550个氨基酸。每条重链具有两个区，恒定区(CH)和可变区(VH)。在一类中，恒定区在相同同种型的所有抗体中是相同的，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由3个串联Ig结构域组成的恒定区和用于提高柔性的铰链区；重链μ和ε具有由4个免疫球蛋白结构域组成的恒定区。在由不同B细胞产生的抗体中重链的可变区不同，但由单一B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体均相同。每个重链的可变区长约110个氨基酸，由单一Ig结构域组成。

在哺乳动物中，有两种类型的免疫球蛋白轻链，用λ和κ表示。轻链具有2个连续的结构域：一个恒定结构域(CL)，一个可变结构域(VL)。轻链的近似长度为211-217个氨基酸。各个抗体含有2条总是相同的轻链；在哺乳动物中每个抗体中仅存在一种类型的轻链，κ或λ。其它类型的轻链(例如ι链)存在于低等脊椎动物像软骨鱼纲(Chondrichthyes)和真骨鱼次亚纲(Teleostei)。

除天然存在的抗体以外，已开发了包括抗体片段在内的人工抗体形式。下面描述了它们中的一些。然而，本发明还包括包含上述多肽或由之组成的并且可供与RAGE特异性结合的任何其它抗体形式。

尽管所有抗体的一般结构非常相似，但给定抗体的独特性质由如上详述的可变(V)区决定。更准确地讲，可变环，轻(VL)链各3个，重(VH)链上3个，负责与抗原结合，即负责其抗原特异性。这些环称为互补决定区(CDR)。因为VH和VL结构域两者的CDR有助于抗原结合部位，所以正是重链和轻链的组合而非单独的任一种决定最终的抗原特异性。

因此，本文所用术语“抗体”意指与天然存在的抗体具有结构相似性并能够与RAGE特异性结合的任何多肽，其中结合特异性由SEQ ID NO：1-46的CDR决定，例如如图1所示。因此，“抗体”旨在涉及与RAGE特异性结合的免疫球蛋白衍生结构，其包括但不限于与RAGE选择性结合并任选抑制RAGE功能的全长或完整抗体、抗原结合片段(实际上或概念上从抗体结构衍生的片段)、前述任一种的衍生物、嵌合分子、前述任一种与另一种多肽的融合物或任何备选结构/组成。抗体可以是包含至少一个抗原结合片段的任何多肽。抗原结合片段至少由以两个结构域一起能够结合特定抗原的方式排列的重链可变结构域和轻链可变结构域组成。

“全长”或“完全”抗体是指包含通过二硫键互相连接的2条重(H)链和2条轻(L)链的蛋白质，其包含：(1)就重链而言，可变区和包含3个结构域CH1、CH2和CH3的重链恒定区；和(2)就轻链而言，轻链可变区和包含1个结构域CL的轻链恒定区。至于术语“完全抗体”，任何抗体意指天然存在的抗体的典型总体结构域结构(即包含3或4个恒定结构域的重链和1个恒定结构域的轻链以及相应的可变结构域)，但是各个结构域还可包含不改变总体结构域结构的修饰，例如突变、缺失或插入。

“抗体片段”还含至少一个如上文定义的抗原结合片段，并具有与片段从中衍生的完全抗体基本相同的功能和特异性。用木瓜蛋白酶进行有限的蛋白水解消化将Ig原型切割成3个片段。2个相同的氨基端片段(各含有一个完整的L链和约半个H链)为抗原结合片段(Fab)。第3个片段(大小相似但含有带有其链间二硫键的两条重链的羧基端一半)为可结晶片段(Fc)。Fc含有糖、补体结合部位和FcR结合部位。有限的胃蛋白酶消化得到含有Fab片段和铰链区两者的单一F(ab′)2片段，包括H-H链间二硫键。F(ab′)2对于抗原结合是二价的。可切割F(ab′)2的二硫键以获得Fab′。此外，重链和轻链的可变区可融合在一起形成单链可变片段(scFv)。

由于全尺寸的抗体的第一代存在某些问题，故许多第二代抗体只包含抗体的片段。可变结构域(Fv)是具有完整抗原结合结构域的最小片段，由一个VL和一个VH组成。可通过酶促方法或相关基因片段的表达(例如在细菌和真核细胞中)产生仅有结合结构域的这类片段。可采用不同方法，例如或仅Fv片段或包含含Fv加第一恒定结构域的“Y”的一个上臂的′Fab′片段。通常通过在两条链之间引入导致单链Fv(scFv)产生的多肽键，来稳定这些片段。或者，可以使用二硫键连接的Fv(dsFv)片段。片段的结合结构域可与任何恒定结构域组合以产生全长抗体，或者可与其它蛋白质和多肽融合。

重组抗体片段是单链Fv(scFv)片段。一般而言，对其抗原具有高亲和力，可在多种宿主中表达。这些和其它性质使得scFv片段不仅可适用于医学，而且还具有生物技术应用潜力。正如上文详述的一样，在scFv片段中，VH和VL结构域被亲水和柔性肽接头连接起来，这改进了表达和折叠效率。通常使用约15个氨基酸的接头，其中(Gly4Ser)3接头最常被使用。根据所用接头，scFv分子可容易地被蛋白酶降解。随着遗传工程技术的发展，通过致力于改进功能和稳定性的研究，实际上能够克服这些限制。一个实例是产生二硫键稳定的(或二硫键连接的)Fv片段，其中通过链间二硫键稳定VH-VL二聚体。将半胱氨酸引入VL和VH结构域之间的界面，形成将4个结构域保持在一起的二硫桥。

scFv的解离产生单体scFv，其可复合成二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)或更大的聚集体例如TandAb和Flexibody。

通过2个scFv与简单多肽键(scFv)2结合或通过2个单体的二聚化，产生具有2个结合结构域的抗体(双抗体)。最简单的设计是具有两个功能性抗原结合结构域的双抗体，抗原结合结构域可相同、相似(二价双抗体)或对截然不同的抗原具有特异性(双特异性双抗体)。这些双特异性抗体可供例如将新的效应子功能(例如细胞毒性T细胞)募集到靶细胞上，这使得它们在医学应用中十分有用。

最近，已开发出包含4个重链可变结构域和4个轻链可变结构域的抗体形式。这些的实例包括四价双特异性抗体(TandAbs and Flexibodies，Affimed Therapeutics AG，Heidelberg.Germany)。与双特异性双抗体形成对比，双特异性TandAb是仅由一个多肽组成的同二聚体。因为2条不同的链，所以双抗体可构建3种不同的二聚体，其中仅一种具有功能。因此，产生并纯化这种均质产物更简单并更便宜。此外，TandAb通常具有更好的结合性质(具有两倍的结合部位数目)，且体内稳定性提高。Flexibody是scFv与双抗体多聚体基序的组合，产生在连接细胞表面上彼此相距相当远的2个分子方面具有高度柔性的多价分子。如果存在不止一个功能性抗原结合结构域，并且如果对截然不同的抗原具有特异性，则抗体是多特异性的。

总之，特定的所公开的序列可插入其中或者在备选方案中可形成其基本组成部分的具体免疫球蛋白，包括但不限于形成本发明的具体实施方案的下列抗体分子：Fab(具有可变轻(VL)链结构域、可变重(VH)链结构域、恒定轻(CL)链结构域和恒定重链1(CH1)结构域的一价片段)、F(ab′)2(包含由二硫桥或备选在铰链区连接的2个Fab片段的二价片段)、Fv(VL和VH结构域)、scFv(单链Fv，其中VL和VH通过接头(例如肽接头)连接)、双特异性抗体分子(包含本文所公开的多肽与结合特异性不同于该抗体的第二功能部分连接的抗体分子，第二功能部分包括而不限于另一种肽或蛋白质，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体(minibody)(与CH3连接的scFv)。

包括但不限于Fv、scFv、双抗体分子或结构域抗体(Domantis)的某些抗体分子可通过掺入二硫桥使VH和VL结构域成线状排列来稳定。双特异性抗体可采用常规技术产生，其具体方法包括按化学方法产生或得自杂合杂交瘤和其它技术，包括但不限于BiTETM技术(具有不同特异性的抗原结合区与肽接头的分子)和knobs-into-holes工程改造。

因此，抗体可以是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、(scFv)2、二价抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体或微型抗体。

在另一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。单克隆抗体是相同的单特异性抗体，因为它们由一种类型的免疫细胞产生，所述免疫细胞均是单一母细胞的克隆。嵌合抗体是这样的抗体，其中一种物种的免疫球蛋白的至少一个区与另一种物种的免疫球蛋白的另一个区通过遗传工程融合以降低其免疫原性。例如鼠VL区和VH区可与人免疫球蛋白的其余部分融合。嵌合抗体的一种具体类型是人源化抗体。人源化抗体是通过将编码非人抗体CDR的DNA与产生人抗体的DNA合并所产生的。所得DNA构建体然后可用来表达和产生通常不具有与非人胃肠外抗体或与嵌合抗体一样的免疫原性的抗体，因为仅CDR是非人的。

在本发明的一个优选实施方案中，多肽或多肽复合物包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、结构域、人IgG4 恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。

正如上文详述的一样，在本发明的抗体的情况下，天然存在的抗体的每条重链具有2个区，恒定区和可变区。哺乳动物免疫球蛋白重链有5种类型：γ、δ、α、μ和ε，其分别界定了免疫球蛋白的以下类别：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

人中有4个IgG亚类(IgG1、2、3和4)，以其在血清中的丰度顺序命名(IgG1的丰度最大)。尽管在其IgG亚类的Fc区之间有约95％相似性，但铰链区的结构却相对不同。介于Fab臂(片段抗原结合)和2条重链的2个羧基端结构域CH2和CH3之间的这个区域决定分子的柔性。上铰链(朝向氨基端)区段允许Fab臂之间角度的变异性(Fab-Fab柔性)以及每个个体Fab的转动柔性。下铰链区(朝向羧基端)的柔性直接决定Fab臂相对于Fc区(Fab-Fc柔性)的位置。铰链依赖性Fab-Fab和Fab-Fc柔性在触发其它效应子功能(例如补体活化和Fc受体结合)方面可能很重要。因此，铰链区的结构赋予4个IgG类别的每一个独特的生物学特征。

在IgG亚类中，铰链区的长度和柔性不同。IgG1的铰链区包括氨基酸216-231，并且因为它是随意弯曲的，因此Fab片段可绕其对称轴转动，并在以2个重链间二硫桥的第一个为中心的球体内移动。IgG2具有比IgG1短的铰链，具有12个氨基酸残基和4个二硫桥。IgG2的铰链区缺乏甘氨酸残基，它相对较短，含有刚性聚脯氨酸双螺旋，因额外的重链间二硫桥而稳定。这些性质限制IgG2分子的柔性。IgG3因其独特的延长的铰链区(长约为IgG1铰链的4倍)而不同于其它亚类，该延长的铰链区含有62个氨基酸(包括21脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成刚性聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段离Fc片段相对较远，赋予分子较大的柔性。IgG3中延长的铰链也造成其分子量比其它亚类大。IgG4的铰链区比IgG1的铰链区短，而且其柔性介于IgG1和IgG2的中间。

在本发明的一个优选实施方案中，可使用上述SEQ ID NO：1-46 序列任一个的功能活性变体代替所标明的序列。例如，可以限定变体，因为变体

a)是由SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、还更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选99％组成的功能活性片段；

b)是与SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、还更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选99％序列同一性的功能活性变体；或者

c)由SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列和1-50个其它氨基酸残基、优选1-40个、更优选1-30、甚至更优选至多1-25、还更优选至多1-10、最优选1、2、3、4或5个其它氨基酸残基组成。

a)中限定的片段的特征是以一个或多个缺失之差衍生自SEQ ID NO：1-46的任一个的序列。缺失可以是C端、N端和/或内部缺失。优选得到相差以下缺失的片段：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失，更优选1、2、3、4或5个缺失，甚至更优选1、2或3个缺失，还更优选1或2个缺失，最优选1个缺失。本发明的功能活性片段的特征在于具有类似于完整蛋白质所显示的生物活性，包括与RAGE结合的能力和任选抑制RAGE的能力。在本发明的情况下，如果片段的活性相当于没有序列变化的抗原的活性的至少10％、优选至少25％、更优选至少50％、甚至更优选至少70％、还更优选至少80％、尤其至少90％、特别至少95％、最优选至少99％，则抗原片段具有功能活性。实施例中给出了测定与RAGE的结合活性的合适方法。

b)中限定的变体的特征在于以一个或多个氨基酸修饰(包括缺失、添加和/或取代)之差衍生自SEQ ID NO：1-46的任一个的序列。修饰可以是C端、N端和/或内部修饰。优选得到相差以下修饰的片段：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰，更优选1、2、3、4或5个修饰，甚至更优选1、2或3个修饰，还更优选1或2修饰，最优选1个修饰。本发明的功能活性变体的特征在于具有类似于完整蛋白质显示的生物活性，包括与RAGE结合的能力和任选抑制RAGE的能力。在本发明的情况下，如果片段的活性相当于没有序列变化的抗原的活性的至少10％、优选至少25％、更优选至少50％、甚至更优选至少70％、还更优选至少80％、尤其至少90％、特别至少95％、最优选至少99％，则抗原片段具有功能活性。

c)中限定的变体的特征是它由SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列和1-50个其它氨基酸残基组成。添加可以是C端、N端和/或内部添加。优选得到相差以下添加的变体：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个添加，更优选1、2、3、4或5个添加，甚至更优选1、2或3个添加，还更优选1或2个添加，最优选1个添加。功能活性变体进一步如上限定(参见b)的变体)。

(b)和/或(c)的其它氨基酸残基可以是任何氨基酸，其可以是L-氨基酸和/或D-氨基酸、天然存在的氨基酸和其它形式的氨基酸。优选氨基酸是任何天然存在的氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。

然而，氨基酸还可以是修饰氨基酸或不常见氨基酸。它们的实例为2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸或鸟氨酸。另外，可对氨基酸进行修饰，例如翻译后修饰。修饰的实例包括乙酰化、酰胺化、封闭、甲酰化、-羧基谷氨酸羟基化、糖基化、甲基化、磷酸化和硫酸酯化(sulfatation)。如果肽中存在不止一个其它或异源氨基酸残基，则氨基酸残基彼此可相同或不同。

序列同一性百分比可通过例如序列比对来测定。用于比较的序列的比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981或Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.85：2444，1988。

NCBI基础局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可获自几个来源，包括美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，Bethesda，MD)和互联网，以用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。SEQ ID NO：1-46的任何序列的变体通常应用空位blastp设置为默认参数的NCBI Blast2.0来表征。对于至少30个氨基酸的氨基酸序列的比较，利用设置为默认参数(空位存在代价(gap existence cost)为11，每残基空位代价为1)的默认BLOSUM62矩阵，应用Blast 2序列功能。当对短肽(少于约30个氨基酸)进行比对时，利用设置为默认参数(开放空位9(open gap9)，延长空位1罚分(extension gap 1 penalties))的PAM30矩阵，应用Blast 2序列功能进行比对。用于在这种短的窗口内(例如15个氨基酸以下)测定序列同一性的方法描述于由美国国立生物技术信息中心(Bethesda，Maryland)维护的网站。

在一个更优选的实施方案中，上文定义的功能活性变体以一个或多个保守氨基酸取代之差衍生自SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列。

正如本领域普通技术人员应理解的是，保守氨基酸取代是用赋予类似或更好的(用于既定目的)功能特性和/或化学特性的氨基酸残基置换的取代。例如，保守氨基酸取代中氨基酸残基通常被具有类似侧链的氨基酸残基置换。本领域已界定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。这类修饰不是设计来显著降低或改变多肽(复合物)的结合性质或功能抑制性质，但是它们可改进这类性质。进行取代的目的并不重要，可包括但绝不限于用具有能够更好地保持或加强分子的结构、分子的电荷或疏水性或者分子的大小的残基置换。例如，可能只是需要用有相同极性或电荷的残基取代不太需要的残基。这类修饰可通过本领域已知的标准技术引入，例如定点诱变和PCR介导的诱变。本领域技术人员用以实现保守氨基酸取代的一种具体方法是丙氨酸扫描诱变。然后采用本领域可获得的或实施例中描述的功能测定，测试经改变的多肽保持的功能或更好的功能。在本发明的一个更优选的实施方案中，SEQ ID NO：1-46的任何序列中保守取代的数目为至多20、19、18、27、26、15、14、13、12或11个，优选至多10、9、8、7或6个，尤其至多5、4、3个，特别为2或1个。

本发明的另一个方面涉及编码本发明的多肽或多肽复合物的一种或多种核酸。本发明的核酸分子可呈RNA的形式，例如mRNA或cRNA，或呈DNA的形式，包括诸如通过克隆得到的或通过化学合成技术或通过其组合产生的例如cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，亦称有义链，或者可以是非编码链，亦称为反义链。本文所用的核酸分子尤其还指单链和双链DNA、作为单链和双链RNA的混合物的DNA和作为单链和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更通常为双链、或三链、或单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，本文所用核酸分子是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。

核酸还包括作为遗传密码简并结果的序列。有20种天然氨基酸，其中大多数由不止一个密码子限定。因此，产生上文定义的肽的所有核苷酸序列都包括在本发明中。

另外，核酸可含有一个或多个修饰碱基。这类核酸例如在核糖-磷酸骨架中还可含有修饰以提高生理环境中这类分子的稳定性和半寿期。因此，具有出于稳定性或其它原因进行修饰的骨架的DNA或RNA是特征是本文预期的“核酸分子”。此外，仅举两个例子说明，包含不常见碱基(例如肌苷)或修饰碱基(例如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA是在本发明背景下的核酸分子。应理解的是，对DNA和RNA进行种类繁多的修饰以用作本领域技术人员已知的许多有用目的。正如在本文所用的一样，术语核酸分子包括核酸分子的这类化学、酶或代谢修饰形式，以及尤其是病毒和细胞(包括简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。例如，可进行核苷酸取代，其不影响由该核酸编码的多肽，因此本发明包括编码上文定义的抗原或其片段或功能活性变体的任何核酸分子。

此外，编码本发明的一种或多种多肽(包括其片段或功能活性变体)的任何核酸分子可应用标准技术(例如标准克隆技术)与任何所需调节序列、前导序列、异源标记序列或异源编码序列功能性连接以产生融合蛋白。

本发明的核酸最初可体外形成或在培养的细胞中形成，一般通过内切核酸酶和/或外切核酸酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或专业从业人员已知的其它方法对核酸进行操作以产生所述核酸。

在一个优选的实施方案中，核酸位于载体中。载体还可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列例如复制起点、一个或多个治疗基因和/或选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件，例如指导编码蛋白质的转录、翻译和/或分泌的调节元件。可以使用载体转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达不是细胞天然的核酸和/或蛋白质。载体任选包括有助于实现使核酸进入细胞的物质，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质外壳等。通过标准分子生物学技术，用于蛋白质表达的合适表达载体的许多类型是本领域已知的。在以下常规载体类型中选择这类载体：包括昆虫(例如杆状病毒表达)系统或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。其许多类型是本领域已知的其它合适的表达载体也可用于此目的。用于获得这类表达载体的方法是众所周知的(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989))。在一个实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于反转录病毒和腺病毒载体。

用于通过该方法转染的合适宿主细胞或细胞系包括细菌细胞。例如，大肠杆菌(E.coli)的各种菌株作为生物技术领域中的宿主细胞是众所周知的。枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和其它杆菌等的各种菌株也可用于该方法。还可获得本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株作为用于表达本发明肽的宿主细胞。其它真菌细胞或昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugipedera)(Sf9)细胞也可用作表达系统。或者，可以使用哺乳动物细胞，例如人293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴COS-1细胞系或来源于Swiss，BALB/c或NIH小鼠的鼠3T3细胞。还有其它合适的宿主细胞以及用于转染、培养、扩增、筛选、生产和纯化的方法是本领域已知的。

本发明的多肽或者多肽复合物可通过在合适的宿主细胞中表达本发明的核酸来产生。例如可通过常规方法(例如电穿孔)，用至少一种含有在转录调节序列控制下的本发明核酸的表达载体转染宿主细胞。然后将经转染或转化的宿主细胞培养在允许蛋白质表达的条件下。通过本领域技术人员已知的合适方法，从细胞(或从培养基中，如果胞外表达的话)中回收、分离并任选纯化表达的蛋白质。例如，在细胞溶解后以可溶形式分离蛋白质，或采用已知技术提取，例如在氯化胍中提取。如有需要，本发明的多肽可作为融合蛋白产生。这类融合蛋白是上文描述的融合蛋白。或者，例如可能需要产生融合蛋白以在所选宿主细胞中提高蛋白质的表达或改进纯化。包含本发明的多肽的分子可采用多种常规方法的任一种进一步纯化，包括但不限于：应用HPLC、FPLC等的液相层析法，例如正相或反相层析法；亲和层析法 (例如用无机配体或单克隆抗体)；大小排阻层析法；固定化金属螯合层析法；凝胶电泳等。本领域技术人员可在不偏离本发明的范围的情况下选择最适当的分离和纯化技术。这类纯化提供呈基本不含微生物的其它蛋白质性和非蛋白质性物质形式的抗原。

本发明的另一个方面涉及产生本发明的抗体的细胞。

正如其它蛋白质一样，可以在一系列细胞表达系统中体外产生本发明的多肽。这些可包括CHO细胞(来源于中国仓鼠卵巢)、酵母(酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母(Pichia))、丝状真菌、转基因植物和大肠杆菌。

起初，大肠杆菌表达系统的使用主要限于抗体片段的产生。在大肠杆菌中，这些片段已被成功表达并分泌。Fab常被用于诊断应用、治疗药和用于预定重新整合至全长单克隆抗体中的测试可变区。在大肠杆菌产生中的另一个成功应用是功能性蛋白与Fab的融合。靶向抗原的特异性Fab区与功能性蛋白序列融合。产生具有提高的细胞杀死作用的靶向治疗药是该方法的一种应用。包括抗体片段的其它策略包括使靶特异性蛋白质结构域(例如受体片段)与Fc(受体结合片段)区融合。抗体的Fc片段造成长血清半寿期和免疫系统的活化。Fc融合物的应用取决于融合配偶体的结合活性与Fc区的活化的结合。然而，在大肠杆菌中，由于Fc片段在细菌中难以有效表达，Fc区的产生可能成问题。这可解释为什么在大肠杆菌中完全单克隆抗体的产生仍然是难以达到的目标。如下文中所述，已经开发出用于在大肠杆菌中表达片段和完全单克隆抗体的改进方法。虽然哺乳动物细胞体系对于抗体生产特性(例如糖基化)是决定性的，但是对于有效的大肠杆菌抗体生产系统仍存在许多机会。翻译工程(Translation Engineering)已被用于使在大肠杆菌中有效表达抗体和抗体片段的基因最优化。翻译工程包括产业标准技术，例如除去罕用密码子、使RNA二级结构平滑、鉴定和操纵在翻译抗体mRNA的同时实现核糖体的分步动力学(step-wise kinetics)的翻译暂停信号。在操纵编码目标抗体的基因后，将重新设计的基因构建体置于可包括重链和轻链组分的合适载体中。

在另一个实施方案中，细胞是通过众所周知的常规技术产生的表达所需单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在本发明的情况下，杂交瘤细胞能够产生与RAGE特异性结合的抗体。可通过将正常激活的产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。尤其可如下产生杂交瘤细胞：从用相关抗原激发的动物脾中取出B细胞。然后将这些B细胞与可在培养中无限生长的骨髓瘤肿瘤细胞融合。通过使细胞膜更通透来进行这种融合。作为癌细胞的融合的杂合细胞(称为杂交瘤)可快速无限繁殖，并可产生大量所需要的抗体。通过有限稀释进行选择，随后克隆。含有白介素-6的补充培养基(例如briclone)通常是该步骤所必需的。通过在选择性培养基(具体地，含有1x浓度HAT的培养基)中培养新融合的原代杂交瘤细胞大约10-14天来进行选择。在使用HAT后，常常需要使用含有HT的培养基。在鉴定出阳性原代杂交瘤细胞后进行克隆。

本发明的另一个方面涉及能够结合RAGE并包含本发明的多肽或多肽复合物的结合分子。本发明的多肽(或其复合物)和抗体可用于多种应用，包括医学、治疗、诊断，而且还可用于科研中，例如用于检测、纯化、标记等。

因此，可能有必要将另一种成分加到本发明的多肽(复合物)中。特别是可能需要加入分子检测标记。合适的标记包括而不限于标签(例如6His(或HexaHis)标签、Strep标签、HA标签、c-myc标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签)、荧光标记(例如FITC、荧光素、罗丹明、Cy染料或Alexa)、酶标记(例如青霉素酶、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、放射性标记(例如3H、32P、35S、125I或14C)。另外，可将多肽(复合物)加到支持体上，特别是例如阵列、珠粒(例如玻璃珠或磁珠)、纤维、膜等的固相支持体上。技术人员能够通过选择合适的其它成分使包含本发明的多肽或多肽复合物的结合分子与欲使用的其它成分相适应。

本发明的另一个方面涉及用作药物的组合物，组合物包含至少一种本发明的多肽和/或至少一种本发明的核酸。

本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。可用于本发明的药学上可接受的载体和/或赋形剂是常规的，可包括缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。Remington′s Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975))描述了适于本文公开的多肽/核酸的药物递送的组合物和制剂。药物组合物中的活性成分(多肽或核酸)的含量不受限制，只要可用于治疗或预防，但优选含有总组合物重量的0.0000001-10％。

载体或赋形剂的性质一般将取决于待采用的具体给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含注射用液体，其包括药学上和生理学上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为溶媒。对于固体组合物(例如散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规无毒固体载体可包括例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学上中性的载体以外，待给予的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨醇单月桂酸酯。

一般将适量的药学上可接受的盐用于载体中以为制剂提供等渗性。载体的实例包括但不限于盐水、林格氏液(Ringer′s solution)和葡萄糖溶液。优选可接受的赋形剂、载体或稳定剂在所用剂量和浓度下优选是无毒的，包括缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸盐和其它有机酸；成盐抗衡离子，例如钠和钾；低分子量(＞10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；单糖；双糖；其它糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；螯合剂，例如EDTA；非离子型表面活性剂，例如Tween、Pluronic或聚乙二醇；抗氧化剂，包括甲硫氨酸、抗坏血酸和生育酚和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)。

在一个优选的实施方案中，药物组合物还包含免疫刺激物例如佐剂。佐剂可根据给药方法选择，可包括矿物油型佐剂，例如弗氏完全佐剂和不完全佐剂、Montanide不完全Seppic佐剂例如ISA、油包水乳液佐剂例如Ribi佐剂系统、含有胞壁酰二肽的syntax佐剂制剂或铝盐佐剂。优选佐剂为矿物油型佐剂，最优选ISA206(SEPPIC，Paris，France)。在一个更优选的实施方案中，免疫刺激物选自聚阳离子聚合物，尤其聚阳离子肽，例如聚精氨酸；免疫刺激性脱氧核苷酸(ODN)；含有至少两个LysLeuLys基序的肽，尤其是KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：51)；神经活性化合物，尤其是人生长激素；明矾；佐剂或其组合。优选所述组合是聚阳离子聚合物和免疫刺激性脱氧核苷酸或含有至少两个LysLeuLys基序的肽和免疫刺激性脱氧核苷酸。在一个还更优选的实施方案中，聚阳离子聚合物是聚阳离子肽。在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，免疫刺激物是至少一种免疫刺激性核酸。免疫刺激性核酸为例如中性或人工的含CpG的核酸、来源于非脊椎动物的核酸的短序列段或在限定碱基的情况下呈含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的短的寡核苷酸(ODN)形式(例如参见WO96/02555)。或者，基于肌苷和胞苷的核酸(例如参见WO 01/93903)，或含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(参见WO 01/93905和WO 02/095027)也可优选用作本发明的免疫刺激性核酸。优选将不同的免疫刺激性核酸的混合物用于本发明。另外，前述聚阳离子化合物可与前述任何免疫刺激性核酸组合。优选这类组合是按照描述于WO01/93905、WO 02/32451、WO 01/54720、WO 01/93903、WO 02/13857和WO 02/095027和澳大利亚专利申请A 1924/2001中的组合。

药物组合物包括至少一种本发明的多肽或核酸；然而，还可含有混合剂(即简单混合物)，其含有不同的本发明的多肽和/或核酸。本发明的多肽还可以药学上可接受的盐的形式使用。能够与本发明的肽形成盐的合适的酸和碱也为本领域技术人员所熟知，包括无机和有机的酸和碱。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物旨在治疗或用于治疗正如技术人员所知或本文定义的RAGE相关疾病或病症，优选选自脓毒症、败血症性休克、李斯特菌病、炎性疾病包括类风湿性关节炎和银屑病性关节炎和肠病、癌症、关节炎、克罗恩病、慢性急性炎性疾病、心血管疾病、勃起机能障碍、糖尿病、糖尿病并发症、血管炎、肾病、视网膜病、神经病、淀粉样变性、动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗死、充血性心力衰竭、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病和阿尔茨海默病，尤其是糖尿病和/或炎性病症。

本发明的另一个方面涉及诊断上文定义的RAGE相关疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使得自受试者的样品与本发明的多肽或多肽复合物或结合分子接触；和

(b)检测RAGE的量，

其中相对于对照的RAGE受体的量的变化表明RAGE相关疾病或病症。

本发明还涉及诊断测定，例如用本发明的多肽或结合分子检测细胞和组织或体液中的RAGE或RAGE水平的定量和诊断测定，包括测定正常和异常水平。可用于测定来源于宿主的样品中的多肽或抗体水平的测定技术为本领域技术人员所熟知。这样的方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析和ELISA测定。在这些当中，通常优选ELISA。ELISA测定最初包括制备对多肽(特别是RAGE)有特异性的抗体，优选为单克隆抗体。另外，一般制备与单克隆抗体结合的报道抗体。将报道抗体与可检测试剂连接，例如放射性试剂、荧光试剂或酶试剂，例如辣根过氧化物酶。

本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以改变。此外，本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非意味着限制本发明的范围。正如本文和随附权利要求书所使用的一样，单数形式包括复数形式，除非上下文另有明确说明。同样，措词“包含”、“含有”和“包括”应解释为包含在内而并非唯一。

除非另有说明，否则本文所用全部科技术语和任何首字母缩略词具有本发明领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在实施本发明时可使用类似或等同于本文所述方法和材料的方法和材料，但是本文描述了优选的方法和材料。

通过下列实施例对本发明进行进一步的说明，但是应当了解，所包括的实施例仅用于说明目的，并不意味着限制本发明的范围，除非另有明确说明。

附图：

图1：具有CDR的轻链(左)和重链(右)可变区。

图2：用15nM的LP08062(Rage)测试的抗Rage杂交瘤的ka/kd。

图3：所选的抗RAGE单克隆抗体的Kd范围。

图4：RAGE S100A6相互作用的抑制。

图5：RAGE 513_LP08062(上)和501-4RAGE-1 050908 b的Biacore分析。

实施例：

实施例1：抗体的产生和鉴定

按照本领域技术人员熟知的方法实现抗体的产生和鉴定。这类方法公开于例如(i)Handbook of therapeutic antibodiesWiley-VCH，Weinheim；ISBN-10：3-527-31453-9；ISBN-13：978-3-527-31453-9-；和/或(ii)Therapeutic monoclonal antibodies：from bench to clinic；ISBN：978-0-470-11791-0；和/或(iii)Current protocols in Immunology；John Wiley and Sons，Inc.；2009年10月1日最后更新。

实施例2：有利抗体的选择

可获得的抗体中，根据以下方面鉴定并选择“最好的23”种抗体

-结合常数(KD≤1.0E-9M和koff≤2.0E-3s-1)和

-与大鼠、小鼠和猕猴sRAGE的物种交叉反应性

测定了抗rage单克隆抗体可变区的下列氨基酸序列：

蛋白质56RAGE-1

VL 56：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：1

1 divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg invawyqqkp gqspkaliys

51 asyrysgvpd rftgsgsgtd ftliisnvqs edlaeyfcqq ynnyprtfgg

101 gtkleik

VH 56：重链可变区；完整分子长度：115aa；SEQ ID NO：24

1 qvqlqqsgpe lvkpgasvri sckasgytft syfihwvkqr pgqglewigw

51 iypgnvntky nekfkdkatl tadkssstay mqlsnltsed savyfcvrgq

101 lgdywgqgit ltvss

蛋白质95RAGE-1

VL 95：轻链可变区；完整分子长度：109aa；SEQ ID NO：2

1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftglt

51 ggtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf

101 gggtkltvl

VH 95：重链可变区；完整分子长度：115aa；SEQ ID NO：25

1 qvqlqqpgae lvkpgasvkl sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewige

51 snpsngrtny nekfknkatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarap

101 yygfdywgqg ttltvss

蛋白质130RAGE-1

VL 130：轻链可变区；完整分子长度：106aa；SEQ ID NO：3

1 qivltqspai msaspgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwisdt

51 sklasgvpar fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpptfggg

101 tkleik

VH 130：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：26

1 evqlvesggg lvkpggslkl scaasgftfs syvmswvrqs pekrlewvae

51 issggsytyy pdtvtg rfti srdndkntly lemsslrsed tamyycarpp

101 ygkdamdywg qgtsvtvss

蛋白质140RAGE-1

VL 140：轻链可变区；完整分子长度：108aa；SEQ ID NO：4

1 qivltqspai msaspgekvt iscsasssvs ymywyqqkpg sspkpwiyrt

51 snlasgvpar fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqy hsyppmytfg

101 ggtkleik

VH 140：重链可变区；完整分子长度：121aa；SEQ ID NO：27

1 qvqlqqpgae lvkpgasvrl sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewige

51 inpsngrtny nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycardg

101 lgyrpiamdy wgqgtsvtvs s

蛋白质152RAGE-1

VL 152：轻链可变区；完整分子长度：110aa；SEQ ID NO：5

1 divltqspas lavslgqrat iscrasksvg tsdssymhwy qqkpgqppkl

51 liylasnles gvparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqhsrelyt

101 fgggtkleik

VH 152：重链可变区；完整分子长度：115aa；SEQ ID NO：28

1 dvqlqesgpd lvkpsqslsl tctvtgysit sgyswhwirq fpgnklewmg

51 yihysgstny npslksrisi trdtsknqff lqlnsvtted tatyycargg

101 dfaywgqgtl vtvsa

蛋白质158RAGE-1

VL 158：轻链可变区；完整分子长度：113aa；SEQ ID NO：6

1 sdvvltqtpl slpvnigdqa sisckstksl lnsdgftyld wylqkpgqsp

51 qlliylvsnr fsgvpdrfsg sgsgtdftlk isrveaedlg vyycfqsnyl

101 pltfgggtkv eik

VH 158：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：29

1 qiqlvqsgpe lkkpgetvki sckasgytft dysmhwvkqa pgkglkwmgw

51 intetgepty addfkgrfaf sletsastay llinnlkted tatyfcardy

101 lyyyamdywg qgtsvtvss

蛋白质164RAGE-1

VL 164：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：7

1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvg tyvswyqqkp eqspklliyg

51 asnrytgvpd rftgsgsatd ftltissvqa edladyhcgq sytypytfgg

101 gtkleik

VH 164：重链可变区；完整分子长度：116aa；SEQ ID NO：30

1 qvqlqqpgse lvrpgasvkl sckasgytft nywmhwvkqr pgqglewign

51 iypgsgstny dekfkskatl tvdtssstay mqlssltsed savyyctrlr

101 rgiaywgqgt lvtvsa

蛋白质166RAGE-1

VL 166：轻链可变区；完整分子长度：112aa；SEQ ID NO：8

1 nimmtqspss lavsagekvt msckssqsvl yssnqknyla wyqqkpgqsp

51 klliywastr esgvpdrftg sgsgtdftlt issvqaedla vyychqylss

101 ytfgggtkle ik

VH 166：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：31

1 qvqlqqsgpe lvkpgtsvri sckasgytft syyihwvkqr pgqglewigw

51 iypgnvitny hekfkgkasl tadkssstay mqlssltsed savyfcared

101 pfaywgqgtl vtvsa

蛋白质173RAGE-1

VL 173：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：9

1 divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg tnvawyqqkp gqspkaliys

51 asyrysgvpd rftgsgsgtd ftltisnvqs edlaeyfcqq ynsypltfga

101 gtklelk

VH 173：重链可变区；完整分子长度：120aa；SEQ ID NO：32

1 evkleesggg lvqpggsmkl scvasgftfs nywmnwvrqs pekglewvae

51 irlksnnyat hyaesvkgrf tisrddskss vylqmndlra edpgiyycir

101 dygnyamdhw gqgtsvtvss

蛋白质183RAGE-1

VL 183：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：10

1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvg tyvswyqqkp eqspklliyg

51 asnrytgvpd rftgsgsatd ftltissvqa edladyhcgq sysypytfgg

101 gtkleik

VH 183：重链可变区；完整分子长度：116aa；SEQ ID NO：33

1 evqlqqsgtv larpgasvkm sckasgysft sywmhwvkqr pgqglewiga

51 ifpgnsdtty nqkfkgkakl tavtsastay melssltned savyyctglr

101 rgfpywgqgt lvtvsv

蛋白质184RAGE-1

VL 184：轻链可变区；完整分子长度：111aa；SEQ ID NO：11

1 divltqspas lavslgqrat iscrasksvs tsgysymhwy qqkpgqppkl

51 liylashles gvparfsgsg sgtdfslnih pveeedaaty ycqhsrelpw

101 tfgggtklei k

VH 184：重链可变区；完整分子长度：120aa；SEQ ID NO：34

1 qvqlqqsgae lvrpgtsvkv sckasgyaft nyliewvkqr pgqglewigm

51 inpgsggtny nekfkgkatl tadkssstay mqlssltsdd savyfcargr

101 gghyryfdvw gagttvtvss

蛋白质210RAGE-1

VL 210：轻链可变区；完整分子长度：110aa；SEQ ID NO：12

1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli

51 ggtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhfwv

101 fgggtkltvl

VH 210：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：35

1 hseiqlqqtg pelvkpgasv kisckasgys ftdyimvwvk qshgkslewi

51 gtinpyygst synlkfkgka tltvdkssst anmqlnslts edsavyycar

101 lrlyamdywg qgtsvtvss

蛋白质240RAGE-1

VL 240：轻链可变区；完整分子长度：113aa；SEQ ID NO：13

1 sdvvltqtpl slpvsigdqa sisckstksl lnsdgftyld wylqkpgqsp

51 qlliylvsnr fsgvpdsfsg sgsgtdftlk isrveaedlg vyycfqsnyf

101 pltfgggttl eik

VH 240：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：36

1 qiqlvqsgpe lkkpgetvki sckasgytft dysmhwvkqa pgkglkwmgw

51 intetgepty addfkgrfaf sletsastay lqinnlkned tatyfcardy

101 lyyyamdywg qgtsvtvss

蛋白质250RAGE-1

VL 250：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：14

1 divmtqsqkf mstsvgdrvs vtckasqnvg tnvawyqqkp gqspkaliys

51 asyrysgvpd rftgsgsgtd ftltisnvqs edlaeffcqq ynsypltfga

101 gtklelk

VH 250：重链可变区；完整分子长度：120aa；SEQ ID NO：37

1 evkleesggg lvqpggsmkl scvasgftfs nywmnwvrqs pekglewvae

51 irlksnnyat hyaesvkgrf tisrddskss vylqmnnlra edtgiyfcir

101 dygnyamdyw gqgtsvtvss

蛋白质253RAGE-1

VL 253：轻链可变区；完整分子长度：113aa；SEQ ID NO：15

1 divmsqspss lavsvgekvt msckssqtll yssnqknyla wyqqkpgqsl

51 klliywastr esgvpdrfag sgsgtdftlt issvkaedla vyycqqyfgy

101 pytfgggtkl eik

VH 253：重链可变区；完整分子长度：118aa；SEQ ID NO：38

1 qvqlqqsgpe lvkpgasvri sckasgytft dyyihwvkqr pgqglewigw

51 iypgnvitky nekfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcaryd

101 ydyamdywgq gtsvtvss

蛋白质259RAGE-1

VL 259：轻链可变区；完整分子长度：109aa；SEQ ID NO：16

1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli

51 ggtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf

101 gggtkltvl

VH 259：重链可变区；完整分子长度：117aa；SEQ ID NO：39

1 qvqlqqsgae lvrpgtsvkv sckasgyaft nylidwvnqr pgqglewigv

51 inpgsggtny nekftgkatl tadkssstay mqlssltsdd savyfcarrr

101 vdtmdywgqg tsvtvss

蛋白质283RAGE-1

VL 283：轻链可变区；完整分子长度：109aa；SEQ ID NO：17

1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli

51 rgtnnrapgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf

101 gggtkltvl

VH 283：重链可变区；完整分子长度：118aa；SEQ ID NO：40

1 qvqlqqsgae lvrpgtsvkv sckasgyaft nyliewvkqr pgqglewigv

51 inpgsggtny serfkgkatl tadkssstay mqlssltsdd savyfcasyr

101 ydggmdywgq gtsvtvss

蛋白质316RAGE-1

VL 316：轻链可变区；完整分子长度：111aa；SEQ ID NO：18

1 divltqspas lavslgqrat iscrasksvs isgysylhwn qqkpgqspkl

51 liylasnles gvparfsgsg sgtdftln ih pveeedaaty ycqhsrelpy

101 tfgggtklei k

VH 316：重链可变区；完整分子长度：118aa；SEQ ID NO：41

1 qvqlqqsgpe lvrpgasvkm sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewigm

51 idpsnsetrl nqkfkdkatl nvdkssntay mqlssltsed savyycarnf

101 ygsslrvwga gttvtvss

蛋白质326RAGE-1

VL 326：轻链可变区；完整分子长度：108aa；SEQ ID NO：19

1 divmtqsqkf mstsvgdrvs itckasqnvg tavawyqqkp gqspklliys

51 asnrytgvpd rftgsgsgtd ftltisnmqs edladyfcqq yssyplltfg

101 agtklelk

VH 326：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：42

1 evklvesggg lvkpggslkl scaasgfafs sydmswvrqt pekrlewvat

51 issggsytsy pdsvqgrfti srdnarntly lqmsslrsed talyycassq

101 lppyamdywg qgtsvtvss

蛋白质347RAGE-1

VL 347：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：20

1 diqmtqsssy lsvslggrvt itckasd rin ywlawyqqkp gnaprllisg

51 attletgvps rfsgsgsgkd ytlsitslqt edvatyycqq ywstpytfgg

101 gtklelk

VH 347：重链可变区；完整分子长度：118aa；SEQ ID NO：43

1 qvqlqqsgae lakpgasvkm scrasgytft dywmhwvkqr pgqglewigf

51 inpstvytey ipkfkdkatl tadkssstay mqlssltsed savyycarsd

101 ggwyfdvwga gttvtvss

蛋白质499RAGE-1

VL 499：轻链可变区；完整分子长度：107aa；SEQ ID NO：21

1 divmtqshkf mstsvgdrvs itckasqdvs tavawyqqkp gqspklliys

51 asyrytgvpd rftgsgsgtd ftftissvqa edlavyycqq hyntprtfgg

101 gtkleik

VH 499：重链可变区；完整分子长度：113aa；SEQ ID NO：44

1 evqlqqsgtv larpgasvkm sckasgytft sywmhwvkqr pgqglewiga

51 iypgdsdtyy nq kfkg ka kl tavtststay melssltned savyyctmw

101 dywgqgttlt vss

蛋白质501-4RAGE-1

VL 501-4：轻链可变区；完整分子长度：109aa；SEQ ID NO：22

1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli

51 ggtnnrapdv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhwvf

101 gggtkltvl

VH 501-4：重链可变区；完整分子长度：120aa；SEQ ID NO：45

1 evmlvdsggg lvkpggslkl scaasgftfr syamswvrqt pekrlewvat

51 issggsytyy pdsvrgrftt srdngkntly lqmsslrsed tamyycarhg

101 gnysawftyw gqgtlvtvsa

蛋白质529RAGE-1

VL 529：轻链可变区；完整分子长度：109aa；SEQ ID NO：23

1 qavvtqesal ttspgetvtl tcrsstgavt tsnyanwvqe kpdhlftgli

51 ggtnnrspgv parfsgslig dkaaltitga qtedeaiyfc alwysnhlvf

101 gggtkltvl

VH 529：重链可变区；完整分子长度：119aa；SEQ ID NO：46

1 hseiqlqqtg pelvkpgasv kisckasgys ftdyimlwvk qshgkslewi

51 gninpyygst fynlkfkgka tltvdkssst aymqlnslts edsavyycar

101 sdywyfdvwg agttvtvss

实施例3：在用S100A12和S100A6的竞争ELISA中对选择的mAb的表征

对于S100A12竞争ELISA测定，孔用0.5μg/孔的S100A12包被。之后，将10μg/mL的RAGE-Fc和10μg/mL的竞争性mAb在室温下预温育30分钟。将混合物转移到S100A12包被的板中，并在室温下搅拌温育2小时。使用450nm的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)，用抗hIgG Fc特异性POD检测结合的RAGE-Fc。27种测试抗体中均不显示对RAGE-Fc/S100A12相互作用的拮抗剂活性。

对于S100A6竞争ELISA测定，孔用0.5μg/孔的S100A6包被。之后，将10μg/mL的RAGE-Fc和10μg/mL的竞争性mAb室温下预温育30分钟。将混合物转移到S100A6包被的板中，并在室温下搅拌温育2小时。使用450nm的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)，用抗hIgGFc特异性POD检测结合的RAGE-Fc。结果可表明27种抗体中有7种能够破坏RAGE-Fc/S100A6相互作用(15-35％抑制)。

对于5种mAb(显示抑制作用＞20％；LP08103、LP08104、LP08105、LP08108和LP08122D)，测试RAGE-S100A6结合(IC50)的抑制的剂量依赖性。为此，正如上文详述的一样，用S100A6进行包被。将10μg/mL的RAGE-Fc与竞争性mAb(以100μg/ml开始2倍系列稀释)在室温下温育2小时。使用450nm的TMB1组分HRP，通过抗IgG Fc特异性抗体过氧化物酶缀合物检测结合。

得到所测抗体的下列IC50值(另参见图4)：

56RAGE-1(LP08103)：IC50＝1.16[0.47；2.80]μg/mL(7.73nM)

240RAGE-1(LP08108)：IC50＝6.66[4.33；10.20]μg/mL(44.4nM)

166RAGE-1(LP08122)：IC50＝8.33[6.20；11.20]μg/mL(55.5nM)

158RAGE-1(LP08105)：IC50＝6.79[5.01；9.21]μg/mL(45.3nM)

对照XT-M4(LP08130)：IC50＝5.20[3.18；8.53]μg/mL(34.6nM)

用152RAGE-1(LP08104)未得到剂量作用

总之，4种mAb破坏hRAGE-S100A6相互作用，其中最大抑制作用为50％。

实施例4：竞争测定中鉴定的mAb的表征

按照本领域技术人员熟知的操作程序进行竞争测定。这类操作程序包括在实施例1所列举的手册中。竞争测定的结果汇编于表1中。

竞争ELISA测定表明

-5种mAb强有力地阻断hRAGE-S100B相互作用，即

158RAGE-1(LP08105)，其IC50＝0.109[0.071；0.166]μg/mL(0.72nM)

240RAGE-1(LP08108)，其IC50＝0.123[0.073；0.204]μg/mL(0.82nM)

166RAGE-1(LP08122)，其IC50＝0.128[0.093；0.176]μg/mL(0.85nM)

253RAGE-1(LP08127)，其IC50＝0.108[0.082；0.131]μg/mL(0.72nM)

326RAGE-1(LP08137)，其IC50＝0.097[0.064；0.148]μg/mL(0.64nM)

XT-M4(LP08130)，其IC50＝0.208[0.117；0.368]μg/mL(1.37nM)

-2种mAb阻断hRAGE-HMGB1相互作用，即

158RAGE-1(LP08105)，其IC50＝0.290[0.189；0.447]μg/mL(1.39nM)

240RAGE-1(LP08108)，其IC50＝0.310[0.270；0.463]μg/mL(2.06nM)

XT-M4(LP08130)，其IC50＝0.272[0.168；0，439]μg/mL(1.79nM)

-4种mAb破坏hRAGE-S100A6相互作用，即

56RAGE-1(LP08103)：IC50＝1.16[0.47；2.80]μg/mL(7.73nM)

240RAGE-1(LP08108)，其IC50＝6.66[4.33；10.20]μg/mL(44.4nM)

166RAGE-1(LP08122)，其IC50＝8.33[6.20；11.20]μg/mL(55.5nM)

158RAGE-1(LP08105)，其IC50＝6.79[5.01；9.21]μg/mL(45.3nM)

XT-M4(LP08130)，其IC50＝5.20[3.18；8.53]μg/mL(34.6nM)

实施例5：Biacore测定中mAb的表征

本测定基于使用CM5芯片上固定的抗小鼠Fc IgG的捕获测定。对于抗Fc抗体的固定，使用HBS-EP作为运行缓冲液。以11分钟的接触时间和10μl/分钟的流速进行与CM5芯片的标准胺偶联。10mM乙酸钠(pH 5.0)用作固定缓冲液。蛋白质浓度(抗小鼠Fc，BiacoreBR-1008-38)为100μg/mL。

对于结合分析，按1/10稀释于运行缓冲液的SN抗RAGE mAb(流速5μl/分钟)和15nM稀释于运行缓冲液的sRAGE(V-C1-C2)批号LP08062(流速50μl/分钟)分别用作分析物和配体(运行缓冲液：HBS-P+BSA 12mg/mL+CM葡聚糖12mg/mL，再生溶液：10mM甘氨酸pH1.7)。Langmuir 1∶1分析用作拟合模型。结果概括于表2中。

表2：人RAGE与固定化抗hRAGE mAb的结合

Claims

1.一种包含至少两个氨基酸序列或其功能活性变体的多肽或多肽复合物，其中所述至少两个氨基酸序列为

-SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：24，

-SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：25，

-SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：26，

-SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：27，

-SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28，

-SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：29，

-SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：30，

-SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：31，

-SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：32，

-SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：33，

-SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：34，

-SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：35，

-SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：36，

-SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：37，

-SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：38，

-SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：39，

-SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：40，

-SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：41，

-SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：42，

-SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：43，

-SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：44，

-SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：45，和/或

-SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：46，

2.权利要求1的多肽或多肽复合物，其中序列SEQ ID NO：1-23任一个的功能活性变体包含SEQ ID NO：1-23的各个序列的互补决定区L3(CDR L3)，优选CDR L1、CDR L2和CDR L3；和/或

其中序列SEQ ID NO：24-46任一个的功能活性变体包含SEQ IDNO：24-46的各个序列的互补决定区H3(CDR H3)，优选CDR H1、CDRH2和CDR H3。

3.权利要求1或2的多肽或多肽复合物，

i)其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和/或SEQ ID NO：23的氨基酸序列或其功能活性变体是轻链可变结构域(VL)；和/或

ii)其中SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和/或SEQ ID NO：46的氨基酸序列或其功能活性变体是重链可变结构域(VH)。

4.权利要求1-3中任一项的多肽或多肽复合物，其中所述多肽或多肽复合物是抗体。

5.权利要求4的多肽或多肽复合物，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、(scFv)2、二价抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体和/或微型抗体。

6.权利要求1-5中任一项的多肽或多肽复合物，其中所述多肽或多肽复合物包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。

7.权利要求1-6中任一项的多肽或多肽复合物，其中所述功能活性变体

c)由SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列和1-50个其它氨基酸残基、优选1-40个、更优选1-30个、甚至更优选至多1-25个、还更优选至多1-10个、最优选1、2、3、4或5个其它氨基酸残基组成。

8.7的多肽或多肽复合物，其中所述功能活性变体以一个或多个保守氨基酸取代之差衍生自SEQ ID NO：1-46任一个的SEQ ID NO：1-46任一个的氨基酸序列。

9.一种或多种核酸，其编码权利要求1-8中任一项的多肽或多肽复合物。

10.权利要求9的一种或多种核酸，其中所述一种或多种核酸位于载体中。

11.一种细胞，其产生权利要求4-8中任一项的抗体。

12.一种结合分子，其能够结合RAGE和包含权利要求1-8中任一项的多肽或多肽复合物。

13.一种用作药物的组合物，所述组合物包含至少一种权利要求1-8中任一项的多肽和/或至少一种权利要求9的核酸。

14.权利要求13的组合物，其用于治疗RAGE相关疾病或病症，优选选自脓毒症、败血症性休克、李斯特菌病、炎性疾病包括类风湿性关节炎和银屑病性关节炎和肠病、癌症、关节炎、克罗恩病、慢性急性炎性疾病、心血管疾病、勃起机能障碍、糖尿病、糖尿病并发症、血管炎、肾病、视网膜病、神经病、淀粉样变性、动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗死、充血性心力衰竭、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病和阿尔茨海默病、尤其糖尿病和/或炎性病症。

15.一种诊断权利要求13限定的RAGE相关疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使得自受试者的样品与权利要求1-7中任一项的多肽或多肽复合物或权利要求12的结合分子接触；和

(b)检测RAGE的量，

其中RAGE受体相对于对照的量的变化表明RAGE相关疾病或病症。