ES2562832T3

ES2562832T3 - Anticuerpos monoclonales contra la proteína RGM para su uso en el tratamiento de la degeneración de la capa de fibra nerviosa de la retina

Info

Publication number: ES2562832T3
Application number: ES10794938.0T
Authority: ES
Inventors: Bernhard K. MÜLLER
Original assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG
Current assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG
Priority date: 2009-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2016-03-08
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: US20160075773A1; BR112012013734A2; EP2510001B1; ECSP12012029A; DK2510001T3; JP2013512942A; IL219766A0; CA2780069C; PL2510001T3; US9175075B2; SG181563A1; KR20120118002A; US20110135664A1; JP2019059731A; EP2510001A1; JP2023075266A; US20170114129A1; AU2010329955A1; MX2012006560A; CA2780069A1

Abstract

Una proteína de unión a la Molécula de Orientación Repulsiva humana (RGM A) para su uso en el tratamiento de la degeneración la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR).

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos monoclonales contra la protefna RGM para su uso en el tratamiento de la degeneracion de la capa de fibra nerviosa de la retina.

Campo de la invencion

La presente solicitud describe protefnas de union a RGM, concretamente anticuerpos monoclonales, y, en particular versiones humanizadas, injertadas con CDR, de las mismas, que tienen la capacidad de unirse a RGM A y evitar la union de las protefnas RGM al receptor de RGM A y otras protefnas de union a RGM, y por lo tanto, neutralizar la funcion de RGM A, para su uso en el tratamiento de la degeneracion de la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR), asf como metodos para tratar terapeutica o profilacticamente un mamffero contra la degeneracion de la CFNR.

Antecedentes de la invencion

La regeneracion axonal despues de la lesion, los ataques inflamatorios, o las enfermedades neurodegenerativas dentro del sistema nervioso central de los mamfferos (SNC) es casi siempre imposible; el resultado depende del equilibrio entre la capacidad intrfnseca de las fibras nerviosas del SNC para volver a crecer, y los factores inhibidores en el SNC, localizados en el microentorno de la zona de la lesion o dano, que impiden activamente el re-crecimiento, y por lo tanto, la regeneracion de los tractos de fibras lesionadas.

Se ha establecido que la mielina del SNC, generada por los oligodendrocitos, y la cicatriz lesional son las estructuras no permisivas mas relevantes para el crecimiento axonal en la fase temprana de una lesion, al causar el colapso del cono de crecimiento y la inhibicion del crecimiento de neuritas in vitro, asf como en vivo, lo que da como resultado la inhibicion directa de la regeneracion del axon. Se han identificado las protefnas RGM, los principales factores inhibitorios de la mielina del SNC y el tejido de la cicatriz (Monnier et al., Nature 419: 392-395, 2002; Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-1576, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173: 47-58, 2006; para las revisiones veanse: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-1529, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). Las protefnas RGM son reguladas al alza en los sitios de dano o lesion en los seres humanos que mueren por trauma cerebral o ataque isquemico, (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) y estan reguladas al alza en los sitios de lesion en ratas con lesion de la medula espinal (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006 para una revision veanse: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-1529, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). Ademas, los primeros datos utilizando muestras clfnicas de pacientes con esclerosis multiple y de personas sanas sugirieron que la RGM A humana esta regulada al alza en el lfquido cefalorraqufdeo de pacientes que padecen ES (datos no mostrados).

Para evaluar el potencial de promocion de la regeneracion de un anticuerpo policlonal especffico de RGM A, los anticuerpos se administraron en un modelo de lesion moderada a grave de la medula espinal, donde se secciona aproximadamente 60% de la medula espinal a nivel toracico 9/10. El examen histologico revelo que tal lesion cortaba todas las fibras dorsales y laterales del tracto corticoespinal. El anticuerpo especffico de RGM A administrado a nivel local a traves de una bomba durante dos semanas induce la regeneracion a larga distancia de las fibras nerviosas danadas (Hata et al., J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006).

Cientos de fibras nerviosas se extendfan mas alla del sitio de la lesion y las fibras mas largas se regeneraban mas de 10 mm mas alla de la lesion, mientras que no se encontraron fibras en regeneracion lejos de la lesion en los animales tratados con anticuerpo de control. La recuperacion funcional de las ratas tratadas con anti-RGM mejoro significativamente en comparacion con las ratas con la medula espinal danada, tradadas con anticuerpo de control, demostrando con ello que RGM A es un potente inhibidor de la neuroregeneracion y un objetivo valioso para estimular la recuperacion en indicaciones que se caracterizan por dano axonal o lesion de fibras nerviosas (Hata et al., J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006; Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007). Ademas la neutralizacion de la protefna RGM A con un anticuerpo policlonal de bloqueo de funcion estimulo no solo el nuevo crecimiento de las fibras nerviosas danadas en las ratas con lesion de la medula espinal si no que mejoro su formacion de sinapsis permitiendo de este modo la nueva formacion o la restauracion de los circuitos neuronales danados (Kyoto et al. Brain Res.1186: 74-86, 2007).

La familia de genes rgm abarca tres genes diferentes, dos de ellos, rgm a y b, se expresan en el SNC de mamfferos originando las protefnas RGM A y RGM B, mientras que el tercer miembro, rgm c, se expresa en la periferia (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361:1513-1529, 2006), donde RGM C juega un papel importante en el metabolismo del hierro. In vitro, RGM A inhibe el crecimiento de neuritas mediante la union a Neogenina, que ha sido identificada como un receptor de RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). La neogenina habfa sido descrita por primera vez como una protefna de union a netrina (Keino-Masu et al. Cell, 87(2): 175-85, 1996). Este es un hallazgo importante ya que se ha referido que la union de Netrina-1 a Neogenina o a su receptor

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estrechamente relacionado DCC (suprimido en el cancer colorrectal) estimula en lugar de inhibir el crecimiento de las neuritas (Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2.000). Por lo tanto, el bloqueo de RGM A libera la inhibicion del crecimiento mediada por RGM permitiendo que la Neogenina se una a su ligando estimulador del crecimiento de neuritas Netrina. Basandose en estas observaciones, se puede suponer que la neutralizacion de RGM A es superior a la neutralizacion de Neogenina en modelos de lesion de la medula espinal humana. Ademas de la union de RGM A a Neogenina y de la induccion de la inhibicion del crecimiento de neuritas, la union de RGM A o B a las protefnas morfogeneticas del hueso BMP-2 y BMP-4 podrfa representar otro obstaculo para la neuroregeneracion satisfactoria y la recuperacion funcional (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361:1513-1529, 2006).

La CFNR es la capa mas interna de la retina y se compone principalmente de los axones de las neuronas de las celulas ganglionares que componen el nervio optico. Los axones dentro de la CFNR no estan mielinizados hasta que pasan a traves de la lamina cribosa del ojo. Esta caracterfstica estructural de la CFNR hace que sea un tejido ideal para examinar los procesos neurodegenerativos en el SNC debido a que el espesor de la CFNR refleja la contribucion de los axones sin potenciales efectos estructurales de la degeneracion de la mielina (Frohman et al., Arch. Neurol. 65(1): 26-35, 2008) (Vease, tambien la Figura 19).

Frisen, L. y Hoyl, W.F. informaron por primera vez del adelgazamiento de la CFNR en pacientes con Esclerosis Multiple (EM) (Frisen, L. y Hoyl, W. F., Arch. Opthalmol. 92:91-97, 1974).

En individuos sanos, la CFNR tiene solo aproximadamente de 110 a 120 m de espesor a la edad de 15 anos y la mayorfa de los individuos normales perderan aproximadamente 0,017% por ano en el espesor de la retina lo que equivale a aproximadamente 10 a 20 micras a lo largo de 60 anos (Kanamori. A. et al., Ophthalmologica 217: 273278, 2003). Contrariamente a esto aproximadamente 75% de los pacientes con EM que habfan experimentado la neuritis optica aguda (NOA) mostraron una perdida de espesor de 10 a 40 micras en la CFNR en un plazo de solo aproximadamente 3-6 meses despues del evento inflamatorio inicial. Tambien se informa de que el adelgazamiento de la CFNR por debajo de un nivel de aproximadamente 75 micras causa un deterioro de la funcion visual (Costello, et al., Ann. Neurol. 59: 963-969, 2006). La utilidad potencial de la CFNR con el proposito de modelar la neuroproteccion en respuesta a las terapias de la EM fue sugerida por Frohman et al., que tambien describen la tomograffa de coherencia optica (TCO) como una tecnica de formacion de imagenes reproducible que permite mediciones de espesor de la CFNR (Frohman et al., vease mas arriba; y Frohman et al; Nature Clinical Practice Neurology 4: 12, 664-675, 2008).

La degeneracion de la CFNR se observa tambien durante el transcurso de muchas otras enfermedades como; retinopatfa diabetica, neuropatfa optica isquemica, retinosquisis ligada al cromosoma X, neuropatfa optica inducida por farmacos, distrofia retiniana, degeneracion macular relacionada con la edad, enfermedades oculares caracterizadas drusen en la cabeza del nervio optico, enfermedades oculares caracterizadas por determinantes geneticos de la degeneracion de los fotorreceptores, distrofia de conos-varillas autosomica recesiva, trastornos mitocondriales con neuropatfa optica, ataxia de Friedreich i.p., enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve (DCL) por enfermedad Parkinson, y enfermedades Prionicas, Creutzfeld-Jacob i.p. Scrapie, Encefalopatfa Espongiforme Bovina (vease tambien Sakata LM, et al. Clin. Experiment Ophtalmol. 2009, 37: 90-99; Morris RW et al. Optometry 2009, 80, 83-100; Kallenbach K. y Frederiksen J. Eur. J. Neurol. 2007, 14: 841-849; Trick et al. J. Neuroophthalmol. 2006, 26: 284-295; Tantri A. et al. Surv. Ophtalmol. 49: 214-230).

Gheith Moataz E et al: "Managing refractory glaucoma with a fixed combination of bimatoprost (0,03%) y timolol (0,5%).", CLINICAL OPHTALMOLOGY (Auckland, N.Z.) Mar 2008 LNKD-PUBMED: 19668385, vol. 2, num. 1, Marzo de 2008 (2008-03), paginas 15-20, describen el tratamiento del glaucoma, una neuropatfa progresiva cronica que se caracteriza por la perdida progresiva de las celulas ganglionares de la retina que se manifiesta clfnicamente con perdida del tejido de la papila neurorretiniana del disco optico, defectos en la capa de fibras nerviosas de la retina y deficits en las pruebas de campo visual funcional. Los medicamentos disponibles incluyen antagonistas beta- adrenergicos, agonistas alfa-adrenergicos, inhibidores de anhidrasa carbonica, analogos de prostaglandina y mioticos.

El documento WO 2009/106356 A1 (ABBOTT GMBH & CO KG [DE]; ABBOTT LAB [US]; MUELLER BERNHARD K [DE]; SC) 3 de Septiembre de 2009 (3-9-2009) describe anticuerpos monoclonales que se unen a la protefna RGM A. Los anticuerpos inhiben la union de RGM A a su receptor y/o a co-receptores y se utilizan para la deteccion de RGM A y para la inhibicion de la actividad de RGM A en los trastornos humanos tales como la esclerosis multiple, el trauma cerebral en mamfferos, la lesion de la medula espinal, el accidente cerebrovascular, las enfermedades neurodegenerativas y la esquizofrenia y la induccion de la remielinizacion de axones de los nervios opticos danados, aplastados en un modelo de rata de lesion del nervio optico.

Existe la necesidad en la tecnica de un enfoque terapeutico que permite el tratamiento directo de la degeneracion de CFNR. El problema a resolver por la presente invencion era, por lo tanto, proporcionar medios que permitieran el tratamiento directa, en particular, el tratamiento neuroprotector de la degeneracion de CFNR como se observa en una multiplicidad de estados de enfermedad.

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Compendio de la invencion

Una realizacion de la invencion se refiere al tratamiento neuroprotector de la degeneracion de CFNR como se observa en una multiplicidad de estados de enfermedad utilizando anticuerpos capaces de unirse a RGM A.

Otra realizacion se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal que bloquea RGM A y evita la interaccion entre RGM A y su receptor y/o protefnas de union, es decir, Neogenina y BMP-2, BMP-4, para el tratamiento de la degeneracion de RNFL.

Otra realizacion consiste en un metodo de tratamiento de la degeneracion de CFNR, que comprende la etapa de administrar a un mamffero que lo necesita una cantidad eficaz de una composicion que comprende anticuerpos capaces de unirse a RGM A.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1A muestra los anticuerpos monoclonales que se unen a hRGM A en el ensayo ELISA.

La Figura 1B representa los anticuerpos monoclonales que se unen a hRGM A expresada en celulas HEK 293.

La Figura 1C representa los anticuerpos monoclonales que se unen a RGM A de rata expresada en celulas HEK 293.

La Figura 2 muestra la union de RGM A completa a Neogenina. El MAB 5F9 inhibe la union de hRGM A acoplada a fc, completa a Neogenina.

La Figura 3 representa la union de RGM A completa a BMP-4. El MAB 5F9 inhibe la union del fragmento de hRGM A completo acoplado a Fc (47- 422) a bMp-4.

La Figura 4 representa la union de un fragmento 0 de RGM A a BMP-4. El MAB 5F9 inhibe la union del fragmento 0 de hRGM A completo acoplado a fc (47-168) a BMP-4.

La Figura 5 muestra la union de RGM A completa a BMP-2. El MAB 5F9 inhibe la union del fragmento hRGM A completo acoplado a fc (47- 422) a BMP-2.

La Figura 6 es una combinacion de microfotograffas que muestran la neutralizacion por mAb5F9 de un fragmento de RGM A en un ensayo de crecimiento de neuritas de celulas NTera. El MAB 5F9 neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de un fragmento inhibidor de hRGM A potente, conjugado con fc en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados Ntera humanos. A. Cultivo de control, crecimiento de neuronas Ntera sobre laminina, B. sobre un sustrato de laminina-fragmento de hRGM A (47 - 168), C. - E. sobre un sustrato de laminina-fragmento de hRGM A (47 - 168) en presencia de 0,1 pg/ml de MAB 5F9 (C.), 1 pg/ml de MAB 5F9 (D.), 10 pg/ml de MAB 5F9 (E).

La Figura 7 muestra el analisis cuantitativo de los resultados del ensayo NTera 2. El MAB 5F9 neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de una manera dependiente de la dosis de un fragmento inhibidor de hRGM A potente, conjugado con fc (fragmento 0, 47 - 168) en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados Ntera humanos.

La Figura 8 muestra el analisis cuantitativo del ensayo de bandas de SH-SY5Y. El MAB 5F9 neutraliza la repulsion, inducida por las bandas que consisten en RGM A humana completa de celulas neuronales SH- sY5Y humanas en los tapices de membrana de las bandas. En ausencia de MAB 5F9 (A) o en presencia de concentraciones bajas de MAB las neuronas SH-SY5Y prefieren evitar las bandas de RGM A. Este comportamiento se invierte mediante el aumento de las concentraciones del MAB 5F9. (B a D) A la concentracion mas alta de MAB (10 pg/ml) (E), las neuronas SH-SY5Y muestran una fuerte preferencia por las bandas de RGM A en comparacion con las bandas de Colageno I.

La Figura 9 resume el analisis cuantitativo de las caracterfsticas de union de los mAB 5F9 y 8D1. Los MAB 5F9 y 8D1 se evaluan en ensayos de union de hRGM A - neogenina, hRGM A - BMP-2 y hRGM A - BMP-4 a diferentes concentraciones.

La Figura 10 muestra la actividad neutralizadora para la actividad quimiorrepulsiva de hRGM A de los anticuerpos 5F9 humanizados (h5F9.21, h5F9.23, h5F9.25) en un ensayo de quimiotaxis de SH-SY5Y.

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La Figura 11muestra la actividad in vivo neurorregenerativa in vivo de la aplicacion local de 5F9 en un modelo animal de lesion del nervio optico. La aplicacion local de MAB 5F9 neutraliza RGM A y estimula el crecimiento de regeneracion de los axones del nervio optico danado en un modelo animal de rata de aplastamiento del nervio optico. En los animales tratados con 5F9 (A), muchas de las fibras positivas para GAP-43 se extienden mas alla del sitio de aplastamiento en contraste con el MAB 8D1 de control (B), que no se une a RGM A de rata.

Las Figuras 12 A y las Figuras 12B muestran el analisis cuantitativo de la aplicacion de 5F9 local en un modelo animal de lesion del nervio optico. (A) 5F9, pero no el MAB 8D1 de control, aumento significativamente el numero de fibras positivas para GAP-43 en regeneracion. Se observaron significativamente mas fibras (p <0,05) en los animales tratados con 5F9 a distancias de 200 pm, 400 pm y 600 pm, y en 1200 pm solamente se encuentran fibras en los animales tratados con 5F9, pero no en los animales de control (B) 5F9 aumento significativamente el area positiva para GAP-43 en el sitio de la lesion del nervio optico en comparacion con el anticuerpo de 8D1 de control y el control con vehfculo PBS. El area de crecimiento regenerativo (area positiva para GAP-43) se midio usando el soporte logico Axiovision (Zeiss).

La Figura 13 muestra la actividad neurorregenerativa in vivo de aplicacion sistemica de 5F9 en un modelo animal de lesion del nervio optico. Los animales fueron tratados con 5F9 el dfa 0 y el dfa 21 con 2 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. El anticuerpo o el vehfculo se administraron por via intraperitoneal o intravenosa. Imagenes compuestas de nervios opticos de rata. En los animales tratados con 5F9 (A), muchas fibras positivas para GAP-43 se extienden mas alla del sitio de aplastamiento en contraste con los animales de control tratados con PBS (B). El sitio de aplastamiento se encuentra en el margen izquierdo y las fibras en regeneracion se tinen con un anticuerpo para GAP-43. Se observan muchas fibras en el borde superior e inferior del nervio optico en los animales tratados con 5F9 pero no en los animales con PBS.

La Figura 14A y la Figura 14B muestran el analisis cuantitativo de aplicacion sistemica de 5F9 en un modelo animal de lesion del nervio optico.

La Figura 15 muestra la actividad de remielinizacion in vivo de la aplicacion sistemica de 5F9 en un modelo animal de lesion del nervio optico. Los animales fueron tratados con 5F9 el dfa 0 y d21 con 2 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. El anticuerpo o el vehfculo se administraron por via intraperitoneal o intravenosa. Imagenes compuestas de nervios opticos de rata. La mielinizacion se visualiza usando un anticuerpo dirigido contra el marcador de mielina protefna basica de mielina MBP. Los sitios de aplastamiento se encuentran en medio de los nervios compuestos y el area esta libre en los animales de control tratados con vehfculo (A y B). En los animales tratados con 5F9 (C y D), se observan muchas estructuras positivas para MBP en la zona media (centro de aplastamiento) de los nervios opticos.

La Figura 16 muestra el efecto cuantitativo sobre la remielinizacion de la aplicacion sistemica de 5F9 en un modelo animal de lesion del nervio optico.

La Figura 17 ilustra el efecto protector superior del anticuerpo 5F9 sobre CFNR de ojos de animales con aplastamiento del nervio optico. Se observa una densidad significativamente mayor de haces de fibras nerviosas en las retinas de los animales tratados sistemicamente con 5F9.

La Figura 18 ilustra la influencia del anticuerpo 5F9 sobre las neuronas intrarretinianas de ojos de animales con aplastamiento del nervio optico. Se observa un numero significativamente mayor de brotacion de neuronas intrarretinianas en retinas de animales tratados sistemicamente con el anticuerpo 5F9.

La Figura 19 ilustra la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR), que es la capa directamente adyacente al bulbo vftreo. Esta formado por los axones de las celulas ganglionares de la retina. Las otras capas son la capa plexiforme interna (IPL), donde las neuronas amacrinas y bipolares forman contactos sinapticos con las celulas ganglionares de la retina. Los fotorreceptores, las neuronas horizontales y las neuronas bipolares hacen sinapsis en la capa plexiforme externa (OPL). Los fotorreceptores (conos y bastones) se encuentran en la capa de fotorreceptores (PRL). El RPE es el epitelio pigmentario de la retina (el esquema es de Frohman et al. Arch. Neurol. 65, 26-35, 2008).

Descripcion detallada de la invencion

1. Definicion de terminos

A menos que se definan de otro modo en la presente memoria, los terminos cientfficos y tecnicos utilizados en relacion con la presente invencion tendran los significados que son comunmente entendidos por los expertos normales en la tecnica. El significado y el alcance de los terminos deben ser claros, sin embargo, en el caso de

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cualquier ambiguedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente memoria tienen prioridad sobre cualquier diccionario o definicion extrfnseca. Adicionalmente, a menos que sea requerido por el contexto, los terminos singulares incluiran pluralidades y los terminos plurales incluiran el singular. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Ademas, el uso del termino "que incluye", asf como otras formas, tales como "incluye" y "incluido", no es limitante. Asimismo, terminos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto los elementos como los componentes que constituyen una unidad y los elementos y los componentes que comprenden mas de una subunidad a menos que se especifique lo contrario.

Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y las tecnicas de, cultivo de celulas y tejidos, biologfa molecular, inmunologfa, microbiologfa, genetica y qufmica e hibridacion de protefnas y acidos nucleicos descritos en la presente memoria son aquellos bien conocidos y comunmente utilizados en la tecnica. Los metodos y tecnicas de la presente invencion se realizan generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describen en diversas referencias generales y mas especfficas que se citan y se discuten a lo largo de la presente memoria a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimaticas y los mecanismos de purificacion se realizan de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes, comunmente realizadas en la tecnica o como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio, la qufmica analftica, la qufmica organica sintetica, y la qufmica medicinal y farmaceutica descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la tecnica. Se utilizan tecnicas convencionales para sfntesis qufmicas, analisis qufmicos, preparacion farmaceutica, formulacion, y suministro, y tratamiento de los pacientes.

Segun se utiliza en toda esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, los siguientes terminos tienen los siguientes significados:

Los terminos "aceptor" y "anticuerpo aceptor" se refieren al anticuerpo o secuencia de acido nucleico que proporciona o codifica al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o 100% de las secuencias de aminoacidos de una o mas de las regiones marco. En algunas realizaciones, el termino "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoacidos o de acido nucleico del anticuerpo que proporciona o que codifica las regiones constantes. En otra realizacion mas, el termino "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoacidos o de acido nucleico del anticuerpo que proporciona o codifica una o mas de las regiones marco y las regiones constantes. En una realizacion especffica, el termino "aceptor" se refiere a una secuencia de aminoacidos o de acido nucleico del anticuerpo humano que proporciona o codifica al menos 80%, particularmente, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98 %, o 100% de las secuencias de aminoacidos de una o mas de las regiones marco. De acuerdo con esta forma de realizacion, un aceptor puede contener al menos 1, al menos 2, al menos 3, por lo menos 4, al menos 5, o al menos 10 residuos de aminoacidos que no existen en una o mas posiciones especfficas de un anticuerpo humano. Una region marco aceptora y/o una o varias regiones constantes aceptoras pueden, p. ej., derivar u obtenerse de un gen de anticuerpo de la lfnea germinal, un gen de anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (p. ej., anticuerpos bien conocidos en la tecnica, anticuerpos en desarrollo, o anticuerpos disponibles comercialmente).

El termino "anticuerpo", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere en terminos generales a cualquier molecula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento, mutante, variante, o derivacion funcional del mismo, que conserva las caracterfsticas de union a epftopos esenciales de una molecula de Ig. Semejantes formatos de anticuerpos mutantes, variantes, o derivados son conocidos en la tecnica. Las realizaciones no limitantes de los cuales se discuten a continuacion. Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" una molecula si es capaz de reaccionar especfficamente con la molecula para unir de ese modo la molecula al anticuerpo.

El termino "producto conjugado de anticuerpo" se refiere a una protefna de union, tal como un anticuerpo, qufmicamente ligado a un segundo radical qufmico, tal como un agente terapeutico o citotoxico. El termino "agente" se refiere a un compuesto qufmico, una mezcla de compuestos qufmicos, una macromolecula biologica o un extracto hecho de materiales biologicos. Concretamente los agentes terapeuticos o citotoxicos incluyen, pero no se limitan a, la toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procafna, tetracafna, lidocafna, propranolol y puromicina y analogos u homologos de los mismos.

El termino "constructo de anticuerpo" segun se utiliza en la presente memoria se refiere a un polipeptido que comprende una o mas las porciones de union a antfgeno de la invencion unida a un polipeptido conector o un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipeptidos conectores comprenden dos o mas residuos de aminoacido unidos por enlaces peptfdicos y se utilizan para conectar una o mas porciones de union a antfgeno. Tales polipeptidos conectores son bien conocidos en la tecnica (vease p. ej., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121/23). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de la cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoacidos del dominio constante de la cadena pesada y la cadena ligera de IgG humana se conocen en la tecnica y se representan en la Tabla 1.

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secuencia

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laentrficador de

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SEC ID NO:14

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Aun mas, un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo puede ser parte de una molecula de inmunoadherencia de mayor tamano, formada por asociacion covalente o no covalente del anticuerpo o porcion de anticuerpo con una o mas de otras protefnas o peptidos. Los ejemplos de tales moleculas de inmunoadherencia incluyen el uso de la region del nucleo de estreptavidina para elaborar una molecula tetramerica de scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) y el uso de un residuo de cistefna, un peptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para elaborar moleculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047 a 1058). Las porciones de anticuerpos, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar a partir de anticuerpos completos usando tecnicas convencionales, tales como la digestion con papafna o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Ademas, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moleculas de inmunoadherencia pueden ser obtenidos utilizando tecnicas de ADN recombinante convencionales, como se describe en la presente memoria.

El termino "porcion de union a antfgeno" o "fragmento de union a antfgeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo") segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno (p. ej., hRGM A). Se ha demostrado que la funcion de union al antfgeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo completo. Tales realizaciones de anticuerpos tambien pueden ser formatos biespecfficos, especfficos duales, o multi-especfficos; que se unen especfficamente a dos o mas antfgenos diferentes. Los ejemplos de los fragmentos de union incluidos dentro del termino "porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546, Winter et al., Publicacion PCT WO 90/05144 A1incorporada a la presente memoria como referencia), que comprende un unico dominio variable; y (vi) una region determinante de complementariedad aislada (CDR). Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estan codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por medio de un conector sintetico que permite que se puedan elaborar en forma de una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease p. ej., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla tambien estan destinados a estar

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comprendidos en el termino "porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo. Tambien se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecfficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptfdica, pero utilizando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, obligando de esta manera a que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union a antfgeno (vease p. ej., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Tales porciones de union a anticuerpo son conocidas en la tecnica (Kontermann y Dubel Eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 pags. (ISBN 3-540-41354-5).

El termino "determinante antigenico" o "epftopo" incluye cualquier determinante polipeptfdico susceptible de union especffica a una inmunoglobulina o receptor de celulas T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitopicos incluyen agrupaciones superficiales qufmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucares, fosforilo o sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener caracterfsticas estructurales tridimensionales especfficas, y/o caracterfsticas de carga especfficas. Un epftopo es una region de un antfgeno que esta unida a un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une especfficamente a un antfgeno cuando reconoce de manera preferente su antfgeno diana en una mezcla compleja de protefnas y/o macromoleculas.

El termino "actividad biologica" se refiere a todas las propiedades biologicas inherentes de RGM A como se define en la presente memoria.

El termino "residuo canonico" se refiere a un residuo de una CDR o marco que define una estructura de CDR canonica particular, tal como la definen Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196: 901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992), incorporados ambos a la presente memoria como referencia). De acuerdo con Chothia et al., las porciones crfticas de las CDR de muchos anticuerpos tienen conformaciones de la cadena principal peptfdica casi identicas a pesar de la gran diversidad a nivel de la secuencia de aminoacidos. Cada estructura canonica especifica principalmente un conjunto de angulos de torsion de la cadena principal del peptido para un segmento contiguo de residuos de aminoacido que forman un bucle.

El termino "anticuerpo quimerico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la region variable de la cadena pesada y ligera de una especie y las secuencias de la region constante de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de las cadenas pesada y ligera murinas ligadas a regiones constantes humanas. El anticuerpo quimerico puede ser producido a traves de tecnicas de biologfa molecular recombinante, o puede conjugarse ffsicamente entre sf.

El termino "CDR" se refiere a la region determinante de complementariedad dentro de las secuencias variables de los anticuerpos. Existen tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El termino "conjunto de CDR" segun se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de tres CDR que se producen en una sola region variable capaz de unirse al antfgeno. Los lfmites exactos de estas CDR se han definido de manera diferente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nationa Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeracion de residuos inequfvoco aplicable a cualquier region variable de un anticuerpo, sino que tambien proporciona lfmites de residuos precisos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden ser referidas como CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) y Chothia et al., Nature 342:. 877883 (1989)) encontraron que ciertas sub-porciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de la cadena principal del peptido casi identicas, a pesar de tener una gran diversidad a nivel de secuencia de aminoacidos. Estas sub-porciones fueron denominadas L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3, donde la "L" y la "H" indican las regiones de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden ser referidas como CDR de Chothia, que tienen lfmites que se solapan con las CDR de Kabat. Otros lfmites que definen las CDR que se solapan con las cDr de Kabat han sido descritos por Padlan (FASEB J. 9: 133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5): 732-45 (1996)). Sin embargo, otras definiciones de los lfmites de las CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas anteriores, permitiendo en cambio el solapamiento con las CDR de Kabat, a pesar de que se pueden acortar o prolongar a la luz de la prediccion o de hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos concretos o incluso CDR completas no afectar significativamente a la union al antfgeno. Los metodos utilizados en la presente memoria pueden utilizar las CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque las realizaciones concretas utilizan las CDR definidas por Kabat o Chothia.

El termino "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la region variable de la cadena pesada y ligera de una especie pero en la que las secuencias de una o mas de las regiones CDR de VH y/o VL se sustituyen por secuencias CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de las cadena pesada y ligera murinas en las que una o mas de las CDR murinas (p. ej., CDR3) han sido sustituidas por secuencias CDR humanas.

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Los terminos "cristal", y "cristalizado" se refieren a un anticuerpo, o porcion de union a antfgeno del mismo, que existe en la forma de un cristal. Los cristales son una forma de estado solido de la materia, que es distinto de otras formas tales como el estado solido amorfo o el estado cristalino lfquido. Los cristales estan compuestos por matrices tri-dimensionales repetitivas, regulares, de atomos, iones, moleculas (p. ej., protefnas tales como anticuerpos), o ensamblajes moleculares (p. ej., complejos antfgeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales estan dispuestas de acuerdo con relaciones matematicas especfficas que son bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental, o el elemento esencial, que se repite en un cristal se denomina unidad asimetrica. La repeticion de la unidad asimetrica en una disposicion que se ajusta a una simetrfa cristalografica dada, bien definida proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repeticion de la celda unitaria por traslaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Vease Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Cristalization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach, 2a ed., pags. 20, 1-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999)."

Los terminos "donador" y "anticuerpo donador" se refieren a un anticuerpo que proporciona una o mas CDR. En una realizacion particular, el anticuerpo donador es un anticuerpo de una especie diferente del anticuerpo del que se obtienen o derivan las regiones de marco. En el contexto de un anticuerpo humanizado, el termino "anticuerpo donador" se refiere a un anticuerpo no humano que proporciona una o mas CDR.

El termino "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la gravedad y/o duracion de un trastorno o uno o mas de sus sfntomas, evitar el avance de un trastorno, causar la regresion de un trastorno, prevenir la recurrencia, el desarrollo, el inicio o el progreso de uno o mas sfntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno, o aumentar o mejorar el efecto o los efectos profilacticos o terapeuticos de otra terapia (p. ej., un agente profilactico o terapeutico).

El termino "marco" o "secuencia marco" se refiere a las secuencias restantes de una region variable menos las CDR. Debido a que la definicion exacta de una secuencia de CDR puede estar determinada por diferentes sistemas, el significado de una secuencia marco esta sujeto por otra parte a diferentes interpretaciones. Las seis CDR (CDR-L1, - L2 y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2 y -H3 de la cadena pesada) tambien dividir las regiones marco de la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en la que CDR1 se coloca entre FR1 y fR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre fR3 y Fr4. Sin precisar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una region marco, a la que se refieren las otras, representa las FR combinadas dentro de la region variable de una sola cadena de inmunoglobulina de origen natural. Segun se utiliza en la presente memoria, una FR representa una de las cuatro subregiones, y la FR representa dos o mas de las cuatro sub-regiones que constituyen una region marco.

Las secuencias aceptoras de la cadena pesada y la cadena ligera humanas son conocidas en la tecnica. En una realizacion de la invencion, las secuencias aceptoras de la cadena pesada y la cadena ligera humanas se seleccionan entre las secuencias descritas en la Tabla 2 y la Tabla 3. En dichas tablas se expresan diferentes combinaciones de secuencias marco humanas FR1 a FR4.

sag 13 HO.: Region de la proteina Secuencia


: 12345G7S0CL2345678901234501B9012

h: vk3 'T8/jj;3 FtfJ 1 fi 4 8/Jl:3 FF2 * VM3^iS/JHS FEW VH3-48/JJ;3 iiRTQ - V L 3GGG U VO R® 3 ui :.SC ft A3G > v f. 3 .......-nv"-: "f rih! ; 1 ■ n trt t-m .'M bKmi.v iMs ; - *.

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16: VH3-46/Jfi4 FR2 WV RQ ft F0 KG LEWVS

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IS: yH3-4i3/.rK6i FRi EV-Q I.VE2CGGL VQPCC SLRL SCAASGFT FP

if,: VH3-4B/JHG FF.2 WVRQA E'GKGLEW'-'S

11: RFTISRDNAKH S LY LQMW3 LRDZDTAVYYCSRf I i

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21: VH3-33/JH3 FRI gVQLVES GGGWQ PGRS 1RL SCAAP CFT FS

22: VH3-33/JH3 FF2 WRQA PGKGLEHVA

21: VH3 53/J33 FV.'i RFT I SRDN5KNTLYLQHNSLRAEDTSVY YCAR

IS: VMS 33/JH3 FR4 WGOGThVtTCS

2\: vh3 "33/.m4 nil QVQlVE SGGG'Wg I.RI.SCAA SG F'l H

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Wi: yj;3-33/JM f'FS jj ■ : 1 S LU;:i SRH T L Y LvMllS LLiAE C^'A V Y YCAR

13: VK.1 -3S/0H4 FR-1 WGOGT LY'TVSS

31: VH3-33/JH6 FRI OVOLVE 3GGG WQPGR5 LR LSCAASG FTFS

22: VH3-33/JH6 FR2 WVRQAFG KG I.3NVA

21: VH3-33/JH6 FR3 RFT 13RDN3KNTl,YLQt«f£l.KAT; FT AVYTCftR

20: VH3-33/JH6 fr4 hGQGttvtvsS

21: VH3-Z3/JH3 Ull EV®iJLE6lGGGAVOFEx33l>Rl,SCAA3G RTFS I

25 26 . lb: Vfl3-33/J.ri3 FR2 i!«f«3TS»' 'F’R*! WV^OAF&KGli^NVS lir-'TrSSIiMSK^I.YiaHNS^WP.WAvj'YCAX f ** WGQGTl^ifSfSfl§m ' lIllS

24: Vfi3-2 3AJH4 FRI E VOLt B3OGGlV0FGG3LRLSCftftBCiIFTF3

25: VH3-23/JH4 FR2 WVRQAPGKGLEHVS

2 6>: VR3-23/JH4 FR3 RFT15RDW3KNTI .YLQMHS LFAEDTftVYYCAK

19: vii 3-2 3/J114 FF4 MQQGTyvrvSS

: V1L3-23/J516 FRI. . . E Y0 L l.ESGG'J L VQPGG SLRL SCAASGFTFS.

26 20 f1: VJI3-2 3/JH6 FF2 Vl!3-2 3Aji|^ FR3 iCVRQ A PGKGLEVFV S RFT 1:3R DNS [i NT LYLCMlvE LR/'F D7l!.''-rr:.'CRK ■

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TABLA 3: SECUENCIAS ACEPTORAS DE LA CADENA LIGERA HUMANA

3E0 ID Ho,: Region de la proteina Secuencia


: 12345676901234567890133456799012

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31: A17/JK2 FRI DWHT0 3 FL3 LPVT LCgPAG 13C

32: A17/JK2 FR2 WFQQRFGQ5PRRLIY

3Eg ID HO.: Region de la proteina Secuencia


: 13345676901334561990123456799012

33: A11 / lJ K2 I'RJ GVPDRFSGSG3GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC

3S: A17/JK2 FR4 PG0STELE3KR

El termino "gen de anticuerpo de la linea germinal" o "fragmento genico" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por celulas no linfoides que no han sufrido el proceso de maduracion que conduce a la reorganizacion genetica y la mutacion para la expresion de una inmunoglobulina concreta. (Vease, p. ej., Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484: 13-30 (2001)). Una de las

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ventajas proporcionadas por diversas realizaciones de la presente invencion parte del reconocimiento de que los genes de anticuerpo de la lfnea germinal son mas propensos que los genes de anticuerpos maduros a conservar estructuras de secuencias de aminoacidos esenciales caracterfsticas de los individuos en las especies, por lo tanto menos probables de ser reconocidos como procedentes de una fuente foranea cuando se utilizan terapeuticamente en esa especie.

Se pretende que el termino "anticuerpo humano", segun se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especffica del sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular, CDR3. Sin embargo, no se pretende que el termino "anticuerpo humano", segun se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la lfnea germinal de otra especie de mamffero, tal como un raton, hayan sido injertadas en secuencias marco humanas.

El termino "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la region variable de la cadena pesada y ligera de una especie no humana (p. ej., un raton) pero en el que al menos una parte de la secuencia de VH y/o VL ha sido alterada para que sea mas "similar a la humana", es decir, mas similar a las secuencias variables de la lfnea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el que las secuencias de CDR humanas se introducen en secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las correspondientes secuencias de CDR no humanas. Un anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo o una variante, derivado, analogo o fragmento del mismo que se une inmunoespecfficamente a un antfgeno de interes y que comprende una region marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano y una region determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo no humano. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoacidos al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 o 80%, particularmente al menos 85%, al menos 90 %, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% identica a la secuencia de aminoacidos de una CDR de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador), y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En particular, un anticuerpo humanizado tambien comprende al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera, como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo tambien puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En realizaciones especfficas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.

El anticuerpo humanizado se puede seleccionar entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgY, IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo sin limitacion IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de mas de una clase o isotipo, y en particular se pueden seleccionar los dominios constantes para optimizar las funciones efectoras deseadas utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica.

Las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado no tienen que corresponder exactamente a las secuencias parentales, p. ej., la CDR del anticuerpo donador o el marco de consenso pueden mutagenizarse por sustitucion, insercion y/o delecion de al menos un residuo de aminoacido de manera que el residuo de la CDR o del marco en ese sitio no se corresponda con el anticuerpo donante o el marco consenso. En una realizacion particular, dichas mutaciones, sin embargo, no seran extensas. Por lo general, al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 o 80%, particularmente al menos 85%, mas particularmente al menos 90%, y mas particularmente al menos 95% de los residuos del anticuerpo humanizado se corresponderan con los de las secuencias de FR y CDR parentales. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "marco consenso" se refiere a la region marco en la secuencia consenso de inmunoglobulina. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "secuencia consenso de inmunoglobulina" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoacidos (o nucleotidos) que aparecen con mas frecuencia en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (Vease, p. ej., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de inmunoglobulinas, cada posicion en la secuencia consenso esta ocupada por el aminoacido que aparece con mas frecuencia en esa posicion en la familia. Si dos aminoacidos aparecen con igual frecuencia, se puede incluir cualquiera de ellos en la secuencia consenso.

El termino " RGM A humana" (abreviado en la presente memoria como hRGM A) se refiere a una glicoprotefna de 450 aminoacidos anclada a glicosilfosfatidil-inositol (gpi), que fue descrita primero como un repelente del crecimiento de las neuritas o un inhibidor del crecimiento de las neuritas durante el desarrollo de proyecciones topograficas

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(Stahl et al. Neuron 5: 735-43, 1990; Mueller, en Molceular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation, Editado por H. Fujisawa, Japan Scientific Societies Press, 215-229, 1997). La familia del gen rgm abarca tres genes diferentes, dos de ellos, rgm a y rgm b, se expresan en el SNC de mamfferos, mientras que el tercer miembro, rgm c, se expresa en el periferico (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-1529, 2006), donde juega un papel importante en el metabolismo del hierro. Las protefnas RGM humanas tienen una identidad de secuencia de 43%-50%; la homologfa de aminoacidos de la tGm A humana y de rata es de 89%. Las protefnas RGM humanas no comparten ninguna homologfa de secuencia significativa con ninguna otra protefna conocida. Son protefnas ricas en prolina que contienen una region RGD y tienen homologfa estructural con el dominio del Factor de Von Willebrand y son escindidas en el aminoacido N-terminal 168 por una proteasa desconocida para producir la protefna funcionalmente activa (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-1529, 2006).

In vitro, la RGM A inhibe el crecimiento de neuritas a concentraciones picomolares mediante la union a Neogenina, que ha sido identificado como un receptor de RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6 (8), 756-62, 2004). La neogenina habfa sido descrita primero como una protefna de union a netrina (Keino-Masu et al. Cell, 87 (2): 175-85, 1996), pero su afinidad por la Netrina (Kd 2 nM) es un orden de magnitud inferior al de RGM (Kd 0,2 nM) (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). Este es un hallazgo importante ya que se ha informado de que la union de Netrina-1 a Neogenina o a su receptor estrechamente relacionado DcC (suprimido en el cancer colorrectal) estimula en lugar de inhibe el crecimiento de las neuritas (Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000).

Ademas de la union de RGM A a Neogenina y la induccion de la inhibicion del crecimiento de neuritas, la union de RGM A o B a las protefnas morfogeneticas del hueso BMP-2 y BMP-4 podrfa representar otro obstaculo para la neuroregeneracion y la recuperacion funcional satisfactorias (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-1529, 2006). Se ha informado de que ambas clases de protefnas (Neogenina y BMP) transducen la senal inhibidora del crecimiento de neuritas de rGm A traves de dos vfas de transduccion de senales completamente diferentes e independientes. Por lo general, la expresion de estas protefnas BMP es relativamente baja en la mayorfa de regiones del SNC adulto, pero se ha informado de rapidos incrementos en la expresion y la acumulacion de algunas BMP (p. ej., BMP-2, BMP-6, BMP-7) en respuesta a la lesion y la agresion (Lai et al., Neuroreport 8: 2691 - 94, 1997; Martinez et al. Brain Res. 894: 1-11, 2001; Hall y Miller, J. Neurosci. Res. 76: 1-8, 2004; Setoguchi et al., Exp. Neurol. 189: 33-44, 2004). Ademas, en un modelo de esclerosis multiple, el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), BMP-4, BMP-6 y BMP-7 estuvieron reguladas al alza en medula espinal de raton (Ara et al., J. Neurosci. Res. 86: 125-35, 2008). Se ha informado de que BMP-2 inhibe el crecimiento de las neuritas mediante la union a la RGM A de la superficie celular, receptores de BMP-I y II y mediante la activacion directa de LIM-quinasa (Matsuura et al. Biochem Biophys Res Commun, 360: 868-73, 2007) y por lo tanto se espera que el bloqueo de la interaccion de RGM A-BMP-2 aumente aun mas la recuperacion funcional despues de una lesion del SNC.

Como se menciono anteriormente, las ratas con lesion medular y los seres humanos con lesion cerebral, muestran acumulaciones masivas de RGM celular en el sitio de la lesion y el patron de tincion de RGM A en ratas en el sitio de lesion de la medula es muy similar a la tincion con anticuerpos para pan RGM en los seres humanos, lo que sugiere que la mayorfa de la tincion de pan RGM en los seres humanos esta relacionada con la localizacion de RGM A pero no con la localizacion de RGM B (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006). En el cerebro humano sano, la tincion de pan RGM (inmunorreactividad de RGM A y B) se detecto en fibras de la sustancia blanca, los oligodendrocitos, el pericarion de pocas neuronas, algunas celulas de musculo liso vascular y pocas celulas endoteliales. No se observo tincion de los astrocitos. El patron de tincion de RGM en cerebro humano adulto sano es muy similar al patron de tincion observado en medulas espinales de rata adulta (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006).

Basandose en la acumulacion de RGM A en los sitios de lesion en el cerebro y de lesion de la medula espinal y debido a su actividad inhibidora del crecimiento de neuritas celulares, se espera que la protefna ejerza una actividad inhibidora del crecimiento de neuritas y que su neutralizacion por anticuerpos, o fragmentos de union a antfgeno de los mismos que se unen a al menos un epftopo de la rGm humana A pueda dar como resultado un mejor crecimiento de las fibras nerviosas lesionadas y una mejora de la recuperacion funcional en indicaciones caracterizadas por una lesion en las fibras nerviosas y por la acumulacion de rGm.

El termino "RGM A" tambien abarca moleculas de RGM A aisladas u obtenidas a partir de otras especies, por ejemplo, roedores, tales como ratones o ratas; especfficamente, la molecula derivada de rata se denomina en la presente memoria "RGM A de rata".

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TABLA 4: LISTA DE SECUENCIAS DE MOLECULAS RELACIONADAS CON RGM A

Protefna: Identificador de secuencia Descripcion

hRGM A: SEQ ID NO: 2 Secuencia de la protefna RGM A humana

: SEQ ID NO: 1 Secuencia de nucleotidos de RGM A humana

hRGM A: SEQ ID NO: 4 Secuencia de la protefna RGM A-fc humana

: SEQ ID NO: 3 Secuencia de nucleotidos de RGM A-fc humana

hRGM A: SEQ ID NO: 6 Secuencia la protefna cadena ligera de RGM A-fc humana

: SEQ ID NO: 5 Secuencia de nucleotidos de cadena ligera de RGM A-fc humana

RGM A de rata: SEQ ID NO: 8 Secuencia de nucleotidos de RGM A de rata

: SEQ ID NO: 7 Secuencia de nucleotidos de RGM A de rata

El termino "inhibicion de la union de RGM a uno de sus receptores" abarca la reduccion parcial (como por ejemplo aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% o mas) o completa de dicha actividad de union al receptor. Dicha "inhibicion de la union" se puede determinar por cualquier metodo adecuado disponible en la tecnica, particularmente por cualquier metodo ilustrado en la presente memoria, por ejemplo ensayos de union basados en ELISA.

Se pretende que un "anticuerpo aislado", segun se utiliza en la presente memoria, haga referencia a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigenicas diferentes (p. ej., un anticuerpo aislado que se une especfficamente a hRGM A esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especfficamente a antfgenos distintos hRGM A). Un anticuerpo aislado que se une especfficamente a hRGM A puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antfgenos, tales como moleculas de RGM A de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos qufmicos.

El termino "polinucleotido aislado" se referira a un polinucleotido (p. ej., de origen genomico, ADNc, o sintetico, o alguna combinacion de los mismos) que, en virtud de su origen, no esta asociado con todo o una parte de un polinucleotido con el que el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza; esta unido operablemente a un polinucleotido al que no esta unido en la naturaleza; o no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia mas grande.

El termino "protefna aislada" o "polipeptido aislado" es una protefna o polipeptido que en virtud de su origen o fuente de derivacion no esta asociado con los componentes asociados de forma natural que lo acompanan en su estado nativo; esta sustancialmente libre de otras protefnas de la misma especie; es expresado por una celula de una especie diferente; o no se produce en la naturaleza. Por lo tanto, un polipeptido que se sintetiza qufmicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la celula a partir de la cual se origina naturalmente estara "aislado" de sus componentes asociados de forma natural. Una protefna tambien puede volverse sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural por medio de aislamiento, utilizando mecanismos de purificacion de protefnas bien conocidos en la tecnica.

Los terminos "numeracion de Kabat", "definiciones de Kabat" y "marcaje de Kabat" se utilizan indistintamente en la presente memoria. Estos terminos, que son reconocidos en la tecnica, se refieren a un sistema de numeracion de residuos de aminoacidos que son mas variables (es decir hipervariables) que otros residuos de aminoacidos en las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porcion de union a antfgeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 y Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Deparment of Health and Human Services, NIH Publication Num. 913242). Para la region variable de cadena pesada, la region hipervariable oscila de las posiciones de los aminoacidos 31 a 35 para la CDR1, las posiciones de aminoacidos 50 a 65 para CDR2, y las posiciones de aminoacidos 95 a 102 para CDR3. Para la region variable de la cadena ligera, la region hipervariable oscila de las posiciones de aminoacidos 24 a 34 para CDR1, las posiciones de aminoacidos 50 a 56 para CDR2, y las posiciones de aminoacidos 89 a 97 para CDR3.

El termino "Kd" se refiere a la constante de disociacion de una interaccion anticuerpo-antfgeno concreta tal como se conoce en la tecnica.

El termino "residuos clave" se refiere a ciertos residuos dentro de la region variable que tienen un mayor impacto sobre la especificidad y/o la afinidad de union de un anticuerpo, en particular, un anticuerpo humanizado. Un residuo clave incluye, pero no se limita a, uno o mas de los siguientes: un residuo que es adyacente a una CDR, un sitio de glicosilacion potencial (puede ser un sitio de glicosilacion ligado a N o a O), un residuo raro, un residuo capaz de

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interaccionar con el antfgeno, un residuo capaz de interaccionar con una CDR, un residuo canonico, un residuo de contacto entre la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera, un residuo dentro de la zona de Vernier, y un residuo en la region que se solapa entre la definicion de Chothia definicion de una CDR1 de una cadena pesada variable y la definicion de Kabat del primer marco de la cadena pesada.

El termino "kon" se refiere a la constante de la velocidad de asociacion de un anticuerpo al antfgeno para formar el complejo anticuerpo/antfgeno tal como se conoce en la tecnica.

El termino "koff" se refiere a la constante de la velocidad de disociacion de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antfgeno tal como se conoce en la tecnica.

El termino "protefna de union marcada" se refiere a una protefna con una marca incorporada que proporciona la identificacion de la protefna de union. En particular, la marca es un marcador detectable, p. ej., la incorporacion de un aminoacido radiomarcado o el anclaje a un polipeptido de radicales biotinilados que se puede detectar mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede ser detectada por metodos opticos o colorimetricos). Los ejemplos de las marcas para polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisotopos o radionuclidos (p. ej., 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 1l1In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, o 153Sm); marcas fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fosforos que contienen lantanidos), marcas enzimaticas (p. ej., peroxidasa de rabano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcas quimioluminiscentes; grupos biotinilados; epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metales, etiquetas de epftopos); y agentes magneticos, tales como quelatos de gadolinio.

El termino "tratamiento local" se refiere a cualquier forma de administracion de la protefna de union de la invencion o de una formulacion que contiene la misma directamente en la region previsto del cuerpo de un mamffero que va a ser tratado, donde se pretende inducir la accion neuroprotectora o neurorregeneradora deseada.

Los terminos "modular" y "regular' se utilizan indistintamente y se refieren a un cambio o una alteracion en la actividad de una molecula de interes (p. ej., la actividad biologica de hRGM A). La modulacion puede ser un aumento o una disminucion en la magnitud de una determinada actividad o funcion de la molecula de interes. Las actividades y funciones ilustrativas de una molecula incluyen, pero no se limitan a, caracterfsticas de union, actividad enzimatica, activacion del receptor celular y transduccion de senales.

Correspondientemente, el termino "modulador' es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o funcion de una molecula de interes (p. ej., la actividad biologica de hRGM A). Por ejemplo, un modulador puede causar un aumento o disminucion en la magnitud de una determinada actividad o en la funcion de una molecula en comparacion con la magnitud de la actividad o la funcion observada en ausencia del modulador. El termino "agonista", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molecula de interes, provoca un aumento en la magnitud de una determinada actividad o funcion de la molecula en comparacion con la magnitud de la actividad o funcion observada en ausencia del agonista. Los agonistas particulares de interes pueden incluir, pero no se limitan a, polipeptidos de hRGM A o polipeptidos, acidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molecula que se unen a hRGM A. El termino "antagonista", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molecula de interes provoca una disminucion en la magnitud de una determinada actividad o funcion de la molecula en comparacion con la magnitud de la actividad o funcion observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, protefnas, peptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o pequenas moleculas organicas. Los pepticuerpos se describen, p. ej., en el documento WO 01/83525.

Los antagonistas particulares de interes incluyen los que bloquean o modulan la actividad biologica o inmunologica de hRGM A. Los antagonistas de hRGM A pueden incluir, pero no se limitan a, protefnas, acidos nucleicos, hidratos de carbono, o cualquier otra molecula, que se unen a hRGM A, como los anticuerpos monoclonales que interaccionan con la molecula de RGM A. Cabe senalar que la interaccion con RGM A puede dar como resultado la union y neutralizacion de otros componentes ligandos/componentes de la membrana celular, y puede ser util para el funcionamiento aditivo o sinergico contra multiples enfermedades.

El termino "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparacion de moleculas de anticuerpo, que comparten una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada comun y de la cadena ligera comun, en contraste con las preparaciones de anticuerpos "policlonales" que contienen una mezcla de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados por varias tecnologfas nuevas como presentacion en fagos, bacterias, levaduras o ribosomas, asf como metodos clasicos ilustrados por anticuerpos derivados de hibridomas (p. ej., un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado mediante tecnologfa de hibridoma, tal como la metodologfa de hibridoma de Kohler y Milstein convencional ((1975) Nature 256: 495-497).

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En un anticuerpo completo, cada cadena pesada esta compuesta por una region variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta por una region variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son las regiones mas conservadas, denominadas marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDr2, FR3, CDR3, FR4. Las moleculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase.

El termino "neuroprotector" o "neuroproteccion" se refiere a un tratamiento que evita que las celulas neuronales, en particular celulas que comprenden celulas de la CFNR se danen o degeneren, (analizable mediante la observacion de la conservacion de los axones de CGR (Celulas Ganglionares de la Retina) en la retina; o inhibe la degeneracion "anormal" de CFNR medible a traves de las perdidas de espesor de la CFNR como se definio anteriormente.

El termino "neurorregeneradora" o "neurorregeneracion" se refiere a un tratamiento de acuerdo con la invencion que da como resultado una reparacion o re-crecimiento de las celulas neuronales, en particular celulas que comprenden celulas de CFNR danadas, (analizables mediante, por ejemplo, Tomograffa de Coherencia Optica (TCO) de la retina, formacion de imagenes por tensor de difusion de los nervios opticos; brotacion de neuronas de la retina;

El termino "neutralizador" se refiere a la neutralizacion de la actividad biologica de una protefna diana cuando una protefna de union se une especfficamente a la protefna diana. La neutralizacion puede ser el resultado de diferentes maneras de union de dicho protefna de union a la diana. Por ejemplo, la neutralizacion puede estar causada por la union de la protefna de union en una region de la diana que no afecta a la union del receptor a la molecula diana. Alternativamente la union de una protefna de union puede dar como resultado un bloqueo de la union del receptor a la diana, cuyo bloqueo finalmente neutraliza la actividad de la protefna diana. Una protefna de union neutralizadora es un anticuerpo neutralizador cuya union a hRGM A da como resultado la neutralizacion de una actividad biologica de hRGM A. En particular, la protefna de union neutralizadora se une a hRGM A y disminuye una actividad biologica de hRGM A en al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o mas. La neutralizacion de una actividad biologica de hRGM A por una protefna de union neutralizadora se puede evaluar mediante la medicion de uno o mas indicadores de la actividad biologica de hRGM bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo la neutralizacion de hRGM A invierte la inhibicion en un ensayo de crecimiento neuronal Ntera (vease el Ejemplo 3, a continuacion). El ensayo de crecimiento de neuritas Ntera aborda la inhibicion del crecimiento de las neuritas. En ausencia de una protefna inhibidora de RGM o fragmento y en presencia del sustrato estimulador del crecimiento laminina, los agregados NTera neuronales muestran una red extensa y densa de las neuritas en crecimiento. La RGM A o los fragmentos de RGM A inhiben el crecimiento de neuritas, dando como resultado una reduccion de la longitud y el numero de neuritas. Los antagonistas que bloquean la funcion de RGM A o los MAB de tipo mAb 5F9 neutralizan la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas del potente fragmento de la cadena ligera de hRGM A conjugado con fc (aminoacidos 47-168) de la protefna RGM A humana en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados de neuronas NTera humanas diferenciadas, lo que da como resultado un fuerte aumento en la longitud y el numero de las neuritas.

El termino "anticuerpo monoclonal neutralizador" se refiere a una preparacion de moleculas de anticuerpo, que tras la union al antfgeno especffico son capaces de competir y de inhibir la union del ligando natural a dicho antfgeno. En una realizacion concreta de la presente solicitud, los anticuerpos neutralizadores de la presente invencion son capaces de competir con RGM A por la union a Neogenina y/o BMP-2 y/o BMP-4, y de prevenir la actividad biologica o la funcion de RGM A. En particular, los anticuerpos neutralizadores de la presente invencion son capaces de unirse con RGM A y prevenir la union a Neogenina y/o BMP-2 y/o BMP-4, y prevenir la actividad biologica o la funcion de RGM A. El termino "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo por un antfgeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRGM A que se une a un antfgeno RGM A y/o la potencia de neutralizacion de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRGM A cuya union a hRGM A inhibe la actividad biologica de hRGM A, p. ej., como se determina en un ensayo de union de hRGM A-Neogenina, un ensayo de union de hRGM A-BMP-2 o un ensayo de union de hRGM A-BMP-4 como se describe mas abajo en la seccion experimental.

La actividad biologica de RGM A se puede describir como la regulacion de la migracion celular. Un ejemplo especial de la migracion celular es el crecimiento de neuritas, que se ve dificultado o inhibido por las protefnas rGm A. Ademas se ha demostrado que las protefnas RGM modulan la actividad de las protefnas BMP. Los ejemplos publicados en la presente memoria describen una actividad sinergizante, potenciadora de las protefnas de RGM sobre la ruta de BMP a un lado y una actividad inhibidora de las protefnas RGM sobre la ruta de BMP, que es importante para la regulacion del metabolismo del hierro, la regeneracion de hueso y cartflago y en el SNC para la remielinizacion y la regeneracion.

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El termino "conectado operablemente" se refiere a una yuxtaposicion en donde los componentes descritos estan en una relacion que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia de control "conectada operablemente" a una secuencia codificante esta ligada de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "conectadas operablemente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresion que son contiguas al gen de interes como las secuencias de control de la expresion que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes. El termino "secuencia de control de la expresion" segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a secuencias de polinucleotidos, que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que estan ligadas. Las secuencias de control de la expresion incluyen secuencias de inicio de la transcripcion, de terminacion, promotoras y potenciadoras apropiadas; senales de procesamiento del ARN eficaces tales como senales de empalme y poliadenilacion; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmico; secuencias que potencian la eficacia de traduccion (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la protefna; y cuando se desee, secuencias que potencian la secrecion de protefnas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrion; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de union al ribosoma, y secuencia de terminacion de la transcripcion; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminacion de la transcripcion. Se pretende que el termino "secuencias de control" incluya componentes cuya presencia es esencial para la expresion y el procesamiento, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias de companeros de fusion.

El termino "polinucleotido" significa una forma polimerica de dos o mas nucleotidos, ya sean ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido. El termino incluye formas de hebra sencilla y de doble hebra de ADN, pero particularmente es ADN de doble hebra.

El termino "polipeptido" se refiere a cualquier cadena polimerica de aminoacidos. Los terminos "peptido" y "protefna" se utilizan de forma indistinta con el termino polipeptido y tambien se refieren a una cadena polimerica de aminoacidos. El termino "polipeptido" abarca protefnas nativas o artificiales, fragmentos de protefnas y analogos polipeptfdicos de una secuencia de protefna. Un polipeptido puede ser monomerico o polimerico.

Se pretende que el termino "celula anfitriona recombinante" (o simplemente "celula anfitriona") haga referencia a una celula en la que se ha introducido ADN exogeno. Se debe entender que tales terminos pretenden referirse no solo a la celula sujeto concreta, si no a la progenie de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutacion o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula parental, pero aun asf estar incluida dentro del alcance del termino "celula anfitriona" segun se utiliza en la presente memoria. Particularmente las celulas anfitrionas incluyen celulas procariotas y eucariotas seleccionadas entre cualquiera de los Reinos de la vida. Las celulas eucariotas concretas incluyen celulas de protistas, hongos, plantas y animales. Mas particularmente las celulas anfitrionas incluyen, pero no se limitan a la lfnea celular procariotica de E. coli; lfneas celulares de mamfferos CHO, HEK 293 y COS; la lfnea celular de insecto Sf9; y la celula fungica Saccharomyces cerevisiae.

Las tecnicas convencionales se pueden utilizar para el ADN recombinante, la sfntesis de oligonucleotidos, y el cultivo y la transformacion de tejidos (p. ej., electroporacion, lipofeccion). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante o comunmente llevadas a cabo en la tecnica o descritas en la presente memoria. Las tecnicas y procedimientos anteriores pueden ser realizados generalmente de acuerdo con los metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas especfficas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria. Vease, p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que se incorpora a la presente memoria como referencia para cualquier proposito.

Se pretende que el termino "anticuerpo humano recombinante", segun se utiliza en la presente memoria, incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o afslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresion recombinante transfectado a una celula anfitriona (que se describe mas adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca de de anticuerpos humanos combinatoria recombinante (Hoogenboom H.R., (l997) TIB Tech.15: 62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V. y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom H. y Chames P. (2000) Immunology Today 21: 371-378), anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un raton) que es transgenico para genes de inmunoglobulina humana (vease, p. ej., Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann S- A, y Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21: 364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias genicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagenesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, mutagenesis somatica in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de los

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anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con las secuencias de VH y VL de la lmea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la lmea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

El termino "recuperacion" se refiere al procedimiento de volver una especie qmmica tal como un polipeptido sustancialmente libre de componentes asociados de forma natural por medio de aislamiento, p. ej., utilizando mecanismos de purificacion de protemas bien conocidos en la tecnica.

El termino "CFNR" es la capa mas interna de la retina y se compone principalmente de los axones de las neuronas de las celulas ganglionares que componen el nervio optico. La estructura de la capas de la retina comprende dicha CFNR mas interna seguida de la capa plexiforme interna (CPI), la capa plexiforme externa (CPE), la capa de fotorreceptores (CFR) y el epitelio pigmentario de la retina (EPR). En individuos sanos, la CFNR tiene solo alrededor de 110-120 pm de espesor a la edad de 15 anos y la mayona de los individuos normales perderan aproximadamente 0,017% al ano de espesor de la retina lo que equivale a alrededor de 10-20 pm a lo largo de mas de 60 anos (los cambios en el espesor de CFNR pueden ser determinados, por ejemplo, por el metodo TCO como describen Frohman et al., mas arriba). Dicha perdida de espesor podra designarse tambien degeneracion "normal" de la CFNR.

Una degeneracion o perdida de espesor por encima de o mayor que dicha degeneracion "normal" tambien se puede denominar degeneracion de la CFNR "anormal" o "relacionada con enfermedad". En particular, dichas perdidas anormales de espesor pueden estar por encima de 0, 017%, como por ejemplo por encima de 0,02%, o por encima de 0,1%, o por encima de 1%, o por encima de 5%, o por encima de 10% o por encima de 20% por ano, como por ejemplo de 1 a 10% o de 2 a 5% por mes.

El termino "degeneracion de CFNR" abarca las perdidas de espesor de CFNR tanto normales como las anormales relacionadas con la enfermedad.

El termino "muestra" se utiliza en su sentido mas amplio. Una "muestra biologica", segun se utiliza en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o anteriormente ser vivo. Tales seres vivos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, lfquido sinovial, celulas, organos, tejidos, medula osea, ganglios linfaticos y bazo.

Los terminos "union espedfica" o "se une espedficamente", segun se utiliza en la presente memoria, en referencia a la interaccion de un anticuerpo, una protema, o un peptido con una segunda especie qmmica, quieren significar que la interaccion depende de la presencia de una estructura concreta (p. ej., un "determinante antigenico" o "epftopo" tal como se define mas adelante) en la especie qmmica; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica espedfica en lugar de a las protemas en general. Si un anticuerpo es espedfico para el epftopo "A", la presencia de una molecula que contiene el epftopo A (o A no marcado, libre), en una reaccion que contiene "A" marcado y el anticuerpo, reducira la cantidad de A marcado unido al anticuerpo .

El termino "resonancia de plasmon superficial" se refiere a un fenomeno optico que permite el analisis de las interacciones bioespedficas en tiempo real mediante la deteccion de alteraciones en las concentraciones de protemas dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para una descripcion mas detallada, veanse Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem.198: 268-277.

El termino "tratamiento sistemico" se refiere a cualquier forma de administracion de la protema de union de la invencion o de una formulacion que la contiene al organismo de un mairnfero que va a ser tratado de modo que la protema de union alcanza el lugar previsto de accion neuroprotectora o neurorregeneradora a traves el torrente sangumeo. Por ejemplo, la administracion sistemica abarca la infusion o inyeccion de la protema de union de la invencion o una formulacion que la contiene.

El termino "transformacion" se refiere a cualquier proceso por el que el ADN exogeno entra en una celula anfitriona. La transformacion puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando diversos metodos bien conocidos en la tecnica. La transformacion puede basarse en cualquier metodo conocido para la insercion de secuencias de acido nucleico foraneo en una celula anfiriona procariota o eucariota. El metodo se selecciona basandose en la celula anfitriona que se esta transformando y pueden incluir, pero no se limita a, infeccion viral, electroporacion, lipofeccion, y bombardeo de partmulas. Tales celulas "transformadas" incluyen celulas transformadas establemente en las que el ADN insertado es capaz de replicarse, ya sea como un plasmido de replicacion autonoma o como parte del cromosoma del anfitrion. Tambien incluyen celulas que expresan transitoriamente el ADN o ARN insertados durante penodos limitados de tiempo.

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El termino "organismo transgenico" se refiere a un organismo que tiene celulas que contienen un transgen, en donde el transgen introducido en el organismo (o un ancentro del organismo) expresa un polipeptido no expresado de forma natural en el organismo. Un "transgen" es un constructo de ADN, el cual esta integrado de forma estable y operativa en el genoma de una celula a partir del cual se desarrolla un organismo transgenico, que dirige la expresion de un producto genico codificado en uno o mas tipos de celulas o tejidos del organismo transgenico.

El termino "tratamiento de la degeneracion de RNFL" se refiere tanto al tratamiento terapeutico (es decir, agudo) como profilactico, de la degeneracion de RNFL. Dicho tratamiento puede ser "neurorregenerador" o "neuroprotector"; dicho tratamiento puede ser en forma de un tratamiento "local" o de uno "sistemico".

El termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son susceptibles de replicacion autonoma en una celula anfitriona en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomales de mamffero). Otros vectores (p. ej., vectores de mamfferos no episomales) se pueden integrar en el genoma de una celula anfitriona tras la introduccion en la celula anfitriona, y de ese modo se replican junto con el genoma del anfitrion. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Tales vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresion recombinante" (o simplemente, "vectores de expresion"). En general, los vectores de expresion de utilidad en las tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos. En la presente memoria, "plasmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plasmido es la forma mas comunmente utilizada de vector. Sin embargo, se pretende que la invencion incluya dichas otras formas de vectores de expresion, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven para funciones equivalentes.

El termino "zona de vernier" se refiere a un subconjunto de los residuos del marco que pueden ajustar la estructura de CDR y afinar el ajuste al antfgeno segun lo descrito por Foote y Winter (1992, J. Mol. Biol. 224: 487-499, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Los residuos de la zona de Vernier forman una capa que subyace a las CDR y pueden tener un impacto sobre la estructura de las CDR y la afinidad del anticuerpo.

2. Utilizacion de anticuerpos contra RGM A

El anticuerpo monoclonal neutralizador contra RGM A, inhibe selectivamente la union de RGM A a su receptor Neogenina y a las protefnas morfogeneticas oseas 2 y 4 (BMP-2, BMP-4). Los anticuerpos monoclonales neutralizadores estimulan el nuevo crecimiento de las fibras nerviosas lesionadas o danadas y la formacion de sinapsis funcionales de fibras nerviosas en regeneracion, e inducen la regeneracion a larga distancia en un modelo de rata in vivo de lesion del nervio optico y tambien mejora la remielinizacion de las fibras nerviosas lesionadas y en regeneracion (vease el documento PCT/EP2009/001437).

Sorprendentemente, se observo que los anticuerpos contra RGM A estan asociados con un efecto terapeutico directo adicional todavfa no reconocido sobre la CFNR. En particular, los pacientes que padecen una enfermedad ocular asociada con la degeneracion de la CFNR o que tienen riesgo de degeneracion de la CFNR se pueden tratar con una molecula de anticuerpo como se define en la presente memoria. La presente invencion tambien se basa en el sorprendente hallazgo de que los anticuerpos administrados por via sistemica de la presente invencion se localizan en la retina y ejercen su efecto beneficioso directamente en la region enferma del ojo.

Por lo tanto, por primera vez, se proporciona en el presente documento un metodo de tratamiento dirigido de un grupo especffico de pacientes destinado a la proteccion contra la degeneracion de CFNR o destinado a la regeneracion de la CFNR ya degenerada utilizando anticuerpos capaces de unirse a RGM A.

Otra realizacion se refiere al tratamiento neuroprotector de la degeneracion de CFNR como se observa en una multiplicidad de estados de enfermedad utilizando anticuerpos capaces de unirse a RGM A.

Otra realizacion se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal que bloquea RGM A y evita la interaccion entre RGM A y sus protefnas receptoras y/o de union, es decir, Neogenina y BMP-2, BMP-4, para el tratamiento de la degeneracion de la CFNR.

Otra realizacion de la invencion se refiere a la protefna de union para RGM A humana para su utilizacion en el tratamiento de la degeneracion de la CFNR.

En otra realizacion, dicho tratamiento es un tratamiento terapeutico o profilactico, neurorregenerador o neuroprotector, local o sistemico.

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En otra realizacion "como resultado de dicho tratamiento

1. a. se observa brotacion de neuronas retinianas; y/o

2. b. los axones de las CGR (Celulas Ganglionares de la Retina) en la retina estan preservados frente a la degeneracion.

De acuerdo con un aspecto, la presente invencion proporciona una protefna de union que se disocia de la RGM A humana (hRGM A) con una Kd de 1 x 10-7 M o menos y una constante de la velocidad de disociacion kf de 1 x 10'2s' 1 o menos, ambas determinadas por resonancia de plasmon superficial para su uso en el tratamiento de la degeneracion de la CFNR:

De acuerdo con otro aspecto, la invencion se refiere a una protefna de union, como por ejemplo una protefna de union que muestra las caracterfsticas cineticas anteriores, que se une a RGM A humana y neutraliza la actividad inhibitoria del crecimiento de neuritas de RGM A humana como se determina en un ensayo convencional in vitro, como por ejemplo el ensayo de crecimiento neuronal Ntera como se ilustra en el Ejemplo 3, a continuacion para su uso en el tratamiento de la degeneracion de la CFNR.

Otra realizacion se refiere tambien a una protefna de union para su uso como se ha definido anteriormente, que tiene al menos una de las siguientes caracterfsticas funcionales adicionales: union a RGM A de rata, union a RGM C humana, y union a RGM C de rata.

En otra realizacion, la protefna de union como se define en la presente memoria modula la capacidad de RGM para unirse a al menos uno de sus receptores. Semejante protefna de union se une a un dominio de union al receptor de RGM A humana. Para RGM A se han identificado dominios de union a receptores N y C terminales. Las realizaciones concretas de las protefnas de union de la invencion se unen al dominio de union del receptor N- terminal de RGM A, como se ilustra por la inhibicion de la union entre un fragmento de hRGM A N-terminal, como por ejemplo 47-168 y las moleculas receptoras, como Neogenina y BMP-4. Dicho fragmento de hRGM A N-terminal puede tener una longitud total de aproximadamente 30 a aproximadamente 150 o de aproximadamente 30 a aproximadamente 122 residuos de aminoacidos. Como ejemplo no limitante se pueden mencionar el Fragmento 0 (correspondiente a los residuos N-terminales 47-168) de hRGM A como se describe en la presente memoria o cualquier fragmento de union al receptor mas corto.

En otra realizacion dicha protefna de union modula o inhibe, al menos una de las siguientes interacciones: union de RGM A humana a BMP-4 humana. union de hRGM A a Neogenina humana, union de hRGM C a Neogenina humana, union de RGM A humana a BMP-2 humana.

De acuerdo con una realizacion concreta, la protefna de union como se define en la presente memoria es un anticuerpo humanizado.

La protefna de union como se describio anteriormente puede tener un dominio de union a antfgeno, dicha protefna de union capaz de unirse a un epftopo de una molecula de RGM, comprendiendo dicho dominio de union a antfgeno al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en

GTTPDY: (SEQ ID NO: 59),

FQATHDPLT: (SEQ ID NO: 62),

ARRNEYYGSSFFDY: (SEQ ID NO: 65),

LQGYIPPRT: (SEQ ID NO: 68), y

secuencias de aminoacidos de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50% con una de dichas secuencias. En otra realizacion, la presente invencion se refiere a una protefna de union, que comprende un dominio de union a antfgeno siendo dicha protefna de union capaz de unirse a un epftopo de una molecula de RGM, comprendiendo dicho dominio de union a antfgeno al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

GTTPDY: (SEQ ID NO: 59),

FQATHDPLT: (SEQ ID NO: 62),

ARRNEYYGSSFFDY: (SEQ ID NO: 65),

LQGYIPPRT: (SEQ ID NO: 68), y

secuencias de aminoacidos de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% de identidad con una de dichas secuencias.

Por ejemplo, dicha protefna de union puede comprender dos de dichas CDR, como, por ejemplo el SEQ ID NO: 59 y 5 62; o el SEQ ID NO: 65 y 68; en donde al menos una de dichas CDR puede ser modificada, teniendo una identidad

de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% de identidad con una de dichas secuencias.

Dicha protefna de union puede comprender adicionalmente al menos una CDR que comprende una secuencia de 10 aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 y las secuencias de aminoacidos de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% de identidad, con una de dichas secuencias.

En otra realizacion, dicha al menos una CDR comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que 15 consiste en:

SEQ ID NO: 57: Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 34

SEQ ID NO: 58: Residuos 50 a 66 del SEQ ID NO: 34

SEQ ID NO: 59: Residuos 99-104 del SEQ ID NO: 34

SEQ ID NO: 60: Residuos 24 a 39 del SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 61: Residuos 55-61 del SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 62: Residuos 94-102 del SEC ID NO: 10

SEQ ID NO: 63: Residuos 31 a 35 del SEQ ID NO: 55

SEQ ID NO: 64: Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 55

SEQ ID NO: 65: Residuos 97 a 110 del SEQ ID NO: 55

SEQ ID NO: 66: Residuos 24-34 del SEQ ID NO: 56

SEQ ID NO: 67: Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 56

SEQ ID NO: 68: Residuos 89 a 97 del SEQ ID NO: 56

En otra realizacion, dicha protefna de union comprende al menos 3 CDR que se seleccionan entre un conjunto de CDR de dominio variable que consiste en:

Conjunto VH 5F9

VH 5F9 CDR-H1: Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 57

5F9 VH CDR-H2: Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 58

5F9 VH CDR-H3: Residuos 99 a 104 del SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 59

Conjunto VL 5F9

VL 5F9 CDR-L1: Residuos 24-39 del SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 60

VL 5F9 CDR-L2: Residuos 55-61 del SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 61

VL 5F9 CDR-L3: Residuos 94-102 del SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 62

VH conjunto 8D1

VH 8D1 CDR-H1: Residuos 31 a 35 de la SEQ ID NO.:55 SEQ ID NO: 63

VH 8D1 CDR-H2: Residuos 50 a 66 de la SEQ ID NO.:55 SEQ ID NO: 64

VH 8D1 CDR-H3: Residuos 97-110 del SEQ ID NO: 55. SEQ ID NO: 65

VL conjunto 8D1

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VH conjunto 8D1

VL 8D1 CDR-L1: Residuos 24 a 34 del SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 66

VL CDR-L2 8D1: Residuos 50 a 56 del SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 67

VL 8D1 CDR-L3: Residuos 89-97 del SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 68

o un conjunto de dominios variables en donde al menos una de dichas 3 CDR es una secuencia de aminoacidos CDR modificada que tiene una identidad de secuencia de al menos 50%, como por ejemplo al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% de identidad, con la secuencia parental.

Cada una de dichas modificaciones anteriormente mencionadas puede ser generada por adicion, delecion, o, en particular, sustitucion de un unico o de multiples aminoacidos, o combinaciones de las mismas.

En otra realizacion, la protefna de union comprende al menos dos conjuntos de CDR de dominio variable.

Dichos al menos dos conjuntos de CDR de dominio variable se seleccionan del grupo que consiste en: conjunto de VH 5F9 y conjunto de VL 5F9; y conjunto de VH 8D1 y conjunto de VL 8D1

La protefna de union tal como se utiliza de acuerdo con otra realizacion de la invencion comprende, ademas, un marco aceptor humano.

Dicho marco aceptor humano puede comprender al menos una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y 33.

La protefna de union de la invencion puede comprender al menos un conjunto de secuencias marco seleccionado del grupo que consiste en los conjuntos:

(1) conjunto VH3-48 (SEQ ID NO: 15, 16 y 17) conjunto VH3-33 (SEQ ID NO: 21, 22 y 23) conjunto VH3-23 (SEQ ID NO: 24, 25 y 26)

estando combinado cada uno de los conjuntos combinado con una secuencia de marco adicional, seleccionada entre

JH3 (SEQ ID NO: 18),

JH4 (SEQ ID NO: 19),

JH6 (SEQ ID NO: 20); o

(2) seleccionado del grupo que consiste en los conjuntos

conjunto A18: (SEQ ID NO: 27, 28 y 29) conjunto A17: (SEQ ID NO: 31, 32 y 33)

estando combinado cada uno de los conjuntos con una secuencia marco adicional, seleccionada entre JK2 (SEQ ID NO: 2)

La protefna de union definida anteriormente que comprende al menos un dominio variable de cadena pesada injertado con CDR seleccionado entre los SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, y 43; y/o al menos un dominio variable de cadena ligera injertado con CDR seleccionado entre los SEQ ID NO: 44, 45, y 46.

La protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion comprende una combinacion de dos dominios variables, en donde dichos dos dominios variables tienen secuencias de aminoacido seleccionadas entre: los SEQ ID NO: 35 y 44; 36 y 44; 37 y 44; 38 y 44; 39 y 44; 40 y 44; 41 y 44; 42 y 44; 43 y 44;

los SEQ ID NO: 35 y 45; 36 y 45; 37 y 45; 38 y 45; 39 y 45; 40 y 45; 41 y 45; 42 y 45; 43 y 45;

los SEQ ID NO: 35 y 46; 36 y 46; 37 y 46; 38 y 46; 39 y 46; 40 y 46; 41 y 46; 42 y 46; 43 y 46;

En otra realizacion de la invencion, dicho marco aceptor humano de la protefna de union utilizado de acuerdo con la

invencion comprende al menos una sustitucion de aminoacido en la region marco en un residuo clave, seleccionandose dicho residuo clave del grupo que consiste en: un residuo adyacente a una CDR; un residuo del sitio de glicosilacion; un residuo raro;

un residuo capaz de interaccionar con un epftopo de RGM; un residuo capaz de interaccionar con una CDR; un residuo canonico;

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un residuo de contacto entre la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera; un residuo dentro de una zona de Vernier;

un residuo N-terminal susceptible de formacion de paraglutamato y

un residuo en una region que se solapa entre una cadena pesada variable definida por Chothia CDR1 y un primer marco de la cadena pesada definido Kabat.

Dichos residuos clave se seleccionan del grupo que consiste en (posicion de la secuencia de la cadena pesada): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98 (posicion de la secuencia de la cadena ligera): 2, 4, 41, 51

En una realizacion concreta, la protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion es o comprende un dominio variable humano consenso.

De acuerdo con otra realizacion de la protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion, dicho marco aceptor humano comprende al menos una sustitucion de aminoacido en la region marco, en donde la secuencia de aminoacidos del marco es al menos 65%, como por ejemplo al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o 99%, identica a la secuencia de dicho marco aceptor humano y comprende al menos 70 residuos de aminoacidos, como por ejemplo al menos 75, 80, o 85 residuos, identicos a dicho marco aceptor humano.

De acuerdo con una realizacion concreta, la protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion comprende al menos un dominio variable mutado del marco que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

los SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50; (Dominio VH), y/o seleccionada del grupo que consiste en:

los SEQ ID NO: 51, 52, 53, y 54 (dominio VL)

En particular, dicha protefna de union comprende dos dominios variables opcionalmente mutados del marco, en donde dichos dos dominios variables tienen secuencias de aminoacidos seleccionadas de los grupos que consisten en:

los SEQ ID NO: 47 y 44; 47 y 45; 47 y 46; 47 y 51; 47 y 52; 47 y 53; 47 y 54;

los SEQ ID NO: 48 y 44; 48 y 45; 48 y 46; 48 y 51; 48 y 52; 48 y 53; 48 y 54;

los SEQ ID NO: 49 y 44; 49 y 45; 49 y 46; 49 y 51; 49 y 52; 49 y 53; 49 y 54;

los SEQ ID NO: 50 y 44; 50 y 45; 50 y 46; 50 y 51; 50 y 52; 50 y 53; 50 y 54;

Las protefnas de union utilizadas de acuerdo con otra realizacion de la invencion descrita en la presente memoria son capaces de unirse al menos a una diana, seleccionada entre moleculas de RGM. Son capaces de unirse a RGM A humana, y opcionalmente al menos otra molecula de RGM de origen humano o procedente de monos cinomolgos, rata, pollo, rana, y peces. Por ejemplo se pueden unir ademas a RGM A de rata, RGM C humana, y/o RGM C de rata.

La protefna de union segun se utiliza de acuerdo con otra realizacion de la invencion es capaz de modular, en particular, capaz de neutralizar o inhibir una funcion biologica de una diana, seleccionada entre moleculas de RGM como se definio anteriormente.

En particular, la protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion modula, en particular inhibe, la capacidad de RGM para unirse a al menos uno de sus receptores, como por ejemplo Neogenina, y BMP, como BMP-2 y BMP- 4. Por ejemplo dicha protefna de union modula, en particular, disminuye y en particular inhibe al menos una de las siguientes interacciones:

union de RGM A humana a BMP-4 humana. union de hRGM A a Neogenina humana, union de hRGM C a Neogenina humana, union de RGM A humana a BMP-2 humana.

Las protefnas de union con diferentes combinaciones de caracterfsticas funcionales, y por consiguiente que muestran diferentes perfiles funcionales, como los descritos en la presente memoria, estan tambien dentro del alcance de la invencion. Los ejemplos no limitantes de tales perfiles se enumeran a continuacion:

: Perfiles

Caracterfstica: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Union a RGM A humana: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Union a RGMA de rata: + - + - + + - + - + - + - + - + - + - + +

Union a RGM C humana: + - - - - + - - + + - - + + - - + + - - + +

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: Perfiles

Caracterfstica: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Union a RGM C de rata: + + + + + + + + +

Inhibicion de la union de hRGM A a Neogenina humana: + ■ • + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Inhibicion de la union de hRGM C a Neogenina humana: + ■ • + + + + + + + + +

Inhibicion de la union de RGM A humana a BMP'2 humana: + + + + + +

Inhibicion de la union de RGM A humana a BMP'4 humana: + + + + + +

Por ejemplo, el perfil 1 lo cumple el anticuerpo 5F9 proporcionado por la presente invencion y sus derivados descritos en la presente memoria.

Por ejemplo, el perfil 2 lo cumple el anticuerpo 8D1 proporcionado por la presente invencion y sus derivados descritos en la presente memoria.

Una protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion es capaz de inhibir al menos una actividad biologica de RGM, en particular, RGM A, en donde dicha RGM A se selecciona entre la humana, de mono cinomolgo, de rata, de pollo, de rana, y de pescado.

La protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas cineticas:

(a) una constante de velocidad de asociacion (kon) a dicha diana seleccionada del grupo que consiste en: al menos aproximadamente 102 M'V1; al menos aproximadamente 103 M'V1; al menos aproximadamente 104

1 1 1 51*1 g 1 1 1

M' s' ; al menos aproximadamente 10 M' s' ; al menos aproximadamente 10 M's', y al menos aproximadamente 107 M'V1, medido por resonancia de plasmon superficial;

(b) una constante de velocidad de disociacion (koff) a dicha diana seleccionada del grupo que consiste en: a lo sumo aproximadamente 10' s' , a lo sumo aproximadamente 10' s' ; a lo sumo aproximadamente 10s'; a lo sumo aproximadamente 10'5s'1; y a lo sumo aproximadamente 10'6s'1, medido por resonancia de plasmon superficial; o

(c) una constante de disociacion en equilibrio (Kd) a dicha diana seleccionada del grupo que consiste en: a lo

sumo aproximadamente 10'7 M; a lo sumo aproximadamente 10'8 M; a lo sumo aproximadamente 10'9 M; a lo 1 10 1 11 1 12 sumo aproximadamente 10' M; a lo sumo aproximadamente 10' M; a lo sumo aproximadamente 10' M; y

a lo sumo 10'13 M.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion hace uso de un constructo de anticuerpo que comprende una protefna de union descrita anteriormente, comprendiendo dicho constructo de anticuerpo adicionalmente un polipeptido conector o un dominio constante de inmunoglobulina.

Dichos constructo de anticuerpo o protefna de union pueden ser seleccionados del grupo que consiste en: una molecula de inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, Fv unido a disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio unico, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecffico, un anticuerpo de doble especificidad, una inmunoglobulina de dominio variable dual, y un anticuerpo biespecffico.

En un constructo de anticuerpo como el utilizado de acuerdo con otra realizacion de la invencion, dicha protefna de union comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en;

un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgD humana, un dominio constante de IgA1 humana un dominio constante de IgA2 humana un dominio constante de IgY humana y

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los correspondientes dominios constantes mutados

Un constructo de anticuerpo utilizado de acuerdo con otra realizacion de la invencion comprende un dominio constante de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 11, 12, 13 y 14

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion hace uso de un producto conjugado de anticuerpo que comprende un constructo de anticuerpo descrito en la presente memoria, comprendiendo dicho producto conjugado de anticuerpo adicionalmente un agente seleccionado del grupo que consiste en; una molecula de inmunoadherencia, un agente para la formacion de imagenes, un agente terapeutico, y un agente citotoxico, estando conjugado cada uno de los agentes, por ejemplo, unido covalentemente a dicha protefna de union.

Por ejemplo, dicho agente es un agente para la formacion de imagenes seleccionado del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca

magnetica, y biotina. En particular, dicho agente para la formacion de imagenes es una radiomarca seleccionada del

grupo que consiste en: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc

'In,

I, 131YO, 177Lu, 166Ho

166,

y 153Sm.

Por ejemplo, dicho agente es un agente terapeutico o citotoxico seleccionado del grupo que consiste en; un anti- metabolito, un agente alquilante, un antibiotico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente anti-angiogenico, un agente anti-mitotico, una antraciclina, una toxina, y un agente apoptotico.

De acuerdo con otra realizacion, dicha protefna de union utilizada de acuerdo con otra realizacion de la invencion posee un patron de glicosilacion humano.

Ademas, las protefnas de union, los constructos de anticuerpos y los productos conjugados de anticuerpos utilizados de acuerdo con otra realizacion de la invencion pueden existir en forma de un cristal (en forma cristalina), conservando concretamente la actividad biologica. Dicho cristal es un cristal de liberacion controlada farmaceutico libre de portador. En vista de dicha forma cristalina la protefna de union, el constructo de anticuerpo o el producto conjugado de anticuerpo pueden tener una mayor vida media in vivo que la correspondiente contraparte soluble.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica una secuencia de aminoacidos de la protefna de union, una secuencia de aminoacidos del constructo de anticuerpo, y una secuencia de aminoacidos del producto conjugado de anticuerpo como se describe en la presente memoria.

Otra realizacion de la invencion tambien se refiere a un vector que comprende un acido nucleico aislado como se describe en la presente memoria. En particular, el vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, y pBJ.

Otra realizacion de la invencion tambien se refiere a una celula anfitriona que comprende semejante vector. En particular, dicha celula anfitriona es una celula procariota, como por ejemplo E. coli; o es una celula eucariota, y se puede seleccionar del grupo que consiste en una celula protista, una celula animal, una celula de planta y una celula fungica. En particular, dicha celula eucariota es una celula animal seleccionada del grupo que consiste en una celula de mamffero, una celula aviar, y una celula de insecto. Dicha celula anfitriona se selecciona entre celulas HEK, celulas CHO, celulas COS y celulas de levadura. La celula de levadura puede ser Saccharomyces cerevisiae y dicha celula de insecto puede ser una celula Sf9.

Otra realizacion de la invencion tambien proporciona un metodo para producir una protefna capaz de unirse a RGM, que comprende cultivar una celula anfitriona como se define en la presente memoria en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir una protefna de union capaz de unirse a RGM.

Otra realizacion de la invencion tambien se refiere a una protefna producida de acuerdo con dicho metodo.

Otra realizacion proporciona una composicion para la liberacion de una protefna de union, comprendiendo dicha composicion

(a) una formulacion, en donde dicha formulacion comprende una protefna producto cristalizada como se define en la presente memoria, y un ingrediente; y

(b) al menos un portador polimerico.

Dicho portador polimerico puede ser un polfmero seleccionado entre uno o mas del grupo que consiste en: poli(acido acrflico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoacidos), poli(anhfdridos), poli(depsipeptidos), poli(esteres), poli- (acido lactico), poli(acido lactico-co-glicolico) o PLGA, poli(b-hidroxibutiratos), poli(caprolactona), poli(dioxanona); poli- (etilenglicol), poli((hidroxipropil)metacrilamida, poli[(organo)fosfaceno], poli(orto-esteres), poli(alcohol vinflico), poli(vinilpirrolidona), copolfmeros de anhfdrido maleico-alquilvinileter, polioles pluronicos, albumina, alginato, celulosa

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y derivados de celulosa, colageno, fibrina, gelatina, acido hialuronico, oligosacaridos, glicaminoglicanos, polisacaridos sulfatados, mezclas y copolfmeros de los mismos.

Dicho ingrediente se puede seleccionar del grupo que consiste en albumina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-13-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para tratar un mairnfero que comprende la etapa de administrar al marnffero una cantidad eficaz de la composicion se define en la presente memoria.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el producto (en particular, una protema de union, un constructo o un producto conjugado como se describe anteriormente en la presente memoria), y un portador farmaceuticamente aceptable.

Dicho portador farmaceuticamente aceptable puede funcionar como coadyuvante util para aumentar la absorcion o la dispersion de dicha protema de union.

Por ejemplo, dicho coadyuvante es la hialuronidasa.

De acuerdo con otra realizacion, dicho farmaco comprende ademas al menos un agente terapeutico adicional para el tratamiento de un trastorno en el que la actividad de RGM es perjudicial. Por ejemplo dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: un agente terapeutico, un agente para la formacion de imagenes, un agente citotoxico, inhibidores de la angiogenesis; inhibidores de la quinasa; bloqueadores de moleculas de co-estimulacion; bloqueadores de moleculas de adherencia; anticuerpos anti-citoquinas o fragmentos funcionales de los mismos; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; marcas o indicadores detectables; un antagonista de TNF; un antirreumatico; un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, una eritropoyetina, una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antipsicotico, un estimulante, una medicacion para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o analogo, una citoquina, y un antagonista de citoquina.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para el tratamiento de un sujeto por un trastorno asociado con la degeneracion de CFNR que comprende la etapa de administrar solo o combinado con otros agentes terapeuticos un producto de la invencion (en particular, una protema de union, un constructo o un producto conjugado como se ha descrito anteriormente en la presente memoria).

Dicho trastorno comprende concretamente enfermedades seleccionadas del grupo que comprende retinopatfa diabetica, neuropatfa optica isquemica, retinosquisis ligada al cromosoma X, neuropatfa optica inducida por farmacos, distrofia de la retina, degeneracion macular relacionada con la edad, enfermedades oculares caracterizadas por drusen en la cabeza del nervio optico, enfermedad de los ojos caracterizada por determinantes geneticos de degeneracion de los fotorreceptores, distrofia de conos y bastones autosomica recesiva, y trastornos mitocondriales con neuropatfa optica.

Cualquier ensenanza o referencia al SEQ ID NO: 34 como se describe en la presente memoria se aplica al SEQ ID NO: 9 por analogfa.

3. Usos de polipeptidos que se unen a hRGM A

Otra realizacion de la presente solicitud comprende el uso identificado anteriormente de protemas aisladas o polipeptidos que se unen espedficamente a al menos un epttopo de una protema RGM A. Las protemas o polipeptidos aislados que se unen espedficamente a al menos un epttopo de una protema RGM A son capaces de inhibir la union de RGM A a su receptor Neogenina y/o a las protemas morfogeneticas oseas 2 y 4 (BMP-2, BMP-4), en particular anticuerpos que se unen a RGM A o a porciones de union a antfgeno o fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos anti-RGM A de la presente invencion presentan una alta capacidad para reducir o neutralizar la actividad de RGM A, p. ej., tal como se evaluo mediante uno cualquiera de varios ensayos in vitro e in vivo conocidos en la tecnica o descritos a continuacion.

La presente solicitud, en particular, hace uso de anticuerpos monoclonales neutralizadores contra RGM A, que impiden selectivamente la union de RGM A a su receptor Neogenina y a las protemas morfogeneticas del hueso 2 y 4 (BMP-2, BMP-4), y la generacion de un anticuerpo monoclonal neutralizador contra RGM A, que evita selectivamente la union de RGM A a sus protemas morfogeneticas del hueso 2 y 4 (BMP-2, BMP-4) co-receptoras.

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En particular, el anticuerpo monoclonal neutralizador de la presente solicitud es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. El termino "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes a, o derivadas de, secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal humana (p. ej., vease Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U. S. Department of Health and Human Services, Publicacion NIH Num. 91-3242, 1991). Los anticuerpos humanos de la presente solicitud, sin embargo, pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especffica del sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, la CDR3.

En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal. Se pretende que los ejemplos de anticuerpos neutralizadores de la presente solicitud referidos en la presente memoria como mAb5F9 y mAb8D1 y los fragmentos de anticuerpos funcionales de los mismos, y otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos funcionales con propiedades equivalentes a mAb5F9 y mAb8D1, tales como una alta afinidad de union a RGM A con una cinetica disociacion baja y una alta capacidad de neutralizacion, sean parte de la presente invencion. La afinidad de union y la tasa de disociacion de un anticuerpo anti-RGM A de la presente solicitud a un polipeptido RGM A inmunogenico o fragmento del mismo, se puede determinar por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, la afinidad de union se puede medir por medio de ELISA competitivos, o tecnologfa RIA, BIAcore o KinExA. La tasa de disociacion tambien se puede medir mediante tecnologfa BIAcore o KinExA. La afinidad de union y la tasa de disociacion se miden por medio de resonancia de plasmon superficial utilizando, p. ej., un BIAcore.

Uno de los anticuerpos monoclonales de la presente solicitud, el anticuerpo mAb5F9, tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos 90% con una secuencia que comprende una region variable de cadena pesada (region VH) que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 o 34 y una region variable de cadena ligera (region VL) que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 10.

Tambien se pretende que los anticuerpos monoclonales aislados que interaccionan con RGM A de la presente solicitud puedan ser una protefna de union glicosilada, en donde el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo comprende uno o mas residuos de hidratos de carbono. La produccion de protefna naciente in vivo se puede someter a un procesamiento adicional, conocido como modificacion post-traduccional. En particular, se pueden anadir enzimaticamente residuos de azucares (glicosilo), un proceso conocido como glicosilacion. Las protefnas resultantes que llevan cadenas laterales de oligosacaridos unidos covalentemente se conocen como protefnas glicosiladas o glicoprotefnas. La glicosilacion de protefnas depende de la secuencia de aminoacidos de la protefna de interes, asf como de la celula anfitriona en la que se expresa la protefna. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilacion (p. ej., glicosiltransferasas y glicosidasas), y tener diferentes sustratos (azucares de nucleotidos) disponibles. Debido a estos factores, el patron de glicosilacion de protefnas, y la composicion de los residuos de glicosilo, pueden variar en funcion del sistema del anfitrion en el que se expresa la protefna en particular. Los residuos de glicosilo utiles en la invencion pueden incluir, pero no se limitan a, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N-acetilglucosamina y acido sialico. En particular, la protefna de union glicosilada comprende los residuos de glicosilo de tal manera que el patron de glicosilacion es humano.

Los anticuerpos utilizados de acuerdo con la invencion comprenden una region constante de cadena pesada, tal como una region constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgY o IgD. Ademas, el anticuerpo puede comprender una region constante de cadena ligera, o bien una region constante de cadena ligera kappa o una region constante de cadena ligera lambda. El anticuerpo comprende una region constante de cadena ligera kappa. Alternativamente, la porcion de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de cadena sencilla. Los reemplazos de residuos de aminoacidos en la porcion Fc para alterar la funcion del efector del anticuerpo son conocidos en la tecnica (Winter, et al. Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.648.260; 5.624.821). La porcion Fc de un anticuerpo media varias funciones de efectores importantes, p. ej., la induccion de citoquinas, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y tasa de vida media/eliminacion de anticuerpos o complejos de antfgeno/anticuerpo. En algunos casos las funciones de estos efectores son deseables para el anticuerpo terapeutico pero en otros casos podrfan ser innecesarias o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapeuticos. Ciertos isotipos de IgG humana, particularmente IgG1 e IgG3, median la ADCC y la CDC a traves de la union a R de Fcy y C1q del complemento, respectivamente. Los receptores de Fc neonatales (FcRn) son los componentes crfticos que determinan la vida media en circulacion de los anticuerpos. En otra realizacion mas, se sustituye al menos un residuo de aminoacido en la region constante del anticuerpo, por ejemplo, la region Fc del anticuerpo, de manera que las funciones del efector del anticuerpo se alteran.

3. Generacion de anticuerpos anti-hRGM A

3.1.General

Los anticuerpos de la invencion pueden ser generados por la inmunizacion de un anfitrion adecuado (p. ej., vertebrados, incluyendo seres humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas, caballos, reptiles, peces,

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anfibios, y en huevos de aves, reptiles y peces). Para generar los anticuerpos de la presente solicitud, el anfitrion es inmunizado con un polipeptido RGM A inmunogenico o un fragmento del mismo de la invencion. El termino "inmunizacion" se refiere en la presente memoria al proceso de presentacion de un antfgeno a un repertorio inmunologico si existe ese repertorio en un organismo geneticamente inalterado natural, o un organismo transgenico, incluyendo aquellos modificados para mostrar un repertorio inmunologico humano artificial. Del mismo modo, una "preparacion inmunogenica" es una formulacion de antfgeno que contiene coadyuvantes u otros aditivos que aumentarfan la inmunogenicidad del antfgeno.

La inmunizacion de animales se puede realizar por cualquier metodo conocido en la tecnica. Vease, p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Los metodos para la inmunizacion de animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas y caballos son bien conocidos en la tecnica. Veanse, p. ej., Harlow y Lane y la Patente de los Estados Unidos Num. 5.994.619. En una realizacion concreta, el antfgeno RgM A se administra con un coadyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Tales coadyuvantes incluyen el coadyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (muramildipeptidos) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos coadyuvantes pueden proteger al polipeptido de la dispersion rapida secuestrandolo en un deposito local o pueden contener sustancias que estimulan al anfitrion para secretar factores que son quimiotacticos para los macrofagos y otros componentes del sistema inmunitario. En particular, si se esta administrando un polipeptido, el programa de inmunizacion implicara dos o mas administraciones del polipeptido, que se distribuyen a lo largo de varias semanas.

Se contempla que el anfitrion animal sea inmunizado con el antfgeno asociado con la membrana celular de una celula intacta o desorganizada y los anticuerpos de la presente solicitud se identifican por su union a un polipeptido inmunogenico de la invencion. Despues de la inmunizacion del anfitrion animal con el antfgeno, los anticuerpos pueden ser obtenidos del animal. El suero que contiene los anticuerpos se obtiene del animal por sangrado o sacrificio del animal. El suero se puede utilizar tal como se obtiene del animal, se puede obtener una fraccion de inmunoglobulina a partir del suero, o los anticuerpos se pueden purificar a partir del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidos de este modo son policlonales, teniendo asf una matriz heterogenea de propiedades.

3.2 Anticuerpos monoclonales anti-RGM A utilizando la tecnologfa del hibridoma

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de mecanismos conocidos en la tecnica, incluyendo el uso de tecnologfas de hibridomas, recombinantes, y de presentacion en fagos, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando tecnologfas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la tecnica y se ilustran, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, y, en al., en Monoclonal Antiboides and T-Cell Hybridomas563-681 (Elsevier, N.Y. 1981) (dichas referencias incorporadas como referencia en su totalidad). El termino "anticuerpo monoclonal" segun se utiliza en la presente memoria no se limita a anticuerpos producidos a traves de la tecnologfa de hibridoma. El termino "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un unico clon, incluyendo cualquier clon procariotico, eucariotico o de fago, y no al metodo por el cual se produce.

Los metodos para producir y escrutar anticuerpos especfficos utilizando tecnologfa del hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la tecnica. En una realizacion, la presente invencion proporciona metodos para generar anticuerpos monoclonales asf como anticuerpos producidos por el metodo que comprende cultivar una celula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invencion en donde, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados a partir de un raton inmunizado con un antfgeno de la invencion con celulas de mieloma y despues escrutando los hibridomas resultantes de la fusion para determinar los clones del hibridoma que segregan un anticuerpo capaz de unirse a un polipeptido de la invencion. Brevemente, los ratones pueden ser inmunizados con un antfgeno RGM A. En otra realizacion, el antfgeno RGM A se administra con un coadyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Dichos coadyuvantes incluyen coadyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (muramildipeptidos) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos coadyuvantes pueden proteger el polipeptido de la dispersion rapida secuestrandolo en un deposito local, o pueden contener sustancias que estimulan al anfitrion para que secrete factores que son quimiotacticos para macrofagos y otros componentes del sistema inmunitario. Si se esta administrando un polipeptido, el programa de inmunizacion implicara dos o mas administraciones del polipeptido, distribuidas a lo largo de varias semanas.

Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, p. ej., se detectan anticuerpos especfficos para el antfgeno RGM A en el suero de raton, el bazo del raton se cosecha y los esplenocitos se afslan. Los esplenocitos se fusionan a continuacion mediante mecanismos bien conocidos a cualquier celula de mieloma adecuada, por ejemplo celulas de la lfnea celular SP20 disponible en la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan por dilucion limitante. Los clones de hibridomas se someten a ensayo despues por metodos conocidos en la tecnica para determinar las celulas que segregan anticuerpos capaces de unirse a RGM A. El lfquido ascftico, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, se puede generar mediante la inmunizacion de ratones con clones de hibridoma positivos.

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En otra realizacion, se pueden preparar hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Despues de la inmunizacion, se sacrifica el animal y las celulas B del bazo se fusionan con celulas de mieloma inmortalizadas como es bien conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, mas arriba. En otra realizacion, las celulas de mieloma no secretan polipeptidos de inmunoglobulina (una lfnea celular no secretora). Despues de la fusion y la seleccion con antibiotico, los hibridomas se escrutan utilizando RGM A, o una porcion de la misma, o una celula que expresa RGM A. En otra realizacion, el escrutinio inicial se realiza utilizando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), un ELISA. Un ejemplo de escrutinio por ELISA se proporciona en el documento WO 00/37504, incorporada a la presente memoria como referencia.

Los hibridomas productores de anticuerpos anti- RGM A se seleccionan, se clonan y, adicionalmente se escrutan para determinar las caracterfsticas deseables, incluyendo el crecimiento robusto del hibridoma, la produccion alta de anticuerpos y caracterfsticas deseables de los anticuerpos, como se discute mas adelante. Los hibridomas se pueden cultivar y ampliar in vivo en animales singenicos, en animales que carecen de un sistema inmunologico, p. ej., ratones carentes de sistema inmunologico, o en cultivo celular in vitro. Los metodos de seleccion, clonacion y expansion de hibridomas son bien conocidos para los expertos en la tecnica.

En una realizacion concreta, los hibridomas son hibridomas de raton, como se describio anteriormente. En otra realizacion concreta, los hibridomas se producen en una especie no humana, no de raton tal como rata, oveja, cerdo, cabra, vaca o caballo. En otra realizacion, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que un mieloma no secretor humano se fusiona con una celula humana que expresa un anticuerpo anti-RGM A.

Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epftopos especfficos se pueden generar por medio de tecnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos Fab y F(ab')2 de la invencion por escision proteolftica de moleculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papafna (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la region variable, la region constante de la cadena ligera y el dominio CHI de la cadena pesada.

3.3 Anticuerpos monoclonales anti-RGM A utilizando SLAM

En otro aspecto de la invencion, los anticuerpos recombinantes se generan a partir de linfocitos individuales, aislados utilizando un procedimiento denominado en la tecnica metodo de anticuerpos de linfocitos seleccionados (SLAM), como se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 5.627.052, en la Publicacion PCT WO 92/02551y en Babcock, J. S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848. En este metodo, las celulas individuales que secretan anticuerpos de interes, p. ej., linfocitos derivados de cualquiera de los animales inmunizados descritos anteriormente, son escrutadas utilizando un ensayo de placa hemolftica especffica del antfgeno, en donde el antfgeno RGM A, una subunidad de RGM A, o una fragmento del mismo, esta acoplado a globulos rojos de oveja usando un conector, tal como biotina, y se utiliza para identificar celulas individuales que secretan anticuerpos con especificidad para RGM A. Despues de la identificacion de las celulas que secretan el anticuerpo de interes, se rescatan los ADNc de la region variable de la cadena pesada y ligera de interes de las celulas por medio de transcriptasa inversa-PCR y estas regiones variables se pueden expresar a continuacion, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (p. ej., regiones constantes humanas), en celulas anfitrionas de mamffero, tales como celulas COS o CHO. Las celulas anfitrionas transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse a continuacion a mas analisis y seleccion in vitro, por ejemplo mediante seleccion de las celulas transfectadas para aislar celulas que expresan anticuerpos para RGM A. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas pueden manipularse adicionalmente in vitro, tal como metodos de maduracion de afinidad in vitro tales como los descritos en la Publicacion PCT WO 97/29131 y la Publicacion PCT WO 00/56772.

3.4 Anticuerpos monoclonales anti-RGM A utilizando animales transgenicos

En otra realizacion de la presente invencion, los anticuerpos son producidos por inmunizacion de un animal no humano que comprende algunos, o todos, los loci de inmunoglobulina humana con un antfgeno RGM A. En una realizacion concreta, el animal no humano es un raton transgenico XENOMOUSE, una cepa de raton modificada geneticamente que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en la produccion de anticuerpos de raton. Veanse, p. ej., Green et al. Nature genetics 7: 13-21 (1994) y las Patentes de los Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Veanse tambien el documento WO 91/10741, publicado el 25 de Julio de 1991, el documento WO 94/02602, publicado el 3 de Febrero de 1994, el documento WO 96/34096 y el documento WO 96/33735, ambos publicados el 31 de Octubre de 1996, el documento WO 98/16654, publicado el 23 de Abril de 1998, el documento WO 98/24893, publicado el 11 de Junio de 1998, el documento WO 98/50433, publicado el 12 de Noviembre de 1998, el documento WO 99/45031, publicado el 10 de Septiembre de 1999, el documento WO 99/53049, publicado el 21 de Octubre de 1999, el documento WO 00 09560, publicado el 24 de Febrero de 2000 y el documento WO 00/037504, publicado el 29 de Junio de 2000. El raton transgenico XENOMOUSE produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos totalmente humanos, y genera Mab humanos especfficos de antfgenos. El raton transgenico

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XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introduccion de fragmentos YAC con configuracion de la lmea germinal de tamano de megabases, de los loci de cadena pesada humana y x loci de la cadena ligera. Vease Mendez et al., Nature Genetic 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med.188: 483-495 (1998), cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia.

3.5 Anticuerpos monoclonales anti-RGM A utilizando bibliotecas de anticuerpos recombinantes

Tambien se pueden utilizar metodos in vitro para elaborar los anticuerpos de la invencion, en donde una biblioteca de anticuerpos se escruta para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de union deseada. Los metodos para tal escrutinio de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la tecnica e incluyen los metodos descritos, por ejemplo, por Ladner et al. Patente de los Estados Unidos Num. 5.223.409; Kang et al. Publicacion PCT Num. WO 92/18619; Dower et al. Publicacion PCT Num. WO 91/17271; Winter et al. Publicacion PCT Num. WO 92/20791; Markland et al. Publicacion PCT Num. WO 92/15679; Breitling et al. Publicacion PCT Num. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicacion PCT Num. WO 92/01047; Garrard et al. Publicacion PCT Num. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) BiolTechnology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibody Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 20030186374, y Publicacion PCT Num. WO 97/29131, los contenidos de cada uno de los cuales se incorporan a la presente memoria como referencia.

La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto inmunizado con RGM A, o una porcion de RGM A. Alternativamente, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto no sometido a tratamiento previo, es decir, uno que no ha sido inmunizado con RGM A, tal como una biblioteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con RGM A humana. Los anticuerpos de la invencion se seleccionan mediante el escrutinio de la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el peptido que comprende RGM A humana para seleccionar de ese modo los anticuerpos que reconocen RGM A. Los metodos para la realizacion de dicho escrutinio y seleccion son bien conocidos en la tecnica, tal como se describe en las referencias del parrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la invencion que tienen afinidades de union concretas para hRGM A, tales como los que se disocian de una RGM A humana con un constante de velocidad koff concreta, se puede utilizar el metodo conocido en la tecnica de resonancia de plasmon superficial para seleccionar anticuerpos que tienen la constante de velocidad koff deseada. Para seleccionar los anticuerpos de la invencion que tienen una actividad neutralizadora concreta para hRGM A, tales como aquellos con una CI50 concreta, se pueden utilizar metodos convencionales conocidos en la tecnica para evaluar la inhibicion de la actividad de hRGM A.

En un aspecto, la invencion se refiere a un anticuerpo aislado, o una porcion de union a antfgeno del mismo, que se une a rGm A humana. En particular, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizador. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden generarse utilizando diversos metodos de presentacion en fagos conocidos en la tecnica. En los metodos de presentacion en fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se muestran sobre la superficie de partfculas de fagos que llevan las secuencias de polinucleotidos que los codifican. En particular, tal fago se puede utilizar para mostrar dominios de union a antfgeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (p. ej., humano o murino). El fago que expresa un dominio de union a antfgeno que se une al antfgeno de interes se puede seleccionar o identificar con antfgeno, p. ej., utilizando un antfgeno marcado o un antfgeno unido o capturado en una superficie solida o cuenta. Los fagos usados en estos metodos son tipicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de union fd y M13 expresados a partir del fago con dominios de anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro fusionados recombinantemente a la protema del gen III o del gen VIII del fago. Los ejemplos de los metodos de presentacion en fagos que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invencion incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); Solicitud PcT Num. PCT/GB91/01134; Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108; cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad.

Como se describe en las referencias anteriores, despues de la seleccion de los fagos, las regiones codificantes del anticuerpo del fago se pueden aislar y utilizar para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de union a antfgeno deseado, y se pueden expresar en cualquier anfitrion deseado, incluyendo celulas de mairnfero, celulas de insecto, celulas vegetales, levaduras y bacterias, p. ej., como se describe con detalle a continuacion. Por ejemplo, las tecnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y

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F(ab')2 tambien se pueden emplear utilizando metodos conocidos en la tecnica tales como los descritos en la Publicacion PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1.995); y Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) (dichas referencias incorporadas como referencia en su totalidad). Los ejemplos de las tecnicas que se pueden utilizar para producir Fv de cadena sencilla y anticuerpos incluyen los descritos en las Patentes de los Estados Unidos 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988).

Como alternativa al escrutinio de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante presentacion en fagos, se pueden aplicar otras metodologfas conocidas en la tecnica para el escrutinio de grandes bibliotecas combinatorias a la identificacion de anticuerpos de especificidad dual de la invencion. Un tipo de sistema de expresion alternativo es uno en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de ARN-protefna, como se describe en Publicacion PCT Num. WO 98/31700 de Szostak y Roberts, y en Roberts, R. W. y Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302. En este sistema, se crea una fusion covalente entre un ARNm y el peptido o protefna que codifica por medio de traduccion in vitro de ARNm sinteticos que llevan puromicina, un antibiotico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. Por lo tanto, un ARNm especffico se puede enriquecer a partir de una mezcla compleja de ARNm (p. ej., una biblioteca combinatoria) basandose en las propiedades del peptido o protefna codificados, p. ej., anticuerpo, o porcion del mismo, tal como la union del anticuerpo, o porcion del mismo, al antfgeno de especificidad dual. Las secuencias de acido nucleico que codifican anticuerpos, o porciones de los mismos, recuperadas del escrutinio de tales bibliotecas se pueden expresar por medios recombinantes como se describe anteriormente (p. ej., en celulas anfitrionas de mamfferos) y, ademas, se pueden someter a una mayor maduracion de afinidad por cualquier rondas adicional de escrutinio de fusiones de ARNm-peptido en las que las mutaciones se han introducido en las secuencias seleccionadas originalmente, o por otros metodos para la maduracion de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se ha descrito anteriormente.

En otro enfoque los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden generarse usando metodos de presentacion en levadura conocidos en la tecnica. En los metodos de presentacion en levadura, los metodos geneticos se utilizan para fijar dominios de anticuerpos a la pared celular de levadura y presentarlos en la superficie de la levadura. En particular, dicha levadura se puede utilizar para presentar dominios de union a antfgenos expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (p. ej., humana o murina). Los ejemplos de los metodos de presentacion en levadura que se pueden utilizar para preparar los anticuerpos de la presente invencion incluyen los descritos por Wittrup, et al. en la Patente de los Estados Unidos Num. 6.699.658 incorporada a la presente memoria como referencia.

4. Produccion de anticuerpos RGM A recombinantes particulares de la invencion

Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser producidos por cualquiera de una serie de mecanismos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, expresion en celulas anfitrionas, en donde el vector (o vectores) de expresion que codifican las cadenas pesadas y ligeras es (o son) transfectado a una celula anfitriona mediante tecnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del termino "transfeccion" abarquen una amplia variedad de tecnicas comunmente usadas para la introduccion de ADN exogeno en una celula anfitriona procariotica o eucariotica, p. ej., electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invencion en cualquiera de las celulas anfitrionas procarioticas o eucarioticas, la expresion de anticuerpos en celulas eucarioticas es de interes, y de mayor interes en las celulas anfitrionas de mamffero, debido a que es mas probable que tales celulas eucarioticas (y, en particular las celulas de mamffero) ensamblen y secreten un anticuerpo correctamente plegado e inmunologicamente activo que las celulas procarioticas.

Las celulas anfitrionas de mamffero concretas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invencion incluyen ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluyendo celulas CHO dhfr-, descritas por Urlaub y Chasin, (1980) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, utilizadas con un marcador DHFR seleccionable, p. ej., como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), celulas de mieloma NS0, celulas COS y celulas SP2. Cuando los vectores de expresion recombinantes que codifican genes de anticuerpos se introducen en celulas anfitrionas de mamffero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas anfitrionas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas anfitrionas o, mas concretamente, la secrecion del anticuerpo al medio de cultivo en el que se cultivan las celulas anfitrionas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando metodos de purificacion de protefnas convencionales.

Las celulas anfitrionas tambien se pueden utilizar para producir fragmentos de anticuerpos funcionales, tales como fragmentos Fab o moleculas de tipo scFv. Se entendera que las variaciones sobre el procedimiento anterior estan dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una celula anfitriona con fragmentos funcionales que codifican el ADN de la cadena ligera y/o de la cadena pesada de un anticuerpo de esta invencion. La tecnologfa de ADN recombinante tambien se puede utilizar para eliminar algo o la totalidad del ADN que codifica una o ambas cadenas ligeras y pesadas que no es necesario para la union a los antfgenos de interes.

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Las moleculas expresadas a partir de tales moleculas de ADN truncadas tambien estan abarcadas por los anticuerpos de la invencion. Ademas, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invencion y la otra cadena pesada y ligera son especfficas para un antfgeno distinto de los antfgenos de interes mediante entrecruzamiento de un anticuerpo de la invencion con un segundo anticuerpo por medio de metodos de entrecruzamiento qufmico convencional.

En un sistema concreto para la expresion recombinante de un anticuerpo, o porcion de union al antfgeno del mismo, de la invencion, un vector de expresion recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en celulas CHO dhfr- mediante transfeccion mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresion recombinante, los genes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo estan cada una conectadas operativamente a elementos reguladores potenciador de CMV/promotor de AdMLP para conducir altos niveles de transcripcion de los genes. El vector de expresion recombinante tambien porta un gen DHFR, que permite la seleccion de celulas CHO que han sido transfectadas con el vector usando seleccion/amplificacion con metotrexato. Las celulas anfitrionas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresion de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan tecnicas convencionales de biologfa molecular para preparar el vector de expresion recombinante, transfectar las celulas anfitrionas, seleccionar los transformantes, cultivar las celulas anfitrionas y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Tambien adicionalmente la invencion proporciona un metodo para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invencion cultivando una celula anfitriona de la invencion en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante de la invencion. El metodo puede comprender adicionalmente aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.

4.1 Anticuerpos anti RGM A

La Tabla 5 es una lista de secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de anticuerpos anti-hRGM A concretos de la invencion.

Tabla 5: Lista de secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos anti-hRGM A5F9 y 8D1

imagen2

SEQ ID No .: Region de la proteina Secuencia



: 123456789012345678901234567890

34: VH 5F9 EVQLVE SGGGLVQPGSS LKI, SGVASO FTF.S- NYGMNWIRQAPK KGT.F.W I <JMI YYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSED DA 1Y YCAKGTTPD Y.'JGOG VM VT VS S

<: Roslduos

57: ■ : ■ VH §F9 CDR-Hi ; 31.-35 del 3EQ ID NO.:34 NYGMN

58: VH 5F9 CDR-H2 Residuos 50 66 del SRC? ID NO.; 34 MIYYDSSEKHYADSVKC-

59: ;:VH 5r'9 CDR-H 3 Residuos 99-10 4 del SEQ ID NO.:34i GTTPDY

10: VI 5F9 DW LTQT PV S TiSVT T G DQASMS CRS SQSLE YSDGYTFLEWFLQKPGQSPQLLIYEVSNRF SGVPDRFIGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGV yycfqathdpltfgsgtkleikr

60: VL 5F9 CDR-LI Residuos 24-39 del SEQ ID NO.:10 RSSQSLEYSDGYTFLE

61: VL 5F9 CDR-L2 Residuos 55-61 del SEQ ID NO.:10 EVSNRFS

62: VL 5F9 CDR-L3 Residuos 94-102 del SEQ ID NO.:10 FQATHDPLT

55: VH 8D1 EVQLQQSGPEI.VKPGTSVKMSCRTSGYTFT: SYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIIPYNDNTKY NEKFKGKATLTSDKSSS TAYME LSSLTSED savyycarrneyygssffdywgqgttltvs s :

63: VH 0D1 CDR-lit Residuos 31-35 del SEQ ID MO. :':o SYVMH

64: VH :8Q1 ;CDR-H? ? : Residuos 50-66 del SEQ ID NO.:55 YIIPYNDNTKYNEKFKG

65: VH 8E1 CDR-H3 : Residuos 57-110 del SEQ ID NO.-55 ARRNEYYGSSFFDY

56: VL 8D1 DIQMTQSFASLSAS LEEIVTT TCQASQDID NYLAWYHQKPGKSPRLLIYGATNLADGVPS RFSGSRSGTQFSLKINRLQ1EDLGIYYCLQ GYIPPRTFGGGTKLELKR

66: VL 8D1 CDR-L1 Residuos 24-34 del SEQ ID NO.:56 QASQDIDNYLA

67: VL 8D1 CDR-L2 Residuos 50-56 del SEQ ID NO.:56 GATNLAD

68: VL 8D1 CDR-L3 Residuos 8 9-97 del SEQ ID NO.:56 LQGY1FPRT

Las secuencias de CDR del anticuerpo anti-RGM aislado anterior establecen una nueva familia de protefnas de union a RGM A, aisladas de acuerdo con esta invencion. Para generar y seleccionar las CDR de la invencion que 5 tienen una actividad de union y/o neutralizacion a RGM A concreta con respecto a hRGM A, se pueden utilizar metodos convencionales conocidos en la tecnica para generar protefnas de union de la presente invencion y evaluar

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las caracterfsticas de union y/o neutralization de RGM A de esas protefnas de union, incluyendo pero no limitadas a las descritos especfficamente en la presente memoria.

4.2 Anticuerpos anti-RGM A quimericos

Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una region variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una region constante de inmunoglobulina humana. Los metodos para producir anticuerpos quimericos son conocidos en la tecnica. Veanse, p. ej., Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125: 191-202; Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.807.715; 4,816,567; y 4.816.397, que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad. Ademas, se pueden utilizar las tecnicas desarrolladas para la production de "anticuerpos quimericos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604 hasta 608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454 que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad) mediante corte y empalme de genes de una molecula de anticuerpo de raton de especificidad antigenica apropiada junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada.

En una realizacion, los anticuerpos quimericos de la invencion se producen mediante la sustitucion de la region constante de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales murinos anti-RGM A humana descritos en la presente memoria por una region constante de IgG 1 humana.

4.3 Anticuerpos injertados con CDR anti RGM A

Los anticuerpos injertados con CDR de la invention comprenden secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano en donde una o mas de las regiones CDR de VH y/o VL se sustituyen por secuencias de CDR de anticuerpos no humanos, como por ejemplo, anticuerpos murinos de la invencion. Una secuencia marco de cualquier anticuerpo humano puede servir como molde para el injerto de CDR. Sin embargo, el reemplazo de cadena lineal en uno de tales marcos a menudo conduce a una cierta perdida de afinidad de union al antfgeno. Cuanto mas homologo es un anticuerpo humano al anticuerpo murino original, menos probable es la posibilidad de que la combination de las CDR murinas con el marco humano introduzcan distorsiones en las CDR que pudieran reducir la afinidad. Por lo tanto, es de interes particular que el marco variable humano que se elija para reemplazar el marco variable de raton aparte de las CDR tenga una identidad de secuencia de al menos 65% con el marco de la region variable del anticuerpo murino. Es de mayor interes particular que las regiones variables humanas y murinas, aparte de las CDR tengan al menos una identidad de secuencia de al menos 70%. Es de un interes aun mas particular que las regiones variables humanas y murinas, aparte de las CDR tengan una identidad de secuencia de al menos 75%. Es de un mayor interes particular, que las regiones variables humanas y murinas, aparte de las CDR tengan una identidad de secuencia de al menos 80%. Los metodos para producir anticuerpos injertados con CDR son conocidos en la tecnica (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Patente de los Estados Unidos Num. 5.225.539). En una realization especffica, la invencion proporciona anticuerpos injertados con CDR con cadenas Vh y/o Vl como se describe en la Tabla 6.

TABLA 6: Anticuerpos injertados con CDR

SEQ ID No.: Region de la protefna Secuencia


: 123456789012345678901234567890

35 (15) (16) (17) (18): VH-GL 5F9.1 (VH3-48 / JH3 FR1) (VH3-48 / JH3 FR2) (VH3-48 / JH3 FR3) (VH3-48 / JH3 FR4) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDED TAVYYCARGTTPDYWGQGTMVTVSS

36 (15) (16) (17) (19): VH-GL 5F9.2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

(VH3-48 / JH4 FR1) (VH3-48 / JH4 FR2) (VH3-48 / JH4 FR3) (VH3-48 / JH4 FR4): NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDED TAVYYCARGTTPDYWGQGT LVTVS S

37 (15) (16) (17) (20): VH-GL 5F9.3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

(VH3-48 / JH6 FR1) (VH3-48 / JH6 FR2) (VH3-48 / JH6 FR3) (VH3-48 / JH6 FR4): NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDED TAVYYCARGTTPDYWGQGT TVTVS S

SEQ ID No.

Region de la protefna

Secuencia

(21)

(22)

(23)

(18)

VH 5F9.4-GL

(VH3-33 / JH3 FR1) (VH3-33 / JH3 FR2) (VH3-33 / JH3 FR3) (VH3-33 / JH3 FR4)

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS

NYGMNWVRQAPGKGLEWVAMIYYDSSEKHY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCARGTTPDYWGQGTMVTVSS

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(21)

(22)

(23)

(19)

VH-GL 5F9.5

(VH3-33 / JH4 FR1) (VH3-33 / JH4 FR2) (VH3-33 / JH4 FR3) (VH3-33 / JH4 FR4)

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS

NYGMNWVRQAPGKGLEWVAMIYYDSSEKHY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVY Y CARGTT PDYW GQGT LVTV S S

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(22)

(23)

(20)

VH-GL 5F9.6

(VH3-33 / JH6 FR1) (VH3-33 / JH6 FR2) (VH3-33 / JH6 FR3) (VH3-33 / JH6 FR4)

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS

NYGMNWVRQAPGKGLEWVAMIYYDSSEKHY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCARGTTPDYWGQGTTVTVSS

41

(24)

(25)

(26) (18)

VH 5F9.7-GL

(VH3-23 / JH3 FR1) (VH3-23 / JH3 FR2) (VH3-23 / JH3 FR3) (VH3-23 / JH3 FR4)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARGTTPDYWGQGTMVTVSS .

42

(24)

(25)

(26) (19)

VH 5F9.8-GL

(VH3-23 / JH4 FR1) (VH3-23 / JH4 FR2) (VH3-23 / JH4 FR3) (VH3-23 / JH4 FR4)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGTTPDYWGQGTLVTVS S

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(24)

(25)

(26) (20)

VH 5F9.9-GL

(VH3-23 / JH6 FR1) (VH3-23 / JH6 FR2) (VH3-23 / JH6 FR3) (VH3-23 / JH6 FR4)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS

NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED

TAVYYCARGTTPDYWGQGTTVTVSS

44

(27)

(28)

(29)

(30)

VL 5F9.1-GL

(A18 / JK2 FR1) (A18 / JK2 FR2) (A18 / JK2 FR3) (A18 / JK2 FR4)

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLE Y SDGYT FLEWY LQKPGQSPQLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

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(31)

(32)

(33) (30)

VL 5F9.2-GL

(A17 / JK2 FR1) (A17 / JK2 FR2) (A17 / JK2 FR3) (A17 / JK2 FR4)

DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLE Y SDGYT FLEW FQQRPGQSP RRLIYEVSNRF

SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

46

(31)

(28)

(29)

(30)

VL 5F9.3-GL

(A17 / JK2 FR1) (A18 / JK2 FR2) (A18 / JK2 FR3) (A18 / JK2 FR4)

DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLE Y SDGYTFLEWYLQKPGQSPQLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

Las secuencias de CDR derivadas del mAb 5F9 se indican en negrita. Tambien se hace referencia a las secuencias marco especfficas (FR1 a FR4) indicando los correspondientes SEQ ID NO. (veanse tambien las Tablas 3 y 4)

5 4.4 Anticuerpos humanizados contra RGM A

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Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpo de anticuerpos de especies no humanas que se une al antfgeno deseado que tiene una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las especies no humanas y regiones de marco de una molecula de inmunoglobulina humana. Las secuencias de Ig humanas conocidas se describen, p. ej., en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi;
www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/;www.abcam.com/;
www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html;
www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html;
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www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;
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www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.
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www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni- marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html;
www.recab.uni- hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html;

www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/;
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www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada una incorporada a la presente memoria en su totalidad como referencia. Tales secuencias importados se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la union, afinidad, la velocidad de asociacion, la velocidad de disociacion, la avidez, la especificidad, la vida media, o cualquier otra caracterfstica adecuada, como se conoce en la tecnica.

Los residuos del marco en las regiones marco humanas pueden ser sustituidos por el correspondiente residuo del anticuerpo donador de CDR para alterar, en particular mejorar, la union al antfgeno. Estas sustituciones del marco se identifican mediante metodos bien conocidos en la tecnica, p. ej., mediante modelado de las interacciones de residuos de las CDR y del marco para identificar residuos del marco importantes para la union al antfgeno y comparacion de secuencias para identificar residuos del marco inusuales en posiciones concretas. (Veanse, p. ej., Queen et al., Patente de los Estados Unidos Num. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad). Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales estan comunmente disponibles y son familiares para los expertos en la tecnica. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antfgeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias consenso e importadas de manera que se consiga la caracterfstica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antfgeno o los antfgenos diana. En general, los residuos de CDR estan directamente y mas sustancialmente implicados en influir en la union al antfgeno. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una variedad de mecanismos conocidos en la tecnica, tales como, pero no limitados a los descritos por Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91: 969-973 (1994); publicacion PCT WO 91/09967, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, Patente de los Estados Unidos Nums. 5.565.332, 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483, 5814476, 5763192, 5723323, 5.766886, 5.714.352, 6.204.02, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.53; 4.816.567, cada una incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad, incluyendo las referencias citadas en las mismas.

5. Realizaciones adicionales de anticuerpos de la invencion

5.1 Anticuerpos Fusion e inmunoadhesinas

La presente solicitud tambien describe un anticuerpo de fusion o inmunoadhesina que puede preparar que comprende la totalidad o una parte de un anticuerpo RGM A de la presente solicitud conectado a otro polipeptido. En algunas realizaciones, solo la region variable del anticuerpo RGM A esta conectada al polipeptido. En otras realizaciones, el dominio VH de un anticuerpo RGM A de esta solicitud esta conectado a un primer polipeptido, mientras el dominio VL del anticuerpo esta conectado a un segundo polipeptido que se asocia con el primer polipeptido de una manera que permite que los dominios VH y VL interactuen entre sf para formar un sitio de union al anticuerpo. En otras realizaciones, el dominio VH se separa del dominio VL por medio de un conector que permite

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que los dominios VH y VL interactuen entre si (vease a continuacion Anticuerpos de cadena sencilla). El anticuerpo VH -conector- VL se conecta a continuacion a un polipeptido de interes. El anticuerpo de fusion es util para dirigir un polipeptido a una celula o tejido que expresa un RGM A. El polipeptido de interes puede ser un agente terapeutico, tal como una toxina, o puede ser un agente de diagnostico, tal como una enzima; que pueden ser facilmente visualizados, por ejemplo mediante peroxidasa de rabano picante. Ademas, se pueden crear anticuerpos de fusion en los que dos (o mas) anticuerpos de cadena sencilla se conectan entre si. Esto es util si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena polipeptfdica sencilla, o si se quiere crear un anticuerpo biespecffico.

Una realizacion proporciona una protefna de union marcada en donde un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la presente solicitud se derivatiza o conecta a otra molecula funcional (p. ej., otro peptido o protefna). Por ejemplo, una protefna de union marcada de la presente solicitud se puede obtener conectando funcionalmente un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la presente solicitud (mediante acoplamiento qufmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otra manera) a una o mas entidades moleculares, tales como un acido nucleico, otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecffico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotoxico, un agente farmaceutico, y/o una protefna o peptido que puede mediar la asociacion del anticuerpo o porcion de anticuerpo con otra molecula (tal como una region central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Los agentes detectables utiles con los que un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la presente solicitud se pueden derivatizar incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes fluorescentes detectables ilustrativos incluyen fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo tambien puede ser derivatizado con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se derivatiza con una enzima detectable, esta se detecta mediante la adicion de reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reaccion detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rabano picante esta presente, la adicion de peroxido de hidrogeno y diaminobencidina conduce a un producto de reaccion coloreado, que es detectable. Un anticuerpo tambien se puede derivatizar con un acido nucleico, biotina, y detectar a traves de medicion indirecta de la union a avidina o estreptavidina.

5.2 Anticuerpos de cadena sencilla

La presente solicitud incluye un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se une a un inmunogeno RGM A de la invencion. Para producir el scFv, ADN que codifica VH y V se conecta operativamente al ADN que codifica un conector flexible, p. ej., que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser), de manera que las secuencias de VH y VL pueden expresarse como una protefna de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 30 Nature (1990) 34 8: 552-554). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si solo se utilizan una VH y una VL sencillas, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan mas de dos VH y VL. Dos de dichos fragmentos scFv acoplados a traves de un conector se denominann "diacuerpo", cuya forma tambien es abarcada por la invencion.

5.3 Anticuerpos biespecfficos

La presente solicitud incluye, adicionalmente, un anticuerpo biespecffico o fragmento de union a antfgeno del mismo en el que una especificidad es para un polipeptido RGM A inmunogenico de la presente solicitud. Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo biespecffico que se une especfficamente a un polipeptido RGM A inmunogenico de la invencion a traves de un dominio de union y a una segunda molecula a traves de un segundo dominio de union. Ademas, se puede generar un anticuerpo de cadena sencilla que contiene mas de una VH y VL que se une especfficamente a un polipeptido inmunogenico de la invencion y a otra molecula que se asocia con la atenuacion del colapso del cono de crecimiento mediado por mielina y la inhibicion del crecimiento y la brotacion de neuritas. Tales anticuerpos biespecfficos pueden generarse utilizando tecnicas que son bien conocidas por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, 20 (supra).

En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecfficos se preparan utilizando una o mas de las regiones variables de un anticuerpo de la invencion. En otra realizacion, el anticuerpo biespecffico se prepara utilizando una o mas regiones CDR de dicho anticuerpo.

5.4 Anticuerpos derivatizados y marcados

Un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno de la presente solicitud pueden ser derivatizados o conectados a otra molecula (p. ej., otro peptido o protefna). En general, el anticuerpo o fragmento de union al antfgeno se derivatizan de tal manera que la union a un polipeptido inmunogenico de la invencion no se ve afectada negativamente por la derivacion o el marcaje.

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Por ejemplo, un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la presente solicitud puede ser unido funcionalmente (por acoplamiento qufmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otra manera) a una o mas entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecffico o un diacuerpo), un reactivo de deteccion, un agente citotoxico, un agente farmaceutico, y/o una protefna o peptido que pueden mediar la asociacion del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno con otra molecula (tal como una region central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina). Tambien adicionalmente, un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo puede ser parte de una molecula de inmunoadherencia mas grande, formada por asociacion covalente o no covalente del anticuerpo o porcion de anticuerpo con uno o mas de otros o diferentes protefnas o peptidos. Los ejemplos de tales moleculas de inmunoadherencia incluyen el uso de la region central de estreptavidina para preparar una molecula de scFv tetramerica (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cistefna, un peptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para preparar moleculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Molecular Immunology 31:1047-1058). Se pueden preparar porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, a partir de anticuerpos completos usando tecnicas convencionales, tales como la digestion con papafna o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Por otra parte, se pueden obtener anticuerpos, porciones de anticuerpo y moleculas de inmunoadherencia utilizando tecnicas de ADN recombinante convencionales.

Se puede producir un anticuerpo derivatizado mediante entrecruzamiento de dos o mas anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, p. ej., para crear anticuerpos biespecfficos). Los agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (p. ej., ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncionales (p. ej., suberato de disuccinimidilo). Tales conectores estan disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.

Un anticuerpo derivatizado tambien puede ser un anticuerpo marcado. Por ejemplo, los agentes de deteccion con los que un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion se pueden derivatizar son compuestos fluorescentes, incluyendo fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fosforos que contienen lantanidos y similares. Un anticuerpo tambien puede marcarse con enzimas que son utiles para la deteccion, tales como peroxidasa de rabano picante, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. En realizaciones que estan marcadas con una enzima detectable, el anticuerpo se detecta mediante la adicion de reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reaccion detectable. Por ejemplo, peroxidasa de rabano picante con peroxido de hidrogeno y diaminobencidina. Un anticuerpo tambien puede marcarse con biotina y detectarse a traves de medicion indirecta de la union a avidina o estreptavidina. Un anticuerpo tambien puede marcarse con un epftopo de polipeptido predeterminado reconocido por un informador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metales, etiquetas epftopicas). Un anticuerpo contra RGM A o un fragmento de antfgeno del mismo tambien se pueden marcar con un aminoacido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse tanto para fines diagnosticos como terapeuticos. El anticuerpo contra RGM A radiomarcado se puede utilizar para el diagnostico, por ejemplo, para la determinacion de los niveles del receptor RGM A en un sujeto. Ademas, la anticuerpo contra RGM A radiomarcado se puede utilizar terapeuticamente para el tratamiento de lesiones de la medula espinal.

Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisotopos o radionucleotidos 15N, 35S, 90Y, 99Tc,111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm. Un anticuerpo contra RGM A o un fragmento de antfgeno del mismo tambien puede ser derivatizado con un grupo qufmico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser utiles para mejorar las caracterfsticas biologicas del anticuerpo, p. ej., para aumentar la vida media en suero o para aumentar la union a tejidos. Ademas, una marca para polipeptidos puede incluir un acido nucleico, por ejemplo ADN para la deteccion por PCR, o la mejora de la expresion genica, o ARNip para suprimir la expresion de genes en celulas o tejidos que portan RGM A.

La clase y subclase de anticuerpos contra RGM A se pueden determinar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se pueden determinar usando anticuerpos que son especfficos para una clase y subclase de anticuerpo concreto. Tales anticuerpos estan disponibles comercialmente. La clase y subclase se pueden determinar mediante ELISA, transferencia Western, asf como otras tecnicas. Alternativamente, la clase y subclase se pueden determinar mediante secuenciacion de todo o una porcion de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoacidos con las secuencias de aminoacidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.

5.5 Inmunoglobulinas de dominio variable dual

Las protefnas de union de dominio variable dual (DVD) o inmunoglobulinas segun se utiliza en la presente memoria, son protefnas que comprenden dos o mas sitios de union a antfgeno y que son protefnas de union multivalentes, como por ejemplo divalentes y tetravalentes. El termino "protefna de union multivalente" se utiliza en esta memoria para indicar una protefna de union que comprende dos o mas sitios de union a antfgeno. La protefna de union

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multivalente esta disenada concretamente para tener las dos o mas sitios de union a antfgeno, y generalmente no es un anticuerpo de origen natural. El termino "protefna de union multiespecffica" se refiere a una protefna de union capaz de unirse a dos o mas dianas relacionadas o no relacionadas. Tales DVD pueden ser monoespecfficos, es decir capaces de unirse a un antfgeno o multiespecfficos, es decir, capaces de unirse a dos o mas antfgenos. Las protefnas de union de DVD que comprenden dos polipeptidos DVD de cadena pesada y dos polipeptidos de DVD de cadena ligera hacen referencia a una Ig de DVD. Cada mitad de una Ig de DVD comprende un polipeptido de DVD de cadena pesada, y un polipeptido de DVD cadena ligera, y dos sitios de union al antfgeno. Cada sitio de union comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDR que participan en la union al antfgeno por sitio de union al antfgeno. Las protefnas de union de DVD y metodos de fabricacion de las protefnas de union de DVD se describen en las Solicitudes de Patente de los estados Unidos Num. 11/507050 y se incorporan a la presente memoria como referencia. Se pretende que la presente invencion comprenda una protefna de union de DVD que comprende protefnas de union capaces de unirse a RGM A. Particularmente, la protefna de union de DVD es capaz de unirse RGM A y a una segunda diana. La segunda diana se selecciona del grupo que consiste en las actividades de MAB antiinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, TNF alfa/beta, IFN-beta, gamma, LIF, OSM, CNTF, PF-4, Protefna basica plaquetaria (PBP), NAP-2, beta-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, linfotactina), de protefnas mediadoras del transporte (receptor de insulina, receptor de transferrina, receptor de trombina, receptor de leptina, receptor de LDL) de otros MAB neurorregeneradores (NgR, Lingo, p75, CSPG (p. ej., NG-2, neurocano, brevicano, versicano, agrecano) acido hialuronico, MAG, tenascina, NI-35, NI-250, IMP, perlecano, neurocano, fosfacano, nogo-A, OMGP, Sema4D, Sema 3A, efrina B3, efrina A2, efrina A5, MAG, EphA4, plexina B1, TROY, wnts, ryk rec., BMP-2, BMP-4, BMP-7), de actividades de MAB neuroprotectoras (EgF, EGFR, Sema 3), de MAB anti-beta amiloide (p. ej., m266, 3D6 (bapineuzumab), MAB 7C6 anti-globulomero), de los receptores y transportadores localizados en el SNC (receptores de serotonina, receptores de dopamina, DAT, Asc-1, GlyT1).

5.6 Anticuerpos de especificidad dual

La presente solicitud tambien describe la tecnologfa de "anticuerpo de especifidad dual". Los anticuerpos de especifidad dual pueden servir como agonistas, antagonistas, o ambos en diferentes combinaciones. Los anticuerpos de especificidad dual son anticuerpos en los que la cadena VH se une a un primer antfgeno y la cadena VL se une a otro antfgeno como se ilustra en el documento WO2008082651.

5.7 Anticuerpos cristalizados

Otra realizacion de la presente solicitud proporciona una protefna de union cristalizada. El termino "cristalizado" segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo, o porcion de union a antfgeno del mismo, que existe en forma de cristal. Los cristales son una forma de estado solido de la materia, que es distinta de otras formas tales como el estado solido amorfo o el estado cristalino lfquido. Los cristales estan compuestos de matrices de atomos, iones, moleculas regulares, repetitivas, tridimensionales (p. ej., protefnas tales como anticuerpos), o ensamblajes moleculares (p. ej., complejos antfgeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales estan dispuestas de acuerdo con relaciones matematicas especfficas que son bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental, o elemento esencial, que se repite en un cristal se llama la unidad asimetrica. La repeticion de la unidad asimetrica en una disposicion que se ajusta a una simetrfa cristalografica bien definida dada proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repeticion de la celda unitaria mediante translaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Vease Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., pag. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).

En particular, la presente solicitud describe cristales de anticuerpos contra RGM A completos y fragmentos de los mismos segun se utiliza en la presente memoria, y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una realizacion, la protefna de union cristalizada tiene una mayor vida media in vivo que la contraparte soluble de la protefna de union. En otra realizacion, la protefna de union conserva la actividad biologica despues de la cristalizacion.

La protefna de union cristalizada de la invencion pueden producirse de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica y como se describe en el documento WO 02072636, incorporado a la presente memoria como referencia.

5.8 Anticuerpos glicosilados

Otra realizacion de la invencion proporciona una protefna de union glicosilada en donde el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo comprende uno o mas residuos de carbohidratos. La produccion de protefna naciente in vivo puede someterse a procesamiento adicional, conocido como modificacion post-traduccional. En particular, se pueden anadir enzimaticamente residuos de azucar (glicosilo), un procedimiento conocido como glicosilacion. Las protefnas resultantes que llevan cadenas laterales de oligosacaridos unidos covalentemente se conocen como protefnas o glicoprotefnas glicosiladas. Los anticuerpos son glicoprotefnas con uno o mas restos de carbohidratos en el dominio Fc, asf como en el dominio variable. Los residuos de carbohidratos en el dominio Fc tienen efecto

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importante en la funcion efectora del dominio Fc, con un efecto mfnimo en la union al antfgeno o la vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pags.11-16). En contraste, la glicosilacion del dominio variable puede tener un efecto sobre la actividad de union al antfgeno del anticuerpo. La glicosilacion en el dominio variable puede tener un efecto negativo sobre la afinidad de union del anticuerpo, probablemente debido al impedimento esterico (Co, M. S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30: 1361-1367), o dar como resultado una mayor afinidad por el antfgeno (Wallick, S. C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).

Un aspecto de la presente invencion se refiere a la generacion de mutantes del sitio de glicosilacion en los que se ha mutado el sitio de glicosilacion ligado a O o N de la protefna de union. Un experto en la tecnica puede generar tales mutantes usando tecnologfas convencionales bien conocidas. Los sitios de glicosilacion mutantes que conservan la actividad biologica, pero han aumentado o disminuido la actividad de union son otro objeto de la presente invencion.

En otra realizacion mas, se modifica la glicosilacion del anticuerpo o porcion de union a antfgeno de la invencion. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Tales modificaciones de carbohidratos se puede lograr mediante, por ejemplo, la alteracion de uno o mas sitios de glicosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de uno o mas sitios de glicosilacion de la region variable para eliminar de ese modo la glicosilacion en dicho sitio. Tal aglicosilacion puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Este enfoque se describe con mas detalle en la Publicacion PCT WO2003016466A2 y en la Patente de los Estados Unidos Nums. 5.714.350 y 6.350.861, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad.

Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo modificado de la invencion que tiene un tipo alterado de glicosilacion, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos fucosilo o un anticuerpo que tiene aumento de estructuras de GlcNAc de biseccion. Se han demostrado que tales patrones de glicosilacion alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula anfitriona con la maquinaria de glicosilacion alterada. Las celulas con la maquinaria de glicosilacion alterada se han descrito en la tecnica y se pueden utilizar como celulas anfitrionas en las que para expresar anticuerpos recombinantes de la invencion para producir de este modo un anticuerpo con glicosilacion alterada. Veanse, por ejemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733 a 26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, asf como, la Patente Europea Num.: EP 1.176.195; PCT Publications WO 03/035835; Wo 99/54342 80, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

La glicosilacion de protefnas depende de la secuencia de aminoacidos de la protefna de interes, asf como de la celula anfitriona en la que se expresa la protefna. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilacion (p. ej., glicosiltransferasas y glicosidasas), y tener diferentes sustratos (azucares nucleotidos) disponibles. Debido a estos factores, el patron de glicosilacion de protefnas, y la composicion de los residuos de glicosilo, pueden variar dependiendo del sistema anfitrion en el que se expresa la protefna en particular. Los residuos de glicosilo utiles en la invencion pueden incluir, pero no estan limitados a, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N-acetilglucosamina y acido sialico. En particular, la protefna de union glicosilada comprende los residuos de glicosilo de tal manera que el patron de glicosilacion es humano.

Es conocido por los expertos en la tecnica que diferente glicosilacion de protefnas puede dar como resultado diferentes caracterfsticas de protefnas. Por ejemplo, la eficacia de una protefna terapeutica producida en un microorganismo anfitrion, tal como levadura, y glicosilada utilizando la ruta endogena de levadura puede ser reducida en comparacion con la de la misma protefna expresada en una celula de mamffero, tal como una lfnea celular CHO. Estas glicoprotefnas tambien pueden ser inmunogenicas en seres humanos y muestran una reduccion de la vida media in vivo despues de la administracion. Los receptores especfficos en los seres humanos y otros animales pueden reconocer los residuos de glicosilo especfficos y promover el rapido aclaramiento de la protefna de la sangre. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de protefnas, la solubilidad, la susceptibilidad a proteasas, el trafico, el transporte, la compartimentalizacion, la secrecion, el reconocimiento por otras protefnas o factores, la antigenicidad, o la alergenicidad. Por consiguiente, un medico puede preferir una protefna terapeutica con una composicion y patron de glicosilacion especfficos, por ejemplo composicion y patron glicosilacion identicos, o al menos similares, a los producidos en celulas humanas o en las celulas especfficas de la especie del animal sujeto deseado.

La expresion de protefnas glicosiladas diferentes de las de una celula anfitriona puede conseguirse modificando geneticamente la celula anfitriona para expresar enzimas de glicosilacion heterologas. La utilizacion de mecanismos conocidos en la tecnica un medico puede generar anticuerpos o porciones de union a antfgeno de los mismos que exhiben glicosilacion de la protefna humana. Por ejemplo, las cepas de levadura se han modificado geneticamente para expresar enzimas de glicosilacion de origen no natural de manera que las protefnas glicosiladas (glicoprotefnas) producidas en estas cepas de levadura exhiben glicosilacion de protefnas identica a la de las celulas

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animales, especialmente celulas humanas (Solicitudes de patente de los Estados Unidos Nums. 20040018590 y 20020137134 y Publicacion PCT WO2005100584 A2).

Adicionalmente, un experto en la tecnica apreciara que una protefna de interes puede expresarse usando una biblioteca de celulas anfitrionas modificadas geneticamente para expresar diversas enzimas de glicosilacion, de modo que las celulas anfitrionas miembros de la biblioteca produzcan la protefna de interes con patrones de glicosilacion variantes. Un medico puede entonces seleccionar y aislar la protefna de interes con determinados patrones de glicosilacion novedosos. Concretamente, la protefna que tiene un patron de glicosilacion novedoso seleccionado particularmente exhibe propiedades biologicas mejoradas o alteradas.

5.9 Anticuerpos anti-idiotfpicos

Ademas de las protefnas de union, la presente invencion tambien se refiere a un anticuerpo anti-idiotfpico (anti-Id) especffico para tales protefnas de union de la invencion. Un anticuerpo anti-Id es un anticuerpo que reconoce determinates unicos asociados generalmente con la region de union al antfgeno de otro anticuerpo. El anti-Id se puede preparar mediante la inmunizacion de un animal con la protefna de union o una region que contiene CDR de la misma. El animal inmunizado reconocera y respondera a los determinantes idiotfpicos del anticuerpo inmunizante y produce un anticuerpo anti-Id. El anticuerpo anti-Id tambien se puede usar como un "inmunogeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal mas, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id.

6. Composiciones farmaceuticas

La invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo, o porcion de union a antfgeno del mismo, de la invencion y un portador farmaceuticamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la invencion son para su uso en, pero no estan limitados a, el diagnostico, deteccion, o el seguimiento de un trastorno, en la prevencion, el tratamiento, la gestion, o la mejora de un trastorno o uno o mas sfntomas de los mismos, y/o en investigacion. En una realizacion especffica, una composicion comprende uno o mas anticuerpos de la invencion. En otra realizacion, la composicion farmaceutica comprende uno o mas anticuerpos de la invencion y uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos distintos de los anticuerpos de la invencion para tratar un trastorno en el que la actividad de RGM A es perjudicial. En particular, los agentes profilacticos o terapeuticos son conocidos por ser utiles para o haber sido o estar siendo utilizados en la actualidad en la prevencion, tratamiento, gestion, o mejora de un trastorno o uno o mas de sus sfntomas. De acuerdo con estas realizaciones, la composicion puede comprender adicionalmente un portador, diluyente o excipiente.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invencion se pueden incorporar a composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion a un sujeto. Tfpicamente, la composicion farmaceutica comprende un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En la presente memoria, "portador farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de absorcion, y similares que son fisiologicamente compatibles. Los ejemplos de los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen uno o mas de agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. En muchos casos, tendra particular interes incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composicion. Los vehfculos farmaceuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida util o eficacia del anticuerpo o porcion de anticuerpo.

Varios sistemas de suministro se conocen y se pueden utilizar para administrar uno o mas anticuerpos de la invencion o la combinacion de uno o mas anticuerpos de la invencion y un agente profilactico o un agente terapeutico utiles para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno o uno o mas de sus sfntomas, por ejemplo, encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptores (vease, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construccion de un acido nucleico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc. Los metodos de administracion de un agente profilactico o terapeutico de la invencion incluyen, pero no se limitan a, administracion parenteral (p. ej., intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutanea), administracion epidural, administracion intratumoral, y administracion en la mucosa (p. ej., rutas intranasal y oral). Ademas, se puede emplear la administracion pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulacion con un agente de aerosolizacion. Veanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Nums. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las Publicaciones PCT Nums. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia su totalidad. En una realizacion, un anticuerpo de la invencion, la terapia combinada, o una composicion de la invencion se administran utilizando la tecnologfa de suministro de farmacos pulmonar Alkermes aIr® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En una realizacion especffica, los agentes profilacticos o terapeuticos de la invencion se administran por via intramuscular, por via intravenosa, por via

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intratumoral, por via oral, por via intranasal, por via pulmonar, o por via subcutanea. Los agentes profilacticos o terapeuticos se pueden administrar por cualquier via conveniente, por ejemplo mediante infusion o inyeccion en embolada, mediante absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local.

En una realizacion especffica, puede ser deseable administrar los agentes profilacticos o terapeuticos de la invencion localmente a la zona que necesita tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ejemplo, y no a modo de limitacion, infusion local, mediante inyeccion, o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialasticas, polfmeros, matrices fibrosas (p. ej., Tisseel®), o matrices de colageno. En una realizacion, se administra una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos de los antagonistas de la invencion localmente a la zona afectada a un sujeto para prevenir, tratar, gestionar, y/o mejorar un trastorno o un sfntoma del mismo. En otra realizacion, se administra una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos de la invencion localmente a la zona afectada combinada con una cantidad eficaz de una o mas terapias (p. ej., uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos) distintos de un anticuerpo de la invencion de un sujeto para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar un trastorno o uno o mas de sus sfntomas.

En otra realizacion, el agente profilactico o terapeutico se puede suministrar en un sistema de liberacion controlada o de liberacion sostenida. En una realizacion, se puede utilizar una bomba para lograr una liberacion controlada o sostenida (veanse Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). En otra realizacion, los materiales polimericos se pueden utilizar para lograr una liberacion controlada o sostenida de las terapias de la invencion (vease, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; vease tambien Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1: 105); Patente de los Estados Unidos Num. 5.679.377; Patente de los Estados Unidos Num. 5.916.597; Patente de los Estados Unidos Num. 5.912.015; Patente de los Estados Unidos Num. 5.989.463; Patente de los Estados Unidos Num. 5.128.326; Publicacion PCT Num. WO 99/15154; y Publicacion PCT Num. WO 99/20253. Los ejemplos de polfmeros usados en formulaciones de liberacion sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(acido acrflico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(acido metacrflico), poliglicolidos (PLG), polianhfdridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinflico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidos) (PLGA), y poliortoesteres. En una realizacion concreta, el polfmero utilizado en una formulacion de liberacion sostenida es inerte, esta libre de impurezas lixiviables, es estable durante el almacenamiento, es esteril y es biodegradable. En otra realizacion mas, un sistema de liberacion controlada o sostenida se puede situar en las proximidades de la diana profilactica o terapeutica, requiriendo asf solo una fraccion de la dosis sistemica (vease, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, mas arriba, vol. 2, pags. 115-138 (1984)).

Los sistemas de liberacion controlada se discuten en la revision de Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Cualquier mecanismo conocido para un experto en la tecnica se puede utilizar para producir formulaciones de liberacion sostenida que comprenden uno o mas agentes terapeuticos de la invencion. Veanse, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 4,526,938, la publicacion PCT WO 91/05548, la publicacion PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50: 372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad.

En una realizacion especffica, cuando la composicion de la invencion es un acido nucleico que codifica un agente profilactico o terapeutico, el acido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresion de su agente profilactico o terapeutico codificado, construyendolo como parte de un vector de expresion de acido nucleico apropiado y administrandolo de modo que se convierta en intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (vease la Patente de Estados Unidos Num. 4.980.286), o mediante inyeccion directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartfculas (p. ej., una pistola de genes; biolfstica, Dupont), o recubrimiento con lfpidos o receptores de superficie celular o agentes de transfeccion, o administrandolo en conexion con un peptido de tipo homeobox que se sabe que entra en el nucleo (vease, p. ej., Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 88: 18641868). Alternativamente, un acido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del ADN de la celula anfitriona para su expresion mediante recombinacion homologa.

Una composicion farmaceutica de la invencion se formula para que sea compatible con su via de administracion prevista. Los ejemplos de la vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, parenteral, por ejemplo,

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intravenosa, intradermica, subcutanea, oral, intranasal (p. ej., inhalacion), transdermica (p. ej., topica), transmucosal, y rectal. En una realizacion espedfica, la composicion se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios en forma de una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa, subcutanea, intramuscular, oral, intranasal o topica a seres humanos. Tfpicamente, las composiciones para administracion intravenosa son soluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lignocama para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion.

Si las composiciones de la invencion son para ser administradas por via topica, las composiciones se pueden formular en forma de una pomada, crema, parche transdermico, locion, gel, champu, pulverizacion, aerosol, solucion, emulsion u otra forma bien conocida por un experto en la tecnica. Vease, p. ej., Remington Pharmaceutical Sciences e Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para las formas de dosificacion topicas no pulverizables, se emplean tfpicamente formas de viscosas a semisolidas o solidas que comprenden un vehfculo o uno o mas excipientes compatibles con la aplicacion topica y que tienen una viscosidad dinamica particularmente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitacion, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, unguentos, polvos, linimentos, pomadas, y similares, que son, si se desea, esterilizados o mezclados con agentes auxiliares (p. ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones, o sales) para influir en diversas propiedades, tales como, por ejemplo, la presion osmotica. Otras formas de dosificacion topicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables en las que el ingrediente activo, en particular en combinacion con un vehfculo inerte solido o lfquido, se envasa en una mezcla con una sustancia volatil presurizada (p. ej., un propelente gaseoso, tal como freon) o en un frasco atomizador. Tambien se pueden anadir a las composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion si se desea cremas hidratantes o humectantes. Los ejemplos de tales ingredientes adicionales son bien conocidos en la tecnica.

Si el metodo de la invencion comprende la administracion intranasal de una composicion, la composicion puede formularse en forma de aerosol, pulverizacion, neblina o en forma de gotas. En particular, los agentes profilacticos o terapeuticos para uso de acuerdo con la presente invencion puede ser suministrados convenientemente en forma de una presentacion de pulverizacion de aerosol desde envases presurizados o de un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado (p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para suministrar una cantidad medida. Las capsulas y cartuchos (compuestos, p. ej., de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidon.

Si el metodo de la invencion comprende la administracion oral, las composiciones se pueden formular por via oral en forma de comprimidos, capsulas, sellos, capsulas de gel, soluciones, suspensiones, y similares. Los comprimidos o capsulas se pueden preparar por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p. ej., almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (p. ej., almidon de patata o glicolato de almidon sodico); o agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato sodico). Los comprimidos pueden recubrirse por metodos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas para administracion oral pueden adoptar la forma de, pero no limitada a, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para su reconstitucion con agua u otro vehfculo adecuado antes del uso. Tales preparaciones lfquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o acacia); vehfculos no acuosos (p. ej., aceite de almendras, esteres oleosos, alcohol etflico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p. ej., p- hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener sales tampon, aromatizantes, colorantes, y agentes edulcorantes segun sea apropiado. Las preparaciones para administracion oral pueden formularse convenientemente para la liberacion lenta, liberacion controlada o liberacion sostenida de uno o varios agentes profilacticos o terapeuticos.

El metodo de la invencion puede comprender la administracion pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composicion formulada con un agente de aerosolizacion. Veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nums. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las Publicaciones PCT Nums. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia su totalidad. En una realizacion espedfica, un anticuerpo de la invencion, la terapia combinada, y/o la composicion de la invencion se administran utilizando la tecnologfa de administracion de farmacos pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

El metodo de la invencion puede comprender la administracion de una composicion formulada para la administracion parenteral mediante inyeccion (p. ej., mediante inyeccion en embolada o infusion continua). Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en una forma de dosificacion unitaria (p. ej., en ampollas o en envases multidosis) con un conservante anadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o

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emulsiones en vehfculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como de agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su reconstitucion con un vehfculo adecuado (p. ej., agua libre de pirogenos esteril) antes de su uso. Los metodos de la invencion pueden comprender adicionalmente la administracion de composiciones formuladas en forma de preparaciones de deposito. Tales formulaciones de accion prolongada pueden administrarse mediante implantacion (p. ej., por via subcutanea o intramuscular) o mediante inyeccion intramuscular. Asf, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (p. ej., en forma de una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o en forma de derivados escasamente solubles (p. ej., en forma de una sal poco soluble).

Los metodos de la invencion abarcan la administracion de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de acidos clorhfdrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procafna, etc.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones se suministran por separado o mezclados juntos en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente sellado hermeticamente tal como una ampolla o un sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando el modo de administracion es una infusion, la composicion se puede dispensar con una botella de infusion que contiene agua de calidad farmaceutica esteril o solucion salina. Cuando el modo de administracion es mediante inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administracion.

Otra realizacion proporciona que uno o mas de los agentes profilacticos o terapeuticos, o composiciones farmaceuticas de la invencion se envase en un recipiente hermeticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente. En una realizacion, uno o mas de los agentes profilacticos o terapeuticos, o composiciones farmaceuticas de la invencion se suministra como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente hermeticamente cerrado y puede ser reconstituido (p. ej., con agua o solucion salina) para la concentracion apropiada para la administracion a un sujeto. En particular, uno o mas de los agentes profilacticos o terapeuticos o composiciones farmaceuticas de la invencion se suministra como un polvo liofilizado esteril seco en un recipiente hermeticamente cerrado a una dosis unitaria de al menos 5 mg, mas concretamente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilacticos o terapeuticos liofilizados o las composiciones farmaceuticas de la invencion deben almacenarse entre 2°C y 8°C en su envase original y los agentes profilacticos o terapeuticos, o las composiciones farmaceuticas de la invencion se deben administrar en el plazo de de 1 semana, concretamente en el plazo de 5 dfas, en el plazo de 72 horas, en el plazo de 48 horas, en el plazo de 24 horas, en el plazo de 12 horas, en el plazo de 6 horas, en el plazo de 5 horas, en el plazo de 3 horas, o en el plazo de 1 hora despues de haber sido reconstituidas. En una realizacion alternativa, uno o mas de los agentes profilacticos o terapeuticos o las composiciones farmaceuticas de la invencion se suministran en forma lfquida en un recipiente hermeticamente cerrado que indica la cantidad y concentracion del agente. En particular, la forma lfquida de la composicion administrada se suministra en un recipiente hermeticamente cerrado a al menos 0,25 mg/ml, mas concretamente al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma lfquida debe ser almacenada a temperaturas entre 2°C y 8°C en su envase original.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invencion se pueden incorporar a una composicion farmaceutica adecuada para su administracion parenteral. Particularmente, el anticuerpo o porciones de anticuerpo seran preparados en forma de una solucion inyectable que contiene de 0,1 a 250 mg/ml de anticuerpo. La solucion inyectable puede estar compuesta de cualquiera de una forma de dosificacion lfquida o liofilizada en un vial de vidrio de sflex o ambar, ampolla o jeringuilla precargada. El tampon puede ser L-histidina (1-50 mM), optimamente 5-10 mM, a pH 5,0 a 7,0 (optimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen, pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio puede usarse para modificar la toxicidad de la solucion a una concentracion de 0-300 mM (de manera optima 150 mM para una forma de dosificacion lfquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosificacion liofilizada, principalmente sacarosa al 0-10% (optimamente de 0,5 a 1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes de carga para una forma de dosificacion liofilizada, principalmente manitol al 1-10% (de manera optima 2-4%). Se pueden utilizar estabilizadores en las formas de dosificacion tanto lfquidas como liofilizadas, principalmente L-Metionina 1-50 mM (de manera optima 5-10 mM). Otros agentes de carga adecuados incluyen glicina, arginina, y pueden ser incluidos como polisorbato-80 al 0-0,05% (optimamente 0,005-0,01%). Los tensioactivos adicionales incluyen, pero no se limitan a polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ. La composicion farmaceutica que comprende los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invencion preparados como una solucion inyectable para la administracion parenteral, puede comprender adicionalmente agentes utiles como coadyuvantes, tales como los utilizados para aumentar la absorcion o dispersion de una protefna terapeutica (p. ej.,

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anticuerpo). Un coadyuvante particularmente util es la hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adicion de hialuronidasa en la solucion inyectable mejora la biodisponibilidad humana despues de la administracion parenteral, particularmente la administracion subcutanea. Tambien permite mayores volumenes en el sitio de la inyeccion (es decir, mas de 1 ml) con menos dolor y malestar, e incidencia minima de reacciones en el lugar de la inyeccion. (Veanse los documentos WO2004078140, US2006104968 incorporados a la presente memoria como referencia).

Las composiciones de esta invencion pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificacion liquidas, semisolidas y solidas, tales como soluciones (p. ej., soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones liquidas, comprimidos, pfldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma concreta depende del modo pretendido de administracion y de la aplicacion terapeutica. Las composiciones particulares tfpicas estan en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunizacion pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. La manera concreta de administracion es parenteral (p. ej., intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular). En una realizacion particular, el anticuerpo se administra mediante infusion o inyeccion intravenosa. En otra realizacion particular, el anticuerpo se administra mediante inyeccion intramuscular o subcutanea.

Las composiciones terapeuticas deben ser tfpicamente esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion puede formularse en forma de una solucion, microemulsion, dispersion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porcion de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion mediante filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion alcalino y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles, liofilizados para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion concretos son secado al vacfo y secado por pulverizacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solucion previamente filtrada en condiciones esteriles del mismo. La fluidez apropiada de una solucion puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La absorcion prolongada de composiciones inyectables puede provocarse incluyendo, en la composicion, un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invencion se pueden administrar mediante una variedad de metodos conocidos en la tecnica, aunque para muchas aplicaciones terapeuticas, la vfa/modo particular de administracion es la inyeccion subcutanea, inyeccion o infusion intravenosa. Como apreciara el experto en la tecnica, la via y/o modo de administracion variaran dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehfculo que protegera el compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhfdridos, poli(acido glicolico), colageno, poliortoesteres, y poli(acido lactico). Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la tecnica. Vease, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion puede administrarse por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehfculo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) tambien pueden ser encerrados en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos, o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para la administracion terapeutica oral, a los compuestos se les pueden incorporar excipientes y utilizar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invencion por una administracion distinta de parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co- administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivacion.

Tambien se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos complementarios. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion es co-formulado con y/o co-administrado con uno o mas agentes terapeuticos adicionales que son utiles para el tratamiento de trastornos en los que la actividad de RGM A es perjudicial. Por ejemplo, un anti-anticuerpo o porcion de anticuerpo contra RGM A de la invencion se puede co- formulador y/o co-administrar con uno o mas anticuerpos que se unen a otras dianas (p. ej., anticuerpos que se unen a citoquinas o que se unen a moleculas de la superficie celular). Ademas, uno o mas anticuerpos de la invencion pueden usarse combinados con dos o mas de los agentes terapeuticos anteriores. Tales terapias de combinacion pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los agentes terapeuticos administrados, evitando asf posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

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En ciertas realizaciones, un anticuerpo contra RGM A o fragmento del mismo es conectado a un vehfculo que prolonga la vida media conocido en la tecnica. Tales vehfculos incluyen, pero no se limitan a, el dominio Fc, polietilenglicol, y dextrano. Dichos vehfculos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de los Estados Unidos Num. de Serie 09/428.082 y la Solicitud PCT publicada Num. WO 99/25044, que se incorpora a la presente memoria como referencia para cualquier proposito.

En una realizacion especffica, las secuencias de acido nucleico que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un anticuerpo de la invencion u otro agente profilactico o terapeutico de la invencion se administran para tratar, prevenir, gestionar o mejorar un trastorno o uno o mas de sus sfntomas por medio de terapia genica. La terapia genica se refiere a la terapia realizada mediante la administracion a un sujeto de un acido nucleico expresado o expresable. En esta realizacion de la invencion, los acidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o el gente profilactico o terapeutico de la invencion que media un efecto profilactico o terapeutico.

Cualquiera de los metodos para terapia genica disponibles en la tecnica se puede utilizar de acuerdo con la presente invencion. Para revisiones generales de los metodos de terapia genica, veanse Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991 Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215. Los metodos conocidos comunmente en la tecnica de la tecnologfa de ADN recombinante que se puede utilizar son descritos por Ausubel et al. (eds.), en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). La descripcion detallada de los diversos metodos de terapia genica se describe en el documento US20050042664 A1 que se incorpora a la presente memoria como referencia.

Cualquier agente neuroprotector que sea un antioxidante, un captador de radicales, un farmaco anti-convulsivo, tal como Fenitofna o el farmaco para la anemia Eritropoyetina es adecuado para una terapia combinatoria con anticuerpos contra RGM A pro-regenerativos, prolongandose asf la generalmente muy corta ventana de tratamiento terapeutico de los neuroprotectores.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invencion se pueden utilizar para tratar seres humanos que padecen tales enfermedades.

Se debe entender que los anticuerpos de la invencion o porciones de union a antfgeno de los mismos se pueden usar solos o combinados con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapeutico, siendo seleccionado dicho agente adicional por el experto en la tecnica para su uso pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapeutico reconocido en la tecnica por ser util para el tratamiento de la enfermedad o afeccion que esten siendo tratadas por el anticuerpo de la presente invencion. El agente adicional tambien puede ser un agente que confiere un atributo beneficioso a la composicion terapeutica p. ej., un agente, que afecta a la viscosidad de la composicion.

Ademas, debe entenderse que las combinaciones que se van a incluir dentro de esta invencion son aquellas combinaciones utiles para su proposito pretendido. Los agentes expuestos a continuacion son ilustrativos de los propositos y no se pretende que sean limitantes. Las combinaciones, que son parte de esta invencion, pueden ser los anticuerpos de la presente invencion y al menos un agente adicional seleccionado de la lista de mas abajo. La combinacion tambien puede incluir mas de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinacion es tal que la composicion formada puede realizar su funcion pretendida.

Los ejemplos no limitantes de los agentes terapeuticos para la esclerosis multiple con los que un anticuerpo, o porcion de anticuerpo, de la invencion pueden combinarse incluyen los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferon-p1a (AvOnEX; Biogen); interferon-p1b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferon a-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferon-a (Alfa Wassermann/J&J), interferon p1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics), Peginterferon a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolfmero 1 (Cop-1 ; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxfgeno hiperbarico; inmunoglobulina intravenosa; cladribina; anticuerpos contra o antagonistas de otras citoquinas o factores de crecimiento humanos y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL- 16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invencion, o porciones de union a antfgeno de los mismos, pueden ser combinados con anticuerpos contra moleculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invencion, o porciones de union a antfgeno de los mismos, tambien se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetilo, leflunomida, AINE, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitromboticos, inhibidores del complemento, agentes adrenergicos, agentes que interfieren en la senalizacion por citoquinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (p. ej., inhibidores de quinasas IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP), inhibidores de la enzima conversora de IL-1 p, inhibidores de TACE, inhibidores de las senalizacion de celulas T tales como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-

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mercaptopurinas, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina, receptores de citoquinas solubles y derivados de los mismos (p. ej., receptores de TNF p55 o p75 solubles, RIL-1 Ri, RIL-1RII, RIL-6R) y citoquinas antiinflamatorias (p. ej., IL-4, IL-10, IL-13 y TGFp).

Los ejemplos concretos de agentes terapeuticos para la esclerosis multiple en los que el anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo puede combinarse incluyen interferon-p, por ejemplo, IFNp1a e IFNp1b; copaxona, corticosteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF y anticuerpos contra ligandos CD40 y CD80.

Los anticuerpos de la invencion, o porciones de union a antfgeno de los mismos, tambien se pueden combinar con agentes, tales como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, hidrocloruro de xaliprodeno, fampridina, acetato de glatiramer, natalizumab, sinnabidol, a-immunoquina NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptores de quimioquinas, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposomas), THC.CBD (agonista cannabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpos anti-receptor de IL-6, NeuroVax, pirfenidona allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida, tGf- beta2, tiplimotida, antagonistas de VLA-4 (p. ej., TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferon gamma, agonistas de IL-4.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "cantidad profilacticamente eficaz" de un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o porcion de anticuerpo puede ser determinada por un experto en la tecnica y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porcion de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del anticuerpo o porcion de anticuerpo, son superados por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Tfpicamente, puesto que una dosis profilactica se usa en sujetos antes o en una etapa mas temprana de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.

Los regfmenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta optima deseada (p. ej., una respuesta terapeutica o profilactica). Por ejemplo, se puede administrar un unico bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun indiquen las exigencias de la situacion terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosificacion unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de dosificacion. La forma de dosificacion unitaria segun se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamfferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehfculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de dosificacion unitaria de la invencion estan dictadas por y dependen directamente de (a) las caracterfsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico o profilactico concreto que se vaya a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de composicion de tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.

Un, intervalo ilustrativo no limitante para una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion es de 0,1 a 20 mg/kg, mas concretamente de 1 a 10 mg/kg. Cabe senalar que los valores de dosificacion pueden variar con el tipo y gravedad de la afeccion a aliviar. Se debe entender adicionalmente que para cualquier sujeto concreto, los regfmenes de dosificacion especfficos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de dosificacion establecidos en este documento son ejemplares solamente y no estan destinados a limitar el alcance o practica de la composicion reivindicada.

Ejemplos:

Metodos

Los metodos siguientes describen en detalle los procedimientos experimentales usados en la seccion de Ejemplos.

(i) Se recubrieron placas de ELISA de union directa con hRGM A (R&D) a una concentracion de 2 pg/ml en tampon carbonato. Los pocillos se bloquearon a continuacion con una solucion de bloqueo al 2% (Bio-Rad) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos biotinilados se diluyeron seriadamente con un factor de dilucion 1:5 en bSa/PBS al 0,1% bajo la placa y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. El reactivo de deteccion fue una dilucion 1:10.000 de estreptavidina-HRP en BSA/PBS al 0,1%. La deteccion se

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realizo con un reactivo TMB, que se detuvo con 2N H2SO4 y la DO se leyo a 450 nm.

(ii) Analisis FACS. Los transfectantes estables de celulas HEK293 que expresaban en exceso hRGM A o las celulas BAF3 que expresaban en exceso rataRGM A se sometieron a tincion con MAB 5F9 o 8D1 no marcados durante mas de 15 minutos a 4° en tampon BSA/PBS al 0,1%. La deteccion se llevo a cabo con un anticuerpo de raton anti-IgG PE de rata.

(iii) Ensayos ELISA en fase solida para la evaluacion de MAB 5F9 en ensayos de union de hRGM A- Neogenina.

Las placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) se recubrieron durante 1 hora a 37°C con una concentracion de 2,5 pg/ml del dominio extracelular de la protefna Neogenina humana marcada con His (concentracion de solucion de partida: 30 pg/ml). Despues de la incubacion, la Neogenina no unida se retiro en 3 etapas de lavado separadas con PBS que contenfa Tween 20 al 0,02%. El bloqueo de las placas recubiertas con Neogenina se realizo mediante la adicion de 200 pl por pocillo de una solucion de bloqueo de albumina de suero bovino (BSA) al 3%, PBS, Tween 20 (0,02%). Despues de la incubacion durante 1 hora a 37°C, la solucion de bloqueo se retiro y se anadieron fragmentos RGM A o protefna completa, conjugados con una etiqueta de fc humano, con o sin anticuerpo. En algunos experimentos los anticuerpos se preincubaron con las protefnas hRGM A conjugadas con fc durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas recubiertas con Neogenina se incubaron con hRGM A con o sin anticuerpos durante 1 hora a 37°C. Despues de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 (0,02%), las placas se incubaron con un anticuerpo anti-Fc humano marcado con biotina (1 mg/ml, diluido 1:200 en PBS que contenfa BSA al 0,6%, Tween 20 al 0,02%), Jackson ImmunoResearch Num. de catalogo: 709-065-149, durante 1 hora a 37°C. El anticuerpo no unido se retiro mediante 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 (0,02%). Para visualizar la union del anticuerpo anti-fc marcado con biotina, se anadio un complejo que constaba de Estreptavidina-Peroxidasa (Roche, Num. de catalogo 11089153001), diluido 1:5000 con PBS que contenfa BSA al 0,6%, Tween 20 al 0,02%, seguido de incubacion a 37°C durante 1 h. El complejo de peroxidasa no unido se elimino en 3 etapas de lavado posteriores (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de anadir el sustrato de Peroxidasa (Immuno Pure TMB, Pierce Num. 34021). La reaccion del sustrato se detuvo 1-30 minutos despues de su adicion a los pocillos mediante H2SO4 2,5 M. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos.

(iv) Ensayos de ELISA en fase solida para la evaluacion de MAB 5F9 en ensayos de union de hRGM A - BMP-4.

Las placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) se recubrieron durante 1 hora a 37°C con una solucion que contenfa una concentracion de 2,5 pg/ml de protefna BMP-4 recombinante humana (R & D Systems, Num. 314-BP, Num. de Lote BEM316061). Despues de la incubacion, se separo la BMP-4 no unida en 3 etapas de lavado separadas con PBS que contenfa Tween 20 al 0,02%. El bloqueo de las placas recubiertas con BMP-4 se realizo mediante la adicion de 200 pl por pocillo de una albumina de suero bovino (BSA) al 3%, PBS, solucion de bloqueo de Tween 20 (0,02%). Despues de la incubacion durante 1 hora a 37°C, la solucion de bloqueo se retiro y se anadieron fragmentos de RGM A o protefna completa, conjugados con una etiqueta de fc humano, con o sin anticuerpo. En algunos experimentos los anticuerpos se preincubaron con las protefnas hRGM A conjugadas con fc durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas recubiertas con BMP-4 se incubaron con hRGM A con o sin anticuerpos durante 1 hora a 37°C. Despues de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 (0,02%), las placas se incubaron con un anticuerpo anti-Fc humano marcado con biotina (1 mg/ml, diluido 1:200 en PBS que contenfa BSA al 0,6%, Tween 20 al 0,02%), Jackson ImmunoResearch Num. de catalogo: 709, 065-149, durante 1 hora a 37°C. El anticuerpo no unido se retiro mediante 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 (0,02%). Para visualizar la union del anticuerpo anti-fc marcado con biotina, se anadio un complejo que consistfa en Estreptavidina-Peroxidasa (Roche, Num. de catalogo 11089153001), diluido 1:5000 con PBS que contenfa BSA al 0,6%, Tween 20 al 0,02%, seguido de incubacion a 37°C durante 1 h. El complejo de peroxidasa no unido se retiro en 3 etapas de lavado posteriores (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de anadir el sustrato de Peroxidasa (Immuno Pure TMB, Pierce Num. 34021). La reaccion del sustrato se detuvo 1-30 min despues de su adicion a los pocillos mediante H2SO4 2,5 M. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos.

(v) Ensayos de ELISA en fase solida para la evaluacion de MAB 5F9 en ensayos de union de hRGM A-BMP-2.

Las placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) se recubrieron durante 1 hora a 37°C con una solucion que contenfa una concentracion de 2,5 pg/ml de protefna recombinante humana BMP-2 (R & D Systems, Num. 355-BM, Num. de Lote MSA04). Despues de la incubacion, se retiro la BMP-2 no unida en 3 etapas de lavado separadas con PBS que contenfa Tween 20 al 0,02%. El bloqueo de las placas recubiertas con BMP-2 se realizo mediante la adicion de 200 pl por pocillo de una albumina de suero bovino al 3% (BSA), PBS, solucion de bloqueo de Tween 20 (0,02%). Despues de la incubacion durante 1 hora a 37°C, la solucion de bloqueo se retiro y se anadieron fragmentos de RGM A o protefna completa, conjugados con una etiqueta de fc humano, con o sin anticuerpo. En algunos experimentos los anticuerpos se preincubaron con las protefnas hRGM A conjugadas con fc durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas recubiertas con BMP-2 se incubaron con hRGM A con o sin anticuerpos durante 1 hora a 37°C. Despues de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 (0,02%), las placas se incubaron con un anticuerpo anti-Fc humano marcado con biotina (1 mg/ml, diluido 1:200 en PBS que contenfa BSA

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(vi) Cultivo de celulas Ntera-2

Las celulas Ntera-2 humanas se obtuvieron de la Coleccion Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DMSZ, Braunschweig). Las provisiones de partida congeladas de celulas indiferenciadas Ntera-2 se descongelaron en medio DMEM que contenfa suero bovino fetal al 10% de (FBS; JRH Bioscience, Kansas, USA) y suero de caballo al 5% (HS; Sigma, Alemania). Las celulas se cultivaron en matraces de cultivo (Greiner, Alemania) hasta que alcanzaron la confluencia de 80%.

Para la diferenciacion neuronal, las celulas Ntera-2 se sembraron a una densidad de 2,5 x 106 celulas/175 cm2 en medio de diferenciacion (medio DMEM que contenfa FBS al 10%, HS al 5%, penicilina-estreptomicina al 1%, acido retinoico 10 pM). Las celulas se diferenciaron durante 3 semanas y el medio se intercambio dos veces a la semana.

Despues de la diferenciacion, las celulas se separaron con tripsina-EDTA y se dividieron a una razon 1:6. Cuarenta y ocho horas mas tarde las celulas neuronales se separaron mediante golpecitos de las celulas subyacentes. Las celulas desalojadas fueron transferidas para la agregacion en el nuevo medio a matraces de cultivo oscilante nuevos (Corning, USA). Se permitio que las celulas Ntera-2 diferenciadas se agregaran bajo condiciones de leve balanceo horizontal a 37°C, durante 24 h en medio Neurobasal (Gibco) con un suplemento de B27 (Gibco), glutamina (Gibco) y penicilina-estreptomicina. Los agregados de Ntera-2 se sembraron a una densidad de aproximadamente 20-30 agregados por cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Los cubreobjetos previamente recubiertos de poli-lisina se recubrieron con laminina (20 pg/ml, Sigma) y con el fragmento Num. 786 de RGM A humana acoplada a fc recombinante (aminoacidos 47-168) a una concentracion de 10 pg/ml. Despues de la siembra, los cultivos se trataron con el MAB 5F9, se anadieron a tres concentraciones diferentes (0,1 pg/ml; 1 pg/ml; 10 pg/ml) al medio de cultivo y se incubaron adicionalmente durante 24 horas a 37°C en medio Neurobasal. Los agregados se fijaron en paraformaldehfdo al 4% (2 h, temperatura ambiente) y se permeabilizaron mediante la adicion de Triton X-100 al 0,1% en PBS (20 min. A temperatura ambiente). Para los cultivos de tincion fluorescente se bloquearon con PBS que contenfa BSA al 1% durante 1 h a temperatura ambiente. Despues del bloqueo, las celulas NTERA se incubaron con un anticuerpo monoclonal de raton contra el isotipo 3 de 13-tubulina (SDL3D10 clon, Sigma Num. T8660) durante 2 h a temperatura ambiente. El anticuerpo no unido se elimino mediante 3 etapas de lavado diferentes (5-15 min cada una) y las celulas Ntera se incubaron con un anticuerpo de Burro anti-raton conjugado con Cy-3 (Jackson ImmunoResearch Lote 62597), diluido 1:350 veces en PBS con BSA al 0,5% y 0,5 pg/ml de bisbenzimida. Despues de una incubacion de 1 hora, los cultivos se lavaron 3 veces para retirar el anticuerpo secundario no unido. Para la microscopfa de fluorescencia, cubreobjetos se embebieron en Fluoromount G (Southern Biotech, Eching).

Se adquirieron imagenes de agregados de Ntera-2 utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 200 y el crecimiento de los cultivos se analizaron automaticamente mediante un sistema de adquisicion de imagenes y de analisis propio. El analisis automatico de derivacion se realizo con Imagen Pro Plus 4.5 y el analisis estadfstico de los datos se realizo con GraphPad Prism 4. El crecimiento se normalizo a los cultivos de control desarrollados en ausencia de fragmento Num. 786 de RGM A humana.

(vii) Cultivo de SH-SY5Y.

Las celulas SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) son celulas de neuroblastoma humano derivadas de un tumor cerebral metastasico. Estas celulas se cultivaron en un medio que consistfa en solucion salina equilibrada de Earle (Invitrogen Life Technologies, Num. de catalogo 24010-043) al 50% y Mezcla de Nutrientes F12 (Ham) + GlutaMAX- 1 (Invitrogen Life Technologies, Num. de catalogo 31765-027) al 50%. Este medio se complemento adicionalmente con suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS, JRH Biosciences, Kansas Num. de catalogo 12107-1000M) al 10%, NEAA al 1% (solucion de aminoacidos no esenciales MEM (Sigma-Aldrich Num. de catalogo M1745), y penicilina al 1% (10.000 U/ml)/Estreptomicina (10.000 pg/ml) (Invitrogen Life Technologies, Num. de catalogo 15140122). Para estimular la diferenciacion neuronal y el crecimiento de los procesos neuronales, las celulas SH-SY5Y se cultivaron en medio con un suplemento de acido retinoico 10 mM (Ra, Sigma-Aldrich Num. de catalogo R2625- 050MG)) durante varios dfas. Las celulas SH-SY5Y diferenciadas se cultivaron en matraces de cultivo de tejido y se separaron mediante tripsinizacion cuidadosa y se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con un patron de bandas de protefna rGm A o fragmento de la misma y colageno I.

(viii) Preparacion de cubreobjetos de vidrio con bandas

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La version modificada del ensayo de bandas sobre cubreobjetos de vidrio se llevo a cabo de una manera ligeramente diferente a la descrito previamente (Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216-1224, 2007) y se resume a continuacion.

Matrices de silicio esteriles para la produccion de bandas que consistfan en protefnas purificadas fueron presionadas sobre la superficie de una placa de Petri dirigiendo hacia arriba la cara rugosa de la matriz. Cubreobjetos limpios, lavados con etanol, se colocaron sobre la matriz y las esquinas de la matriz se marcaron con un rotulador en la parte trasera del cubreobjetos. La matriz que portaba el cubreobjetos se volvio cuidadosamente del reves con el cubreobjetos frente a la parte inferior de la placa de Petri. La RGM A inhibidora completa conjugada con fc o fragmentos fc o RGM A humana recombinante (R & D Systems Num. de catalogo 2459 RM) de la misma se mezclaron con 10 pl de un anticuerpo anti-raton marcado con FITC (anti-IgG de raton de cabra especffico de Fab, Sigma-Aldrich Num. de catalogo F-4018) para visualizar las bandas de RGM A. Utilizando una jeringa Hamilton, se inyectaron cuidadosamente 50 pl de la solucion de anticuerpo contra RGM A-FITC a traves del canal de entrada. El exceso de lfquido salio de la matriz a traves del canal de salida y se retiro con un pano Kleenex. Despues de la incubacion de la matriz-cubreobjetos a 37°C durante 2 horas, la primera solucion de recubrimiento (que contenfa RGM A) se lavo con 100 pl de PBS. En la siguiente etapa, el cubreobjetos con las bandas de RGM A se transfirio a una placa de 24 pocillos, se recubrio con 500 pl de Colageno I (Colageno I de cola de rata, Becton Dickinson Biosciences Num. de catalogo 354236) para llenar los espacios vacfos entre las bandas de RGM A y se incubo a 37°C durante 2 horas. En el extremo se produjo un patron de bandas alternas de RGM A y Colageno I en el cubreobjetos. Despues de la incubacion, el colageno I no unido fue retirado mediante lavado mediante tres etapas de lavado separadas con PBS y las celulas SH-SY5Y diferenciadas se sembraron en los cubreobjetos. La incubacion de las celulas SH-SY5Y sobre el sustrato con un patron se continuo a 37°C durante 20-24 horas en presencia o ausencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra RGM A humana.

Para el analisis de inmunofluorescencia las celulas se fijaron en paraformaldehfdo al 4% durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C y se permeabilizaron mediante incubacion con PBS que contenfa Triton X-100 al 0,1% durante 10-20 min a temperatura ambiente. Despues de bloquear con BSA al 3% durante 60 minutos, las celulas se incubaron con el anticuerpo primario (clon sDl 3D10 isotipo 3 anti-IS-tubulina monoclonal, Sigma-Aldrich Num. de catalogo T8660) durante 2 horas a temperatura ambiente y despues de varias etapas de lavado con el anticuerpo secundario (Cy-3 de burro anti-raton JacksonImmuno Research Lote: 62 597), se diluyeron en PBS con BSA al 0,1% durante 1 h. Los nucleos se contratineron utilizando bisbenzimida H33258 (Riedel-de-Haen, Num. de catalogo A-0207). Las celulas se incorporaron finalmente en Fluoromount G (Southern Biotechnology Associates Inc.: Num. de catalogo 010001). Las celulas se analizaron usando un microscopio de fluorescencia Axioplan2 (Zeiss).

(ix) Construccion y expresion de anticuerpos recombinantes anti-RGMA

El ADN que codificaba los fragmentos de ADNc de la region variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales 5F9 y 8D1 de rata anti-RGMA humana se clono en un vector de expresion pHybE que contenfa la region constante de IgG1 humana, que contenfa las mutaciones de aminoacidos region bisagra 2, mediante recombinacion homologa en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en las posiciones 234 y 235 (numeracion de EU, Lund et al., 1991, J. Immunol, 147: 2657). La cadena ligera de la region variable de los anticuerpos monoclonales 5F9 y 8D1 se clono en el vector pHybE que contenfa una region constante kappa humana. Los vectores PHYB-E ilustrativos incluyen pHybE-Hck y pHybE-hCgl, z, no-a (vease la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. de Serie 61/021.282). Los anticuerpos completos se expresaron transitoriamente en celulas 293E mediante co-transfeccion de ADNc de las cadenas pesada y ligera quimericos ligado al plasmido de expresion pHybE. Los sobrenadantes celulares que contenfan el anticuerpo recombinante se purificaron mediante cromatograffa de Protefna A Sefarosa y el anticuerpo unido se eluyo mediante la adicion de tampon acido. Los anticuerpos se neutralizaron y se sometieron a dialisis en PBS. Los anticuerpos monoclonales anti-RGMA humana purificados se sometieron a ensayo a continuacion para determinar su capacidad para unirse a RGMA mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 1 y ELISA de competicion como se describe en el Ejemplo 7.

Ejemplo 1: Generacion de anticuerpos monoclonales anti-RGMA humana

Los anticuerpos monoclonales de rata anti-RGMA humana se obtuvieron como sigue:

Ejemplo 1A: Inmunizacion de ratas con antfgeno de RGMA humana

Se inyectaron por via subcutanea 25 pg de RGMA humana purificada recombinante (R & D Systems Num. de catalogo 2459-RM lote MRH02511A) mezclada con coadyuvante completo de Freund (Sigma), en cuatro edad ratas Harlan Sprague Dawley de 6-8 semanas el dfa 1. Los dfas 21, 42 y 63, se inyecto por via subcutanea veinticinco microgramos de RGMA humana purificada recombinante mezclada con coadyuvante de Freund incompleto (Sigma) en las mismas 4 ratas Harlan Sprague Dawley. El dfa 144, o el dfa 165 a las ratas se les inyectaron por via

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intravenosa 10 |jg de RGMA humana recombinante purificada. Ejemplo 1B: Generacion de hibridoma

Los esplenocitos obtenidos a partir de las ratas inmunizadas descritos en el Ejemplo 1.2.A se fusionaron con celulas SP2/O- a una proporcion de 2:1 de acuerdo con el metodo establecido descrito por Kohler, G. y Milstein 1975, Nature, 256: 495 para generar hibridomas. Los productos de fusion se sembraron en medios de seleccion que contenfan hipoxantina y azaserina en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,5x105 celulas de bazo por pocillo. De siete a diez dfas despues de la fusion, se observaron colonias de hibridoma macroscopicos. El sobrenadante de cada pocillo que contenfa las colonias de hibridoma se sometio a ensayo mediante ELISA directo (vease el Ejemplo 2) para determinar la presencia de anticuerpos contra RGMA humana. Las lfneas celulares positivas del ELISA se sometieron a ensayo en FACS frente a celulas HEK293 transfectadas estables que expresaban RGMA humana y/o de rata. Estas lfneas celulares de hibridoma de rata se sometieron a ensayo posteriormente en un ELISA directo para determinar la reactividad cruzada con la RGMA de rata, y en ELISA de union a la protefna de fusion HuRGMA 47-168.

Tabla 7: Union de lucha contra RGMA rata anticuerpos monoclonales

Nombre: ELISA directo FACS HEK293- ELISA directo ELISA Directo hRGMA 47-

: rHuRGMA rhRGMA rRataRGMA 168/HuIgGFc

ML68-8D1: Sf Sf No Sf

ML69-5F9: Sf Sf Sf Sf

Ejemplo 2: Union mediante ELISA directo de mAbs 5F9 y 8D1.

Como se muestra en la Figura 1A, los MAB 5F9 y 8D1 se unen a hRGM A con tftulos similares, como se describe en la seccion anterior (i). Tambien se demostro que MAB 5F9 se unfa a rataRGM A en ELISA, mientras que 8D1 no era capaz de unirse a rataRGM A (datos no mostrados). La Figura 1B muestra que MAB 5F9 y 8D1 se unen a celulas HEK293 que sobreexpresan hRGM A en FACS. La Figura 1C muestra que 5F9 pero no 8D1 es capaz de unirse a celulas bAF3 que expresan en exceso rataRGM A en FACS. El FACS se llevo a cabo como se describe en la seccion (ii).

Los ensayos de ELISA en fase solida se utilizaron para evaluar la union de MAB 5F9 en ensayos de union de hRGM A-neogenina competitivos. Las placas de ELISA se prepararon y se utilizaron como se describe en la seccion (iii) de la presente solicitud. La hRGM A se anadio a una concentracion de 0,5 jg/ml con anticuerpos 5F9 durante 1 h a 37°C. El MAB 5F9 se uso a las siguientes concentraciones: 1,25 jg/ml; 0,63 jg/ml; 0,32 jg/ml; 0,16 jg/ml; 0,08 jg/ml; 0,04 jg/ml; 0,02 jg/ml; 0,01 jg/ml. La union de hRGM A se visualizo utilizando un anticuerpo anti-fc marcado con Biotina y un complejo de Estreptavidina-Peroxidasa. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos. Como se muestra en la Figura 2, las tres concentraciones mas altas de anticuerpos, inhibieron de manera dependiente de la dosis la union de RGM A humana completa a Neogenina.

Los ensayos de ELISA en fase solida se utilizaron tambien para evaluar el MAB 5F9 en ensayos de union competitiva de hRGM A-BMP-4. Las placas de ELISA se prepararon y se utilizaron como se ha descrito en la seccion (iv) de la presente solicitud. La hRGM A se anadio a una concentracion de 0,5 jg/ml con anticuerpos 5F9 durante 1 h a 37°C. El MAB 5F9 se uso a las siguientes concentraciones: 1,25 jg/ml; 0,63 jg/ml; 0,32 jg/ml; 0,16 jg/ml; 0,08 jg/ml; 0,04 jg/ml; 0,02 jg/ml; 0,01 jg/ml. La union de hRGM A se visualizo utilizando un anticuerpo anti- fc marcado con biotina y un complejo de Estreptavidina-Peroxidasa. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos. Como se muestra en la Figura 3, las cuatro concentraciones mas altas de anticuerpos, inhibieron de una manera dependiente de la dosis la union de RGM A humana completa a BMP-4.

Los Ensayos de ELISA en fase solida tambien se utilizaron para la evaluacion de inhibicion de la union por MAB 5F9 del fragmento 0 (47-168) de hRGM A a BMP-4. Las placas de ELISA se recubrieron durante 1 hora a 37°C con una concentracion de 2,5 jg/ml de la protefna BMP-4 humana recombinante. Se anadio la cadena ligera de hRGM A (fragmento de 0, 47 a 168) a una concentracion de 0,5 mg/ml con 5F9 anticuerpos durante 1 h a 37°C. El MAB 5F9 se uso a las siguientes concentraciones: 1,25 jg/ml; 0,63 jg/ml; 0,32 jg/ml; 0,16 jg/ml; 0,08 jg/ml; 0,04 jg/ml; 0,02 jg/ml; 0,01 jg/ml. La union de hRGM A se visualizo utilizando un anticuerpo anti-fc marcado con biotina y un complejo de Estreptavidina-Peroxidasa. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos. La Figura 4 representa las concentraciones de anticuerpos de 1,25 jg/ml, 0,63 jg/ml y 0,32 jg/ml que inhiben dependientemente de la dosis la union de la cadena ligera de RGM A humana a BMP-4.

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Los ensayos de ELISA en fase solida tambien se utilizaron para evaluar la union de MAB 5F9 en ensayos de union competitiva de hRGM A-BMP-2. Las placas de ELISA se prepararon y utilizaron como se describe en la seccion (v) de la presente solicitud. Se anadio hRGM A completa a una concentracion de 0,5 pg/ml con anticuerpos 5F9 durante 1 h a 37°C. El MAB 5F9 se utilizo a las siguientes concentraciones: 5 pg/ml; 2,5 pg/ml; 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml. La union de hRGM A se visualizo usando un anticuerpo anti-fc marcado con biotina y un complejo de Estreptavidina-Peroxidasa. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos. La Figura 5 representa las concentraciones de anticuerpos de 5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 1,25 pg/ml, 0,63 pg/ml, que inhiben la union de RGM A humana completa a BMP-2.

Los ensayos de ELISA en fase solida tambien se utilizaron para evaluar los MAB 5F9 y 8D1 en ensayos de union de hRGM A-Neogenina, hRGM A-BMP-2 y hRGM A-BMP-4 (Figura 9). Como se ha descrito, las placas de ELISA se recubrieron durante 1 hora a 37°C con una concentracion de 2,5 pg/ml del dominio extracelular de la protefna Neogenina humana etiquetada con His o con 2,5 pg/ml de BMP-2 o BMP- 4. Se anadio hRGM A completa conjugada con fc a una concentracion de 0,5 pg/ml con anticuerpos durante 1 h a 37°C. Los MAB 5F9 y 8D1 se utilizaron a las siguientes concentraciones: 5 pg/ml; 2,5 pg/ml; 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml. La union de hRGM A se visualizo usando un anticuerpo anti-fc marcado con biotina y un complejo de Estreptavidina-Peroxidasa. Las placas se analizaron (determinacion de DO) a una longitud de onda de 450 nm utilizando un fotometro Anthos. Como se muestra en la Figura 9, el anticuerpo monoclonal 8D1 de rata inhibe o reduce la union de RGM A humana a BMP-2 y BMP-4, pero no es capaz de inhibir su union a Neogenina.

Ejemplo 3: Actividad de mAb 5F9 en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados de neuronas NTera humanas diferenciadas.

Se obtuvieron celulas NTera y se cultivaron como se describe en la seccion (vi) del Metodo de la presente solicitud. El mAb 5F9 neutralizo la actividad inhibitoria del crecimiento de neuritas de la potente cadena ligera conjugada con fc (aminoacidos 47 - 168) de la protefna RGM A humana en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados de neuronas NTera humanas diferenciadas. Como se muestra en la Figura 6, en ausencia de una protefna RGM A o fragmento inhibidores y en presencia de la laminina sustrato estimuladora del crecimiento, los agregados de NTera neuronales muestran una amplia y densa red de neuritas en crecimiento (A). Tambien mostrado en la Figura 6, la presencia de la cadena ligera de hRGM A reduce drasticamente el numero, la densidad y la longitud de las neuritas NTera, lo que demuestra la potente actividad inhibidora del fragmento de hRGM A. Las pocas neuritas que salen del agregado son cortas y bien empaquetadas (B). Las partes C-E de la Figura 6 muestran concentraciones crecientes del MAB 5F9, anadidas a los cultivos neutraliza o desreprime de manera dependiente la actividad inhibidora del crecimiento neurftico del fragmento de cadena ligera de la hRGM A. Con concentraciones crecientes del MAB, se restablece completamente el crecimiento de los agregados neuronales de NTera, a pesar de la presencia del inhibidor de RGM A (C: 0,1 pg/ml de MAB 5F9; D: 1 pg/ml de MAB 5F9; E: 10 pg/ml de MAB 5F9).

Se realizo un analisis cuantitativo de la actividad neutralizadora de MAB 5F9 en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados NTera humanos para someter a ensayo el potente fragmento (aminoacidos 47-168) inhibidor de la cadena ligera conjugado con fc de la protefna rGm A humana. El crecimiento de los cultivos se analizo automaticamente por tener agregados tenidos con bisbencimida y posteriormente se fotografio. La tincion solo marco el agregado no las neuritas en crecimiento. Sin embargo, estas se tineron con un anticuerpo contra p3- tubulina y un anticuerpo secundario marcado con fluoroforo. El crecimiento de las neuritas se determino automaticamente calculando el fndice de crecimiento de las neuritas, un fndice determinado restando el area de los cuerpos celulares de la zona tenida con p3-tubulina del agregado y sus procesos. A continuacion, este factor se dividio por el area de los cuerpos celulares como describen Lingor et al. en J. Neurochem. 103: 181-189, 2007. La Figura 7, muestra que el MAB 5F9 neutralizo dependientemente de la dosis (0,1-10,0 pg) la actividad inhibidora del crecimiento de un fragmento (fragmento 0, 47-168; 10 pg) inhibidor de hRGM A conjugado con fc potente en ensayos de crecimiento de neuritas con agregados de Ntera humana.

Ejemplo 4: Actividad de mAb 5F9 en bandas de hRGM A/Colageno I.

Las celulas SH-SY5Y se cultivaron y se utilizaron como se describe en la seccion (vii) de la presente solicitud. Se prepararon cubreobjetos de vidrio con bandas de RGM A y colageno I como se describe en la seccion (viii) de la presente solicitud. Se produjo un tapiz de bandas alternas de hRGM A/Colageno I y Colageno I para los experimentos de acuerdo con un protocolo descrito en la bibliograffa (Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216-1224, 2007). En ausencia del MAB 5F9 (A), las celulas SH-SY5Y neuronales muestran una clara preferencia por la banda de Colageno I, prefiriendo mas de 90% de las celulas las bandas de Colageno I sobre las bandas de hRGM A. Con concentraciones crecientes de MAB 5F9 las celulas SH-SY5Y neuronales prefieren las bandas de hRGM A sobre las bandas de Colageno I (B-E). A la concentracion de MAB mas alta utilizada (E)), las neuronas SH-SY5Y muestran una fuerte preferencia por las bandas de hRGM A en comparacion con las bandas de Colageno I (vease la figura 8). Esto se puede interpretar como una caracterfstica unica del MAB 5F9 ya que transforma la naturaleza inhibidora de RGM A en una actividad atractiva. En presencia de concentraciones crecientes de 5F9, las celulas neuronales prefieren migran y crecer en un sustrato de RGM A, y no en un sustrato permisivo como el Colageno I. Dicha

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caracterfstica unica nunca se habfa descrito antes para un anticuerpo monoclonal.

Ejemplo 5: Construccion de los anticuerpos injertados con CDR

Mediante la aplicacion de metodos convencionales bien conocidos en la tecnica, las secuencias de CDR de cadenas VH y VL del anticuerpo monoclonal 5F9 (vease la Tabla 5 anterior) se injertan en diferentes secuencias aceptoras de cadena pesada y ligera humanas. Basandose en los alineamientos de secuencia de VH y VL con las secuencias de VH y VL del anticuerpo monoclonal 5F9 de la presente invencion se seleccionan las siguientes secuencias humanas conocidas:

a) VH3-48, VH3-33 y VH3-23, asf como las secuencias de empalme hJH3, hJH4 y hJH6 para la construccion de secuencias aceptoras de cadena pesada (de acuerdo con la Tabla 3 de mas arriba);

b) A17 y A18, asf como hJK2 para la construcion de secuencias aceptoras de cadena ligera (de acuerdo con la Tabla 4 de mas arriba).

Al injertar las correspondientes CDR de VH y VL de 5F9 en dichas secuencias aceptoras se prepararon las siguientes secuencias de VH y VL injertadas, humanizadas, modificadas de CDR (vease tambien la Tabla 6, de mas arriba): VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, VH 5F9.3-GL, VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, VH 5F9.6-GL, VH 5F9.7-GL, y VH 5F9.8-GL; VL 5F9.1-GL, VL 5F9.2-GL, y VL 5F9.3-GL.

Ejemplo 6: Construccion de retromutaciones del marco en anticuerpos injertados con CDR

Para generar retromutaciones del marco del anticuerpo humanizado, se introducen mutaciones en las secuencias de anticuerpos injertadas con CDR preparadas de acuerdo con el Ejemplo 5, mediante sfntesis de novo del dominio variable y/o uso de cebadores mutagenicos y PCR, y metodos bien conocidos en la tecnica. Se construyen diferentes combinaciones de retromutaciones y otras mutaciones para cada uno de los injertos de CDR como sigue.

Para las cadenas pesadas VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, y VH 5F9.3-GL se someten a retromutacion uno o mas de los siguientes residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL de la siguiente manera: V37 ^ I, V48 ^ I, S49 ^ G, y/o R98 ^ K

Para las cadenas pesadas VH 5F9.4-GL, GL-VH 5F9.5, y VH-GL 5F9.6 se someten a retromutacion uno o mas de los siguientes residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL de la siguiente manera: V37 ^ I, I ^ V48, A49 ^ G, K ^ R98.

Para las cadenas pesadas VH 5F9.7-GL, GL-VH 5F9.8, y VH-GL 5F9.9 se someten a retromutacion uno o mas de los siguientes residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL de la siguiente manera: V37 ^ I, I ^ V48, S49 ^ G.

Las mutaciones adicionales incluyen las siguientes:

para cadenas pesadas VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, y VH 5F9.3-GL: D88 ^ A, para cadenas pesadas VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, y VH 5F9.6-GL: Q1 ^ E y para las cadenas pesadas VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL, y VH 5F9.9-GL: L5 ^ V.

Para la cadena ligera VL 5F9.1-GL se someten a retromutacion uno o mas de los siguientes residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL de la siguiente manera: I2 ^ V, M4 ^ L, Y41 ^ F.

Para la cadena ligera VL 5F9.2-GL se someten a retromutacion uno o mas de los siguientes residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL de la siguiente manera: M4 ^ L, L ^ R51.

Para la cadena ligera VL 5F9.3-GL se someten a retromutacion uno o mas de los siguientes residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL de la siguiente manera: M4 ^ L, Y41 ^ F.

Ejemplo 7: Construccion y expresion de anticuerpos anti-RGMA humanizados recombinantes

Los vectores de expresion pHybE que albergan las cadenas pesadas y ligeras que contienen retromutaciones del marco se co-transfectaron a celulas 293-6E para producir transitoriamente anticuerpos humanizados de completos, como se describe en la seccion ix de mas arriba. Las mutaciones se introdujeron en las secuencias de anticuerpo injertadas con CDR preparadas de acuerdo con el Ejemplo 5, mediante sfntesis de novo del dominio variable y/o uso de cebadores mutagenicos y PCR, y metodos bien conocidos en la tecnica. Las secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos humanizados se describen en la Tabla 8.

Especfficamente, para las cadenas pesadas:

VH 5F9.1, VH 5F9.5, y VH 5F9.9 contienen VH 5F9.4-GL con una mutacion Q1 ^ E.

VH 5F9.2, VH 5F9.6, VH 5F9.10, VH 5F9.19, VH 5F9.20, VH 5F9.21 y VH 5F9.22 contienen VH 5F9.4-GL

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con una mutacion Q1 — E y las siguientes retromutaciones de residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL: V37 —— I, V48 — — —— K.

VH 5F9.3, VH 5F9.7 y VH 5F9.11 contienen VH 5F9.7-GL con una mutacion L5 — V. VH 5F9.4, 5F9.8 VH, VH 5F9.12, VH 5F9.23, VH 5F9.24, VH 5F9.25, y VH 5F9.26 contienen VH 5F9.7-GL con una mutacion V

— L5 y las siguientes retromutaciones de residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL: V37 — I, V48 — I, S49

— G.

Para las cadenas ligeras:

VL 5F9.1, VL 5F9.2, VL 5F9.3, y VL 5F9.4 son identicos a VL 5F9.1-GL.

VL 5F9.5, VL 5F9.6, VL 5F9.7, y VL 5F9.8 son identicos a VL 5F9.2-GL.

VL 5F9.9, VL 5F9.10, VL 5F9.11, y VL 5F9.12 son identicos a VL 5F9.3-GL.

VL y VL 5F9.19 5F9.23 contienen VL 5F9.2-GL con las siguientes retromutaciones de residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL: M4 — L, L — R51. VL 5F9.20 y VL 5F9.24 contienen VL 5F9.2-GL con las siguientes retromutaciones de residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL: M4 — L.

VL 5F9.21 y VL 5F9.25 contienen VL 5F9.3-GL con las siguientes retromutaciones de residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL: M4 — L, Y41 — F. VL 5F9.22 y VL 5F9.26 contienen VL 5F9.3-GL con las siguientes retromutaciones de residuos de Vernier y de la interfaz VH/VL: M4 — L.

TABLA 8: Expresion de anticuerpos humanizados

SEQ ID NO.: Region de la protefna Secuencia


: 123456789012345678901234567890

47: VH h5F9.1 EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS NYGMNWVRQAPGKGLEWVAMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMN S LRAE D TAVYYCARGTTPDYWGQGTMVTVS S

44: VL h5F9.1 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLE YSDGYTFLEWYLQKPGQS PQLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

48: VH h5F9.2 EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS NYGMNWIRQAPGKGLEWIGMIYYD SSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGTTPDYWGQGTMVTVS S

44: VL h5F9.2 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLE YSDGYTFLEWYLQKPGQSPQLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

49: VH h5F9.3 EVQ LVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMNWVRQAPGKGLEWVSMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGTTPDYWGQGTMVTVS S

44: VL h5F9.3 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLE YSDGYTFLEWYLQKPGQS PQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

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SEQ ID NO.: Region de la protefna Secuencia

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45: VL h5F9.5 DWMTQ S PL S L PVT LGQ PAS ISCRSSQSLE YSDGYTFLEWFQQRPGQ S PRRL1YEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

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47: VH h5F9.9 EVQ LVE SGGGWQ PGRS LRL SCAASGFT FS NYGMNWVRQAPGKGLEWVAMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARGTTPDYWGQGTMVTVS S

SEQ ID NO.: Region de la protefna Secuencia

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SEQ ID NO.: Region de la protefna Secuencia

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52: VL h5F9.24 DWLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLE YSDGYTFLEWFQQRPGQS PRRLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

SEQ ID NO.: Region de la protefna Secuencia

50: VH h5F9.25 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYGMNWIRQAPGKGLEWIGMIYYD SSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAED TAVYYCAKGTTPDYWGQGTMVTVSS

53: VL h5F9.25 DWLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLE YSDGYTFLEWFLQKPGQSPQLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

50: VH h5F9.26 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYGMNWIRQAPGKGLEWIGMIYYDSSEKHY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGTTPDYWGQGTMVTVS S

54: VL h5F9.26 DWLTQSPLSLPVTLGQPAS I SCRSSQSLE YSDGYTFLEWYLQKPGQSPQLLIYEVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQATHDPLTFGQGTKLEIKR

Ejemplo 8: Caracterizacion de anticuerpos 5F9 humanizados utilizando ELISA de competition

Las placas ELISA (Costar 3369) se recubrieron durante la noche a 4°C con 50 pl/pocillo de hRGMA de 0,25 pg/ml en 5 tampon de carbonato-bicarbonato de sodio 0,2 M, pH 9,4, se lavaron con Tampon de Lavado (PBS que contiene Tween 20 al 0,1%), y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con 200 pl/pocillo de leche en polvo no grasa al 2% en pBs. Despues de lavar con Tampon de Lavado, se anadio por duplicado una mezcla de un quimerico 5F9 biotinilado (concentration final 0,1 pg /ml) y anticuerpo de ensayo competidor no marcado partiendo de una concentration final de 50 pg/ml y diluido seriadamente 5 veces) en 50 pl/pocillo de tampon de ELISA. 10 Despues de incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente, y lavar con Tampon de Lavado, los anticuerpos unidos se detectaron usando 100 pl/pocillo de dilution 1:10.000 de estreptavidina conjugada con HRP (Fitzgerald) en tampon de ELISA. Despues de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, y lavar con Tampon de Lavado, se llevo a cabo el desarrollo del color mediante la adicion de 100 pl/pocillo de tampon TMB (Zymed). Despues de incubar durante 15 min a temperatura ambiente, el desarrollo del color se detuvo anadiendo 50 pl/pocillo 15 de acido clorhfdrico 1N. La absorbancia se leyo a 490 nm.

La Tabla 9 muestra los valores de CI5o de los anticuerpos humanizados 5F9 obtenidos utilizando el soporte logico de ordenador GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

20 Tabla 9: Valores de IC50 de anticuerpos 5F9 humanizados en ELISA competitivo

Anticuerpo: CI50 (pg/ml) Anticuerpo CI50 (pg/ml)

h5F9.1: > 10 h5F9.19 N/A

h5F9.2: > 10 h5F9.20 > 2.0

h5F9.3: > 10 h5F9.21 0.60

h5F9.4: > 10 h5F9.22 > 2.0

h5F9.5: > 10 h5F9.23 0.55

h5F9.6: > 10 h5F9.24 1.32

h5F9.7: > 10 h5F9.25 0.66

h5F9.8: > 10 h5F9.26 > 2.0

h5F9.9: > 10

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Anticuerpo: CI50 (pg/ml) Anticuerpo CI50 (pg/ml)

h5F9.11: > 10

h5F9.12: > 10

Ejemplo 9: Determinaciones de afinidad de anticuerpos quimericos y humanizados utilizando tecnologfa BIACORE

El ensayo BIACORE (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) determina la afinidad de los anticuerpos con las mediciones cineticas de las constantes de asociacion y disociacion. La union de los anticuerpos a RGMA humana purificada recombinante se determino mediante mediciones basadas en resonancia de plasmon superficial con un aparato Biacore® 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) utilizando HBS-EP de migracion (HEPES l0 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005%) a 25°C. Todos los productos qufmicos se obtuvieron de Biacore® AB (Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron aproximadamente 5000 UR de anticuerpo policlonal especffico de fragmento, (Fcy), IgG de cabra anti-humana (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluido en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5) directamente a traves de un chip biosensor de calidad para investigacion CM5 utilizando un kit de acoplamiento de amina convencional de acuerdo con las instrucciones y los procedimientos del fabricante a 25 pg/ml. Los radicales sin reaccionar sobre la superficie de biosensor se bloquearon con etanolamina. Se utilizo una superficie de carboximetildextrano modificado en la celda de flujo 2 y 4 como una superficie de reaccion. Se utilizo carboximetildextrano sin modificar sin IgG de cabra anti-humana en la celda de flujo 1 y 3 como la superficie de referencia. Los anticuerpos purificados se diluyeron en solucion salina tamponada con HEPES para la captura a traves de superficies de reaccion especfficas de anti-IgG humana de cabra. Los anticuerpos humanos que se van a capturar como ligando (25 pg/ml) se inyectaron sobre matrices de reaccion a una velocidad de flujo de 5 pl/min. Las constantes de velocidad de asociacion y disociacion, Kon (unidad M"1s"1) y koff (unidad s"1) se determinaron de acuerdo con un flujo continuo de 25 pl/min. Las constantes de velocidad se obtuvieron mediante mediciones cineticas de union al antfgeno a diez concentraciones diferentes que oscilan de 0,39 a 50 nM. Para el analisis cinetico, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de union de Langmuir 1:1 se ajustaron simultaneamente a las fases de asociacion y disociacion de las ocho inyecciones (utilizando el analisis de ajuste global) con el uso de soporte logico Bioevaluation 4.0.1. La constante de disociacion en equilibrio (unidad M) de la reaccion entre los anticuerpos humanizados y la RGMA humana recombinante purificada se calculo a continuacion a partir de las constantes de velocidad cineticas mediante la siguiente formula: Kd = kf/kon.

Tabla 9: Afinidad de anticuerpos monoclonales anti-RGMA quimericos y humanizados

Nombre: kon (1/M • s) koff (1/s) Kd (nM)

5F9 quimerico: 7,65 x 105 2,36 x 10-3 3,09

h5F9.21: 3,55 x 105 2,69 x 10-3 7,59

h5F9.23: 5,07 x 105 2,21 x 10-3 4,37

h5F9.25: 5,70 x 105 3,29 x 10-3 5,78

Ejemplo 10: Los anticuerpos humanizados 5F9 neutralizan la actividad quimiorepelente de RGM A humano en un ensayo de quimiotaxis de SH-SY5Y neuronal.

El ensayo de quimiotaxis mide el comportamiento quimiotactico de las celulas en respuesta a factores difusibles que puede ejercer actividades quimioatrayentes o quimiorepelentes. La RGM A ha sido descrita como una protefna que actua en forma tanto unida a membrana (repulsion dependiente del contacto) como difusible, soluble (quimiorepelente) y por lo tanto se ha evaluado en un ensayo de quimiotaxis de hRGM A. Para este fin se utilizaron celulas de neuroblastoma humano SH-SY5Y sensibles a RGM A, que portan el receptor de RGM Neogenina (Schaffar et al. J. Neurochemistry: 107: 418-431, 2008). Se cultivaron celulas SH-SY5Y en Solucion Salina Equilibrada de Earle/F12 (EBSS/F12) con un suplemento de suero bovino fetal al 10% y aminoacidos no esenciales al 1% (MEM-NEAA). Para la induccion de crecimiento de neuritas las celulas se cultivaron en medio con un suplemento de acido retinoico (RA) 10 mM. Al cabo de 5-6 horas, las celulas se trataron con tripsina y se contaron para la siembra en las Camaras de Boyden de 24 pocillos (BD Falcon 351185, HTS Multiwell System). Se anadieron 500 pl de la suspension celular (correspondiente a 1x105 celulas) al cfrculo interior de cada pocillo. Este cfrculo interior esta separado del cfrculo exterior mas grande de cada pocillo por una membrana de PET con un diametro de poro de 8 pm. Se pipetearon 600 pl de medio +/- RGM A +/- anticuerpos al cfrculo exterior y las celulas se cultivaron en las Camaras Boyden Multipocillo durante la noche a 37°C. Despues el medio de incubacion se aspiro y se reemplazo por el fijador (paraformaldehfdo al 2%. La fijacion continuo durante 2 horas a temperatura ambiente y despues de varias etapas de lavado con PBS se realizo la permeabilizacion utilizando PBS que contenfa Triton-X- 100 al 0,1% (15 min, RT). La tincion de las celulas se realizo incubando las mismas durante 1 hora en la oscuridad en una solucion de Faloidina Alexa Fluor 488 1:100 (Invitrogen A12379) y Bisbenzimida (H332456) 1:100. Despues de 2 etapas de lavado con PBS, los cultivos cargaron con PBS, se sellaron con parafilm y se almacenaron en la

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oscuridad para el analisis con un microscopio de fluorescencia (Zeiss Axiovert).

En la ausencia de hRGM A las celulas migran a traves de los poros de la membrana y se pueden contar despues de la fijacion y la tincion. Solo se cuentan aquellas celulas que se unen a la parte inferior de la membrana, debido a que estas celulas habfan migrado a traves de la membrana de PET. Las celulas en el lado superior de la membrana se retiraron cuidadosamente antes del procedimiento de fijacion. Este ensayo de quimiotaxis demostro que la presencia de hRGM A reducfa significativamente el numero de celulas SH-SY5Y que migran a traves de la membrana en mas de 80%. El anticuerpo monoclonal de rata 5F9, el quimerico de humano-rata 5F9 y el humanizado 5F9 pero no uno monoclonal de rata de control de isotipo (p21) neutralizaron parcial o completamente la actividad quimiorepelente de hRGM A a 10 pg/ml, que se manifiesta como un mayor numero de celulas que se encuentran en la parte inferior de la membrana (Figura 10).

Ejemplo 11: 5F9 induce la regeneracion de los axones del nervio optico aplastados, con mielina danada en un modelo de rata de lesion del nervio optico.

El modelo de Aplastamiento del Nervio Optico (o Lesion del nervio optico) proporciona un modelo animal para someter a ensayo diversas sustancias que estimulan la regeneracion de las fibras del nervio optico y reducen la muerte celular masiva de celulas ganglionares de la retina.

Los experimentos se llevaron a cabo en ratas Sprague Dawley macho y Wistar macho adultas obtenidas de Charles River (D) Laboratories (Alemania). Los animales se mantienen en jaulas individuales en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h con alimento y agua ad libitum. El aplastamiento del nervio optico se realiza siempre solo en el ojo izquierdo mediante cirugfa anterior minima. Este es un metodo minimamente invasivo de la lesion del nervio optico y fue desarrollado por los autores de la presente invencion, de acuerdo con los metodos de cirugfa visual anterior humana. Antes y durante la operacion los animales del procedimiento son anestesiados mediante anestesia de inhalacion utilizando Sevoflurano (Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Alemania) y se fijan a la mesa de operaciones mediante el uso de una mordaza fijadora y cinta adhesiva para las extremidades. La caida de la temperatura corporal es impedida mediante el montaje de los animales sobre una almohadilla calefactora. Para la cirugfa de aplastamiento anterior del nervio optico de la rata, el ojo izquierdo se libera cuidadosamente de ligamentos y de tejido conectivo. Como primer paso, se realiza un corte microquirurgico (2-3 mm) del tejido adyacente en la comisura exterior del ojo. A continuacion, el nervio optico se expone mediante el uso de un par de forceps para mover a un lado los musculos del ojo y la glandula lagrimal, preservandolo de ese modo. En la siguiente etapa, las meninges se abrieron longitudinalmente mediante el uso de micro tijeras para exponer el nervio optico.

Esto da como resultado una mayor movilidad del ojo y permite la rotacion lateral del ojo y el acceso a su nervio optico izquierdo. El nervio optico se dana aproximadamente 1-3 mm por detras del ojo, usando un par de forceps ajustados para proporcionar una presion maxima fijada durante 20-30 s. Se tiene especial cuidado de no danar el suministro vascular al ojo.

a) Administracion local de anticuerpos y solucion tampon.

Despues de la lesion por aplastamiento del nervio optico masculino las ratas Sprague Dawley fueron tratadas localmente con anticuerpo 5F9 (n = 10 animales), el anticuerpo de control 8D1 (n = 10 animales) o con un control de vehfculo de PBS (n = 10 animales). Los experimentadores fueron cegados para los diferentes grupos de tratamiento. Para la aplicacion local de anticuerpos, pequenas piezas de espuma de gel (longitud: 2,5 mm, anchura: 2,5 mm, altura: 2,5 mm) se empaparon con 20 pl de una solucion de anticuerpo de 10 mg/ml o con 20 pl de PBS y se colocaron directamente adyacentes a la zona de la lesion del nervio optico. Despues de la cirugfa minimamente invasiva y la aplicacion de anticuerpos, los animales se colocaron sobre toallas de papel en la jaula limpia montada sobre el calentador para controlar la temperatura corporal hasta que comenzaron a moverse. Se aplico sobre el ojo un unguento que contenfa antibiotico (Gentamytrex, Dr. Mann Pharma) para evitar la infeccion bacteriana y la sequedad de la esclerotica. Se aplico i.p. carprofeno (Rimadyl, 5 mg/kg, Pfizer GmbH, Karlsruhe) para la terapia del dolor postoperatorio directamente despues de la cirugfa y a continuacion dos veces por dfa durante un perfodo de 3 dfas. Los animales se observaron y se controlaron regularmente varias horas directamente despues de la cirugfa y durante los siguientes dfas para asegurarse de que todos los animales sobrevivfan y se recuperaban de la anestesia y la cirugfa. Cinco semanas despues de la cirugfa y de la aplicacion de anticuerpo/vehfculo, los animales se anestesiaron con una sobredosis de Narcoren (40-60 mg/kg) y se perfundieron mediante la inyeccion de solucion de paraformaldehfdo al 4% en el corazon. Los nervios opticos se aislaron y se transfirieron a una solucion de paraformaldehfdo al 4% durante 1 h a temperatura ambiente para asegurar una fijacion adecuada del tejido. Despues de la postfijacion, los nervios opticos de rata se almacenaron durante la noche en una solucion de sacarosa al 30% (4°C). Al dfa siguiente los nervios opticos se incluyeron en Tissue Tek, se congelaron y se prepararon secciones longitudinal con un espesor de 16 pm utilizando un criostato.

Para las inmunotinciones, las secciones del nervio optico se fijaron con Acetona frfa (-20°C) (10 min), se lavaron 3x

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(5 min) con Solucion Salina Tamponada con Tris (TBS, Fluka 93312) y se bloquearon y se permeabilizaron con TBS, que contema Albumina de Suero bovino al 5% y Triton-X-100 al 1% (30 min), a temperature ambiente). La BSA residual y el detergente se eliminaron mediante 2 etapas de lavado separadas (5 min cada una) con TBS. Las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal de conejo anti-GAP-43 (Abcam, ab 7562) diluido 1:100 en una solucion de BSA/TBS al 5%. Despues de 3 etapas de lavado con TBS, Tween al 0,1%, las secciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario anti- conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A11034), diluido 1:1000 en BSA/TBS al 5%, que contema una dilucion 1:100 de Bisbenzimida (H33258, 50 mg/ml) para visualizar los nucleos celulares. Antes de la inclusion, las secciones tenidas se lavaron 3 veces con TBS-Tween al 0,1% (5 min cada etapa) y con agua destilada. Las secciones se incluyeron en Fluoromount G, se cubrieron con un cubreobjetos y se almacenaron en la oscuridad para la documentacion microscopica.

Utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss las imagenes (Figura 11) de las secciones longitudinales tenidas se almacenaron utilizando el soporte logico Zeiss Axiovison. Las representaciones individuales de cada nervio se montaron para el analisis utilizando el soporte logico de Analisis de Imagenes Photoshop (Adobe). El analisis cuantitativo se realizo de dos maneras diferentes usando las imagenes compuestas de los nervios opticos. La zona positiva para GAP-43 en el sitio de la lesion se midio usando el soporte logico Axiovision (Figura 12B). Independiente de este primer analisis cuantitativo, se contaron fibras regeneradoras individuales (positivas para GAP-43) en 4 zonas diferentes: 0-200 pm, 200-400 pm, 400-600 pm y 600-1200 pm mas alla del sitio de aplastamiento. Los analisis de los datos y evaluacion estadfstica de los datos se realizaron con la ayuda del soporte logico Graphpad Prism. (Figura 12A)

b) Administracion sistemica de anticuerpos y solucion tampon.

Para el suministro sistemico de anticuerpos, se trataron sistemicamente (por via intraperitoneal, ip) o por via intravenosa, iv) ratas Wistar macho con 5F9 anticuerpo (n = 10 animales) o con un vehfculo de control PBS (n = 10 animales). Los animales recibieron inyecciones dos veces y las inyecciones se realizaron el dfa 0, poco despues de la induccion de aplastamiento del nervio y el dfa 21 despues del aplastamiento. Las dosis de anticuerpo administradas fueron 2 mg/kg el dfa 0 y 10 mg/kg el dfa 21. Los animales se sacrificaron cinco semanas despues de la lesion por aplastamiento y del aislamiento de tejidos, preparacion de secciones, tinciones y analisis cuantitativo se llevo a cabo como se ha descrito anteriormente. Al igual que antes los experimentadores fueron cegados para los dos grupos de tratamiento diferentes. Las imagenes compuestas de nervios opticos de rata se muestran en la Figura 13. En los animales tratados con 5F9 (A), muchas fibras positivas para GAP-43 se extienden mas alla del sitio de aplastamiento en contraste con los animales de control tratados con PBS (B). El sitio de aplastamiento se encuentra en el margen izquierdo y fibras en regeneracion se tinen con un anticuerpo para GAP-43. Se observan muchas fibras en el borde superior e inferior del nervio optico en los animales tratados con 5F9 pero no en los animales con PBS.

5F9 pero no el control de vehfculo con PBS aumento significativamente el numero de fibras positivas para GAP-43 en regeneracion. Se encontraron significativamente mas fibras (p <0,001) en los animales tratados con 5F9 a distancias de 300 pm a 1800 pm, que en los animales tratados con vehfculo. Los animales fueron tratados con 5F9 el dfa 0 y d21 con 2 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. Se administraron por via intraperitoneal o intravenosa anticuerpo o vehfculo. Los datos son del analisis de 9 animales por grupo. Por animal se analizaron 3 series de secciones de criostato. (Figura 14A)

En un segundo experimento, las ratas Wistar machos fueron tratadas despues de la lesion del nervio optico sistemicamente (iv) con anticuerpo 5F9 (n = 10 animales), el anticuerpo de control 8D1 (n = 10 animales) o con el control de vehfculo de PBS (n = 10 animales). Las ratas recibieron inyecciones una vez por semana con 2 mg/kg de anticuerpo administrado iv y las inyecciones se iniciaron inmediatamente despues del aplastamiento del nervio optico. Todas las ratas recibieron 4 inyecciones y los animales fueron sacrificados 5 semanas despues de la lesion por aplastamiento. Los experimentadores fueron cegados y el procesamiento de tejidos y analisis cuantitativo se realizaron como se ha descrito antes. PBS 5F9 pero no el control de vehfculo aumento significativamente el numero de fibras positivas para GAP-43 en regeneracion. Se encontraron significativamente mas fibras (p <0,001) en los animales tratados con 5F9 a distancias de 200 pm a 1400 pm, que en los animales tratados con vehfculo o anticuerpo de control. Los animales fueron tratados una vez por semana iv durante 4 semanas partiendo del dfa 0 con 5F9 (2 mg/kg por dosis), con el anticuerpo 8D1 de control (2 mg/kg por dosis) o con PBS. (Figura 14B)

Ejemplo 12: 5F9 induce la remielinizacion de axones con el nervio optico aplastado, danado en un modelo de rata de lesion del nervio optico.

Un marcador de oligodendrocitos y mielina es la protema basica de mielina (BPM). Se utilizo un anticuerpo dirigido contra BPM para responder a la pregunta de si las diferencias se produjeron en la remielinizacion en los diferentes grupos de tratamiento. Para visualizar el procedimiento de remielinizacion, las secciones del nervio optico de los animales tratados sistemicamente se fijaron con acetona fna (-20°C) (10 min), se lavaron 3 veces (5 min) con

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solucion salina tamponada con Tris (TBS, Fluka 93312) y se bloquearon y permeabilizaron con TBS, que contenfa albumina de suero bovino al 5% y Triton-X-100 al 1% (30 min), a temperatura ambiente). La BSA residual y el detergente se elimino mediante 2 etapas de lavado separadas (5 minutos cada una) con TBS. Las secciones se incubaron durante 3 horas o durante la noche a 4°C con un anticuerpo policlonal anti-BPM de conejo (Abcam, ab 2404) diluido 1:50 en solucion de BSA/TBS al 5%. Despues de 3 etapas de lavado con TBS, Tween al 0,1%, las secciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario de anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A11034), diluido 1:1000 en BSA/TBS al 5%, que contenfa una dilucion 1:100 de Bisbenzimida (H33258, 50 pg/ml) para visualizar los nucleos celulares. Antes de la inclusion, las secciones tenidas se lavaron 3 veces con tBs con Tween al 0,1% (5 min cada etapa) y con agua destilada. Las secciones se incluyeron en Fluoromount G, se cubrieron con un cubreobjetos y se almacenaron en la oscuridad para la documentacion microscopica.

Utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss las imagenes de secciones longitudinales tenidas se almacenaron utilizando el soporte logico Zeiss Axiovison. Las representaciones individuales de cada nervio se montaron para el analisis utilizando el soporte logico de Analisis de Imagenes de Photoshop (Adobe). El analisis cuantitativo se llevo a cabo de dos maneras diferentes usando las imagenes compuestas de los nervios opticos. La zona positiva para BPM en el sitio de la lesion se midio utilizando el soporte logico Axiovision. El analisis de datos y la evaluacion estadfstica de los datos se realizo con la ayuda del soporte logico Graphpad Prism.

Los animales fueron tratados con 5F9 el dfa 0 y d21 con 2 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. Se les administro por via intraperitoneal o intravenosa anticuerpo o vehfculo. Imagenes compuestas de nervios opticos de ratas.

La mielinizacion se visualizo utilizando un anticuerpo dirigido contra el marcador de mielina protefna basica mielina BPM. Los sitios de aplastamiento se encuentran en medio de los nervios compuestos y la zona esta libre en los animales de control tratados con vehfculo (A y B). En los animales tratados 5F9 (C y D), se observaron muchas estructuras positivas para BPM en la zona media (centro del aplastamiento) de los nervios opticos. (Figura 15)

La mielinizacion se visualizo utilizando un anticuerpo dirigido contra el marcador de la protefna mielina basica de mielina BPM. El area de BPM se midio usando el soporte logico Zeiss Axiovison. M1 y M2 son dos mediciones independientes y M es el area media medida positiva para BPM. 5F9 aumenta significativamente (p <0,001 en comparacion con el control de vehfculo) el area de BPM del sitio de aplastamiento del nervio optico en un factor de 3,5. (Figura 16)

Ejemplo 13: 5F9 protege la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR) de la degeneracion e induce la brotacion de neuronas de la retina en la CFNR en degeneracion

Con el fin de observar la proteccion de la degeneracion de CFNR y la induccion de la brotacion de neuronas de la retina se establecio un metodo de ensayo de laboratorio novedoso. Dicho metodo se basa en la explantacion y el analisis de retina de rata adulta de los ojos de ratas con aplastamiento del nervio optico (como se describe en el Ejemplo 11, mas arriba) y tratada sistemicamente con anticuerpo 5F9, anticuerpo de control p21 (un anticuerpo monoclonal IgG1 de rata) o vehfculo de PBS. Para llevar a cabo este experimento las ratas con aplastamiento del nervio optico fueron tratadas con Abs o PBS inmediatamente despues de la induccion del aplastamiento del nervio optico y a continuacion a intervalos de 1 semana (cinco veces; a dosificaciones de anticuerpos de 2 mg/kg o 10 mg/kg)

a) Preparacion de retina y tincion de inmunofluorescencia:

Los animales fueron profundamente anestesiados con Sevoflurano (8%; Abbott), a continuacion se sacrificaron inmediatamente mediante apertura de la caja toracica y perfusion con una solucion de paraformaldehfdo al 4% (PFA) a traves del ventrfculo izquierdo del corazon. Los ojos fueron se disecaron con el tejido conectivo ajustado y se colocaron en PFA al 4% hasta llevar a cabo la preparacion de la retina.

La preparacion de la retina se realizo en Solucion Salina Equilibrada de Hank (HBSS, libre de Magnesio y de Calcio; Invitrogen, Num. 14170070). El ojo se fijo en el tejido conectivo mediante pinzas y se realizo un corte redondo en la esclerotica inmediatamente alrededor de la cornea.

La lente y el cuerpo ciliar se retiraron cuidadosamente a traves de la abertura, en la mayorfa de los casos junto con la retina. En caso de que la retina estuviera todavfa unida a la esclerotica - esta se separo suavemente y se extrajo.

La media esfera de la retina se corto en cuatro puntos, se abrio y se extendio sobre una membrana de nitrocelulosa de color gris (Sartorius, Num. 13006-50-N). Si fuera necesario, la membrana con la retina sobre ella se dejo secar al aire durante 5 a 10 seg.

Despues de eso, la retina sobre la membrana se coloco en una solucion de formaldehfdo tamponada con fosfato

Claims

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1. Una protefna de union a la Molecula de Orientacion Repulsiva humana (RGM A) para su uso en el tratamiento de la degeneracion la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR).
2. La protefna de union para su uso como se define en la reivindicacion 1, en donde dicho tratamiento es un tratamiento terapeutico o profilactico, neurorregenerador o neuroprotector, local o sistemico.
3. La protefna de union para su uso como se define en la reivindicacion 1 o 2, en donde como resultado de dicho tratamiento

a) se observa la brotacion de neuronas de la retina; y/o

b) los axones de las CGR (celulas ganglionares de la retina) en la retina son preservados de la degeneracion.
4. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha degeneracion de la CFNR se asocia con una enfermedad seleccionada entre:

retinopatfa diabetica, neuropatfa optica isquemica, retinosquisis ligada al cromosoma X, neuropatfa optica inducida por farmacos, distrofia de la retina, degeneracion macular relacionada con la edad, enfermedades oculares caracterizadas por drusen de la cabeza del nervio optico, enfermedad ocular caracterizada por determinantes geneticos de la degeneracion de los fotorreceptores, distrofia de conos y bastones autosomica recesiva, y trastornos mitocondriales con neuropatfa optica.
5. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores que se disocia de la RGM humana con una Kd de 1 x 10-7 M o menos y una constante de velocidad koff de 1 x 10-2s-1 o menos, ambas determinadas mediante resonancia de plasmon superficial.
6. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores que se une a RGM A humana y neutraliza la actividad inhibitoria del crecimiento de neuritas de RGM A humana como se determina en un ensayo convencional in vitro.
7. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo humanizado.
8. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que comprende un dominio de union a antfgeno, dicha protefna de union capaz de unirse a un epftopo de una molecula de RGM, comprendiendo dicho dominio de union a antfgeno al menos una CDR seleccionada del grupo que consiste en:

a) las secuencias de aminoacidos del grupo CDR-H3 que consisten en los SEQ ID NO: 59 y 65, y secuencias de aminoacidos de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50% con una de dichas secuencias;

y/o

b) las secuencias de aminoacidos del grupo CDR-L3 que consisten en los SEQ ID NO: 62 y 68, y secuencias de aminoacidos de CDR modificadas que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con una de dichas secuencias.
9. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente al menos una CDR seleccionada entre:

a) el grupo CDR-H1 de las secuencias de aminoacidos que consisten en los SEQ ID NO: 57 y 63; y/o

b) el grupo de CDR-L1 de las secuencias de aminoacidos que consisten en los SEQ ID NO: 60 un 66; y/o

c) el grupo de CDR-H2 de las secuencias de aminoacidos que consisten en los SEQ ID NO: 58 y 64; y/o

d) el grupo de CDR-L2 de las secuencias de aminoacidos que consisten en los SEQ ID NO: 61 y 67; y secuencias de aminoacidos de CDR modificadas que tienen una identidad de secuencia de al menos 50% con una de dichas secuencias.
10. La protefna de union para su uso como se define en la reivindicacion 9, que comprende al menos 3 CDR que

- se seleccionan entre un conjunto de CDR de dominio variable que consiste en:

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Conjunto VH 5F9

VH 5F9 CDR-H1

Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 34. SEQ ID NO: 57

VH 5F9 CDR-H2

Residuos 50 a 66 del SEQ ID NO:34 SEQ ID NO: 58

VH 5F9 CDR-H3

Residuos 99 a 104 del SEQ ID NO:34 SEQ ID NO: 59

Conjunto VL 5F9

VL 5F9 CDR-L1

Residuos 24-39 del SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 60

VL 5F9 CDR-L2

Residuos 55-61 del SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 61

VL 5F9 CDR-L3

Residuos 94 a 102, del SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 62

Conjunto VH 8D1

VH 8D1 CDR-H1

Residuos 31 a 35 del SEQ ID NO:55 SEQ ID NO: 63

VH 8D1 CDR-H2

Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 55. SEQ ID NO: 64

VH 8D1 CDR-H3

Residuos 97 a 110 del SEQ ID NO:55 SEQ ID NO: 65

Conjunto VL 8D1

VL 8D1 CDR-L1

Residuos 24 a 34 del SEQ ID NO:56 SEQ ID NO: 66

VL 8D1 CDR-L2

Residuos 50 a 56 del SEQ ID NO:56 SEQ ID NO: 67

VL 8D1 CDR-L3

Residuos 89 a 97 del SEQ ID NO:57 SEQ ID NO: 68

o un conjunto de dominios variables en donde al menos una de dichas 3 CDR es una secuencia de aminoacidos de CDR modificada que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la secuencia parental.
11. La protefna de union para su uso como se define en la reivindicacion 10, que comprende al menos dos conjuntos de CDR de dominio variable.
12. La protefna de union para su uso como se define en la reivindicacion 11, en donde dichos al menos dos conjuntos de CDR de dominio variable se seleccionan de un grupo que consiste en:

conjunto VH 5F9 y conjunto VL 5F9; y conjunto VH 8D1 y conjunto VL 8D1.
13. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un marco aceptor humano.
14. La protefna de union para su uso como se define en una de las reivindicaciones anteriores, que comprende al

menos un dominio variable de cadena pesada seleccionado entre los SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, y 43; y/o al menos un dominio variable de cadena ligera seleccionado entre los SEQ ID NO: 44, 45, y 46.
15. La protefna de union para su uso como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, en donde

dicho marco aceptor humano comprende al menos una sustitucion de aminoacido en la region del marco en un residuo clave, dicho residuo clave se selecciona del grupo que consiste en:

(posicion de la secuencia de la cadena pesada): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98;

(posicion de la secuencia de la cadena ligera): 2, 4, 41, 51.
16. La protefna de union de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha protefna de union comprende al menos un dominio variable (mutado en marco) que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada entre los grupos que consisten en:

(secuencias de la cadena pesada) SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50; y (secuencias de la cadena ligera) SEQ ID NO: 51, 52, 53, y 54.
17. La protefna de union para su uso como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo seleccionado entre 5F9 y 8D1.