KR20120118002A - 망막 신경 섬유 층 변성의 치료에 사용하기 위한 ｒｇｍ ａ 단백질에 대한 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

본원은 RGM A에 결합하여 RGM A 수용체 및 다른 RGM A 결합 단백질에 대한 RGM 단백질의 결합을 방지하는 능력을 지님으로써, 망막 신경 섬유층(RNFL) 변성을 치료하는데 사용하기 위한 RGM A의 기능을 중화시키는, RGM A 결합 단백질, 특히 모노클로날 항체, 및 특히 이의 CDR 이식된, 사람화된 버젼, 및 RNFL 변성에 대해 포유동물을 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는 방법을 기술한다.

Description

망막 신경 섬유 층 변성의 치료에 사용하기 위한 ＲＧＭ Ａ 단백질에 대한 모노클로날 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE RGM A PROTEIN FOR USE IN THE TREATMENT OF RETINAL NERVE FIBER LAYER DEGENERATION}
본원은 RGM A에 결합하여 RGM A 수용체 및 다른 RGM A 결합 단백질에 대한 RGM 단백질의 결합을 방지하는 능력을 지님으로써, 망막 신경 섬유층(RNFL) 변성을 치료하는데 사용하기 위한 RGM A의 기능을 중화시키는, RGM A 결합 단백질, 특히 모노클로날 항체, 및 특히 이의 CDR 이식된, 사람화된 버젼, 및 RNFL 변성에 대해 포유동물을 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는 방법을 기술한다.
포유동물 중추 신경계(CNS)내에서 손상, 염증성 공격 또는 신경변성 질환 이후 축색 재생은 거의 항상 불가능하며; 당해 결과는 CNS내 신경 섬유의 재-성장하는 고유의 능력과, 손상된 섬유 관의 재-성장, 및 이에 따른 재생을 활성적으로 방지하는, 병변 또는 손상 부위의 미세 환경내에 국재화된, CNS내의 억제 인자 사이의 균형에 의존한다.
희소돌기아교세포에 의해 생성된 CNS 미엘린, 및 병변 흉터는 시험관내 성장 콘 붕괴(growth cone collapse) 및 신경돌기 성장 억제를 유발하여 축색 재성장의 직접적인 억제를 생성함에 의해, 손상의 조기 단계에서 축색 성장을 위한 가장 관련된 비-허용 구조이다. CNS 미엘린 및 반흔 조직(scar tissue)에서 주요 억제성 인자들인, RGM 단백질들은 확인되어 있다(참조: Monnier et al., Nature 419: 392-395, 2002; Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173: 47-58, 2006; for reviews see: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). RGM 단백질은 뇌 외상 또는 허혈성 발작으로 죽어가는 사람의 손상 또는 병변 부위에서 상향-조절되고(참조: Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) 척추 손상된 래트의 병변 부위에서 상향-조절된다(참조: Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21 : 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173: 47-58, 2006 for review see: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). 또한, 다발성 경화증 환자 및 건강한 사람으로부터의 임상 시료를 사용한 제1 데이터는, 사람 RGM A가 MS로 고생하는 환자의 뇌척수액내에서 상향-조절됨을 제안하였다(데이터는 나타내지 않음).
RGM A-특이적인 폴리클로날 항체의 재생-촉진 잠재력을 평가하기 위해서, 항체를 척추 손상의 중간 내지 중증 모델에 투여하였으며, 여기서, 흉곽 수준(thoracal level) 9/10에서 척추의 대략 60%가 가로절단(transected)되었다. 조직학적 실험은, 이러한 병변이 피질 척수로의 모든 배면 및 측면 섬유 모두를 절단하였음을 나타내었다. 2주 동안 펌프를 통해 국소적으로 제공된 RGM A-특이적인 폴리클로날 항체는 손상된 신경 섬유의 장거리 재생을 유도하였다(참조: Hata et al., J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006).
수백개의 신경 섬유가 병변 부위를 지나 연장되고 가장 긴 섬유는 병변의 10mm를 초과하여 재생된 반면, 대조군 항체-처리된 동물에서의 병변의 원위에서는 재생 섬유가 발견되지 않았다. 항-RGM A 처리된 래트의 기능 회복은 대조군-항체 처리된, 척추 손상된 래트와 비교하여 유의적으로 향상되었으므로, RGM A가 강력한 신경재생 억제제이며 축색 손상 또는 신경 섬유 손상으로 특징화되는 징후(indication)의 회복을 자극하는데 유효한 표적임을 입증하였다(참조: Hata et al., J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006; Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007). 또한, 기능-차단 폴리클로날 항체를 사용한 RGM A 단백질의 중화는 신경 손상된 래트에서 손상된 신경 섬유의 재생을 자극한 것뿐만 아니라 이들의 시냅스 형성을 향상시킴으로써 손상된 신경 회로의 개선 또는 복원이 가능하도록 하였다(참조: Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86,_2007).
rgm 유전자 계열은 3개의 상이한 유전자를 포함하며, 이들 중 2개, rgm a 및 b는 RGM A 및 RGM B 단백질이 기원하는 포유동물 CNS에서 발현되는 반면, 3번째 구성원, rgm c는 말초에서 발현되고(참조: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361 : 1513-29, 2006), 여기서 RGM C는 철 대사에 중요한 역할을 한다. 시험관내에서, RGM A는 RGM 수용체로서 확인된 네오제닌(Neogenin)[참조: Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004]에 결합함으로써 신경돌기 과성장(outgrowth)을 억제한다. 네오제닌은 처음에 네트린(netrin)-결합 단백질로 기술되어 왔다(참조: Keino-Masu et al. Cell, 87(2): 175-85, 1996). 이는, 네오제닌 또는 이의 밀접하게 관련된 수용체 DCC(결장직장 암에서 결실됨)에 대한 뉴트린-1의 결합이 신경돌기 성장을 억제하기 보다는 오히려 자극하는 것으로 보고되어왔기 때문에(참조: Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000) 중요한 발견이다. 따라서, RGM A의 차단은 네오제닌이 이의 신경돌기 성장-자극 리간드 네트린에 결합할 수 있도록 함으로써 RGM-매개된 성장 억제를 방출한다. 이러한 관찰을 기준으로 하여, RGM A의 중화는 사람 척추 손상의 모델에서 네오제닌을 중화하는데 우수한 것으로 추정될 수 있다. 네오제닌에 대한 RGM A의 결합 및 신경돌기 성장 억제 이외에, 골 형태형성 단백질 BMP-2 및 BMP-4에 대한 RGM A 또는 B의 결합은 성공적인 신경재생 및 기능적 회복에 대한 다른 장애를 나타낼 수 있다(참조: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006).
RNFL은 망막의 최내층이고 시신경을 구성하는 신경절 세포 뉴런으로부터의 축색으로 주로 구성된다. RNFL내 축색은, 이들이 눈의 시브로사층(lamina cibrosa)을 통과할 때까지 유수화(myelinated)되지 않는다. RNFL의 이러한 구조적 특징은, RNFL 두께가 미엘린 변성의 잠재적인 구조적 효과없이 축색의 기여를 반영하므로 CNS내에서 신경변성 공정을 시험하기 위한 이상적인 조직이 되게 한다[참조: Frohman et al., Arch. Neurol. 65(1): 26-35, 2008](참조: 또한 도 19).
Frisen, L. 및 Hoyl, W.F.는 다발성 경화증(MS)이 있는 환자에서 RNFL의 박화(thinning)에 대해 최초로 보고하였다(참조: Frisen, L. and Hoyl, W.F., Arch. Opthalmol. 92: 91-97, 1974).
건강한 개체에서, RNFL은, 15세 연령까지 두께가 단지 약 110 내지 120 μm이고 대부분의 정상 개체는 망막 두께에 있어 매년 약 0.017%를 손실할 것이며 이는 60년에 걸쳐 약 10 내지 20μm 손실하는 것과 동일하다(참조: Kanamori. A. et al., Ophthalmologica 217: 273-278, 2003). 이와는 대조적으로, 급성 시신경 신경돌기(AON)를 경험한 MS 환자의 약 75%는 초기 염증 현상 이후 단지 약 3 내지 6개월의 기간내에 10 내지 40μm의 RNFL 두께를 손실하는 것으로 나타났다. 또한, 약 75 μm의 수준 이하의 RNFL의 박화는 시각 기능의 쇠퇴를 유발하는 것으로 보고되어 있다(참조: Costello, et al., Ann. Neurol. 59: 963-969, 2006). MS 치료요법에 대한 반응시 신경 보호를 모델링할 목적을 위한 RNFL의 잠재적인 유용성은 RNFL 두께의 측정을 허용하는 재생가능한 영상화 기술로서 광간섭 단층영상기(optical coherence tomography: OTC)를 또한 기술하는 프로만(Frohman) 등에 의해 제안되었다(참조: Frohman et al., 상기 참조; 및 Frohman et al; Nature Clinical Practice Neurology 4: 12, 664-675, 2008).
RNFL의 변성은 또한 당뇨병성 망막증, 허혈성 시신경병증, X-염색체 결합된 망막층간분리증, 약물-유도된 시신경병, 망막 이영양증, 연령-관련된 황반 변성, 시신경두 드루젠(optic nerve head drusen)을 특징으로 하는 안 질환, 광수용체 변성의 유전적 결정인자를 특징으로 하는 안 질환, 상염색체 열성 추체간체 이영양증, 시신경병증이 있는 미토콘드리아 질환, 즉, 프리이드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 경도 인지 장애(MCI), 파킨슨병(Parkinsons's disease), 및 프리온병(Prion disease), 즉, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob), 스크래피(Scrapie), BSE(참조: 또한 Sakata LM, et al. Clin. Experiment Ophtalmol. 2009, 37: 90-99; Morris RW et al. Optometry 2009, 80, 83-100; Kallenbach K. & Frederiksen J. Eur. J. Neurol.2007, 14: 841-849; Trick et al. J. Neuroophtthalmol. 2006, 26: 284-295; Tantri A. et al. Surv. Ophtalmol. 49: 214-230)과 같은 다수의 다른 질환의 과정 동안 관찰된다.
RNFL 변성을 직접적으로 치료하는 치료학적 시도가 당해 분야에서 요구되고 있다. 따라서, 본 발명에 의해 해결되는 문제는 직접적인 치료, 특히 질환 상태의 다중성에서 관찰되는 RNFL 변성의 신경보호 치료를 허용하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시형태는 RGM A에 결합할 수 있는 항체를 사용하여 질환 상태의 다중성에서 관찰되는 RNFL 변성의 신경보호성 치료에 관한 것이다.
다른 실시형태는 RNFL 변성을 치료하기 위한, RGM A를 차단하고 RGM A와 이의 수용체 및/또는 결합 단백질, 즉 네오제닌 및 BMP-2, BMP-4 사이의 상호작용을 방지하는 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.
다른 실시형태는 RGM A에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 RNFL 변성의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, RNFL 변성을 치료하는 방법이다.
도 1a는 ELISA 검사에서 hRGM A에 결합하는 모노클로날 항체를 나타낸다.
도 1b는 HEK 293 세포에서 발현된 hRGM A에 결합하는 모노클로날 항체를 나타낸다.
도 1c는 HEK 293 세포에서 발현된 래트 RGM A에 결합하는 모노클로날 항체를 나타낸다.
도 2는 네오제닌에 대한 전장 RGM A 결합을 나타낸다. MAB 5F9는 네오제닌에 대한 전장 fc-커플링된 hRGM A의 결합을 억제한다.
도 3은 BMP-4에 대한 전장 RGM A 결합을 나타낸다. MAB 5F9는 BMP-4에 대한 fc-커플링된 전장 hRGM A 단편(47 내지 422)의 결합을 억제한다.
도 4는 BMP-4에 대한 RGM A 단편 0 결합을 나타낸다. MAB 5F9는 BMP-4에 대한 fc-커플링된 hRGM A 단편 0(47 내지 168)의 결합을 억제한다.
도 5는 BMP-2에 대한 전장 RGM A 결합을 나타낸다. MAB 5F9는 BMP-2에 대한 fc-커플링된 전장 hRGM A 단편(47 내지 422)의 결합을 억제한다.
도 6은 NTera 세포 신경돌기 과성장(outgrowth) 검사에서 RGM A 단편의 mAb5F9 중화를 나타내는 마이크로사진의 조합이다. MAB 5F9는 사람 Ntera 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 fc-접합된, 강력한 hRGM A 억제제 단편의 과성장 억제 활성을 중화한다. A. 대조군 배양물, 라미닌 상에서 Ntera 뉴런의 성장, B. 라미닌-hRGM A 단편(47 내지 168) 기질 상에서 Ntera 뉴런의 성장, C. 내지 E. 0.1 ㎍/ml MAB 5F9 (C.), 1㎍/ml MAB 5F9 (D.), 10μg/ml MAB 5F9 (E)의 존재 하에 라미닌-hRGM A 단편(47 내지 168) 기질 상에서 Ntera 뉴런의 성장.
도 7은 NTera 2 검사 결과의 정량적 분석을 나타낸다. MAB 5F9는 사람 Ntera 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 fc-접합된, 강력한 hRGM A 억제제 단편(단편 0, 47 내지 168)의 과성장 억제 활성을 용량-의존적으로 중화한다.
도 8은 SH-SY5Y 스트라이프 검사(stripe assay)의 정량적 분석을 나타낸다. MAB 5F9는 스트라이프 막 카펫에서 사람 SH-SY5Y 뉴런 세포의 전장 사람 RGM A로 이루어진 스트라이프에 의해 유도된, 반발작용(repulsion)을 중화한다. MAB 5F9 (A)의 부재하에 또는 낮은 MAB 농도의 존재하에 SH-SY5Y 뉴런은 RGM A 스트라이프를 피하는 것을 선호한다. 이러한 거동은 MAB 5F9의 농도를 증가시킴에 의해 역전된다(B 내지 D). 최고 MAB 농도(10 μg/ml)(E)에서, SH-SY5Y 뉴런은 콜라겐 I 스트라이프와 비교하여 RGM A 스트라이프에 대해 강력한 선호를 나타낸다.
도 9는 mAB 5F9 및 8D1 결합 특성의 정량적 분석을 요약한다. MAB 5F9 및 8D1을 hRGM A - 네오제닌, hRGM A - BMP-2 및 hRGM A - BMP-4 결합 검사에서 상이한 농도로 평가한다.
도 10은 SH-SY5Y 주화성 검사에서 사람화된 5F9 항체(h5F9.21, h5F9.23, h5F9.25)의 hRGM A의 화학반발 활성에 대한 중화 활성을 나타낸다.
도 11은 시신경 손상의 동물 모델에서 국소 5F9 적용의 생체내 신경재생 활성을 나타낸다. MAB 5F9의 국소 적용은 RGM A를 중화시키고 시신경 파쇄(crush)가 래트 동물 모델에서 손상된 시신경 축색의 재생된 성장을 자극한다. 5F9 처리된 동물(A)에서, 많은 GAP-43 양성 섬유가 래트 RGM A에 결합하지 않는 대조군 MAB 8D1(B)과 대조적으로 파쇄 부위 이상으로 연장된다.
도 12a 및 도 12b는 시신경 손상의 동물 모델에서 국소 5F9 적용의 정량적 분석을 나타낸다. (A) 대조군 MAB 8D1이 아닌 5F9는 재생하는 GAP-43 양성 섬유의 수를 유의적으로 증가시켰다. 유의적으로 더 많은 섬유(p < 0.05)가 5F9로 처리된 동물에서 200μm, 400μm 및 600μm의 거리에서 관찰되었으며, 1200μm에서는 섬유가 5F9-처리된 동물에서만 발견되나, 대조군 동물(B)에서 5F9는 대조군 항체 8D1 및 비히클 대조군 PBS와 비교하여 시신경 병변 부위에서 GAP-43 양성 부위를 유의적으로 증가시켰다. 재생 성장의 영역(GAP-43 양성 부위)은 악시오비젼 소프트웨어(Axiovision software)[제조원: 짜이즈(Zeiss)]를 사용하여 측정하였다.
도 13은 시신경 손상의 동물 모델에서 전신계 5F9 적용의 생체내 신경재생 활성을 나타낸다. 동물을 5F9로 0일 및 21일째에 각각 2 mg/kg 및 10 mg/kg으로 처리하였다. 항체 또는 비히클을 복강내 또는 정맥내 제공하였다. 래트 시신경의 복합 영상. 5F9 처리된 동물(A)에서, 많은 GAP-43 양성 섬유가 PBS로 처리한 대조군 동물(B)과 대조적으로 파쇄 부위 이상으로 연장되고 있다. 파쇄 부위는 좌측 가장자리에 위치하며 재생 섬유는 GAP-43에 대한 항체로 염색된다. 많은 섬유가 5F9-처리된 동물에서 시신경의 상부 및 하부 가장자리에서 관찰되지만 PBS 동물에서는 관찰되지 않는다.
도 14a 및 도 14b는 시신경 손상의 동물 모델에서 전신계적 5F9 적용의 정량적 분석을 나타낸다.
도 15는 시신경 손상의 동물 모델에서 전신계적 5F9 적용의 생체내 재유수화 활성을 나타낸다. 동물을 5F9로 0일 및 21일째에 각각 2 mg/kg 및 10 mg/kg으로 처리하였다. 항체 또는 비히클은 복강내로 또는 정맥내 제공하였다. 래트 시신경의 복합 영상. 유수화를 미엘린 마커 미엘린 기본 단백질 MBP에 대해 지시된 항체를 사용하여 가시화한다. 파쇄 부위는 복합 신경의 중간에 위치하며 당해 영역은 비히클 처리된 대조군 동물에서는 존재하지 않는다(A 및 B). 5F9 처리된 동물(C 및 D)에서, 많은 MBP-양성 구조가 시신경의 중간 영역(파쇄 중심)에서 관찰된다.
도 16은 시신경 손상의 동물 모델에서 전신계적 5F9 적용의 탈유수화에 대한 정량적 효과를 나타낸다.
도 17은 시신경 파쇄된 동물의 눈으로부터의 RNFL에 대한 항체 5F9의 우수한 보호 효과를 나타낸다. 신경 섬유 다발의 유의적으로 보다 높은 밀도가 5F9로 전신계 처리된 동물의 망막에서 관찰된다.
도 18은 시신경 파쇄된 동물의 눈으로부터의 망막내 뉴런에 대한 항체 5F9의 영향을 나타낸다. 유의적으로 보다 높은 수의 발아되는 망막내 뉴런이 5F9 항체로 전신계 처리한 동물의 망막내에서 관찰된다.
도 19는 유리체 안구에 직접적으로 인접한 층인, 망막 신경 섬유층(RNFL)을 나타낸다. 이는 망막 신경절 세포의 축색에 의해 형성된다. 다른 층들은 내부 망상층(IPL)이며, 여기서 무축색 및 양극 뉴런은 망막 신경절 세포와 시냅스 접촉을 형성한다. 광수용체, 수평 뉴런 및 양극 뉴런은 외부 망상층(OPL)에서 시냅스를 만든다. 광수용체(막대 및 원뿔)은 광수용체층(PRL)내에 위치한다. RPE는 망막 색소 상피이다(도면은 문헌: Frohman et al. Arch. Neurol. 65, 26-35, 2008로부터 발췌된다).
1. 용어의 정의
본원에 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 그러나, 용어들의 의미 및 범위는 어떠한 잠재된 모호성의 경우에서도 명백하여야 하며, 본원에 제공된 정의들은 어떠한 사전적 또는 외적 정의보다 우선한다. 또한, 내용에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수 용어를 포함하며 복수 용어는 단수 용어를 포함할 수 있다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는", 및 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어들은 달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 하나 이상의 소단위를 포함하는 하나의 단위 및 요소들 및 성분들을 포함하는 요소들 및 성분들 둘다를 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련되어 사용된 명명법 및 이의 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술들은 일반적으로 당해 분야에 잘 공지된 통상의 방법에 따라서 및 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이, 제조업자의 명세서에 따라 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학적 및 약제 화학과 관련되어 사용된 명명법, 및 이의 실험실 과정 및 이의 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 일반적으로 사용된다. 표준 기술이 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제형 및 전달, 및 환자의 치료에 사용된다.
당해 명세서 및 첨부된 특허청구의 범위 전체에서 사용된 것으로서, 다음 용어들은 다음 의미들을 갖는다:
용어 "수용체" 및 "수용체 항체"는 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 항체 또는 핵산 서열을 말한다. 일부 실시형태에서, 용어 "수용체"는 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 말한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "수용체"는 골격 영역 및 불변 영역(들) 중 하나 이상을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 말한다. 구체적인 실시형태에서, 용어 "수용체"는 골격 영역 중 하나 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 특히, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 말한다. 당해 실시형태에 따라서, 수용체는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에 발생하지 않는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 10개의 아미노산을 함유할 수 있다. 수용체 골격 영역 및/또는 수용체 불변 영역(들)은 예를 들면, 배선(germline) 항체 유전자, 성숙한 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들면, 당해 분야에 잘-공지된 항체, 개발중인 항체 또는 시판중인 항체)로부터 기원하거나 수득될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 광범위하게는 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특성을 보유하는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄, 또는 이의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자를 말한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 형식은 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 비-제한적 실시형태는 하기에 논의된다. 항체는, 이것이 분자와 특이적으로 반응할 수 있음으로써 분자가 항체에 결합하는 경우 분자에 "결합할 수 있는"으로 일컬어진다.
용어 "항체 접합체"는 치료제 또는 세포독성제와 같은 제2의 화학적 잔기에 화학적으로 연결된 항체와 같은 결합 단백질을 말한다. 용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타낸다. 특히 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "항체 작제물"은 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된 본 발명의 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며 하나 이상의 항원 결합 부분을 연결하기 위해 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123]. 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 말한다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
여전히 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예로는 사합체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101] 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058]이 포함된다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 전체 항체로부터 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 본원에 기술된 바와 같은, 표준 재조합체 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"(또는 단순히 "항체 부분" 또는 "항체 단편")은 항원(예를 들면, hRGM A)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 하나 이상의 항체의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 이러한 항체 실시형태는 또한 이특이적, 이중 특이적 또는 다-특이적 양식; 2개 이상의 상이한 항원에 대한 특이적인 결합일 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"내 포함된 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) 단일 가변 도메인을 포함하는, dAb 단편[참조: 본원에 참조로 인용된, Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546, Winter et al, PCT 공보 제WO 90/05144 A1호]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, 비록 Fv 단편, VL 및 VH의 2개 도메인이 별개의 유전자에 의해 암호화되어 있다고 해도, 이들은 재조합 방법을 이용하여, 이들이, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자[단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 참조: 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디(diabody)와 같은 단일쇄 항체의 다른 형태도 또한 포함된다. 디아바디는 2가, 이특이적 항체이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서, 그러나 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 링커를 사용하여 발현된다[참조: 예를 들면, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123]. 이러한 항체 결합 부분은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Kontermann and Dubel Eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)].
용어 "항원 결정인자" 또는 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자도 포함한다. 특정 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화를 포함하며, 특정 실시형태에서, 특이적인 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 특정 실시형태에서, 항체는, 이것이 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인식하는 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어진다.
용어 "생물학적 활성"은 본원에 정의한 바와 같은 RGM A의 모든 고유의 생물학적 특성을 말한다.
용어 "기본 잔기(canonical residue)"는 쵸티아(Chothia) 등이 정의한 바와 같은[참조: 둘 다 본원에 참조로 인용된, 문헌, J. Mol. Biol. 196: 901-907 (1987); Chothia et al, J. Mol. Biol. 227: 799 (1992)] 특정 기본 CDR 구조를 정의하는 골격 또는 CDR내 잔기를 말한다. 쵸티아 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요 부분은 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 구조를 가진다. 각각의 기본 구조는 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속된 분절에 대한 펩타이드 골격 비틀림각(torsion angle)의 세트를 주로 명시한다.
용어 "키메라 항체"는 사람 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열, 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 말한다. 키메라 항체는 재조합체 분자 생물학 기술을 통해 생산될 수 있거나, 물리학적으로 함께 접합될 수 있다.
용어 "CDR"은 항체 가변 서열내 상보성 결정 영역을 말한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에는 3개의 CDR이 존재하며, 이는 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정되어 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일의 가변 영역내 발생하는 3개의 CDR의 그룹을 말한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되어 왔다. 카밧(Kabat)에 의해 기술된 시스템[참조: Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991)]은 항체의 어떠한 가변 영역에도 적용가능한 모호하지 않은 잔기 번호매김 시스템을 제공하는 것뿐만 아니라, 3개의 CDR들을 정의하는 정밀한 잔기 경계도 제공한다. 이들 CDR은 카밧 CDR로 언급될 수 있다. 쵸티아 및 공동연구자[참조: Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342: 877-883 (1989)]는, 카밧 CDR내 특정의 소-부분이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고, 거의 동일한 펩타이드 골격 구조를 채택함을 발견하였다. 이들 소-부분은 L1, L2 및 L3 또는 HI, H2 및 H3으로 지정되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 경쇄 및 중쇄 영역 각각을 나타낸다. 이들 영역은 쵸티아 CDR로 언급될 수 있으며, 이는 카밧 CDR과 중첩된 경계를 갖는다. 카밧 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 Padlan[참조: FASEB J. 9: 133-139 (1995)] 및 MacCallum[참조: J Mol Biol 262(5): 732-45 (1996)]에 의해 기술되어 있다. 여전히 다른 CDR 경계 정의들은, 비록 이들이, 특정 잔기 또는 잔기들의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의적으로 영향을 미치지 않는 예측 또는 실험적 발견 측면에서 단축되거나 신장될 수 있다고 해도, 상기 시스템들 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있으나, 그럼에도 불구하고 카밧 CDR과 중첩될 수 있다. 특정 실시형태는 카밧 또는 쵸티아 정의된 CDR을 사용하지만, 본원에 사용된 방법은 이들 시스템들 중 어느 하나에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다.
용어 "CDR-이식된 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 여기서 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열은 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예를 들면 뮤린 CDR(예를 들면, CDR3) 중 하나 이상이 사람 CDR 서열로 대체된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 말한다.
용어 "결정", 및 "결정화된'은 결정의 형태로 존재하는, 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 말한다. 결정은 무정형 고체 상태 또는 액체 결정성 상태와 같은 다른 형태와 상이한 물질의 고체 상태의 하나의 형태이다. 결정은 원자, 이온, 분자(예를 들면, 항체와 같은 단백질), 또는 분자 조립체(예를 들면, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고, 반복되는 3-차원 어레이로 구성된다. 이들 3차원 어레이는 당해 분야에서 잘-이해되는 특이적인 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정내에서 반복된 기본 단위, 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위로 일컬어진다. 제공된, 잘-정의된 결정학적 대칭에 따른 배열에서 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀(unit cell)"을 제공한다. 모든 3차원내 규칙적인 전환에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다. Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20, 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)을 참조한다.
용어 "공여체" 및 "공여체 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 말한다. 특정한 실시형태에서, 공여체 항체는, 골격 영역이 수득되거나 기원하는 항체와는 상이한 종으로부터의 항체이다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여체 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-사람 항체를 말한다.
용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속기간을 감소 또는 완화시키거나, 장애의 진행을 방지하거나, 장애의 퇴행을 유발하거나, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 발생 또는 진행을 방지하거나, 다른 치료요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)을 향상시키거나 개선시키기에 충분한 치료요법의 양을 말한다.
용어 "골격" 또는 "골격 서열"은 CDR이 빠진 가변 영역의 나머지 서열을 말한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 측정될 수 있으므로, 골격 서열의 의미는 상응하게 상이한 해석에 속한다. 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 골격 영역을 각각의 쇄 상의 4개의 소-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누며, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2의 사이에 위치하고, CDR2는 FR2와 FR3의 사이에 위치하며, CDR3는 FR3과 FR4의 사이에 위치한다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4와 같은 특정 소-영역을 명시하지 않고, 다른 것에 의해 언급된 골격 영역은 단일의, 천연적으로 존재하는 면역글로불린 쇄의 가변 영역내 결합된 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 것으로서, FR은 4개의 소-영역 중 하나를 나타내고, FR은 골격 영역을 구성하는 4개의 소-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 표 2 및 표 3에 기술된 서열로부터 선택된다. 사람 골격 서열 FR1 내지 FR4에 대한 상이한 조합은 상기 표에 언급되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위한 유전적 재배열 및 돌연변이를 초래하는 돌연변이 공정을 겪지 않는 비-림프구 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 말한다[참조: 예를 들면, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484: 13-30 (2001)]. 본 발명의 각종 실시형태에 의해 제공된 장점들 중 하나는, 배선 항체 유전자가 종에서 개개의 필수적인 아미노산 서열 구조 특성을 보존하기 위해 성숙한 항체 유전자 보다 더 유사하여, 이러한 종에서 치료학적으로 사용되는 경우 외부 공급원으로 인식될 가능성이 거의 없다는 인식에 기인한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 기원한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들면, CDR내 및 특히 CDR3내에서 사람 배선 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "사람 항체"는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종으로부터 기원한 CDR 서열이 사람 골격 서열내로 이식된 항체를 포함함을 의도하지는 않는다.
용어 "사람화된 항체"는 비-사람 종(예를 들면, 마우스)으로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 여기서 VH 및/또는 VL 서열 중 적어도 일부분이 보다 "사람과 유사하도록", 즉, 사람 배선 가변 서열과 보다 더 유사하도록 변경되어 있는 항체를 말한다. 사람화된 항체의 하나의 유형은, 사람 CDR 서열이 비-사람 VH 및 VL 서열내로 도입되어 상응하는 비사람 CDR 서열이 대체된 CDR-이식된 항체이다. 사람화된 항체는 목적한 항원에 면역특이적으로 결합하며 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 골격(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, CDR과 관련하여 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%, 특히 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 말한다. 사람화된 항체는 적어도 1개, 및 통상적으로 2개의, 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 중 실질적으로 모두를 포함하며 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-사람 면역글로불린(즉, 공여체 항체)의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 골격 영역은 사람 면역글로불린 컨센서스 서열(consensus sequence)의 것이다. 특히, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 사람 면역글로불린의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄, 및 중쇄의 적어도 가변 도메인 둘다를 함유한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 구체적인 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 함유한다.
사람화된 항체는 IgY, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 어떠한 부류의 면역글로불린, 및 IgA1, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 임의의 동형으로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 하나 이상의 부류 또는 동형으로부터의 서열을 포함할 수 있으며, 특정 불변 도메인은 당해 분야에 잘-공지된 기술을 사용하여 바람직한 효과기 기능을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
사람화된 항체의 골격 및 CDR 영역은 모 서열에 정확히 상응할 필요가 없는데, 예를 들면, 공여체 항체 CDR 또는 컨센서스 골격은 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이유발되어 당해 부위에서 CDR 또는 골격 잔기가 컨센서스 골격 또는 공여체 항체에 상응하지 않을 수 있다. 특정 실시형태에서, 그러나, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 일반적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%, 특히 적어도 85%, 보다 특히 적어도 90%, 및 가장 특히 적어도 95%가 모 FR 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "컨센서스 골격"은 컨센서스 면역글로불린 서열내 골격 영역을 말한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련된 면역글로불린 서열의 계열내 가장 흔히 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 말한다(참조: 예를 들면, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). 면역글로불린의 계열에서, 컨센서스 서열내 각각의 위치는 당해 계열의 이러한 위치에서 가장 흔히 발생하는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산이 동일하게 자주 발생하는 경우, 이들 중 하나가 컨센서스 서열내에 포함될 수 있다.
용어 "사람 RGM A"(hRGM A로 본원에서 축약됨)는, 국소 투사(topographic projection)의 개발 동안 신경돌기 성장 퇴치제 또는 신경돌기 성장 억제제로서 최초로 기술된, 450개 아미노산을 갖는 글리코실포스파티딜-이노시톨(gpi)-고정(anchor)된 당단백질을 말한다(참조: Stahl et al. Neuron 5: 735-43, 1990; Mueller, in Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation, Edited by H. Fujisawa, Japan Scientific Societies Press, 215-229, 1997). rgm 유전자 계열은 3개의 상이한 유전자들을 포함하며, 이들 중 2개, rgm a 및 b는 포유동물 CNS에서 발현되는 반면, 세번째 구성원, rgm c는 말초에서 발현되고(참조: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006), 여기서 이는 철 대사에 중요한 역할을 한다. 사람 RGM 단백질은 43% 내지 50%의 서열 동일성을 가지며; 사람 및 래트 RGM A의 아미노산 상동성은 89%이다. 사람 RGM 단백질은 임의의 다른 공지된 단백질과 유의적인 서열 상동성을 공유하지 않는다. 이들은 RGD 영역을 함유하는 프롤린이 풍부한 단백질이며 폰-빌레브란트-인자(Von-Willebrand-Factor) 도메인에 대해 구조적 상동성을 가지며 공지되지 않은 프로테아제에 의해 N-말단 아미노산 168에서 절단되어 기능적으로 활성인 단백질을 생성한다(참조: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006).
시험관내에서, RGM A는 RGM 수용체로서 확인된 네오제닌에 결합함으로써 피코몰 농도에서 신경돌기 과성장을 억제한다[참조: Rajagopalan et al. Nat Cell Biol: 6(8), 756-62, 2004]. 네오제닌은 처음에 네트린-결합 단백질로 기술되었으나[참조; Keino-Masu et al. Cell, 87(2): 175-85, 1996], 네트린에 대한 이의 친화성(Kd 2nM)은 RGM(Kd 0.2 nM)에 대한 것보다 더 낮은 크기의 순서이다[참조: Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004]. 이는, 네오제닌 또는 이의 밀접하게 관련된 수용체 DCC(결장직장 암에서 결실됨)에 대한 네트린-1의 결합이 신경돌기 성장을 억제하기보다는 오히려 자극하는 것으로 보고되었기 때문에 중요한 발견이다(참조: Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000).
네오제닌에 대한 RGM A의 결합 및 신경돌기 성장 억제 유도 외에, 골 형태형성유전자 단백질 BMP-2 및 BMP-4에 대한 RGM A 또는 B의 결합은 성공적인 신경재생 및 기능성 회복에 대한 다른 장애를 나타낼 수 있다(참조: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006). 단백질 부류 둘다(네오제닌 및 BMP)는 2개의 완전하게 상이하고 독립적인 시그날 형질도입 경로를 통해 RGM A의 신경돌기 성장 억제 시그날을 형질도입하는 것으로 보고되어 왔다. 일반적으로, 이들 BMP 단백질의 발현은 성인 CNS의 대부분의 영역에서 비교적 낮지만 일부 BMP(예를 들면, BMP-2, BMP-6, BMP-7)의 발현 및 축적시 신속한 증가가 손상 및 발작에 대한 반응시 보고되어 있다(참조: Lai et al., Neuroreport 8: 2691 - 94, 1997; Martinez et al. Brain Res. 894: 1-11, 2001; Hall and Miller, J. Neurosci. Res. 76: 1-8, 2004; Setoguchi et al., Exp. Neurol. 189: 33-44, 2004). 또한, 다발성 경화증의 모델에서, 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델, BMP-4, BMP-6 및 BMP-7은 마우스 척수에서 상향조절되었다(참조: Ara et al., J. Neurosci.Res. 86: 125-35, 2008). BMP-2는 세포 표면 RGM A, BMP-수용체 I 및 II에 대한 결합에 의해 및 LIM-키나제를 직접 활성화시킴에 의해 신경돌기 성장을 억제하는 것으로 보고되어 왔으며(참조: Matsuura et al. Biochem Biophys Res Commun., 360: 868-73, 2007), 따라서, RGM A-BMP-2 상호작용의 차단은 CNS 손상 후 기능성 회복을 추가로 증가시킬 것으로 예측된다.
위에서 언급한 바와 같이, 척추 손상된 래트 및 뇌 손상된 사람은 손상 부위에서 세포 RGM의 대량 축적을 나타내며 척수 병변 부위에서 래트내 RGM A의 염색 패턴은 사람에서 팬 RGM 항체 염색과 매우 유사하며, 이는, 사람에서 대부분의 팬 RGM 염색이 RGM A 국재화와 관련되어 있지만 RGM B 국재화와 관련되지 않음을 제안한다(참조: Schwab et al., Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173: 47-58, 2006). 건강한 사람 뇌에서, 팬 RGM 염색(RGM A 및 B 면역반응성)은 백색질 섬유, 희소돌기아교세포, 약간의 뉴런의 세포체, 일부 혈관 평활근 및 약간의 내피 세포에서 검출되었다. 성상세포의 염색은 관찰되지 않았다. 건강한 성인 사람 뇌에서 RGM 염색 패턴은 성체 래트 척수에서 관찰된 염색 패턴과 매우 유사하다(참조: Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006).
뇌 및 척수 손상내 병변 부위에서 RGM A의 축적을 기초로 및 이의 세포 신경돌기 성장 억제 활성으로 인해, 단백질은 신경돌기 성장 억제 활성을 발휘할 것이며 사람 RGM A의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 의한 이의 중화는 손상된 신경 섬유의 향상된 재성장 및 신경 섬유 손상 및 RGM 축적을 특징으로 하는 징후에 있어서 기능적 회복의 향상을 가져온다.
용어 "RGM A"는 또한 다른 종, 예를 들면, 마우스 또는 래트와 같은 설치류로부터 분리되거나 수득된 RGM A 분자를 포함하며; 구체적으로, 래트 기원한 분자는 본원에서 "래트 RGM A"로 나타낸다.
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용어 "이의 수용체 중 하나에 대한 RGM의 결합의 억제"는 상기 수용체 결합 활성의 부분적(예를 들면, 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상으로서) 또는 완전한 감소를 포함한다. 상기 "결합의 억제"는 당해 분야에서 이용가능한 임의의 적합한 방법, 특히 본원에 예시된 임의의 방법, 예를 들면, ELISA계 결합 검사에 의해서도 측정할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성를 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체(예를 들면, hRGM A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hRGM A 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않는다)를 말하는 것으로 의도된다. 그러나, hRGM A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터의 RGM A 분자와 같은 다른 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 이의 기원에 의해 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 게놈성, cDNA, 또는 합성 기원의, 또는 이들의 일부 조합의)를 의미할 수 있으며, "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"가 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드 중 일부 또는 모두와 관련되어 있지 않고; 천연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되거나; 보다 큰 서열 중 일부로서 천연에 존재하지 않는다.
용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"는 이의 기원 또는 유도화의 공급원에 의해 이의 천연 상태에서 이를 동반하는 천연적으로 관련된 성분들과 관련되지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드이거나; 동일한 종으로부터의 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않거나; 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; 또는 천연에 존재하지 않는다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 이것이 천연적으로 기원하는 세포와는 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩타이드는 이의 천연적으로 관련된 성분들로부터 "분리"될 것이다. 단백질은 또한 당해 분야에 잘 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여, 분리에 의해 천연적으로 관련된 성분을 실질적으로 함유하지 않도록 할 수 있다.
용어 "카밧 번호매김", "카밧 정의" 및 "카밧 표지화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 분야에 인식된 이들 용어는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역내 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호매김 시스템을 말한다.[참조: Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 및 Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공보 제91-3242]. 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1의 경우 31 내지 35번 아미노산 위치, CDR2의 경우 50 내지 65번 아미노산 위치, 및 CDR3의 경우 95 내지 102번 위치에 이른다. 경쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1의 경우 24 내지 34번 아미노산 위치, CDR2의 경우 50 내지 56번 아미노산 위치, 및 CDR3의 경우 89 내지 97번 아미노산 위치에 이른다.
용어 "Kd"는 당해 분야에 공지된 바와 같이 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 말한다.
용어 "주요 잔기"는 항체, 특히 사람화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 있어 보다 더 많은 영향을 미치는 가변 영역내 특정 잔기를 말한다. 주요 잔기는 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적인 글리코실화 부위(N- 또는 O-글리코실화 부위일 수 있음), 드믄 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 표준 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 베르니어 영역(Vernier zone)내 잔기, 및 가변 중쇄 CDR1의 쵸티아 정의와 제1 중쇄 골격의 카밧 정의 상이에 중첩된 영역내 잔기.
용어 "kon"은 당해 분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 항체의 결합에 대한 온 속도 상수(on rate constant)를 말한다.
용어 "koff"는 당해 분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 오프 속도 상수(off rate constant)를 말한다.
용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 확인을 제공하는 혼입된 표지를 지닌 단백질을 말한다. 특히, 표지는 검출가능한 마커, 예를 들면, 마커 아비딘(예를 들면, 광학적 방법 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩타이드에 대한 부착 또는 방사선표지된 아미노산의 혼입이다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: 방사동위원소 또는 방사핵종(예를 들면, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm); 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 란타나이드 인), 효소 표지(예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제); 화학발광성 마커; 비오티닐 그룹; 제2 리포터에 의해 인식된 예정된 폴리펩타이드 에피토프[예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequence), 제2 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그] 및 가돌리늄 킬레이트와 같은 자기 제제.
용어 "국소 치료"는, 바람직한 신경보호 또는 신경변성 작용이 유도되도록 의도되는 치료되는 포유동물의 신체의 의도된 영역에서 본 발명의 결합 단백질 또는 이를 함유하는 제형의 직접 투여의 특정 형태를 말한다.
용어 "조정하다(modulate)" 및 "조절하다"는 상호교환적으로 사용되며 목적한 분자의 활성(예를 들면, hRGM A의 생물학적 활성)에 있어서의 변화 또는 변경을 말한다. 조정은 목적한 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 분자의 예시적인 활성 및 기능은 결합 특성, 효소 활성, 세포 수용체 활성, 및 시그날 형질도입을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
상응하게, 용어 "조정인자"는 목적 분자의 활성 또는 기능(예를 들면, hRGM A의 생물학적 활성)을 변화시키거나 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들면, 조정인자는 조정인자의 부재하에서 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기에 있어서의 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "효능제"는 목적한 분자와 접촉시 효능제의 부재하에서 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기에 있어서 증가를 유발시키는 조정인자를 말한다. 목적한 특정한 효능제는 hRGM A 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 또는 hRGM A에 결합하는 임의의 다른 분자를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "길항제"는, 목적한 분자와 접촉시, 길항제의 부재하에서 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기에 있어서 감소를 유발하는 조정인자를 말한다. 예시적인 길항제는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디, 탄수화물 또는 소 유기 분자를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 펩티바디는 예를 들면, WO01/83525호에 기술되어 있다.
목적한 특정 길항제는 hRGM A의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단하거나 조정하는 것들을 포함한다. hRGM A의 길항제는 단백질, 핵산, 탄수화물, 또는 hRGM A 분자와 상호작용하는 모노클로날 항체와 같이, hRGM A에 결합하는 어떠한 다른 분자를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. RGM A와의 상호작용은 다른 리간드/세포 막 성분들의 결합 및 중화를 생성할 수 있고, 다수의 질환에 대해 부가적 또는 상승적 기능에 유용할 수 있음에 주목하여야 한다.
용어 "모노클로날 항체"는 상이한 항체의 혼합물을 함유하는 "폴리클로날" 항체 제제와는 대조적으로, 일반적인 중쇄 및 일반적인 경쇄 아미노산 서열을 공유하는, 항체 분자의 제조를 말한다. 모노클로날 항체는 파아지, 세균, 효모 또는 리보소옴 디스플레이와 같은 몇가지 신규한 기술, 및 하이브리도마-기원한 항체[예를 들면, 표준 코흘러(Kohler) 및 밀슈타인(Milstein) 하이브리도마 방법(참조: standard Kohler and Milstein hybridoma methodology (1975) Nature 256: 495-497)과 같은 하이브리도마 기술에 의해 제조된 하이브리도마에 의해 분비된 항체]에 의해 예시된 전통적인 방법에 의해 생성될 수 있다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 축약) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약술) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 골격 영역(FR)으로 명명된, 보다 보전적인 영역으로 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된, 초가변성의 영역으로 추가로 아분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 어떠한 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 소부류일 수 있다.
용어 "신경보호성" 또는 "신경보호"는 신경 세포, 특히 변성으로부터 망막내 RGC(망막 신경절 세포) 축색의 보존; 또는 위에서 정의한 바와 같이 RNFL 두께 손실을 통해 측정가능한 "비정상" RNFL 변성의 억제를 관찰함으로써 분석가능한 변성 또는 손상으로부터 RNFL의 세포를 포함하는 세포를 방지하는 치료를 말한다.
용어 "신경재생성" 또는 "신경재생"은 신경 세포, 특히 손상된 RNFL[예를 들면, 망막의 시신경 응집 단층촬영법(Optic Coherence Tomography: OCT), 시신경의 확산 텐서 영상(diffusion tensor imaging); 망막 뉴런 발아(sprouting)에 의해 분석가능]의 세포를 포함하는 세포의 보수 또는 재-성장을 생성하는 본 발명에 따른 치료를 말한다.
용어 "중화"는, 결합 단백질이 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 경우, 표적 단백질의 생물학적 활성의 중화를 말한다. 중화는 표적에 대한 상기 결합 단백질의 결합의 상이한 방식의 결과일 수 있다. 예를 들면, 중화는 표적 분자에 대한 수용체 결합에 영향을 미치지 않는 표적의 영역내 결합 단백질의 결합에 의해 유발될 수 있다. 달리는, 결합 단백질의 결합은 표적에 대한 수용체 결합의 차단을 초래할 수 있으며, 이러한 차단은 표적 단백질 활성을 최종적으로 중화시킨다. 중화 결합 단백질은, hRGM A에 대한 이의 결합이 hRGM A의 생물학적 활성의 중화를 생성하는 중화 항체이다. 특히, 중화 결합 단백질은 hRGM A에 결합하여 hRGM A의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85% 또는 그 이상 감소시킨다. 중화결합 단백질에 의한 hRGM A의 생물학적 활성의 중화는 당해 분야에 잘 공지된 hRGM A 생물학적 활성의 하나 이상의 지표를 측정함으로써 평가할 수 있다. 예를 들어, hRGM A의 중화는 NTera 신경세포 과성장 검사(참조: 하기 실시예 3)에 있어서 억제를 역전시킨다. NTera 신경돌기 성장 검사은 신경돌기 과성장의 억제에 촛점이 맞추어져 있다. 억제성 RGM A 단백질 또는 단편의 부재 및 과성장-자극 기질 라미닌의 존재하에서, 신경세포 NTera 응집체는 과성장하는 신경돌기의 광범위하고 치밀한 네트워크를 나타낸다. RGM A 또는 RGM A 단편은 신경돌기 과성장을 억제하여 신경돌기의 감소된 길이 및 수를 생성한다. 기능-차단 RGM A 길항제 또는 mAb 5F9와 같은 MAB는 분화된 사람 NTera 뉴런이 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 사람 RGM A 단백질의 강력한 fc-접합된 hRGM A 경쇄 단편(아미노산 47 내지 168번)의 신경돌기 과성장 억제 활성을 중화시켜, 신경돌기 길이 및 수에 있어서 강력한 증가를 생성하였다.
용어 "중화하는 모노클로날 항체"는 특이적인 항원에 결합시 상기 항원에 대한 천연 리간드의 결합을 경쟁하거나 억제할 수 있는 항체 분자의 제제를 말한다. 본원의 특정 실시형태에서, 본 발명의 중화 항체는 네오제닌 및/또는 BMP-2 및/또는 BMP-4에 대한 결합에 대하여 RGM A와 경쟁할 수 있고, RGM A 생물학적 활성 또는 기능을 방지할 수 있다. 특히, 본 발명의 중화 항체는 RGM A에 결합하여 네오제닌 및/또는 BMP-2 및/또는 BMP-4에 대한 결합을 방지하고 RGM A 생물학적 활성 또는 기능을 방지할 수 있다. 용어 "활성"은 항원에 대한 항체, 예를 들면, RGM A 항원에 결합하는 항-hRGM A 항체의 결합 특이성/친화성과 같은 활성 및/또는 항체, 예를 들면, 실험 단락에서 하기 기술된 바와 같이 hRGM A-네오제닌 결합 검사, hRGM A-BMP-2 결합 검사 또는 hRGM A-BMP-4 결합 검사에서 측정된 바와 같이, hRGM A에 대한 이의 결합이 hRGM A의 생물학적 활성을 억제하는 항-hRGM A 항체의 중화 효능을 포함한다.
hRGM A의 생물학적 활성은 세포 이주의 조절로 기술될 수 잇다. 세포 이주의 특정 예는 hRGM A 단백질에 의해 지연되거나 억제되는 신경돌기 성장이다. 또한, RGM 단백질은 BMP-단백질의 활성을 조정하는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 기술된 예들은 철 대사, 골 및 연골 재생의 조절 및 CNS내에서 재유수화 및 재생에 중요한, BMP-경로에 있어 RGM 단백질의 억제 활성 및, 한 면의 BMP-경로에서 RGM 단백질의 상승, 효능화 활성을 기술한다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 기술된 성분들이 이들의 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있는 병렬위치(juxtaposition)를 말한다. 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 대조군 서열은, 암호화 서열의 발현이 대조군 서열과 혼용성인 조건하에서 달성되는 방식으로 연결된다. "작동적으로 연결된" 서열은 목적하는 유전자와 연속된 발현 조절 서열 및 목적 유전자를 조절하는 거리에서 또는 트랜스(trans)로 작용하는 발현 조절 서열 둘다를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "발현 조절 서열"은, 이들이 연결된 암호화 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치는데 필수적인, 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 시그날; 세포질성 mRNA를 안정화하는 서열; 해독 효능을 향성시키는 서열[즉, 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 경우에 따라, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며; 원핵 세포에서, 이러한 조절 서열을 일반적으로 프로모터, 리보소옴 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵 세포에서, 일반적으로 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은, 이의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분들을 포함하는 것으로 의도되며 또한 이의 존재가 유리한 추가의 성분, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드로서 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 또는 한가지 유형의 뉴클레오타이드의 변형 형태를 의미한다. 당해 용어는 DNA의 단일쇄 및 이본쇄 형태를 포함하지만 특히 이본쇄 DNA이다.
용어 "폴리펩타이드"는 어떠한 아미노산의 중합체 쇄를 말한다. 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 용어 폴리펩타이드와 상호교환적으로 사용되며 또한 아미노산의 중합체 쇄를 말한다. 용어 "폴리펩타이드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
용어 "재조합체 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")는, 외인성 DNA가 도입된 세포를 말하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포만 언급하는 것이 아니라 이러한 세포의 후대세포도 언급하는 것으로 의도되어야 한다. 특정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후속 세대에서 발생할 수 있으므로, 이러한 후대세포는 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본원에 사용된 것으로서 용어 "숙주 세포"의 영역내에 포함된다. 특히 숙주 세포는 생명계(Kingdoms of life) 중 어느 것으로부터 선택된 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 특히 진핵 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 가장 특히 숙주 세포는 원핵 세포주 이. 콜라이(E. coli); 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevidiae)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
표준 기술을 재조합체 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들면, 전기천공, 지질감염)을 위해 사용할 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 명세 또는 당해 분야에서 일반적으로 달성된 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 앞서의 기술 및 과정은 일반적으로 당해 분야에 잘 공지된 통상의 방법에 따라서 및 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 각종의 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다[참조: 예를 들면, 특정 목적을 위해 참조로서 본원에 혼입된, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)].
본원에 사용된 것으로서, 용어 "재조합체 사람 항체"는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합체 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기에 추가로 기술됨), 재조합체, 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체[참조: Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom H., 및 Chames P. (2000) Immunology Today 21 : 371-378 ], 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자삽입된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체[참조: 예를 들면, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21 : 364-370] 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱(splicing)함을 포함하는 어떠한 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나 분리된 모든 사람 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합체 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 기원한 가변 및 불변 도메인을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합체 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 사람 Ig 서열에 대해 유전자삽입성인 동물이 사용된 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용됨으로써 재조합체 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 배선 VH 및 VL 서열로부터 기원하고 이와 관련되어 있지만 생체내에서 사람 항체 배선 레파토리내 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "회수하는"은 예를 들면, 당해 분야에 잘 공지된 단백질 정제 기술을 사용한 분리에 의해 천연적으로 결합된 성분들을 함유하지 않는 폴리펩타이드와 같은 화학 종(chemical species)이 되도록 하는 공정을 말한다.
용어 "RNFL"은 망막의 최내층이며 주로 시신경을 구성하는 신경절 세포 뉴런으로부터의 축색으로 구성된다. 망막층 구조는 상기 최내층(OPL)에 이어 내부 복잡한 층(IPL), 외부 망상층(OPL), 광수용체 층(PRL) 및 망막 색소 내피(RPE)를 포함한다. 건강한 개인에서, RNFL은 15세까지 두께가 단지 약 110 내지 120μm이며 대부분 정상 개인은 매년 망막 두께를 약 0.017% 손실하여 60세에 이르러 약 10 내지 20μm에 이르게 될 것이다(RNFL의 두께에 있어서의 변화는 예를 들면, 상기 프로만(Frohman) 등에 의해 기술된 OCT 방법에 의해 측정될 수 있다). 두께의 상기 손실은 또한 "정상" RNFL 변성으로 나타낼될 수 있다.
상기 "정상" 변성을 초과하거나 그 이상인 두께의 손실 또는 변성은 또한 "비정상" 또는 "질병-관련" RNFL 변성으로 지정될 수 있다. 특히 두께의 이러한 비정상적인 손실은 매년 0.017% 초과, 예를 들면, 매년 0.02% 초과, 또는 0.1% 초과, 또는 1% 초과, 또는 약 5% 초과, 또는 10% 초과 또는 20% 초과, 예를 들면, 수개월당 1 내지 10% 또는 2 내지 5%일 수 있다.
용어 "RNFL 변성"은 RNFL의 정상 및 특히, 비정상적인, 질병-관련 두께 손실 둘 다를 포함한다.
용어 "시료"는 이의 최대 광범위한 의미로 사용된다. 본원에 사용된 것으로서 "생물학적 시료"는 생명체 또는 기존의 생명체로부터의 물질의 특정 양을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 생명체는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 물질은 혈액, 혈청, 뇨, 활액, 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2의 화학 종의 상호작용과 관련하여, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은, 상호작용이 화학종 상의 특정 구조(예를 들면, 하기 정의된 것으로서 "항원성 결정인자" 또는 "에피토프")의 존재에 의존함을 의미하며; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특이적인 단백질 구조를 인식하여 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 에피토프 A(또는 유리된, 표지되지 않는 A)를 함유하는 분자의 존재는, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서, 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BIAcore 시스템[제조원: 파마시아 바이오센서 에이비(Pharmacia Biosensor AB), 뉴저지주 스웨덴 및 피츠카타웨이, 업살라 소재]을 사용하여 바이오센서 매트릭스내 단백질 농도에 있어서의 변경을 검출함으로써 실시간 생특이적인 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 말한다. 추가의 기술을 위해, 문헌[참조: Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51 : 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11 : 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.
용어 "전신계 치료"는, 결합 단백질이 혈류를 통해 신경보호 또는 신경재생 작용의 의도된 위치에 도달하도록 치료될 포유동물의 신체에 본 발명의 결합 단백질 또는 이를 함유하는 제형의 투여의 어떠한 형태도 말한다. 예를 들면, 전신계 투여는 본 발명의 결합 단백질 또는 이를 함유하는 제형의 주입 또는 주사를 포함한다.
용어 "형질전환'은, 외인성 DNA가 숙주 세포내로 도입되는 어떠한 과정도 말한다. 형질전환은 당해 분야에 잘 공지된 각종 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건하에서 발생할 수 있다. 형질전환은 외부 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 삽입시키기 위한 어떠한 공지된 방법에도 의존할 수 있다. 당해 방법은 형질전환되는 숙주 세포에 따라 선택되며 바이러스 감염, 전기천공, 지질감염 및 입자 충격(particle bombardment)을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 "형질전환"된 세포는, 삽입된 DNA가 자가 복제하는 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 또한 제한된 기간 동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.
용어 "유전자삽입 유기체"는 삽입유전자를 함유하는 세포를 갖는 유기체를 말하며, 여기서 유기체(또는 유기체의 조상)내로 도입된 삽입유전자는 유기체내에 천연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "삽입유전자"는, 유전자삽입 유기체가 유전자삽입 유기체의 하나 이상의 세포 유형 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 지시하는, 유전자삽입 유기체가 개발되는 세포의 게놈내로 안정하게 및 작동적으로 통합된 DNA 작제물이다.
용어 "RNFL 변성의 치료"는 RNFL 변성의 치료학적(즉, 급성) 및 예방학적 치료 둘다를 말한다. 상기 치료는 "신경변성" 또는 "신경보호성"일 수 있으며; 상기 치료는 "국소" 또는 "전신계" 치료의 형태일 수 있다.
용어 "벡터"는, 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한가지 유형은 "플라스미드"이며, 이는, 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 환형 이본쇄 DNA 루프를 말한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈내로 연결될 수 있다. 특정의 벡터는, 이들이 도입된 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 복제의 세균 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피소옴 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피소옴 포유동물 벡터)는 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정의 벡터는, 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합체 DNA 기술에서의 유용성의 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용된 벡터의 형태이므로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는, 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결핍성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 발현 벡터의 이러한 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "버니어 존(vernier zone)"은 문헌(참조: 본원에 참조로 인용된, Foote and Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224: 487-499)에 기술된 바와 같이 CDR 구조를 조절할 수 있고 항원에 대해 피트(fit)를 미세-조정(fine-tune)할 수 있는 골격 잔기의 소세트를 말한다. 버니어 존 잔기는 CDR 밑에 있는 층을 형성하며 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 미칠 수 있다.
2. RGM A 항체의 용도
RGM A에 대한 중화 모노클로날 항체는 RGM A의 이의 수용체 네오제닌 및 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4)에 대한 결합을 선택적으로 억제한다. 중화 모노클로날 항체는 부상을 입거나 손상된 신경 섬유의 재성장 및 재생 신경 섬유의 기능성 신경돌기의 형성, 및 시신경 손상의 생체내 래트 모델에서 원거리 재생을 유도하기 위해 자극하며 이는 또한 병변이 있는 및 재생 신경 섬유의 탈유수화를 향상시킨다(참조: PCT/EP2009/001437).
놀랍게도, RGM A에 대한 항체는 추가의 아직 인식되지 않은 RNFL 상의 직접적인 치료학적 효과와 관련되어 있다. 특히, RNFL 변성과 관련된 안 질환으로 고생하거나 RNFL 변성 위험을 지닌 환자는 본원에 정의된 바와 같은 항체 분자로 치료될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 전신계적으로 투여된 항체가 망막내 국재화되며 눈의 질병이 있는 영역에서 직접적으로 유리한 효과를 발휘한다는 놀라운 발견을 기초로 한다.
따라서, 최초로, RNFL 변성에 대한 보호를 목적으로 또는 RGM A에 결합할 수 있는 항체를 사용하여 이미 변성된 RNFL의 재생을 목적으로 하는 환자의 특정 그룹의 유도된 치료 방법이 본원에서 제공된다.
다른 실시형태는 RGM A에 결합할 수 있는 항체를 사용하는 다수의 질병 상태에서 관찰되는 것으로서 RNFL 변성의 신경보호 치료에 관한 것이다.
다른 실시형태는 RNFL 변성의 치료를 위해, RGM A를 차단하고 RGM A와 이의 수용체 및/또는 결합 단백질, 즉, 네오제닌 및 BMP-2, BMP-4 사이의 상호작용을 방지하는 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시형태는 RNFL 변성의 치료에 사용하기 위한 사람 RGM A에 대한 결합 단백질에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 상기 치료는 치료학적 또는 예방학적, 신경변성 또는 신경보호, 국소 또는 전신계 치료이다.
다른 실시형태에서, 상기 치료의 결과로서,
a. 망막 뉴런 발아가 관찰되고/되거나;
b. 망막내 RGC(망막 신결절 세포) 축색이 변성으로부터 보존된다.
하나의 국면에 따라서, 본 발명은 둘다 RNFL 변성의 치료에 사용하기 위한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된, 1 x 10-7M 이하의 KD 및 1 x 10-2s-l 이하의 koff 속도 상수로 사람 RGM A(hRGM A)로부터 해리되는 결합 단백질을 제공한다.
다른 국면에 따라서, 본 발명은 예를 들면, 사람 RGM A에 결합하여 표준 시험관내 검사, 예를 들면, RNFL 변성의 치료에 사용하기 위해 하기 실시예 3에서 예시된 바와 같은 Ntera 뉴런 과성장 검사로 측정된 바와 같이 사람 RGM A의 뉴런 과성장 억제 활성을 중화하는, 상기 역학적 특징을 나타내는 결합 단백질과 같은 결합 단백질에 관한 것이다.
다른 실시형태는 또한 다음의 추가의 기능적 특성들 중 적어도 하나를 갖는, 상기 정의한 바와 같이 사용하기 위한 결합 단백질에 관한 것이다:
래트 RGM A에 대한 결합,
사람 RGM C에 대한 결합, 및
래트 RGM C에 대한 결합.
다른 실시형태에서, 본원에 정의된 것으로서 결합 단백질은 이의 수용체 중 적어도 하나에 결합하기 위한 RGM의 능력을 조정한다. 이러한 결합 단백질은 사람 RGM A의 수용체 결합 도메인에 결합한다. RGM A에 있어서, N- 및 C-말단 수용체 결합 도메인이 확인되었다. 본 발명의 결합 단백질의 특별한 실시형태는, 네오제닌 및 BMP-4와 같은, 실시예 47 내지 168에서와 같은, N-말단 hRGM A와, 수용체 분자 사이의 결합의 억제에 의해 설명되는 바와 같은, RGM A의 N-말단 수용체 결합 도메인에 결합한다. 상기 N-말단 hRGM A 단편은 약 30 내지 약 150 또는 약 30 내지 약 122개 아미노산 잔기의 총 길이를 가질 수 있다. 비-제한적 예로서, 본원에 기술된 것으로서 hRGM A의 단편 0(N-말단 잔기 47 내지 168번에 상응) 또는 어떠한 보다 짧은 수용체 결합 단편이 언급될 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 다음 상호작용들 중 적어도 하나를 조정하거나 억제한다:
사람 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM C의 결합,
사람 BMP2에 대한 사람 RGM A의 결합.
특정 실시형태에 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 결합 단백질은 사람화된 항체이다.
상기 기술된 바와 같은 결합 단백질은 항원 결합 도메인을 가질 수 있으며, 상기 결합 단백질은 RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 항원 결합 도메인은 GTTPDY (서열 번호 59), FQATHDPLT (서열 번호 62), ARRNEYYGSSFFDY (서열 번호 65), LQGYIPPRT (서열 번호 68)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR, 및 상기 서열들 중 하나에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서 본 발명은 GTTPDY (서열 번호 59), FQATHDPLT (서열 번호 62), ARRNEYYGSSFFDY (서열 번호 65), LQGYIPPRT (서열 번호 68)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR, 및 상기 서열들 중 하나에 대해 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열을 포함하는, RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 결합 단백질에 관한 것이다.
예를 들면, 상기 결합 단백질은 예를 들면, 서열 번호 59 및 62; 또는 서열 번호 65 및 68와 같은 상기 CDR중 2개를 포함할 수 있으며; 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 상기 서열 중 하나에 대해 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%의 서열 동일성을 갖도록 변형될 수 있다.
상기 결합 단백질은 서열 번호 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR 및, 상기 서열들 중 하나에 대해 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 CDR은
Figure pct00006
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 다음으로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트로부터 선택된 적어도 3개의 CDR 또는, 가변 도메인 세트를 포함하며, 여기서 상기 3개의 CDR 중 적어도 하나는 모 서열에 대해 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열이다:
Figure pct00007
상기 언급된 변형 각각은 단일 또는 다중 아미노산 첨가, 결실, 또는 특히 치환, 또는 이의 조합에 의해 생성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 결합 단백질은 적어도 2개의 가변 도메인 CDR 세트를 포함한다.
상기 적어도 2개의 가변 도메인 CDR 세트는 VH 5F9 세트 및 VL 5F9 세트; 및 VH 8D1 세트 및 VL 8D1 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 또한 사람 수용체 골격을 포함한다.
상기 사람 수용체 골격은 서열 번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은
(1) VH3-48 세트(서열 번호 15, 16 및 17)
VH3-33 세트(서열 번호 21, 22 및 23)
VH3-23 세트(서열 번호 24, 25 및 26)[이들 세트 각각은 JH3(서열 번호 18), JH4(서열 번호 19), JH6(서열 번호 20) 중에서 선택된 추가의 골격 서열과 결합된다]의 세트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 골격 서열; 또는
(2) A18 세트:(서열 번호 27, 28 및 29)
A17 세트:(서열 번호 31, 32 및 33)[이들 세트 각각은 JK2 (서열 번호 2)로부터 선택된, 추가의 골격 서열과 결합된다]의 세트들로 이루어진 그룹 중에서 선택된 골격 서열 중 적어도 하나의 세트를 포함할 수 있다.
상기 정의한 바와 같은 결합 단백질은 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 및 43 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR-이식된 중쇄 가변 도메인; 및/또는 서열 번호 44, 45, 및 46 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR-이식된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 2개의 가변 도메인의 조합을 포함하며, 여기서, 상기 2개의 가변 도메인은
서열 번호 35 및 44; 36 및 44; 37 및 44; 38 및 44; 39 및 44; 40 및 44; 41 및 44; 42 및 44; 43 및 44;
서열 번호 35 및 45; 36 및 45; 37 및 45; 38 및 45; 39 및 45; 40 및 45; 41 및 45; 42 및 45; 43 및 45;
서열 번호 35 및 46; 36 및 46; 37 및 46; 38 및 46; 39 및 46; 40 및 46; 41 및 46; 42 및 46; 43 및 46 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용된 결합 단백질의 상기 사람 수용체 골격은 CDR에 근접한 잔기; 글리코실화 부위 잔기; 드문 잔기; RGM 에피토프와 상호작용할 수 있는 잔기; CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 표준 잔기; 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기; 베르니어 존내 잔기; 파라글루타메이트 형성할 수 있는 N-말단 잔기 및 쵸티아 정의된 가변 중쇄 CDR1과 카밧(Kabat)-정의된 제1의 중쇄 골격 사이에 중첩된 영역내 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 키 잔기(key residue)에 적어도 하나의 골격 영역 아미노산 치환을 포함한다.
상기 키 잔기는 (중쇄 서열 위치): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98
(경쇄 서열 위치): 2, 4, 41, 51로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 컨센서스 사람 가변 도메인이거나 이를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질의 다른 실시형태에 따라, 상기 사람 수용체 골격은 적어도 하나의 골격 영역 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 골격의 아미노산 서열은 상기 사람 수용체 골격의 서열과 적어도 65%, 예를 들면, 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일하고, 상기 사람 수용체 골격과 동일한 적어도 70개 아미노산 잔기, 예를 들면, 적어도 75, 80, 또는 85개 잔기를 포함한다.
특정 실시형태에 따라서, 본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 서열 번호 47, 48, 49, 50(VH 도메인)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고/되거나 서열 번호 51, 52, 53, 및 54 (VL 도메인)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 골격 돌연변이된 가변 도메인을 포함한다.
특히, 상기 결합 단백질은 2개의 임의로 골격 돌연변이된 가변 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 2개의 가변 도메인은
서열 번호 47 및 44; 47 및 45; 47 및 46; 47 및 51; 47 및 52; 47 및 53; 47 및 54;
서열 번호 48 및 44; 48 및 45; 48 및 46; 48 및 51; 48 및 52; 48 및 53; 48 및 54;
서열 번호 49 및 44; 49 및 45; 49 및 46; 49 및 51; 49 및 52; 49 및 53; 49 및 54;
서열 번호 50 및 44; 50 및 45; 50 및 46; 50 및 51; 50 및 52; 50 및 53; 50 및 54로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 기술된 바와 같이 본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 RGM 분자로부터 선택된 적어도 하나의 표적에 결합할 수 있다. 이들은 사람 RGM A, 및 임의로 사람 기원 또는 시노몰구스 원숭이(synomolgus monkey), 래트, 닭, 개구리 및 어류로부터 기원하는 적어도 하나의 추가의 RGM 분자에 결합할 수 있다. 예를 들면, 이들은 래트 RGM A, 사람 RGM C, 및/또는 래트 RGM C에 임의로 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 상기 정의된 바와 같은 RGM 분자로부터 선택된, 표적의 생물학적 기능을 조정, 특히, 중화시키거나 억제할 수 있다.
특히, 본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 예를 들면, 네오제닌과 같은 적어도 하나의 이의 수용체, 및 BMP-2 및 BMP-4와 같은 BMP에 결합하는 RGM의 능력을 조정, 특히 억제한다. 예를 들면, 상기 결합 단백질은 다음 상호작용 중 적어도 하나를 조정, 특히 소멸시키고 특히 억제한다:
사람 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM A의 결합,
사람 네오제닌에 대한 hRGM C의 결합,
사람 BMP-2에 대한 사람 RGM A의 결합.
본원에 기재된 것으로서 기능적 특징의 상이한 조합을 갖고, 후속적으로 상이한 기능적 프로파일을 나타내는 결합 단백질은 또한 본 발명의 영역내에 있다. 이러한 프로파일의 비-제한적 예는 하기 나열되어 있다:
Figure pct00008
예를 들면, 프로파일 1은 본 발명에 의해 제공된 항체 5F9 및 본원에 기술된 이의 유도체에 의해 충족된다.
예를 들면, 프로파일 2는 본 발명에 의해 제공된 항체 8D1 및 본원에 기술된 바와 같은 이의 유도체에 의해 충족된다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 RGM, 특히 RGM A의 적어도 하나의 생물학적 활성을 억제할 수 있으며, 여기서 상기 RGM A는 사람, 시노몰구스 원숭이, 래트, 닭, 개구리 및 어류중에서 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질은 다음 역학적 특징들 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 것으로서, 적어도 약 102M-1s-1; 적어도 약 103M-1s-1; 적어도 약 104M-1s-1; 적어도 약 105M-1s-1; 적어도 약 106M-1s-1 및 적어도 약 107M-1s-1로 이루어진 그룹 중에서 선택된 상기 표적에 대한 온 속도 상수(kon);
(b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 것으로서, 최대 약 10-2s-1; 최대 약 10-3s-1; 최대 약 10-4s-1; 최대 약 10-4s-1; 최대 약 10-5s-1; 및 최대 약 10-6s-1로 이루어진 그룹 중에서 선택된 상기 표적에 대한 오프 속도 상수(koff); 또는
(c) 최대 약 10-7 M; 최대 약 10-8 M; 최대 약 10-9 M; 최대 약 10-10 M; 최대 약 10-11 M; 최대 약 10-12 M; 및 최대 약 10-13 M으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 상기 표적에 대한 해리 상수(KD).
추가의 국면에 따라서, 본 발명은 상술한 결합 단백질을 포함하는 항체 작제물의 용도에 관한 것이며, 상기 항체 작제물은 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인을 추가로 포함한다.
상기 항체 작제물 또는 결합 단백질은 면역글로불린 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 사람화된 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물 결합된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 디아바디, 다특이적 항체, 이중 특이적 항체, 이중 가변 도메인 면역글로불린, 및 이특이적 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 항체 작제물에서, 상기 결합 단백질은
사람 IgM 불변 도메인,
사람 IgGl 불변 도메인,
사람 IgG2 불변 도메인,
사람 IgG3 불변 도메인,
사람 IgG4 불변 도메인,
사람 IgE 불변 도메인,
사람 IgD 불변 도메인,
사람 IgAl 불변 도메인
사람 IgA2 불변 도메인
사람 IgY 불변 도메인 및
상응하는 돌연변이된 불변 도메인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 항체 작제물은 서열 번호 11, 12, 13 및 14로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다.
다른 국면에 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 작제물을 포함하는 항체 접합체의 용도에 관한 것이며, 상기 항체 접합체는 면역부착 분자, 영상제(imaging aent), 치료제 및 세포독성제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제제를 추가로 포함하고, 이들 제제 각각은 접합, 예를 들면, 상기 결합 단백질에 공유결합으로 결합된다.
예를 들면, 상기 제제는 방사선표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생발광성 표지, 자기 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 영상제이다. 특히, 상기 영상제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 방사선표지이다.
예를 들면, 상기 제제는 항-대사제, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토킨, 항-혈광형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 및 세포자멸사제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 치료제 또는 세포독성제이다.
다른 실시형태에 따라서, 본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 상기 결합 단백질은 사람 글리코실화 패턴을 지닌다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태에 따라 사용된 결합 단백질, 항체 작제물 및 항체 접합체는 특히 생물학적 활성을 보유하는 결정(결정 형)으로 존재할 수 있다. 상기 결정은 담체-유리된 약제학적으로 조절된 방출 결정이다. 상기 결정형의 측면에서, 결합 단백질, 항체 작제물 또는 항체 접합체는 상응하는 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 높을 수 있다.
다른 국면에서, 본 발명은 본원에 기술된 결합 단백질 아미노산 서열, 항체 작제물 아미노산 서열, 및 항체 접합체 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태는 본원에 기술된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특히, 벡터는 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, 및 pBJ로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태는 또한 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 특히, 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 세포이거나; 진핵 세포이고 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 동물 세포이다. 상기 숙주 세포는 HEK 세포, CHO 세포, COS 세포 및 효모 세포 중에서 선택된다. 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있고 상기 곤충 세포는 Sf9 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 또한 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양 배지 속에서 RGM에 결합할 수 있는 결합 단백질을 생산하기에 충부한 조건하에서 배양함을 포함하여, RGM에 결합할 수 있는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는 또한 상기 방법에 따라 생산된 단백질에 관한 것이다.
다른 실시형태는
(a) 본원에 정의된 바와 같은 결정화된 생성물 단백질, 및 성분을 포함하는 제형; 및
(b) 적어도 하나의 중합체성 담체를 포함하는, 결합 단백질의 방출을 위한 조성물을 제공한다.
상기 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리((하이드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(오가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로즈 및 셀룰로즈 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 설페이트화된 다당류, 이의 배합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체일 수 있다.
상기 성분은 알부민, 슈크로즈, 트레할로즈, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
다른 국면에 따라서 본 발명은 포유동물에게 본원에 정의한 바와 같은 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 국면에 따라서, 본 발명은 생성물(특히, 상기 본원에 기술된 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체), 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 상기 결합 단백질의 흡수 또는 분산을 증가시키기에 유용한 보조제로서 기능할 수 있다.
예를 들면, 상기 보조제는 하이알루로니다제이다.
다른 실시형태에 따라서, 상기 약제는 또한, RGM 활성이 유해한 질환을 치료하기 위한 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 예를 들면, 상기 제제는 치료제, 영상제, 세포독성제, 혈관형성 억제제, 키나제 억제제; 공-자극 분자 차단제; 부착 분자 차단제; 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성약제, 항우울증제, 항정신병제, 자극제, 천식 의약, 베타 효능제, 흡입된 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨, 및 사이토킨 길항제로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명의 생성물(특히, 상기 본원에 기술된 바와 같은 결합 단백질, 작제물 또는 접합체) 단독 또는 다른 치료제와의 조합물을 투여하는 단계계를 포함하여, RNFL 변성과 관련된 질환에 대해 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 질환은 특히 당뇨병성 망막병증, 허혈성 시신경병증, X-염색체 결합된 망막층간분리증, 약물-유도된 시각 신경병증, 망막이영양증, 노화-관련 황반 변성, 시신경 헤드 드루젠(optic nerve head drusen)을 특징으로 하는 안 질환, 광반응인자 변성의 유전적 결정인자를 특징으로 하는 안 질환, 상염색체 열성 추체간체이영양증, 및 시각 신경병증을 지닌 미토콘드리아 질병을 포함하는 그룹 중에서 선택된 질병을 포함한다.
유사하게 본원에 기재된 서열 번호 34에 대한 어떠한 교시 또는 참조 문헌도 서열 번호 9에 적용된다.
3. hRGM A에 결합하는 폴리펩타이드의 용도
본 발명의 다른 실시형태는 RGM A 단백질의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드의 상기 확인된 용도를 포함한다. RGM A 단백질의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드는 이의 수용체 네오제닌 및/또는 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4), 특히 RGM A 또는 이의 항원-결합 부위 또는 단편에 결합하는 항체에 대한 RGM A의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 항-RGM A 항체는, 예를 들면, 당해 분야에 공지되거나 하기 기술된 시험관내 및 생체내 검사에서 몇개중 어느 하나에 의해 평가된 바와 같이, RGM A 활성을 감소시키거나 중화시키는 고 능력을 나타낸다.
본원은 특히 네오제닌 및 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4)에 대한 RGM A의 결합을 선택적으로 방지하는, RGM A에 대한 중화 모노클로날 항체의 용도, 및 이의 공반응인자 골 형태형성 단백질 2 및 4(BMP-2, BMP-4)에 대한 RGM A의 결합을 선택적으로 방지하는 RGM A에 대한 중화 모노클로날 항체의 생성에 관한 것이다.
특히, 본원의 모노클로날 중화 항체는 사람 항체 또는 사람화된 항체이다. 용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열에 상응하거나, 이로부터 기원한 가변 및 불변 도메인을 갖는 항체를 말한다(참조: 예를 들면, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, 1991). 그러나, 본원의 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해, 예를 들면, CDR내에서 및, 특히 CDR3 내에서 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내에서 무작위적 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
각종 실시형태에서, 항체는 재조합체 항체 또는 모노클로날 항체이다. 본원의 중화 항체의 예는 본원에서 mAb5F9 및 mAb8Dl 및 이의 기능성 항체 단편으로 언급되며, 해리 역학이 낮고 고 중화능을 가진 RGM A에 대해 고 친화성 결합과 같은 mAb5F9 및 mAb8DI에 대해 동등한 특성을 갖는 다른 항체 및 기능성 항체 단편은 본 발명의 일부로 의도된다. 면역원성 RGM A 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 대한 본원의 항-RGM A 항체의 결합 친화성 및 해리 속도는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 측정할 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성은 경쟁적 ELISA, c RIA, BIAcore 또는 KinExA 기술에 의해 측정할 수 있다. 해리 속도는 또한 BIAcore 또는 KinExA 기술로 측정할 수 있다. 결합 친화성 및 해리 속도는 예를 들면, BIAcore를 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정한다.
본원의 모노클로날 항체중 하나인, mAb5F9 항체는 서열 번호 9 또는 34의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH 영역) 및 서열 번호 10의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL 영역)을 포함하는 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
본원의 RGM A와 상호작용하는 분리된 모노클로날 항체는, 항체 또는 이의 항원-결합 부위가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 글리코실화된 결합 단백질일 수 있음이 또한 의도된다. 초기 생체내 단백질 생산은 해독 후 변형으로 공지된, 추가의 프로세싱을 겪을 수 있다. 특히, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로서 공지된 공정으로 효소적으로 첨가될 수 있다. 공유결합된 올리고사카라이드 측쇄를 지닌 수득되는 단백질은 글리코실화 단백질 또는 당단백질로 공지되어 있다. 단백질 글리코실화는 목적 단백질의 아미노산 서열, 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의존한다. 상이한 유기체는 상이한 글리코실화 효소(예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있으며 이용가능한 상이한 기질(뉴클레오타이드 당)을 갖는다. 이러한 인자로 인하여, 단백질 글리코실화 패턴, 및 글리코실 잔기의 조성은, 특정 단백질이 발현되는 숙주 시스템에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 푸코즈, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 특히, 글리코실화된 결합 단백질은, 글리코실화 패턴이 사람이도록 하는 글리코실 잔기를 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgY 또는 IgD 불변 도메인과 같은 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 또한, 항체는 경쇄 불변 도메인, 즉, 카파 경쇄 불변 도메인 또는 람다 경쇄 불변 도메인 중 하나를 포함할 수 있다. 항체는 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 또한, 항체 부위는 예를 들면, Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다. 항체 효과기의 기능을 변경시키기 위한 Fc 부위내 아미노산 잔기의 대체는 문헌(참조: Winter, et al. 미국 특허 제5,648,260호; 제5,624,821호)에 공지되어 있다. 항체의 Fc 부위는 몇가지 중요한 효과기의 기능, 예를 들면, 사이토킨 유도, ADCC, 포식작용, 상보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/청소율을 매개한다. 일부 경우에 이들 효과기의 기능은 치료학적 항체에 바람직하지만 다른 경우에서 치료 대상에 따라 불필요하거나 심지어 유해할 수 있다. 특정의 사람 IgG 동형, 특히 IgG1 및 IgG3은 Fey Rs 및 상보체 Clq 각각에 대한 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생아 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 순환하는 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 여전히 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기는 항체의 불변 도메인, 예를 들면, 항체의 Fc 영역내에서 대체됨으로써, 항체의 효과기의 기능이 변경된다.
3. 항-hRGM A 항체의 생성
3.1. 개요
본 발명의 항체는 적합한 숙주(예를 들면, 사람, 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 파충류, 어류, 양서류를 포함하는 척추동물 및, 조류, 파충류 및 어류의 알)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 본원의 항체를 생성하기 위해, 숙주를 본 발명의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 면역화시킨다. 용어 "면역화"는 본원에서 레퍼토리가 천연의 유전적으로 변경되지 않은 유기체, 또는 인공의 사람 면역 레퍼토리를 나타내기 위해 변형된 것들을 포함하는 유전자삽입 유기체내에 존재하는지를 면역 레퍼토리에 대해 항원을 표시하는 공정을 말한다. 유사하게, "면역원성 제제"는 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있는 보조제 또는 다른 첨가제를 함유하는 항체의 제형이다.
동물의 면역화는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 수행할 수 있다(참조: 예를 들면, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 같은 비-사람 동물을 면역화시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Harlow and Lane 및 미국 특허 제5, 994,619호). 특정 실시형태에서, RGM A 항원은 보조제와 함께 투여하여 면역 반응을 자극한다. 이러한 보조제는 완전하거나 불완전한 프루언드 보조제(Freund's adjuvant), RIBI(무라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역 자극 복합체)을 포함한다. 이러한 보조제는 이를 국소 데포짓(local deposit) 속에 봉쇄시킴으로써 신속한 분산으로부터 폴리펩타이드를 보호할 수 있거나, 이들은 면역계의 대식세포 및 다른 성분들에 대해 주화성인 인자들을 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 특히, 폴리펩타이드가 투여되는 경우, 면역화 스케쥴은 폴리펩타이드이 2회 이상의 투여, 수주에 걸친 확산을 포함할 것이다.
동물 숙주를 완전하거나 파괴된 세포의 세포 막과 연합된 항원으로 면역화시키고 본원의 항체를 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 결합에 의해 확인함이 고려된다. 동물 숙주를 항원으로 면역화시킨 후, 항체를 동물로부터 수득할 수 있다. 항체-함유 혈청은 동물을 방혈시키거나 희생시켜 동물로부터 수득한다. 혈청은 동물로부터 수득되므로 사용될 수 있거나, 면역글로불린 분획은 혈청으로부터 수득될 수 있거나, 항체는 혈청으로부터 정제될 수 있다. 이러한 방식으로 수득되 면역글로불린 또는 혈청은 폴리클로날이며, 따라서 특성들의 비균질 배열을 가진다.
3.2 하이브리도마 기술을 사용한 항-RGM A 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합체, 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합의 사용을 포함하여 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 당해 분야에 공지되고 예를 들면, 문헌[참조: Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)](상기 참조 문헌들은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다)에 교시된 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 어떠한 진핵세포, 원핵세포 또는 파아지 클론을 포함하고 이것이 생산되는 방법은 제외된, 단일 클론으로부터 기원한 항체를 말한다.
하이브리도마 기술을 사용하여 특이적인 항체를 생산하고 이에 대해 스크리닝하는 방법은 통상적이며 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생성하는 방법 및 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양함을 포함하는 방법에 의해 생산된 항체를 제공하며, 여기서, 하이브리도마는 본 발명의 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 분리된 비장 세포를 흑색종 세포와 융합시킨 후 본 발명의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 융합체로부터 생성된 하이브리도마를 스크리닝함을 포함하는 방법에 의새 생산된 항체를 제공한다. 요약하면, 마우스는 RGM A 항원으로 면역화시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, RGM A 항원은 보조제와 함께 투여되어 면역 반응을 자극시킨다. 이러한 보조제는 완전하거나 불완전힌 프루언드 보조제, RIBI(무라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역 자극 복합체)를 포함한다. 이러한 보조제는 폴리펩타이드를 국소 데포짓(local deposit) 속에 봉쇄시킴으로써 신속한 분산으로부터 이들을 보호할 수 있거나, 이들은 면역계의 대식세포 및 다른 성분들에 대해 주화성인 인자들을 분비하기 위해 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드가 투여되는 경우, 면역화 스케쥴은 폴리펩타이드의 2회 이상의 투여, 수주에 걸친 확산을 포함할 것이다.
면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원 RGM A에 대해 특이적인 항체가 마우스 혈청 속에서 검출되면, 마우스 비장을 수거하고 비장세포를 분리한다. 이후에, 비장세포를 잘 공지된 기술에 의해 융합시켜 어떠한 적합한 흑색종 세포, 예를 들면, ATCC로부터 이용가능한 세포주 SP20으로부터의 세포에 융합시킨다. 하이브리도마는 제한 희석에 의해 선택하여 클로닝한다. 이후에, 하이브리도마 클론을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 RGM A에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 검사한다. 일반적으로 높은 수준의 항체를 함유하는 복수액은 마우스를 양성 하이브리도마 클론으로 면역화시켜 생성할 수 있다.
다른 실시형태에서, 항체를 생산하는 무한증식하는 하이브리도마는 면역화된 동물로부터 제조할 수 있다. 면역화 후, 동물을 희생시키고, 비장 B 세포를 당해 분야에 잘 공지된 바와 같이 무한증식한 흑색종 세포에 융합시킨다(참조: 예를 들면, Harlow and Lane, 상기 참조). 다른 실시형태에서, 흑색종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드(비-분비성 세포주)를 분비하지 않는다. 융합 및 항생제 분비 후, 하이브리도마를 RGM A, 또는 이의 일부, 또는 RGM A를 발현하는 세포를 사용하여 스크리닝한다. 다른 실시형태에서, 초기 스크리닝은 효소-결합된 면역검사(ELISA) 또는 방사면역검사(RIA), ELISA를 사용하여 수행한다. ELISA 스크리닝의 예는 본원에 참조로 인용된 제WO 00/37504호에 제공된다.
항-RGM A 항체-생산 하이브리도마를 선택하고 클로닝하여 하기에 추가로 논의된 바와 같이, 강건한 하이브리도마 성장, 고 항체 생산 및 바람직한 항체 특성을 포함하는 바람직한 특성에 대해 추가로 스크리닝한다. 하이브리도마는 동계 동물(syngeneic animal), 즉 면역계를 결여한 동물, 예를 들면, 누드 마우스(nude mouse), 또는 시험관내 세포 배양물 속에서 생체내 배양하고 확장시킬 수 있다. 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하며 확장시키는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 하이브리도마는 위에 기술된 바와 같은 마우스 하이브리도마이다. 다른 특정 실시형태에서, 하이브리도마는 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비-사람, 비-마우스 종에서 생산된다. 다른 실시형태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마이며, 여기서 사람 비-분비성 흑색종이 항-RGM A 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된다.
특이적인 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해) 또는 펩신[F(ab')2 단편을 생산하기 위해]과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질분해적 절단으로 생산할 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 도메인 및 중쇄의 CHI 도메인을 함유한다.
3.3 SLAM을 사용한 항-RGM A 모노클로날 항체
본 발명의 다른 국면에서, 재조합체 항체는 문헌[참조: 미국 특허 제5,627,052호, PCT 공보 제WO 92/02551호 및 Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]에 기술된 것으로서, 선택된 림프세포 항체 방법(SLAM)과 같이 당해 분야에서 언급된 과정을 사용하여, 단일의, 분리된 림프세포로부터 생성된다. 당해 방법에서, 목적한 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들면, 상술한 면역화된 동물 중 어느 하나로부터 기원한 림프세포를 항원-특이적인 용혈빈혈 플라크 검사을 사용하여 스크리닝하며, 여기서 항원 RGM A, RGM A의 소단위, 또는 이의 단편은 비오틴과 같은 링커를 사용하여 양 적혈구 세포에 커플링시키고 RGM A에 대해 특이성이 있는 항체를 분비하는 단일 세포를 확인하기 위해 사용한다. 목적한 항체를 분비하는 세포의 확인에 이어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 역 트랜스크립타제-PCR에 의해 세포로부터 구조하고 이후에, 이들 가변 영역을 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포내에서 적절한 면역글로불린 불변 도메인{예를 들면, 사람 불변 도메인}과 관련하여 발현시킬 수 있다. 생체내에서 선택된 림프세포로부터 기원한 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포는 예를 들면 형질감염된 세포를 패닝(panning)함으로써 이후에 시험관내에서 추가로 분석 및 선택하여 RGM A에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 또한 PCT 공보 제WO 97/29131호 및 PCT 공보 제WO 00/56772호에 기술된 것과 같은 시험관내 친화성 성숙 방법에 의해서와 같이, 시험관내에서 조작할 수 있다.
3.4 유전자삽입 동물을 사용한 항-RGM A 모노클로날 항체
본 발명의 다른 실시형태에서, 항체는 사람 면역글로불린 유전자자리 중 일부 또는 모두를 포함하는 비-사람 동물을 면역화시켜 생산한다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 XENOMOUSE 유전자삽입 마우스, 사람 면역글로불린 유전자위치의 거대 단편을 포함하는 가공된 마우스 균주이며 마우스 항체 생산이 결여되어 있다[참조: 예를 들면, Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) 및 미국 특허 제5,916,771호, 제5,939,598호, 제5,985,615호, 제5,998,209호, 제6,075,181호, 제6,091,001호, 제6,114,598호 및 제6,130,364호]. 또한 1991년 7월 25일 발표된 제WO 91/10741호, 1994년 2월 3일 발표된 제WO 94/02602호, 둘다 1996년 10월 31일 발표된 제WO 96/34096호 및 제WO 96/33735호, 1998년 4월 23일 발표된 제WO 98/16654호, 1998년 6월 11일 발표된 제WO 98/24893호, 1998년 11월 12일 발표된 제WO98/50433호, 1999년 9월 10일 발표된 제WO 99/45031호, 1999년 10월 21일 발표된 제WO 99/53049호, 2000년 2월 24일 발표된 제WO 00 09560호, 및 2000년 6월 29일 발표된 제WO 00/037504호를 참조한다. XENOMOUSE 유전자삽입 마우스는 완전한 사람 항체의 성인-유사 사람 레퍼토리를 생산하며, 항원-특이적인 사람 Mab를 생성한다. XENOMOUSE 유전자삽입 마우스는 사람 중쇄 유전자위치 및 x 경쇄 유전자위치의 메가염기 크기의, 배선 구조 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 대략 80%를 함유한다[참조: 이의 기재내용은 본원에 참조로 인용된 문헌, Mendez et al, Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)].
3.5 재조합 항체 라이브러리를 사용한 항-RGM A 모노클로날 항체
시험관내 방법을 또한 사용하여 본 발명의 항체를 제조할 수 있으며, 여기서 항체 라이브러리를 스크리닝하여 바람직한 결합 특이성을 갖는 항체를 확인한다. 재조합 항체 라이브러리의 이러한 스크리닝 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[참조: Ladner et al. 미국 특허 제5,223,409호; Kang et al. PCT 공보 제WO 92/18619호; Dower et al. PCT 공보 제WO 91/17271호; Winter et al. PCT 공보 제WO 92/20791호; Markland et al. PCT 공보 제WO 92/15679호; Breitling et al. PCT 공보 제WO 93/01288호; McCafferty et al. PCT 공보 제WO 92/01047호; Garrard et al. PCT 공보 제WO 92/09690호; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, 미국 특허원 공보 제20030186374호, 및 PCT 공보 제WO 97/29131호; 상기 문헌들 각각의 내용은 본원에 참조 문헌으로 혼입된다]에 기술된 방법을 포함한다.
재조합 항체 라이브러리는 RGM A, 또는 RGM A의 일부로 면역화된 대상체로부터 기원할 수 있다. 달리는, 재조합 항체 라이브러리는 나이브(naive) 대상체, 즉, 사람 RGM A로 면역화되지 않는 사람 대상체로부터의 사람 항체 라이브러리와 같은, RGM A로 면역화되지 않는 대상체로부터 기원할 수 있다. 본 발명의 항체는 재조합 항체 라이브러리를 사람 RGM A를 포함하는 펩타이드를 사용하여 스크리닝함으로써 RGM A를 인식하는 항체를 선택함으로써 선택한다. 이러한 스크리닝 및 선택을 수행하기 위한 방법은 앞서의 단락에서 참조 문헌에 기술된 바와 같이, 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 사람 RGM A로부터 특정한 koff 속도 상수로 해리된 것들과 같이, hRGM A에 대해 특정한 결합 친화성을 가진 본 발명의 항체를 선택하기 위해, 표면 플라스몬 공명의 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 바람직한 koff 속도 상수를 갖는 항체를 선택할 수 있다. 특정한 IC50을 지닌 것과 같이, hRGM A에 대해 특정한 중화 활성을 갖는 본 발명의 항체를 선택하기 위해, hRGM A 활성의 억제를 평가하기 위해 본 발명에 공지된 표준 방법을 사용할 수 있다.
하나의 국면에서, 본 발명은 사람 RGM A에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 부위에 관한 것이다. 특히, 항체는 중화 항체이다. 각종 실시형태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들면, 본 발명의 항체는 또한 당해 분야에 공지된 각종 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 수반하는 파아지 입자의 표면에 디스플레이된다. 특히, 이러한 파아지를 이용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이할 수 있다. 목적한 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 항원, 예를 들면 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 당해 방법에 사용된 파아지는 전형적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화물 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파아지로부터 발현된 fd 및 MI 3 결합 도메인을 포함하는 필리멘트형 파아지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는, 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 인용된, 문헌[참조: Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al, J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al, Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al, Gene 187 9-18 (1997); Burton et al, Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); PCT 출원 번호 제PCT/GB91/01134호; PCT 공보 제WO 90/02809호; 제WO 91/10737호; 제WO 92/01047호; 제WO 92/18619호; 제WO 93/11236호; 제WO 95/15982호; 제WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호]에 기술된 것들을 포함한다.
상기 참조 문헌들에 기술된 바와 같이, 파아지 선택 후, 파아지로부터의 영역을 암호화하는 항체를 분리하여 사용함으로써 사람 항체 또는 어떠한 다른 바람직한 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하고 예를 들면, 하기 상세히 기술된 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 어떠한 바람직한 숙주내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하기 위한 기술은 또한 문헌[참조: PCT 공보 제WO 92/22324호; Mullinax et al, BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); 및 Sawai et al, AJRI 34: 26-34 (1995); 및 Better et al, Science 240: 1041-1043 (1988)](상기 문헌들은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다)에 기술된 것들과 같이 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 사용할 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 기술들의 예는 문헌[참조: 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al, Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al, PNAS 90: 7995-7999 (1993); 및 Skerra et al, Science 240: 1038-1040 (1988)]에 기술된 것들을 포함한다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 대안으로, 거대 조합 라이브러리를 스크리닝하기 위해 당해 분야에 공지된 다른 방법론을 본 발명의 이중 특이성 항체의 확인에 적용시킬 수 있다. 대안적인 발현 시스템의 한가지 유형은, 문헌[참조: PCT 공보 제WO 98/31700호(by Szostak and Roberts), and in Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302]에 기술된 바와 같이, 재조합 항체 라이브러리를 RNA-단백질 융합체로 발현시키는 것이다. 당해 시스템에서, 공유결합 융합체가 mRNA와 이들의 3' 말단에서 퓨로마이신, 펩티딜 수용체 항생제를 수반하는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해 암호화하는 mRNA 및 펩타이드 또는 단백질 사이에서 생성된다. 따라서, 특이적인 mRNA가 이중 특이성 항원에 대한 항체, 또는 이의 부위의 결합과 같은, 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 부위의 특성을 기준으로 mRNA(예를 들면, 조합 라이브러리)의 복합체 혼합물로부터 농축될 수 있다. 이러한 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수된, 항체 또는 이의 부위를 암호화하는 핵산 서열은 위에서 기술된 바와 같은 재조합 수단(예를 들면, 포유동물 숙주 세포내에서)에 의해 발현시킬 수 있으며, 더욱이 돌연변이를 원래 선택된 서열(들)내로 도입시킨 mRNA-펩타이드 융합체의 스크리닝의 추가의 라운드, 또는 위에서 기술한 바와 같이, 재조합체 항체의 시험관내 친화성 성숙에 대한 다른 방법에 의해 추가의 친화성 성숙에 적용시킬 수 있다.
다른 시도에서, 본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 효모 디스플레이 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전 방법을 효모 세포벽에 대한 테터(tether) 항체 도메인에 대해 사용하고 이들을 효모의 표면상에 디스플레이한다. 특히, 이러한 효모를 이용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Wittrup, et al. 미국 특허 제6,699,658호)에 기재된 것들을 포함한다.
4. 본 발명의 특정한 재조합 RGM A 항체의 생산
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 다수의 기술 중 어느 것으로도 생산할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)을 표준 기술에 의해 숙주 세포내로 형질감염시키는, 숙주 세포로부터의 발현. 용어 "형질감염"의 각종 형태는 외인성 DNA를 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포내로 예를 들면, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등에 의해 도입시키기 위해 일반적으로 사용된 각종 기술을 포함하는 것으로 의도된다. 비록 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 진핵 세포가 관심있는 항체의 발현, 및 가장 흥미있게는 포유동물 숙주 세포내에서 발현시키는 것이 가능하다고 해도, 이러한 진핵 세포(및 특히 포유동물 세포)는 원핵 세포보다 더 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비하는 경향이 있다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 특정 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)[예를 들면, 문헌(참조: R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621)에 기술된 것으로서, DHFR 선택성 마커와 함께 사용된 문헌(참조: Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220)에 기술된 dhfr- CHO 세포 포함], NS0 흑색종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포내로 도입된 경우, 항체는 숙주 세포를 숙주 세포내에서 항체의 발현, 또는 보다 특히, 숙주 세포가 성장하는 성장 배지내로의 항체의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 배양함으로써 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
숙주 세포를 또한 사용하여 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 기능성 항체 단편을 생산할 수 있다. 상기 과정의 변형은 본 발명의 영역내에 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술을 또한 사용하여 목적한 항원에 결합하는데 필수적이지 않은 중쇄 및 경쇄 중 어느 하나 또는 둘다를 암호화하는 DNA 중 일부 또는 모두를 제거할 수 있다. 이러한 트렁케이트된(truncated) DNA 분자로부터 발현된 분자는 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 본 발명의 항체를 표준 화학적 교차 방법에 의해 제2의 항체에 교차결합시켜 목적한 항원 이외의 항원에 대해 특이적인 이기능성 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부위의 재조합 발현을 위한 특정 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포내로 도입된다. 재조합 발현 벡터내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 성분에 작동적으로 연결되어 유전자의 고 수준의 전사를 구동한다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 수반하며, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 허용하는 DHFR 유전자를 수반한다. 선택된 형질전환 숙주 세포는 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 허용하고 완전한 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키며, 형질전환체를 선택하고 숙주 세포를 배양하며 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 여전히 또한 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를, 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적합한 배양 배지 속에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 또한 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리함을 포함할 수 있다.
4.1 항 RGM A 항체
표 5는 본 발명의 특정한 항-hRGM A 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열의 목록이다.
Figure pct00009
앞서 분리된 항-RGM A 항체 CDR 서열은 본 발명에 따라 분리된 RGM A 결합 단백질의 신규 계열을 확립한다. hRGM A와 관련하여 특정한 RGM A 결합 및/또는 중화 활성을 갖는 본 발명의 CDR을 생성하고 선택하기 위하여, 본원에 구체적으로 기술된 것들을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 본 발명의 결합 단백질을 생성하고 이들 결합 단백질의 RGM A 결합 및/또는 중화 특성을 평가하기 위한 당해 분야에 공지된 표준 방법을 사용할 수 있다.
4.2 항 RGM A 키메라 항체
키메라 항체는, 항체의 상이한 부위가 상이한 동물 종으로부터 기원한 분자, 예를 들면, 뮤린 모노클로날 항체 및 사람 면역글로불린 불변 도메인으로부터 기원한 가변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al, BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al, (1989) J. Immunol. Methods 125: 191-202; 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호]. 또한, 적절한 생물학적 활성의 사람 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱(splicing)함으로써 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술(참조: 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, Morrison et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 851-855; Neuberger et al, 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al, 1985, Nature 314: 452-454)을 사용할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항체는 본원에 기술된 뮤린 모노클로날 항 사람 RGM A 항체의 중쇄 불변 도메인을 사람 IgGl 불변 도메인으로 대체시킴으로써 생산한다.
4.3 항 RGM A CDR 이식된 항체
본 발명의 CDR-이식된 항체는 사람 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하며, 여기서 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상은 예를 들면, 본 발명의 뮤린 항체와 같이, 비-사람의 CDR 서열로 대체된다. 어떠한 사람 항체로부터의 골격 서열도 CDR 이식을 위한 주형으로 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 골격위에 직쇄의 교체는 흔히 항원에 대한 결합 친화성의 일부 손실을 일으킨다. 사람 항체가 원래의 뮤린 항체에 대해서 보다 상동성일 수록, 뮤린 CDR을 사람 골격과 결합하는 것은 친화성을 감소시킬 수 있는 CDR내 왜곡(distortion)을 도입시킬 가능성이 더 적어진다. 따라서, CDR로부터 떨어진 뮤린 가변 골격을 대체시키기 위해 선택된 사람 가변 골격은 뮤린 항체 가변 영역 골격과 적어도 65% 서열 동일성을 가진다는 것은 특히 흥미롭다. CDR로부터 떨어진 사람 및 뮤린 가변 영역이 적어도 70% 서열 상동성을 갖는다는 것은 보다 특히 흥미롭다. CDR로부터 떨어진 사람 및 뮤린 가변 영역이 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것이 훨씬 더 특히 흥미롭다. CDR로부터 떨어진 사람 및 뮤린 가변 영역이 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다는 것은 가장 특히 흥미롭다. CDR-이식된 항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986); 미국 특허 제5,225,539호]. 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 표 6에 기술된 바와 같이 VH 및/또는 VL 쇄를 지닌 CDR 이식된 항체를 제공한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
mAb 5F9로부터 기원한 CDR 서열은 고딕체로 기술되어 있으며, 참조는 또한 상응하는 서열 번호를 언급함으로써 구체적인 골격 서열(FR1 내지 FR4)에 대해 이루어진다(참조: 또한 표 3 및 4).
4.4 항 RGM 사람화된 항체
사람화된 항체는 비-사람 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자로부터의 골격 영역에 결합하는 비-사람 종 항체로부터의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은 예를 들면, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whireeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www. library.thinkquest.org/ 12429/Immune/ Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl. edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl. edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath. ac.uk/; abgen. cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen. html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/SlideO 1.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path. cam. ac.uk/. about .mrc7/h- umanisation/T AHHP .html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc. cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al, Sequences of ProteiNs of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)에 기재되어 있으며, 이들 각각은, 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다. 이러한 중요한 서열을 사용하여 당해 분야에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 온-속도, 오프-속도, 항원항체결합력, 특이성, 반감기, 또는 어떠한 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나 수정할 수 있다.
사람 골격 영역내 골격 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환하여 항원 결합을 변경, 특히 개선시킬 수 있다. 이들 골격 치환은 예를 들면, CDR 및 골격 잔기의 상호작용을 모델링하여 특정 위치에서 일반적이지 않은 골격 잔기를 확인하기 위한 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 확인함으로써, 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 확인한다[참조: 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, Queen et al, U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)]. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 유용하며 당해 분야의 숙련가에게 친숙하다. 선택된 후보물 면역글로불린 서열의 개연성있는 3-차원 형태 구조를 나열하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 이스플레이의 검사는 후보물 면역글로불린 서열의 기능성에 있어서 잔기의 유사한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하기 위한 후보물 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 당해 방식으로, FR 잔기를 컨센서스 및 도입 서열로부터 선택하여 결합함으로써 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 바람직한 항체 특성을 달성한다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는데 관여된다. 항체는 문헌[참조: 각각 전문이 본원에 참조로 인용된, Jones et al, Nature 321 : 522 (1986); Verhoeyen et al, Science 239: 1534 (1988)), Sims et al, J. Immunol. 151 : 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol. 151 : 2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al, Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91 : 969-973 (1994); PCT 공보 제WO 91/09967호, PCT/US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755호; 제WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, 미국 특허 제5,565,332호, 제5,723,323호, 제5,976,862호, 제5,824,514호, 제5,817,483호, 제5,814,476호, 제5,763,192호, 제5,723,323호, 제5,766,886호, 제5,714,352호, 제6,204,023호, 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,225,539호; 제4,816,567호 및 이들 문헌에 인용된 문헌들]에 기술된 것들과 같은, 그러나 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 사람화시킬 수 있다.
5. 본 발명의 항체의 추가의 실시형태
5.1 융합 항체 및 면역부착소(immunoadhesin)
본원은 또한 다른 폴리펩타이드에 연결된 본 발명의 RGM A 항체 중 모두 또는 일부를 포함하여 제조될 수 있는 융합 항체 또는 면역부착소를 기술한다. 일부 실시형태에서, RGM A 항체의 가변 영역만이 폴리펩타이드에 연결된다. 다른 실시형태에서, 본원의 RGM A 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩타이드에 연결되는 한편, 항체의 VL 도메인은, VH 및 VL 도메인이 다른 하나와 상호작용하여 항체 결합 부위를 형성하도록 하는 방식으로 제1의 폴리펩타이드와 연합하는 제2의 폴리펩타이드에 연결된다. 다른 실시형태에서, VH 도메인은 VH 및 VL 도메인이 다른 것과 상호작용하도록 하는 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(참조: 단일쇄 항체 이하의 내용). 이후에, VH-링커-VL 항체는 목적하는 폴리펩타이드에 연결된다. 융합 항체는 RGM A를 발현하는 세포 또는 조직에 폴리펩타이드를 지시하는데 유용하다. 목적한 폴리펩타이드는 독소와 같은 치료제일 수 있거나, 효소와 같은 진단제일 수 있고; 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같이 용이하게 가시화될 수 있다. 또한, 융합 항체가 생성될 수 있으며, 여기서 2개(또는 그 이상)의 단일쇄 항체가 서로 연결된다. 이는, 하나가 단일의 폴리펩타이드 쇄 상에서 2가 또는 다가 항체를 생성하기를 원하는 경우, 또는 하나가 이특이적 항체를 생성하기를 원하는 경우 유용하다.
하나의 실시형태는 표지된 결합 단백질을 제공하며, 여기서 본원의 항체 또는 항체 부위는 유도체화되거나 다른 기능성 분자(예를 들면, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결된다. 예를 들면, 본원의 표지된 결합 단백질은 본원의 항체 또는 항체 부위를 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합적 연합 또는 기타 방법에 의해) 핵산, 다른 항체(예를 들면, 이특이적인 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제 및/또는, 항체 또는 항체 부위와 다른 분자(예를 들면, 스트렙트아비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결시킴으로써 유도시킬 수 있다.
본원의 항체 또는 항체 부위가 유도체화될 수 있는 유용한 검출가능한 제제는 형광성 화합물을 포함한다. 예시적인 형광성 검출가능한 제제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함한다. 항체는 또한 알칼린 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코즈 옥시다제 등과 같은 검출가능한 효소로 유도체화시킬 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 유도체화되는 경우, 이는 효소를 사용하여 검출가능한 반응 생성물을 생산하는 추가의 시약을 가함으로써 검출된다. 예를 들어, 검출가능한 제제인 서양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 착색된 반응 생성물을 생성한다. 항체는 또한 핵산 비오틴으로 유도체화시킬 수 있으며 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출될 수 있다.
5.2 단일쇄 항체
본원은 본 발명의 면역원성 RGM A에 결합하는 단일쇄 항체(scFv)를 포함한다. scFv를 생산하기 위해, VH- 및 V-암호화 DNA를 굴곡가능한 링커를 암호화하는, 예를 들면, 아미노산 서열(Gly4-Ser)을 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결시킴으로써, VH 및 VL 서열을 굴곡가능한 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 영역을 지닌 연속된 단일쇄 단백질로서 발현시킬 수 있다.[참조: 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242: 423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al, 30 Nature (1990) 34 8: 552-554]. 단일쇄 항체는, 단지 단일의 VH 및 VL이 사용된 경우 1가일 수 있으며, 2개의 VH 및 VL이 사용된 경우, 2가이거나, 2개 이상의 VH 및 VL이 사용된 경우 다가일 수 있다. 링커를 통해 커플링된 상기 scFv 단편 중 2개는 본 발명에 또한 포함된 형태인 "디아바디"로 불린다.
5.3 이특이적인 항체
본원은 또한 이특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며 여기서 하나의 특이성은 본원의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드에 대한 것이다. 예를 들어, 하나의 결합 도메인을 통해 본 발명의 면역원성 RGM A 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 제2의 결합 도메인을 통해 제2의 분자에 특이적으로 결합하는 이특이적 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 약화되는 미엘린 매개된 성장 원뿔 붕괴 및 신경돌기 과성장 및 발아의 억제와 관련된 다른 분자에 특이적으로 결합하는, 하나 이상의 VH 및 VL을 함유하는 단일쇄 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 이특이적인 항체는 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) 및 Wright and Harris, 20 (상기 참조)]에 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 이특이적인 항체는 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 가변 영역을 사용하여 제조한다. 다른 실시형태에서, 이특이적 항체는 상기 항체로부터 하나 이상의 CDR 영역을 사용하여 제조한다.
5.4 유도체화되고 표지된 항체
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 유도체화하거나 다른 분자(예를 들면, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 항원-결합 단편은 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 역으로 영향받지 않도록 유도체화된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 부위는 다른 항체(예를 들면, 이특이적인 항체 또는 디아바디), 검출 시약, 세포독성제, 약제 및/또는 항체 또는 항원-결합 단편의 다른 분자(예를 들면, 스트렙트아비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드와 같은 하나 이상의 다른 분자 실체에 기능적으로 연결(화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합성 연합 또는 기타에 의해)시킬 수 있다. 여전히 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 부위는 항체 또는 항체 부위와 하나 이상의 다른 또는 상이한 단백질 또는 펩타이드의 공유결합 또는 비-공유결합성 연합에 의해 형성된 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사합체성 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용[참조: Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101] 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용을 포함한다[참조: Kipriyanov et al. (1994) Molecular Immunology 31 : 1047-1058]. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부위는 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해 각각과 같은 통상의 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 부위 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
유도체화된 항체는 2개 이상의 항체(예를 들면, 이특이적 항체를 생성하기 위한 동일한 유형 또는 상이한 유형의) 항체를 교차결합시켜 생산할 수 있다. 적합한 교차결합제는 적절한 스페이서(예: m-말레이미도벤조일-N-하이드록시선신이미드 에스테르) 또는 단독이기능성(예: 디석신이미딜 수버레이트)에 의해 분리된 2개의 구별가능하게 반응성인 그룹을 갖는 이종이기능성인 것들을 포함한다. 이러한 링커는 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company)로부터 이용가능하다.
유도체화된 항체는 또한 표지된 항체일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항체 부위가 유도체화될 수 있는 검출제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피로에리트린, 란타나이드 인 등을 포함하는 형광성 화합물이다. 항체는 또한 서양고추냉이 퍼옥시다제, 갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제, 글루코즈옥시다제 등과 같이 검출에 유용한 효소로 표지시킬 수 있다. 검출가능한 효소로 표지하는 실시형태에서, 항체는 검출가능한 반응 생성물을 생산하기 위해 효소를 사용하는 추가의 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 과산화수소 및 디아미노벤지딘. 항체는 또한 비오틴으로 표지시키고, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출할 수 있다. 항체는 또한 제2의 리포터[예를 들면, 루이신 지퍼 쌍 서열(leucin zipper pair sequence), 제2 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프: 태그]에 의해 인식된 예정된 폴리펩타이드 에피토프로 표지시킬 수 있다. RGM A 항체 또는 이의 항원 단편은 또한 방사선-표지된 아미노산으로 표지시킬 수 있다. 방사선표지는 진단 및 치료 목적 둘다에 대해 사용할 수 있다. 방사선-표지된 RGM A 항체는 예를 들면, 대상체내에서 RGM A 수용체 수준을 측정하기 위해 진단적으로 사용할 수 있다. 또한, 방사선-표지된 RGM A 항체는 척수 손상을 치료하기 위해 치료학적으로 사용할 수 있다.
폴리펩타이드용 표지의 예는 다음 방사선동위원소 또는 방사선뉴클레오타이드 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111n, 1251, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. RGM A 항체 또는 이의 항원 단편은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 그룹, 또는 탄수화물 그룹과 같은 화학 그룹으로 유도체화시킬 수 있다. 이들 그룹은 항체의 생물학적 특성을 개선시키기 위해, 예를 들면, 혈청 반감기를 증가시키거나 조직 결합을 증가시키는데 유용할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드용 표지는 PCR에 의해, 또는 유전자 발현을 향상시키기 위한 검출용의 핵산, 예를 들면 DNA, 또는 RGM A-함유 세포 또는 조직에서 유전자 발현을 제어하기 위한 siRNA를 포함할 수 있다.
RGM A 항체의 부류 및 소부류는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 측정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 부류 및 소부류는 항체의 특정 분류 및 소부류에 특이적인 항체를 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 이용가능하다. 부류 및 소부류는 ELISA, 웨스턴 브롯 및 다른 기술로 측정할 수 있다. 달리는, 부류 및 소부류는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인 모두 또는 일부를 서열분석하고, 이들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 각종 부류 및 소부류의 공지된 아미노산 서열과 비교하며, 항체의 부류 및 소부류를 측정함으로써 측정할 수 있다.
5.5 이중 가변 도메인 면역글로불린
본원에 사용된 바와 같은 이중 가변 도메인(DVD) 결합 단백질 또는 면역글로불린은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는결합 단백질이며 예를 들면, 2가 및 4가와 같은 다가 결합 단백질이다. 용어 "다가 결합 단백질"은 본 명세서에서 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 나타내기 위해 사용된다. 다가 결합 단백질은 특히 2개 이상의 항원 결합 부위를 지니도록 가공되며, 일반적으로 천연적으로 발생하는 항체가 아니다. 용어 "다특이적 결합 단백질"은 2개 이상의 관련되거나 관련되지 않은 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 말한다. 이러한 DVD는 일특이적, 즉, 1개의 항원에 결합할 수 있거나, 다특이적, 즉 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다. 2개 이상의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig로 언급된다. DVD Ig의 1/2 각각은 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 포함된 총 6개의 CDR을 지닌 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. DVD 결합 단백질 및 DVD 결합 단백질을 제조하는 방법은 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 제11/507,050호에 기재되어 있다. 본 발명은 RGM A에 결합할 수 있는 결합 단백질을 포함하는 DVD 결합 단백질을 포함한다. 특히 DVD 결합 단백질은 RGM A 및 제2 표적에 결합할 수 있다. 제2 표적은 항 염증 MAB 활성(IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23,TNF 알파/베타, IFN-베타, 감마, LIF, OSM, CNTF, PF-4, 혈소판 기본 단백질(PBP), NAP-2, 베타-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, 림포탁틴), 수송-매개 단백질(인슐린 수용체, 트랜스페린 수용체, 트롬빈 수용체, 렙틴 수용체, LDL 수용체), 다른 신경재생성 MAB[NgR, 린고(Lingo), p75, CSPG(예를 들면, NG-2, 뉴로칸, 브레비칸, 베르시칸, 아그레칸), 하이알루론산, mAG, 테나스킨, NI-35, NI-250, IMP, 페를레칸, 뉴로칸, 포스파칸, 노고(nogo)-A, OMGP, 세마(Sema)4D, 세마 3A, 에프린 B3, 에프린 A2, 에프린 A5, MAG, EphA4, 플렉신 B1, TROY, wnts, ryk rec, BMP-2, BMP-4, BMP-7), 신경보호 MAB 활성(EGF, EGFR, Sema 3), 항-아밀로이드 베타 MAB[예: m266, 3D6(바피뉴주마브), 항-글로불로머 MAB 7C6], CNS 위치된 수용체 및 수송인자(세로토닌 수용체, 도파민 수용체, DAT, Asc-1, GlyT1]으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
5.6 이중-특이적인 항체
본원은 또한 "이중-특이적인 항체" 기술을 설명한다. 이중-특이적인 항체는 효능제, 길항제, 또는 상이한 조합의 둘 다로서 제공될 수 있다. 이중-특이적인 항체는, 제WO1008082651호에 예시된 바와 같이, VH 쇄가 제1의 항원에 결합하고 VL 쇄가 다른 항원에 결합하는 항체이다.
5.7 결정화된 항체
본원의 다른 실시형태는 결정화된 결합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "절정화된"은 결정의 형태로 존재하는 항체, 또는 항원 결합 부위를 말한다. 결정은 무정형 고체 상태 또는 액체 결정 상태와 같은 다른 형태와는 구별되는 물질의 고체 상태 중 하나의 형태이다. 결정은 원자, 이온, 분자(예를 들면, 항체와 같은 단백질), 또는 분자 조립체(예를 들면, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고, 반복적인, 3-차원 배열로 구성된다. 이들 3-차원 배열은 당해 분야에서 잘 이해되는 특정한 수학적 관계에 따라 정렬되어 있다. 결정내 반복된 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위로 일컬어진다. 제공되고, 잘 정의된 결정학적 대칭에 대해 확인하는 정렬내 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적인 해독에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다[참조: Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2n ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)].
특히 본원은 본원에 기술된 것으로서 전체 RGM A 항체 및 이의 단편의 결정, 및 이러한 결정을 포함하는 제형 및 조성물을 기술한다. 하나의 실시형태에서 결정화된 결합 단백질은 결합 단백질의 가용성 대응부보다 생체내에서 보다 큰 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 보유한다.
본 발명의 결정화된 결합 단백질은 당해 분야에 공지되고 본원에 참조로 인용된 제WO 02072636호에 기재된 방법에 따라 생산될 수 있다.
5.8 글리코실화된 항체
본 발명의 다른 실시형태는, 항체 또는 이의 항원-결합 부위가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 글리코실화된 결합 단백질을 제공한다. 초기의 생체내 단백질 생산은 해독 후 변형으로 알려진 추가의 프로세싱을 겪을 수 있다. 특히, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로 공지된 과정인, 효소적으로 첨가될 수 있다. 공유결합으로 연결된 올리고사카라이드 측쇄를 지닌 수득되는 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로 공지되어 있다. 항체는 Fc 도메인, 및 가변 도메인내 하나 이상의 탄수화물 잔기를 지닌 당단백질이다. Fc 도메인내 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 효과기 기능에 있어서 중요한 효과와 항체의 항원 결합 또는 반감기에 있어서 최소 효과를 갖는다[참조: R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16]. 대조적으로, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 있어 효과를 가질 수 있다. 가변 도메인내 글리코실화는 입체적 장애에 기인한 항체 결합 친화성에 있어서 음성 효과를 가질 수 있거나[참조: Co, M.S., et al, Mol. Immunol. (1993) 30: 1361- 1367], 항원에 대한 증가된 친화성을 초래한다[참조: Wallick, S.C., et al, Exp. Med. (1988) 168: 1099-1109; Wright, A., et al, EMBO J. (1991) 10:2717 2723].
본 발명의 하나의 국면은 글리코실화 부위 돌연변이체를 생성하는 것에 관한 것이며, 여기서 결합 단백질의 O- 또는 N-결합된 글리코실화 부위는 돌연변이된다. 당해 분야의 숙련가는 잘-공지된 표준 기술을 사용하여 이러한 돌연변이체를 생성할 수 있다. 생물학적 활성을 보유하지만 결합 활성이 증가되거나 감소된 글리코실화 부위 돌연변이체는 본 발명의 다른 목적이다.
여전히 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위의 글리코실화는 변형되어 있다. 예를 들면, 아글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화를 결여한다). 글리코실화는 예를 들면 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 항체 서열내 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산을 치환시켜 하나 이상의 가변 영역 글리코실화 부위를 제거함으로써 이러한 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 시도는, 이의 전문 각각이 본원에 참조로 인용된 PCT 공보 제WO2003016466A2호, 및 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 기술되어 있다.
추가로 또한 대안적으로, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화된 항체 또는 증가된 이등분 GlcNAc 구조를 갖는 항체와 같은 글리코실화의 변형된 유형을 갖는 본 발명의 변형된 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 변경된 글리코실화 기관을 지닌 숙주 세포내에서 항체를 발현시킴으로써 달성할 수 있다. 변경된 글리코실화 기관을 지닌 세포는 당해 분야에 기술되어 있으며 본 발명의 재조합체 항체를 발현함으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로 사용될 수 있다[참조: 예를 들면, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, 및 유럽 특허 제EP 1,176,195호; PCT 공보 제WO 03/035835호; 제WO 99/54342 80호, 이들 각각은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다].
단백질 글리코실화는 목적한 단백질의 아미노산 서열, 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의존한다. 상이한 유기체는 상이한 글리코실화 효소(예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있으며, 이용가능한 상이한 기질(뉴클레오타이드 당)을 가질 수 있다. 이러한 인자들로 인하여, 단백질 글리코실화 양식, 및 글리코실 잔기의 조성은, 특정한 단백질이 발현되는 숙주 시스템에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 푸코즈, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 특히, 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실 잔기를 포함함으로써 글리코실화 양식은 사람이다.
상이한 단백질 글리코실화는 상이한 단백질 특성을 생성할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주내에서 생산되고, 효모 내인성 경로를 이용하여 글리코실화된 치료학적 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포내에서 발현된 동일한 단백질의 것과 비교하여 감소될 수 있다. 이러한 당단백질은 또한 사람내에서 면역원성일 수 있으며 투여 후 생체내에서 감소된 반감기를 나타낸다. 사람 및 다른 동물에서 특이적인 수용체는 특이적인 글리코실 잔기를 인식하여 혈류로부터 단백질의 신속한 청소(clearance)를 촉진할 수 있다. 다른 부작용은 단백질 폴딩, 가용성, 프로테아제에 대한 민감성, 트래피킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식, 항원성, 또는 알레르기항원성에 있어서의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 숙련가들은 특이적인 조성 및 글리코실화 패턴, 예를 들면, 의도된 대상체 동물의 종-특이적인 세포내에서 또는 사람 세포내에서 생산된 것과 동일하거나, 적어도 유사한 글리코실화 조성 및 양식을 갖는 치료학적 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포의 것과는 상이한 글리코실화된 패턴을 발현하는 것은 숙주 세포를 유전적으로 변형시켜 이종 글리코실화 효소를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 숙련가는 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 생성할 수 있다. 예를 들면, 효모 균주를 유전적으로 변형시켜 비-천연적으로 존재하는 글리코실화 효소를 발현시킴으로써 이들 효모 균주내에서 생산된 글리코실화된 단백질(당단백질)이 동물 세포, 특히 사람 세포의 것과 동일한 단백질 글리코실화를 나타낸다(참조: 미국 특허원 제20040018590호 및 제20020137134호 및 PCT 공보 제WO2005100584 A2호).
또한, 목적 단백질은 각종 글리코실화 효소를 발현하도록 유전적으로 가공된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 발현시킴으로써 라이브러리의 구성원 숙주 세포가 변이체 글리코실화 양식을 갖는 목적 단백질을 생산할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 인식될 것이다. 이후에 숙련가는 특정한 신규 글리코실화 양식을 갖는 목적 단백질을 선택하고 분리할 수 있다. 특히, 특정하게 선택된 신규 글리코실화 패턴을 갖는 단백질은 개선되거나 변경된 생물학적 특성을 나타낸다.
5.9 항-개체특이형 항체
결합 단백질 외에, 본 발명은 또한 본 발명의 이러한 결합 단백질에 대해 특이적인 항-개체특이형(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 다른 항체의 항원-결합 영역과 유전적으로 관련된 유일한 결정인자를 인식하는 항체이다. 항-Id는 동물을 결합 단백질 또는 이의 CDR 함유 영역으로 면역화시켜 제조할 수 있다. 면역화된 동물은 면역화 항체의 개체특이형 결정인자를 인식하여 이와 반응하여 항-Id 항체를 생산할 것이다. 항-Id 항체는 "면역원"으로 사용되어 소위 항-항-Id 항체를 생산하는 여전히 다른 동물에서 면역 반응을 유도하기 위한 "면역원"으로 사용될 수 있다.
6. 약제학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부위 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 질환을 진단하거나, 검출하거나 모니터링하고/하거나 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 유지하거나 완화시키고/시키거나 조사에서 사용된다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은, RGM A 활성이 유해한 질환을 치료하기 위한 본 발명의 하나 이상의 항체 및 본 발명의 항체 이외의 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특히, 예방제 또는 치료제는 질환 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 유지 또는 완화에 유용하거나 이에 사용되어 왔거나 현재 사용중인 것으로 공지되어 있다. 이들 실시형태에 따라서, 조성물은 또한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체-부위는 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물내로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 부위 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 어떠한 및 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 하나 이상의 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이의 조합을 포함한다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가알코올, 또는 염화나트륨을 조성물 속에 포함시키는 것이 특히 유리할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 또한 항체 또는 항체 부위의 반감기 또는 유효성을 향상시키는, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량 포함할 수 있다.
각종 전달 시스템이 공지되어 있으며 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 하나 이상의 항체와 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 유지하거나, 치료하거나 완화시키는데 유용한 예방제 또는 치료제와의 조합물, 예를 들면, 리포좀, 미세입자, 미세캅셀, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합체 세포, 수용체-매개된 세포내이입[참조: 예를 들면, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)], 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제물 등을 투여하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들면, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경질막 투여, 종양내 투여 및 점막 투여(예를 들면, 비강내 및 경구 경로)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 예를 들면 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 사용한 제형을 사용함으로써 폐 투여를 사용할 수 있다(참조: 예를 들면, 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호). 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항체, 조합 치료요법, 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술[공급원: 알커메스, 인크(Alkermes, Inc.), 매사추세츠주 캠브릿지 소재]을 사용하여 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구, 비강내, 폐 또는 피하 투여된다. 예방제 또는 치료제는 예를 들면, 주입 또는 볼내 주사에 의해, 상피 또는 점막 라이닝(lining)(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 어떠한 편리한 경로로도 투여될 수 있으며 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신계 또는 국소일 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제를 치료가 요구되는 부위에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예를 들면, 국소 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 삽입물(implant)의 수단에 의해, 그러나 이들에 한정되지 않는 수단으로 달성할 수 있으며, 상기 삽입물은 실라스틱 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예를 들면, Tisseel®), 또는 콜라겐 매트릭스와 같은 막 및 매트릭스를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 유효량의 본 발명의 길항제의 하나 이상의 항체는 대상체에게 영향받는 부위에 국소 투여됨으로써 질환 또는 이의 증상을 예방, 치료, 유지 및/또는 완화시킨다. 다른 실시형태에서, 유효량의 본 발명의 하나 이상의 항체는 본 발명의 항체 이외의 하나 이상의 치료제(예를 들면, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 함께 대상체의 영향받은 부위에 국소 투여되어 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 유지 및/또는 완화시킨다.
다른 실시형태에서, 예방제 또는 치료제는 조절된 서방출 또는 지연된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 펌프를 사용하여 조절된 또는 지연된 방출을 달성할 수 있다(참조: Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald et al, 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321 : 574). 다른 실시형태에서, 중합체 물질은 본 발명의 치료제의 조절된 방출 또는 서방출을 달성하는데 사용될 수 있다[참조: 예를 들면, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; see also Levy et al, 1985, Science 228: 190; During et al, 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 7 1 : 105); 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제5,128,326호; PCT 공보 제WO 99/15154호; 및 PCT 공보 제WO 99/20253호]. 서방출 제형에 사용된 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 다무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 및 폴리오르토 에스테르를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 서방출 제형에 사용된 중합체는 불활성이고, 여과할 수 있는 불순물을 포함하지 않으며, 저장시 안정하고, 멸균되어 있으며 생분해가능하다. 여전히 다른 실시형태에서 조절된 방출 또는 서방출 시스템은 예방학적 또는 치료학적 표적에 근접하게 위치함으로써 전신계 투여량의 분획만을 필요로 할 수 있다[참조: 예를 들면, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)].
조절된 방출 시스템은 문헌[참조: Langer (1990, Science 249: 1527-1533]에 논의되어 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 기술도 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 서방출 제형을 생산하기 위해 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,526,938호, PCT 공보 제WO 91/05548호, PCT 공보 제WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of Humam Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39: 179-189, Song et al, 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50: 372-397, Cleek et al, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854, and Lam et al, 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760, 이들 각각은, 이들의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다].
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 경우, 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로 작제함으로써 이의 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진하고, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 사용하여(참조: 미국 특허 제4,980,286호), 또는 직접 주사에 의해, 또는 미세입자 충격(예를 들면, 유전자 총(gene gun); 제조원: 바이올리스틱(Biolistic), 듀퐁(Dupont)]을 사용하여 이를 투여하거나, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 피복하거나, 또는 이를 핵을 도입시키는 것으로 공지된 호메오박스(homeobox)-유사 펩타이드(참조: 예를 들면, Joliot et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868)에 연결시켜 투여함으로써 이것이 세포내가 되도록 할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포내적으로 도입시키고 동종 재조합에 의해 발현용 숙주 세포 DNA내에 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 상용성이되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비강내(예를 들면, 흡입), 경피(예를 들면, 국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 조성물은 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 국소 투여하기 위해 조정된 약제학적 조성물로서 통상의 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 면귤 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요할 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 감소시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물을 국소적으로 투여하는 경우, 조성물은 연고제, 크림제, 경피 패치, 로션제, 겔제, 샴푸제, 분무제, 에어로졸제, 액제, 유제 또는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 다른 형태로 제형화될 수 있다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]. 분무가능하지 않은 국소 용량형의 경우, 국소 적용에 양립성인 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 물보다 특히 더 높은 동적 점도를 갖는 점성 내지 반-고체 또는 고체 형이 전형적으로 사용된다. 적합한 제형은 경우에 따라, 예를 들면, 삼투압과 같은 각종 특성에 영향을 미치기 위한 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)과 혼합되거나 멸균된, 액제, 현탁제, 유제, 크림제, 연고제, 산제, 리니먼트(liniment), 슬레이브(slaves) 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 다른 적합한 국소 용량형은 분무가능한 에어로졸 제제를 포함하며, 여기서 특히 고체 또는 액체 불활성 담체와 함께, 활성 성분은 가압된 휘발물(예를 들면, 프레온과 같은 가스성 추진제)과의 혼합물 또는 스퀴즈 병(squeeze bottle) 속에 포장된다. 습윤제 또는 보습제를 또한 경우에 따라 용량형 및 약제학적 조성물에 가할 수 있다. 이러한 추가의 성분의 예는 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비강내 투여를 포함하는 경우, 조성물은 에어로졸 형태, 분무, 연무(mist) 또는 점적제의 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 편리하게는 가압 팩 또는 분무기(nebuliser)로부터 적합한 추진제(예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스)를 사용하여 에어로졸 분무 제시(spray presentation)의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 밸브를 제공하여 계량된 양을 전달함으로써 측정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캅셀 및 카트릿지(cartridge)(예를 들면, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물과 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 조성물은 정제, 캅셀제, 카쉐제(cachet), 젤캡(gelcap), 액제, 현탁제 등의 형태로 경구적으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캅셀제는 통상의 수단에 의해 결합제(예를 들면, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈); 충전제(예를 들면, 락토즈, 미세결정성 셀룰로즈, 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들면, 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제(예를 들면, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제조할 수 있다. 정제는 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 피복할 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 액제, 시럽제 또는 현탁제의 형태를 취할 수 있으나 이들에 한정되지 않거나, 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클을 사용하여 구성하기 위한 무수 생성물로 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 통상의 수단에 의해 현탁화제(예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로즈 유도체, 또는 수소화된 식용성 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들면, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 야채 오일); 및 방부제(예: 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제와 함께 제조될 수 있다. 제제는 또한 적절하게는 완충제 염, 풍미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 예방제 또는 치료제(들)의 서방출, 조절된 방출 또는 지연된 방출용으로 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 에어로졸화제와 함께 제형화된 조성물의 예를 들면, 흡입기 또는 분무기를 사용하여 폐 투여하는 것을 포함할 수 있다(참조: 예를 들면, 각각이 본원에 이의 전문이 참조로 인용된, 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5, 985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호). 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체, 조합 치료요법 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술[공급원: 알커메스, 인크.(Alkermes, Inc.), 매사추세츠주 캠브릿지 소재]를 사용하여 투여한다.
본 발명의 방법은 주사(예를 들면, 볼내 주사 또는 연속 주입)에 의해 비경구 투여용으로 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 방부제와 함께 단위 용량형(예를 들면, 앰플 또는 다중-투여량 용기)으로 존재할 수 있다. 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중 현탁제, 액제 또는 유제의 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클(예를 들면, 멸균 발열물이 없는 물)과의 구성을 위한 산제 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 데포트 제제로 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일 중 유제로서) 또는 이온 교환 수지로서, 또는 난용성 유도체(예를 들면, 난용성 염)으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 기원한 것들과 같은 음이온, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 기원한 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분들은 예를 들면, 활성 성분의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰(sachette)와 같은 밀폐하여 밀봉시킨 용기 속에 무수 동결건조시킨 분말 또는 물이 없는 농출물로서 단위 용량형 속에 별도로 또는 함께 혼합하여 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분산시킬 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플을 제공하여 성분들을 투여 전에 혼합시킬 수 있다.
다른 실시형태는, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제, 또는 약제학적 조성물을 제제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 밀폐하여 밀봉된 용기 속에 패키징함을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제, 또는 약제학적 조성물은 밀폐하여 밀봉된 용기 속에 무수 멸균된 동결건조시킨 분말 또는 물이 없는 농축물로서 제공되며 대상체에게 투여하기에 적절한 농도로 재구성(예를 들면, 물 또는 염수를 사용하여)될 수 있다. 특히, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 밀페하여 밀봉된 용기 속에 무수 멸균 동결건조된 분말로서 적어도 5 mg, 보다 특히 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg, 또는 적어도 100 mg의 단위 용량으로 공급된다. 본 발명의 동결건조시킨 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 2℃ 내지 8℃ 사이에서 이의 원래의 용기 속에 저장할 수 있으며, 본 발명의 예방제 또는 치료제, 또는 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주, 특히 5일내, 72시간내, 48시간내, 24시간내, 12시간내, 6시간내, 5시간 내, 3시간내, 또는 1시간내에 투여될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 제제의 양 및 농도를 나타내는 밀폐하여 밀봉된 용기 속에 액체 형태로 공급된다. 특히, 투여된 조성물의 액체 형은 밀폐하여 밀봉된 용기 속에 적어도 0.25 mg/ml, 보다 특히 적어도 0.5 mg/ml, 적어도 1 mg/ml, 적어도 2.5 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/kg, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml 또는 적어도 100 mg/ml에서 공급된다. 액체 형은 이의 원래 용기 속에 2℃ 내지 8℃ 사이에서 저장될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체-부위는 비경구 투여용으로 적합한 약제학적 조성물내로 혼입될 수 있다. 특히, 항체 또는 항체-부위는 0.1 내지 250 mg/ml 항체를 함유하는 주사가능한 액제로 제조될 것이다. 주사가능한 액제는 플린트(flint) 또는 앰버(amber) 바이알, 앰플 또는 예비-충전된 주사기 속에 액체 또는 동결건조된 용량형으로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로 pH 6.0)에서 L-히스티딘(1-50 mM), 최적으로 5 내지 10mM일 수 있다. 다른 적합한 완충제는 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 염화나트륨을 사용하여 용액의 독성을 0 내지 300 mM(액체 용량형의 경우 최적으로 150 mM)의 농도에서 조정할 수 있다. 동결보호제, 주로 0 내지 10% 슈크로즈(최적으로 0.5 내지 1.0%)가 동결건조된 용량형을 위해 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제는 트레할로즈 및 락토즈를 포함한다. 증량제는 동결건조된 용량형의 경우에, 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로 2 내지 4%)이 포함될 수 있다. 안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로 5 내지 10mM)이 액체 및 동결건조된 용량형 둘다로 사용될 수 있다. 다른 적합한 증량제는 글리신, 아르기닌을 포함하며, 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로 0.005 내지 0.01%)으로 포함될 수 있다. 추가의 표면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 표면활성제를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 비경구 투여용의 주사가능한 액제로서 제조된 본 발명의 항체 및 항체-부위를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 치료학적 단백질(예를 들면, 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키기 위해 사용된 것들과 같은 보조제로서 유용한 제제를 포함할 수 있다. 특히 유용한 보조제는 Hylenex®(재조합 사람 하이알루로니다제)와 같은 하이알루로니다제이다. 주사가능한 액제 속에 하이알루로니다제의 첨가는 비경구 투여, 특히 피하 투여 후 사람 생이용성을 개선시킨다. 이는 또한 통증 및 불편이 거의 없이, 최소의 주사 부위 반응의 발생으로 보다 큰 주사 부위 용적(1ml보다 큰 용적)을 허용한다(참조: 본원에 참조로 인용된 제WO2004078140호, 제US2006104968호).
본 발명의 조성물은 각종 형태로 존재할 수 있다. 이들은 예를 드렴ㄴ, 액체 용액(예를 들면, 주사가능하고 주입가능한 액제), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제와 같은 액체, 반-고체 및 고체 용량형을 포함한다. 특정 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 적용에 의존한다. 대표적인 특정 조성물은 다른 항체를 사용한 사람의 수동 면역화에 사용된 것들과 유사한 조성물과 같은 주사가능하거나 주입가능한 액제의 형태이다. 특정한 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 특정 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 특정한 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균이고 안정하여야 한다. 이 조성물은 액제, 미세유제, 분산제, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 주문된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 액제는 요구량의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 부위)를 상기 나열한 성분들 중 하나 또는 조합과 적절한 용매 속에 혼입한 후, 필요에 따라 여과된 멸균에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질 및 상기 나열한 것들로부터의 요구되는 다른 성분들을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 액제의 제조를 위한 멸균된, 동결건조시킨 분말의 경우에, 특정한 제조 방법은 활성 성분 및 이의 앞서 멸균-여과된 용액으로부터의 어떠한 추가의 바람직한 성분들의 분말을 생성하는 진공 건조 및 분무-건조이다. 액제의 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물의 사용에 의해, 분산제의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 및 표면활성제의 사용으로 유지시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 속에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체-부위는, 비록 많은 치료학적 적용의 경우에, 툭수한 투여 경로/방식이 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이라고 해도, 당해 분야에 공지된 각종 방법으로 투여할 수 있다. 숙련가에게 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 것이다. 특정 실시형태에서, 활성 화합물은 이식물, 경피 패치(patch), 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은, 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해가능한, 생적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 많은 제조 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부위는 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 식용가능한 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물(및 경우에 따라 다른 성분들)은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캅셀 속에 봉입시키거나, 정제내에 압착시키거나, 대상체의 식이내로 직접 혼입시킬 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 화합물은 부형제와 함께 혼입하여 소화가능한 정제, 거환 정제, 트로키제(troche), 캅셀제, 엘릭서르제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 비경구 투여 이외의 방식으로 투여하기 위해서는, 화합물은 이의 불활성화를 방지하는 물질로 피복하거나, 화합물을 이러한 물질과 함께 공-투여하는 것이 필요할 수 있다.
추가의 활성 화합물은 또한 조성물내로 혼입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 부위는, RGM A 활성이 유해한 질환을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 공제형화되고/되거나 투여된다. 예를 들면, 본 발명의 항-RGM A 항체 또는 항체 부위는 다른 표적(예를 들면, 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)에 결합하는 하나 이상의 추가의 항체로 공제형화되고/되거나 공투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 2개 이상의 상기 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 조합 치료요법은 투여된 치료제의 보다 적은 용량을 유리하게 이용할 수 있으므로 각종 단독치료요법과 관련된 가능한 독성 또는 문제점을 피할 수 있다.
특정 실시형태에서, RGM A에 대한 항체 또는 이의 단편은 당해 분야에 공지된 반감기 연장 비히클에 연결된다. 이러한 비히클은 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 비히클은 특정 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 일련번호 제09/428,082호 및 발표된 PCT 출원 제WO 99/25044호에 기술되어 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 다른 예방제 또는 치료제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열은 유전자 치료요법에 의해 질환 또는 하나 이상의 이의 증상들을 치료하고, 예방하고, 유지하거나, 완화시키기 위해 투여된다. 유전자 치료요법은 대상체에게 발현되거나 발현가능한 핵산을 투여함으로써 수행된 치료요법을 말한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 핵산은 이들의 암호화된 항체 또는 예방 또는 치료 효과를 매개하는 본 발명의 예방제 또는 치료제를 생산한다.
당해 분야에 이용가능한 유전자 치료요법을 위한 방법들 중 어느 것도 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 유전자 치료요법의 방법의 일반적인 고찰을 위해 문헌[참조: Goldspiel et al, 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991 , Biotherapy 3 : 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 1 1(5): 155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 분야에 일반적으로 공지된 방법들은 문헌[참조: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 치료요법의 각종 방법의 상세한 기술은 본원에 참조로 인용된 제US20050042664 A1호에 기재되어 있다.
항산화제, 라디칼 스캐빈저(radical scavenger), 페니토인과 같은 항경련 약물 또는 빈혈 약물 에리트로포에틴인 어떠한 신경보호제도 전-재생성 RGM A 항체와의 조합 치료요법에 의해 신경보호제의 일반적으로 매우 짧은 치료학적 치료 윈도우(window)를 연장시키는데 적합하다.
본 발명의 항체, 및 항체 부위는 이러한 질병으로 고생하는 사람을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 단독으로 또는 추가의 제제, 예를 들면, 치료제와 함께 사용될 수 있음은 이해하여야 하며, 상기 추가의 제제는 이의 의도된 목적을 위해 당해 분야의 숙련가에 의해 선택된다. 예를 들면, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질병 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당해 분야에 인식된 치료제일 수 있다. 추가의 제제는 또한 치료학적 조성물에 유리한 기여를 부여하는 제제, 예를 들면, 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
본 발명내에 포함될 조합물은 이들의 의도된 목적에 유용한 조합임을 또한 이해하여야 한다. 하기 설정된 제제는 목적을 위해 나열한 것이며 이들에 한정하는 것을 의도하지는 않는다. 본 발명의 부분인 조합물은 본 발명의 항체 및 하기 나목록으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 제제일 수 있다. 조합물은 또한, 조합물이, 이렇게 형성된 조성물이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 존해는 경우 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들면, 2개 또는 3개의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 항체 부위가 조합될 수 있는 다발성 경화증용 치료제의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 사이클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-β1α[AVONEX; 제조원: 바이오겐(Biogen)]; 인터페론-β1b[BETASERON; 제조원: 키론(Chiron)/베를렉스(Berlex)]; 인터페론 α-n3)[제조원: 인터페론 사이언시즈(Interferon Sciences)/후지모토(Fujimoto)], 인터페론-α[제조원: 알파 와세르만(Alfa Wassermann)/제이 앤드 제이(J&J)], 인터페론 β1Α-IF[제조원: 세로노(Serono)/인할레 테라퓨틱스(Inhale Therapeutics)], 페그인터페론 α2b[제조원: 엔존(Enzon)/쉐링-플라우(Schering-Plough)], 공중합체 1[Cop-1; COPAXONE; 제조원: 테바 파마슈티칼스 인더스트리즈, 인크.(Teva Pharmaceutical Industries, Inc.)]; 고압성 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라드리빈; 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자에 대한 항체 및 이들의 수용체, 예를 들면, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 또는 이들의 리간드와 같은 세포 표면 분자에 대한 항체와 조합될 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위는 또한 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 상보체 억제제, 아드레날린 차단제, 전염증성 사이토킨, 예를 들면, TNFα 또는 IL-1(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제, TACE 억제제, 키나제 억제제와 같은 T-세포 시그날링 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토푸린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수요체 및 이의 유도체(예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-lRI, sIL-1RII, sIL-6Pv) 및 소염성 사이토킨(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGF)와 같은 제제와 조합될 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 부위가 조합될 수 있는 다발성 경화증용 치료제의 특정 예는 인터페론-β, 예를 들면, IFNβ1a 및 IFN β1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, 카스파제 억제제, 예를 들면, 카스파제-1의 억제제, IL-1 억제제, TNF 억제제, 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체를 포함한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위는 또한 알렘투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 다클리주마브, 미토크산트론, 크살리프로덴 하이드로클로라이드, 팜프리딘, 글라티라머 아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, a-임뮤노킨 NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, 케모킨 수용체 길항제, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM(리포좀 캡슐화된 미토크산트론), THC.CBD(카나비노이드 효능제) MBP-8298, 메소프람(PDE4 억제제), MNA-715, 항-IL-6 수용체 항체, 뉴로박스, 피르페니돈 알리노 트랩 1258(RDP-1258), sTNF-Rl, 탈람파넬, 테리플루노미드, TGF-베타2, 티플리모티드, VLA-4 길항제(예를 들면, TR-14035, VLA4 울트라할러, 안테그란-ELAN/바이오겐), 인터페론 감마 길항제, IL-4 효능제와 같은 제제와 조합될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 부위의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 바람직한 치료학적 결과를 달성하는데 효과적인 양, 용량 및 필요한 기간을 말한다. 항체 또는 항체 부위의 치료학적 유효량은 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있으며, 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 바람직한 반응을 유발하기 위한 항체 또는 항체 부위의 능력에 따라 변할 수 있다 치료학적 유효량은, 치료학적으로 유리한 효과가 항체 또는 항체 부위의 어떠한 독성 또는 유해한 효과보다 더 큰 것이다. "예방학적 유효량"은 바람직한 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양, 용량 및 필요한 기간을 말한다. 전형적으로, 예방학적 투여량은 질병의 조기 단계 이전 또는 조기 단계에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 미만일 것이다.
용량 섭생은 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하기 위해 조절할 수 있다. 예를 들어, 단일 거환제가 투여될 수 있으며, 몇개의 분할된 투여량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나 투여량을 비율적으로 감소되거나 치료 상태의 위급성에 의해 나타낸 바와 같이 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 용량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화시키는 것이 특히 유리한다. 본원에 사용된 용량 단위형은 치료할 포유동물 대상체에 대해 통합된 용량으로 적합한 물리학적으로 별개의 단위를 말하며; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 화합물의 예정된 양을 함유한다. 본 발명의 용량 단위 형태를 위한 명세는 (a) 활성 화합물의 유일한 특성 및 달성될 특정한 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개인에서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 화합하는 당해 분야에서 고유한 제한에 의해 나타내어지고 이에 직접 의존한다.
예로서, 본 발명의 항체 또는 항체 부위의 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양에 대한 비-제한적 범위는 0.1 내지 20 mg/kg, 보다 특히 1 내지 10 mg/kg이다. 용량 값은 완화시킬 상태의 유형 및 중증도에 따라 변할 수 있음에 주목하여야 한다. 어떠한 특정한 대상체에 대해, 특이적인 용량 섭생이 개인의 필요성 및, 조성물을 투여하거나 이의 투여를 관리하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하며, 본원에 나타낸 용량 범위는 단지 예시적인 것이며 특허청구된 조성물의 범위 또는 실시를 한정하는 것으로 의도되지 않음이 또한 이해되어야 한다.
당해 분야의 숙련가에게는, 본원에 기술된 본 발명의 방법의 다른 적합한 변형 및 적응이 명백하며 본원에 기재된 실시형태 또는 본 발명의 영역으로부터 벗어남이 없이 적합한 등량체를 사용하여 제조할 수 있음이 매우 명백할 것이다. 이제 본 발명을 보다 상세히 설명하며, 이는 단지 예시 목적으로 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 다음 실시예를 참조로 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예:
방법
다음 방법들은 실시예 단락에서 사용된 실험 과정을 상세히 기술한다.
(i) 직접 결합 ELISA 플레이트를 hRGM A[제조원: 알 앤드 디(R&D)]로 카보네이트 완충액 속에서 2μg/mL의 농도에서 피복시켰다. 이후에 웰을 2% 차단 용액[제조원: 바이오-라드(Bio-Rad)]으로 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 비오티닐화된 항체를 플레이트 아래에서 0.1% BSA/PBS 속에서 1: 5 희석비로 일련 희석시키고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 검출 시약을 0.1% BSA/PBS 속에서 스트렙트아비딘-HRP로 1:10,000 희석켰다. 검출을 TMB 시약으로 수행하고, 이를 2N H2SO4로 정지시키고 OD를 450nM에서 판독하였다.
(ii) FACS 분석. hRGM A를 과발현하는 HEK293 세포 또는 래트RGM A를 과발현하는 BAF3 세포의 안정한 형질전환체를 표지되지 않은 5F9 또는 8D1 MAB를 사용한 염색에 15분 이상 동안 4℃에서 0.1% BSA/PBS 완충액 속에서 적용시켰다. 검출을 마우스 항-래트 IgG PE 항체를 사용하여 수행하였다.
(iii) hRGM A-네오제닌 결합 검사에서 MAB 5F9를 평가하기 위한 고체상 ELISA 검사
ELISA 플레이트(Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454)를 1시간 동안 37℃에서 2.5 μg/ml 농도의 His-태그된 사람 네오제닌 단백질의 세포외 도메인(스톡 용액의 농도: 30 μg/ml)으로 피복시켰다. 항온처리 후, 결합되지 않은 네오제닌을 3회의 별개의 세척 단계에서 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS를 사용하여 제거하였다. 네오제닌-피복된 플레이트의 차단은 웰당 200μl의 3% 소 혈청 알부민(BSA), PBS, 트윈 20(0.02%) 차단 용액을 가하여 수행하였다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 용액을 제거하고, 항원의 존재 또는 부재하에, 사람 fc 태그와 접합된 RGM A 단편 또는 전장 단백질을 가하였다. 일부 실험에서, 항체를 fc-접합된 hRGM A 단백질과 함께 1시간 동안 실온에서 예비항온처리하였다. 네오제닌-피복된 플레이트를 hRGM A와 함께 항체의 존재 또는 부재하에서 1시간 동안 37℃로 항온처리하였다. PBS-트윈 20(0.02%)으로 3회 세척 단계 후, 플레이트를 비오틴-표지된 항-사람 fc 항체(lmg/ml, 0.6% BSA, 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS 속에서 1 :200으로 희석됨)[잭슨 임뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 제품 번호: 709-065-149]를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 PBS-트윈 20(0.02%)을 사용하여 3회의 세척 단계로 제거하였다. 비오틴-표지된 항-fc 항체의 결합을 가시화하기 위해, 0.6% BSA, 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS를 사용하여 1:5000으로 희석시킨 스트렙트아비딘-퍼옥시다제[로슈(Roche), 제품 번호 11089153001)로 이루어진 복합체를 가한 후 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결합되지 않은 퍼옥시다제-복합체를 3회의 후속적인 세척 단계(PBS-트윈 20 (0.02%)에서 제거한 후 퍼옥시다제 기질(Immuno Pure TMB , 피어스(Pierce) 제품 번호 34021) 속에 가하였다. 기질 반응을, 웰에 2.5M H2SO4를 첨가한 후 1 내지 30분내에 중지시켰다. 플레이트를 안토스 광도계(Anthos photometer)를 사용하여 450nm의 파장에서 분석(OD 측정)하였다.
(iv) hRGM A - BMP-4 결합 검사에서 MAB 5F9를 평가하기 위한 고체 상 ELISA 검사
ELISA 플레이트(Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454)를 1시간 동안 37℃에서 2.5 μg/ml 농도의 재조합 사람 BMP-4 단백질(제조원; 알 앤드 디 시스템스, # 314-BP, Lot # BEM316061)을 함유하는 용액으로 피복하였다. 항온처리 후, 결합되지 않은 BMP-4를 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회의 별개의 세척 단계에서 제거하였다. BMP-4 피복된 플레이트의 차단은 웰당 200μl의 3% 소 혈청 알부민(BSA), PBS, 트윈 20(0.02%) 차단 용액을 가하여 수행하였다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 용액을 제거하고, 사람 fc 태그와 접합된 RGM A 단편 또는 전장 단백질을 항체의 존재 또는 부재하에서 가하였다. 일부 실험에서 항체를 fc-접합된 hRGM A 단백질과 함께 1시간 동안 실온에서 예비항온처리하였다. BMP-4 피복된 플레이트를 hRGM A와 항체의 존재 또는 부재하에 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. PBS-트윈 20 (0,02%)으로 3회 세척 단계 후, 플레이트를 비오틴-표지된 항-사람 fc 항체[lmg/ml, 0.6% BSA, 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS 속에서 1:200으로 희석됨, 잭슨 임뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 제품번호: 709, 065-149]와 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 PBS-트윈 20 (0.02%)을 사용한 3회 세척 단계로 제거하였다. 비오틴-표지된 항-fc 항체의 결합을 가시화하기 위해, 0.6% BSA, 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS로 1:5000으로 희석시킨 스트렙트아비딘-퍼옥시다제(제조원: 로슈, 제품 번호 11089153001)을 가한 후 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결합되지 않은 퍼옥시다제-복합체를 3회의 후속적인 세척 단계(PBS-트윈 20 (0.02%)에서 제거한 후 퍼옥시다제 기질[Immuno Pure TMB, 피어스(Pierce) 번호 34021]을 가하였다. 기질 반응은 이를 웰에 2.5 M H2SO4까지 첨가한 후 1 내지 30분내에 중지시켰다. 플레이트를 450nm의 파장에서 안토스 광도계를 사용하여 분석(OD 측정)하였다.
(v) hRGM A-BMP-2 결합 검사에서 MAB 5F9를 평가하기 위한 고체 상 ELISA 검사
ELISA 플레이트(Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454)를 1시간 동안 37℃에서 2.5 μg/ml 농도의 재조합체 사람 BMP-2 단백질(제조원: 알앤드디 시스템즈, # 355-BM, Lot # MSA04)을 함유하는 용액으로 피복하였다. 항온처리 후, 결합되지 않은 BMP-2를 3회의 별개의 세척 단계에서 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS로 제거하였다.
BMP-2 피복된 플레이트의 차단은 웰당 200 μl의 3% 소 혈청 알부민(BSA), PBS, 트윈 20(0.02%) 차단 용액을 첨가하여 수행하였다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 용액을 제거하고 항체의 존재 또는 부재하에 사람 fc 태그와 접합된, RGM A 단편 또는 전장 단백질을 가하였다. 일부 실험에서 항체를 fc-접합된 hRGM A 단백질과 함께 1시간 동안 실온에서 예비항온처리하였다. BMP-2 피복된 플레이트를 hRGM A와 함께 항체의 존재 또는 부재하에서 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. PBS-트윈 20(0.02%)으로 3회 세척 단계 후, 플레이트를 비오틴-표지된 항-사람 fc 항체(lmg/ml, 0.6% BSA, 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS 속에서 1:200으로 희석됨)(잭슨 임뮤노 리서치 제품번호: 709, 065-149)와 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 PBS-트윈 20(0.02%)을 사용한 3회 세척으로 제거하였다. 비오틴-표지된 항-fc 항체의 결합을 가시화하기 위해, 0.6% BSA, 0.02% 트윈 20을 함유하는 PBS를 사용하여 1:5000으로 희석시킨, 스트렙트아비딘-퍼옥시다제(로슈, 제품 번호 11089153001)로 이루어진 복합체를 가한 후, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결합되지 않은 퍼옥시다제-복합체를 3회의 후속적인 세척 단계[PBS-트윈 20(0.02%)]에서 제거한 후 퍼옥시다제 기질(Immuno Pure TMB, 피어스 제품번호 34021)을 가하였다. 기질 반응을 웰에 2.5 M H2SO4를 첨가한 후 1 내지 30분내에 중지시켰다. 플레이트를 안토스 광도계를 사용하여 450nm의 파장에서 분석(OD 측정)하였다.
(vi) Ntera-2 세포 배양
사람 Ntera-2 세포를 미생물 및 세포 배양의 독일 수집기관(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures: DMSZ, 브라운슈바이크 소재)으로부터 입수하였다. 분화되지 않은 Ntera-2 세포의 동결된 스톡을 10% 태아 소 혈청[FBS; 제조원: 제이알에이치 바이오사이언스(JRH Bioscience), 미국 칸사스 소재] 및 5% 말 혈청[HS; 제조원: 시그마(Sigma), 독일 소재]를 함유하는 DMEM 배지 속에서 해동시켰다. 세포를 배양 플라스크[제조원: 그라이너(Greiner), 독일 소재] 속에서 이들이 80%의 합치성에 이를 때까지 성장시켰다.
신경세포 분화를 위해, Ntera-2 세포를 분화 배지(10% FBS, 5% HS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 레티노산 10μΜ을 함유하는 DMEM 배지) 속에서 2.5 x 106 세포/175 cm2의 밀도로 씨드(seed)하였다. 세포를 3주 동안 분화시키고 배지를 주당 2회 교환하였다.
분화 후, 세포를 트립신-EDTA로 탈착시키고 1:6의 비로 쪼갰다. 48시간 후 신경세포를 기저 세포로부터 태이핑(TAPPING)하여 분리하였다. 제거한(dislodged) 세포를 새로운 배지 속에서 응집시키기 위해 새로운 진탕 배양 플라스크[제조원: 코닝(Corning), 미국 소재]내로 이전시켰다. 분화된 Ntera-2 세포를 잔잔한 수평 진탕 조건하에 37℃에서 24시간 동안 B27(제조원: 기브코), 글루타민(제조원: 기브코) 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 신경기본 배지(제조원: 기브코) 속에서 응집되도록 하였다. Ntera-2 응집체를 24-웰 플레이트 속에서 커버 슬립당 대략 20 내지 30개 응집체의 밀도로 씨드하였다. 폴리-라이신 예비피복된 커버 슬립을 라미닌(20㎍/ml, 제조원: 시그마) 및 재조합 fc-커플링된 사람 RGM A 단편 #786(아미노산 47 내지 168)로 10 μg/ml의 농도에서 피복하였다. 씨딩 후, 배양물을 5F9 MAB로 처리하고, 3개의 상이한 농도(0.1 μg/ml; 1 μg/ml; 10 μg/ml)에서 배양 배지에 가하고 24시간 동안 37℃로 신경기본 배지 속에서 추가로 항온처리하였다. 이후에 응집체를 4% 파라포름알데하이드(2h, 실온) 속에서 고정시키고 PBS 속에서 0.1% 트리톤 X-100의 첨가(20분, 실온)하여 투과시켰다. 형광성 염색을 위해, 배양물을 1% BSA를 함유하는 PBS로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 후 Ntera 세포를 β-투불린 동형 3(clone SDL3D10, 시그마 제품번호 T8660)에 대한 마우스 모노클로날 항체와 함께 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 결합되지 않은 항체를 3회의 상이한 세척 단계(각각 5 내지 15분)로 제거하고 Ntera 세포를 PBS/0.5% BSA 및 0.5 μg/ml 비스벤즈이미드 속에서 1;350배로 희석시킨, Cy-3 접합된 당나귀 항-마우스 항체[잭슨 임뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 로트 62597]와 함께 항온처리하였다. 1시간 항온처리한 후, 배양물을 3회 세척하여 결합되지 않은 제2 항체를 제거하였다. 형광 현미경을 위해, 커버 슬립을 플루오로마운트(Fluoromount) G[제조원: 서던 바이오테크(Southern Biotech), 에칭 소재) 속에 봉매하였다.
Ntera-2 응집체의 영상을 짜이즈 악시오버트(Zeiss Axiovert) 200 형광 현미경을 사용하여 획득하고 배양물의 과성장을 인-하우스(in-house) 영상 획득 및 분석 시스템을 사용하여 자동적으로 분석하였다. 과성장의 자동화된 분석을 Image Pro Plus 4.5를 사용하여 수행하고 데이터의 통계적 분석을 그래프파드 프리즘(Graph Pad Prism) 4로 수행하였다. 과성장을 사람 RGM A 단편 #786의 부재하에서 성장시킨 대조군 배양물에 대해 표준화하였다.
(vii) SH-SY5Y 배양
SH-SY5Y 세포(ATCC, CRL-2266)은 전이성 뇌 종양으로부터 기원한 사람 신경모세포종 세포이다. 당해 세포를 50% 이글스 균형 염 용액(Earle's Balanced Salt Solution)[제조원: 인비트로겐 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies), 제품번호 24010-043] 및 50% F12(Ham) 영양 혼합물 + GlutaMAX-1(제조원: 인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 제품번호 31765-027)로 이루어진 배지 속에서 성장시켰다. 당해 배지에 열-불활성화시킨 10% 태아 송아지 혈청(FCS, 제조원: 제이알에이치 바이오사이언시스, 칸사스 소재, 제품번호 12107-1000M), 1% NEAA(MEM 비 필수 아미노산 용액[제조원: 시그마-알드리히(Sigma- Aldrich) 제품번호 M1 745], 및 1% 페니실린(10.000 U/ml)/스트렙토마이신(10.000 μg/ml)(제조원: 인비트로겐 라이프 테크놀로지스, 제품 번호 15140-122)로 추가로 보충시켰다. 신경세포 분화 및 신경세포 성장 공정을 자극시키기 위해, SH-SY5Y 세포를 10 μΜ 레티노산(RA, 시그마-알드리히 제품번호 R2625-050MG)가 보충된 배지 속에서 수일 동안 배양하였다. 분화된 SH-SY5Y 세포를 조직 배양 플라스크 속에서 성장시키고 조심스러운 트립신처리로 제거하고 RGM A 단백질 또는 이의 단편 및 콜라겐 I의 스트라이프 양식으로 피복된 유리 커버슬립에 플레이팅하였다.
(viii) 스트라이프된 유리 커버슬립의 제조
유리 커버슬립상의 스트라이프 검사의 변형된 버젼을 앞서 기술된 (참조: Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216-1224, 2007) 바와 약간 상이한 방식으로 수행하고 하기 요약한다.
정제된 단백질로 이루어진 스트라이프의 생산용 멸균 규소 매트릭스를 상부를 가르키는 매트릭스의 거친 표면을 지닌 페트리 디쉬의 표면에 압착시켰다. 에탄올 세척하고, 깨끗한 커버슬립을 매트릭스 위애 덮고 매트릭스의 구석을 커버슬립의 뒷쪽에서 잉크 볼 점 펜으로 표시하였다. 커버슬립을 수반한 매트릭스를 페트리 디쉬의 바닥을 접하는 커버슬립으로 조심스럽게 뒤집었다. Fc-접합된 전장 억제성 RGM A 또는 fc-단편 또는 이의 재조합 사람 RGM A(알 앤드 디 시스템스 제품번호 2459 RM)를 10 μl의 FITC-표지된 항-마우스 항체(Fab-특이적인 염소 항-마우스 IgG, 시그마-알드리히 제품번호 F-4018)와 혼합하여 RGM A 스트라이프를 가시화하였다. 해밀톤 주사기(Hamilton syringe)를 사용하여, 50 μl의 RGM A-FITC 항체 용액을 조심스럽게 내부 채널을 통해 주사하였다. 과량의 유액이 외부 채널을 따라 매트릭스에 남으며 이는 크리넥스 직물(Kleenex cloth)로 제거하였다. 매트릭스-커버슬립을 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 후, 제1의 피복 용액(RGM A 함유)을 100 μl의 PBS로 세척제거하였다. 다음 단계에서, RGM A 스트라이프를 지닌 커버슬립을 24 웰 플레이트로 이전시키고, 500 μl 콜라겐 I(래트 꼬리 콜라겐 I, 제조원: 벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈(Becton Dickinson Biosciences) 제품번호 354236]으로 피복하여 RGM A 스트라이프 사이에 빈 공간을 충전시키고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 말기에 RGM A와 콜라겐 I의 교호되는 스트라이프의 양식을 커버슬립상에서 생산하였다. 항온처리한 후, 결합되지 않은 콜라겐 I을 PBS를 사용한 3회의 별개의 세척 단계로 세척제거하고 분화된 SH-SY5Y 세포를 커버슬립상에 플레이팅하였다. 패턴화된 기질 상에서 SH-SY5Y 세포의 항온처리를 37℃에서 20 내지 24시간 동안 사람 RGM A에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재 또는 부재하에서 지속하였다.
면역형광성 분석을 위해, 세포를 4% 파라포름알데하이드 속에서 2시간 동안 실온에서 또는 밤새 4℃에서 고정시키고 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS와 함께 실온에서 10 내지 20분 동안 항온처리하여 침투시켰다. 3% BSA를 사용하여 60분 동안 차단시키고, 세포를 제1 항체(모노클로날 항-β-투불린 동형 3개 클론 SDL 3D10, 시그마-알드리히 제품번호 T8660)와 함께 2시간 동안 실온에서 항온처리하고 제2 항체(Cy-3 당나귀 항-마우스 잭슨임뮤노 리서치 로트: 62597)를 사용한 수회 세척 단계 후, 0.1% BSA를 사용하여 PBS 속에서 1시간 동안 희석시켰다. 핵을 비스벤즈이미드 H33258[제조원: 라이델-데-하엔(Riedel-De-Haen), 제품번호 A-0207]을 사용하여 역염색하였다. 세포를 최종적으로 플루오로마운트(Fluoromount) G[제조원: 서던 바이오테크놀로지 어쏘우시에이트 인크(Southern Biotechnology Associates Inc.): 제품번호 010001] 속에 봉매하였다. 세포를 악시오플란2 형광 현미경[제조원: 짜이즈]을 사용하여 분석하였다.
(ix) 재조합 항 RGMA 항체의 작제 및 발현
래트 항-사람 RGMA 모노클로날 항체 5F9 및 8D1의 중쇄 가변 영역의 cDNA 단편을 암호화하는 DNA를 세균내에서 동종 재조합에 의해 2개의 힌지-영역 아미노산 돌연변이를 함유하는, 사람 IgGl 불변 도메인을 함유하는 pHybE 발현 벡터내로 클로닝하였다. 당해 돌연변이는 234번 및 235번((EU 번호매김, 참조: Lund et al, 1991, J. Immunol, 147: 2657)에서 류신이 알라닌으로 변화된 것이다. 5F9 및 8D1 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 사람 카파 불변 도메인을 함유하는 pHybE 벡터내로 클로닝하였다. 예시적인 pHyb-E 벡터는 pHybE-hCk, 및 pHybE-hCgl,z, non-a를 포함한다(참조: 미국 특허원 일련 번호 제61/021,282호). 전장 항체를 293E 세포내에서 pHybE 발현 플라스미드내로 연결된 키메라 중쇄 및 경쇄 cDNA의 공-형질감염에 의해 일시적으로 발현시켰다. 재조합 항체를 함유하는 세포 상층액을 단백질 A 세파로즈 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체를 산 완충액을 첨가하여 용출시켰다.
항체를 PBS내로 중화시키고 투석시켰다. 이후에 정제된 항-사람 RGMA 모노클로날 항체를 RGMA에 결합하는 이들의 능력에 대해 실시예 1에 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 및 실시예 7에 기술된 바와 같은 경쟁 ELISA에 의해 시험하였다.
실시예 1: 항 사람 RGMA 모노클로날 항체의 생성
항 사람 RGMA 래트 모노클로날 항체를 다음과 같이 수득하였다:
실시예 1A: 사람 RGMA 항원을 사용한 래트의 면역화
완전 프루언드 보조제(complete Freund's adjuvant, 제조원: 시그마)와 혼합된 25 마이크로그람의 재조합 정제된 사람 RGMA(알앤드디 시스템스 제품번호 2459-RM lot MRH02511 A)를 6 내지 8주령의 하를란 스플라그 다울리 래트(Harlan Sprague Dawley rat)내에 1일째에 피하 주사하였다. 21, 42, 및 63일째에, 불완전 프루언드 보조제(제조원: 시그마)와 혼합된 25 마이크로그람의 재조합 정제된 사람 RGMA를 동일한 4마리의 하를란 스프라그 다울리 래트내로 피하 주사하였다. 144일 또는 165일째에, 래트에게 10μg의 재조합 정제된 사람 RGMA를 정맥내 주사하였다.
실시예 1B: 하이브리도마의 생성
실시예 1.2.A에 기술된 면역화된 래트로부터 수득된 비장세포를 SP2/0- 세포와 2:1의 비율에서 문헌(참조: Kohler, G. and Milstein 1975, Nature, 256: 495)에 기술된 확립된 방법에 따라 융합시켜 하이브리도마를 생성하였다. 융합 생성물을 아자세린 및 하이포크산틴을 함유하는 선택 배지 속에 96-웰 플레이트내에서 1.5 x 105 비장 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 융합 후 7 내지 10일째에, 현미경적 하이브리도마 콜로니가 관찰되었다. 하이브리도마 클론을 함유하는 각각의 웰로부터의 상층액을 직접적인 ELISA(참조: 실시예 2)에 의해 사람 RGMA에 대한 항체의 존재하에 시험하였다. ELISA 양성 세포주를 사람 및/또는 래트 RGMA를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포에 대해 FACS 속에서 시험하였다. 당해 래트 하이브리도마 세포주를 연속적으로 직접적인 ELISA 속에서 래트 RGMA와의 교차반응성, 및 HuRGMA 47-168 융합 단백질에 대한 ELISA 결합에 대해 시험하였다.
Figure pct00012
실시예 2: mAB 5F9 및 8D1에 대한 직접적인 ELISA 결합
도 1a에 나타낸 바와 같이, MAB 5F9 및 8D1는 상기 단락 (i)에 기술된 바와 같이, 유사한 역가로 hRGM A에 결합한다. MAB 5F9는 ELISA내에서 래트RGM A에 결합하는 반면, 8D1은 래트RGM A에 결합할 수 없는 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 도 1b는, MAB 5F9 및 8D1이 FACS내에서 hRGM A를 과발현하는 HEK293 세포에 결합함을 나타낸다. 도 1c는, 8D1이 아닌 5F9가 FACS내에서 래트RGM A를 과발현하는 BAF3 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다. FACS는 단락 (ii)에 기술된 바와 같이 수행하였다.
고체 상 ELISA 검사을 사용하여 경쟁적인 hRGM A-네오제닌 결합 검사에서 MAB 5F9 결합을 평가하였다. ELISA 플레이트를 제조하고 본원의 단락 (iii)에 기술된 바와 같이 사용하였다. hRGM A를 0.5 μg/ml의 농도에서 5F9 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 가하였다. MAB 5F9를 다음 농도에서 사용하였다: 1.25 μg/ml; 0.63 μg/ml; 0.32 μg/ml; 0.16 μg/ml; 0.08 μg/ml; 0.04 μg/ml; 0.02 μg/ml; 0.01 μg/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지된 항-fc 항체 및 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체를 사용하여 가시화하였다. 플레이트를 안토스 광도계를 사용하여 450nm의 파장에서 분석(OD 측정)하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 3개의 최대 항체 농도는 네오제닌에 대한 전장 사람 RGM A의 결합을 투여량-의존적으로 억제하였다.
고체 상 ELISA 검사을 경쟁적 hRGM A-BMP-4 결합 검사에서 MAB 5F9를 평가하는데 사용하였다. ELISA 플레이트를 제조하고 본원의 단락 (iv)에 기술된 바와 같이 사용하였다. hRGM A를 0.5 μg/ml의 농도에서 5F9 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 가하였다. MAB 5F9를 다음 농도에서 사용하였다: 1.25 μg/ml; 0.63 μg/ml; 0.32 μg/ml; 0.16 μg/ml; 0.08 μg/ml; 0.04 μg/ml; 0.02 μg/ml; 0.01 μg/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지된 항-fc 항체 및 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체를 사용하여 가시화하였다. 플레이트를 안토스 광도계를 사용하여 450nm의 파장에서 분석(OD 측정)하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 4개의 최대 항체 농도는 BMP-4에 대한 전장 사람 RGM A의 결합을 투여량-의존적으로 억제하였다.
고체 상 ELISA 검사을 또한 BMP-4에 대한 단편 0(47 내지 168) hRGM A의 MAB 5F9 결합 억제를 평가하는데 사용하였다. ELISA 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 2.5 μg/ml 농도의 사람 재조합 BMP-4 단백질로 피복하였다. hRGM A 경쇄(단편 0, 47 내지 168)를 0.5 μg/ml의 농도에서 5F9 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 가하였다. MAB 5F9를 다음 농도에서 사용하였다: 1.25 μg/ml; 0.63 μg/ml; 0.32 μg/ml; 0.16 μg/ml; 0.08 μg/ml; 0.04 μg/ml; 0.02 μg/ml; 0.01 μg/ml. hRGM A의 결합을 비오틴-표지된 항-fc 항체 및 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체를 사용하여 가시화하였다. 플레이트를 450 nm의 파장에서 안토스 광도계를 사용하여 분석(OD 측정)하였다. 도 4는, 1.25 μg/ml, 0.63 μg/ml 및 0.32 μg/ml의 항체 농도가 BMP-4에 대한 사람 RGM A 경쇄의 결합을 투여량-의존적으로 억제함을 나타낸다.
고체 상 ELISA 검사을 또한 경쟁적 hRGM A-BMP-2 결합 검사에서 MAB 5F9 결합을 평가하는데 사용하였다. ELISA 플레이트를 제조하고 본원의 단락 (v)에 기술된 바와 같이 사용하였다. 전장 hRGM A를 0.5 μg/ml의 농도에서 5F9 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 가하였다. MAB 5F9를 다음 농도에서 사용하였다: 5 μg/ml; 2.5 μg/ml; 1.25 μg/ml; 0.63 μg/ml; 0.32 μg/ml; 0.16 μg/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지된 항-fc 항체 및 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체를 사용하여 가시화하였다. 플레이트를 450nm의 파장에서 안토스 광도계를 사용하여 분석(OD 측정)하였다. 도 5는 BMP-2에 대한 전장 사람 RGM A의 결합을 억제하는, 항체 농도 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml, 0.63 μg/ml를 나타낸다.
고체 상 ELISA 검사을 또한 사용하여 hRGM A-네오제닌, hRGM A-BMP-2 및 hRGM A-BMP-4 결합 검사에서 MABs 5F9 및 8D1을 평가하였다(도 9). 기술된 바와 같이, ELISA 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 2.5 μg/ml 농도의 His-태그된 사람 네오제닌 단백질의 세포외 도메인 또는 2.5 μg/ml Bmp-2 또는 BMP-4로 피복하였다. 전장 fc-접합된 hRGM A를 0.5 μg/ml의 농도에서 항체와 함께 1시간 동안 37℃에서 가하였다. MAB 5F9 및 8D1을 다음 농도에서 사용하였다: 5 μg/ml; 2.5 μg/ml; 1.25 μg/ml; 0.63 μg/ml; 0.32 μg/ml; 0.16 μg/ml; 0.08 μg/ml. hRGM A의 결합은 비오틴-표지된 항-fc 항체 및 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체를 사용하여 가시화하였다. 플레이트를 450 nm의 파장에서 안토스 광도계를 사용하여 분석(OD 측정)하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 래트 모노클로날 항체 8D1는 BMP-2 및 BMP-4에 대한 사람 RGM A의 결합을 억제하거나 감소시키지만 네오제닌에 대한 이의 결합을 억제할 수 없다.
실시예 3: 분화된 사람 NTera 신경세포의 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 mAb 5F9 활성
Ntera 세포를 수득하고 본원의 방법 단락 (vi)에 기술된 바와 같이 배양하였다. mAb 5F9는 분화된 사람 NTera 신경세포의 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 사람 RGM A 단백질의 강력한 fc-접합된 경쇄(아미노산 47 내지 168번)의 신경돌기 과성장 억제 활성을 중화하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 억제성 RGM A 단백질 또는 단편의 부재 및 과성장-자극 기질 라미닌의 존재하에서, 신경세포 NTera 응집체는 과성장하는 신경돌기(A)의 강력하고 농밀한 네트워크를 나타낸다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, hRGM A 경쇄의 존재는 NTera 신경돌기의 수, 밀도 및 길이를 현저하게 감소시키며, hRGM A 단편의 강력한 억제 활성을 입증한다. 응집체를 남기는 수개의 신경돌기는 짧고 강력하게 다발(B)을 이루고 있다 도 6의 C 내지 E 부분은, 배양물에 가해진 MAB 5F9의 증가하는 농도가 hRGM A 경쇄 단편의 신경돌기-성장 억제 활성을 투여량-의존적으로 중화시키거나 발현을 활성화시켰음을 나타낸다. 증가하는 MAB 농도를 사용하여, NTera 신경세포 응집체의 과성장은 RGM A 억제제(C: 0.1 μg/ml MAB 5F9; D: 1 μg/ml MAB 5F9; E: 10 μg/ml MAB 5F9)의 존재에도 불구하고 완전히 회복된다.
사람 NTera 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 MAB 5F9의 중화 활성의 정량적 분석을 수행하여 사람 RGM A 단백질의 강력한 fc-접합된 경쇄 억제 단편(아미노산 47 내지 168번)을 시험하였다. 배양물의 과성장은 비스벤즈이미드로 염색한 응집체를 가짐으로써 자동적으로 분석하고 후속적으로 사진을 찍었다. 염색은 과성장하는 신경돌기가 아닌 응집체만을 표지하였다. 그러나, 이들은 β3-투불린에 대한 항체 및 형광단-표지된 제2 항체로 염색되었다. 신경돌기 과성장은 응집체 및 이의 공정의 β3-투불린 염색된 영역으로부터 세포체의 영역을 감함으로써 측정한 지표인, 신경돌기 과성장 지표를 계산하여 자동적으로 측정하였다. 이후에, 당해 인자를 문헌(참조: Lingor et al. J. Neurochem. 103: 181-189, 2007)에 기술된 바와 같이 세포체의 영역으로 나누었다. 도 7은, MAB 5F9가 사람 Ntera 응집체를 사용한 신경돌기 성장 검사에서 fc-접합된, 강력한 hRGM A 억제제 단편(단편 0, 47-168; 10 μg)의 과성장 억제 활성을 투여량-의존적으로(0.1-10.0 μg) 중화시켰음을 나타낸다.
실시예 4: hRGM A/콜라겐 I 스트라이프에서 mAb 5F9 활성
SH-SY5Y 세포를 배양하고 본원의 단락 (vii)에 기술된 바와 같이 사용하였다. RGM A 및 콜라겐 I을 지닌 스트라이프된 유리 커버슬립을 본원의 단락 (viii)에 기술된 바와 같이 제조하였다. hRGM A/콜라겐 I 및 콜라겐 I의 교호하는 스트라이프를 지닌 카펫을 문헌(참조: Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216-1224, 2007)에 기술된 프로토콜에 따라 실험을 위해 생산하였다. 5F9 MAB (A)의 부재하에서, 신경 SH-SY5Y 세포는 hRGM A 스트라이브보다 콜라겐 I 스트라이프를 선호하는 세포 중 90% 이상과 함께 콜라겐 I 스트라이프에 대해 명확한 선호를 나타낸다. MAB 5F9의 농도가 증가함에 따라, 신경 SH-SY5Y 세포는 콜라겐 I 스트라이프보다 hRGM A 스트라이프를 선호한다(B-E). (E)에서 사용된 최대 MAB 농도에서, SH-SY5Y 신경세포는 콜라겐 I 스트라이프와 비교하여 hRGM A 스트라이프에 대해 강력한 선호를 나타낸다(참조: 도 8). 이는 매력적인 활성에 있어서 RGM A의 억제 특성을 형질전환시켰으므로 5F9 MAB의 유일한 특성으로 해석될 수 있다. 증가하는 농도의 5F9의 존재하에서, 신경 세포는 RGM A 기질 상으로 이주하여 성장하는 것을 선호하지만, 콜라겐 I와 유사한 허용된 기질상에서는 그렇지 않다. 이러한 유일한 특징은 모노클로날 항체에 대해 이전에 전혀 기술되지 않았다.
실시예 5: CDR-이식된 항체의 작제
당해 분야에 잘 공지된 표준 방법을 적용시킴으로써, 모노클로날 항체 5F9의 VH 및 VL쇄의 CDR 서열(참조: 상기 표 5)을 상이한 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열내로 이식한다. 본 발명의 모노클로날 항체 5F9의 VH 및 VL 서열과의 서열 VH 및 VL 정렬을 기초로 다음의 공지된 사람 서열을 선택한다:
a) 중쇄 수용체 서열(상기 표 3에 따른)을 작제하기 위한 VH3-48, VH3-33 및 VH3-23 및 결합 서열 hJH3, hJH4 및 hJH6;
b) 경쇄 서열(상기 표 4에 따른)을 작제하기 위한 A17 및 A18 및 hJK2.
5F9의 상응하는 VH 및 VL CDR을 상기 수용체 서열내로 이식함으로써 다음의 CDR 이식된, 사람화되고, 변형된 VH 및 VL 서열을 제조하였다(참조: 또한 상기 표 6): VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, VH 5F9.3-GL, VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, VH 5F9.6-GL, VH 5F9.7-GL, 및 VH 5F9.8-GL; VL 5F9.1-GL, VL 5F9.2-GL, 및 VL 5F9.3-GL.
실시예 6: CDR-이식된 항체에서 골격 역 돌연변이의 작제
사람화된 항체 골격 역 돌연변이를 생성시키기 위해, 돌연변이를 실시예 5에 따라 제조된 CDR-이식된 항체 서열내로 가변 도메인의 드 노보(de novo) 합성에 의해 및/또는 돌연변이유발원성 프라이머 및 PCR, 및 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 도입시킨다. 역 돌연변이 및 다른 돌연변이의 상이한 조합을 다음과 같이 CDR-이식체 각각에 대해 작제한다.
중쇄 VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, 및 VH 5F9.3-GL의 경우 다음 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기(interfacing residue) 중 하나 이상을 다음과 같이 역 돌연변이시킨다: V37→I, V48→H S49→G, 및/또는 R98→K
중쇄 VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, 및 VH 5F9.6-GL의 경우 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역 돌연변이시킨다: V37→I, V48→I A49→G, R98→K.
중쇄 VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL, 및 VH 5F9.9-GL의 경우 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역 돌연변이시킨다: V37→I, V48→I S49→G.
추가의 돌연변이는 다음을 포함한다:
중쇄 VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, 및 VH 5F9.3-GL의 경우: D88→A,
중쇄 VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, 및 VH 5F9.6-GL의 경우: Q1→E 및
중쇄 VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL, 및 VH 5F9.9-GL의 경우: L5→V.
경쇄 VL 5F9.1-GL의 경우 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역 돌연변이시킨다: I2→V, M4→L, Y41→F.
경쇄 VL 5F9.2-GL의 경우 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역 돌연변이시킨다: M4→L, R51→L.
경쇄 VL 5F9.3-GL의 경우 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 역 돌연변이시킨다: M4→L, Y41→F.
실시예 7: 재조합 사람화된 항 RGMA 항체의 작제 및 발현
골격 역 돌연변이를 함유하는 중쇄 및 경쇄를 지닌 pHybE 발현 벡터를 293-6E 세포내로 공-형질감염시켜 상기 단락 ix에 기술된 바와 같이 전장 사람화된 항체를 일시적으로 생산한다. 돌연변이를 가변 도메인의 드 노보 합성에 의해 및/또는 돌연변이유발 프라이머 및 PCR, 및 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 실시예 5에 따라 제조된 바와 같은 CDR-이식된 항체 서열내로 도입시켰다. 사람화된 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 표 8에 기재되어 있다.
구체적으로, 중쇄의 경우:
VH 5F9.1, VH 5F9.5, 및 VH 5F9.9는 Q1→E 돌연변이를 지닌 VH5F9.4-GL를 함유한다.
VH 5F9.2, VH 5F9.6, VH 5F9.10, VH 5F9.19, VH 5F9.20, VH 5F9.21, 및 VH 5F9.22는 Q1→E 돌연변이 및 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 역 돌연변이: V37→I, V48→I, A49→G, R98→K를 지닌 VH 5F9.4-GL을 함유한다.
VH 5F9.3, VH 5F9.7, 및 VH 5F9.11은 L5→V 돌연변이를 지닌 VH 5F9.7-GL을 함유한다.
VH 5F9.4, VH 5F9.8, VH 5F9.12, VH 5F9.23, VH 5F9.24, VH 5F9.25, 및 VH 5F9.26은 L5→V 돌연변이 및 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 역 돌연변이: V37→I, V48→I, S49→G를 지닌 VH 5F9.7-GL을 함유한다.
경쇄의 경우:
VL 5F9.1, VL 5F9.2, VL 5F9.3, 및 VL 5F9.4은 VL 5F9.1-GL과 동일하다.
VL 5F9.5, VL 5F9.6, VL 5F9.7, 및 VL 5F9.8은 VL 5F9.2-GL과 동일하다.
VL 5F9.9, VL 5F9.10, VL 5F9.11, 및 VL 5F9.12는 VL 5F9.3-GL과 동일하다.
VL 5F9.19 및 VL 5F9.23은 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 역 돌연변이: M4→L, R51→L을 지닌 VL 5F9.2-GL을 함유한다. VL 5F9.20 및 VL 5F9.24는 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 역 돌연변이: M4→L를 지닌 VL 5F9.2-GL을 함유한다.
VL 5F9.21 및 VL 5F9.25는 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 역 돌연변이: M4→L, Y41→F를 지닌 VL 5F9.3-GL을 함유한다. VL 5F9.22 및 VL 5F9.26은 다음의 베르니어 및 VH/VL 접속 잔기 역 돌연변이: M4→L을 지닌 VL 5F9.3-GL을 함유한다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016

실시예 8: 경쟁적 ELISA를 사용한 사람화된 5F9 항체의 특성화
ELISA 플레이트(Costar 3369)를 4℃에서 0.2M 탄산나트륨-중탄산나트륨 완충액, pH 9.4중 0.25 μg/ml hRGMA의 50 μl/웰로 밤새 피복시키고, 세척 완충액(0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS)로 세척하고, 1시간 동안 실온에서 PBS중 2% 탈지방 분유 200 μl/웰로 차단시켰다. 세척 완충액으로 세척한 후, 50 μl/웰의 ELISA 완충액 속에서 50 μg/ml 최종 농도에서 개시하여 5-배 일련 희석시킨 비오티닐화된 키메라 5F9 (0.1 μg/ml 최종 농도) 및 표지되지 않은 경쟁인자 시험 항체의 혼합물을 중복해서 가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, 세척 완충액으로 세척한 후, 결합된 항체를 ELISA 완충액 속에서 100 μl/웰의 HRP-접합된 스트렙트아비딘[제조원: 피츠게랄트(Fitzgerald)]의 1 : 10,000 희석물을 사용하여 검출하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, 세척 완충액으로 세척한 후, 발색을 100 μl/웰의 TMB 완충액[제조원: 지메드(Zymed)]을 가하여 수행하였다. 15분 동안 실온에서 항온처리한 후, 발색을 50 μl/웰의 1N 염산을 가하여 중지시켰다. 흡광도를 490 nm에서 판독하였다.
표 9는 컴퓨터 소프트웨어 그라파드 프리즘(GraphPad Prism)[제조원: 그라프 파드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.), 캘리포니아주 산 디에고 소재]를 사용하여 수득한 사람화된 5F9 항체의 IC50 값을 나타낸다.
Figure pct00017
실시예 9: BIACORE 기술을 사용한 키메라 및 사람화된 항체의 친화성 측정
BIACORE 검사[제조원: 비아코어, 인크(Biacore, Inc), 뉴저지주 피츠카타웨이 소재]은 온-속도, 및 오프-속도 상수의 역학적 측정을 이용하여 항체의 친화성을 측정한다. 재조합 정제된 사람 RGMA에 대한 항체의 결합은 Biacore® 3000 장치[제조원: 비아코어 아베(Biacore® AB), 스웨덴 업살라 소재]로 이동하는 HBS-EP(10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% 표면활성제 P20)를 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명-계 측정에 의해 측정하였다. 모든 화학물질은 비어코어 아베(Biacore® AB)(스웨덴 업살라 소재)로부터 입수하였다. 대략 5000 RU의 염소 항-사람 IgG, (Fcγ), 10 mM 아세트산나트륨(pH 4.5) 속에 희석시킨 단편 특이적인 폴리클로날 항체[제조원: 피어스 바이오테크놀로지 인크(Pierce Biotechnology Inc.), 일리노이주 록크빌 소재]를 제조업자의 지시 및 과정에 따라 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 조사 등급 바이오센서 칩을 따라 25 μg/ml에서 직접 고정화시켰다. 바이오센서 표면상의 반응하지 않은 잔기를 에탄올아민으로 차단시켰다. 플로우셀(flowcell) 2 및 4에서 변형된 카복시메틸 덱스트란 표면을 반응 표면으로 사용하였다. 유동 셀 1 및 3에서 염소 항-사람 IgG의 부재하에 변형되지 않은 카복시메틸 덱스트란을 참조 표면으로서 사용하였다. 정제된 항체를 염소 항-사람IgG 특이적인 반응 표면을 따라 포획하기 위해 HEPES-완충된 염수 속에 희석시켰다. 리간드(25 μg/ml)로서 포획될 사람 항체를 반응 매트릭스에 걸쳐 5 μl/분의 유동 속도로 주사하였다. 연합 및 해리 속도 상수, kon(단위 M-1s-1) 및 k0ff(단위 s-1)를 25 μl/분의 연속된 유동 속도하에 측정하였다. 속도 상수는 0.39 내지 50 nM 범위의 10개의 상이한 항원 농도에서 역학적 결합 측정에 의해 유도하였다. 역학적 분석을 위해, 1 : 1 랑뮈르(Langmuir) 결합 모델로부터 기원한 속도 방정식을 Bioevaluation 4.0.1 소프트웨어를 사용하여 모든 8개의 주사[국제 적응 분석(global fit analysis)]의 연합 및 해리 상에 대해 유사하게 일치(fit)시켰다. 사람화된 항체와 재조합체 정제된 사람 RGMA 사이의 평형 해리 상수(단위 M)를 이후에 다음 식: KD = koff/kon에 의해 역학적 속도 상수로부터 계산하였다.
[표 9]
Figure pct00018
실시예 10: 신경세포 SH-SY5Y 주화성 검사에서 사람 RGM A의 화학반발 활성(chemorepulsive activity)을 중화시키는 사람화된 5F9 항체
주화성 검사은 주화성 또는 화학반발 활성을 발휘할 수 있는 인자들을 확산시키기 위한 반응에서 세포의 주화성 행위를 측정한다. RGM A는 막-결합된(접촉-의존성 반발) 및 가용성의 확산가능한 형태(화학반발) 둘다에서 작용하는 단백질로 기술되어 왔으므로 hRGM A 주화성 검사에서 평가하여 왔다. RGM A-민감성 사람 신경모세포종 세포 SH-SY5Y를 목표로 하기 위해, 수반하는 RGM 수용체 네오제닌을 사용하였다(참조: Schaffar et al. J. Neurochemistry: 107: 418-431, 2008). SH-SY5Y 세포를 10% 태아 소 혈청 및 1% 비-필수 아미노산(MEM-NEAA)이 보충된 이글스 균형된 염 용액/F12 (EBSS/F12) 배지 속에서 성장시켰다. 신경돌기 과성장의 유도를 위해, 세포를 10 μΜ 레티노산(RA)이 보충된 배지 속에서 배양하였다. 5 내지 6시간 후, 세포를 트립신처리하고 24-웰 보이덴 챔버(Boyden Chamber)(BD Falcon 351185, HTS Multiwell System) 속에서 플레이팅을 위해 계수하였다. 500 μl의 세포 현탁액(1 x 1O5 세포에 상응)을 각각의 웰의 내부 원에 가하였다. 당해 내부 원을 각각의 웰의 보다 큰 외부 원으로부터 공극 직경이 8μm인 PET 막에 의해 분리하였다. 600 μl의 배지 +/- RGM A +/- 항체를 외부 원내로 피펫팅하고 세포를 다중웰 보이덴 챔버(Multiwell Boyden Chamber) 속에서 밤새 37℃로 배양하였다. 항온처리 후, 배지를 통기시키고 고정액(2% 파라포름알데하이드)로 교체하였다. 고정을 2시간 동안 실온에서 지속시키고 PBS를 사용한 수회 세척 단계 후 침투를 0.1% 트리톤-X-100(15분, 실온)을 함유하는 PBS를 사용하여 수행하였다. 세포의 염색은 이들을 1시간 동안 암실 속에서 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 팔로이딘 1 : 100(인비트로겐 A12379) 및 비스벤즈이미드(H332456) 1 : 100의 용액 속에서 항온처리하여 수행하였다. PBS를 사용한 2회의 세척 단계 후, 배양물을 PBS로 충진시키고, 파라필름으로 밀봉하고 형광 현미경(Zeiss Axiovert)을 사용한 분석을 위해 암실에 저장하였다.
hRGM A의 부재하에서, 세포는 막 공극을 통해 이주하며 고정 및 염색 후 계수될 수 있다. 단지 막의 바닥에 부착된 세포들 만이 계수되는데, 이들 세포는 PET 막을 통해 이주했기 때문이다. 막의 상부 면 상의 세포는 고정 과정 전에 조십스럽게 제거한다. 당해 주화성 검사은, hRGM의 존재가 막을 통해 이주하는 SH-SY5Y 세포의 수를 80% 까지 유의적으로 감소시켰음을 입증하였다. 동형 대조군 래트 모노클날 항체(p21)를 제외한 래트 모노클로날 5F9, 키메라 사람-래트 5F9 및 사람화된 5F9는, 10 μg/ml에서 hRGM A의 화학반발 활성을 부분적으로 또는 완전히 중화시켰으며, 막의 바닥에서 발견된 세포 중 다수로 나타났다(도 10).
실시예 11: 시신경 손상의 래트 모델에서 파쇄되고, 손상된 미엘린 시신경 축색의 재생을 유도하는 5F9.
시신경 파쇄(또는 시신경 손상)의 모델은 시신경 섬유의 재생을 자극하고 망막 신경절 세포의 대량의 세포 사멸을 감소시키는 각종 기질을 시험하기 위한 동물 모델을 제공한다.
실험을 챨스 리버 (D) 실험실[Charles River (D) Laboratories, 독일 소재]로부터 입수한 성체 수컷 스프라그 다울리 및 수컷 위스타 래트(Wistar rat)에서 수행하였다. 동물을 단일 우리에 12 : 12 h 광/암 주기로 사료와 물을 자유로이 제공하면서 유지시켰다. 시신경 파쇄는 최소 전방 수술에 의해 좌측 눈에서만 수행한다. 이는 시신경 손상의 최소한의 외과적 방법이며 사람 전방 눈 수술 방법에 따라 본 발명자들에 의해 개발되었다. 수술 과정 전 및 동안에 동물은 세보플루란[제조원: 애보트 게엠베하 코 앤 카게(Abbott GmbH Co. & KG), 독일 델켄하임 소재]를 사용한 흡입 마취로 마취시키고 저클램프(jawclamp) 및 사지용 부착 테잎을 사용하여 수술대 위에 고정시킨다. 체온의 강하는 동물을 가열 패드 위에 올려놓아 방지한다. 래트 시신경의 전방 파쇄 수술을 위해, 좌측 눈에서 인대 및 연결 조직을 조심스럽게 제거한다. 제1 단계로서, 눈의 외부 가장자리내 인접 조직의 미세수술 절개(2 내지 3 mm)를 수행한다. 이후에, 시신경을 핀셋의 쌍을 사용하여 노출시켜 눈 근육과 눈물샘 옆으로 이동시킴으로서 이를 남겨둔다. 다음 단계에서, 뇌척수막을 미세가위를 사용하여 종렬로 개방시켜 시신경을 노출시켰다.
이는 눈의 보다 높은 이동성을 초래하고 눈의 측면 회전 및 이의 좌측 시신경으로의 접근을 가능하도록 한다. 시신경을 눈 뮤린의 대략 1 내지 3mm를 핀셋 세트의 쌍을 사용하여 손상시켜 20 내지 30초 동안 고정된 최대 압력을 제공한다. 특별한 주의를 기울여 눈에 혈관 공급이 손상되지 않도록 한다.
a) 항체 및 완충액 용액의 국소 투여
시신경의 파쇄 손상 후 수컷 스프라그 다울리 래트를 5F9 항체(n = 10마리의 동물), 8D1 대조군 항체(n = 10마리의 동물) 또는 비히클 대조군 PBS(n = 10마리의 동물)로 국소 치료하였다. 실험은 상이한 치료 그룹에 대해 블라인드 처리하였다. 국소 항체 적용을 위해, 작은 젤폼(gelfoam) 조각(길이: 2.5 mm, 너비: 2.5 mm, 높이: 2.5 mm)을 20 μl의 10 mg/ml 항체 용액 또는 20 μl의 PBS와 함께 침지시키고 시신경 손상 부위 근처에 직접 두었다. 최소 침습 수술 및 항체 적용 후, 동물을 이들이 움직이기 시작할 때까지 체온을 조절하기 위한 가온기 상에 올려놓은 깨끗한 우리 속의 종이 타월에 두었다. 항생제[젠타마이트렉스(Gentamytrex, Dr. Mann Pharma]를 함유하는 연고를 눈에 적용시켜 세균 감염 및 공막의 건조를 피하였다. 카프로펜[리마딜, 5 mg/kg, 제조원: 화이자 게엠베하(Pfizer GmbH), 카를스루헤 소재]를 수술 후 통증 치료요법을 위해 수술 후 직접 복강내 적용한 후 3일 동안 매일 2회 적용하였다. 동물을 수술 후 및 다음날 수시간 동안 직접 정규적으로 관찰하고 제어하여 모든 동물들이 생존하고 마취 및 수술로부터 회복되도록 하였다. 수술 및 항체/비히클 적용 후 5주째에, 동물을 과투여량의 나르코렌(40 내지 60 mg/kg)으로 마취시키고 4% 파라포름알데하이드 용액을 심장내로 주사하여 관류시켰다. 시신경을 분리하고 4% 파라포름알데하이드 용액내로 1시간 동안 실온에서 이전시켜 조직의 적절한 고정을 보증하였다. 고정 후, 래트 시신경을 밤새 30% 슈크로즈 용액(4℃) 속에 저장하였다. 다음 날, 시신경을 조직 테크(Tissue Tek) 속에 봉매하고, 동결시키고 두께가 16μm인 종적 단면을 저온유지장치를 사용하여 제조하였다.
면역염색을 위해, 시신경 단면을 냉(-20℃) 아세톤(10분)으로 고정시키고 트리스 완충된 염수(TBS, Fluka 93312)를 사용하여 3회(5 분) 세척하고 차단시키고 5% 소 혈청 알부민 및 1% 트리톤-X-100을 함유하는 TBS로 실온에서 침투(30분)시켰다. 잔류성 BSA 및 세제를 TBS를 사용한 2회의 별개의 세척 단계에 의해 제거하였다. 단면을 실온에서 1시간 동안 5% BSA/TBS 용액 속에 1:100으로 희석시킨 폴리클로날 토끼 항-GAP-43 항체(Abcam, ab 7562)와 함께 항온처리하였다. TBS, 0,1% 트윈을 사용한 3회의 세척 단계 후, 단면을 1시간 동안 실온에서 알렉사 플루오르 488-접합된 염소 항-토끼 제2 항체[몰레큘러 프로브스(Molecular Probes) A11034)와 함께 항온처리하고, 1:100 희석의 비스벤즈이미드(H33258, 50 μg/ml)를 함유하는 5% BSA/TBS 속에서 1:1000으로 희석시켜 세포 핵을 가시화하였다. 봉매 전에, 염색된 단면을 TBS 0,1% 트윈(각 단계에서 5분) 및 증류수로 3회 세척하였다. 단면을 플루오로마운트(Fluoromount) G 속에 봉매시키고, 커버슬립으로 덮고 현미경 기록을 위해 암실에 저장하였다.
짜이즈 형광 현미경 영상(도 11)을 사용하여 염색된 종적 단면을 짜이즈 악시오비젼 소프트웨어를 사용하여 저장하였다. 각각의 신경의 단일 사진을 포토샵 영상 분석 소프트웨어(Photoshop Image Analysis software)[제조원: 아도브(Adobe)]를 사용한 분석을 위해 올려놓았다. 정량적 분석은 2개의 상이한 방식으로 시신경의 조합 영상을 사용하여 수행하였다. 병변 부위에서 GAP-43-양성 부위를 악시오비젼 소프트웨어를 사용하여 측정하였다(도 12b). 당해 제1의 정량적 분석과는 별도로 단일의 재생 섬유(GAP-43 양성)을 파쇄 부위 위의 4개의 상이한 부위에서 계수하였다: 0 내지 200 μm, 200 내지 400 μm, 400 내지 600 μm 및 600 내지 1200 μm. 데이터 분석 및 데이터의 통계적 평가를 그래프파드 프리즘 소프트웨어(Graphpad Prism software)의 도움으로 수행하였다(도 12a).
b) 항체 및 완충 용액의 전신계 투여
전신계 항체 전달을 위해, 수컷 비스타 래트를 전신계(복강내, ip) 또는 정맥내, iv)로 5F9 항체(n = 10마리 동물) 또는 비히클 대조군 PBS(n = 10마리 동물)로 처리하였다. 동물에 2회 주사하고 주사를 신경 파쇄를 유도한 후 0일 째에 및 파쇄 후 21일째에 수행하였다. 제공된 항체의 투여량은 0일째에 2 mg/kg이고 21일 째에 10 mg/kg이었다. 동물을 파쇄 손상 및 조직 분리 후 5주째에 사멸시키고, 단면의 제조, 염색 및 정량적 분석을 위에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 앞서와 같이 실험은 2개의 상이한 처리 그룹에 대해 맹검처리하였다. 래트 시신경의 복합 영상을 도 13에 나타낸다. 5F9 처리된 동물(A)에서, 많은 GAP-43 양성 섬유가 PBS(B)로 처리한 대조군 동물과는 대조적으로 파쇄 부위를 능가하여 연장되어 있다. 파쇄된 부위는 좌측 가장자리에 위치하며 재생 섬유는 GAP-43에 대한 항체로 염색되었다. 많은 섬유가 5F9-처리된 동물내 시신경의 상부 및 하부 가장자리에서 관찰되나 PBS 동물에서는 그렇지 않다.
비히클 대조군 PBS를 제외한 5F9는, 재생하는 GAP-43 양성 섬유의 수를 유의적으로 증가시켰다. 유의적으로 보다 많은 섬유(p < 0.001)는 비히클 처리된 동물에서보다 5F9로 처리한 동물에서 300 μm 내지 1800 μm 거리에서 발견되었다. 동물을 0일 및 21일 째에 5F9로 각각 2 mg/kg 및 10 mg/kg으로 처리하였다. 항체 또는 비히클은 복강내 또는 정맥내 제공하였다. 데이터는 그룹당 9마리의 분석으로부터 취한다. 동물당 3개의 일련의 저온유지 단면을 분석하였다(도 14a).
제2 실험에서, 수컷 비스터 래트를 시신경 손상 후 전신계로(iv) 5F9 항체(n = 10마리 동물), 8D1 대조균 항체(n = 10마리 동물) 또는 비히클 대조군 PBS(n = 10마리 동물)로 처리하였다. 래트에게 주당 1회 2 mg/kg의 항체를 정맥내 제공하고 주사를 시신경 파쇄 후 즉시 개시하였다. 모든 래트에게 4회 주사하고 동물을 파쇄 손상 후 5주째에 마취하였다. 실험은 맹검이었으며 조직 가공 및 정량적 분석은 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다. 비히클 대조군 PBS를 제외한 5F9는 재생하는 GAP-43 양성 섬유의 수를 유의적으로 증가시켰다. 유의적으로 보다 많은 섬유(p < 0.001)가 비히클 또는 대조군 항체 처리한 동물에서보다 200μm 내지 1400 μm의 거리에서 5F9로 처리한 동물에서 발견되었다. 동물을 0일 째에 개시하여 4주 동안 주당 1회 5F9(투여량당 2 mg/kg), 대조군 항체 8D1(투여량당 2 mg/kg) 또는 PBS로 정맥내 처리하였다(도 14b).
실시예 12: 시신경 손상의 래트 모델에서 파쇄되고, 손상된 시신경 축색의 재유수화를 유도하는 5F9
희소돌기아교세포 및 미엘린에 대한 마커는 미엘린-염기성 단백질(MBP)이다. MBP에 대해 지시된 항체를 사용하여 상이한 처리 그룹에서 재수초화시 차이점들이 발생하는지의 질문에 답하였다. 재유수화의 공정을 가시화하기 위해, 전신계 처리된 동물의 시신경 단면을 냉(-20℃) 아세톤(10분)으로 고정시키고, 트리스 완충된 염수(TBS, Fluka 93312)로 3회(5 분) 세척하고 5% 소 혈청 알부민 및 1% 트리톤-X-100(30분)을 함유하는 TBS로 실온에서 침투시켰다. 잔류성 BSA 및 세제를 2회의 별개의 세척 단계(각각 5분)에 의해 TBS를 사용하여 제거하였다. 단면을 3시간 동안 또는 밤새 4℃에서 5% BSA/TBS 용액 속에서 1:50으로 희석시킨 폴리클로날 토끼 항-MBP 항체(Abeam, ab 2404)와 함께 항온처리하였다. TBS, 0.1% 트윈을 사용한 3회의 세척 단계 후, 단면을 1시간 동안 실온에서 비스벤즈이미드(H33258, 50 μg/ml)의 1:100 희석물을 함유하는 5% BSA/TBS 속에서 1:1000으로 희석된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488-접합된 염소 항-토끼 제2 항체(몰레큘러 프로브스 A1 1034)와 함께 항온처리하여 세포 핵을 가시화하였다. 봉매 전에, 염색된 단면을 TBS, 0.1% 트윈(각 단계에서 5분) 및 증류수로 3회 세척하였다. 플루오로마운트(Fluoromount) G 속에 봉매된 단면을 커버슬립으로 덮고 현미경 기록을 위해 암실에 저장하였다.
짜이즈 형광 현미경을 사용하여 염색된 종축 단면의 영상을 짜이즈 악시오비젼 소프트웨어를 사용하여 저장하였다. 각각의 신경의 단일 사진을 포토샵 영상 분석 소프트웨어(제조원: 아도브)를 사용하여 분석을 위해 놓았다. 정량적 분석을 2개의 상이한 방식으로 시신경의 복합 영상을 사용하여 수행하였다. 병변 부위에서 MBP-양성 부위를 악시오비젼 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 데이터 분석 및 데이터의 통계적 평가를 그래프파드 프리즘 소프트웨어의 도움으로 수행하였다.
동물을 0일 및 21일 째에 2 mg/kg 및 10 mg/kg 각각을 사용하여 5F9로 처리하였다. 항체 또는 비히클을 복강내 또는 정맥내로 제공하였다.
래트 시신경의 복합 영상
유수화를 미엘린 마커 미엘린 염기성 단백질 MBP에 대해 지시된 항체를 사용하여 가시화하였다. 파쇄된 부위는 복합 신경의 중간에 위치하며 영역은 비히클 처리된 대조군 동물에서는 존재하지 않는다(a 및 b). 5F9 처리된 동물(c 및 d)에서, 많은 MBP-양성 구조가 시신경의 중간 영역(파쇄 중심)에서 관찰된다(도 15).
유수화는 미엘린 마커 미엘린 염기성 단백질 MBP에 대해 지시된 항체를 사용하여 가시화한다. MBP 영역은 짜이즈 악시오비젼 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. M1 및 M2는 2개의 독립된 측정이며 M은 평균 측정된 MPB-양성 영역이다. 5F9는 3.5의 인자까지 시신경 파쇄 부위의 MBP-영역을 유의적으로(비히클 대조군에 대해 p < 0.001) 증가시킨다(도 16).
실시예 13: 변성하는 RNFL내 망막 신경의 발아를 유도하고 변성으로부터 망막 신경 섬유층(RNLF)를 보호하는 5F9
RNLF 변성의 보호 및 망막 신경 발아의 유도를 관찰하기 위하여, 신규한 실험실 검사 방법을 확립하였다. 당해 방법은 시신경 파쇄된 래트의 눈으로부터의 성체 래트 망막을 외식(explanting)하여 분석하고(상기 실시예 11에 기술됨) 항체 5F9, 대조군 항체 p21(래트 IgG1 모노클로날 항체) 또는 PBS 비히클로 전신계 처리함을 기초로 한다. 이를 수행하기 위해, 시신경 파쇄된 실험 래트를 Ab 또는 PBS로 시신경 파쇄 유도 즉시 및 이후에 1주 간격(5회 동안; 2 mg/kg 또는 10 mg/kg의 항체 투여량)으로 처리하였다.
a) 망막 제조 및 면역형광성 염색:
동물을 세보플루란(8%; 제조원: 애보트)로 깊게 마취시킨 직 후, 흉곽을 개방하고 좌심심을 통해 4% 파라포름알데하이드(PFA) 용액으로 관류시켜 희생시켰다. 눈을 망막 제제가 완성될 때까지 4% PFA 속에서 조절하여 둔 연결조직과 함께 절개하였다.
망막의 제조는 행크스 균형 염 용액[Hank's Balanced Salt Solution: HBSS, 마그네슘- 및 칼슘-유리됨, 제조원: 인비트로겐(Invitrogen), #14170070] 속에서 수행하였다. 눈을 연결 조직에서 쪽집게로 고정시키고 둥근 절단을 각막 주변의 공막내에서 수행하였다.
수정체 및 섬모체를 대부분의 경우 망막과 함께, 개방부를 통해 조심스럽게 제거하였다. 이 경우 망막은 여전히 공막에 부착되어 있었으며 - 이는 부드럽게 탈착되어 제거되었다.
망막의 반구를 회색 니트로셀룰로즈 막(Sartorius, #13006-50-N) 위에서 개방되고 분무된 4점에서 절단하였다. 필수적인 경우, 위에 망막을 지닌 막이 5 내지 10초간 공기 건조되도록 하였다.
이후에, 막 위의 망막을 10% 중성 포스페이트-완충된 포름알데하이드 용액[pH 7.3; 제조원: 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), #F/1520/21] 속에서 면역형광성 염색이 수행될 때까지 +4℃에서 두었다.
염색은 다음 프로토콜에 따라 수행한다:
망막 제제를 TBS로 세척한 후 5% BSA, TBS 중 1% 트리톤 X-100으로 30분 동안 차단시키고 침투시키며 TBS로 다시 세척하였다. 제1 항체(모노클로날 Ab TUJ-1, 마우스 항-β III 투불린 Ab, AbCam, # abl4545; 1:500 희석, TBS 중, 5% BSA)를 1시간 동안 실온에서 암실에서 가한 후, TBS, 0.1% 트윈 20으로 세척하였다. 이후에, 제2 항체(당나귀 항-마우스 Cy3; 제조원: 잭슨 임뮤노리서치(Dianova) 715-165-151, 1:1000 희석) 및 비스벤즈이미드(50 μg/ml 1:100 희석)(TBS 중, 5% BSA)를 1시간 동안 실온에서 암실 속에서 가한 후, TBS, 0.1% 트윈 20으로 세척하고, 탈염된 H20로 세척하였다. 이후에, 제제를 플루오르마운트 G와 함께 두고 +4℃에서 암실 속에 저장하였다.
b) 눈속에서 망막 섬유(RNFL) 상의 5F9의 보호 효과의 시험
악시오 비젼 소프트웨어를 사용하여, 각각의 망막의 무작위적으로 선택된 영상(n = 12개)을 선택하여 신경 섬유의 수를 각각의 영상에 대해 측정하였다.
실험을 위해, 파쇄된 시신경을 지닌 3개의 망막을 각각의 그룹에 대해 사용하였다: 5F9 mab 그룹, p21 대조군 mab 그룹 및 PBS 비히클 그룹. 데이터 분석 및 통계적 분석을 그래프파드 프리즘 프로그램을 사용하여 수행하였다.
결과는 도 17에 나열한다. 신경 섬유 다발의 유의적으로 보다 높은 밀도가 본 발명의 5F9 항체로 전신계 처리한 동물의 망막에서 관찰된다.
c) 눈에서 망막 신경세포의 발아에 있어 5F9의 효과의 시험
악시오 비젼 소프트웨어를 사용하여, 각각의 외식된 망막의 무작위적으로 선택된 영상(n = 12)을 선택하여 발아하는 신경세포의 수를 각각의 영상에 대해 측정하였다.
실험을 위해 파쇄된 시신경을 지닌 3개의 망막을 각각의 그룹에 대해 사용하였다: 5F9 mab 그룹, p21 대조군 mab 그룹 및 PBS 비히클 그룹. 데이터 분석 및 통계적 분석을 그래프파드 프리즘 프로그램을 사용하여 수행하였다.
결과는 도 18에 나열한다. 유의적으로 보다 높은 수의 발아하는 망막내 신경세포가 본 발명의 5F9 항체를 전신계 처리한 동물의 망막내에서 관찰된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBOTT GMBH & CO. KG <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE RGM A PROTEIN FOR USE IN THE TREATMENT OF RETINAL NERVE FIBER LAYER DEGENERATION <130> M/50237 <150> US 61/267,446 <151> 2009-12-08 <160> 68 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1353 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1353) <400> 1 atg cag ccg cca agg gag agg cta gtg gta aca ggc cga gct gga tgg 48 Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 1 5 10 15 atg ggt atg ggg aga ggg gca gga cgt tca gcc ctg gga ttc tgg ccg 96 Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 acc ctc gcc ttc ctt ctc tgc agc ttc ccc gca gcc acc tcc ccg tgc 144 Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45 aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg ggc agc 192 Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60 cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt gca gcc ttg cgc 240 His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg 65 70 75 80 agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc tgc cgg ggt gac 288 Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95 ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag 336 Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln 100 105 110 cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca cgc ctg cgc acg 384 His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr 115 120 125 ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac agc ccc gag atc 432 Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile 130 135 140 tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc acc ccc aac tac 480 Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr 145 150 155 160 acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac cca cac ctc agg act ttc acc gac 528 Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp 165 170 175 cgc ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gcc tgg ccg ctc atc gac aat 576 Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn 180 185 190 aat tac ctg aac gtg cag gcc acc aac acg cct gtg ctg ccc ggc tca 624 Asn Tyr Leu Asn Val Gln Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser 195 200 205 gcg gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc aag aac ttc cag 672 Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln 210 215 220 gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag gct gag atg gac gag ctc ccg 720 Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro 225 230 235 240 gcc gcc ttc gtg gat ggc tct aag aac ggt ggg gac aag cac ggg gcc 768 Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala 245 250 255 aac agc ctg aag atc act gag aag gtg tca ggc cag cac gtg gag atc 816 Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile 260 265 270 cag gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg cgc cag gtg ggc cgc 864 Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg 275 280 285 tac ctg acc ttt gcc gtc cgc atg cca gag gaa gtg gtc aat gct gtg 912 Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val 290 295 300 gag gac tgg gac agc cag ggt ctc tac ctc tgc ctg cgg ggc tgc ccc 960 Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro 305 310 315 320 ctc aac cag cag atc gac ttc cag gcc ttc cac acc aat gct gag ggc 1008 Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly 325 330 335 acc ggt gcc cgc agg ctg gca gcc gcc agc cct gca ccc aca gcc ccc 1056 Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro 340 345 350 gag acc ttc cca tac gag aca gcc gtg gcc aag tgc aag gag aag ctg 1104 Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu 355 360 365 ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gcc tgc gtc ttc gac ctc ctc acc 1152 Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr 370 375 380 acg ggc gac gtg aac ttc aca ctg gcc gcc tac tac gcg ttg gag gat 1200 Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp 385 390 395 400 gtc aag atg ctc cac tcc aac aaa gac aaa ctg cac ctg tat gag agg 1248 Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg 405 410 415 act cgg gac ctg cca ggc agg gcg gct gcg ggg ctg ccc ctg gcc ccc 1296 Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro 420 425 430 cgg ccc ctc ctg ggc gcc ctc gtc ccg ctc ctg gcc ctg ctc cct gtg 1344 Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val 435 440 445 ttc tgc tag 1353 Phe Cys 450 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 1 5 10 15 Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60 His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95 Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln 100 105 110 His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile 130 135 140 Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr 145 150 155 160 Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp 165 170 175 Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn 180 185 190 Asn Tyr Leu Asn Val Gln Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser 195 200 205 Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln 210 215 220 Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro 225 230 235 240 Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala 245 250 255 Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile 260 265 270 Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg 275 280 285 Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val 290 295 300 Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro 305 310 315 320 Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly 325 330 335 Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro 340 345 350 Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu 355 360 365 Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr 370 375 380 Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp 385 390 395 400 Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg 405 410 415 Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro 420 425 430 Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val 435 440 445 Phe Cys 450 <210> 3 <211> 1929 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hRGMA fc <220> <221> CDS <222> (1)..(1929) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(102) <220> <221> misc_feature <222> (103)..(1230) <223> hRGMA Fragment 47-422 <220> <221> misc_feature <222> (1231)..(1929) <223> fc portion <400> 3 atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ctt ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc 144 Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala 35 40 45 acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt 192 Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60 gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc 240 Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 tgc cgg ggt gac ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac 288 Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp 85 90 95 ctc atg agc cag cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca 336 Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro 100 105 110 cgc ctg cgc acg ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac 384 Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp 115 120 125 agc ccc gag atc tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc 432 Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140 acc ccc aac tac acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac cca cac ctc agg 480 Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg 145 150 155 160 act ttc acc gac cgc ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gcc tgg ccg 528 Thr Phe Thr Asp Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro 165 170 175 ctc atc gac aat aat tac ctg aac gtg cag gtc acc aac acg cct gtg 576 Leu Ile Asp Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val 180 185 190 ctg ccc ggc tca gcg gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc 624 Leu Pro Gly Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe 195 200 205 aag aac ttc cag gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag gct gag atg 672 Lys Asn Phe Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met 210 215 220 gac gag ctc ccg gcc gcc ttc gtg gat ggc tct aag aac ggt ggg gac 720 Asp Glu Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp 225 230 235 240 aag cac ggg gcc aac agc ctg aag atc act gag aag gtg tca ggc cag 768 Lys His Gly Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln 245 250 255 cac gtg gag atc cag gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg cgc 816 His Val Glu Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg 260 265 270 cag gtg ggc cgc tac ctg acc ttt gcc gtc cgc atg cca gag gaa gtg 864 Gln Val Gly Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val 275 280 285 gtc aat gct gtg gag gac tgg gac agc cag ggt ctc tac ctc tgc ctg 912 Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu 290 295 300 cgg ggc tgc ccc ctc aac cag cag atc gac ttc cag gcc ttc cac acc 960 Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr 305 310 315 320 aat gct gag ggc acc ggt gcc cgc agg ctg gca gcc gcc agc cct gca 1008 Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala 325 330 335 ccc aca gcc ccc gag acc ttc cca tac gag aca gcc gtg gcc aag tgc 1056 Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys 340 345 350 aag gag aag ctg ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gcc tgc gtc ttc 1104 Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe 355 360 365 gac ctc ctc acc acg ggc gac gtg aac ttc aca ctg gcc gcc tac tac 1152 Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr 370 375 380 gcg ttg gag gat gtc aag atg ctc cac tcc aac aaa gac aaa ctg cac 1200 Ala Leu Glu Asp Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His 385 390 395 400 ctg tat gag agg act cgg gac ctg cca ggc ttg aat tct gca gat atc 1248 Leu Tyr Glu Arg Thr Arg Asp Leu Pro Gly Leu Asn Ser Ala Asp Ile 405 410 415 gag gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 1296 Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 420 425 430 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 1344 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 435 440 445 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 1392 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 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Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp 85 90 95 Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro 100 105 110 Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp 115 120 125 Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140 Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg 145 150 155 160 Thr Phe Thr Asp Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro 165 170 175 Leu Ile Asp Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val 180 185 190 Leu Pro Gly Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe 195 200 205 Lys Asn Phe Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met 210 215 220 Asp Glu Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp 225 230 235 240 Lys His Gly Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln 245 250 255 His Val Glu Ile Gln Ala Lys 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(103)..(468) <223> hRGMA Fragment 47-168 <220> <221> misc_feature <222> (469)..(1167) <223> fc portion <400> 5 atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ctt ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc 144 Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala 35 40 45 acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt 192 Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60 gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc 240 Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 tgc cgg ggt gac ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac 288 Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp 85 90 95 ctc atg agc cag cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca 336 Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro 100 105 110 cgc ctg cgc acg ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac 384 Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp 115 120 125 agc ccc gag atc tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc 432 Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140 acc ccc aac tac acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac ttg aat tct gca 480 Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala 145 150 155 160 gat atc gag gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 528 Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 165 170 175 ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 576 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 180 185 190 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 624 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 672 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 720 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 225 230 235 240 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 768 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 245 250 255 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 816 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 864 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 275 280 285 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 912 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 290 295 300 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 960 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 305 310 315 320 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1008 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc 1056 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 340 345 350 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1104 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 355 360 365 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1152 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 370 375 380 tct ccg ggt aaa tga 1167 Ser Pro Gly Lys 385 <210> 6 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala 35 40 45 Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp 85 90 95 Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro 100 105 110 Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp 115 120 125 Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140 Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala 145 150 155 160 Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 180 185 190 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 225 230 235 240 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 245 250 255 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 275 280 285 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 290 295 300 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 305 310 315 320 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 340 345 350 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 355 360 365 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 370 375 380 Ser Pro Gly Lys 385 <210> 7 <211> 1431 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1431) <400> 7 atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ctt ggt acc gag ctc gga tcc act agt cca gtg tgg tgg aat tct 144 Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser 35 40 45 gca gat atc aca agt ttg tac aaa aaa gca ggc tcc ccg tgc aag atc 192 Ala Asp Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Pro Cys Lys Ile 50 55 60 ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg tca ggc agc cac 240 Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His 65 70 75 80 gcc cct gcc tct gac gac gtg ccc gag ttc tgt gct gcc ctg cgc acc 288 Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr 85 90 95 tac gcc ctg tgc acg cga cgg aca gcc cgc acc tgc cgg ggc gac ctg 336 Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu 100 105 110 gct tac cac tcg gct gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag cac 384 Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His 115 120 125 aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tca cag cct cga gtg cgc acg ctc 432 Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu 130 135 140 ccg cca gct ggg gac agc cag gag cgc tca gat agc ccc gag atc tgc 480 Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys 145 150 155 160 cac tat gag aag agt ttc cac aag cac tca gct gcc ccc aac tac act 528 His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr 165 170 175 cac tgc ggc ctc ttt ggg gac cca cac ctc agg act ttc aca gac cac 576 His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His 180 185 190 ttc cag aca tgt aag gtg caa ggc gct tgg cct ctc atc gac aat aat 624 Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn 195 200 205 tac ctg aac gtg cag gtc acc aat aca cct gtg ctg ccc ggc tct gcc 672 Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 210 215 220 gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc aag aac ttc caa gag 720 Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu 225 230 235 240 tgt gtg gac cag aaa gta tac caa gcc gag atg gac gag ctt ccg tcc 768 Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 245 250 255 gcc ttt gcc gat ggc tcc aaa aac ggt gga gat aaa cac gga gcc aac 816 Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 260 265 270 agc ctg aag atc aca gag aag gtg tca ggc cag cac gtg gag atc cag 864 Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln 275 280 285 gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg aga cag gtg ggc cgc tac 912 Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr 290 295 300 ctg acc ttc gcc gtc cgg atg ccc gag gag gta gtc aac gcc gtg gag 960 Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 305 310 315 320 gac cgt gac agc caa ggc ctc tac ctc tgc ctg cgg ggc tgc ccg ctc 1008 Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 325 330 335 aac cag cag atc gac ttc cag gct ttc cgt gcc aac gcc gag agc cct 1056 Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 340 345 350 cgc agg cca gca gct gcc agc ccc tct cct gtg gtc ccc gag aca ttt 1104 Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 355 360 365 ccg tac gag aca gct gtg gcc aag tgc aaa gag aag ctg cct gta gaa 1152 Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 370 375 380 gac ttg tac tac cag gcc tgt gtc ttc gac ctc ctc acg act ggc gac 1200 Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 385 390 395 400 gtg aac ttc acg ctg gcc gcc tac tat gct ttg gag gat ggc aag atg 1248 Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 405 410 415 ctc cac tcc aac aag gac aag cta cac ctg ttt gaa agg act cgg gag 1296 Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 420 425 430 ctg cct gac cca gct ttc ttg tac aaa gtg gtg ata tcc agc aca gtg 1344 Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Ser Thr Val 435 440 445 gcg gcc gct cga gga ggg ccc gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat 1392 Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 450 455 460 ctg aat agc gcc gtc gac cat cat cat cat cat cat tga 1431 Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 465 470 475 <210> 8 <211> 476 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 8 Met Glu Thr Asp 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Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu 225 230 235 240 Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 245 250 255 Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 260 265 270 Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln 275 280 285 Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr 290 295 300 Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 305 310 315 320 Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 325 330 335 Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 340 345 350 Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 355 360 365 Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 370 375 380 Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 385 390 395 400 Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 405 410 415 Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 420 425 430 Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Ser Thr Val 435 440 445 Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 450 455 460 Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 465 470 475 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 5F9 <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Xaa Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9 <400> 10 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 11 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ig gamma-1 constant region <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 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Artificial <220> <223> VL 5F9 CDR-L2 <400> 61 Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 5F9 CDR-L3 <400> 62 Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 CDR-H1 <400> 63 Ser Tyr Val Met His 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 CDR-H2 <400> 64 Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 8D1 CDR-H3 <400> 65 Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 CDR-L1 <400> 66 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 CDR-L2 <400> 67 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 8D1 CDR-L3 <400> 68 Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg Thr 1 5

Claims (19)

  1. 망막 신경 섬유층(RNFL) 변성의 치료에 사용하기 위한 사람 RGM A에 대한 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치료가 치료학적 또는 예방학적, 신경재생 또는 신경보호, 국소 또는 전신계 치료인, 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료의 결과로서
    a) 망막 뉴런 발아가 관찰되고/되거나;
    b) 망막내 RGC(망막 신경절 세포) 축색이 변성으로부터 보존되는, 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNFL 변성이 당뇨병성 망막증, 허혈성 시신경병증, X-염색체 결합된 망막층간분리증, 약물-유도된 시신경병증, 망막 이영양증, 연령-관련된 황반 변성, 시신경두 드루젠(optic nerve head drusen)을 특징으로 하는 안 질환, 광수용체 변성의 유전적 결정인자를 특징으로 하는 안 질환, 상염색체 열성 추체간체 이영양증, 및 시신경병증이 있는 미토콘드리아 장애로부터 선택된 질환과 관련된, 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 1 x 10-7M 이하의 KD 및 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 1 x 10-2s-l 이하의 koff 속도 상수로 사람 RGM A로부터 해리되는, 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 RGM A에 결합하여 표준 시험관내 검사로 측정한 사람 RGM A의 신경돌기 과성장 억제 활성을 중화하는, 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 사람화된 항체인, 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 결합 단백질이 RGM 분자의 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 항원 결합 도메인은
    a) 서열 번호 59 및 65로 이루어진 CDR-H3 그룹 아미노산 서열, 및 당해 서열들 중 하나에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열; 및/또는
    b) 서열 번호 62 및 68로 이루어진 CDR-L3 그룹 아미노산 서열, 및 당해 서열들 중 하나에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열로 이루어진 그룹
    으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 57 및 63으로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-H1 그룹; 및/또는
    b) 서열 번호 60 및 66으로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-L1 그룹; 및/또는
    c) 서열 번호 58 및 64로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-H2 그룹; 및/또는
    d) 서열 번호 61 및 67로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-L2 그룹; 및 당해 서열들 중 하나에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 다음:
    Figure pct00019

    으로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트로부터 선택된 3개 이상의 CDR을 포함하거나, 또는 이러한 3개의 CDR 중 하나 이상이, 모 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열인 가변 도메인 세트를 포함하는, 결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트를 포함하는, 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트가
    VH 5F9 세트 및 VL 5F9 세트; 및
    VH 8D1 세트 및 VL 8D1 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 수용체 골격을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 및 43으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 가변 도메인; 및/또는 서열 번호 44, 45 및 46으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 사람 수용체 골격이
    (중쇄 서열 위치): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98;
    (경쇄 서열 위치): 2, 4, 41, 51로 이루어진 그룹으로부터 선택된 주요 잔기(key residue)에서 적어도 하나의 골격 영역 아미노산 치환을 포함하는, 결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    (중쇄 서열) 서열 번호 47, 48, 49, 50; 및
    (경쇄 서열) 서열 번호 51, 52, 53 및 54로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 (골격 돌연변이된) 가변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 5F9 및 8D1로부터 선택되는 항체인, 결합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 분리된 결합 단백질을 포함하는 조성물의 유효량을 RNFL 변성의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, RNFL 변성을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치료가 치료학적 또는 예방학적, 신경재생 또는 신경보호, 국소 또는 전신계 치료인, 방법.
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