MX2010012142A - Anticuerpos para receptor de productos finales de glucacion avanzada (rage) y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud se refiere a proteínas aisladas, particularmente anticuerpos monoclonales, en particular anticuerpos humanizados injertados con CDR, los cuales enlazan a la proteína RAGE. Especificamente, estos anticuerpos tienen la capacidad de inhibir el enlace de RAGE a sus diversos ligandos. Los anticuerpos o partes de los mismos que se describen en la presente solicitud, son útiles para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por, o inducido por ligandos patofisiolágicos de RAGE, por ejemplo proteínas sin pliegues lipo amiloide ß y productos finales de glucación avanzada.

Description

ANTICUERPOS PARA RECEPTOR DE PRODUCTOS FINALES DE GLUCACIÓN AVANZADA (RAGE) Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente solicitud se refiere a anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y en particular versiones humanizadas, injertadas con CDR de los mismos que se pueden utilizar en el tratamiento y diagnóstico de enfermedad de Alzheimer (AD), degeneración celular del sistema nervioso, aprendizaje y memoria dañados, transporte anormal de amiloide ß y otras condiciones neuroinflamatorias asociadas^ con el Receptor de productos finales de glucación avanzada. En particular, la presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que enlazan a RAGE.

Antecedentes de la Invención La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa más frecuente de demencia entre las personas de edad avanzada, con una incidencia de aproximadamente el 10% de la población en las personas con edades superiores a los 65 años. Con el incremento de la edad, también se eleva la probabilidad de la enfermedad. Globalmente, existen aproximadamente 15 millones de personas afectadas con la enfermedad, y se espera que los incrementos adicionales en las expectativas de vida en las siguientes décadas, incrementen el número de personas afectadas con la enfermedad aproximadamente al triple. En virtud de lo anterior, existe una necesidad tremenda e inmediata de un tratamiento para AD. Con dicho tratamiento, los pacientes afectados pueden tener la capacidad de mantener un estilo de vida activo y funcional durante muchos años, más allá de lo posible sin dicho tratamiento. Por lo tanto, no únicamente existen implicaciones financieras para dicho tratamiento, sino también implicaciones con respecto a la "calidad de vida", para los pacientes así como para quienes los cuidan.

Desde un punto de vista molecular, la AD está caracterizada por un depósito de proteínas agregadas de manera anormal. En el caso de placas amiloides extracelulares, estos depósitos consisten principalmente en filamentos de amiloide- -péptido (?ß), y en el caso de los enredos neurofibrilares intracelulares (NFTs), en su mayoría la proteína tau. AD también está caracterizada por una expresión neuronal incrementada de RAGE. RAGE es un receptor de ligando múltiple de la familia de inmunoglobulina que funciona como un aceptor de superficie celular de transducción de señal para ?ß.

La infusión de ?ß40 en ratones ha mostrado, en diversos grupos, conducir a la vasoconstricción de vasos cerebrales y a una disminución del flujo sanguíneo cerebral (CBF). Los pacientes que padecen de AD también tienen un flujo sanguíneo cerebral disminuido. En modelos de ratón de AD, en donde los animales transgénicos sobreexpresan la Proteína Precursora Amiloide (APP), que conduce a la enfermedad que origina la formación de placas, RAGE ha estado implicado como un factor patógeno en el progreso de la enfermedad (Deane y asociados. Nature Medicine 9(7) pp 907-913, 2003; Arancio y asociados. EMBOJ, 1-10, 2004).

RAGE ha mostrado enlazar a péptidos-?ß. La inhibición de esta interacción suprime la acumulación de ?ß en el modelo de animal transgénico; por consiguiente RAGE se considera que estará implicado en AD. El tratamiento con sRAGE (RAGE soluble) así como anticuerpos anti-RAGE ha mostrado disminuir los números de placa (Deane y asociados, 2003). El bloqueo de la interacción de RAGE con amiloides mediante anticuerpos, puede conducir a un tratamiento para pacientes AD; sin embargo, los anticuerpos policlonales existentes generados a partir de suero animal, no están adaptados para el tratamiento crónico de humanos.

La interacción de RAGE con ?ß se describe en la Publicación Internacional WO 2006/077101 A1, la cual describe la competición de RAGE que carece del dominio-v para el enlace de ?ß a RAGE, así como la competición de péptidos que representan partes del dominio C-termínal de RAGE, en su mayoría el dominio C1. La interacción de anticuerpos anti-RAGE con el dominio-v de RAGE se describe en la Publicación Internacional WO2007 09749(A2); la cual también describe que el enlace de diferentes ligandos (S100b, HMGB1 (proteína de Alto Nivel del Cuadro 1 de Grupo de Movilidad), amiloide ßß) puede enlazar a RAGE a través del enlace a este dominio.

La Publicación Internacional WO 2008/137552 A2 describe ciertos anticuerpos anti-RAGE monoclonales que enlazan a diferentes dominios de RAGE. La mayor parte de los anticuerpos inhiben la interacción de RAGE humano y el complejo de HMGB1 y CpG ADN.

La Publicación Internacional WO 2006/077101 se refiere a la identificación, funcionalidad y uso de péptidos designados AGER-R E y AGER-CDP de RAGE. Dichos péptidos entre otras cosas, aplican para identificar y preparar los ligandos de enlace RAGE tipo anticuerpos anti-RAGE. La presente invención describe anticuerpos monoclonales novedosos que enlazan a dominios-C de RAGE y a la interacción y composición específica con el enlace de ?ß con anticuerpos monoclonales para el dominio C1 y C2 en RAGE.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona moléculas de enlace, en particular anticuerpos, que enlazan específicamente a RAGE; los anticuerpos anti-RAGE representativos de la presente invención pueden comprender al menos una de las secuencias de aminoácido de región variable del anticuerpo mostrado en las SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, y <21, o CDRs individuales de las mismas o secuencias de CDR relacionadas, tal como se especifica con mayor detalle más adelante.

Específicamente la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que enlazan a RAGE, más específicamente anticuerpos monoclonales que enlazan a los mismos-C de RAGE.

Incluidos en la presente invención, se encuentran anticuerpos anti-RAGE que enlazan específicamente a RAGE y comprenden una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos el 90% idéntica a cualesquiera de SEQ ID NOs.: 5, 13, y 21, o es un fragmento de enlace RAGE de un anticuerpo comprendido en las secuencias.

También se incluyen anticuerpos anti-RAGE que enlazan específicamente a RAGE y comprenden una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos el 90% idéntica a cualesquiera de las SEQ ID NOs.: 1, 9, y 17, o es un fragmento de enlace RAGE de un anticuerpo comprendido en las secuencias.

Una modalidad particular de la presente invención está representada por diversos anticuerpos monoclonales que tienen la capacidad de enlazar al dominio-C de RAGE, y de bloquear el enlace de los globulómeros-?ß. Más específicamente la presente invención describe el anticuerpo monoclonal 11E6, el cual enlaza al dominio C-2 de RAGE, no enlaza a péptidos con secuencias de aminoácido utilizados para generar anticuerpos policlonales y tiene la capacidad de neutralizar in vivo el efecto de ?ß1-40 en vasculatura cerebral en ratones.

El anticuerpo anti-RAGE de la presente invención incluyen anticuerpos que enlazan específicamente al dominio-C de RAGE.

Los anticuerpos anti-RAGE de la presente invención incluyen un anticuerpo anti-RAGE o fragmento de enlace RAGE tal como se describe anteriormente, el cual se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o injertado con CDR, un anticuerpo de cadena simple, una proteína de fusión y un anticuerpo humano.

En diversas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos recombinantes o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos de neutralización particulares de la presente invención solicitud son referidos en la misma como mAb7F9, mAb11E6 y mAb4E5 y fragmentos de anticuerpo funcional de los mismos, y otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpo funcionales con propiedades equivalentes a mAb7F9, mAb11E6 y mAb4E5, tal como el enlace de alta afinidad a RAGE con cinéticas de disociación de bajo nivel y alta capacidad de neutralización, están proyectados como parte de la presente invención. Los anticuerpos humanos de la presente invención, sin embargo, pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por el polipéptido RAGE inmunogénico de inmunoglobulina de línea germinal humana o fragmento del mismo, el cual puede ser determinado a través de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de enlace puede medirse mediante tecnología ELISAs, c RIAs, BIAcore o KinExA competitiva. El rango de disociación también puede ser medido mediante tecnología BIAcore o KinExA. La afinidad de enlace y rango de disociación se miden mediante resonancia de plasmón de superficie utilizando por ejemplo, BIAcore.

Uno de los anticuerpos monoclonales de la presente solicitud, el anticuerpo mAb7F9, tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia que comprende una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1; y SEQ ID NOs. 2, 3, y 4 que son los residuos 31 a 35, 50 a 68, y 101 a 108 de SEQ ID NO: 1, respectivamente. El anticuerpo mAb7F9 de la presente invención tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia que comprende una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende las secuencias de la SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NOs. 6, 7, y 8 que son los residuos 24 a 34, 50 a 56, 89 a 97 de SEQ ID NO: 5, respectivamente.

Otros de los anticuerpos monoclonales de la presente solicitud, el anticuerpo mAb11E6, tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia que comprende una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NOs. 10, 11, y 12 que son los residuos 31 a 35, 50 a 66, y 99 a 109 de la SEQ ID NO: 9, respectivamente. El anticuerpo mAb11E6 de la presente invención tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia que comprende una región variable de cadena ligera (región VH) que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NOs. 14, 15, y 16 que son los residuos 24 a 34, 50 a 56, 89 a 97 de la SEQ ID NO: 13, respectivamente. El mAb11E6 enlaza al dominio C-2 de RAGE, no enlaza a péptidos con secuencias de aminoácido utilizadas para generar anticuerpos policlonales y tiene la capacidad de neutralizar in vivo el efecto de ?ß1-40 en la vasculatura cerebral en ratones.

Otro de los anticuerpos monoclonales de la presente solicitud, el anticuerpo mAb4E5, tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia que comprende una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NOs. 18, 19, y 20 que son los residuos 31 a 35, 50 a 66, y 99 a 109 de la SEQ ID NO: 17, respectivamente. El anticuerpo mAb4E5 de la presente invención tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia que comprende una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21, y SEQ ID NOs. 22, 23, y 24 que son los residuos 24 a 34, 50 a 56, 89 a 97 de la SEQ ID NO: 21, respectivamente.

También se pretende que los anticuerpos monoclonales aislados que interactúan con RAGE de la presente solicitud puedan ser una proteína de enlace glucosilada en donde el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo comprenda uno o más residuos de carbohidrato. La producción de proteína nasciente in vivo, puede pasar por procesamiento adicional, conocido como, modificación post-traducción. En particular, los residuos de azúcar (glucosilo) pueden agregarse en forma enzimática, un proceso conocido como glucosilación. Las proteínas resultantes que contienen las cadenas laterales de oligosacárido enlazadas en forma covalente son conocidas como proteínas o. glucoproteínas glucosiladas. La glucosilación de proteína depende de la secuencia de aminoácido de la proteína de interés, así como la célula huésped en la cual se expresa la proteína. Los diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glucosilación (por ejemplo, glucosiltransferasas y glucosidasas), y tienen .diferentes substratos (azúcares de nucleótido) disponible. Debido a dichos factores, el patrón de glucosilación de proteína, y la composición de los residuos de glucosilo pueden diferir dependiendo del sistema huésped en el cual se expresa la proteína particular. Los residuos de glucosilación útiles en la presente invención pueden incluir pero no se limitan a glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico.

Los anticuerpos de la presente solicitud comprenden una región constante de cadena pesada, tal como una región constante lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. Además, el anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera, ya sea una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda. Particularmente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. Como alternativa, la parte del anticuerpo puede ser por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de cadena simple. Los reemplazos de residuos de aminoácido en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (Winter, y asociados. Patentes Norteamericanas Nos. 5,648,260; 5,624,821). La porción Fe del anticuerpo, transmite diversas funciones efectoras importantes por ejemplo inducción de citocina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y rango de vida media/despeje del anticuerpo y complejos de antígeno-anticuerpo. En algunos casos estas funciones efectoras son deseables para anticuerpos terapéuticos, pero en otros casos pueden ser innecesarias, o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos IgG humanos, particularmente I g G e lgG3, transmiten ADCC y CDC mediante el enlace a Fcy Rs y Clq de complemento, respectivamente. Los receptores Fe neonatales (FcRn) son los componentes importantes que determinan la vida media de los anticuerpos en la circulación. Aún en otra modalidad, al menos un residuo de aminoácido es reemplazado en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fe del anticuerpo, de modo que se alteran las funciones efectoras del anticuerpo.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A a 1C, muestran el enlace ELISA de anticuerpos monoclonales RAGE anti-humanos 7F9, 11E6 y 4E5 derivados de hibridoma y recombinantes, a RAGE humano recombinante.

La figura 2, muestra la caracterización de los anticuerpos monoclonales 7F9, 11E6 y 4E5 mediante enlace de manchado de punto.

Las figuras 3A a 3C muestran los resultados del ensayo HTRF que muestran la competición de los sRAGE -globulómeros-?ß - anticuerpos monoclonales.

La figura 4, muestra el enlace de sRAGE HTRF -globulómero-?ß.

La figura 5, muestra el enlace del globulómero-?ß a sRAGE-Fc y al dominio RAGE v-.

Las figuras 6A a 6C, muestran los experimentos de enlace ELISA de los anticuerpos monoclonales de la presente invención a diferentes fragmentos RAGE.

Las figuras 7A a 7C, muestran los experimentos de enlace ELISA de anticuerpos monoclonales de la presente invención a diferentes fragmentos RAGE.

Las figuras 8a a 8f, muestran cambios de Flujo Sanguíneo Cerebral inducidos mediante diferentes dosis de ?ß1-40.

Las figuras 9a a 9c, muestran los efectos de 11E6 en cambios inducidos por ?ß1-40 en el Flujo Sanguíneo Cerebral.

La figura 10, muestra los cambios del Flujo Sanguíneo Cerebral Observados en ratones con edad avanzada Tg2576 tratados con diferentes dosis de anticuerpo 11E6 o de control.

La figura 11, muestra que el anticuerpo 11 E6 protege las neuronas hipocampales contra disociación de dinamina inducida por ?ß. Panel superior: Se muestran, muestras que representan condiciones experimentales repetidas de un experimento simple y las concentraciones del tratamiento (en µ?) se indican anteriormente. Las células con la adición de ?ß muestran en su mayoría señales de dinamina I intactas (~100 kDa) (primera barra), lo cual se disminuye e invierte a un producto de disociación de ~90kDa en células tratadas con 5µ? ?ß (segunda barra). El tratamiento con el anticuerpo 11E6 (tercera barra) evita la disociación, en tanto que el anticuerpo de control Ig1 control (cuarta barra) es sin un efecto protector pronunciado. Panel inferior: Cuantificación de la señal de dinamina de tres experimentos independientes (expresados como porcentaje de dinamina +/- SEM después de normalización a 0 µ de tratamiento ?ß) revelaron un efecto protector estadísticamente significativo de 11E6 (ANOVA de una dirección, prueba ANOVA, Kruskal Wallis seguido de prueba Dunns: * indica p<0,05) Las figuras 12A y 12B muestran la influencia del anticuerpo 11E6 (A) o de control (B) en la fuerte supresión inducida por globulómero de la transmisión sináptica en cultivo de rebanadas de hipocampo de rata. 0.1 µ? de 11E6 revertió completamente los déficits inducidos por globulómero (ver (A)).

La figura 13, muestra el efecto de un tratamiento de 12 semanas con el anticuerpo 11 E6 en los depósitos de placa amiloide en ratones Tg2576. Se muestra el área cubierta con placas (A,B) y el número de placas (C,D) según se detecta mediante etiquetado con un anticuerpo anti ?ß 6G1 después del tratamiento con anticuerpo de control 1 E6 o I g G (n = 19/grupo). El tratamiento con 11E6 redujo el área cubierta y el número de depósitos en la neocorteza en un 24.5% (A) y 26.8% (C), respectivamente. El análisis estadístico reveló una fuerte tendencia (asteriscos en los paréntesis, p<0.06; prueba-U Mann-Whitney). La reducción fue estadísticamente significativa en la corteza frontal (asteriscos, p<0.05; prueba-U Mann-Whitney) en donde el área de los depósitos fue reducida en un 23.5% (B) y su número en un 26.8% (D) después de tratamiento 11 E6.

LISTA DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1: secuencia de aminoácido de mAb VH 7F9 SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácido de mAb VH 7F9 CDR-H1 SEQ ID NO: 3: secuencia de aminoácido de mAb VH 7F9 CDR-H2 SEQ ID NO: 4: secuencia de aminoácido de mAb VH 7F9 CDR-H3 SEQ ID NO: 5: secuencia de aminoácido de mAb VL 7F9 SEQ ID NO: 6: secuencia de aminoácido de mAb VL 7F9 CDR-L1 SEQ ID NO: 7: secuencia de aminoácido de mAb VL 7F9 CDR-L2 SEQ ID NO: 8: secuencia de aminoácido de mAb VL 7F9 CDR-L3 ' SEQ ID NO: 9: secuencia de aminoácido de mAb VH 11E6 SEQ ID NO: 10: secuencia de aminoácido de mAb VH 11E6 CDR-H1 SEQ ID NO: 11: secuencia de aminoácido de mAb VH 11E6 CDR-H2 SEQ ID NO: 12: secuencia de aminoácido de mAb VH 11 E6 CDR-H3 SEQ ID NO: 13: secuencia de aminoácidos de mAb VL 11 E6 SEQ ID NO: 14: secuencia de aminoácido de mAb VL 11E6 CDR-L1 SEQ ID NO: 15: secuencia de aminoácido de mAb VL 11E6 CDR-L2 SEQ ID NO: 16: secuencia de aminoácido de mAb VL 11E6 CDR-L3 SEQ ID NO: 17: secuencia de aminoácido de mAb VH 4E5 SEQ ID NO: 18: secuencia de aminoácido de mAb VH 4E5 CDR-H1 SEQ ID NO: 19: secuencia de aminoácido de mAb VH 4E5 CDR-H2 SEQ ID NO: 20: secuencia de aminoácido de mAb VH 4E5 CDR-H3 SEQ ID NO: 21: secuencia de aminoácido de mAb VL 4E5 SEQ ID NO: 22: secuencia de aminoácido de mAb VL 4E5 CDR-L1 SEQ ID NO: 23: secuencia de aminoácido de mAb VL 4E5 CDR-L2 SEQ ID NO: 24: secuencia de aminoácido de mAb VL 4E5 CDR-L3 SEQ ID NO: 25: secuencia de aminoácido de región constante de cadena pesada gamma Ig humano SEQ ID NO: 26: secuencia de aminoácido de región constante de cadena ligera de kappa Ig humana SEQ ID NO: 27: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción #1 (negritas) que codifica a OmpA-[RAGE (23-340)]-6His SEQ ID NO: 28: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción #2 (negritas) que codifica a 6His-(Thr)-[RAGE (24-129)] SEQ ID NO: 29: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción # 3 (negritas) que codifica a 6His-(Thr)-[RAGE (24-234)] SEQ ID NO: 30: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción # 4 (negritas) que codifica a 6His-(Thr)-[RAGE (24-336)] SEQ ID NO: 31: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción # 5 (negritas) que codifica a 6His-(Thr)-[RAGE (130-234)] SEQ ID NO: 32: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción # 6 (negritas) que codifica a 6His-(Thr)-[RAGE (130-336)] SEQ ID NO: 33: Secuencia de nucleótido de plásmido total de Construcción # 7 (negritas) que codifica a 6His-(Thr)-[RAGE (235-336)] SEQ ID NO: 34: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 1 SEQ ID NO: 35: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 2 SEQ ID NO: 36: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 3 SEQ ID NO: 37: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 4 SEQ ID NO: 38: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 5 SEQ ID NO: 39: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 6 SEQ ID NO: 40: secuencia de aminoácido codificada por proteína RAGE # 7 SEQ ID NO: 41: secuencia de aminoácido mutante de región constante gamma-1 Ig SEQ ID NO: 42: secuencia de aminoácido de región constante gamma-2 Ig SEQ ID NO: 43: secuencia de aminoácido de estrüctura VH7-4.1/JH6 FR1 SEQ ID NO: 44: secuencia de aminoácido de estructura VH7-4.1/JH6 FR2 y VH1-2/JH6 FR2 SEQ ID NO: 45: secuencia de aminoácido de estructura VH7-4.1/JH6 FR3 SEQ ID NO: 46: secuencia de aminoácido de estructura VH7-4.1/JH6 FR4 y VH1-2/JH6 FR4 SEQ ID NO: 47: secuencia de aminoácido de estructura VH1-2/JH6 FR1 SEQ ID NO: 48: secuencia de aminoácido de estructura VH1-2/JH6 FR3 SEQ ID NO: 49: secuencia de aminoácido de estructura 1-12/L5/JK2 FR1 SEQ ID NO: 50: secuencia de aminoácido de estructura 1-12/L5/JK2 FR2 SEQ ID NO: 51: secuencia de aminoácido de estructura 1-12/L5/JK2 FR3 SEQ ID NO: 52: secuencia de aminoácido de estructura 1- 12/L5/JK2 FR4 y 3-15/L2/JK2 FR4 SEQ ID NO: 53: secuencia dé aminoácido de estructura 3-15/L2/JK2 FR1 SEQ ID NO: 54: secuencia de aminoácido de estructura 3-15/L2/JK2 FR2 SEQ ID NO: 55: secuencia de aminoácido de estructura 3-15/L2/JK2 FR3 SEQ ID NO: 56: secuencia de aminoácido injertada-CDR 6 VH 11E6.1-GL SEQ ID NO: 57: secuencia de aminoácido injertada-CDR VH 11 E6.2-GL SEQ ID NO: 58: secuencia de aminoácido injertada-CDR VL 11E6.1-GL SEQ ID NO: 59: secuencia de aminoácido injertada-CDR VL 11E6.2-GL SEQ ID NO: 60: secuencia de aminoácido de hRAGE SEQ ID NO: 61: secuencia de aminoácido de fragmento de husRAGE SEQ ID NO: 62: secuencia de anticuerpo humanizado VH h11E6.1 SEQ ID NO: 63: secuencia de anticuerpo humanizado VL h 11 E6.1 SEQ ID NO: 64: secuencia de anticuerpo humanizado VL h11E6.2 SEQ ID NO: 65: secuencia de anticuerpo humanizado VL h11E6.3 SEQ ID NO: 66: secuencia de anticuerpo humanizado VL h11 E6.4 SEQ ID NO: 67: secuencia de anticuerpo humanizado VH h11E6.5 SEQ ID NO: 68: secuencia de anticuerpo humanizado VH h11E6.9 SEQ ID NO: 69: secuencia de anticuerpo humanizado VH h11 E6.16 SEQ ID NO: 70: secuencia de aminoácido de péptido de NtermR31 derivado de RAGE SEQ ID NO: 71: secuencia de aminoácido de péptido 1 derivado de RAGE SEQ ID NO: 72: secuencia de aminoácido de péptido 2 derivado de RAGE SEQ ID NO: 73: secuencia de aminoácido de péptido 3 derivado de RAGE SEQ ID NO: 74: secuencia de aminoácido de péptido 4 derivado de RAGE SEQ ID NO: 75: secuencia de aminoácido de péptido 5 derivado de RAGE SEQ ID NO: 76: secuencia de aminoácido de péptido 6 derivado de RAGE SEQ ID NO: 77: secuencia de aminoácido de péptido 7 derivado de RAGE SEQ ID NO: 78: secuencia de aminoácido de péptido 8 derivado de RAGE SEQ ID NO: 79: secuencia de aminoácido de péptido 9 derivado de RAGE SEQ ID NO: 80: secuencia de aminoácido de péptido 10 derivado de RAGE SEQ ID NO: 81: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 82: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 83: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 84: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 85: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 86: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 87: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 88: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 89: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 90: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 91: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 92: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 93: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 94: secuencia de nucleótido de cebadores de oligonucleótido Descripción Detallada de la Invención 1. Definiciones Generales A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención deben tener los significados que son comprendidos comúnmente por los expertos en la técnica. El significado y alcance de los términos debe quedar claro, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones aquí proporcionadas tomarán precedentes con respecto a cualquier definición de diccionario o extrínseca. Además, a menos que le contexto requiera lo contrario, los términos singulares deben incluir pluralidades y los términos plurales deben incluir el singular. En esta solicitud, el uso de "o" significa y/o", a menos que se manifieste lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas tales como "incluye" y "incluido" no es limitante. Asimismo, los términos tales como "elemento" o "componente" comprende tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se manifieste específicamente lo contrario.

Generalmente, las nomenclaturas utilizadas y las técnicas relacionadas con esto, cultivos de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genéticas y química de proteína y ácido nucleico e hibridación aquí descritas son conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención generalmente se llevan a cabo de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica y tal como se describen en diversas referencias generales y más específicas que son mencionadas y descritas a lo largo de la presente especificación, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, tal como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente invención. Las nomenclaturas utilizadas y los procedimientos y técnicas de laboratorio relacionadas con esto, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica aquí descrita son conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes.

De modo que la presente invención pueda ser comprendida de manera más fácil, los términos seleccionados se definen a continuación.

El término "polipéptido", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable con el término polipéptido, y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" comprende las proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación, no está asociado con componentes asociados naturalmente que la acompañan en su estado nativo; está sustancialmente libre de otras proteínas de la misma especie; se expresa a través de un célula de una diferente especie; o no ocurre en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que es „ sintetizado en forma química o sintetizada en un sistema celular diferente al de la célula de la cual se origina naturalmente, será "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Una proteína también puede hacerse sustancialmente libre de componentes asociados en forma natural mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteína conocidas en el arte.

El término "recuperación" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al proceso de convertir una especie química, tal como un polipéptido sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, por ejemplo utilizando técnicas de purificación de proteína conocidas en el arte.

El término "Receptor de Productos Finales de Glucación avanzados (RAGE)", designa un receptor multiligando en la familia de inmunoglobulina que enlaza al péptido ?ß soluble, S100b y HMGB1 (también conocido, como anfoterina) entre otros. RAGE transmite cambios celulares pato-fisiológicamente relevantes en respuesta al enlace a estos ligandos. Los animales transgénicos que sobreexpresan RAGE y APP despliegan anormalidades tempranas en aprendizaje y memoria espacial, indicando que RAGE es un cofactor para la perturbación neuronal inducida por ?ß en patologías tipo Alzheimer, y sugiere que RAGE es un agente terapéutico potencial para disminuir la disfunción celular.

La estructura de RAGE no ha sido resuelta. La homología con otras proteínas conduce a un modelo en donde RAGE tiene diversos dominios. Estos dominios son nombrados en analogía a las inmunoglobulinas: (i) dominio tipo V en el término-N: este dominio equivalente en inmunoglobulinas enlaza al antígeno y representa la única región de enlace dentro de estas proteínas.

En RAGE, este dominio enlaza a algunos ligandos tipo S100 (Ostendorp y asociados. EMBOJ. 26,3875,2007; Leclerc y asociados. JBC 282,31317,2007). Un anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio tipo v en RAGE, compite con el enlace de diferentes ligandos S100b, HMGB1 y ß amiloide (WO2007109749(A2)) implicando que estos ligandos pueden enlazar a RAGE a través de este mismo dominio, (ii) Primer dominio tipo C2: Dos dominios dentro de RAGE tienen la homología con los dominios C2 de ¡nmunoglobulinas; uno de estos dominios ha sido denominado C1 (nomenclatura también utilizada mediante Ostendorp y asociados. BBRC 2006). Los diversos ligandos que enlazan a este dominio han sido descritos por ejemplo, S100A12 (también llamado ENRAGE o Calgranulin C), que enlaza con una afinidad de Kd = 90 nM (Hofmann y asociados. Cell 97, 889, 1999; Xie y asociados. JBC, 282, 4218, 2007). ?ß compite con S100A12 para este dominio sugiriendo que ?ß también enlaza al dominio-C1. (iii) El segundo dominio tipo C2: este dominio es llamado C2 (también utilizado por Ostendorp y asociados. BBRC 2006). El ligando RAGE S100A6 enlaza al dominio C2 de un anticuerpo generado contra un péptido del dominio C2 mostró competir contra S100A6 para este enlace; el anticuerpo conduce a una transducción de señal reducida en SH-SY5Y (Leclerc y asociados. JBC 282,31317,2007).

Un "dominio RAGE" puede ser definido en línea con diferentes definiciones proporcionadas en el estado del arte: De acuerdo con la Publicación de Xie y asociados. 2007, J. Biol. Chem., Vol. 282:4218-4231 aplica la siguiente definición de los dominios h RAGE: - el dominio V (aminoácidos 24 a 129 de SEQ ID NO: 60), - el dominio C1 (aminoácidos 130 a 234 de SEQ ID NO: 60), - el dominio C2 (aminoácidos 235 a 336 de SEQ ID NO: 60), De acuerdo con una definición más reciente de Hudson y asociados, The FASEB Journal. 2008; 22: 1572-1580, h RAGE (404 residuos de aminoácido de acuerdo con SEQ ID NO:60) tiene una región extracelular (aminoácidos 1 a 342 de SEQ ID NO: 60) compuesto de - un péptido de señal (aminoácidos 1 a 22 de SEQ ID NO: 60), seguido de tres dominios tipo inmunoglobulina, que incluyen - un dominio tipo IG, tipo V (aminoácidos 23 a 116 de SEQ ID NO: 60) y - dos dominios 1/2 tipo Ig, tipo C2 (aminoácidos 124 a 221 de SEQ ID NO:60¡ también designado dominio C1; y aminoácidos 227 a 317 de SEQ ID NO: 60; también designados dominio C2). - un dominio de transmembrana simple (aminoácidos 343 a 363 de SEQ ID NO.60), y - una cola citoplásmica corta (aminoácidos 364 a 404 de SEQ ID NO: 60).

En virtud del alto grado de identidad, en particular con respecto a la definición de los dominios V, C1 y C2, y a menos que se manifieste de otra manera, cada una de las definiciones se puede aplicar con el objeto de definir las características de enlace de las proteínas de enlace de la presente invención.

Tal como se indicó anteriormente, RAGE tiene la capacidad de enlazar diferentes ligandos a través de diferentes dominios. Los resultados de los experimentos de competición con otros ligandos parecen indicar que ?ß enlaza al dominio-C1 (Hofmann y asociados. Cell 97, 889, 1999 o Xie y asociados.

JBC, 282, 4218, 2007). Como un ejemplo no limitante de ligandos RAGE, se pueden mencionar: - Productos finales de glucosilación avanzados (AGEs), (Baynes J. W., 1991, Diabetes. 1991, 40:405-412; Ahmed K.A., 2007, J Clin Biochem Nutr. 41 (2):97-105); - Miembros de la familia S100/calgranulin (por ejemplo, calgranulin C (también conocido como ENRAGE y S100A12), S100A1, S100A4, S100A11, S100A13, S100B y S100P); - Amiloide- -péptido (?ß), por ejemplo 1 a 40 péptidos ?ß Globulómeros amiloide-ß; como por ejemplo globulómeros ?ß1-42, ?ß12-42, ?ß20-42 (ver la Publicación de Barghorn y asociados, oligómero de péptido 1 a 42 amiloide ß Globular - una proteína homogénea y neuropatológica estable en enfermedad de Alzheimer) Journal of Neurochemistry. 95(3):834-847, Noviembre 2005; WO2007/062852; WO2008/150949; todas incorporadas a la presente invención como referencia); - integrinas de eucocito (por ejemplo, Mac-1) El término "RAGE" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere particularmente a RAGE humano, también designado "hRAGE" o "huRAGE". A menos que se manifieste lo contrario el término "RAGE" también comprende moléculas RAGE aisladas u obtenidas de otras especies, diferentes a especies humanas, por ejemplo, roedores, tipo ratones o ratas, por ejemplo moléculas RAGE de bovino.

El término "sRAGE" se refiere a una forma soluble de RAGE, derivada del dominio extracelular de RAGE. Por ejemplo, una molécula sRAGE derivada de RAGE humano, también designada como husRAGE, comprende residuos de aminoácido 1 a 331 (ver SEQ ID NO: 61) de RAGE humana (ver SEQ ID NO: 60).

La "actividad biológica" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a todas las propiedades biológicas inherentes de RAGE tal como aquí se define.

Los términos "enlace especifico" o "enlace en forma específica", tal como se utiliza en la presente invención, con referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un péptido con una segunda especie química, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, una "determinante antigénica" o "epítope" tal como se define más adelante) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y enlaza a una estructura de proteína específica en lugar de a proteínas generales. Si un anticuerpo es específico de un epítope "A", la presencia de una molécula que contiene al epítope A (o libre, no etiquetado A), en una reacción que contiene "A" etiquetado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A etiquetado enlazado al anticuerpo.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) comprendida de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) o cualquier fragmento, mutante, variante o derivación funcional de la misma, que retiene las características de enlace de epítope esenciales de una molécula Ig. Dicho mutante, variante o formatos de anticuerpo derivados son conocidos en la técnica. Sus modalidades sin limitación se describen más adelante. Un anticuerpo se dice que tiene la "capacidad de enlazar" a una molécula, si tiene la capacidad de reaccionar en forma específica con la molécula para enlazar de esta forma la molécula al anticuerpo.

Un "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a una preparación de moléculas de anticuerpo, que comparten una secuencia de aminoácido de cadena pesada común y de cadena ligera común, en contraste con las preparaciones de anticuerpo "policlonal" que contienen una mezcla de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados mediante diversas técnicas novedosas tipo despliegue de fago, bacteria, levadura o ribosoma, así como métodos clásicos ejemplificados por anticuerpos derivados de hibridoma (por ejemplo, un anticuerpo secretado mediante un hibridoma preparado mediante tecnología de hibridoma, tal como metodología de hibridoma estándar de Kohier y Milstein ((1975) Nature 256:495-497). ( En un anticuerpo de longitud total, cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente invención como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios CHÍ, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente invención como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas en forma adicional en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones de determinación de complementariedad (CDR), interdispersas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, distribuidas a partir del término amino hasta el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de ¡nmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA y IgY), clase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2) o subclase.

El término "parte de enlace de antígeno" o "fragmento de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo"), tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de enlazar específicamente a un antígeno (por ejemplo, RAGE). Se ha mostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Dichas modalidades también pueden ser formatos biespecíficos, específicos dobles o multiespecíficos; enlazando específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de enlace comprendidos dentro del término "parte de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, Cl y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y asociados., (1989) Nature 341 :544-546. Winter y asociados, Publicación PCT WO 90/05144 A1 incorporada a la presente invención como referencia), que comprende un dominio variable simple; y (vi) una región de determinación de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que les permite ser elaborados como una cadena de proteína simple en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); ver las publicaciones de Bird y asociados. (1988) Science 242:423-426; y Huston y asociados (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85_:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena simple, también están proyectados para estar comprendidos ^dentro del término "parte de enlace de antígeno" de un anticuerpo. También están comprendidas otras formas de anticuerpos de cadena simple, tal como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíf icos en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptido simple, pero que utiliza un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena, y crear dos sitios de enlace de antígeno (ver por ejemplo las Publicaciones de Holliger, P., y asociados (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9_0.:6444-6448; Poljak, R.J., y asociados. (1994) Structure 2:1121-1123). Dichas partes de enlace de anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Ingeniería de Anticuerpo (2001 ) Springer-Verlag. Nueva York, página 790 (ISBN 3-540-41354-5).

El término "construcción de anticuerpo" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido que comprende una o más partes de enlace de antígeno de la presente invención enlazadas a un polipéptido enlazador o a un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipéptidos enlazadores comprenden dos o más residuos de aminoácido unidos mediante enlaces de péptido y se utilizan para enlazar una o más partes de enlace de antígeno. Dichos polipéptidos enlazadores son conocidos en la técnica (ver las publicaciones de Holliger, P., y asociados (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., y asociados (1994) Structure 2:1121-1123). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera IgG humana, son conocidas en la técnica y se representan en la Tabla 1.

Tabla 1: Secuencia de dominio constante de cadena pesada y dominio constante de cadena ligera IgG humano Aún ¾demás, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, puede ser parte de moléculas de inmunoadhesión más grandes, formadas mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo o parte de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de una región de centro de estreptavidina para elaborar una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. ., y asociados (1995) Anticuerpos Humanos e Hibridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer las moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., y asociados (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las partes de anticuerpo tal como Fab y fragmentos F(ab')2 se pueden preparar de anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales, tal como digestión con papaína y pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, partes de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, tal como se describe en la presente invención.

Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a un anticuerpo que está sustanciaimente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo un anticuerpo aislado que enlaza específicamente RAGE humano, está sustanciaimente libre de anticuerpos que enlazan específicamente antígenos diferentes a RAGE humano). Un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a RAGE humano, sin embargo puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tal como moléculas RAGE de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o químicos.

El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente invención, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente invención, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura humana.

El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en la presente invención, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados a través de medios recombinantes, tal como anticuerpos que se expresan utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (que se describe más adelante en forma adicional), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano de combinación, recombinante (Hoogenboom H. R., (1997) 776 Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E., (2002) Bioquímica Clínica 35:425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J. W. (2002) Biotécnicas 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Inmunología Actual 21 :371-378 ), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver la Publicación de Taylor, L. D., y asociados (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green LX. (2002) Opinión Actual en Biotecnología 13:593-597; Little M. y asociados (2000) Inmunología Actual 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados a través de otros medios que implican la división de secuencias de gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes, son secuencias que aunque se derivan de, y están relacionadas con secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena ligera y pesada de una especie y secuencias de región constante de otra especie, tal como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de múrido enlazadas a regiones constantes humanas. El anticuerpo quimérico puede ser producido a través de técnicas de biología molecular recombinante, o pueden conjugarse físicamente juntos.

El término "anticuerpo injertado mediante CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie, pero en los cuales las secuencias de uno o más de las regiones CDR de VH y/o VL están reemplazadas con secuencias CDR de otra especie, tal como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de múrido, en donde se han reemplazado una o más de las CDRs de múrido (por ejemplo, CDR3) o en secuencias de CDR humana.

Los términos "numeración de Kabat", definiciones de Kabat y "etiqueta de Kabat" se utiliza de manera intercambiable en la presente invención. Estos términos, los cuales son reconocidos en la técnica se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácido que son más variables (por ejemplo hipervariable) que otros estudios de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una parte de enlace de antígeno del mismo (Kabat y asociados. (1971) Ann . NY Acad, Sci. 190:382-391 y, Kabat, E.A., y asociados (1991) Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Quinta Edición, Departamento de Servicios Humanos y a la Salud de los Estados Unidos Publicación NIH No. 91-3242). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable fluctúa de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácido de 50 a 65 para CDR2, y posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para región variable de cadena ligera, la región hipervariable fluctúa de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aceptor" y "anticuerpo aceptor" se refiere al anticuerpo y secuencia de ácido nucleico que proporciona o codifica al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 ó 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95 % , al menos 98% o 100% de las secuencias de aminoácido de una o más de las regiones de estructura. En algunas modalidades, el término "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoácido o ácido nucleico del anticuerpo que proporciona o codifica la región(s) constante. Aún en otra modalidad, el término "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoácido o ácido nucleico del anticuerpo que proporciona o codifica una o más regiones de estructura de la región(s) constante. En una modalidad específica, el término "aceptor" se refiere a una secuencia de aminoácido o ácido nucleico de anticuerpo humana que proporciona o codifica al menos el 50, 55, 60, 65, 70, 75 ó 80%, particularmente, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% de las secuencias de aminoácido de una o más de las regiones de estructura. De acuerdo con esta modalidad, un aceptor puede comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 10 residuos de aminoácido que no ocurren en una o más posiciones específicas de un anticuerpo humano. Una región de estructura aceptora y/o región(s) constante aceptora puede ser por ejemplo derivada u obtenida de un gen de anticuerpo de línea germinal, un gen de anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (por ejemplo, anticuerpos conocidos en la técnica, anticuerpos en desarrollo o anticuerpos comercialmente disponibles).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "CDR" se refiere a la región de determinación de complementariedad dentro de las secuencias variables del anticuerpo. Existen tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que son designadas CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto CDR" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un grupo de tres CDRs que ocurren en una región variable simple con la capacidad de enlazar el antígeno. Los límites exactos de estas CDRs han sido definidos en forma diferente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat y asociados, Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no únicamente proporciona un sistema de numeración de residuo no ambiguo aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino también proporciona límites de residuo precisos que definen las tres CDRs. Estas CDRs pueden ser referidas como CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia y asociados., Nature 342:877-883 (1989)) encontraron que ciertas sub-porciones dentro de las CDRs de Kabat, adoptan conformaciones de esqueleto de péptido casi idénticas a pesar de tener gran diversidad en el nivel de la secuencia de aminoácido. Estas sub-porciones se designaron como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 en donde "L" y "H" designa las regiones de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente. Estas regiones pueden ser referidas como CDRs de Chothia, las cuales tienen límites que traslapan dentro de las CDRs de Kabat. Otros límites que definen las CDRs que traslapan con las CDRs de Kabat han sido descritas por (FASEB J. 9:133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Aún otras definiciones de límite CDR pueden no seguir de manera estricta uno de los sistemas anteriores, aunque sin embargó traslapará con la CDRs de Kabat, aunque pueden ser acortadas o alargadas en virtud de la anticipación o descubrimientos experimentales de que los residuos o grupos particulares de residuos o incluso todas las CDRs no impactan significativamente el enlace de antígeno. Los métodos aquí utilizados pueden utilizar las CDRs definidas con cualesquiera de estos sistemas, aunque las modalidades particulares utilizan CDRs definidas por Kabat o Chot ia.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término residuo "canónico" se refiere a un residuo en una CDR o estructura que define una estructura CDR canónica particular tal como se define en la Publicación de Chothia y asociados (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia y asociados, J. Mol. Biol. 227:799 (1992), ambas incorporadas a la presente invención como referencia). De acuerdo con Chothia y asociados., las partes críticas de las CDRs de muchos anticuerpos tienen conformaciones de esqueleto de péptido casi idénticas a pesar de la gran diversidad en el nivel de secuencia de aminoácido. Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión del esqueleto del péptido para un segmento contiguo de residuos de aminoácido que forman un lazo.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "donante" y "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo que proporciona una o más CDRs. En una modalidad particular, el anticuerpo donante es un anticuerpo de una especie diferente de anticuerpo del cual se obtienen las regiones de estructura o se derivan. Dentro del contexto de un anticuerpo humanizado, el término "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo no humano que proporciona una o más CDRs.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "estructura" o "secuencia de estructura" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menos las CDRs. Debido a que la definición exacta de una secuencia CDR puede ser determinada a través de diferentes sistemas, el significado de una secuencia de estructura está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDRs (CDR-L1, -L2 y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2 y -H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones de estructura en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en donde CDR1 se coloca entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de estructura, tal como es referido por otros, representa las FR's combinadas dentro de la región variable de una cadena de inmunoglobulina simple, que ocurre naturalmente. Tal como se utiliza en la presente invención, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y FRs representa dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen una región de estructura.

Las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humana son conocidas en la técnica. En una modalidad de la presente invención, las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humana se seleccionan de las secuencias descritas en la tabla 1 y tabla 3. Las diferentes combinaciones para secuencias de estructura humana FR1 y FR4 se manifiestan en dichas tablas.

Tabla 2: Secuencias aceptoras de cadena pesada humana Tabla 3: Secuencias aceptoras de cadena ligera humana Tal como se utiliza en la presente invención, el término "gen de anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no pasan por procesos de maduración que conducen a la redistribución y mutación genética para expresión de una inmunoglobulina particular. (Ver, por ejemplo las Publicaciones de Shapiro y asociados, Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis y asociados, Adv Exp ed Biol. 484:13-30 (2001)). Una de las ventajas proporcionadas por las diversas modalidades de la presente invención, se soporta desde el reconocimiento de que los genes de anticuerpo de línea germinal es más probable que conserven las estructuras de secuencia de aminoácido esencial características de individuos dentro de la especie que los genes de anticuerpo maduros, por lo tanto es menos probable que sean reconocidos como que proceden de una fuente extraña cuando se utilizan en forma terapéutica en dicha especie.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término residuos "clave" se refiere a ciertos residuos dentro de la región variable que tienen más impacto en la especificidad de enlace y/o afinidad de un anticuerpo, en particular un anticuerpo humanizado. Un residuo clave incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes: un residuo que está adyacente a una CDR, un sitio de glucosilación potencial (puede ser un sitio de glucosilación ya sea N- o O-), un residuo raro, un residuo con la capacidad de interactuar con el antígeno, un residuo con la capacidad de interactuar con una CDR, un residuo canónico, un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, un residuo dentro de la zona de Vernier, y un residuo en la región que traslapa entre la definición de Chothia de una CDR1 de cadena pesada variable y la definición de Kabat de una primera estructura de cadena pesada.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere de manera general a anticuerpos y comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en los cuales se ha alterado al menos una parte de la secuencia VH y/o VL para ser más "tipo-humana", es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal humanas. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado-CDR, en el cual las secuencias CDR humanas se introducen en secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias CDR no humanas correspondientes.

En particular, el término "anticuerpo .humanizado" tal como se utiliza en la presente invención, es un anticuerpo o variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, el cual enlaza en forma inmunoespecífica a un antígeno de interés y el cual comprende una región de estructura (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo humano y una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo no humano. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sustancialmente" dentro del contexto de una CDR, se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácido al menos el 50, 55, 60, 65, 70, 75 ó 80%, particularmente al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de una CDR de anticuerpo no humana. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones de estructura son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Particularmente, el anticuerpo humanizado también comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente la de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera, como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, de articulación, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado únicamente contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene únicamente una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado únicamente contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.

El anticuerpo humanizado puede ser seleccionado de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgY, IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier isotipo, incluyendo sin limitación I g A 1 , lgA2, lgG1, lgG2, lgG3 y lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y se pueden seleccionar dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas utilizando técnicas conocidas en el arte.

La estructura y las regiones CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder en forma precisa a las secuencias de origen, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o la estructura de consenso puedes ser mutagenizadas mediante sustitución, inserción y/o eliminación de al menos un residuo de aminoácido, de modo que la CDR o residuo de framework en dicho sitio, no corresponda ya sea a un anticuerpo donante o a la estructura de consenso. En una modalidad particular, sin embargo dichas mutaciones no serán extensivas. Normalmente, al menos el 50, 55, 60, 65, 70, 75 ó 80%, particularmente al menos 85%, más particularmente al menos 90%, y en particular al menos 95% de los residuos de anticuerpo humanizados corresponderán a los de las secuencias FR o CDR de origen. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "estructura de consenso" se refiere a la región de estructura dentro de la secuencia de inmunoglobulina de consenso. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "secuencia de inmunoglobulina de consenso" se refiere a la secuencia formada de los aminoácidos que ocurren en forma más frecuente (o nucleótidos) en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (Ver por ejemplo la Publicación de Winnaker, De Genes a Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que ocurre más frecuentemente en dicha posición en la familia. Si ocurren en forma igualmente frecuencia dos aminoácidos, frecuentemente cualquiera puede ser incluido en la secuencia de consenso.

Tal como se utiliza en la presente invención, la zona "Vernier" se refiere a un subconjunto de residuos de estructura que pueden ajustar la estructura CDR y sintonizar en forma fina el ajuste para el antígeno tal como se describe en la Publicación de Foote y Winter (1992, J. Mol. B i o 1. 224:487-499, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). Los residuos de la zona Vernier forman una capa que subyace las CDRs y pueden impactar una estructura de las CDRs y la afinidad del anticuerpo.

El término "inhibición de enlace" de RAGE a uno de sus ligandos, tal como se utiliza en la presente invención, comprende la reducción parcial (como por ejemplo aproximadamente 1 a 10% o más, en particular aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95% o más) o total de la actividad de enlace del ligando. La "inhibición de enlace" puede determinarse a través de cualquier método adecuado disponible en la técnica, preferentemente a través de cualquier método tal como aquí se ejemplifique, como por ejemplo los ensayos HTRF aquí descritos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "neutralización" se refiere a la neutralización de una actividad biológica de una proteína objetivo cuando una proteína de enlace, enlaza específicamente a la proteína objetivo. La neutralización puede ser el resultado de diferentes formas de enlace de la proteína de enlace al objetivo. Por ejemplo, la neutralización puede ser originada mediante el enlace de. la proteína de enlace en una región del objetivo, que no afecta el enlace de receptor a la molécula objetivo. Como alternativa el enlace de una proteína de enlace puede dar como resultado el bloqueo del enlace receptor al objetivo, en donde el bloqueo neutraliza finalmente la actividad de proteína objetivo. Cada uno de los diferentes mecanismos puede ocurrir de acuerdo con la presente invención.

Particularmente una proteína de enlace de neutralización es un anticuerpo de neutralización cuyo enlace a RAGE da como resultado la neutralización de una actividad biológica de RAGE. Particularmente, la proteína de enlace de neutralización enlaza RAGE y reduce una actividad biológica de RAGE en al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más. La neutralización de una actividad biológica de RAGE a través de una proteína de enlace de neutralización, se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de RAGE conocidos en la técnica, y/o ejemplificarse en la parte experimental, como en particular, en los ejemplos 5, 6, 10, y 16 a 19. Por ejemplo la neutralización de RAGE neutraliza el enlace de RAGE a globulómeros-?ß, tal como se mide en los ejemplos 5 y 6 que se encuentran más adelante.

Una "inhibición de reducción inducida por el péptido ?ß1- 40 soluble del volumen de sangre cerebral" determinado in vivo en un modelo animal, se refiere a una inhibición parcial o completa, como por ejemplo de al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un control no tratado, o en particular, si se compara con un control negativo, monoclonal o policlonal, de isotipo-inmunoglobulina.

Una "mejoría del volumen de sangre cerebral" como in vivo en un modelo animal que sobreexpresa APP humano, se refiere a una mejoría estadísticamente significativa de CBV, si se compara con un control no tratado, o en particular, si se compara con un control negativo, monoclonal o policlonal, de isotipo-inmunoglobulina.

Una "reducción de un número de placa amiloide y/o área de placa amiloide" tal como se mide in vivo en un modelo animal que sobreexpresa APP humana, se refiere a una reducción parcial o completa, como por ejemplo en al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un control no tratado, o en particular, si se compara con un control negativo, monoclonal o policlonal, de isotipo-inmunoglobulina.

Una "inhibición de disociación de neuronas de hipocampo in vitro inducida por péptido ?ß1-20 agregado, se refiere a una inhibición parcial o completa como por ejemplo en al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un control no tratado, o en particular si se compara con un control negativo, monoclonal o policlonal, de isotipo-inmunoglobulina.

Una "reversión de reducción de transmisión sináptica inducida por globulómero ?ß-42" in vitro, se refiere a una reversión parcial o completa, como por ejemplo en al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un icontrol no tratado, o en particular si se compara con un control negativo, monoclonal o policlonal, de isotipo-inmunoglobulina.

Un "anticuerpo monoclonal de neutralización" tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a una preparación de moléculas de anticuerpo, las cuales al momento del enlace al antígeno específico tienen la capacidad de competir e inhibir el enlace del ligando natural para dicho antígeno. En una modalidad particular de la presente solicitud, los anticuerpos de neutralización de la presente invención tienen la capacidad de competir con RAGE para enlazar al menos a uno de sus ligandos, en particular un ligando seleccionado de péptidos-?ß, globulómeros-?ß, S100b y anfoterina, y de evitar la actividad o función biológica de RAGE.

El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de enlace de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo un anticuerpo anti-RAGE que enlaza a un antígeno RAGE y/o la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE cuyo enlace a RAGE neutraliza la actividad biológica de RAGE.

La "función biológica" o "actividad de RAGE" se puede describir como la de un receptor de superficie de célula de transducción de señal para ?ß o un receptor que modula el transporte de proteínas en o a través de la célula.

El término "epítope" o "determinante antigénica" incluye cualquier determinante de péptido con la capacidad de enlazar en forma específica a un receptor de inmunoglobulina o de célula T. En ciertas modalidades, las determinantes de epítope incluyen agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específica. Un epítope es una región de un antígeno que se enlaza a través de un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo enlaza en forma específica un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

El término "resonancia de plasmón de superficie", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíf icas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo utilizando el sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, ver la Publicación de Jónsson, U., y asociados (1993) Ann. Biol. Clin. 5J_:19-26; Jónsson, U., y asociados (1991) Biotécnicas 11: 620-627; Johnsson, B., y asociados. (1995) J. Mol. Recognit. 8_:125-131; y Johnnson, B., y asociados (1991) Análisis Bioquímico 198:268-277.

El término "ken rango", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a la constante en rango para la asociación de un anticuerpo al antígeno para formar el complejo de anticuerpo/antígeno tal como se conoce en la técnica.

El término "kfuera de rango", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a la constante fuera de rango para la disociación de un anticuerpo procedente del complejo de anticuerpo/antígeno tal como se conoce en la técnica.

El término "Kd", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular tal como se conoce en la técnica.

El término "proteína de enlace etiquetada", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una proteína con una etiqueta incorporada que proporciona la identificación de la proteína de enlace. Particularmente, la etiqueta es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido radioetiq uetado o la adhesión de un polipéptido de porciones de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente de actividad enzimática que puede ser detectada mediante métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a los siguientes radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H 4C, 35S, 90Y, "Te, 1 1ln, 125l, 131l, 177Lu, 66Ho, o 153Sm); etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánida), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores ' quimioluminiscentes; grupos de biotinilo; epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cierre de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, etiquetas de epítope); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio.

El término "conjugado de anticuerpo" se refiere a una proteína de enlace tal como un anticuerpo, enlazado en forma química a una segunda porción química, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza en la presente invención para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado de materiales biológicos. Particularmente los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, pero no se limitan a toxina de pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diona de antracina de dihidróxido, mitoxantrona , mitramicina, actinomicina, D, 1- dehidrotestosterona, glucocorticoídes, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Los términos "cristal" y "cristalizado" tal como se utiliza en la presente invención, se refieren a un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo que existe en la forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, que es distinta a otras formas, tal como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos de formaciones tridimensionales, de repetición, regulares de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos), o ensambles moleculares (por ejemplo, complejos de antígeno/anticuerpo). Estas formaciones tridimensionales se distribuyen de acuerdo con relaciones matemáticas específicas que son bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental o bloque de construcción, que se repite en un cristal es denominada la unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una distribución que se conforma con una simetría cristalográfica bien definida, determinada proporciona la "célula unitaria" del cristal. La repetición de la célula unitaria mediante traducciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Ver las Publicaciones de Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Cristalización de Acidos Nucleicos y Proteínas, un Método práctico, segunda edición, páginas 20 1-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999)." El término "polinucleótido" tal como se utiliza en la presente invención, significa una forma polimérico de dos o más nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de hebra simple y doble, aunque particularmente es ADN de hebra doble.

El término "polinucleótido aislado" tal como se utiliza en la presente invención, debe significar un polinucleótido (por ejemplo, de origen genómico, de cADN, o sintético, o algunas combinaciones de los mismos, el cual, de modo que, en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" no está asociado con toda o una parte del polinucleótido con el cual se encuentra el "polinucleótido aislado" en la naturaleza; está enlazado en forma operable a un polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza; o no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

El término "vector", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico con la capacidad de transportar otro ácido nucleico al cual se había enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", lo cual se refiere a un lazo de ADN de hebra doble circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicional pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores tienen la capacidad de réplica autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de réplica bacteriano y vectores de mamífero episomal). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomal) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped al momento de la introducción en la célula huésped, y de esta forma replicarse junto con el genoma de receptor. Además, ciertos vectores tienen la capacidad de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan en forma operativa. Dichos vectores son referidos en la presente invención como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante, están en frecuencia en la forma de plásmidos. En la presente especificación, se puede utilizar el término "plásmido" y "vector" de manera intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la presente invención pretende incluir otras de dichas formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (por ejemplo, retroviruses, adenoviruses, y virus adenoasociados con defecto de réplica), los cuales sirven funciones equivalentes.

El término "enlazado en forma operable" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma proyectada. Una secuencia de control "enlazada en forma operable" a una secuencia de codificación, se liga de tal forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajó condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "enlazadas en forma operable" incluyen tanto secuencias de control de expresión que están contiguas con el gen de interés, como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a secuencias de polinucleótido, que son necesarias para detectar la expresión y el procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se ligan. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de inicio, terminación, promoción y aumento de transcripción adecuadas; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de división y poliadenilación; secuencias que estabilizan el mARN citoplásmico; secuencias que aumentan la eficacia de traducción (por ejemplo, secuencia de consenso Kozak); secuencias que aumentan la estabilidad de proteína; y cuando se desea secuencias que aumentan la secreción de proteína. La naturaleza de dicha secuencia de control difiere dependiendo del organismo receptor; en procariotos, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, sitio de enlace ribosomal y secuencia de terminación de transcripción; en eucariotos, generalmente, dichas secuencias de control incluyen secuencias promotoras y de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretenden incluir componentes cuya presencia es esencial para expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parte de fusión.

La "transformación", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a cualquier proceso a través del cual el ADN exógeno ingresa a una célula huésped. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. La transformación puede depender de cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico extraño en una célula huésped procariótica o eucariótica. El método se selecciona con base en la célula huésped que está siendo transformada y puede incluir, pero no se limita a, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Dichas células "transformadas" incluyen células transformadas en forma estable en las cuales el ADN insertado tiene la capacidad de réplica ya sea como un plásmido de réplica en forma autónoma o como una parte del cromosoma huésped. También incluyen células que expresan en forma temporal el ADN o ARN insertado durante períodos de tiempo limitados.

El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a una célula en la cual se ha introducido el ADN exógeno. Deberá quedar entendido que dichos términos están proyectados para referirse no únicamente a la célula en cuestión, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesoras debido ya sea a mutación o influencias ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula de origen, pero aún estar incluida dentro del alcance del término "célula huésped" tal como se utiliza en la presente invención. Particularmente las células huésped incluyen células procarióticas y eucarióticas seleccionadas de cualesquiera de los Reinos de vida. Las células eucarióticas particulares incluyen organismos de una sola célula, células fúngicas de plantas y animales. Las células huésped particulares incluyen pero no se limitan a la línea de célula procariótica E. coli; líneas de células de mamíferos CHO, HEK 293 y COS; la línea de célula de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

Se pueden utilizar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación , lipofección). Se pueden llevar a cabo técnicas de purificación y reacciones enzimáticas de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se hace normalmente en la técnica, o tal como se describe en la presente invención. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden llevarse a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica y - tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se mencionan y describen a lo largo de la presente especificación. Ver por ejemplo la Publicación de Sambrook y asociados. Clonación molecular: Manual de Laboratorio (segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)), la cual está incorporada para cualquier propósito a la presente invención como referencia.

Un "organismo transgénico", tal como se sabe en la técnica y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgeno, en donde el transgeno introducido en el organismo (o un ancestro del organismo) expresa un polipéptido que no se expresa naturalmente en el organismo. Un "transgen" es una construcción de ADN, que se integra de manera estable y operable en el genoma de la célula de la cual se desarrolla un organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del organismo transgénico.

Los términos "regula" y "modula" se utilizan de manera intercambiable, y tal como se utiliza en la presente invención, se refieren a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de RAGE). La modulación puede ser un incremento o una disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula de interés. Las actividades y funciones de ejemplo de una molécula incluyen pero no se limitan a características de enlace, actividad enzimática, activación de receptor celular y transducción de señal.

De manera correspondiente, el término "modulador", tal como se utiliza en la presente invención, es un compuesto con la capacidad de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de RAGE). Por ejemplo, un modulador puede originar un incremento o disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del modulador.

El término "agonista", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un modulador que cuando se contacta con una molécula de interés, origina un incremento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del agonista. Los agonistas de interés particulares pueden incluir pero no se limitan a polipéptidos RAGE o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualesquiera de otras moléculas que enlazan a RAGE.

El término "antagonista", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un modulador que cuando se contacta con una molécula de interés, origina una disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del antagonista. Los antagonistas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen por ejemplo en la Publicación Internacional WO01/83525.

Los antagonistas de interés particulares incluyen los que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica de RAGE. Los antagonistas de RAGE pueden incluir pero no se limitan a proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, u otras moléculas, que enlazan a RAGE, particularmente anticuerpos monoclonales que interactúan con la molécula RAGE. Deberá observarse que la interacción con RAGE puede dar como resultado el enlace y neutralización de otros ligandos/componentes de la membrana celular y pueden ser útiles para el funcionamiento aditivo o sinérgico contra múltiples enfermedades.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o disminuir la severidad y/o duración de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, evitar el avance de un trastorno, originar la regresión de un trastorno, prevenir la recurrencia, desarrollo, generación o progreso de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno o aumentar o mejorar el efecto(s) profiláctico o terapéutico de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).

El término "muestra", tal como se utiliza en la presente invención, se utiliza en su sentido más amplio. Una "muestra biológica", tal como se utiliza en la presente invención, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia procedente de una cosa viva o cosa anteriormente vida. Dichas cosas vivas incluyen pero no se limitan a humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen pero no se limitan a sangre, suero, orina, fluido sinovial, células, órganos, tejidos, médula ósea, nodos linfáticos y bazo. 2. Modalidades Específicas Las modalidades específicas de la presente invención se describen a continuación: 1. Una proteína de enlace aislada que se disocia de RAGE humano con una KD de 1 x 10"7 M o menos y una constante de kfUera de rango de 1 x 102 s"1 o menos, ambas determinadas mediante resonancia de plasmón de superficie. 2. i) La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 1, caracterizada porque enlaza a RAGE humano y modula, inhibe en particular, la capacidad que tiene RAGE para enlazar al menos a uno de sus ligandos, tal como se determina en un ensayo in vitro estándar, como por ejemplo un ensayo HTRF, como se describe por ejemplo con mayor detalle en la parte experimental, en particular los ejemplos 4 y 5, y las referencias ahí mencionadas. ii) La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 1, que tiene la capacidad de inhibir una actividad biológica transmitida por RAGE. iii) Una proteína de enlace en particular tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque tiene al menos una de las siguientes actividades biológicas: a. inhibición in vivo de la reducción del volumen de sangre cerebral (CBV) inducida por péptido ?ß1-40 soluble en un modelo animal, tipo ratones hembra C57BL/6, como se describe por ejemplo con mayor detalle en la parte experimental, en particular el ejemplo 10 y las referencias ahí mencionadas; b. mejoría in vivo del volumen de sangre cerebral en un modelo animal que sobreexpresa APP humana, tipo modelo de ratón Tg2576 transgénico, como se describe por ejemplo con mayor detalle en la parte experimental, en particular el ejemplo 16 y las referencias ahí mencionadas; c. reducción in vivo del número de placas amiloides y/o área de placa amiloide en un modelo animal que sobreexpresa APP humana, tipo el modelo de ratón Tg2576 transgénico, como se describe por ejemplo con mayor detalle en la parte experimental, en particular el ejemplo 19 y las referencias ahí mencionadas; d. inhibición in vitro de la disociación de dinamina de las neuronas hipocampales inducida por péptido ?ß1-40 agregado, tipo neuronas hipocampales tal como se obtiene de ratas embriónicas, como se describe por ejemplo con mayor detalle en la parte experimental, en particular el ejemplo 17 y las referencias ahí mencionadas. e. reversión in vivo de reducción de transmisión sináptica inducida por globulómero ?ß1-42, determinada en cultivos de rebanadas de hipocampo, como se describe por ejemplo con mayor detalle en la parte experimental, en particular el ejemplo 18 y las referencias ahí mencionadas. 3. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 1 ó 2, caracterizada porque el ligando se selecciona de los péptidos ?ß, globulómeros ?ß, S100b y Anfoterina. 4. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque es una proteína de enlace de neutralización. 5. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque tiene la capacidad de bloquear, en particular inhibir, el enlace del globulómero ?ß a ?ß1-40 humana. 6. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque el globulómero ?ß es ?ß1-42. 7. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace interactua con al menos uno, como por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos de aminoácido del dominio C1 y/o C2 de RAGE humano. 8. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque es un anticuerpo humanizado. 9. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque comprende un dominio de enlace de antígeno, en donde la proteína de enlace tiene la capacidad de enlazar un epítope de una molécula RAGE humano, comprendiendo el dominio de enlace de antígeno al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de el grupo CDR-H3 de secuencias de aminoácido que consiste en SEQ ID NO.: 4, 12 y 20; y las secuencias de aminoácido CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos una identidad del 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%, con una de dichas secuencias; el grupo CDR-L3 de las secuencias de aminoácido que consiste en la SEQ ID NO: 8, 16 y 24; y las secuencias de aminoácido CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, tal como por ejemplo al menos una identidad del 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 %, con una de dichas secuencias. 10. Una proteína de enlace que comprende un dominio de enlace de antígeno, en donde la proteína de enlace tiene la capacidad de enlazar un epítope de una molécula RAGE humano, comprendiendo el dominio de enlace de antígeno al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de: el grupo CDR-H3 de las secuencias de aminoácido que consiste en la SEQ ID NO.: 4, 12 y 20; y las secuencias de aminoácido de CDR modificada que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos una identidad del 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%, con una de dichas secuencias; el grupo CDR-L3 de las secuencias de aminoácido que consisten en la SEQ ID NO.: 8, 16 y 24; teniendo las secuencias de aminoácido de CDR modificadas una identidad de al menos 50%, como por ejemplo una identidad de al menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%, con una de dichas secuencias. 11. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque comprende además al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo CDR-H1 que consiste en SEQ ID NO: 2, 10, 18; o que se selecciona del grupo CDR-H2 que consiste en SEQ ID NO: 3, 11, 19; o que se selecciona del grupo CDR-L1 que consiste en SEQ ID NO: 6, 14, 22; o que se selecciona del grupo CDR-L2 que consiste en SEQ ID NO: 7, 15, 23; y secuencias de aminoácido de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo una identidad de al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%, con una de dichas secuencias. 12. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la al menos una CDR, comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 13. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 12, caracterizada porque comprende al menos 3 CDRs que se- seleccionan de un conjunto CDR de dominio variable que consiste en: o un conjunto de dominio variable en donde al menos una de las 3 CDRs es una secuencia de aminoácido CDR modificada que tiene una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo una identidad dé al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%, con la secuencia de origen. 14. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 13, caracterizada porque comprende al menos dos conjuntos CDR de dominio variable. 15. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 14, caracterizada porque al menos dos conjuntos de CDR de dominio variable se seleccionan de un grupo que consiste en: conjunto VH 7F9 y conjunto VL 7F9; conjunto VH 4E5 y conjunto VL 4E5 y conjunto VH11E6 y conjunto VL 11E6. 16. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque comprende además una estructura aceptora humana. 17. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 16, caracterizada porque la estructura aceptora humana comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 y 55. 18. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque comprende al menos un dominio variable de cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 56 y 57; y/o al menos un dominio variable de cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 58 y 59. 19. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 18, caracterizada porque la proteína de enlace comprende dos dominios variables, en donde los dos dominios variables tienen secuencias de aminoácido seleccionadas de: SEQ ID NOs: 56 y 58; 56 y 59; SEQ ID NOs: .57 y 58; 57 y 59. 20. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 16 a la 19, caracterizada porque la estructura aceptora humana comprende al menos una sustitución de aminoácido de la región de estructura de un residuo clave, siendo seleccionado el residuo clave del grupo que consiste en: un residuo adyacente a una CDR; un residuo del sitio de glucosilación; un residuo raro; un residuo con la capacidad de interactuar con una epítope RAGE; un residuo con la capacidad de interactuar con una CDR; un residuo canónico; un residuo de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera; un residuo dentro de una zona Vernier; un residuo N-terminal con la capacidad de formación de para-glutamato; y un residuo en una región que traslapa entre una CDR1 de cadena pesada variable definida por Chothia y una primera estructura de cadena pesada definida por Kabat. 21. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 20, caracterizada porque el residuo clave se selecciona del grupo que consiste en. (posición de secuencia de cadena pesada): 1, 2, 68, 70, 72, 76, 85, 89, 95 (posición de secuencia de cadena ligera): 11, 13, 43, 49, 58, 70, 87. 22. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace es un dominio variable humano de consenso. 23. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 16 a la 22, caracterizada porque la estructura aceptora humana comprende al menos una sustitución de aminoácido de la región de estructura, como por ejemplo 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 sustituciones, en donde la secuencia de aminoácido de la estructura es al menos el 65% idéntica a la secuencia de la estructura aceptora humana y comprende al menos 70 residuos de aminoácido idénticos a la estructura aceptora humana. 24. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace comprende al menos un dominio variable (estructura mutada) que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (secuencia de cadena pesada) SEQ ID NO: 62, 67, 68 y 69; (secuencias de cadena ligera) SEQ ID NO: 63, 64, 65 y 66. 25. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 24, caracterizada porque la proteína de enlace comprende dos dominios variables, en donde los dos dominios variables tienen secuencias de aminoácido seleccionadas de los grupos que consisten en: SEQ ID NOs: 62 y 63; 62 y 64; 62 y 65; 62 y 66; SEQ ID NOs: 67 y 63; 67 y 64; 67 y 65; 67 y 66; SEQ ID NOs: 68 y 63; 68 y 64; 68 y 65; 68 y 66; 26. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace tiene la capacidad de enlazar un objetivo seleccionado de las moléculas RAGE. 27. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores caracterizada porque tiene la capacidad de enlazar a RAGE humano. 28. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 27, caracterizada porque tiene al menos una de las siguientes características funcionales adicionales: enlazar a RAGE de ratón y rata. 29. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace tiene la capacidad de modular, en particular neutralizar, una función biológica de un objetivo, seleccionado de las moléculas RAGE. 30. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 29, caracterizada porque la proteína de enlace modula, en particular inhibe, la capacidad de RAGE para enlazar al menos a uno de sus ligandos. 31. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 30, caracterizada porque la proteína de enlace modula, en particular inhibe, al menos una de las siguientes interacciones: enlace de RAGE humano a péptidos ?ß, globulómeros ?ß, S100b y anfoterina. 32. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace tiene la capacidad de neutralizar una actividad biológica de RAGE, como por ejemplo disociación inducida por ?ß de dinamina en neuronas primarias, déficits sinápticos inducidos por Globulómero en rebanadas de hipocampo, disminución en CBV inducida por ?ß. 33. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 32, caracterizada porque la molécula RAGE es RAGE o un fragmento de RAGE, tipo sRAGE. 34. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 33, caracterizada porque el RAGE se selecciona de humano, rata y ratón. 35. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de rango (ken) para dicho objetivo seleccionado del grupo que consiste en: al menos aproximadamente 102M"1s"1; al menos aproximadamente 103M"1 s"1 ; al menos aproximadamente 104M"1 s"1 ; al menos aproximadamente 105M"1 s"1 ; al menos aproximadamente 106M"1s" 1, y al menos aproximadamente 107M"1s"1 tal como se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. 36. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante fuera de rango (kfuera) para el objetivo seleccionado del grupo que consiste en: cuando mucho aproximadamente 10"2s"1; cuando mucho aproximadamente 10"3s"1; cuando mucho aproximadamente 10" s"1; cuando mucho aproximadamente 10"5s~1; y cuando mucho aproximadamente 10~6s"1, tal como se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. 37. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la proteína de enlace tiene una constante de disociación , (KD) para el objetivo seleccionado del grupo que consiste en: cuando mucho aproximadamente 10"7 ; cuando mucho aproximadamente 10"8 M; cuando mucho aproximadamente 10"9 M; cuando mucho aproximadamente 10"10 M; cuando mucho aproximadamente 10~11 M; cuando mucho aproximadamente 10" 12 M; y cuando mucho 10"13 M. 38. Una construcción de anticuerpo que comprende una proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizada porque la construcción de anticuerpo comprende además un polipéptido enlazador o un dominio constante de inmunoglobulina. 39. La construcción de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 38, caracterizada porque la proteína de enlace se selecciona del grupo que consiste en: una molécula de inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab'., un F(ab')2, un Fv, un Fv enlazado por disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio simple, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico doble, una inmunoglobulina de dominio variable doble, y un anticuerpo biespecífico. 40. La construcción de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades 38 y 39, caracterizada porque la proteína de enlace comprende un dominio constante de ¡nmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en: un dominio constante IgM humano, un dominio constante I g G 1 humano, un dominio constante lgG2 humano, un dominio constante lgG3 humano, un dominio constante lgG4 humano, un dominio constante I g E humano, un dominio constante IgD humano, un dominio constante lgA1 humano, un dominio constante lgA2 humano, un dominio constante IgY humano y dominios mutados correspondientes. 41. La construcción de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 38 a la 40, caracterizada porque comprende un dominio constante de ¡nmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 25, 41, 42, y 26. 42. Un conjugado de anticuerpo que comprende una construcción de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 38 a la 41, caracterizado porque el conjugado de anticuerpo comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de inmunoadhesión, un agente de generación de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico. 43. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 42, caracterizado porque el agente es un agente de generación de imagen seleccionado del grupo que consiste en una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética y una biotina. 44. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 43, caracterizado porque el agente de generación de imagen es una radioetiqueta seleccionada del grupo que consiste en: 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho y 153Sm. 45. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 42, caracterizado porque el agente es un agente terapéutico o citotóxico seleccionado del grupo que consiste en: un anti-metabolito, un agente de alquilación, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, toxina y un agente apoptótico. 46. La construcción de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 38 a la 41, caracterizada porque la proteína de enlace posee un patrón de glucosilación humano. 47. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 42 a la 45, caracterizado porque la proteína de enlace posee un patrón de glucosilación humano. 48. La proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 37, caracterizada porque la proteína de enlace existe en la forma de un cristal. 49. La construcción de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 38 a la 41, caracterizada porque la construcción de anticuerpo existe como un cristal. 50. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 42 a la 45, caracterizado porque la construcción de anticuerpo existe en la forma de un cristal . 51. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 48, caracterizada porque el cristal es un cristal de liberación controlado por un farmacéutico libre de transportador. 52. La construcción de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 49, caracterizada porque el cristal es un cristal de liberación controlado por un farmacéutico libre de transportador. 53. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 50, caracterizado porque el cristal es un cristal de liberación controlado por un farmacéutico libre de transportador. 54. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 48, caracterizada porque la proteína de enlace tiene una vida media mayor in vivo, que la contraparte soluble de la proteína de enlace. 55. La construcción de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 49, caracterizada porque la construcción de anticuerpo tiene una vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de la construcción de anticuerpo. 56. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 50, caracterizado porque el conjugado de anticuerpo tiene una vida mayor in vivo que la contraparte soluble del conjugado de anticuerpo. 57. La proteína de enlace tal como se describe en la modalidad 48, caracterizada porque la proteína de enlace retiene la actividad biológica. 58. La construcción de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 49, caracterizada porque la construcción de anticuerpo retiene la actividad biológica. 59. El conjugado de anticuerpo tal como se describe en la modalidad 50, caracterizado porque el conjugado de anticuerpo retiene la actividad biológica. 60. Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácido de proteína de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 37. 61. Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácido de la construcción de anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 38 a la 41. 62. Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácido del conjugado de anticuerpo tal corrro / se describe en cualesquiera de las modalidades de la 42 a la 45. 63. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 60 a la 62. 64. El vector tal como se describe en la modalidad 63, caracterizado porque el vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pHybE y pBJ. 65. Una célula huésped que comprende un vector tal como se describe en cualesquiera de las modalidades 63 y 64. 66. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 65, caracterizada porque la célula huésped es una célula procariótica. 67. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 66, caracterizada porque la célula huésped es E. coli. 68. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 67, caracterizada porque la célula huésped es una célula eucariótica. 69. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 68, caracterizada porque la célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste en un organismo de una sola célula, célula animal, célula de planta y célula fúngica. 70. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 69, caracterizada porque la célula eucariótica es una célula animal seleccionada del grupo que consiste en: una célula de mamífero, una célula aviar, y una célula de insecto. 71. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 69, caracterizada porque la célula huésped se selecciona de células HEK, células CHO, células COS y células de levadura. 72. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 71, caracterizada porque la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae. 73. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 70, caracterizada porque la célula huésped es una célula Sf9 de insecto. 74. " Un método para producir una proteína con la capacidad de enlazar RAGE, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 65 a la 73 en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de enlace con la capacidad de enlazar RAGE. 75. Una proteína producida tal como se describe en el método de la modalidad 74. 76. Una composición para la liberación de una proteína de enlace, en donde la composición comprende (a) una formulación, en donde la formulación comprende una proteína del producto cristalizado tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 48 a la 50, y un ingrediente; y (b) al menos un transportador polimérico. 77. La composición tal como se describe en la modalidad 76, caracterizada porque el transportador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste en: poli (ácido acrílico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anhídridos), poli (depsipéptido), poli (ésteres), poli (ácido láctico), poli (ácido lactic-co-glicólico) o PLGA, poli (b-hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etilen glicol), poli ((hidroxipropil) metacrilamida, poli[(organo)fosfazeno], poli (orto ésteres), poli (alcohol vinílico), poli (vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-éter alquil vinílico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glucaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, combinaciones y copolímeros de los mismos. 78. La composición tal como se describe en la modalidad 76, caracterizada porque el ingrediente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil- -ciclodextrina, metoxipolietilen glicol y polietilen glicol. 79. Un método para tratar a un mamífero, en donde el método comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición tal como se describe en cualesquiera de las modalidades 77 y 78. 80. Una composición farmacéutica que comprende el producto tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 59, y un transportador farmacéuticamente aceptable. 81. La composición farmacéutica tal como se describe en la modalidad 80, caracterizada porque el transportador farmacéuticamente aceptable funciona como un adyuvante útil para incrementar la absorción o dispersión de la proteína de enlace. 82. La composición farmacéutica tal como se describe en la modalidad 81, caracterizada porque el adyuvante es h i al u ron id asa. 83. La composición farmacéutica tal como se describe en la modalidad 82, caracterizada porque comprende además al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual la actividad RAGE es perjudicial. 84. La composición farmacéutica tal como se describe en la modalidad 83, caracterizada porque el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: un agente terapéutico, agente de generación de imagen, agente citotóxico, inhibidores de angiogénesis; inhibidores de cinasa; bloqueadores de molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; etiqueta o reportero detectable; un antagonista TNF; un antirreumático; un relajante muscular; un narcótico, un fármaco anti-inflamatório no esteroidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticoesteroide, un' esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocina. Los ejemplos adicionales son: Dimebon, anticuerpo anti-?ß, inhibidores de beta-secretasa, moduladores-tau, aumentadores de cognición tipo por ejemplo antagonistas 5-HT6, inhibidor de colesterinasa (por ejemplo, tactrina, donepezil, rivastigmina o galantamina), un bloqueador del receptor NMDA parcial (por ejemplo, memantina), un mimético de glucosaminoglican (por ejemplo, Alzhemed), un inhibidor o modulador alostérico de secretasa gamma (por ejemplo, R-flurbiprofen), un agonista de hormona de liberación de gonadotropina de bloqueo de hormona luteinizante (por ejemplo, leuprorelin), un antagonista de receptor 5-HT1A de serotonina, un agente de quelación, un bloqueador de canal de calcio tipo L selectivo neuronal, un inmunomodulador, un inhibidor de fibrilogénesis amiloide o inhibidor de deposición de proteína amiloide (por ejemplo, 266), otro anticuerpo (por ejemplo, bapineuzumab), un antagonista de receptor 5-HT1a, un inhibidor PDE4, un agonista de histamina, una proteína receptora para productos finales de glicación avanzada, un estimulador PARP, un antagonista de receptor de serotonina 6, un agonista de receptor 5-HT4, un esteroide humano, un estimulante de captación de glucosa el cual aumenta el metabolismo neuronal, un antagonista CB1 selectivo, un agonista parcial en receptores de benzodiazepina, un antagonista o inhibidor de producción beta amiloide, un inhibidor de deposición beta amiloide, un antagonista parcial de alfa-7 NNR, un PDE4 de dirección terapéutico, un inhibidor de traducción de ARN, un agonista muscarínico, un agonista de receptor de factor de crecimiento nervioso, un agonista de receptor NGF y un modulador de terapia genética. 85. Un método para reducir la actividad de RAGE humano, caracterizado porque comprende contactar RAGE humano con el producto tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 59, de modo que se reduzca la actividad de RAGE humano. 86. Un método para disminuir el enlace RAGE al menos a un ligando seleccionado de péptidos ?ß, globulómeros, S100b y Anfoterina en un sujeto que necesita del mismo, caracterizado porque comprende el paso de administrar al sujeto un producto tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 59. 87. Un método para tratar a un sujeto de un trastorno asociado con actividad RAGE, caracterizado porque comprende el paso de administrar solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, un producto tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 59. 88. Un método para reducir la actividad RAGE en un sujeto que padece de un trastorno, en el cual la actividad de RAGE es perjudicial, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto un producto tal como se describe en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 59, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. 89. El método tal como se describe en la modalidad 88, caracterizado porque el trastorno comprende enfermedades neurológicas seleccionadas del grupo que comprende Esclerosis Lateral Amiotrópica, Lesión de Plexo Braquial, lesión cerebral incluyendo lesión cerebral traumática, Parálisis Cerebral, Ataxia de Friedrich, Guillain Barre, Leucodistrofias, Esclerosis Múltiple, Post Polio, Epina Bifida, Lesión de Médula Espinal, Atrofia de Músculo Espinal, Tumores Espinales, Ataque, Mielitis Transversal, demencia, demencia senil, daño cognitivo leve, demencia relacionada con Alzheimer, corea de Huntington, disquinesia tardía, hiperquinesias, manías, Parkinson Morbus, síndrome de Steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, trauma nervioso, amiloidosis vascular, hemorragia cerebral I con amiloidosis, inflamación cerebral, ataxia de Friedrich, trastorno de confusión aguda, esclerosis lateral amiotrófica, glaucoma, enfermedad de Alzheimer, nefropatía diabética, sepsis, artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias relacionadas; Diabetes y complicaciones resultantes tipo retinopatía diabética, nefropatía, complicaciones vasculares, complicaciones ateroescleróticas, fibrosis pulmonar, Cáncer especialmente melanomas, otras amiloidosis. 90. Una CDR aislada de una proteína de enlace tal como se define en cualesquiera de las modalidades de la 1 a la 51. 91. Una proteína de enlace aislada que interactúa específicamente con al menos un epítope de un receptor de la proteína de Productos Finales de Glucación Avanzada (RAGE). 92. La proteína de enlace aislada tal como se describe en la modalidad 91, caracterizada porque la proteína aislada es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace de antígenos del mismo. 93. El anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace de ahtígeno tal como se describe en la modalidad 92, caracterizado porque comprende un dominio VH y un dominio VL. 94. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 92, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal disminuye la capacidad de RAGE para enlazar a sus ligandos. 95. Los ligandos tal como se describe en la modalidad 94, caracterizados porque los ligandos comprenden péptidos ?ß, globulómeros, S100b y anfoterina. 96. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 92, caracterizado porque el anticuerpo tiene la capacidad de bloquear el enlace de globulómero ?ß a RAGE. 97. El anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace de antígenos del mismo tal como se describe en la modalidad 92, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos comprende: una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 9, y SEQ ID NO. 17; una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 13, y SEQ ID NO. 21; una región constante de cadena pesada de gamma 1 de inmunoglobulina humana con la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 25; y una región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana con la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 26. 98. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 93, caracterizado porque el dominio de enlace de antígenos comprende al menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que comprende una secuencia de aminoácido con al menos el 90% de homología con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 y 20. 99. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 93, caracterizado porque el dominio VH comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 90% de homología con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 17. 100. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 99, caracterizado porque el dominio VH comprende al menos una región CDR que comprende una secuencia de aminoácido con al menos el 90% de homología con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 10, 11 , 12, 18, 19 y 20. 101. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 100, caracterizado porque el dominio VH comprende al menos tres regiones CDR seleccionadas del conjunto de SEQ ID NOs: 2, 3,4; SEQ ID NOs. 10, 11, 12; SEQ ID NOs. 18, 19 y 20. 102. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 93, caracterizado porque el dominio VL comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 90% de homología con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 13, y SEQ ID NO. 21. 103. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 102, caracterizado porque el dominio VL comprende al menos una región CDR que comprende una secuencia de aminoácido con al menos el 90% de homología con la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 14, 15, 16, 22, 23 y 24. 104. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la modalidad 103, caracterizado porque el dominio VL comprende al menos tres regiones CDR seleccionadas del conjunto de SEQ ID NOs: 6, 7, 8; SEQ ID NOs. 14, 15, 16; SEQ ID NOs. 22, 23 y 24. 105. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos tal como se describe en la modalidad 92, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos es un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo quimérico, un fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo humanizado o un fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo quimérico. 106. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos tal como se describe en la modalidad 92, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos es un fragmento de enlace de antígeno seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fv. 107. Una línea de célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la modalidad 96. 108. La línea de célula de hibridoma tal como se describe en la modalidad 107, caracterizado porque el hibridoma se selecciona del grupo que consiste en hibridoma de ratón, humano, rata, oveja, cerdo, ganado, cabra y caballo. 109. Una línea de célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal, caracterizada porque enlaza específicamente al menos a un epítope de una proteína RAGE. 110. La línea de célula de hibridoma tal como se describe en la modalidad 107, caracterizada porque el hibridoma se selecciona del grupo que consiste en hibridoma de ratón y h u m a n o . 111. La línea de célula de hibridoma tal como se describe en la modalidad 107, caracterizada porque ß\ hibridoma se selecciona del grupo que consiste en hibridoma de rata, oveja, cerdo, ganado, cabra y caballo. 112. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico aislado que codifica a cualesquiera de las secuencias de aminoácido tal como se describe en la modalidad 97, caracterizado porque el vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA; pTT; pTT3; pEFBOS; pBV; pJV; y pBJ. 113. Una célula huésped transformada con el vector tal como se describe en la modalidad 112, caracterizada porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en un organismo de una sola célula, célula animal, célula de planta, célula fúngica. 114. La célula huésped tal como se describe en la modalidad 113, caracterizada porque la célula animal es una célula de mamífero seleccionada del grupo que comprende HEK293, CHO y COS. 115. Un método para producir una proteína de enlace aislada tal como se describe en la modalidad 91, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de enlace, recolectar el medio de cultivo y purificar la proteína de enlace aislada producida. 116. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o una parte de enlace de antígenos tal como se describe en cualesquiera de las modalidades 99 ó 102 y un transportador farmacéuticamente aceptable. 117. Un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado porque comprende administrar los anticuerpos monoclonales tal como se describen en las modalidades 99 ó 102, que enlazan al dominio C2 en RAGE. 118. El método tal como se describe en la modalidad 117, caracterizado porque el trastorno comprende enfermedades neurológicas seleccionadas del grupo que comprende Esclerosis Lateral Amiotrópica, Lesión de Plexo Braquial, lesión cerebral incluyendo lesión cerebral traumática, Parálisis Cerebral, Ataxia de Friedrich, Guillain Barre, Leucodistrofias, Esclerosis Múltiple, Post Polio, Epina Bifida, Lesión de Médula Espinal, Atrofia de Músculo Espinal, Tumores Espinales, Ataque, Mielitis Transversal, demencia, demencia senil, daño cognitivo leve, demencia relacionada con Alzheimer, corea de Huntington, disquinesia tardía, hiperquinesias, manías, Parkinson Morbus, síndrome de Steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, trauma nervioso, amiloidosis vascular, hemorragia cerebral I con amiloidosis, inflamación cerebral, ataxia de Friedrich, trastorno de confusión aguda, esclerosis lateral amiotrófica, glaucoma, enfermedad de Alzheimer, nefropatía diabética, sepsis, artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias relacionadas. 119. El anticuerpo tal como se describe en la modalidad 105, caracterizado porque comprende al menos una región VH que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 56 y 57. 120. El anticuerpo tal como se describe en la modalidad 105, caracterizado porque comprende al menos una región VL que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 58 y 59. 121. El anticuerpo tal como se describe en la modalidad 119 ó 120, caracterizado porque se modifica en forma adicional a través de 1 a 10 mutaciones en una secuencia VH o VL. 122. El anticuerpo tal como se describe en la modalidad 121, caracterizado porque las mutaciones se seleccionan de las mutaciones de soporte de estructura y las mutaciones de Vernier y residuos de interfase VH/VL. 123. Un anticuerpo o parte de enlace tal como se describe en cualesquiera de las modalidades anteriores, caracterizado porque inhibe el enlace de RAGE a un complejo de ADN HMGB1-CpG; o un anticuerpo o parte de enlace de una de las modalidades anteriores que no inhibe el enlace de RAGE a un complejo de ADN HMGB1 -CpG. 3. Generación de anticuerpos anti-RAGE 3.1. General Los anticuerpos de la presente solicitud, se pueden generar mediante inmunización de un receptor adecuado (por ejemplo vertebrados incluyendo humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado, caballo, réptiles, peces, anfibios, y en huevos de aves, réptiles y peces). Para generar los anticuerpos de la presente solicitud, el huésped es inmunizado con un polipéptido RAGE inmunogénico o un fragmento del mismo de la presente invención. El término "inmunización", se refiere en la presente invención al proceso de presentar un antígeno a un repertorio inmune ya sea que el repertorio exista en un organismo genéticamente no alterado, natural o, un organismo transgénico, incluyendo los modificados para mostrar un repertorio inmune humano artificial. En forma similar, una "preparación inmunogénica" es una formulación de antígeno que contiene adyuvantes u otros aditivos que pueden aumentar la inmunogenicidad del antígeno.

La inmunización de animales puede realizarse a través de cualquier método conocido en la técnica. Ver por ejemplo, la Publicación de Harlow y Lañe, Anticuerpos: Manual de Laboratorio, Nueva York: Cold Spring, Harbor Press, 1990. Los métodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado y caballos son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo la Publicación de Harlow y Lañe y la Patente Norteamericana No. 5, 994,619. En una modalidad particular, el antígeno RAGE se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos de inmunoestimulación). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al receptor a secretar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Particularmente, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, dispersos en varias semanas.

Se contempla que el huésped animal se inmuniza con el antígeno asociado con la membrana celular de una célula intacta o interrumpida y los anticuerpos de la presente solicitud se identifican enlazando a un polipéptido inmunogénico de la presente invención. Después de la inmunización del huésped animal con el antígeno, los anticuerpos pueden obtenerse del animal. Se obtiene el suero que contiene el anticuerpo del animal, desangrando o sacrificando al animal. El suero puede ser utilizado tal como se obtiene del animal, se puede obtener una fracción de inmunoglobulina del suero o los anticuerpos pueden ser purificados del suero. El suero y las inmunoglobulinas obtenidas de esta forma son policlonales, teniendo de esta forma un conjunto de propiedades heterogéneas. 3.2. Anticuerpos monoclonales anti-RAGE utilizando tecnología Hibridoma Se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de despliegue de fago o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas por ejemplo en la Publicación de Harlow y asociados, Anticuerpos: Manual de Laboratorio, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edición. 1988); Hammerling, y asociados, en: Anticuerpos Monoclonales e Hibridomas de Célula T 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (dichas referencias están incorporadas en sus totalidades a la presente invención como referencia). El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención, no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon simple, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico, o de fago, y no el método a través del cual se produce.

Los métodos para producir y clasificar anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridoma son de rutina y bien conocidos en la técnica. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales, así como anticuerpos producidos a través del método que comprende cultivar una célula de hibridoma que se secreta un anticuerpo de la presente invención, en donde particularmente, el hibridoma es generado fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la presente invención con células de mieloma y posteriormente clasificar los hibridomas que resultan de la fusión para clones de hibridoma que secretan un anticuerpo con la capacidad de enlazar un polipéptido de la presente invención. En síntesis, los ratones pueden ser inmunizados con un antígeno RAGE. En una modalidad particular, el antígeno AGE se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen adyuvantes de Freund completo o incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos de inmunoestimulación). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la rápida dispersión secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped a secretar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Particularmente, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización debe implicar dos o más administraciones del polipéptido, y la dispersión en diversas semanas.

Una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan en el suero de ratón los anticuerpos específicos para el antígeno RAGE, el bazo de ratón se recolecta y se aislan los esplenocitos. Los esplenocitos posteriormente se fusionan mediante técnicas conocidas para cualesquiera células de mieloma adecuadas, por ejemplo células de la línea celular SP20 disponible en ATCC. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitada. Los clones de hibridoma posteriormente se ensayan a través de métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos con la capacidad de enlazar RAGE. El fluido de ascitos, el cual generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, se puede generar inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.

En otra modalidad, los hibridomas inmortalizados que 0 producen anticuerpos pueden prepararse a partir del animal inmunizado. Después de inmunización, el animal es sacrificado y las células esplénicas B se fusionan con células de mieloma inmortalizadas tal como se conoce en la técnica. Ver por ejemplo la Publicación de Harlow y Lañe, supra. En una modalidad particular, la células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular sin secreción). Después de la fusión y selección de antibiótico, los hibridomas se clasifican utilizando RAGE o una parte del mismo, o una célula que expresa RAGE. En una modalidad particular, se lleva a cabo la clasificación inicial utilizando un inmunoensayo enlazado por enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), particularmente un ELISA. Un ejemplo de clasificación ELISA se proporciona en la Publicación Internacional WO 00/37504, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

Se seleccionan hibridomas que producen un anticuerpo anti-RAGE, se clonan y clasifican en forma adicional para características deseables, incluyendo crecimiento robusto de hibridoma, producción de anticuerpos de alto nivel y características de anticuerpo deseables, tal como se describe más adelante en forma adicional. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo ratones desprotegidos o en cultivos celulares in vivo. Los métodos de selección, clonación y expansión de ibridomas son conocidos para los expertos en la técnica.

En una modalidad particular, los hibridomas son hibridomas de ratón tal como se describió anteriormente. En otra modalidad particular, los hibridomas se producen en una especie no humana, no de ratón tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballo. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales se fusiona el mieloma sin secreción humano con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-RAGE.

Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos pueden generarse a través de técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la presente invención se pueden producir mediante disociación proteolítica de moléculas de inmunoglobulina utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. 3.3. Anticuerpos monoclonales anti-RAGE utilizando SLAM En otro aspecto de la presente invención, los anticuerpos recombinantes se generan a partir de linfocitos aislados, simples utilizando un procedimiento referido en la técnica como el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), tal como se describe en la Publicación de Patente No. 5,627,052, Publicación PCT WO 92/02551 y en la Publicación de Babcock, J.S. y asociados (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. En este método, las células simples que secretan los anticuerpos de interés, por ejemplo linfocitos derivados de cualesquiera de los animales inmunizados descritos anteriormente, se clasifican utilizando un ensayo de placa hemolítica específica de antígeno, en donde el antígeno RAGE, una subunidad de RAGE, o un fragmento del mismo se acopla a glóbulos rojos de oveja, utilizando un enlazador, tal como biotina, y se utiliza para identificar células simples que secretan anticuerpos con especificidad para RAGE. Después de la identificación de las células que secretan anticuerpos de interés, se rescatan los cADNs de la región variable de cadena pesada y ligera de las células mediante PCR-transcriptasa inversa, y estas regiones variables pueden ser expresadas posteriormente dentro del contexto de regiones constantes de inmunoglobulina adecuadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células huésped de mamífero, tales como células COS o CHO. Las células huésped transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, posteriormente pasan por análisis adicional y selección in vitro, por ejemplo abarcando las células transfectadas para aislar células que expresan anticuerpos para RAGE. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, pueden ser manipuladas en forma adicional in vitro, tal como mediante métodos de maduración de afinidad in vitro tal como los descritos en la Publicación PCT WO 97/29131 y en la Publicación PCT WO 00/56772. 3.4. Anticuerpos monoclonales anti-RAGE utilizando animales transgénicos En otra modalidad de la presente invención, se producen anticuerpos inmunizando un animal no humano que comprende algunos o todos los lugares de inmunoglobulina humana con un antígeno RAGE. En una modalidad particular, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón construida que comprende fragmentos grandes de lugares de inmunoglobulina humana y tiene deficiencia en la producción de anticuerpos de ratón. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Green y asociados. Genéticas de la Naturaleza 7:13-21 (1994) y Patentes Norteamericanas Nos. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 y 6,130,364. También ver la Publicación Internacional WO 91/10741, publicada el 25 de Julio de 1991, WO 94/02602, publicada el 3 de Febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, publicadas ambas el 31 de Octubre de 1996, WO 98/16654, publicada el 23 de Abril de 1998, WO 98/24893, publicada el 11 de Junio de 1998, WO 98/50433, publicada el 12 de Noviembre de 1998, WO 99/45031, publicada el 10 de Septiembre de 1999, WO 99/53049, publicada el 21 de Octubre de 1999, WO 00 09560, publicada el 25 de Febrero de 2000 y WO 00/037504, publicada el 29 de Junio de 200. Los ratones transgénicos XENOMOUSE producen un repertorio humano tipo adulto de anticuerpos humanos completos, y genera Mab humanos específicos de antígenos. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpo humano a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal con tamaño de mega base del lugar de la cadena pesada humana y lugar de la cadena ligera x. Ver la Publicación de Méndez y asociados., Genéticas de la Naturaleza 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. 3.5. Anticuerpos monoclonales anti-RAGE utilizando bibliotecas de anticuerpo recombinante También se pueden utilizar métodos ¡n vitro para elaborar los anticuerpos de la presente invención, en donde la biblioteca de anticuerpo se clasifica para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de enlace deseada. Los métodos para dicha clasificación de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidas en la técnica e incluyen métodos descritos por ejemplo en la Publicación de Ladner y asociados. Patente Norteamericana No. 5,223,409; Kang y asociados. Publicación PCT No. WO 92/18619; Dower y asociados. Publicación PCT No. WO 91/17271; Winter y asociados. Publicación PCT No. WO 92/20791; Markland y asociados. Publicación PCT No. WO 92/15679; Breitling y asociados. Publicación PCT . No. WO 93/01288; McCafferty y asociados. Publicación PCT No. WO 92/01047; Garrard y asociados. Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs y asociados (1991) Bio/Tecnología 9:1370-1372; Hay y asociados (1992) Hibridomas de Anticuerpo Humano 3_:81-85; Huse y asociados (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty y asociados, Nature (1990) 348:552-554: Griffiths y asociados (1993) EMBO J 1_2:725-734; Hawkins y asociados (1992) J Mol Biol 226:889-896: Clackson y asociados (1991) Naturaleza 352:624-628: Gram y asociados (1992) PNAS 8_9:3576-3580; Garrad y asociados (1991) Bio/Tecnología 9_: 1373-1377; Hoogenboom y asociados (1991) Investigación de Ácidos Nucleicos 1_9:4133-4137; y Barbas y asociados (1991) PNAS 88:7978-7982, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 20030186374, y Publicación PCT No. WO 97/29131, cuyos contenidos están incorporados cada uno a la presente invención como referencia.

La biblioteca de anticuerpo recombinante puede ser de un sujeto inmunizado con RAGE, o una parte de RAGE. Como alternativa, la biblioteca de anticuerpo recombinante puede ser de un sujeto na'íve, por ejemplo uno quien no haya sido inmunizado con RAGE, tal como una biblioteca de anticuerpo humano de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con RAGE humano. Los anticuerpos de la presente invención se seleccionan clasificando la biblioteca de anticuerpo recombinante con el péptido que comprende RAGE humano para seleccionar de esta forma los anticuerpos que reconocen RAGE. Los métodos para conducir dicha clasificación y selección son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en las referencias en el párrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la presente invención que tienen afinidades de enlace particulares para hRAGE, tal como los que se disocian de RAGE humano con una constante de rango kfuera particular, se puede utilizar el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón de superficie para seleccionar anticuerpos, que tienen la constante de rango kfuera deseada. Para seleccionar anticuerpos de la presente invención que tienen una actividad neutralizante en particular para hRAGE, tal como aquellos con un IC50 particular, se pueden utilizar métodos estándar conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad hRAGE.

En un aspecto, la presente invención pertenece a un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígenos del mismo, que enlaza a RAGE humano. Particularmente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En diversas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar utilizando varios métodos de despliegue de fagos conocidos en la técnica. El método de despliegue de fago, los dominios de anticuerpo funcional son desplegados en la superficie de las partículas de fago, que llevan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En particular, dicho fago puede utilizarse para desplegar dominios de enlace de antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpo de combinación (por ejemplo, humano o múrido). El fago que expresa un dominio de enlace de antígeno que enlaza al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con un antígeno, por ejemplo, utilizando el antígeno etiquetado o un antígeno enlazado o capturado a una superficie sólida o gránulo. El fago utilizando estos métodos normalmente es un fago filamentoso que incluye dominios de enlace fd y M13 expresados del fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro fusionados en forma recombinante ya sea a la proteína del gen III o gen VIII de fago. Los ejemplos de los métodos de despliegue de fagos que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invención, incluyen los descritos en la Publicación de Brínkman y asociados, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames y asociados, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough y asociados, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic y asociados, Gene 187 9-18 (1997); Burton y asociados., Avances en Inmunología 57:191-280 (1994); Publicación PCT No. PCT/GB91/01134; Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes Norteamericanas. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Tal como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fago, las regiones que codifican el anticuerpo del fago se pueden aislar y utilizar para generar anticuerpos completos incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de enlace de antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células de plantas, levadura y bacterias, por ejemplo como se describe con mayor detalle más adelante. Por ejemplo, las técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también se pueden emplear utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la Publicación PCT WO 92/22324; Mullinax y asociados, Biotécnicas 12(6): 864-869 (1992); y Sawai y asociados, AJRI 34:26-34 (1995); y Better y asociados, Ciencia 240:1041-1043 (1988) (las referencias están incorporadas en sus totalidades a la presente invención). Los ejemplos de técnicas, que se pueden utilizar para producir Fvs y anticuerpos de cadena simple incluyen las que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778 y 5,258,498; en la Publicación de Huston y asociados, Métodos en Enzimología 203:46-88 (1991); Shu y asociados, PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra y asociados, ciencia 240:1038-1040 (1988).

Como alternativa a la clasificación de bibliotecas de anticuerpo recombinante mediante despliegue de fago, se pueden aplicar otras metodologías conocidas en la técnica para clasificar bibliotecas de combinación grandes para la identificación de anticuerpos de especificidad doble de la presente invención. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el cual la biblioteca de anticuerpo recombinante se expresa como fusiones de ARN-proteína, tal como se describe en la Publicación PCT No. WO 98/31700 de Szostak y Roberts, y en la Publicación de Roberts, R.W. y Szostak, J.W. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94^12297-12302. En este sistema, una fusión covalente es creada entre un mARN y el péptido o proteína que se codifica mediante traducción in vitro de mARN sintético que llevan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo en su extremo 3'. Por lo tanto, un mARN específico puede ser enriquecido a partir de una mezcla compleja de mARN (por ejemplo, una biblioteca de combinación) con base en las propiedades del péptido o proteína codificado, por ejemplo anticuerpo, o parte del mismo, tal como enlace del anticuerpo, o parte del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos o partes del mismo, recuperadas de la clasificación de dichas bibliotecas se pueden expresar a través de medios recombinantes tal como se describe anteriormente (por ejemplo, en células huésped de mamífero) y, además, se pueden someter a maduración por afinidad adicional a través de ya sea vueltas adicionales de clasificación de fusiones de péptido-mARN en donde las mutaciones han sido introducidas en la secuencia(s) seleccionada originalmente o a través de otros métodos de maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, tal como se describe anteriormente.

En otro método los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar utilizando métodos de despliegue de levadura conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de levadura, se utilizan métodos genéticos para atar los dominios de anticuerpo a la pared de la célula de levadura y desplegarlos en la superficie de la misma. En particular, la levadura se puede utilizar para desplegar dominios de enlace-antígeno expresados de un repertorio o biblioteca de anticuerpo de combinación (por ejemplo, humana o de múrido). Los ejemplos de métodos de despliegue de levadura que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invención, incluyen los descritos en la Publicación de Wittrup, y asociados. Patente Norteamericana No. 6,699,658 incorporada a la presente invención como referencia. 4. Producción de anticuerpos RAGE recombinantes particulares de la presente invención Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir a través de cualquier número de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, la expresión de células huésped, en donde el vector(s) de expresión que codifica las cadenas pesadas y ligeras es (son) transfectado en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" están proyectadas para comprender una amplia variedad de técnicas utilizadas comúnmente para la introducción de ADN endógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación , precipitación de fosfato-calcio, transfección de dextrano-DEAE y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la presente invención ya sea en células huésped procarióticas o eucarióticas, la expresión de los anticuerpos en células eucarióticas es preferible, y más preferible en células huésped de mamífero, debido a que dichas células eucarióticas (en particular células de mamífero) es más probable que ensamblen y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y multiplicado en forma adecuada que las células procarióticas.

Las células huésped de mamífero particulares para expresar los anticuerpos recombinantes de la presente invención, incluyen Células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en las Publicaciones de Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77_:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, tal como se describe en la Publicación de R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 ). células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpo se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped, o en particular, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual crecen las células huésped. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar.

Las células huésped también se pueden utilizar para producir fragmentos de anticuerpo funcionales, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Quedará entendido que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifica los fragmentos funcionales ya sea de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. La tecnología de ADN recombinante también se puede utilizar para eliminar parte o todo el ADN que codifica cualquiera de, o ambas de las cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para enlazar a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están comprendidas en los anticuerpos de la presente invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la presente invención, y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno además de los antígenos de interés, reticulando un anticuerpo de la presente invención para un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química estándar.

En un sistema particular para expresión recombinante de un anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, la presente invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células dhfr-CHO mediante transfección transmitida por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo cada uno se enlazan en forma operativa a los elementos de regulación aumentadores CMV/promotores AdMLP para conducir a altos niveles de transcripción de genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, el cual permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación de metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y el anticuerpo intacto es recuperado del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar los- transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Aún además la presente invención proporciona un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la presente invención, cultivando una célula huésped de la presente invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante de la presente invención. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo. 4.1. Anticuerpos anti-RAGE La tabla 4 es una lista de secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos anti-hRAGE particulares de la presente invención.

Tabla 4: Lista de Secuencias de Aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos anti-huRAGE Seq. ID Región de la No. Proteína Secuencia 1234567890123456789012345678901 EEKLEESGGGLVQLGGSMKISCVASGFTLSN Y MDWVRQSPEKGLE IAEI LKSNYYSTHY 1 VH 7F9 AESVKGRFSISRDDS GSVSLQMDNLTAEDT GIYFCARNAYWYFDVWGTGTTVTVSS Residuos VH 7F9 31-35 de NYWMD CDR-Hl SEQ ID NO . : 1 ¦Seq. ID Región de la No. Proteína Secuencia 1234567890123456789012345678901 Residuos VH 7F9 50-68 de EIRLKSNYYSTHYAESVKG CDR-H2 SEQ ID NO. : 1 Residuos VH 7F9 101-108 de NAYWYFDV CDR-H3 SEQ ID NO. : 1 DIVMTQSHKF STSVGDRVSATCKASQDVGT SVAWYQQKLGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRF 5 VL 7F9 TGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYNN YPLTFGDGTKLELKR Residuos VL 7F9 24-34 de KASQDVGTSVA CDR-L1 SEQ ID NO. : 5 Residuos 50- VL 7F9 56 de SEQ WTSTRHT CDR-L2 ID NO. : 5 Residuos 89- VL 7F9 97 de SEQ QQY NYPLT CDR-L3 ID NO. : 5 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTN FGMNWVKQAPGKGLKWMGYINTNTGESIYSE 9 VH 11E6 EFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTAT YFCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS Residuos VH 11E6 31-35 de CDR-H1 NFGMN SEQ ID NO. : 9 Residuos VH 11E6 50-66 de YIN NTGESIYSEEFKG CDR-H2 SEQ ID NO. : 9 Residuos VH 11E6 99-109 de SRMVTAYGMDY CDR-H3 SEQ ID NO. :9 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGT VL AVAWYQQRPGQSPKLLIFSASNRYTGVPDRF 13 11E6 TGSGSGTDFTLTLSN QPEDLADY CQQYSS YPLTFGVGTKLELKR Residuos 24- VL 11E6 34 de SEQ KASQNVGTAVA CDR-L1 ID NO. : 13 VL 11E6 Residuos 50- SASNRYT CDR-L2 56 de SEQ ID NO . : 13 Residuos 89- VL 11E6 97 de SEQ QQYSSYPLT CDR-L3 ID NO. :13 Seq. ID Región de la NO. proteína Secuencia 1234567890123456789012345678901 QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFNN YLIEWIKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNHNE 17 VH 4E5 KFKVKATLTAD SSSTAYIQLSSLTSDDSAV YFCARSAGTARARFAYWGQGTLVTVSA Residuos VH 4E5 31-35 de NYLIE CDR-H1 SEQ ID NO. : 17 Residuos VH 4E5 50-66 de VINPGSGGTNHNEKFKV CDR-H2 SEQ ID NO. : 17 Residuos VH 4E5 99-109 de SAGTARARFAY CDR-H3 SEQ ID NO. : 17 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGS SL WLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRF 21 VL E5 SGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYAS FPFTFGSGTKLEIKR Residuos 24- VL 4E5 34 de SEQ RASQDIGSSLN CDR-L1 ID NO. :21 Residuos 50- VL 4E5 56 de SEQ ATSSLDS CDR-L2 ID NO. : 21 Residuos 89- VL 4E5 97 de SEQ LQYASFPFT CDR-L3 ID NO. :21 Las secuencias CDR del anticuerpo anti-RAGE aislado anteriores establecen una familia novedosa de proteínas de enlace RAGE, aisladas de acuerdo con la presente invención. Para generar y seleccionar las CDR's de la presente invención que tengan actividad de enlace y/o neutralización de RAGE particular con respecto a hRAGE, se pueden utilizar métodos estándar conocidos en la técnica para generar proteínas de enlace de la presente invención y evaluar las características de enlace y/o neutralización RAGE de dicha proteína de enlace, incluyendo pero sin limitarse a las descritas de manera específica en la presente invención. 4.2. Anticuerpos Quiméricos anti RAGE Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes partes del anticuerpo de diferentes especies animales, tal como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de múrido y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, la Publicación de Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y asociados, Biotécnicas 4:214 (1986); Gillies y asociados, (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes Norteamericanas Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397, que están incorporadas en sus totalidades a la presente invención como referencia. Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y asociados, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger y asociados, 1984, Naturaleza 312:604-608; Takeda y asociados, 1985, Naturaleza 314:452-454 las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia) mediante división de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno adecuada junto con genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica adecuada.

En una modalidad, los anticuerpos quiméricos de la presente invención se producen reemplazando la región constante de cadena pesada de los anticuerpos anti RAGE humano monoclonales de múrido aquí descritos con una región constante lgG1 humana. 4.3. Anticuerpos injertados mediante CDR anti RAGE Los anticuerpos injertados con CDR de la presente invención, comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano en donde una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se reemplazan con secuencias CDR de procedencia no humana, como por ejemplo, anticuerpos de múrido de la presente invención. Una secuencia de estructura de cualquier anticuerpo humano puede servir como la plantilla para el injerto CDR. Sin embargo, el reemplazo de cadena recta en dicha estructura con frecuencia conduce a cierta pérdida de afinidad de enlace para el antígeno. Entre más homólogo es un anticuerpo humano con el anticuerpo de múrido original, es menos probable la posibilidad de que la combinación de las CDR de múrido dentro de la estructura humana introduzcan distorsiones en las CDRs que puedan reducir la afinidad. Por consiguiente, es preferible que la región variable humana que se elija para reemplazar la estructura variable de múrido además de las CDRs, tengan al menos una identidad de secuencia del 65% con la estructura de región variable de anticuerpo de múrido. Es más preferible que las regiones variables de humano y de múrido además de las CDRs tengan al menos el 70% de identidad de secuencia.

Incluso es más probable que las regiones variables de humano y múrido además de las CDRs tengan al menos el 75% de identidad de secuencia. Es más preferible aunque las regiones variables de humano y múrido además de las CDRs tengan al menos el 80% de identidad de secuencia. Los métodos para producir anticuerpos injertados con CDR son conocidos en la técnica (Jones y asociados, Naturaleza 321:522-525 (1986); Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539).

En una modalidad específica, la presente invención proporciona anticuerpos injertados con CDR con cadenas VH y/o VL tal como se describe en la tabla 5.

Tabla 5: Anticuerpos injertados con CDR SEQ ID - Región de la proteína Secuencia No. 123456789012345678901234567890 56 VH 11E6.1-GL QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT (43) (VH7-4.1/JH6 FRl) NFGMNWVRQAPGQGLE MGYINTNTGESIY (44) (VH7-4.1/JH6 FR2) SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAED (45) (VH7-4.1/JH6 FR3) TAVYYCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS (46) (VH7-4.1/JH6 FR4) 57 VH 11E6.2-GL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (47) (VH1-2/JH6 FRl) NFGMNWVRQAPGQGLE MGYINTNTGESIY (44) (VH1-2/JH6 FR2) SEEFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDD (48) (VH1-2/JH6 FR3) TAVYYCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS (46) (VH1-2/JH6 FR4) 58 VL 11E6.1-GL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQNVG (49) . (1-12/L5/JK2 FRl) TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPS (50) (1-12/L5/JK2 FR2) RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ (51) (1-12/L5/JK2 FR3) YSSYPLTFGQGTKLEIKR , (52) (1-12/L5/JK2 FR4) 59 VL 11E6.2-GL EIVMTQSPA LS SPGERATLSCKASQNVG (53) (3-15/L2/JK2 FRl) TAVA YQQKPGQAPRLLIYSASNRYTGIPA (54) (3-15/L2/JK2 FR2) RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ (55) (3-15/L2/JK2 FR3) YSSYPLTFGQGTKLEIKR (52) (3-15/L2/J 2 FR4) Las secuencias CDR derivadas de mAb 11E6 se escriben con letras negritas. También se hace referencia a las secuencias de estructura específica (FR1 a FR4), escribiendo las SEQ ID NOs correspondientes (ver también tablas 2 y 3). 4.4. Anticuerpos humanizados anti RAGE Los anticuerpos humanizados son moléculas de un anticuerpo de especie no humana que enlaza el antígeno deseado que tiene una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la especie no humana y las regiones de estructura de una molécula de inmunoglobulina humana. Se describen secuencias Ig humanas conocidas, en los sitios por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www. public. iastate.edu/. about.pedro/research_tools. html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www. whf reeman .com/i mmu nology/CH-05/ku by05. htm ; www. libra ry.thin kquest.org/ 12429/I mmune/Antibody. html; www. h hmi.org/grants/lectur es/1996/vlab/; www. path. ca m. ac. uk/. abo ut.mrcV/m-i keimages.html; www.antibod resource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology. html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/ índex. -html; www. biotech .ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u. a cjp/.about.yasuhito-/ Elisa, html; www. biodesign.com/table.asp; www. icnet. uk/axp/facs/davies/links. html ; www. biotech. ufl.edu/. a bout.f ccl/p roto col . html; www. isacnet.org/sites_geo. html; aximtl.imt. unimarburg.de/. about.rek/AEP-Start. html; base rv.uci.kun. ni/. about.jraats/linksl. html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/ INTRO.html; www.ibt.unam. mx/v ir/ V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www. biochem.ucl.ac. uk/.about.martin/abs/index. html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www. unizh.ch/.about. honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www. nimr. mrc.ac. uk/CC/ccaewg/ccaewg. htm ; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam. mx/v ¡r/structure/stat_aim. html; www. biosci. missouri.edu/smithgp/index. html; www.cryst.bioc.cam.ac. uk/. a bout.f mol i na/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat y asociados, Secuencias de Proteínas de Interés I nmunológico, Departamento de Salud de los Estados Unidos (1983), cada una incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Dichas secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o reducir, aumentar o modificar el enlace, afinidad, en rango, fuera de rango, avidez, especificidad, vida media, o cualquier otra característica adecuada, tal como se conoce en la técnica.

Los residuos de estructura en las regiones de estructura humana pueden sustituirse con el residuo correspondiente del anticuerpo donante CDR para alterar, particularmente mejorar, el enlace de antígeno. Estas sustituciones de estructura se identifican a través de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo modelando las interacciones de CDR y los residuos de estructura para identificar residuos de estructura importantes para el enlace de antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos de estructura no usuales en posiciones particulares. (Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,585,089 de Queen y asociados; Riechmann y asociados., Naturaleza 332:323 (1988), las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia). Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del probable desempeño de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para enlazar su antígeno. De esta forma, se pueden seleccionar residuos FR y combinarse a partir de las secuencias de consenso e importación de modo que la característica del anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada para el antígeno(s) objetivo, pueda lograrse. En general, los residuos CDR están directa, y en su mayor parte sustancialmente implicados en la influencia del enlace de antígeno. Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una variedad de técnicas conocidas en el arte, tal como pero sin limitarse a las descritas en la Publicación de Jones y asociados, Naturaleza 321:522 (1986); Verhoeyen y asociados, Ciencia 239:1534 (1988)), Sims y asociados, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Cárter y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:4285 (1992); Presta y asociados, J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Inmunología Molecular 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka y asociados, Construcción de Proteína 7(6):805-814 (1994); Roguska. y asociados, PNAS 91:969-973 (1994); Publicación PCT WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, Patentes Norteamericanas Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, cada una de las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia, incluyendo las referencias ahí mencionadas. 5. Modalidades Adicionales de los Anticuerpos de la Invención 5.1. Anticuerpos de Fusión e Inmunoadhesinas La prese,nte solicitud también describe un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que se puede elaborar que comprende todo o parte de un anticuerpo RAGE de la presente solicitud enlazado a otro polipéptido. En algunas modalidades, únicamente la región variable del anticuerpo RAGE se enlaza al polipéptido. En otras modalidades, el dominio VH del anticuerpo RAGE de la presente solicitud se enlaza a un primer polipéptido, en tanto que el dominio VL del anticuerpo se enlaza a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido en una forma que le permite a los dominios VH y VL ¡nteractuar entre sí para formar un sitio de enlace de anticuerpo. En otras modalidades, el dominio VH se separa del dominio VL a través de un enlazador que permite que los dominios VH y VL interactúen uno con el otro (ver más adelante en la sección de Anticuerpos de Cadena Simple). El anticuerpo VH enlazador-VL posteriormente se enlaza a un polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresa un RAGE. El polipéptido de interés puede ser un agente terapéutico tal como una toxina, o puede ser un agente de diagnóstico tal como una enzima que se puede visualizar fácilmente, tal como peroxidasa de rábano. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los cuales se enlazan entre sí dos (o más) anticuerpos de cadena simple. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena de polipéptido simple, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.

Una modalidad proporciona una proteína de enlace etiquetada en donde un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente solicitud, se deriva o se enlaza a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de enlace etiquetada de la presente solicitud se puede derivar mediante el enlace funcional de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente solicitud (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o cualquier otra) a una o más de otras entidades moleculares, tal como un ácido nucleico, otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede transmitir la asociación del anticuerpo o parte del anticuerpo con otra molécula (tal como la región del centro de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Los agentes detectables útiles con los cuales se puede derivar un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente solicitud, incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes de ejemplo incluyen fluorescenia, isotiocianato de flourescenia, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. También se puede derivar un anticuerpo con enzimas detectables, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, oxidasa de glucosa y similares. Cuando se deriva un anticuerpo con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando está presente el agente detectable de peroxidasa de rábano, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, el cual es detectable. También se puede derivar un anticuerpo con un ácido nucleico, biotina y detectarse a través de la medición indirecta de avidina o enlace de estreptavidina. 5.2. Anticuerpos de Cadena Simple La presente solicitud incluye un anticuerpo de cadena simple (svFv) que enlaza a un RAGE inmunogénico de la presente invención. Para producir el scFv, el ADN que codifica VH y V se enlaza en forma operativa al ADN que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácido (Gly4-Ser), de modo que las secuencias VH y VL se puedan expresar como una proteína de cadena simple contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el enlazador flexible (ver por ejemplo la Publicación de Bird y asociados. (1988) Ciencia 242:423-42 6; Huston y asociados (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; cCafferty y asociados., 30 Naturaleza (1990) 34 8: 552-554). El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si únicamente se utiliza VH y VL simple, bivalentes y se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL. Dos de dichos fragmentos scFv acoplados a través de un enlazador, son denominados "diacuerpo", cuya forma también está comprendida en la presente invención. 5.3. Anticuerpos Biespecí fieos La presente solicitud incluye además un anticuerpo biespecífico o fragmento de enlace de antígenos del mismo en el cual una especificidad es para un polipéptido RAGE inmunogénico de la presente solicitud. Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo biespecífico que enlaza específicamente a un polipéptido RAGE inmunogénico de la presente invención, a través de un dominio de enlace y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de enlace. Además, se puede generar un anticuerpo de cadena simple que contiene más de un VH y VL que enlaza específicamente a un polipéptido inmunogénico de la presente invención y a otra molécula que está asociada con la atenuación del colapso en forma de cono del crecimiento transmitido por mielina, y la inhibición del excrecencia y retoño de neurita. Dichos anticuerpos biespecíf icos pueden ser generados utilizando técnicas que son conocidas por ejemplo, Fanger y asociados. Métodos de Inmunología 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, 20 (supra).

En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíf icos se preparan utilizando una o más regiones variables de un anticuerpo de la presente invención. En otra modalidad, el anticuerpo biespecífico se prepara utilizando una o más regiones CDR del anticuerpo. 5.4. Anticuerpos Derivados y Etiquetados Un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de la presente solicitud se puede derivar o enlazar a otras moléculas (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno se deriva de modo que el enlace a un polipéptido inmunogénico de la presente invención no se vea afectado en forma adversa por la derivación o etiquetado.

Por ejemplo, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente solicitud se puede enlazar en forma funcional (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o cualquier otra) a una o más de otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un reactivo de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede transmitir la asociación del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno con otra molécula (tal como una región de centro de estreptavidina o una etiqueta de polihístidina). Aún además, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mayor, formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo o parte de anticuerpo con una o más de otras diferentes proteínas o péptidos. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de una región central de estreptavidina para elaborar la molécula scFv tetramérica (Kipriyanov y asociados. (1995) Anticuerpos e Hibrídomas Humanos 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para elaborar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov y asociados (1994) Inmunología Molecular 31: 1047-1058). Las partes de anticuerpo, tal como fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar a partir anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, partes de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener utilizando técnicas de ADN recombinante estándar.

Se puede producir un anticuerpo derivado reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticuladores adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos en forma diferente separados por un espaciador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, 111.

Un anticuerpo derivado también puede ser un anticuerpo etiquetado. Por ejemplo, los agentes de detección con los cuales se puede derivar un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente invención, son compuestos fluorescentes incluyendo fluorescenia, isotiocianato de fluorescenia, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánida y similares. Un anticuerpo también se puede etiquetar con enzimas que son útiles para detección, tal como peroxidasa de rábano, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosaoxidasa y similares. En modalidades que están etiquetadas con una enzima detectable, el anticuerpo se detecta agregando reactivos adicionales, que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, peroxidasa de rábano con peróxido de hidrógeno y diaminobencidina. Un anticuerpo también se puede etiquetar con biotina, y detectarse a través de la medida indirecta de enlace de avidina o estreptavidina. También se puede etiquetar un anticuerpo con un epítope de polipéptido predeterminado reconocido por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cierre de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, epítope: etiquetas). Un anticuerpo RAGE o un fragmento de antígeno de los mismos también se puede etiquetar con un aminoácido radio-etiquetado. La radioetiqueta puede utilizarse tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos. El anticuerpo RAGE radioetíquetado puede utilizarse en forma de diagnóstico, por ejemplo para determinar los niveles del receptor RAGE en un sujeto. Además, el anticuerpo RAGE radioetíquetado se puede utilizar en forma terapéutica para tratar lesión de médula espinal.

Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos se incluyen pero no se limitan a los siguientes radioisótopos o radionucleótidos 5N, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 1251, 1311, 177Lu, 166Ho, 53Sm. Un anticuerpo RAGE o un fragmento de enlace de antígeno del mismo también se puede derivar con un grupo químico tal como polietilen glicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo de carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo para incrementar la vida media en suero o incrementar el enlace de tejido. Asimismo, una etiqueta para polipéptidos puede incluir un ácido nucleico, por ejemplo ADN para detección mediante PCR, o aumentar la expresión genética, o siARN para suprimir la expresión genética en células o tejidos que contienen RAGE.

La clase y la subclase de anticuerpos RAGE se puede generar a través de cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase o subclase de un anticuerpo puede determinarse utilizando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particular del anticuerpo. Dichos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase se puede determinar mediante ELISA, manchado Western Blot, así como otras técnicas. Como alternativa, la clase y subclase puede determinarse mediante secuenciación de toda o una parte de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácido con las secuencias de aminoácido conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos. 5.5. Inmunoglobulinas de Dominio Variable Doble Las proteínas de enlace de dominio variable doble (DVD) o inmunoglobulinas tal como se utiliza en la presente invención, son proteínas de enlace que comprenden dos o más sitios de enlace de antígeno y son proteínas de enlace tetravalente o multivalente, como por ejemplo divalente o tetravalente. El término "proteína de enlace multivalente" se utiliza en la presente especificación para indicar una proteína de enlace que comprende dos o más sitios de enlace de antígeno. La proteína de enlace multivalente se construye particularmente para tener dos o más sitios de enlace de antígeno, y generalmente no es un anticuerpo que ocurre naturalmente. El término "proteína de enlace multiespecífico" se refiere a una proteína de enlace con la capacidad de enlazar dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Dichos DVDs pueden ser monoespecíficos, es decir con la capacidad de enlazar un antígeno o multiespecíficos, es decir con la capacidad de enlazar dos o más antígenos. Las proteínas de enlace DVD que comprenden dos polipéptidos DVD de cadena pesada y dos polipéptidos DVD de cadena ligera son referidos como DVD Ig. Cada mitad de un DVD Ig comprende un polipéptido DVD de cadena pesada, y un polipéptido DVD de cadena ligera, y dos sitios de enlace de antígeno. Cada sitio de enlace comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDRs implicadas en el enlace de antígeno sitio de enlace de antígeno. Las proteínas de enlace DVD y los métodos para elaborar proteínas de enlace DVD se describen en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/507,050 y se incorpora en la presente invención como referencia. Se pretende que la presente invención comprenda una proteína de enlace DVD que comprenda proteínas de enlace con la capacidad de enlazar RAGE. Particularmente la proteína de enlace DVD tiene la capacidad de enlazar RAGE y un segundo objetivo. El segundo objetivo se selecciona del grupo que consiste en actividades MAB antiinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23.TNF alfa/beta, IFN-beta, gamma, LIF, OSM, CNTF, PF-4, Proteína Básica de Plaqueta (PBP), NAP-2, beta-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, linfotactina), de proteínas que transmiten el transporte (receptor de insulina, receptor de transferina, receptor de trombina, receptor de leptina, receptor LDL) de otros MABs neurodegenerativos (NgR, Lingo, p75, CSPG (por ejemplo NG-2, neurocan, brevican, versican, aggrecan) ácido hialurónico, mAG, tenascina, NI-35, NI-250, IMP, perlecan, neurocan, fosfacan, nogo-A, OMGP, Sema4D, Sema 3A, efrina B3, efrina A2, efrina A5, MAG, EphA4, plexin B1, TROY, wnts, ryk rec, BMP-2, BMP-4, BMP-7), de actividades humanas MAB neuroprotectoras (EGF, EGFR, Sema 3), de MABs anti-amiloide beta (por ejemplo m266, 3D6 (bapineuzumab), anti-globulómero MABs 7C6), de receptores y transportadores localizados CNS (receptor de serotonina, receptores de dopamina, DAT, Asc-1, GlyT1). 5.6. Anticuerpos específicos dobles La presente solicitud también describe tecnología de "anticuerpo específico doble". Los anticuerpos específicos dobles pueden servir como agonistas, antagonistas, o ambos en diferentes combinaciones. Los anticuerpos específicos dobles son anticuerpos en los cuales la cadena VH enlaza a un primer antígeno, y la cadena VL enlaza a otro antígeno tal como se ejemplifica en la Publicación Internacional WO2008082651. 5.7. Anticuerpos Cristalizados Otra modalidad de la presente solicitud proporciona una proteína de enlace cristalizada. El termino "cristalizado" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, que existe en la forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, que es distinto a otras formas tal como estado sólido amorfo y el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos de formaciones tridimensionales, de repetición, regulares de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos), o ensambles moleculares (por ejemplo, complejos de antígeno/anticuerpo). Estas formaciones tridimensionales son distribuidas de acuerdo con relaciones matemáticas específicas que son bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal es denominada unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una formación que se conforma con una simetría cristalográfica bien definida, determinada proporciona la "célula unitaria" del cristal. La repetición de la célula unitaria mediante traducciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Ver la Publicación de Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Cristalización de Ácidos Nucleicos y Proteínas, método práctico, 2° edición, páginas 20 1-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999).

Particularmente la presente solicitud describe cristales de anticuerpos RAGE completos y fragmentos de los mismos tal como aquí se describe, y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una modalidad la proteína de enlace cristalizada tiene una vida media mayor ¡n vivo que la contraparte soluble de la proteína de enlace. En otra modalidad la proteína de enlace retiene la actividad biológica después de la cristalización.

La proteína de enlace cristalizada de la presente invención se puede producir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y tal como se describe en la Publicación Internacional WO 02072636, incorporada a la presente invención como referencia. 5.8. Anticuerpos Glucosilados Otra modalidad de la presente invención proporciona una proteína de enlace glucosilada en donde la parte de enlace de anticuerpo o antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción de proteína in vivo nasciente, puede pasar por procesamientos adicionales, conocidos como modificación post-traducción. En particular, se puede agregar en forma enzimática residuos de azúcar (glucosilo) un proceso conocido como glucosilación. Las proteínas resultantes que contienen cadenas laterales de oligosacárido enlazas en forma covalente son conocidas como proteínas o glucoproteínas glucosiladas. Los anticuerpos son glucoproteínas con uno o más residuos de carbohidrato en el dominio Fe, así como el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fe tienen efectos importantes en la función efectora del dominio Fe, con un efecto mínimo en el enlace de antígenos o vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). En contraste, La glucosilación del dominio variable puede tener un efecto en la actividad de enlace de antígenos del anticuerpo. La glucosilación en el dominio variable puede tener un efecto negativo en la actividad del enlace de anticuerpo, probablemente debido a la hidranza esférica (Co, M.S., y asociados, Inmunología Molecular (1993) 30:1361-1367), o se puede obtener como resultado la afinidad incrementada para el antígeno (Wallick, S. C, y asociados, Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., y asociados, EMBO J. (1991) 10:2717 2723).

Un aspecto de la presente invención se dirige a generar mutantes de sitio de glucosilación en los cuales el sitio de glucosilación enlazado-0 o -N de la proteína de enlace ha sido mutado. Un experto en la técnica puede generar dichos mutantes utilizando tecnologías bien conocidas. Los mutantes de sitio de glucosilación que retienen actividad biológica, pero tienen actividad de enlace incrementada o disminuida, son otro objeto de la presente invención. Aún en otra modalidad, la glucosilación del anticuerpo o parte de enlace de antígenos de la presente invención es modificada. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación puede ser alterada, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden lograr por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, pueden elaborar una o más sustituciones de aminoácido que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de región variable para eliminar de esta forma la glucosilación en dicho sitio. Dicha aglucosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dicho método se describe con mayor detalle en la Publicación PCT WO2003016466A2, y en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,714,350 y 6,350,861, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

En forma adicional o alternativa, un anticuerpo modificado de la presente invención se puede elaborar de modo que tenga un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo hi pof ucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GIcNAc de bisección incrementadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados incrementan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glucosilación alterada. Las células con maquinaria de glucosilación alterada han sido descritas en la técnica y se pueden utilizar como células huésped en los cuales se expresan anticuerpos recombinantes de la presente invención para producir de esta forma un anticuerpo con glucosilación alterada. Ver por ejemplo las Publicaciones de Shields, R. L. y asociados (2002) J. B i o I . Chem. 277:26733-26740; Umana y asociados (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como la Patente Norteamericana No. EP 1,176,195; las Publicaciones PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, cada una de las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

La glucosilación de proteína depende de la secuencia de aminoácido de la proteína de interés, así como la célula huésped en la cual se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glucosilación (por ejemplo, glucosiltransferasas y glucosidasas), y tener diferentes substratos (azúcares de nucleótido) disponibles. Debido a dichos factores, el patrón de glucosilación de proteína, y la composición de residuos de glucosilo pueden diferir dependiendo del sistema huésped en el cual se expresa la proteína particular. Los residuos de glucosilo útiles en la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. Particularmente la proteína de enlace glucosilada comprende residuos de glucosilo, de modo que el patrón de glucosilación es humano.

Es sabido para los expertos en la técnica que las diferentes glucosilaciones de proteína pueden dar como resultado diferentes características de proteína. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un microorganismo huésped, tal como levadura, y glucosilada utilizando la trayectoria endógena de levadura se puede reducir en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea de célula CHO. Dichas glucoproteínas también pueden ser inmunogénicas en humanos y mostrar una vida media reducida in vivo después de la administración. Los receptores específicos en humanos y otros animales pueden reconocer residuos de glucosilo específicos y promover el rápido despeje de la proteína del torrente sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en la multiplicación de proteína, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por parte de otras proteínas o factores, antigenicidad , o alergenicidad . Por consiguiente, un practicante puede preferir una proteína terapéutica con una composición específica y patrón de glucosilación y por ejemplo, una composición de glucosilación y patrón idénticos o aniones similares a los producidos en células humanas o en las células específicas de la especie del animal en cuestión proyectado.

La expresión de proteínas glucosiladas diferentes a las de una célula huésped, se puede lograr mediante modificación genética de la célula huésped para expresar enzimas de glucosilación heteróloga. Utilizando técnicas conocidas en el arte, un practicante puede generar anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos que exhiben glucosilación de proteína humana. Por ejemplo, las cepas de levadura han sido modificadas en forma genética para expresar enzimas de glucosilación que no ocurren naturalmente, de modo que las proteínas glucosiladas (glucoproteínas) producidas en esta cepas de levadura, inhiban la glucosilación de proteína idénticas a la de células animales, especialmente células humanas (Solicitudes de Patente Norteamericana 20040018590 y 20020137134 y Publicación PCT WO2005100584 A2).

Además, los expertos en la técnica podrán apreciar que una proteína de interés puede ser expresada utilizada una biblioteca de células huésped construidas en forma genética para expresar diversas enzimas de glucosilación, de modo que las células huésped miembros de la biblioteca, produzcan la proteína de interés con patrones de glucosilación diversos. Posteriormente un practicante puede seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones de glucosilación novedosos, particulares. Particularmente la proteína que tiene un patrón de glucosilación novedoso seleccionado particularmente, exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas. 5.9. Anticuerpos anti-idiotípicos Además de las proteínas de enlace, la presente invención también se dirige a un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) específico para dichas proteínas de enlace de la presente invención. Un anticuerpo anti-ld es un anticuerpo, el cual reconoce determinantes únicas asociadas generalmente con la región de enlace de antígeno de otro anticuerpo. El anti-ld puede prepararse inmunizando un animal con la proteína de enlace o una región que contiene CDR del mismo. El animal inmunizado reconocerá y responderá a las determinantes idiotípicas del anticuerpo de inmunización y producirá un anticuerpo anti-ld. El anticuerpo anti-ld también puede ser utilizado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal aún, produciendo lo que se llama un anticuerpo anti-anti-ld. 6. Usos de los Anticuerpos Debido a su capacidad de enlazar a RAGE humano, los anticuerpos de neutralización de la presente solicitud, o partes de los mismos, se pueden utilizar para detectar RAGE humano (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. La presente solicitud proporciona un método para detectar RAGE humano en una muestra biológica que comprende contactar una muestra biológica con un anticuerpo, o parte de anticuerpo de la presente invención y detectar ya sea el anticuerpo (o parte de anticuerpo) enlazado a RAGE humano o un anticuerpo no enlazado (o parte de anticuerpo), para detectar de esta forma RAGE humano en la muestra biológica. El anticuerpo se etiqueta directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo enlazado o no enlazado. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetil colinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos adecuados de materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluorescenia, isotiocianato de fluorescenia, rodamina, fluorescenia de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o picoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 13 l, 177Lu, 166Ho, 53Sm.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente solicitud, tienen particularmente la capacidad de neutralizar la actividad de RAGE humano tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, dichos anticuerpos o partes de anticuerpo de la presente invención se pueden utilizar para inhibir el enlace de RAGE a sus ligandos, y por consiguiente neutralizar la actividad resultante.

En otra modalidad, la presente solicitud proporciona un método para reducir la actividad RAGE en un sujeto, en forma conveniente de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno en el cual es perjudicial la actividad que resulta de RAGE. La presente solicitud proporciona métodos para reducir la actividad RAGE en un sujeto que padece de dicha enfermedad o trastorno, evitando el enlace RAGE al menos a uno de sus ligandos, tipo globulómeros-?ß, a través del uso de anticuerpos monoclonales de la presente solicitud. Los anticuerpos de la presente invención, en particular, los anticuerpos humanizados aquí descritos, se pueden administrar a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Además, los anticuerpos de la presente solicitud se pueden administrar a un mamífero no humano que expresa un RAGE con el cual el anticuerpo tiene la capacidad de enlazar para propósitos veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a esto último, dichos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, probando las dosis y los cursos de tiempo de administración).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "un trastorno en el cual es perjudicial la actividad de RAGE" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de RAGE o su actividad resultante en un sujeto que padece del trastorno, han mostrado ser, o se sospecha que son ya sea responsables de la patof isiolog ía del trastorno, o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de RAGE es perjudicial, es un trastorno en el cual la reducción de la actividad RAGE se espera que alivie los síntomas y/o progreso del trastorno. Los ejemplos sin limitación de trastornos que pueden ser tratados con los anticuerpos de la presente invención, incluyen los trastornos mencionados en la sección que se encuentra más adelante que pertenecen a las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la presente invención.

Se reconoce que RAGE desempeña un papel importante en la patología asociada con una variedad de enfermedades que implican enfermedades neurológicas seleccionadas del grupo que comprende Esclerosis Lateral Amiotrópica, Lesión de Plexo Braquial, lesión cerebral incluyendo lesión cerebral traumática, Parálisis Cerebral, Ataxia de Friedrich, Guillain Barre, Leucodistrofias, Esclerosis Múltiple, Post Polio, Epina Bifida, Lesión de Médula Espinal, Atrofia de Músculo Espinal, Tumores Espinales, Ataque, Mielitis Transversal, demencia, demencia senil, daño cognitivo leve, demencia relacionada con Alzheimer, corea de Huntington, disquinesia tardía, hiperquinesias, manías, Parkinson Morbus, síndrome de Steel-Richard, síndrome de Down, míastenia grave, trauma nervioso, amiloidosis vascular, hemorragia cerebral I con amiloidosis, inflamación cerebral, ataxia de Friedrich, trastorno de confusión aguda, esclerosis lateral amiotrófica, glaucoma, enfermedad de Alzheimer, nefropatía diabética, sepsis, artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias relacionadas; Diabetes y complicaciones resultantes tipo retinopatía diabética, nefropatía, complicaciones vasculares, complicaciones ateroescleróticas, fibrosis pulmonar, Cáncer especialmente melanomas, otras amiloidosis. (Ver por ejemplo las siguientes referencias: Amiloidosis, cáncer, artritis, enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias crónicas y agudas: Schmidt AM y asociados: J Clin Invest. 2001 Oct; 108(7): 949-55 ; enfermedades cardiovasculares, diabetes, complicaciones diabéticas: Yan SD y asociados: Eur J Clin Invest. 1997 Mar; 27(3): 179-81; enfermedades asociadas-Prion : Sasaki N y asociados: Neurosci Lett. 2002 Jun 28;326(2): 117-20; vascularitis, nefropatías, retinopatías y neuropatías: Thornallev PJ.: Int Rev Neurobiol. 2002;50:37-57; enfermedad de Alzheimer: Weldon DT y asociados: Geriatrics. 1997 Sep;52 Suppl 2:S13-6; Yan SD y asociados: Biochim Biophys Acta. 2000 Jul 26;1502(1): 145-57; artritis reumatoide, osteoartritis: Drinda S y asociados:. Rheumatol Int. 2004 Mar 26; enfermedad de intestino: Foell D y asociados: Gut. 2003 Jun; 52(6):847-53; esclerosis múltiple: Yan SS y asociados: Nat Med. 2003 Mar; 9(3):287-93; psoriasis: Foell D y asociados: Rheumatology (Oxford). 2003 Nov; 42(11): 1383-9: lupus: Tanji N y asociados: J Am Soc Nephrol. 2000 Sep; 11(9): 1656-66; enfermedades autoinmunes generales, sepsis: Liliensiek B y asociados: J Clin Invest. 2004 Jun; 113(11): 1641-50; arteriosclerosis y restenosis: Schmidt AM y asociados: Circ Res. 1999 Mar 19; 84(5):489-97).

Asimismo, tal como se describió anteriormente, las inmunoglobulinas DVD, o anticuerpos específicos dobles entre cualesquiera de las partes descritas anteriormente, pueden ser utilizadas. Dichas preparaciones de anticuerpo tal como se describió anteriormente, pueden ser útiles para el tratamiento de dichas enfermedades.

Los anticuerpos de la presente solicitud también pueden ser combinados con péptidos que permiten la transferencia de trans-membrana para incluir la dirección de proteínas objetivo intracelulares. Dichas secuencias de péptido pueden incluir pero no se limitan a, tat, antennapedia, poli-args, algunos péptidos antimicrobianos. Dichos péptidos pueden permitir la transferencia a través de membranas, incluyendo membranas de plasma celular, aunque también epitelia y membranas endoteliales, incluyendo barrera de sangre-cerebro, mucosa de intestino, meninges, y otros.

Un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la presente solicitud también se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos de molécula pequeña adicionales útiles en el tratamiento de trastornos en los cuales la actividad RAGE está implicada tal como se describe en los párrafos anteriores. Deberá quedar entendido que los anticuerpos de la presente solicitud o una parte de enlace de antígenos del mismo se pueden utilizar solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo un agente terapéutico, siendo seleccionado el agente adicional por el experto para su propósito proyectado. Por ejemplo, un agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que está siendo tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecte la viscosidad de la composición. 7. Composiciones Farmacéuticas La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o la parte de enlace de antígenos del mismo, de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de la presente invención son para utilizarse en, pero sin limitarse a diagnóstico, detección o monitoreo en un trastorno, para prevenir, tratar, maneja o disminuir un trastorno o uno o más síntomas del mismo y/o en investigación. En una modalidad específica, una composición comprende uno o más anticuerpos de la presente invención. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la presente invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos además de los anticuerpos de la presente invención, para tratar un trastorno en el cual es perjudicial la actividad de RAGE. Particularmente, los agentes profilácticos o terapéuticos conocidos como útiles para, o que han sido o están siendo utilizados actualmente en la prevención, tratamiento, manejo o disminución de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas modalidades, la composición puede comprender además un transportador, diluyente o excipiente.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente invención, un "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera de y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso de absorción e isotónicos y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada por fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los transportadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsificación, conservadores o amortiguadores que aumentan la vida media o efectividad del anticuerpo o parte de anticuerpo.

Se conocen diversos sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar uno o más anticuerpos de la presente invención o la combinación de uno o más anticuerpos de la presente invención y un agente profiláctico o un agente terapéutico útil para prevenir, manejar, tratar o disminuir un trastorno o uno o más síntoma del mismo, por ejemplo, encapsu lación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes con la capacidad de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis transmitida por receptor (ver por ejemplo la Publicación de Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos de administración de un agente profiláctico o terapéutico de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración mucosa (por ejemplo, rutas intranasales y orales). Además, se puede emplear administración pulmonar, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebulizador y una formulación con un agente de aerosolización . Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, y 4,880,078; y las Publicaciones PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903, cada una de las cuales está incorporada en sus totalidades a la presente invención como referencia. En una modalidad, se administra un anticuerpo de la presente invención, terapia de combinación o una composición de la misma utilizando la tecnología de suministro de fármacos pulmonares Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la presente invención se administran en forma intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar a través de cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y se pueden administrar juntos con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la presente invención en forma local al área que necesita de tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, mediante infusióji local, mediante inyección, o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissel®), o matrices de colágeno. En una modalidad, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos en forma local al área afectada a un sujeto para evitar tratar, manejar, y/o disminuir un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la presente invención se administran en forma local al área afectada en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) además del anticuerpo de la presente invención a un sujeto para prevenir, tratar, manejar, y/o disminuir un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico se puede administrar en un sistema de liberación controlada o sostenida. En una modalidad, se puede utilizar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (ver por ejemplo la Publicación de Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald y asociados, 1980, Surgery 88:507; Saudek y asociados, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la presente invención (ver por ejemplo, las Aplicaciones Médicas de Liberación Controlada de Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Biodisponibilidad de Fármaco Controlado, Diseño de Desempeño de Fármaco Controlado, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver también las Publicaciones de Levy y asociados, 1985, Ciencia 228:190; During y asociados, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard y asociados, 1989, J. Neurosurg. 71:105); Patente Norteamericana No. 5,679,377; Patente Norteamericana No. 5,916,597; Patente Norteamericana No. 5,912,015; Patente Norteamericana No. 5,989,463; Patente Norteamericana No. 5,128,326; Publicación PCT No. WO 99/15154; y Publicación PCT No. WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etilen-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglucólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli (eti len glicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glucólidos) (PLGA), y poliorto ésteres. En una modalidad preferida, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas filtrables, estables al momento del almacenamiento, estériles y biodegradables. Aún en otra modalidad, un sistema de liberación controlada o sostenida puede colocarse en proximidad de un objetivo profiláctico o terapéutico, requiriendo de esta forma únicamente una fracción de la dosis sistémica (ver por ejemplo la Publicación de Goodson, en Aplicaciones Médicas de Liberación Controlada, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Los sistemas de liberación controlada se describen en la revisión de Langer (1990, Ciencia 249: 1527-1533). Cualquier técnica conocida para un experto en la técnica se puede utilizar para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la presente invención. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,526, 938, Publicación PCT WO 91/05548, Publicación PCT WO 96/20698, Ning y asociados, 1996, "Radio I nmunoterapia Intratumoral de un Xenoinjerto de Cáncer de Colon Humano Utilizando un Gel de Liberación Sostenida" Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song y asociados, 1995, "Tratamiento de Pulmón Transmitido por Anticuerpo de Emulsiones de circulación-Larga Duración", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek y asociados., 1997, "Transportadores Pollméricos Biodegradables de un anticuerpo bFGF para Aplicaciones Cardiovasculares", Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam y asociados, 1997, "Microencapsulación de Anticuerpos Monoclonales Humanizados Recombinantes para Suministro Local", Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada uno de los cuales está incorporado en sus totalidades a la presente invención como referencia.

En una modalidad específica, cuando la composición de la presente invención es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y administrándolo de modo que se convierta intracelular, por ejemplo, a través del uso de un vector retroviral (ver la Patente Norteamericana No. 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola genética; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en ligadura a un péptido tipo homeocaja desconocido por ingresar al núcleo (ver, por ejemplo, la Publicación de Joliot y asociados, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). En forma alternativa, se puede introducir un ácido nucleico en forma intracelular e incorporarse dentro de un ADN de célula huésped para expresión mediante recombinación homologa.

Se formula una composición farmacéutica de la presente invención para ser compatible con su ruta de administración proyectada. Los ejemplos de rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa y rectal. En una modalidad específica, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios en la forma de una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal, o tópica a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local tal como lignocamne para evitar el dolor en el sitio de la inyección.

Si las composiciones de la presente invención se administran en forma tópica, las composiciones se pueden formular en la forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, rociado, aerosol, solución, emulsión u otra forma conocida para los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Publicación de Ciencias Farmacéuticas de Remington e Introducción a Formas de Dosificación Farmacéutica, edición 19, Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para forma de dosificación tópica no rociables, normalmente se emplean formas viscosas a semi-sólidas o sólidas que comprenden un transportador o uno o más excipientes compatible con aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica particularmente mayor al agua. Las formulaciones adecuadas incluyen sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas, y similares, los cuales, si se desea, son esterilizados y mezclados con agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizadores, agentes de humectación, amortiguadores, o sales) para influenciar las diversas propiedades, tales como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas dé dosificación tópica adecuadas incluyen preparaciones en aerosol rociables, en donde el ingrediente activo, particularmente en combinación con un transportador inerte sólido o líquido, se empaca en una mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propulsor gaseoso, tal como freon) o en una botella para apachurrarse. También se pueden agregar humectadores o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Los ejemplos de dichos ingredientes adicionales son conocidos en la técnica.

Si el método de la presente invención comprende administración intranasal de una composición, la composición puede ser formulada en forma de aerosol, rocío, nebulización o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para utilizarse de acuerdo con la presente invención se pueden suministrar en forma conveniente en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (compuestos por ejemplo, gelatina) para utilizarse en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo de compuesto de una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Si el método de la presente invención comprende administración oral, las composiciones se pueden formular oralmente en la forma de tabletas, cápsulas, grajeas, cápsulas de gel, soluciones, suspensiones, y similares. Las tabletas o cápsulas se pueden preparar a través de medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de enlace (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, o hidroxipropil metilcelulosa); rellenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato de hidrógeno o calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glucolato de almidón de sodio); o agentes de humectación (por ejemplo, sulfato laurilo de sodio). Las tabletas pueden ser recubiertas a través de métodos conocidos en la técnica. Las preparaciones liquidas para administración oral pueden tomar la forma de, pero sin limitarse a soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de utilizarse. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse a través de medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o grasas comestibles hidrogenadas); agentes de emulsificación (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, agentes de saborización, coloración, y edulcoración, según sea el adecuado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse en forma adecuada para liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de un agente(s) profiláctico o terapéutico.

El método de la presente invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de aerosolización. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 6,019, 968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 y 4,880,078; y las Publicaciones PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. En una modalidad específica, se administra un anticuerpo de la presente invención, terapia de combinación, y/o composición de la presente invención utilizando tecnología de suministro de fármaco pulmonar AIkermes AIR® (AIkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

El método de la presente invención puede comprender administración de una composición formulada para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o contenedores de dosis múltiple) con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en la forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril) antes del uso. Los métodos de la presente invención pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Dichas formulaciones de acción duradera pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones o como derivados solubles en forma moderada (por ejemplo, como una sal soluble en forma moderada).

Los métodos de la presente invención, comprenden administración de composiciones formuladas como formas neutrales o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como las derivadas de ácidos hidroclóricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc., y las formadas con cationes tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, etanol 2-etilamino, histidina, procaína, etc.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones se suministran ya sea por separado o se mezclan juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado o concentrado libre de agua en un contener sellado herméticamente tal como una ampolleta o sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando el modo de administración es infusión, la composición se puede suministrar con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o solución salina. Cuando el modo de administración es mediante inyección, puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina, de modo que los ingredientes puedan ser mezclados antes de la administración.

En particular, la presente invención también proporciona que se empaquen uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la presente invención en un contenedor sellado herméticamente tal como una ampolleta o sobre que indica la cantidad del agente. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la presente invención se suministran en la forma de un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrador libre de agua, en un contenedor herméticamente sellado y se pueden reconstituir (por ejemplo, con agua o solución salina) para la concentración adecuada para administración a un sujeto. Particularmente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la presente invención, se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un contenedor sellado herméticamente en una dosificación unitaria de al menos 5 mg, más particularmente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o composiciones farmacéuticas de la presente invención deben almacenarse a una temperatura entre 2°C y 8°C, en su contenedor original y los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la presente invención deben administrarse a la semana particularmente a los 5 días, a las 72 horas, a las 78 horas, a las 24 horas, a las 12 horas, a las 6 horas, a las 5 horas, a las 3 horas o a la hora después de haber sido reconstituidos. En una modalidad alternativa, se suministra uno o más agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la presente invención en forma líquida en un contenedor herméticamente sellado que indica la cantidad y concentración del agente. Particularmente, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un contenedor herméticamente sellado al menos 0.25 mg/ml, más particularmente al menos 0.5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2.5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. Las formas líquidas deben almacenarse a una temperatura entre 2°C y 8°C en su contenedor original.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral.

Particularmente, el anticuerpo o partes de anticuerpo se prepararán como una solución inyectable que contiene de 0.1 a 250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta ya sea de un líquido o una forma de dosificación liofilizada en un frasco ámbar o flint, ampolleta o jeringa llena previamente. El amortiguador puede ser L-histidina (1 a 50 mM), opcionalmente 5 a 10 mM, en un pH de 5.0 a 7.0 (opcionalmente pH 6.0). Otros amortiguadores adecuados incluyen pero no se limitan a, succcinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución en una concentración de 0 a 300 mM (opcionalmente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0 a 10% de sacarosa (óptimamente 0.5 a 1.0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes de generación de volumen para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1 a 10% de manitol (óptimamente 2 a 4%). Se pueden utilizar estabilizadores en formas de dosificación tanto líquida como liofilizadas, principalmente 1 a 50 ml_ de L-Metionina (ópticamente 5 a 10 mM). Otros agentes de generación de volumen adecuados incluyen glicina, arginina, se pueden incluir en la forma de 0 a 0.05% de polisorbato-80 (óptimamente 0.005 a 0.01%). Los tensoactivos adicionales incluyen pero no se limitan a tensoactivos polisorbato 20 y BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención preparados como una solución inyectable para administración parenteral, pueden comprender además un agente útil como un adyuvante tal como los utilizados para incrementar la absorción o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo). Un adyuvante particularmente útil es hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana después de la administración parenteral, particularmente administración subcutánea. Esto también permite mayores volúmenes en el sitio de inyección (por ejemplo mayor a 1 mi) con menos dolor e incomodidad, y mínima incidencia de reacciones en el sitio de inyección (ver las Publicaciones de Patente WO2004078140, US2006104968 incorporadas a la presente invención como referencia.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquida o semisólida y sólida, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables o infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma particular depende del modo de administración proyectado y la aplicación terapéutica. Las composiciones particulares típicas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tal como composiciones similares a las utilizadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. Un modo de administración particular es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutáneo, intraperítoneal, intramuscular). En una modalidad particular, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad particular, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármacos. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, anticuerpo o parte de anticuerpo) en la cantidad sugerida en un solvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes descritos anteriormente, según se requiera seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los requeridos de los otros ingredientes de los descritos anteriormente. En el caso de polvos liofilizados, estériles para preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos particulares de preparación son secado al vacío y secado-rocío que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional procedente de una solución filtrada estéril previamente del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través de un mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede ser incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención se pueden administrar a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, una ruta/modo de administración particular es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Tal como lo apreciarán los expertos en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un transportador que protegerá el compuesto contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradables tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos de preparación de dichas formulaciones están patentados o son conocidos generalmente para los expertos en la técnica. Ver la publicación de Sistemas y Suministro de Fármaco de Liberación Sostenida y Controlada, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

En ciertas modalidades, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente invención puede administrarse en forma oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un transportador comestible asimilable El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se pueden guardar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en tabletas, o incorporadas directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la presente invención a través de otra ruta que no sea administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrarlo junto con el compuesto con un material para evitar su desactivación. También se pueden incorporar los compuestos activados suplementarios en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo o una parte de anticuerpo de la presente invención se formula junto con y/o se administra junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los cuales la actividad es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE o parte de anticuerpo de la presente invención se puede formular junto con y/o administrarse con uno o más anticuerpos adicionales que enlazan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que enlazan citocinas o que enlazan moléculas de superficie celular). Además, se pueden utilizar uno o más anticuerpos de la presente invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación pueden utilizar en forma conveniente dosis inferiores de los agentes terapéuticos administrados, para evitar de esta forma posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

En ciertas modalidades, un anticuerpo para RAGE o fragmento del mismo se enlaza a un vehículo de extensión de vida media conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan el dominio Fe, polietilenglicol, y dextrano. Dichos vehículos se describen por ejemplo en la Solicitud Norteamericana Serie No. 09/428,082 y en la Solicitud PCT Publicada No. WO 99/25044, las cuales están incorporadas para cualquier propósito a la presente invención.

En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la presente invención u otro agente profiláctico o terapéutico de la presente invención se administran para tratar, prevenir, manejar o disminuir un trastorno o uno o más síntomas de los mismos a manera de terapia genética. La terapia genética se refiere a terapia llevada a cabo mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que se puede expresar. En esta modalidad de la presente invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o agente profiláctico o terapéutico de la presente invención, el cual transmite un efecto profiláctico o terapéutico. Cualesquiera de los métodos para terapia genética disponibles en la técnica se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. Para revisiones generales de los métodos de terapia genética, ver las Publicaciones de Goldspiel y asociados, 1993, Farmacia Clínica 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Bioterapia 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Ciencia 260:926- 932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Mayo 1993, TIBTECH 11(5): 155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden utilizar, se describen en las Publicaciones de Ausubel y asociados, (eds.), Protocolos Actuales de Biología Molecular, John Wiley &Sons, NY (1993); y Kriegler, Transferencia de Expresión Genética, Manual de Laboratorio, Stockton Press, NY (1990). La descripción detallada de diversos métodos de terapia genética se describen en la Publicación de Patente US20050042664 A1, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

RAGE desempeña un papel importante en la patología asociada con una variedad de enfermedades tal como se definió anteriormente. La infusión de péptidos ?ß amiloides en animales conduce a respuestas tipo respuestas inflamatorias en arteriolosa, disminución en flujo sanguíneo cerebral. Estos efectos pueden evitarse mediante anticuerpos contra RAGE (Rhodin, J. y asociados. Congreso Mundial de Microcirculación, Documentos presentados, 7o, Sydney, Australia, Agosto 19-22, 2001, 543-547; Deane y asociados. Nature med. 2003). RAGE se activa en la microvasculatura de pacientes AD y en ratones transgénicos en donde el gen APP humano ha sido sobre-expresado (Deane y asociados. Nature med. 2003). Utilizando ratones transgénicos dobles, cuando el gen APP humano se expresa y se sobre-expresa RAGE, se demostró que la sobre-expresión del gen RAGE normal conduce a daño en aprendizaje, incremento en placas, en tanto que la sobre-expresión de una variante RAGE con defecto de señalización negativo-dominante conduce a la mejoría en el aprendizaje y menores niveles de placa (Arancio y asociados. 2004 EMBO J. 2004). La experimentación en modelos animales de diabetes tanto tipo 1 como 2, revela que el antagonismo del eje de ligando-RAGE suprime el desarrollo y progreso de la perturbación vascular y de célula inflamatoria en el medio diabético, por ejemplo, ratones de eliminación RAGE y anticuerpos Anti-RAGE se han utilizado para mostrar una mejoría en modelos animales por ejemplo para nefropatía diabética (Ravichandran R. y asociados, REVISTA CANADIENSE DE DIABETES, 2006;30(4):422, Myint Khin y asociados. Diabetes (2006), 55(9), 2510; De-Vriese y asociados. Revista de la Sociedad Americana de Nefrología 2003, 14/8, 2109, Jensen y asociados. Efectos renales del anticuerpo RAGE de neutralización en ratones diabéticos con estreptozotocina a largo plazo. Revista de endocronología , 2006, 188¡ 493). Los efectos renales a largo plazo positivos de un anticuerpo RAGE en ratones obesos diabéticos tipo 2, se muestran en la Publicación de FIyvbjerg y asociados (Diabetes, 2004, 53, 1, p. 166-72). Los ratones de eliminación RAGE se utilizaron para mostrar una implicación de RAGE en sepsis (Birgit Liliensiek y asociados. J Clin Invest. Junio 1, 2004; 113(11): 1641-1650; Receptor para productos finales de glucasión avanzada (RAGE) regula la sepsis pero no la respuesta inmune de adaptación). Los fragmentos de bloqueo F(ab)2 derivados de IgG anti-RAGE reducen la respuesta inflamatoria en EAE inducida por MOG o MBP (Yan, S. S., y asociados. 2003. Nat. Med. 9:287-293). Se demostró la implicación de RAGE en Cáncer (Abe-R y asociados. Revista de Dermatología de investigación, 2004, 122/2 (461-467). En ratones que contienen tumores, se prolongaron los rangos de supervivencia y se inhibieron las metástasis pulmonares espontáneas mediante tratamiento utilizando anticuerpos de neutralización anti-RAGE.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención se pueden utilizar para tratar a humanos que padecen de dichas enfermedades.

Deberá quedar entendido que los anticuerpos de la presente invención o parte de enlace de antígenos de los mismos, se pueden utilizar solos o en combinación con un agente adicional. Por ejemplo un agente terapéutico, siendo seleccionado el agente adicional por los expertos en la técnica para su propósito proyectado. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que esté siendo tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo un agente el cual afecte la viscosidad de la composición.

Deberá quedar entendido en forma adicional que las combinaciones que estarán incluidas dentro de la presente invención son las combinaciones útiles para su propósito proyectado. Los agentes establecidos más adelante son con propósitos ilustrativos y no pretenden ser limitados. Las combinaciones, que son parte de la presente invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y al menos un agente adicional seleccionado de las listas que se encuentran más adelante. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales, si la combinación es tal que la composición formada pueda llevar a cabo su función proyectada. Los ejemplos sin limitación de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con el cual se puede combinar un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente invención, incluyen los siguientes: corticoesteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; \ interferón-ß? a (AVONEX; Biogen); interferón-ß? b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferón a-n3) (Interferón Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß ?-IF (Serono/I nhale Therapeutics), Peginterferón a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la presente invención, o partes de enlace de antígenos de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos.

Los anticuerpos de la presente invención, o partes de enlace de antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa , agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citocinas pro-inflamatorias tales como TNFalfa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o AP), inhibidores de enzima de conversión IL-1B, inhibidores TACE, inhibidores de señalización de célula T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina soluble y derivado de los mismos (por ejemplo, receptores TNF p55 o p75, sIL-IRI, sIL-IRII, slL-6R) y citocipas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGFbeta). Los ejemplos particulares de agentes terapéuticos para esclerosis múltiples en los cuales se puede combinar un anticuerpo o parte de enlace de antígeno de los mismos, incluyen interferón-beta , por ejemplo, IFNpia y IFNplb; Copaxona, corticoesteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores IL-1, inhibidores TNF, y anticuerpos para ligando CD40 y CD80.

Particularmente las proteínas de enlace y anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para tratar una amiloidosis, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down. Deberá quedar entendido que las proteínas de enlace y anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar solos o en combinación con al menos un agente adicional adecuado para tratar una de las siguientes enfermedades. El al menos un agente adicional puede ser seleccionado por los expertos en la técnica para su propósito proyectado. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico tal como un inhibidor de colesterinasa (por ejemplo, tactrina, donepezil, rivastigmina o galantamina), un bloqueador de receptor NMDA parcial (por ejemplo, memantina), un mimético de glucosaminoglican (por ejemplo, Alzhemed), un inhibidor o modulador alostérico de secretasa gamma (por ejemplo, R-flurbiprofen), un agonista de hormona de liberación de gonadotropina de bloqueo de hormona luteinizante (por ejemplo, leuprorelin), un antagonista de receptor 5-HT1A de serotonina, un agente de quelatina, un bloqueador de canal tipo L-selectivo neuronal, un inmunomodulador, un inhibidor de fibrilogénesis amiloide o inhibidor de deposición de proteína amiloide (por ejemplo, M266), otro anticuerpo (por ejemplo, bapineuzumab), un antagonista de receptor 5-HT1a, un inhibidor PDE4, un agonista de histamina, una proteína receptora para productos finales de glucasión avanzada, un estimulador PARP, un antagonista de receptor de serotonina 6, un agonista de receptor 5-HT4, un esteroide humano, un estimulante de captación de glucosa el cual aumenta el metabolismo neuronal, un antagonista de CB1 selectivo, un agonista parcial en receptores de benzodiacepina, un antagonista o inhibidor de producción beta amiloide, un inhibidor de deposición beta amiloide, un antagonista parcial alfa-7 NNR, un PDE4 de dirección terapéutica, un inhibidor de traducción de ARN, un agonista muscarínico, un agonista de receptor de factor de crecimiento de nervios, un agonista de receptor NGF y un modulador de terapia genética (por ejemplo, los agentes reconocidos actualmente, o que serán reconocidos en el futuro, como útiles para tratar la enfermedad o condición que esté siendo tratada por el anticuerpo o proteína de enlace de la presente invención). El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo un agente que afecte la viscosidad de la composición.

Los anticuerpos de la presente invención, o partes de enlace de antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes tales como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, cloruro de xaliproden, fampridina, acetato deglatiramer, natalizumab, sinnabidol, a-inmunocina NNS03, ABR-215062, Anerg ¡X. M S , antagonistas de receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada por liposoma), THCCBD (agonista canabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor PDE4), MNA-715, anticuerpo de receptor anti-IL-6, neurovax, alotrap de pirfenidona 1258 (RDP- 258), sTNF-RI , talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas VL A-4 (por ejemplo, TR-14035, VL A4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferón gamma, agonistas IL-4.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o parte de la presente invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o parte de anticuerpo puede ser determinada por un experto en la técnica y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o parte del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, o parte del anticuerpo, es ponderado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, ya que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor a la cantidad terapéuticamente efectiva.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo simple, se puede administrar diversas dosis divididas con el tiempo o la dosis puede ser reducida proporcional mente o incrementada según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para la facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a unidades físicamente separadas adaptadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que serán tratados; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la presente invención son dictadas por, y directamente dependiente de (a) las características únicas del el compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que será logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la generación de compuestos, tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Un rango no limitante de ejemplo para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la presente invención, es de 0.1 a 20 mg/kg, más particularmente 1 a 10 mg/kg. Se deberá observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición que será aliviada. Quedará entendido además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de quien administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación aquí establecidos son de ejemplo únicamente y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.

Los expertos en la técnica podrán apreciar que son obvias otras modificaciones y adaptaciones de los métodos de la presente invención aquí descritos, y pueden realizarse utilizando equivalentes adecuadas sin apartarse del alcance de la presente invención o las modalidades aquí descritas. Habiendo descrito la presente invención con detalle, la misma será comprendida más claramente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales están incluidos únicamente con propósitos de ilustración, y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

PARTE EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Anticuerpos anti-huRAGE preferidos 1.1 Producción de híbridomas y anticuerpos.

Los ratones Balb/c y A/J, de 4 a 6 semanas de edad, fueron inmunizados y reforzados en forma subcutánea con RAGE humano. Los animales se inyectaron cada tres semanas comenzando con una inyección primaria de 30 pg en adyuvante completo de Freund y refuerzos de inyección de 30 pg de adyuvante incompleto de Freund. Los ratones seleccionados para fusión, fueron inyectados en forma intravenosa con 10 pg de hRAGE en solución salina, cuatro días antes de la fusión. Se eliminaron los bazos de los animales inmunizados y se prepararon suspensiones celulares simples. Se recolectaron células SP2/0 mieloma del cultivo y se lavaron. Se mezclaron células de bazo y células de tumor en una proporción de 5:1 y se fusionaron utilizando 50% de PEG 3000 utilizando técnicas estándar (Kohler y Milstein, 1975). Las células fusionadas se sembraron en placas de 96 depósitos en medio selectivo en una densidad de 2.5 x 105 de células de bazo por depósito. Las fusiones se incubaron a una temperatura de 37°C durante 7 a 10 días. Cuando se observaron colonias macroscópicas, los sobrenadantes fueron eliminados y probaron en el ELISA hRAGE.

Los híbridomas que produjeron mAbs con características deseadas, fueron subclonados mediante método de dilución limitante. Los subclones que contienen sobrenadantes fueron ensayados para enlace a hRAGE mediante ELISA. Las subclases de cadena pesada y ligera de los mAbs fueron determinadas utilizando el equipo de isotipificación Zymed EIA. 1.2. Determinación de secuencias de aminoácido de la región variable para cada mAb RAGE de múrido.

Para cada determinación de secuencia de aminoácido, se aislaron aproximadamente 10 x 106 de células de hibridoma mediante centrifugación y se procesaron para aislar ARN total con Trizol (Gibco BRL/I nvitrogen, CA.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total fue sometido a síntesis de ADN de primera hebra utilizando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra (Invitrogen, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se utilizó Oligo(dT) para imprimar la síntesis de primera hebra para seleccionar el ARN poli(A)+. El producto de cADN de primera hebra posteriormente fue amplificado mediante PCR con cebadores designados para amplificación de regiones variables de inmunoglobulina de múrido (Ig-Primer Sets, Novagen, Wl). Los productos PCR fueron resueltos en un gel de agarosa, cortados, purificados y posteriormente subclonados con el equipo de Clonación TOPO en vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, CA) y transformados en E. coli químicamente competente TOP10 (Invitrogen, CA). Se llevó a cabo PCR de colonias en los transformantes para identificar los clones que contienen el inserto. El ADN de plásmido fue aislado de los clones que contienen insertos utilizando un equipo QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Los insertos en los plásmidos fueron secuenciados en ambas hebras para determinar las secuencias de ADN de cadena ligera variable o pesada variable utilizando cebadores de avance 13 e inversos y M13 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). Las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable de los 3 anticuerpos monoclonales 7F9, 11E6 y 4E5 y sus tres CDRs de cadena pesada variables y las tres CDRs de cadena ligera variables se describen en la tabla 4 anterior. 1.3. Construcción y expresión de anticuerpos RAGE anti humano recombinantes.

El ADN que codifica a una región constante de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales RAGE anti-humano de múrido 7F9, 11 E6 y 4E5 se reemplazó mediante un fragmento de cADN que codifica la región constante I g G 1 humana mediante recombinación homologa en bacteria. La región constante de cadena ligera de cada uno de estos anticuerpos fue reemplazada por una región constante kappa humana (tabla 1, anterior). Los anticuerpos quiméricos de longitud total fueron expresados en forma temporal en células COS o células 293 mediante transfección conjunta de cADNs de cadena pesada y ligera quimérica ligadas en el plásmido de expresión pBOS o pTT3 (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pg 5322). Los sobrenadantes celulares que contienen anticuerpo quimérico recombinante fueron purificados mediante cromatografía de Sefarosa de Proteína A y se eluyó el anticuerpo enlazado mediante adición de amortiguador ácido. Los anticuerpos fueron neutralizados y dializados en PBS. 1.4. Enlace ELISA de mAbs RAGE anti-humano recombinante v de mAbs RAGE anti-humano derivado de hibridoma.

Los anticuerpos monoclonales RAGE anti-humanos quiméricos purificados fueron probados con respecto a su capacidad de enlazar a RAGE humano en un ELISA de competición. Los anticuerpos monoclonales RAGE anti-humano quiméricos recombinantes o anticuerpos monoclonales RAGE anti-humano derivados de hibridoma fueron diluidos en Superbloque PBST + 10% (Pierce Biotech, Rockford, IL) y se elaboraron como una reserva 2x en diversas concentraciones que fluctúan de 320 pg/mL a 0.0156 pg /mL (7F9 y 11E6) y de 160 pg /mL a 0.0078 pg /mL (4E5). Los anticuerpos monoclonales RAGE anti-humanos derivados de hibridoma biotinilado (7F9-biotin, 11 E6-biotin y 4E5-biotin) fueron preparados en 8 pg /mL en Superbloque PBST+10%. Se mezclaron volúmenes iguales (50 pL) de cada uno de los anticuerpos monoclonales RAGE anti-humanos quiméricos recombinantes o anticuerpos monoclonales RAGE anti-humanos derivados de hibridoma y cada mAbs anti-RAGE derivado de hibridoma biotinilado correspondiente. Posteriormente se agregaron 50 µ?_ de esta mezcla a las placas ELISA cubiertas previamente con RAGE humano recombinante en 2 g /mL e incubadas durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Los depósitos se lavaron tres veces con PBS+ 0.05% Tween-20. Se diluyó estreptavidina HRP (1 mg/mL) 1: 16000 en Superbloque PBST + 10%; se agregaron 50 L/depósito y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS+ 0.05% Tween-20. Se agregaron 50 µ? de solución TMB (Sigma, St Louis, MO) a cada depósito y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 1N. Las placas se leyeron en forma espectrof otométrica en una longitud de onda de 450 nm. Los resultados se muestran en las figuras 1 A, 1 B, y 1 C.

Ejemplo 2: Generación de sRAGE humano recombinante (husRAGEl La proteína husRAGE recombinante 293/6.1 sRAGE His 6 se expresó y purificó en células HEK293 (ATCC CRL-1573). El vector de expresión utilizado para la generación de la expresión estable fue "pcADN3 (-) 6.1 C HIS A".

Se utilizaron técnicas estándar de biología molecular de acuerdo con la Publicación de Sambrook y Russel (Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, 3o edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001). El ARN total de linfocitos humanos (PBL) fue transcrito en forma inversa en cADN utilizando el sistema Superscript RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad E.U.A.). Utilizando los cebadores de oligonucleótido RAGE-SE: CCG AAT TCC GGA AGC AGG ATG GCA GCC G (SEQ ID NO: 81) y RAGE-AS: CCC TCG AGC CCC TCA AGG CCC TCA GTA CTA CT (SEQ ID NO: 82), el cADN RAGE fue amplificado del cADN (obtenido anteriormente) produciendo el cADN RAGE tal como se describe en la secuencia de referencia NM-001136. El fragmento PCR corrió en gel de agarosa, se purificó y extractó con el Equipo QIAquick Gelextraction (Qiagen GmbH, Alemania). Posteriormente el cADN se cortó con endonucleasas de restricción EcoRI y Xhol. El fragmento resultante se purificó con gel y se ligó en el vector pcADN 3 (Invitrogen, E.U.A.) el cual se había cortado previamente con Xhol/EcoR1. Después de la transformación en E. coli en células azules XL-1 (Invitrogen, E.U.A.), se identificó un clon recombinante. La secuencia de este clon se verificó y el ADN de plásmido 2.6 se aisló utilizando el miniequipo de plásmido pcADN3/RAGE (Qiagen, Alemania). La región de codificación de la parte extracelular de RAGE, husRAGE, fue amplificada a partir de pcADN3/RAGE 2.6 utilizando PCR y los cebadores N-SE A: AGT AAC GGC CGC CAG TGT GCT GGA ATT CGG A (SEQ ID NO: 83) y C-SE B: CCG GTA CCA CCT GCA GTT GGC CCC TCC TCG CC (SEQ ID NO: 84). El producto PCR resultante se cortó con endonucleasas de restricción EcoRI y Kpn1, se purificó con gel como se describió anteriormente y se ligó en "pcADN3.1(-) Myc HIS" (Invitrogen, E.U.A.) que ha sido cortado previamente con EcoR1/Kpn1. El plásmido resultante "pcADN 3 (-) 6.1 C HIS A" se transfectó en células HEK293 utilizando Superfect (Qiagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La selección de células resistentes se realizó utilizando 800 pg/ml G418 en un medio MEM (# 4528, Sigma, Alemania) + 10% FCS, 2 mM L-Glutamina, 100 U/ml Penicilina/Estreptavidina (Invitrogen, E.U.A.). La clonación de las células simples a través de diluciones en serie de las suspensiones celulares conducen a la identificación de un clon "293/6.1 sRAGE His 6" que secretó husRAGE en el medio de cultivo celular tal como se confirma mediante Manchado Western utilizando un anticuerpo específico RAGE (Santa Cruz; # sc5563). Para expresión y purificación de cantidades suficientes de proteína husRAGE, este clon se creció en suero que contiene medio de cultivo celular (ver anteriormente) en factorías celulares (Nunc, Alemania). Posteriormente las células se cambiaron a un medio libre de suero Pro293a-CDM (#12-764Q, BioWhittaker, Bélgica) y se incubaron durante 3 días a una temperatura de 37°C. Se recolectaron 80 litros del medio libre de células y se concentraron utilizando columnas Hemoflow F-Series High-Flux (Fresenisus Medical Care AG, Alemania) hasta un volumen de 1400 mi.

Se realizó la purificación de proteína utilizando cromatografía de afinidad de ión de metal inmovilizado (IMAC) mediante Diarect AG (Freiburg, Alemania) y sefarosa FF para quelación (Amersham-Bioscience, Suecia). El equilibrio de la columna y el enlace de la proteína que contiene hexa-His a partir desde los sobrenadantes celulares hasta la matriz, se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La elución de la proteína se realizó utilizando gradientes de paso con concentraciones en incremento de imidazol. Las fracciones eluidas se analizaron para proteína que contiene hexa-His utilizando Manchados Western y anticuerpos anti HIS. El husRAGE purificado se eluyó específicamente en 250-500 mM de imidazol. Se combinaron fracciones positivas, se concentraron y dializaron 3 veces contra PBS (2 x 4 horas, 1 x 16 horas).

Una versión acortada N-terminal de husRAGE (102-331-sRAGE-HIS) que le faltan los primeros 101 aminoácidos de RAGE humano, fue generada mediante técnicas estándar en biología molecular tal como se describe anteriormente para la proteína husRAGE. Esta proteína se generó a través del mismo procedimiento básico utilizado para husRAGE (1-331). Utilizando el plásmido descrito anteriormente (pcADN3/RAGE 2.6) y dos cebadores (CGA AGC TTG ATG AAC AGG AAT GGA AAG GAG ACC AAG (SEQ ID NO: 85) y TCC TCG AGC ACC TGC AGT TGG CCC CTC CTC GCC T (SEQ ID NO: 86)), la versión acortada del ADN para husRAGE fue amplificada mediante PCR. Después del gel de agarosa y la elución del fragmento, el fragmento puro resultante fue disociado por endonucleasas de restricción Hindlll y Xhol y purificado nuevamente utilizando gel de agarosa y elución. El fragmento se ligó en psecTAG 2A (Invitrogen, E.U.A.) que fue cortado previamente con endonucleasas de restricción Hindlll y Xhol. Después de la transformación en células E.coli "TOP10 One Shot" (Invitrogen, E.U.A.) se recolectó un clon positivo y el ADN de plásmido fue aislado. El ADN en el vector de expresión fue transfectado en células HEK293 F utilizando el sistema de expresión Freestyle (Invitrogen, E.U.A.). Después de 96 horas de expresión, el sobrenadante libre de células fue utilizado para la purificación utilizando cuentas Ni-NTA Superflow (Quiagen, Alemania). El equilibrio y el enlace se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína enlazada se eluyó en amortiguador (PBS, 160 mM de NaCI, 150 m de Imidazol, pH 8.0). Las fracciones que contienen proteínas se combinaron y dializaron durante la noche a una temperatura de 4°C contra TBS (solución salina amortiguada por Tris; pH 7,4). Se determinaron en forma espectrofotométrica las concentraciones husRAGE (102-331). Una versión acortada C-terminal de la proteína de fusión-husRAGE ( 1 - 130-sRAG E-Fc) a la que le faltan los aminoácidos después del aminoácido 130 del RAGE humano, se generó mediante técnicas estándar en biología molecular tal como se describió anteriormente para la proteína husRAGE. Utilizando el plásmido descrito anteriormente (pcADN3/RAGE 2.6) y dos cebadores (GC ACC ATGGC AGCCGGAAC AGC AGTTG (SEQ ID NO: 87) y G AGTCTCG AGGC AGAATCTACAATTTCTG (SEQ ID NO: 88)), la versión más corta del ADN para husRAGE fue amplificada mediante PCR. Después del gel de agarosa y la elución del fragmento, el fragmento puro resultante fue disociado con endonucleasas de restricción Ncol y Xhol y purificado nuevamente utilizando gel de agarosa y elución. El fragmento se ligó posteriormente y el plásmido pENTR4 que fue cortado previamente con endonucleasas de restricción Ncol y Xhol. Se transformaron las mezclas de ligadura en células E.coli "TOP10 One Shot" (Invitrogen, E.U.A.) para generar pENTR4-RAGE 1-130. Se recolectó un clon positivo y se aisló el ADN de plásmido. Utilizando recombinación específica del sitio y el sistema de clonación de salida (Invitrogen, Carlsbad, E.U.A.; attL x attR) con ADN del clon pE NTR4 hRAGE 1 a 130 y ADN del vector pcADN3.1 ( + )Zeo hlgG lambda he 257-Stop, se construyó un plásmido (ver más adelante) el cual posteriormente se transformó en células "TOP10 One Shot" (Invitrogen, E.U.A.) y la purificación fue codificada para husRAGE-1 -130-Fc (plásmido denominado: pEXP hRAGE 1-130/hlgG lambda he 257-Stop). La expresión de este plásmido utilizado en sistema de expresión Freestyle y células 293F (Ejemplo 2.1) y la purificación de la proteína resultante del sobrenadante celular utilizando cuentas de Proteína G (Ejemplo 2.2) dio como resultado una proteína con una pureza del > 95 %.

Ejemplo 3: Construcción de pcADN3.1 ( + )Zeo hlqG lambda hc 257-Stop Se utilizaron dos cebadores de oligonucleótido (gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc (SEQ ID NO: 91); ctagtctagatcatttacccggagacagggag (SEQ ID NO: 92)) para amplificar la secuencia de ADN para la cadena pesada lambda hlgG de una biblioteca de cADN de placenta humana (Clontech # HL5014a) utilizando EasyA Polymerase en una PCR, reacción de cadena de polimerasa. El ADN resultante se purificó con gel (tal como se describe anteriormente) se clonó en pcADN3.1 V5-His TOPO Vektor (Equipo de Expresión pcADN3.1 /V5/His TOPO TA Invitrogen #K4800-01) utilizando las instrucciones del fabricante y se transformó en células E.coli TOP10 tal como se describió anteriormente. Se identificaron clones positivos y el ADN del plásmido resultante fue purificado (nombrado: pcADN3.1 (V5His) FC/hlgG lambda hc Nr.2/7) utilizando PCR y cebadores de oligonucleótido (gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc (SEQ ID NO: 93); ctagtctagatcatttacccggagacagggag (SEQ ID NO: 94)). La parte hlgG lambda del ADN fue amplificada, se cortó con EcoRV/Xbal, se ligó a ADN de vector pcADN3.1 ( + )Zeo de precorte EcoRV/Xbal y se transformó en células E.coli TOP10.

El plásmido resultante fue nombrado: pcADN3.1 ( + )Zeo hlgG lambda he 257-Stop y se utilizó para trabajo adicional para expresar proteínas fusionadas en forma N-terminal en estructura para una parte C-terminal de las cadenas pesadas IgG de inmunoglobulina. 3.1. Transfección v Expresión de proteínas en células HEK293F Las células HEK 293F que habían sido crecidas en cultivo durante 2 a 3 días en un Medio de Expresión Free Style 293 fueron centrifugadas en 400 g y el sobrenadante fue desechado. El pelet celular fue resuspendido en el medio y ajustado a células 3x107 en 28 mi de medio fresco, transferidas a un Erlenmeyer de 125 mi e incubadas en un incubador a una temperatura de 37°C, 8% C02 en un agitador orbital en 150 rpm hasta que se estableció la mezcla de transfección.

Las mezclas de transfección con complejo 293fectin-ADN fueron establecidas como se indica a continuación: (i) 30 pg de ADN fueron diluidas con Opti- EM I para un volumen total de 1000 µ? (control 1000 µ? Opti-MEM I) y se mezclaron. (ii) 35 µ? de 293fectin (Invitrogen #12347-019; 1 mi) fueron diluidas con Opti-MEM I a un volumen total de 1000 µ?, mezcladas e incubadas durante 5 minutos a temperatura ambiente.

La mezcla de ADN y la solución-239fectin de (i) y (ii) fueron transferidas a un tubo nuevo, mezcladas ligeramente y después de la incubación durante 25 minutos a temperatura ambiente se agregaron a las células en el frasco Erlenmeyer.

Las células fueron incubadas con esta mezcla de transfección durante el tiempo indicado en una incubadora a una temperatura de 37°C, 8% C02, en un agitador orbital en 150 rpm. Los sobrenadantes celulares fueron recolectados mediante centrifugación en 400 g durante 10 minutos. 3.2. Purificación de proteínas de fusión RAGE-Fc utilizando Sefarosa-Proteína G Para acoplar la proteína de los sobrenadantes celulares a las cuentas, las cuentas (flujo rápido de proteína G-sefarosa 4 Fast Flow (Amersham Bioscience) fueron lavadas 3 veces en PBS suspendiendo las cuentas en PBS y la centrifugación en 13,500 rpm, desechando el sobrenadante. Las cuentas fueron incubadas con los sobrenadantes celulares respectivos (300 mi sobrenadantes celulares por mi de cuentas) para ser acopladas durante 1 a 2 horas en un rotator a temperatura ambiente. Las cuentas fueron lavadas 3 veces con PBS e incubadas con los sobrenadantes celulares durante 12 horas o durante la noche a una temperatura de 4°C. Después de la incubación las cuentas fueron lavadas 3 veces con PBS tal como se describió anteriormente. Se eluyó la proteína enlazada agregando 200 µ? de 140 mM NaCI + 0.1M glicina al pelet de las cuentas e incubando durante 30 minutos en un rotator. Después de la centrifugación el sobrenadante fue neutralizado inmediatamente agregando 2 M Tris para ajustar el pH a 7.1 a pH 7.4. Se desecho el pelet de la cuenta. Se dializaron las sondas obtenidas contra PBS y se almacenaron congeladas en alícuotas a una temperatura de -20°C. La proteína de fusión RAGE-Fc que contiene electrodominio extracelular completo de RAGE fue obtenida a partir de sistemas R&D (no. 1145-RG; RAGE Humano Recombinante/Quimera Fe). 3.3. Enlace de manchado de punto de anticuerpos a péptidos o fragmentos de RAGE en una forma no desnaturalizada Se utilizaron manchados de punto para evaluar el enlace de anticuerpos a péptidos o fragmentos de RAGE en una forma no desnaturalizada. Las proteínas utilizadas fueron ya sea proteína sRAGE (1-331 sRAGE-HIS) o una versión acortada N-terminal (102-331 -sRAGE-HIS). Los péptidos fueron ordenados y sintetizados mediante Biotrend de acuerdo con métodos estándar (síntesis de péptidos de fase sólida en un sintetizador AMS 222 utilizando Fmoc/tBu-) que contiene el término carboxilo libre. Los péptidos fueron purificados con HPLC y el análisis de cada péptido para pureza fue realizado utilizando RP-HPLC. Todos los péptidos tuvieron una pureza del >80%. Las identidades de los péptidos fueron verificadas mediante espectrometría de masa.

Los péptidos utilizados fueron 30mers que abarcan la región extracelular de la proteína RAGE humano. La carga neta de los péptidos fue similar.

NtermR31: QNITARIGEPL VLKCKGAPKKPPQRLEWKLN Carga neta:: +7 (SEQ ID NO: 70) Péptido 1 : KLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPN Carga neta: +2 (SEQ ID NO: 71) Péptido 2: LPNGSLFLP AVGIQDEGIFRCQ AMNRNGKE Carga neta: 0 (SEQ ID NO: 72) Péptido 3: GKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVD SASELTA Carga neta: +1 (SEQ ID NO: 73) Péptido 4: LT AGVPNKVGTC VSEGS YP AGTLS WKLDGK Carga neta: +1(SEQ ID NO: 74) Péptido 5: DGKPL VPNEKGVS VKEQTRRHPETGLFTLQ Carga neta: +2 (SEQ ID NO: 75) Péptido 6: TLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPR Carga neta: +1 (SEQ ID NO: 76) Péptido 7: LPRHRALRT APIQPRV WEP VPLEEVQL WE Carga neta: +2 (SEQ ID NO: 77) Péptido 8: WEPEGGAVAPGGTVTLTCEVP AQPSPQIH Carga neta: -2 (SEQ ID NO: 78) Péptido 9: QIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQG » Carga neta: +0 (SEQ ID NO: 79) Péptido 10: DQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPG Carga neta: -1 (SEQ ID NO: 80) Los puntos que consisten en diferentes cantidades de proteína/péptido (30 ng, 10 ng, 3 ng, 1 ng, 0.3 ng, 0.1 ng, 0.03 ng, y 0.01 ng) en un volumen de 1 µ? en 1 x PBS fueron manchadas sobre una membrana de Nitrocelulosa Hybond-ECL (Amersham, RPN68D) por duplicado. Las membranas fueron secadas y se bloqueo el enlace no específico, agitando las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con reactivo de Bloqueo Western (Roche, no. 1921673). El reactivo de bloqueo fue desechable y las membranas y se incubaron con anticuerpos en una concentración de 7.14 nM (agitación de 1 hora a temperatura ambiente). Los anticuerpos monoclonales fueron ML37-7F9, ML37-11E6, ML37-4E5, anticuerpos comercialmente disponibles de sistemas R&D (por ejemplo, AF1145). Los manchados se lavaron 4 veces (cada vez 5 minutos de incubación con agitación a temperatura ambjente) con 1xPBS. Los manchados se incubaron posteriormente con anticuerpo secundario IgG AP anti-ratón de cabra (Sigma no. A-7434), diluidos 1:2000 en Reactivo de Bloqueo Western (Roche, no. 192173). La incubación durante 1 hora fue como se indicó anteriormente (agitación, temperatura ambiente). Los filtros se lavaron 4 veces (5 minutos cada uno) en 1X PBS. El desarrollo de las señales estuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la solución del substrato NBT/BClP (Roche, no. 1691 All). Se detuvo el desarrollo de color después de 10 minutos con agua bi-destilada. Ver figura 2.

Aunque se detectó husRAGE en manchados de punto a través de los tres anticuerpos monoclonales de la presente invención y el anticuerpo policlonal AF1145 (de una fuente comercial, R&D) ninguno de los péptidos fue detectado mediante los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Sin embargo, el anticuerpo policlonal detectó diversos péptidos. El péptido 9, el cual no incluyó la secuencia de aminoácido utilizada para generar anticuerpos policlonales tal como se describe en la Publicación de Ostendorp y asociados. (EMBOJ. 26,3875,2007), fue detectado claramente a través de anticuerpo policlonal comercialmente disponible. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales de la presente invención reconocen claramente un epítope diferente a los anticuerpos disponibles actualmente.

La caracterización adicional del enlace de realizó mediante análisis de mutantes RAGE de sRAGE humano expresado en E. coli. Los anticuerpos monoclonales 11E6 y 4E5 se enlazan a una región alrededor del dominio C2, ya que el enlace se pierde en mutantes de eliminación que carecen de los aminoácidos 235-336 y el enlace es aparente en la proteína RAGE mutante que consiste en los aminoácidos 235-336.

Ejemplo 4: Interacción entre qlobulómero AB1-42 y proteína derivada de husRAGE utilizando tecnología HTRF.

El ensayo estuvo basado en la tecnología HTRF (Fluorescencia resuelta por tiempo homogénea) disponible en CIS Bio International (Bagnols, Francia).

Los componentes Donantes y Aceptores HTRF, Anti-6HIS-Europiocriptato (CIS Bio catálogo no.: 61 HISKLA; 500 depósitos/13 pg) y Estreptavidina XL - 665 (CIS Bio catálogo no.: 611SAXLA, 500 depósitos/250 pg), cada uno fueron disueltos en 250 pl agua bi-destilada. Estas soluciones de reserva fueron diluidas 100 veces en PBS, 0.1 % BSA, pH 7.4 para obtener soluciones de trabajo con concentraciones finales de 3.7 nM Anti6His-Criptato y 60.6 nM de Estreptavidina XL- 665. Las soluciones de 10 µ?, 5 µ?, 2.5 µ?, 1.25 µ?, 0.625 µ?, 312.5 ??, 156.25 ? del globulómero-?ß biotinilado (1/5 de ?ß1-42 péptido utilizada para preparar los globulómeros-?ß fueron Proteína-P-Biotinilo-Amiloide (1-42) (Bachem no. H-5642) se prepararon de acuerdo con la Publicación de Barghorn y asociados (J. Neuro chemistry, vol. 95, no 3, pp. 834-847, 2005 y la Publicación Internacional WO/2007/062852; Solicitud Internacional No. PCT/EP2006/011530); se calculó la concentración de globulómero utilizada con base en la concentración de monómeros ?ß1-42, los cuales se utilizaron para la generación de los globulómeros. Las soluciones de 10 µ?, 5 µ?, 2.5 µ?, 1.25 µ?, 0.625 µ?, 0.312 µ?, 0.156 µ , del globulómero ?ß biotinilado se prepararon en el mismo amortiguador (PBS, 0.1% BSA, pH 7.4). Se mezclaron 4 µ? de estas soluciones o 4 µ? de amortiguador con 4 µ? de 1 µ de proteína husRAGE recombinante y la solución se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de la adición de 4 µ? de cada una de las soluciones (3.7 nM Anti6His-Criptato y 60.6 nM Estreptavidina XL-665).

El ensayo se incubo durante 2 horas a una temperatura de 4°C. Después de la adición de 4 µ? de una solución de reserva 2M KF, la señal HTRF fue medida en un modo HTRF en un instrumento de fluorescencia BMG Pherastar (BMG Labtech GmbH, Alemania). Se utilizaron curvas de señal máxima sin resultados de anticuerpo y antecedente utilizando únicamente solución Anti6HIS-Criptato - o Estreptavidina XL. Se calcularon los valores %DeltaF de acuerdo con instrucciones del fabricante CisBio utilizando GrafPad Prism 4 (GrafPad Software, San Diego, E.U.A.).

Ejemplo 5: Inhibición de enlace de globulómero-AB1 -42 a husRAGE mediante anticuerpos utilizando tecnología HTRF El protocolo básico tal como se describió anteriormente fue utilizado con algunas modificaciones. Se diluyeron componentes Donantes y Aceptores HTRF 40 veces a 10.25 nM para Anti-6HIS-Europiocriptato y 151.5 nM para Estreptavidina XL-665 en PBS, pH 7.4, 0.1% BSA.

Se utilizaron anticuerpos monoclonales purificados (MABs) contra husRAGE o inmunoglobulinas de control (lgG1 de ratón y lgG2a de ratón; no. M-5284 rsp. No. M-5409; Sigma, Alemania) como anticuerpos de control.

El ensayo se llevó a cabo en un volumen total de 20 µ? en 384 placas de depósito. Para cada punto de ensayo: se incubaron 4 µ? de 1 µ? de husRAGE con 4 µ? del anticuerpo de prueba o anticuerpos de control IgG en concentraciones de 2 µ?, 1 µ?, 0.5 µ?, 0.25 µ?, 0.125 µ?, 62.5 nM, 31.25 nM, 15.62 nM, 7.81 nM, 3.9 nM durante 1 hora a temperatura ambiente. El control para antecedentes se llevo a cabo sin husRAGE y sin anticuerpos. Se obtuvo la señal máxima sin anticuerpos. Posteriormente, se agregaron 4 µ? de globulómero-?ß biotinilado 800 nM, así como 2 µ? de 10.25 nM para Anti-6HIS- Europiocriptato y 151.5 nM para Estreptavidina XL-665. Se ajustaron las diferencias en volumen agregando amortiguador de enlace (1 x PBS pH 7.4; 0.1% BSA). El ensayo se incubó durante otra hora. Después de la adición de 4 µ? de una solución de reserva 2M KF, la señal HTRF fue medida en el modo HTRF en un instrumento de fluorescencia BMG Pherastar (BMG Labtech GmbH, Alemania). Se utilizaron las curvas de señal máxima sin resultados de anticuerpo y antecedente utilizando únicamente la solución Anti6HIS-Criptato - o Estreptavidina XL. Se calcularon valores %Delta F de acuerdo con las instrucciones del fabricante CisBio utilizando GrafPad Prism 4 (Software GrafPad, San Diego, E.U.A.). Los resultados se muestran en las figuras 3A, 3B, y 3C. Las concentraciones indicadas en las figuras son las concentraciones finales de las proteínas en un volumen de ensayo de 20 µ?.

Tal como se muestra en la figura 4, husRAGE que expresa los tres dominios de RAGE no enlazó los globulómeros-?ß de amiloide. Una proteína muíante RAGE que consiste en sRAGE humano que carece de la mayor parte del dominio-v (RAGE102-331), enlazó sin afinidad superior a globulómeros-?ß amiloides que indican que el dominio dentro de RAGE humano para el enlace a globulómeros ?ß está dentro del C-término.

Ejemplo 6: Enlace de globulómeros-?ß a proteína RAGEs utilizando la tecnología de ensayo de clasificación ALPHA Este ensayo se llevó a cabo en el amortiguador de ensayo (25 mM HEPES, 100 mM NaCI pH 7.4 y 0.1% BSA) en un volumen de 20 µ?. Las cuentas donadoras utilizadas fueron recubiertas con Estreptavidina (Perkin Elmer; 6760002S) y las cuentas aceptoras utilizadas fueron Proteína A ALPHALISA (Perkin Elmer; CUSM64133000EA), 4 µ? de cada una de las cuentas fue diluida previamente con 196 µ? de amortiguador de ensayo.

Utilizando una placa Proxi de 384 depósitos (Perkin Elmer, no. 6006280), las cuentas donadoras fueron cargadas con globulómeros-a -biotina (ver anteriormente) utilizando 4 µ? de las cuentas donadoras diluidas previamente y 6 µ I de una solución 200 nM de globulómeros-a biotinilados.

Las cuentas aceptoras fueron cargadas con diferentes cantidades de proteínas de fusión RAGE-Fc utilizando 4 µ? de las cuentas aceptoras diluidas previamente y 6 µ? de las diferentes diluciones de proteina de fusión RAGE-Fc (comenzando por ejemplo con 100 µ?/p??).

Se realizó la carga (enlace de las proteínas a las cuentas) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos.

El enlace de globulómeros-?ß a RAGE comenzó combinando las preparaciones de cuentas donadoras y aceptoras precargadas durante 180 minutos adicionales en la oscuridad. Las señales se midieron en un instrumento ALPHA-Quest (Perkin Elmer) con un retraso de tiempo de 1 segundo. Se realizaron análisis adicionales utilizando el software GrafPadPrism. En un experimento diferente, pero utilizando la misma tecnología, el enlace de los globulómeros-?ß a RAGE-Fc que consiste en los tres dominios, se comparó con el enlace de los globulómeros-?ß a la proteína mutante RAGE-Fc que consiste en el dominio-v únicamente (aminoácidos 1-130 de huRAGE). Tal como se muestra en la figura 5, el enlace de los globulómeros-?ß amiloides a los tres dominios de RAGE solubles fue fuerte y el enlace de los globulómeros-?ß amiloides al dominio-v de RAGE fue insignificante. Ya que el enlace de los globulómeros-?ß a RAGE tienen lugar en la región C-terminal, los anticuerpos que enlazan preferentemente a estos dominios, puede anticiparse que compiten con este enlace.

Ejemplo 7: Construcción, expresión y purificación de fragmentos RAGE E. coli 7.1. Preparación de construcciones Las construcciones RAGE E. coli descritas en la tabla 6 fueron generadas como se indica a continuación.

La construcción 1 se creó mediante amplificación PCR a partir del pcADN 3 de plásmido de plantilla (-) 6.1 C HIS A utilizando el cebador de avance (atgctacatatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctacc gtagcgcaggccgctcaaaacatcacagcc (SEQ ID NO: 89)) y cebador de retroceso (atgctactcgagtcagtggtggtgg tggtggtgagttcccagccctgatcctcccacagagcctgcagttggcccctcc (SEQ ID NO: 90)) el cual introdujo sitios de restricción Nde I y Xho I que fueron utilizados para subclonar en los sitios análogos de pET29. Las construcciones restantes (#2 - #7, tabla 6) fueron generadas utilizando la construcción 1 como una plantilla. Las secuencias que codifican los residuos de aminoácido RAGE 24 a 129, 24 a 234, 24 a 336, 130 a 234, 130 a 336, 235 a 336 fueron amplificadas PCR a partir de la Construcción 1. Los fragmentos de ADN resultantes se corrieron en un gel de agarosa al 1.0%, y el ADN se purificó utilizando el equipo de extracción de Gel QIAquick de Qiagen. Los fragmentos de ADN fueron digeridos con Ndel y Xhol, y ligados en pET28a digerido en forma similar. La mezcla de ligadura fue transformada en células competentes DH5a de Máxima Eficiencia y se plaquearon en placas de agar LB que contienen 50 mg/L canamicina. Después de incubación durante la noche a una temperatura de 37°C, se incubaron tres colonias de cada clon en 3 mi de caldo LB que contiene 50 mg/L canamicina y se agitaron durante la noche a una temperatura de 37°C. El ADN fue aislado utilizando el Equipo QIAprep Spin Miniprep de Qiagen, y el inserto fue secuenciado utilizando los cebadores específicos de promotor 11 y terminador T7. La secuencia de ADN de los plásmidos que codifican las construcciones #1 a #7 se describen en las SEQ ID Nos.: 27 a 33 y las regiones traducidas correspondientes se describen en las SEQ ID Nos 34 a 40.

Tabla 6: Construcciones RAGE Se transformó la cepa E. coli BL21(DE3) con el ADN del plásmido de la Construcción #1, revestidas en placas LB que contienen canamicina (50 mg/L), y se incuban a una temperatura de 37°C durante la noche. Al siguiente día, se inocularon 14 frascos fernbach, que contienen cada uno 1L de Caldo Terrific con canamicina (50 mg/L), con un CFU y se colocaron con agitación (180 rpm) en una incubador a una temperatura de 37°C. Cuando los cultivos alcanzaron un OD60onm de 0.47, los frascos se transfirieron a un incubador 30°C (agitando aún en 180 rpm) y la expresión se indujo mediante la adición de 0.4 mM IPTG. Las células se recolectaron 4 horas después de la inducción mediante centrifugación (15,900 g, 8 minutos, 4°C), y la pasta celular posteriormente se congeló a una temperatura de -80°C hasta la purificación. La purificación de la Construcción 1 de RAGE procedió descongelando primero y resuspendiendo un pelet celular de -20 g en 180 mi de amortiguador de lisis [50 mM Tris pH 7.6, 300 mM NaCI, 10% glicerol, 0.1% tritón X-100, 0.5 mM de MgCb. 20 mM de imidazol, inhibidores de proteasa libre-EDTA Roche IX, 20 U/ml DNase I]. Las células se Usaron pasando la suspensión tres veces consecutivas a través de un micro fluidizador Avestin Emulsiflex a una temperatura de 3°C. El lisado clarificado posteriormente se cargó en una columna HiTrap IMAC de 5 mi (GE Healtcare, 17-5255-01) en 2 ml/minutos. Posteriormente la columna se lavó con 10 CV de amortiguador de lavado [50 mM Tris pH 7.6, 300 mM de NaCI, 10% de glicerol, 20 mM de imidazol]. Después del paso de lavado, RAGE fue un gradiente eluido utilizando amortiguador de elución [50 mM Tris pH 7.6, 300 mM de NaCI, 10% de glicerol, 500 mM de imidazol]. Las fracciones que contienen RAGE se recolectaron y posteriormente se dializaron contra 50 mM Tris pH 7.6, 20 mM de NaCI, 10% de glicerol. Ta como se esperaba el análisis Mass-spec del material purificado confirmó que el líder-OmpA había sido procesado y que el material purificado comenzó con el residuo 23 de RAGE (es decir, la secuencia A-Q-N-...) .

Los plásmidos que codifican las Construcciones #2- #7 se transformaron por separado en una cepa E. coli BL21(DE3), revestidas en placas LB que contienen canamicina (50mg/L), y se incubaron a una temperatura de 37°C durante la noche. Al siguiente día se inoculó con una colonia 1L de un Medio TB Instantáneo Express Durante la Noche (Novagen) y se agitaron durante 19 horas a una temperatura de 30°C. Las células se peletizaron mediante centrifugación (15,900 xg, 10 minutos, 4°C) y posteriormente se congelaron a una temperatura de -80°C. Los pelets (5 a 6 gramos cada uno) se descongelaron y resuspendieron en 50 mi de amortiguador de lisis [50 mM Tris, pH 8, 300 mM de NaCI, 0.1% de Tritón X-100, 10% de glicerol, 0.2 mg/ml de lisozima, 1 mi del conjunto III de coctel inhibidor de proteasa (Calbiochem), 20U/ml benzonasa, 5 mM de B-mercaptoetanol]. Los Usados se sonicaron en un Sonicador Vibra Cell durante 2 minutos, seguido de centrifugación en 20K x g durante 30 minutos. Se llenaron 10 columnas Econo-Pac de Bio-Rad con 2 mi de volumen de cama de Resina ProBond Nickel y se equilibraron con amortiguador de lisis. Los lisados aclarados sé pasaron a través de las columnas 3 veces consecutivas, seguido de lavado con volúmenes de columna de 3 x 10 (60 mi total) de amortiguador de lavado [2X PBS, 20 mM de imidazol, 10% de glicerol, 5 mM de B-mercaptoetanol]. Las proteínas se eluyeron de las columnas con un volumen de columna de 5 x 1 (10 mi total) de amortiguador de elución [2X PBS, 500 mM de imidazol, 10% de glicerol, 5 mM de B-mercaptoetanol]. El material eluido se transfirió en PBS, 10% de glicerol, y 1 mM de DTT utilizando columnas Bio-Rad Econo-Pac 10DG. 7.2. Expresión de anticuerpos monoclonales anti-RAGE 11 E6. 4E5 v 7F9 El medio utilizado para expansión de célula de hibridoma consistió en un Medio de Rendimiento Quantum MAb de Célula BD (Becton Dickenson - catálogo # 220511) que contiene 10% de suero de bovino fetal IgG ultra bajo (Invitrogen - catálogo #16250-078). En síntesis, se expandieron múltiples cultivos de semilla de 300 mi de la línea de célula de hibridoma de múrido que expresa el anticuerpo monoclonal RAGE 11E6 en una botella de rodillo de 2 L agitando en un incubador (65 rpm, 8% C02, 37°C) hasta que alcanzó una densidad de 1.0 x 106 célula/ml. Posteriormente las células se sembraron en 20L en medio de una densidad de 0.06 x 106 células/mL en un Wave BioReactor de 25L con ajustes de operación de 14 movimientos/minuto, un ángulo de movimiento de 6o, una temperatura de 37°C, y un rango de rocío de 8% C02 de 0.15 Lpm. Después de dos días, el cultivo se expandió en forma adicional mediante la adición del medio a un volumen final de 24 L, que da como resultado una densidad de célula nueva de 0.43 x 106 células/mL. El cultivo fue recolectado 12 días después de ser expandido al volumen total. Las células se eliminaron mediante centrifugación continua (Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1.7 Lpm). Después de la adición de 5 nM NaN3 (de una reserva 1 M NaN3 - Hampton Research) al medio aclarado, el material se utilizó inmediatamente en el proceso de purificación.

El medio utilizado para expansión de célula de hibridoma consistió en un Medio de Rendimiento Quantum MAb de Célula BD (Becton Dickenson - catálogo # 220511) que contiene 10% de suero de bovino fetal IgG (Invitrogen - catálogo #16250-078). En síntesis, se expandieron múltiples cultivos de semilla de 300 mi de la línea de célula de hibridoma de múrido que expresa anticuerpo monoclonal RAGE 4E5 en una botella de rodillo de 2 L agitando en un incubador (65 rpm, 8% C02> 37°C) hasta que se alcanzó un densidad de 1.0 x 106 célula/ml. Las células posteriormente se sembraron en 5L de medio en una densidad de 0.12 x 106 células/mL en un Wave BioReactor de 25L con ajustes de operación de 12 movimientos/minuto, un ángulo de movimiento 6o, una temperatura de 37°C, y 8% C02 de rango-rocío de 0.15 Lpm. Después cuatro días, el cultivo se expandió en forma adicional mediante la adición del medio a un volumen final de 24 L, dando como resultado una nueva densidad celular de 0.24 x 106 células/mL. El rango-movimiento se incrementó a 14 movimientos/minuto. El cultivo se recolectó 12 días después de expandirse al volumen total. Las células se eliminaron mediante centrifugación continua (Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1.7 Lpm). Después de la adición de 5mM NaN3 (de una reserva de NaN3 1 M - Hampton Research) al medio aclarado, el material se utilizó inmediatamente en el proceso de purificación.

El medio utilizado para expansión de célula de hibridoma consistió en un medio de rendimiento de Quantum MAb de Célula BD (Becton Dickenson - catálogo # 220511) que contiene 10% de suero bovino fetal IgG ultrabajo (Invitrogen - catálogo #16250-078). En síntesis se expandieron múltiples cultivos de semilla de 300 mi de la línea de célula de hibridoma de múrido que expresa el anticuerpo monoclonal RAGE 7F9 en una botella de rodillo de 2 L agitando en un incubador (65 rpm, 8% C02, 37°C) hasta alcanzar una densidad de 1.0 x 106 célula/ml. Posteriormente las células se sembraron en 10L del medio en una densidad de 0.05 x 106 células/mL en unWave BioReactor 25L con ajustes de operación de 12 movimientos/minuto, un ángulo de movimiento de 6o, una temperatura de 37°C, y 8% C02 de rango-rocío de 0.15 Lpm. Después de cuatro días de cultivo de expande en forma adicional mediante la adición de medio a un volumen final de 25 L, dando como resultado una nueva densidad celular de 0.25 x 106 células/mL. El rango-movimiento se incrementó a 14 movimientos/minuto. El cultivo se recolectó 10 días después de haber sido expandido al volumen total. Las células se eliminaron mediante centrifugación continua (Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1.7 Lpm). Después de la adición de 5 mM NaN3 (de una reserva de 1 M NaN3 - Hampton Research) al medio aclarado, el material se utilizó inmediatamente en el proceso de purificación. 7.3. Purificación de anticuerpos monoclonales anti RAGE 11E6. 4E5. 7F9 Al medio de cultivo de hibridoma aclarado se le agregaron, glicina y NaCI en concentraciones finales de 3M y 1.5M, respectivamente. El pH se ajustó a 8.0 con NaOH. El material se filtró utilizando un filtro de membrana de Cápsula Pall #120 en 5 µp? y se cargaron en una columna BioSepra Protein A de 200 ml_. La solución de proteína se lavó con 11 CV de amortiguador de lavado (20 mM de fosfato de sodio pH 8.0, 1 mM de azida de sodio) y se eluyó utilizando un gradiente de grado de 50 mM de glicina (pH 3.0). las fracciones de 100 mL de tamaño, se recolectaron y se determinó la concentración de proteína midiendo A280 nm. Todos los pasos de procesamiento-columna se corrieron a una temperatura de 4°C. Se dializó el material recolectado contra 20 L de 10 mM Tris pH 8.0 durante la noche a una temperatura de 4°C. Se logró el pulido cromatográfico adicional utilizando un cartucho Singlesep Mini de intercambiador de anión básico fuerte SartoBind Q (Sartorius) en un flujo a través del modo en 10 mL/min. El anticuerpo no enlaza la columna y se recolecta como un grupo. Después de este paso, el material se concentró en 5 mg/ml utilizando la célula de presión agitada Amicon (5000 MWCO membrana, 75 psi, 4°C). Finalmente, el anticuerpo fue dializado dos veces contra 20L de amortiguador PBS (10 mM de fosfato, 0.138 M de NaCI, 0.0027 M de KCI, pH 7.4), cada ciclo durante 24 horas a una temperatura de 4°C. 7.4. Experimentos de Enlace ELISA: Se diluyeron antígenos (proteínas purificadas construcción #1 a 7) en Amortiguador de Recubrimiento [100 mM de NaHC03l pH 8.2] a 1 pg/ml, y 100 µ? de la solución resultante y posteriormente se alicuotaron en una placa Nunc Immuno Píate de 96 depósitos (Maxi-Sorb Surface, fondo plano, catálogo # 439454). La placa se selló con película de sellado y se incubó a una temperatura de 4°C durante la noche. Al siguiente día, los depósitos de la placa se lavaron cada uno tres veces con 150 ÍL de amortiguador PBST [Sigma PBS + 0.05% Tween 20]. Posteriormente se agregaron a cada depósito 300 ul de solución de bloqueo (3% NFDM en PBST). La placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y se agitó a una temperatura de 100 rpm. Después del paso de incubación, cada depósito se lavó nuevamente tree veces con 150 uL de PBST. Se agregaron 100 ul del anticuerpo correspondiente que será probado (por ejemplo, 7F9, 11E6, y 4E5) en diversas diluciones elaboradas en PBST/0.5% BSA. Posteriormente la placa se selló con película de sellado y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y se agitó a una temperatura de 100 rpm. Posteriormente la solución de anticuerpo se drenó de los depósitos, y posteriormente cada depósito se lavó tres veces con 200 ul PBST. A cada depósito se le agregó posteriormente 200 ul de una dilución 1:5000 (en PBST/1% NFDM) de anticuerpo secundario conjugado [conjugado HRPO anti-ratón de asno, Jackson Immuno Research, Catálogo #715-035-150]. La placa se cubrió y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente y se agitó en 100 rpm. Después de esta incubación, la solución se eliminó de los depósitos y cada depósito se lavó tres veces con 200 ul PBST. A cada depósito se le agregó 100 pL de una solución de substrato HRPO [Substrato Líquido de 3,3',5',5'-Tetrametilbencidina (TMB), Supersensible para ELISA, Sigma Catálogo #T4444] y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente se agregaron a cada depósito 50 pL de 2M H2S04 para detener la reacción y los A5 0 nm de cada depósito se midieron utilizando un lector de placa microtitulación.

Los resultados de estos experimentos de enlace se muestran en las figuras 6A, 6B y 6C, y las figuras 7A, 7B, y 1C. Las figuras 6A, 6B, y 6C muestran que los residuos RAGE 24 a 234 no estuvieron implicados en el enlace de anticuerpos monoclonales RAGE 11E6, 4E5, ó 7F9. Inversamente, tal como se muestra en las figuras 7A, 7B, y 7C, los residuos RAGE 235 a 336 fueron suficientes para el enlace de los anticuerpos monoclonales RAGE 11E6 y 4E5. El RAGE mAb 7F9 no mostró enlace alguno a cualquiera de estos (E. coli expresado) fragmentos RAGE.

Ejemplo 8: Mapeo de Epítope 8.1. Inmovilización de los Anticuerpos 11E6. 4E5 v 7F9 Se pesaron aproximadamente 20 mg de resina de flujo rápido de Sefarosa activada por CNBr, en tres columnas de reacción compacta ajustadas con sinterizadores de 35 µ?t?. Las resinas se dejaron expandir en 200 µ?_ de 1 mM HCI antes de lavar 3 veces con 200 pL de 1 mM HCI. Las resinas se enjuagaron en forma subsecuente 3 veces con 200 pL de 100 mM de amortiguador de bicarbonato de sodio (pH 8.3) que contienen cloruro de sodio 500 mM (amortiguador A). Una vez completadas, las soluciones se enjuagaron de las columnas de modo que únicamente permaneciera una capa delgada del amortiguador en la superficie de cada resina. Se inmovilizaron para las resinas aproximadamente 5.5 nmoles de los anticuerpos, lo cual requirió la adición de 235 pL de 7F9 (3.4 mg/mL), 500 pL de 11E6 (1.6 mg/mL), y 200 pL de 4E5 (3.75 mg/mL). Para las inmovilizaciones de anticuerpo 7F9 y 4E5, también se incluyeron 200 pL de amortiguador A. Se sellaron las columnas de reacción compacta y se dejaron mezclar a través de inversión a temperatura ambiente durante 4 horas. Una vez completadas, a las columnas de reacción compactas se les eliminó el sello y se enjuagaron con tres adiciones de 200 pL de amortiguador A para eliminar el anticuerpo no enlazado. Después del enjuague, se agregaron a cada columna 200 pL de un amortiguador que contiene 100 mM Tris-HCI (pH 8) y 500 mM de cloruro de sodio (amortiguador B). Las columna se volvieron a sellar y se dejaron mezclar a través de inversión a temperatura ambiente para bloquear los sitios no enlazados pero activos en las resinas. Después de 2 horas, a las columnas se les eliminó el sello y se enjuagaron primero con 200 µ?_ de 100 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH 4) que contiene 500 mM de cloruro de sodio (amortiguador C) seguido de 200 µ?_ de amortiguador B. Este proceso se repitió dos veces adicionales para asegurar la eliminación total del anticuerpo no enlazado y para bloquear completamente los sitios de restantes de adhesión sobre las resinas. Las resinas posteriormente se lavaron cuatro veces con 200 µ?_ de 100 mM de amortiguador de bicarbonato de sodio (pH 8.3) que contiene 100 mM de cloruro de sodio (amortiguador D) antes del acoplamiento del antígeno. 8.2. Excisión Proteolítica de E.coli y Antígenos sRAGE Expresados mediante BacMam A los antígenos sRAGE se les permitió enlazar a las columnas de anticuerpo agregando 75 ? del antígeno expresado mediante E. coli a las resinas 11 E6 y 4E5 y agregar 125 µ?_ de antígeno expresado mediante BacMac a las resinas 11E6, 4E5 y 7E9. Las columnas se sellaron y las muestras se dejaron mezclar mediante inversión a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de este tiempo a las columnas se les eliminó el selló y se enjuagaron con 4 adiciones de 200 µL· de amortiguador D. Después de enjuagar a través de los enjuagues, las resinas se resuspendieron en 200 µ? de amortiguador D así como con las proteasas, generadas como soluciones 0.1 mg/mL ya sea de Tripsina, endoproteinasa Glu-C o Quimiotripsina. Las cantidades de proteasas variaron entre los experimentos para atenuar las digestiones, pero fluctuaron de 200 a 400 veces en exceso del antígeno con respecto a la proteasa por peso. Se permitió que ocurriera la proteólisis a temperatura ambiente mezclando mediante inversión durante 12 horas. Después de este tiempo, a las columnas se les eliminó el sello y la solución proteolítica se enjuagó y se guardó para análisis adicional. Las muestras se sometieron a digestión dual, las resinas se resuspendieron en 200 pL de amortiguador D y una segunda proteasa antes de los siguientes pasos. Para las muestras no tratadas en una segunda proteasa, las columnas fueron sometidas a dos lavados de 200 pL individuales en amortiguador D seguido de un lavado de 200 pL en amortiguador A, posteriormente un lavado 200 pL final en amortiguador D. Cada lavó se retuvo por separado para análisis posterior. Los péptidos que contienen epítope, se eluyeron de la columna con tres lavados individuales de 200 pL en ácido fórmico al 2%. Cada muestra de elución se detuvo por separado para análisis posterior. 8.3. Análisis de Espectrometría de Masa de los Péptidos que Contienen Epítope Las muestras se analizaron utilizando tanto un espectrómetro de masa de Resonancia de Ciclotrón de Iones de Transformación-Fourier Bruker Apex QE 7T (FT-ICR), como un espectrómetro de masa Applied Biosystems Q-STAR Pulsar I. Para el análisis espectrométrico de masa FT-ICR, se inyectaron 8 pL de las muestras de excisión de epítope sobre una columna de fase invertida Júpiter C4 (0.5 x 150 mm, tamaño der partícula 5 µ, 300 A tamaño de poro) a través de una columna HPLC capilar serie 1100 Agilent. Las muestras se lavaron durante 5 minutos en 90% de agua con ácido fórmico al 0.1% (solvente A)/acetonitrilo al 10% con ácido fórmico al 0.1% (solvente B) en un rango de flujo de 5 pL/minutos para eliminar la sal. Los péptidos fueron eluidos en el espectrómetro de masa cambiando la composición de fase móvil a 5% de solvente A/95% de solvente B. Las muestras que requieren infusión directa para espectrometría de masa tándem se inyectaron sobre una icrotrap de proteína (Michrom) equilibrada en agua al 98%, acetonitrilo al 1% y ácido fórmico al 1%. Las muestras fueron lavadas con 1 mL del solvente de equilibrio siendo eluido en 300 pL de acetonitrilo al 60%, agua al 40% y ácido fórmico al 0.1%. El eluente se infusionó directamente en el espectrómetro de masa FT-ICR en 2 pL/minutos. Para el espectrómetro de masa Q-STAR Pulsar, se inyectaron entre 5 a 30 pL de la muestra en una Microtrap de proteína (Michrom) a través de una columna HPLC Serie 1100 Agilent. Las muestras se lavaron en 95% de solvente A/5% de solvente B durante 1 minuto antes de la elución de los péptidos enlazados en el espectrómetro de masa en 5% de solvente A/95% de solvente B.

La excisión proteolítica de sRAGE expresado mediante E.coli enlazado al anticuerpo 11E6 y la elución de los péptidos que contienen epítope revelaron la presencia de un péptido con una masa de 12,204.5 Da. La selección de masa y la disociación activada por colisión de un estado de carga 10 + , confirmó la identidad de este péptido, lo cual correspondió a los residuos Val229-His346 (este residuo His se debe a la adición de la etiqueta Hexa-His-tag a la proteína RAGE). Además el mapeo de epítope utilizando Tripsina seguido de proteólisis Quimiotripsina, reveló la disociación de la etiqueta de hexahistidina tag, refinando de esta forma el epítope para los residuos Val229-His341 (este residuo His se debe a la adición de la etiqueta Hexa-His-tag a la proteína RAGE). No se puede obtener un refinado adicional de este epítope utilizando proteólisis. La excisión proteolítica ejecutada en forma similar de sRAGE expresado mediante E.coli enlazado al anticuerpo 4E5, reveló el mismo péptido de 12,204.5 Da que se observó para el epítope de anticuerpo 11E6. En forma correspondiente, la excisión del sRAGE expresado mediante BacMam enlazado ya sea al anticuerpo 11E6 ó 4E5, reveló dos péptidos que contienen epítopes importantes con masas de 10,671.9 Da y 10,614.0 Da. Estos péptidos coindicen con la C-terminal de la construcción expresada mediante BacMam, abarcando los residuos Val229-Gly331 y Val229-Ala330, respectivamente.

La excisión proteolítica del sRAGE expresado mediante BacMam enlazado al anticuerpo 7F9 y la elución de los péptidos que contienen epítope, reveló múltiples especies que representan diversos péptidos de traslape. La desconvolución del espectro de masa reveló péptidos con masas de 12,079.6 Da, 12,372.9 Da, 13,477.3 Da y 24,132.3 Da. Estas masas coinciden con los residuos Asn105-Arg216, Asn105-Arg218, Asn105-Arg228 y Asn 05-Gly331 , respectivamente, sugiriendo un epítome mínimo que abarca los residuos Asn105- Arg216. Estos resultados indican que los anticuerpos 11E6 y 4E5 poseen epítopes en el término-C de sRAGE expresados tanto mediante E.coli como BacMam, y que el anticuerpo 7F9 reconoce un epítope en el dominio central de sRAGE expresado por BacMam.

Ejemplo 9: Medidas Biacore y de resonancia de plasmón de superficie La afinidad de los tres anticuerpos monoclonales de la presente invención, es decir 7F9, 11E6 y 4E5, se midió utilizando medidas de Biacore y de resonancia de plasmón de superficie. 9.1. Materiales v Métodos para determinaciones cinéticas de enlace antiRAGE: Se utilizó un instrumento Biacore 2000 para medir las cinéticas de enlace mAb anti-RAGE de ratón. El formato de ensayo para el análisis de afinidad mAb, fue una captura a base de Fe mediante anticuerpos anti-Fc inmovilizados. Se empleó un protocolo de acoplamiento de amina estándar, para inmovilizar IgG específico-Fc mediante aminas primarias a la superficie de dextrano carboxi-metilo (C ) de los chips de sensor CM5 (Biacore). Para el estudio de mAbs anti-RAGE de ratón, se utilizó Fe anti-ratón (Biacore, anti-ratón, BR-1005-14) como el reactivo de captura inmovilizado. Se utilizó un protocolo automático disponible en el Biacore 2000, para inmovilizar 8000-10000RU del reactivo de captura en las 4 células de flujo del chip de sensor. En síntesis, se activaron las superficies de CM-dextrano mediante 50 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS):200mM propil-N-etilcarbodiimida de 3-(N , N-dimetilamino) (EDC), 1:1 preparado recientemente. El reactivo de captura anti-Fc IgG (20 ug/ml en 10mM de acetato de sodio, pH 4.5) posteriormente se aplicó a la superficie seguido de desactivación de la superficie y bloqueo de los sitios reactivos residuales con 1 M de etanolamina (pH 8.5).

El amortiguador de corrida empleado fue HBS-EP+ [10mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCI, 3m M de EDTA, 0.05% de tensoactivo P20 (Biacore)] para los mAbs de ratón anti-RAGE. Cada ciclo experimental consistió en los siguientes pasos: 1) los mAbs anti-RAGE fueron capturados en células de flujo 2, 3 ó 4 a un nivel de 50-200RU (dependiendo del antígeno). Las medidas fueron referenciadas contra la célula de flujo 1, la cual no había capturado el mAb anti-RAGE. 2) El antígeno se inyectó a través de las 4 células de flujo, 180 ul en 60 ul/min. Después de la inyección de antígeno, se monitoreo la disociación durante 600 segundos en 60 ul/min. 3) La superficie de captura anti-Fc fue regenerada con glicina con pH bajo. Para determinaciones cinéticas, las inyecciones RAGE fueron una serie de dilución al 2 a partir de 20 nM a 0.31 nM y amortiguador únicamente en duplicados aleatorizados. 9.2. Evaluación v resultados Se procesaron datos utilizando el software de evaluación Biacore. En síntesis, los datos fueron referenciados por duplicado, sustrayendo primero la señal de la célula de referencia, y segundo, sustrayendo la señal de las inyecciones únicamente de amortiguador. Los datos referenciados dobles de las series de inyección RAGE, posteriormente se ajustaron globalmente a un modelo de enlace 1:1 (Langmuir), el cual incluyó un término de transferencia de masa para determinar las constantes de rango cinético de enlace ka y kd, y la afinidad, KD.

La tabla 7, muestra que 4E5 no enlaza a RAGE de ratón (Mu-RAGE). 11 E6 y 4E5 compitieron en forma cruzada entre sí para enlazar a RAGE. 7F9 no enlazó a RAGE producido en glucosilación que carece de E.coli.

La tabla 7 también muestra los epítopes específicos a los cuales los tres anticuerpos de la presente invención enlazan a RAGE humano, mediante mapeo de epítope utilizando protección de sRAGE humano de digestión proteolítica e identificación de péptidos protegidos con espectrometría de \ masa. MAb 7F9 enlazado a C1 (Asn105 - Pro215); mAb 4E5 enlazado a C2 (Val229 - Thr340 en RAGE E.coli; Val229 - Gly331 en husRAGE producido en células de mamífero), y 11 E6 enlazado a C2 (Val238 - Arg314 en RAGE E.coli; Val229 - Gly331 en husRAGE producido en células de mamífero).

Tabla 7: epítopes a los cuales se enlazan los anticuerpos Ejemplo 10: Estudios de volumen de sangre cerebral fCBV) in vivo en ratones hembra C57BL/6 10.1. Animales Se mantuvieron ratones hembra C57BL/6 (4 a 6 meses de edad; Taconic, Germantown, Nueva York, E.U.A.) con agua y alimento disponible ad libitum, en una cama de trozos de madera estéril estándar, dentro de una habitación tranquila bajo condiciones de 12 horas de luz encendida/12 horas de luz apagada (en 06:00). Se utilizaron un total de 33 ratones en los estudios fMRI-CBV. Todos los estudios fueron aprobados y monitoreados en forma cercana por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Abbott, apegándose a laos lineamientos del Instituto Nacional de Guía de Salud para el Cuidado y Uso de animales de Laboratorio en Instalaciones Acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio. 10.2. Preparación de péptido ?ß soluble \ Se sintetizó ?ß1-40 (>99% pureza) en Abbott Laboratories. En síntesis, se indujeron BL21E. coli. (DE3) con 1 mM IPTG y se expresaron durante 3 horas a una temperatura de 41°C durante 3 horas en una corrida de fermentador de 18L. Se recolectaron 185 gm de pasta celular. El péptido se expresó en cuerpos de infusión. Las células se lísaron en amortiguador tris 0.1M que contiene 0.1% de tritón X100. Posteriormente el pelet se lavó 3X con 50 mM de amortiguador tris y una vez con agua. Los lavados se desecharon y el pelet final de resuspendió en agua y se liofilizó. El pelet liofilizado se extractó en 500 mL de DMSO y se diluyó a 1L con 0.2% de amoniaco en agua. Esta muestra de 1L se dializó contra 19L de etanol al 10% que contiene amonia al 0.1%. Se continuó la diálisis solo con 0.1% de amoniaco en agua durante un tiempo total de 5 hora a temperatura ambiente. La muestra de 1.4L de diluyó con amoniaco al 0.1% a 2L y se aplicó a una columna HPLC PLRP-S 2.5 X 25 cm, (Polymer Labs, Amherst, MA), equilibrada con amoniaco al 0.1% en agua. La elución fue con acetonitrilo que contiene amoniaco al 0.1%. ?ß1-40 se eluyó durante un gradiente de 10 a 30%B durante 200 minutos. El material recolectafo fue liofilizado. Se utilizó análisis MALDI para confirmar la identidad y pureza del material. El material se purificó en la forma de ?ß?ß?-1-40, etiquetado N15. Una pequeña cantidad de sulfóxido de metionina estuvo presente en unidades de masa +16 en la muestra. Se purificaron 138 mg en esta corrida simple como la sal de amonio del péptido. La secuencia inversa, ?ß40-1 (>99% de pureza), se compró en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, E.U.A.). Los péptidos ?ß (0.01 ó 0.1 mg) de disolvieron por separado en solución salina amortiguada por fosfato fresca (0.1 mL; PBS) inmediatamente antes de cada experimento fMRI-CBV. Para estudios iniciales, los ratones se asignaron en forma aleatoria en cinco grupos de tratamiento: control PBS, ?ß1-40 (0.01 o 0.1 mg/ratón) o ?ß40-1 (0.01 o 0.1 mg/ratón), con cinco animales en cada grupo. 10.3. Preparación de anticuerpo Un anticuerpo de control IgG negativo y el anticuerpo anti-RAGE, 11E6 (ambos >99% de pureza), se sintetizó en Abbott Laboratories. 10.4. Medida CBV utilizando fMRI Todos los experimentos fMRI se llevaron a cabo en un magneto horizontal de 7.0 T/21 cm con un inserto de gradiente de campo magnético de 20 G/cm (Biospec Bruker, Billerica, MA). Los animales se anestesiaron primero con meditomidina (1 mg/kg, i.p.; Pfizer Animal Healt, Exton, Pennsilvania, E.U.A.) + cetamina (75 mg/kg, i.p.; Fort Dodge Animal Healt, lowa, E.U.A.) y posteriormente se colocaron en un contenedor para animal pequeño de bobina doble (Insight Neuroimaging Systems, LLC, Worcester, MA), que contiene una bobina de volumen para transmisión y una bobina de superficie para recepción. Los rangos de respiración y las formas de onda fueron monitoreados en forma continua mediante un transductor de fuerza. Se monitoreo la temperatura rectal y se mantuvo en 37 ± 1°C mediante una almohadilla de agua circulante, regulada con retroalimentación. Toda la generación de imagen se llevó a cabo durante la fase de luz. Se desacopló en forma activa la interacción electromagnética de bobina a bobina. Se adquirieron imágenes anatómicas utilizando la secuencia de pulsación aumentada (RARE) de relajación de adquisición rápida eco-giro rápido con TR = 3 s, TE efectivo = 100 ms, matriz = 256 x 256, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm, nueve rebanadas de 1.0-mm y cuatro promedios. Se utilizó generación de imagen eco-plana de disparo simple de eco de gradiente (EPI) para la adquisición de imagen fMRI-CBV con TR = 2 s, TE = 13 ms, matriz = 64 x 64, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm, y se proporciona resolución en plano = 400 µ?t? x 400 µ?t?. Se administraron 10 mg Fe/kg de agente de contraste de óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO) (SH U555C, Schering AG, Alemania) en forma intravenosa 2 minutos en una adquisición de imagen de 18 minutos. Se administraron ?ß y PBS solubles a través de la vena de la cola 6 minutos después del agente de contraste, utilizando una bomba de jeringa (0.1 mL/min durante 1 minuto) y posteriormente se detectaron cambios en CBV durante un período subsecuente de 10 minutos. Se administró ip anticuerpo I g G 1 de control o 11 E6 a ratones en sus jaulas domésticas, 3 horas antes del comienzo de los estudios de generación de imagen. 10.5. Análisis de datos fMRI Se llevó a cabo el análisis de datos utilizando el paquete de software de Análisis de Neuro Imágenes Funcionales (AFNI) (Cox R W, Comput Biomed Res 29:162-173, 1996). Para identificar el cambio CBV, relativa dependiente del tiempo, rCBV(t), se calculó a partir de los datos sin procesar del curso de tiempo con base en la relación (Mandeville y asociados, 1999), en donde s(t) es la intensidad de señal después de la infusión de ?ß o PBS, S0(t) es la señal de línea de base antes de la infusión ?ß o PBS, y Spre es la intensidad de señal promedio antes de la administración de agente de contraste. Se eliminó la tendencia de los cambios rCBV de curso de tiempo con una función lineal para tomar en cuenta la eliminación del agente de contraste de la sangre (Cox, 1996).

Subsecuentemente, la señal rCBV para cada voxel en cada ratón, se ajustó a un modelo exponencial diferencial no lineal (Eq.2) que refleja la cinética del fármaco (Luo y asociados, 2004) en donde t0 es el retraso en tiempo de respuesta, k es el coeficiennte de multiplicación, cti es el rango de eliminación y a2 es el rango de absorción. y(t) = k(e-aí°-'o) t=t0, Eq.2.

Las valores iniciales ajustados a los parámetros t0, k, a? y a2 fueron de 0 a 45 segundos, -500 a 500, 0 a 0.15, y 0.15 a 0.5, respectivamente, con base en cinéticas ?ß conocidas (Shiiki y asociados., J Neurosci 24:9632-9637, 2004). Los valores finales para, t0, k, af y a2 fueron determinados en forma automática utilizando AFNI con base en la significancia máxima del ajuste de modelo. Los voxeles rCBV activados posteriormente se determinaron en p < 0.05 después de la corrección de Bonferroni.

Los resultados mostrados en la figura 8 indican que ?ß -40 disminuyó CBV en una forma dependiente de la dosis y específica de la región (con 0.01 mg, figura 8a y con 0.1 mg figura 8b). El grado del CBV disminuido fue significativamente mayor cundo los ratones fueron tratados con altas dosis (figura 8b) en comparación con bajas dosis (figura 8a) de ?ß?.40, aunque se afectaron regiones similares del cerebro (por ejemplo, corteza frontal, caudato, tálamo, hipocampo). En contraste con los efectos dependientes de la dosis de ?ß-1.40, el péptido inverso, ?ß40-?, no afectó significativamente CBV cuando se probó en la misma dosis (con 0.01 mg de figura 8c y con 0.1 mg de figura 8d) y el grado de cualquier disminución en CBV observado no difiere significativamente del grupo de control tratado con PBS (PBS, figura 8e). Durante un curso de tiempo de 12 minutos, la amplitud de las disminuciones en CBV inducidas mediante ?ß?. ?, lo cual fluctuó de 10% a 20% para los voxeles afectados a través de diversas regiones del cerebro, alcanza en forma consistente un máximo en 5 minutos después de la administración, permaneció oprimido durante la duración del estudio (datos representativos mostrados para el hipocampo en la figura 8f) y fue similar en ambas dosis de ?ß?. 40- Estos datos son consistentes con un estudio adicional utilizando la técnica de flujometría Doppler láser invasiva (no mostrada).

Para probar los efectos de 11E6 en CBV utilizando fMRI, los efectos de la administración previa de un anticuerpo lgG1 de control se evaluó primero. Tal como se anticipó, la administración previa del anticuerpo lgG1 3 horas antes del comienzo de la generación de imagen, no bloqueo el efecto de un estímulo con ?ß?-4?, (con 0.01 mg de figura 9a). En contraste, 11E6 en una dosis de 0.1 mg/ratón administrado 3 horas antes del comienzo de la generación de imagen, bloqueo completamente la disminución en CBV provocada normalmente por el estímulo con ?ß?-4? (con 0.1 mg de figura 9b). En forma similar las disminuciones en amplitud CBV también fueron abolidas mediante tratamiento previo con el anticuerpo anti-RAGE, 11E6, pero no el anticuerpo de control (figura 9c). Estos datos demuestran la actividad funcional in vivo del anticuerpo, 11E6, en un modelo animal relevante para enfermedad de Alzheimer.

EJEMPLO 11: Construcción de anticuerpos injertados con CDR Al aplicar métodos estándar conocidos en la técnica, las secuencias CDR de las cadenas VH y VL de anticuerpo monoclonal 11E6 (ver tabla 4 anterior) se insertaron diferentes secuencias aceptoras de cadena pesada y ligera humanas. Con base en las alineaciones de secuencia VH y VL con las secuencias VH y VL del anticuerpo monoclonal 11E6 de la presente invención, se seleccionaron las siguientes secuencias humanas conocidas: a) VH7-4.1 y VH1-2 así como las secuencias de unión 11 E6 para construir secuencias aceptoras de cadena pesada (de acuerdo con la tabla 2 anterior); b) 1-12/L5 y 3-15/L2 así como hJK2 para construir secuencias aceptoras de cadena ligera (de acuerdo con la tabla 3 anterior).

Al injertar las CDRs VH y VL correspondientes de 11E6 en las secuencias aceptoras, se prepararon las siguientes secuencias VH y VL, humanizadas, injertadas con CDR (ver también tabla 5 anterior): VH 11E6.1-GL, VH 11E6.2-GL, VL11E6.1-GL y VL 11E6.2-GL.

EJEMPLO 12: Construcción de mutaciones de respaldo de estructura en anticuerpos injertados con CDR Para generar mutaciones de estructura de anticuerpo humanizada, se introdujeron las mutaciones en los anticuerpos injertados con CDR utilizando síntesis de novo de dominios variables y/o cebadores mutagénicos y PCR, utilizando métodos conocidos en la técnica. Se construyeron diferentes combinaciones de mutaciones de respaldo y otras mutaciones, para cada uno de los injertos CDR como se indica a continuación.

Para la cadena pesada VH 11E6.1-GL se mutaron con respaldo uno o más de los siguientes residuos de interfase Vernier y VH/VL como se indica a continuación: V2?l, y/o Y95?F.

Para la cadena pesada se VH 11E6.2-GL mutaron con respaldo uno o más de los siguientes residuos de interfase Vernier y VH/VL como se indica a continuación: V2?l, V68?F, M70?F, R72?L, Y95?F.

Para la cadena ligera VL 11E6.1-GL se mutaron con respaldo uno o más de los siguientes residuos de interfase Vernier y VH/VL como se indica a continuación: A43? S, Y49?F, Y87?F.

Para la cadena ligera VL 11E6.2-GL se mutaron con respaldo uno o más de los siguientes residuos de interfase Vernier y VH/VL como se indica a continuación: A43?S, Y49?F, I58?, Y87?F.

Las mutaciones adicionales incluyen las siguientes: para cadena pesada VH 11E6.1-GL, Q1?E, y para VH 11E6.2-GL, Q1?E, 176?T, R85?S, D89?E; para cadena ligera VL 11E6.1-GL, V11?L, y VL 11E6.2-GL, V13?L, E70?D.

EJEMPLO 13: Construcción y expresión de anticuerpos anti-RAGE humanizados recombinantes Los vectores de expresión pHybE que albergan cadenas pesadas y ligeras que contienen mutaciones de respaldo de estructura, se transfectaron en conjunto en células 293-6E para producir temporalmente anticuerpos humanizados de longitud total. Se introdujeron mutaciones en las secuencias de anticuerpo injertadas con CDR tal como se prepara de acuerdo con el Ejemplo 11, mediante síntesis de novo del dominio variable y/o utilizando cebadores mutagénicos y PCR, y métodos bien conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos humanizados se describen en la Tabla 8.

Tabla 8: Expresión de anticuerpos humanizados DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG VL hllE6.2 TAVAWYQQKPGKSPKLLI SASNRYTGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFG NWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.3 M SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSL AED TAVYYCARS MVTAYGMDYWGQGTTVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQ VG TAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYTGIPA VL hllE6.3 RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.4 SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAED TAVYYCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG TAVAWYQQKPGQSPRLLIFSASNRYTGVPA VL hllE6.4 RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.5 SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAED TAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPS VL hllE6.5 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.6 SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAED TAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TAVAWYQQKPGKSPKLLIFSASNRYTGVPS VL hllE6.6 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.7 SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAED TAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG VL hllE6.7 TAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYTGI PA RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.8 SEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAED TAV FCARSRMVTAYGMDYWGQGTTVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG TAVAWYQQKPGQSPRLLIFSASNRYTGVPA VL hllE6.8 RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6.9 SEEFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSED TAVY CARSRMVTAYGMDYWGQGTSV VSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPS VL hllE6. 9 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6. 10 SEEFKGRVTMTRDTSTSTAY ELSSLRSED TAVYYCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TAVAWYQQKPGKSPKLLIFSASNRYTGVPS VL hllE6. 10 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6. 11 SEEFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG TAVAWYQQKPGQAP LIYSASNRYTGI PA VL hllE6. 11 RL RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6. 12 SEEFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG TAVAWYQQKPGQSPRLLIFSASNRYTGVPA VL hllE6. 12 RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hllE6. 13 SEEFKGRFTFTLDTSTSTAYMELSSLRSED TAV FCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPS VL hllE6 13 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT hllE6 14 NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH SEEFKGRFTFTLDTSTSTAYMELSSLRSED TAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CKASQNVG TAVAWYQQKPGKSPKLLIFSASNRYTGVPS VL hllE6 14 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT E6 NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY VH hll .15 SEEFKGRFTFTLDTSTSTAYMELSSLRSED TAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG 6 .1 TAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYTGI PA VL hllE 5 RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 69 VH hllE6.16 NFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIY SEEFKGRFTFTLDTSTSTAY ELSSLRSED TAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSS EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVG TAVAWYQQ PGQSPRLLIFSASNRYTGVPA 66 VL hllE6.16 RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQ YSSYPLTFGQGTKLEIKR Específicamente para las cadenas pesadas: VH h11E6.1, VH h11E6.2, VH h11E6.3, y VH h11E6.4 contienen VH 11 E6.1-GL, con una mutación Q1?E.

VH h11E6.5, VH h11E6.6, VH h11E6.7 y VH h11E6.8 contienen VH 11E6.1-GL, con una mutación Q1?E y las siguientes mutaciones con respaldo de residuo de interfase Vernier y VH/VL: V2?M y Y95?F.

VH h11E6.9, VH h11E6.10, VH h 11 E6.11 , y VH h11E6.12 contienen VH 11E6.2-GL, con una mutación Q1?E, 176?T, R85?S, y D89?E.

VH h11E6.13, VH h11E6.14, VH h11E6.15, y VH h11E6.16 contienen VH 11E6.2-GL, con una mutación Q1?E, 176?T, R85?S, D89?E y las siguientes mutaciones con respaldo de residuo de interfase Vernier y VH/VL: V2?M, V68?F, M70?F, R72?L, y Y95?F.

Para las cadenas ligeras: VL h11E6.1, VL h11E6.5, VL h11E6.9, y VL h11E6.13 contienen VL 11E6.1-GL con una mutación V11?L.

VL h11E6.2, VL h11E6.6, VL h11E6.10, y VL h11E6.14 contienen VL 11E6.1-GL con una mutación V11?L y las siguientes mutaciones de respaldo del residuo de interfase Vernier y VH/VL: A?43S, Y49?F, y Y87?F.

VL h11E6.3, VL h11E6.7, VL h11E6.11, y VL h11E6.15 contienen VL 11E6.2-GL con mutaciones V13?L y E70?D.

VL h11E6.4, VL h11E6.8, VL h11E6.12, y VL h11E6.16 contienen VL 11E6.2-GL con mutaciones V13?L y E70?D y las siguientes mutaciones de respaldo del residuo de interfase Vernier y VH/VL: A43?S, Y49?F, 158?V, y V87?F.

Ejemplo 14: Caracterización de anticuerpo 11E6 humanizados utilizando ELISA de competición Se recubrieron placas ELISA (Costar 3369) durante la noche a una temperatura de 4°C con 50 µ?/depósito de 2 pg/ml hRAGE (1 a 331) en 0.2 M amortiguador de carbonato de sodio-bicarbonato, pH 9.4, se lavó con Amortiguador de Lavado (PBS que contiene 0.1% de Tween 20), y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con 200 µ?/depósito de leche en polvo sin grasa al 2% en PBS. Después de lavar con Amortiguador de Lavado, se agregó por duplicado una mezcla de un m11E6 biotinilado (0.3 µg/ml concentración final) y anticuerpo de prueba competidor no etiquetado comenzando en una concentración final de 81 µg ml y se diluyó en serie 3 veces) en 50 µ?/depósito de amortiguador ELISA. Después de incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente, y lavar con Amortiguador de Lavado, se detectaron anticuerpos de enlace utilizando 100 µ?/depósito de dilución 1:10,000 de estreptavidina conjugada-HRP (Fitzgerald) en amortiguador ELISA. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, y de lavar con Amortiguador de Lavado, se llevó a cabo el desarrollo de color agregando 100 µ?/depósito de Amortiguador TMB (Zymed). Después de incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se detuvo el desarrollo del color agregando 50 µ?/depósito de ácido hidroclórico 1N. Se leyó la absorbancia en 490 nm. La Tabla 9 muestra los valores IC50 de anticuerpos 11 E6 humanizados obtenidos utilizando el software de computadora GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Tabla 9: Valores IC50 de anticuerpos 11E6 humanizados en un ELISA competitivo Ejemplo 15: Determinación de constantes de enlace para interacción de m Ab antiRAGE con RAGE Se utilizaron instrumentos Biacore 2000 y Biacore T100 para medir las cinéticas de enlace mAb anti-RAGE. El formato de ensayo para análisis de afinidad mAb, fue una captura a base de Fe mediante anticuerpos anti-Fc inmovilizados. Se empleó un protocolo de acoplamiento de amina estándar para inmovilizar IgG específicas-Fc mediante aminas primarias para la superficie de dextrano carboxi-metilo (CM) de chips de sensor CM5 (Biacore). Para el estudio de mAbs anti-RAGE de ratón, se utilizó Fe anti-ratón (Biacore, anti-ratón, BR-1005-14) como el reactivo de captura inmovilizado y para el estudio de mAbs anti-RAGE humanizados, se utilizó Fe anti-humano (Pierce 31125) como el reactivo de captura inmovilizado. Se utilizó un protocolo automático, disponible en Biacore 2000 y Biacore T100, para inmovilizar 8000-10000 RU de reactivo de captura en las 4 células de flujo del chip de sensor. En síntesis, se activaron las superficies de CM-dextrano mediante 50 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS):200 mM de 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida (EDC) 1:1 preparado recientemente. Posteriormente se aplicó a la superficie el reactivo de captura IgG anti-Fc (20 ug/ml en 10 mM de acetato de sodio, pH 4.5) seguido de desactivación de la superficie y bloqueo de los sitios reactivos residuales con 1M de etanolamina (pH 8.5).

El amortiguador de corrida empleado fue PBS-P [1X PBS (Sigma P3813), pH 7.4, 0.005% de tensioactivo P20 (Biacore)] para los anticuerpos humanizados. Cada ciclo experimental consistió en los siguientes pasos: 1) mAbs anti-RAGE fueron capturados en células de flujo 2, 3 ó 4 a un nivel de 50-200 RU (dependiendo del antígeno). Todas las medidas fueron referenciadas contra célula de flujo 1 que no había capturado el mAb anti-RAGE. 2) El antígeno fue inyectado a través de las 4 células de flujo, 240 ul en 80 ul/minuto. Después de la inyección de antígeno, se monitoreó la disociación durante 600 segundos en 80 ul/minuto. 3) la superficie de captura anti-Fc fue regenerada con glicina de pH bajo. Para determinaciones cinéticas, las inyecciones de antígeno fueron una serie de dilución al triple ya sea de 30 nM - 0.12 nM (para sRAGE [RAGE (1-331)] y amortiguador únicamente en duplicados aleatorizados.

Los datos fueron procesados utilizando ya sea el software de evaluación Biacore o el software Scrubber 2.0 (BioLogic Software). En síntesis, los datos fueron referenciados por duplicado, substrayendo primero la señal de la célula de referencia y segundo, substrayendo la señal de las inyecciones únicamente de amortiguador. Los datos referenciados dobles para las series de inyección RAGE, posteriormente se ajustaron en forma global a un modelo de enlace 1:1 (Langmuir), el cual incluyó un término de transferencia de masa, para determinar las constantes de rango de cinética de enlace, ka y kd, y la afinidad, KD (ka = ken; kd = kfuera)- Tabla 10: Datos de Biacore Los valores KD, son pM de doble dígito para los tres mAbs y no parecen ser una distinción significativa entre las tres mAbs con respecto a sus cinéticas de enlace. En un experimento concurrente, el mAb 11E6 de ratón original fue evaluado con este antígeno (sRAGE 1-331 humano, V#400) y también fue un KD pM de doble dígito.

El mAb 11E6 de ratón original se reportó previamente para ser 290 pM. Sin embargo, los experimentos anteriores utilizaron un diferente sistema de amortiguador (amortiguador Biacore HBS-EP + : 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.05% P20). La elección de amortiguador, por supuesto, puede afectar las cinéticas.

Ejemplo 16: Estudios de volumen de sangre cerebrovascular (CBV) in vivo en ratones Tq2576 de edad avanzada 16.1. Animales El modelo de ratón Tg2576 de enfermedad de Alzheimer (Hsiao y asociados, 1996) expresa la mutación Sueca de APP (APPK670N,M671 L) en un alto nivel bajo el control del promotor de proteína de prión (PrP) de hámster. Esta bien establecido que esta mutación origina incrementos concomitantes en Ab42 y Ab40 secretados. Conforme los ratones Tg2576 envejecen, las placas parece que son similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer. Además, los ratones Tg2576 desarrollan déficit de comportamiento dependientes de la edad tal como se evalúa mediante el laberinto Y, el laberinto T, y prueba de laberinto de agua de Morris (Hsiao y asociados, (1996), déficits de memoria de correlación, elevación Ab, y placas amiloides en ratones transgénicos. Science 274: páginas 99 a 102.) 16.2 Preparación de anticuerpo Un anticuerpo de control IgG negativo y el anticuerpo anti- RAGE, 11 E6 (ambos >99% de pureza), se sintetizaron en Abbott Laboratories. 16.3. Medida CBV utilizando fMRI Se llevaron a cabo experimentos fMRI-CBV en un magneto horizontal de 7.0 T/21 cm con un inserto de gradiente de campo magnético 20 G/cm (Biospec Bruker, Billerica, MA). Se anestesiaron primero ratones Tg2576 de edad avanzada (19 a 20 meses de edad) con meditomidina (1 mg/kg, i.p.; Pfizer Animal Health, Exton, Pennsylvania, USA) + cetamina (75 mg/kg, i.p.; Fort Dodge Animal Health, lowa, USA), y posteriormente se colocaron en un contenedor de animal pequeño de bobina doble (Insight Neuroimaging Systems, LLC, Worcester, MA), el cual contiene una bobina de volumen para transmisión y una bobina de superficie para recepción. Los rangos de respiración y formas de onda se monitorearon en forma continua a través de un transductor de fuerza. Se monitoreó la temperatura rectal y se mantuvo a una temperatura de 37°C ± 1°C mediante una almohadilla de agua circulante, regulada con retroalimentación. Toda la generación de imagen se llevó a cabo durante la fase de luz. La interacción electromagnética de bobina a bobina se desacopló en forma activa. Se adquirieron imágenes anatómicas utilizando la secuencia de pulsación aumentada de relajación de adquisición rápida (RARE) de eco-giro rápido con TR = 3 s, efectivo TE = 100 ms, matriz = 256 x 256, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm, nueve rebanadas de 1.0 mm, y cuatro promedios. Se utilizó la generación de imagen eco-plana de un solo disparo de eco gradiente (EPI) para la adquisición de imagen fMRI-CBV con TR = 2 s, TE = 13 ms, matriz = 64 x 64, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm, y se proporcionó una resolución en plano = 400 µp? x 400 µ??. Se administraron 10 mg Fe/kg de agente de contraste de óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO) (SH U555C, Scherlng AG, Berlín, Alemania) en forma intravenosa 2 minutos en una adquisición de imagen de 18 minutos. Se administraron 11E6 de ratón no específico o I g G 1 (anticuerpo de control) a través de la vena de la cola 6 minutos después del agente de contraste utilizando una bomba de jeringa (0.1 mL/min durante 1 minuto) y posteriormente los cambios en CBV fueron detectados sobre un período subsecuente de 10 minutos. 16.4 Análisis de datos fMRI El análisis de datos se llevó a cabo utilizando el paquete de software de Análisis de Neuro-I mágenes Funcionales (AFNI) (Cox, 1996). Para identificar el cambio relativo dependiente del tiempo CBV, rCBV(t), se calculó a partir de los datos sin procesar del curso del tiempo con base en la relación (Mandeville y asociados, 1999), en donde s(t) es la intensidad de señal después de una infusión ?ß o PBS, S0(t) es la señal de línea de base antes de la infusión ?ß o PBS, y Spre es la intensidad de señal promedio antes de la administración del agente de contraste. Se eliminaron las tendencias de los cambios rCBV de curso-tiempo con una función lineal que toma en cuenta la eliminación del agente de contraste de la sangre (Cox, 1996).

En forma subsecuente, la señal rCBV de cada voxel en cada ratón fue ajustada a un modelo exponencial diferencial no lineal (Eq.2) que refleja las cinéticas del fármaco (Luo y asociados, 2004) en donde t0 es el retraso del tiempo de la respuesta, k es el coeficiente de multiplicación, ai es el rango de eliminación y a2 es el rango de absorción. y{t) = k(e-a1{l-t0) - e-a2(,-,0)) t= t0, Eq. 2.

Los valores finales para ío, k, a-\ y a2 fueron determinados en forma automática utilizando AFNI en base a la significancia máxima de la adaptación del modelo. Posteriormente se determinaron los voxeles rCBV activados en p < 0.05 después de la corrección de Bonferroni. Los voxeles activados por cerebro completo con incremento CBV fueron registrados. Ya que los datos no transformados no confirman las suposiciones ANOVA, se empleó la transformación Box-Cox para asegurar la normalidad y homogeneidad de varianza adecuada. El efecto 11E6 es estadísticamente significativo versus lgG1 (p<0.05) en ratones TG2576 de 19 meses de edad en el modelo fMRI-CBV.

Los resultados se muestran en la figura 10 adjunta. Nuestros datos extienden los resultados de Deane (Deane y asociados, 2003) que muestran que los anticuerpos anti-RAGE policlonales que se dirigen a una variedad de epítopes dentro de RAGE, pueden aumentar la perfusión de sangre cerebral en ratones transgénicos-APP. Nuestros datos muestran por primera vez, que un anticuerpo monoclonal 11E6 que dirige el dominio C2 dentro de RAGE, incrementa la perfusión de sangre cerebral en ratones transgénicos APP. Este efecto es transmitido probablemente compitiendo el enlace de alto nivel de ?ß a RAGE. El alto nivel de ?ß existe en el cerebro y plasma debido a la sobre-expresión de APP humana. El tratamiento de pacientes AD con 11E6 por lo tanto puede incrementar la perfusión cerebral en estos pacientes, conduciendo potencial mente a una mejoría de funciones neuronales. Al mismo tiempo el tratamiento de pacientes puede ser monitoreado potencialmente siguiendo el flujo sanguíneo cerebral durante el tratamiento.

Ejemplo 17: Protección de neuronas de hipocampo contra disociación de dinamina inducida por ?ß mediante 11E6 de anticuerpo 17.1. Cultivo de neuronas de hipocampo Se prepararon neuronas hipocampales de rata de acuerdo con la literatura (Goslin y Banker. (1991), Neuronas Hipocampales de Rara en Cultivo de Baja Densidad. En: Banker G y Goslin K (ed). Cultivo de Células Nerviosas , MIT Press, Cambridge) con una ligera modificación. En síntesis, se diseccionó el hipocampo de ratas embriónicas de 19 días de edad, y se liberaron de las meninges. Se obtuvieron las neuronas hipocampales mediante tripsinación de tejido (0,1% de tripsina/17 a 20 minutos/37°C) seguido de trituración con pipetas de Pasteur pulidas con fuego. Las neuronas hipocampales se plaquearon en una densidad de 0.2-1.0 x 105 células en placas de 6 depósitos o 24 depósitos recubiertas con poli-D-lisina (placa Biocoat™; BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) utilizando 0.5 a 3 mi de un medio de cultivo libre de suero (medio Neurobasal, suplemento B27, L-Glutamina 2 m ; Penicilina-Estreptomicina al 1%; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las células se cultivaron a una temperatura de 37°C, 5% C02 durante al menos 21 días y un tercio del medio fue intercambiado una vez a la semana. 17.2. Disociación de dinamina inducida por ?ß Se agregó ?ß de acuerdo con la literatura (Kelly, B. L., y Ferreira, A. (2006; J Biol Chem 281(38), páginas 28079 a 28089; Kelly, B. L. , Vassar, R. , y Ferreira, A. (2005) J Biol Chem 280(36), páginas 31746 a 31753) con una ligera modificación. En síntesis, se disolvió AB1-40 (American Peptide, Sunnyvale, Ca) en un medio de cultivo libre de suero en 0.1 mg/ml y se incubó durante 4 días a una temperatura de 37°C. El anticuerpo monoclonal anti-RAGE 11E6, un anticuerpo de control monoclonal de isotipo lgG1 dirigido contra KLH (Hemocianina de Penetración Magnética de Megathura crenulata, Abbott) o PBS se incubaron con el ?ß agregado durante 1 hora a una temperatura de 25°C bajo agitación constante a un volumen final de 225 µ?-1 mi. Las mezclas se agregaron al medio de cultivo dando como resultado una concentración final de 5 µ? de ?ß (calculado como monómero) y 2 µ? de anticuerpo, respectivamente. Cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado y los depósitos sin adición de ?ß o anticuerpos, se incluyeron como controles adicionales. Las células fueron cultivadas durante otras 24 horas y se inspeccionaron brevemente mediante microscopio de luz antes de ser procesadas para manchado Western. El tratamiento con ?ß no indujo la muerte neuronal palpable durante el período de incubación. 17.3. Manchado Western, cuantificación de disociación de dinamina. v análisis estadístico Se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron con PBS una vez. Las células fueron Usadas mediante la adición de amortiguador frío (50 mM Tris-HCI pH 7.5; 150 mM NaCI; 1% NP-40; 1% Tritón X-100; 2 m EDTA) que contiene cocktailes inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche, Mannheim, Alemania). Las células fueron raspadas y el homogenado fue centrifugado en 13000 g a una temperatura de 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se eliminó y se determinó la concentración de proteína total a través del método de Bradford utilizando un equipo comercial (Bio-Rad, München, Alemania). Se diluyó la proteína para 1 µ9/µ? en amortiguador de carga (Bio-Rad, München, Alemania) y se hirvió durante 5 minutos. Se corrieron 25 µg de cada muestra en un SDS-PAGE del 4% al 20% (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se transfirieron en membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema iBIot (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Como alternativa las células se Tizaron directamente en placas de 96 depósitos, diluidas con amortiguador de carga y se cargaron de 1/4 a 1/5 de la proteína en SDS-PAGE. Las membranas fueron bloqueadas a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas utilizando el Reactivo de Bloqueo 1x (Roche, Mannheim, Alemania) y posteriormente se incubaron con anticuerpo primario contra dinamina I (PA-1-660; dilución 1:1000; Affinity BioReagents, Golden, Co) a una temperatura de 4°C durante la noche. En forma subsecuente, se aplicó anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (IgG anti-conejo de cabra, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a los manchados a temperatura ambiente durante 1 hora y se detectó utilizando quimioluminiscencia aumentada (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate; Pierce, Rockford, II). Se visualizaron señales de inmunomanchado a través de un sistema VersaDoc (Bio-Rad, München, Alemania) y la señal de la dinamina I intacta (-100 kDa) fue cuantificada utilizando el software Quantity One (Bio-Rad, München, Alemania). Para normalización, los manchados fueron rayados (Restore Western Blot Stripping Buffer; Pierce, Rockford, II) durante 30 minutos a una temperatura de 37°C, lavados en PBS, y se volvieron a probar con un anticuerpo primario dirigido contra tubulina ß??? (TuJ-l, dilución 1:1000, Abeam, Cambridge, MA), y anticuerpo secundario (IgG antiratón de asno, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). El promedio de la expresión de dinamina I normalizada de las células no tratadas con ?ß, se ajustó al 100%. Los datos de porcentaje de los tres experimentos separados fueron analizados para significancia estadística a través de un One-Way ANOVA (prueba de Kruskal-Wallis) seguido de prueba de Dunn (GraphPad Prism™; GraphPad Software, San Diego, Ca). 17.4. El anticuerpo anti-RAGE 11E6 protege neuronas hipocampales contra disociación de dinamina inducida por ?ß El ?ß1-40 agregado ha mostrado recientemente inducir la disociación de la proteína marcadora sináptica, dinamina I, en neuronas hipocampales (Kelly y asociados, 2005; Kelly y Ferreira, 2006). De acuerdo totalmente con los resultados publicados, observamos una disminución marcada en la cantidad de dinamina I intacta (-100 kDa) después de incubación de neuronas hipocampales con ?ß agregado durante 24 horas y un incremento concomitante de un producto de disociación de -90 kDa (figura 11, pánel superior). La incubación previa del ?ß con el anticuerpo anti-RAGE 11E6, evitó la disociación de aproximadamente el 70%. En contraste, un anticuerpo de control de isotipo lgG1 de múrido no relacionado-RAGE, no proporcionó protección alguna (figura 11, pánel superior). La exploración densitométrica de las muestras por triplicado, normalización para la cantidad de proteína de control (tubulina ß???), y análisis de datos de tres experimentos independientes revelaron la significancia estadística del efecto protector observado (figura 11, pánel inferior; One-Way ANOVA; p<0,05).

Ejemplo 18: Efecto del anticuerpo 11E6 en supresión inducida por qlobulómero de transmisión sináptica 18.1. Prueba A Se prepararon cultivos de rebanada hipocampal organotípicos en un protocolo modificado de Stoppini y asociados (Revista de Métodos de Neurociencia, 37, Emisión 2, Abril 1991, páginas 173 a 182 "Un método simple para cultivos organotípicos de tejido nervioso" L. Stoppinia, P.-A. Buchsa y D. Muller) y cultivados en membranas millicell-CM (Mili i po re , Billerica, USA) en medio de potasio de alto nivel durante 3 días y posteriormente en un medio neurobasal A suplementado en la interfase de líquido/gas a una temperatura de 34°C/5%C02.

Se prepararon cultivos de rebanada hipocampal de rata a partir de ratas Wistar de 9 días de edad y se utilizaron en 15 a 16 días ¡n vitro. Se incubaron los cultivos de rebanadas durante la noche ya sea con - 1 µ? de globulómero 1-42, - 0.1 µ? de 11E6 (purificación de mAb ML 39-11E6 RAGE #4194, muestra #6116) + 1 µ? de globulómero 1-42 - control (ultrafiltrado de globulómero + SDS) En el grupo de incubación conjunta, el anticuerpo se aplicó para rebanada del medio de cultivo 2 horas antes del globulómero. Se llevaron a cabo registros en una interfase que registra la cámara bajo perfusión continua con fluido cerebroespinal artificial. Se registraron potenciales postsinápticos de excitación de campo de la región CA1 después de estimulación del Schaffer colateral con pulsaciones bifásicas de diferentes intensidades de voltaje. El Schaffer colateral se estimuló con pulsaciones bifásicas (0.1 ms/fase) utilizando un electrodo de Tungsteno bipolar 0.5 M (WPI; Saraosta USA), y se registraron las amplitudes fEPSP con electrodos de vidrio llenos con aCSF (0.7-1.1 Megaohm, GC150F-15, Harvard Apparatus, Hugstetten, Alemania). Se digitalizaron las señales utilizando un CED 1401 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK) y se analizaron utilizando Signal 2.14 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK).

Los resultados se muestran en la figura 12A. La aplicación de globulómero suprime fuertemente la transmisión sinóptica. La aplicación conjunta de 0.1 µ? de 11E6 invirtió completamente los déficits inducidos por globulómero. Por lo tanto, 11E6 puede invertir los déficits inducidos por globulómero en transmisión sináptica. 18.2. Prueba B Se prepararon cultivos de rebanada hipocampal de rata a partir de ratas Wistar de 9 días de edad y se utilizaron en 16 a 18 días ¡n vitro. Los cultivos de rebanada fueron incubados durante la noche ya sea con - 1 µ? de globulómero 1-42 - 0.1 µ? de mAb IgG 1 H35C206 (KLH) + 1 µ? de globulómero 1-42 - control (SDS) Se llevaron a cabo los registros (en fluido cerebroespinal artificial) de CA1 después de estimulación del Schaffer colateral en diferentes intensidades.

Los resultados se muestran en la figura 12B. La aplicación de globulómero suprimió fuertemente la transmisión sináptica. La aplicación conjunta de I g G 1 no invirtió los déficits inducidos por globulómero. Por lo tanto, el anticuerpo de control IgG no invierte los déficits inducidos por globulomero en transmisión sináptica en 0.1 µ?.

Ejemplo 19: Análisis in situ del efecto de anticuerpo 11E6 en placas amiloides en la corteza frontal de ratones Tq2576.

Para estos experimentos, se utilizaron ratones Tg2576 de 14.5 meses de edad (Hsiao y asociados, 1996, Science; 274(5284), páginas 99 a 102). Los ratones sobre-expresan APP humana con la mutación denominada Sueca (K670N/M67 L) y formaron depósitos amiloides ß en la paranquima cerebral en aproximadamente 11 meses de edad. Comenzando a los 12 meses de edad, los ratones fueron inyectados con 500 de 11 E6 (n=19) i.p. (intraperitoneal) o un anticuerpo de control lgG1 (n = 19) una vez a la semana durante 12 meses. Después de la última inyección, los animales se anestesiaron profundamente y se prefusionaron en forma transcardíaca con solución salina amortiguada por fosfato 0.1 M (PBS) para enjuagar la sangre. Posteriormente el cerebro se eliminó del cráneo y se dividió en forma longitudinal. Un hemisferio del cerebro se congeló-impacto, el otro se fijó mediante inmersión en paraformaldehído al 4%. El hemisferio fijado por inmersión se crioprotegió enjuagando en 30% de sacarosa en PBS y se montó en un microtomo de congelación. Todo el cerebro frontal se cortó en una sección de 40 µp?, la cual se recolectó en PBS y se montó en correderas de vidrio Superfrost® Plus (Menzel Glaeser, Braunschweig, Alemania), para el procedimiento de manchado subsecuente. El manchado de ?ß que contiene placas amiloides se llevó a cabo con el anticuerpo monoclonal de ratón 6G1 elevado contra ?ß monomérico (Barghorn y asociados, 2005, J. Neurochem). En un dispositivo de manchado automático (Ventana Discovery®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el siguiente protocolo: - las secciones de las correderas de vidrio se secaron con aire completamente y se transfirieron a la máquina Ventana - Se utilizó un protocolo automático proporcionado por Ventana para el procedimiento de bencidina de diamino cromogénico (DAB), que contenía pasos de lavado y bloqueo y se utilizó el manchado con el Equipo DAB MapTM; se incluyó recuperación de antígeno e inmunohistoquímica primaria y secundaria en el protocolo automático a través del experimentador: - se obtuvo recuperación de antígeno en la presencia del acondicionador #2 (amortiguador a base de citrato, pH 6.0) a una temperatura de 95°C durante 45 minutos - incubación con 6G1 (1:500) en diluyente de anticuerpo (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) a una temperatura de 37°C durante 3 horas - incubación con IgG anti-ratón de asno de anticuerpo secundario (1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) a una temperatura de 37°C durante 30 minutos - después de la finalización del manchado automático, las correderas fueron lavadas en agua normal, deshidratadas en etanoles graduados, aclaradas en XTRA-Solve® (J.T. Baker, Griesheim, Alemania), y la corredera deslizante con UltraKitt® (J.T. Baker, Griesheim, Alemania) Se cuantificó el manchado de placa en 3 secciones histológicas de la neocorteza utilizando el sistema de análisis de imagen ImagePro 5.0. El experimentador fue ciego para el tratamiento del ratón bajo análisis y se determinaron los siguientes parámetros: área de la neocorteza, área cubierta con manchado positivo 6G1 y número de placas manchadas. Estos parámetros fueron variables y no distribuidos de manera normal. Posteriormente, se evaluó en forma estadística una reducción de la carga de placa a través de una prueba-U de Mann-Whitney de un lado. Los resultados del manchado de depósito ?ß en ratones Tg2576 se muestran en la figura 13.

La evaluación de los depósitos DAB color café mostraron que el anticuerpo anti-RAGE redujo el número y área de placas amiloides en la neocorteza en un .24.5% y 26.8%, respectivamente (p<0.1). La reducción en el número de placas y área fue más evidente en la neocorteza frontal (p<0.05).

Los documentos que se mencionan en la presente invención están incorporados a la misma como referencia.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un Anticuerpo monoclonal aislado que comprende un dominio de enlace de antígeno, en donde el anticuerpo tiene la capacidad de enlazar un epítope de una molécula RAGE humano, comprendiendo el dominio de enlace de antígeno, al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de: a) el grupo CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos que consisten en SEC ID NO.: 4, 12 y 20; las secuencias de aminoácidos CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 50% con algunas de las secuencias; y/o b) el grupo CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos que consisten en SEC ID NO.: 8, 16 y 24; y las secuencias de aminoácidos CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 50%'con una de las secuencias.

2. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo CDR-H1 que consiste en SEC ID NO: 2, 10, 18; o seleccionada del grupo CDR-H2 que consiste en SEC ID NO: 3, 11, 19; o seleccionada del grupo CDR-L1 que consiste en SEC ID NO: 6, 14, 22; o seleccionada del grupo CDR-L2 que consiste en SEC ID NO: 7, 15, 23; y secuencias de aminoácidos CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 50% con una de las secuencias.

3. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque comprende al menos 3 CDRs que se seleccionan de un conjunto CDR de dominio variable que consiste en: o un dominio variable ajustado en donde al menos una de las 3 CDRs es una secuencia de aminoácido de CDR modificada que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% con la secuencia de origen.

4. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque al menos dos conjuntos CDR de dominio variable se seleccionan de un grupo que consiste en: conjunto VH 7F9 y conjunto VL 7F9; conjunto VH 4E5 y conjunto VL 4E5 y conjunto VH 11E6 y conjunto VL 11E6.

5. El anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una estructura aceptora humana.

6. El anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende al menos un dominio variable de cadena pesada seleccionado de SEC ID NO: 56 y 57; y/o al menos un dominio variable de cadena ligera seleccionado de SEC ID NO: 58 y 59.

7. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína de enlace comprende al menos una mutación de estructura seleccionada del grupo que consiste en: (posición de secuencia de cadena pesada): 1, 2, 68, 70, 72, 76, 85, 89, 95 (posición de secuencia de cadena ligera): 11, 13, 43, 49, 58, 70, 87.

8. El anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteina de enlace comprende al menos un dominio variable (estructura mutada) que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (secuencias de cadena pesada) SEC ID NO: 62, 67, 68 y 69; (secuencias de cadena ligera) SEC ID NO: 63, 64, 65 y 66.

9. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos 11E6, 4E5 y 7F9.

10. Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácido del anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9.

11. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado tal como se describe en la reivindicación 10.

12. Una célula huésped que comprende un vector tal como se describe en la reivindicación 11.

13. Un método para producir una proteína con la capacidad de enlazar RAGE, en donde el método comprende cultivar una célula huésped tal como se describe en la reivindicación 12 en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una proteína de enlace con la capacidad de enlazar RAGE.

14. Una proteína producida tal como se describe en el método de la reivindicación 13.

15. Una composición para la liberación de un anticuerpo de la composición, que comprende (a) una formulación, en donxle la formulación comprende el anticuerpo tal como se describe en las reivindicaciones de la 1 a la 9 en forma cristalizada como un ingrediente; y (b) al menos un transportador polimérico.

16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

17. Un método para tratar un mamífero, en donde el método comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad efectiva de la composición tal como se describe en la reivindicación 15 ó 16.

18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el método es para tratar enfermedades neurológicas seleccionadas del grupo que comprende Esclerosis Lateral Amiotrópica, Lesión de Plexo Braquial, lesión cerebral incluyendo lesión cerebral traumática, Parálisis Cerebral, Ataxia de Friedrich, Guillain Barre, Leucodistrofias, Esclerosis Múltiple, Post Polio, Epina Bifida, Lesión de Médula Espinal, Atrofia de Músculo Espinal, Tumores Espinales, Ataque, Mielitis Transversal, demencia, demencia senil, daño cognitivo leve, demencia relacionada con Alzheimer, corea de Huntington, disquinesia tardía, hiperquinesias, manías, Parkinson Morbus, síndrome de Steel-Richard , síndrome de Down, miastenia grave, trauma nervioso, amiloidosis vascular, hemorragia cerebral I con amiloidosis, inflamación cerebral, ataxia de Friedrich, trastorno de confusión aguda, esclerosis lateral amiotrófica, glaucoma, enfermedad de Alzheimer, nefropatía diabética, sepsis, artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias relacionadas.

19. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el método es para tratar la enfermedad de Alzheimer.

20. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque la composición comprende 11E6.