ES2577718T3 - Anticuerpos contra el receptor de los productos finales de la glicación avanzada (RAGE) y usos de los mismos - Google Patents

Description

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SEQ ID NO: 30: secuencia de nucleótidos completa del plásmido Constructo # 4 (negrilla) que codifica 6HIS

(Thr)-[RAGE (24-336)]

SEQ ID NO: 31: secuencia de nucleótidos completa del plásmido Constructo # 5 (negrilla) que codifica 6HIS

(Thr)-[RAGE (130-234)]

SEQ ID NO: 32: secuencia de nucleótidos completa del plásmido Constructo # 6 (negrilla) que codifica 6HIS

(Thr)-[RAGE (130-336)]

SEQ ID NO: 33: secuencia de nucleótidos completa del plásmido Constructo # 7 (negrilla) que codifica 6HIS

(Thr)-[RAGE (235-336)]

SEQ ID NO: 34: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 1

SEQ ID NO: 35: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 2

SEQ ID NO: 36: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 3

SEQ ID NO: 37: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 4

SEQ ID NO: 38: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 5

SEQ ID NO: 39: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 6

SEQ ID NO: 40: secuencia de aminoácidos de la proteína RAGE # 7

SEQ ID NO: 41: secuencia de aminoácidos mutante de la región constante de Ig gamma-1

SEQ ID NO: 42: secuencia de aminoácidos de la región constante de Ig gamma 2

SEQ ID NO: 43: secuencia de aminoácidos marco VH7-4.1/JH6 FR1

SEQ ID NO: 44: secuencia de aminoácidos marco VH7-4.1/JH6 FR2 y VH1-2/JH6 FR2

SEQ ID NO: 45: secuencia de aminoácidos marco VH7-4.1/JH6 FR3

SEQ ID NO: 46: secuencia de aminoácidos marco VH7-4.1/JH6 FR4 y VH1-2/JH6 FR4

SEQ ID NO: 47: secuencia de aminoácidos marco VH1-2/JH6 FR1

SEQ ID NO: 48: secuencia de aminoácidos marco VH1-2/JH6 FR3

SEQ ID NO: 49: secuencia de aminoácidos marco 1-12/L5/JK2 FR1

SEQ ID NO: 50: secuencia de aminoácidos marco 1-12/L5/JK2 FR2

SEQ ID NO: 51: secuencia de aminoácidos marco 1-12/L5/JK2 FR3

SEQ ID NO: 52: secuencia de aminoácidos marco 1-12/L5/JK2 FR4 y 3-15/L2/JK2 FR4

SEQ ID NO: 53: secuencia de aminoácidos marco 3-15/L2/JK2 FR1

SEQ ID NO: 54: secuencia de aminoácidos marco 3-15/L2/JK2 FR2

SEQ ID NO: 55: secuencia de aminoácidos marco 3-15/L2/JK2 FR3

SEQ ID NO: 56: Secuencia de aminoácidos injertada en VH 11E6.1-GL

SEQ ID NO: 57: Secuencia de aminoácidos injertada en VH 11E6.2-GL

SEQ ID NO: 58: Secuencia de aminoácidos injertada en VL 11E6.1-GL

SEQ ID NO: 59: Secuencia de aminoácidos injertada en VL 11E6.2-GL

SEQ ID NO: 60: secuencia de aminoácidos de hRAGE

SEQ ID NO: 61: secuencia de aminoácidos de un fragmento husRAGE

SEQ ID NO: 62: secuencia de aminoácidos humanizada VH h11E6.1

SEQ ID NO: 63: secuencia de aminoácidos humanizada VL h11E6.1

SEQ ID NO: 64: secuencia de aminoácidos humanizada VL h11E6.2

SEQ ID NO: 65: secuencia de aminoácidos humanizada VL h11E6.3

SEQ ID NO: 66: secuencia de aminoácidos humanizada VL h11E6.4

SEQ ID NO: 67: secuencia de aminoácidos humanizada VH h11E6.5

SEQ ID NO: 68: secuencia de aminoácidos humanizada VH h11E6.9 8

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(Hofmann et al. Cell 97, 889, 1999 o Xie et al. JBC, 282, 4218, 2007). Como ejemplos no limitantes de ligandos RAGE se pueden mencionar:

-Productos finales de la glicación avanzada (AGEs), (Baynes J.W., 1991, Diabetes. 1991, 40:405-412; Ahmed 5 K.A., 2007, J Clin Biochem Nutr. 41 (2):97-105); -Miembros de la familia S100/calgranulina (v.g., calgranulina C (conocida también como ENRAGE y S100A12),

S100A1, S100A4, S100A11, S100A13, S100B, y S100P); -Péptido Amiloide β (Aß), como por ejemplo el péptido Aß 1-40; -Globulómeros de amiloide-β ; como por ejemplo los globulómeros Aß1-42, Aß12-42, Aß20-42 (véase

10 Barghorn et al., Globular amyloid ß peptide1-42 oligomer -a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease) Journal of Neurochemistry 95(3):834-847, noviembre de 2005; WO2007/062852; WO2008/150949); -integrinas leucocitarias (v.g., Mac-1).

15 El término "RAGE" como se utiliza en esta memoria, se refiere particularmente a RAGE humano, designado también "hRAGE" o "huRAGE". A no ser que se indique otra cosa, el término "RAGE" abarca también moléculas RAGE aisladas u obtenidas de otras especies diferentes de la humana, como por ejemplo, roedores, como ratones o ratas;

o moléculas RAGE de ganado.

20 El término "sRAGE" se refiere a una forma soluble de RAGE, derivada del dominio extracelular de RAGE. Por ejemplo, una molécula de sRAGE derivada de RAGE humano, designada también como husRAGE, comprende los residuos de aminoácido 1 a 331 (véase SEQ ID NO: 61) de RAGE humano (véase SEQ ID NO: 60).

"Actividad biológica", como se utiliza en esta memoria, se refiere a todas las propiedades biológicas inherentes de 25 RAGE como se define en esta memoria.

Los términos "fijación específica" o "que se fijan específicamente", como se utilizan en esta memoria, con referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un pépt*ido con una segunda especie química, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (v.g., un "determinante antigénico" o "epítopo" como

30 se define más adelante) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo que reconoce y se fija a una estructura específica de proteína más bien que a las proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para un epítopo "A", la presencia de una molécula que contenga el epítopo A (o A el libre sin marcar), en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado fijada al anticuerpo.

35 El término "anticuerpo", como se utiliza en esta memoria, se refiere en términos generales a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) constituida por cuatro cadenas polipeptídicas, 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento, mutante, valiente, o derivación funcional de la misma, que retenga las características esenciales de fijación del epítopo de una molécula Ig Formatos de anticuerpo mutantes, variantes, o derivados se conocen en la técnica. Decepciones no limitantes de los mismos se exponen más adelante. Un anticuerpo se dice

40 que es "capaz de fijarse" a una molécula si el mismo es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir con ello la molécula al anticuerpo.

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Debe entenderse que un "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en esta memoria, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo, que comparten una secuencia de aminoácidos de cadena pesada común y cadena ligera común, en contraste con las preparaciones de anticuerpos "policlonales" que contienen una mixtura de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse por varias tecnologías nuevas como presentación de fago, bacterias, levadura o ribosoma así como métodos clásicos ilustrados por anticuerpos derivados de hibridoma (v.g., un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado por tecnología de hibridomas, tal como la metodología estándar del hibridoma de Kohler y Milstein ((1975) Nature 256:495-497).

En un anticuerpo de longitud total, cada cadena pesada está constituida por una región variable de cadena pesada (abreviada en esta memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está constituida por 3 dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está constituida por una región variable de cadena ligera (abreviada en esta memoria como en LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está constituida por un solo dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse ulteriormente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, determinadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el término amino al término carboxi en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (v.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (v.g., IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG 4, IgA1 e IgA2) o subclase.

El término "porción de fijación de antígeno" o "fragmento de fijación de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo"), como se utiliza en esta memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de fijarse específicamente a un antígeno (v.g., RAGE). Se ha demostrado que la función de fijación de antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Tales realizaciones de anticuerpo pueden ser también formatos biespecíficos, de especificidad dual, o multiespecíficos; que se fijan específicamente a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de fijación abarcados dentro del término "porción de fijación de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra;

(iii) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de una sola rama de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., publicación PCT WO 90/05144 A1), que comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, los mismos pueden estar unidos, utilizando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que hace posible que los mismos se produzcan como una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase v.g., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios deben considerarse también abarcados dentro del término "porción de fijación de antígeno" de un anticuerpo. Están abarcadas también otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL están expresados en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para hacer posible el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando con ello el apareamiento de los dominios con dominios de complementariedad de otra cadena y creando dos sitios de fijación de antígeno (véase v.g., Holliger, P., et al. (1993) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121

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Todavía más, un anticuerpo o porción de fijación de antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mayor, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos diferentes. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la 5 región de núcleo de estreptavidina para formar una molécula scFv tetrámera (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para producir moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina,

10 respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse utilizando técnicas estándar de DNA recombinante, como se describe en esta memoria.

Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto hacer referencia a un anticuerpo que está

15 sustancialmente exento de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (v.g., un anticuerpo aislado que se une específicamente a RAGE humano está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de RAGE humano). Un anticuerpo aislado que se fija específicamente a

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Una "inhibición de la reducción inducida por el péptido soluble Aβ 1-40 del volumen de sangre cerebral" determinada in vivo en un modelo animal se refiere a una inhibición parcial o completa, como por ejemplo al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un control no tratado, o en particular, si se compara con un control isotipo de inmunoglobulina negativo, monoclonal o policlonal.

Un "aumento del volumen de sangre cerebral" como in vivo en un modelo animal que sobreexpresa APP humano, se refiere a un aumento estadísticamente significativo de CBV, si se compara con un control sin tratar, o en particular, si se compara con un control isotipo de inmunoglobulina negativo, monoclonal o policlonal.

Una "reducción del número de placas de amiloide y/o área de placas de amiloide" como se mide in vivo en un modelo animal que sobreexpresan APP humano se refiere a una reducción parcial o completa, como por ejemplo de al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%

o más, si se compara con un control sin tratar, o en particular, si se compara con un control isotipo de inmunoglobulina negativo, monoclonal o policlonal.

Una "inhibición de la escisión de dinamina inducida por el péptido Aβ 1-40 agregado de neuronas del hipocampo in vitro", se refiere a una inhibición parcial o completa, como por ejemplo de al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un control sin tratar, o en particular, si se compara con un control isotipo de inmunoglobulina negativo, monoclonal o policlonal.

Una "inversión de la reducción inducida por el globulómero Aβ 1-42 de la transmisión sináptica" in vitro, se refiere a una inversión parcial o completa, como por ejemplo de al menos aproximadamente 1 a 10%, al menos aproximadamente 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o más, si se compara con un control sin tratar,

o en particular, si se compara con un control isotipo de inmunoglobulina negativo, monoclonal o policlonal.

Un "anticuerpo monoclonal neutralizante" como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo, que después de fijación al antígeno específico son capaces de competir e inhibir la fijación del ligando natural para dicho antígeno. En una realización particular de la presente solicitud, los anticuerpos neutralizantes de la presente invención son capaces de competir con RAGE para fijación a al menos uno de sus ligandos, en particular un ligando seleccionado de péptidos Aβ, globulómeros Aβ, S 100b y anfoterina, y para prevenir la actividad o función biológica de RAGE.

El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de fijación de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE que se fija a un antígeno RAGE y/o la potencia neutralizante de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE cuya fijación a RAGE neutraliza la actividad biológica de RAGE.

La "función biológica" o "actividad" de RAGE puede describirse como la de un receptor de la superficie celular transductor de señales para Aβ o un receptor que media el transporte de proteínas al interior o a través de la célula.

El término "epítopo" o "determinante antigénico" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de fijarse específicamente a una inmunoglobulina o un receptor de las células T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen grupos de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos, cadenas

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Los términos "cristal", y "cristalizado" como se utilizan en esta memoria, se refieren a un anticuerpo, o porción de fijación de antígeno del mismo, que existe en la forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, que es distinta de otras formas tales como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos de redes tridimensionales regulares repetidas de átomos, iones, moléculas (v.g., proteínas tales como anticuerpos), o ensamblajes moleculares (v.g., complejos antígeno/anticuerpo). Estas redes tridimensionales están dispuestas conforme a relaciones matemáticas específicas que son bien conocidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal se conoce como la unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que se ajusta a una simetría cristalográfica dada bien definida proporciona la "celdilla unidad" del cristal. La repetición de la celdilla unidad por traslaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2ª ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999)."

El término "polinucleótido" como se conoce en esta memoria, significa una forma polímera de dos o más nucleótidos, sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono-y bicatenarias de DNA, pero particularmente es DNA bicatenario.

El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que significa un polinucleótido (v.g., de DNA genómico, cDNA, o de origen sintético, o alguna combinación de los mismos) tal que, en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado": no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza; el mismo está enlazado operativamente a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza; o no existe en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

El término "vector", como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico el cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de DNA bicatenario al pueden estar ligados segmentos adicionales de DNA. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual segmentos de DNA adicionales pueden estar ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen los mismos (v.g., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la célula hospedadora, y por tanto se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente los mismos. A dichos vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir tales otras formas de vectores de expresión, como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan funciones equivalentes.

El término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la cual los componentes descritos están en una relación que permite que los mismos funcionen de su manera propuesta. Una secuencia de control "enlazada operativamente" a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante

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se alcanza en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "enlazadas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés y secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a cierta distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se utiliza en esta memoria, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están ligadas aquéllas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción, promotoras e intensificadoras; señales eficientes de procesamiento de RNA tales como señales de remodelación y poliadenilación; secuencias que estabilizan el mRNA citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas, y en caso deseado, secuencias que mejoran la secreción de proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en los procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de fijación de ribosoma, y secuencia de terminación de la transcripción; en los eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" tiene por objeto incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras y secuencias pareja de fusión.

La "transformación", como se define en esta memoria, se refiere a cualquier proceso por el cual DNA exógeno entra en una célula hospedadora. La transformación puede ocurrir en condiciones naturales o artificiales utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La trasformación puede estar basada en cualquier método conocido para la inserción de secuencias extrañas de ácido nucleico en una célula hospedadora procariota o eucariota. El método se selecciona basándose en la célula hospedadora que se transforma y puede incluir, pero sin carácter limitante, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Tales células "transformadas" incluyen células transformadas establemente en las cuales el DNA insertado es capaz de replicación sea como plásmido replicante autónomamente o como parte del cromosoma hospedador. Aquéllas incluyen también células que expresan transitoriamente el DNA o RNA insertado durante periodos de tiempo limitados.

El término "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto hacer referencia a una célula en la cual se ha introducido DNA exógeno. Debe entenderse que tales términos tienen por objeto hacer referencia no sólo a la célula sujeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Dado que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero se incluye todavía dentro del alcance del término "célula hospedadora" como se utiliza en esta memoria. Las células hospedadoras incluyen particularmente células procariotas y eucariotas seleccionadas de cualquiera de los reinos de la vida. Células eucariotas particulares incluyen células protistas, fúngicas, así como células de plantas y animales. En particular, las células hospedadoras incluyen, pero sin carácter limitante, el linaje de células procariotas E. coli; los linajes de células CHO, HEK 293 y COS de mamífero; el linaje de células de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

Pueden utilizarse técnicas estándar para DNA recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transformación de tejidos (v.g., electroporación y lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse conforme a especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la técnica o tal como se describe en esta memoria. Las técnicas y procedimientos que anteceden pueden realizarse generalmente conforme

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a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y exponen a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase v.g., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

"Organismo transgénico", como se conoce en la técnica y como se utiliza en esta memoria, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgén, en el cual el transgén introducido en el organismo (o un ancestro del organismo) expresa un polipéptido no expresado naturalmente en el organismo. Un "transgén" es un constructo de DNA, que está integrado de manera estable y operativa en el genoma de una célula a partir del cual se desarrolla un organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del organismo transgénico.

Los términos "regular" y "modular" se utilizan intercambiablemente y, como se utiliza en esta memoria, se refieren a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (v.g., la actividad biológica de RAGE). La modulación puede ser un aumento o una disminución en la magnitud de cierta actividad o función de la molécula de interés. Actividades y funciones ilustrativas de una molécula incluyen, pero sin carácter limitante, características de fijación, actividad enzimática, activación de receptores celulares, y transducción de señales.

Correspondientemente, el término "modulador", como se utiliza en esta memoria, es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (v.g., la actividad biológica de RAGE). Por ejemplo, un modulador puede causar un aumento o disminución en la magnitud de cierta actividad o función de una molécula comparada con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador.

El término "agonista", como se utiliza en esta memoria, se refiere a un modulador que, cuando está en contacto con una molécula de interés, causa un aumento en la magnitud de cierta actividad o función de la molécula comparada con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del agonista. Agonistas particulares de interés pueden incluir, pero sin carácter limitante, polipéptidos de RAGE o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualesquiera otras moléculas que se fijan a RAGE.

El término "antagonista", como se utiliza en esta memoria, se refiere a un modulador que, cuando está en contacto con una molécula de interés, causa una disminución en la magnitud de cierta actividad o función de la molécula comparada con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista. Antagonistas ilustrativos incluyen, pero sin carácter limitante, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o pequeñas moléculas orgánicas. Pepticuerpos se describen, v.g., en WO01/83.525.

Antagonistas particulares de interés incluyen aquéllos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica de RAGE. Antagonistas de RAGE pueden incluir, pero sin carácter limitante, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o cualesquiera otras moléculas, que se fijan a RAGE, particularmente anticuerpos monoclonales que interaccionan con la molécula RAGE. Debe observarse que la interacción con RAGE puede dar como resultado fijación y neutralización de otros ligandos/componentes de la membrana celular, y puede ser útil para funcionamiento aditivo o sinérgico contra enfermedades múltiples.

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NO: 2, 10, 18; o seleccionada del grupo CDR-H2 constituido por SEQ ID NO: 3, 11, 19; o seleccionada del grupo CDR-L1 constituido por SEQ ID NO: 6, 14, 22; o seleccionada del grupo CDR-L2 constituido por SEQ ID NO: 7, 15, 23; y secuencias de aminoácidos de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% con una de dichas secuencias.

12. la proteína de fijación conforme a una cualquiera de las realizaciones anteriores, en la cual dicha al menos una CDR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

SEQ ID NO.: 2

Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:1

SEQ ID NO.: 3

Residuos 50-68 de SEQ ID NO.:1

SEQ ID NO.: 4

Residuos 101-108 de SEQ ID NO.:1

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SEQ ID NO.: 6

Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:5

SEQ ID NO.: 7

Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:5

SEQ ID NO.: 8

Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:5

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SEQ ID NO.: 10

Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:9

SEQ ID NO.: 11

Residuos 50-66 de SEQ ID NO.:9

SEQ ID NO.: 12

Residuos 97-109 de SEQ ID NO.:9

imagen25

imagen26

SEQ ID NO.: 14

Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:13

SEQ ID NO.: 15

Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:13

SEQ ID NO.: 16

Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:13

imagen27

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SEQ ID NO.: 18

Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:17

SEQ ID NO.: 19

Residuos 50-66 de SEQ ID NO.:17

SEQ ID NO.: 20

Residuos 99-109 de SEQ ID NO.:17

imagen29

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SEQ ID NO.: 22

Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:21

SEQ ID NO.: 23

Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:21

SEQ ID NO.: 24

Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:21

10 13. La proteína de fijación conforme a la realización 12, que comprende al menos tres CDRs que se seleccionan de un conjunto de CDR de dominio variable constituido por: 29

Conjunto VH 7F9

imagen31 imagen32

VH 7F9 CDR-H1

Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:1 SEQ ID NO: 2

VH 7F9 CDR-H2

Residuos 50-68 de SEQ ID NO.:1 SEQ ID NO: 3

VH 7F9 CDR-H3

Residuos 101-108 de SEQ ID NO.:1 SEQ ID NO: 4

Conjunto VL 7F9

imagen33 imagen34

VL 7F9 CDR-L1

Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:5 SEQ ID NO: 6

VL 7F9 CDR-L2

Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:5 SEQ ID NO: 7

VL 7F9 CDR-L3

Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:5 SEQ ID NO: 8

Conjunto VH 11E6

imagen35 imagen36

VH 11E6 CDR-H1

Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:9 SEQ ID NO: 10

VH 11E6 CDR-H2

Residuos 50-66 de SEQ ID NO.:9 SEQ ID NO: 11

VH 11E6 CDR-H3

Residuos 99-109 de SEQ ID NO.:9 SEQ ID NO: 12

Conjunto VL 11E6

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VL 11E6 CDR-L1

Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:13 SEQ ID NO: 14

VL 11E6 CDR-L2

Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:13 SEQ ID NO: 15

VL 11E6 CDR-L3

Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:13 SEQ ID NO: 16

Conjunto VH 4E5

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VH 4E5 CDR-H1

Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:17 SEQ ID NO: 18

VH 4E5 CDR-H2

Residuos 50-66 de SEQ ID NO.:17 SEQ ID NO: 19

VH 4E5 CDR-H3

Residuos 99-109 de SEQ ID NO.:17 SEQ ID NO: 20

Conjunto VL 4E5

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VL 4E5 CDR-L1

Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:21 SEQ ID NO: 22

VL 4E5 CDR-L2

Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:21 SEQ ID NO: 23

VL 4E5 CDR-L3

Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:21 SEQ ID NO: 24

o un conjunto de dominio variable en el cual al menos una de dichas tres CDRs es una secuencia de aminoácidos de CDR modificada que tiene una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%, con la secuencia parental.

14. La proteína de fijación conforme a la realización 13, que comprende al menos dos conjuntos CDR de dominio variable.

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15.

La proteína de fijación conforme a la realización 14, en la cual dichos al menos dos conjuntos CDR de dominio

variable se seleccionan de un grupo constituido por: conjunto VH 7F9 y conjunto VL 7F9; conjunto VH 4E5 y VL 4E5 y conjunto VH 11E6 y conjunto VL 11E6.

16.

La proteína de fijación conforme a una de las realizaciones anteriores, que comprende adicionalmente un marco aceptor humano.

17.

La proteína de fijación conforme a la realización 16, en la cual dicho marco aceptor humano comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 y 55.

18.

La proteína de fijación de una cualquiera de las realizaciones anteriores que comprende al menos un dominio variable de cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 56 y 57; y/o al menos un dominio variable de cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 58 y 59.

19.

La proteína de fijación de la realización 18, en donde dicha proteína de fijación comprende dos dominios

variables, en donde dichos 2 dominios variables tienen secuencias de aminoácido seleccionadas de: SEQ ID NOs: 56 y 58; 56 y 59; SEQ ID NOs: 57 y 58; 57 y 59.

20.

La proteína de fijación conforme a una cualquiera de las realizaciones 16 a 19, en donde dicho marco de aceptor humano comprende al menos una sustitución de aminoácido en la región marco en un residuo clave, seleccionado dicho residuo clave del grupo constituido por:

un residuo adyacente a una CDR; un residuo de sitio de glicosilación, un residuo raro, un residuo capaz de interaccionar con un epítopo de RAGE, un residuo capaz de interaccionar con una CDR; un residuo canónico; un residuo de contacto entre región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera; un residuo dentro de una zona Vernier; un residuo N-terminal capaz de formación de para-glutamato; y un residuo en una región que se solapa entre una CDR 1 de cadena pesada variable definida por Chothia y un primer marco de cadena pesada definida por Kabat.

21.

La proteína de fijación conforme a la realización 20, en la cual dichos residuos clave se seleccionan del grupo constituido por (posición de la secuencia de cadena pesada): 1, 2, 68, 70, 72, 76, 85, 89, 95 (posición de la secuencia de cadena ligera): 11, 13, 43, 49, 58, 70, 87.

22.

La proteína de fijación de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en la cual la proteína de fijación es un

dominio variable humano de consenso. 31

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un anticuerpo de especificidad dual, una inmunoglobulina de dominio variable dual, y un anticuerpo biespecífico.

5 40. El constructo de anticuerpos conforme a una cualquiera de las realizaciones 38 y 39, en donde dicha proteína de fijación comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo constituido por:

un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG1 humana,

10 un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgD humana,

15 un dominio constante de IgA1 humana, un dominio constante de IgA2 humana, un dominio constante de IgY humana y dominios mutados correspondientes.

20 41. El constructo de anticuerpos conforme a una cualquiera de las realizaciones 38 a 40, que comprende un dominio constante de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 25, 41, 42, y 26.

42. Un conjugado de anticuerpos que comprende un constructo de anticuerpos descrito en una cualquiera de las

25 realizaciones 38 a 41, comprendiendo adicionalmente dicho conjugado de anticuerpos un agente seleccionado del grupo constituido por: una molécula de inmunoadhesión, un agente de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico.

43. El conjugado de anticuerpos conforme a la realización 42, en el cual dicho agente es un agente de imagen

30 seleccionado del grupo constituido por un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético, y biotina.

44. El conjugado de anticuerpos conforme a la realización 43, en el cual dicho agente de imagen es un

radiomarcador seleccionado del grupo constituido por: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. 35

45. El conjugado de anticuerpos conforme a la realización 42, el cual dicho agente es un agente terapéutico o citotóxico seleccionado del grupo constituido por: un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.

40

46. El constructo de anticuerpos conforme a una cualquiera de las realizaciones 38 a 41, en el cual dicha proteína de fijación posee un patrón de glicosilación humano.

47. El conjugado de anticuerpos conforme a cualquiera de las realizaciones 42 a 45 en el cual dicha proteína de fijación posee un patrón de glicosilación humano.

48. La proteína de fijación conforme a una cualquiera de las realizaciones 1 a 37, en donde dicha proteína de fijación 5 existe como un cristal.

49. El constructo de anticuerpos conforme a una cualquiera de las realizaciones 38 a 41, en donde dicho constructo de anticuerpos existe como un cristal.

10 50. El conjugado de anticuerpos conforme a una cualquiera de las realizaciones 42 a 45, en donde dicho constructo de anticuerpos existe como un cristal.

51. La proteína de fijación conforme a la realización 48, en donde dicho cristal es un cristal farmacéutico de

liberación controlada exento de portador. 15

52. El constructo de anticuerpos conforme a la realización 49, en donde dicho cristal es un cristal farmacéutico de libros encontrada exento de portador.

53. El conjugado de anticuerpos conforme a la realización 50, en donde dicho cristal es un cristal farmacéutico de 20 liberación controlada exento de portador.

54. La proteína de fijación conforme a la realización 48, en donde dicha proteína de fijación tiene una semivida in vivo mayor que la contrapartida soluble de dicha proteína de fijación.

25 55. El constructo de anticuerpos conforme a la realización 49, en donde dicho constructo de anticuerpos tiene una semivida in vitro mayor que la contrapartida soluble de dicho constructo de anticuerpos.

56. El conjugado de anticuerpos conforme a la realización 50, en donde dicho conjugado de anticuerpos tiene una

semivida in vivo mayor que la contrapartida soluble de dicho conjugado de anticuerpos. 30

57. La proteína de fijación conforme a la realización 48, en donde dicha proteína de fijación retiene actividad biológica.

58. El constructo de anticuerpos conforme a la realización 49, en donde dicho constructo de anticuerpos retiene 35 actividad biológica.

59. El conjugado de anticuerpos conforme a la realización 50, en donde dicho conjugado de anticuerpos retiene actividad biológica.

40 60. Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína de fijación de cualquiera de las realizaciones 1-37.

61. Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de un constructo de anticuerpos de una cualquiera de las realizaciones 38-41.

62.

Un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de un conjugado de anticuerpos de una 5 cualquiera de las realizaciones 42-45.

63. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado conforme a una cualquiera de las realizaciones 60 a 62.

64.

El vector de la realización 63, en donde dicho vector se selecciona del grupo constituido por pcDNA, pTT, pTT3, 10 pEFBOS, pBV, pJV, pHybE, y pBJ.

65. Una célula hospedadora que comprende un vector conforme a una cualquiera de las realizaciones 63 y 64.

66.

La célula hospedadora conforme a la realización 65, en donde dicha célula hospedadora es una célula 15 procariota.

67. La célula hospedadora conforme a la realización 66, en donde dicha célula hospedadora es E. coli.

68.

La célula hospedadora conforme a la realización 67, en donde dicha célula hospedadora es una célula eucariota. 20

69. La célula hospedadora conforme a la realización 68, en donde dicha célula eucariota se selecciona del grupo constituido por una célula protista, célula animal, célula de planta y célula fúngica.

70. La célula hospedadora conforme a la realización 69, en donde dicha célula eucariota es una célula animal 25 seleccionada del grupo constituido por: una célula de mamífero, una célula de ave, y una célula de insecto.

71. La célula hospedadora conforme a la realización 69, en donde dicha célula hospedadora se selecciona de células HEK, células CHO, células COS y células de levadura.

30 72. La célula hospedadora conforme a la realización 71, en donde dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

73. La célula hospedadora conforme a la realización 70, en donde dicha célula hospedadora es una célula de

insecto Sf9. 35

74. Un método de producción de una proteína capaz de fijar RAGE, que comprende cultivar una célula hospedadora de una cualquiera de las realizaciones 65 a 73 en el medio de cultivo en condiciones suficientes para producir una proteína de fijación capaz de fijar RAGE.

40 75. Una proteína producida conforme al método de la realización 74.

76. Una composición para la liberación de una proteína de fijación, comprendiendo dicha composición

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(a)

una formulación, en donde dicha formulación comprende un producto proteínico cristalizado conforme a una cualquiera de las realizaciones 48 a 50, y un ingrediente; y

(b)

al menos un portador polímero.

77.

La composición conforme a la realización 76, en donde dicho portador polímero es un polímero seleccionado de uno o más del grupo constituido por: poli (ácido acrílico), poli (ciano-acrilatos), poli (aminoácidos), poli (anhídridos), poli (depsipéptido), poli (ésteres), poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli (b-hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etilenglicol), poli ((hidroxipropil) metacrilamida, poli [(organo) fosfazeno], poli (ortoésteres), poli (vinil-alcohol), poli (vinilpirrolidona), copolímeros anhídrido maleico-alquil-viniléter, polioles Pluronic, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos.

78.

La composición conforme a la realización 76, en la cual dicho ingrediente se selecciona del grupo constituido por albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-β-ciclodextrina, metoxipolietilen-glicol y polietilen-glicol.

79.

Un método para tratamiento de un mamífero que comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición conforme a una cualquiera de las realizaciones 77 y 78.

80.

Una composición farmacéutica que comprende el producto de una cualquiera de las realizaciones 1 a 59, y un portador farmacéuticamente aceptable.

81.

La composición farmacéutica de la realización 80, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable se comporta como adyuvante útil para aumentar la absorción, o dispersión de dicha proteína de fijación.

82.

La composición farmacéutica de la realización 81, en la que dicho adyuvante es hialuronidasa.

83.

La composición farmacéutica de la realización 82 que comprende adicionalmente al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual la actividad de RAGE es perjudicial.

84.

La composición farmacéutica de la realización 83, en donde dicho agente adicional se selecciona del grupo constituido por: agente terapéutico, agente de imagen, agente citotóxico, inhibidores de angiogénesis; inhibidores de quinasas; bloqueadores de moléculas de co-estimulación; bloqueadores de moléculas de adhesión; anticuerpos anticitocinas o fragmentos funcionales de los mismos; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK 506; marcador o informador detectable; un antagonista de TNF; un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, un inmunizador, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de reemplazamiento hormonal, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación contra el asma, un β -agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocinas. Ejemplos adicionales son: Dimebón, anticuerpos anti-Aβ , inhibidores de β -secretasas, moduladores tau, mejoradores de la cognición tales como v.g. antagonistas 5-HT 6, inhibidor de colesterinasa (v.g., tactrina, donepezil, rivastigmina o galantamina), un bloqueador parcial del receptor de NMDA (v.g., memantina), un mimético de glicosaminoglicanos (v.g., Alzhemed), un inhibidor o modulador alostérico de gamma-secretasa (v.g., R

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Los anticuerpos de la solicitud pueden generarse por inmunización de un hospedador adecuado (v.g., vertebrados, con inclusión de humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado, caballos, reptiles, peces, anfibios, y huevos de aves, reptiles y peces). Para generar los anticuerpos de la presente solicitud, el hospedador se inmuniza con un polipéptido inmunógeno RAGE y o fragmento del mismo de la invención. El término "inmunización" se refiere en esta memoria al proceso de presentación de un antígeno a un repertorio inmune si dicho repertorio existe en un organismo natural genéticamente inalterado, o un organismo transgénico, con inclusión de los modificados para presentar un repertorio inmune humano artificial. Análogamente, una "preparación inmunógena" es una formulación de antígeno que contiene adyuvantes u otros aditivos que podrían aumentar la inmunogenicidad del antígeno.

La inmunización de animales puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica. Véase, v.g. Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para inmunización de animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado y caballos son bien conocidos en la técnica. Véase, v.g., Harlow y Lane y el documento Patentes U.S. No. 5, 994,619. En una realización particular, el antígeno RAGE se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (muramil-dipéptidos) o ISCOM (complejos imunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger el polipéptido contra la dispersión rápida por secuestración del mismo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan el hospedador a secretar factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Particularmente, si se está administrando un polipéptido, el protocolo de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, extendidas a lo largo de varias semanas.

Se contempla que el animal hospedador se inmuniza con el antígeno asociado a la membrana celular de una célula intacta o alterada y los anticuerpos de la presente solicitud se identifican por fijación a un polipéptido inmunógeno de la invención. Después de inmunización del hospedador animal con el antígeno, pueden obtenerse anticuerpos del animal. El suero que contiene anticuerpos se obtiene del animal por sangrado o sacrificio del animal. El suero puede utilizarse tal como se obtiene del animal, puede obtenerse del suero una fracción de inmunoglobulina, o los anticuerpos pueden purificarse a partir del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidas de esta manera son policlonales, teniendo por tanto un conjunto heterogéneo de propiedades.

3.2 Anticuerpos monoclonales anti-RAGE utilizando tecnología de hibridoma

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando una gran diversidad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y de presentación de fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales utilizando técnicas de hibridoma que incluyen las conocidas en la técnica y expuestas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en esta memoria no está limitado a anticuerpos producidos por tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota, o de fago, y no al método por el que se produce el mismo.

Los métodos para producción y selección de anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En una realización, la presente invención proporciona métodos de

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generación de anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en donde, particularmente, el hibridoma se genera por fusión de esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la invención, con células de mieloma, seguido por cribado de los hibridomas resultantes de la fusión respecto a clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de fijar un polipéptido de la invención. Resumidamente, pueden inmunizarse ratones con un antígeno RAGE. En una realización particular, el antígeno RAGE se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (muramil-dipéptidos) o ISCOM (complejos imunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger el polipéptido contra la dispersión rápida por secuestración del mismo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan el hospedador a secretar factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Particularmente, si se está administrando un polipéptido, el protocolo de inmunización implicará dos

o más administraciones del polipéptido, extendidas a lo largo de varias semanas.

Una vez que se detecta una respuesta inmune, v.g., se detectan anticuerpos específicos para el antígeno RAGE en el suero de ratón, se extirpa el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Los esplenocitos se fusionan luego por técnicas bien conocidas con cualesquiera células de mieloma adecuadas, por ejemplo células del linaje de células SP 20, disponible de la ATCC. Se seleccionan hibridomas y se clonan por dilución limitada. Los clones de hibridoma se ensayan luego por métodos conocidos en la técnica respecto a células que secreten anticuerpos capaces de fijar RAGE. Fluido de ascitis, que contiene generalmente niveles elevados de anticuerpos, puede generarse por inmunización de ratones con clones de hibridoma positivos.

En otra realización, pueden prepararse hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B esplénicas se fusionan a células de mieloma inmortalizadas como es bien conocido en la técnica. Véase, v.g., Harlow y Lane, supra. En una realización particular, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (un linaje de células no secretoras). Después de fusión y selección de antibióticos, los hibridomas se someten a cribado utilizando RAGE o una porción del mismo, o una célula que expresa RAGE. En una realización particular, el cribado inicial se realiza utilizando un inmunoensayo unido a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), particularmente un ELISA. Un ejemplo de selección ELISA se proporciona en WO 00/37504.

Los hibridomas productores de anticuerpos anti-RAGE se seleccionan, clonan y criban adicionalmente respecto a características deseables, con inclusión de crecimiento robusto del hibridoma, producción alta de anticuerpos y características deseables de anticuerpos, como se expone con mayor detalle más adelante. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmune, v.g. ratones lampiños, o en cultivo de células in vitro. Métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos por quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica.

En una realización particular, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se ha descrito arriba. En otra realización particular, los hibridomas se producen de una especie no humana y distinta de ratón tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra realización, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales un mieloma humano no secretor se fusiona con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-RAGE.

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los loci de cadena pesada y loci de cadena ligera x humanos. Véase Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998).

3.5 Anticuerpos monoclonales anti-RAGE utilizando bibliotecas de anticuerpos recombinantes

Pueden utilizarse también métodos in vitro para producir los anticuerpos de la invención, en los cuales se somete a cribado una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de fijación deseada. Métodos para tal cribado de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos descritos, por ejemplo, en Ladner et al. Patente U.S. No. 5,223,409; Kang et al. Publicación PCT No. WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT No. WO 91/17271; Winter et al. Publicación PCT No. WO 92/20791; Markland et al. Publicación PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:35763580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, publicación de la solicitud de patente U.S. 20030186374, y Publicación PCT No. WO 97/29131.

La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un individuo inmunizado con RAGE, o una porción de RAGE. Alternativamente, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un individuo naif, es decir, uno que no ha sido inmunizado con RAGE, tal como una biblioteca de anticuerpos humanos de un individuo humano que no ha sido inmunizado con RAGE humano. Los anticuerpos de la invención se seleccionan por cribado de la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende RAGE humano para seleccionar de este modo aquellos anticuerpos que reconocen RAGE. Métodos para la realización de dichos cribado y selección son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en las referencias del párrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tengan afinidades particulares de fijación a hRAGE, tales como aquéllos que se disocian de RAGE humano con una constante de disociación koff particular, pueden utilizarse el método de resonancia de plasmones de superficie conocido en la técnica a fin de seleccionar anticuerpos que tengan la constante de disociación koff deseada. A fin de seleccionar anticuerpos de la invención que tengan una actividad neutralizante particular para h RAGE, tales como aquéllos con una CI50 particular, pueden utilizarse métodos estándar conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad de hRAGE.

En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o una porción de fijación de antígeno del mismo, que se fija a RAGE humano. Particularmente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden generarse también utilizando diversos métodos de presentación de fago conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de fago, se presentan dominios funcionales de anticuerpo en la superficie de partículas de fago, que llevan las secuencias polinucleotídicas que codifican los mismos. En una realización particular, dicho fago puede utilizarse para presentar dominios de fijación de antígeno expresados de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (v.g., humana o murina). Fagos que expresan un dominio de fijación de antígeno que se fija al antígeno de interés pueden seleccionarse o

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genéticos para ligar dominios de anticuerpo a la pared de la célula de levadura y presentarlos en la superficie de la levadura. En particular, dicha levadura puede utilizarse para presentar dominios de fijación de antígeno expresados por un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (v.g., humana o murina). Ejemplos de métodos de presentación de levadura que pueden utilizarse para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos por Wittrup, et al. Patente de los Estados Unidos No. 6,699,658.

4. Producción de anticuerpos RAGE recombinantes particulares de la invención

Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la expresión a partir de células hospedadoras, en la que uno o más vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera es/son transfectado(s) a una célula hospedadora por técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" debe entenderse que abarcan una gran diversidad de técnicas utilizadas comúnmente para introducción de DNA exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, v.g. electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección DEAE-dextrano y análogos. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferible en células hospedadoras de mamífero, dado que tales células eucariotas (y en particular células de mamífero) tienen mayor probabilidad que las células procariotas de ensamblarse y secretar un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo.

Células hospedadoras particulares de mamífero para expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (con inclusión de células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, v.g. como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen por cultivo de las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, en particular, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se desarrollan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteínas.

Pueden utilizarse también células hospedadoras para producir fragmentos de anticuerpo funcionales, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se comprenderá que variaciones del procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con DNA que codifica fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. También puede utilizarse tecnología de DNA recombinante para separar algo, o la totalidad, del DNA que codifica una o las dos cadenas ligeras y pesadas que no es/son necesaria(s) para fijación a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de DNA truncadas están abarcadas también por los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invención, y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de los antígenos de interés por reticulación de un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo por métodos estándar de reticulación química.

En un sistema particular para expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de fijación de antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica a la vez la cadena pesada del anticuerpo y la

cadena ligera del anticuerpo se introduce en células dhfr-CHO por transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo están enlazados cada uno operativamente a elementos reguladores intensificador CMV/promotor AdMLP para impulsar niveles altos de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante lleva también un gen DHFR, que permite la 5 selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, recuperándose el anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se utilizan técnicas estándar de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de

10 cultivo. Todavía adicionalmente, la invención proporciona un método de síntesis de un anticuerpo recombinante de la invención por cultivo de una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además el aislamiento del anticuerpo recombinante del medio de cultivo.

15 4.1 Anticuerpos anti-RAGE

La Tabla 4 es una lista de secuencias de aminoácidos de regiones VH y VL de anticuerpos anti-RAGE particulares como se describen en esta memoria.

20 Tabla 4: lista de secuencias de aminoácidos de regiones VH y VL de anticuerpos anti-huRAGE

Seq. No.

ID Región de Proteína imagen51 Secuencia

imagen52

imagen53 imagen54 1234567890123456789012345678901

1

imagen55 VH 7F9 imagen56 imagen57

imagen58

VH 7F9 CDR-H1 Residuos 31-35 de SEQ ID NO. : 1 NYWMD

imagen59

VH 7F9 CDR-H2 Residuos 50-68 de SEQ ID NO. : 1 EIRLKSNYYSTHYAESVKG

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VH 7F9 CDR-H3 Residuos 101-108 de SEQ ID NO. : 1 NAYWYFDV

5

imagen61 VL 7F9 imagen62 imagen63

imagen64

VL 7F9 CDR-L1 Residuos 24-34 de SEQ ID NO. :5 KASQDVGTSVA

imagen65

VL 7F9 CDR-L2 Residuos 50-56 de SEQ ID NO. :5 WTSTRHT

imagen66

VL 7F9 CDR-L3 Residuos 89-97 de SEQ ID NO. :5 QQYNNYPLT

9

imagen67 VH 11E6 imagen68 imagen69

Seq. No.

ID Región de Proteína imagen70 Secuencia

imagen71

imagen72 imagen73 1234567890123456789012345678901

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VH 11E6 CDR-H1 Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:9 NFGMN

imagen75

VH 11E6 CDR-H2 Residuos 50-66 de SEQ ID NO.:9 YINTNTGESIYSEEFKG

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VH 11E6 CDR-H3 Residuos 99-109 de SEQ ID NO.:9 SRMVTAYGMDY

13

imagen77 VL 11E6 imagen78 imagen79

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VL 11E6 CDR-L1 Residuos 24-34 de SEQ ID NO..:13 KASQNVGTAVA

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VL 11E6 CDR-L2 Residuos 50-56 de SEQ ID NO..:13 SASNRYT

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VL 11E6 CDR-L3 Residuos 89-97 de SEQ ID NO..:13 QQYSSYPLT

17

imagen83 VH 4E5 imagen84 imagen85

imagen86

VH 4E5 CDR-H1 Residuos 31-35 de SEQ ID NO.:17 NYLIE

imagen87

VH 4E5 CDR-H2 Residuos 50-66 de SEQ ID NO.:17 VINPGSGGTNHNEKFKV

imagen88

VH 4E5 CDR-H3 Residuos 99-109 de SEQ ID NO.:17 SAGTARARFAY

21

imagen89 VL 4E5 imagen90 imagen91

imagen92

VL 4E5 CDR-L1 Residuos 24-34 de SEQ ID NO.:21 RASQDIGSSLN

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VL 4E5 CDR-L2 Residuos 50-56 de SEQ ID NO.:21 ATSSLDS

imagen94

VL 4E5 CDR-L3 Residuos 89-97 de SEQ ID NO.:21 LQYASFPFT

Las secuencias CDR de anticuerpos anti-RAGE aislados que anteceden establecen una nueva familia de proteínas de fijación de RAGE, aisladas conforme a esta invención. Para generar y seleccionar CDR' S de la invención que tengan fijación de RAGE y/o actividad particular de neutralización con respecto a hRAGE, pueden utilizarse métodos

5 estándar conocidos en la técnica para generación de proteínas de fijación de la presente invención y evaluación de las características de fijación y/o neutralización de RAGE de dichas proteínas de fijación, incluyendo, pero sin carácter limitante, las descritas específicamente en esta memoria.

4.2 Anticuerpos Quiméricos anti-RAGE

10 Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual porciones diferentes del anticuerpo se derivan de especies animales diferentes, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Pueden utilizarse métodos para producción de

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SEQ ID No.

Región de proteína Secuencia

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imagen97 123456789012345678901234567890

(46)

(VH7-4.1/JH6 FR4)

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VH 11E6.2-GL imagen98

(47)

(VH1-2/JH6 FR1)

(44)

(VH1-2/JH6 FR2)

(48)

(VH1-2/JH6 FR3)

(46)

(VH1-2/JH6 FR4)

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VL 11E6.1-GL imagen99

(49)

(1-12/L5/JK2 FR1)

(50)

(1-12/L5/JK2 FR2)

(51)

(1-12/L5/JK2 FR3)

(52)

(1-12/L5/JK2 FR4)

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VL 11E6.2-GL imagen100

(53)

(3-15/L2/JK2 FR1)

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(3-15/L2/JK2 FR2)

(55)

(3-15/L2/JK2 FR3)

(52)

(3-15/L2/JK2 FR4)

Las secuencias CDR derivadas de mAb 11 E6 se indican en letra negrilla. Se hace referencia también a las secuencias marco específicas (FR 1 a FR 4) por indicación de los SEQ ID NOs correspondientes (véanse también las Tablas 2 y 3).

5

4.4 Anticuerpos anti-RAGE humanizados

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpos de especie no humana que se fijan al antígeno deseado, teniendo una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de una especie no

10 humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana. Secuencias Ig humanas conocidas se describen, v.g., en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; ww.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;

15 www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime

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u.acjp/.about.yasuhito-/ELISA.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/;www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Tales secuencias importadas pueden utilizarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, aumentar o modificar la fijación, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, semivida, o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. Residuos marco en las regiones marco humanas pueden sustituirse con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de la CDR para alterar, particularmente aumentar, la fijación de antígeno. Estas sustituciones marco se identifican por métodos muy conocidos en la técnica, v.g., por modelación de las interacciones de la CDR y los residuos marco para identificar regiones marco importantes para la fijación de antígeno y comparación de secuencias a fin de identificar residuos marco inusuales en posiciones particulares. (Véase, v.g., Queen et al., Patente U.S. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Modelos tridimensionales de inmunoglobulina están disponibles comúnmente y son familiares para los expertos en la técnica. Se dispone de programas de computadora que ilustran y presentan estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para fijarse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse residuos FR y combinarse a partir de las secuencias de consenso e importación de tal modo que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para el o los antígenos diana. En general, los residuos CDR están implicados directa y en la mayoría de los casos sustancialmente en influir en la fijación de antígeno. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una diversidad de métodos conocidos en la técnica, tales como pero sin carácter limitante los descritos en Jones et al., Nature

321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); Publicación PCTWO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, Patentes U.S. NOs. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567.

5. Realizaciones Adicionales de Anticuerpos de la Invención

5.1 Anticuerpos de Fusión e Inmunoadhesinas 5

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La presente solicitud describe también un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que puede producirse, que comprende la totalidad o una porción de un anticuerpo RAGE de la presente solicitud enlazada a otro polipéptido. En algunas realizaciones, únicamente la región variable del anticuerpo RAGE está enlazada al polipéptido. En otras realizaciones, el dominio VH de un anticuerpo RAGE de esta solicitud está enlazado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL del anticuerpo está enlazado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de una manera que permite que los dominios VH y VL interaccionen uno con otro para formar un sitio de fijación del anticuerpo. En otras realizaciones, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador que permite que los dominios VH y VL interaccionen uno con otro (véase más adelante bajo Anticuerpos Monocatenarios). El anticuerpo VH-enlazador-VL se enlaza luego a un polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresa un RAGE. El polipéptido de interés puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, o puede ser un agente diagnóstico, tal como una enzima, que puede visualizarse fácilmente, tal como peroxidasa de rábano picante. Adicionalmente, pueden crearse anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos monocatenarios están enlazados uno a otro. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una sola cadena de polipéptido, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.

Una realización proporciona una proteína de fijación marcada en la cual un anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente solicitud se derivatiza o se enlaza a otra molécula funcional (v.g., otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de fijación marcada de la presente solicitud puede derivarse por enlace funcional de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente solicitud (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares distintas, tales como un ácido nucleico, otro anticuerpo (v.g., un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina una etiqueta de polihistidina).

Agentes detectables útiles con los cuales puede derivatizarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente solicitud incluyen compuestos fluorescentes. Agentes detectables fluorescentes ilustrativos incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y análogos. Un anticuerpo puede derivatizarse también con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa-oxidasa y análogas. Cuando un anticuerpo está derivatizado con una enzima detectable, el mismo se detecta por adición de reactivos adicionales que utiliza la enzima para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando está presente el agente detectable peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo puede estar derivatizado también con un ácido nucleico, biotina, y detectarse por medida indirecta de la fijación de avidina o estreptavidina.

5.2. Anticuerpos Monocatenarios

La presente solicitud incluye un anticuerpo monocatenario (scFv) que se fija a un RAGE inmunógeno de la invención. Para producir el scFv, se enlaza operativamente DNA codificante de VH y V a DNA que codifica un enlazador flexible, v.g., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser), de tal modo que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, v.g., Bird et al. (1988) Science 242:423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.

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Geriatrics. 1997 Sep;52 Suppl 2:S13-6; Yan SD et al: Biochim Biophys Acta. 2000 Jul 26;1502(1):145-57; artritis reumatoide, osteoartritis: Drinda S et al: Rheumatol Int. 2004 Mar 26; enfermedad intestinal: Foell D et al: Gut. 2003 Jun;52(6):847-53; esclerosis múltiple: Yan SS et al: Nat Med. 2003 Mar;9(3):287-93; psoriasis: Foell D et al: Rheumatology (Oxford). 2003 Nov;42(11):1383-9 : lupus : Tanji N et al: J Am Soc Nephrol. 2000 Sep;11(9):1656-66; enfermedades autoinmunes generales, sepsis: Liliensiek B et al: J Clin Invest. 2004 Jun;113(11):1641-50; arterioesclerosis y restenosis : Schmidt AM et al: Circ Res. 1999 Mar 19;84(5):489-97).

Asimismo, como se ha expuesto previamente, pueden ser útiles inmunoglobulinas DVD, o anticuerpos de especificidad dual entre uno cualquiera de los compuestos asociados arriba descritos. Tales preparaciones de anticuerpos como se han descrito arriba pueden ser útiles para el tratamiento de dichas enfermedades.

Los anticuerpos de la presente solicitud pueden combinarse también con péptidos que permiten la transferencia trans-membranal para incluir el direccionamiento de proteínas diana intracelulares. Tales secuencias peptídicas pueden incluir, pero sin carácter limitante, TAT, antenapedia, poli-args, y algunos péptidos anti-microbianos: Tales péptidos pueden permitir la transferencia a través de las membranas, con inclusión de membranas plasmáticas celulares, pero también epitelios y membranas endoteliales, con inclusión de la barrera hematoencefálica, la mucosa intestinal, las meninges, y otras.

Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la presente solicitud puede administrarse también con uno o más agentes terapéuticos de molécula pequeña adicionales útiles en el tratamiento de trastornos en los cuales está implicada la actividad de RAGE como se ha expuesto en los párrafos que anteceden. Debe entenderse que los anticuerpos de la presente solicitud o porción de fijación de antígeno de los mismos pueden utilizarse solos o en combinación con un agente adicional, v.g. un agente terapéutico, seleccionándose dicho agente adicional por el especialista experto para su propósito propuesto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o afección que se esté tratando por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional puede ser también un agente que imparte un atributo beneficioso a la composición terapéutica, v.g., un agente que afecta a la viscosidad de la composición.

7. Composiciones Farmacéuticas

La invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o porción de fijación de antígeno del mismo, de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de la invención son útiles, pero sin carácter limitante, para diagnóstico, detección, o monitorización de un trastorno, en la prevención, tratamiento, gestión, o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, y/o en investigación. En una realización específica, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención. En otra realización, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de los anticuerpos de la invención para el tratamiento de un trastorno en el cual es perjudicial la actividad de RAGE. Particularmente, los agentes profilácticos o terapéuticos conocidos por ser útiles para o haber sido o estar siendo utilizados actualmente en la prevención, tratamiento, gestión, o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas realizaciones, la composición puede comprender adicionalmente un portador, diluyente o excipiente.

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fijación (v.g, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, o hidroxipropil-metilcelulosa); cargas (v.g., lactosa, celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (v.g., estearato de magnesio, talco, o sílice); desintegrantes (v.g., almidón de patata o almidón-glicolato de sodio); o agentes humectantes (v.g. lauril-sulfato de sodio). Las tabletas pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar, pero sin carácter limitante, la forma de soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (v.g., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (v.g. lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (v.g., aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (v.g., phidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales tampón, saborizantes, colorantes, y agentes edulcorantes en caso apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse convenientemente para liberación lenta, liberación controlada, o liberación sostenida de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos.

El método de la invención puede comprender la administración pulmonar, v.g., por el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de aerosolización. Véase, v.g. las Patentes U.S. Nos. 6,019, 968, 5,985, 320, 5, 985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, y 4,880,078; y las Publicaciones PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903. En una realización específica, un anticuerpo de la invención, terapia de combinación, y/o composición de la invención se administra utilizando tecnología de suministro de fármacos pulmonares Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

El método de la invención puede comprender administración de una composición formulada para administración parenteral por inyección (v.g., de tipo bolus o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria (v.g., en ampollas o en envases multi-dosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden presentar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado (v.g., agua estéril exenta de pirógenos) antes de su utilización. Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones de tipo depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (v.g. subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las composiciones se pueden formular con materiales polímeros o hidrófilos adecuados (v.g., como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas cambiadoras de iones,

o como derivados escasamente solubles (v.g., como una sal escasamente soluble).

Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

Por regla general, los ingredientes de las composiciones se suministran por separado o mezclados unos con otros en forma de dosis unitaria por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o concentrado anhidro en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o papelillo que indica la cantidad de agente activo. En el caso en que el modo de administración es infusión, la composición se puede dispensar con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Donde el modo de administración es por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina a fin de que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administración.

En particular, la invención hace posible también que uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se envasa en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o papelillo que indica la cantidad de agente. En una realización, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se suministra como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado anhidro en un envase herméticamente cerrado y puede reconstituirse (v.g., con agua o solución salina) a la concentración apropiada para administración a un individuo. Particularmente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministra como un polvo liofilizado estéril seco en un envase herméticamente cerrado en una dosis unitaria de al menos 5 mg, más particularmente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos dos5 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o composiciones farmacéuticas de la invención deben almacenarse a una temperatura comprendida entre 2ºC y 8ºC en su recipiente original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención deberían administrarse dentro de una semana, particularmente dentro de 5 días, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, o dentro de 1 hora después de su reconstitución. En una realización alternativa, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministra en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración del agente. Particularmente, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente herméticamente cerrado que contiene al menos 0,25 /mg/mL, más particularmente al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida debería guardarse a una temperatura comprendida entre 2ºC y 8ºC en su envase original.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. Particularmente, el anticuerpo o las porciones de anticuerpo se prepararán como una solución inyectable que contiene 0,1-250 mg/mL de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta de un líquido o forma de dosificación liofilizada en un vial de sílex o ámbar, ampolla o jeringuilla previamente llenada. El tampón puede ser L-histidina (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH de 5,0 a 7,0 (óptimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Puede utilizarse cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Pueden incluirse crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% de sacarosa (óptimamente 0,5-1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse agentes de aumento de volumen para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1-10% manitol (óptimamente 2-4%). Pueden utilizarse estabilizadores en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente 1-50 mmol de Lmetionina (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes de aumento de volumen adecuados incluyen glicina, arginina, y pueden incluirse como 0-0,5% polisorbato-80 (óptimamente 0,005-0,01%). Surfactantes adicionales incluyen, pero sin carácter limitante, polisorbato 20 y surfactantes BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención preparada como una solución inyectable para administración parenteral, puede comprender adicionalmente un agente útil como adyuvante, tal como los utilizados para aumentar la absorción, o dispersión de una proteína terapéutica (v.g., anticuerpo). Un adyuvante particularmente útil es hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana después de administración parenteral, en particular administración subcutánea. La misma permite también un volumen mayor en el sitio de inyección (es decir, mayor que 1 mL, con menos dolor e incomodidad, e incidencia mínima de reacciones en el sitio de inyección (véase WO 2004078140, US 2006104968).

Las composiciones de esta invención pueden encontrarse en una diversidad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (v.g. soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, píldoras, bolus, liposomas y supositorios. La forma particular depende del modo de administración y la medicación terapéutica propuestos. Composiciones típicas particulares se encuentran en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. Un modo particular de administración es el parenteral (v.g., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización particular, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización particular, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas deben ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles por incorporación del compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes arriba enumerados, según sea requerido, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan por incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los arriba enumerados. En el caso de polvos liofilizados estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, métodos particulares de preparación son secado a vacío y spray-secado que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de surfactantes. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede realizarse por inclusión, en la composición, de un agente retardador de la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la presente invención se pueden administrar por una diversidad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, una ruta/modo de administración particular es la inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como será apreciado por el profesional experto, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, con inclusión de implantes, parches transdérmicos, y dispositivos de suministro microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y

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John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). En US 2005 0042664A1 se hace una descripción detallada de diversos métodos de terapia génica

RAGE juega un papel crítico en la patología asociada por una diversidad de enfermedades como se define anteriormente en esta memoria. La infusión de péptidos de amiloide Aβ en animales conduce a respuestas como respuestas inflamatorias en "arteriolose", disminución en el flujo sanguíneo cerebral. Estos efectos podrían prevenirse por anticuerpos contra RAGE (Rhodin, J. et al. World Congress for Microcirculation, submitted Papers, 7th, Sydney, Australia, Aug. 19-22, 2001 ,543-547; Deane et al. Nature med. 2003).

RAGE está regulado en sentido creciente en la microvasculatura de los pacientes de AD y en ratones transgénicos en los cuales el gen de APP humano ha sido sobreexpresado (Deane et al., Nature Med. 2003). Utilizando ratones doblemente transgénicos en los que el gen de APP humano se expresa y RAGE está sobreexpresado, se demostró que la sobreexpresión del gen RAGE normal conduce a deterioro en el aprendizaje y aumento de placas, mientras que la sobreexpresión de una variante de RAGE deficiente en señalización y dominante negativa conduce a mejora en el aprendizaje y niveles menores de placas (Arancio et al. 2004 EMBO J. 2004). La experimentación en modelos animales de diabetes de ambos tipos 1 y 2 revela que el antagonismo del eje ligando-RAGE reprime el desarrollo y la progresión de la perturbación de células vasculares e inflamatorias en el medio diabético, v.g. ratones RAGE desactivados y anticuerpos Anti-RAGE se han utilizado para demostrar una mejora en modelos animales para, v.g. la retinopatía diabética (Ravichandran R. et al CANADIAN JOURNAL OF DIABETES. 2006; 30(4):422, Myint Khin et al. Diabetes (2006), 55(9), 2510; De-Vriese et al. Journal of the American Society of Nephrology 2003, 14/8, 2109, Jensen et al. Renal effects of a neutralising RAGE-antibody in long-term streptozotocin-diabetic mice. The Journal of endocrinology, 2006, 188, 493). Los efectos renales positivos a largo plazo de un anticuerpo RAGE neutralizante en ratones diabéticos obesos tipo 2 fueron demostrados por Flyvbjerg et al (Diabetes, 2004, 53, 1, p. 166-72). Se utilizaron ratones RAGE desactivados para demostrar una implicación de RAGE en la sepsis (Birgit Liliensiek et al. J Clin Invest. 2004 June 1; 113(11): 1641-1650; Receptor for advanced glycation end products (RAGE) regulates sepsis but not the adaptive immune response). El bloqueo de fragmentos F(ab)2 derivados de IgG anti-RAGE reduce la respuesta inflamatoria en la EAE inducida por MOG o BMP (Yan, S.S., et al. 2003. Nat. Med. 9: 287-293). La implicación de RAGE en el cáncer fue demostrada (Abe-R et al. Journal of Investigative Dermatology, 2004, 122/2 (461-467). En ratones portadores de tumores, las tasas de supervivencia se prolongaron, y las metástasis pulmonares espontáneas fueron inhibidas por el tratamiento utilizando anticuerpos neutralizantes anti-RAGE.

Los anticuerpos, y porciones de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar humanos que padecen enfermedades de este tipo.

Debe entenderse que los anticuerpos de la invención o porción de fijación de antígeno de los mismos pueden utilizarse solos o en combinación con un agente adicional, v.g., un agente terapéutico, seleccionándose dicho agente adicional por el profesional experto para su propósito propuesto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico bien conocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o afección que es tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional puede ser también un agente que imparte un atributo beneficioso a la composición terapéutica, v.g., un agente que afecta a la viscosidad de la composición.

Debe entenderse adicionalmente las combinaciones que están incluidas dentro de esta invención son aquellas combinaciones útiles para su propósito propuesto. Los agentes indicados más adelante son ilustrativos para los propósitos y no deben considerarse limitados. Las composiciones, que forman parte de la invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y al menos un agente adicional seleccionado de las listas que siguen. La combinación puede incluir también más de un agente adicional, v.g. dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar su función propuesta.

Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo de la invención puede combinarse incluye los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclofosforina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanicina; interferón-β1a (AVONEX; Biogén); interferón-β1b (BETASERON; Chron/bernex); interferón-α-n3 (Interferón Sciences/Fujimoto), interferón-α (Alfa Wassermann/J&J), interferón βA-IF (Serono/Inhale Therapeutics), peginterferón α2b (Enzon/Schering-Prough), Copolymer 1 (Op-1; COMPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16. IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de fijación de antígeno de los mismos, pueden combinarse con anticuerpos para moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de fijación de antígeno de los mismos, pueden combinarse también con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato, mofetil, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citoquinas proinflamatorias tales como TNF-α □ o IL-1 (v.g. inhibidores de las quinasas IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1β, inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de las células T tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de las angiotensinas, receptores de citocinas solubles y derivados de los mismos (v.g., receptores de TNF M55 o p75 solubles, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) y citocinas antiinflamatorias (v.g. IL-4, IL-10, IL-13 y TGFβ).

Ejemplos particulares de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple en los cuales el anticuerpo o porción de fijación de antígeno del mismo puede combinarse incluyen interferón-β, por ejemplo, IFNβ1a e IFNβ1b; copaxona, corticosteroides, inhibidores de caspasas, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para el ligando CD40 y CD80.

Particularmente, las proteínas de fijación y anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para tratar una amiloidosis, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down. Debe entenderse que las proteínas de fijación y anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con al menos un agente adicional adecuado para tratar una de las enfermedades anteriores. Dicho al menos un agente adicional puede ser seleccionado por el profesional experto para su propósito propuesto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico tal como un inhibidor de colesterinasa (v.g., tactrina, donepezil, rivastigmina o galantamina), un bloqueador parcial del receptor NMDA (v.g., memantina), un mimético de glicosaminoglicano (v.g., Alzhemed), un inhibidor del modulador alostérico de gamma-secretasa (v.g., R-flurbiprofeno), un agonista de la hormona liberadora de gonadotropina bloqueador de la hormona luteinizante (v.g., leuprorelina), un antagonista del receptor 5-HT1A de serotonina, un agente quelante, un bloqueador selectivo neuronal de los canales de calcio tipo L, un inmunomodulador, un inhibidor de la fibrilogénesis amiloide o inhibidor de la deposición de proteína amiloide (v.g.,

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requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de la invención viene dictada por y es directamente dependiente de (a) las características singulares del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.

Un intervalo ilustrativo y no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0,1-20 mg/kg, más particularmente 1-10 mg/kg. Debe indicarse que los valores de dosis pueden variar por el tipo y la gravedad de la condición a aliviar. Debe indicarse que para cualquier individuo particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en esta memoria son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos de la invención descritos en esta memoria son obvias y pueden hacerse utilizando equivalentes adecuados sin apartarse del alcance de la invención o las realizaciones descritas en esta memoria. Una vez descrita la presente invención en detalle, la misma será comprendida más claramente haciendo referencia a los ejemplos que siguen, que se incluyen únicamente para propósitos de ilustración y no pretenden ser limitantes de la invención.

PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1: Anticuerpos anti-huRAGE preferidos

1.1. Producción de hibridomas y anticuerpos

Ratones Balb/c y A/J, de 4-6 semanas de edad, se inmunizaron y reforzaron subcutáneamente con RAGE humano. Los animales se inyectaron cada 3 semanas, comenzando con una inyección primaria de 30 μg en adyuvante de Freund completo e inyecciones de refuerzo de 30 μg en adyuvante de Freund incompleto. Los ratones seleccionados para fusión se inyectaron por vía intravenosa con 10 μg de hRAGE en solución salina, 4 días antes de la fusión. Se extirparon los bazos de los animales inmunizados y se prepararon suspensiones de células simples. Las células de mieloma SP2/0 se cosecharon del cultivo y se lavaron. Las células de bazo y células de tumor se mezclaron en una ratio de 5:1 y se fusionaron utilizando 50% PEG 3000 utilizando técnicas estándar (Kohler y Milstein, 1975). Las células fusionadas se sembraron en placas de 96 pocillos en medio selectivo, a una densidad de 2,5 x 105 células de bazo por pocillo. Las fusiones se incubaron a 37ºC durante 7-10 días. Cuando se observaron colonias macroscópicas, se retiraron los sobrenadantes y se testaron en el ELISA hRAGE.

Los hibridomas que producían mAbs con características deseadas se subclonaron por el método de dilución limitante. Los sobrenadantes que contenían subclones se ensayaron respecto a 7fijación a hRAGE por ELISA. Las subclases de cadena pesada y ligera de los mAbs se determinaron utilizando el kit de determinación del isotipo Zymed EIA.

1.2. Determinación de la secuencia de aminoácidos de la región variable para cada mAb anti-RAGE humano de murino

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Ejemplo 3: Construcción de pcDNA3.1(+)Zero hlgG Lambda hc257-Stop

Se utilizaron dos cebadores oligonucleotídicos (gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc (SEQ ID NO: 91); ctagtctagatcatttacccggagacagggag (SEQ ID NO: 92)) para amplificar la secuencia de DNA para la cadena pesada de hlgG lambda a partir de una biblioteca de cDNA de placenta humana (Clontech #HL5014a) utilizando EasyA Polimerasa en una PCR, reacción en cadena de polimerasa. El DNA resultante se purificó en gel (como se ha descrito arriba), se clonó en un vector pcDNA3.1 V5-His TOPO (pcDNA3.1/V5/His TOPO TA Expression Kit Invitrogen #K4800-01) utilizando las instrucciones del fabricante y se transformó en células TOP10 de E. coli como se ha descrito arriba. Los clones positivos se identificaron y el DNA plasmídico resultante se purificó (designado: pcDNA3.1 (V5His) FC/hIgG lambda hc Nr.2/7) utilizando PCR y cebadores oligonucleotídicos (gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc (SEQ ID NO: 93); ctagtctagatcatttacccggagacagggag (SEQ ID NO: 94)). La parte de hlgG lambda hc del DNA se amplificó, se cortó con EcoRV/XbaI, se ligó a un vector de DNA EcoRV/XbaI precurtido pcDNA3.1 (+) Zeo y se transformó en células E. coli TOP10. El plásmido resultante se designó: pcDNA3.1 (+) Zeo hIgG lambda hc 257-Stop y se utilizó para trabajo ulterior a fin de expresar proteínas fusionadas en el terminal N en marco a una parte C-terminal de cadenas pesadas de inmunoglobulina IgG.

3.1. Transfección y expresión de proteínas en células HEK293F

Células HEK293F que se habían dejado crecer en cultivo durante 2-3 días en Medio de Expresión Free Style 293 se centrifugaron a 400 g y se desechó el sobrenadante. El sedimento de células se resuspendió en medio y se ajustó a 3 x 107 células en 28 mL de medio fresco, se transfirió a un Erlenmeyer de 125 mL y se incubó en una incubadora a 37ºC, 8% CO2 en un agitador de sacudidas orbital a 150 rpm hasta que se preparó la mixtura de transfección.

Las mixturas de transfección con el complejo 293 Fectin-DNA se ajustaron como sigue:

(i)

se diluyeron 30 μg de DNA con Opti-Mem I a un volumen total de 1000 μL (control 1000 μL de Opti-MemI) y se mezclaron;

(ii)

35 μL de 293 Fectin Invitrogen #12347-019; 1 mL) se diluyeron con Opti-MemI a un volumen total de 1000 μL, se mezclaron y se incubaron durante 5 min a la temperatura ambiente.

La mixtura de DNA y la solución de 293 Fectin de (i) y (ii) se transfirieron a un tubo nuevo, se mezclaron ligeramente y después de incubación durante 25 minutos a la temperatura ambiente se añadieron a las células en el Erlenmeyer.

Las células se incubaron con esta mixtura de transfección durante el tiempo indicado en una incubadora a 37ºC, 8% CO2 en un agitador de sacudidas orbital a 150 rpm. Los sobrenadantes de las células se cosecharon por centrifugación a 400 g durante 10 minutos.

3.2. Purificación de las proteínas de fusión RAGE-Fc utilizando proteína G-Sepharose

Para acoplar la proteína de los sobrenadantes de células a cuentas, se lavaron 3 veces cuentas (proteína G-Sepharose 4 FastFlow (Amersham Biosciences) en PBS por suspensión de las cuentas en PBS y centrifugación a 13500 rpm, desechando el sobrenadante. Las cuentas se incubaron con los sobrenadantes de células respectivos (300 mL de sobrenadantes de células por mL de cuentas) a acoplar durante 1-2 horas en un rotor a la temperatura ambiente. Se lavaron las cuentas tres veces con PBS y se incubaron con los sobrenadantes de células durante 12 horas o durante una noche a 4ºC. Después de la incubación, las cuentas se lavaron tres veces con PBS como anteriormente. La proteína fijada se eluyó por adición de 200 μL de NaCl 140 mM + glicina 0,1 M al sedimento de cuentas e incubación durante 30 minutos en un rotor. Después de centrifugación, el sobrenadante se neutralizó

5 inmediatamente por adición de Tris 2 M para ajustar el pH a 7,1-pH 7,4. El sedimento de cuentas se desechó. Las sondas obtenidas se dializaron contra PBS y se guardaron congeladas en partes alícuotas a -20ºC. La proteína de fusión RAGE-Fc que contenía el ectodominio extracelular entero de RAGE se obtuvo de R&D Systems (No. 1145-RG; Quimera RAGE-Fc Humano Recombinante).

10 3.3. Fijación por hibridación puntual de anticuerpos a péptidos o fragmentos de RAGE en una forma no desnaturalizada

Se utilizaron hibridaciones puntuales para evaluar la fijación de anticuerpos a péptidos o fragmentos de RAGE en una forma no desnaturalizada. Las proteínas utilizadas eran sRAGE-proteína (1-331 sRAGE-HIS) o una versión

15 acortada en el terminal N (102-331-sRAGE-HIS). Los péptidos se ordenaron y sintetizaron por Biotrend de acuerdo con métodos estándar (síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador AMS 222 utilizando química Fmoc/tBu) que contenía un término carboxilo libre. Los péptidos se purificaron por HPLC y se realizó el análisis de cada péptido respecto a pureza utilizando RP-HPLC. Todos los péptidos tenían una pureza superior a 80%. Las identidades de los péptidos se verificaron por espectrometría de masas.

20 Los péptidos utilizados eran 30-meros que abarcaban la región extracelular de la proteína RAGE humana. La carga neta de la mayoría de los péptidos era similar.

NtermR31:

QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLN Carga neta:: +7 (SEQ ID NO: 70)

Péptido 1:

KLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPN Carga neta: +2 (SEQ ID NO: 71)

Péptido 2:

LPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKE Carga neta: 0 (SEQ ID NO: 72)

Péptido 3:

GKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVBSASELTA Carga neta: +1 (SEQ ID NO: 73)

Péptido 4:

LTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWKLDGK Carga neta: +1 (SEQ ID NO: 74)

Péptido 5:

DGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQ Carga neta: +2 (SEQ ID NO: 75)

Péptido 6:

TLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPR Carga neta: +1 (SEQ ID NO: 76)

Péptido 7:

LPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVE Carga neta: +2 (SEQ ID NO: 77)

Péptido 8:

VVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIH Carga neta: -2 (SEQ ID NO: 78)

Péptido 9:

QIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQG Carga neta: +0 (SEQ ID NO: 79)

Péptido 10:

DQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPG Carga neta: -1 (SEQ ID NO: 80)

25 Manchas consistentes en diferentes cantidades de proteína/péptido (30 ng, 10 ng, 3 ng, 1 ng, 0,3 ng, 0,1 ng, 0,03 ng, y 0,01 ng) en un volumen de 1 μL en 1 x PBS se aplicaron por puntos sobre una Membrana de Nitrocelulosa ECL Hybond (Amersham, RPN68D) por duplicado. Las membranas se secaron y la fijación inespecífica se bloqueó

imagen116

globulómero Aβ biotinilado en el mismo tampón (PBS, 0,1% BSA, pH 7,4). Se mezclaron 4 μL de estas soluciones o 4 μL de tampón con 4 μL de proteína husRAGE recombinante y la solución se incubó a la temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la adición de 4 μL de cada una de las soluciones (3,7 nM Anti6HIS-Criptato y 60,6 nM de estreptavidina XL-665).

El ensayo se incubó durante 2 horas a 4ºC. Después de adición de 4 μL de una solución stock 2 M de KF, la señal de HTRF se midió en modo HTRF en un instrumento de fluorescencia BMG Pherastar (BMG Labtech GmbH, Alemania). Se utilizaron curvas de señal máximas sin anticuerpo y resultados de ruido de fondo utilizando sólo solución de Anti6HIS-Criptato o solución de Estreptavidina XL. Los valores % DeltaF se calcularon de acuerdo con las instrucciones del fabricante CisBio utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, USA).

Ejemplo 5: Inhibición de la fijación del globulómero Aβ 1-42 a husRAGE por anticuerpos utilizando tecnología HTRF

Se utilizó el protocolo básico que se ha descrito arriba con pocas modificaciones. Los componentes HTRF donante y aceptor se diluyeron 40 veces a 10,25 nM para Anti6HIS-Europiumcryptate y 151,5 nM para Estreptavidina XL-665 en PBS, pH 7,4, 0,1% BSA.

Se utilizaron anticuerpos monoclonales (MABs) purificados contra husRAGE o inmunoglobulinas de control (IgG 1 de ratón e IgG 2A de ratón; no. M-5284 o respectivamente no. M-5409; Sigma, Alemania) como anticuerpos de control.

El ensayo se realizó en un volumen total de 20 μL en placas de 384 pocillos. Para cada punto de ensayo se incubaron 4 μL de husRAGE 1 μM con 4 μL de anticuerpo de test o anticuerpos IgG de control en concentraciones de 2 μM, 1 µM, 0,5 µM, 0,25 µM, 0,125 µM, 62,5 nM, 31,25 nM, 15,62 nM, 7,81 nM, 3,9 nM durante 1 hora a la temperatura ambiente. El control del ruido de fondo se realizó sin husRAGE y sin anticuerpos. La señal máxima se obtuvo sin anticuerpos. Subsiguientemente, se añadieron 4 μL de globulómero Aβ biotinilado 800 nM, así como 2 μL de 10,25 nM para Anti6HIS-Europiumcriptate y 151,5 nM para Estreptavidina XL-665. Las diferencias en volumen se ajustaron por adición de tampón de fijación (1 x PBS pH 7,4; 0,1% BSA). El ensayo se incubó durante 1 hora más. Después de adición de 4 μL de una solución stock de KF 2M, la señal HTRF se midió en modo HTRF en un instrumento de fluorescencia Pherastar BMG (BMG Labtech GmbH, Alemania). Se utilizaron curvas máximas de señal sin anticuerpo y los resultados de ruido de fondo utilizando sólo solución de Anti6HIS-Criptato o solución de Estreptavidina XL. Los valores % DeltaF se calcularon de acuerdo con las instrucciones del fabricante CisBio utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, USA). Los resultados se presentan en las Figuras 3A, 3B y 3C. Las concentraciones indicadas en las figuras son las concentraciones finales de las proteínas en un volumen de ensayo de 20 μL.

Como se muestra en la Figura 4, husRAGE que expresaba los 3 dominios de RAGE se fijaba de hecho a los globulómeros Aβ de amiloide. Una proteína mutante de RAGE que consistía en sRAGE humano que carecía de la mayor parte del dominio-v (RAGE 102-331) se fijaba de hecho con mayor afinidad a los globulómeros Aβ de amiloide, indicando que el dominio dentro de RAGE humano para fijación a los globulómeros Aβ está dentro del término C.

Ejemplo 6: Fijación de los globulómeros Aβ a la proteína sRAGE utilizando la tecnología de ensayo de cribado ALFA

Este ensayo se realizó en tampón de ensayo (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 y 0,1% BSA) en un volumen de 20 μl. Las cuentas donantes utilizadas se recubrieron con estreptavidina (Perkin Elmer; 6760002S) y las cuentas aceptoras utilizadas eran de Proteína A ALPHALISA (Perkin Elmer; CUSM6413300EA), 4 μL de cada una de las cuentas se pre-diluyeron con 196 μL de tampón de ensayo.

Utilizando una Proxi-Plate de 384 pocillos (Perkin Elmer, no. 6006280), las cuentas donantes se cargaron con globulómeros Aβ-biotina (véase arriba) utilizando 4 μL de las cuentas donantes prediluidas y 6 μL de una solución 200 nM de globulómeros Aβ biotinilados.

Las cuentas aceptoras se cargaron con cantidades diferentes de proteínas de fusión RAGE-Fc utilizando 4 μL de las cuentas aceptoras prediluidas y 6 μL de diluciones diferentes de proteínas de fusión RAGE-Fc (comenzando v.g. con 100 μg/mL).

La carga (fijación de las proteínas a las cuentas) se realizó en la oscuridad a la temperatura ambiente durante 30 minutos.

La fijación de los globulómeros Aβ a RAGE se inició por combinación de las preparaciones de cuentas donantes y aceptoras precargadas durante 180 minutos adicionales en la oscuridad. Las señales se midieron en un instrumento ALPHA-Quest (Perkin Elmer) con un retardo temporal de 1 segundo. Los análisis ulteriores se realizaron utilizando software GraphPadPrism. En un experimento diferente pero utilizando la misma tecnología, la fijación de los globulómeros Aβ a RAGE-Fc constituido por los tres dominios, se comparó con la fijación de los globulómeros Aβ a la proteína mutante RAGE-Fc constituida por el dominio v solamente (aminoácidos 1-130 de huRAGE). Como se muestra en la Figura 5, la fijación de globulómeros Aβ de amiloide a los tres dominios de RAGE soluble era fuerte y la fijación de los globulómeros Aβ de amiloide al dominio v de RAGE era insignificante. Dado que la fijación de globulómeros Aβ a RAGE tiene lugar en la región C-terminal, podría predecirse que los anticuerpos que se fijaban preferiblemente a estos dominios compiten con esta fijación.

Ejemplo 7: Construcción, expresión y purificación de los fragmentos RAGE de E. coli

7.1. Preparación de constructos

Los constructos RAGE de E. coli enumerados en la Tabla 6 se generaron como sigue. El constructo 1 se creó por amplificación PCR a partir del plásmido molde pcDNA3 (-) 6.1 C HIS A utilizando el cebador directo (atgctacatatgaaaaagacagctatcgcgatt gcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctcaaaacatcacagcc (SEQ ID NO: 89)) y el cebador inverso (atgctactcgagtcagtggtggtgg tggtggtgagttcccagccctgatcctcccacagagcctgcagttggcccctcc (SEQ ID NO: 90)), que introducían sitios de restricción NdeI y XhoI que se utilizaron para subclonación en los sitios análogos de pET29. Los constructos restantes (#2-#7, Tabla 6) se generaron utilizando el Constructo 1 como molde. Las secuencias codificantes de los residuos de aminoácidos RAGE 24-129, 24-234, 24-336, 130-234, 130-336, y 235-336 se amplificaron por PCR a partir del Constructo 1. Los fragmentos de DNA resultantes se pasaron sobre un gel de agarosa al 1,0%, y el DNA se purificó utilizando el Kit de Extracción de gel QIAquick de Qiagen. Los fragmentos de DNA se digirieron con NdeI y XhoI, y se ligaron en pET28a digerido análogamente. La mezcla de ligación se transformó en células competentes Max Efficiency DH5α y se extendió en placas de agar LB que contenían 50 mg/L de kanamicina. Después de incubación durante una noche a 37ºC, tres colonias de cada clon se inocularon en 3 μl de caldo LB que contenía 50 mg/L de kanamicina y se agitaron durante una noche a 37ºC. El DNA

5 se aisló utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep de Qiagen, y el inserto se secuenció utilizando cebadores específicos del promotor T7 y el terminador T7. Las secuencias de DNA de los plásmidos que codificaban los constructos #1-#7 se enumera como SEQ ID Nos.: 27-33 y las regiones traducidas correspondientes se enumeran como SEQ ID Nos.: 34-40.

10 Tabla 6: Constructos RAGE

Constructo #

Nombre de la Forma Proteína de SEQ ID de Proteína la SEQ ID del Plásmido

1

OmpA-[RAGE (23-340)]-6His imagen117 34 imagen118 27

2

6His-(Thr)-[RAGE (24-129)] imagen119 35 imagen120 28

3

6His-(Thr)-[RAGE (24-234)] imagen121 36 imagen122 29

4

6His-(Thr)-[RAGE (24-336)] imagen123 37 imagen124 30

5

6His-(Thr)-[RAGE (130-234)] imagen125 38 imagen126 31

6

6His-(Thr)-[RAGE (130-336)] imagen127 39 imagen128 32

7

6His-(Thr)-[RAGE (235-336)] imagen129 40 imagen130 33

La cepa BL21 (DE3) de E. coli se transformó con el DNA del plásmido Constructo #1, se extendió en placas LB que contenían kanamicina (50 mg/L), y se incubó a 37ºC durante una noche. Al día siguiente, 14 frascos Fernbach, cada uno de los cuales contenía 1 L de Caldo Terrific con kanamicina (50 mg/L), se inocularon con una CFU y se pusieron

15 en agitación (a 180 rpm) en una incubadora a 37ºC. Cuando los cultivos alcanzaron una DO600 nm de 0,47, los matraces se transfirieron a una incubadora a 30ºC (manteniéndose todavía en agitación a 180 rpm) y se indujo la expresión por adición de IPTG 0,4 mM. Las células se cosecharon 4 horas después de la inducción por centrifugación (15900 g, 8 minutos, 4ºC), y la pasta de células se congeló luego a -80ºC hasta su purificación.

20 La purificación del Constructo 1 de RAGE prosiguió por descongelación en primer lugar seguida por resuspensión de un sedimento de células de ~ 20 g en 180 mL de tampón de lisis [Tris 50 mM de pH 7,6, NaCl 300 mM, 10% glicerol, 0,1% Triton X-100, MgCl2 0,5 mM, imidazol 20 mM, 1 x inhibidores de proteasas exentos de EDTA Roche, 20 U/mL de DNasa I]. Las células se lisaron por paso de la suspensión 3 veces consecutivas a través de un microfluidizador Avestin Emulsiflex a 3ºC. El lisado clarificado se cargó luego en una columna IMAC HiTrap de 5 ml (GE Healthcare,

25 17-5255-02) a 2 mL/min. La columna se lavó luego con 10 CV de tampón de lavado [Tris 50 mM de pH 7,6, NaCl 300 mM, 10% glicerol, imidazol 20 mM]. Después del paso de lavado, se eluyó RAGE en gradiente utilizando tampón de elución [Tris 50 mM de pH 7,6, NaCl 300 mM, 10% glicerol, imidazol 500 mM]. Las fracciones que contenían RAGE se agruparon y se dializaron luego contra Tris 50 mM de pH 7,6, NaCl 20 mM, 10% glicerol. El análisis por espectroscopía de masas del material purificado confirmó que el líder OmpA se había eliminado por

30 procesamiento y que el material purificado comenzaba con el residuo 23 de RAGE (es decir, la secuencia A-Q-N-...) como se esperaba.

Los plásmidos que codifican los constructos #2-#7 se transformaron por separado en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, se extendieron en placas de LB que contenían kanamicina (50 mg/L), y se incubaron a 37ºC durante una noche. Al día siguiente, se inoculó 1 L de medio TB Overnight Express Instant (Novagen) con una colonia y se agitó mediante 19 horas a 30ºC. Las células se redujeron a un sedimento por centrifugación (15900 x g, 10 minutos, 4ºC) y se congelaron luego a -80ºC. Los sedimentos (5-6 gramos cada uno) se descongelaron y se resuspendieron en 50 mL de tampón de lisis [Tris 50 mM, pH 8, NaCl 300 mM, 0,1% Triton X-100, 10% glicerol, 0,2 mg/mL de lisozima, 1 mL del cóctel inhibidor de proteasas Set III (Calbiochem), 20 U/mL de benzonasa, B-mercaptoetanol 5 mM]. Los lisados se trataron por ultrasonidos en un instrumento Vibra Cell Sonicator durante 2 minutos, seguido por centrifugación a 20 K x g durante 30 minutos. Columnas Econo-Pac 10 de Bio-Rad se llenaron con un volumen de lecho de 2 mL de resina ProBond Nickel y se equilibraron con tampón de lisis. Los lisados clarificados se pasaron 3 veces consecutivas a través de las columnas, seguido por lavado con 3 x 10 volúmenes de columna (60 mL en total) de tampón de lavado [2 x PBS, imidazol 20 mM, 10% glicerol, B-mercaptoetanol 5 mM]. Las proteínas se eluyeron de las columnas con 5 x 1 volúmenes de columna (10 mL en total) de tampón de elución [2 x PBS, imidazol 500 mM, 10% glicerol, B-mercaptoetanol 5 mM]. El material eluido se transfirió a PBS, 10% glicerol, y DTT 1 mM utilizando columnas Bio-Rad Econo-Pac 10 D.

7.2. Expresión de anticuerpos monoclonales anti-RAGE 11E6, 4E5 y 7F9

El medio utilizado para la expansión de las células de hibridoma consistía en BD Cell MAb Quantum Yield Medium (Becton Dickinson, Catálogo #220511) que contenía 10% de suero bovino fetal IgG ultrabajo (Invitrogen-catálogo #16250-078). Resumidamente, cultivos de siembra múltiples de 300 ml del linaje de células de hibridoma murino que expresaban el anticuerpo monoclonal de RAGE 11E6 se expandieron en un frasco rodante de 2 L que se mantenía en agitación en una incubadora (65 rpm, 8% CO2, 37ºC) hasta alcanzar una densidad de 1,0 x 106 células/mL. Las células se sembraron luego en 20 L de medio a una densidad de 0,06 x 106 células/mL en un BioReactor Ware de 25 L con ajustes operativos de 14 oscilaciones/minuto, un ángulo de oscilación de 6º, temperatura de 37ºC, y una velocidad de borboteo de CO2 al 8% de 0,15 Lpm. Después de 2 días, el cultivo se expandió ulteriormente por adición de medio hasta un volumen final de 24 L, dando como resultado una nueva densidad de células de 0,43 x 106 células/mL. El cultivo se cosechó 12 días después de expandirse al volumen total. Las células se separaron por centrifugación continua (Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1,7 Lpm). Después de adición de NaN3 5 mM (procedente de un stock de NaN3 1 mM (Hampton Research) al medio clarificado, utilizándose inmediatamente el material en el proceso de purificación.

El medio utilizado para la expansión de las células de hibridoma consistía en Medio BD Cell MAb Quantum Yields (Becton Dickinson-catálogo #220511 que contenía 10% de suero bovino fetal IgG ultrabajo (Invitrogen -catálogo #16350-078). Resumidamente, cultivos múltiples de siembra de 300 ml del linaje de células de hibridoma murino que expresaban el anticuerpo monoclonal de RAGE 4E5 se expandieron en un matraz rodante de sacudidas de 2L en una incubadora (65 rpm, 8% CO2, 37ºC) hasta alcanzar una densidad de 1,0x106 células/ml. Las células se sembraron luego en 5L de medio a una densidad de 0,12 x 106 células/ml en un BioReactor Wave de 25 L con ajustes operativos de 12 oscilaciones/minuto, un ángulo de oscilación de 6°, temperatura de 37 ºC, y una velocidad de borboteo de CO2 al 8% de 0,15 litros/minuto. Después de 4 días, el cultivo se expandió ulteriormente por adición de medio a un volumen final de 24 l, dando como resultado una nueva densidad de células de 0,24 x 106 células/mililitro. La tasa de oscilación se aumentó a 14 oscilaciones/minuto. El cultivo se recogió 12 días después de la expansión al volumen total. Las células se separaron por centrifugación continua (Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1,7

imagen131

temperatura ambiente y con agitación a 100 rpm. A continuación, la solución de anticuerpo se vació de los pocillos, y cada pocillo se lavó luego 3 veces con 200 μL de PBST. Se añadió luego a cada pocillo 200 μL de una dilución 1:5000 (en PBST/1% NFDM) de anticuerpo secundario conjugado [conjugado HRPO anti-ratón de burro, Jackson ImmunoResearch, catálogo #715-035-150]. Se cubrió la placa y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaba a 100 rpm. Después de esta incubación, la solución se retiró de los pocillos y cada pocillo se lavó 3 veces con 200 μL de PBST. Se añadieron a cada pocillo 100 μL de solución sustrato HRPO [Sustrato Líquido de 3,3',5',5'-tetrametilbencidina (TMB), supersensible para ELISA, Catálogo Sigma #T4444], y la placa se incubó a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, se añadieron 50 μL de H2SO4 2 M a cada pocillo para parar la reacción y se midió la A540nm de cada pocillo utilizando un lector de placas de microtitulación.

Los resultados de estos experimentos de fijación se muestras en las Figuras 6A, 6B y 6C, y en las figuras 7A, 7B y 7C. Las Figuras 6A, 6B y 6C demuestran que los residuos RAGE 24-234 no estaban implicados en la fijación de los anticuerpos monoclonales de RAGE 11E6, 4E5, o 7F9. Inversamente, como se muestra en las Figuras 7A, 7B y 7C, los residuos de RAGE 235-336 eran suficientes para la fijación de los anticuerpo monoclonales RAGE 11E6 y 4E5. El mAb de RAGE 7F9 no exhibía fijación alguna a ninguno de estos fragmentos RAGE (expresados en E. coli).

Ejemplo 8: Mapeado de epítopos

8.1. Inmovilización de los anticuerpos 11E6, 4E5 y 7F9

Aproximadamente 20 mg de resina Sepharose de flujo rápido activada con CNBr se pesaron en tres columnas de reacción compactas provistas de fritas de 35 μm. Se dejó que las resinas se hincharan en 200 μL de HCl 1 mM antes de lavarlas tres veces con 200 μL de HCl 1 mM. Las resinas se lavaron subsiguientemente tres veces con 200 μL de tampón de bicarbonato de sodio 100 mM (pH 8,3) que contenía cloruro de sodio 500 mM (tampón A). Una vez completadas, las soluciones se lavaron de las columnas de tal modo que quedaba únicamente una capa delgada de tampón en la superficie de cada resina. Aproximadamente 5,5 nanomoles de los anticuerpos estaban inmovilizados en las resinas, lo que requirió la adición de 235 μL de 7F9 (3,4 mg/mL), 500 μL de 11E6 (1,6 mg/mL), y 200 μL de 4E5 (3,75 mg/mL). Para las inmovilizaciones de los anticuerpos 7F9 y 4E5, se incluyeron también 200 μL de tampón

A. Las columnas de reacción compactas se sellaron y se dejó que se mezclaran por inversión a la temperatura ambiente durante 4 horas. Una vez completado esto, las columnas de reacción compactas se abrieron y se lavaron con tres adiciones de 200 μL de tampón A para eliminar el anticuerpo no fijado. Después del lavado, se añadieron a cada columna 200 μL de un tampón que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 8) y cloruro de sodio 500 mM (tampón B). Las columnas se sellaron de nuevo y se dejaron mezclar por inversión a la temperatura ambiente para bloquear los sitios no fijados pero activados en las resinas. Después de 2 horas, se abrieron las columnas y se lavaron en primer lugar con 200 μL de tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4) que contenía cloruro de sodio 500 mM (tampón C), seguido por 200 μL de tampón B. Este proceso se repitió dos veces más para asegurar la eliminación completa del anticuerpo no fijado y para bloquear por completo los sitios restantes de fijación en las resinas. Las resinas se lavaron luego 4 veces con 200 μL de tampón de bicarbonato de sodio 100 mM (pH 8,3) que contenía cloruro de sodio 100 mM (tampón D), antes del acoplamiento del antígeno.

8.2. Escisión proteolítica de los antígenos sRAGE expresados en E. coli y BacMam Se dejó que los antígenos sRAGE se fijaran a las columnas de anticuerpos por adición de 75 μL del antígeno expresado en E. coli a las resinas 11E6 y 4E5 y adición de 125 μL del antígeno expresado en BacMam a las resinas de 11E6, 4E5 y 7E9. Las columnas se sellaron y se dejó que las muestras se mezclaran por inversión a la temperatura ambiente durante 2 horas. Pasado este tiempo, se abrieron las columnas y se lavaron con cuatro adiciones de 200 μL de tampón D. Después de vertido concienzudo de los lavados, las resinas se resuspendieron en 200 μL de tampón D así como con las proteasas, generadas como soluciones de 0,1 mg/mL de tripsina, endoproteinasa Glu-C o quimotripsina. Las cantidades de las proteasas variaban entre los experimentos para atenuar las digestiones, pero abarcaban desde 200 a 400 veces de exceso del antígeno con respecto a la proteasa en peso. Se dejó que tuviera lugar la proteólisis a la temperatura ambiente con mezcladura por inversión durante 12 horas. Después de este tiempo, se abrieron las columnas y la solución proteolítica se lavó y se recogió para análisis ulterior. Para las muestras sometidas a digestión dual, las resinas se resuspendieron en 200 μL de tampón D y una segunda proteasa antes del paso siguiente. Para aquellas muestras no tratadas con una segunda proteasa, las columnas se sometieron a lavados individuales de 200 μL en tampón D seguido por un lavado de 200 μL en tampón A y finalmente un lavado de 200 μL en tampón D. cada lavado se retuvo por separado para análisis ulterior. Los péptidos que contenían el epítopo se eluyeron de la columna con 3 lavados individuales de 200 μL en ácido fórmico al 2%. Cada muestra de elución se retuvo por separado para análisis ulterior.

8.3. Análisis por espectrometría de masas de los péptidos que contenían epítopo

Las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Bruker Apex QE7T de Resonancia Ion-Ciclotrón con Transformada de Fourier (FT-ICR) y un espectrómetro de masas Q-STAR Pulsar I de Applied Biosystems. Para el análisis espectrométrico de masas FT-ICR, se inyectaron 8 μL de las muestras de escisión del epítopo en una columna de fase inversa Jupiter C4 (0,5 x 150 mm, tamaño de partícula 5 μm, tamaño de poro 300 Å) con un HPLC capilar Agilent Serie 1100. Las muestras se lavaron durante 5 minutos en 90% de agua con 0,1% de ácido fórmico (disolvente A)/10% acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico (disolvente B) a un caudal de 5 μL/min para desalado. Los péptidos se eluyeron en el espectrómetro de masas por cambio de la composición de la fase móvil a 5% disolvente A/95% disolvente B. Las muestras que requerían infusión directa para espectrometría de masas en tándem se inyectaron en un Microtrap de proteínas (Michrom) equilibrado en 98% de agua, 1% acetonitrilo y 1% ácido fórmico. Las muestras se lavaron con 1 mL de disolvente de equilibración antes de ser eluidas en 300 μL de 60% acetonitrilo/40% agua y 0,1% ácido fórmico. El eluyente se infundió directamente en el espectrómetro de masas FT-ICR a 2 μL/min. Para el espectrómetro de masas Pulsar Q-Star, se inyectaron entre 5 y 30 μL de la muestra en un Microtrap de proteínas (Michrom) por medio de un HPLC Agilent Serie 1100. Las muestras se lavaron en 95% disolvente A/5% disolvente B durante 1 minuto antes de elución de los péptidos fijados en el espectrómetro de masas en 5% disolvente A/95% disolvente B.

La escisión proteolítica del sRAGE expresado en E. coli fijado al anticuerpo 11E6 y elución de los péptidos que contenían el epítopo reveló la presencia de un péptido con una masa de 12204,5 Da. La selección de masas y disociación activada por colisión del estado de carga 10+ confirmaron la identidad de este péptido, que correspondía a los residuos Val229-His346 (este residuos His es debido a la adición de la etiqueta Hexa-His a la proteína sRAGE). El mapeado ulterior del epítopo utilizando proteólisis con tripsina seguida por quimotripsina revelaba la escisión de la etiqueta hexahistidina C-terminal, refinando así el epítopo a los residuos Val229-His341 (este residuo His es debido a la adición de la etiqueta Hexa-His a la proteína sRAGE). No pudo obtenerse refino ulterior alguno de este epítopo utilizando proteólisis. La escisión proteolítica ejecutada análogamente del sRAGE expresado en E. coli fijado al anticuerpo 4E5 reveló el mismo péptido de 12204,5 Da que se observaba para el epítopo del anticuerpo 11E6. Correspondientemente, la escisión del sRAGE expresado en BacMam fijado al anticuerpo 11E6 o 4E5 revelaba dos péptidos que contenían el epítopo de masas principal 10671,9 Da y 10614,0 Da. Estos péptidos coinciden con el terminal C del constructo expresado por BacMam, abarcando los residuos Val229-Gly331 y Val229-Ala330, respectivamente.

La escisión proteolítica del sRAGE expresado en BacMam fijado al anticuerpo 7F9 y elución de los péptidos que contenían el epítopo reveló especies múltiples que representaron varios péptidos solapantes. La deconvolución del espectro de masas reveló péptidos de masas 12,079.6 Da, 12,372.9 Da, 13,477.3 Da y 24,132.3 Da. Estas masas coinciden con los residuos Asn105-Arg216, Asn105-Arg218, Asn105-Arg228 y Asn105-Gly331, respectivamente, sugiriendo un epítopo mínimo que abarca los residuos Asn105-Arg216.

Estos resultados indican que los anticuerpos 11E6 y 4E5 poseen epítopos en los términos C de sRAGE expresado tanto en E. coli como en BacMam, y que el anticuerpo 7F9 reconoce un epítopo en el dominio central de sRAGE expresado en BacMam.

Ejemplo 9: Medidas por Biacore y resonancia de plasmones de superficie.

La afinidad de los tres anticuerpos monoclonales de la presente invención, es decir 7F9, 11E6 y 4E5, se midió utilizando medidas Biacore y de resonancia de plasmones de superficie.

9.1. Materiales y métodos para determinaciones de la cinética de fijación anti-RAGE

Se utilizó un instrumento Biacore 2000 para medir la cinética de fijación de mAb anti-RAGE de ratón. El formato de ensayo para el análisis de afinidad de mAb era la captura basada en Fc por los anticuerpos anti-Fc inmovilizados. Se empleó un protocolo estándar de acoplamiento de aminas para inmovilizar IgG específica de Fc por aminas primarias a la superficie de carboxi-metil (CM)-dextrano de chips sensores CM5 (Biacore). Para el estudio de los mAbs anti-RAGE de ratón, se utilizó Fc anti-ratón (Biacore, anti-ratón, BR-1005-14) como el reactivo de captura inmovilizado. Se utilizó un protocolo automático, disponible en el Biacore 2000, para inmovilizar 8000-10000 RU de reactivo de captura en la totalidad de las cuatro celdillas de flujo del chip sensor. Resumidamente, las superficies de CM-dextrano se activaron por medio de N-hidroxisuccinimida (NHS) 50 mM: 3-(N,N-dimetilamino)propil-Netilcarbodiimida (EDC) 1:1 recién preparada. A continuación, se aplicó el reactivo de captura de IgG anti-Fc (200 μg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,5) a la superficie, seguido por desactivación de la superficie y bloqueo de los sitios reactivos residuales con etanolamina 1 M (pH 8,5).

El tampón de ejecución empleado era HBS-EP+ [HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,05% surfactante P20 (Biacore)] para los mAbs anti-RAGE de ratón. Cada ciclo experimental consistía en los pasos siguientes: 1) se capturaron mAbs anti-RAGE en las celdillas de flujo 2, 3 ó 4 hasta un nivel de 50-200 R (dependiendo del antígeno). Todas las medidas se referenciaron contra la celdilla de flujo 1 que no tenía mAb anti-RAGE capturado alguno. 2) Se inyectó antígeno a la totalidad de las cuatro celdillas de flujo, 180 μL a 60 μL/min. Después de la inyección de antígeno, la disociación se monitorizó durante 600 segundos a 60 μL/min. 3) La superficie de captura anti-Fc se regeneró con glicina a pH bajo. Para las determinaciones cinéticas, las inyecciones

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10.2. Preparación del péptido Aβ soluble

Se sintetizó Aβ 1-40 (pureza > 99%) en Abbott Laboratories. Resumidamente, se indujeron BL21 (DE3) de E. coli con IPTG 1 mM y se expresaron durante 3 horas a 41ºC en una cuba de fermentación de 18 L. Se cosecharon 185 gramos de pasta de células. El péptido se expresó como cuerpos de inclusión. Las células se lisaron en tampón Tris 0,1 M que contenía 0,1% de Triton X-100. El sedimento se lavó luego tres veces con tampón Tris 50 mM y una sola vez con agua. Los lavados se desecharon y el sedimento final se resuspendió en agua y se liofilizó. El sedimento liofilizado se extrajo en 500 mL de DMSO y se diluyó a 1 L con amoníaco al 0,2% en agua. Esta muestra de 1 L se dializó contra 19 L de etanol al 10% que contenía 0,1% de amoníaco. La diálisis se continuó con exactamente 0,1% de amoníaco en agua durante un tiempo total de 5 horas a la temperatura ambiente. La muestra de 1,4 L se diluyó con 0,1% de amoníaco hasta 2 L y se aplicó a una columna HPLC de 2,5 x 25 cm PLRP-S, (Polymer Labs, Amherst, MA), equilibrada con 0,1% de amoníaco en agua. La elución se realizó con acetonitrilo que contenía 0,1% de amoníaco. Se eluyó Aβ 1-40 con un gradiente desde 10 a 30% B a lo largo de 200 minutos. El material acumulado se liofilizó. Se utilizó análisis MALDI para confirmar la identidad y pureza del material. El material se purificó como Aβ Met-1-40, marcado con N15. Estaba presente una pequeña cantidad de sulfóxido de metionina a +16 unidades másicas en la muestra. Se purificaron 138 mg en esta ejecución simple como la sal de amonio del péptido. La secuencia inversa, Aβ 40-1 (pureza > 99%), se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Los péptidos Aβ (0,01 ó 0,1 mg) se disolvieron por separado en solución salina fresca tamponada con fosfato (0,1 mL; PBS) inmediatamente antes de cada experimento fMRI-CBV. Para los estudios iniciales, se asignaron aleatoriamente los ratones a 5 grupos de tratamiento: control de PBS, Aβ 1-40 (0,01 ó 0,1 mg/ratón) o Aβ 40-1 (0,01 ó 0,1 mg/ratón), con 5 animales en cada grupo.

10.3. Preparación de los anticuerpos

Un anticuerpo de control negativo IgG y el anticuerpo anti-RAGE, 11E6 (ambos de pureza > 99%) se sintetizaron en Abbott Laboratories.

10.4. Medida de CBV utilizando fMRI

Todos los experimentos de fMRI se realizaron en un imán horizontal 7.0 T/21 cm con un inserto de gradiente de campo magnético 20 G/cm (Biospec Bruker, Billerica, MA). Los animales se anestesiaron primeramente con meditomidina (1 mg/kg, intraperitoneal; Pfizer Animal Health Exton, Pensilvania, USA) + ketamina (75 mg/kg, intraperitoneal; Fort Dodge Animal Health, Iowa, USA) y se pusieron luego en una jaula de doble bobina para animales pequeños (Insight Neuroimaging Systems, LLC, Worcester, MA), que contiene una bobina volumétrica para transmisión y una bobina de superficie para recepción. Las velocidades de respiración y las formas de onda se monitorizaron continuamente mediante un transductor de fuerza. La temperatura rectal se monitorizó y se mantuvo a 37 ± 1ºC por medio de una compresa de agua circulante regulada por retroalimentación. Todas las imágenes se obtuvieron durante la fase de luz. La interacción electromagnética de bobina a bobina estaba desacoplada activamente. Las imágenes anatómicas se adquirieron utilizando la secuencia de pulsos espín-eco de adquisición rápida con relajación mejorada (RARE) con TR = 3s, TE eficaz = 100 ms, matriz = 256 x 256, FOV = 2,56 x 2,56 cm, 9 cortes de 1,0 mm, y 4 valores medios. Se utilizó imagen eco-planar con eco de gradiente de un solo disparo (EPI) para la adquisición de imágenes fMRI-CBV con TR = 2s, TE = 13 ms, matriz = 64 x 64, FOV = 2,56 x 2,56 cm, y que daba una resolución en el plano = 400 μm x 400 μm. Se administraron por vía intravenosa 10 mg de agente de

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Para la cadena pesada VH 11E6.2-GL, uno o más de los residuos de interfaz Vernier y VH/VL siguientes se someten a retromutación como sigue: V2→I, V68→F, M70→F, R72→L, Y95→F.

Para la cadena ligera VL 11E6.1-GL, uno o más de los residuos de interfaz Vernier y VH/VL siguientes se someten a 5 retromutación como sigue: A43→S, Y49→F, Y87→F.

Para la cadena ligera VL 11E6.2-GL, uno o más de los residuos de interfaz Vernier y VH/VL siguientes se someten a retromutación como sigue: A43→S, Y49→F, 158→V, Y87→F.

10 Mutaciones adicionales incluyen las siguientes: Para la cadena pesada VH 11E6.1-GL, Q1→E, y para VH 11E6.2-GL, Q1→E, I76→T, R85→S, D89→E; Para la cadena ligera

15 VL 11E6.1-GL, V11→L, y VL 11E6.2-GL, V13→L, E70→D.

EJEMPLO 13: Construcción y expresión de anticuerpos anti-RAGE recombinantes humanizados

20 Vectores de expresión pHybE que alojaban cadenas pesadas y ligeras que contenían retromutaciones en marco se co-transfectaron en células 293-6E para producir transitoriamente anticuerpos humanizados de longitud total. Se introdujeron mutaciones en las secuencias de anticuerpos injertadas en CDR conforme al Ejemplo 11, por síntesis de novo del dominio variable y/o utilizando cebadores mutágenos y PCR, y métodos bien conocidos en la técnica.

25 Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos humanizados se exponen en la Tabla 8.

Tabla 8: Expresión de anticuerpos humanizados

SEQ ID No.

Región proteínica Secuencia

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imagen136 123456789012345678901234567890

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VH h11E6.1 imagen137

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VL h11E6.1 imagen138

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VH h11E6.2 imagen139

SEQ ID No.

Región proteínica Secuencia

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VL h11E6.2 imagen143

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VH h11E6.3 imagen144

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VL h11E6.3 imagen145

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VH h11E6.4 imagen146

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VL h11E6.4 imagen147

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VH h11E6.5 imagen148

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VL h11E6.5 imagen149

SEQ ID No.

Región proteínica Secuencia

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VH h11E6.6 imagen150

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VL h11E6.6 imagen151

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VH h11E6.7 imagen152

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VH h11E6.8 imagen154

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VL h11E6.8 imagen155

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VH h11E6.9 imagen156

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VL h11E6.9 imagen157

SEQ ID No.

Región proteínica Secuencia

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VH h11E6.10 imagen161

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VH h11E6.11 imagen163

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SEQ ID No.

Región proteínica Secuencia

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VH h11E6.16 imagen176

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VL h11E6.16 imagen177

Específicamente, para las cadenas pesadas: VH h11E6.1, VH h11E6.2, VH h11E6.3, y VH h11E6.4 contienen VH 11E6.1-GL, con una mutación Q1→E.

VH h11E6.5, VH h11E6.6, VH h11E6.7 y VH h11E6.8 contienen VH 11E6.1-GL, con una mutación Q1→E y las retromutaciones Vernier y VH/VL en los residuos de interfaz: V2→I y Y95→F. VH h11E6.9, VH h11E6.10, VH h11E6.11, y VH h11E6.12 contienen VH 11E6.2-GL, con una mutación Q1→E, I76→T, R85→S, y D89→E.

5 VH h11E6.13, VH h11E6.14, VH h11E6.15, y VH h11E6.16 contienen VH 11E6.2-GL, con una mutación Q1→E, I76→T, R85→S, D89→E y las siguientes retromutaciones en los residuos de interfaz Vernier y VH/VL: V2→I, V68→F, M70→F, R72→L, y Y95→F.

Para las cadenas ligeras:

10 VL h11E6.1, VL h11E6.5, VL h11E6.9, y VL h11E6.13 contienen VL 11E6.1-GL con una mutación V11→L.0 VL h11E6.2, VL h11E6.6, VL h11E6.10, y VL h11E6.14 contienen VL 11E6.1-GL con una mutación V11→L y las retromutaciones siguientes en los residuos de interfaz Vernier y VH/VL: A43→S, Y49→F, y Y87→F. VL h1E6.3, VL h11E6.7, VL h11E6.11, y VL h11E6.15 contienen VL 11E6.2-GL con mutaciones V13→L y E70→D

15 VL h11E6.4, VL h11E6.8, VL h11E6.12, y VL h11E6.16 contienen VL 11E6.2-GL con mutaciones V13→L y E70→D y las siguientes retromutaciones en los residuos de interfaz Vernier y VH/VL: A43→S, Y49→F, I58→V, y V87→F.

EJEMPLO 14: Caracterización de los anticuerpos humanizados 11E6 utilizando ELISA de competición

20 Placas ELISA (Costar 3369) se recubrieron durante una noche a 4ºC con 50 μL/pocillo de 2 μg/mL de hRAGE (1331) en tampón carbonato-bicarbonato de sodio 0,2 M, pH 9,4, lavado con Tampón de lavado (PBS que contenía 0,1% de Tween 20), y se bloquearon durante 1 hora a la temperatura ambiente con 200 μL/pocillo de leche en polvo desnatada al 2% en PBS. Después de lavar con Tampón de Lavado se añadió por duplicado una mixtura de un

25 m11E6 biotinilado (concentración final 0,3 μg/mL) y anticuerpo de test competidor sin marcar que comenzó a 81 μg/mL de concentración final y diluyendo serialmente 3 veces) en 50 μL/pocillo de tampón ELISA. Después de incubación de las placas durante 1 hora a la temperatura ambiente, y lavado con Tampón de Lavado, los anticuerpos fijados se detectaron utilizando 100 μL/pocillo de dilución 1:10.000 de estreptavidina conjugada con HRP (Fitzgerald) en tampón ELISA. Después de incubación durante 1 hora a la temperatura ambiente, y lavado con

30 Tampón de Lavado, se realizó el desarrollo del color por adición de 100 μL/pocillo de tampón TMB (Zymed). Después de incubación durante 15 min a la temperatura ambiente, se paró el desarrollo del color por adición de 50 μL/pocillo de ácido clorhídrico 1 N. La absorbancia se leyó a 490 nm. La Tabla 9 muestra los valores CI50 de anticuerpos 11E6 humanizados obtenidos utilizando el software de computadora Graphpad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

35 Tabla 9: Valores CI50 de anticuerpos 11E6 humanizados en un ELISA competitivo

Anticuerpo

IC50 (nM) Anticuerpo IC50 (nM)

h11E6.1

19.7 h11E6.9 17.9

h11E6.2

N/A h11E6.10 N/A

h11E6.3

18.8 h11E6.11 19.9

Anticuerpo

IC50 (nM) Anticuerpo IC50 (nM)

h11E6.4

14.1 h11E6.12 11.3

h11E6.5

16.1 h11E6.13 16.8

h11E6.6

N/A h11E6.14 N/A

h11E6.7

15.5 h11E6.15 14.0

h11E6.8

10.8 h11E6.16 9.2

Ejemplo 15: Determinación de las constantes de fijación para la interacción de mAb antiRAGE con RAGE

5 Se utilizaron instrumentos Biacore 2000 y Biacore T100 para medir las cinéticas de fijación de mAb anti-RAGE. El formato de ensayo para el análisis de afinidad de mAb era la captura basada en Fc por anticuerpos anti-Fc inmovilizados. Se empleó un protocolo estándar de acoplamiento de amina para inmovilizar IgG específica de Fc por aminas primarias a la superficie de carboxi-metil (CM-dextrano de chips y sensores CM5 (Biacore). Para el estudio de los mAbs anti-RAGE de ratón, se utilizó Fc anti-ratón (Biacore, BR-1005-14 anti-ratón) como el reactivo de

10 captura inmovilizado y para el estudio de mAbs anti-RAGE humanizados, se utilizó Fc anti-humano (Pierce 31125) como reactivo de captura inmovilizado. Un protocolo automático, disponible en los equipos Biacore 2000 y Biacore T100, se utilizó para inmovilizar 8000-10.000 RU de reactivo de captura en las 4 celdillas de flujo del chip sensor. Resumidamente, las superficies de CM-dextrano se activaron por medio de N-hidroxisuccinimida (NHS) 50 mM 3(N,N-dimetilamino)-propil-N-etilcarbodiimida (EDC) 200 mM 1:1. A continuación se aplicó el reactivo de captura de

15 IgG anti-Fc (20 μg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,5) a la superficie, seguido por desactivación de la superficie y bloqueo de los sitios reactivos residuales con etanolamina 1 M (pH 8,5).

El tampón de ejecución empleado era PBS-P [1 x PBS (Sigma P3813), pH 7,4, 0,005% surfactante P20 (Biacore)] para los anticuerpos humanizados. Cada ciclo experimental se componía de los pasos siguientes: 1) los mAbs anti20 RAGE se capturaron en las celdillas de flujo 2, 3 ó 4 hasta un nivel de 50-200 RU (dependiendo del antígeno). Todas las medidas se utilizaron como referencia contra la celdilla de flujo 1 que no tenía mAb anti-RAGE alguno capturado. 2) se inyectó antígeno a través de las 4 celdillas de flujo, 240 μL a 80 μL/min. Después de la inyección de antígeno, la disociación se monitorizó durante 600 segundos a 80 μL/min. 3) La superficie de captura anti-Fc se regeneró con glicina de pH bajo. Para las determinaciones cinéticas, las inyecciones de antígeno eran una serie de diluciones al

25 triple desde 30 nM a 0,12 nM (para sRAGE [RAGE (1-331)] y tampón solo en duplicados aleatorizados.

Los datos se procesaron utilizando software de evaluación Biacore o software Scrubber 2,0 (BioLogic Software). Resumidamente, los datos se referenciaron doblemente, sustrayendo en primer lugar la señal de la celdilla de referencia y sustrayendo en segundo lugar la señal de las inyecciones de tampón solo. Los datos de doble

30 referencia para la serie de inyecciones de RAGE se ajustaron luego globalmente a un modelo de fijación 1:1 (Langmuir), que incluía un término de transferencia de masa, para determinar las constantes cinéticas de velocidad de fijación, ka y kd, y la afinidad, y kD (ka = kon; kd = koff).

Tabla 10: Datos Biacore

11E6 mAb

kon (M-1 s -1) koff (s-1) KD (pM) Desv. estándar del Residuo

h11E6.8

2.5E+07 8.4E-04 33 1,6

h11E6.12

2.0E+07 1.7E-03 83 1,8

h11E6.16

2.8E+07 1.4E-03 50 1,9

mouse 11E6

1.8E+07 1.3E-03 68 1,4

Los valores KD son pM de dos dígitos para la totalidad de los tres mAbs, y no parece existir una distinción 5 significativa entre los tres mAbs en lo que respecta a sus cinéticas de fijación.

En un experimento concurrente, se evaluó el mAb 11E6 original de ratón con su antígeno (sRAGE humano 1-331, V#400) y era también pM KD de dos dígitos.

10 Se había comunicado previamente que el mAb 11E6 original de ratón era 290 pM. Sin embargo, dichos experimentos iniciales utilizaron un sistema patrón diferente (tampón Biacore HBS-EP+: HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,05% P20). El tampón de elución puede, por supuesto, afectar a la cinética.

Ejemplo 16: Estudios de volumen de sangre cerebrovascular (CBV) en vivo en ratones Tg2576 viejos

15

16.1. Animales

El modelo de ratón Tg2576 de la enfermedad de Alzheimer (Hsiao et al., 1996) expresa la mutación Sueca de APP (APPK670N, M671L) a nivel elevado bajo control del promotor de la proteína priónica de hámster (PrP). Está

20 perfectamente establecido que esta mutación causa aumentos concomitantes en Ab42 y Ab40 secretados. A medida que los ratones Tg2576 envejecen, aparecen placas que son similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer. Adicionalmente, los ratones Tg2576 desarrollan déficits de comportamiento dependientes de la edad como se evalúa por los tests del laberinto Y, laberinto T, y el laberinto de agua Morris (Hsiao et al. (1996), (Hsiao et al. (1996) Correlative memory deficits, Ab elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274:99 -102.)

25

16.2. Preparación de anticuerpos

Un anticuerpo de control IgG negativo y el anticuerpo anti-RAGE, 11E6 (ambos de pureza superior a 99%), se sintetizaron en Abbott Laboratories.

30

16.3. Medida de CBV utilizando fMRI

Se realizaron experimentos fMRI-CBV en un imán horizontal 7.0 T/21 cm con una inserción de gradiente de campo magnético de 20 G/cm (Biospec Bruker, Billerica, MA). Ratones Tg2576 viejos (de 19-20 meses de edad) se 35 anestesiaron primeramente con meditomidina (1 mg/kg, i.p.; Pfizer Health, Exton, Pensilvania, USA) + ketamina (75 mg/kg, i.p.; Fort Dodge Animal Health, Iowa, USA) y se pusieron luego en una jaula de doble bobina para animales

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Los resultados se muestran en la Figura 10 adjunta. Los datos de los autores extienden los resultados obtenidos por Deane (Deane et al., 2003) demostrando que los anticuerpos anti-RAGE policlonales que están direccionados a una diversidad de epítopos dentro de RAGE pueden mejorar la perfusión de sangre cerebral en los ratones APP transgénicos. Los datos de los autores demuestran por primera vez que un anticuerpo monoclonal 11E6 direccionado al dominio C2 dentro de RAGE aumenta la perfusión de sangre cerebral en ratones APP transgénicos. Este efecto está mediado probablemente por fijación de competición de alto nivel de Aβ a RAGE. Niveles altos de Aβ existen en el cerebro y el plasma debido a la sobreexpresión de APP humano. El tratamiento de pacientes de AD con 11E6 puede aumentar por tanto la perfusión cerebral en estos pacientes que conduce potencialmente a mejora de las funciones neuronales. Al mismo tiempo, el tratamiento de los pacientes podría monitorizarse potencialmente siguiendo el flujo de sangre cerebral durante el tratamiento.

Ejemplo 17: Protección de las neuronas del hipocampo contra la escisión de dinamina inducida por Aβ por el anticuerpo 11E6

17.1. Cultivo de neuronas del hipocampo

Se prepararon neuronas de hipocampo de rata conforme a la bibliografía (Goslin y Banker, (1991) Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. En: Banker G and Goslin K (ed). Culturing Nerve Cells, MIT Press, Cambridge), con ligera modificación. Resumidamente, los hipocampos de ratas embrionarias de 19 días de edad se disecaron y se liberaron de las meninges. Se obtuvieron neuronas de hipocampo por tripsilación de tejido (0,1% tripsina/17-20 min/37ºC) seguido por trituración con pipetas Pasteur pulimentadas a la llama. Las neuronas del hipocampo se extendieron a una densidad de 0,2-1,0 por 105 células en placas de 6 pocillos o 24 pocillos recubiertas con poli-Dlisina (placa BiocoatTM; BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) utilizando 0,5-3 ml de medio de cultivo exento de suero (medio Neurobasal, suplemento B27, L-glutamina 2 mM; 1% penicilina-estreptomicina; Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las células se cultivaron a 37ºC, 5% de CO2 durante al menos dos1 días y se intercambió una tercera parte del medio una vez por semana.

17.2. Escisión de dinamina inducida por Aβ

Se agregó Aβ conforme a la bibliografía (Kelly, B. L., y Ferreira, A. (2006) JBiol Chem 281(38), 28079-28089; Kelly,

B. L., Vassar, R., y Ferreira, A. (2005) JBiol Chem 280(36), 31746-31753) con modificaciones ligeras. Resumidamente, Aβ 1-40 (American Peptide, Sunnyvale, CA) en medio de cultivo exento de suero a 0,1 mg/mL y se incubó durante 4 d a 37ºC. Se incubaron anticuerpos monoclonales anti-RAGE 11E6, un anticuerpo de control monoclonal isotipo IgG 1 dirigido contra KLH (Hemocianina de Lapa Bocallave de Megathura crenulata, Abbott) o PBS con el Aβ agregado durante 1 hora a 25ºC bajo agitación constante en un volumen final de 225 μL-1 mL. Las mixturas se añadieron al medio de cultivo dando como resultado una concentración final de Aβ 5 μM (calculado como monómero y anticuerpo 2 μM, respectivamente. Cada tratamiento se realizó por triplicado y se incluyeron pocillos sin adición de Aβ o anticuerpos como controles adicionales. Las células se cultivaron durante 24 horas más y se inspeccionaron brevemente por microscopía óptica antes de su procesamiento para transferencia Western. El tratamiento con Aβ no inducía muerte neuronal manifiesta durante el periodo de incubación.

17.3. Transferencia Western, cuantificación de la escisión de dinamina, y análisis estadísticos

Se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron con PBS una sola vez. Las células se lisaron por adición de tampón frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM; 1% NP-40; 1% Triton X-100; EDTA 2 mM) que contenía cócteles inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche, Mannheim, Alemania). Las células se rascaron y el homogeneizado se centrifugó a 13.000 g a 4ºC durante 5 min. Se retiró el sobrenadante y la concentración total de proteínas se determinó por el método de Bradford utilizando un kit comercial (Bio-Rad, Munich, Alemania). La proteína se diluyó a 1 μg/μL en tampón de carga (Bio-Rad, Munich, Alemania), y se hirvió durante 5 min. Se ejecutaron 25 μg de cada muestra en una SDS-PAGE 4-20% (Invitrogen, Karlsruhe Alemania) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema iBlot (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Alternativamente, las células se lisaron directamente en placas de 96 pocillos, se diluyeron con tampón de carga, y se cargó ¼ a 1/5 de la proteína en SDS-PAGE. Las membranas se bloquearon a la temperatura ambiente durante 1-2 h utilizando 1 x Reactivo de Bloqueo (Roche, Mannheim, Alemania) y se incubaron luego con anticuerpos primarios contra dinamina I (PA-1-660; dilución 1:1000; Affinity BioReagents, Golden, Co) a 4ºC durante una noche. Subsiguientemente, se aplicó un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano picante (IgG anti-conejo de cabra, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a las transferencias a la temperatura ambiente durante 1 hora y se detectó utilizando quimioluminiscencia intensificada (Sustrato Quimioluminiscente SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, I1). Las señales de inmunotransferencia se visualizaron por un sistema VersaDoc (Bio-Rad, Munich, Alemania) y la señal de dinamina I intacta (~ 100 kDa) se cuantificó utilizando software Quantity One (Bio-Rad, Munich, Alemania). Para normalización, las transferencias se sometieron a separación ("stripping") (Tampón de Separación de Materias Volátiles Restore Western Blot, Pierce, Rockford, I1) durante 30 min a 37ºC, se lavaron en PBS, y se re-sondaron con un anticuerpo primario dirigido contra tubulina βIII (TuJ-I, dilución 1:1000, Abcam, Cambridge, MA), y anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de burro, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). El valor medio de la expresión normalizada de dinamina I de las células no tratadas con Aβ se ajustó a 100%. Los datos porcentuales de tres experimentos separados se analizaron respecto a significación estadística por un ANOVA de una sola vía (test de Kruskal-Wallis) seguido por el test de Dunn (GrafpadPrismTM; Software GraphPad, San Diego, CA).

17.4. El anticuerpo 11E6 anti-RAGE protege las neuronas del hipocampo contra la escisión de dinamina inducida por αB

Se ha demostrado recientemente que Aβ 1-40 agregado induce la escisión de la proteína marcadora sináptica dinamina I en las neuronas del hipocampo (Kelly et al, 2005; Kelly & Ferreira, 2006). En pleno acuerdo con los datos publicados, los autores de la presente invención han observado una disminución acusada en la cantidad de dinamina I intacta (~ 100 kDa) después de incubación de neuronas del hipocampo con Aβ agregado durante 24 h y un aumento concomitante de un producto de escisión de ~ 90 kDa (Fig. 11, panel superior). La pre-incubación de Aβ con el anticuerpo anti-RAGE 11E6 evitaba la escisión a aproximadamente 70%. En contraste, un anticuerpo de control isotipo IgG 1 murino no relacionado con RAGE no proporcionaba protección alguna (Fig. 11, panel superior). El escaneo densitométrico de las muestras triplicadas, la normalización a la cantidad de una proteína de control (tubulina βIII), y el análisis de los datos de tres experimentos independientes revelaron la significación estadística del efecto protector observado (Fig. 11, panel inferior; ANOVA de una vía; p < 0,05).

Ejemplo 18: Efecto del anticuerpo 11E6 sobre la supresión de la transmisión sináptica inducida por globulómeros

18.1. Test A

Se prepararon cultivos de cortes organotípicos de hipocampo en un protocolo modificado de Stoppini et al (Journal of Neuroscience Methods, 37, ejemplar 2, abril de 1991, páginas 173-182 "A simple method for organotypic cultures of nervous tissue" L. Stoppinia, P.-A. Buchsa y D. Muller) y se cultivaron en membranas minicell-CM (Millipore, Billerica, USA) en medio rico en potasio durante 3 días y más tarde en medio neurobasal A suplementado en la interfaz líquido/gas a 34ºC/5% CO2.

Se prepararon cultivos de corte de hipocampo de rata procedentes de ratas Wistar de 9 días y se utilizaron al cabo de 15-16 días en vitro. Los cultivos de corte se incubaron durante una noche con

-

1 μM de globulómero 1-42,

-

11E6 0,1 μM (mAb de RAGE ML39-11E6 purificación #4194, muestra #6116) + globulómero 1-42 1 μM

-

control (ultrafiltrado de globulómero + SDS).

En el grupo de co-incubación, el anticuerpo se aplicó al medio de cultivo de corte 2 horas antes del globulómero. Se realizaron los registros en una cámara de registro de interfaz bajo perfusión continua con fluido cerebroespinal artificial. Los potenciales postsinápticos de excitación de campo se registraron a partir de la región CA1 después de estimulación de la colateral de Schaffer con pulsos bifásicos a intensidades de voltaje diferentes. La colateral de Schaffer se estimuló con pulsos bifásicos (0,1 ms/fase) utilizando un electrodo bipolar de wolframio 0,5 M (WPI; Salaosta, USA), y se registraron las amplitudes fEPSP con electrodos de vidrio llenos con aCSF (0,7-1,1 Megaohm, GC150F-15, Harvard Apparatus, Hugstetten, Alemania). Las señales se digitalizaron utilizando un instrumento de potencia CED1401 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, Reino Unido) y se analizaron utilizando Signal

2.14 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, Reino Unido).

Los resultados se muestran en la Figura 12A. La aplicación de globulómeros reprimía fuertemente la transmisión sináptica. La co-aplicación de 11E6 0,1 μM invertía completamente los déficits inducidos por los globulómeros. Así pues, 11E6 puede invertir los déficits de la transmisión sináptica inducidos por los globulómeros.

18.2. Test B

Se prepararon cultivos de cortes de hipocampo de rata procedentes de ratas Wistar de 9 días y se utilizaron al cabo de 16-18 días en vitro. Los cultivos de corte se incubaron durante una noche con:

-globulómero 1-42 1 μM -mAb IgG1 H35C206 (KLH) 0,1 μM + globulómero 1-42 1 μM -control (SDS).

Los registros se realizaron (en fluido cerebroespinal artificial) desde CA1 después de estimulación de la colateral de Schaffer a intensidades diferentes.

Los resultados se muestran en la Figura 12B. La aplicación de globulómeros reprimía fuertemente la transmisión sináptica. La co-aplicación de IgG 1 no invertía los déficits inducidos por globulómeros. Por tanto, el anticuerpo de control IgG no invierte los déficits inducidos por globulómero en la transmisión sináptica a 0,1 μM.

Ejemplo 19: Análisis en situ del efecto del anticuerpo 11E6 sobre las placas de amiloide en el córtex frontal de los ratones Tg2576

Para estos experimentos, se utilizaron ratones Tg2576 de 14,5 meses (Hsiao et al., 1996, Science; 274 (5284), 99102). Los ratones sobreexpresan APP humano con la denominada mutación sueca (K670N/N671L) y formaban depósitos de amiloide β en el parénquima cerebral a aproximadamente los 11 meses. Comenzando a los 12 meses, los ratones se inyectaron con 500 μg de 11E6 (n = 19) i.p. (intraperitoneal) o un anticuerpo de control IgG 1 (n = 19) una vez por semana durante 12 semanas. Después de la última inyección, los animales se anestesiaron profundamente y se sometieron a perfusión transcardial con solución salina tamponada con fosfato 0,1 M (PBS) para lavar la sangre. Después de ello se separó el cerebro del cráneo y se dividió longitudinalmente. Un hemisferio del cerebro se congeló bruscamente, y el otro se fijó por inversión en paraformaldehído al 4%. El hemisferio fijado por inversión se sometió a crioprotección por impregnación en sacarosa al 30% en PBS y se montó en un microtubo de congelación. El telencéfalo entero se cortó en secciones de 40 μM que se recogieron en PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio Superfrost® Plus (Menzel Glaeser, Braunschweig, Alemania), para el procedimiento de tinción subsiguiente. La tinción de placas de amiloide que contenían Aβ se realizó con el anticuerpo monoclonal de ratón 6G1 producido contra Aβ monómero (Barghorn et al., 2005, J. Neurochem, en un dispositivo de tinción automático (Ventana Discovery®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), conforme al protocolo siguiente:

-

las secciones en los portaobjetos de vidrio se secaron completamente al aire y se transfirieron a la máquina

Ventana;

-

se utilizó un protocolo automático proporcionado por Ventana para el procedimiento cromogénico de

diaminobencidina (DAB), que incluía pasos de lavado y bloqueo y tinción con el Kit DAB Map TM; se

incluyeron en el protocolo automático por el experimentador recuperación del antígeno e inmunohistoquímica

primaria y secundaria;

-

se obtuvo la recuperación de antígeno en presencia de acondicionador #2, (tampón basado en citrato, pH

6,0) a 95ºC durante 45 minutos;

-

incubación con 6G1 (1:500) en diluyente de anticuerpos (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) a

37ºC durante 3 horas;

-

incubación con el anticuerpo secundario biotinilado IgG anti-ratón de burro (1:500; Jackson ImmunoResearch,

Newmarket, Reino Unido) a 37ºC durante 30 minutos;

-

después de la finalización de la tinción automática, se lavaron los portaobjetos en agua normal, se

deshidrataron en etanol graduado, se aclararon en XTRA-Solve® (J.T. Baker, Griesheim, Alemania), y se

cubrieron con UltraKitt® (J.T. Baker, Griesheim, Alemania).

La tinción de las placas se cuantificó en tres secciones histológicas del neocortex utilizando el sistema de análisis de imágenes ImagePro 5.0. El experimentador desconocía el tratamiento del ratón objeto de análisis y determinó los parámetros siguientes: área del neocortex, área cubierta con tinción positiva de 6G1 y número de placas teñidas. Estos parámetros eran variables y no estaban distribuidos normalmente. Por tanto, se evaluó estadísticamente una

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Claims (1)

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