JP2016104740A - 終末糖化産物受容体（ｒａｇｅ）に対する抗体及びその使用 - Google Patents

終末糖化産物受容体（ｒａｇｅ）に対する抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】アルツハイマー病（ＡＤ）、中枢神経系の細胞変性、学習及び記憶障害、アミロイドβの異常な輸送及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）に関連するその他の神経炎症症状の治療及び診断において使用され得る抗体、特にモノクローナル抗体の提供。【解決手段】ヒトＲＡＧＥ分子のエピトープに結合することができる、抗原結合ドメインを有する単離されたモノクローナル抗体又はそのＲＡＧＥ分子結合性断片であって、前記抗原結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域である、モノクローナル抗体又はそのＲＡＧＥ分子結合性断片。【選択図】なし

Description

本願は、アルツハイマー病（ＡＤ）、中枢神経系の細胞変性、学習及び記憶障害、アミロイドβの異常な輸送及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）に関連するその他の神経炎症症状の治療及び診断において使用され得る抗体、特にモノクローナル抗体、及び特に、ＣＤＲ移植され、ヒト化されたモノクロナール抗体に関する。特に、本発明は、ＲＡＧＥに結合する抗体及びその断片に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者の認知症の最も多い原因であり、６５歳以上の集団の約１０％に発生する。年齢が高くなるほど、疾病の確率も上昇する。全世界で、本疾患の罹患者は約１，５００万人存在し、平均寿命の更なる増加が、次の１０年間で、本疾病の罹患者数を約３倍に増加させると予想されている。前記に照らして、ＡＤの治療に対して大きく切迫した要望が存在する。このような治療を用いることにより、罹患者は、機能的で活動的なライフスタイルを長年にわたって維持できることがあり得るが、それを超えると、このような治療がなければ維持は不可能である。従って、患者と治療従事者の両者に対して、このような治療には、金銭的な利点が存在するのみならず、「生活の質」に関しても利点が存在する。
分子的な観点から、ＡＤは、異常に凝集されたタンパク質の沈着によって特徴付けられる。細胞外アミロイド斑の場合には、これらの沈着の多くは、アミロイド−β−ペプチド繊維（Ａβ）からなり、細胞内神経線維のもつれ（ＴＮＦ）の場合には、多くはτタンパク質からなる。ＡＤは、ＲＡＧＥの増加した神経細胞での発現によっても特徴付けられる。ＲＡＧＥは、Ａβに対するシグナル伝達細胞表面アクセプターとして機能する免疫グロブリンファミリーのマルチリガンド受容体である。
Ａβ４０のマウスへの注入は、脳血管の収縮及び脳血流量（ＣＢＦ）の減少をもたらすことが幾つかのグループによって示されている。ＡＤに罹患している患者も、減少した脳血流量を有する。トランスジェニック動物が病気を引き起こす斑の形成をもたらすタンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を過剰発現するＡＤのマウスモデルにおいて、ＲＡＧＥは、疾病の進行における発病因子として関与している可能性がある（Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（７） ｐｐ ９０７−９１３，２００３；Ａｒａｎｃｉｏ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ，１−１０，２００４）。
ＲＡＧＥは、Ａβ−ペプチドに結合することが示されている。この相互作用の阻害は、トランスジェニック動物モデルにおいて、Ａβの蓄積を抑制し、従って、ＲＡＧＥはＡＤに関与していると考えられる。ｓＲＡＧＥ（可溶性ＲＡＧＥ）及び抗ＲＡＧＥ抗体を用いた治療は、斑の数を低下させることが示されている（Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。抗体によるＲＡＧＥのアミロイドとの相互作用を遮断することは、ＡＤ患者に対する治療になり得るが、動物の血清から作製される既存のポリクローナル抗体は、ヒトの長期的な治療には適していない。
ＡβとのＲＡＧＥの相互作用は、ＡβのＲＡＧＥへの結合に関して、ｖドメインを欠如するＲＡＧＥの競合及びＲＡＧＥのＣ末端ドメインの一部（多くは、Ｃ１ドメイン）に相当するペプチドの競合を記載するＷＯ２００６／０７７１０１Ａ１に開示されている。抗ＲＡＧＥ抗体のＲＡＧＥのｖドメインとの相互作用がＷＯ２００７１０９７４９（Ａ２）に開示されており、ＷＯ２００７１０９７４９（Ａ２）には、様々なリガンド（Ｓ１００ｂ、ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ １タンパク質）、アミロイドａβ）の結合がこのドメインへの結合を介してＲＡＧＥに結合することも記載されている。
ＷＯ２００８／１３７５５２Ａ２は、ＲＡＧＥの様々なドメインに結合するある種のモノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体を開示する。前記抗体の多くは、ヒトＲＡＧＥとＨＭＧＢ１及びＣｐＧＤＮＡの複合体の相互作用を阻害する。
ＷＯ２００６／０７７１０１は、ＲＡＧＥのＡＧＥＲ−ＲＭＥ及びＡＧＥＲ−ＣＤＰと称されるペプチドの同定、機能及び使用に関する。前記ペプチドは、とりわけ、抗ＲＡＧＥ抗体のようなＲＡＧＥ結合リガンドを同定及び調製するために使用することができる。本発明は、ＲＡＧＥのＣドメインに結合する新規モノクローナル抗体並びにＲＡＧＥ中のＣ１及びＣ２ドメインに対するモノクローナル抗体とＡβの結合との特異的な相互作用及び競合を記載する。
国際公開第２００６／０７７１０１号 国際公開第２００７／１０９７４９号 国際公開第２００８／１３７５５２号
Ｄｅａｎｅ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（７）、２００３年、ｐｐ．９０７−９１３，２００３ Ａｒａｎｃｉｏ他、ＥＭＢＯＪ，２００４年、ｐｐ．１−１０
本発明は、ＲＡＧＥに特異的に結合する結合分子、特に抗体を提供する。本発明の代表的な抗ＲＡＧＥ抗体は、以下でより詳しく明記されているように、配列番号１、５、９、１３、１７及び２１に示されている抗体可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ又は個別のそのＣＤＲ又は関連するＣＤＲ配列を含み得る。
具体的には、本発明は、ＲＡＧＥに結合するモノクローナル抗体、より具体的には、ＲＡＧＥのＣドメインに結合するモノクローナル抗体を提供する。
本発明には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、並びに配列番号５、１３及び２１の何れかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗ＲＡＧＥ抗体又は前記配列中に含まれる抗体のＲＡＧＥ結合断片である。
ＲＡＧＥに特異的に結合し、並びに配列番号１、９及び１７の何れかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗ＲＡＧＥ抗体又は前記配列中に含まれる抗体のＲＡＧＥ結合断片も含まれる。
本発明の特定の実施形態は、ＲＡＧＥのＣドメインに結合し、Ａβ−グロブロマーの結合を遮断することができる幾つかのモノクローナル抗体によって代表される。より具体的には、本発明は、ＲＡＧＥのＣ−２ドメインに結合し、ポリクローナル抗体を作製するために使用されるアミノ酸配列を有するペプチドに結合せず、及びマウス中の脳血管構造に対するＡβ１−４０の効果をインビボで中和することができるモノクローナル抗体１１Ｅ６を記載する。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ＲＡＧＥのＣドメインに特異的に結合する抗体が含まれる。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、キメラ抗体、ＣＤＲ移植された抗体又はヒト化抗体、一本鎖抗体、融合タンパク質及びヒト抗体からなる群から選択される上記抗ＲＡＧＥ抗体又はＲＡＧＥ結合断片が含まれる。
様々な実施形態において、本発明の抗体は、組換え抗体又はモノクローナル抗体である。本願の特定の中和抗体は、本明細書においてｍＡｂ７Ｆ９、ｍＡｂ１１Ｅ６及びｍＡｂ４Ｅ５と称され、これらの機能的抗体断片並びに低い解離速度及び高い中和能でのＲＡＧＥへの高親和性結合など、ｍＡｂ７Ｆ９、ｍＡｂ１１Ｅ６及びｍＡｂ４Ｅ５と等価な特性を有する他の抗体及び機能的抗体断片は本発明の一部として意図される。しかしながら、本願のヒト抗体は、本分野で公知の何れかの方法によって決定され得るヒト生殖系列免疫グロブリン免疫原性ＲＡＧＥポリペプチド又はその断片によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。例えば、結合親和性は競合的ＥＬＩＳＡ、ｃＲＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ技術によって測定することができる。解離速度も、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ技術によって測定することができる。結合親和性及び解離速度は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定される。
本願のモノクローナル抗体の１つであるｍＡｂ７Ｆ９抗体は、配列番号１並びにそれぞれ、配列番号１の残基３１から３５、５０から６８及び１０１から１０８である配列番号２、３及び４の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。本発明のｍＡｂ７Ｆ９抗体は、配列番号５並びにそれぞれ、配列番号５の残基２４から３４、５０から５６、８９から９７である配列番号６、７及び８の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
本願の別のモノクローナル抗体であるｍＡｂ１１Ｅ６抗体は、配列番号９並びにそれぞれ、配列番号９の残基３１から３５、５０から６６及び９９から１０９である配列番号１０、１１及び１２の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。本発明のｍＡｂ１１Ｅ６抗体は、配列番号１３並びにそれぞれ、配列番号１３の残基２４から３４、５０から５６、８９から９７である配列番号１４、１５及び１６の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。ｍＡｂ１１Ｅ６は、ＲＡＧＥのＣ−２ドメインに結合し、ポリクローナル抗体を作製するために使用されるアミノ酸配列とのペプチドに結合せず、及びマウス中の脳血管構造に対するＡβ１−４０の効果をインビボで中和することができる。
本願の別のモノクローナル抗体であるｍＡｂ４Ｅ５抗体は、配列番号１７並びにそれぞれ、配列番号１７の残基３１から３５、５０から６６及び９９から１０９である配列番号１８、１９及び２０の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。本発明のｍＡｂ４Ｅ５抗体は、配列番号２１並びにそれぞれ、配列番号２１の残基２４から３４、５０から５６、８９から９７である配列番号２２、２３及び２４の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
本願のＲＡＧＥと相互作用する単離されたモノクローナル抗体はグリコシル化された結合タンパク質であり得、前記抗体又はその抗原結合部分は１つ又はそれ以上の炭水化物残基を含む。新生のインビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセッシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基が酵素的に付加され得る（グリコシル化として知られるプロセス）。共有結合されたオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化されたタンパク質又は糖タンパク質として知られる。タンパク質グリコシル化は、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びその中でタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシル転移酵素及びグリコシダーゼ）を産生し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し得る。このような要因のために、タンパク質グリコシル化のパターン及びグリコシル残基の組成は、その中で特定のタンパク質が発現される宿主系に応じて異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。
本願の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。さらに、抗体は、軽鎖定常領域（κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域の何れか）を含み得る。特に、抗体は、κ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体の一部は、例えば、Ｆａｂ断片又は一本鎖Ｆｖ断片であり得る。抗体のエフェクター機能を改変するために、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基を置換することが、本分野において公知である（Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、幾つかの重要なエフェクター機能（例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、貪食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）並びに抗体及び抗原抗体複合体の半減期／排除速度）を媒介する。幾つかの事例では、これらのエフェクター機能は治療用抗体にとって望ましいが、他の事例では、治療目的に応じて、不必要であり又は有害でさえあり得る。ある種のヒトＩｇＧイソタイプ、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、それぞれ、ＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介して、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介する。新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な要因である。さらに別の実施形態において、抗体のエフェクター機能が変化されるように、抗体の定常領域（例えば、抗体のＦｃ領域）において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。
図１Ａから１Ｃは、組換え及びハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体７Ｆ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５の、組換えヒトＲＡＧＥへのＥＬＩＳＡ結合を示している。 図１Ａから１Ｃは、組換え及びハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体７Ｆ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５の、組換えヒトＲＡＧＥへのＥＬＩＳＡ結合を示している。 図１Ａから１Ｃは、組換え及びハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体７Ｆ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５の、組換えヒトＲＡＧＥへのＥＬＩＳＡ結合を示している。 図２は、ドットブロット結合によるモノクローナル抗体７Ｆ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５の性質決定を示している。 図３Ａから３Ｃは、ｓＲＡＧＥ−Ａβ−グロブロマー−モノクローナル抗体の競合を示すＨＴＲＦアッセイの結果を示す。 図３Ａから３Ｃは、ｓＲＡＧＥ−Ａβ−グロブロマー−モノクローナル抗体の競合を示すＨＴＲＦアッセイの結果を示す。 図３Ａから３Ｃは、ｓＲＡＧＥ−Ａβ−グロブロマー−モノクローナル抗体の競合を示すＨＴＲＦアッセイの結果を示す。 図４は、ＨＴＲＦｓＲＡＧＥ−Ａβ−グロブロマーの結合を示す。 図５は、ｓＲＡＧＥ−Ｆｃへの及びＲＡＧＥｖ−ドメインへのＡβ−グロブロマーの結合を示す。 図６Ａから６Ｃは、異なるＲＡＧＥ断片への本発明のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合実験を示す。 図６Ａから６Ｃは、異なるＲＡＧＥ断片への本発明のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合実験を示す。 図６Ａから６Ｃは、異なるＲＡＧＥ断片への本発明のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合実験を示す。 図７Ａから７Ｃは、異なるＲＡＧＥ断片への本発明のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合実験を示す。 図７Ａから７Ｃは、異なるＲＡＧＥ断片への本発明のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合実験を示す。 図７Ａから７Ｃは、異なるＲＡＧＥ断片への本発明のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合実験を示す。 図８ａから８ｆは、Ａβ１−４０の異なる用量によって誘導された脳血流量の変化を示している。 図９ａから９ｃは、脳血流量のＡβ１−４０によって誘導された変化における１１Ｅ６の効果を示す。 図１０は、１１Ｅ６又は対照抗体の異なる用量で処理された高齢のＴｇ２５７６マウス中で観察された脳血流量の変化を示す。 図１１は、抗体１１Ｅ６がＡβによって誘導されたダイナミン切断に対する海馬神経細胞を保護することを示す。上部パネル：単一の実験から得られた反復実験条件を代表する試料が示されており、処理濃度（μＭ）が上に示されている。Ａβの添加なしの細胞は、殆ど完全な状態の（約１００ｋＤａ）ダイナミンＩシグナル（第一のバー）を示し、これは、５μＭＡβで処理された細胞中では、約９０ｋＤａの切断産物に減少及び復帰された（第二のバー）。抗体１１Ｅ６処理（第三のバー）は切断を抑制するのに対して、Ｉｇ１対照抗体（第四の４バー）は顕著な保護効果がない。下部パネル：３つの独立した実験のダイナミンシグナルの定量（０μＭＡβ処理に対して標準化した後の％ダイナミン＋／−平均値標準誤差として表されている。）は、１１Ｅ６の統計学的に有意な保護効果を明らかにした（片側ＡＮＯＶＡ、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定後にＤｕｎｎｓ検定；＊は、ｐ＜０．０５を示す。）。 図１２は、ラット海馬スライス培養中でのシナプス伝達のグロブロマーによって誘導された強い抑制に対する１１Ｅ６（Ａ）又は対照抗体（Ｂ）の影響を示す。０．１μＭ１１Ｅ６は、グロブロマーによって誘導される欠損を完全に回復させた（（Ａ）参照）。 図１２は、ラット海馬スライス培養中でのシナプス伝達のグロブロマーによって誘導された強い抑制に対する１１Ｅ６（Ａ）又は対照抗体（Ｂ）の影響を示す。０．１μＭ１１Ｅ６は、グロブロマーによって誘導される欠損を完全に回復させた（（Ａ）参照）。 図１３は、Ｔｇ２５７６マウス中のアミロイド斑沈着に対する、抗体１１Ｅ６での１２週の処理の効果を示している。１１Ｅ６又はＩｇＧ１対照抗体処理後の抗Ａβ抗体６Ｇ１での標識によって検出された、斑で覆われた面積（Ａ、Ｂ）及び斑の数（Ｃ、Ｄ）（ｎ＝１９／グループ）が示されている。１１Ｅ６での処理は、新皮質中の沈着によって覆われている面積及び新皮質中の沈着の数を、それぞれ、２４．５％（Ａ）及び２６．８％（Ｃ）低下させた。統計解析によって、強い傾向が明らかになった（カッコ内のアスタリスク、ｐ＜０．０６；Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定）。前頭皮質内で、低下は統計学的に有意であり（アスタリスク、ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定）、１１Ｅ６処理後に、沈着の面積は２３．５％（Ｂ）及びその数は２６．８％（Ｄ）低下した。
配列表
配列番号１：ｍＡｂ ＶＨ ７Ｆ９のアミノ酸配列
配列番号２：ｍＡｂ ＶＨ ７Ｆ９ ＣＤＨ−Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号３：ｍＡｂ ＶＨ ７Ｆ９ ＣＤＨ−Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号４：ｍＡｂ ＶＨ ７Ｆ９ ＣＤＨ−Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号５：ｍＡｂ ＶＬ ７Ｆ９のアミノ酸配列
配列番号６：ｍＡｂ ＶＬ ７Ｆ９ ＣＤＨ−Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号７：ｍＡｂ ＶＬ ７Ｆ９ ＣＤＨ−Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号８：ｍＡｂ ＶＬ ７Ｆ９ ＣＤＨ−Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号９：ｍＡｂ ＶＨ １１Ｅ６のアミノ酸配列
配列番号１０：ｍＡｂ ＶＨ １１Ｅ６ ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１１：ｍＡｂ ＶＨ １１Ｅ６ ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１２：ｍＡｂ ＶＨ １１Ｅ６ ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１３：ｍＡｂ ＶＬ １１Ｅ６のアミノ酸配列
配列番号１４：ｍＡｂ ＶＬ １１Ｅ６ ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１５：ｍＡｂ ＶＬ １１Ｅ６ ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号１６：ｍＡｂ ＶＬ １１Ｅ６ ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１７：ｍＡｂ ＶＨ ４Ｅ５のアミノ酸配列
配列番号１８：ｍＡｂ ＶＨ ４Ｅ５ ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１９：ｍＡｂ ＶＨ ４Ｅ５ ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号２０：ｍＡｂ ＶＨ ４Ｅ５ ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号２１：ｍＡｂ ＶＬ ４Ｅ５のアミノ酸配列
配列番号２２：ｍＡｂ ＶＬ ４Ｅ５ ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号２３：ｍＡｂ ＶＬ ４Ｅ５ ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号２４：ｍＡｂ ＶＬ ４Ｅ５ ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒトＩｇγ１重鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒトＩｇκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号２７：ＯｍｐＡ−［ＲＡＧＥ（２３−３４０）］−６Ｈｉｓをコードする構築物＃１（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号２８：６Ｈｉｓ−（Ｔｈｒ）−［ＲＡＧＥ（２４−１２９）］をコードする構築物＃２（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号２９：６Ｈｉｓ−（Ｔｈｒ）−［ＲＡＧＥ（２４−２３４）］をコードする構築物＃３（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号３０：６Ｈｉｓ−（Ｔｈｒ）−［ＲＡＧＥ（２４−３３６）］をコードする構築物＃４（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号３１：６Ｈｉｓ−（Ｔｈｒ）−［ＲＡＧＥ（１３０−２３４）］をコードする構築物＃５（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号３２：６Ｈｉｓ−（Ｔｈｒ）−［ＲＡＧＥ（１３０−３３６）］をコードする構築物＃６（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号３３：６Ｈｉｓ−（Ｔｈｒ）−［ＲＡＧＥ（２３５−３３６）］をコードする構築物＃７（太字）の完全なプラスミドヌクレオチド配列
配列番号３４：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃１
配列番号３５：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃２
配列番号３６：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃３
配列番号３７：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃４
配列番号３８：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃５
配列番号３９：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃６
配列番号４０：コードされるアミノ酸配列ＲＡＧＥタンパク質＃７
配列番号４１：Ｉｇγ−１定常領域変異体アミノ酸配列
配列番号４２：Ｉｇγ−２定常領域変異体アミノ酸配列
配列番号４３：フレームワークアミノ酸配列ＶＨ７−４．１／ＪＨ６ ＦＲ１
配列番号４４：フレームワークアミノ酸配列ＶＨ７−４．１／ＪＨ６ ＦＲ２及びＶＨ１−２／ＪＨ６ ＦＲ２
配列番号４５：フレームワークアミノ酸配列ＶＨ７−４．１／ＪＨ６ ＦＲ３
配列番号４６：フレームワークアミノ酸配列ＶＨ７−４．１／ＪＨ６ ＦＲ４及びＶＨ１−２／ＪＨ６ ＦＲ４
配列番号４７：フレームワークアミノ酸配列ＶＨ１−２／ＪＨ６ ＦＲ１
配列番号４８：フレームワークアミノ酸配列ＶＨ１−２／ＪＨ６ ＦＲ３
配列番号４９：フレームワークアミノ酸配列１−１２／Ｌ５／ＪＫ２ ＦＲ１
配列番号５０：フレームワークアミノ酸配列１−１２／Ｌ５／ＪＫ２ ＦＲ２
配列番号５１：フレームワークアミノ酸配列１−１２／Ｌ５／ＪＫ２ ＦＲ３
配列番号５２：フレームワークアミノ酸配列１−１２／Ｌ５／ＪＫ２ ＦＲ４及び３−１５／Ｌ２／ＪＫ２ ＦＲ４
配列番号５３：フレームワークアミノ酸配列３−１５／Ｌ２／ＪＫ２ ＦＲ１
配列番号５４：フレームワークアミノ酸配列３−１５／Ｌ２／ＪＫ２ ＦＲ２
配列番号５５：フレームワークアミノ酸配列３−１５／Ｌ２／ＪＫ２ ＦＲ３
配列番号５６：ＣＤＲ移植されたアミノ酸配列ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬ
配列番号５７：ＣＤＲ移植されたアミノ酸配列ＶＨ１１Ｅ６．２−ＧＬ
配列番号５８：ＣＤＲ移植されたアミノ酸配列ＶＬ１１Ｅ６．１−ＧＬ
配列番号５９：ＣＤＲ移植されたアミノ酸配列ＶＬ１１Ｅ６．２−ＧＬ
配列番号６０：ｈＲＡＧＥのアミノ酸配列
配列番号６１：ｈｕｓＲＡＧＥ断片のアミノ酸配列
配列番号６２：ヒト化された抗体配列ＶＨ ｈ１１Ｅ６．１
配列番号６３：ヒト化された抗体配列ＶＬ ｈ１１Ｅ６．１
配列番号６４：ヒト化された抗体配列ＶＬ ｈ１１Ｅ６．２
配列番号６５：ヒト化された抗体配列ＶＬ ｈ１１Ｅ６．３
配列番号６６：ヒト化された抗体配列ＶＬ ｈ１１Ｅ６．４
配列番号６７：ヒト化された抗体配列ＶＨ ｈ１１Ｅ６．５
配列番号６８：ヒト化された抗体配列ＶＨ ｈ１１Ｅ６．９
配列番号６９：ヒト化された抗体配列ＶＨ ｈ１１Ｅ６．１６
配列番号７０：ＲＡＧＥ由来のペプチドＮｔｅｒｍＲ３１のアミノ酸配列
配列番号７１：ＲＡＧＥ由来のペプチド１のアミノ酸配列
配列番号７２：ＲＡＧＥ由来のペプチド２のアミノ酸配列
配列番号７３：ＲＡＧＥ由来のペプチド３のアミノ酸配列
配列番号７４：ＲＡＧＥ由来のペプチド４のアミノ酸配列
配列番号７５：ＲＡＧＥ由来のペプチド５のアミノ酸配列
配列番号７６：ＲＡＧＥ由来のペプチド６のアミノ酸配列
配列番号７７：ＲＡＧＥ由来のペプチド７のアミノ酸配列
配列番号７８：ＲＡＧＥ由来のペプチド８のアミノ酸配列
配列番号７９：ＲＡＧＥ由来のペプチド９のアミノ酸配列
配列番号８０：ＲＡＧＥ由来のペプチド１０のアミノ酸配列
配列番号８１：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８２：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８３：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８４：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８５：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８６：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８７：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８８：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号８９：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号９０：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号９１：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号９２：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号９３：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
配列番号９４：オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列
（詳細な記述）
１．一般的な定義
本明細書に別段の定義がなければ、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。しかしながら、何らかの潜在的な曖昧さが生じた場合には、用語の意味及び範囲は明瞭でなければならず、本明細書に提供されている定義があらゆる辞書又は外部的な定義に優越する。さらに、文脈上別段の要求がなければ、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。本願において、別段の記載がなければ、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。さらに、「含み」という用語並びに「含む」及び「含んだ」などの他の形態の使用は限定的でない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、具体的に別段の表記がなければ、１つのユニットを含む要素及び成分並びに２以上のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
一般に、本明細書に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリッド形成と関連して使用される命名法及びこれらの技術は、当業者に周知であり、本分野において一般的に使用されている。本発明の方法及び技術は、別段の記載がなければ、本分野において周知の慣用的な方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的な及びより具体的な参考文献に記載されているように一般に行われる。酵素反応及び精製技術は、本分野において一般的に達成されているように又は本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って行われる。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学及び医化学及び薬化学に関連して使用されている命名法並びにこれらの研究室的手法及び技術は、当業者に周知であり、本分野において一般的に使用されている。化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療には、標準的な技術が使用されている。
本発明がより容易に理解できるように、選択された用語が以下に定義されている。
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のあらゆるポリマー性鎖を表す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ポリペプチドととう用語と互換的に使用され、同じく、アミノ酸のポリマー性鎖を表す。「ポリペプチド」という用語は、原型の又は人工的なタンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類縁体を包含する。ポリペプチドは、単量体又は多量体であり得る。
「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、その取得起源又は取得源のために、固有の状態において付随する天然に付随する成分を随伴しておらず、同じ種由来の他のタンパク質が実質的に存在せず、異なる種由来の細胞によって発現され、又は天然に存在しないタンパク質又はポリペプチドである。従って、化学的に合成された又は当該ポリペプチドが本来起源とする細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然に随伴する成分から「単離」されている。タンパク質は、本分野において周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、天然に随伴する成分が実質的に存在しないようにされ得る。
本明細書において使用される「回収する」という用語は、例えば、本分野において周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、ポリペプチドなどの化学種を天然に随伴する成分が実質的に存在しないようにする過程を表す。
「終末糖化産物に対する受容体（ＲＡＧＥ）」という用語は、とりわけ、可溶性Ａβペプチド、Ｓ１００ｂ及びＨＭＧＢ１（アムホテリンとしても知られる。）を結合する、免疫グロブリンファミリー中のマルチリガンド受容体を表す。ＲＡＧＥは、これらのリガンドへの結合に応答して、病態生理学的に適切な細胞的変化を媒介する。ＲＡＧＥ及びヒトＡＰＰを過剰発現するトランスジェニック動物は、空間学習及び記憶における早期の異常を示し、ＲＡＧＥがアルツハイマー型病変でのＡβによって誘導される神経細胞の擾乱に対する補因子であることを示し、ＲＡＧＥが細胞の異常機能を軽減するための潜在的な治療的標的であることを示唆する。
ＲＡＧＥの構造は、解明されていない。他のタンパク質に対する相同性は、ＲＡＧＥが幾つかのドメインを有するモデルを導く。これらのドメインは、免疫グロブリンとの類推によって名付けられている。（ｉ）Ｎ末端のＶ様ドメイン。免疫グロブリン中のこの等価なドメインは抗原を結合し、これらのタンパク質内の唯一の結合領域に相当する。ＲＡＧＥでは、このドメインは、Ｓ１００のような幾つかのリガンドへ結合する（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ．２６，３８７５，２００７；Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２８２，３１３１７，２００７）。ＲＡＧＥ中のｖ様ドメインに結合するモノクローナル抗体は、様々なリガンド（Ｓ１００ｂ、ＨＭＧＢ１及びアミロイドβ）の結合と競合し（ＷＯ２００７１０９７４９（Ａ２）、これらのリガンドも、この同じドメインを介してＲＡＧＥに結合することを示唆する。（ｉｉ）第一のＣ２様ドメイン：ＲＡＧＥ内の２つのドメインは、免疫グロブリンのＣ２ドメインに対して相同性を有し、これらのドメインの１つは、Ｃ１と称される（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ他、ＢＢＲＣ２００６によっても使用される命名法）。このドメインに結合する幾つかのリガンド（例えば、Ｋｄ＝９０ｎＭの親和性で結合するＳ１００Ａ１２（ＥＮＲＡＧＥ又はカルグラニュリンＣとも称される。））が記載されている（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ９７，８８９，１９９９；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ，２８２，４２１８，２００７）。Ａβはこのドメインに関してＳ１００Ａ１２と競合し、ＡβもＣ１−ドメインに結合することを示唆する。（ｉｉｉ）第二のＣ２様ドメイン：このドメインは、Ｃ２と称される（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ２００６によっても使用された。）。ＲＡＧＥリガンドＳ１００Ａ６はＣ２ドメインに結合し、Ｃ２ドメインから得られたペプチドに対して生成された抗体は、この結合に関して、Ｓ１００Ａ６に対して競合することが示された。抗体はＳＨ−ＳＹ５Ｙ中での低下したシグナル伝達をもたらす（Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ２８２，３１３１７，２００７）。
「ＲＡＧＥドメイン」は、本分野の水準で提供される異なる定義に従って定義され得る。
「Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８２：４２１８−４２３１」に従って、ｈＲＡＧＥドメインの以下の定義が適用される。
−Ｖドメイン（配列番号６０のアミノ酸２４から１２９）、
−Ｃ１ドメイン（配列番号６０のアミノ酸１３０から２３４）、
−Ｃ２ドメイン（配列番号６０のアミノ酸２３５から３３６）、
「Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．２００８；２２：１５７２−１５８０」による、より最近の定義によると、ｈＲＡＧＥ（配列番号６０に記載の４０４のアミノ酸残基）は、
−シグナルペプチド（配列番号６０のアミノ酸１から２２）、その後に、
−Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（配列番号６０のアミノ酸２３から１１６）及び
−２つのＩｇ様Ｃ２型１／２ドメイン（配列番号６０のアミノ酸１２４から２２１、Ｃ１ドメインとも表記される；及び配列番号６０のアミノ酸２２７から３１７；Ｃ２ドメインとも表記される。）
を含む３つの免疫グロブリン様ドメイン；
から構成される細胞外領域（配列番号６０のアミノ酸１から３４２）
−単一の膜貫通ドメイン（配列番号６０のアミノ酸３４３から３６３）、及び
−短い細胞質尾部（配列番号６０のアミノ酸３６４から４０４）
を有する。
同一性の高い程度に照らせば、特に、ドメインＶ、Ｃ１及びＣ２の定義に関して、別段の記載がなければ、本発明の結合タンパク質の結合特性を定義するために、定義の各々が適用され得る。
上述されているように、ＲＡＧＥは、異なるドメインを介して、異なるリガンドを結合することができる。他のリガンドとの競合実験から得られた結果は、ＡβがＣ１ドメインに結合することを示すように見受けられる（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ９７，８８９，１９９９又はＸｉｅ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ，２８２，４２１８，２００７）。ＲＡＧＥリガンドの非限定的な例として、以下のものを挙げることができる。
−終末糖化産物（ＡＧＥ）（Ｂａｙｎｅｓ Ｊ．Ｗ．，１９９１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９９１，４０：４０５−４１２；Ａｈｍｅｄ Ｋ．Ａ．，２００７，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｕｔｒ．４１ （２）：９７−１０５）；
−Ｓ１００／カルグラニュリンファミリーの一員（例えば、カルグラニュリンＣ（ＥＮＲＡＧＥ及びＳ１００Ａ１２としても知られる。）、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１３、Ｓ１００Ｂ及びＳ１００Ｐ）；
−アミロイド−β−ペプチド（Ａβ）、例えば、Ａβ１−４０ペプチド
−アミロイド−βグロブロマー；例えば、Ａβ１−４２、Ａβ１２−４２、Ａβ２０−４２グロブロマー（Ｂａｒｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｏｂｕｌａｒ ａｍｙｌｏｉｄ Ｂ ｐｅｐｔｉｄｅ １−４２ ｏｌｉｇｏｍｅｒ− ａ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９５（３）：８３４−８４７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５；ＷＯ２００７／０６２８５２；ＷＯ２００８／１５０９４９参照；全て、参照により、組み込まれる。）
−白血球インテグリン（例えば、Ｍａｃ−１）
本明細書において使用される「ＲＡＧＥ」という用語は、特に、ヒトＲＡＧＥを表し、「ｈＲＡＧＥ」又は「ｈｕＲＡＧＥ」とも表記される。別段の記載がなければ、「ＲＡＧＥ」という用語は、ヒトとは異なる別の種、例えば、マウス若しくはラットのようなげっ歯類又はウシＲＡＧＥ分子から単離又は取得されたＲＡＧＥ分子も包含する。
「ｓＲＡＧＥ」という用語は、ＲＡＧＥの細胞外ドメインに由来するＲＡＧＥの可溶性形態を表す。例えば、ヒトＲＡＧＥ由来のｓＲＡＧＥ（ｈｕｓＲＡＧＥとも表記される。）は、ヒトＲＡＧＥ（配列番号６０参照）のアミノ酸残基１から３３１（配列番号６１参照）を含む。
本明細書において使用される「生物学的活性」は、本明細書において定義されるＲＡＧＥの全ての固有の生物学的特性を表す。
別の化学種との抗体、タンパク質又はペプチドの相互作用に関して、本明細書において使用される「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、相互作用が、その化学種上の特定の構造（例えば、以下で定義されている「抗原性決定基」又は「エピトープ」）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、タンパク質全般ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的であれば、標識された「Ａ」及び抗体を含有する反応中にエピトープＡを含有する分子（又は遊離の、標識されていないＡ）が存在すると、抗体に結合される標識されたＡの量を低下させる。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）から構成されるあらゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持するあらゆるその機能的断片、変異体、変形物又は誘導体を広く表す。このような変異体、変形物又は誘導体抗体の形式は、本分野において公知である。それらの非限定的な実施形態は、以下に論述されている。ある分子と特異的に反応することにより、その分子を抗体に結合することができれば、抗体はその分子を「特異的に結合する」と称される。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」は、異なる抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物とは異なり、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子の調製物を表すものとする。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイのような幾つかの新しい技術及びハイブリドーマから得られた抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ法（（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７などのハイブリドーマ技術によって調製されたハイブリドーマによって分泌された抗体）がその例である古典的な方法によって作製することが可能である。
完全長の抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲ又はＶＨと略称される。）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲ又はＶＬと略称される。）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されている領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。）が介在された超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。）へさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ酸末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（又は単に「抗体部分」若しくは「抗体断片」）という用語は、抗原（例えば、ＲＡＧＥ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上の断片を表す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。このような抗体の実施形態は、二特異的、二重特異的又は多重特異的形式でもあり得、２つ又はそれ以上の異なる抗原に結合し得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１（参照により、本明細書に組み込まれる。））；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対を成して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３参照）、これらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結することができる。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されている二価の二特異的抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎ、これにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を作製するリンカーを使用する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３参照）。このような抗体結合部分は本分野において公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （２００１） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．７９０ ｐｐ．（ＩＳＢＮ ３−５４０−４１３５４−５）。
本明細書において使用される「抗体構築物」という用語は、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１つ又はそれ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを表す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって連結された２つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含み、１つ又はそれ以上の抗原結合部分を連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは、本分野において周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを表す。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は本分野において公知であり、表１に表されている。
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さらに、抗体又はその抗原結合部分は、１つ又はそれ以上の他のタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有的会合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦＶ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）及び二価の、ビオチン化されたｓｃＦＶ分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ、完全な抗体のパパイン又はペプシン消化などの慣用技術を用いて、完全な抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、本明細書に記載されているように、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて取得することができる。
本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ヒトＲＡＧＥを特異的に結合する単離された抗体は、ヒトＲＡＧＥ以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）抗体を表すものとする。しかしながら、ヒトＲＡＧＥを特異的に結合する単離された抗体は、他の種から得られたＲＡＧＥ分子などの他の抗原に交叉反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことができる。
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為の突然変異誘発若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないものとする。
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（以下でさらに記載されている。）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．Ｒ．，（１９９７） ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ Ｈ．，ａｎｄ Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ Ｗ．Ｅ．，（２００２） Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．（２００２） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ Ｐ．（２０００） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入された動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｓ−Ａ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ Ｌ．Ｌ．（２００２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ （２０００） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−３７０参照）又は他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む他のあらゆる手段によって調製され、発現され、作製され、若しくは単離された抗体などの、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、又は単離された全てのヒト抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対して遺伝子導入された動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、これらの配列に関連しつつも、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には、天然に存在しない場合があり得る配列である。
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列並びに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体を表す。キメラ抗体は、組換え分子生物学技術を通じて作製することが可能であり、又は物理的に一緒に連結され得る。
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、マウスＣＤＲの１つ又はそれ以上（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置換されている抗体を表す。
「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。本分野において認知されているこれらの用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基に比べて、より可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に付番するシステムを表す（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＡ１ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＮＯ．９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から６５及びＣＤＲ３に対するアミノ酸位置９５から１０２にわたる。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対するアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に対するアミノ酸位置５０から５６及びＣＤＲ３に対するアミノ酸位置８９から９７にわたる。
本明細書において使用される「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードする抗体又は核酸配列を表す。幾つかの実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域を提供し、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の１つ又はそれ以上を提供し、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。特定の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、特に、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。本実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１つ又はそれ以上の特定の位置に存在しない少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも１０のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、本分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）に由来し、又はこれらから取得され得る。
本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を表す。重鎖及び軽鎖の各可変領域中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、各可変領域に対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と表記される。本明細書において使用される「ＣＤＲの組み」という用語は、抗原を結合することが可能な単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を表す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによって記載された系（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７） ａｎｄ （１９９１））は、抗体の何れの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを画する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７ （１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３ （１９８９））は、ＫａｂａｔＣＤＲ内のある種の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３（「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を表す。）と表記された。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称される場合があり、これは、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを画する他の境界は、Ｐａｄｌａｎによって記載されている（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９ （１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ （Ｊ Ｍｏｌｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））。さらに別のＣＤＲ境界定義は、上記系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、ＫａｂａｔＣＤＲと重複するが、それらは、残基又は場合によってはＣＤＲ全体の特定の残基又は基が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測又は実験的な発見に照らして、短縮又は延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらの系の何れかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。
本明細書において使用される「標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２）、何れも、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって定義される特定の標準的なＣＤＲ構造を規定するＣＤＲ又はフレームワーク中の残基を表す。Ｃｈｏｔｈｉａらによれば、多くの抗体のＣＤＲの重大な部分は、アミノ酸配列のレベルでの大きな多様性に関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を有する。各標準的な構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続するセグメントに対して、ペプチド骨格ねじれ角の組みを主に指定する。
本明細書で使用される「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する抗体を表す。特定の実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が取得され又は由来する抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体という文脈において、「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を表す。
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残りの配列を表す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なる系によって決定され得るので、フレームワーク配列の意義は、これに対応して、異なる解釈に供せられる。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）は、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域も、各鎖上の４つの亜領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者によって表記されるように、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定の亜領域を特定せずに、フレームワーク領域は、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書中で使用される場合、１つのＦＲは、４つの亜領域の１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの亜領域の２つ又はそれ以上を表す。
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、本分野において公知である。本発明の一実施形態において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、表２及び表３に記載されている配列から選択される。ヒトフレームワーク配列ＦＲ１からＦＲ４に対する異なる組み合わせが、前記表中に記載されている。
Figure 2016104740
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本明細書において使用される「生殖系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝的再編成及び変異をもたらす変異プロセスを経ていない非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を表す。（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０ （２００１）参照）。本発明の様々な実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子は、成熟した抗体遺伝子より、種内の個体に特徴的な必須のアミノ酸配列構造を保存する傾向がより大きく、このため、その種において治療的に使用された場合に、外来源に由来すると認識される可能性がより低いという認識から生じる。
本明細書において使用される「中心的な」残基という用語は、抗体、特に、ヒト化された抗体の結合特異性及び／又は親和性に対してより大きな影響を有する可変領域内のある種の残基を表す。中心的な残基には、以下の１つ又はそれ以上、ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ又はＯグリコシル化部位の何れかであり得る。）、稀な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準的な残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基並びに可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義及び第一の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義の間で重複する領域中の残基が含まれるが、これらに限定されない。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」である、すなわち、ヒト生殖系列の可変配列により似ているように変化を受けている抗体を全般的に表す。ヒト化抗体の１つの種類は、対応する非ヒトＣＤＲ配列に置き換えるために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列の中に導入されているＣＤＲ移植された抗体である。
特に、本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、及びヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域と非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変形物、誘導体、類縁体若しくは断片である。本明細書において使用されるＣＤＲの文脈での「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、特に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを表す。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、及びフレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。特に、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部（Ｆｃ）も含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖及び重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
ヒト化抗体は、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥなどの免疫グロブリンのあらゆるクラス、並びにＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４など（但し、これらに限定されない）あらゆるイソタイプから選択することが可能である。ヒト化抗体は２以上のクラス又はイソタイプから得られる配列を含み得、本分野において周知の技術を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するために、特定の定常ドメインを選択し得る。
ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、当該部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークの何れかに対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって変異され得る。特定の実施形態において、このような変異は、しかしながら、大規模なものではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、特に少なくとも８５％、より具体的には、少なくとも９０％及び特に少なくとも９５％は、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに対応する。本明細書において使用されている「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワークを表す。本明細書において使用される「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリー中の最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を表す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ （Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７を参照されたい。）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリー内で当該位置において最も頻繁に存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しい頻度で存在する場合には、何れもが、コンセンサス配列中に含まれ得る。
本明細書において使用される「Ｖｅｒｎｉｅｒ」ゾーンとは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９、参照により、本明細書中に組み込まれる。）によって記載されているように、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への適合性を微調整し得るフレームワーク残基のサブセットを表す。Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン残基は、ＣＤＲの下に存在する層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に対して影響を及ぼし得る。
本明細書において使用される、ＲＡＧＥのリガンドの１つへのＲＡＧＥの「結合の阻害」という用語は、前記リガンド結合活性の部分的な（例えば、約１から１０％又はそれ以上、特に、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％又はそれ以上）又は完全な低下を包含する。前記「結合の阻害」は、本分野において利用可能なあらゆる適切な方法によって、好ましくは、本明細書中に例示されているあらゆる方法、例えば、本明細書に記載されているＨＴＲＦアッセイによって測定され得る。
本明細書において使用される「中和」という用語は、結合タンパク質が標的タンパク質を特異的に結合するときの、標的タンパク質の生物学的活性の中和を表す。中和は、標的への前記結合タンパク質の結合の様々な様式の結果であり得る。例えば、中和は、標的分子への受容体結合に影響を及ぼさない、標的の領域中への結合タンパク質の結合によって引き起こされ得る。あるいは、結合タンパク質の結合は、標的への受容体結合の封鎖をもたらし得、この封鎖は標的タンパク質活性を最終的に中和する。前記様々な機序の各々が、本発明に従って起こり得る。
特に、中和結合タンパク質は、ＲＡＧＥへのその結合がＲＡＧＥの生物学的活性の中和をもたらす中和抗体である。特に、中和結合タンパク質はＲＡＧＥを結合し、ＲＡＧＥの生物活性を少なくとも約１から１０％、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％又はそれ以上低下させる。中和結合タンパク質によるＲＡＧＥの生物学的活性の中和は、本分野において周知の並びに／又は実験の部、特に、実施例５、６、１０及び１６から１９に例示されているＲＡＧＥの生物学的活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することによって評価することができる。例えば、ＲＡＧＥの中和は、以下の実施例５及び６で測定されているように、Ａβ−グロブロマーへのＲＡＧＥの結合を中和する。
動物モデル中においてインビボで測定された「可溶性Ａβ１−４０ペプチドによって誘導された脳血液容積の低下の阻害」は、非処理対照と比較した場合に、又は、特に、陰性のモノクローナル若しくはポリクローナル免疫グロブリンイソタイプ対照と比べた場合に、例えば、少なくとも約１から１０％、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％又はそれ以上の部分的な又は完全な阻害に関する。
ヒトＡＰＰを過剰発現する動物モデルにおけるインビボでの「脳血液容積の改善」は、非処理対照と比べた場合に、又は、特に、陰性のモノクローナル若しくはポリクローナル免疫グロブリンイソタイプ対照と比べた場合に、ＣＢＶの統計学的に有意な改善に関する。
ヒトＡＰＰを過剰発現する動物モデル中においてインビボで測定された「アミロイド斑の数及び／又はアミロイド斑の面積の低下」は、非処理対照と比較した場合に、又は、特に、陰性のモノクローナル若しくはポリクローナル免疫グロブリンイソタイプ対照と比べた場合に、例えば、少なくとも約１から１０％、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％又はそれ以上の部分的な又は完全な低下に関する。
「インビトロでの海馬神経細胞の凝集されたＡβ１−４０ペプチドによって誘導されたダイナミン切断の阻害」は、非処理対照と比較した場合に、又は、特に、陰性のモノクローナル若しくはポリクローナル免疫グロブリンイソタイプ対照と比べた場合に、例えば、少なくとも約１から１０％、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％又はそれ以上の部分的な又は完全な阻害に関する。
「Ａβ１−４２グロブロマーによって誘導されたインビトロでのシナプス伝達の低下の回復」は、非処理対照と比較した場合に、又は、特に、陰性のモノクローナル若しくはポリクローナル免疫グロブリンイソタイプ対照と比べた場合に、例えば、少なくとも約１から１０％、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％又はそれ以上の部分的な又は完全な回復に関する。
本明細書において使用される「中和モノクローナル抗体」は、特定の抗原に結合した際に、前記抗原に対する天然のリガンドの結合を競合及び阻害することができる抗体分子の調製物を表すものとする。本願の特定の実施形態において、本発明の中和抗体は、ＲＡＧＥのリガンドの少なくとも１つ、特に、Ａβペプチド、Ａβグロブロマー、Ｓ１００ｂ及びアムホテリンから選択されるリガンドへの結合に関して、ＲＡＧＥと競合し、ＲＡＧＥの生物学的活性又は機能を妨げることができる。
「活性」という用語には、抗原に対する抗体（例えば、ＲＡＧＥ抗原に結合する抗ＲＡＧＥ抗体）の結合特異性／親和性及び／又は抗体（例えば、ＲＡＧＥへのその結合がＲＡＧＥの生物学的活性を中和する抗ＲＡＧＥ抗体）の中和能などの活性が含まれる。
ＲＡＧＥの「生物学的機能」又は「活性」は、Ａβに対するシグナル伝達細胞表面受容体又は細胞中への若しくは細胞を通じたタンパク質の輸送を媒介する受容体の生物学的機能又は活性として記載され得る。
「エピトープ」又は「抗原性決定基」という用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体へ特異的な結合が可能なあらゆるポリペプチド決定基が含まれる。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある種の実施形態において、特異的な三次元構造の特徴及び／又は特異的な電荷の特徴を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある種の実施形態において、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中で、抗体がその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗体は抗原を特異的に結合すると称される。
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムな生物特異的相互作用の分析を可能とする光学現象を表す。さらなる記述に関しては、「Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７」を参照されたい。
本明細書において使用される「ｋｏｎ」という用語は、本分野において公知であるような抗体／抗原複合体を形成するための、抗体の抗原への会合に対するオン速度定数を表すものとする。
本明細書において使用される「Ｋｏｆｆ」という用語は、本分野において公知であるように、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対するオフ速度定数を表すものとする。
本明細書において使用される「Ｋｄ」という用語は、本分野において公知であるように、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を表すものとする。
本明細書において使用される「標識された結合タンパク質」という用語は、結合タンパク質の同定を与える取り込まれた標識を有するタンパク質を表す。
特に、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射線標識されたアミノ酸の取り込み又は印が付けられたアビジン（例えば、光学的な又は比色測定法によって検出することができる蛍光性マーカー若しくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。放射性同位体又は放射線核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍ）；蛍光性標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次的レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；並びにガドリニウムキレート物質などの磁性因子。
「抗体連結物」という用語は、治療剤又は細胞毒性剤などの第二の化学的部分に化学的に連結された抗体などの結合タンパク質を表す。本明細書において、「因子」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子又は生物材料から作製された抽出物を表すために使用される。特に、治療剤又は細胞毒性剤には、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテステストロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにこれらの類縁体又は相同体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「結晶」及び「結晶化された」という用語は、結晶の形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を表す。結晶は、物質の固体状態の１つの形態であり、非晶質の固体状態又は液晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）又は分子集合物（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復する３次元配列から構成される。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特定の数学的関係に従って配置されている。結晶中で繰り返される基本的な単位又は構築ブロックは、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に確定された結晶学的な対称性に合致する配置での非対称性単位の反復は、結晶の「単位セル」を与える。三つの次元全てでの規則的な平行移動による単位セルの反復は、結晶を与える。「Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ ｅａ．，ｐｐ．２０ １−１６，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９９）」を参照されたい。
本明細書において引用される「ポリヌクレオチド」という用語は、２つ又はそれ以上のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れか）又はヌクレオチドの何れかの種類の修飾された形態のポリマー形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含むが、特に、二本鎖ＤＮＡである。
本明細書において使用される「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成起源又はこれらの幾つかの組み合わせの）ポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、「単離されたポリヌクレオチド」が自然の状態でともに見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部を随伴しておらず、自然の状態で連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されており、又はより大きな配列の一部として自然の状態で存在しない。
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、その核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を表すものとする。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ウイルスベクターにおいて、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点及びエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクターなどの（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）発現ベクターのこのような他の形態を含むものとする。
「作用可能に連結された」という用語は、記載された成分がそれらを所期の様式で機能させることができる関係にある併置を表す。コード配列に対して「作用可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結されている。「作用可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現調節配列及び目的の遺伝子を調節するように、トランスで又は離れて作用する発現調節配列の両方を含む。本明細書において使用される「発現制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼす必要があるポリヌクレオチド配列を表す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び所望であれば、タンパク質分泌を増強させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。真核生物では、このような制御配列は、一般に、プロモーター及び転写終結配列を含み得る。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセッシングに不可欠である成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合対配列も含むことも可能である。
本明細書において記載される「形質転換」とは、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る全てのプロセスを表す。形質転換は、本分野で周知の様々な方法を用いて、自然の条件又は人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞中へ外来核酸配列を挿入するための何れかの公知の方法に依拠し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェション及び粒子照射を含み得るが、これらに限定されない。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとして、又は宿主染色体の一部として、その中で複製することできる安定に形質転換された細胞が含まれる。それらには、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、限られた時間にわたって一過性に発現する細胞も含まれる。
本明細書において使用される「組換え宿主細胞」（又は単に、「宿主細胞」）という用語は、外来ＤＮＡがその中に導入されている細胞を表すものとする。このような用語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表すことが意図されることを理解すべきである。変異又は環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲に、なお含まれる。特に、宿主細胞には、生物の何れかの界から選択される原核及び真核細胞が含まれる。具体的な真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が含まれる。特に、宿主細胞には、原核細胞株イー．コリ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９及び真菌細胞サッカロミセス・セレビシアエが含まれるが、これらに限定されるものではない。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために、標準的な技術を使用し得る。酵素反応及び精製技術は、本分野において一般的に達成されているように又は本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って行われ得る。一般に、先述の技術及び手順は、本分野で周知の慣用的な方法に従い、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的参考文献及びより具体的な参考文献中に記載されているように、実施することができる。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）」（参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
本分野において公知であり、本明細書において使用されている「トランスジェニック生物」は、導入遺伝子を含有する細胞を有する生物を表し、生物（又は生物の先祖）中に導入された導入遺伝子は、当該生物中で天然には発現されていないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」とは、トランスジェニック生物がそこから発達する細胞のゲノム中に安定に及び作用可能に組み込まれており、トランスジェニック生物の１つ又はそれ以上の細胞種又は組織中で、コードされた遺伝子産物の発現を誘導するＤＮＡ構築物である。
「制御する」及び「調節する」という用語は互換的に使用され、本明細書において使用される場合、目的の分子の活性（例えば、ＲＡＧＥの生物学的活性）の変化又は改変を表す。調節は、目的の分子のある種の活性又は機能の規模の増加又は減少であり得る。分子の典型的な活性及び機能には、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。
対応して、本明細書において使用される「調節物質」という用語は、目的の分子の活性又は機能（例えば、ＲＡＧＥの生物学的活性）を変化又は改変することができる化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性又は機能の大きさと比べて、分子のある種の活性又は機能の大きさの増加又は減少を引き起こし得る。
本明細書において使用される「アゴニスト」という用語は、目的の分子と接触されたときに、アゴニストの不存在下で観察される活性又は機能の大きさと比べて、分子のある種の活性又は機能の大きさの増加を引き起こす調節物質を表す。具体的な目的のアゴニストには、ＲＡＧＥポリペプチド又はＲＡＧＥに結合するポリペプチド、核酸、炭水化物若しくは他のあらゆる分子が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「アンタゴニスト」という用語は、目的の分子と接触されたときに、アンタゴニストの不存在下で観察される活性又は機能の大きさと比べて、分子のある種の活性又は機能の大きさの減少を引き起こす調節物質を表す。典型的なアンタゴニストには、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小有機分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えば、ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
具体的な目的のアンタゴニストには、ＲＡＧＥの生物学的又は免疫学的活性を遮断又は調節するものが含まれる。ＲＡＧＥのアンタゴニストには、ＲＡＧＥに結合するタンパク質、核酸、炭水化物又は他のあらゆる分子、特に、ＲＡＧＥ分子と相互作用するモノクローナル抗体が含まれ得るが、これらに限定されない。ＲＡＧＥとの相互作用は、他のリガンド／細胞膜成分の結合及び中和をもたらし得、複数の疾病に対する相加的又は相乗的機能に関して有用であり得ることに注目すべきである。
本明細書において使用される「有効量」という用語は、疾患又はその１つ若しくはそれ以上の症候の重度及び／若しくは期間を低下若しくは軽減させ、疾患の進行を妨げ、疾患の後退を引き起こし、疾患に伴う１つ若しくはそれ以上の症候の再発、発症、開始若しくは進行を妨げ、疾患を検出し、又は別の治療法（例えば、予防的又は治療的因子）の予防的若しくは治療的効果を増強若しくは改善するのに十分である治療法の量を表す。
本明細書において使用される「試料」は、その最も広い意味で使用される。本明細書において使用される「生物学的試料」には、生物又は以前生物であったものから得られる物質のあらゆる量が含まれるが、これに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及びその他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節及び脾臓が含まれるが、これらに限定されない。
２．具体的な実施形態
本発明の具体的な実施形態が以下に列記されている。
１．１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤ及び１×１０−２ｓ−１又はそれ以下のｋｏｆｆ速度定数で（何れも、表面プラズモン共鳴によって測定される。）、ヒトＲＡＧＥから解離する単離された結合タンパク質。
２．ｉ）例えば、実験の部、特に、実施例４及び５、並びにそこに引用されている参考文献中でさらに詳しく記載されているように、標準的なインビトロアッセイ、例えば、ＨＴＲＦアッセイで測定されたときに、ヒトＲＡＧＥに結合し、並びに、ＲＡＧＥがそのリガンドの少なくとも１つに結合する能力を調節する（特に、阻害する）、実施形態１に記載の結合タンパク質、
ｉｉ）ＲＡＧＥによって媒介される生物学的活性を阻害することができる実施形態１に記載の結合タンパク質、
ｉｉｉ）以下の生物学的活性の少なくとも１つを有する結合タンパク質、特に、実施形態１に記載の結合タンパク質：
ａ．例えば、実験の部、特に、実施例１０及びそこに引用されている参考文献中でさらに詳しく記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのような動物モデルにおいてインビボで脳血液容量（ＣＢＶ）の可溶性Ａβ１−４０ペプチドによって誘導される低下の阻害；
ｂ．例えば、実験の部、特に、実施例１６及びその中に引用されている参考文献中により詳しく記載されているように、トランスジェニックＴｇ２５７６マウスモデルのようなヒトＡＰＰを過剰発現する動物モデル中でのインビボでの脳血液容量の改善；
ｃ．例えば、実験の部、特に、実施例１９及びその中に引用されている参考文献中により詳しく記載されているように、トランスジェニックＴｇ２５７６マウスモデルのようなヒトＡＰＰを過剰発現する動物モデル中でのインビボでのアミロイド斑の数及び／又はアミロイド斑の面積の低下；
ｄ．例えば、実験の部、特に、実施例１７及びその中に引用されている参考文献中により詳しく記載されているように、凝集されたＡβ１−４０ペプチドによって誘導される、胎児のラットから得られた海馬神経細胞のような海馬の神経細胞のインビトロでのダイナミン切断の阻害；
ｅ．例えば、実験の部、特に、実施例１８及びその中に引用されている参考文献中により詳しく記載されているように、海馬の切片培養物中で測定される、インビトロでのシナプス伝達のＡβ１−４２グロブロマーによって誘導される低下の回復。
３．リガンドがＡβペプチド、Ａβ−グロブロマー、Ｓ１００ｂ及びアムホテリンから選択される、実施形態１又は２に記載の結合タンパク質。
４．中和結合タンパク質である、実施形態１から３の１つに記載の結合タンパク質。
５．ヒトＲＡＧＥへのＡβグロブロマーの結合を遮断する（特に、阻害する）ことができる、実施形態１から４の１つに記載の結合タンパク質。
６．前記ＡβグロブロマーがＡβ１−４２である、実施形態１から５の１つに記載の結合タンパク質。
７．前記結合タンパク質が、少なくとも１つの、例えば、ヒトＲＡＧＥのＣ１及び／又はＣ２ドメインの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のアミノ酸残基と相互作用する、実施形態１から６の１つに記載の結合タンパク質。
８．ヒト化抗体である、実施形態１から７の１つに記載の結合タンパク質。
９．抗原結合ドメインを含み、ヒトＲＡＧＥ分子のエピトープを結合することが可能であり、前記抗原結合ドメインが
配列番号４、１２及び２０からなるアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ３群、並びに前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列；
配列番号８、１６及び２４からなるアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ３群、並びに前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む、実施形態１から８の何れか１つに記載の結合タンパク質。
１０．抗原結合ドメインを含み、ヒトＲＡＧＥ分子のエピトープを結合することが可能であり、前記抗原結合ドメインが
配列番号４、１２及び２０からなるアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ３群、並びに前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列；
配列番号８、１６及び２４からなるアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ３群、並びに前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列；
から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む結合タンパク質。
１１．配列番号２、１０、１８からなるＣＤＲ−Ｈ１の群から選択される、又は配列番号３、１１、１９からなるＣＤＲ−Ｈ２の群から選択される、又は配列番号６、１４、２２からなるＣＤＲ−Ｌ１の群から選択される、又は配列番号７、１５、２３からなるＣＤＲ−Ｌ２の群、及び前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲをさらに含む、実施形態１から１０の１つに記載の結合タンパク質。
１２．前記少なくとも１つのＣＤＲが
Figure 2016104740
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１の何れか１つに記載の結合タンパク質。
１３．
Figure 2016104740
 又は前記３つのＣＤＲの少なくとも１つが、親配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性、例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列である、可変ドメインの組み、
からなる可変ドメインＣＤＲから選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む、実施形態１２に記載の結合タンパク質。
１４．少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲの組みを含む、実施形態１３に記載の結合タンパク質。
１５．前記少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲの組みが
ＶＨ７Ｆ９の組みとＶＬ７Ｆ９の組み；
ＶＨ４Ｅ５の組みとＶＬ４Ｅ５の組み；及び
ＶＨ１１Ｅ６の組みとＶＬ１１Ｅ６の組み
からなる群から選択される、実施形態１４に記載の結合タンパク質。
１６．ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、実施形態１から１５の１つに記載の結合タンパク質。
１７．前記ヒトアクセプターフレームワークが配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４及び５５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載の結合タンパク質。
１８．配列番号５６と５７から選択される少なくとも１つの重鎖可変ドメイン及び／又は配列番号５８と５９から選択される少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から１７の何れか１つに記載の結合タンパク質。
１９．前記結合タンパク質が２つの可変ドメインを含み、前記２つの可変ドメインが
配列番号５６と５８、５６と５９、
配列番号５７と５８、５７と５９、
から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態１８に記載の結合タンパク質。
２０．前記ヒトアクセプターフレームワークが中心的な残基に少なくとも１つのフレームワーク領域のアミノ酸置換を含み、前記中心的な残基が
ＣＤＲに隣接する残基、
グリコシル化部位残基、
希な残基、
ＲＡＧＥエピトープと相互作用することができる残基、
ＣＤＲと相互作用することができる残基、
標準的な残基、
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、
Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基、ｐ−グルタミン酸を形成することができるＮ末端残基、及び
Ｃｈｏｔｈｉａ定義された可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義された第一の重鎖フレームワークの間で重複する領域中の残基
からなる群から選択される、実施形態１６から１９の何れか１つに記載の結合タンパク質。
２１．前記中心的な残基が、
（重鎖配列位置）：１、２、６８、７０、７２、７６、８５、８９、９５
（軽鎖配列位置）１１、１３、４３、４９、５８、７０、８７
からなる群から選択される、実施形態２０に記載の結合タンパク質。
２２．結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、実施形態１から２１の何れか１つに記載の結合タンパク質。
２３．前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域のアミノ酸置換（例えば、１から２０、１から１５、１から１０又は２、３、４、５、６、７、８若しくは９個の置換）を含み、フレームワークのアミノ酸配列が前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、及び前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０のアミノ酸残基を含む、実施形態１６から２２の何れか１つに記載の結合タンパク質。
２４．前記結合タンパク質が
（重鎖配列）配列番号６２、６７、６８及び６９；
（軽鎖配列）配列番号６３、６４、６５及び６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの（フレームワーク変異された）可変ドメインを含む、実施形態１から２３の何れか１つに記載の結合タンパク質。
２５．前記結合タンパク質が２つの可変ドメインを含み、前記２つの可変ドメインが
配列番号６２及び６３；６２及び６４；６２及び６５；６２及び６６；
配列番号：６７及び６３；６７及び６４；６７及び６５；６７及び６６；
配列番号：６８及び６３；６８及び６４；６８及び６５；６８及び６６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態２４に記載の結合タンパク質。
２６．前記結合タンパク質がＲＡＧＥ分子から選択される標的を結合することができる、実施形態１から２５の何れか１つに記載の結合タンパク質。
２７．ヒトＲＡＧＥへ結合することができる実施形態１から２６の何れか１つに記載の結合タンパク質。
２８．以下のさらなる機能的特徴の少なくとも１つを有する実施形態２７に記載の結合タンパク質：
マウス及びラットＲＡＧＥへの結合。
２９．結合タンパク質がＲＡＧＥ分子から選択される標的の生物学的機能を調節する（特に、中和する）ことができる、実施形態１から２８の何れか１つに記載の結合タンパク質。
３０．前記結合タンパク質が、ＲＡＧＥがそのリガンドの少なくとも１つに結合する能力を調節する（特に、阻害する）、実施形態２９に記載の結合タンパク質。
３１．前記結合タンパク質が、以下の相互作用の少なくとも１つを調節する（特に、阻害する）、実施形態３０に記載の結合タンパク質：
Ａβペプチド、Ａβグロブロマー、Ｓ１００ｂ及びアムホテリンへのヒトＲＡＧＥの結合。
３２．前記結合タンパク質が、ＲＡＧＥの生物学的活性、例えば、一次神経細胞中でのダイナミンのＡβ誘導性切断、海馬スライス中でのグロブロマー誘導性シナプス欠乏、Ａβ誘導性のＣＢＶの減少を中和することができる、実施形態１から３１の何れか１つに記載の結合タンパク質。
３３．ＲＡＧＥ分子がＲＡＧＥ又はｓＲＡＧＥのようなＲＡＧＥ断片である、実施形態３２に記載の結合タンパク質。
３４．ＲＡＧＥがヒト、ラット及びマウスから選択される、実施形態３３に記載の結合タンパク質。
３５．前記結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０７Ｍ−１ｓ−１からなる群から選択される、前記標的へのオン速度定数（ｋｏｎ）を有する、実施形態１から３４の何れか１つに記載の結合タンパク質。
３６．前記結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、最大約１０−２ｓ−１；最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；及び最大約１０−６ｓ−１からなる群から選択される、前記標的へのオフ速度定数（ｋｏｆｆ）を有する、実施形態１から３５の何れか１つに記載の結合タンパク質。
３７．前記結合タンパク質が、最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍ及び最大１０−１３Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、実施形態１から３６の何れか１つに記載の結合タンパク質。
３８．前記抗体構築物がリンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、実施形態１から３７に記載の何れか１つに記載されている結合タンパク質を含む抗体構築物。
３９．前記結合タンパク質が、
免疫グロブリン分子、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
ＣＤＲ移植された抗体、
ヒト化抗体、
Ｆａｂ、
Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）２、
Ｆｖ、
ジスルフィド連結されたＦｖ、
ｓｃＦｖ、
単一ドメイン抗体、
ダイアボディ、
多重特異的抗体、
二重特異的抗体、
二重可変ドメイン免疫グロブリン及び
二特異的抗体
からなる群から選択される、実施形態３８に記載の抗体構築物。
４０．前記結合タンパク質が
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、
ヒトＩｇＥ定常ドメイン、
ヒトＩｇＤ定常ドメイン、
ヒトＩｇＡ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＡ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＹ定常ドメイン及び
対応する変異されたドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、実施形態３８及び３９の何れか１つに記載の抗体構築物。
４１．配列番号２５、４１、４２及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、実施形態３８から４０の何れか１つに記載の抗体構築物。
４２．前記抗体連結物が免疫接着分子、造影剤、治療剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される因子をさらに含む、実施形態３８から４１の何れか１つに記載されている構築物を含む抗体連結物。
４３．前記因子が放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である、実施形態４２に記載の抗体連結物。
４４．前記造影剤が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である、実施形態４３に記載の抗体連結物。
４４．前記因子が代謝抑制剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、トキシン及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療剤又は細胞毒性剤である、実施形態４２に記載の抗体連結物。
４５．前記結合タンパク質がヒトのグリコシル化パターンを有する、実施形態３８から４１の何れか１つに記載の抗体構築物。
４７．前記結合タンパク質がヒトのグリコシル化パターンを有する、実施形態４２から４５の何れか１つに記載の抗体連結物。
４８．前記結合タンパク質が結晶として存在する、実施形態１から３７の何れか１つに記載の結合タンパク質。
４９．前記抗体構築物が結晶として存在する、実施形態３８から４１の何れか１つに記載の抗体構築物。
５０．前記抗体構築物が結晶として存在する、実施形態４２から４５の何れか１つに記載の抗体連結物。
５１．前記結晶が担体を含まない医薬徐放結晶である、実施形態４８に記載の結合タンパク質。
５２．前記結晶が担体を含まない医薬徐放結晶である、実施形態４９に記載の抗体構築物。
５３．前記結晶が担体を含まない医薬徐放結晶である、実施形態５０に記載の抗体連結物。
５４．前記結合タンパク質が前記結合タンパク質の可溶性対応物より長いインビボ半減期を有する、実施形態４８に記載の結合タンパク質。
５５．前記抗体構築物が前記抗体構築物の可溶性対応物より長いインビボ半減期を有する、実施形態４９に記載の抗体構築物。
５６．前記抗体連結物が前記抗体連結物の可溶性対応物より長いインビボ半減期を有する、実施形態５０に記載の抗体連結物。
５７．前記結合タンパク質が生物学的活性を保持する、実施形態４８に記載の結合タンパク質。
５８．前記抗体構築物が生物学的活性を保持する、実施形態４９に記載の抗体構築物。
５９．前記抗体連結物が生物学的活性を保持する、実施形態５０に記載の抗体連結物。
６０．実施形態１から３７の何れか１つに記載の結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
６１．実施形態３８から４１の何れか１つに記載の抗体構築物のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
６２．実施形態４２から４５の何れか１つに記載の抗体連結物のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
６３．実施形態６０から６２の何れか１つに記載の単離された核酸を含むベクター。
６４．ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ、ｐＨｙｂＥ及びｐＢＪからなる群から選択される、実施形態６３に記載のベクター。
６５．実施形態６３及び６４の何れか１つに記載のベクターを含む宿主細胞。
６６．前記宿主細胞が原核細胞である、実施形態６５に記載の宿主細胞。
６７．前記宿主細胞がイー・コリ細胞である、実施形態６６に記載の宿主細胞。
６８．前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態６７に記載の宿主細胞。
６９．前記真核細胞が原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項６８に記載の宿主細胞。
７０．前記真核細胞が哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項６９に記載の宿主細胞。
７１．前記宿主細胞がＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞及び酵母細胞から選択される、実施形態６９に記載の宿主細胞。
７２．前記酵母細胞がサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、実施形態７１に記載の宿主細胞。
７３．前記宿主細胞が昆虫Ｓｆ９細胞である、実施形態７０に記載の宿主細胞。
７４．ＲＡＧＥを結合することができる結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、実施形態６５から７３の何れか１つに記載の宿主細胞を培地中で培養することを含む、ＲＡＧＥを結合することができるタンパク質を産生する方法。
７５．実施形態７４に記載の方法に従って産生されたタンパク質。
７６．（ａ）実施形態４８から５０の何れか１つに記載の結晶化された生成物タンパク質及び成分を含む製剤；並びに
（ｂ）少なくとも１つのポリマー性担体；
を含む、結合タンパク質を放出するための組成物。
７７．前記ポリマー性担体が：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリラート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸グリコール酸共重合体）又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチラート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化された多糖、これらの混合物及び共重合体からなる群の１つ又はそれ以上から選択されるポリマーである、実施形態７６に記載の組成物。
７８．前記成分が、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、実施形態７６に記載の組成物。
７９．実施形態７７及び７８の何れか１つに記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物を治療するための方法。
８０．実施形態１から５９の何れか１つの生成物及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
８１．前記医薬として許容される担体が前記結合タンパク質の吸収又は分散を増加させるのに有用な佐剤として機能する、実施形態８０に記載の医薬組成物。
８２．前記佐剤がヒアルロニダーゼである、実施形態８１の医薬組成物。
８３．ＲＡＧＥ活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含む、実施形態８２に記載の医薬組成物。
８４．前記さらなる薬剤が、治療剤、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤；キナーゼ阻害剤；共同刺激分子遮断薬；接着分子遮断薬；抗サイトカイン抗体又はその機能的断片；メトトレキサート；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；検出可能な標識又はレポーター；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ薬；筋弛緩剤、催眠薬；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬、抗うつ病、精神病治療薬、興奮剤、喘息薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリン又は類縁体、サイトカイン及びサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される、実施形態８３に記載の医薬組成物。さらなる例は、ジメボン、抗Ａβ抗体、β−セクレターゼ阻害剤、τ調整物質、例えば、５−ＨＴ６アンタゴニストのような認知強化物質、コレステリナーゼ阻害剤（例えば、タクトリン、ドネペジル、リバスチグミン又はガランタミン）、部分的ＮＭＤＲＡ受容体遮断薬（例えば、メマンチン）、グリコサミノグリカン模倣物（例えば、Ａｌｚｈｅｍｅｄ）、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質（例えば、Ｒ−フルルビプロフェン）、黄体ホルモン遮断性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト（例えば、リューウプロレリン）、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｉｎ ａｇｅｎｔ）、神経細胞選択的Ｌ型カルシウムチャンネル遮断薬、免疫調節物質、アミロイド繊維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤（例えば、Ｍ２６６）、別の抗体（例えば、バピネオズマブ）、５−ＨＴ１ａ受容体アンタゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、終末糖化産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経細胞の代謝を増強したグルコース取り込み刺激物質、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体での部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分的アンタゴニスト、ＰＤＥ４を標的とする治療薬、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン作動性アゴニスト、神経細胞成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質である。
８５．ヒトＲＡＧＥ活性が低下されるように、ヒトＲＡＧＥを実施形態１から５９の何れか１つの産物と接触させることを含む、ヒトＲＡＧＥ活性を低下させる方法。
８６．Ａβペプチド、グロブロマー、Ｓ１００ｂ及びアムホテリンから選択される少なくとも１つのリガンドへのｈＲＡＧＥの結合を減少させることを必要とする対象に、実施形態１から５９の何れか１つに記載の産物を投与する工程を含む、前記対象中のＡβペプチド、グロブロマー、Ｓ１００ｂ及びアムホテリンから選択される少なくとも１つのリガンドへのｈＲＡＧＥの結合を減少させる方法。
８７．実施形態１から５９の何れか１つの産物を単独で、又は他の治療剤と組み合わせて投与する工程を含むＲＡＧＥ活性と関連する疾患に関して対象を治療する方法。
８８．ＲＡＧＥ活性が有害である疾患に罹患している対象に、実施形態１から５９の何れか１つの産物を単独で又は他の治療剤と組み合わせて投与することを含む、ＲＡＧＥ活性が有害である疾患に罹患している対象中のＲＡＧＥ活性を低下させる方法。
８９．前記疾患が筋萎縮性側索硬化症、腕神経叢傷害、脳傷害（外傷性脳傷害を含む。）、脳性麻痺、フリードリッヒ失調症、ギラン・バレー、白質委縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群（Ｐｏｓｔ Ｐｏｌｉｏ）、二分脊椎、脊髄傷害、脊髄筋肉萎縮症、脊髄腫瘍、卒中、横断性脊髄炎、認知症、老年性認知症、軽度の認知障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、晩発性運動障害、運動亢進症、躁病、パーキンソン病、スチール・リチャード症候群、ダウン症候群、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う脳出血Ｉ、脳炎症、フリードリッヒ失調症、急性精神錯乱、筋萎縮性側索硬化症、緑内障、アルツハイマー病、糖尿病性腎障害、敗血症、関節リウマチ及び関連炎症性疾患を含む群から選択される神経疾患；糖尿病及び糖尿病性網膜症、腎障害、血管合併症のような糖尿病の結果として生じる合併症；アテローム性動脈硬化症の合併症、肺繊維症、癌、特に、悪性黒色腫、他のアミロイドーシスを含む、実施形態８８に記載の方法。
９０．実施形態１から５１の何れか１つに記載の結合タンパク質の単離されたＣＤＲ。
９１．終末糖化産物（ＲＡＧＥ）タンパク質の受容体の少なくとも１つのエピトープに特異的に相互作用する単離された結合タンパク質。
９２．単離されたタンパク質がモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、実施形態９１に記載の単離された結合タンパク質。
９３．ＶＨ及びＶＬドメインを含む、実施形態９２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片。
９４．前記モノクローナル抗体が、ＲＡＧＥがそのリガンドへ結合する能力を減弱させる、実施形態９２に記載のモノクローナル抗体。
９５．リガンドがＡβペプチド、グロブロマー、Ｓ１００ｂ及びアムホテリンを含む、実施形態９４に記載のリガンド。
９６．前記抗体がＡβグロブロマーのＲＡＧＥへの結合を遮断することができる、実施形態９２に記載のモノクローナル抗体。
９７．配列番号１、配列番号９及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号５、配列番号１３及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；アミノ酸配列番号２５を有するヒト免疫グロブリンγ１重鎖定常領域；並びにアミノ酸配列番号２６を有するヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域を含む、実施形態９２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片。
９８．抗原結合ドメインが配列番号２、３、４、６、７、８、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、１９及び２０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、実施形態９３に記載のモノクローナル抗体。
９９．前記ＶＨドメインが配列番号１、配列番号９及び配列番号１７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、実施形態９３に記載のモノクローナル抗体。
１００．前記ＶＨドメインが配列番号２、３、４、１０、１１、１２、１８、１９及び２０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む、実施形態９９に記載のモノクローナル抗体。
１０１．前記ＶＨドメインが配列番号２、３、４；配列番号１０、１１、１２；配列番号１８、１９及び２０の組みから選択される少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む、実施形態１００に記載のモノクローナル抗体。
１０２．前記ＶＬドメインが配列番号５、配列番号１３及び配列番号２１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態９３に記載のモノクローナル抗体。
１０３．前記ＶＬドメインが配列番号６、７、８、１４、１５、１６、２２、２３及び２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む、実施形態１０２に記載のモノクローナル抗体。
１０４．前記ＶＬドメインが配列番号６、７、８；配列番号１４、１５、１６；配列番号２２、２３及び２４の組みから選択される少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む、実施形態１０３に記載のモノクローナル抗体。
１０５．前記抗体又は抗原結合断片がマウス抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合断片又はキメラ抗体の抗原結合断片である、実施形態９２に記載の抗体又は抗原結合断片。
１０６．前記抗体又は抗原結合断片がＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｖ断片からなる群から選択される抗原結合断片である、実施形態９２に記載の抗体又は抗原結合断片。
１０７．実施形態９６に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞株。
１０８．ハイブリドーマがマウス、ヒト、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ及びウマハイブリドーマからなる群から選択される、実施形態１０７に記載のハイブリドーマ細胞株。
１０９．ＲＡＧＥタンパク質の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
１１０．ハイブリドーマがマウス及びヒトからなる群から選択される、実施形態１０７に記載のハイブリドーマ細胞株。
１１１．ハイブリドーマがラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ及びウマハイブリドーマからなる群から選択される、実施形態１０７に記載のハイブリドーマ細胞株。
１１２．実施形態９７に記載のアミノ酸配列の何れかをコードする単離された核酸を含む単離された核酸を含み、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＪからなる群から選択されるベクター。
１１３．原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、実施形態１１２に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
１１４．動物細胞がＨＥＫ２９３、ＣＨＯ及びＣＯＳを含む群から選択される哺乳動物細胞である、実施形態１１３に記載の宿主細胞。
１１５．結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、培地を集めること、及び産生された単離された結合タンパク質を精製することを含む、実施形態９１に記載の単離された結合タンパク質を産生する方法。
１１６．実施形態９９又は１０２の何れかに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合タンパク質及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
１１７．ＲＡＧＥ中のＣ２ドメインに結合する実施形態９９又は１０２に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む疾病又は疾患を治療する方法。
１１８．前記疾患が筋萎縮性側索硬化症、腕神経叢傷害、脳傷害（外傷性脳傷害を含む。）、脳性麻痺、フリードリッヒ失調症、ギラン・バレー、白質委縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄傷害、脊髄筋肉萎縮症、脊髄腫瘍、卒中、横断性脊髄炎、認知症、老年性認知症、軽度の認知障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、晩発性運動障害、運動亢進症、躁病、パーキンソン病、スチール・リチャード症候群、ダウン症候群、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う脳出血Ｉ、脳炎症、フリードリッヒ失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ）、急性精神錯乱、筋萎縮性側索硬化症、緑内障、アルツハイマー病、糖尿病性腎障害、敗血症、関節リウマチ及び関連炎症性疾患を含む群から選択される神経疾患を含む、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．配列番号５６及び５７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶＨ領域を含む、実施形態１０５の抗体。
１２０．配列番号５８及び５９から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶＬ領域を含む、実施形態１０５の抗体。
１２１．ＶＨ又はＶＬ配列中において１から１０の変異によってさらに修飾された、実施形態１１９又は１２０の抗体。
１２２．変異がフレームワークの逆変異及びＶｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ界面残基の変異から選択される、実施形態１２１に記載の抗体。
１２３．ＨＭＧＢ１−ＣｐＧＤＮＡ複合体へのＲＡＧＥの結合を阻害する先行する実施形態の１つに記載の抗体若しくは結合タンパク質又はＨＭＧＢ１−ＣｐＧＤＮＡ複合体へのＲＡＧＥの結合を阻害しない先行する実施形態の１つに記載の抗体若しくは結合タンパク質。
３．抗ＲＡＧＥ抗体の作製
３．１総論
本願の抗体は、適切な宿主（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウ、爬虫類、魚、両生類を含む脊椎動物並びに鳥、爬虫類及び魚の卵）の免疫化によって作製することができる。本願の抗体を作製するために、宿主は、本発明の免疫原性ＲＡＧＥポリペプチド又はその断片で免疫化される。本明細書において、「免疫化」という用語は、免疫レパートリーが遺伝的に変化していない天然の生物又はトランスジェニック生物（人工のヒト免疫レパートリーを示すように修飾されたものを含む。）中に存在するかどうかを問わず、免疫レパートリーへ抗原を提示する方法を表す。同様に、「免疫原性調製物」は、抗原の免疫原性を増加させる佐剤又は他の添加物を含有する抗原の製剤である。
動物の免疫化は、本分野において公知のあらゆる方法によって実施され得る。例えば、「Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９０」を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマなどのヒト以外の動物を免疫化するための方法は、本分野において周知である。例えば、「Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ」及び米国特許第５，９９４，６１９号を参照されたい。特定の実施形態において、免疫応答を刺激するために、ＲＡＧＥ抗原はアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントには、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が含まれる。このようなアジュバントは局所的な沈着物中にポリペプチドを取り囲むことによって、迅速な分散からポリペプチドを保護することができ、又はこのようなアジュバントはマクロファージ及び免疫系の他の成分に対して走化性を示す要素を分泌するために宿主を刺激する物質を含有し得る。特に、ポリペプチドが投与される場合には、免疫化のスケジュールは、数週間以上にわたる、ポリペプチドの２つ又はそれ以上の投与を含む。
動物宿主は完全な状態の細胞又は破壊された細胞の細胞膜に付随する抗原で免疫化されること、及び本願の抗体は本発明の免疫原性ポリペプチドへ結合することによって同定されることが想定される。抗原での動物宿主の免疫化の後、抗体は動物から取得され得る。抗体を含有する血清は、動物を出血させ又は屠殺することによって動物から得られる。動物から得られたままで血清を使用することができ、血清から免疫グロブリン画分を取得することができ、又は血清から抗体を精製することができる。このようにして得られた血清又は免疫グロブリンはポリクローナルであり、従って、特性の不均一な列を有する。
３．２ハイブリドーマ技術を使用する抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はこれらの組み合わせの使用などの、本分野において公知の様々な技術を用いて調製することができる。例えば、本分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を作製することが可能である（前記参考文献の全体が、参照により組み込まれる。）。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、あらゆる真核生物、原核生物又はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を表し、モノクローナル抗体が作製された方法を表さない。
ハイブリドーマ技術を用いて特異的な抗体を作製及びスクリーニングする方法は定型的であり、本分野において周知である。一実施形態において、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む（特に、ハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫化されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで、本発明のポリペプチドを結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに関して、融合から得られたハイブリドーマをスクリーニングすることによって作製される。）モノクローナル抗体を作製する方法及び該方法によって作製された抗体を提供する。要約すれば、マウスはＲＡＧＥ抗原で免疫化することができる。特定の実施形態において、免疫応答を刺激するために、ＲＡＧＥ抗原はアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントには、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が含まれる。このようなアジュバントは局所的な沈着物中にポリペプチドを取り囲むことによって、迅速な分散からポリペプチドを保護することができ、又はこのようなアジュバントはマクロファージ及び免疫系の他の成分に対して走化性を示す要素を分泌するために宿主を刺激する物質を含有し得る。特に、ポリペプチドが投与される場合には、免疫化のスケジュールは、数週間以上にわたる、ポリペプチドの２つ又はそれ以上の投与を含む。
免疫抗体が検出されたら、例えば、抗原ＲＡＧＥに対して特異的な抗体がマウス血清中に検出されたら、マウスの脾臓を採集し、脾細胞を単離する。次いで、周知の技術によって、あらゆる適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０から得られる細胞）に脾細胞が融合される。ハイブリドーマは、限界希釈によって選択され、クローニングされる。次いで、ＲＡＧＥを結合することができる抗体を分泌する細胞に関して、本分野で公知の方法によって、ハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することによって、腹水（抗体の高いレベルを一般に含有する）を生成させ得る。別の実施形態において、抗体を産生する不死化されたハイブリドーマは免疫化された動物から調製され得る。免疫化後、動物を屠殺し、本分野において周知のように、脾臓Ｂ細胞を不死化された骨髄腫細胞に融合する。例えば、上記「Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ」を参照されたい。特定の実施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞株）。融合及び抗生物質選択後、ＲＡＧＥ若しくはその一部又はＲＡＧＥを発現する細胞を使用して、ハイブリドーマをスクリーニングする。特定の実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素連結免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、特にＥＬＩＳＡを用いて行われる。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／３７５０４に提供されている。
抗ＲＡＧＥ抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングし、以下でさらに論述されているように、強固なハイブリドーマ増殖、高い抗体産生及び望ましい抗体特性などの望ましい特徴に関してさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、同一遺伝子型の動物中、免疫系を欠如する動物（例えば、ヌードマウス）中においてインビボで、又は細胞培養中でインビトロで培養及び増殖させ得る。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は、当業者に周知である。
特定の実施形態において、ハイブリドーマは、上述されているように、マウスハイブリドーマである。別の特定の実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの非ヒト非マウス種中で産生される。別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒトの非分泌性骨髄腫が抗ＲＡＧＥ抗体を発現するヒト細胞と融合されているヒトハイブリドーマである。
特異的なエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作製され得る。例えば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を用いた、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断によって作製され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
３．３ＳＬＡＭを用いた抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体
本発明の別の態様において、組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０２５５１及び「Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３−７８４８」に記載されているような、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ；ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｔｈｏｄ）と本分野で称される手法を用いて、単一の単離されたリンパ球から作製される。この方法では、ビオチンなどのリンカーを用いて、抗原ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥのサブユニット又はこれらの断片がヒツジの赤血球に連結されており、ＲＡＧＥに対する特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために使用される抗原特異的な溶血斑アッセイを用いて、目的の抗体を分泌する単一の細胞（例えば、上記免疫化された動物の何れか１つに由来するリンパ球）がスクリーニングされる。目的の抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素−ＰＣＲによって、重及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡが細胞から救出され、次いで、これらの可変領域は、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物の宿主細胞中で、適切な定常領域（例えば、ヒト定常領域）の状況下で発現させることができる。次いで、インビボで選択されたリンパ球に由来する増幅された免疫グロブリン配列で形質移入された宿主細胞は、例えば、ＲＡＧＥに対する抗体を発現する細胞を単離するために、形質移入された細胞にパニングを行うことによって、インビトロでさらなる分析及び選択を受けることができる。さらに、増幅された免疫グロブリン配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１及びＰＣＴ公開ＷＯ００／５６７７２に記載されているようなインビトロアフィニティー成熟法のように、インビトロで操作することができる。
３．４トランスジェニック動物を使用する抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全部を含む非ヒト動物をＲＡＧＥ抗原で免疫化することによって作製される。特定の実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の巨大な断片を含み、マウス抗体産生を欠損している操作されたマウス系統であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスである。例えば、「Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１ （１９９４）」並びに米国特許第５，９１６，７７１号、５，９３９，５９８号、同第５，９８５，６１５号、同第５，９９８，２０９号、同第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号及び同第６，１３０，３６４号を参照されたい。１９９１年７月２５日に公開されたＷＯ９１／１０７４１、１９９４年２月３日に公開されたＷＯ９４／０２６０２、ともに１９９６年１０月３１日に公開されたＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５、１９９８年４月２３日に公開されたＷＯ９８／１６６５４、１９９８年６月１１日公開されたＷＯ９８／２４８９３、１９９８年１１月１２日に公開されたＷＯ９８／５０４３３、１９９９年９月１０日に公開されたＷＯ９９／４５０３１、１９９９年１０月２１日に公開されたＷＯ９９／５３０４９、２０００年２月２４日に公開されたＷＯ００／０９５６０及び２０００年６月２９日に公開されたＷＯ００／０３７５０４も参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全なヒト抗体の成人様のヒトレパートリーを産生し、抗原特異的なヒトｍＡｂを生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及びｘ軽鎖遺伝子座のメガ塩基サイズの生殖系列構成ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーの約８０％を含有する。「Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６ （１９９７）、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５ （１９９８）」（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
３．５組換え抗体ライブラリーを用いる抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ方法も使用することも可能であり、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリーがスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングのための方法は、本分野において周知であり、例えば、Ｌａｄｎｅｒ他の米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ他のＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ他のＰＣＴ公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ他のＰＣＴ公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ他のＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ他のＰＣＴ公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他のＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ他のＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ （１９９０） ３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ （１９９１） ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２、米国特許出願公開２００３０１８６３７４号及びＰＣＴ公開ＷＯ９７／２９１３１（これらの各々の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている方法を含む。
組換え抗体ライブラリーは、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥの一部で免疫化された対象から得られ得る。あるいは、組換え抗体ライブラリーは、ナイーブな対象（すなわち、ＲＡＧＥで免疫化されていない者）から得られ得る（ヒトＲＡＧＥで免疫化されていないヒト対象から得られたヒト抗体ライブラリーなど）。本発明の抗体は、ヒトＲＡＧＥを含むペプチドを用いて組換え抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、ＲＡＧＥを認識する抗体を選択することによって選択される。このようなスクリーニング及び選択を実施する方法は、前パラグラフ中の参考文献に記載されているように、本分野で周知である。特定のｋｏｆｆ速度定数でヒトＲＡＧＥから解離するものなど、ｈＲＡＧＥに対して特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、表面プラズモン共鳴の本分野で公知の方法を使用して、所望のｋｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のＩＣ５０を有するものなど、ｈＲＡＧＥに対して特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、ｈＲＡＧＥ活性の阻害を評価するための本分野で公知の標準的な方法を使用し得る。
一態様において、本発明は、ヒトＲＡＧＥを結合する単離された抗体又はその抗原結合部分に関する。特に、抗体は中和抗体である。様々な実施形態において、抗体は組換え抗体又はモノクローナル抗体である。
例えば、本発明の抗体は、本分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に、機能的抗体ドメインがディスプレイされる。特に、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために、このようなファージを使用することができる。目的の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉された抗原を用いて選択又は同定することができる。典型的には、これらの方法において使用されるファージは、Ｆａｂ、Ｆｖ又はファージ遺伝子ＩＩＩ若しくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の何れかに組換え的に融合された、ジスルフィド安定化されたＦｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０ （１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６ （１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８ （１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８ （１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０ （１９９４）；国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号；（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ヒト抗体又はあらゆる他の所望の抗原結合断片を含む完全な抗体を作製するために、ファージからの抗体コード領域を単離及び使用し、例えば、以下で詳しく記載されているように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、宿主細胞、酵母及び細菌などのあらゆる所望の宿主中で発現させることができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９ （１９９２）及びＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６−３４ （１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３ （１９８８）（前記参考文献の全体が、参照により組み込まれる。）に開示されているものなどの、本分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に産生するための技術も使用することができる。一本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８ （１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９ （１９９３）；及びＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０ （１９８８）に記載されているものが含まれる。
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングに代えて、巨大なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための本分野で公知の他の方法を本発明の二重特異性抗体の同定に適用することができる。別の発現系の１つの種類は、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓによるＰＣＴ公開ＷＯ９８／３１７００並びにＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．及びＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２２９７−１２３０２に記載されているように、組換え抗体ライブラリーがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現される発現系である。この系では、ｍＲＮＡとその３’末端にピューロマイシン（ペプチジルアクセプター抗生物質）を担持する合成ｍＲＮＡのインビトロでの翻訳によってｍＲＮＡがコードするペプチド又はタンパク質との間で、共有的融合物が作製される。従って、二重特異性抗原への抗体又はその一部の結合などの、コードされるペプチド又はタンパク質（例えば、抗体又はその一部）の特性に基づいて、特異的なｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から濃縮され得る。このようなライブラリーのスクリーニングから改修された抗体又はその一部をコードする核酸配列は、上述のような組換え手段によって（例えば、哺乳動物宿主細胞中で）発現させることができ、さらに、最初に選択された配列中に変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによる、又は上述のように、組換え抗体のインビトロでのアフィニティー成熟のための他の方法による、さらなる親和性成熟に供することができる。
別のアプローチにおいて、本発明の抗体は、本分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて作製することもできる。酵母ディスプレイ法では、酵母の細胞壁に抗体ドメインを係留し、酵母の表面上に抗体ドメインをディスプレイするためにするために遺伝学的方法が使用される。特に、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために、このような酵母を使用することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、参照により本明細書に組み込まれるＷｉｔｔｒｕｐ他の米国特許第６，６９９，６５８号に開示されているものが含まれる。
４．本発明の特定の組換えＲＡＧＥ抗体の作製
本発明の抗体は、本分野において公知の多数の技術の何れによっても作製され得る。例えば、宿主細胞からの発現、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞の何れの中でも、本発明の抗体を発現することは可能であるが、真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は、原核細胞に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を組み立てて、分泌する可能性がより大きいので、真核細胞中での抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞中での抗体の発現が最も好ましい。
本発明の組換え抗体を発現するための具体的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０に記載されており、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入されると、宿主細胞中で抗体の発現を可能とするのに十分な期間にわたって、又は、特に、宿主細胞がその中で増殖されている培地中への抗体の分泌を可能とするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から回収することが可能である。
Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子など、機能的抗体断片を作製するために、宿主細胞を使用することも可能である。上記手技に対する改変は、本発明の範囲に属することが理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖の何れかの機能的断片をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質移入することが望ましい場合があり得る。目的の抗原への結合に必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術も使用し得る。このような末端切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の抗体によって包含される。さらに、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖及び軽鎖が、目的の抗原以外の抗原に対して特異的である二機能性抗体は、標準的な化学架橋法によって、本発明の抗体を第二の抗体へ架橋することによって作製し得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現用の特定の系では、リン酸カルシウムによって媒介された形質移入によって、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内において、遺伝子の転写の高いレベルを誘導するために、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御要素へそれぞれ作用可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を用いて、ベクターで形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能とするために培養され、完全な状態の抗体が培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技術が使用される。さらに、本発明は、本発明の組換え抗体タンパク質が合成されるまで、適切な培地中で、本発明の宿主細胞を培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。この方法は、培地から組換え抗体を単離することをさらに含むことが可能である。
４．１抗ＲＡＧＥ抗体
表４は、本発明の特定の抗ｈＲＡＧＥ抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列のリストである。
Figure 2016104740
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先述されている単離された抗ＲＡＧＥ抗体ＣＤＲ配列は、ＲＡＧＥ結合タンパク質の新規ファミリーを確立し、本発明に従って単離される。ｈＲＡＧＥに関して特定のＲＡＧＥ結合及び／又は中和活性を有する本発明のＣＤＲを作製するために及びＣＤＲを選択するために、本明細書に具体的に記載されているものなどの（但し、これらに限定されない。）、本発明の結合タンパク質を作製し、結合タンパク質のＲＡＧＥ結合及び／又は中和特性を評価するための本分野において公知の標準的な方法が使用され得る。
４．２抗ＲＡＧＥキメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を作製するための方法が本分野において公知である。例えば、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２ （１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４ （１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８９） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び同第４，８１６，３９７号（参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる。）」を参照されたい。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子から得られる遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子から得られる遺伝子と一緒にスプライシングさせることによって「キメラ抗体」を作製するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４、これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を使用することができる。
一実施形態において、本発明のキメラ抗体は、本明細書に記載されているマウスモノクローナル抗ヒトＲＡＧＥ抗体の重鎖定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域で置換することによって作製される。
４．３抗ＲＡＧＥＣＤＲ移植された抗体
本発明のＣＤＲ移植された抗体は、ヒト抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上が、本発明の非ヒト（例えば、マウス）抗体のＣＤＲで置換されている。何れのヒト抗体由来のフレームワーク配列も、ＣＤＲ移植のためのテンプレートとしての役割を果たし得る。しかしながら、このようなフレームワーク上への直鎖置換は、抗原への結合親和性の幾らかの喪失をしばしばもたらす。ヒト抗体が元のマウス抗体に対してより相同的であるほど、マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせることによって、親和性を低下させ得るＣＤＲ中のゆがみを導入する可能性がより低くなる。従って、ＣＤＲ以外のマウス可変フレームワークを置換するために選択されたヒト可変フレームワークはマウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％の配列同一性を有することが好ましい。ＣＤＲ以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも７０％の配列同一性を有することがより好ましい。ＣＤＲ以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも７５％の配列同一性を有することがさらに好ましい。ＣＤＲ以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも８０％の配列同一性を有することが最も好ましい。ＣＤＲ移植された抗体を作製する方法は、本分野において公知である（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；米国特許第５，２２５，５３９号）。
特定の実施形態において、本発明は、表５に記載されているようなＶＨ及び／又はＶＬ鎖を有するＣＤＲ移植された抗体を提供する。
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ｍＡｂ１１Ｅ６由来のＣＤＲ配列は、太字で表記されている。対応する配列番号を表記することによって、特定のフレームワーク配列（ＦＲ１からＦＲ４）に対する参照が為されている（表２及び３も参照）。
４．４抗ＲＡＧＥヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原を結合する非ヒト種抗体から得られた抗体分子である。公知のヒトＩｇ配列が開示されている。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍ−ｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．Ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ ｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）（それぞれの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。本分野において公知であるように、このような輸入される配列は、免疫原性を低下させ、又は結合親和性、オン速度、オフ速度、結合力、特異性、半減期又は他のあらゆる適切な特徴を低下させ、増強し、若しくは修飾するために使用することができる。ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる（特に、改善させる）ために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、本分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合のために重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル化及び特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ （１９８８）参照、これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。三次元の免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造を図解し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析）が可能になる。このようにして、標的抗原に対する増加した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサス及び輸入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接且つ最も大幅に関与している。抗体は、「Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ （１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ （１９８８）），Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１ （１９８７），Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５ （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３ （１９９３），Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８ （１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４ （１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３ （１９９４）；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号；同第４，８１６，５６７号（その中に引用されている参考文献を含み、参照により、それぞれの全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなどの（但し、これらに限定されない。）、本分野において公知の様々な技術を用いてヒト化することができる。
５．本発明の抗体のさらなる実施形態
５．１融合抗体及びイムノアドヘシン
本願は、別のポリペプチドに連結された本願のＲＡＧＥ抗体の全部又は一部を含む、作製され得る融合抗体又はイムノアドヘシンも記載する。幾つかの実施形態において、ＲＡＧＥ抗体の可変領域のみがポリペプチドに連結される。他の実施形態において、本願のＲＡＧＥ抗体のＶＨドメインは第一のポリペプチドに連結されるのに対して、抗体のＶＬドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに相互作用して抗体結合部位を形成するのを許容する様式で、第一のポリペプチドと会合する第二のポリペプチドに連結されている。他の実施形態において、ＶＨドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに相互作用するのを許容するリンカーによって、ＶＬドメインから隔てられている（以下の一本鎖抗体を参照）。ＶＨ−リンカーＶＬ抗体は、次いで、目的のポリペプチドへ連結される。融合抗体は、ＲＡＧＥを発現する細胞又は組織へポリペプチドを誘導するために有用である。目的のポリペプチドは、トキシンなどの治療剤であり得、又は西洋ワサビペルオキシダーゼなどの容易に可視化され得る酵素などの診断剤であり得る。さらに、２つ（又はそれ以上の）一本鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作製することができる。単一のポリペプチド鎖上に二価若しくは多価の抗体を作製することを望む場合に、又は二特異的抗体を作製することを望む場合に、これは有用である。
一実施形態は、本願の抗体又は抗体部分が誘導化され又は別の機能的分子（例えば、別のペプチド又はタンパク質）に連結されている標識された結合タンパク質を提供する。例えば、本願の標識された結合タンパク質は、核酸、別の抗体（例えば、二特異的抗体又はダイアボディ）、検出可能な因子、細胞毒性剤、薬剤及び／又は別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との抗体若しくは抗体部分の会合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチドなどの１つ又はそれ以上の他の分子実体へ、（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有的会合又はその他による）本願の抗体又は抗体部分を機能的に連結することによって誘導され得る。
本願の抗体又は抗体部分を誘導化し得る有用な検出可能な因子には、蛍光性化合物が含まれる。典型的な蛍光性の検出可能な因子には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素でも誘導化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導化される場合、検出可能な反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を転化することによって検出される。例えば、検出可能な因子、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素とジアミノベンジジンの添加が、検出可能な発色された反応産物をもたらす。抗体は、核酸、ビオチンを用いて誘導化することもでき、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的な測定を通じて検出され得る。
５．２一本鎖抗体
本願は、本発明の免疫原性ＲＡＧＥを結合する一本鎖（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖを作製するために、ＶＨ及びＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現され、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーによって連結され得るように、ＶＨ及びＶをコードするＤＮＡは、柔軟なリンカーをコードする（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）をコードする）ＤＮＡへ作用可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，３０Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４参照）。単一のＶＨ及びＶＬのみが使用されれば、一本鎖抗体は一価であり得、２つのＶＨ及びＶＬが使用されれば、二価であり得、又は３以上のＶＨ及びＶＬが使用されれば、多価であり得る。リンカーを介して結合された前記ｓｃＦｖ断片の２つは、「ダイアボディ」と称され、この形態も本発明によって包含される。
５．３二特異的抗体
本願は、１つの特異性が本願の免疫原性ＲＡＧＥポリペプチドに対する、二特異的抗体又はその抗原結合断片をさらに含む。例えば、１つの結合ドメインを通じて本発明の免疫原性ＲＡＧＥポリペプチドに及び第二の結合ドメインを通じて第二の分子に特異的に結合する二特異的抗体を作製することができる。さらに、本発明の免疫原性ポリペプチドに及びミエリンによって媒介される増殖錐体の崩壊の弱化並びに神経突起の突出及び発芽の阻害と関連する別の分子に特異的に結合する２以上のＶＨ及びＶＬを含有する一本鎖抗体が作製され得る。このような二特異的抗体は、周知の技術、例えば、「Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：７２−８１（１９９４）及びＷｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，２０（上記）」を用いて作製することができる。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体由来の可変領域の１つ又はそれ以上を用いて、二特異的抗体が調製される。別の実施形態において、二特異的抗体は、前記抗体からの１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域を用いて調製される。
５．４誘導化された及び標識された抗体
本願の抗体又抗原結合断片は、誘導化され又は別の分子（例えば、ペプチド又はタンパク質）に連結され得る。一般に、抗体又は抗原結合断片は、本発明の免疫原性ポリペプチドへの結合が誘導化又は標識によって悪影響を受けないように誘導化される。
例えば、本願の抗体又は抗体部分は、別の抗体（例えば、二特異的抗体又はダイアボディ）、検出試薬、細胞毒性剤、薬剤及び／又は別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との抗体若しくは抗原結合断片の会合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチドなどの１つ又はそれ以上の他の分子実体へ、（化学的カップリング、遺伝的融合、非共有的会合又はその他によって）機能的に連結することによって誘導され得る。さらに、抗体又はその抗原結合部分は、１つ又はそれ以上の他又は異なるタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有的会合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦＶ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）及び二価の、ビオチン化されたｓｃＦＶ分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３１：１０４７−１０５８）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ、完全な抗体のパパイン又はペプシン消化などの慣用技術を用いて、完全な抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて取得することができる。
誘導化された抗体は、（例えば、二特異的抗体を作製するために、同じ種類の又は異なる種類の）２つ又はそれ以上の抗体を架橋することによって作製され得る。適切な架橋剤には、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって隔てられた２つの異なる反応性の基を有するヘテロ二官能性又はホモ二官能性（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）であるものが含まれる。このようなリンカーは、「Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１」から入手可能である。
誘導化された抗体は、標識された抗体でもあり得る。例えば、本発明の抗体又は抗体部分を誘導化し得る検出剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などの蛍光性化合物である。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出のために有用である酵素でも標識され得る。検出可能な酵素で誘導化される実施形態において、抗体は検出可能な反応産物を産生するために酵素を使用するさらなる試薬を添加することによって検出される。例えば、過酸化水素及びジアミノベンジジンとともに西洋ワサビペルオキシダーゼ。抗体は、ビオチンを用いて標識することもでき、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的な測定を通じて検出され得る。抗体は、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ：タグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープでも標識され得る。ＲＡＧＥ抗体又はその抗原断片は、放射性標識されたアミノ酸で標識され得る。診断及び治療の両目的のために、放射線標識を使用し得る。放射性標識されたＲＡＧＥ抗体は、診断的に、例えば、対象中のＲＡＧＥ受容体レベルを測定するために使用され得る。さらに、放射性標識されたＲＡＧＥ抗体は脊髄損傷を治療するために治療的に使用され得る。
ポリペプチドに対する標識の例には、以下の放射性同位体又は放射性核種が含まれるが、これらに限定されない。１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ。ＲＡＧＥ抗体又はその抗原断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル若しくはエチル基又は炭水化物基などの化学基でも誘導化され得る。これらの基は、抗体の生物学的な特徴を改善するために、例えば、血清半減期を増加させるために又は組織結合を増加させるために有用であり得る。また、ポリペプチド用の標識には、核酸、例えば、ＰＣＲ若しくは強化遺伝子発現による検出のためのＤＮＡ又はＲＡＧＥを有する細胞若しくは組織中での遺伝子発現を抑制するためのｓｉＲＮＡが含まれ得る。
ＲＡＧＥ抗体のクラス及びサブクラスは、本分野において公知のあらゆる法によって測定され得る。一般に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに対して特異的である抗体を用いて測定され得る。このような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及び他の技術によって測定することができる。あるいは、クラス及びサブクラスは、抗体の重及び／又は軽鎖の定常ドメインの全部又は一部を配列決定し、そのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラスの公知のアミノ酸配列と比較し、抗体のクラス及びサブクラスを決定することによって決定され得る。
５．５二重可変ドメイン免疫グロブリン
本明細書において使用される二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質又は免疫グロブリンは、２つ又はそれ以上の抗原結合部位を含み、四価又は多価の結合タンパク質（例えば、二価及び四価）である結合タンパク質である。本明細書において、「多価の結合タンパク質」という用語は、２つ又はそれ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を表すために使用される。多価の結合タンパク質は、２つ又はそれ以上の抗原結合部位を有するように特に改変され、一般に、天然には存在する抗体ではない。「多重特異的結合タンパク質」という用語は、２つ又はそれ以上の関連する又は無関係な標的を結合することができる結合タンパク質を表す。このようなＤＶＤは、一重特異的（すなわち、１つの抗原を結合することが可能である。）又は多重特異的（すなわち、２つ又はそれ以上の抗原を結合することが可能である。）であり得る。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤＩｇと称される。ＤＶＤＩｇのそれぞれの半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド及び軽鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、抗原結合部位当り合計６つのＣＤＲが抗原結合に関与する。ＤＶＤ結合タンパク質及びＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許出願１１／５０７，０５０号に開示されており、参照により、本明細書に組み込まれる。本発明は、ＲＡＧＥを結合することができる結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質を含むことが意図される。特に、ＤＶＤ結合タンパク質は、ＲＡＧＥ及び第二の標的を結合することができる。第二の標的は、抗炎症性ＭＡＢ活性（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦα／β、ＩＦＮ−β、γ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＰＦ−４、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、ＮＡＰ−２、β−ＴＧ、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ２／３、ＲＡＮＴＥＳ、リンフォタクチン）、輸送を媒介するタンパク質（インシュリン受容体、トランスフェリン受容体、トロンビン受容体、レプチン受容体、ＬＤＬ受容体）、他の神経変性性ＭＡＢ（ＮｇＲ、Ｌｉｎｇｏ、ｐ７５、ＣＳＰＧ（例えば、ＮＧ−２、ニューロカン、ブレビカン、ベルシカン、アグレカン）、ヒアルロン酸、ｍＡＧ、テナシン、ＮＩ−３５、ＮＩ−２５０、ＩＭＰ、ペルレカン、ニューロカン、ホスファカン、ｎｏｇｏ−Ａ、ＯＭＧＰ、Ｓｅｍａ４Ｄ、Ｓｅｍａ３Ａ、エフリンＢ３、エフリンＡ２、エフリンＡ５、ＭＡＧ、ＥｐｈＡ４、プレキシンＢ１、ＴＲＯＹ、ｗｎｔｓ、ｒｙｋ ｒｅｃ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、神経保護的ＭＡＢ活性（ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｓｅｍａ３）、抗アミロイドβＭＡＢ（例えば、ｍ２６６、３Ｄ６（バピノイズマブ）、抗グロブロマーＭＡＢ７Ｃ６）、中枢神経系に位置する受容体及び輸送体（セロトニン受容体、ドーパミン受容体、ＤＡＴ、Ａｓｃ−１、ＧＩｙＴ１）からなる群から選択される。
５．６二重特異的抗体
本願は、「二重特異的抗体」技術も記載する。二重特異的抗体は、アゴニスト、アンタゴニスト又は様々な組み合わせでの両方の役割を果たし得る。二重特異的抗体は、ＷＯ２００８０８２６５１に例示されているように、ＶＨ鎖が第一の抗原に結合し、及びＶＬ鎖が別の抗原に結合する抗体である。
５．７結晶化された抗体
本願の別の実施形態は、結晶化された結合タンパク質を提供する。本明細書において使用される「結晶化された」用語は、結晶の形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を表す。結晶は、物質の固体状態の１つの形態であり、非晶質の固体状態又は液晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）又は分子集合物（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復する３次元配列から構成される。これらの三次元配列は、本分野においてよく理解されている特定の数学的関係に従って配置されている。結晶中で繰り返される基本的な単位又は構築ブロックは、非対称単位と呼ばれる。所定の十分に確定された結晶学的な対称性に合致する配置での非対称性単位の反復は、結晶の「単位セル」を与える。三つの次元全てでの規則的な平行移動による単位セルの反復は、結晶を与える。「Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．２０１−１６，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９９）」を参照されたい。
特に、本願は、本明細書に開示されている完全なＲＡＧＥ抗体及びその断片の結晶並びにこのような結晶を含む製剤及び組成物を記載する。一実施形態において、結晶化された結合タンパク質は、前記結合タンパク質の可溶性対応物より大きなインビボ半減期を有する。別の実施形態において、結合タンパク質は結晶化後に生物学的活性を保持する。
本発明の結晶化された結合タンパク質は、本分野で公知の方法に従って及びＷＯ２０７２６３６に開示されているように（参照によって、本明細書に組み込まれる。）作製され得る。
５．８グリコシル化された抗体
本発明の別の実施形態は、抗体又はその抗原結合部分が１つ又はそれ以上の炭水化物残基を含む、グリコシル化された結合タンパク質を提供する。新生のインビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセッシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基が酵素的に付加され得る（グリコシル化として知られるプロセス）。共有結合されたオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化されたタンパク質又は糖タンパク質として知られる。抗体は、Ｆｃドメイン中に１つ又はそれ以上の炭水化物残基及び可変ドメインを有する糖タンパク質である。Ｆｃドメイン中の炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に対して重要な効果を有しており、抗体の抗原結合又は半減期に対して最小限の影響を有する（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１ （２００５），ｐｐ．１１−１６）。これに対して、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に対して影響を有し得る。可変ドメイン中のグリコシル化は、おそらく、立体的な妨害のために、抗体結合親和性に対して負の効果を有し得（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３） ３０：１３６１−１３６７）又は抗原に対する増加した親和性をもたらし得る（Ｗａｌｌｉｃｋ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６８：１０９９−１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９１） １０：２７１７ ２７２３）。
本発明の１つの態様は、結合タンパク質のＯ−結合型又はＮ−結合型グリコシル化部位が変異されているグリコシル化部位変異体を作製することに向けられる。当業者は、標準的な周知の技術を用いて、このような変異体を作製することができる。生物学的活性を保持するが、増加又は減少した結合活性を有するグリコシル化部位変異体は、本発明の別の目的である。
さらに別の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合部分のグリコシル化は修飾される。例えば、脱グリコシル化された抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠如する。）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変化させることができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ又はそれ以上の部位を変化させることによって達成することができる。例えば、１つ又はそれ以上の可変領域のグリコシル化部位の除去をもたらし、これにより、その部位のグリコシル化を除去する１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を施すことができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このようなアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３０１６４６６Ａ２及び米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号（これらの各々全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）にさらに詳しく記載されている。
これに加えて又はこれに代えて、フコース残基の低下した量を有する低フコシル化抗体又は増加した二分岐ＧｌｃＮＡｃ構造を有する抗体など、グリコシル化の変化した種類を有する本発明の修飾された抗体を作製することができる。このような変化されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが示されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、変化されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変化されたグリコシル化機構を有する細胞は本分野において記載されており、その中で、本発明の組換え抗体を発現させることによって、変化されたグリコシル化を有する抗体を産生させるための宿主細胞として使用することができる。例えば、「Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１」並びに欧州特許番号：ＥＰ１，１７６，１９５；ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５；ＷＯ９９／５４３４２８０（各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
タンパク質のグリコシル化は、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びその中でタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシル転移酵素及びグリコシダーゼ）を産生し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し得る。このような要素のために、タンパク質グリコシル化のパターン及びグリコシル残基の組成は、その中で特定のタンパク質が発現される宿主系に応じて異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。特に、グリコシル化された結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようにグリコシル残基を含む。
異なるタンパク質グリコシル化は異なるタンパク質特性をもたらし得ることが当業者に公知である。例えば、酵母などの微生物宿主中で産生され、酵母の内在的経路を用いてグリコシル化された治療用タンパク質の効力は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞中で発現された同じタンパク質の効力と比較して低下され得る。このような糖タンパク質は、ヒトの中でも免疫原性であり得、投与後に低下したインビボ半減期を示し得る。ヒト及び他の動物中の特異的な受容体は、特異的なグリコシル化残基を認識し、血流からのタンパク質の迅速な排除を促進し得る。他の有害な効果には、タンパク質の折り畳み、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質若しくは因子による認識、抗原性又はアレルギー性の変化が含まれ得る。従って、従事者は、グリコシル化の特異的な組成及びパターン、例えば、ヒト細胞中で又は予定される対象動物の種特異的な細胞中で産生されるものと同一の又は少なくとも類似のグリコシル化の組成及びパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。
宿主細胞のものと異なるグリコシル化されたタンパク質を発現させることは、異種のグリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝的に修飾することによって達成され得る。本分野において公知の技術を用いて、従事者は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を作製し得る。例えば、酵母系統は、これらの酵母系統中で産生されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）は動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を示すように、天然に存在しないグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に修飾されている（米国特許出願２００４００１８５９０及び２００２０１３７１３４及びＰＣＴ公開ＷＯ２００５１００５８４Ａ２）。
さらに、ライブラリーの一員の宿主細胞が変形物グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に操作された宿主細胞のライブラリーを用いて、目的のタンパク質を発現させ得ることが当業者によって理解される。次いで、従事者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択及び単離し得る。特に、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、改善された又は変化された生物学的特性を示す。
５．９抗イディオタイプ抗体
結合タンパク質に加えて、本発明は、本発明のこのような結合タンパク質に対して特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体にも向けられる。抗Ｉｄ抗体は、別の抗体の抗原結合領域と一般に会合される特有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、結合タンパク質又はそのＣＤＲ含有領域で動物を免疫化することによって調製することができる。免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識及び応答し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生するさらに別の動物中での免疫応答を誘導するための「免疫原」としても使用され得る。
６．抗体の使用
ヒトＲＡＧＥに結合する能力に鑑みれば、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学などの慣用のイムノアッセイを用いて、ヒトＲＡＧＥ（例えば、血清又は血漿などの生物学的試料中の）ヒトＲＡＧＥを検出するために、本願の中和抗体又はその一部を使用することができる。本願は、本発明の抗体又は抗体部分と生物学的試料を接触させること、及びヒトＲＡＧＥに結合された抗体（又は抗体部分）又は結合していない抗体（又は抗体部分）の何れかを検出して、これにより、生物学的試料中のヒトＲＡＧＥを検出することを含む、生物学的試料中のヒトＲＡＧＥを検出する方法を提供する。抗体は、結合された又は結合されていない抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接又は間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例には、ルミノールが含まれ、及び適切な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍが含まれる。
本願の抗体及び抗体部分は、特に、インビトロ及びインビボの両方で、ヒトＲＡＧＥ活性を中和することができる。従って、本発明のこのような抗体及び抗体部分は、ＲＡＧＥのそのリガンドへの結合を阻害するために、従って、生じる活性を中和するために使用することができる。
別の実施形態において、本願は、有利には、ＲＡＧＥによって生じた活性が有害である疾病又は疾患に罹患している対象から対象中のＲＡＧＥ活性を低下させる方法を提供する。本願は、本願のモノクローナル抗体の使用を通じて、Ａβ−グロブロマーのようなＲＡＧＥのリガンドの少なくとも１つにＲＡＧＥが結合するのを妨げることによって、このような疾病又は疾患に罹患する対象中のＲＡＧＥ活性を低下させる方法を提供する。本発明の抗体、特に、本明細書中に開示されているヒト化抗体は、治療目的のためにヒト対象に投与することができる。さらに、本願の抗体は、獣医学的目的のために又はヒト疾病の動物モデルとして、前記抗体と結合することができるＲＡＧＥを発現しているヒト以外の哺乳動物へ投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効果（例えば、投薬量の検査及び投与の時間経過）を評価するために有用であり得る。
本明細書において、「ＲＡＧＥ活性が有害である疾患」という用語には、当該疾患に罹患している対象中にＲＡＧＥ若しくはその生じた活性が存在することが、当該疾患の病態生理の原因であり若しくは原因であると疑われている疾病及びその他の疾患又は当該疾患の悪化に寄与する要因であり若しくは要因であると疑われている疾病及びその他の疾患を含むものとする。従って、ＲＡＧＥ活性が有害である疾患は、ＲＡＧＥ活性の低下が疾患の症候及び／又は進行を緩和すると予想される疾患である。本発明の抗体で治療することができる疾患の非限定的な例には、本発明の抗体の医薬組成物に関して、以下の説で論述されている疾患が含まれる。
ＲＡＧＥは、筋萎縮性側索硬化症、腕神経叢傷害、脳傷害（外傷性脳傷害を含む。）、脳性麻痺、フリードリッヒ失調症、ギラン・バレー、白質委縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄傷害、脊髄筋肉萎縮症、脊髄腫瘍、卒中、横断性脊髄炎、認知症、老年性認知症、軽度の認知障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、晩発性運動障害、運動亢進症、躁病、パーキンソン病、スチール・リチャード症候群、ダウン症候群、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う脳出血Ｉ、脳炎症、フリードリッヒ失調症、急性精神錯乱、筋萎縮性側索硬化症、緑内障、アルツハイマー病、糖尿病性腎障害、敗血症、関節リウマチ及び関連炎症性疾患を含む群から選択される神経学的疾患を含む様々な疾病を伴う病変において重要な役割を果たすことが認識されている。糖尿病及び糖尿病性網膜症、腎障害、血管合併症のような糖尿病の結果として生じる合併症；アテローム性動脈硬化合併症、肺繊維症、癌、特に、悪性黒色腫、他のアミロイドーシス。（例えば、以下の参考文献を参照されたい。アミロイドーシス、癌、関節炎、クローン病、慢性及び急性炎症性疾患：Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡＭ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００１ Ｏｃｔ；１０８（７）：９４９−５５．；心血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症：Ｙａｎ ＳＤ ｅｔ ａｌ：Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７ Ｍａｒ；２７（３）：１７９−８１；プリオン関連疾患：Ｓａｓａｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２００２ Ｊｕｎ ２８；３２６（２）：１１７−２０；血管炎、腎障害、網膜傷害及び神経障害：Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｖ ＰＪ．：Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００２；５０：３７−５７；アルツハイマー病：Ｗｅｌｄｏｎ ＤＴ ｅｔ ａｌ：Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ．１９９７ Ｓｅｐ；５２ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３−６；Ｙａｎ ＳＤ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０００ Ｊｕｌ ２６；１５０２（１）：１４５−５７；関節リウマチ、骨関節炎：Ｄｒｉｎｄａ Ｓ ｅｔ ａｌ：Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ．２００４ Ｍａｒ ２６；腸疾患：Ｆｏｅｌｌ Ｄ ｅｔ ａｌ：Ｇｕｔ．２００３ Ｊｕｎ；５２（６）：８４７−５３；多発性硬化症：Ｙａｎ ＳＳ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３ Ｍａｒ；９（３）：２８７−９３；乾癬：Ｆｏｅｌｌ Ｄ ｅｔ ａｌ：Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ （Ｏｘｆｏｒｄ）．２００３ Ｎｏｖ；４２（１１）：１３８３−９：ループス：Ｔａｎｊｉ Ｎ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０００ Ｓｅｐ；１１（９）：１６５６−６６；一般的な自己免疫疾患、敗血症：Ｌｉｌｉｅｎｓｉｅｋ Ｂ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４ Ｊｕｎ；１１３（１１）：１６４１−５０；動脈硬化症及び再狭窄：Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡＭ ｅｔ ａｌ：Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９９ Ｍａｒ １９；８４（５）：４８９−９７）。
また、先述されているように、ＤＶＤ免疫グロブリン又は上に記載されている対の何れか１つとの間での二重特異的抗体を使用し得る。上に記載されているようにこのような抗体調製物は、このような疾病の治療のために有用であり得る。
本願の抗体は、細胞内標的タンパク質の標的誘導を含めるために、膜貫通転移を可能にするペプチドと組み合わせることもできる。このようなペプチド配列には、ｔａｔ、アンテナペディア、ポリａｒｇ、幾つかの抗微生物ペプチドが含まれ得るが、これらに限定されない。このようなペプチドは、細胞の形質膜などの膜を通じて、血液脳関門、腸粘膜、髄膜及びその他などの上皮及び内皮の膜を通じても転移させ得る。
本願の抗体又は抗体部分は、前パラグラフ中に論述されているようなＲＡＧＥ活性が関与している疾患の治療において有用な１つ又はそれ以上のさらなる小分子治療剤とともに投与することもできる。本願の抗体又はその抗原結合部分は、単独で、又は追加の因子、例えば治療剤と組み合わせて使用することが可能であり、前記追加の因子は、その意図される目的に対して、当業者によって選択されることを理解すべきである。例えば、追加の因子は、本発明の抗体によって治療されている疾病又は症状を治療するのに有用であると本分野で認識されている治療剤であり得る。追加の因子は、治療用組成物に有益な属性を付与する因子、例えば、組成物の粘度に影響を及ぼす因子とすることも可能である。
７．医薬組成物
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合部分及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物も提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、疾患の診断、検出若しくはモニターにおいて、疾病又は１つ若しくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理若しくは軽減において、及び／又は研究において（但し、これらに限定されない。）使用される。特定の実施形態において、組成物は本発明の１つ又はそれ以上の抗体を含む。別の抗体において、医薬組成物は、本発明の１つ又はそれ以上の抗体及びＲＡＧＥ活性が有害である疾患を治療するための本発明の抗体以外の１つ又はそれ以上の予防又は治療剤を含む。特に、疾患又は１つ若しくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理又は軽減のために有用であることが知られた予防若しくは治療剤、又は疾患又は１つ若しくはそれ以上のその症候の予防、治療、管理又は軽減において使用されてきた若しくは現在使用されている予防若しくは治療剤。これらの実施形態に従えば、組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
本発明の抗体及び抗体部分は、対象に投与するのに適した医薬組成物中に取り込ませることが可能である。典型的には、医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分と及び医薬として許容される担体とを含む。本明細書において使用される「医薬として許容される担体」には、生理的に適合性がある、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬として許容される担体の例には、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ又はそれ以上及びこれらの組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マニトール、ソルビトールなどの多価アルコール又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。医薬として許容される担体は、抗体又は抗体部分の保存寿命又は有効性を増大する、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの補助物質の微量をさらに含み得る。
様々な送達系が公知であり、本発明の１つ若しくはそれ以上の抗体又は本発明の１つ若しくはそれ以上の抗体と疾患若しくは１つ若しくはそれ以上のその症候を予防し、管理し、治療し、若しくは軽減するのに有用な予防剤若しくは治療剤の組み合わせを投与するために使用することができる（例えば、リポソーム中へのカプセル封入、微粒子、ミクロカプセル、抗体又は抗体断片を発現させることができる組換え細胞、受容体によって媒介されるエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２ （１９８７）参照）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築など）。本発明の予防又は治療剤を投与する方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば、鼻内及び経口経路）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、例えば、吸入器又は噴霧器及びエアロゾル化剤を有する製剤の使用によって、経肺投与を使用することができる。例えば、米国特許６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらの各々は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。一実施形態において、本発明の抗体、組み合わせ療法又は本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ ＡＩＲ（Ｒ）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を用いて投与される。特定の実施形態において、本発明の予防又は治療剤は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、経肺又は皮下投与される。予防又は治療剤は、あらゆる都合のよい経路によって、例えば、注入又は大量瞬時注射によって、上皮又は粘膜皮下裏打ち（例えば、経口粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通じた吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な因子と一緒に投与され得る。投与は、全身性又は局所であり得る。
特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に本発明の予防又は治療剤を投与することが望ましい場合があり得る。これは、例えば、限定することなく、局所的な注入によって、注射によって、又はインプラント（インプラントは、サイラスティック膜、ポリマー、繊維状マトリックス（例えば、Ｔｉｓｓｅｌ（Ｒ））又はコラーゲンマトリックスなどの膜及びマトリックスを含む多孔性又は非多孔性材料である。）によって達成され得る。一実施形態において、疾患又はその症候を予防し、治療し、管理し、及び／又は軽減するために、本発明のアンタゴニスト１つ又はそれ以上の抗体の有効量が罹患領域へ局所的に投与される。別の実施形態において、疾患又はその１つ若しくはそれ以上の症候を予防し、治療し、管理し、及び／又は軽減するために、本発明の１つ又はそれ以上の抗体の有効量が、本発明の抗体以外の１つ又はそれ以上の治療薬の有効量（例えば、１つ又はそれ以上の予防又は治療剤）と組み合わせて、罹患領域へ局所的に投与される。
別の実施形態において、予防又は治療剤は、調節された放出又は徐放系で送達され得る。一実施形態において、調節された放出又は徐放を達成するために、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態において、本発明の治療薬の調節された放出又は徐放を達成するために、ポリマー性材料を使用することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ （ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；同第５，９８９，４６３号；同第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；及びＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３も参照されたい。）。徐放製剤中で使用されるポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、徐放製剤中で使用されるポリマーは不活性であり、ろ過可能な不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、及び生物分解性である。さらに別の実施形態において、調節された放出又は徐放系は、予防的又は治療的標的に近接して配置することができ、従って、全身用量の一部のみが必要とされ得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８ （１９８４）参照）。
徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）による概説に論述されている。本発明の１つ又はそれ以上の治療剤を含む徐放製剤を作製するために、当業者に公知のあらゆる技術を使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，“Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ，”Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９−１８９，Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｎｇ− Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５０：３７２−３９７，Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４及びＬａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，“Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
本発明の組成物が予防又は治療剤をコードする核酸である特定の実施形態において、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接的な注射によって、又は微粒子照射の使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは形質移入因子での被覆によって、又は核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに核酸を連結して投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８参照）、細胞内になるように核酸を投与することによって、そのコードされる予防又は治療剤の発現を促進するために、核酸をインビボで投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えによる発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませることができる。
本発明の医薬組成物は、その予定される投与経路と適合的であるように調合される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜及び直腸投与が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内又は局所投与に適合された医薬組成物として、定型的な手法に従って調合される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、注射部位での傷みを和らげるために、可溶化剤及びリグノカイン（ｌｉｇｎｏｃａｍｎｅ）などの局所麻酔薬も含み得る。
本発明の組成物が局所的に投与されるべき場合には、組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態又は当業者に周知の他の形態で調合することができる。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）」を参照されたい。噴霧不可能な局所的剤形に対して、局所適用に適合的であり、水より特に大きな動的粘度を有する担体又は１つ若しくはそれ以上の賦形剤を含む粘性ないし半固体又は固体形態が典型的に使用される。適切な製剤には、例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を与えるために、所望であれば、滅菌された又は補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液又は塩）と混合された溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な局所的剤形には、特に固体又は液体不活性担体と組み合わされた活性成分が加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体状噴射剤）との混合中に又は搾り出せる瓶中に梱包されている噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれる。所望であれば、加湿剤又は保湿剤も、医薬組成物及び剤形に添加することができる。このような追加成分の例は、本分野において周知である。
本発明の方法が組成物の鼻内投与を含む場合、組成物は、エアロゾル形態、スプレー、ミスト又は点鼻薬の形態で調合することができる。特に、本発明に従って使用するための予防又は治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体）を用いて、加圧されたパック又は噴霧器からエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達することができる。加圧されたエアロゾルの場合、計量された量を送達するためにバルブを付与することによって、投薬量単位が測定され得る。化合物の粉末混合物及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基材を含有する、吸入器又は吸引器において使用するための（例えば、ゼラチンから構成された）カプセル及びカートリッジを調合し得る。
本発明の方法が経口投与を含む場合、組成物は、錠剤、カプセル、オブラート、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で、経口的に調合することができる。錠剤又はカプセルは、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、イモデンプン又はグリコール酸デンプンナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬として許容される賦形剤とともに、慣用の手段によって調製することができる。錠剤は、本分野で周知の方法によって被覆され得る。経口投与用の液体調製物は、溶液、シロップ若しくは懸濁液の形態を採ることができ（但し、これらに限定されない。）、又は使用前に、水若しくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥産物として与えることができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコール又は分画植物油）；及び防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸メチル又はプロピル）などの医薬として許容される添加物とともに、慣用の手段によって調製され得る。調製物は、緩衝液の塩、着香剤、着色剤及び甘味剤も適宜含有し得る。経口投与用の調製物は、予防又は治療剤の遅い放出、調節された放出又は徐放のために適切に調合され得る。
本発明の方法は、例えば、吸入器又は噴霧器の使用による、エアロゾル化剤とともに調合された組成物の経肺投与を含み得る。例えば、米国特許６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらの各々は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。特定の実施形態において、本発明の抗体、組み合わせ療法及び／又は本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ ＡＩＲ（Ｒ）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を用いて投与される。
本発明の方法は、注射による（例えば、大量瞬時注射又は継続的な注入による）、非経口投与のために調合された組成物の投与を含み得る。注射用製剤は、添加された防腐剤とともに、（例えば、アンプル又は複数投薬容器中の）単位剤形で与えることができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンのような形態を採ることができ、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない無菌の水）で構成するための粉末形態であり得る。本発明の方法は、デポ調製物として調合された組成物の投与をさらに含み得る。このような長期作用製剤は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）によって又は筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、組成物は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂とともに、又は僅かに可溶性の誘導体として（例えば、僅かに可溶性の塩として）調合され得る。
本発明の方法は、中性又は塩形態として調合された組成物の投与を包含する。医薬として許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなど、陰イオンとともに形成された医薬として許容される塩及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンとともに形成された医薬として許容される塩が含まれる。
一般に、組成物の成分は、例えば、活性因子の量を記すアンプル又は小袋などの気密的に密封された容器中の凍結乾燥された乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、単位投薬形態で、別個に又は一緒に混合されて供給される。投与の様式が注入である場合、組成物は、無菌医薬等級水又は生理的食塩水を含有する注入瓶を用いて分配することができる。投与の様式が注射による場合、成分が投与前に混合され得るように、無菌の注射用水又は生理的食塩水のアンプルを提供することができる。
特に、本発明は、本発明の予防若しくは治療剤の１つ若しくはそれ以上又は医薬組成物が、薬剤の量を記したアンプル又は小袋などの気密的に密封された容器中に梱包されているものも提供する。一実施形態において、本発明の予防若しくは治療剤の１つ若しくはそれ以上又は医薬組成物は、気密的に密封された容器中の無菌の凍結乾燥された乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給され、対象に投与するための適切な濃度になるように（例えば、水又は生理的食塩水で）再構成することができる。特に、本発明の予防若しくは治療剤の１つ若しくはそれ以上又は医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、より具体的には、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ又は少なくとも１００ｍｇの単位投薬量で、気密的に密封された容器中に無菌の凍結乾燥された乾燥粉末として供給される。本発明の凍結乾燥された予防若しくは治療剤又は医薬組成物は、その元の容器中で、２℃と８℃の間で保存すべきであり、本発明の予防若しくは治療剤又は医薬組成物は、再構成後１週以内に、特に、５日以内に、７２時間以内に、４８時間以内に、２４時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、５時間以内に、３時間以内に又は１時間以内に投与すべきである。別の実施形態において、本発明の予防若しくは治療剤の１つ若しくはそれ以上又は医薬組成物は、薬剤の量及び濃度を記した気密的に密封された容器中に、液体形態で供給される。特に、投与される組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬで気密的に密封された容器中に供給される。液体形態は、その元の容器中で、２℃と８℃の間で密封されるべきである。
本発明の抗体及び抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に取り込ませることが可能である。特に、抗体又は抗体部分は、０．１から２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、フリント又は琥珀色バイアル、アンプル又は予め充填された注射器中の液体又は凍結乾燥された剤形から構成され得る。緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（１から５０ｍＭ）、最適には５から１０ｍＭ、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）であり得る。他の適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。０から３００ｍＭの濃度に（最適には、液体剤形に対して１５０ｍＭ）の濃度の溶液の毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を修飾するために、塩化ナトリウムを使用することが可能である。凍結保護剤、原則として０から１０％（最適には、０．５から１．０％）のスクロースを、凍結乾燥された剤形に対して含めることができる。他の適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。凍結乾燥された剤形に対して、充填剤、原則として、１から１０％のマニトール（最適には、２から４％）を含めることが可能である。液体及び凍結乾燥された両剤形中で、安定化剤、原則として１から５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には、５から１０ｍＭ）を使用することが可能である。他の適切な充填剤には、グリシン、アルギニンが含まれ、０から０．０５％のポリソルベート−８０（最適には、０．００５から０．０１％）として含めることが可能である。さらなる界面活性剤には、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。非経口投与用の注射可能溶液として調製された本発明の抗体及び抗体部分を含む医薬組成物は、治療用タンパク質（例えば、抗体）の吸収又は分散を増加させるために使用されるものなどの佐剤として有用な因子をさらに含むことができる。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（Ｒ）（組換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射可能な溶液中のヒアルロニダーゼの添加は、非経口投与、特に皮下投与後のヒト生物学的利用性を改善する。注射可能な溶液中のヒアルロニダーゼの添加は、より少ない痛みと不快感及び注射部位反応の最小限の発生で、より大きな注射部位容積（すなわち、１ｍＬ超）も可能とする（参照により、本明細書に組み込まれるＷＯ２００４０７８１４０、ＵＳ２００６１０４９６８参照）。
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。具体的な形態は、予定される投与様式及び治療用途に依存する。典型的な具体的組成物は、他の抗体を用いたヒトの受動免疫のために使用される組成物と類似の組成物など、注射可能溶液又は注入可能溶液の形態である。投与の具体的な様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。特定の実施形態において、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の特定の実施形態において、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
治療組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で、無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム又は高薬物濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化することが可能である。無菌注射可能溶液は、上に列記されている成分の１つ又は組み合わせを加えた適切な溶媒中に、必要な量で活性化合物（すなわち、抗体又はその抗体部分）を取り込ませ、必要に応じて、その後、滅菌ろ過によって調製することが可能である。一般に、分散液は、塩基性分散溶媒及び上に列記されたものから得られる必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を取り込ませることによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌凍結乾燥粉末の場合には、調製の具体的な方法は、予め滅菌ろ過されたその溶液から、あらゆる追加の所望される成分を加えた活性成分の粉末を与える真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
多くの治療用途において、具体的な投与経路／様式は皮下注射、静脈内注射又は注入であるが、本発明の抗体及び抗体部分は、本分野で公知の様々な方法によって投与することが可能である。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望される結果に応じて変動する。ある種の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ及び微小封入された送達系を含む徐放製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生物分解可能な生体適合性ポリマーを使用することが可能である。このような製剤を調製するための多くの方法には特許が付与されており、又は当業者に一般的に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８」を参照されたい。
ある種の実施形態において、本発明の抗体又は抗体部分は、例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体とともに、経口投与され得る。また、化合物（及び、所望であれば、その他の成分）は、硬若しくは軟殻ゼラチンカプセル中に封入され、錠剤へと圧縮され、又は患者の食事中に直接取り込ませ得る。経口治療的投与の場合、化合物は、賦形剤とともに取り込ませることができ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用し得る。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活化を妨げるための物質で化合物を被覆し、又はその不活化を妨げるための物質とともに化合物を同時投与することが必要であり得る。
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることが可能である。ある実施形態において、本発明の抗体又は抗体部分は、ＲＡＧＥ活性が有害である疾患を治療するのに有用である、１つ又はそれ以上のさらなる治療剤とともに共製剤化され、及び／又は同時投与される。例えば、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体又は抗体部分は、他の錠剤を結合する１つ又はそれ以上のさらなる抗体（例えば、サイトカインを結合する抗体又は細胞表面分子を結合する抗体）とともに共製剤化され、及び／又は同時投与され得る。さらに、本発明の１つ又はそれ以上の抗体は、先述の治療剤の２つ又はそれ以上と組み合わせて使用され得る。このような組み合わせ療法は、投与される治療剤のより低い投薬量を有利に使用し得るので、様々な単独療法に伴って生じ得る毒性又は合併症が回避される。
ある種の実施形態において、ＲＡＧＥに対する抗体又はその断片は、本分野において公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号及びＰＣＴ公開ＷＯ９９／２５０４４号（これらは、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
特定の実施形態において、本発明の抗体又は本発明の別の予防若しくは治療剤をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列は、遺伝子療法によって、疾患又はその１つ若しくはそれ以上の症候を治療し、予防し、管理し、又は軽減するために投与される。遺伝子治療は、発現された又は発現可能な核酸の対象への投与によって行われる治療法を表す。本発明のこの実施形態において、核酸は、そのコードされる本発明の抗体又は予防若しくは治療効果を媒介する予防若しくは治療剤を産生する。
本分野において利用可能な遺伝子治療のための方法の何れもが、本発明に従って使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２ （１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５を参照されたい。使用可能な組換えＤＮＡ技術の本分野で一般的に公知の方法は、「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ （１９９３）」及び「Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ （１９９０）」に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な説明は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５００４２６６４Ａ１に開示されている。
ＲＡＧＥは、本明細書で上に定義されているような様々な疾病に伴う病変において重大な役割を果たす。動物中へのアミロイドＡβ−ペプチドの注入は、細動脈（ａｒｔｅｒｉｏｌｏｓｅ）中の炎症性応答、脳血流量の減少のような応答をもたらす。これらの効果は、ＲＡＧＥに対する抗体によって予防され得る（Ｒｈｏｄｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ Ｐａｐｅｒｓ，７ｔｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｕｇ．１９−２２，２００１ ，５４３−５４７；Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄ．２００３）。ＲＡＧＥは、ＡＤ患者の微小血管構造中及びヒトＡＰＰ遺伝子が過剰発現されているトランスジェニックマウス中で上方制御される（Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄ．２００３）。ヒトＡＰＰ遺伝子が発現され、及びＲＡＧＥが過剰発現されている二重トランスジェニックマウスを用いて、正常なＲＡＧＥ遺伝子の過剰発現は学習障害、斑の増加をもたらすのに対して、ドミナントネガティブなシグナル伝達欠損ＲＡＧＥバリアントの過剰発現は学習の改善及びより低い斑レベルをもたらすことが示された（Ａｒａｎｃｉｏ ｅｔ ａｌ．２００４ ＥＭＢＯ Ｊ．２００４）。１型及び２型糖尿病の両方の動物モデルでの実験によって、リガンド−ＲＡＧＥ軸の拮抗が糖尿病環境中での血管及び炎症性細胞擾乱の発生及び進行を抑制することが明らかになり、例えば、ＲＡＧＥノックアウトマウス及び抗ＲＡＧＥ抗体が、例えば、糖尿病性腎障害に対する動物モデルの改善を示すために使用されている（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ ＣＡＮＡＤＩＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＩＡＢＥＴＥＳ．２００６；３０（４）：４２２，Ｍｙｉｎｔ Ｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ （２００６），５５（９），２５１０；Ｄｅ−Ｖｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２００３，１４／８，２１０９，Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ＲＡＧＥ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００６，１８８，４９３）。肥満２型糖尿病マウス中での中和ＲＡＧＥ抗体の陽性の長期腎臓効果が、Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ他（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００４，５３，１，ｐ．１６６−７２）によって示された。ＲＡＧＥノックアウトマウスは、敗血症へのＲＡＧＥの関与を示すために使用された（Ｂｉｒｇｉｔ Ｌｉｌｉｅｎｓｉｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４ Ｊｕｎｅ １；１１３（１１）：１６４１−１６５０；Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ＲＡＧＥ） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｅｐｓｉｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）。抗ＲＡＧＥＩｇＧに由来するＦ（ａｂ）２断片を遮断することは、ＭＯＧ又はＭＢＰによって誘導されたＥＡＥでの炎症性応答を低下させる（Ｙａｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：２８７−２９３）。癌へのＲＡＧＥの関与が示された（Ａｂｅ−Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００４，１２２／２ （４６１−４６７）。腫瘍を有するマウスにおいて、抗ＲＡＧＥ中和抗体を使用する治療によって、生存率が延長され、自発的な肺転移が阻害された。
このような疾病に罹患しているヒトを治療するために、本発明の抗体及び抗体部分を使用することができる。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、単独で、又は追加の因子、例えば治療剤と組み合わせて使用することが可能であり、前記追加の因子は、その意図される目的のために、当業者によって選択されることを理解すべきである。例えば、追加の因子は、本発明の抗体によって治療されている疾病又は症状を治療するのに有用であると本分野で認識されている治療剤であり得る。追加の因子は、治療用組成物に有益な属性を付与する因子、例えば、組成物の粘性に影響を及ぼす因子とすることも可能である。
本発明に含まれるべき組み合わせは、それらの意図される目的に対して有用な組み合わせであることをさらに理解すべきである。以下に記されている因子は、例示を目的とするものであって、限定を意図するものではない。本発明の一部である組み合わせは、本発明の抗体及び以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の因子であり得る。形成された組成物がその意図される機能を実行することが可能であるような組み合わせであれば、２以上の追加の因子、例えば、２又は３個の追加の因子を含むこともできる。
本発明の抗体又は抗体部分と組み合わせることが可能な、多発性硬化症のための治療剤の非限定的な例には、以下のもの：コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキサート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（ＡＶＯＮＥＸ；Ｂｉｏｇｅｎ）；インターフェロン−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；インターフェロンα−ｎ３）（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）、インターフェロンα（Ａｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ／Ｊ＆Ｊ）、インターフェロンβ１Ａ−ＩＦ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ペグインターフェロンα２ｂ（Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１；ＣＯＰＡＸＯＮＥ；ＴｅｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラブリビン；他のヒトサイトカイン又は成長因子及びそれらの受容体（例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦ）に対する抗体又はこれらのアンタゴニストが含まれる。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０又はこれらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることが可能である。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸・モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害剤、アドレナリン系薬物、ＴＮＦα又はＩＬ−１などの炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する因子（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５又はｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）及び炎症抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）などの因子とも組み合わされ得る。
抗体又はその抗原結合部分を組み合わせることが可能な、多発性硬化症のための治療剤の具体的な例には、インターフェロン−β、例えば、ＩＦＮβ１ａ及びＩＦＮβ１ｂ；コパキソン、コルチコステロイド、カスパーゼ阻害剤（たとえば、カスパーゼ−１の阻害剤）、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤並びにＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体が含まれる。
特に、本発明の結合タンパク質及び抗体は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病及びダウン症候群を治療するために使用され得る。本発明の結合タンパク質及び抗体は、単独で、又は上記疾病の１つを治療するのに適した少なくとも１つの追加の因子と組み合わせて使用できることを理解すべきである。前記少なくとも１つの追加の因子は、その予定される目的のために、当業者によって選択され得る。例えば、追加の因子は、コレステリナーゼ阻害剤（例えば、タクトリン、ドネペジル、リバスチグミン又はガランタミン）、部分的ＮＭＤＲＡ受容体遮断薬（例えば、メマンチン）、グリコサミノグリカン模倣物（例えば、Ａｌｚｈｅｍｅｄ）、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質（例えば、Ｒ−フルルビプロフェン）、黄体ホルモン遮断性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト（例えば、リュープロレリン）、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｉｎ ａｇｅｎｔ）、神経細胞選択的Ｌ型カルシウムチャンネル遮断薬、免疫調節物質、アミロイド繊維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤（例えば、Ｍ２６６）、別の抗体（例えば、バピノイズマブ（ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ））、５−ＨＴ１ａ受容体アンタゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、終末糖化産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経細胞の代謝を増強したグルコース取り込み刺激物質、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体での部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分的アンタゴニスト、ＰＤＥ４を標的とする治療薬、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン作動性アゴニスト、神経細胞成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質（すなわち、本発明の抗体又は結合タンパク質によって治療されている疾病又は症状を治療するのに有用として、現在認められている又は将来認められる因子）などの治療剤であり得る。追加の因子は、治療用組成物に有益な属性を付与する因子、例えば、組成物に粘度に影響を及ぼす因子でもあり得る。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、アレムツズマブ、ドロナビノール、ユニメド、ダクリズマブ、ミトキサントロン、塩酸キサリプロデン、ファムプリジン、酢酸グラチラマー、ナタリズマブ、シンナビドール、α−イムノカインＮＮＳＯ３、ＡＢＲ−２１５０６２、ＡｎｅｒｇｉＸ．ＭＳ、ケモカイン受容体アンタゴニスト、ＢＢＲ−２７７８、カラギュアリン、ＣＰＩ−１１８９、ＬＥＭ（リポソーム封入されたミトキサントロン）、ＴＨＣ．ＣＢＤ（カンナビノイドアゴニスト）ＭＢＰ−８２９８、メソプラム（ＰＤＥ４阻害剤）、ＭＮＡ−７１５、抗ＩＬ−６受容体抗体、ニューロバックス、ピルフェニドンアロトラップ１２５８（ＲＤＰ−１２５８）、ｓＴＮＦ−Ｒ１、タラムパネル、テリフルノミド、ＴＧＦ−β２、チプリモチド、ＶＬＡ−４アンタゴニスト（例えば、ＴＲ−１４０３５、ＶＬＡ４Ｕｌｔｒａｈａｌｅｒ、Ａｎｔｅｇｒａｎ−ＥＬＡＮ／Ｂｉｏｇｅｎ）、インターフェロンγアンタゴニスト、ＩＬ−４アゴニストなどの因子と組み合わせることもできる。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」は、所望の治療的結果を達成するために必要な投薬量で、及び所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者によって決定され得、病状、年齢、性別及び個体の体重並びに抗体又は抗体部分が、個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、治療的に有益な効果が抗体又は抗体部分の何れかの毒性効果又は有害効果を上回る量でもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、及び所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。疾病のより初期段階の前に又は疾病のより初期段階において、予防的投薬が対象に使用されるので、通例、予防的有効量は、治療的有効量を下回る。
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答又は予防的応答）を与えるように調整され得る。例えば、単一の大量瞬時投与を投与することができ、複数の分割された用量を経時的に投与することができ、又は、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少若しくは増加させ得る。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される投薬単位形態は、治療されるべき哺乳動物対象に対する統一的な投薬として適した、物理的に分離された単位を表し、各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の投薬単位形態に対する規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴及び達成されるべき具体的な治療効果又は予防効果並びに（ｂ）個体における過敏症の治療用のこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。
本発明の抗体又は抗体部分の治療的に又は予防的に有効な量に対する典型的な非限定的範囲は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には１から１０ｍｇ／ｋｇである。緩和されるべき症状の種類及び重度に応じて、投薬量の値が変動し得ることに注意すべきである。何れの具体的な対象に対しても、個別の要求に従って、及び組成物の投与を行い又は監督している者の専門的判断に従って、具体的な投薬計画を経時的に調整すべきこと、及び、本明細書に記載されている投薬量の範囲は典型的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている組成物の範囲又は実施を限定することを意図したものではないことをさらに理解すべきである。
本発明の方法の他の適切な修飾及び改変が明白であり、本発明の範囲及び本明細書に開示されている実施形態から逸脱することなく、適切な均等物を用いて、本発明の方法の他の適切な修飾及び改変を施し得ることが当業者に自明である。ここまで本発明を詳しく記載してきたが、例示の目的のためにのみ含まれており、本発明の限定を意図するものではない以下の実施例を参照することによって、本発明がさらに明瞭に理解される。
実験の部
好ましい抗ｈｕＲＡＧＥ抗体
１．１ ハイブリドーマ及び抗体の作製
４から６週齢のＢａｌｂ／ｃ及びＡ／ＪマウスをヒトＲＡＧＥで免疫化し、皮下に強化免疫した。完全フロイントアジュバント中の３０μｇの一次注射及び不完全フロイントアジュバント中の３０μｇの注射強化免疫から開始して、動物には３週ごとに注射した。融合のために選択されるマウスに、融合の４日前に、生理的食塩水中のｈＲＡＧＥ１０μｇを静脈内注射した。免疫化された動物の脾臓を取り出し、単一細胞懸濁物を調製した。培養物からＳＰ２／０骨髄腫細胞を採集し、洗浄した。脾細胞及び腫瘍細胞を５：１の比で混合し、標準的な技術を使用して、５０％ＰＥＧ３０００を用いて融合した（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）。２．５×１０５脾臓細胞／ウェルの密度で、選択培地中の９６ウェルプレート中に、融合された細胞を播種した。３７℃で７から１０日間、融合物を温置した。肉眼で見えるコロニーが観察されたら、上清を除去し、ｈＲＡＧＥＥＬＩＳＡ中で検査した。
所望の特徴を有するｍＡｂを産生しているハイブリドーマを、限界希釈法によってサブクローニングした。ＥＬＩＳＡによって、ｈＲＡＧＥへの結合に関して、サブクローンを含有する上清をアッセイした。ｍＡｂの重鎖及び軽鎖サブクラスは、ＺｙｍｅｄＥＩＡＩｓｏｔｙｐｉｎｇキットを用いて決定した。
１．２．各マウス抗ヒトＲＡＧＥｍＡｂに対する可変領域のアミノ酸配列の決定
各アミノ酸配列の決定のために、約１０×１０６個のハイブリドーマ細胞を遠心によって単離し、製造業者の指示書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ．）を用いて全ＲＮＡを単離するために処理した。製造業者の指示書に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを第一鎖ＤＮＡ合成に供した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを選択するための第一鎖合成を開始するために、オリゴ（ｄＴ）を使用した。次いで、マウス免疫グロブリン可変領域の増幅のために設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって、第一鎖ｃＤＮＡ産物を増幅した（Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔｓ，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分離し、切り出し、精製し、次いで、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、ＴＯＰＯＣｌｏｎｉｎｇキットを用いてサブクローニングし、化学的に形質転換受容能力を有するＴＯＰ１０イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換した。挿入物を含有するクローンを同定するために、形質転換体に対してコロニーＰＣＲを行った。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、挿入物を含有するクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ ＭＤ）を用いて、可変重鎖又は可変軽鎖ＤＮＡ配列を決定するために、両鎖に対して、プラスミド中の挿入物を配列決定した。３つのモノクローナル抗体７Ｅ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５の可変重及び可変軽鎖配列並びにこれらの３つの可変重鎖ＣＤＲ及び３つの可変軽鎖ＣＤＲが、上記表４に列記されている。
１．３．組換え抗ヒトＲＡＧＥ抗体の構築及び発現
細菌中での相同的組換えによって、マウス抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体７Ｅ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５の重鎖定常領域をコードするＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｃＤＮＡ断片によって置換した。これらの抗体のそれぞれの軽鎖定常領域は、ヒトκ定常領域によって置き換えた（上記表１）。ｐＢＯＳ又はｐＴＴ３発現プラスミド中に連結されたキメラ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの同時形質移入によって、完全長キメラ抗体をＣＯＳ細胞又は２９３細胞中に一過性に発現させた（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０，Ｖｏｌ．１８，ｐｇ５３２２）。プロテインＡセファロースクロマトグラフィーによって、組換えキメラ抗体を含有する細胞上清を精製し、酸緩衝液の添加によって、結合された抗体を溶出した。抗体を中性にし、ＰＢＳ中に透析した。
１．４．組換え抗ヒトＲＡＧＥｍＡｂ及びハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥｍＡｂのＥＬＩＳＡ結合。
競合的ＥＬＩＳＡ中でヒトＲＡＧＥを結合する能力に関して、精製されたキメラ抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体を検査した。組換えキメラ抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体又はハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体をＰＢＳＴ＋１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中に希釈し、３２０μｇ／ｍＬから０．０１５６μｇ／ｍＬ（７Ｅ９及び１１Ｅ６）及び１６０μｇ／ｍＬから０．００７８μｇ／ｍＬ（４Ｅ５）の範囲の様々な濃度で、２×原液として作製した。ビオチン化されたハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体（７Ｆ９−ビオチン、１１Ｅ６−ビオチン及び４Ｅ５ビオチン）を、ＰＢＳＴ＋１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中に、８μｇ／ｍＬで調製した。各組換えキメラ抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体又はハイブリドーマ由来の抗ヒトＲＡＧＥモノクローナル抗体の等しい容量（５０μＬ）とそれぞれの対応するビオチン化されたハイブリドーマ由来の抗ＲＡＧＥｍＡｂを混合した。次いで、２μｇ／ｍＬで組換えヒトＲＡＧＥが予め被覆されたＥＬＩＳＡプレートにこの混合物５０μＬを添加し、室温で１．５時間温置した。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＰＢＳＴ＋１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中に、ストレプトアビジンＨＲＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を１：１６０００希釈した。５０Ｌ／ウェルを添加し、室温で１時間プレートを温置した。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の５０μＬを各ウェルに添加し、室温で１０分間温置した。１Ｎ硫酸の添加によって、反応を停止させた。４５０ｎｍの波長で、プレートを分光学的に読み取った。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ中に、結果が示されている。
組換えヒトｓＲＡＧＥ（ｈｕｓＲＡＧＥ）の作製
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）中で組換えｈｕｓＲＡＧＥタンパク質２９３／６．１ｓＲＡＧＥＨｉｓ６を発現させ、精製した。安定な発現の作製のために使用された発現ベクターは、「ｐｃＤＮＡ３（−）６．１ＣＨＩＳＡ」であった。
分子生物学の標準的な技術を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．２００１）に従って使用した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＵＳＡ）を用いて、ヒトリンパ球（ＰＢＬ）から得た全ＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した。オリゴヌクレオチドプライマーＲＡＧＥ−ＳＥ：ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ Ｇ（配列番号８１）及びＲＡＧＥ−ＡＳ：ＣＣＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＣＣＣ ＴＣＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＣＡ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＴ（配列番号８２）を用いて、（上で得られた）ｃＤＮＡからＲＡＧＥｃＤＮＡを増幅し、参照配列ＮＭ−００１１３６中に記載されているようにＲＡＧＥｃＤＮＡを得た。ＰＣＲ断片をアガロースゲル上で走行させ、精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。その後、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを用いてｃＤＮＡを切断した。得られた断片をゲル精製し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩを用いて予め切断されたベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中に連結した。イー・コリＸＬ−１ブルー細胞（ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中への形質転換後、陽性の組換えクローンを同定した。このクローンの配列を確認し、プラスミドｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３／ＲＡＧＥ２．６プラスミドＤＮＡを単離した。ＰＣＲ並びにプライマーＮ−ＳＥＡ：ＡＧＴ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＡＧ ＴＧＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ Ａ（配列番号８３）及びＣ−ＳＥ Ｂ：ＣＣＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＣＣ（配列番号８４）を用いて、ＲＡＧＥの細胞外部分に対するコード領域ｈｕｓＲＡＧＥをｐｃＤＮＡ３／ＲＡＧＥ２．６から増幅した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩを用いて、得られたＰＣＲ産物を切断し、上に記載されているようにゲル精製し、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで予め切断された「ｐｃＤＮＡ３．１（−）ＭｙｃＨＩＳ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中に連結した。製造業者の指示書に従い、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、得られたプラスミド「ｐｃＤＮＡ３（−）６．１ＣＨＩＳＡ」をＨＥＫ２９３細胞中に形質移入した。ＭＥＭ培地（＃Ｍ４５２８，Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中の８００μｇ／ｍＬＧ４１８を用いて、耐性細胞の選択を行った。細胞懸濁液の系列希釈を通じた単一細胞のクローニングは、ＲＡＧＥ特異的抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；＃ ｓｃ５５６３）を用いるウェスタンブロットによって確認されたように、細胞培地中にｈｕｓＲＡＧＥを分泌するクローン「２９３／６．１ｓＲＡＧＥ Ｈｉｓ ６」の同定をもたらしす。ｈｕｓＲＡＧＥタンパク質の十分量の発現及び精製のために、細胞工場（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、血清を含有する細胞培地（上記参照）中でこのクローンを増殖させた。次いで、無血清培地Ｐｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ（＃１２−７６４Ｑ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）へ細胞を交換し、３７℃で３日間温置した。無細胞培地８０Ｌを採集し、Ｈｅｍｏｆｌｏｗ Ｆ−Ｓｅｒｉｅｓ Ｈｉｇｈ−Ｆｌｕｘカラム（Ｆｒｅｓｅｎｉｓｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１４００ｍＬの容積まで濃縮した。
Ｄｉａｒｅｃｔ ＡＧ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びキレート化のためのセファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、タンパク質精製を行った。製造業者による指示書に従って、カラムの平衡化及び細胞上清由来のヘキサＨｉｓ含有タンパク質のマトリックスへの結合を行った。イミダゾールの増加する濃度を用いた段階的勾配を用いて、タンパク質の溶出を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ及び抗ＨＩＳ抗体を用いて、ヘキサＨｉｓを含有するタンパク質に関して、溶出された画分を分析した。精製されたｈｕｓＲＡＧＥは、２５０から５００ｍＭイミダゾールで特異的に溶出した。陽性画分を合わせ、濃縮し、ＰＢＳに対して３回透析した（２×４時間、１×１６時間）。
ｈｕｓＲＡＧＥタンパク質に関して上述されている分子生物学の標準的な技術によって、ヒトＲＡＧＥの最初の１０１アミノ酸を喪失したｈｕｓＲＡＧＥのＮ末端短縮様式（１０２−３３１−ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ）を作製した。ｈｕｓＲＡＧＥ（１−３３１）に対して使用された同じ基本的手法によって、このタンパク質を作製した。上記プラスミド（ｐｃＤＮＡ３／ＲＡＧＥ２．６）並びに２つのプライマー（ＣＧＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＡＧ（配列番号８５）及びＴＣＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＧＣＣ Ｔ（配列番号８６））を用いて、ｈｕｓＲＡＧＥに対するＤＮＡのより短い様式をＰＣＲによって増幅した。断片のアガロースゲル及び溶出後、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを用いて、得られた純粋な断片を切断し、アガロースゲル及び溶出を用いて、再び精製した。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを用いて予め切断されたｐｓｅｃＴＡＧ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中に、断片を連結した。イー・コリの「ＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ」細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中への形質転換後、陽性クローンを選び出し、プラスミドＤＮＡを単離した。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、発現ベクター中のＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｆ細胞中へ形質移入した。発現の９６時間後、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する精製のために、無細胞上清を使用した。平衡化及び結合は、製造業者による指示に従って行った。結合されたタンパク質を緩衝液（ＰＢＳ、１６０ｍＭＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）中に溶出した。タンパク質を含有する画分を合わせて、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化された生理的食塩水；ｐＨ７．４）に対して、４℃で一晩透析した。精製されたｈｕｓＲＡＧＥ（１０２−３３１）濃度を分光学的に測定した。
ｈｕｓＲＡＧＥタンパク質に関して上述されている分子生物学の標準的な技術によって、ヒトＲＡＧＥのアミノ酸１３０以降のアミノ酸を喪失するヒトＲＡＧＥ融合タンパク質のＣ末端短縮様式（１−１３０−ｓＲＡＧＥ−Ｆｃ）を作製した。上記プラスミド（ｐｃＤＮＡ３／ＲＡＧＥ２．６）並びに２つのプライマー（ＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴＧ（配列番号８７）及びＧＡＧＴＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＴＴＣＴＧ（配列番号８８））を用いて、ｈｕｓＲＡＧＥに対するＤＮＡのより短い様式をＰＣＲによって増幅した。断片のアガロースゲル及び溶出後、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを用いて、得られた純粋な断片を切断し、アガロースゲル及び溶出を用いて、再び精製した。次いで、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで予め切断されたプラスミドｐＥＮＴＲ４中に、断片を連結した。ｐＥＮＴＲ４−ＲＡＧＥ１−１３０を作製するために、連結混合物をイー・コリ「ＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ」細胞（Ｉｎｔｉｒｔｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中に形質転換した。陽性クローンを選び出し、プラスミドＤＮＡを単離した。クローンｐＥＮＴＲ４ｈＲＡＧＥ１−１３０のＤＮＡ及びベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＺｅｏｈＩｇＧλｈｃ２５７−ＳｔｏｐのＤＮＡとともに、部位特異的組換え及びｇａｔｅｗｅａｙ ｃｌｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ；ａｔｔＬ ｘ ａｔｔＲ）を用いて、「ＴＯＰ１０ＯｎｅＳｈｏｔ」細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中への形質転換及び精製後に、ｈｕｓＲＡＧＥ−１−１３０−Ｆｃ（ｐＥＸＰ ｈＲＡＧＥ １−１３０／ｈＩｇＧλｈｃ２５７−Ｓｔｏｐと称されるプラスミド）をコードするプラスミドを構築した（下記参照）。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ及び２９３Ｆ細胞（実施例２．１）を用いたこのプラスミドの発現及びＰｒｏｔｅｉｎＧ−ビーズを用いた細胞上清からの得られたタンパク質の精製（実施例２．２）は、９５％超の純度でタンパク質をもたらした。
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＺｅｏｈＩｇＧλｈｃ２５７−Ｓｔｏｐの構築
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）中でＥａｓｙＡポリメラーゼを用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃Ｈ５０１４ａ）からｈＩｇＧλ重鎖に対するＤＮＡ配列を増幅するために、２つのオリゴヌクレオチドプライマー（ｇｔａｃｇａｔａｔｃｇａｇｇｇａｃｇａａｔｇｇａｔｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃ（配列番号９１）；ｃｔａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇ（配列番号９２））を使用した。得られたＤＮＡを（上述のように）ゲル精製し、製造業者からの指示書を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯＶｅｋｔｏｒ（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ ＴＯＰＯ ＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｋ４８００−０１）中にクローニングし、上述のように、イー・コリＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。陽性クローンを同定し、ＰＣＲ及びオリゴヌクレオチドプライマー（ｇｔａｃｇａｔａｔｃｇａｇｇｇａｃｇａａｔｇｇａｔｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃ（配列番号９３）；ｃｔａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇ（配列番号９４））を用いて、得られたプラスミドＤＮＡを精製した（名称：ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５Ｈｉｓ）Ｆｃ／ｈＩｇＧλｈｅＮｒ．２／７）。ＤＮＡのｈＩｇＧλｈｃ部分を増幅し、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩで切断し、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩで予め切断されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＺｅｏベクターＤＮＡに連結し、イー・コリＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。得られたプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＺｅｏｈＩｇＧλｈｃ２５７−Ｓｔｏｐと名付け、免疫グロブリンＩｇＧ重鎖のＣ末端部分にインフレームでＮ末端に融合されたタンパク質を発現させるために、さらなる研究のために使用した。
３．１．ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中でのタンパク質の形質移入及び発現
Ｆｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で２から３日間培養して増殖されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を４００ｇで遠心し、上清を廃棄した。培地中に細胞沈降物を再懸濁し、新鮮な培地２８ｍＬ中に、３×１０７細胞になるように調整し、１２５ｍＬのｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒに移し、形質移入混合物が準備されるまで、１５０ｒｐｍで、軌道式振盪装置上にて、３７℃、８％ＣＯ２で、温置装置中で温置した。
２９３ｆｅｃｔｉｎ−ＤＮＡ複合体を有する形質移入混合物は、以下のようにして準備した。
（ｉ）１０００μＬの総容量になるように、ＤＮＡ３０μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭＩで希釈し（対照１０００μＬＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ）、混合した。
（ｉｉ）１０００μＬの総容量になるように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩを用いて、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１２３４７−０１９；１ｍＬ）の３５μＬを希釈し、混合し、室温で５分間温置した。
（ｉ）及び（ｉｉ）から得られたＤＮＡ混合物と２３９ｆｅｃｔｉｎ溶液を新しい管に移し、僅かに混合し、室温で２５分間の温置後に、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ中の細胞に添加した。
１５０ｒｐｍで、軌道式振盪装置上にて、３７℃で、８％ＣＯ２で、温置装置中において、細胞をこの形質移入混合物とともに表記時間にわたって温置した。４００ｇで１０分間の遠心によって、細胞上清を採集した。
３．２．ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の精製
細胞上清由来のタンパク質をビーズに連結するために、ＰＢＳ中にビーズを懸濁し、１３，５００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄することによって、ビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＰＢＳ中で３回洗浄した。室温で回転装置上にて、１から２時間、連結すべきそれぞれの細胞上清（細胞上清３００ｍＬ／ｍＬビーズ）とともにビーズを温置した。ＰＢＳでビーズを３回洗浄し、４℃で１２時間又は一晩、細胞上清とともに温置した。温置後、上記のように、ＰＢＳでビーズを３回洗浄した。ビーズ沈降物に１４０ｍＭＮａＣｌ＋０．１Ｍグリシン２００μＬを添加し、回転装置上で３０分間温置することによって、結合されたタンパク質を溶出した。遠心後、ｐＨ７．１から７．４になるようにｐＨを調整するために、２ＭＴｒｉｓを添加することによって、上清を直ちに中和した。ビーズ沈降物を廃棄した。得られたプローブをＰＢＳに対して透析し、−２０℃で、分取試料中に凍結保存した。ＲＡＧＥの完全な細胞外エクトドメインを含有するＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（ｎｏ．１１４５−ＲＧ；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＲＡＧＥ／Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ）から入手した。
３．３．変性されていない形態のＲＡＧＥのペプチド又は断片への抗体のドットブロット結合
変性されていない形態のＲＡＧＥのペプチド又は断片への抗体の結合を評価するために、ドットブロットを使用した。使用されたタンパク質は、ｓＲＡＧＥ−タンパク質（１−３３１ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ）又はＮ末端の短縮された様式（１０２−３３１−ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ）の何れかであった。ペプチドは注文し、遊離のカルボキシル末端を含有する標準的な方法（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用するＡＭＳ２２２合成装置上での固相ペプチド合成）に従って、Ｂｉｏｔｒｅｎｄによって合成された。ペプチドをＨＰＬＣ精製し、純度に関する全てのペプチドの分析はＲＰ−ＨＰＬＣを用いて行った。全てのペプチドは、８０％を超える純度を有していた。ペプチドの正体は、質量分析法によって確認した。
使用したペプチドは、ヒトＲＡＧＥタンパク質の細胞外領域を貫く３０マーであった。多くのペプチドの正味の電荷は類似していた。
ＮｔｅｒｍＲ３１：ＱＮＩＴＡＲＩＧＥＰＬＶＬＫＣＫＧＡＰＫＫＰＰＱＲＬＥＷＫＬＮ
正味の電荷：＋７（配列番号７０）
ペプチド１：ＫＬＮＴＧＲＴＥＡＷＫＶＬＳＰＱＧＧＧＰＷＤＳＶＡＲＶＬＰＮ
正味の電荷：＋２（配列番号７１）
ペプチド２：ＬＰＮＧＳＬＦＬＰＡＶＧＩＱＤＥＧＩＦＲＣＱＡＭＮＲＮＧＫＥ
正味の電荷：０（配列番号７２）
ペプチド３：ＧＫＥＴＫＳＮＹＲＶＲＶＹＱＩＰＧＫＰＥＩＶＤＳＡＳＥＬＴＡ
正味の電荷：＋１（配列番号７３）
ペプチド４：ＬＴＡＧＶＰＮＫＶＧＴＣＶＳＥＧＳＹＰＡＧＴＬＳＷＫＬＤＧＫ
正味の電荷：＋１（配列番号７４）
ペプチド５：ＤＧＫＰＬＶＰＮＥＫＧＶＳＶＫＥＱＴＲＲＨＰＥＴＧＬＦＴＬＱ
正味の電荷：＋２（配列番号７５）
ペプチド６：ＴＬＱＳＥＬＭＶＴＰＡＲＧＧＤＰＲＰＴＦＳＣＳＦＳＰＧＬＰＲ
正味の電荷：＋１（配列番号７６）
ペプチド７：ＬＰＲＨＲＡＬＲＴＡＰＩＱＰＲＶＷＥＰＶＰＬＥＥＶＱＬＶＶＥ
正味の電荷：＋２（配列番号７７）
ペプチド８：ＶＶＥＰＥＧＧＡＶＡＰＧＧＴＶＴＬＴＣＥＶＰＡＱＰＳＰＱＩＨ
正味の電荷：−２（配列番号７８）
ペプチド９：ＱＩＨＷＭＫＤＧＶＰＬＰＬＰＰＳＰＶＬＩＬＰＥＩＧＰＱＤＱＧ
正味の電荷：＋０（配列番号７９）
ペプチド１０：ＤＱＧＴＹＳＣＶＡＴＨＳＳＨＧＰＱＥＳＲＡＶＳＩＳＩＩＥＰＧ
正味の電荷：−１ （配列番号８０）
１×ＰＢＳ中の１μＬの容量で、タンパク質／ペプチド（３０ｎｇ、１０ｎｇ、３ｎｇ、１ｎｇ、０．３ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０３ｎｇ及び０．０１ｎｇ）の異なる量からなるドットを、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬＮｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ６８Ｄ）上に、２つ組みで点状添加した。膜を乾燥させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬（Ｒｏｃｈｅ，ｎｏ．１９２１６７３）とともに、室温で１時間、膜を振盪することによって、非特異的な結合をブロックした。ブロッキング試薬を廃棄し、７．１４ｎＭの濃度で抗体とともに膜を温置した（振盪、室温で１時間）。モノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓから市販されている抗体（例えば、ＡＦ１１４５）ＭＬ３７−７Ｆ９、ＭＬ３７−１１Ｅ６、ＭＬ３７−４Ｅ５であった。１×ＰＢＳで、ブロットを４回洗浄した（各回、室温で振盪しながら、５分の温置）。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧＡＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ番号Ａ−７４３４）とともに、ブロットを温置し、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｃｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、ｎｏ．１９２１７３）中に１：２０００希釈した。１時間の温置は、前述のとおりであった（振盪、室温）。１×ＰＢＳ中で、フィルターを４回（各５分）洗浄した。シグナルの生成は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ，ｎｏ．１６９７４７１）を用いて、製造業者の指示書に従った。二重蒸留水を用いて、１０分後に、呈色を停止させた。図２参照。
本発明の３つのモノクローナル抗体全て及びポリクローナル抗体ＡＦ１１４５（市販の入手源Ｒ＆Ｄから）によって、ドットブロット中でｈｕｓＲＡＧＥが検出されたが、本発明のモノクローナル抗体によっては、何れのペプチドも検出されなかった。しかしながら、ポリクローナル抗体は、幾つかのペプチドを検出した。Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ他（ＥＭＢＯＪ．２６、３８７５、２００７）によって記載されているポリクローナル抗体を作製するために使用されたアミノ酸配列を含むペプチド９は、市販のポリクローナル抗体によって明確に検出された。これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体が現在入手可能な抗体とは異なるエピトープを明確に認識することを示唆する。
イー・コリ中で発現されたヒトｓＲＡＧＥのＲＡＧＥ変異体の分析によって、結合のさらなる性質決定を行った。アミノ酸２３５から３３６を欠如する欠失変異体中で結合は失われ、アミノ酸２３５から３３６からなる変異体ＲＡＧＥタンパク質中では結合は明白であるので、モノクローナル抗体１１Ｅ６及び４Ｅ５はＣ２ドメイン付近の領域に結合する。
ＨＴＲＦ技術を用いた、Ａβ１−４２グロブロマーとｈｕｓＲＡＧＥに由来するタンパク質間の相互作用
アッセイは、ＣＩＳ Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂａｇｎｏｌｓ， Ｆｒａｎｃｅ）から入手可能なＨＴＲＦ（均質時間分解蛍光）技術に基づいており、ＨＴＲＦドナー及びアクセプター成分、抗−６ＨＩＳ−ユーロピウムクリプタート（ＣＩＳ Ｂｉｏカタログ番号：６１ＨＩＳＫＬＡ；５００ウェル／１３μｇ）及びストレプトアビジンＸＬ−６６５（ＣＩＳ Ｂｉｏカタログ番号：６１ＩＳＡＸＬＡ、５００ウェル／２５０μｇ）を、二重蒸留水２５０μＬ中にそれぞれ溶解した。３．７ｎＭ抗６Ｈｉｓ−クリプタート及び６０．６ｎＭストレプトアビジンＸＬ−６６５の最終濃度を有する作業溶液を得るために、これらの原溶液をＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４中に１００倍希釈した。ビオチン化されたＡβ−グロブロマーの１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、３１２．５ｎＭ、１５６．２５ｎＭの溶液（Ａβ−グロブロマーを調製するために使用されたＡβ１−４２ペプチドの１／５は、ビオチニル−アミロイドβ−タンパク質（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ ｎｏ．Ｈ−５６４２）であった。）は、Ｂａｒｇｈｏｒｎ他（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．９５， ｎｏ３， ｐｐ．８３４−８４７， ２００５及びＷＯ／２００７／０６２８５２；国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１５３０）に従って調製した。使用されたグロブロマー濃度は、グロブロマーの作製のために使用されたＡβ１−４２単量体の濃度に基づいて計算した。ビオチン化されたＡβ−グロブロマーの１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２μＭ、０．１５６μＭの溶液は、同じ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に調製した。これらの溶液の４μＬ又は緩衝液の４μＬを１μＭ組換えｈｕｓＲＡＧＥタンパク質４μＬと混合し、室温で１時間、溶液を温置した後、溶液（３．７ｎＭ抗６Ｈｉｓ−クリプタート及び６０．６ｎＭストレプトアビジンＸＬ−６６５）の各々の４μＬを添加した。
４℃で２時間、アッセイを温置した。２ＭＫＦ原溶液４μＬの添加後、ＢＭＧＰｈｅｒａｓｔａｒ蛍光装置（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＨＴＲＦモードで、ＨＴＲＦシグナルを測定した。抗体なしの最大シグナル曲線及び抗６ＨＩＳ−Ｃｒｙｐｔａｔｅ又はストレプトアビジンＸＬ−溶液のみを使用するバックグラウンド結果を使用した。％δＦ値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）を用いて、製造業者ＣｉｓＢｉｏによる指示書に従って計算した。
ＨＴＲＦ技術を用いた、抗体によるｈｕｓＲＡＧＥへのＡβ１−４２グロブロマー結合の阻害
若干の修飾を加えて、上に記載されている基本的なプロトコールを用いた。抗６ＨＩＳユーロピウムクリプタートに対しては１０．２５ｎＭになるように、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ中のストレプトアビジンＸＬ−６６５に対しては１５１．５ｎＭになるように、ＨＴＲＦドナー及びアクセプター成分を希釈した。
ｈｕｓＲＡＧＥ又は対照抗体としての対照免疫グロブリン（マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａ；番号Ｍ−５２８４ｒｓｐ．番号Ｍ−５４０９；Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対して、精製されたモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を使用した。
アッセイは、３８４ウェルプレート中で、２０μＬの総容量で行った。各アッセイ点に対して、室温で１時間、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１２５μＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１５．６２ｎＭ、７．８１ｎＭ、３．９ｎＭの濃度の検査抗体又はＩｇＧ対照抗体４μＬとともに、１μｈｕｓＲＡＧＥ４μＬを温置した。ｈｕｓＲＡＧＥなしで及び抗体なしで、バックグラウンドに対する調節を行った。最大シグナルは、抗体なしで得られた。続いて、８００ｎＭビオチン化Ａβグロブロマー４μＬならびに抗６ＨＩＳ−ユーロピウムクリプタートに対しては１０．２５ｎＭ及びストレプトアビジンＸＬ−６６５に対しては１５１．５ｎＭの２μＬを添加した。容量の差は、結合緩衝液（１×ＰＢＳｐＨ７．４；０．１％ＢＳＡ）を添加することによって調整した。アッセイをさらに１時間温置した。２ＭＫＦ原溶液４μＬの添加後、ＢＭＧＰｈｅｒａｓｔａｒ蛍光装置（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＨＴＲＦモードで、ＨＴＲＦシグナルを測定した。抗体なしの最大シグナル曲線及び抗６ＨＩＳ−Ｃｒｙｐｔａｔｅ又はストレプトアビジンＸＬ−溶液のみを使用するバックグラウンド結果を使用した。％δＦ値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）を用いて、製造業者ＣｉｓＢｉｏによる指示書に従って計算した。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ中に、結果が示されている。図面中に記されている濃度は、２０μＬのアッセイ容量でのタンパク質の最終濃度である。
図４に示されているように、ＲＡＧＥの３つのドメイン全てを発現するｈｕｓＲＡＧＥがアミロイドＡβ−グロブロマーに結合した。ｖ−ドメインの多くを欠如するヒトｓＲＡＧＥ（ＲＡＧＥ１０２−３３１）からなるＲＡＧＥ変異体タンパク質は、アミロイドＡβ−グロブロマーへより高い親和性で結合し、Ａβ−グロブロマーへの結合に関して、ヒトＲＡＧＥ内のドメインがＣ末端内にあることを示唆する。
ＡＬＰＨＡスクリーンアッセイ技術を用いたＲＡＧＥタンパク質へのＡβグロブロマーの結合
このアッセイは、２０μＬの容積で、アッセイ緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４及び０．１％ＢＳＡ）中で行った。使用したドナービーズはストレプトアビジンで被覆され（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ； ６７６０００２Ｓ）及び使用したアクセプタービーズはＰｒｏｔｅｉｎＡＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；ＣＵＳＭ６４１３３０００ＥＡ）であった。ビーズの各々の４μＬを、アッセイ緩衝液１９６μＬで予め希釈した。
３８４ウェルＰｒｏｘｉ−Ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， ｎｏ． ６００６２８０）を使用し、予め希釈されたドナービーズ４μＬ及びビオチン化された−ａβ−グロブロマーの２００ｎＭ溶液６μＬを用いて、ドナービーズをビオチン−ａβ−グロブロマー（上記参照）とともに添加した。
予め希釈されたアクセプタービーズ４μＬ及びＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の様々な希釈物６μＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬから始まる。）を用いて、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の異なる量をアクセプタービーズに添加した。
室温で３０分間、暗所で、添加（ビーズへのタンパク質の結合）を行った。
暗所でさらに１８０分間、予め添加されたドナーとアクセプタービーズ調製物を合わせることによって、ＲＡＧＥへのＡβ−グロブロマーの結合は開始した。シグナルは、１秒の時間遅延を用いて、ＡＬＰＨＡ−Ｑｕｅｓｔ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で測定した。さらなる分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。同じ技術を使用する異なる実験では、３つのドメイン全てからなるＲＡＧＥ−ＦｃへのＡβ−グロブロマーの結合を、ｖ−ドメインのみ（ｈｕＲＡＧＥのアミノ酸１から１３０）からなるＲＡＧＥ−Ｆｃ変異体タンパク質へのＡβグロブロマーの結合と比較した。図５に示されているように、可溶性ＲＡＧＥの３つのドメインへのアミロイドＡβ−グロブロマーの結合は強力であり、ＲＡＧＥのｖドメインへのアミロイドＡβ−グロブロマーの結合は無視できるものであった。ＲＡＧＥへのＡβ−グロブロマーの結合はＣ末端領域中で起こるので、これらのドメインへ好ましく結合する抗体は、この結合と競合すると予測される。
イー・コリＲＡＧＥ断片の構築、発現及び精製
７．１．構築物の調製
表６に列記されているイー・コリＲＡＧＥ構築物は、以下のようにして作製した。ｐＥＴ２９の同類の部位内へのサブクローニングのために使用されたＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を導入したフォワードプライマー（ａｔｇｃｔａｃａｔａｔｇａａａａａｇａｃａｇｃｔａｔｃｇｃｇａｔｔｇｃａｇｔｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｔａｃｃｇｔａｇｃｇｃａｇｇｃｃｇｃｔｃａａａａｃａｔｃａｃａｇｃｃ（配列番号８９）及びリバースプライマー（ａｔｇｃｔａｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｔｇａｔｃｃｔｃｃｃａｃａｇａｇｃｃｔｇｃａｇｔｔｇｇｃｃｃｃｔｃｃ（配列番号９０））を用いて、テンプレートプラスミドｐｃＤＮＡ３（−）６．１ＣＨＩＳＡからのＰＣＲ増幅によって、構築物１を作製した。残りの構築物（＃２から＃７、表６）は、構築物１をテンプレートとして使用して作製した。ＲＡＧＥアミノ酸２４から１２９、２４から２３４、２４から３３６、１３０から２３４、１３０から３３６、２３５から３３６をコードする配列は、構築物１からＰＣＲ増幅した。１．０％アガロースゲル上に、得られたＤＮＡ断片を走行させ、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを用いてＤＮＡ断片を消化し、同様に消化されたｐＥＴ２８ａ中に連結した。Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５α形質転換受容性細胞中に連結混合物を形質転換し、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。３７℃で一晩温置した後、５０ｍｇ／カナマイシンを含有するＬＢブロス３ｍＬ中に、各クローンに対して３つのコロニーを接種し、３７℃で一晩振盪した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、ＤＮＡを単離し、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネータ特異的プライマーを用いて挿入物を配列決定した。構築物＃１から＃７をコードするプラスミドのＤＮＡ配列が配列番号２７から３３として列記されており、対応する翻訳された領域が配列番号３４から４０として列記されている。
Figure 2016104740
構築物＃１プラスミドＤＮＡでイー・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢプレート上に配置し、３７℃で一晩温置した。翌日、それぞれがカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えたＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈの１Ｌを含有する１４のフェルンバッハフラスコにＣＦＵを接種し、３７℃で温置装置中に振盪しながら（１８０ｒｐｍ）を配置した。培養物が０．４７のＯＤ６００ｎｍに達成したときに、フラスコを３０℃の温置装置（１８０ｒｐｍでなお振盪）に移し、０．４ｍＭＩＰＴＧの添加によって、発現を誘導した。遠心（１５，９００ｇ、８分、４℃）による誘導から４時間後に、細胞を採集し、次いで、精製まで、−８０℃で、細胞ペーストを凍結した。
第一の融解によって進行されたＲＡＧＥ構築物１の精製及び溶解緩衝液［５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭイミダゾール、１ＸＲｏｃｈｅ無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤、２０Ｕ／ｍＬＤＮアーゼＩ］１８０ｍＬ中に、細胞沈降物約２０ｇを再懸濁した。３回連続して、３℃で、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ微小流動装置に懸濁物を通過させることによって、細胞を溶解した。次いで、２ｍＬ／分で、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ−カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７−５２５５−０１）上に清澄化された可溶化液を添加した。次いで、洗浄緩衝液［５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール］の１０ＣＶでカラムを洗浄した。洗浄工程後、溶出緩衝液［５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール］を用いてＲＡＧＥを勾配溶出した。ＲＡＧＥを含有する画分をプールし、次いで、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、２０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して透析した。精製された物質の質量分析法による分析は、ＯｍｐＡ−リーダーが除去されたこと、精製された物質は、予想通り、ＲＡＧＥの残基２３（すなわち、配列Ａ−Ｑ−Ｎ−）から始まることを確認した。
構築物＃２から＃７をコードするプラスミドをイー・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に別々に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢプレート上に播種し、３７℃で一晩温置した。翌日、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の１Ｌにコロニーを接種し、３０℃で１９時間振盪した。遠心（１５，９００×ｇ、１０分、４℃）によって細胞を沈降させ、次いで、−８０℃で凍結した。沈降物（それぞれ、５から６グラム）を融解し、溶解緩衝液［５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８、３００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩの１ｍＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ、５ｍＭβ−メルカプトエタノール］５０ｍＬ中に再懸濁した。Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ上で、可溶化液を２分間音波処理した後、２０Ｋ×ｇで３０分間、遠心した。ＰｒｏＢｏｎｄ Ｎｉｃｋｅｌ Ｒｅｓｉｎの床容積２ｍＬをＢｉｏ−ＲａｄのＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ１０カラムに充填し、溶解緩衝液で平衡化した。清澄化された可溶化液を３回連続カラムに通過させた後、洗浄緩衝液［２×ＰＢＳ、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、５ｍＭβ−メルカプトエタノール］の３×１０カラム容積（合計６０ｍＬ）で洗浄した。溶出緩衝液［２×ＰＢＳ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、５ｍＭβ−メルカプトエタノール］の５×１カラム容積（合計１０ｍＬ）を用いて、タンパク質をカラムから溶出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ１０ＤＧカラムを用いて、溶出された物質をＰＢＳ、１０％グリセロール及び１ｍＭＤＴＴ中に移した。
７．２．抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体１１Ｅ６、４Ｅ５及び７Ｆ９の発現
ハイブリドーマ細胞の増殖のために使用した培地は、１０％のウルトラローＩｇＧウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−カタログ番号１６２５０−０７８）を含有するＢＤ Ｃｅｌｌ ＭＡｂ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ−カタログ番号２２０５１１）からなった。簡潔に述べれば、ＲＡＧＥモノクローナル抗体１１Ｅ６を発現するマウスハイブリドーマ細胞株の複数の３００ｍＬの種培養物を、１．０×１０６細胞／ｍＬの密度に達するまで、温置装置中で振盪しながら（６５ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７０Ｃ）、２Ｌのローラー瓶中で増殖させた。次いで、１４ロック／分の運転設定、６°のロック角度、３７℃の温度及び０．１５Ｌｐｍの８％ＣＯ２注入速度で、２５ＬのＷａｖｅ ＢｉｏＲｅａｃｔｏｒ中で、０．０６×１０６細胞／ｍＬの密度で、培地２０Ｌ中に細胞を播種した。２日後に、２４Ｌの最終容積になるように培地を添加することによって、培養物をさらに増殖させ、０．４３×１０６細胞／ｍＬの新しい細胞密度をもたらす。完全な容積になるまで増殖されてから１２日後に、培養物を採集した。連続的な遠心（Ｃａｒｒ ＶｉａＦｕｇｅ、６０００ｒｐｍ、１．７Ｌｐｍ）によって、細胞を除去した。清澄化された培地への５ｍＭＮａＮ３（１ＭＮａＮ３ｓｔｏｃｋ−Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た）の添加後に、精製過程で材料を直ちに使用した。
ハイブリドーマ細胞の増殖のために使用した培地は、１０％のウルトラローＩｇＧウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−カタログ番号１６２５０−０７８）を含有するＢＤ Ｃｅｌｌ ＭＡｂ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ−カタログ番号２２０５１１）からなった。簡潔に述べれば、ＲＡＧＥモノクローナル抗体４Ｅ５を発現するマウスハイブリドーマ細胞株の複数の３００ｍＬの種培養物を、１．０×１０６細胞／ｍＬの密度に達するまで、温置装置中で振盪しながら（６５ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７０Ｃ）、２Ｌのローラー瓶中で増殖させた。次いで、１２ロック／分の運転設定、６°のロック角度、３７℃の温度及び０．１５Ｌｐｍの８％ＣＯ２注入速度で、２５ＬのＷａｖｅ ＢｉｏＲｅａｃｔｏｒ中で、０．１２×１０６細胞／ｍＬの密度で、培地５Ｌ中に細胞を播種した。４日後に、２４Ｌの最終容積になるように培地を添加することによって、培養物をさらに増殖させ、０．２４×１０６細胞／ｍＬの新しい細胞密度をもたらす。ロック速度は、１４ロック／分まで増加させた。完全な容積になるまで増殖されてから１２日後に、培養物を採集した。連続的な遠心（Ｃａｒｒ ＶｉａＦｕｇｅ、６０００ｒｐｍ、１．７Ｌｐｍ）によって、細胞を除去した。清澄化された培地への５ｍＭＮａＮ３（１ＭＮａＮ３ｓｔｏｃｋ−Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た）の添加後に、精製過程でこの材料を直ちに使用した。
ハイブリドーマ細胞の増殖のために使用した培地は、１０％のウルトラローＩｇＧウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−カタログ番号１６２５０−０７８）を含有するＢＤ Ｃｅｌｌ ＭＡｂ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ−カタログ番号２２０５１１）からなった。簡潔に述べれば、ＲＡＧＥモノクローナル抗体７Ｆ９を発現するマウスハイブリドーマ細胞株の複数の３００ｍＬの種培養物を、１．０×１０６細胞／ｍＬの密度に達するまで、温置装置中で振盪しながら（６５ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７０Ｃ）、２Ｌのローラー瓶中で増殖させた。次いで、１２ロック／分の運転設定、６°のロック角度、３７℃の温度及び０．１５Ｌｐｍの８％ＣＯ２注入速度で、２５ＬのＷａｖｅ ＢｉｏＲｅａｃｔｏｒ中で、０．０５×１０６細胞／ｍＬの密度で、培地１０Ｌ中に細胞を播種した。４日後に、２５Ｌの最終容積になるように培地を添加することによって、培養物をさらに増殖させ、０．２５×１０６細胞／ｍＬの新しい細胞密度をもたらす。ロック速度は、１４ロック／分まで増加させた。完全な容積になるまで増殖されてから１０日後に、培養物を採集した。連続的な遠心（Ｃａｒｒ ＶｉａＦｕｇｅ、６０００ｒｐｍ、１．７Ｌｐｍ）によって、細胞を除去した。清澄化された培地への５ｍＭＮａＮ３（１ＭＮａＮ３ｓｔｏｃｋ−Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た）の添加後に、精製過程でこの材料を直ちに使用した。
７．３．抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体１１Ｅ６、４Ｅ５、７Ｆ９の精製
清澄化されたハイブリドーマ培地に、それぞれ、３Ｍ及び１．５Ｍの最終濃度になるように、グリシン及びＮａＣｌを添加した。８．０になるように、ＮａＯＨでｐＨを調整した。５μｍＰａｌｌ Ｃａｐｓｕｌｅ ＃１２０膜フィルターを用いて、材料をろ過し、２００ｍＬのＢｉｏＳｅｐｒａＰｒｏｔｅｉｎＡカラム上に添加した。洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、１ｍＭアジ化ナトリウム）の１１ＣＶでタンパク質溶液を洗浄し、５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）の段階勾配を用いて溶出した。１００ｍＬサイズの画分を集め、Ａ２８０ｎｍを測定することによって、タンパク質濃度を測定した。全てのカラム処理工程は、４℃で行った。４℃で一晩、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０の２０Ｌに対して、プールされた材料を透析した。１０ｍＬ／分でのフロースルーモードで、ＳａｒｔｏＢｉｎｄＱ強塩基性陰イオン交換Ｓｉｎｇｌｅｓｅｐ Ｍｉｎｉｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、更なるクロマトグラフィー精製を達成した。抗体はカラムを結合せず、１つのプールとして収集される。この工程後に、Ａｍｉｃｏｎｓｔｉｒｒｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ（５０００ＭＷＣＯ膜、７５ｐｓｉ、４℃）を用いて、５ｍｇ／ｍＬになるように、材料を濃縮した。最後に、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭホスファート、０．１３８ＭＮａＣｌ、０．００２７ＭＫＣｌ、ｐＨ７．４）２０μＬに対して、抗体を２回透析した（各サイクル、４℃で２４時間）。
７．４．ＥＬＩＳＡ結合実験：
１μｇ／ｍＬになるように、Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２］中に抗原（精製された構築物＃１から７タンパク質）を希釈し、次いで、９６ウェルＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ （Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｂ Ｓｕｒｆａｃｅ、平底、カタログ番号４３９４５４）中に、得られた溶液１００μＬを分取した。密封フィルムでプレートを密封し、４℃で一晩温置した。翌日、ＰＢＳＴ緩衝液［ＳｉｇｍａＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］１５０μＬで、プレートウェルをそれぞれ３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中３％ＮＦＤＭ）の３００μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間、１００ｒｐｍで振盪しながら、プレートを温置した。温置工程後、ＰＢＳＴ１５０μＬで、各ウェルを再び３回洗浄した。検査されるべき対応する抗体（すなわち、７Ｆ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５）１００μＬを、ＰＢＳＴ／０．５％ＢＳＡ中に作製された様々な希釈で添加した。次いで、密封フィルムでプレートを密封し、室温で２時間、１００ｒｐｍで振盪しながら、プレートを温置した。次に、抗体溶液をウェルから排出し、次いで、ＰＢＳＴ２００μＬで、各ウェルを３回洗浄した。次いで、各ウェルに、連結された二次抗体［ロバ抗マウスＨＲＰＯ連結物、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０］の１：５０００希釈（ＰＢＳＴ／１％ＮＦＤＭ）の２００μＬを添加した。プレートを覆い、１００ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間温置した。この温置後、ウェルから溶液を除去し、ＰＢＳＴ２００μＬで、各ウェルを３回洗浄した。ＨＲＰＯ基質［３，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン液体基質（ＴＭＢ）、Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ４４４４］溶液１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１０分間、プレートを温置した。最後に、反応を停止するために、２ＭＨ２ＳＯ４５０μＬを各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、各ウェルのＡ５４０ｎｍを測定した。
これらの結合実験の結果が図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃ並びに７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに示されている。図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、ＲＡＧＥ残基２４から２３４が、ＲＡＧＥモノクローナル抗体１１Ｅ６、４Ｅ５又は７Ｆ９の結合に関与していなかったことを示す。逆に、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに示されているように、ＲＡＧＥ残基２３５から３３６は、ＲＡＧＥモノクローナル抗体１１Ｅ６及び４Ｅ５の結合のために十分であった。ＲＡＧＥｍＡｂ７Ｆ９は、これらの（イー・コリ発現された）ＲＡＧＥ断片の何れにも、一切結合を示さなかった。
エピトープマッピング
８．１．１１Ｅ６、４Ｅ５及び７Ｆ９抗体の固定化
ＣＮＢｒ活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅファーストフロー樹脂約２０ｍｇを、３５μｍフリットが装着された３つのコンパクトな反応カラム中に秤量した。１ｍＭＨＣｌ２００μＬで３回洗浄する前に、１ｍＭＨＣｌ２００μＬ中で樹脂を膨潤させた。続いて、５００ｍＭ塩化ナトリウム（緩衝液Ａ）を含有する１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．３）２００μＬで、樹脂を３回濯いだ。完了したら、緩衝液の薄い層のみが各樹脂の表面上に残存するように、溶液をカラムから流した。抗体約５．５ｎｍｏｌｅを樹脂に固定化し、これには、７Ｆ９の２３５μＬ（３．４ｍｇ／ｍＬ）、１１Ｅ６の５００μＬ（１．６ｍｇ／ｍＬ）及び４Ｅ５の２００μＬ（３．７５ｍｇ／ｍＬ）の添加が必要であった。７Ｆ９及び４Ｅ５抗体の固定化のために、緩衝液Ａ２００μＬも含めた。コンパクトな反応カラムを密封し、室温で４時間、反転によって混合させた。完了したら、コンパクト反応カラムの開封し、結合していない抗体を除去するために、緩衝液Ａの２００μＬを３回添加して流した。流した後、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び５００ｍＭ塩化ナトリウム（緩衝液Ｂ）を含有する緩衝液２００μＬを各カラムに添加した。カラムを再度密封し、樹脂上の結合されていないが、活性化された部位をブロックするために、室温で、反転によって混合させた。２時間後に、カラムを開封し、最初に、５００ｍＭ塩化ナトリウム（緩衝液Ｃ）を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）２００μＬ、続いて、緩衝液Ｂの２００μＬを流した。結合されていない抗体を完全に除去し、樹脂上の残りの付着部位を完全にブロックすることを確実にするために、このプロセスをさらに２回反復した。次いで、抗原を連結する前に、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）（緩衝液Ｄ）の２００μＬで樹脂を４回洗浄した。
８．２．イー・コリ及びＢａｃＭａｍによって発現されたｓＲＡＧＥ抗原のタンパク分解性切除
イー・コリによって発現された抗原７５μＬを１１Ｅ６及び４Ｅ５樹脂へ添加し、ＢａｃＭａｍによって発現された抗原１２５μＬを１１Ｅ６、４Ｅ５及び７Ｅ９樹脂へ添加することによって、ｓＲＡＧＥ抗原を抗体カラムへ結合させた。カラムを密封し、室温で２時間、反転によって試料を混合させた。この時間の後、カラムの開封し、緩衝液Ｄ２００μＬの４回添加によって流した。濯ぎを通して流した後、緩衝液Ｄの２００μＬ中に、及びプロテアーゼ（トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ又はキモトリプシンの何れかの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として作製された。）とともに樹脂を再懸濁した。消化を弱めるために、プロテアーゼの量は実験の間に変動したが、プロテアーゼに対して、重量で抗原の２００から４００倍過剰の範囲であった。１２時間反転によって混合しながら、タンパク分解を室温で起こさせた。この時間の後、カラムを開封し、タンパク質分解溶液を流し、さらなる分析のために保存した。二重消化に供された試料に関しては、次の工程の前に、緩衝液Ｄ及び第二のプロテアーゼの２００μＬ中に樹脂を再懸濁した。第二のプロテアーゼ中で処理されていない試料に関しては、緩衝液Ｄ中でのそれぞれ２００μＬの洗浄２回、続いて、緩衝液Ａ中で２００μＬの洗浄、次いで、最後に緩衝液Ｄ中で２００μＬの洗浄にカラムを供した。各洗浄は、その後の分析のために別々に保持した。それぞれ、２％ギ酸中での２００μＬの３回の洗浄で、エピトープを含有するペプチドをカラムから溶出させた。各溶出試料は、その後の分析のために別々に保持した。
８．３．エピトープ含有ペプチドの質量分析による分析
Ｂｒｕｋｅｒ Ａｐｅｘ ＱＥ ７Ｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ （ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析装置及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑ−ＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ Ｉ質量分析装置の両方を用いて試料を分析した。ＦＴ−ＩＣＲ質量分析のために、Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００キャピラリーＨＰＬＣによって、エピトープ切断試料８μＬをＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ４逆相カラム（０．５×１５０ｍＭ、５μ粒子サイズ、３００オングストローム孔サイズ）上に注入した。脱塩するために、５μＬ／分の流速で、０．１％ギ酸を加えた９０％水（溶媒Ａ）０．１％ギ酸を加えた１０％アセトニトリル中で、試料を５分間洗浄した。５％溶媒Ａ／９５％溶媒Ｂへ移動相の組成を変化させることによって、ペプチドを質量分析装置中に溶出した。直列質量分析のために直接の注入を必要とする試料は、９８％水、１％アセトニトリル及び１％ギ酸中に平衡化されたタンパク質Ｍｉｃｒｏｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ）上に注入した。６０％アセトニトリル、４０％水及び０．１％ギ酸３００μＬ中に溶出する前に、平衡化溶媒１ｍＬで試料を洗浄した。２μＬ／分で、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析装置中に溶出液を直接注入した。Ｑ−ＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ質量分析装置に対して、Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００ＨＰＬＣによって、タンパク質Ｍｉｃｒｏｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ）上に試料の５から３０μＬの間を注入した。結合されたペプチドを５％溶媒Ａ／９５％溶媒Ｂ中の質量分析装置中に溶出する前に、９５％溶媒Ａ／５％溶媒Ｂ中で、試料を１分間洗浄した。
１１Ｅ６抗体に結合されたイー・コリによって発現されたｓＲＡＧＥのタンパク分解による切除及びエピトープ含有ペプチドの溶出は、１２，２０４．５Ｄａの質量を有するペプチドの存在を明らかにした。質量選択及び１０＋電荷状態の衝突によって活性化された解離は、このペプチドの正体を確認し、残基Ｖａｌ２２９−Ｈｉｓ３４６（このＨｉｓ残基は、ｓＲＡＧＥタンパク質へのヘキサＨｉｓタグの付加によるものである。）に対応した。トリプシンの後にキモトリプシンタンパク分解を使用するさらなるエピトープマッピングは、Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグの切断を明らかにし、従って、エピトープを残基Ｖａｌ２２９−Ｈｉｓ３４１へ純化した（このＨｉｓ残基は、ｓＲＡＧＥタンパク質へのヘキサＨｉｓタグの付加によるものである。）。このエピトープのさらなる純化は、タンパク質分解を用いては得られなかった。イー・コリによって発現された４Ｅ５抗体に結合されたｓＲＡＧＥの同様に行われたタンパク分解的切除は、１１Ｅ６抗体エピトープに対して観察された１２，２０４．５Ｄａの同じペプチドを明らかにした。同様に、ＢａｃＭａｍによって発現された、１１Ｅ６又は４Ｅ５抗体の何れかに結合されたｓＲＡＧＥの切除は、１０，６７１．９Ｄａ及び１０，６１４．０Ｄａの質量のペプチドを含有する２つの主要なエピトープを明らかにした。これらのペプチドは、ＢａｃＭａｍによって発現された構築物のＣ末端に合致し、それぞれ、残基Ｖａｌ２２９−Ｇｌｙ３３１及びａｌ２２９−Ａｌａ３３０を貫く。
ＢａｃＭａｍによって発現された７Ｆ９抗体に結合されたｓＲＡＧＥのタンパク分解による切除及びエピトープ含有ペプチドの溶出は、幾つかの重複するペプチドに相当する複数の種を明らかにした。質量分析の解析は、１２，０７９．６Ｄａ、１２，３７２．９Ｄａ、１３，４７７．３Ｄａ及び２４，１３２．３Ｄａの質量のペプチドを明らかにした。これらの質量は、それぞれ、残基Ａｓｎ１０５−Ａｒｇ２１６、Ａｓｎ１０５−Ａｒｇ２１８、Ａｓｎ１０５−Ａｒｇ２２８及びＡｓｎ１０５−Ｇｌｙ３３１に合致し、最小のエピトープが残基Ａｓｎ１０５−Ａｒｇ２１６を包含することを示唆する。
これらの結果は、抗体１１Ｅ６及び４Ｅ５がイー・コリ及びＢａｃＭａｍによって発現されたｓＲＡＧＥのＣ末端上のエピトープを有すること、及び抗体７Ｆ９がＢａｃＭａｍによって発現されたｓＲＡＧＥの中心ドメイン上のエピトープを認識することを示唆する。
Ｂｉａｃｏｒｅ及び表面プラズモン共鳴測定
Ｂｉａｃｏｒｅ及び表面プラズモン共鳴測定を用いて、本発明の３つのモノクローナル抗体（すなわち、７Ｆ９、１１Ｅ６及び４Ｅ５）の親和性を測定した。
９．１．抗ＲＡＧＥ結合速度論測定のための材料と方法
マウス抗ＲＡＧＥｍＡｂ結合速度論を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００装置を使用した。ｍＡｂ親和性分析のためのアッセイフォーマットは、固定化された抗Ｆｃ抗体を介したＦｃを基礎とする捕捉であった。一級アミンを介して、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のカルボキシメチル（ＣＭ）デキストラン表面へＦｃ特異的なＩｇＧを固定化するために、標準的なアミンカップリングプロトコールを使用した。マウス抗ＲＡＧＥｍＡｂの研究のために、固定化された捕捉試薬として、抗マウスＦｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、抗マウス、ＢＲ−１００５−１４）を使用した。センサーチップの４つのフレーセル全てに、捕捉試薬の８０００から１００００ＲＵを固定化するために、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００上で利用可能な自動化されたプロトコールを使用した。簡潔に述べると、調製直後の１：１５０ｍＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：２００ｍＭ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）によって、ＣＭ−デキストラン表面を活性化した。次いで、抗体ＦｃＩｇＧ捕捉試薬（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２０μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）を表面に適用した後、表面の脱活性化及び１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）での残存する反応性部位のブロッキングを行った。
使用した走行緩衝液は、マウス抗ＲＡＧＥｍＡｂに対して、ＨＢＳ−ＥＰ＋［１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％Ｐ２０界面活性剤（Ｂｉａｃｏｒｅ）］であった。各実験サイクルは、以下の工程からなった。１）５０から２００ＲＵ（抗原に依存する。）のレベルになるように、抗ＲＡＧＥｍＡｂをフローセル２，３又は４中に捕捉した。全ての測定は、捕捉された抗ＲＡＧＥｍＡｂを持たないフローセル１に対して参照された。２）６０μＬ／分で１８０μＬ、４つのフローセル全てを通じて、抗原を注入した。抗原注射後、６０μＬ／分で、６００秒間、解離をモニターした。３）抗Ｆｃ捕捉表面を低ｐＨグリシンで再生した。速度論測定のために、ＲＡＧＥ注入は、無作為化された２つ組みの２０ｎＭから０．３１Ｍ及び緩衝液のみの２倍希釈系列であった。
９．２．評価と結果
データは、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて処理した。簡潔に述べれば、まず、参照セルからのシグナルを差し引き、次に、緩衝液のみの注入からのシグナルを差し引くことによって、データを二重に参照した。次いで、結合速度論の速度定数ｋａ及びｋｄ並びに親和性ＫＤを測定するために、ＲＡＧＥ注入系列から得られた二重参照されたデータを１：１の（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデル（質量転移項を含んだ。）へ全般的にフィットさせた。
表７は、４Ｅ５がマウスＲＡＧＥ（Ｍｕ−ＲＡＧＥ）に結合しなかったことを示す。１１Ｅ６及び４Ｅ５は、ＲＡＧＥへの結合に関して、互いに交叉競合した。７Ｆ９は、グリコシル化を欠如するイー・コリ中で産生されたＲＡＧＥには結合しなかった。
表７は、タンパク分解による消化からのヒトｓＲＡＧＥの保護及び質量分析による保護されたペプチドの同定を用いてエピトープマッピングを介した、本発明の３つの抗体がヒトＲＡＧＥに結合される特異的なエピトープも示している。ＭＡｂ７Ｆ９はＣ１（Ａｓｎ１０５−Ｐｒｏ２１５）に結合し；ｍＡｂ４Ｅ５はＣ２（イー・コリＲＡＧＥ中のＶａｌ２２９−Ｔｈｒ３４０；哺乳動物細胞中で産生されたｈｕｓＲＡＧＥ中のＶａｌ２２９−Ｇｌｙ３３１）に結合し、１１Ｅ６はＣ２（イー・コリＲＡＧＥ中のＶａｌ２３８−Ａｒｇ３１４；哺乳動物細胞中で産生されたｈｕｓＲＡＧＥ中のＶａｌ２２９−Ｇｌｙ３３１）に結合した。
表７：抗体が結合するエピトープ
Figure 2016104740
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス中でのインビボ脳血液容積（ＣＢＶ）の研究
１０．１．動物
自由に餌及び水を与えて、１２時間の光オン／１２時間の光オフ（０６：００にオン）の条件下の静かな部屋の中で、標準的な無菌の木の切れ端の床の上で、Ｃ５６ＢＬ／６雌マウス（４から６月齢；Ｔａｃｏｎｉｃ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ）を維持した。ｆＭＲＩ−ＣＢＶ研究では、合計３３マウスを使用した。全ての研究は、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ」による認証を受けた施設内で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓガイドラインを遵守し、Ａｂｂｏｔｔ社のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認を受け、綿密に監視された。
１０．２．可溶性Ａβペプチドの調製
ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで、Ａβ１−４０（＞９９％純粋）を合成した。要約すれば、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を１ｍＭＩＰＴＧで誘導し、４１℃で３時間発現させ、１８Ｌの発酵装置中で３時間実施した。細胞ペースト１８５ｇを採集した。ペプチドは、封入体として発現された。０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ１００を含有する０．１Ｍｔｒｉｓ緩衝液中で細胞を溶解した。次いで、５０ｍＭｔｒｉｓ緩衝液で３回、水で１回ペレットを洗浄した。洗浄液を廃棄し、最終のペレットを水の中に再懸濁し、凍結乾燥した。凍結乾燥されたペレットをＤＭＳＯ５００ｍＬ中に抽出し、水中の０．２％アンモニアで１Ｌになるように希釈した。０．１％アンモニアを含有する１０％エタノール１９Ｌに対して、この１Ｌ試料を透析した。室温で合計５時間、水中の０．１％アンモニアのみを用いて、透析を続けた。０．１％アンモニアを用いて、１．４Ｌの試料を２Ｌまで希釈し、水中の０．１％アンモニアで平衡化された２．５×２５ｃｍＰＬＲＰ−ＳＨＰＬＣカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ， Ａｍｈｅｒｓｔ， ＭＡ）に適用した。０．１％アンモニアを含有するアセトニトリルで、溶出した。Ａβ１−４０は、２００分にわたる１０から３０％への勾配の間に溶出した。プールされた材料を凍結乾燥した。材料の正体と純度を確認するために、ＭＡＬＤＩ分析を使用した。材料はＡβＭｅｔ−１−４０として精製され、Ｎ１５標識された。試料中に、メチオニンスルホキシドの少量が＋１６質量単位で存在した。ペプチドのアンモニウム塩として、この単一の実行中に１３８ｍｇが精製された。逆配列Ａβ４０−１（＞９９％純粋）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）から購入した。全てのｆＭＲＩ−ＣＢＶ実験の直前に、Ａβペプチド（０．０１又は０．１ｍｇ）を新鮮なリン酸緩衝化された生理的食塩水（０．１ｍＬ；ＰＢＳ）中に別々に溶解した。初期研究のために、５つの処理群（ＰＢＳ対照、Ａβ１−４０（０．０１又は０．１ｍｇ／マウス）又はＡβ４０−１（０．０１又は０．１ｍｇ／マウス）（各群５匹の動物）へ、マウスを無作為に割り振った。
１０．３．抗体の調製
陰性ＩｇＧ対照抗体及び抗ＲＡＧＥ抗体１１Ｅ６（何れも９９％超純粋）は、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで合成した。
１０．４．ｆＭＲＩを用いたＣＢＶ測定
全てのｆＭＲＩ実験は、２０Ｇ／ｃｍの磁場勾配インサート（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｂｒｕｋｅｒ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を有する７．０Ｔ／２１ｃｍ水平磁石上で行った。
まず、メジトミジン（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｅｘｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， ＵＳＡ）＋ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｏｗａ， ＵＳＡ）で動物に麻酔をかけ、次いで、伝達のためのボリュームコイル及び受容のための表面コイルを含有する二重コイルの小さな動物拘束装置（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＬＬＣ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）中に配置した。力伝達装置を介して、呼吸速度と波形を継続的にモニターした。直腸温をモニターし、フィードバックによって制御される循環水パッドを介して、３７±１℃に維持した。全ての画像化は、明期の間に行った。コイルからコイルへの電磁気的相互作用は、能動的にデカップルさせた。ＴＲ＝３秒、有効ＴＥ＝１００ｍ秒、マトリックス＝２５６×２５６、ＦＯＶ＝２．５６ｃｍ×２．５６ｃｍ、９つの１．０ｍｍスライス及び４つの平均を用いる高速スピンエコー迅速取得緩和増強（ＲＡＲＥ；ｒａｐｉｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ）パルス系列を使用して、解剖学的画像を取得した。ＴＲ＝２秒、ＴＥ＝１３ｍ秒、マトリックス＝６４×６４、ＦＯＶ＝２．５６ｃｍ×２．５６ｃｍのｆＭＲＩ−ＣＢＶ画像取得のために、勾配エコー単一ショットエコーぷらなー画像化（ＥＰＩ；ｅｃｈｏ−ｐｌａｎａｒ ｉｍａｇｉｎｇ）を使用し、４００μｍ×４００μｍの平面内解像度を与えた。１０ｍｇＦｅ／ｋｇの極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）造影剤（ＳＨ Ｕ５５５Ｃ， Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１８分の画像取得中に２分、静脈内投与した。シリンジポンプ（０．１ｍＬ／分、１分間）を用いて、造影剤の６分後に、尾静脈を介して、可溶性Ａβ及びＰＢＳを投与し、次いで、その後の１０分の期間にわたって、ＣＢＶの変化を検出した。画像化研究を開始する３時間前に、ホームケージ中のマウスに対照ＩｇＧ１抗体又は１１Ｅ６を腹腔内投与した。
１０．５．ｆＭＲＩデータ解析
データ解析は、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏ Ｉｍａｇｅｓ（ＡＦＮＩ）ソフトウェアパッケージ（Ｃｏｘ Ｒ Ｗ， Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ ２９：１６２−１７３， １９９６）を用いて行った。時間依存的な相対的ＣＢＶ変化を特定するために、以下の関係に基づいて、時間経過の生データからｒＣＢＶ（ｔ）を計算した。
Figure 2016104740
 ｓ（ｔ）はＡβ又はＰＢＳ注入後のシグナル強度であり、Ｓ０（ｔ）はＡβ又はＰＢＳ注入前のベースラインシグナルであり、Ｓｐｒｅは造影剤の投与前の平均シグナル強度である。血液からの造影剤の除去を考慮するために、線形関数を用いて経時的なｒＣＢＶ変化をトレンド除去した（Ｃｏｘ，１９９６）。
続いて、全てのマウスにおける各ボクセルに対するｒＣＢＶシグナルを、薬物の速度論を反映する非線形微分指数関数モデル（式２）（Ｌｕｏ ｅｔ ａ．，２００４）にフィッティングした（ｔ０は応答の時間遅延であり、ｋは多重係数であり、α１は除去速度であり、α２は吸収速度である。）。
ｙ（ｔ）＝ｋ（ｅ−α１（ｔ−ｔ０）−ｅ−α２（ｔ−ｔ０）） ｔ＞ｔ０ 式２
パラメータｔ０、ｋ、α１及びα２に対してフィッティングされた初期値は、公知のＡβ速度論に基づいて（Ｓｈｉｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４：９６３２−９６３７， ２００４）、それぞれ、０から４５秒、−５００から５００、０から０．１５及び０．１５から０．５であった。ｔ０、ｋ、α１及びα２に対する最終値は、モデルフィッティングの最大有意性に基づいて、ＡＦＮＩを用いて自動的に決定された。次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正後に、活性化されたｒＣＢＶボクセルを求めた。
図８に示されている結果は、Ａβ１−４０が用量依存的及び領域特異的な様式で、ＣＢＶを減少させたことを示す（０．０１ｍｇで図８ａ及び０．１ｍｇで図８ｂ）。減少したＣＢＶの程度は、Ａβ１−４０のより低用量（図８ａ）と比較して、高用量（図８ｂ）でマウスを処理したときに、有意に高かったが、類似の脳領域（例えば、前頭皮質、尾状核、視床、海馬）が影響を受けた。Ａβ１−４０の用量依存的な効果とは異なり、逆のペプチドＡβ４０−１は、同じ用量（図８ｃでは０．０１ｍｇ、及び図８ｄでは０．１ｍｇ）で検査したときに、ＣＢＶに有意に影響を及ぼさず、観察されたＣＢＶの何らかの減少の程度はＰＢＳ処理された対照群と有意に異ならなかった（ＰＢＳ、図８ｅ）。１２分の時間経過の間に、Ａβ１−４０によって誘導されたＣＢＶの減少の幅（数個の脳領域にわたって影響を受けたボクセルに対して、１０から２０％の範囲であった。）は、一貫して、投与後５分以内に最大に到達し、研究の間低下したままであり（代表的なデータが、図８ｆに、海馬に対して示されている。）、Ａβ１−４０の両用量に関して似通っていた。これらのデータは、侵襲性レーザードップラー流速計測技術を用いたさらなる研究と合致している（データは図示せず）。
ｆＭＲＩを用いて、ＣＢＶに対する１１Ｅ６の効果を検査するために、対照ＩｇＧ１抗体の投与前の効果をまず評価した。予想通り、画像化を開始する３時間前に、ＩｇＧ１抗体を予め投与することによって、Ａβ１−４０を用いた攻撃の効果を遮断することはできなかった（０．０１ｍｇ、図９ａ）。これに対して、画像化を開始する３時間前に与えた０．１ｍｇ／マウスの用量の１１Ｅ６は、Ａβ１−４０での攻撃によって正常に惹起されたＣＢＶの減少を完全に遮断した（０．１ｍｇ、図９ｂ）。同様に、ＣＢＶ振幅の減少は、抗ＲＡＧＥ抗体１１Ｅ６での前処理によっても喪失したが、対照抗体によっては喪失しなかった（図９ｃ）。これらのデータは、アルツハイマー病に対して適切な動物モデルにおける、抗体１１Ｅ６のインビボでの機能的活性を示している。
ＣＤＲ移植された抗体の構築
本分野において周知の標準的な方法を適用することによって、モノクローナル抗体１１Ｅ６のＶＨ及びＶＬ鎖のＣＤＲ配列（上記表４参照）を、異なる異なるヒト重及び軽鎖アクセプター配列中に移植する。本発明のモノクローナル抗体１１Ｅ６のＶＨ及びＶＬ配列との配列ＶＨ及びＶＬ並置に基づいて、以下の公知のヒト配列が選択される。
ａ）重鎖アクセプター配列を構築するために、ＶＨ７−４．１及びＶＨ１−２並びに連結配列ｈＪＨ６（上記表２に従う。）；
ｂ）軽鎖アクセプター配列を構築するために、１−１２／Ｌ５及び３−１５／Ｌ２並びにｈＪＫ２（上記表３に従う）。
前記アクセプター配列中に１１Ｅ６の対応するＶＨ及びＶＬＣＤＲを移植することによって、以下のＣＤＲ移植され、ヒト化され、修飾されたＶＨ及びＶＬ配列：ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬ、ＶＨ１Ｅ６．２−ＧＬ、ＶＬＨＥ６．１−ＧＬ及びＶＬ１１Ｅ６．２−ＧＬを調製した（上記表５も参照）。
ＣＤＲ移植された抗体中でのフレームワーク逆変異の構築
ヒト化抗体フレームワーク変異を作製するために、本分野で周知の方法を使用し、可変ドメイン及び／又は変異誘発プライマー及びＰＣＲの新規合成を使用して、ＣＤＲ移植された抗体中に変異を導入する。ＣＤＲ移植の各々に対して、逆変異と他の変異の異なる組み合わせを以下のように構築する。
重鎖ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬに対して、以下の１つ又はそれ以上 Ｖｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基を以下のように逆変異させる。Ｖ２−＞Ｉ及び／又はＹ９５−＞Ｆ。
重鎖ＶＨ１１Ｅ６．２−ＧＬに対して、以下の１つ又はそれ以上 Ｖｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基を以下のように逆変異させる。Ｖ２−＞Ｉ、Ｖ６８−＞Ｆ、Ｍ７０−＞Ｆ、Ｒ７２−＞Ｌ、Ｙ９５−＞Ｆ。
軽鎖ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬに対して、以下の１つ又はそれ以上 Ｖｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基を以下のように逆変異させる。Ａ４３−＞Ｓ、Ｙ４９−＞Ｆ、Ｙ８７−＞Ｆ。
軽鎖ＶＬ１１Ｅ６．２−ＧＬに対して、以下の１つ又はそれ以上 Ｖｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基を以下のように逆変異させる。Ａ４３−＞Ｓ、Ｙ４９−＞Ｆ、Ｉ５８−＞Ｖ、Ｙ８７−＞Ｆ。
さらなる変異には、以下のものが含まれる。
重鎖に対して
ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬ、Ｑ１−＞Ｅ及び
ＶＨ１１Ｅ６．２−ＧＬ、Ｑｌ−＞Ｅ、Ｉ７６―＞Ｔ、Ｒ８５−＞Ｓ、Ｄ８９−＞Ｅ；
軽鎖に対して
ＶＬ１１Ｅ６．１−ＧＬ、Ｖ１１−＞Ｌ及び
ＶＬ１１Ｅ６．２−ＧＬ、Ｖ１３−＞Ｌ、Ｅ７０−＞Ｄ。
組換えヒト化抗ＲＡＧＥ抗体の構築及び発現
完全長のヒト化抗体を一過性に産生させるために、フレームワーク逆変異を含有する重鎖及び軽鎖を有するｐＨｙｂＥ発現ベクターを２９３−６Ｅ細胞中に同時形質移入した。可変ドメインの新規合成によって及び／又は突然変異誘発プライマー及びＰＣＲ並びに本分野で周知の方法によって、実施例１１に従って調製されたＣＤＲ移植された抗体配列中に変異を導入した。ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が表８に開示されている。
Figure 2016104740
Figure 2016104740
Figure 2016104740
Figure 2016104740
具体的には、重鎖に対して：
ＶＨｈ１１Ｅ６．１、ＶＨｈ１１Ｅ６．２、ＶＨｈ１１Ｅ６．３及びＶＨｈ１１Ｅ６．４は、ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬを含有し、Ｑ１−＞Ｅ変異を有する。
ＶＨｈ１１Ｅ６．５，ＶＨｈ１１Ｅ６．６，ＶＨｈ１１Ｅ６．７及びＶＨｈ１１Ｅ６．８は、ＶＨ１１Ｅ６．１−ＧＬを含有し、Ｑ１−＞Ｅ変異並びに以下のＶｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基逆変異：Ｖ２−＞Ｉ及びＹ９５−＞Ｆを有する。
ＶＨｈ１１Ｅ６．９、ＶＨｈ１１Ｅ６．１０、ＶＨｈ１１Ｅ６．１１及びＶＨｈ１１Ｅ６．１２は、ＶＨ１１Ｅ６．２−ＧＬを含有し、Ｑ１−＞Ｅ、１７６−＞Ｔ、Ｒ８５−＞Ｓ及びＤ８９−＞Ｅ変異を有する。
ＶＨｈ１１Ｅ６．１３，ＶＨｈ１１Ｅ６．１４，ＶＨｈ１１Ｅ６．１５及びＶＨｈ１１Ｅ６．１６は、ＶＨ１１Ｅ６．２−ＧＬを含有し、Ｑ１−＞Ｅ、１７６−＞Ｔ、Ｒ８５−＞Ｓ及びＤ８９−＞Ｅ変異を有し、並びに以下のＶｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基逆変異：Ｖ２−＞Ｉ、Ｖ６８−＞Ｆ、Ｍ７０−＞Ｆ、Ｒ７２−＞Ｌ及びＹ９５−＞Ｆを有する。
軽鎖に対して：
ＶＬｈ１１Ｅ６．１，ＶＬｈ１１Ｅ６．５，ＶＬｈ１１Ｅ６．９及びＶＬｈ１１Ｅ６．１３は、ＶＬ１１Ｅ６．１−ＧＬを含有し、Ｖ１１−＞Ｌ変異を有する。
ＶＬｈ１１Ｅ６．２，ＶＬｈ１１Ｅ６．６，ＶＬｈ１１Ｅ６．１０，及びＶＬｈ１１Ｅ６．１４は、ＶＬ１１Ｅ６．１−ＧＬを含有し、Ｖ１１−＞Ｌ変異並びに以下のＶｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基逆変異：Ａ４３−＞Ｓ、Ｙ４９−＞Ｆ及びＹ８７−＞Ｆを有する。
ＶＬｈ１１Ｅ６．３、ＶＬｈ１１Ｅ６．７、ＶＬｈ１１Ｅ６．１１及びＶＬｈ１１Ｅ６．１５は、ＶＬ１１Ｅ６．２−ＧＬを含有し、Ｖ１３−＞Ｌ及びＥ７０−＞Ｄ変異を有する。
ＶＬｈ１１Ｅ６．４、ＶＬｈ１１Ｅ６．８、ＶＬｈ１１Ｅ６．１２及びＶＬｈ１１Ｅ６．１６は、ＶＬ１１Ｅ６．２−ＧＬを含有し、Ｖ１３−＞Ｌ及びＥ７０−＞Ｄ変異並びに以下のＶｅｒｎｉｅｒ及びＶＨ／ＶＬ境界面残基逆変異：Ａ４３−＞Ｓ、Ｙ４９−＞Ｆ、Ｉ５８−＞Ｖ及びＶ８７−＞Ｆ。
競合的ＥＬＩＳＡを用いたヒト化１１Ｅ６抗体の性質決定
０．２Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．４中の２μｇ／ｍＬｈＲＡＧＥ（１−３３１）の５０μＬ／ウェルで、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３６９）を４℃で一晩被覆し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の２％無脂肪ドライミルクの２００μＬ／ウェルで、室温で１時間ブロックした。洗浄緩衝液での洗浄後、ＥＬＩＳＡ緩衝液の５０μＬ／ウェル中に、ビオチン化されたｍ１１Ｅ６（０．３μｇ／ｍＬの最終濃度）及び８１μｇ／ｍＬの最終濃度から開始し、３倍系列希釈される標識されていない競合検査抗体の混合物を２つ組みで添加した。室温で１時間プレートを温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中のＨＲＰ連結ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒｌａｄ）の１：１０，０００希釈の１００μＬ／ウェルを用いて、結合された抗体を検出した。室温で１時間の温置及び洗浄緩衝液で洗浄後、ＴＭＢ緩衝液（Ｚｙｍｅｄ）の１００μＬ／ウェルを添加することによって、呈色を行った。室温で１５分間温置した後、１Ｎ塩酸の５０μＬ／ウェルを添加することによって、呈色を停止させた。吸光度を４９０ｎｍで読み取った。表９は、コンピュータソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて得られたヒト化１１Ｅ６抗体のＩＣ５０値を示す。
Figure 2016104740
ＲＡＧＥとの抗ＲＡＧＥｍＡｂ相互作用に対する結合定数の測定
抗ＲＡＧＥｍＡｂ結合速度論を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００及びＢｉａｃｏｒｅＴ１００装置を使用した。ｍＡｂ親和性分析のためのアッセイフォーマットは、固定化された抗Ｆｃ抗体を介したＦｃを基礎とする捕捉であった。一級アミンを介して、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）のカルボキシメチル（ＣＭ）デキストラン表面へＦｃ特異的なＩｇＧを固定化するために、標準的なアミンカップリングプロトコールを使用した。マウス抗ＲＡＧＥｍＡｂの研究のために、固定化された捕捉試薬として、抗マウスＦｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、抗マウス、ＢＲ−１００５−１４）を使用し、ヒト化抗ＲＡＧＥｍＡｂの研究のために、固定化された捕捉試薬として、抗ヒトＦｃ（Ｐｉｅｒｃｅ３１１２５）を使用した。センサーチップの４つのフローセル全てに、捕捉試薬の８０００から１００００ＲＵを固定化するために、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００及びＢｉａｃｏｒｅＴ１００上で利用可能な自動化されたプロトコールを使用した。簡潔に述べると、新たに調製された１：１の５０ｍＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：２００ｍＭ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）によって、ＣＭ−デキストラン表面を活性化した。次いで、抗ＦｃＩｇＧ捕捉試薬（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２０μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．５）を表面に適用した後、表面の脱活性化及び１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）での残存する反応性部位のブロッキングを行った。
使用した走行緩衝液は、ヒト化抗体に対して、ＰＢＳ−Ｐ［１×ＰＢＳ（ＳｉｇｍａＰ３８１３）、ｐＨ７．４、０．００５％Ｐ２０界面活性剤（Ｂｉａｃｏｒｅ）］であった。各実験サイクルは、以下の工程からなった。１）５０から２００ＲＵ（抗原に依存する。）のレベルになるように、抗ＲＡＧＥｍＡｂをフローセル２，３又は４中に捕捉した。全ての測定は、捕捉された抗ＲＡＧＥｍＡｂを持たないフローセル１に対して参照された。２）８０μＬ／分で２４０μＬ、４つのフローセル２４０μＬ全てを通じて、抗原を注入した。抗原注射後、８０μＬ／分で、６００秒間、解離をモニターした。３）抗Ｆｃ捕捉表面を低ｐＨグリシンで再生した。速度論測定のために、抗原注射は、無作為化された２つ組みの、３０ｎＭから０．１２ｎＭ（ｓＲＡＧＥ［ＲＡＧＥ（１−３３１）］）の３倍希釈系列及び緩衝液のみの何れかであった。
データは、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア又はＳｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の何れかを用いて処理した。簡潔に述べれば、まず、参照セルからのシグナルを差し引き、次に、緩衝液のみの注入からのシグナルを差し引くことによって、データを二重に参照した。次いで、結合速度論の速度定数ｋａ及びｋｄ並びに親和性ＫＤ（ｋａ＝ｋｏｎ；ｋｄ＝ｋｏｆｆ）測定するために、ＲＡＧＥ注入系列に対する二重参照されたデータを１：１の（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデル（質量転移項を含んだ。）へ全般的にフィットさせた。
Figure 2016104740
ＫＤ値は、３つのｍＡｂ全てに対して、二桁のｐＭであり、その結合速度論に関して、３つのｍＡｂ間に有意な差は存在しないように見受けられる。同時の実験において、元のマウス１１Ｅ６ｍＡｂをこの抗原（ヒトｓＲＡＧＥ１−３３１、Ｖ＃４００）で評価し、同じく二桁ｐＭのＫＤであった。
元のマウス１１Ｅ６ｍＡｂは、以前には、２９０ｐＭであると報告された。しかしながら、初期の実験は、異なる緩衝液系を使用した（Ｂｉａｃｏｒｅ緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋：１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％Ｐ２０）。緩衝液の選択は、もちろん、速度論に影響を与え得る。
高齢のＴｇ２５７６マウス中でのインビボ脳血管血液容積（ＣＢＶ）の研究
１６．１．動物
アルツハイマー病のＴｇ２５７６マウスモデル（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６）は、ハムスタープリオンタンパク質（ＰｒＰ）プロモーターの制御下において、高いレベルで、ＡＰＰのスウェーデン変異（ＡＰＰＫ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）を発現する。この変異は、分泌されたＡｂ４２及びＡｂ４０の同時の増加を引き起こすことがよく確立されている。Ｔｇ２５７６マウスは加齢とともに、アルツハイマー病において見られるものと同様の斑が出現する。さらに、Ｔｇ２５７６マウスは、Ｙ迷路、Ｔ迷路及びＭｏｒｒｉｓの水迷路試験によって評価されたように、年齢依存性の行動的欠陥を生じる（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｉｃｉｔｓ， Ａｂ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２）。
１６．２ 抗体の調製
陰性ＩｇＧ対照抗体及び抗ＲＡＧＥ抗体１１Ｅ６（何れも９９％超純粋）は、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで合成した。
１６．３ ｆＭＲＩを用いたＣＢＶ測定
ｆＭＲＩ−ＣＢＶ実験は、２０Ｇ／ｃｍの磁場勾配インサート（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｂｒｕｋｅｒ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を有する７．０Ｔ／２１ｃｍ水平磁石上で行った。まず、メジトミジン（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｅｘｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， ＵＳＡ）＋ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｏｗａ， ＵＳＡ）で高齢のＴｇ２５７６マウス（１９から２０月齢）に麻酔をかけ、次いで、伝達のためのボリュームコイル及び受容のための表面コイルを含有する二重コイルの小さな動物拘束装置（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＬＬＣ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）中に配置した。力伝達装置を介して、呼吸速度と波形を継続的にモニターした。直腸温をモニターし、フィードバックによって制御される循環水パッドを介して、３７±１℃に維持した。全ての画像化は、明期の間に行った。コイルからコイルへの電磁気的相互作用は、能動的にデカップルさせた。ＴＲ＝３秒、有効ＴＥ＝１００ｍ秒、マトリックス＝２５６×２５６、ＦＯＶ＝２．５６ｃｍ×２．５６ｃｍ、９つの１．０ｍｍスライス及び４つの平均を用いる高速スピンエコー迅速取得緩和増強（ＲＡＲＥ；ｒａｐｉｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ）パルス系列を使用して、解剖学的画像を取得した。ＴＲ＝２秒、ＴＥ＝１３ｍ秒、マトリックス＝６４×６４、ＦＯＶ＝２．５６ｃｍ×２．５６ｃｍのｆＭＲＩ−ＣＢＶ画像取得のために、勾配エコー単一ショットエコープラナー画像化（ＥＰＩ；ｅｃｈｏ−ｐｌａｎａｒ ｉｍａｇｉｎｇ）を使用し、４００μｍ×４００μｍの平面内解像度を与えた。１０ｍｇＦｅ／ｋｇの極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）造影剤（ＳＨ Ｕ５５５Ｃ， Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１８分の画像取得中に２分、静脈内投与した。シリンジポンプ（０．１ｍＬ／分、１分間）を用いて、造影剤の６分後に、尾静脈を介して、マウス１１Ｅ６又は非特異的なマウスＩｇＧ１（対照抗体）を投与し、次いで、その後の１０分の期間にわたって、ＣＢＶの変化を検出した。
１６．４ ｆＭＲＩデータ解析
データ解析は、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏ Ｉｍａｇｅｓ（ＡＦＮＩ）ソフトウェアパッケージ（Ｃｏｘ Ｒ Ｗ， Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ ２９：１６２−１７３， １９９６）を用いて行った。時間依存的な相対的ＣＢＶ変化を特定するために、以下の関係に基づいて、時間経過の生データからｒＣＢＶ（ｔ）を計算した。
Figure 2016104740
 ｓ（ｔ）はＡβ又はＰＢＳ注入後のシグナル強度であり、Ｓ０（ｔ）はＡβ又はＰＢＳ注入前のベースラインシグナルであり、Ｓｐｒｅは造影剤の投与前の平均シグナル強度である。血液からの造影剤の除去を考慮するために、線形関数を用いて経時的なｒＣＢＶ変化をトレンド除去した（Ｃｏｘ，１９９６）。
続いて、全てのマウスにおける各ボクセルに対するｒＣＢＶシグナルを、薬物の速度論を反映する非線形微分指数関数モデル（式２）（Ｌｕｏ ｅｔ ａ．，２００４）にフィッティングした（ｔ０は応答の時間遅延であり、ｋは多重係数であり、α１は除去速度であり、α２は吸収速度である。）。
ｙ（ｔ）＝ｋ（ｅ−α１（ｔ−ｔ０）−ｅ−α２（ｔ−ｔ０）） ｔ＞ｔ０ 式２
ｔ０、ｋ、α１及びα２に対する最終値は、モデルフィッティングの最大有意性に基づいて、ＡＦＮＩを用いて自動的に決定された。モデルフィッティングの最大有意性に基づいて、ＡＦＮＩを用いて自動的に決定された。次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正後に、活性化されたｒＣＢＶボクセルを求めた。ＣＢＶ増加を伴う全脳の活性化されたボクセルを記録した。未変換データはＡＮＯＶＡの仮定に合致しないので、十分な正規性と分散の均一性を確保するために、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換を使用した。１１Ｅ６の効果は、ｆＭＲＩ−ＣＢＶモデルで、１９月齢のＴＧ２５７６マウスにおいて、ＩｇＧ１に対して統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
結果は、添付の図１０に示されている。本発明者らのデータは、Ｄｅａｎｅ（Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ，２００３）による結果を拡張し、ＲＡＧＥ内の様々なエピトープを標的とするポリクローナル抗ＲＡＧＥ抗体がＡＰＰ−トランスジェニックマウス中の脳血液灌流を増強できることを示す。本発明者らのデータは、ＲＡＧＥ内のＣ２ドメインを標的とするモノクローナル抗体１１Ｅ６がＡＰＰトランスジェニックマウス中の脳血液灌流を増加させることを初めて示す。この効果は、ＲＡＧＥへのＡβの高いレベルの結合を競合することによっておそらく媒介される。ヒトＡＰＰの過剰発現のために、脳及び血漿中には、Ａβの高いレベルが存在する。従って、１１Ｅ６でのＡＤ患者の処理は、これらの患者中の脳灌流を増加させ得、神経細胞の機能の改善を引き起こす可能性を有する。同時に、処理の間に、脳血流量を追跡することによって、患者の治療をモニターできる可能性がある。
Ａβによって誘導されるダイナミン切断に対する抗体１１Ｅ６による海馬神経細胞の保護
１７．１．海馬神経細胞の培養
僅かな変更を加えて、文献（Ｇｏｓｌｉｎ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ．（１９９１） Ｒａｔ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎ：Ｂａｎｋｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｇｏｓｌｉｎ Ｋ （ｅｄ）．Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｎｅｒｖｅ Ｃｅｌｌｓ， ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に従って、ラット海馬神経細胞を調製した。簡潔に述べると、１９日齢の胎児ラットの海馬を切除し、髄膜を除去した。組織のトリプシン処理（０．１％トリプシン／１７から２０分／３７℃）後に、火で磨かれたパスツールピペットを用いた磨砕によって、海馬の神経細胞を得た。無血清培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ、Ｂ２７補充、２ｍＭＬ−グルタミン；１％ペニシリン−ストレプトマイシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の０．５から３ｍＬを用いて、ポリ−Ｄ−リジンが被覆された６ウェル又は２４ウェルのプレート（ＢｉｏｃｏａｔＴＭプレート；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、０．２から１．０×１０５細胞の密度で、海馬神経細胞を播種した。少なくとも２１日間、３７℃、５％ＣＯ２で、細胞を培養し、培地の１／３を週一回交換した。
１７．２．Ａβによって誘導されるダイナミン切断
僅かな変更を加えて、文献（Ｋｅｌｌｙ， Ｂ． Ｌ．， ａｎｄ Ｆｅｒｒｅｉｒａ， Ａ． （２００６； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１（３８）， ２８０７９−２８０８９； Ｋｅｌｌｙ， Ｂ． Ｌ．， Ｖａｓｓａｒ， Ｒ．， ａｎｄ Ｆｅｒｒｅｉｒａ， Ａ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（３６）， ３１７４６−３１７５３）に従って、Ａβを凝集させた。簡潔に述べれば、０．１ｍｇ／ｍＬで、無血清培地中に、Ａβ１−４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， Ｃａ）を溶解し、３７℃で４日間温置した。抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体１１Ｅ６、ＫＬＨ（メガスラ・クレニュラータ（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａ）から得られたキーホール・リンペット・ヘモシアニン、Ａｂｂｏｔｔ）に対して誘導されたＩｇＧ１イソタイプモノクローナル対照抗体又はＰＢＳを、２２５μＬから１ｍＬの最終容量で、絶えず撹拌しながら、２５℃で１時間、凝集されたＡβとともに温置した。培地に混合物を添加し、それぞれ、５μＭＡβ（単量体として計算）及び２μＭ抗体の最終濃度を与える。全ての処理は３つ組みで行い、Ａβ又は抗体を添加しないウェルをさらなる対照として含めた。さらに２４時間、細胞を培養し、ウェスタンブロットのために処理する前に、光学顕微鏡によって短時間検査した。Ａβでの処理は、温置期間の間に、明白な神経細胞死を誘導しなかった。
１７．３．ウェスタンブロット、ダイナミン切断の定量及び統計解析
培地を除去し、ＰＢＳで１回細胞を洗浄した。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する冷緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣｌ；１％ＮＰ−４０；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２ｍＭＥＤＴＡ）の添加によって、細胞を溶解した。細胞を剥離させ、１３０００ｇで、４℃で５分間、ホモジネートを遠心した。上清を除去し、市販のキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって、総タンパク質濃度を測定した。１μｇ／μＬになるように、添加緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中にタンパク質を希釈し、５分間沸騰させた。ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、各試料２５μｇを４から２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で走行させ、ニトロセルロース膜上に転写した。あるいは、９６ウェルプレート上で、細胞を直接溶解し、添加緩衝液で希釈し、タンパク質の１／４から１／５をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に添加した。１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて室温で１から２時間、膜をブロックし、次いで、４℃で一晩、ダイナミンＩに対する一次抗体（ＰＡ−１−６６０；１：１０００希釈；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ， Ｇｏｌｄｅｎ， Ｃｏ）とともに温置した。続いて、室温で１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ連結された二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を適用し、増強された化学発光を用いて検出した（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ； Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩ）。ＶｅｒｓａＤｏｃシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｍｕｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、イムノブロットシグナルを可視化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、完全な状態のダイナミンＩ（約１００ｋＤａ）のシグナルを定量した。標準化のために、３７℃で３０分間、ブロットを剥離させ（Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ； Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩ）、ＰＢＳ中で洗浄し、βＩＩＩチューブリン（ＴｕＪ−Ｉ， １：１０００希釈、Ａｂｅａｍ，、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に対して誘導された一次抗体及び二次抗体（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を用いて、再度プローブした。Ａβで処理されていない細胞の標準化されたダイナミンＩ発現の平均を１００％に設定した。片側ＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）に続く、Ｄｕｎｎの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍＴＭＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ）により、統計学的有意性に関して、３つの別個の実験の％データを解析した。
１７．４．抗ＲＡＧＥ抗体１１Ｅ６は、Ａβによって誘導されたダイナミン切断に対して、海馬神経細胞を保護する。
凝集されたＡβ１−４０は、海馬神経細胞中のシナプスマーカーであるタンパク質ダイナミンＩ）の切断を誘導することが最近示された（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ， ２００５； Ｋｅｌｌｙ ＆ Ｆｅｒｒｅｉｒａ， ２００６）。公表された結果に完全に従って、本発明者らは、凝集されたＡβとともに２４時間海馬神経細胞を温置した後の完全な状態の（約１００ｋＤａ）ダイナミンＩの量の顕著な減少及び付随する約９０ｋＤａ切断産物の増加を観察した（図１１、上側パネル）。抗ＲＡＧＥ抗体１１Ｅ６とともにＡβを事前温置することによって、約７０％まで切断が抑制された。これに対して、ＲＡＧＥで処理されていないマウスＩｇＧ１イソタイプ対照抗体は、一切保護を与えなかった（図１１、上部パネル）。３つ組みの試料の濃淡測定走査、対照タンパク質（βＩＩＩチューブリン）の量への標準化及び３つの独立した実験のデータ解析は、観察された保護効果の統計学的有意性を明らかにした（図１１、下パネル；片側ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０５）。
グロブロマーによって誘導されたシナプス伝達の抑制に対する抗体１１Ｅ６の効果
１８．１．試験Ａ
Ｓｔｏｐｐｉｎｉ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３７， Ｉｓｓｕｅ ２， Ａｐｒｉ１１９９１， Ｐａｇｅｓ １７３−１８２ “Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｎｅｒｖｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ”Ｌ． Ｓｔｏｐｐｉｎｉａ， Ｐ．−Ａ． Ｂｕｃｈｓａ ａｎｄ Ｄ． Ｍｕｌｌｅｒ）の改変されたプロトコールで、Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ海馬スライス培養物を高カリウム溶媒中で３日間、その後、３４℃／５％ＣＯ２の液体／気体界面中の補充された神経基礎Ａ培地中で、ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＵＳＡ）上で培養した。
ラット海馬スライス培養物は、９日齢のＷｉｓｔａｒラットから調製し、１５から１６日にインビトロで使用した。
−１μＭ１−４２グロブロマー
−０．１μＭ１１Ｅ６（ＲＡＧＥｍＡｂＭＬ３９−１１Ｅ６精製＃４１９４、試料６１１６）＋１μＭ１−４２グロブロマー
−対照（グロブロマー限外ろ過物＋ＳＤＳ）
の何れかとともに、スライス培養物を一晩温置した。
同時温置群では、グロブロマーの２時間前に、スライス培地に抗体を適用した。記録は、人工の脳脊髄液での継続的な灌流下において、界面記録チャンバー中で行った。異なる電圧強度の二相性パルスでのシャッファー側枝の刺激後に、ＣＡ領域から、興奮性シナプス後場電位を記録した。０．５Ｍ双極性タングステン電極（ＷＰＩ；ＳａｒａｏｓｔａＵＳ）を用いて、二相性パルス（０．１ｍｓ／パルス）でシャッファー側枝を刺激し、ａＣＳＦ（０．７から１．１ＭΩ、ＧＣ１５０Ｆ−１５、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｕｇｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填されたガラス電極を用いて記録した。パワーＣＥＤ１４０４（（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を用いて、シグナルをデジタル化し、Ｓｉｇｎａｌ２．１４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）を用いて解析した。
結果が、図１２Ａに示されている。グロブロマーの適用は、シナプス伝達を強く抑制した。０．１μＭ１１Ｅ６の同時適用は、グロブロマーによって誘導された欠乏を完全に回復させた。従って、１１Ｅ６は、グロブロマーによって誘導されたシナプス伝達の欠乏を回復させることができる。
１８．２．試験Ｂ
日齢のＷｉｓｔａｒラットからラット海馬スライス培養物を９調製し、１６から１８日にインビトロで使用した。
−１μＭ１−４２グロブロマー
−０．１μＭＩｇＧ１ｍＡｂＨ３５Ｃ２０６（ＫＬＨ）＋１μＭ１−４２グロブロマー
−対照（ＳＤＳ）
の何れかとともに、スライス培養物を一晩培養した。異なる強度で、シャッファー側枝を刺激した後に、ＣＡ１から（人工の脳脊髄液中で）記録を行った。
結果が、図１２Ｂに示されている。グロブロマーの適用は、シナプス伝達を強く抑制した。ＩｇＧ１の同時適用は、グロブロマーによって誘導された欠乏を回復させなかった。従って、ＩｇＧ対照抗体は、０．１μＭで、グロブロマーによって誘導されたシナプス伝達の欠乏を回復させない。
Ｔｇ２５７６マウスの前頭皮質中のアミロイド斑に対する抗体１１Ｅ６の効果の原位置分析
これらの実験のために、１４．５月齢のＴｇ２５７６マウス（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ； ２７４（５２８４）， ９９−１０２）を使用した。マウスは、いわゆるスウェーデン変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を有するヒトＡＰＰを過剰発現し、約１１月齢時で、脳実質組織中にβアミロイド沈着物を形成した。１２月齢から開始して、５００μｇの１１Ｅ６（ｎ＝１９）腹腔内又はＩｇＧ対照抗体（ｎ＝１９）を、毎週１回、１２週間注射した。最後の注射の後、動物に深く麻酔をかけ、血液を流すために、０．１Ｍリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）を経心的に灌流した。次いで、頭蓋骨から脳を取り出し、縦方向に分割した。脳の一方の半球を瞬間凍結し、他方の半球は４％パラホルムアルデヒド中への浸漬によって固定化した。ＰＢＳ中の３０％ショ糖中に浸漬固定化された半球を凍結保護し、凍結ミクロトーム上に戴置した。前脳全体を４０μｍ切片へ切断し、これをＰＢＳ中に集め、その後の染色操作のために、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（Ｒ）Ｐｌｕｓガラススライド（Ｍｅｎｚｅｌ Ｇｌａｅｓｅｒ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上に戴置した。以下のプロトコールに従って、単量体Ａβに対して産生されたマウスモノクローナル抗体６Ｇ１を用いて、Ａβ含有アミロイド斑の染色を行った（Ｂａｒｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｏｎ ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ （Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
−ガラススライド上の切片を完全に風乾させ、Ｖｅｎｔａｎａ機械に移した。
−洗浄及びブロッキング工程を含み、ＤＡＢＭａｐＴＭキットでの染色が使用される、発色性ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）操作のためにＶｅｎｔａｎａによって提供された自動プロトコールを使用した。実験者によって、抗原検索並びに一次及び二次免疫組織化学を自動化されたプロトコール中に含めた。
−抗原検索は、９５℃で４５分間、コンディショナー＃２（クエン酸を基礎とする緩衝液、ｐＨ６．０）の存在下で得られた。
−３７℃で３時間、抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中で６Ｇ１（１：５００）とともに温置
−３７℃で３０分間、ビオチンかされた二次抗体ロバ抗マウスＩｇＧ（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ， ＵＫ）
−自動化された染色の完了後、通常の水でスライドを洗浄し、段階化されたエタノール中で脱水し、ＸＴＲＡ−Ｓｏｌｖｅ（Ｒ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ， Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中で清澄化し、ＵｌｔｒａＫｉｔｔ（Ｒ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ， Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）でカバーガラスをかけた。
ＩｍａｇｅＰｒｏ５．０画像解析システムを用いて、新皮質の３つの組織学的切片中で、斑染色を定量した。解析下のマウスの処理に関して、実験者は知らされておらず、以下のパラメータを測定した。新皮質の面積、６Ｇ１陽性染色で覆われた面積及び染色された斑の数。これらのパラメータは可変的で、正常に分布していなかった。従って、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって、斑添加量の低下を統計学的に評価した。Ｔｇ２５７６マウス中のＡβ沈着物染色の結果が、図１３に示されている。茶色のＤＡＢ沈着物の評価は、抗ＲＡＧＥ抗体が、新皮質中のアミロイド斑の数及び面積をそれぞれ、２４．５％及び２６．８％低下させることを示した（ｐ＜０．１）。斑の数及び面積の低下は、前頭新皮質において最も明白であった（ｐ＜０．０５）。
本明細書中に引用されている文献は、参照により、組み込まれる。

Claims (20)

  1. 抗原結合ドメインを含み、ヒトＲＡＧＥ分子のエピトープを結合することが可能であり、前記抗原結合ドメインが
    ａ）配列番号４、１２及び２０からなるアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ３の群；前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列；並びに／又は
    ｂ）配列番号８、１６及び２４からなるアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ３の群；並びに前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列；
    から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む、単離されたモノクローナル抗体。
  2. 配列番号２、１０、１８からなるＣＤＲ−Ｈ１の群から選択される、又は配列番号３、１１、１９からなるＣＤＲ−Ｈ２の群から選択される、又は配列番号６、１４、２２からなるＣＤＲ−Ｌ１の群から選択される、又は配列番号７、１５、２３からなるＣＤＲ−Ｌ２の群から選択されるアミノ酸配列、及び前記配列の１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲをさらに含む、請求項１に記載の抗体。
  3. Figure 2016104740
     又は前記３つのＣＤＲの少なくとも１つが、親配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する修飾されたＣＤＲアミノ酸配列である可変ドメインの組み
    からなる可変ドメインＣＤＲの組みから選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲの組みが、
    ＶＨ ７Ｆ９の組み及びＶＬ ７Ｆ９の組み；
    ＶＨ ４Ｅ５の組み及びＶＬ ４Ｅ５の組み；並びに
    ＶＨ １１Ｅ６の組み及びＶＬ １１Ｆ６の組み；
    からなる群から選択される、請求項３に記載の抗体。
  5. ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
  6. 配列番号５６と５７から選択される少なくとも１つの重鎖可変ドメイン及び／又は配列番号５８と５９から選択される少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
  7. 前記結合タンパク質が、
    （重鎖配列位置）：１、２、６８、７０、７２、７６、８５、８９、９５
    （軽鎖配列位置）１１、１３、４３、４９、５８、７０、８７
    からなる群から選択される少なくとも１つのフレームワーク変異を含む、請求項６に記載の抗体。
  8. 前記結合タンパク質が
    （重鎖配列）配列番号６２、６７、６８及び６９；
    （軽鎖配列）配列番号６３、６４、６５及び６６；
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの（フレームワーク変異された）可変ドメインを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
  9. 抗体１１Ｅ６、４Ｅ５及び７Ｆ９からなる群から選択される、請求項１の抗体。
  10. 請求項１から９の何れか一項の抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
  11. 請求項１０に記載の単離された核酸を含むベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  13. ＲＡＧＥを結合することができる結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、請求項１２に記載の宿主細胞を培地中で培養することを含む、ＲＡＧＥを結合することができるタンパク質を産生する方法。
  14. 請求項１３の方法に従って産生されたタンパク質。
  15. （ａ）製剤（製剤は、結晶化された形態の請求項１から９の抗体を成分として含む。）及び
    （ｂ）少なくとも１つのポリマー性担体
    を含む、抗体を放出するための組成物。
  16. 請求項１から９の何れか一項の抗体及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
  17. 有効量の請求項１５又は１６に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物を治療する方法。
  18. 筋萎縮性側索硬化症、腕神経叢傷害、脳傷害（外傷性脳傷害を含む。）、脳性麻痺、フリードリッヒ失調症、ギラン・バレー、白質委縮症、多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄傷害、脊髄筋肉萎縮症、脊髄腫瘍、卒中、横断性脊髄炎、認知症、老年性認知症、軽度の認知障害、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、晩発性運動障害、運動亢進症、躁病、パーキンソン病、スチール・リチャード症候群、ダウン症候群、重症筋無力症、神経外傷、血管アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う脳出血Ｉ、脳炎症、フリードリッヒ失調症、急性精神錯乱、筋萎縮性側索硬化症、緑内障、アルツハイマー病、糖尿病性腎障害、敗血症、関節リウマチ及び関連炎症性疾患を含む群から選択される神経疾患を治療するための、請求項１７の方法。
  19. アルツハイマー病を治療するための、請求項１７の方法。
  20. 組成物が１１Ｅ６を含む、請求項１９の方法。
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