2.
具体实施方案
本发明的具体实施方案在下文列出:
1. 分离的结合蛋白,其以1 x 10-7 M或更少的KD和1 x 10-2 s-1或更少的koff速率常数与人RAGE解离,两者都通过表面等离振子共振测定。
2. i)实施方案1的结合蛋白,其与人RAGE结合,并且调节特别是抑制RAGE与其配体中的至少一种结合的能力,如在标准体外测定中测定的,如例如HTRF测定,如例如在实验部分中更详细描述的,特别是实施例4和5,和其中引用的参考文献。
ii)实施方案1的结合蛋白,其能够抑制RAGE介导的生物学活性。
iii)结合蛋白,特别是根据前述实施方案之一的,具有下述生物学活性中的至少一种:
a. 在动物模型如C57BL/6雌性小鼠中在体内可溶性Aβ1-40肽诱导的脑血容量(CBV)减少的抑制,如例如在实验部分中更详细描述的,特别是实施例10和其中引用的参考文献;
b. 在超表达人APP的动物模型如转基因Tg2576小鼠模型中在体内脑血容量的改善,如例如在实验部分中更详细描述的,特别是实施例16和其中引用的参考文献;
c. 在超表达人APP的动物模型如转基因Tg2576小鼠模型中在体内淀粉状蛋白斑数目和/或淀粉状蛋白斑面积的减少,如例如在实验部分中更详细描述的,特别是实施例19和其中引用的参考文献;
d. 在体外聚集的Aβ1-40肽诱导的海马神经元如得自胚胎大鼠的海马神经元发动蛋白切割的抑制,如例如在实验部分中更详细描述的,特别是实施例17和其中引用的参考文献;
e. 在海马切片培养中测定的,在体外Aβ1-42球聚体诱导的突触传递减少的逆转,如例如在实验部分中更详细描述的,特别是实施例18和其中引用的参考文献。
3. 实施方案1或2的结合蛋白,其中所述配体选自Aβ肽、Aβ-球聚体、S100b和两性蛋白。
4. 前述实施方案之一的结合蛋白,其是中和结合蛋白。
5. 前述实施方案之一的结合蛋白,其能够阻断特别是抑制Aβ球聚体与人RAGE的结合。
6. 前述实施方案之一的结合蛋白,其中所述其中所述Aβ球聚体是Aβ1-42。
7. 前述实施方案之一的结合蛋白,其中所述结合蛋白与人RAGE的C1-和/或C2-结构域的至少一个,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基相互作用。
8. 根据前述实施方案之一的结合蛋白,其是人源化抗体。
9. 根据前述实施方案之一的结合蛋白,其包括抗原结合结构域,所述结合蛋白能够结合人RAGE分子的表位,所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR
由SEQ ID NO.:4、12和20组成的氨基酸序列的CDR-H3组;和与所述序列之一具有至少50%,如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 %同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列;
由SEQ ID NO.:8、16和24组成的氨基酸序列的CDR-L3组;和与所述序列之一具有至少50%,如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 %同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。
10. 包括抗原结合结构域的结合蛋白,所述结合蛋白能够结合人RAGE分子的表位,所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR:
由SEQ ID NO.:4、12和20组成的氨基酸序列的CDR-H3组;和与所述序列之一具有至少50%,如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 %同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列;
由SEQ ID NO.:8、16和24组成的氨基酸序列的CDR-L3组;和与所述序列之一具有至少50%,如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 %同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。
11. 根据前述实施方案之一的结合蛋白,其进一步包括至少一个CDR,所述至少一个CDR包含如下氨基酸序列,所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:2、10、18组成的CDR-H1组;或选自由SEQ ID NO:3、11、19组成的CDR-H2组;或选自由SEQ ID NO:6、14、22组成的CDR-L1组;或选自由SEQ ID NO:7、15、23组成的CDR-L2组;
和与所述序列之一具有至少50%,如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 %同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。
12. 根据前述实施方案任一个的结合蛋白,其中所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列:
13. 根据实施方案12的结合蛋白,其包括至少3个CDRs,所述至少3个CDRs选自由下述组成的可变结构域CDR组:
或可变结构域组,其中所述3个CDRs中的至少一个是与亲本序列具有至少50%,如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 %同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。
14. 根据实施方案13的结合蛋白,其包括至少2个可变结构域CDR组。
15. 根据实施方案14的结合蛋白,其中所述至少2个可变结构域CDR组选自下述:
VH 7F9组和VL 7F9组;
VH 4E5组和VL 4E5和
VH 11E6组和VL 11E6组。
16. 根据前述实施方案之一的结合蛋白,其进一步包括人受体构架。
17. 根据实施方案16的结合蛋白,其中所述人受体构架包括选自SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53 54和55的至少一个氨基酸序列。
18. 前述实施方案任一个的结合蛋白,其包括选自SEQ ID NO:56和57的至少一个重链可变结构域;和/或选自SEQ ID NO:58和59的至少一个轻链可变结构域。
19. 实施方案18的结合蛋白,其中所述结合蛋白包括2个可变结构域,其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列:
SEQ ID NOs:56和58 ;56和59 ;
SEQ ID NOs:.57和58 ;57和59。
20. 根据实施方案16 – 19中任何一个的结合蛋白,其中所述人受体构架包括在关键残基上的至少一个构架区氨基酸取代,所述关键残基选自:
与CDR相邻的残基;
糖基化位点残基;
稀有残基;
能够与RAGE表位相互作用的残基;
能够与CDR相互作用的残基;
规范残基;
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基;
在Vernier区带内的残基;
能够进行副谷氨酸(para-glutamate)形成的N末端残基;和
和在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
21. 根据实施方案20的结合蛋白,其中所述关键残基选自
(重链序列位置):1、2、68、70、72、76、85、89、95
(轻链序列位置):11、13、43、49、58、70、87。
22. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白是共有人可变结构域。
23. 实施方案16 – 22中任何一个的结合蛋白,其中所述人受体构架包括至少一个构架区氨基酸取代,如例如1 - 20、1 - 15、1 – 10个,或2、3、4、5、6、7、8或9个取代,其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65%等同,并且包括与所述人受体构架等同的至少70个氨基酸残基。
24. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的至少一个(构架突变的)可变结构域:
(重链序列)SEQ ID NO:62、67、68和69;
(轻链序列)SEQ ID NO:63、64、65和66。
25. 实施方案24的结合蛋白,其中所述结合蛋白包括2个可变结构域,其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列:
SEQ ID NOs:62和63 ;62和64 ;62和65 ;62和66 ;;
SEQ ID NOs:67和63 ;67和64 ;67和65 ;67和66 ;
SEQ ID NOs:68和63 ;68和64 ;68和65 ;68和66 ;
26. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白能够结合选自RAGE分子的靶。
27. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其能够与人RAGE结合。
28. 实施方案27的结合蛋白,其具有下述另外功能特征中的至少一个:
与小鼠和大鼠RAGE结合。
29. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白能够调节特别是中和选自RAGE分子的靶的生物学功能。
30. 实施方案29的结合蛋白,其中所述结合蛋白调节特别是抑制RAGE与其配体中的至少一个结合的能力。
31. 实施方案30的结合蛋白,其中所述结合蛋白调节特别是抑制下述相互作用中的至少一种:
人RAGE与Aβ肽、Aβ球聚体、S100b和两性蛋白的结合。
32. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白能够中和RAGE生物学活性,如例如初级神经元中Aβ诱导的发动蛋白切割,海马切片中球聚体诱导的突触缺陷,Aβ诱导的CBV中的降低。
33. 实施方案32的结合蛋白,其中所述RAGE分子是RAGE或RAGE片段,如sRAGE。
34. 实施方案33的结合蛋白,其中所述RAGE选自人、大鼠和小鼠。
35. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白与所述靶具有选自下述的结合速率常数(kon):至少约102M-1s-1;至少约103M-1s-1;至少约104M-1s-1;至少约105M-1s-1;至少约106M-1s-1和至少约107M-1s-1,如通过表面等离振子共振测量的。
36. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白与所述靶具有选自下述的解离速率常数(koff):至多约10-2s-1;至多约10-3s-1;至多约10-4s-1;至多约10-5s-1;和至多约10-6s-1,如通过表面等离振子共振测量的。
37. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白与所述靶具有选自下述的解离常数(KD):至多约10-7 M;至多约10-8 M;至多约10-9 M;至多约10-10 M;至多约10-11 M;至多约10-12 M;和至多10-13 M。
38. 包括前述实施方案中任何一个中所述的结合蛋白的抗体构建体,所述抗体构建体进一步包括接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。
39. 根据实施方案38的抗体构建体,其中所述结合蛋白选自
免疫球蛋白分子,
单克隆抗体,
嵌合抗体,
CDR嫁接的抗体,
人源化抗体,
Fab,
Fab’,
F(ab’)2,
Fv,
二硫键连接的Fv,
scFv,
单结构域抗体,
双抗体,
多特异性抗体,
双重特异性抗体,
双重可变结构域免疫球蛋白,和
双特异性抗体。
40. 根据实施方案38和39中任何一个的抗体构建体,其中所述结合蛋白包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域:
人IgM恒定结构域,
人IgG1恒定结构域,
人IgG2恒定结构域,
人IgG3恒定结构域,
人IgG4恒定结构域,
人IgE恒定结构域,
人IgD恒定结构域,
人IgA1恒定结构域
人IgA2恒定结构域
人IgY恒定结构域,和
相应突变的结构域。
41. 根据实施方案38 - 40中任何一个的抗体构建体,其包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域:SEQ ID NO:25、41、42和26。
42. 包括实施方案38 - 41中任何一个中所述的抗体构建体的抗体缀合物,所述抗体缀合物进一步包括选自下述的试剂:免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。
43. 根据实施方案42的抗体缀合物,其中所述试剂是选自下述的显像剂:放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
44. 根据实施方案43的抗体缀合物,其中所述显像剂是选自下述的放射性标记:3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
45. 根据实施方案42的抗体缀合物,其中所述试剂是选自下述的治疗或细胞毒性剂:抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
46. 根据实施方案38 - 41中任何一个的抗体构建体,其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。
47. 根据实施方案42 - 45中任何一个的抗体缀合物,其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。
48. 根据实施方案1 - 37中任何一个的结合蛋白,其中所述结合蛋白作为晶体存在。
49. 根据实施方案38 - 41中任何一个的抗体构建体,其中所述抗体构建体作为晶体存在。
50. 根据实施方案42 - 45中任何一个的抗体缀合物,其中所述抗体构建体作为晶体存在。
51. 根据实施方案48的结合蛋白,其中所述晶体是无载体药物控释晶体。
52. 根据实施方案49的抗体构建体,其中所述晶体是无载体药物控释晶体。
53. 根据实施方案50的抗体缀合物,其中所述晶体是无载体药物控释晶体。
54. 根据实施方案48的结合蛋白,其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更大的体内半衰期。
55. 根据实施方案49的抗体构建体,其中所述抗体构建体具有比所述抗体构建体的可溶性配对物更大的体内半衰期。
56. 根据实施方案50的抗体缀合物,其中所述抗体缀合物具有比所述抗体缀合物的可溶性配对物更大的体内半衰期。
57. 根据实施方案48的结合蛋白,其中所述结合蛋白保留生物学活性。
58. 根据实施方案49的抗体构建体,其中所述抗体构建体保留生物学活性。
59. 根据实施方案50的抗体缀合物,其中所述抗体缀合物保留生物学活性。
60. 分离的核酸,其编码实施方案1-37中任何一个的结合蛋白氨基酸序列。
61. 分离的核酸,其编码实施方案38-41中任何一个的抗体构建体氨基酸序列。
62. 分离的核酸,其编码实施方案42-45中任何一个的抗体缀合物氨基酸序列。
63. 载体,其包括根据实施方案60 - 62中任何一个的分离的核酸。
64. 实施方案63的载体,其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE和pBJ。
65. 宿主细胞,其包括根据实施方案63和64中任何一个的载体。
66. 根据实施方案65的宿主细胞,其中所述宿主细胞是原核细胞。
67. 根据实施方案66的宿主细胞,其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
68. 根据实施方案67的宿主细胞,其中所述宿主细胞是真核细胞。
69. 根据实施方案68的宿主细胞,其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
70. 根据实施方案69的宿主细胞,其中所述真核细胞是选自下述的动物细胞:哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。
71. 根据实施方案69的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自HEK细胞、CHO细胞、COS细胞和酵母细胞。
72. 根据实施方案71的宿主细胞,其中所述酵母细胞是啤酒糖酵母。
73. 根据实施方案70的宿主细胞,其中所述宿主细胞是昆虫Sf9细胞。
74. 产生能够结合RAGE的蛋白质的方法,其包括在足以产生能够结合RAGE的结合蛋白的条件下,在培养基中培养实施方案65 – 73中任何一个的宿主细胞。
75. 蛋白质,其根据实施方案74的方法产生。
76. 用于释放结合蛋白的组合物,所述组合物包括
(a)制剂,其中所述制剂包括根据实施方案48 – 50中任何一个的结晶产物蛋白质,和成分;和
(b)至少一种聚合载体。
77. 根据实施方案76的组合物,其中所述聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚合物:聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己酮)(poly(dioxanone));聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖(polyeaccharides)、其掺和物和共聚物。
78. 根据实施方案76的组合物,其中所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
79. 用于治疗哺乳动物的方法,其包括给哺乳动物施用有效量的根据实施方案77和78中任何一个的组合物的步骤。
80. 药物组合物,其包括实施方案1 – 59中任何一个的产物,和药学上可接受的载体。
81. 实施方案80的药物组合物,其中所述药学上可接受的载体起用于增加所述结合蛋白的吸收或分散的佐剂的作用。
82. 实施方案81的药物组合物,其中所述佐剂是透明质酸酶。
83. 实施方案82的药物组合物,其进一步包括用于治疗其中RAGE活性有害的病症的至少一种另外的治疗剂。
84. 实施方案83的药物组合物,其中所述另外的试剂选自:治疗剂、显像剂、细胞毒性剂、血管发生抑制剂;激酶抑制剂;共刺激分子阻断剂;粘附分子阻断剂;抗细胞因子抗体或其功能片段;氨甲蝶呤;环孢菌素;雷帕霉素;FK506;可检测标记或报道分子;TNF拮抗剂;抗风湿剂;肌肉弛缓剂、麻醉药、非类固醇消炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇(corticosteriod)、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、刺激剂、哮喘药物治疗、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。进一步的例子是:Dimebon、抗Aβ抗体、β-分泌酶抑制剂、tau-调节剂、认知增强剂如例如5-HT6拮抗剂、胆固醇酯酶(cholesterinase)抑制剂(例如,他克林(tactrine)、多奈哌齐、霉司替明或加兰他敏)、部分NMDA受体阻断剂(例如,美金刚胺)、糖胺聚糖模拟物(例如,Alzhemed)、γ分泌酶的抑制剂或变构调节剂(例如,R-氟比洛芬)、促黄体素阻断促性腺激素释放激素激动剂(例如,亮丙瑞林)、5-羟色胺(serotinin)5-HTlA受体拮抗剂、螯合(chelatin)剂、神经元选择性L-型钙通道阻断剂、免疫调谐剂、淀粉状蛋白原纤维生成抑制剂或淀粉状蛋白蛋白沉积抑制剂(例如,M266)、另一种抗体(例如,bapineuzumab)、5-HTla受体拮抗剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、用于渐进性糖化终极产物的受体蛋白质、PARP刺激物、5-羟色胺6受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激剂、选择性CB1拮抗剂、针对苯二氮杂受体的不全激动剂、淀粉状蛋白β生产拮抗剂或抑制剂、淀粉状蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7不全拮抗剂、靶向PDE4的治疗剂、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂。
85. 用于减少人RAGE活性的方法,其包括使人RAGE与实施方案1 – 59中任何一个的产物接触,从而使得人RAGE活性减少。
86. 用于减少有此需要的受试者中hRAGE与选自Aβ肽、球聚体、S100b和两性蛋白的至少一种配体结合的方法,其包括给受试者施用实施方案1 – 59中任何一个的产物的步骤。
87. 用于治疗受试者的与RAGE活性相关的病症的方法,其包括施用单独或与其他治疗剂组合的实施方案1 – 59中任何一个的产物的步骤。
88. 用于减少患有其中RAGE活性有害的病症的受试者中的RAGE活性的方法,其包括给受试者施用单独或与其他治疗剂组合的实施方案1 – 59中任何一个的产物。
89. 实施方案88的方法,其中所述病症包括选自下述的神经学疾病:肌萎缩性(Amytropic)侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症(Post Polio)、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎(Myelitits)、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏(Huntington’s)舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病(Morbus Parkinson)、steel-Richard综合征、唐氏(Down’s)综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱病症、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病、脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病;糖尿病和所产生的并发症如糖尿病性视网膜病、肾病、脉管并发症;动脉粥样硬化并发症、肺纤维化、癌症尤其是黑素瘤、其他淀粉样变性。
90. 结合蛋白的分离的CDR,所述结合蛋白如实施方案1 – 51中任何一个中定义的。
91. 分离的结合蛋白,其与渐进性糖化终极产物受体(RAGE)蛋白质的至少一个表位特异性相互作用。
92. 实施方案91的分离的结合蛋白,其中所述分离的蛋白是单克隆抗体或其抗原结合片段。
93. 根据实施方案92的单克隆抗体或其抗原结合片段,其包括VH和VL结构域。
94. 根据实施方案92的单克隆抗体,其中所述单克隆抗体减少RAGE与其配体结合的能力。
95. 根据实施方案94的配体,其中所述配体包括Aβ肽、球聚体、S100b和两性蛋白。
96. 根据实施方案92的单克隆抗体,其中所述抗体能够阻断Aβ球聚体与RAGE的结合。
97. 根据实施方案92的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段包括:
具有选自SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 17的氨基酸序列的重链可变区;
具有选自SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 21的氨基酸序列的轻链可变区;
具有氨基酸序列SEQ ID No. 25的人免疫球蛋白γ1重链恒定区;和
具有氨基酸序列SEQ ID No. 26的人免疫球蛋白κ轻链恒定区。
98. 实施方案93的单克隆抗体,其中所述抗原结合结构域包括至少一个互补性决定区(CDR),其包括与选自SEQ ID NOs:2、3、4、6、7、8、10、11、12、14、15、16、18、19和20的序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
99. 根据实施方案93的单克隆抗体,其中所述VH结构域包括重链可变区,其包括与选自SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 17的序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
100. 根据实施方案99的单克隆抗体,其中所述VH结构域包括至少一个CDR区,其包括与选自SEQ ID NOs:2、3、4、10、11、12、18、19和20的序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
101. 根据实施方案100的单克隆抗体,其中所述VH结构域包括选自SEQ ID NOs:2、3、4;SEQ ID NOs. 10、11、12;SEQ ID NOs. 18、19和20组的至少3个CDR区。
102. 根据实施方案93的单克隆抗体,其中所述VL结构域包括轻链可变区,其包括与选自SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 21的序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
103. 根据实施方案102的单克隆抗体,其中所述VL结构域包括至少一个CDR区,其包括与选自SEQ ID NOs:6、7、8、14、15、16、22、23和24的序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
104. 根据实施方案103的单克隆抗体,其中所述VL结构域包括选自SEQ ID NOs:6、7、8;SEQ ID NOs. 14、15、16;SEQ ID NOs. 22、23和24组的至少3个CDR区。
105. 实施方案92的抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段是小鼠抗体、人源化抗体、全人、嵌合抗体、人源化抗体的抗原结合片段、或嵌合抗体的抗原结合片段。
106. 实施方案92的抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或抗原结合片段是选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和Fv片段的抗原结合片段。
107. 杂交瘤细胞系,其生产根据实施方案96的单克隆抗体或其抗原结合片段。
108. 实施方案107的杂交瘤细胞系,其中所述杂交瘤选自小鼠、人、大鼠、绵羊、猪、牛、山羊和马杂交瘤。
109. 产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系,所述单克隆抗体与RAGE蛋白质的至少一个表位特异性结合。
110. 实施方案107的杂交瘤细胞系,其中所述杂交瘤选自小鼠和人杂交瘤。
111. 实施方案107的杂交瘤细胞系,其中所述杂交瘤选自大鼠、绵羊、猪、牛、山羊和马杂交瘤。
112. 包括分离的核酸包括分离的核酸的载体,所述分离的核酸编码实施方案97的氨基酸序列中的任何一种,其中所述载体选自pcDNA;pTT;pTT3;pEFBOS;pBV;pJV;和pBJ。
113. 用根据实施方案112的载体转化的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
114. 实施方案113的宿主细胞,其中所述动物细胞是选自HEK293、CHO和COS的哺乳动物细胞。
115. 产生根据实施方案91的分离的结合蛋白的方法,其包括在足以产生结合蛋白的条件下在培养基中培养宿主细胞,收集培养基,并且纯化所产生的分离的结合蛋白。
116. 药物组合物,其包括根据实施方案99或102中任何一个的单克隆抗体或抗原结合部分,和药学上可接受的载体。
117. 治疗疾病或病症的方法,其包括施用实施方案99或102的单克隆抗体,其与RAGE中的C2-结构域结合。
118. 实施方案117的方法,其中所述病症包括选自下述的神经学疾病:肌萎缩性侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病、steel-Richard综合征、唐氏综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱病症、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病、脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病。
119. 实施方案105的抗体,其包括至少一个VH区,其包括选自SEQ ID NO:56和57的氨基酸序列。
120. 实施方案105的抗体,其包括至少一个VL区,其包括选自SEQ ID NO:58和59的氨基酸序列。
121. 实施方案119或120的抗体,其通过VH或VL序列中的1 – 10个突变另外修饰。
122. 实施方案121的抗体,其中所述突变选自构架回复突变以及Vernier和VH/VL界面残基的突变。
123. 前述所述实施方案之一的抗体或结合蛋白,其抑制RAGE与HMGB1-CpG DNA复合物的结合;或前述所述实施方案之一的抗体或结合蛋白,其不抑制RAGE与HMGB1-CpG DNA复合物的结合。
3.
抗
RAGE
抗体的生成
3.1.
梗概
应用的抗体可以通过合适宿主(例如脊椎动物,包括人、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行动物、鱼类、两栖动物,以及在鸟类、爬行动物和鱼的卵中)的免疫接种而生成。为了生成本申请的抗体,宿主用本发明的免疫原性RAGE多肽或其片段进行免疫接种。术语“免疫接种”在本文中指对免疫库(repertoire)呈递抗原的过程,无论库存在于天然遗传上未改变的生物,还是转基因生物中,包括进行修饰以展示人工hum5an免疫库的那些。类似地,“免疫原性制剂”是包含可增强抗原的免疫原性的佐剂或其他添加剂的抗原制剂。
动物的免疫接种可以通过本领域已知的任何方法完成。参见例如,Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1990。用于免疫接种非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域众所周知的。参见例如,Harlow和Lane以及美国专利号5,994,619。在具体实施方案中,RAGE抗原与佐剂一起施用,以刺激免疫应答。此种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此种佐剂可以通过使其在局部沉积物中隔离保护多肽免于快速分散,或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞趋化性的因子和免疫系统的其他组分的物质。具体地,如果待施用多肽,那么免疫接种程序表将涉及在几周期间展开的多肽的2次或更多次施用。
预期动物宿主用与完整或破裂细胞的细胞膜结合的抗原进行免疫接种,并且本申请的抗体通过与本发明的免疫原性多肽结合进行鉴定。在用抗原免疫接种动物宿主后,可以从动物中获得抗体。通过放血或处死动物从动物中获得含抗体血清。血清可以如其从动物中获得那样使用,免疫球蛋白级分可以从血清中获得,或抗体可以从血清中纯化。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的,从而具有性质的异质排列。
3.2
使用杂交瘤技术的抗
RAGE
单克隆抗体
单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多样技术进行制备,包括杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术、或其组合的使用。例如,单克隆抗体可以使用杂交瘤技术进行生产,包括本领域已知和例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor
Laboratory Press,第2版1988);Hammerling等人,in:Monoclonal Antibodies and
T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中教导的那些(所述参考文献整体引入作为参考)。如本文使用的,术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单个克隆的抗体,包括任何真核、原核或噬菌体克隆,而不是通过其产生的方法。
使用杂交瘤技术用于生产且筛选特定抗体的方法是本领域常规和众所周知的。在一个实施方案中,本发明提供了生成单克隆抗体的方法以及通过方法产生的抗体,所述方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞,其中特别地,杂交瘤通过下述生成:使从用本发明的抗原免疫接种的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,并且随后在由融合得到的杂交瘤中筛选分泌能够与本发明的多肽结合的抗体的杂交瘤克隆。简言之,小鼠可以用RAGE抗原进行免疫接种。在具体实施方案中,RAGE抗原与佐剂一起施用,以刺激免疫应答。此种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此种佐剂可以通过使其在局部沉积物中隔离保护多肽免于快速分散,或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞趋化性的因子和免疫系统的其他组分的物质。具体地,如果待施用多肽,那么免疫接种程序表将涉及在几周期间展开的多肽的2次或更多次施用。
一旦检测出免疫应答,例如在小鼠血清中检测出对于抗原RAGE特异的抗体,就收获小鼠脾并且分离脾细胞。随后通过众所周知的技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合,例如来自可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择且克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合RAGE的抗体的细胞测定杂交瘤克隆。通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠可以生成一般包含高水平抗体的腹水。
在另一个实施方案中,产生抗体的无限增殖化杂交瘤可以由免疫接种的动物进行制备。在免疫接种后,处死动物并且使脾B细胞与无限增殖化骨髓瘤细胞融合,如本领域众所周知的。参见例如,Harlow和Lane,同上。在具体实施方案中,骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。在融合和抗生素选择后,使用RAGE或其部分、或表达RAGE的细胞筛选杂交瘤。在具体实施方案中,使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA),特别是ELISA,执行初始筛选。ELISA筛选的例子在引入本文作为参考的WO 00/37504中提供。
产生抗RAGE抗体的杂交瘤进行选择、克隆且就所需特征进行进一步筛选,包括强壮杂交瘤生长、高抗体生产和所需抗体特征,如下文进一步讨论的。杂交瘤可以进行培养,并且在体内在同系动物中,在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠中,或在体外细胞培养中扩增。筛选、克隆且扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
在具体实施方案中,杂交瘤是小鼠杂交瘤,如上所述。在另一个具体实施方案中,杂交瘤在非人、非小鼠物种例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中,杂交瘤是人杂交瘤,其中使人非分泌性骨髓瘤与表达抗RAGE抗体的人细胞融合。
识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术生成。例如,本发明的Fab和F(ab')2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切产生,其中使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CHI结构域。
3.3
使用
SLAM
的抗
RAGE
单克隆抗体
在本发明的另一个方面,使用本领域中被称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序,由单个、分离的淋巴细胞生成重组抗体,如美国专利号5,627,052,PCT公开WO 92/02551和Babcock,J.S.等人(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中所述。在这种方法中,使用抗原特异性溶血噬斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞,例如来源于上述免疫接种的动物中的任何一种的淋巴细胞,其中使用接头例如生物素使抗原RAGE、RAGE的亚单位或其片段与绵羊红细胞偶联,并且用于鉴定分泌对于RAGE具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定目的抗体分泌细胞后,通过逆转录酶-PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs,并且随后可以在合适免疫球蛋白恒定区(例如,人恒定区)的背景中,在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。来源于体内选择的淋巴细胞的用扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞随后可以经历在体外的进一步分析和选择,例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对RAGE的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以在体外进行处理,例如通过体外亲和力成熟方法,例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。
3.4
使用转基因动物的抗
RAGE
单克隆抗体
在本发明的另一个实施方案中,通过用RAGE抗原免疫接种包括一些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物生产抗体。在具体实施方案中,非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠,工程改造的小鼠品系,其包括人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体生产方面缺陷。参见例如,Green等人Nature Genetics 7:13-21(1994)以及美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见1991年7月25日公开的WO 91/10741,1994年2月3日公开的WO 94/02602,1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735,1998年4月23日公开的WO 98/16654,1998年6月11日公开的WO 98/24893,1998年11月12日公开的WO 98/50433,1999年9月10日公开的WO 99/45031,1999年10月21日公开的WO 99/53049,2000年2月24日公开的WO 00 09560,和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体样人谱,并且生成抗原特异性人Mabs。通过引入人重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小的、种系构型YAC片段,XENOMOUSE转基因小鼠包含约80%的人抗体谱。参见Mendez等人,Nature Genetics 15:146-156(1997),Green和Jakobovits J. Exp. Med.
188:483-495(1998),其公开内容在此引入作为参考。
3.5
使用重组抗体文库的抗
RAGE
单克隆抗体
体外方法也可以用于制备本发明的抗体,其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。用于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的,并且包括在例如下述中描述的方法:Ladner等人美国专利号5,223,409;Kang等人PCT公开号WO 92/18619;Dower等人PCT公开号WO 91/17271;Winter等人PCT公开号WO 92/20791;Markland等人PCT公开号WO 92/15679;Breitling等人PCT公开号WO 93/01288;McCafferty等人PCT公开号WO 92/01047;Garrard等人PCT公开号WO 92/09690;Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85;Huse等人(1989)Science 246:1275-1281;McCafferty等人,Nature(1990)348:552-554;Griffiths等人(1993)EMBO J 12:725-734;Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226:889-896;Clackson等人(1991)Nature 352:624-628;Gram等人(1992)PNAS 89:3576-3580;Garrad等人(1991)Bio/Technology 9:1373-1377;Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137;和Barbas等人(1991)PNAS 88:7978-7982,美国专利申请公开20030186374,和PCT公开号WO 97/29131,其各自的内容引入本文作为参考。
重组抗体文库可以来自用RAGE或RAGE的部分免疫接种的受试者。可替代地,重组抗体文库可以来自首次用于实验的受试者,即尚未用RAGE免疫接种的受试者,例如来自尚未用人RAGE免疫接种的人受试者的人抗体文库。通过用包括人RAGE的肽筛选重组抗体文库选择本发明的抗体,以从而选择识别RAGE的那些抗体。用于进行此种筛选和选择的方法是本领域众所周知的,例如前述段落中的参考文献中描述的。为了选择对于hRAGE具有特定结合亲和力的本发明的抗体,例如以特定koff速率常数与人RAGE解离的那些,领域已知的表面等离振子共振法可以用于选择具有所需koff速率常数的抗体。为了选择对于hRAGE具有特定中和活性的本发明的抗体,例如具有特定IC50的那些,可以使用用于评估hRAGE活性抑制的本领域已知的标准方法。
在一个方面,本发明涉及结合人RAGE的分离的抗体或其抗原结合部分。具体地,抗体是中和抗体。在各种实施方案中,抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如,本发明的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示法生成。在噬菌体展示法中,功能抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示,所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地,此种噬菌体可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如,人或鼠)表达的抗原结合结构域。用抗原可以选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体,例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。在这些方法中使用的噬菌体一般是丝状噬菌体,包括由噬菌体表达的fd和M13结合结构域,所述噬菌体具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合的Fab、Fv或dsFv抗体结构域。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示法的例子包括公开于下述中的那些:Brinkman等人,J. Immunol. Methods
182:41-50(1995);Ames等人,J. Immunol. Methods
184:177-186(1995);Kettleborough等人,Eur. J. Immunol.
24:952-958(1994);Persic等人,Gene 187 9-18(1997);Burton等人,Advances in Immunology
57:191-280(1994);PCT申请号PCT/GB91/01134;PCT公开WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;以及美国专利号5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108;其各自整体引入本文作为参考。
如上述参考文献中所述,在噬菌体选择后,可以分离来自噬菌体的抗体编码区,并且用于生成全抗体,包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段,并且在任何所需宿主中表达,包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌,例如如下文详细描述的。例如,还可以采用重组生产Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术,其中使用本领域已知的方法,例如公开于PCT公开WO 92/22324;Mullinax等人,BioTechniques 12(6):864-869(1992);和Sawai等人,AJRI 34:26-34(1995);和Better等人,Science 240:1041-1043(1988)中的那些(所述参考文献整体引入作为参考)。可以用于生产单链Fvs和抗体的技术的例子包括在美国专利4,946,778和5,258,498;Huston等人,Methods in Enzymology
203:46-88(1991);Shu等人,PNAS 90:7995-7999(1993);和Skerra等人,Science 240:1038-1040(1988)中描述的那些。
对于通过噬菌体展示筛选重组抗体文库可替代的,可以应用本领域已知用于筛选大型组合文库的其他方法,以鉴定本发明的双重特异性抗体。一种类型的可替代表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白质融合物表达的那种,如在Szostak和Roberts的PCT公开号WO 98/31700,以及在Roberts,R.W.和Szostak,J.W.(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中描述的。在这种系统中,通过合成mRNAs的体外翻译,产生在mRNA及其编码的肽或蛋白质之间的共价融合物,所述合成mRNAs在其3'末端上携带嘌呤霉素,肽基受体抗生素。因此,特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物(例如,组合文库)中富集,这基于所编码的肽或蛋白质例如抗体或其部分的性质,例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列可以通过如上所述的重组方法表达(例如,在哺乳动物宿主细胞中),并且此外,可以实施进一步亲和力成熟,这通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环实现,其中突变已引入一种或多种最初筛选的序列内,或通过用于重组抗体的体外亲和力成熟的其他方法实现,如上所述。
在另一种方法中,本发明的抗体还可以使用本领域已知的酵母展示法生成。在酵母展示法中,遗传方法用于使抗体结构域与酵母细胞壁栓系,并且在酵母表面上展示它们。具体地,此种酵母可以用于展示由谱或重组抗体文库(例如,人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用于制备本发明抗体的酵母展示法的例子包括引入本文作为参考的Wittrup等人美国专利号6,699,658中公开的那些。
4.
本发明的特定重组
RAGE
抗体的产生
本发明的抗体可以通过本领域已知的许多方法中的任何一种产生。例如,由宿主细胞表达,其中通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术,例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体,但在真核细胞中表达抗体是优选的,并且最优选在哺乳动物宿主细胞中,因为此种真核细胞(且特别地哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠和免疫学活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的特定哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin,(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞,与DHFR选择标记一起使用,例如如R.J. Kaufman和P.A. Sharp(1982)Mol. Biol. 159:601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时,通过使宿主细胞培养一段时间来产生抗体,所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达,或特别地抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗体可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。
宿主细胞还可以用于产生功能抗体片段,例如Fab片段或scFv分子。将理解关于上述程序的变异在本发明的范围内。例如,可能希望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码重和轻链中任一或两者的一些或所有DNA,其对于与目的抗原结合不是必需的。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包括。此外,通过经由标准化学交联法使本发明的抗体与第二种抗体交联,可以产生双功能抗体,其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体,并且另一条重和轻链对于除目的抗原外的抗原特异。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的具体系统中,通过磷酸钙介导的转染将重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内,所述重组表达载体编码抗体重链和抗体轻链。在重组表达载体内,抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接,以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因,其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞,以允许表达抗体重和轻链,并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体,转染宿主细胞,选择转化体,培养宿主细胞并且从培养基中回收抗体。再进一步地,本发明提供了合成本发明的重组抗体的方法,其通过在合适培养基中培养本发明的宿主细胞,直至合成本发明的重组抗体来实现。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
4.1
抗
RAGE
抗体
表4是本发明的特定抗hRAGE抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表。
表4:抗huRAGE抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表
前述分离的抗RAGE抗体CDR序列确立了依照本发明分离的RAGE结合蛋白新家族。为了生成且选择就hRAGE而言具有特定RAGE结合和/或中和活性的本发明CDR's,可以使用本领域已知用于生成本发明的结合蛋白且评估那些结合蛋白的RAGE结合和/或中和特征的标准方法,包括但不限于本文具体描述的那些。
4.2
抗
RAGE
嵌合抗体
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子,例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如,Morrison,Science 229:1202(1985);Oi等人,BioTechniques 4:214(1986);Gillies等人,(1989)J. Immunol. Methods
125:191-202;美国专利号5,807,715;4,816,567;和4,816,397,其整体引入本文作为参考。此外,可以使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc. Natl. Acad. Sci.
81:851-855;Neuberger等人,1984,Nature 312:604-608;Takeda等人,1985,Nature 314:452-454,其整体引入本文作为参考),其通过剪接来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因连同来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因来实现。
在一个实施方案中,通过用人IgG1恒定区置换本文描述的鼠单克隆抗人RAGE抗体的重链恒定区产生本发明的嵌合抗体。
4.3 抗RAGE CDR嫁接的抗体
本发明的CDR嫁接的抗体包括来自人抗体的重和轻链可变区序列,其中用本发明的非人如例如鼠抗体的CDR序列置换VH和/或VL的CDR区中的一个或多个。来自任何人抗体的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模板。然而,在此种构架上的直链置换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与原始鼠抗体越同源,使鼠CDRs与人构架组合将引入CDRs中可以减少亲和力的变形的可能性越少。因此,优选选择为置换除CDRs外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65%序列同一性。更优选除CDRs外的人和鼠可变区具有至少70%序列同一性。更加优选除CDRs外的人和鼠可变区具有至少75%序列同一性。最优选除CDRs外的人和鼠可变区具有至少80%序列同一性。用于产生CDR嫁接的抗体的方法是本领域已知的(Jones等人,Nature 321:522-525(1986);美国专利号5,225,539)。
在一个具体实施方案中,本发明提供了具有如表5中所述的VH和/或VL链的CDR嫁接的抗体。
表
5
:
CDR
嫁接的抗体
衍生自mAb 11E6的CDR序列以粗体字母陈述。还参考通过陈述相应SEQ ID NOs(还参见表2和3)的特定构架序列(FR1 - FR4)。
4.4
抗
RAGE
人源化抗体
人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子,其具有来自非人物种的一个或多个互补性决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。公开了已知的人Ig序列,例如,
Kabat等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,U.S. Dept. Health(1983),各自整体引入本文作为参考。此种输入的序列可以用于减少免疫原性,或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期或任何其他合适特征,如本领域已知的。
人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代,以改变特别是改善抗原结合。这些构建取代通过本领域众所周知的方法进行鉴定,例如通过CDR和构架残基的相互作用建模,以鉴定对于抗原结合重要的构架残基,和序列比较,以鉴定在特定位置上的稀有构架残基。(参见例如,Queen等人,美国专利号5,585,089;Riechmann等人,Nature 332:323(1988),其整体引入本文作为参考。)三维免疫球蛋白模型是通常可获得的,并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的,其举例说明且展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式,可以选择FR残基且与共有和输入序列组合,从而使得达到所需抗体特征,例如对于一种或多种靶抗原增加的亲和力。一般而言,CDR残基直接且最充分地与影响抗原结合有关。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化,例如但不限于下述中描述的那些:Jones等人,Nature 321:522(1986);Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988)),Sims等人,J. Immunol. 151:2296(1993);Chothia和Lesk,J. Mol. Biol. 196:901(1987),Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 89:4285(1992);Presta等人,J. Immunol. 151:2623(1993),Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人,Protein Engineering 7(6):805-814(1994);Roguska.等人,PNAS 91:969-973(1994);PCT公开WO 91/09967、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755;WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106;EP 519,596、EP 239,400,美国专利号5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539;4,816,567,各自整体引入本文作为参考,包括其中引用的参考文献。
5.
本发明的抗体的进一步的实施方案
5.1
融合抗体和免疫粘附素
本申请还描述了可以制备的融合抗体或免疫粘附素,其包括与另一种多肽连接的本申请的RAGE抗体的全部或部分。在一些实施方案中,仅RAGE抗体的可变区与多肽连接。在其他实施方案中,本申请的RAGE抗体的VH结构域与第一种多肽连接,而抗体的VL结构域与第二种多肽连接,所述第二种多肽以允许VH和VL结构域彼此相互作用以形成抗原结合部位的方式与第一种多肽结合。在其他实施方案中,VH结构域通过接头与VL结构域分开,所述接头允许VH和VL结构域彼此相互作用(参见下文在单链抗体下)。VH-接头-VL抗体随后与目的多肽连接。融合抗体用于将多肽导向表达RAGE的细胞或组织。目的多肽可以是治疗剂例如毒素,或可以是诊断剂例如酶;其可以是容易显现的,例如辣根过氧化物酶。此外,可以制备融合抗体,其中2种(或更多种)单链抗体彼此连接。如果人们希望产生在单条多肽链上的二价或多价抗体,或如果人们希望产生双特异性抗体,那么这是有用的。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白,其中本申请的抗体或抗体部分由另一种功能分子(例如,另一种肽或蛋白质)衍生或连接。例如,本申请的标记的结合蛋白可以通过使本申请的抗体或抗体部分与一种或多种其他分子实体在功能上连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)而衍生,所述其他分子实体例如核酸、另一种抗体(例如,双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如,链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签)的结合的蛋白质或肽。
本申请的抗体或抗体部分可以由其衍生的有用可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体还可以用可检测酶衍生,例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可检测酶衍生时,它通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如,当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时,过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致可检测的有色反应产物。抗体还可以用核酸、生物素衍生,并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。
5.2
单链抗体
本申请包括结合本发明的免疫原性RAGE的单链抗体(scFv)。为了产生scFv,使VH和V编码DNA与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)的DNA可操作地连接,从而使得VH和VL序列可以作为邻接单链蛋白质表达,其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如,Bird等人(1988)Science 242:423-42 6;Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:5879-5883;McCafferty等人,30 Nature(1990)34 8:552- 554)。单链抗体可以是单价的,如果仅使用单个VH和VL的话,二价的,如果使用2个VH和VL的话,或多价的,如果使用超过2个VH和VL的话。经由接头偶联的2个所述scFv片段被称为“双抗体”,所述形式也由本发明包括。
5.3
双特异性抗体
本申请进一步包括双特异性抗体或其抗原结合片段,其中一种特异性对于本申请的免疫原性RAGE多肽。例如,可以生成双特异性抗体,其通过一个结合结构域与本发明的免疫原性RAGE多肽特异性结合,并且通过第二个结合结构域与第二种分子特异性结合。此外,可以生成包含超过一个VH和VL的单链抗体,其与本发明的免疫原性多肽和另一种分子特异性结合,所述另一种分子与逐渐减弱的髓磷脂介导的生长锥瓦解和神经突增生和萌发的抑制相关。使用众所周知的技术可以生成此种双特异性抗体,例如Fanger等人Immunol Methods 4:72-81(1994)以及Wright和Harris,20(同上)。
在一些实施方案中,使用来自本发明抗体的可变区中的一个或多个制备双特异性抗体。在另一个实施方案中,使用来自所述抗体的一个或多个CDR区制备双特异性抗体。
5.4
衍生化和标记的抗体
本申请的抗体或抗原结合片段可以由另一种分子(例如,另一种肽或蛋白质)衍生或连接。一般而言,这样衍生抗体或抗原结合片段,从而使得与本发明的免疫原性多肽结合不受衍生化或标记不利影响。
例如,本申请的抗体或抗体部分可以与一种或多种其他分子实体在功能上连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式),所述其他分子实体例如另一种抗体(例如,双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、和/或可以介导抗体或抗原结合片段与另一种分子(例如,链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签)的结合的蛋白质或肽。再进一步地,抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他或不同蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用,以制备四聚scFv分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies and
Hybridomas 6:93-101),以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签的使用,以制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Molecular Immunology
31:1047-1058)。抗体部分例如Fab和F(ab’)2片段可以使用常规技术由全抗体制备,例如全抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外,抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。
通过使2种或更多种抗体(具有相同类型或不同类型,例如以制备双特异性抗体)交联可以产生衍生化抗体。合适交联剂包括具有通过合适间隔基分开的2种不同反应基团的异双功能(例如,m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能(例如,二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)的那些。此种接头可从Pierce Chemical Company,Rockford,Ill获得。
衍生化抗体还可以是标记的抗体。例如,本发明的抗体或抗体部分可以由其衍生的检测试剂是荧光化合物,包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。抗体还可以用对于检测有用的酶进行标记,例如辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。在用可检测酶标记的实施方案中,抗体通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如,辣根过氧化物酶用过氧化氢和二氨基联苯胺。抗体还可以用生物素进行标记,并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。抗体还可以用由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如,亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位)进行标记。RAGE抗体或其抗原片段还可以用放射性标记的氨基酸进行标记。放射性标记可以用于诊断和治疗用途。放射性标记的RAGE抗体可以在诊断上例如用于测定受试者中的RAGE受体水平。进一步地,放射性标记的RAGE抗体可以在治疗上用于治疗脊髓损伤。
用于多肽的标记的例子包括但不限于,下述放射性同位素或放射性核素,15N,35S,90Y,99Tc,lllIn,125I,131I,177Lu,166Ho,153Sm。RAGE抗体或其抗原片段还可以用化学基团进行衍生,例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团。这些基团可以用于改善抗体的生物学特征,例如增加血清半衰期或增加组织结合。此外,用于多肽的标记可以包括核酸,例如用于通过PCR检测或增强基因表达的DNA,或siRNA以阻抑具有RAGE的细胞或组织中的基因表达。
RAGE抗体的类别和亚类可以通过本领域已知的任何方法进行测定。一般而言,抗体的类别和亚类可以使用对于抗体的特定类别和亚类特异的抗体进行测定。此种抗体是商购可得的。类别和亚类可以通过ELISA、蛋白质印迹以及其他技术进行测定。可替代地,类别和亚类可以这样进行测定:测序抗体重和/或轻链的全部或部分恒定结构域,使其氨基酸序列与免疫球蛋白各个类别和亚类的已知氨基酸序列比较,并且测定抗体的类别和亚类。
5.5
双重可变结构域免疫球蛋白
如本文使用的,双重可变结构域(DVD)结合蛋白或免疫球蛋白是这样的结合蛋白,其包括2个或更多个抗原结合部位并且是四价或多价结合蛋白,如例如二价和四价。术语“多价结合蛋白”在本说明书中用于指示包括2个或更多个抗原结合部位的结合蛋白。多价结合蛋白特别进行工程改造,以具有2个或更多个抗原结合部位,并且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多种相关或无关靶的结合蛋白。此种DVDs可以是单特异性的,即能够结合一种抗原,或多特异性的,即能够结合2种或更多种抗原。包括2种重链DVD多肽和2种轻链DVD多肽的DVD结合蛋白被称为DVD Ig。DVD Ig的每一半包括重链DVD多肽和轻链DVD多肽,和2个抗原结合部位。每个结合部位包括重链可变结构域和轻链可变结构域,具有与抗原结合有关的总共6个CDRs/抗原结合部位。DVD结合蛋白和制备DVD结合蛋白的方法公开于美国专利申请号11/507,050中,并且引入本文作为参考。本发明意欲包括包含能够结合RAGE的结合蛋白的DVD结合蛋白。具体地,DVD结合蛋白能够结合RAGE和第二种靶。第二种靶选自抗炎MAB活性(IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、TNFα/β、IFN-β、γ、LIF、OSM、CNTF、PF-4、血小板碱性蛋白(PBP)、NAP-2、β-TG、MIP-1、MCP2/3、RANTES、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin))、转运介导蛋白(胰岛素受体、运铁蛋白受体、凝血酶受体、瘦蛋白受体、LDL受体)、其他神经再生MABs(NgR、Lingo、p75、CSPG(例如NG-2、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖)透明质酸、mAG、生腱蛋白、NI-35、NI-250、IMP、基底膜蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、nogo-A、OMGP、Sema4D、Sema 3A、肝配蛋白(ephrin)B3、肝配蛋白A2、肝配蛋白A5、MAG、EphA4、丛蛋白(plexin)B1、TROY、wnts、ryk rec.、BMP-2、BMP-4、BMP-7)、神经保护MAB活性(EGF、EGFR、Sema 3)、抗淀粉状蛋白βMABs(例如m266、3D6(bapineuzumab)、抗球聚体MABs 7C6)、CNS定位的受体和转运蛋白(5-羟色胺受体、多巴胺受体、DAT、Asc-1、GlyT1)。
5.6
双重特异性抗体
本申请还描述了“双重特异性抗体”技术。双重特异性抗体可以充当激动剂、拮抗剂、或以不同组合的两者。双重特异性抗体是其中VH链与第一种抗原结合,并且VL链与另一种抗原结合的抗体,如WO2008082651中例示的。
5.7
结晶的抗体
本申请的另一个实施方案提供了结晶的结合蛋白。如本文使用的,术语“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式,其不同于其他形式例如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子(例如蛋白质,例如抗体),或分子组合(例如抗原/抗体复合物)组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。在符合给定的、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位的重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有三个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege,R.和Ducruix,A. Barrett,Crystallization of Nucleic
Acids and Proteins,a Practical Approach,第2版,第20 1-16页,Oxford University Press,New York,New York,(1999)。
具体地,本申请描述了如本文公开的完整RAGE抗体及其片段的晶体,和包括此种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中,结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性配对物更大的体内半衰期。在另一个实施方案中,结合蛋白在结晶后保留生物学活性。
本发明结晶的结合蛋白可以根据本领域已知且如引入本文作为参考的WO 02072636中公开的方法产生。
5.8
糖基化的抗体
本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白,其中抗体或其抗原结合部分包括一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可以经历进一步加工,称为翻译后修饰。具体地,糖(糖基)残基可以酶促添加,称为糖基化的过程。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白质称为糖基化的蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能具有重要作用,对抗体的抗原结合或半衰期具有最低限度作用(R. Jefferis,Biotechnol. Prog. 21(2005),第11–16页)。相比之下,可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性具有作用。在可变结构域中的糖基化可能对抗原结合亲和力具有负面作用,可能是由于空间位阻(Co,M.S.,等人,Mol. Immunol.(1993)30:1361- 1367),或导致对于抗原增加的亲和力(Wallick,S.C.,等人,Exp. Med.(1988)168:1099-1109;Wright,A.,等人,EMBO J.(1991)10:2717 2723)。
本发明的一个方面涉及生成糖基化位点突变体,其中结合蛋白的O或N联糖基化位点已突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周知的技术生成此种突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。
在另外一个实施方案中,本发明的抗体或抗原结合部分的糖基化是修饰的。例如,可以制备无糖基化(aglycoslated)抗体(即,抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化,以例如增加抗体对于抗原的亲和力。此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如,可以制备一个或多个氨基酸取代,其导致一个或多个可变区糖基化位点的消除,以从而消除在那个位点上的糖基化。此种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。此种方法在PCT公开WO2003016466A2,以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述,其各自整体引入本文作为参考。
另外或可替代地,可以制备本发明修饰的抗体,其具有改变的糖基化类型,例如具有减少量的岩藻糖残基的岩藻糖基化不足(hypofucosylated)抗体,或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种改变的糖基化模式已证实增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域中已得到描述,并且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞,以从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如,Shields,R. L.等人(2002)J. Biol. Chem.
277:26733-26740;Umana等人(1999)Nat. Biotech. 17:176-1,以及欧洲专利号:EP 1,176,195;PCT公开WO 03/035835;WO 99/54342 80,其各自整体引入本文作为参考。
蛋白质糖基化依赖于目的蛋白质的氨基酸序列,以及蛋白质在其中表达的宿主细胞。不同生物可以产生不同糖基化酶(例如,糖基转移酶和糖苷酶),并且具有可用的不同底物(核苷酸糖)。由于此种因素,蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成可能依赖于具体蛋白质在其中表达的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于,葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。具体地,糖基化的结合蛋白包括糖基残基,从而使得糖基化模式是人的。
本领域技术人员已知不同蛋白质糖基化可能导致不同蛋白质特征。例如,与在哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质的那种相比较,在微生物宿主例如酵母中产生,且利用酵母内源途径糖基化的治疗蛋白质的功效可以减少。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的,并且在施用后显示减少的体内半衰期。在人和其他动物中的特异性受体可能识别特异性糖基残基,且促进蛋白质从血流中的快速清除。其他不利作用可能包括蛋白质折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白质或因子识别、抗原性或变应原性中的改变。因此,从业者可能更喜欢具有特定糖基化组成和模式的治疗蛋白质,例如与人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中产生的那种等同或至少相似的糖基化组成和模式。
表达与宿主细胞那种不同的糖基化蛋白质可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来达到。使用本领域已知的技术,从业者可以生成显示人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如,酵母菌株已进行遗传修饰,以表达非天然存在的糖基化酶,从而使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)显示与动物细胞特别是人细胞那种等同的蛋白质糖基化(美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT公开WO2005100584 A2)。
此外,本领域技术人员将认识到,目的蛋白质可以使用进行基因工程改造以表达各种糖基化酶的宿主细胞文库表达,从而使得文库的成员宿主细胞产生具有变体糖基化模式的目的蛋白质。从业者随后可以选择且分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白质。具体地,具有特定选择的新糖基化模式的蛋白质显示出改善或改变的生物学性质。
5.9
抗独特型抗体
除结合蛋白外,本发明还涉及对于本发明的此种结合蛋白特异的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别一般与另一种抗体的抗原结合区相关的独特决定簇的抗体。抗Id可以通过用结合蛋白或其含CDR区免疫接种动物进行制备。免疫接种的动物将识别且响应免疫接种抗体的独特型决定簇,并且产生抗Id抗体。抗Id抗体还可以用作“免疫原”,以在另外一种动物中诱导免疫应答,从而产生所谓的抗抗Id抗体。
6.
抗体的用途
已知其与人RAGE结合的能力,本申请的中和抗体或其部分可以用于检测人RAGE(例如,在生物学样品例如血清或血浆中),其中使用常规免疫测定,例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本申请提供了用于检测生物学样品中的人RAGE的方法,其包括使生物学样品与本发明的抗体或抗体部分接触,并且检测与人RAGE结合的抗体(或抗体部分)或未结合的抗体(或抗体部分),以从而检测生物学样品中的人RAGE。抗体用可检测物质直接或间接标记,以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;合适辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素;合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白;发光材料的例子包括鲁米诺;和合适放射性材料的例子包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm。
本申请的抗体和抗体部分特别能够在体外和体内中和人RAGE活性。因此,本发明的此种抗体和抗体部分可以用于抑制RAGE与其配体结合且因此中和所产生的活性。
在另一个实施方案中,本申请提供了用于减少受试者中的RAGE活性的方法,有利地来自患有其中RAGE所产生的活性有害的疾病或病症的受试者。本申请提供了用于减少患有此种疾病或病症的受试者中的RAGE活性的方法,其通过经由使用本申请的单克隆抗体阻止RAGE与其配体中的至少一种如Aβ-球聚体结合来实现。本发明的抗体特别是本文公开的人源化抗体可以施用于人受试者用于治疗目的。此外,本申请的抗体可以施用于表达抗体能够与之结合的RAGE的非人哺乳动物,以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者,此种动物模型可以用于评价本发明的抗体的治疗功效(例如,测试施用剂量和时程(time course))。
如本文使用的,术语“其中RAGE活性有害的病症”意欲包括这样的疾病和其他病症,其中RAGE或其所产生的活性在患有病症的受试者中的存在已显示负责或怀疑负责病症的病理生理学,或是促进病症恶化的因素。因此,其中RAGE活性有害的病症是其中RAGE活性的减少预期减轻病症的症状和/或进展的病症。可以用本发明的抗体治疗的病症的非限制性例子包括在下文涉及本发明抗体的药物组合物部分中讨论的那些病症。
认识到RAGE在与包括神经学疾病的多种疾病相关的病理学中起重要作用,所述神经学疾病选自肌萎缩性侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病、steel-Richard综合征、唐氏综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱症病、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病、脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病。糖尿病和所产生的并发症如糖尿病性视网膜病、肾病、脉管并发症;动脉粥样硬化并发症、肺纤维化、癌症尤其是黑素瘤、其他淀粉样变性。(参见例如下述参考文献:淀粉样变性、癌症、关节炎、Crohn氏病、慢性和急性炎性疾病:Schmidt AM等人:J Clin Invest. 2001年10月;108(7):949-55.;心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症:Yan SD等人:Eur J Clin Invest. 1997年3月;27(3):179-81;朊病毒相关疾病:Sasaki N等人:Neurosci Lett. 2002年6月28日;326(2):117-20;脉管炎(vascularitis)、肾病、视网膜病和神经病:Thornalley PJ.:Int Rev
Neurobiol. 2002;50:37-57;阿尔茨海默病:Weldon DT等人:Geriatrics. 1997年9月;52 Suppl 2:S13-6;Yan SD等人:Biochim Biophys Acta. 2000年7月26日;1502(1):145-57;类风湿性关节炎、骨关节炎:Drinda S等人:.Rheumatol Int. 2004年3月26日;肠病:Foell D等人:Gut. 2003年6月;52(6):847-53;多发性硬化:Yan SS等人:Nat Med. 2003年3月;9(3):287-93;牛皮癣:Foell D等人:Rheumatology(Oxford). 2003年11月;42(11):1383-9 :狼疮 :Tanji N等人:J Am Soc Nephrol. 2000年9月;11(9):1656-66;一般的自身免疫疾病、脓毒症:Liliensiek B等人:J Clin Invest. 2004年6月;113(11):1641-50;动脉硬化和再狭窄:Schmidt AM等人:Circ Res. 1999年3月19日;84(5):489-97)。
此外,如先前讨论的,上文描述的配偶体任何一个之间的DVD免疫球蛋白或双重特异性抗体可以是有用的。如上所述的此种抗体制剂可以用于治疗此种疾病。
本申请的抗体也可以与允许跨膜转移的肽组合,以包括细胞内靶蛋白质的靶向。此种肽序列可以包括但不限于,tat、触角足(antennapedia)、poly-args、一些抗微生物肽。此种肽可以允许转移通过膜,包括细胞质膜,以及上皮和内皮膜,包括血脑屏障、肠粘膜、脑膜等。
本申请的抗体或抗体部分还可以与一种或多种另外的小分子治疗剂一起施用,所述小分子治疗剂在其中RAGE活性与之有关的病症治疗中有用,如前述段落中讨论的。应当理解本申请的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外试剂例如治疗剂组合使用,所述另外试剂通过技术人员就其预期目的进行选择。例如,另外试剂可以是领域公认为对于治疗通过本发明抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂,例如影响组合物粘度的试剂。
7.
药物组合物
本发明还提供了包括本发明的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物。包括本发明抗体的药物组合物用于但不限于下述用途:诊断、检测或监控病症,预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状,和/或研究。在具体实施方案中,组合物包括本发明的一种或多种抗体。在另一个实施方案中,药物组合物包括本发明的一种或多种抗体,和除本发明抗体外用于治疗其中RAGE活性有害的病症的一种或多种预防或治疗剂。具体地,预防或治疗剂已知用于或已用于或目前用于预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状。依照这些实施方案,组合物可以进一步包括载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。一般地,药物组合物包括本发明的抗体或抗体部分和药学上可接受的载体。如本文使用的,“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的例子包括下述的一种或多种:水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等,及其组合。在许多情况下,将优选在组合物中包括等渗剂,例如糖,多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量辅助物质,例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液,其增强抗体或抗体部分的保存期限或有效性。
各种递送系统是已知的,并且可以用于施用本发明的一种或多种抗体或本发明的一种或多种抗体和预防剂或治疗剂的组合,用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状,例如被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如,Wu和Wu,J. Biol. Chem.
262:4429-4432(1987))、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸的构建等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于,肠胃外施用(例如,皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外(epidurala)施用、瘤内施用和粘膜施用(例如,鼻内和经口途径)。此外,可以采用肺施用,例如通过使用吸入器或喷雾器,和具有雾化剂的制剂。参见例如,美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078;和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903,其各自整体引入本文作为参考。在一个实施方案中,本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)进行施用。在具体实施方案中,本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何常规途径施用,例如通过输注或单次快速静脉注射,通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如,口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收,并且可以连同其他生物学活性试剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
在具体实施方案中,可能需要将本发明的预防或治疗剂局部施用于需要治疗的区域;这可以通过例如但不限于下述达到:局部输注,通过注射,或借助于植入物,所述植入物是多孔或无孔材料,包括膜和基质,例如硅橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如Tissel®)或胶原基质。在一个实施方案中,有效量的本发明拮抗剂的一种或多种抗体局部施用于受试者的受累区域,以预防、治疗、管理和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中,有效量的本发明的一种或多种抗体与有效量的除本发明抗体外的一种或多种治疗(例如,一种或多种预防或治疗剂)组合局部施用于受试者的受累区域,以预防、治疗、管理和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中,预防或治疗剂可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中,泵可以用于达到控释或持续释放(参见Langer,同上;Sefton,1987,CRC Crit. Ref. Biomed.
Eng. 14:20;Buchwald等人,1980,Surgery 88:507;Saudek等人,1989,N. Engl. J. Med. 321:574)。在另一个实施方案中,聚合材料可以用于达到本发明治疗的控释或持续释放(参见例如Medical Applications of
Controlled Release,Langer和Wise(编辑),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and
Performance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York(1984);Ranger和Peppas,1983,J.,Macromol. Sci. Rev.
Macromol. Chem. 23:61;还参见Levy等人,1985,Science 228:190;During等人,1989,Ann. Neurol. 25:351;Howard等人,1989,J. Neurosurg. 7 1:105);美国专利号5,679,377;美国专利号5,916,597;美国专利号5,912,015;美国专利号5,989,463;美国专利号5,128,326;PCT公开号WO 99/15154;和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在优选实施方案中,在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的,不含可沥滤杂质,贮存稳定,无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中,控释或持续释放系统可以接近预防或治疗靶放置,从而仅需要全身剂量的部分(参见例如Goodson,in Medical Applications of
Controlled Release,同上,第2卷,第115-138页(1984))。
控释系统在由Langer的综述(1990,Science 249:1527-1533)中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于产生包括本发明的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见例如,美国专利号4,526,938,PCT公开WO 91/05548,PCT公开WO 96/20698,Ning等人,1996,"Intratumoral
Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release
Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189,Song等人,1995,"Antibody Mediated Lung
Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical
Science &Technology 50:372-397,Cleek等人,1997,"Biodegradable Polymeric
Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l.
Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854,和Lam等人,1997,"Microencapsulation of
Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc.
Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760,其各自整体引入本文作为参考。
在具体实施方案中,当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸时,所述核酸可以在体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达,这通过下述实现,将其构建为合适核酸表达载体的部分,并且这样施用,从而使得其变成细胞内的,例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286),或通过直接注射,或通过使用微粒轰击(例如,基因枪;Biolistic,Dupont),或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被,或通过与已知进入核的同源异型框样肽连接施用(参见例如,Joliot等人,1991,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:1864-1868)。可替代地,核酸可以细胞内引入且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于肠胃外,例如静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如,吸入)、经皮(例如,局部)、跨粘膜和直肠施用。在具体实施方案中,组合物依照常规程序配制为适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类的药物组合物。一般地,用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。需要时,组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocamne),以减轻在注射部位处的疼痛。
如果本发明的组合物将局部施用,那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂的形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见例如,Remington's Pharmaceutical
Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第19版,Mack Pub. Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷雾的局部剂型,一般采用粘性至半固体或固体形式,其包括与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂,并且具有特别大于水的动态粘度。合适制剂包括但不限于,溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等,需要时,其进行灭菌或与用于影响各种性质例如渗透压的助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐)混合。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂,其中特别与固体或液体惰性载体组合的活性成分与加压挥发物(例如气体推进剂,例如氟利昂)在混合物中包装或包装在挤压瓶中。需要时,保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以加入药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用,那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。具体地,用于根据本发明使用的预防或治疗剂可以方便地以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂的形式递送,使用合适推进剂(例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)。在加压气溶胶的情况下,剂量单位可以通过提供阀来确定,以递送计量的量。可以配制用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药液筒(由例如明胶组成),其包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
如果本发明的方法包括经口施用,那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊(gelcaps)、溶液、悬浮液等的经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学上可接受的赋形剂进行制备,例如粘合剂(例如,预凝胶玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);充填剂(例如,乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如,硬脂酸镁、滑石或二氧化硅);崩解剂(例如,马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠);或湿润剂(例如,十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆或悬浮液的形式,或它们可以作为干燥产物呈现,用于在使用前用水或其他合适载体构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂进行制备,例如悬浮剂(例如,山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(例如,卵磷脂或阿拉伯胶);非水载体(例如,杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油);和防腐剂(例如,对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。合适时,制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制,用于一种或多种预防或治疗剂的缓慢释放、控释或持续释放。
本发明的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizing agent)配制的组合物的肺施用,例如通过使用吸入器或喷雾器。参见例如,美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078;和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903,其各自整体引入本文作为参考。在具体实施方案中,本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)进行施用。
本发明的方法可以包括施用配制用于通过注射(例如,通过单次快速静脉注射或连续输注)肠胃外施用的组合物。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如,在安瓿或多剂容器中)呈现。组合物可以采取此种形式,如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂,并且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地,活性成分可以为粉末形式,用于在使用前用合适载体(例如,无菌无致热原水)构建。本发明的方法可以另外包括施用配制为积存(depot)制剂的组合物。此种长效制剂可以通过植入(例如,皮下或肌内)或通过肌内注射进行施用。因此,例如,组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如,作为在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制,或配制为微溶衍生物(例如,作为微溶盐)。
本发明的方法包括施用配制为中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的那些,例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些,和由阳离子形成的那些,例如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁,异丙胺,三乙胺,2-乙氨基乙醇,组氨酸,普鲁卡因等的那些。
一般地,组合物的成分分开或以单位剂型混合在一起提供,例如作为在指示活性剂的量的密封容器例如安瓿或囊剂(sachette)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当施用方式是输注时,组合物可以用包含无菌药物级别水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是通过注射时,可以提供无菌注射用水或盐水安瓿,从而使得成分可以在施用前混合。
具体地,本发明还提供了本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种包装在指示试剂的量的密封容器例如安瓿或囊剂中。在一个实施方案中,本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物供应,并且可以重构(例如,用水或盐水)至合适浓度以用于施用于受试者。具体地,本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末供应,其单位剂量为至少5 mg,更特别地至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg。本发明的冻干预防或治疗剂或药物组合物应在其原始容器中贮存于2℃-8℃,并且本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内施用,特别在5天内、在72小时内、在48小时内、在24小时内、在12小时内、在6小时内、在5小时内、在3小时内、或在1小时内。在可替代的实施方案中,本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种在指示试剂的量和浓度的密封容器中以液体形式供应。具体地,所施用组合物的液体形式在密封容器中以至少0.25 mg/ml供应,更特别地至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应在其原始容器中贮存于2℃-8℃。
本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于肠胃外施用的药物组合物内。具体地,抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250 mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50 mM),最佳地5-10mM,在pH 5.0 - 7.0(最佳地pH 6.0)下。其他合适缓冲液包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰在0-300 mM(对于液体剂型最佳地150 mM)浓度下的溶液毒性。对于冻干剂型可以包括冷冻保护剂,主要是0-10%蔗糖(最佳地0.5-1.0%)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可以包括膨胀剂,主要是1-10%甘露糖醇(最佳地2-4%)。稳定剂可以用于液体和冻干剂型,主要是1-50 mM L-甲硫氨酸(最佳地5-10 mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸,可以作为0-0.05%聚山梨醇酯-80(最佳地0.005-0.01%)包括。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为用于肠胃外施用的可注射溶液的包括本发明抗体和抗体部分的药物组合物,可以进一步包括用作佐剂的试剂,例如用于增加治疗蛋白质(例如,抗体)吸收或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶例如Hylenex®(重组人透明质酸酶)。在可注射溶液中透明质酸酶的添加改善在肠胃外施用特别是皮下施用后的人生物利用率。它还允许具体更少疼痛和不适的更大的注射部位体积(即大于1 ml),以及最低限度的注射部位反应发生率(参见引入本文作为参考的WO2004078140、US2006104968)。
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括液体、半固体和固体剂型,例如液体溶液(例如,可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。具体形式依赖于预期施用方式和治疗应用。一般的特定组合物为可注射或可输注溶液的形式,例如类似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。具体施用方式是肠胃外(例如,静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在具体实施方案中,抗体通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个具体实施方案中,抗体通过肌内或皮下注射进行施用。
治疗组合物一般必须是无菌和在制造和贮存条件下稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以这样制备:将需要量的活性化合物(即,抗体或抗体部分)与上文列出的成分之一或组合一起掺入合适溶剂中,需要时,随后为过滤灭菌。一般地,分散体通过将活性化合物掺入无菌载体内进行制备,所述无菌载体包含基本分散介质和来自上文列出那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冻干粉末的情况下,具体制备方法是真空干燥和喷雾干燥,这由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的正确流动性可以这样维持:例如通过使用包衣例如卵磷脂,在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小,和通过使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来引起。
本发明的抗体和抗体部分可以通过本领域已知的多种方法进行施用,尽管对于许多治疗应用,具体施用途径/方式是皮下注射、静脉内注射或输注。如本领域技术人员将认识到的,施用途径和/或方式将依赖于所需结果而改变。在特定实施方案中,活性化合物可以与保护化合物免于快速释放的载体一起进行制备,例如控释制剂,包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或本领域技术人员一般已知的。参见例如,Sustained and Controlled
Release Drug Delivery Systems,J.R. Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在特定实施方案中,本发明的抗体或抗体部分可以例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物(和若需要,其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中,压缩成片剂,或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用,化合物可以与赋形剂掺合,并且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物,可能必需用预防其失活的材料包被化合物,或使化合物与预防其失活的材料共施用。
补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在特定实施方案中,本发明的抗体或抗体部分与一种或多种另外治疗剂共配制和/或共施用,所述另外治疗剂对于治疗其中RAGE活性有害的病症有用。例如,本发明的抗RAGE抗体或抗体部分可以与一种或多种另外抗体共配制和/或共施用,所述另外抗体结合其他靶(例如,结合细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)。此外,本发明的一种或多种抗体可以与前述治疗剂中的2种或更多种组合使用。此种联合治疗可以有利地利用更低剂量的所施用的治疗剂,从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在特定实施方案中,针对RAGE或其片段的抗体与本领域已知的半衰期延长载体连接。此种载体包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。此种载体在例如美国申请系列号09/428,082和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述,其为了任何目的在此引入作为参考。
在具体实施方案中,施用包括编码本发明抗体或本发明的另一种预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列,以经由基因疗法治疗、预防、管理或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用所表达的或可表达的核酸执行的疗法。在本发明的这个实施方案中,核酸产生其编码的抗体或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。
关于本领域可用的基因疗法的方法中的任何一个可以根据本发明使用。关于基因疗法的方法的一般综述,参见Goldspiel等人,1993,Clinical Pharmacy
12:488-505;Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev,1993,Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 32:573-596;Mulligan,Science 260:926- 932(1993);以及Morgan和Anderson,1993,Ann. Rev. Biochem.
62:191-217;1993年5月,TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel等人(编辑),Current Protocols in
Molecular Biology,John Wiley &Sons,NY(1993);和Kriegler,Gene Transfer and
Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中描述。基因疗法的各种方法的详述公开于引入本文作为参考的US20050042664 A1中。
RAGE在与如本文上文定义的多种疾病相关的病理学中起关键作用。淀粉状蛋白Aβ-肽输注到动物内导致在arteriolose中如同炎症应答的应答,脑血流量中的减少。这些作用可以通过针对RAGE的抗体阻止(Rhodin,J.等人World Congress for
Microcirculation,submitted Papers,7th,Sydney,Australia,2001年8月19-22日,543-547; Deane等人Nature med. 2003)。RAGE在AD患者和其中人APP基因已超表达的转基因小鼠的微脉管系统(microvasculature)中是上调的(Deane等人Nature med. 2003)。使用其中人APP基因表达且RAGE超表达的双重转基因小鼠,显示正常RAGE基因的超表达导致学习中的损害,斑中的增加,而显性失活发信号缺陷RAGE变体的超表达导致学习中的改善和较低的斑水平(Arancio等人2004 EMBO J. 2004)。1和2型糖尿病的动物模型中的实验揭示配体-RAGE轴的拮抗作用阻抑糖尿病环境例如RAGE敲除小鼠中脉管和炎性细胞干扰的发展和进展,并且抗RAGE抗体已用于显示关于例如糖尿病肾病的动物模型中的改善(Ravichandran R.等人CANADIAN JOURNAL OF
DIABETES. 2006;30(4):422,Myint Khin等人Diabetes(2006),55(9),2510;De-Vriese等人Journal of the American
Society of Nephrology 2003,14/8,2109,Jensen等人Renal effects of a
neutralising RAGE-antibody in long-term streptozotocin-diabetic mice. The
Journal of endocrinology,2006,188,493)。在肥胖2型糖尿病小鼠中的中和RAGE抗体的正面长期肾作用由Flyvbjerg 等人(Diabetes,2004,53,1,第166-72页)显示。RAGE敲除小鼠用于显示RAGE在脓毒症中的牵涉(Birgit Liliensiek等人J Clin Invest. 2004 June 1;113(11):1641–1650;Receptor for advanced
glycation end products(RAGE)regulates sepsis but not
the adaptive immune response)。阻断衍生自抗RAGE IgG的F(ab)2片段减少MOG或MBP诱导的EAE中的炎症应答(Yan,S.S.等人2003. Nat. Med. 9:287–293.)显示了RAGE在癌症中的牵涉(Abe-R等人Journal of Investigative
Dermatology,2004,122/2(461-467)。在荷瘤小鼠中,生存率延长,并且通过使用抗RAGE中和抗体的治疗抑制自发性肺转移。
本发明的抗体和抗体部分可以用于治疗患有此种疾病的人。
应当理解本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外试剂例如治疗剂组合使用,所述另外试剂通过技术人员根据其预期目的进行选择。例如,另外试剂可以是领域公认为对于治疗通过本发明抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂,例如影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解待包括在本发明内的组合是对于其预期目的有用的那些组合。下文阐述的试剂用于举例说明目的且不预期是限制性的。作为本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下文列表的至少一种另外试剂。组合还可以包括超过一种另外试剂,例如2种或3种另外试剂,如果组合是这样的,从而使得所形成的组合物可以执行其预期功能的话。
本发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的非限制性例子包括下述:皮质类固醇;强的松龙;甲基强的松龙;硫唑嘌呤;环磷酰胺;环孢菌素;氨甲蝶呤;4-氨基吡啶;替扎尼定;干扰素-ß1a(Avonex;Biogen);干扰素-ß1b(Betaseron;Chiron/Berlex);干扰素α-n3)(Interferon
Sciences/Fujimoto)、干扰素-α(Alfa Wassermann/J&J)、干扰素(Serono/Inhale Therapeutics)、聚乙二醇化干扰素α 2b(Enzon/Schering-Plough)、共聚物1(Cop-1;Copaxone;Teva Pharmaceutical
Industries,Inc.);高压氧;静脉内免疫球蛋白;克拉屈滨(clabribine);针对其他人细胞因子或生长因子及其受体的抗体或拮抗剂,例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合,所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合,例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子例如TNFα或IL-1发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFβ)。
其中本发明的抗体或其抗原结合部分可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的具体例子包括干扰素-β例如IFNß1a和IFNß1b;考帕松、皮质类固醇、胱天蛋白酶抑制剂例如胱天蛋白酶-1抑制剂、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、以及针对CD40配体和CD80的抗体。
具体地,本发明的结合蛋白和抗体可以用于治疗淀粉样变性,例如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。应当理解本发明的结合蛋白和抗体可以单独或与至少一种另外试剂组合使用,所述另外试剂适合于治疗上述疾病之一。所述至少一种另外试剂可以通过技术人员根据其预期目的进行选择。例如,另外试剂可以是治疗剂例如胆固醇酯酶抑制剂(例如,他克林、多奈哌齐、霉司替明或加兰他敏)、部分NMDA受体阻断剂(例如,美金刚胺)、糖胺聚糖模拟物(例如,Alzhemed)、γ分泌酶的抑制剂或变构调节剂(例如,R-氟比洛芬)、促黄体素阻断促性腺激素释放激素激动剂(例如,亮丙瑞林)、5-羟色胺5-HTlA受体拮抗剂、螯合剂、神经元选择性L-型钙通道阻断剂、免疫调谐剂、淀粉状蛋白原纤维生成抑制剂或淀粉状蛋白蛋白沉积抑制剂(例如,M266)、另一种抗体(例如,bapineuzumab)、5-HTla受体拮抗剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、用于渐进性糖化终极产物的受体蛋白质、PARP刺激物、5-羟色胺6受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激剂、选择性CB1拮抗剂、针对苯二氮杂受体的不全激动剂、淀粉状蛋白β生产拮抗剂或抑制剂、淀粉状蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7不全拮抗剂、靶向PDE4的治疗剂、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂(即,目前公认或未来公认为对于治疗通过本发明抗体或结合蛋白治疗的疾病或状况有用的那些试剂)。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂,例如影响组合物粘度的试剂。
本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合,例如阿来组单抗(alemtuzumab)、屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗(daclizumab)、米托蒽醌、盐酸扎利罗登(xaliproden hydrochloride)、4-氨基吡定、乙酸格拉太咪尔、那他珠单抗(natalizumab)、辛纳必醇(sinnabidol)、α-免疫因子(a-immunokine) NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂质体被囊化的米托蒽醌)、THC.CBD(大麻素激动剂)MBP-8298、美苏帕玛(mesopram)(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗IL-6受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼酮allotrop 1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4拮抗剂(例如,TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干扰素γ拮抗剂、IL-4激动剂。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以通过本领域技术人员决定,并且可以根据因素而改变,所述因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量,和抗体或抗体部分在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量还是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地,因为预防剂量在疾病前或在疾病较早阶段时在受试者中使用,所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如,治疗或预防应答)。例如,可以施用快速灌注剂,可以随着时间过去施用几个分份剂量,或可以如由治疗情形的紧急状态指示的按比例减少或增加剂量。以单位剂型配制肠胃外组合物用于容易施用和剂量一致是特别有利的。如本文使用的,单位剂型指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位;每个单位包含与所需药学载体结合的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明单位剂型的详细说明由下述指示且直接依赖于下述:(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用,和(b)配合这种用于治疗个体中的敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。
关于本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20 mg/kg,更具体地1-10 mg/kg。应当指出剂量值可以随着待减轻的状况类型和严重性而改变。应进一步理解对于任何具体受试者,根据个体需要和施用或监督组合物施用的个人的专业判断,应随着时间过去调整特定剂量方案,并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的,并且不意欲限制请求保护的组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员将显而易见的是,本文描述的本发明方法的其他合适修饰和适应是显而易见的,并且在不背离本发明或本文公开的实施方案的范围的情况下可以使用合适等同方案进行。尽管目前已详细描述了本发明,但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明,所述实施例被包括用于举例说明目的并且不预期是本发明的限制。
实验部分
实施例
19
:抗体
11E6
对
Tg2576
小鼠额皮质中的淀粉状蛋白斑的作用的原位分析
对于这些实验,使用14.5个月大的Tg2576小鼠(Hsiao等人,1996,Science;274(5284),99-102)。该小鼠超表达具有所谓的Swedish突变(K670N/M671L)的人APP,并且在约11月大时在脑实质中形成β淀粉状蛋白沉积。从12月大时开始,小鼠用500 µg 11E6(n=19)i.p.(腹膜内)或IgG1对照抗体(n=19)进行注射,每周一次,进行12周。在最后一次注射后,动物进行深度麻醉,并且用0.1 M磷酸缓冲盐水(PBS)经心脏(transcardially)灌注以冲洗血液。随后从颅骨中取出脑,并且纵向分开。一个脑半球进行骤冻(shock-frozen),另一个通过浸入4%低聚甲醛内固定。浸入-固定的半球通过浸泡在PBS中的30%蔗糖中进行冷冻保护,并且封固在冷冻切片机(microtome)上。将整个前脑切割成40 µm切片,这收集在PBS中,并且封固在Superfrost® Plus载玻片上(Menzel Glaeser,Braunschweig,德国),用于后续染色程序。用针对单体Aβ产生的小鼠单克隆抗体6G1执行含Aβ的淀粉状蛋白斑的染色(Barghorn等人,2005,J. Neurochem. On an
automatic staining device(Ventana Discovery®,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany),依照下述规程:
- 在载玻片上的切片充分风干且转移至Ventana机器
- 使用由Ventana提供用于产色二氨基联苯胺(DAB)程序的自动化规程,其包含洗涤和阻断步骤,并且使用由DAB MapTM Kit的染色;抗原提取(retrieval)以及初级和次级免疫组织化学通过实验者包括在自动化规程中:
- 在调节剂#2(基于柠檬酸盐(citrat)的缓冲液,pH 6.0)的存在下在95℃ 45分钟获得抗原提取
-在抗体稀释剂(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)中与6G1(1:500)在37℃温育3小时
- 与生物素化的第二抗体驴抗小鼠IgG(1:500;Jackson ImmunoResearch,Newmarket,UK)在37℃温育30分钟
- 在自动化染色结束后,载玻片在正常水中洗涤,在分级乙醇中脱水,在XTRA-Solve®(J.T. Baker,Griesheim,德国)中澄清,并且用UltraKitt®(J.T. Baker,Griesheim,德国)盖玻片加盖。
斑染色在新皮质的3个组织学切片中进行定量,其中使用ImagePro 5.0图像分析系统。实验者对处于分析中的小鼠处理不知情,并且测定下述参数:新皮质面积、由6G1阳性染色覆盖的面积和染色的斑数目。这些参数是可变的,并且不是正态分布的。因此,通过单侧(on-sided)Mann-Whitney U检验统计学上评价斑负荷的减少。Tg2576小鼠中Aβ沉积物染色的结果显示于图13中。
褐色DAB沉积物的评价显示抗RAGE抗体使新皮质中的淀粉状蛋白斑数目和面积分别减少24.5%和26.8%(p<0.1)。斑数目和面积中的减少在额新皮质中最明显(p<0.05)。
如本文引用的文件引入作为参考。
序列表
<110>
Abbott GmbH & Co. KG
Abbott
Laboratories
<120> 针对渐进性糖化终极产物受体(RAGE)的抗体及其用途
<130>
M/49231-PCT
<160>
94
<170>
PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 119
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Tyr Ala Glu
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Lys Gly Ser
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Gly Ile Tyr
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Phe Cys Ala Arg Asn Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
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<220>
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7F9 CDR-H2
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Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Tyr Tyr Ser Thr His Tyr
Ala Glu Ser
1
5 10 15
Val Lys Gly
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5
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7F9
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Asp Arg Val Ser Ala Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
Gly Thr Ser
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ser Pro Lys
Leu Leu Ile
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Thr Asn Phe
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Thr Ala Tyr
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Val
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Gly Ser Ser
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Phe Pro Phe
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sapiens)
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Ser Ser Lys
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Lys Asp Tyr
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Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
Phe Pro Pro
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Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
Phe Asn Trp
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Pro Arg Glu
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Thr Val Leu
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Val Ser Asn
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Ala Lys Gly
210 215 220
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<213> 智人(Homo
sapiens)
<400> 26
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
Asp Glu Gln
1
5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
Tyr Glu Lys
65
70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 27
<211>
6276
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码OmpA-[RAGE
(23-340)]-6His的质粒
<400> 27
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg
tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt
tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc
tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg
gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg
agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct
cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg
agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag
gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt
caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac
tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat
gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg
attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta
tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc
atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca
tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg
ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca
tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg
gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc
ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg
gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat
cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa
tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg
ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa
aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg
atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc
gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac
tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca
ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt
ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc
ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg
aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc
cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac
gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct
ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc
cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt
tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac
cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg
cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc
actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc
tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac
gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca
tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat
cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga
gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt
tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga
taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt
tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa
tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc
agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt
ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg
ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag
taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc
gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac
cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga
tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca
cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc
cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc
ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc
agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg
gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga
ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc
agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg
gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg
gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg
ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc
cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc
agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat
gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg
atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc
acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc
gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac
accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac
ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc
agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt
tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa
gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg
aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg
gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag
taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc
caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag
cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac
cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga
tctcgatccc 4980
gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc
ccctctagaa 5040
ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa aaagacagct
atcgcgattg 5100
cagtggcact ggctggtttc gctaccgtag cgcaggccgc tcaaaacatc
acagcccgga 5160
ttggcgagcc actggtgctg aagtgtaagg gggcccccaa gaaaccaccc
cagcggctgg 5220
aatggaaact gaacacaggc cggacagaag cttggaaggt cctgtctccc
cagggaggag 5280
gcccctggga cagtgtggct cgtgtccttc ccaacggctc cctcttcctt
ccggctgtcg 5340
ggatccagga tgaggggatt ttccggtgcc aggcaatgaa caggaatgga
aaggagacca 5400
agtccaacta ccgagtccgt gtctaccaga ttcctgggaa gccagaaatt
gtagattctg 5460
cctctgaact cacggctggt gttcccaata aggtggggac atgtgtgtca
gagggaagct 5520
accctgcagg gactcttagc tggcacttgg atgggaagcc cctggtgcct
aatgagaagg 5580
gagtatctgt gaaggaacag accaggagac accctgagac agggctcttc
acactgcagt 5640
cggagctaat ggtgacccca gcccggggag gagatccccg tcccaccttc
tcctgtagct 5700
tcagcccagg ccttccccga caccgggcct tgcgcacagc ccccatccag
ccccgtgtct 5760
gggagcctgt gcctctggag gaggtccaat tggtggtgga gccagaaggt
ggagcagtag 5820
ctcctggtgg aaccgtaacc ctgacctgtg aagtccctgc ccagccctct
cctcaaatcc 5880
actggatgaa ggatggtgtg cccttgcccc ttccccccag ccctgtgctg
atcctccctg 5940
agatagggcc tcaggaccag ggaacctaca gctgtgtggc cacccattcc
agccacgggc 6000
cccaggaaag ccgtgctgtc agcatcagca tcatcgaacc aggcgaggag
gggccaactg 6060
caggctctgt gggaggatca gggctgggaa ctcaccacca ccaccaccac
tgactcgagc 6120
accaccacca ccaccactga gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa
gctgagttgg 6180
ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa
cgggtcttga 6240
ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggat 6276
<210> 28
<211>
5617
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码6His-(Thr)-[RAGE
(24-129)]的质粒
<400> 28
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg
tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt
tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc
tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg
gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg
agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct
cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg
agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag
gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt
caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac
tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat
gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg
attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta
tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc
atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca
tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg
ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca
tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg
gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc
ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg
gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat
cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa
tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg
ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa
aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg
atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc
gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac
tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca
ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt
ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc
ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg
aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc
cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac
gagggagctt 1980
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ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc
cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt
tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac
cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg
cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc
actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc
tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac
gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca
tgtgtcagag 2520
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cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga
gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt
tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga
taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt
tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa
tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc
agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt
ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg
ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag
taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc
gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac
cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga
tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca
cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc
cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc
ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc
agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg
gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga
ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc
agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg
gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg
gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg
ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc
cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc
agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat
gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg
atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc
acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc
gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac
accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac
ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc
agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt
tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa
gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg
aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg
gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag
taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc
caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag
cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac
cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc
gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct
ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca
tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgcaaaaca tcacagcccg
gattggcgag 5160
ccactggtgc tgaagtgtaa gggggccccc aagaaaccac cccagcggct
ggaatggaaa 5220
ctgaacacag gccggacaga agcttggaag gtcctgtctc cccagggagg
aggcccctgg 5280
gacagtgtgg ctcgtgtcct tcccaacggc tccctcttcc ttccggctgt
cgggatccag 5340
gatgagggga ttttccggtg ccaggcaatg aacaggaatg gaaaggagac
caagtccaac 5400
taccgagtcc gtgtctacca gattcctggg aagccagaaa ttgtagattc
ttgactcgag 5460
caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga
agctgagttg 5520
gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa
acgggtcttg 5580
aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat 5617
<210> 29
<211>
5932
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码6His-(Thr)-[RAGE
(24-234)]的质粒
<400> 29
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg
tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt
tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc
tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg
gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg
agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct
cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg
agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag
gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt
caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac
tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat
gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg
attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta
tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc
atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca
tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg
ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca
tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg
gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc
ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg
gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat
cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa
tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg
ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa
aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg
atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc
gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac
tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca
ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt
ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc
ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg
aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc
cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac
gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct
ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc
cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt
tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac
cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg
cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc
actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc
tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac
gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca
tgtgtcagag 2520
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cagcgtggtc 2580
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gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt
tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga
taccgatgaa 2760
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tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa
tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc
agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt
ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg
ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag
taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc
gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac
cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga
tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca
cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc
cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc
ccggtgccta 3480
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agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg
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ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc
agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg
gtatcgtcgt 3780
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gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg
ccctcattca 3900
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gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg
atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc
acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc
gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac
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tcccgcgttt 4500
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taggttgagg 4740
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cccgaagtgg 4860
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cgcacctgtg 4920
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gatcccgcga 4980
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ctagaaataa 5040
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tcatcatcac 5100
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gattggcgag 5160
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cgggatccag 5340
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ccttggggcc 5880
tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg
at 5932
<210> 30
<211>
6238
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码6His-(Thr)-[RAGE
(24-336)]的质粒
<400> 30
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tggttacgcg 60
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tccctttagg 180
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gtgatggttc 240
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agtccacgtt 300
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cggtctattc 360
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acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag
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caaatatgta 540
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gaaggagaaa 660
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ggctgctgcc 1740
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cagcgtggtc 2580
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gtttctccag 2640
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tttcctgttt 2700
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taccgatgaa 2760
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tactggaacg 2820
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tcactcaggg 2880
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agcagcatcc 2940
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ccagacttta 3000
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ttttgcagca 3060
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taaggcaacc 3120
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gtggggccgc 3180
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cagtgacgaa 3240
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tcatcgtcgc 3300
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cctgtcctac 3360
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cccgcgccca 3420
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ccggtgccta 3480
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gtttgcgtat 3600
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ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc
agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg
gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg
gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg
ccctcattca 3900
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cgttccgcta 3960
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caacagtccc 4800
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cccgaagtgg 4860
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gatcccgcga 4980
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aggcccctgg 5280
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cgggatccag 5340
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caagtccaac 5400
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cttcagccca 5700
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<210> 31
<211>
5614
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码6His-(Thr)-[RAGE
(130-234)]的质粒
<400> 31
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg
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ggctgctgcc 1740
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ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg
aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc
cgaagggaga 1920
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gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct
ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc
cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt
tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac
cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg
cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc
actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc
tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac
gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca
tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat
cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga
gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt
tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga
taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt
tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa
tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc
agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt
ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg
ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag
taaggcaacc 3120
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gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac
cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga
tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca
cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc
cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc
ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc
agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg
gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga
ttgcccttca 3660
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agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg
gtatcgtcgt 3780
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gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg
ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc
cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc
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gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg
atgggtgtct 4140
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acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc
gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac
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gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc
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tcccgcgttt 4500
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cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg
gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag
taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc
caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag
cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac
cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc
gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct
ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca
tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggcctctg aactcacggc
tggtgttccc 5160
aataaggtgg ggacatgtgt gtcagaggga agctaccctg cagggactct
tagctggcac 5220
ttggatggga agcccctggt gcctaatgag aagggagtat ctgtgaagga
acagaccagg 5280
agacaccctg agacagggct cttcacactg cagtcggagc taatggtgac
cccagcccgg 5340
ggaggagatc cccgtcccac cttctcctgt agcttcagcc caggccttcc
ccgacaccgg 5400
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caccaccacc accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc
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gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg
ggtcttgagg 5580
ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggat 5614
<210> 32
<211>
5920
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码6His-(Thr)-[RAGE
(130-336)]的质粒
<400> 32
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg
tggttacgcg 60
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tcttcccttc 120
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tccctttagg 180
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cggtctattc 360
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caaatatgta 540
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tgcaatttat 600
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gaaggagaaa 660
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gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta
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atcttcttga 1500
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tgtgtcagag 2520
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tttcctgttt 2700
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agcaggcgaa 3720
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gtatcgtcgt 3780
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ccctcattca 3900
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gagacaccgg 4560
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aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg
gtgtccggga 4680
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taggttgagg 4740
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cccgaagtgg 4860
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ctagaaataa 5040
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tagctggcac 5220
ttggatggga agcccctggt gcctaatgag aagggagtat ctgtgaagga
acagaccagg 5280
agacaccctg agacagggct cttcacactg cagtcggagc taatggtgac
cccagcccgg 5340
ggaggagatc cccgtcccac cttctcctgt agcttcagcc caggccttcc
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<211>
5605
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 编码6His-(Thr)-[RAGE
(235-336)]的质粒
<400> 33
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg
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ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc
tccctttagg 180
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ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga
taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt
tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa
tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc
agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt
ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg
ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag
taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc
gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac
cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga
tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca
cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc
cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc
ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc
agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg
gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga
ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc
agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg
gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg
gcgcgcattg 3840
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gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc
cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc
agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat
gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg
atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc
acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc
gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac
accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac
ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc
agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt
tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa
gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg
aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg
gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag
taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc
caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag
cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac
cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc
gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct
ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca
tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgctggagg aggtccaatt
ggtggtggag 5160
ccagaaggtg gagcagtagc tcctggtgga accgtaaccc tgacctgtga
agtccctgcc 5220
cagccctctc ctcaaatcca ctggatgaag gatggtgtgc ccttgcccct
tccccccagc 5280
cctgtgctga tcctccctga gatagggcct caggaccagg gaacctacag
ctgtgtggcc 5340
acccattcca gccacgggcc ccaggaaagc cgtgctgtca gcatcagcat
catcgaacca 5400
ggcgaggagg ggccaactgc aggctctgtg ggaggatcat gactcgagca
ccaccaccac 5460
caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc
tgctgccacc 5520
gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag
gggttttttg 5580
ctgaaaggag gaactatatc cggat 5605
<210> 34
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#1
<400> 34
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala
Gly Phe Ala
1
5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile
Gly Glu Pro
20 25 30
Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro
Gln Arg Leu
35 40 45
Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys
Val Leu Ser
50 55 60
Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val
Leu Pro Asn
65
70 75 80
Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu
Gly Ile Phe
85 90 95
Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys
Ser Asn Tyr
100 105 110
Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile
Val Asp Ser
115 120 125
Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly
Thr Cys Val
130 135 140
Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu
Asp Gly
145
150 155 160
Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys
Glu Gln Thr
165 170 175
Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser
Glu Leu Met
180 185 190
Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe
Ser Cys Ser
195 200 205
Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr
Ala Pro Ile
210 215 220
Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val
Gln Leu Val
225
230 235 240
Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr
Val Thr Leu
245 250 255
Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His
Trp Met Lys
260 265 270
Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu
Ile Leu Pro
275 280 285
Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val
Ala Thr His
290 295 300
Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile
Ser Ile Ile
305
310 315 320
Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly
Gly Ser Gly
325 330 335
Leu Gly Thr His His His His His His
340 345
<210> 35
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#2
<400> 35
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
Leu Val Pro
1
5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly
Glu Pro Leu
20 25 30
Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln
Arg Leu Glu
35 40 45
Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val
Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu
Pro Asn Gly
65
70 75 80
Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly
Ile Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser
Asn Tyr Arg
100 105 110
Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val
Asp Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#3
<400> 36
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
Leu Val Pro
1
5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly
Glu Pro Leu
20 25 30
Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln
Arg Leu Glu
35 40 45
Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val
Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu
Pro Asn Gly
65
70 75 80
Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly
Ile Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser
Asn Tyr Arg
100 105 110
Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val
Asp Ser Ala
115 120 125
Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr
Cys Val Ser
130 135 140
Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp
Gly Lys
145
150 155 160
Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu
Gln Thr Arg
165 170 175
Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu
Leu Met Val
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser
Cys Ser Phe
195 200 205
Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala
Pro Ile Gln
210 215 220
Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro
225
230
<210> 37
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#4
<400> 37
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
Leu Val Pro
1
5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly
Glu Pro Leu
20 25 30
Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln
Arg Leu Glu
35 40 45
Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val
Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu
Pro Asn Gly
65
70 75 80
Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly
Ile Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser
Asn Tyr Arg
100 105 110
Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val
Asp Ser Ala
115 120 125
Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr
Cys Val Ser
130 135 140
Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu
Asp Gly Lys
145
150 155 160
Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu
Gln Thr Arg
165 170 175
Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu
Leu Met Val
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser
Cys Ser Phe
195 200 205
Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala
Pro Ile Gln
210 215 220
Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln
Leu Val Val
225
230 235 240
Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val
Thr Leu Thr
245 250 255
Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp
Met Lys Asp
260 265 270
Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile
Leu Pro Glu
275 280 285
Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala
Thr His Ser
290 295 300
Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser
Ile Ile Glu
305
310 315 320
Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly
Ser
325 330
<210> 38
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#5
<400> 38
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
Leu Val Pro
1
5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val
Pro Asn Lys
20 25 30
Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly
Thr Leu Ser
35 40 45
Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys
Gly Val Ser
50 55 60
Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu
Phe Thr Leu
65
70 75 80
Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp
Pro Arg Pro
85 90 95
Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His
Arg Ala Leu
100 105 110
Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val
Pro
115 120 125
<210> 39
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#6
<400> 39
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
Leu Val Pro
1
5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val
Pro Asn Lys
20 25 30
Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly
Thr Leu Ser
35 40 45
Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys
Gly Val Ser
50 55 60
Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu
Phe Thr Leu
65
70 75 80
Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp
Pro Arg Pro
85 90 95
Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His
Arg Ala Leu
100 105 110
Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val
Pro Leu Glu
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val
Ala Pro Gly
130 135 140
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro
Ser Pro Gln
145
150 155 160
Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro
Pro Ser Pro
165 170 175
Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly
Thr Tyr Ser
180 185 190
Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser
Arg Ala Val
195 200 205
Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr
Ala Gly Ser
210 215 220
Val Gly Gly Ser
225
<210> 40
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
RAGE蛋白#7
<400> 40
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
Leu Val Pro
1
5 10 15
Arg Gly Ser His Met Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val
Glu Pro Glu
20 25 30
Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
Cys Glu Val
35 40 45
Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp
Gly Val Pro
50 55 60
Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu
Ile Gly Pro
65
70 75 80
Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser
Ser His Gly
85 90 95
Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu
Pro Gly Glu
100 105 110
Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser
115 120
<210> 41
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Ig γ-1恒定区突变体
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
Ser Ser Lys
1
5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
Thr Gln Thr
65
70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
Phe Asn Trp
145
150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
Arg Glu Glu
225
230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
His Tyr Thr
305
310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 42
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo
sapiens)
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
Cys Ser Arg
1
5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
Thr Gln Thr
65
70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
Val Asp Gly
145
150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
Thr Lys Asn
225
230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
Lys Ser Leu
305
310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 43
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
VH7-4.1/JH6 FR1
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr
20 25 30
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
VH7-4.1/JH6 FR2
<400> 44
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
Gly
1
5 10
<210> 45
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
VH7-4.1/JH6 FR3
<400> 45
Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala
Tyr Leu Gln
1
5 10 15
Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
VH7-4.1/JH6 FR4
<400> 46
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1
5 10
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
VH1-2/JH6 FR1
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr
20 25 30
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
VH1-2/JH6 FR3
<400> 48
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala
Tyr Met Glu
1
5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
1-12/L5/JK2 FR1
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala
Ser Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
1-12/L5/JK2 FR2
<400> 50
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr
1
5 10 15
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
1-12/L5/JK2 FR3
<400> 51
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
Asp Phe Thr
1
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
1-12/L5/JK2 FR4
<400> 52
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1
5 10
<210> 53
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
3-15/L2/JK2 FR1
<400> 53
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
3-15/L2/JK2 FR2
<400> 54
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr
1
5 10 15
<210> 55
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
3-15/L2/JK2 FR3
<400> 55
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
Asp Phe Thr
1
5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val
Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VH
11E6.1-GL
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ser
Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser
Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr
Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VH
11E6.2-GL
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ser
Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr
Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
11E6.1-GL
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala
Ser Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
Leu Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
11E6.2-GL
<400> 59
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val
Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg
Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
Leu Gln Ser
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 60
<211> 404
<212> PRT
<213> 智人(Homo
sapiens)
<400> 60
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val
Leu Ser Leu
1
5 10 15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg
Ile Gly Glu
20 25 30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro
Pro Gln Arg
35 40 45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp
Lys Val Leu
50 55 60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg
Val Leu Pro
65
70 75 80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp
Glu Gly Ile
85 90 95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr
Lys Ser Asn
100 105 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu
Ile Val Asp
115 120 125
Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val
Gly Thr Cys
130 135 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp
His Leu Asp
145
150 155 160
Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val
Lys Glu Gln
165 170 175
Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln
Ser Glu Leu
180 185 190
Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr
Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg
Thr Ala Pro
210 215 220
Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu
Val Gln Leu
225
230 235 240
Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly
Thr Val Thr
245 250 255
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile
His Trp Met
260 265 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val
Leu Ile Leu
275 280 285
Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys
Val Ala Thr
290 295 300
His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser
Ile Ser Ile
305
310 315 320
Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val
Gly Gly Ser
325 330 335
Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly
Gly Leu Gly
340 345 350
Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg
Arg Gln Arg
355 360 365
Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu
Glu Glu Glu
370 375 380
Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly
Glu Ser Ser
385
390 395 400
Thr Gly Gly Pro
<210> 61
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> hus
RAGE片段
<400> 61
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val
Leu Ser Leu
1
5 10 15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg
Ile Gly Glu
20 25 30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro
Pro Gln Arg
35 40 45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp
Lys Val Leu
50 55 60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg
Val Leu Pro
65
70 75 80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp
Glu Gly Ile
85 90 95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr
Lys Ser Asn
100 105 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu
Ile Val Asp
115 120 125
Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val
Gly Thr Cys
130 135 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp
His Leu Asp
145
150 155 160
Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val
Lys Glu Gln
165 170 175
Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln
Ser Glu Leu
180 185 190
Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr
Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg
Thr Ala Pro
210 215 220
Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu
Val Gln Leu
225
230 235 240
Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly
Thr Val Thr
245 250 255
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile
His Trp Met
260 265 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val
Leu Ile Leu
275 280 285
Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys
Val Ala Thr
290 295 300
His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser
Ile Ser Ile
305
310 315 320
Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly
325 330
<210> 62
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VH
h11E6.1
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ser
Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser
Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr
Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
h11E6.1
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
Ser Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
Leu Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 64
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
h11E6.2
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
Ser Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys
Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
Leu Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 65
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
h11E6.3
<400> 65
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg
Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
Leu Gln Ser
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 66
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
h11E6.4
<400> 66
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg
Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ala Arg
Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
Leu Gln Ser
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser
Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VH
h11E6.5
<400> 67
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ser
Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser
Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr
Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VH
h11E6.9
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ser
Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr
Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VH
h11E6.13
<400> 69
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ser
Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser
Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr
Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223>
NtermR31
<400> 70
Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu
Lys Cys Lys
1
5 10 15
Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys
Leu Asn
20 25 30
<210> 71
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽1
<400> 71
Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
Ser Pro Gln
1
5 10 15
Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro
Asn
20 25 30
<210> 72
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽2
<400> 72
Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile
Gln Asp Glu
1 5 10 15
Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys
Glu
20 25 30
<210> 73
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽3
<400> 73
Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr
Gln Ile Pro
1
5 10 15
Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr
Ala
20 25 30
<210> 74
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽4
<400> 74
Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val
Ser Glu Gly
1
5 10 15
Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp Lys Leu Asp Gly
Lys
20 25 30
<210> 75
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽5
<400> 75
Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser
Val Lys Glu
1
5 10 15
Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu
Gln
20 25 30
<210> 76
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽6
<400> 76
Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly
Gly Asp Pro
1
5 10 15
Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro
Arg
20 25 30
<210> 77
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽7
<400> 77
Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln
Pro Arg Val
1
5 10 15
Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val
Glu
20 25 30
<210> 78
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽8
<400> 78
Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly
Thr Val Thr
1
5 10 15
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile
His
20 25 30
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽9
<400> 79
Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu
Pro Pro Ser
1
5 10 15
Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln
Gly
20 25 30
<210> 80
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽10
<400> 80
Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser
His Gly Pro
1
5 10 15
Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro
Gly
20 25 30
<210> 81
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 81
Cys Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala
Gly Cys Ala
1
5 10 15
Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly
20 25
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 82
Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr
Cys Ala Ala
1
5 10 15
Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr
Ala Cys Thr
20 25 30
<210> 83
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 83
agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg a 31
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 84
Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly
Cys Ala Gly
1
5 10 15
Thr Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys
Gly Cys Cys
20 25 30
<210> 85
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 85
cgaagcttga tgaacaggaa tggaaaggag accaag 36
<210> 86
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 86
tcctcgagca cctgcagttg gcccctcctc gcct 34
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 87
gcaccatggc agccggaaca gcagttg 27
<210> 88
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 88
gagtctcgag gcagaatcta caatttctg 29
<210> 89
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 89
atgctacata tgaaaaagac agctatcgcg attgcagtgg cactggctgg
tttcgctacc 60
gtagcgcagg ccgctcaaaa catcacagcc 90
<210> 90
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 90
atgctactcg agtcagtggt ggtggtggtg gtgagttccc agccctgatc
ctcccacaga 60
gcctgcagtt ggcccctcc
79
<210> 91
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 91
gtacgatatc gagggacgaa tggatccacc gtgcccagca cc 42
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 92
ctagtctaga tcatttaccc ggagacaggg ag 32
<210> 93
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 93
gtacgatatc gagggacgaa tggatccacc gtgcccagca cc 42
<210> 94
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR引物
<400> 94
ctagtctaga tcatttaccc ggagacaggg ag 32