BRPI0708588A2 - aptámeros de ligaçao ao complemento e agentes anti-c5 usados no tratamento de desordens oculares - Google Patents

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Abstract

APTáMEROS DE LIGAçãO AO COMPLEMENTO E AGENTES ANTI-C5 USADOS NO TRATAMENTO DE DESORDENS OCULARES. São descritas métodos de tratar desordens oculares mediadas pelo complemento administrando agentes que inibem um componente do complemento do sujeito em uma quantidade suficiente para na desordem ocular em que, em uma modalidade selecionada, o dito agente é um aptâmero anti-complemento que, em uma modalidade preferida, é um aptâmero anti-C5.

Description

"APTÂMEROS DE LIGAÇÃO AO COMPLEMENTO E AGENTES ANTI-C5USADOS NO TRATAMENTO DE DESORDENS OCULARES"
PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
Este pedido de patente reivindica prioridade para os pedidos de patente provisóriosU.S. Nos. de série 60/780.905, depositado em 8 de março de 2006, e 60/848.274, depositadoem 29 de setembro de 2006, cada um dos quais está aqui incorporado pela referência na suaíntegra.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção, no geral, diz respeito ao campo de ácidos nucléicos e mais particular-mente a aptâmeros capazes de se ligar às proteínas do sistema complemento, usados comoterapêuticos e diagnósticos em desordens oftálmicas relacionadas ao complemento, cardía-cas, inflamatórias, asmáticas e auto-imunes, lesão de reperfusão isquêmica e/ou outras doen-ças ou desordens em que, especialmente, a ativação do complemento mediada por C5 estáenvolvida. Em modalidades preferidas, a invenção diz respeito mais especificamente a méto-dos e materiais para o tratamento e detecção de desordens oculares incluindo, mas sem limi-tações, o tratamento e detecção de desordens mediadas por C5, tais como desordens media-das por C5 oculares. A invenção adicionalmente diz respeito a materiais e métodos para aadministração de aptâmeros capazes de se ligar a proteínas do sistema complemento incluin-do proteínas C5.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Um aptâmero por definição é uma molécula isolada de ácido nucléico que se ligacom alta especificidade e afinidade a algum alvo, tal como uma proteína por meio de intera-ções a não ser pareamento de base de Watson-Crick. Embora aptâmeros sejam moléculas abase de ácido nucléico, existe uma diferença fundamental entre aptâmeros e outras moléculasde ácido nucléico, tais como genes e RNAm. No último, a estrutura de ácido nucléico codificainformação por meio de sua seqüência de bases lineares e assim esta seqüência é de impor-tância para a função de armazenamento de informação. Completamente ao contrário, a fun-ção do aptâmero, que é baseado na ligação específica de uma molécula alvo, não dependede uma seqüência conservada de bases lineares, mas de preferência uma estrutura secundá-ria/terciária particular. Isto é, aptâmeros são seqüências que não codificam. Qualquer codifica-ção potencial que um aptâmero pode possuir é completamente acidental e não exerce ne-nhum papel que seja na ligação de um aptâmero ao seu alvo cognato. Assim, embora elespossam ser os aptâmeros de ligação ao mesmo alvo, e mesmo ao mesmo local no alvo, com-partilham uma seqüência de bases lineares similares, a maioria não é.
Aptâmeros também devem ser diferenciados das seqüências de ácidos nucléicosque ocorrem naturalmente que se ligam a certas proteínas. As últimas seqüências são se-qüências que ocorrem naturalmente encaixadas no genoma do organismo que se liga a umsubgrupo especializado de proteínas que estão envolvidas na transcrição, tradução e trans-porte de ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente, isto é, ácido nucléico que se liga a pro-teínas. Aptâmeros, por outro lado, são moléculas de ácidos nucléicos pequenos, isoladas,que ocorrem não naturalmente. Enquanto aptâmeros de ligação às proteínas que se ligamao ácido nucléico podem ser identificados, na maioria dos casos tais aptâmeros têm peque-na ou nenhuma identidade de seqüência com as seqüências reconhecidas pelas proteínasque se ligam ao ácido nucléico na natureza. Mais importantemente, aptâmeros podem se ligarvirtualmente a qualquer proteína (não somente às proteínas que se ligam ao ácido nucléico),bem como quase qualquer alvo de interesse, incluindo moléculas pequenas, carboidratos,peptídeos, etc. Para a maioria dos alvos, mesmo proteínas, uma seqüência de ácidos nucléi-cos que ocorre naturalmente à qual ele se liga não existe; para os alvos que realmente têmuma seqüência como esta, isto é, proteínas que se ligam ao ácido nucléico, tais seqüênciasirão se diferir dos aptâmeros como um resultado da afinidade de ligação relativamente baixausado na natureza quando comparado aos aptâmeros de ligação fortemente.
Aptâmeros, tipo peptídeos gerados por apresentação de fago ou anticorpos, sãocapazes de - especificamente se ligar a alvos selecionados e modular a atividade do alvo ouinterações de ligação, por exemplo, por meio de aptâmeros de ligação podem bloquear suacapacidade do alvo para a função. Da forma com anticorpos, esta propriedade funcional deligação específica a um alvo é uma propriedade inerente. Também da forma com anticorpos,embora um versado na tecnologia possa não saber quais características estruturais precisasum aptâmero para um alvo terá, o versado na tecnologia sabe como identicar, preparar eusar uma molécula como esta na ausência de uma definição estrutural precisa.
Aptâmeros também são análogos a terapêuticos de molécula pequena em que umaúnica mudança estrutural, entretanto aparentemente menor, pode drasticamente afetar (emvárias ordens de magnitude) a ligação e/ou outra atividade (ou atividades) do aptâmero. Poroutro lado, algumas mudanças estruturais terão pouco ou nenhum efeito que seja. Isto re-sulta da importância da estrutura secundária/terciária de aptâmeros. em outras palavras, umaptâmero é uma estrutura tridimensional mantida em uma conformação fixa que fornececontato químico para especificamente ligar seu dado alvo. Consequentemente; (1) algumasáreas ou seqüências particulares são essenciais como (a) pontos específicos de contato comalvo, e/ou como (b) seqüências que posicionam as moléculas em contato com o alvo; (2) al-gumas áreas ou seqüências particulares têm uma faixa de variabilidade, por exemplo, nu-cleotídeo X pode ser uma pirimidina, ou nucleotídeo Y pode ser uma purina, ou nucleotídeosXeY podem ser complementares; e (3) algumas áreas ou seqüências particulares podemser algo, isto é, elas são essencialmente elementos de espaçamento, por exemplo, elas po-dem ser qualquer fio de nucleotídeos de um dado comprimento ou mesmo um espaçadornão nucleotídeo, tal como uma molécula de PEG.Descobertos por um processo de seleção in vitro dos grupos de seqüência aleató-ria de oligonucleotídeos, aptâmeros foram gerados para mais de 130 proteínas, incluindofatores de crescimento, fatores de transcrição, enzimas, imunoglobulinas, e receptores. Umaptâmero típico tem 10-15 kDa de tamanho (20-45 nucleotídeos), liga seu alvo com afinidadenanomolar a subnanomolar, e discrimina contra alvos intimamente relacionados (por exem-plo, aptâmeros tipicamente não se ligarão a outras proteínas da mesma família de gene).
Uma série de estudos estruturais mostrou que aptâmeros são capazes de usar os mesmostipos de interações de ligação (por exemplo, ligação de hidrogênio, complementariedadeseletrostáticas, contatos hidrofóbicos, exclusão estérica) que conduz afinidade e especificida-de em complexos anticorpo-antígeno.
Aptâmeros têm inúmeras características desejáveis para uso como terapêuticos e di-agnósticos incluindo alta especificidade e afinidade, eficácia biológica, e excelentes proprie-dades farmacocinética. Além do mais, elas oferecem vantagens competitivas específicassobre anticorpos e outras proteínas biológicas, por exemplo:
1) Velocidade e controle. Aptâmeros são produzidos por um processo completa-mente in vitro, permitindo rápida geração de condutores iniciais, incluindo condutores tera-pêuticos. A seleção iη vitro permite que a especificidade e afinidade do aptâmero seja es-treitamente controlada e permite que a geração de condutores, incluindo condutores contraalvos tanto tóxicos e não imunogênicos.
2) Toxicidade e Imunoqenicidade. Aptâmeros como uma classe demonstraram toxi-cidade terapeuticamente aceitável e falta de imunogenicidade. Embora a eficácia de muitosanticorpos monoclonais possa ser severamente limitada pela resposta imune a anticorpos emsi, é extremamente difícil elicitar anticorpos para aptâmeros mais provável em virtude de osaptâmeros não poderem ser apresentados por células T por meio do MHC e a resposta i-mune é geralmente treinada para não reconhecer fragmentos de ácido nucléico.
3) Administração. Embora a maioria dos anticorpos terapêuticos atualmente apro-vados seja administrada por infusão intravenosa (tipicamente por 2-4 horas), aptâmeros po-dem ser administrados por injeção subcutânea (biodisponibilidade do aptâmero por meio deadministração subcutânea é > 80 % em estudos em macaco (Tucker et al., J. Chromatogra-phy B. 732: 203-212, 1999)). Esta diferença é principalmente em virtude da solubilidadecomparativamente baixa e assim grandes volumes necessários para a maioria dos mAbsterapêuticos. Com boa solubilidade (> 150 mg/mL) e peso molecular comparativamente bai-xo (aptâmero: 10-50 kDa; anticorpo: 150 kDa), uma dose semanal de aptâmero pode serdistribuída por injeção em um volume menor que 0,5 mL. Além do mais, o tamanho pequenodos aptâmeros permite que eles penetrem nas áreas de constrições conformacionais quenão permitem que anticorpos ou fragmentos de anticorpo penetrem, apresentando aindauma outra vantagem de terapêuticos ou profilaxia a base de aptâmero.4) Graduação e custo. Aptâmeros terapêuticos são quimicamente sintetizados econsequentemente podem ser prontamente graduados conforme necessário para atingir ademanda de produção. Embora dificuldades na produção de graduação sejam atualmentelimitantes da disponibilidade de alguns biológicos e o custo capital de uma fábrica de produ-ção de proteína em grande escala seja enorme, um único sintetizador de oligonucleotídeoem grande escala pode produzir acima de 100 kg/ano e requer um investimento inicial relati-vamente modesto. O custo atual de bens para síntese de aptâmero na escala de quilogra-mas é estimado em $500/g, comparável ao para anticorpos altamente otimizados. Espera-seque melhorias contínuas no desenvolvimento do processo abaixem o custo de bens para <$100/g em cinco anos.
5) Estabilidade. Aptâmeros terapêuticos são quimicamente robustos. Eles são in-trinsecamente adaptados para recuperar atividade depois da exposição a fatores, tais comocalor e desnaturantes e podem ser armazenados por períodos prolongados (> 1 ano) emtemperatura ambiente como pós liofilizados. Ao contrário, anticorpos devem ser armazena-dos refrigerados.
Sistema complemento. O sistema complemento compreende um conjunto de pelomenos 20-30 proteínas de plasma e membrana que agem juntas em um sistema de cascataregulado para atacar formas extracelulares de patógenos (por exemplo, bactérias). O siste-ma complemento inclui três cascatas de ativação enzimáticas distintas, a clássica, Iectina ecaminhos alternativos (Figura 1) que convergem em ativação de C5 e resultam em um cami-nho não enzimático conhecido como o caminho de ataque da membrana.
A primeira cascata ativada enzimaticamente, conhecida como o caminho clássico,compreende vários componentes, C1, C4, C2, C3 e C5 (listados por ordem no caminho). Ainiciação do caminho clássico do sistema complemento ocorre depois da ligação e ativaçãodo primeiro componente do complemento (C1) tanto por ativadores imunes quanto nãoimunes. C1 compreende um complexo dependente de cálcio de componentes C1q, C1r eC1s, e é ativado por meio da ligação do componente C1q. C1q contém seis subunidades idênti-cas e cada subunidade compreende três cadeias (as cadeias A, B e C). Cada cadeia tem umaregião de cabeça glubular que é conectada a uma cauda tipo colágeno. A ligação e ativação deC1q por complexos antígeno-anticorpo ocorrem por meio da região do grupo da cabeça C1q. I-números ativadores C1q não anticorpo, incluindo proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, se ligam eativam C1q por meio de um sítio distinto na região de stalk tipo colágeno. O reconhecimento mo-lecular dos ativadores do complemento por C1q induz uma mudança na conformação que estimu-la a autoativação da proenzima C1r que, por sua vez, catalisa a ativação proteolítica de C1s. Csentão catalisa a ativação de componente dos complementos C4 e C2, formando o complexoC4bC2a que funciona como um C3 convertase.
A segunda cascata ativada enzimaticamente, conhecida como o caminho de lecitina, é si-milar à primeira, exeto que o complexo MBL/MASP-2 toma o lugar do C1. Lecitina que se liga amannan (MBL) diretamente reconhece polissacarídeos contendo manose nas superfícies de bac-térias e é estrutural e funcionalmente homóloga ao componente C1q de Cl. A ligação de MBL aoativador induz a ativação de protease 2 associada a MBL (MASP-2). MASP-2, por sua vez, catali-sa a ativação de C4 e C2 de uma maneira homóloga à função de C1s, levando à formação de C3convertase.
A terceira cascata ativada enzimaticamente, conhecida como o caminho alternativo, éuma via rápida, independente do anticorpo para ativação e amplificação do sistema complemento.O caminho alternativo compreende vários componentes, C3, Fator B, e Fator D (listados em or-dem no caminho). A ativação do caminho alternativo ocorre quando C3b, uma forma de clivagemproteolítica de C3, é ligada a um agente de superfície de ativação, tal como uma bactéria. O fator Bé então ligado ao C3b, e clivado pelo fator D para produzir a C3 convertase C3bBb. A amplificaçãoda atividade de C3 convertase ocorre uma vez que C3b adicional é produzida e depositada. Aresposta de amplificação é adicionalmente auxiliada pela ligação da properdina (P) proteína regu-Iadora positiva, que estabiliza a convertase ativa contra a degradação, estendendo sua meia-vidade 1-2 minutos para 18 minutos.
Assim, todos os três caminhos produzem C3 convertases que divide o fator C3 em C3a eC3b. Neste ponto, ambas as C3 convertases (clássica/lectina e alternativa) adicionalmente reú-nem em C5 convertases (C4b2a3b e C3b3bBb). Estes complexos subseqüentemente clivamcomponente do complemento C5 em dois componentes: o C5a polipeptídeo (9 kDa) e o C5b poli-peptídeo (170 kDa). O C5a polipeptídeo se liga a um receptor acoplado a proteína G detransmembrana 7, que foi originalmente associado aos leucócitos e é agora conhecido paraser expresso em uma variedade de tecidos incluindo hepatócitos e neurônios. A moléculaC5a é o componente quimiotático principal do sistema complemento humano e pode dispararuma variedade de respostas biológicas incluindo quimiotaxia de leucócito, contração demúsculo liso, ativação de caminhos de transdução de sinal intracelular, adesão neutrófilo-endotelial, citocina e liberação de mediador de lipídeo e formação de oxidante.
O maior fragmento de C5b se liga seqüencialmente aos últimos componentes dacascata do complemento, C6, C7, C8 e C9 para formar o Complexo de ataque à membranaC5b-9 ("MAC"). O MAC C5b-9 pode diretamente Iisar eritrócitos e, em maiores quantidades,ele é lítico para leucócitos e danoso aos tecidos, tais como músculos, células epiteliais e en-doteliais. Em quantidades sublíticas, o MAC pode estimular sobre-regulação de moléculas deadesão, aumento de cálcio intracelular e liberação de citocina. Além do mais, o MAC C5b-9pode estimular células, tais como células endoteliais e placatas sem causar Iise celular. Osefeitos não líticos de C5a e o C5b-9 MAC são algumas vezes muito similares.
Embora o sistema complemento tenha um importante papel na manutenção da saúde,ele tem potencial para causar ou contribuir para a doença. Por exemplo, o sistema comple-mento está envolvido em efeitos colaterais relacionados à cirurgia de enxerto de bypass daartéria coronária ("CABG"), inúmeras doenças e/ou condições renais, reumatológicas, neu-rológicas, dermatológicas, hematológicas, vascular/pulmonar, alergias, infecciosas e bio-compatibilidade/choque. O sistema complemento não é necessariamente a única causa deum estado de doença, mas pode ser um de vários fatores que contribuem para a patogênese.
Recentemente, dados sugerem que o complemento também está envolvido na do-ença ocular. Desta maneira, seria benéfico ter inibidores inéditos do sistema complementopara uso como terapêuticos e diagnósticos no tratamento de desordens oculares relaciona-das ao complemento.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
Figura 1 é uma ilustração que descreve o caminhos clássico e alternativo do sistema com-plemento.
Figura 2 é uma representação esquemática do processo de seleção de aptâmero in vitro(SELEX) dos conjuntos de seqüência aleatória de oligonucleotídeos.
Figura 3A é uma ilustração que descreve a seqüência de nucleotídeos e estrutura secun-dária de um aptâmero anti-C5 (SEQ ID NO: 1), em que os resíduos sublinhados são tanto resí-duos de 2'-E pirimidina quanto ou resíduos de 2-flúor pirimidina, os resíduos encaixotados sãotanto resíduos de 2'-flúor pirimidina quanto resíduos de 2'-OMe pirimidina e os resíduos indicadospor uma seta ( 4 ) representam resíduos que devem conter uma modificação 2-flúor.
Figura 3B é uma ilustração que descreve a seqüência de nucleotídeos e estrutura se-cundária do aptâmero anti-C5 ARC330 (SEQ ID NO: 2), em que os resíduos circulados são resí-duos 2'-H, os resíduos de pirimidina são 2-flúor substituídos e a maioria dos resíduos de purina é2'-OMe substituído, exceto para os três resíduos de Z-OH purina apresentados no esquema.
Figura 30 é uma ilustração que descreve a seqüência de nucleotídeos e estrutura secun-dária do aptâmero anti-C5 ARC186 (SEQ ID NO: 4) em que todos os 21 resíduos de pirimidinatêm modificações 2'-flúor e a m.aioria das purinas (14 resíduos) têm modificações 2'-OMe, exce-topara os três resíduos de 2-OH purina apresentados no esboço.
Figura 4 é uma ilustração de um PEG ramificado 40 kD (1,3-bis(mEEG-[20 kDa])-propil-20 2-(4'-butamida).
Figura 5 é uma ilustração de um PEG ramificado 40 kD (1,3-bis(n1PEG-[20 kDa]) propil-2-(4'-butamida) anexado à extremidade 5' de um aptâmero.
Figura 6 é uma ilustração que descreve várias estratégias para a síntese de conjugados dePEG-ácido nucléico de alto peso molecular.
Figura 7A é um gráfico que compara inibição dependente da dose de hemólise por ap-tâmeros anti-C5 PEGuiIados (ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62), e ARC187(SEQ ID NO: 5)), a um aptâmero anti-C5 não PEGuiIado (ARC7.86 (SEQ ID NO: 4)); Figura 7B éuma tabela dos valores IC5D dos aptâmeros usados no ensaio de hemólise apresentado na figura7Α; Figura 7C é um gráfico que compara inibição dependente da dose da hemólise por aptâmerosanti-C5 PEGuiIados ARC187 (SEQ ID NO: 5), ARC1537 (SEQ ID NO: 65), ARC1730 (SEQ IDNO: 66), e ARC1905 (SEQ M NO: 67); Figura 7D é uma tabela dos valores 1C50 dos aptâmerosusados no ensaio de hemólise apresentado na figura 7C.
Figura 8 é um gráfico de porcentagem de inibição de hemólise pelo aptâmero anti-C5,ARC658 (SEQ ID NO: 62), de complemento do soro de cinomólogo em função do complementodo soro humano.
Figura 9 é um gráfico que apresenta a ligação de ARC186 (SEQ ID NO: 4) a proteína C5purificada tanto a 37 0C quanto a temperatura ambiente (23 °C) depois de uma incubação de 15minutos.
Figura 10 é um outro gráfico que apresenta a ligação de C186 (SEQ ID NO: 4) a proteínaC5 purificada tanto a 37 0C quanto a temperatura ambiente (23 0C) depois de uma incubação de 4horas.
Figura 11 é um gráfico que mostra um curso de tempo de dissociação de um complexoC5-ARC186 a 23 °C.
Figura 12 é um gráfico que mostra um curso de tempo de equilíbrio na formação de umcomplexo C5-ARC186 a 23 °C.
Figura 13 é um gráfico que apresenta ARC 186 (SEQ 1D NO: 4) que se liga à proteína C5em função dos componentes da proteína a montante e a jusante na cascata do complemento.
Figura 14 é um gráfico que apresenta a porcentagem de ARC186 radiomarcado (SEQ IDNO: 4) que liga C5 na presença de ARC186 competidor não marcado (SEQ ID NO: 4), ARC657(SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) ou ARC187 (SEQ ID NO: 5).
Figura 15 é um gráfico que apresenta a quantidade de proteína do complemento C5 pro-duzida nas amostras de sangue incubadas por 5 horas a 25 0C e 37 0C na presença de concentra-ções variadas do aptâmero ARC186 (SEQ ID NO: 4).
Figura 16 é um gráfico que apresenta porcentagem de inibição do complemento porARC187 (SEQ ZD NO: 5) na presença de zymosan em soro humano não diluído, sangue totalhumano com citrato ou soro de cinomólogo.
Figura 17 é um gráfico que mostra ARC658 (SEQ ID NO: 62) completamente inibe a ati-vação do complemento (C5a) no modelo de laço de tubo descrito no exemplo 1 D.
Figura 18 é um gráfico que apresenta as constantes de dissociação para a rodada 10dos conjuntos de seleção de C5. Constantes de dissociação (KdS) foram estimadas ajustando osdados para a equação: fração de RNA ligado = amplitude*^^ + [C5]). "ARC520" (SEQ ID NO:70) refere-se ao grupo dRmY não selecionado naive e o" +" indica a presença de competidor (0,1mg/mL de RNAt, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão).
Figura 19 é um gráfico que apresenta C5 curvas de constante de dissociação de clone.Constantes de dissociação (FCdS) foram estimadas ajustando os dados para a equação: amplitu-de ligada ao RNA de fração*ICd/(IQ + [CS]).
Figura 20 é um gráfico que apresenta uma curva de IC50 que ilustra o efeito inibitório on a-tividade de hemólise de concentrações variadas do clone do anti-aptâmero C5 ARC913 (SEQ IDNO: 75) comparado ao ARC186 (SEQ ID NO: 4).
Figura 21 é uma ilustração que descreve a estrutura de C187 (SEQ ID NO: 5).
Figura 22 é uma ilustração que descreve a estrutura de ARC1905 (SEQ ID NO: 67).
Figura 23 é uma tabela que esboça o projeto experimental do primeiro estudo do co-ração perfundido isolado.
Figura 24 é um gráfico que compara a linha de pressão para a pressão intraventricular noventrículo esquerdo (LV) de um coração isolado exposto a plasma humano (A) com as linhas depressão de LVP de um coração isolado exposto à solução de aptâmero de controle (B).
Figura 25 é um gráfico que compara as linhas de pressão à pressão intraventricular noventrículo esquerdo (LV) do coração isolado exposto ao equivalente molar, soluções de 10X e 50Xaptâmero/C5 (onde uma concentração de aproximadamente 500 nM é adotada para C5em plas-ma humano normal, não diluído).
Figura 26 é um gráfico que compara as mudanças na taxa cardíaca em batimentos porminuto (bpm) em corações de camundongo isolados depois da exposição ao plasma humano evárias soluções de plasma/aptâmero.
Figura 27 é um gráfico que compara as mudanças no peso do coração em corações decamundongo isolados antes e depois da exposição ao plasma humano contendo 0,1X derazão molar ARC186 (SEQ ID NO: 4) (corações que falharam), ou 10-50X razão molar (coraçõesprotegidos com aptâmero C5).
Figura 28 é um gráfico que compara a produção de C5 relativa no plasma humano,contendo concentrações variadas de aptâmero, depois de perfusão através dos corações decamundongo isolados. Concentrações de C5a relativas são dispostas em gráfico como unida-des de absorbância (Abs), onde maiores leituras refletem a presença de maiores níveis deC5a.
Figura 29 é um gráfico que compara a produção de C5b-9 solúvel relativa no plas-ma humano contendo concentrações variadas de aptâmero, depois da perfusão através doscorações de camundongo isolados.
Figura 30 é um gráfico que mostra o efeito de ARC186 (SEQ ID NO: 4) na clivagemde C3 no efluente do coração de camundongos.
Figura 31 é uma tabela que mostra os resultados de coloração imunoistoquímica para oestudo do coração de camundongo perfundido isolado.
Figura 32 é uma tabela que mostra a razão molar de ARC658 (SEQ ID NO: 62) ne-cessária, em soro humano ou primata, para proteger o coração do dano mediado por C5b.
Figura 33 é um gráfico que mostra um gráfico Iog-Iinear da porcentagem restantede ARC186 de cadeia completa como uma função do tempo de incubação no plasma tantode rato quanto de macacos cinomólogos.
Figura 34 é uma tabela que mostra o projeto experimental do estudo farmacocinéticoconduzido em ratos Sprague-Dawley da forma descrita no exemplo 5.
Figura 35 é uma tabela que mostra concentração plasmática média de C657 (SEQID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) ou ARC187 (SEQ ID NO: 5) em função do tempo emratos Spraguc-Dawley.
Figura 36 é um gráfico que apresenta concentração plasmática média de ARC657(SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187 (SEQ ID NO: 5) sobre o tempo de-pois da administração intravenosa de aptâmero em ratos.
Figura 37 é uma tabela que mostra a análise não compartmental dos dados de con-centração em função do tempo apresentados nas figuras 35 e 36.
Figura 38A é uma tabela que mostra o projeto para o estudo farmacocinético deARC187 (SEQ ID NO: 5) e ARC1905 (SEQ ID NO: 67) em camundongos; Figura 38B é umgráfico que apresenta o perfil farmacocinético de ARC187 (SEQ IA NO: 5) e ARC1905 (SEQID NO: 67) em camundongos CD-1 depois de uma única administração em bolo IV; Figura38C é uma tabela que mostra a análise não compartmental dos dados de concentração em funçãodo tempo apresentados na figura 38B.
Figura 39 é uma tabela que mostra detecção dos aptâmeros listados no tecido cardíaco docamundongo depois da administração intravenosa.
Figura 40 é uma tabela que mostra o projeto experimental do estudo animal 1, descrito noexemplo 5E.
Figura 41 é uma tabela que mostra concentração plasmática de aptâmero em função dotempo depois da administração de bolo intravenoso de aptâmero a macacos cinomólogos.
Figura 42 é uma tabela que lista os parâmetros farmacocinéticos para ARC657 (SEQ IDNO: 10 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARCI87 (SEQ ID NO: 5) administrados intravenosamentea macaco cinomólogo no estudo 1.
Figuras 43(a) e 43(c) são gráficos que apresentam concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a sobre o tempo depois da administração intravenosa do aptâmeros anti-C5 ARC657 (SEQID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC187 (SEQ ID NO: 5) a macacos cinomólogos; Fi-guras 43(b) e 43(d) são gráficos que apresentam concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a emfunção de concentração de aptâmeros anti-C5, ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO:62), ou ARC187 (SEQ ID NO: 5).
Figura 44 é uma tabela que mostra o projeto experimental do estudo 2, descrito no exem-pio 5F.
Figura 45 é um gráfico que mostra a concentração plasmática média de aptâmero emvários pontos de tempo depois da administração intravenosa de AR.C658 (SEQ ID NO: 62), ouARC187 (SEQ ID NO: 5) a macacos cinomólogos.
Figura 46 é uma tabela que mostra as duas análises compartmentais dos dados de con-centração em função do tempo depois da administração de aptâmero de bolo intravenoso a macacocinomólogo.
Figura 47 é um gráfico que apresenta concentração de CSb-9 em função de concentra-ção ARCI87 (SEQ ID NO: 5) ou ARC658 (SEQ.ID NO: 62) na presença de zymosan em plasmade cinomólogo.
Figura 48 é um gráfico que apresenta concentração de C5a em função de concentraçãode ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou A12C658 (SEQ ID NO: 62) na presença de zyrnosan em plasmade cinomólogo.
Figura 49 é uma tabela que resume o estudo PK-PD de ARC187 (SEQ 1 NO: 5) durantee depois administração de bolo IV mais infusão a macacos cinomólogos.
Figura 50 é uma tabela que resume os parâmetros farmacocinéticos para ARC187 (SEQID NO: 5) em macacos cinomólogos depois da administração de bolo IV.
Figura 51 é um gráfico que apresenta o perfil farmacocinético medido calculado e real deC187 (SEQ ID NO: 5) durante e depois administração de bolo IV mais infusão a macacos cinomó-logos.
Figura 52 é um gráfico que mostra que os níveis plasmáticos de ARC187 ativo (SEQ IDNO: 5) permanecem constantes durante e depois da administração de bolo IV mais infusão a ma-cacos cinomólogos.
Figura 53 é uma tabela que mostra as necessidades de dosagem humana prevista paraaptâmeros anti-C5 em cirurgia CABG.
Figura 54 é um gráfico que mostra que ARC187 (SEQ I NO: 5) não tem relativamentenenhum efeito in vitro na coagulação medido pelo tempo de protrombina (PT) e tempo de trom-boplastina parcial ativada (APTT).
Figura 55 é uma tabela que resume os efeitos in vitro de C187 (SEQ ID NO: 5) na ativi-dade anticoagulante de heparina, e atividade pró-coagulante de protamina.
Figura 56 é um gráfico que mostra que ARC187 (SEQ ID NO: 5) não afeta a reversãoda anticoagulação da heparina in vivo.
Figura 57 um é gráfico que mostra que heparina e protaxmina ambas não têm nenhum e-feito na função anti-complemento do ARC187 (SEQ ID NO: 5), medida inibindo a ativação docomplemento de zymosan.
Figura 58 é um gráfico que apresenta a porcentagem de inibição de hemólise de eritrócitode ovelha na presença de soro humano como uma função de concentração de aptâmeros anti-C5ARC1905 (SEQ ID NO: 67) ou ARC672 (SEQ ID NO: 63).
Figura 59A é um gráfico que apresenta a porcentagem de inibição de hemólise na pre-sença de soro humano, macaco cinomólogo e rato por ARC1905 (SEQ ID NO: 67); Figura 59B éuma tabela que resume os valores de IC50 médios para inibição de ativação do complemento nosoro humano, macaco cinomólogo e rato por C1905, um aptâmero anti-C5 ou ARC127, umaptâmero irrelevante que não se liga a C5 (controle negativo).
Figura 60 é um gráfico que apresenta o valor IC50 para inibição de ARC186 radio-marcado (SEQ ID NO: 4) (eixo vertical) como uma função de concentração de competidornão marcado ARC1905 (SEQ ID NO: 67) ou ARC672 (SEQ ID NO: 63) (eixo horizontal), emum ensaio de ligação de competição.
Figura 61 é um gráfico que apresenta o valor IC50 para inibição de ARC186 radio-marcado (SEQ ID NO: 4) (eixo vertical) como uma função de concentração de competidornão marcado ARC1905 (SEQ ID NO: 67) (eixo horizontal) a 37 0C e 25T em um ensaio deligação de competição.
Figura 62 é um gráfico que apresenta curvas padrão para C5a de humano (hC5a) eC5a de de macaco cinomólogo (hC5a cy).
Figura 63 é uma tabela que resume os valores de IC50, IC90 e IC99 para inibição deativação de C5 em soro de humano e de macaco cinomólogo por ARC1905 (SEQ ID NO:67), medida em um ensaio de ativação do complemento induzido por zymosan.
Figura 64 é um gráfico que apresenta a porcentagem de inibição de geração de C5acomo uma função de concentração de ARC1905 (SEQ ID NO: 67) em soros humanos e ma-cacos cinomólogos medida em um ensaio de ativação do complemento induzido por zymo-san.
Figura 65 é um gráfico que apresenta o efeito de ARCI905 (SEQ II) NO: 67) na ge-ração de C3a em soro de humano e de macaco cinomólogo, medido em um ensaio de ati-vação do complemento induzido por zymosan
Figura 66 é uma tabela que resume os valores de IC50, IC90 e IC99 médios para inibi-ção por ARC1905 da ativação do complemento (SEQ ID NO: 67) em soro humano de 5 doa-dores, medidos em um modelo de laço de tubo de ativação do complemento.
Figura 67 é um gráfico que apresenta a porcentagem de inibição de geração de C5ae C3a como uma função de concentração de ACRC1905, um aptâmero anti-C5, ou ARC127,um aptâmero irrelevante que não se liga a C5 (controle negativo) em um modelo de laço detubo de ativação do complemento.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece materiais e métodos para o tratamento, prevenção e/ouestabilização de doença ocular relacionada ao complemento (também referida aqui comodesordens oculares). Em algumas modalidades da invenção, um aptâmero anticomplementomodula uma função de um componente do complemento ou uma variante deste. Em modali-dades particularmente preferidas, um aptâmero anticomplemento inibe ou diminui uma funçãodo componente do complemento ou uma variante deste, preferivelmente in vivo, preferível-mente em um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente in vivo emhumanos. Em algumas modalidades da invenção, por exemplo onde C2, C3, C4, C5 e/ouFator B é o complemento alvo, a função modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero éclivagem de proteína do complemento. Em algumas modalidades da invenção, por exemploonde C2b, C5b, C6, C7, C8, C9, Fator B e/ou properdina é o complemento alvo, a funçãomodulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é reunião de um componente ativo do agre-gado do complemento, tais como uma convertase ou o complexo de ataque à membrana. Emalgumas modalidades da invenção, por exemplo onde C3b, Fator D, C1 (incluindo C1r e/ouC1s) e/ou um Protease de serina associada à manose ("HASP") é o complemento alvo, afunção modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é atividade enzimática. Em algu-mas modalidades da invenção, por exemplo onde receptor C3a, C5a, C3a receptor ou C5a éo complemento alvo, a função modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é ligaçãoligante/receptor.
Em uma modalidade, um método de estabilizar, tratar e/ou prevenir uma desordemocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9, o método compreendendo a etapa de administrarum agente anti-C5 a um sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente paraestabilizar, tratar e/ou prevenir a desordem ocular é fornecido. Em algumas modalidades, adesordem ocular a ser estabilizada, tratada e/ou prevenida é uma desordem de neurovascu-larização ocular. Em algumas modalidades, a desordem ocular a ser estabilizada, tratadae/ou prevenida é retinopatia diabética ou degeneração macular, particularmente degenera-ção macular relacionada à idade ("AMD). Em algumas modalidades, a AMD a ser estabiliza-da, tratada e/ou prevenida é AMID tipo exudativa. Em algumas modalidades, a AMD a serestabilizada, tratada e/ou prevenida é tipo não exudativa.
Em algumas modalidades, um método de estabilizar, tratar e/ou prevenir uma desor-dem ocular mediada pelo complemento, o método compreendendo a etapa de administraruma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero anticomplemento a um sujeito emnecessidade deste é fornecido. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamenteefetiva do aptâmero anti-complemento é uma quantidade suficiente para estabilizar, tratar e/ouprevenir a desordem ocular. Em algumas modalidades da invenção, o sujeito é um vertebrado,em algumas modalidades um mamífero e em algumas modalidades um humano. Em algumasmodalidades, a desordem ocular mediada pelo complemento a ser estabilizada, tratada e/ouprevenida é uma desordem ocular aguda ou crônica mediada por inflamação e/ou imune. Emalgumas modalidades, a desordem ocular mediada pelo complemento a ser tratado, prevenidoe/ou estabilizado é selecionado do grupo que consiste em: conjuntivite inflamatória, incluindoconjuntivite alérgica e papilar gigante, edema macular, uveíte, endoftalmite, esclerite, úlcerascorneais, síndrome do olho seco, glaucoma, doença retinal isquêmica, rejeição de transplantede córnea, complicações relacionadas a cirurgia intraocular, tais como implante de lentes in-traoculares e inflamação associada à cirurgia de catarata, doença de Behcet, doença de Star-gardt, vasculite do complexo imune, doença de Fuch1 doença de Vogt-Koyanagi-Ha1fibrose sub-retinal, queratite, inflamação cítreo-retinal, infestação/migração parasítica ocular,retinite pigmentosa, retinite de citomegalovírus e inflamação coroidal. Em algumas modalida-des, a desordem ocular a ser estabilizada, tratada e/ou prevenida é degeneração macular,particularmente degeneração macular relacionada à idade ("AMID"). Em algumas modalida-des, a desordem ocular a ser estabilizada, tratada e/ou prevenida é não AMD tipo exudativa("seca" e/ou "atrófica"). Em algumas modalidades, a desordem ocular a ser estabilizada, trata-da e/ou prevenida é uma desordem de neurovascularização ocular, tais como retinopatia diabé-tica ou AMD tipo exudativa ("úmida").
Em algumas modalidades, um método de estabilizar uma desordem de neurovascu-larização ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9, particularmente AMD tipo exudativa ou reti-nopatia diabética, compreendendo administrar um agente anti-C5 a um sujeito em necessida-de deste em uma quantidade suficiente para estabilizar a desordem de neurovascularizaçãoocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9 é fornecido. Em algumas modalidades, o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente para manter pelo menos o mesmo nível deacuidade visual do sujeito comparado ao nível e acuidade visual do sujeito mediante a admi-nistração do agente anti-C5. Em algumas modalidades, o agente anti-C5 é administrado emuma quantidade suficiente para manter cerca do mesmo nível de densidade do vaso retinal dosujeito que do sujeito mediante administração do agente anti-C5.
Em algumas modalidades, um método de estabilizar uma desordem de neurovascu-larização ocular mediada pelo complemento, particularmente AMD tipo exudativa ou retinopa-tia diabética, compreendendo administrar um aptâmero anticomplemento a um sujeito em ne-cessidade deste em uma quantidade suficiente para estabilizar desordem de neurovasculariza-ção ocular mediada pelo complemento, é fornecido. Em algumas modalidades, o aptâmeroanticomplemento é administrado em uma quantidade suficiente para manter pelo menos omesmo nível de acuidade visual do sujeito comparado ao nível e acuidade visual do sujeito me-diante a administração do aptâmero anticomplemento. Em algumas modalidades, o aptâmeroanticomplemento é administrado em uma quantidade suficiente para manter cerca do mesmonível de densidade do vaso retinal do sujeito que o do sujeito mediante administração do ap-tâmero anticomplemento. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento é adminis-trado em uma quantidade suficiente para estabilizar ou manter o nível de sangramento asso-ciado à neurovascularização, acúmulo de fluido, desligamento e/ou cicatrização retinal no su-jeito com relação ao nível de sangramento associado à neurovascularização do sujeito, acúmu-lo de fluido, desligamento e/ou cicatrização retinal mediante a administração do aptâmero anti-complemento.
Em algumas modalidades, um método de tratar uma desordem de neurovasculariza-ção ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9, particularmente AMD tipo exudativa ou retinopa-tia diabética, compreendendo administrar um agente antí-C5 a um sujeito em necessidadedeste em uma quantidade suficiente para reduzir um sintoma da desordem de neurovasculari-zação ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9. Em algumas modalidades o agente anti-C5 éadministrado em uma quantidade suficiente para melhorar o nível de acuidade visual no su-jeito com relação ao nível de acuidade visual do sujeito mediante administração do agenteanti-C5. Em algumas modalidades, o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade sufici-ente para reduzir o nível de densidade do vaso retinal no sujeito com relação ao nível de den-sidade do vaso retinal do sujeito mediante administração do agente anti-C5.
Em algumas modalidades, um método de tratar uma desordem de neurovasculariza-ção ocular mediada pelo complemento, particularmente AMD exudativa ou retinopatia diabéti-ca, compreendendo administrar um aptâmero anticomplemento a um sujeito em necessidadedeste em uma quantidade suficiente para reduzir um sintoma da desordem de neurovasculari-zação ocular mediada pelo complemento é fornecido. Em algumas modalidades o aptâmeroanticomplemento é administrado em uma quantidade suficiente para melhorar o nível de acui-dade visual no sujeito com relação ao nível de acuidade visual do sujeito mediante administra-ção do aptâmero anticomplemento. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento éadministrado em uma quantidade suficiente para reduzir o nível de densidade do vaso retinalno sujeito com relação ao nível de densidade do vaso retinal do sujeito mediante administra-ção do aptâmero anticomplemento. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplementoé administrado em uma quantidade suficiente para reduzir o nível de sangramento associa-do à neurovascularização, acúmulo de fluido, desligamento e/ou cicatrização retinal no sujei-to relativo ao nível de sangramento associado à neurovascularização do sujeito, acúmulo defluido, desligamento e/ou cicatrização retinal levei mediante a administração do aptâmeroanticomplemento. Em algumas modalidades, um método de prevenir uma desordem de neu-rovascularização ocular clínica mediada pelo complemento, particularmente AMD tipo exuda-tiva ou retinopatia diabética em um sujeito, o método compreendendo a etapa de adminis-trar o aptâmero anticomplemento ao sujeito em uma quantidade suficiente para prevenir umsintoma clínico da desordem de neurovascularização ocular mediada pelo complemento éfornecido. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento é administrado em umaquantidade suficiente para prevenir a perda clínica de acuidade visual no sujeito. Em algumasmodalidades, o aptâmero anticomplemento é administrado em uma quantidade suficientepara prevenir um nível de densidade do vaso retinal no sujeito correlativo a doença neurovas-cular ocular clínica. Em algumas modalidades, o sujeito está em risco de desenvolver a de-sordem de neurovascularização ocular. Em algumas modalidades, o método adicionalmen-te compreende identificar um sujeito em risco de desenvolver uma desordem de neurovascu-larização ocular mediada pelo complemento antes da administração do aptâmero anticomple-mento. Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreende detectar a presençade mudanças de pigmentação gânglios e/ou retinal no sujeito e não detectar nenhuma perdaclínica de acuidade visual. Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreendedetectar uma variação no fator H do complemento do sujeito relativa a fator H tipo selvagem.
A seqüência de aminoácidos do fator H tipo selvagem é reportada em Ripoche et al (1988)The complete aminoácido sequence of human complement factor H. Biochem. J. 249, 593-602. Em algumas modalidades, onde um método de estabilizar, tratar e/ou prevenir umaneovascular desordem ocular mediada pelo complemento em um sujeito é fornecido, parti-cularmente retinopatia diabética, a via de administração do aptâmero anticomplemento éadministração ocular ou peri-ocular.
Em algumas modalidades, um método de prevenir uma desordem de neurovascula-rização ocular clínica mediada por C5, C5a e/ou C5b-9, particularmente AMD tipo exudativaou retinopatia diabética em um sujeito compreendendo administrar um agente anti-C5 a umsujeito, o método compreendendo a etapa de administrar o agente anti-C5 ao sujeito em umaquantidade suficiente para prevenir um sintoma clínico da desordem de neurovascularizaçãoocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9 é fornecido. Em algumas modalidades, o agenteanti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente par aprevenir a perda clínica de acui-dade visual no sujeito. Em algumas modalidades, o agente anti-C5 é administrado em umaquantidade suficiente para prevenir um nível de densidade do vaso retinal no sujeito correlati-vo à doença neurovascular ocular clínica. Em algumas modalidaes, o sujeito está em riscode desenvolver a desordem de neurovascularização ocular. Em algumas modalidades, ométodo adicionalmente compreende identificar um sujeito em risco de desenvolver uma de-sordem de neurovascularização ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9 antes da adminis-tração do agente anti-C5. Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreendedetectar a presença de gânglios no sujeito e não detectar nenhuma perda clínica de acuida-de visual. Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreende detectar umavariação no fator H do complemento do sujeito.
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o método adicional-mente compreende a etapa de administrar ao sujeito um agente anti-VEGF, particularmenteum agente anti-VEGE selecionado do grupo que consiste em: uma molécula de ácido nu-cléico, um aptâmero, uma molécula antisentido, uma molécula de RNAi, uma proteína, umpeptídeo, um peptídeo cíclico, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um po-límero, e uma molécula pequena.
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o método adicio-nalmente compreende a etapa de administrar ao sujeito um agente anti-PDGF, particularmen-te um agente anti-PDGF é selecionado do grupo que consiste em: uma molécula de ácidonucléico, um aptâmero, uma molécula antisentido, uma molécula de RNAi, uma proteína, umpeptídeo, um peptídeo cíclico, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um po-límero, e uma molécula pequena.
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o método adicio-nalmente compreende administrar um agente anti-vascular ao sujeito. Em algumas modalida-des, o agente anti-vascular é um derivado de porfirina. Em algumas modalidades o derivadode porfirina, é verteporfina para injeção (Visudyne®, Novartis Pharmaceuticals Corporation,East Hanover1 N)). Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende a eta-pa de ativar o derivado de porfirina com luz de laser.
Em uma modalidade, um método de estabilizar, tratar e/ou prevenir AMD tipo nãoexudativa mediada por C5, C5a e/ou C5b-9 compreendendo administrar um agente anti-C5 aum sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente para estabilizar, tratar e/ouprevenir a AMD tipo não exudativa é fornecido. Em uma modalidade em que a AMD tipo nãoexudativa é para ser estabilizada, o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade sufi-ciente para manter cerca do mesmo nível de gânglios comparado ao nível de gânglios dosujeito mediante a administração do agente anti-C5. Em uma modalidade em que o AMD tiponão exudativa é para ser estabilizada, o agente anti-C5 é administrado em uma quantidadesuficiente para manter cerca do same amount nível de acuidade visual no sujeito comparadoà acuidade visual do sujeito mediante a administração do agente anti-C5. Em uma modali-dade onde a AMD tipo não exudativa é para ser tratada, o agente anti-C5 é administrado emqualquer quantidade suficiente para reduzir o nível de gânglios comparado ao nível de gân-glios do sujeito na administração do agente anti-C5. Em uma modalidade onde a AMD tiponão exudativa é para ser tratada, o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade sufici-ente para melhorar a acuidade visual do sujeito comparada à acuidade visual do sujeito me-diante a administração do agente anti-C5. Em uma modalidade onde a AMD tipo não exudati-va é para ser prevenida, o método compreende administrar um agente anti-C5 a um sujeitoem necessidade deste em uma quantidade suficiente para prevenir um sintoma clínico daAMD não exudativa mediada por C5, C5a e/ou C5b-9. Em algumas modalidades, o agenteanti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente para prevenir a perda clínica de acui-dade visual no sujeito. Em algumas modalidades, o agente anti-C5 é administrado em umaquantidade para prevenir o acúmulo de um nível de gânglios clínico. Em algumas modalida-des, o sujeito está em risco de desenvolver AMD não exudativa. Em algumas modalidades,o método adicionalmente compreende identificar um sujeito em risco de desenvolver AMDnão exudativa mediada por C5, C5a e/ou C5b-9 antes da administração do agente anti-C5.Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreende detectar a presença degânglios no sujeito e não detectar nenhuma perda clínica de acuidade visual. Em algumasmodalidades, a etapa de identificação compreende detectar uma variação no fator H do com-plemento do sujeito.Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o agente anti-C5 éselecionado do grupo que consiste em: uma molécula de ácido nucléico, um aptâmero, umamolécula antisentido, uma molécula de RNAi1 uma proteína, um peptídeo, um peptídeo cícli-co, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um polímero, e uma molécula pe-quena. Em modalidade particular, o agente anti-C5 é um aptâmero específico de C5, maisparticularmente um aptâmero específico de C5 selecionado do grupo que consiste em SEQID NOs 1-67, 75-81 e 88-98. Em uma modalidade preferida, o aptâmero específico de C5para uso nos métodos descritos anteriormente é selecionado do grupo que consiste emARC187 (SEQ ID NO: 5) e C1905 (SEQ ID NO: 67).
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o agente anti-C5 édistribuído por administração ocular, particularmente por administração intravitreal. Em algu-mas modalidades dos métodos descritos anteriormente o agente anti-VEGF, o agente anti-PDGF e/ou o agente anti-vascular é distribuído por administração ocular. Em algumas modali-dades dos métodos descritos anteriormente, o agente anti-C5, o agente anti-VEGF, o agenteanti-PDGF e/ou o agente anti-vascular a ser administrado é um promedicamento. Em algumasmodalidades dos métodos descritos anteriormente, o sujeito é humano.
O termo "mediante administração do agente anti-C5" da forma usada nos métodosdescritos anteriormente engloba o tempo no qual o sintoma em questão foi clinicamente medi-do antes da administração do agente anti-C5.
Em uma modalidade, um método de estabilizar, tratar e/ou prevenir ADM tipo nãoexudativa mediada pelo complemento compreendendo administrar uma quantidade terapeuti-camente efetiva de um aptâmero anticomplemento a um sujeito em necessidade deste é for-necido. Em uma modalidade em que AMD tipo não exudativa é para ser estabilizada, o aptâ-mero anticomplemento é administrado em uma quantidade suficiente para manter cerca domesmo nível de gânglios (por exemplo tamanho, número, área e/ou morfologia) comparada aonível de gânglios do sujeito mediante a administração do aptâmero anticomplemento. Em umamodalidade em que AMD tipo não exudativa é para ser estabilizada, o aptâmero anticomple-mento é administrado em uma quantidade suficiente para estabilizar a progressão de atrofiageográfica, incluindo atrofia do epitélio do pigmento retinal, fotorreceptores e/ou capilares co-roidais, para manter cerca do mesmo nível de atrofia geográfica comparado ao nível do sujeitomediante a administração do aptâmero anticomplemento. Em uma modalidade em que a AMDtipo não exudativa é para ser estabilizada, o aptâmero anticomplemento é administrado emuma quantidade suficiente para manter cerca do mesmo nível de quantidade de acuidade visualno sujeito comparado à acuidade visual do sujeito mediante administração do aptâmero anti-complemento.
Em uma modalidade onde a AMD tipo não exudativa é para ser tratada, o aptâmeroanticomplemento é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir o nível de gân-glios, particularmente gânglios grande, macio, comparado ao nível de gânglios do sujeito medi-ante a administração do aptâmero anticomplemento. Em uma modalidade onde a AMD tiponão exudativa é para ser tratada, o aptâmero anticomplemento é administrado em uma quan-tidade suficiente para melhorar a acuidade visual do sujeito comparada à acuidade visual dosujeito mediante a administração do aptâmero anticomplemento.
Em uma modalidade onde a AMD tipo não exudativa é para ser prevenida, o métodocompreende administrar um aptâmero anticomplemento a um sujeito em necessidade deste emuma quantidade suficiente para prevenir um sintoma clínico da AMD não exudativa mediadapelo complemento. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento é administradoem uma quantidade suficiente para prevenir a perda clínica de acuidade visual no sujeito. Emalgumas modalidades, o aptâmero anticomplemento é administrado em uma quantidade sufici-ente para prevenir acúmulo de um nível clínico de gânglios, particularmente gânglios grandes,macios. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento é administrado em umaquantidade suficiente para prevenir um nível clínico de atrofia geográfica. Em algumas moda-lidades, o aptâmero anticomplemento é administrado a um sujeito com AMD tipo não exudati-va em uma quantidade suficiente para prevenir a progressão para AMD exudativa no sujeito.Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento é administrado a um sujeito commusculopatia relacionada à idade (caracterizada pela presença de gânglios, mudanças napigmentação da retina e/ou pequenas regiões de atrofia) em uma quantidade suficiente paraprevenir a progressão para AMD exudativa ou um nível clínico de atrofia geográfica no sujeito.
Em algumas modalidades, o sujeito está em risco de desenvolver AMD não exudati-va. Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende identificar um sujeito emrisco de desenvolver AMD não exudativa mediada pelo complemento antes da administraçãodo aptâmero anticomplemento. Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreen-de detectar a presença de gânglios, particularmente gânclios grandes, macios, mudanças napigmentação da retina e/ou regiões de atrofia no sujeito e não detectar nenhuma perda clínicade acuidade visual. Em algumas modalidades, a etapa de identificação compreende detectaruma variação no fator H do complemento do sujeito comparada ao tipo selvagem.
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o aptâmero anti-complemento inibe um complemento alvo selecionado do grupo que consiste em: um compo-nente do caminho do complemento clássico, um componente do caminho do complementoalternativo e um componente do caminho de lecitina. Em algumas modalidades, o aptâmeroanticomplemento inibes um complemento alvo no caminho que ataca a membrana. Em algu-mas modalidades, o aptâmero anticomplemento inibe um complemento alvo selecionado dogrupo que consiste em receptor de C1, C1q, C1r, C1s, C2, C3, C3a, C3a, receptor de C4,C5, C5a, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, Fator B, Fator D, properdina, lecitina que se liga a Man-nan (daqui em diante "MBL"), Protease 1 de serina associada à MBL ("HASP 1 ") e Protease 2de serina associada à MBL ("HASP 2"). Em algumas modalidades, o aptâmero anticomple-mento não é um aptâmero com afinidade e alta especificidade para um complemento alvoescolhido do grupo que consiste em: receptor de C3a, C3a, receptor de C5a, e C5a. Em al-gumas modalidades, o aptâmero anticomplemento não é um aptâmero com afinidade e altaespecificidade para um complemento alvo escolhido do grupo que consiste em: fator B e fator D.
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, o aptâmero anti-complemento é distribuído ao um sujeito por administração ocular, particularmente por admi-nistração intravitreal ou peri-ocular. Em algumas modalidades, o aptâmero anticomplemento aser administrado a um sujeito está compreendido em uma formulação de depósito.
O termo "mediante administração do aptâmero anticomplemento" da forma aqui usa-da engloba o tempo no qual o sintoma em questão foi clinicamente medido ou estimado o amedição ou estimação foi no tempo que varia de antes da administração do aptâmero anti-complemento até e incluindo medição logo depois da administração do aptâmero anticomple-mento, por exemplo até 12 horas depois, 24 horas depois ou 48 horas depois da administração.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica ocular compreendendouma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero anticomplemento, por exemplo,uma quantidade suficiente para estabilizar, tratar e/ou prevenir uma desordem ocular mediadapelo complemento é fornecida. A composição farmacêutica da invenção pode compreenderum veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto, a invenção fornece umacomposição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de umaptâmero que inibe uma função alvo do complemento ocular in vivo, particularmente em umsujeito humano, ou um sal deste e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Emalgumas modalidades, a composição farmacêutica ocular compreende uma formulação dedepósito.
Em uma modalidade, o aptâmero anticomplemento para uso nos métodos anterioresé um aptâmero que inibe C5 in vivo, preferivelmente C5 humano. Em uma modalidade parti-cular, um aptâmero anti-C5 de acordo com ARC186 (SEQ ID NO 4) ou um aptâmero compre-endendo uma seqüência de nucleotídeos de acordo com ARC186 (SEQ ID NO: 4) conjugadaa uma fração PEG para uso nos métodos anteriores é fornecido. Em modalidades particula-res, este conjugado aptâmero ARC186/PEG compreende substancialmente a mesma afini-dade de ligação para proteína do complemento C5 que um aptâmero qu consite na seqüên-cia de acordo com SEQ ID NO: 4, mas que não tem a fração PEG. Substancialmente amesma afinidade de ligação da forma aqui usada significa não mais que cerca de 2 a dezvezes de diferença, preferivelmente não mais que 2 a dez vezes de diferença em constantesde dissociação medidas por análise dot blot. Em algumas modalidades as constantes dedissociação foram medidas por análise dot blot de competição, da forma descrita no exem-plo IA a seguir. Em algumas modalidades, a fração polietileno glicol compreende um pesomolecular maior que 10 kDA, particularmente um peso molecular de 20 kDA, mais particu-larmente 30 kDa e mais particularmente 40 kDa. Em algumas modalidades, a fração PEG éconjugada à extremidade 5' de ARC186 (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades o conju-gado aptâmero/PEG compreende uma meia-vida, preferivelmente a meia-vida terminal emum modelo de dois compartimentos determinada pelo método descrito no exemplo 5E a se-guir, de pelo menos 15 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, mais preferivelmentepelo menos 48 horas em primatas. Em algumas modalidades o conjugado aptâmero/PEGcompreende uma meia-vida, preferivelmente oa meia-vida terminal em um modelo de doiscompartimentos, de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 horas em rato. Em algu-mas modalidades, o conjugado de PEG à extremidade 5' de ARC186 (SEQ ID NO: 4) é umPEG de 40 kDa. Em modalidades particulares o PEG de 40 kDa é um PEG ramificado. Emalgumas modalidades o PEG de 40 kDa ramificado é 1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4' bu-5 tamida). Em outras modalidades o PEG de 40 kDa ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20kDa]}propil-l-carbamoíla.
Em modalidades onde o PEG de 40 kDA ramificado é 1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'butamida) é fornecido um aptâmero com a estrutura apresentada a seguir:
kDa mPEG-NH-C-O-O
20 kDa mPEG-NH-C-O—1
9 H
-OCH2CH2CH2-C-N-S' Aptâmero 3'
onde,
""' indica um Iigante
Aptâmero =
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGíCCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4),
em que fC e fU = 2-flúor nucleotídeos, e mU e mA = nucleotídeos 2'-OMe e todos os ou-tros nucleotídeos são 2'-OH e 3T indica uma deoxi timidina invertida.
Em modalidades onde o PEG de 40 kDA ramificado é 2,3 bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbaxmoílaé fornecido um aptâmero com a estrutura apresentada a seguir:
<formula>formula see original document page 21</formula>
onde,.....indica um Iigante
Aptâmero =fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCiiiAmGmGfCC£UmG£CmG-3T (SEQ ID NO: 4),
em que fC e ID = 2'-flúor nucleotídeos, e mG e mA = nucleotídeos 2'-0Me e todos os ou-tros nucleotídeos são 2'-OH e 3T indica uma deóxi timidina invertida.
Em algumas modalidades deste aspecto da invenção o Iigante é um Iigante alquila.
Em modalidades particulares, o Iigante alquila compreende 2 a 18 grupos CH2 consecutivos.
Em modalidades preferidas, o Iigante alquila compreende 2 a 12 grupos CH2 consecutivos.
Em modalidades particularmente preferidas o Iigante alquila compreende 3 a 6 grupos CH2consecutivos.
Em uma modalidade particular um aptâmero, ARC187 (SEQ ID NO: 5), com a estru-tura apresentada a seguir é fornecido:
<formula>formula see original document page 22</formula>
onde Aptâmero =
<formula>formula see original document page 22</formula>
em que fC e fll= 2-flúor nucleotídeos, e mG e mA = nucleotídeos 2'-0Me e todos os outrosnucleotídeos são 2'-OH e onde 3T indica uma deóxi timidina invertida.
Em uma outra modalidade um aptâmero, ARC1905 (SEQ ID NO: 67), com a estrutu-ra apresentada a seguir é fornecido:
<formula>formula see original document page 22</formula>
onde Aptâmero =
<formula>formula see original document page 22</formula>
em que fC e fU 2'-flúor nucleotídeos, e mG e mA = nucleotídeos 2'-0Me e todos osoutros nucleotídeos são 2-OH e onde 3T indica deóxi timidina invertida.
Em uma modalidade, uma composição farmacêutica ocular compreendendo umaquantidade de ARC186 (SEQ ID NO 4), ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou 01905 (SEQ ID NO:67) ou um sal deste efetivo para tratar, estabilizar e/ou prevenir uma desordem ocular medi-ada pelo complemento em um sujeito é fornecida. A composição farmacêutica da invençãopode compreender um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto, ainvenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuti-camente efetiva de um aptâmero que inibe clivagem de proteína do complemento C5 in vivoou um sal deste e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto dainvenção uma composição farmacêutica de ARC186 (SEQ I NO 4), ARCI87 (SEQ ID NO: 5)ou C1905 (SEQ ID NO: 67) para uso no tratamento, estabilização e/ou prevenção de doençaocular in vivo é fornecida. Também, neste aspecto da invenção, ARC 186 (SEQ ID NO 4),ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) para uso na preparação de umacomposição farmacêutica para tratamento, estabilização e/ou prevenção de doença ocularmediada pelo complemento em um sujeito é fornecida.
Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica ocular da invenção compre-ende uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero anti-C5 compreendendouma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS 1 a 69,75, 76, 81, 91, 95 e 96 para uso na preparação de uma composição farmacêutica para usonos métodos de tratamento ocular mediados pelo complemento da invenção é fornecida. Nes-te aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quanti-dade terapeuticamente efetiva de um aptâmero que inibe clivagem de proteína do comple-mento C5 in vivo ou um sal deste e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Em um outro aspecto, a invenção fornece composições farmacêuticas. Em umamodalidade, uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamen-te efetiva de ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou ARCI905 (SEQ ID NO: 67) ou um sal deste é for-necida. A composição farmacêutica da invenção pode compreender um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável. Neste aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêu-tica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero que inibeclivagem de proteína do complemento C5 in vivo ou um sal deste e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável. Neste aspecto da invenção uma composição farmacêutica deARC187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) para uso no tratamento, prevençãoou alívio de doença in vivo é fornecida. Também, neste aspecto da invenção ARC187 (SEQID NO: 5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) para uso na preparação de uma composição far-macêutica são fornecidos.
Em um outro aspecto da invenção, métodos de tratamento são forne4cidos. Emuma modalidade, o método da invenção compreende tratar, prevenir ou aliviar uma doençamediada pela proteína do complemento C5, e/ou seus derivados C5a e C5b-9, o método in-cluindo administrar uma composição farmacêutica compreendendo ARC157 (SEQ ID NO: 5)ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) ou um sal deste a um vertebrado. Em algumas modalidades,o método compreende administrar a composição farmacêutica da invenção a um mamífero.Em algumas modalidades, o mamífero é um humano.
Em algumas modalidades, a proteína do complemento C5, doença mediada porC5a e/ou C-9 a ser tratada é doença isquêmica aguda (infarto do miocárdio, acidente vascu-lar, lesão isquêmica/reperfusão); doenças inflamatórias agudas (doença infecciosa, septice-mia, choque, rejeição a transplante agudo/hperagudo); doenças inflamatórias crônicas e/ouimuno mediadas incluindo retinopatia diabética, degeneração macular incluindo formas exu-dativa e não exudativa de AMD e também incluindo alergia, asma, artrite reumatóide, e ou-tras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase eoutras doenças dermatológicas, miastenia grave, Iupus eritematoso sistêmico (SLED; e do-ença inflamatória subaguda/crônica e/ou imuno mediada (incluindo rejeição à transplante,glomerulonefrite e outras doenças renais e doenças oculares. Em algumas modalidades, asdoenças mediadas pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a ser tratadas incluemativação do complemento associada à diálise ou circunstâncias em que o sangue passasobre e/ou através do tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas modalidades, adoença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é selecio-nada do grupo que consiste em lesão do miocárdio relacionada à cirurgia de CABG, lesãodo miocárdio relacionada à angioplastia com balão e lesão do miocárdio relacionada à reste-nose. Em algumas modalidades, desordem mediada pela proteína do complemento C5, C5ae/ou C5b-9 a ser tratada é selecionada do grupo que consiste em: lesão do miocárdio rela-cionada à cirurgia de CABG, lesão do miocárdio relacionada à angioplastia com balão, lesãodo miocárdio relacionada à restenose, complicações mediadas pela proteína do complementorelacionadas à cirurgia de CABG, complicações mediadas pela proteína do complemento rela-cionadas à intervenção coronária percutânea, hemoglubinúria noturna paroxissomal, rejeição à transplante aguda, rejeição à transplante hiperaguda, rejeição à transplante subaguda, erejeição à transplante crônica. Em algumas modalidades a doença mediada pela proteína docomplemento C5, C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é complicações relacionadas à cirurgia deCABG. Em uma modalidade particular, a doença a ser tratada é lesão do miocárdio relacio-nada à cirurgia de CABG. Em uma modalidade particular de um método de tratamento dainvenção, a doença, em que um sintoma é para ser reduzido, estabilizado e/ou prevenido éuma desordem ocular, particularmente retinopatia diabética, AMD exudativa e/ou não exudati-va.
Em algumas modalidades, o método da invenção inclui administrar a composiçãofarmacêutica compreendendo ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) paraatingir uma concentração plasmática de aptâmero que é cerca de 0,5 a cerca de 10 vezesque da proteína endógena do complemento C5. Em algumas modalidades, as composiçõesfarmacêuticas de aptâmero ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) são ad-ministradas para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que é cerca de 0,75 acerca de 5 vezes, 0,75 a cerca de 3 vezes, e 1,5 a cerca de 2 vezes que da proteína endóge-na do complemento C5, enquanto que em outras modalidades a composição de aptâmero éadministrada para atingir uma concentração equivalente à da proteína endógena do com-plemento. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da invenção compreenden-do ARC187 (SEQ ID NO; 5) ou ARC1905 (SEQ 1 NO: 67) é administrada para atingir umaconcentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ , cer-ca de 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 μΜ ou de cerca de 500 nM.
Qualquer combinação de via, duração e taxa de administração pode ser usada queé suficiente para atingir a concentração plasmática de aptâmeros da invenção. Em algumasmodalidades a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em algumas mo-dalidades, a composição farmacêutica é administrada na forma de uma infusão de bolo e/ouvia contínua.
Em modalidades particulares de tratar, prevenir e/ou aliviar complicações relacio-nadas à cirurgia de CABG1 particularmente lesão do miocárdio relacionada à cirurgia deCABG, o método da invenção compreende administrar a composição farmacêutica antes dacirurgia e administração contínua pelo menos 24 horas, em algumas modalidades cerca de48 horas ou em algumas modalidades cerca de 72 horas. Em uma modalidade particular desteaspecto da invenção, uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de duas vezes a con-centração de proteína endógena do complemento é atingida por administração de um bolo intra-venoso de cerca de 0,75 a 1,25, preferivelmente de cerca de 1 mg de aptâmero por kg do pacien-te a ser tratado antecipadamente, simultaneamente com ou depois da infusão intravenosa de umadose inferior de aptâmero em que mg não inclui o peso do PEG conjugado. Em algumas modali-dades a dose inferior será infundida em uma taxa selecionada da faixa de 0,001 a 0,05 mg/kg/minem que mg não inclui o peso do PEG conjugado. Em uma modalidade particular, a dose inferiorserá infundida em uma taxa de cerca de 0,0013 mg/kg/min. Ainda em outras modalidades desteaspecto da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma meia-vida suficientementelonga, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada um ou duas vezes diaria-mente na forma de uma dose de bolo intravenoso.
Em um outro aspecto da invenção, métodos diagnósticos são fornecidos. Em uma moda-lidade, o método diagnóstico compreende colocar o ARÇ187 em contato (SEQ ID NO: 5) ouARC1905 (SEQ ID NO: 67) com uma composição suspeita de compreender proteína do comple-mento C5 ou uma variante deste, e detectar a presença ou ausência de proteína do complementoC5 ou uma variante deste. Em algumas modalidades a proteína do complemento ou variante sãovertebrado, particularmente mamífero e mais particularmente humano. A presente invenção forne-ce uma composição ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) para uso como umdiagnóstico in vitro ou in vivo.
Em um outro aspecto da invenção, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeos selecionada do grupo que consiste em: ARC 330 (SEQ ID NO: 2), ARC188-189,ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525,ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537, e ARC1730,(SEQ ID NOS: 6 a SEQ NO: 66) é fornecido. Em uma outra modalidade qualquer um de ARC330(SEQ ID NO: 2) e C188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459,ARC473, ARC522-525, C532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706,ARC1537, e ARC1730, (SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66) para uso na preparação de uma composi-ção farmacêutica é fornecido. Neste aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêuticacompreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero que inibe a clivagemde proteína do complemento C5 in vivo ou um sal deste e um veículo ou diluente farmaceutica-mente aceitável.
Em uma modalidade particular, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleo-tídeos de acordo com SEQ ID NO: 1 é fornecido. Em uma modalidade particular, um aptâmerocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ IDNO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 é fornecida. Em algumas modali-dades, onde o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupoque consiste em SEQ 1 NO: 61, SEQ 1 NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmerocompreende substancialmente a mesma afinidade de ligação para proteína do complemento C5que um aptâmero que consiste na seqüência de acordo com SEQ ID NO: 4, mas que não temuma fração PEG.
Em algumas modalidades em que o aptâmero compreende uma seqüência de nucleo-tídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO:64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende uma meia-vida, preferivelmente a meia-vida termi-nal em um modelo de dois compartimentos determinada no exemplo 5E a seguir, de pelo menos15, preferivelmente pelo menos 30 horas em primata. Em algumas modalidades em que o aptâ-mero compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende ummeia-vida, preferivelmente a meia-vida terminal em um modelo de dois compartimentos, de pelomenos 1 e meia, preferivelmente pelo menos sete horas em rato.
Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, em que o aptâmero compreendeuma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ IDNO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ 1D NO: 66, o aptâmero é sintetizado com uma Iigante 5' comose segue: H2N------5'Aptâmero 3', em que """" denota o ligante. Em algumas modalidadeso ligante é um ligante alquila como se segue: H2N-(CH2) n - 5' Aptâmero 3' em que n=2 a 18,preferivelmente η = 2-12, mais preferivelmente η = 3 a 6, mais preferivelmente η = 6, e em queaptâmero =
<formula>formula see original document page 26</formula>
em que fC e M = 2-flúor nucleotídeos, e mG e mA = nucleotídeos 2'-OMe e todos osoutros nucleotídeos são 2-OH e onde 3T indicates uma deóxi timidina invertida. O aptâmeromodificado por amida resultante pode ser conjugado a uma fração PEG selecionada do grupoque consiste em um PEG linear de 10 kDa PEG, 20 kDa PEG, 30 kDa PEG e 40kDa. Em algu-mas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuti-camente efetiva de um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionadado grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ I NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particu-larmente do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQID NO: 66 ou um sal deste é fornecida. A composição farmacêutica da invenção pode com-preender um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto da invençãouma composição farmacêutica para uso no tratamento, prevenção ou alívio de doença in vi-vo, compreendendo um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeos sele-cionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particu-larmente do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 aSEQ ID NO: 66 é fornecida.
Em uma outra modalidade, um método de tratar, prevenir ou aliviar uma doençamediada pela proteína do complemento 05 é fornecida, compreendendo administrar umacomposição farmacêutica compreendendo um aptâmero ou um sal deste, onde o aptâmerocompreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente do grupo que consiste em SEQ IDNO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ 1 NO: 64 a SEQ ID NO: 66 a um vertebrado. Em algumasmodalidades deste aspecto da invenção, o método compreende administrar a composiçãofarmacêutica da invenção a um mamífero, preferivelmente um humano.
Em algumas modalidades, a doença mediada pela proteína do complemento05, C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é doença isquêmica aguda(infarto do miocárdio, acidentevascular, lesão isquêmica/reperfusão); doenças inflamatórias agudas (doença infecciosa, sep-ticemia, choque, rejeição à transplante aguda/hiperaguda); doenças inflamatórias crônicase/ou imuno mediadas incluindo retinopatia diabética, degeneração macular incluindo formasexudativa e não exudativa de AMD, e também incluindo alergia, asma, artrite reumatóide, eoutras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase eoutras doenças dermatológicas, miastenia grave, Iupus eritematoso sistêmico (SLE); e do-ença subaguda e/ou imuno mediada (incluindo rejeição à transplante, glomerulonefrite eoutras doenças renais) e doenças oculares. Em algumas modalidades, as doenças media-das pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a ser tratadas incluem ativação docomplemento associada à diálise ou circunstâncias em que sangue passa sobre e/ou atravésdo tubo sintético e/ou matéria estranha. Em algumas modalidades, a doença mediada pelaproteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é selecionada do grupo que con-siste em lesão do miocárdio relacionada à cirurgia de CABG, lesão do miocárdio relacionadaà angioplastia com balão e lesão do miocárdio relacionada à restenose. Em algumas modali-dades, desordem mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C 5 b - 9 a ser trata-da é selecionada do grupo que consiste em lesão do miocárdio relacionada à cirurgia deCABG1 lesão do miocárdio relacionada à angioplastia com balão, lesão do miocárdio relacio-nada à restenose, complicações mediadas pela proteína do complemento relacionadas à ci-rurgia de CABG1 complicações mediadas pela proteína do complemento relaionadas à inter-venção coronária percutânea, hemoglubinúria noturna paraxissomal, rejeição à transplanteaguda, rejeição à transplante hiperaguda, rejeição à transplante subaguda, e rejeição àtransplante crônica. Em algumas modalidades a doença mediada pela proteína do comple-mento C5 C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é complicações relacionadas à cirurgia de CABG.Em uma modalidade particular, a doença a ser tratada é lesão do miocárdio relacionada àcirurgia de CABG. Em uma modalidade particular de um método de tratamento da invenção,a doença, em que um sintoma é para ser reduzido, estabilizado e/ou prevenido, é uma de-sordem ocular, particularmente retinopatia diabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.
Em algumas modalidades, o método da invenção inclui administrar a composiçãofarmacêutica compreendendo um aptâmero com uma seqüência de nucleotídeos selecionadado grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66,a um paciente para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que é cerca de 0,5 a cer-ca de 10 vezes que da proteína endógena do complemento C5. Em algumas modalidades, acomposição farmacêutica de aptâmeros é administrada para atingir uma concentraçãoplasmática de aptâmero que é cerca de 0,5 a cerca de 5 vezes, 0,75 a cerca de 3 vezes, e1,5 a cerca de 2 vezes que da proteína endógena do complemento C5, enquanto que emoutras modalidades a composição de aptâmero é administrada para atingir uma concentra-ção equivalente à da proteína endógena do complemento. Em algumas modalidades, acomposição farmacêutica da invenção administrada para atingir uma concentração plasmáti-ca de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5μΜ, cerca de 1 μΜ ou de cerca de 500 nM.
Qualquer combinação de via, duração e taxa de administração pode ser usada queé suficiente para atingir a concentração plasmática de aptâmeros da invenção. Em algumasmodalidades a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em algumasmodalidades, a composição farmacêutica é administrada na forma de uma infusão de boloe/ou via contínua.
Em modalidades particulares de tratar, prevenir e/ou aliviar complicações relacio-nadas à cirurgia de CABG, particularmente lesão do miocárdio relacionada à cirurgia deCABG, o método da invenção compreende administrar a composição farmacêutica antes dacirurgia e administração contínua pelo menos 24 horas, em algumas modalidades cerca de48 horas ou em algumas modalidades cerca de 72 horas. Em uma modalidade particulardeste aspecto da invenção, a concentração plasmática desejada de aptâmero, por exemplo,duas vezes a concentração de proteína endógena do complemento em algumas modalida-des, é atingida por administração de um bolo intravenoso ao paciente a ser tratado com ante-cipadamente, simultaneamente com, ou depois da infusão intravenosa de uma dose inferiorde aptâmero. Ainda em outras modalidades deste aspecto da invenção, onde o aptâme-ro/conjugado compreende uma meia-vida suficientemente longa, a composição farmacêuticade aptâmero pode ser administrada um ou duas vezes diariamente na forma de uma dosede bolo intravenoso.
Em um outro aspecto da invenção métodos diagnósticos são forne4cidos. Em umamodalidade, o método diagnóstico compreende colocar uma composição em contato comum aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo queconsiste em: SEQ 1D NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO 66, particularmente do grupo queconsiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, e detectara presença ou ausência de proteína do complemento C5 ou uma variante deste na compo-sição. Em algumas modalidades a proteína ou variante do complemento é de vertebrado,particularmente mamífero, e mais particularmente humano. A presente invenção fornece umacomposição de aptâmero com um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO 66 parauso como um diagnóstico in vitro ou in vivo. Na presente invenção, um aptâmero compre-endendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ IDNO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO 66 para uso na preparação de uma composição farma-cêutica é fornecido.
Em um outro aspecto da invenção, um aptâmero compreendendo uma seqüênciade nucleotídeos que é 80 % idêntica a qualquer uma das seqüências selecionadas do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é forneci-do. Em algumas modalidades, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotí-deos que é 80 % idêntica à única região de qualquer uma das seqüências selecionadas dogrupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é fornecido. Em umaoutra modalidade um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é 90 %idêntica a qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo que consiste em SEQ IDNOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é fornecido. Em uma modalidadeparticular, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é 90 % idênti-ca à região única de qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo que consiste emSEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é fornecido. Ainda em uma outra modalidade, umaptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de 40 nucleotídeos contíguos idênticosa 40 nucleotídeos contíguos incluídos em qualquer uma das seqüências selecionadas do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é fornecido. Em uma outra moda-lidade, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de 30 nucleotídeos contí-guos idênticos a 30 nucleotídeos contíguos incluídos em qualquer uma das seqüências seleciona-das do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 éfornecido. Ainda em uma outra modalidade, um aptâmero que se liga especificamente à proteínado complemento C5 compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de 10 nucleotídeos contí-guos idênticos a 10 nucleotídeos contíguos incluídos em qualquer uma das seqüências seleciona-das do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 éfornecido. Em uma modalidade preferida um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucle-otídeos de acordo com qualquer uma das seqüências de nucleotídeos selecionadas do grupo queconsiste em: SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, é fornecido.
Em algumas modalidades, os aptâmeros da invenção descritos anteriormente podem a-dicionalmente compreender uma modificação química selecionada do grupo que consiste: emuma substituição química em uma posição de açúcar; uma substituição química em uma posiçãode fosfato; e uma substituição química em uma posição de base da seqüência de ácidos nucléicos.
Em algumas modalidades a modificação é selecionada do grupo que consiste em: incor-poração de um nucleotídeo modificado; capeamento 3', conjugação a um composto de alto pesomolecular, não imunogênico; conjugação a um composto lipofílico; e modificação da espinha dor-sal de fosfato.
Em modalidades preferidas deste aspecto da invenção, o aptâmero modula uma funçãode uma proteína do complemento C5 ou uma variante deste. Em modalidades particularmentepreferidas, o aptâmero inibe uma função de proteína do complemento C5 ou uma variante deste;preferivelmente in vivo, mais preferivelmente in vivo em humanos. Em uma modalidade deste as-pecto da invenção, a função modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é clivagem de pro-teína do complemento C5.
Em algumas modalidades de um outro aspecto, a invenção fornece uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero quebloqueia clivagem de proteína do complemento C5 in vivo ou um sal deste e um veículo ou dilu-ente farmaceuticamente aceitável.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero compreendendo uma seqüência denucleotídeos 80 % idêntica a, preferivelmente 90 % idêntica a uma seqüência de nucleotí-deos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQID NOS: 88 a 98 ou um sal deste é fornecida. El algumas modalidades, uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmerocompreendendo um nucleotídeo seqüência 80 % idêntica, preferivelmente 90 % idêntica àregião única de uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal deste é fornecida. Emoutras modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeu-ticamente efetiva de um aptâmero com 40, 30 ou 10 nucleotídeos contíguos idênticos a 40,30 ou 10 nucleotídeos, respectivamente, a uma seqüência de nucleotídeos selecionadado grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 éfornecida. A composição farmacêutica da invenção pode compreender um veículo ou diluen-te farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto da invenção, uma composição farmacêuticaé fornecida para uso no tratamento, prevenção ou alívio de doença in vivo, onde a composi-ção farmacêutica compreende um aptâmero com uma seqüência de nucleotídeos selecio-nada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal deste. Neste aspecto, um aptâmero com uma seqüênciade nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS;75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 para uso na preparação de uma composi-ção farmacêutica é fornecido. Neste aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêu-tica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero que inibeclivagem de proteína do complemento C5 in vivo ou um sal deste e um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável.
Em algumas modalidades, a doença mediada pela proteína do complemento C5,C5a e/ou Cb-9 a ser tratada é doença isquêmica aguda (infarto do miocárdio, acidente vas-cular, lesão isquemia/reperfusão); doenças inflamatórias agudas (doença infecciosa, septi-cemia, choque, rejeição a transplante agudo/hperagudo); doenças inflamatórias crônicas e/ouimuno mediadas incluindo retinopatia diabética, degeneração macular incluindo formas exu-dativa e não exudativa de AMD e também incluindo alergia, asma, artrite reumatóide, eoutras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase eoutras doenças dermatológicas, miastenia grave, Iupus eritematoso sistêmico (SLE)1 rejeiçãoà transplante subaguda/crônica, glomerulonefrite e outras doenças renais); e doenças ocula-res. Em algumas modalidades, as doenças mediadas pela proteína do complemento C5,C5a e/ou C5b-9 a ser tratadas incluem ativação do complemento associada à diálise ou cir-cunstâncias em que o sangue passa sobre e/ou através do tubo sintético e/ou matéria es-tranha. Em algumas modalidades, a doença mediada pela proteína do complemento C5,C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é selecionada do grupo que consiste em lesão do miocárdiorelacionada à cirurgia de CABG1 lesão do miocárdio relacionada à angioplastia com balão elesão do miocárdio relacionada à restenose. Em algumas modalidades, desordem mediadapela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a ser tratada é selecionada do grupo queconsiste em: lesão do miocárdio relacionada à cirurgia de CABG, lesão do miocárdio rela-cionada à angioplastia com balão, lesão do miocárdio relacionada à restenose, complica-ções mediadas pela proteína do complemento relacionadas à cirurgia de CABG, complica-ções mediadas pela. proteína do complemento relacionadas à intervenção coronária percu-tânea, hemoglubinúria noturna paroxissomal, rejeição à transplante aguda, rejeição à trans-plante hiperaguda, rejeição à transplante subaguda, e rejeição à transplante crônica. Emalgumas modalidades a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9a ser tratada é complicações relacionadas à cirurgia de CABG. Em uma modalidade particu-lar, a doença a ser tratada é lesão do miocárdio relacionada à cirurgia de CABG. Em umamodalidade particular de um método de tratamento da invenção, a doença, em que um sin-toma é para ser reduzido, estabilizado e/ou prevenido, é uma desordem ocular, particular-mente retinopatia diabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.
Em algumas modalidades, o método da invenção inclui administrar a composiçãofarmacêutica compreendendo um aptâmero com uma seqüência de nucleotídeos selecionadado grupo que consiste em, SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 eSEQ ID NOS: 88 a 98, a um paciente para atingir uma concentração plasmática de aptâme-ro que e cerca de 0,5 a cerca de 10 vezes que da proteína endógena do complemento C5.Em algumas modalidades, a composição farmacêutica de aptâmeros é administrada paraatingir uma concentração plasmática de aptâmero que é cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes,0,75 a cerca de 3 vezes, e 1,5 a cerca de 2 vezes a da proteína endógena do complementoC5, enquanto que em outras modalidades a composição de aptâmero é administrada paraatingir uma concentração equivalente à da proteína endógena do complemento. Em algu-mas modalidades, a composição farmacêutica da invenção é administrada para atingir umaconcentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cercade 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 //M ou de cerca de 500 nM.
Qualquer combinação de via, duração e taxa de administração pode ser usada queé suficiente para atingir a concentração plasmática de aptâmeros da invenção. Em algumasmodalidades a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em algumas mo-dalidades, a composição farmacêutica é administrada na forma de uma infusão de bolo e/ouvia contínua.
Em modalidades particulares de tratar, prevenir e/ou aliviar complicações relacio-nadas à cirurgia de CABG, particularmente lesão do miocárdio relacionada à cirurgia deCABG, ó método da invenção compreende administrar a composição farmacêutica antes dacirurgia e administração contínua pelo menos 24 horas, em algumas modalidades cerca de48 horas ou em algumas modalidades cerca de 72 horas. Em uma modalidade particulardeste aspecto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero desejada, por exemplo,duas vezes a concentração de proteína endógena do complemento em algumas modalida-des, é atingida por administração de um bolo intravenoso ao paciente a ser tratado antecipa-damente, simultaneamente ou depois da infusão intravenosa de uma dose inferior de aptâ-mero. Ainda em outras modalidades deste aspecto da invenção, onde o aptâmero/conjugadocompreende uma meia-vida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmeropode ser administrada uma ou duas vezes diariamente na forma de uma dose de bolo intra-venoso.Em uma outra modalidade, um método diagnóstico é fornecido, o método compre-endendo colocar uma composição suspeita de compreender proteína do complemento C5ou uma variante deste em contato com um aptâmero compreendendo uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83e SEQ ID NOS: 88 a 98 e detectar a presença ou ausência de proteína do complemento C5ou uma variante deste. Em algumas modalidades oa proteína ou variante do complemento éde vertebrado, particularmente mamífero e mais particularmente humano. A presente inven-ção fornece uma composição de aptâmero com um aptâmero compreendendo uma seqüênciade nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 para uso como um diagnóstico in vitro ou in vivo.
Em algumas modalidades, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucle-otídeos que consiste essencialmente em uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 68 e 69 é fornecido. Em algumas modalidades, um ap-tâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que consiste em uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 68 e 69 é fornecido. Emalgumas modalidades deste aspecto da invenção, o aptâmero pode ser usado em um métododiagnóstico.
Em uma modalidade, um método aa presente invenção é direcionado para tratar,estabilizar e/ou prevenir uma desordem ocular mediada pelo complemento, o método com-preendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâme-ro anticomplemento a um sujeito em necessidade deste. Em uma modalidade a desordemocular tratada é degeneração macular. Em uma modalidade a desordem ocular tratada éuma desordem de neurovascularização ocular.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados in nadescrição a seguir. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes asoaqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos emateriais preferidos são agora descritos. Outras características, objetivos e vantagens dainvenção ficarão evidentes a partir da descrição. Na especificação, as formas singularestambém incluem o plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. A menosque de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mes-mos significados comumente entendidos por um versado na tecnologia a qual esta invençãopertence. No caso de conflito, a presente Especificaçxão controlará.
Agentes anti-C5 e Desordens oculares
Dados recentes sugerem que degeneração macular relacionada à idade (AIVID)também é uma doença mediada por inflamação com ativação do complemento exercendoum papel. Degeneração macular relacionada à idade ("AMD") é uma doença do olho crônicae progressiva e que é a causa que leva à perda irreparável da visão nos Estados Unidos,europa e Japão. A M D é caracterizada pela deteriorização progressiva da porção central daretina referida como a mácula. O indicador mais claro da progressão para AMD é a aparên-cia de gânglios, depósitos branco amarelados sobre a retina, que são placas de material quesão derivadas dos produtos de resíduo metabólico das células da retina. A aparência dosgânglios é um importante componente de ambas as formas de AMD: exudativa ("úmida") enão exudativa ("seca"). AMD úmida ocorre quando novos vasos sangüíneos que crescemlogo abaixo da retina invadem as camadas retinais por meio de uma membrana conhecidacomo membrana de Brach. Este crescimento anormal do vaso sangüíneo geralmente é referidocomo angiogênese ou neovascularização (coroidal). Estes novos vasos sangüíneos tendem a serfrágeis e freqüentemente sangram e fazam fluido na mácula, resultando algumas vezes em súbitae freqüente rompimento severo da visão. Embora tratamentos inéditos (por exemplo Luce η tis)possam interromper e reverter o acúmulo de fluido, mesmo restauração da visão em uma minoriade pacientes, a lesão neurovascular freqüentemente leva a cicatriz e/ou dano das células retinaiscausando tratamento da perda da visão. AMD úmida é geralmente precedida pelo desenvolvimen-to de gânglios que se acumulam e que contêm proteínas do complemento incluindo fator H docomplemento (CFH). A presença de gânglios numerosos, intermediário-para-grande é associadaao maior risco de progressão para doença de estágio tardio, caracterizada pela atrofia geográficae/ou neovascularização. A maioria dos pacientes com AMD úmida experimenta perda de visãosevera no olho afetado em meses a dois anos depois da diagnose da doença, embora a perda davisão possa ocorrer em horas ou dias. AMD seca é more gradual e ocorre quando células sensí-veis à luz na mácula lentamente se atrofiam, gradualmente blurring a visão central no olho afeta-do. Perda da visão é exacerbada pela formação e acúmulo de gânglios e, algumas vezes, a dete-rioração da retina, embora sem crescimento e sangramento anormal de vaso sangüíneo.
Existem componentes do complemento e outros mediadores da inflamação em célulasdrusen e inflamatórias que são observadas nas lesões que causam perda de visão relacionada àAMD (Haines et al: (2005) Science 308: 419-421). AMD é fortemente associada a um defeitogenético no caminho regulatório do complemento (Haiines et al., 2005). Uma variante em umgene que codifica para fator H do complemento (CFH) parece contribuir para o maior risco deAMD enorme ou completamente por meio de seu inpacto no desenvolvimento dos gânglios, umprecursor para neovascularização e perda da visão associado a AMD (Edwards et al. (2005) Sci-ence 308:421-424). A função principal de CFH é sobre-regular a atividade das convertases dacascata alternativa ligando-se e inativando C3b ou estimulando a dissociação do fator Bb de C3b.(Hageman at al. (2005) PNAS 102(2):7227-7232). Dados genéticos recentes sugerem que umapessoa com gânglios tipo AMD úmida tem 50-70 % de chance de carregar o alelo CFH resultandoem uma correlação extremamente previsível e forte entre intervenção do complemento e trata-mento de AMD (Klein et at. (2005) Science 308: 385-389). Um anti-C5, aptâmero que bloqueiasua ativação, will do so even se um paciente caregar o gene CFH defeituoso associado a AMD.Igualmente, aptâmeros que inibem a atividade dos alvos da cascata alternativa, tais como fator B,fator D, e properdina, componentes da cascata normal, particularmente C3, e componentes docomplexo de ataque à membrana, inibirão a atividade mesmo se um paciente carregara geneCFH defeituoso associado à AMD. Vários halotipos do gene do fator H do complemento (CFH)foram determinados como associados a um risco da pessoa de desenvolver degeneração macu-lar (AMID). Em particular, uma mudança tirosina-histidina no aminoácido 402 no fator H do com-plemento (CFH) no cromossomo 1 resulta na formação de uma variante do gene CFH que é for-temente associado à suscetibilidade à doença. A mudança da seqüência é em uma região deCFH que se liga à heparina e proteína reativa C. Pessoas cuja constituição genética inclui estavariante do gene CFH são mais propensas a desenvolver AMD. A variante do gene CFH pode serresponsável por cerca de metade dos 15 milhões de casos de degeneração macular nos EstadosUnidos. A probabilidade de desenvolver degeneração macular é maior em cerca de 2,5 a 5,5 ve-zes se um paciente tiver a variante do gene CFH.
O gene CFH está envolvido na regulação dos caminhos inflamatórios (caminho do com-plemento alternativo). Isto implica que inflamação também exerce um importante papel no desen-volvimento da degeneração macular. Níveis sangüíneos de uma proteína reativa C (CRP) marca-dora de inflamação também foram observados elevados na degeneração macular. (Science. 2005Apr 15;308(5720):419-21, Science. 2005 Apr 15;308(5720):421-4, Science. 2005 Apr15;308(5720):385-9) Com base na sua localização na região de ligação à heparina e CRP do fatorH, a variante Υ402Η pode romper o reestabelecimento mediado por proteoglicana e CRP do fatorH a superfícies de célula hospedeira, impedindo a capacidade do fator H de sobre-regular C3bdepositado nestas células. Não selecionado, amplificação do caminho do complemento no tecidodo hospedeiro causa inflamação na retina e nos vasos sangüíneos ao redor, em virtude da Iibera-ção descontrolada de C5a e C5b-9. CFH previne a ativação do complemento e inflamação des-controladas; assim uma mutação em CFH aumentará a inflamação e suas conseqüências. Redu-zindo a excessiva ativação do complemento (caminho inflamatório) que ocorre na degeneraçãomacular, pode-se ser capaz de diminuir o progresso da doença. Adicionalmente, a detecção davariante do gene pode ser um dia usada em combinação com tecnologias de imageamento paraidentificar indivíduos em alto risco de desenvolver AMD avançada precoce que é atualmente pos-sível. (JAMA. 2005 Apr 20;293(15): 18410)
A ativação do complemento também implicou em outras doenças oculares, tal como reti-nopatia diabética, e pode compor ou iniciar dano vascular da retina (Zhang et al., (2002) Diabetes51:3499). Retinopatia diabética proliferativa (PDR) é uma complicação da diabetes que é causadapor mudanças nos vasos sangüíneos da retina. Quando vasos sangüíneos na retina são danifi-cados, eles podem vazar sangue e ficar frágeis, ramificar tipo escova e marcar o tecido. Istopode manchar ou distorcer as imagens da visão que a retina envia para o cérebro. Estima-se que 25 % dos diabéticos sofrem de retinopatia diabética e a incidência aumenta para 60 %depois de 5 anos e 80 % depois de 10-15 anos com diabetes tipo I. A doença é caracterizadapor hiperglicemia, espessamento da membrana basal, perda de periócitos, microaneurismase neovascularização preretinal que podem levar a segueira por meio de hemorragia e des-colamento da retina tradicional. Retinopatia diabética não proliferativa é caracterizada pormicroaneurismas intraretinais, hemorragias, infartos nervos-fibra-camada, exudatos duros eanormalidaes microvasculares. Edema macular é o principal mecanismo para perda da vi-são. Ele resulta de vazamento vascular de microaneurismas nos capilares maculares (áreacentral da retina). Vazamento pode progredir para espessamento macular associado a exu-datos duros ou mudanças cistóides e isto freqüentemente resulta em vários graus de perda davisão central. Retinopatia diabética proliferativa é caracterizada por neovascularização reti-nal. Ela é graduado de acordo com a presença, localização, severidade e atividade hemor-rágica associada de neovascularização retinal. Ela é associada à severa perda da visão. Apatologia da retinopatia diabética pode ser atribuída aos seguinbtes estados da doença.
Problemas de circulação fazem com que regiões da retina se tornem privadas de oxigênioou isquêmicas. Neovascularização faz com que novos vasos comecem a crescer no vítreopara manter níveis de oxigênio adequados. Vazamento de sangue para fora dos capilaresrecém formados e a formação de cicatriz no tecido cria tração na retina causando pequenaslágrimas. Lágrimas são formadas pelo estabelecimento de fluido em baixo ou entre as ca-madas da retina e o descolamento ocorre. Pacientes têm a visão manchada, flutuantes, re-lâmpagos e perda repentina da visão em virtude de hemorragia, edema e formação de teci-do de cicatriz.
Baixo nível de ativação do complemento constitutiva normalmente ocorre no olhonão diabético, evidenciado pela presença de MAC e proteínas regulatórias do complementonos olhos de ratós não diabéticos, indicando que a desrregulação do complemento ocorre empacientes diabéticos (Sohn et al., (2000) IOVS 41:3492). Além do mais, a deposição de C5b-9 foi detectada em vasos retinais de doadores humanos diabéticos onde a ausência de doa-dores humanos não diabéticos (Zhang et al.), reduziu a expressão de CD55 e CD59 é apre-sentado em retinas diabéticas (Zhang et art.), e CD59 glicado está presente na urina de pa-cientes diabéticos, mas não em pacientes não diabéticos (Acosta et al., (2002) PNAS 97,5450-5455). Adicionalmente, sabe-se que o sistema complemento e vascular é ativado nadiabetes tipo I. Ver, por exemplo, Hansen, T.K. et al., Diabetes, 53: 1570-1576 (2004). C5aativa células endoteliais por meio da interação dos sistemas imune e complemento. Ver, porexemplo, Albrecht, E.UM. et al., Am J Patologia, 164: 849-859 (2004). O sistema vascular éativado em doenças oculares incluindo retinopatia diabética. Ver, por exemplo, Gert, V.B. etaL, Invest Opthahnol Vis Sei, 43: 1104-1108 (2002). O sistema complemento também é ati-vado na retinopatia diabética. Ver, por exemplo, Gert, V.B. et aL, Invest Opthalmol Vis Sei,43: 11041108 (2002) e Badouin, C et ai, Am J Opthalmol, 105:383-388 (1988).
Uveíte refere-se a inflamação da úvea, uma camada vascular pigmentada (ou túni-ca) localizada entre a esclera (túnica fibrosa) e a retina (a camada sensível à luz responsávelpela visão), e composta da íris, corpo ciliar e coróide (uma camada de tecido vascular e co-nectivo que nutre a retina). Em virtude da anatomia complexa da úvea, existem diferentestipos de uveíte e em virtude da relação anatômica da úvea com outras estruturas oculares(por exemplo, retina), uveíte é freqüentemente acompanhada por inflamação de outros teci-dos (por exemplo, retinite). Uveíte é geralmente categorizada como uveíte anterior (que afe-ta principalmente a íris e associada ao corpo ciliar, e assim a câmara anterior entre a íris ecórnea e o humor aquoso líquido claro contido), uveíte intermediária (que afeta os pares parsplanares imediatamente atrás do corpo ciliar e na frente da "borda" da retina), ou uveíte pos-terior (que afeta a câmara posterior atrás da íris, que é carregada com humor vítreo gelati-noso claro e em contato direto com a retina). Uveíte pode incluir qualquer ou todas as partesda úvea (por exemplo, coroidite, irite). Uveíte anterior é a forma mais comum e é frequente-mente associada a doenças autoimunes, tal como artrite reumatóide. Uveíte intermediária éa segunda forma mais comum. Uveíte posterior, a forma menos comum, pode surgir depoisde uma infecção sistêmica (por exemplo, viral, bacteriana, fúngica ou parasitária) ou podeestar associada a doenças autoimunes. Uveíte autoimune também pode ocorrer sem envol-vimento sistêmico. Uveíte também pode ocorrer como um resultado de trauma (por exemplo,lesão, cirurgia, etc.) ou por razões desconhecidas ("idiopáticas"). Independente da etiologia,qualquer condição inflamatória que afeta a úvea resultará, por definição, em uveíte.
Tecidos e fluidos oculares normalmente contêm muitos componentes do comple-mentos, tais como fator B e C2, C4, C3, C5, C6, e C7 no tecido uveal (Brawman Mintzer O,Invest Ophthalmol Vis Sei. 1989 Oct;30(10):2240-4), C1, C4, C3 e C5 no humor aquoso (Mon-dino BJ, Arch Ophthalrnol. 1983 Mar;101(3):465-8), e C1, C4, C2, C3, C5, C6 e C7 na cór-nea (Mondino BJ, Arch Ophthalrnol. 1981 Aug;99(8): 1430-3). Estes componentes do com-plemento e proteínas regulatórias do complemento associadas são considerados importan-tes para a vigilância imune normal em ocular tecidos.
Um papel importante para a ativação de complemento na patogênese da uveíte foidemonstrado por: uma maior incidência de alotipo C4 (C4B2) em pacientes com uveíte ante-rior comparada a pacientes com vasculite retinal (controle) (Wakefield D, Hum Immunol.1988 Apr,21(4):233-7.); maior complexos imune compreendendo C3d e complemento noplasma em pacientes com uveíte idiopática (Vergani S, BrJ Ophthalrnol. 1986 Jan;70(1):60-3); maior atividade hemolítica mediada pelo complemento e níveis de C3 e C4 no fluido Ia-crimal (lágrimas) em pacientes com doenças inflamatórias sistêmicas e uveíte recorrente;(Drozdova EA, Vesta Oftalmol. 2004 Sul-Aug; l20(4):24-6); e deposição de complexos imunee complemento no trato uveal em uveíte como um evento de iniciação (0'Connor GR, TransOphthalmol Soc U Κ. 1981 Sep;101 (Pt 3)(3):297-300). A ativação do complemento implicouem inúmeras doenças inflamatórias e/ou autoimunes com um componente de uveíte ocular,incluindo doença de Behcet (Cuchacovich M1 Clin Exp Rheumatol. 2005 Jul-Aug;23 (4 Suppi38):S27-34, Bardak Y, Ocul Immunol Inflamm. 2004 Mar;12(1):53-8), Iridociclite heterocrô-mica de Fuch (La Hey E1 Am J Ophthalmol. 1992 Jan 15;113(1 ):75-80), doença de Vogt-Koyanagi-Harada (Sakamoto T1 Areh Ophthalmol. 1991 Sep; 109(9): 12704), e fibrose sub-retinal e uveíte crônica (Palestine AG1 Ophthalmology. 1985 Jun;92(6):838-44).
Inúmeros modelos animais de uveíte induzida experimentalmente também demons-traram que a ativação do complemento é importante na patogênese da uveíte (Jha P1 InvestOphthalmol Vis Sei. 2006 Mar47(3):1030 8, Kasp E, Clin Exp Immunol. 1992 May;88(2}:307-12) e que a ativação do complemento é intimamente regulada por proteínas regulatórias docomplemento (Bardenstein DS1 Immunology. 2001 Dec;104(4):423-3°, Sohn Ml, Invest Oph-thalmol Vis Sei. 2000 Oct;41(l 1) :3492-502). Nestes modelos de uveíte mediada pelo com-plemento, a depleção do complemento, tal como por tratamento do fator de veneno de cobra(CVF) ou por depleção genética de componentes importantes da ativação dos caminhos docomplemento (C3), resulta em prevenção ou redução significativa da severidade da uveíteinduzida.
Coletivamente, dados indicam que componentes do complemento e proteínas regu-latórias são importantes constituintes normais de tecidos oculares e da úvea em particular,que a ativação do complemento é responsável por uveíte em modelos experimentais deuveíte autoimune e que a ativação do complemento é associada a uveíte em humanos. As-sim, em algumas modalidades aptâmeros que interrompem a ativação dos caminhos docomplemento alternativo e clássico antes da ativação de C5 e subsequente geração de C5a eC5b-9 (MAC) são fornecidos para uso em métodos da invenção para reduzir a incidência, dura-ção e/ou severidade da uveíte.
Glaucoma refere-se a um grupo de doenças em que a perda da visão ocorre como umresultado do dano ao nervo ótico e retina, normalmente associado a um aumento na pressão intra-ocular ("IOP"). Glaucoma de ângulo aberto primário é a forma mais comum, causada por um es-treitamento ou bloqueio gradual dos canais de drenagem de fluido (isto é, rede trabecular) sobre otempo que leva para maior IOP em virtude da constituição do humor aquoso. Glaucoma é classifi-cado em duas categorias, ângulo aberto e fechado. Glaucoma de ângulo aberto primário desen-volve lentamente e sem dor, freqüentemente sem nenhuma perda da visão notável por váriosanos. Glaucoma de ângulo aberto secundário é causado por outras doenças (por exemplo, uveíteou outras doença inflamatória, diabetes, tumor, catarata), lesão contusa ou por certos medicamen-tos, tais como esteróides. Glaucoma de fechamento de ângulo (também referido como glaucomade ângulo estreito ou glaucoma agudo) é causado por uma mudança na posição da íris levando aum bloqueio súbito da drenagem do humor aquoso e abrupto aumento de IOP. Os sintomas deglaucoma de fechamento de ângulo além da perda da visão incluem dor no olho e náusea. Lesãodo nervo ocorre em alguns indivíduos sem um aumento de IOP; este tipo de glaucoma é conheci-do como glaucoma de tensão normal (pressão normal ou baixa tensão). A causa da lesão do ner-vo deste tipo de glaucoma é desconhecida.
Um papel para o complemento na patogênese do glaucoma foi identificado por: 1) maiorexpressão retinal de componentes do complemento RNAm (C1q, C1r, C1s, C3) com elevaçãoexperimental de IOP em um modelo de glaucoma em rato (Ahmed, F, Brown1 KM1 Stephan1 DA1Morrison1 JC1 Johnson1 EC1 Tomarev, Sl (2004) IOVS 45,1247-54); 2) maior expressão retinal doscomponentes do complemento RNAm (C4, B1 Clq1 C3) em um modelo de glaucoma em cinomó-logo (Miyahara, T1 Kikuchi, T1 Akimoto1 M1 Kurokawa1 T, Shibuki1 H1 Yoshimura1 N (2003) IOVS 44,4347-56); 3) maior expressão de RNAm C1q e proteína nas células gliais da retina de modelos decamundongos e macacos de glaucoma (Stasi, K1 Nagel1 D1 Yang, X, Wang1 R1 Ren1 L1 Podos1 SM1Mittag1 T1 Danias1 J (2006) IOVS 47, 102429); 4) manchamento imunoistoquímico para C1q emcélulas gliais de sujeitos humanos (Stasi et a1, 2006). A expressão de complemento C1q em ca-mundongos glaucomatosos experimentais parece correlacionar com o aumento no IOP sobre otempo e precede dano às células do gânglio retinal, sugerindo que o complemento pode contribuirpara a patogênese da doença (Stasi et ai, 2006). O tratamento com um aptâmero anticomplemen-to, por exemplo um aptâmero anti-C5, pode ter um efeito proteror contra at neurodegeneraçãoem glaucomas de alta ou baixa tensão.
Desta maneira, em algumas modalidades a presente invenção fornece agentes an-ti-C5 para o tratamento de desordens oculares mediadas pelo complemento. Em algumasmodalidades, um agente anti-C5 da invenção é usado sozinho enquanto que em outras mo-dalidades ele é usado em combinação com um agente anti-VEGF e/ou um anti-PDGF.
Outras modalidades da presente invenção fornecem aptâmeros anticomplemento pa-ra o tratamento, estabilização e/ou prevenção de desordens oculares mediadas pelo comple-mento. Aptâmeros anticomplemento podem ser gerados pelo método SELEXtm. Em modalida-des particulares, a invenção compreende administrar um aptâmero anticomplemento, por e-xemplo um aptâmero anti-C5 a um sujeito em um método de reduzir, estabilizar e/ou prevenirpelo menos um sintoma de uma desordem ocular, particularmente um sintoma de retinopatiadiabética, ADM exudativa e/ou não exudativa.
Aptâmeros específicos de C5
Aptâmeros específicos de C5 para uso no tratamento, estabilização, prevençãoe/ou redução em sintomas de desordens oculares mediadas pelo complemento podem sergerados pelo método SELEX™. Em modalidades particulares, a invenção compreende admi-nistrar um agente aptâmero anti-C5 a um sujeito em um método de reduzir, estabilizar e/ouprevenir pelo menos um sintoma de uma desordem ocular, particularmente um sintoma deretinopatia diabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.Aptâmeros são moléculas de ácido nucléico com afinidade de ligação específica amoléculas por meio de interações a não ser pareamento de base de Watson-Crick clássico.
Aptâmeros, tipo peptídeos gerados pela apresentação de fago ou anticorpos mono-clonais ("mAbs"), são capazes de especificamente se ligar a alvos selecionados e modular aatividade do alvo, por exemplo, por meio de aptâmeros de ligação podem bloquear sua capa-cidade do alvo para função. Criados por um processo de seleção in vitro a partir de grupos deseqüências aleatórias de oligonucleotídeos, aptâmeros foram gerados para mais de 100proteínas, incluindo fatores de crescimento, fatores de transcrição, enzimas, irnmunoglobulins,e receptores. Um aptâmero típico tem 10-15 kDa de tamanhoi (30-45 nucleotídeos), liga seualvo com afinidade sub-nanomolar, e discrimina contra alvos intimamente relacionados (porexemplo, aptâmeros tipicamente não se ligarão a outras proteínas da mesma família de ge-ne). Uma série de estudos estruturais mostrou que aptâmeros são capazes de usar os mes-mos tipos de interações de ligação (por exemplo, ligação de hidrogênio, complementariedadeseletrostáticas, contatos hidrofóbicos, exclusão estérica) que conferem afinidade e especifici-dade em complexos anticorpo-antígeno.
Aptâmeros têm inúmeras características desejável para uso como terapêuticos ediagnósticos incluindo alta especificidade e afinidade, eficácia biológica, e excelentes propri-edades farmacocinética.
O método SELEX
O método preferido para gerar um aptâmero, geralmente apresentado na figura 2, écom um processo intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment("SELEX™"). O processo SELEX™, um método para a evolução in vitro de moléculas deácidos nucléicos com ligação altamente específica às moléculas alvo, é descrito em,por exemplo, pedido de patente U.S. No. de série 071536.428, depositado em 11 de junho de1990, agora abandonado, patente U.S. No. 5.475.096 intitulada "Nucleic Acids Ligands", epatente U.S. No. 5.270.163 (ver também WO 91119813) intitulada "Nucleic Acids Li-gands". Realizando ciclos interativos de seleção e amplificação, SELEX pode ser usado pa-ra obter aptâmeros, também referido aqui como "ligantes de ácido nucléico" com qualquernível desejado de afinidade de ligação ao alvo.
O processo SELEX se baseia na única perspicácia que ácidos nucléicos têm capa-cidade suficiente para formar uma variedade de estruturas bi e tridimensionais e versatilida-de química suficiente disponível em seus monômeros para agir como ligantes (isto é, formarpares de ligação específica) sem virtualmente nenhum composto químico, seja monoméricoou polimérico. Moléculas de qualquer tamanho ou composição podem servir como alvos.
O processo SELEX se baseia na capacidade de se ligar a um alvo. Aptâmeros obti-dos por meio do procedimento SELEX assim terão a propriedade de ligação ao alvo. Entre-tanto, SELEX em si não seleciona para outras propriedades dos aptâmero ou alvo e nãopode-se razoavelmente esperar que um aptâmero derivado de SELEX tenha nenhuma pro-priedade a não ser ligação ao alvo desejado, embora possa-se esperar que os aptâmerosobtidos tenham outras propriedades. Assim, embora possa-se esperar que um aptâmero te-nha um efeito particular no alvo, além da ligação ao alvo, um dado aptâmero pode não ternenhum efeito, ou pode ter vários efeitos. Por exemplo, quando o alvo é uma proteína queinterage com múltiplos receptores de superfície celular, um aptâmero pode agir tanto parabloquear quanto para melhorar a ligação entre a proteína e um ou mais de tais receptores ouele pode não ter nenhum efeito em quaisquer das interações. Em um outro exemplo, o alvopode ser uma espécie catalítica e um aptâmero pode bloquear ou melhorar a efetividade da fun-ção catalítica ou não ter nenhum efeito na função catalítica. Entretanto, antes do teste em um en-saio apropriado, o versado na tecnologia é incapaz de prever que propriedade, se presente, umdado aptâmero realmente tem. De fato, simples ligação ao alvo não fornece nenhuma informaçãodo efeito funcional, se presente, que pode ser exercido no alvo pela ação da ligação ao aptâmero.
A alteração de uma propriedade da molécula alvo requer que o aptâmero se ligue a umacerta localização no alvo de maneira a efetuar uma mudança em uma propriedade do alvo. Nateoria, SELEX pode resultar na identificação de um grande número de aptâmeros, onde cada ap-tâmero se liga em um local diferente no alvo. Na prática, interações de ligação aptâmero-alvo fre-qüentemente ocorrem em sítios de ligação preferidos ou em um número relativamente pequenodestes no alvo que fornece interface estrutural estável e acessível para a interação. Além disso,quando SELEX é realizado em uma molécula alvo fisiológica o versado na tecnologia geralmentenão é capaz de controlar a licalização do aptâmero no alvo. Desta maneira, a localização do sítiode ligação ao aptâmero no alvo pode ou não ser em um dos potencialmente vários sítios de liga-ção ou próximo deles que podem levar ao efeito desejado, ou podem não ter nenhum efeito namolécula alvo.
Mesmo onde observa-se que um aptâmero, em virtue de sua capacidade de se ligar aoalvo, tem um efeito não existe maneira de prever a existência do efeito ou de saber antecipada-mente qual efeito será. Na execução de um experimento SELEX™ o versado na tecnologia nãopode saber com certeza quais aptâmeros, até o ponto em que é possível obter um aptâmero con-tra um alvo, terão a propriedade de ligação ao alvo. Pode-se realizar um experimento SELEX™ naesperança de que alguns dos aptâmeros identificados também tenham um efeito no alvo além dese ligar a ele, mas isto é incerto.
O método SELEX conta como um ponto de partida mediante uma grande biblioteca ougrupo de oligonucleotídeos de fita simples compreendendo seqüências aleatórias. Os oligonucleo-tídeos podem ser DNA, RNA, ou híbridos de DNA/RNA modificados ou não modificados. Em al-guns exemplos, o grupo compreende oligonucleotídeos 100 % aleatórias ou parcialmente aleató-rios. Em outros exemplos, o grupo compreende oligonucleotídeos aleatórios ou parcialmente alea-tórios contendo pelo menos uma seqüência fixa e/ou seqüência conservada incorporada na se-qüência aleatória. Em outros exemplos, o grupo compreende oligonucleotídeos aleatórios ou par-cialmente aleatórios contendo pelo menos uma seqüência fixa e/ou seqüência conservada emsuas extremidades 5' e/ou 3' que pode compreender uma seqüência compartilhada por to-das as moléculas do grupo de oligonucleotídeos. Seqüências fixas são seqüências comunsaos oligonucleotídeos no grupo que são incorporadas com um propósito pré-selecionado,tais como motivos de CpG descritos adicionalmente a seguir, sítios de hibridização para ini-ciadores de PCR1 seqüências promotoras para RNA polimerase (por exemplo, T3, T4, T7, eSP6), sítios de restrição ou seqüências homopoliméricas, tais como tratos poli A ou poli,núcleos catalíticos, sítios para ligação seletiva a colunas de afinidade e outras seqüênciaspara facilitar clonagem e/ou sequenciamento de um oligonucletídeo de interesse. Seqüên-cias conservadas são seqüências, a não ser as seqüências fixas previamente descritas, com-partilhadas por inúmeros aptâmeros que se ligam ao mesmo alvo.
Os oligonucleotídeos do grupo preferível mente incluem uma porção da seqüênciaaleatória, bem como seqüências fixas necessárias para amplificação eficiente. Tipicamenteos oligonucleotídeos do grupo de partida contêm seqüências terminais 5' e 3' fixas que flan-queiam uma região interna de 30-50 nucleotídeos aleatórios. Os nucleotídeos aleatorizadospodem ser produzidos de inúmeras formas incluindo síntese química e seleção de tamanhode ácidos nucléicos celulares clivados aleatoriamente.
A variação da seqüência em ácidos nucléicos de teste também pode ser introduzidaou aumentada pela mutagênese antes ou durante as interações de seleção/amplificação.
A porção da seqüência aleatória do oligonucleotídeo pode ser de qualquer compri-mento e pode compreender ribonucleotídeos e/ou deosoxirribonucleotídeos e pode incluirnucleotídeos modificados ou não naturais ou análogos de nucleotídeo. Ver, por exemplo,patente U.S. No. 5.958.691; patente U.S. No. 5.660.985; patente U.S. No.5.958.691; patenteU.S. No. 5.698.687; patente U.S. No. 5.817.635; patente U.S. No. 5.672.695, e pedido depatente PCT WO 92107065. Oligonucleotídeos aleatórios podem ser sintetizados a partir denucleotídeos ligados a fosfodiéster usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo de fasesólida bem conhecidas na tecnologia. Ver, por exemplo, Froehler et al., Nucl. Acid Res.14:5399-5467 (1986) e Froehler et al , Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Oligonucleotídeosaleatórios também podem ser sintetizados usando métodos de fase de solução, tais comométodos de síntese de triéster. Ver, por exemplo, Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977)e Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978). Sínteses típicas realizadas em equipamento desíntese de DNA automatizado produzem 1014-1016 moléculas individuais, um número sufici-ente para a maioria dos experimentos de SELEX. Regiões suficientemente grandes de se-qüência aleatória no projeto da seqüência aumenta a propabilidade de que cada moléculasintetizada seja provável de representar uma única seqüência.
A biblioteca de partida dos oligonucleotídeos pode ser gerada por síntese químicaautomatizada em um sintetizador de DNA. Para sintetizar seqüências aleatórias, misturas detodos os quatro nucleotídeos são adicionadas a cada etapa de adição de nucleotídeo duranteo processo de síntese, permitindo a incorporação de nucleotídeos aleatórios. Conforme esta-belecido anteriormente, em uma modalidade, oligonucleotídeos aleatórios compreendemseqüências completamente aleatórias; entretanto, em outras modalidades, oligonucleotídeosaleatórios podem compreender trechos de seqüências não aleatórias ou parcialmente alea-tórias. Seqüências parcialmente aleatórias podem ser criadas adicionando os quatro nucleo-tídeos em diferentes razões molares em cada etapa de adição.
A biblioteca de partida de oligonucleotídeos pode ser RNA, DNA, RNA ou DNA substituído ou combinações destes. Nestes exemplos onde uma biblioteca de RNA é usadacomo a biblioteca de partida ela é tipicamente gerada sintetizando uma biblioteca de DNA,opcionalmente amplificação de PCR, então transcrevendo a biblioteca de DNA in vitro usan-do RNA polimerase T7 ou RNA polimerases T7 modificadas, e purificando a bibliotecatranscrita. A biblioteca de ácido nucléico é então misyturada com o alvo em condições favo-ráveis para ligação e submetidas a iterações em etapas de ligação, particinamento e amplifi-cação, usanso o mesmo esquema de seleção geral, para atingir virtualmente qualquer crité-rio desejado de afinidade e seletividade de ligação. Mais especificamente, começando comuma mistura contendo o grupo de partida de ácidos nucléicos, o método SELEX inclui asetapas de: (a) colocar a mistura em contato com o alvo em condições favoráveis para Iiga-ção; (b) particionar ácidos nucléicos não ligados dos ácidos nucléicos que foram ligadosespecificamente às moléculas alvo; (c) dissociar os complexos ácido nucléico-alvo; (d) am-plificar os ácidos nucléicos dissociados dos complexos ácido nucléico-alvo para produzir umamistura enriquecida com Iigante de ácidos nucléicos; e (e) reiterar as etapas de ligar, particio-nar, dissociar e amplificar por meio de tantos ciclos posíveis desejados para produzir Iigantesde ácido nucléico altamente específicos, de alta afinidade à molécula alvo. Nestes exemplosonde aptâmeros de RNA são selecionados, o método SELEX™ adicionalmente compreendeas etapas de: (i) transcrever reversamente os ácidos nucléicos dissociados dos complexosácido nucléico-alvo antes da amplificação na etapa (d); e (ii) transcrever os ácidos nucléicosamplificados da etapa (d) antes de reiniciar o processo.
Em uma mistura de ácido nucléico contendo um grande número de seqüências eestruturas possíveis, existe uma ampla faixa de afinidades de ligação para um dado alvo. Osque têm a maior afinidade (menores constantes de dissociação) para o alvo são mais prová-veis de se ligar ao alvo. Depois do particionamento, dissociação e amplificação, uma segun-da mistura de ácido nucléico é gerada, enriquecida para os maiores candidatos a afinidadede ligação. Rodadas adicionais de seleção progressivamente favorecem os melhores Iigan-tes até que a mistura de ácido nucléico resultante seja predominantemente composta somen-te de uma ou poucas seqüências. Estas podem então ser clonadas, sequenciadas e individu-almente testadas como Iigantes ou aptâmeros para 1) afinidade de ligação ao alvo; e 2) ca-pacidade de efetuar a função alvo.
Ciclos de seleção e amplificação são repetidso até que uma meta desejada seja al-cançada. Na maioria dos casos gerais, seleção/amplificação continua até que nenhuma me-lhora significativa na força de ligação seja alcançada na repetição do ciclo. O método é tipi-camente usado para amostrar aproximadamente 1014 diferentes espécies de ácido nucléico,mas pode ser usado para amostrar tantos quanto cerca de 1018 diferentes espécies de ácidonucléico. Geralmente, moléculas de aptâmero de ácido nucléico são selecionadas em umprocedimento de 5 a 20 ciclos. Em uma modalidade, heterogeneidade é introduzida somentenos estágios de seleção inicial e não ocorre em todo o processo de replicação.
Em uma modalidade do método SELEX™, o processo de seleção é tão eficiente noisolamento dos ligantes de ácido nucléico que se liga mais fortemente ao alvo selecionado,que somente um ciclo de seleção e amplificação é necessário. Uma seleção eficiente comoesta pode ocorrer, por exemplo, em um processo tipo cromatográfico em que a capacidadedos ácidos nucléicos se associarem aos alvos ligados na coluna opera de uma maneira talque a coluna é suficientemente capaz de permitir separação e isolamento dos Iigantes deácido nucléico de maior afinidade.
Em muitos casos, não é necessariamenteo desejável realizar as etapas eterativasde SELEX™ até que um único Iigante de ácido nucléico seja identificado. A solução de Ii-20 gante de ácido nucléico específico do alvo pode incluir uma família de estrutura ou motivosde ácidos nucléicos que têm inúmeras seqüências conservadas e inúmeras seqüências quepodem ser substituídas ou adicionadas sem afetar significativamente a afinidade dos Iigantesde ácido nucléico ao alvo. A finalização do processo SELEX antes de ele ser completado épossível determinar a seqüência de inúmeros membros da família de solução do Iigante deácido nucléico.
Sabe-se que existe uma variedade de ácido nucléico de estruturas primárias, se-condárias e terciárias. As estruturas ou motivos que mostraram estar mais comumente envol-vidos nas interações tipo não Watson-Crick são referidas como voltas de hairpina, saliênciassimétricas e assimétricas, combinações pseudoknots e myriad do mesmo. Quase todos oscasos conhecidos de tais motivos sugerem que eles podem ser formados em uma seqüênciade ácidos nucléicos de não mais que 30 nucleotídeos. Por esta razão, freqüentemente pre-fere-se que procedimentos SELEX com segmentos aleatorizados contíguos sejam iniciadoscom seqüências de ácidos nucléicos contendo um segmento aleatorizado entre cerca de 20 acerca de 50 nucleotídeos e em algumas modalidades, cerca de 30 a cerca de 40 nucleotí-deos. Em um exemplo, a seqüência 5'-fixa:aleatória:3-fixa compreende uma seqüência alea-tória de cerca de 30 a cerca de 50 nucleotídeos.
O método de SELEX™ núcleo foi modificado para atingir inúmeros objetivos especí-ficos. Por exemplo, patente U.S. No. 5.707.796 descreve o uso de SELEX™ em conjuntocom eletroforese em gel para selecionar moléculas de ácido nucléicos com característicasestruturais específicas, tal como DNA torcido. A patente U.S. No. 5.763.177 descreve méto-dos a base de SELEX™ para selecionar Iigantes de ácido nucléico contendo grupos fororeativos capazes de ligar e/ou foro-reticular e/ou foto-inativar uma molécula alvo. A patenteU.S. No. 5.567.588 e patente U.S. No. 5.861.254 descreve métodos a base de SELEX™que alcançam particionamento altamente eficiente entre oligonucleotídeos com alta e baixaafinidade para uma molécula alvo. A patente U.S. No. 5.496.938 descreve métodos paraobter melhores Iigantes de ácido nucléico depois que o processo SELEX™ foi realizado. Apatente U.S. No. 5.705.337 descreve métodos para ligar covalentemente um Iigante ao seualvo.
SELEX™ também pode ser usado para obter ligantes de ácido nucléico que se li-gam a mais que um sítio nao molécula alvo, e para obter ligantes de ácido nucléico que in-cluem espécies de ácido não nucléico que se ligam a sítios específicos no alvo. SELEX™fornece meiod para isolar e identificar ligantes de ácido nucléico que se ligam a qualquer alvoconsiderável, incluindo biomoléculas grandes e pequenas, tais como proteínas que se ligamao ácido nucléico e proteínas que não se ligam aos ácidos nucléicos como parte de sua fun-ção biológica, bem como cofatores e outras moléculas pequenas. Por exemplo, a patenteU.S. No. 5.580.737 descreve seqüências de ácidos nucléicos identificadas por meio deSELEX™ que são capazes de se ligar com alta afinidade à cafeína e ao análogo intimamenterelacionado, teofilina.
Contra-SELEX™ é um método para melhorar a especificidade de Iigantes de ácidonucléico a uma molécula alvo eliminando seqüências de Iigante de ácido nucléico comcross-reatividade a uma ou mais moléculas não alvo. Contra- SELEX™ é composto dasetapas de: (a) preparar uma mistura candidata de ácidos nucléicos; (b) colocar a misturacandidata em contato com o alvo, em que ácidos nucléicos com uma maior afinidade para oalvo com relação à mistura candidata podem ser particionados do resíduo da mistura candida-ta; (c) particionar os ácidos nucléicos de maior afinidade do resíduo da mistura candidata;(d) dissociar os ácidos nucléicos de maior afinidade do alvo; (e) colocar os ácidos nucléicosde maior afinidade em contato com uma ou mais moléculas nao alvo, tais como Iigantes deácido nucléico com afinidade específica para a molécula não alvo(s) são removidos; e (f)amplificar os ácidos nucléicos com afinidade específica somente para a molécula alvo paraproduzir uma mistura de ácidos nucléicos enriquecida para seqüências de ácidos nucléicoscom uma afinidade e especificidade relativamente maiores para ligação à molécula alvo. Daforma descrita anteriormente para SELEX, ciclos de seleção e amplificação são repetidosconforme necessário até que uma meta desejada seja obtida.
Um problema potencial encontrado no uso de ácidos nucléicos como agentes tera-pêuticos, diagnósticos e vacinas é que oligonucleotídeos em sua forma fosfodiéster podemser rapidamente degradados em fluidos corporais por enzimas intracelulares e extracelulares,tais como endonucleases e exonucleases antes que o efeito desejado seja manifestado. Ométodo SELEX assim engloba a identificação de Iigantes de ácido nucléico de alta afinidadecontendo nucleotídeos modificados que conferem melhores características ao ligante, taiscomo melhor estabilidade in vivo ou melhores características de distribuição. Exemplos detais modificações incluem substituições químicas nas posições de açúcar e/ou fosfato e/oubase. Ligantes de ácido nucléico identificados por SELEX™ contendo nucleotídeos modifi-cados são descritos, por exemplo, na patente U.S. No. 5.660.985, que descreve oligonucleo-tídeos contendo nucleotídeo derivados quimicamente modificados na posição 2' da ribose,posição 5 de pirimidinas e posição 8 de purinas, patente U.S. No. 5.756.703 que descreveoligonucleotídeos contendo várias pirimidinas 2'-modificadas e patente U.S. No. 5.580.737que descreve Iigantes de ácido nucléico altamente específicos contendo um ou mais nucleo-tídeos modificados com substituintes 2'-amino (2' NH2), 2-flúor (2'-F), e/ou 2-O-metila (2-OMe).
Modificações dos Iigantes de ácido nucléico contemplados nesta invenção incluem,mas sem limitações, os que fornecem outros grupos químicos que incorporam carga adicio-nal, polarizabilidade, hidrofobicidade, ligação de hidrogênio, interação eletrostática, e fluxio-nalidade às bases Iigantes de ácido nucléico ou ao ligante de ácido nucléico como um todo.
Modificações para gerar populações de oligonucleotídeo que são resistentes a nucleasestambém podem incluir um ou mais ligações internucleotídeo substituto, açúcares alterados,bases alteradas ou combinações destes. Modificações como estas incluem, mas sem limita-ções, modificações de açúcar na posição 2', modificações de pirimidina na posição 5, modi-ficações de purina na posição 8, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracila; modificações na espinha dorsal, modifi-cações de fosforotioato ou alquil fosfato, metilações, e combinações de pareamento de baseincomuns, tais como as isobases isocitidina e isoguanosina. Modificações também podem incluirmodificações 3' e 5', tal como capeamento, por exemplo, adição de uma capa 3'-3-dT para au-mentar a resistência à exonuclease (ver, por exemplo, patentes U.S. 5.674.685; 5.668.264;6.207.816; e 6.229.002, cada uma das quais está aqui incorporada pela referência na sua íntegra).
Em uma modalidade, são fornecidos oligonucleotídeos em que o grupo P(O)O é substi-tuído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), P(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2("formacetal") ou 3'-amina (-NH-CH2-CH2-), em que cada R ou R' é independentemente H oualquila substituído ou insubstituído. Grupos de ligação podem ser anexados a nucleotídeos ad-jacentes por meio de uma ligação -O-, -N-, ou -S-. Não é necessário que todas as ligações nosoligonucleotídeo sejam idênticas.Em modalidades adicionais, os oligonucleotídeos compreendem grupos açúcar modifi-cados, por exemplo, um ou mais de grupos hidroxila são substituídos por halogênio, grupos ali-fáticos, ou funcionalizados como éteres ou aminas. Em uma modalidade, a posição 2' do resí-duo de furanose é substituída por qualquer um de um grupo O-metila, O-alquila, O-alila, S-alquila, S-alila ou halo group. Métodos de síntese de açúcares 2' modificados são descritos, porexemplo, em Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res.19:2629-2635 (1991); e Hobbs, et al., Biochemistry 12:5138-5145 (1973). Outras modificaçõessão cohecidas por um versado na tecnologia. Tais modificações podem ser modificações emprocesso pré-SELEX ou modificações em peocesso pós-SELEX™ (modificação de Iigantes nãomodificados previamente identificados) ou podem ser feitas pela incorporação no processoSELEX™.
Modificações de processo pré-SELEX ou as feitas pela incorporação no processoSELEX™ rendem Iigantes de ácido nucléico tanto com especificidade para seu alvo SELEX™quanto melhor estabilidade, por exemplo, estabilidade in vivo. Modificações de processo pós-SELEX™ feitas para Iigantes de ácido nucléico podem resultar em melhor estabilidade, por e-xemplo, estabilidade in vivo sem afetar adversamente a capacidade de ligação do ligante do ácido nucléico.
O método SELEX™ engloba combinar oligonucleotídeos selecionados com outras uni-dades funcionais de oligonucleotídeos e não oligonucleotídeo selecionadas descritas na patenteU.S. No. 5.637.459 e patente U.S. No. 5.683.867. O método SELEXtt11 adicionalmente en-globa combinar Iigantes de ácido nucléico selecionados com compostos de alto peso molecularlipofílicos ou não lipofílicos em um complexo diagnóstico ou terapêutico, da forma descrita, porexemplo, na patente U.S. No. 6.011.020, patente U.S. No. 6.051.698, e pedido de patente PCTNo. WO 98118480. Estas patentes e pedidos de patente preceituam a combinação de um amploarranjo de formas e outras propriedades, com as eficientes propriedades de amplificação e replica-ção de oligonucleotídeos, e com as propriedades desejáveis de outras moléculas.
A identificação de Iigantes de ácido nucléico a peptídeos pequenos, flexíveis por meio dométodo SELEX™ também foi explorado. Peptídeos pequenos têm estruturas flexíveis e normal-mente existem em solução em um equilíbrio de múltiplos conformers e, assim, inicialmente pen-sou-se que as afinidades de ligação podem ser limitadas pela entropia conformacional perdidamediante a ligação a um peptídeo flexível. Entretanto, a possibilidade de identificar Iigantes deácido nucléico para pequenos peptídeos em solução foi demonstrada na patente U.S. No.5.648.214. Nesta patente, Iigantes de ácido nucléico de RNA de alta afinidade a substância P, umpeptídeo do aminoácido 11, foram identificados.
Os aptâmeros com especificidade e afinidade de ligação aos complementos alvo da pre-sente invenção são tipicamente selecionados pelo processo SELEX™, da forma aqui descrita.Adicionalmente, seleções podem ser realizadas com seqüências que incorporam nucleotídeosmodificados para estabilizar as moléculas de aptâmero contra degradação in vivo.
SELEX™ 2'modificado
De maneira que um aptâmero seja adequado para uso como um terapêutico ou diagnós-tico, ele é preferivelmente barato para sintetizar, seguro e estável in vivo. Aptâmeros de RNA eDNAtipo selvagem não são tipicamente estáveis in vivo em virtude de sua suscetibilidade adegradação por nucleases. Resistência à degradação por nuclease pode ser muito aumentadapela incorporação de grupos de modificação na posição 2'.
Grupos 2-flúor e 2'-amino foram incorporados com êxito nos grupos de oligonucleotídeoa partir dos quais aptâmeros foram subseqüentemente selecionados. Entretanto, as modificaçõesaumentam muito o custo de síntese do aptâmero resultante e podem introduzir preocupação desegurança em alguns casos, em virtude da possibilidade de que os nucleotídeos modificados po-dem ser recclados no DNA do hospedeiro por degradação dos oligonucleotídeos modificados esubsequente uso dos nucleotídeos como substratos para síntese de DNA.
Aptâmeros que contêm nucleotídeos 2'-0-metila ("2'-0Me"), da forma aqui forneci-da, sobrepõe muitas destas desvantagens. Oligonucleotídeos contendo nucleotídeos 2-OMesão resistentes à nuclease e baratos de sintetizar. Embora nucleotídeos 2'-0Me sejam ubí-quos em sistemas biológicos, polimerases neutras não aceitam NTPs 2'-0Me como substra-tos em condições fisiológicas, assim não existem preocupações com segurança sobre areciclagem de nucleotídeos 2'-OMe no DNA do hospedeiro. Métodos SELEX™ usados paragerar aptâmeros 2'-modificados são descritos, por exemplo, no pedido de patente provisórioU.S. No. 60/430.761, depositado em 3 de dezembro de 2002, pedido de patente provisórioU.S. No. 60/487.474, depositado em 15 de julho de 2003, pedido de patente provisório U.S.No. 60/517.039, depositado em 4 de novembro de 2003, pedido de patente U.S. No.10/729.581, depositado em 3 de dezembro de 2003, pedido de patente U.S. No. 10/873.856,depositado em 21 de junho de 2004, intitulada "Methods for in vitro Selection of 2-O-methylSubstituted Nucleic Acids, pedido de patente provisório U.S. No. 60/696.292, depositado em30 de junho de 2005, intitulada "Improved Materials and Methods for the Generation of Fully2'-Modified Containing Nucleic Acids Transcrições" e pedido de patente U.S. No. 11/480.188depositado em 30 de junho de 2006 intitulada "Materials and Methods for the Generation ofFully 2'-Modified Containing Nucleic Acids Transcrições", cada uma das quais está aqui in-corporada pela referência na sua totalidade.
A presente invenção inclui aptâmeros que se ligam e modulam a função de um com-plemento alvo que contém nucleotídeos modificados (por exemplo, nucleotídeos que têmuma modificação na posição 2') para preparar os oligonucleotídeo mais estáveis que o oli-gonucleotídeo não modificado para degradação enzimática e química, bem como degrada-ção térmica e física. Em uma modalidade preferida, o dito complemento alvo é proteína docomplemento C5. Embora existam vários exemplos de aptâmeros contendo 2'-OMe na Iite-ratura (ver, por exemplo, Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995) estes foram geradospela seleção in vitro de bibliotecas de transcrições modificadas em que os resíduos de C eU foram substituídos por 2'-flúor (2'-F) e os resíduos AeG foram 2'-0H. Uma vez que asseqüências funcionais foram identificadas, então cada resíduo A e G foi testado para tole-rância à substituição 2'-0Me, e o aptâmero foi re-sintetizado com todos os resíduos AeGque toleraram substituição 2'-0Me como resíduos de 2'-0Me. A maioria dos resíduos AeGde aptâmeros gerados desta maneira de duas etapas tolerou substituição com resíduos de 2'-OMe, embora, em média, aproximadamente 20 % não tenha tolerado. Consequentemente,aptâmeros gerados usando este método tendem a conter de dois a quatro resíduos de 2'-OH1 e estabilidade e custo de síntese são comprometidos como um resultado. Incorporandonucleotídeos modificados na reação de transcrição que gera oligonucleotídeos estabilizados usa-dos em grupos de oligonucleotídeo a partir dos quais aptâmeros são selecionados e enriquecidospor SELEX™ (e/ou qualquer uma de suas variações e melhorias, incluindo as aqui descritas), osmétodos da presente invenção eliminam a necessidade de estabilizar os oligonucleotídeos aptâ-meros selecionados (por exemplo, re-sintetizando os oligonucleotídeos aptâmeros com nucleotí-deos modificados).
Em uma modalidade, a presente invenção fornece aptâmeros compreendendo combina-ções de 2-OH, 2'-F, 2'-deóxi, e modificações 2'-0Me dos nucleotídeos ATP, GTP, CTP, TTP, eUTP. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece aptâmeros compreendendo combi-nações de modificações 2-OH, 2-F, 2-deóxi, 2-OMe, 2-NH2, e 2'-metoxietila dos nucleotídeosATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece aptâmeroscompreendendo 56 combinações de modificações 2'-OH, 2'-F, 2-deóxi, 2-OMe, 2' N H 2, anad 2'-metoxietila dos nucleotídeos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Em uma modalidade preferida, a pre-sente invenção fornece aptâmeros compreendendo todos ou substancialmente todos nucleotídeosATP, GTP, CTP, TTP, e/ou UTP 2'-OMe modificados.
Aptâmeros 2'-modificados da invenção podem ser selecionados usando polimerasesmodificadas, por exemplo, uma polimerase T7 modificada, com uma taxa de incorporação de nu-cleotídeos modificados com substituintes volumosos na posição 2' da furanose que é maior que ade polimerases tipo selvagem. Por exemplo, uma polimerase T7 mutante em que o resíduo detirosina na posição 639 foi alterado por fenilalanina (Y639F) prontamente utiliza (incorpora) 2'deóxi,2'amino-, e 2'flúor- nucleotídeo trifosfatos (NTPs), mas não NTPs com 2'-substituintes volumosos,tais como substituintes 2-OMe ou 2-azido (2'-N3). Para a incorporação de 2'-substituintes volumo-sos, uma polimerase T7 mutante com a histidina na posição 784 alterou para um resíduo de alani-na além da mutação Y639F que foi descrita (Y639F/H784A) e foi usada em circunstâncias limitadaspara incorporar NTPs de pirimidina modificados. Ver Padilla, R. e Sousa, R., Nucleic Acids Res.,2002, 30(24): 138. Uma RNA polimerase T7 mutante em que o resíduo de tirosina na posição 639foi alterado para fenilalanina, o resíduo de histidina na posição 784 foi alterado para um alanina, e oresíduo de Iisina na posição 378 foi alterado para arginina (Y 639F1H784A1K378R) foi usada emcircunstâncias limitadas para incorporar NTPs de purina e pirimidina modificados, por exemplo,NTPs de 2-OMe, mas requer uma estaca de GTP de 2-OH para transcrição. Ver Burmeister etal, (2005) Chemistry and Biology, 12: 25-33. Embora não se deseje ficar preso à teoria, a muta-ção K378R não é próxima do sítio ativo da polimerase e, assim, acredita-se ser uma mutaçãosilenciosa, sem nenhum efeito na incorporação de NTPs 2'-OMe modificados. Uma polimeraseT7 mutante com a histidina na posição 784 alterada para um resíduo de alanina (H784A) tam-bém foi descrita. Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138. Tanto na polimerase T7mutante Y639F/H784A quanto mutante H784A, a troca para um resíduo de aminoácido menor,tal como alanina permite a incorporação de substratos de nucleotídeo mais volumosos, por e-xemplo, nucleotídeos 2-OMe substituídos. Ver Chelliserry, K. e Ellington, AD., (2004) NatureBiotech, 9:1155-60. RNA polimerases T7 adicionais foram descritas com mutações no sítio ativodo RNA polimerase T7 que mais prontamente incorpora substratos 2'-modificados volumosos,por exemplo, uma RNA polimerase T7 mutante com o resíduo de tirosina na posição 639 troca-do por uma Ieucina (Y639L).
Geralmente, observou-se que nas condições aqui descritas, o mutante Y693F pode serusado para a incorporação de todos os NTPs 2'-OMe substituídos exceto GTP e as RNA poli-merases T7 mutantes Y639F/H784A, Y639F1H784AIK378R, Y639L/H784A,Y639L/H784AJC378R, Y639L, Y639L/K378R, P266L/Y639L/H784A ou o mutanteP266L/Y639L/H784A/K378R podem ser usados nas condições aqui descritas para a incorpora-ção de todos os NTPs 2'-OMe substituídos incluindo 2'-OMe GTP.
Oligonucleotídeos 2'-modificados podem ser sintetizados completamente de nucleotí-deos modificados, ou com um subconjunto de nucleotídeos modificados. As modificações po-dem ser as mesmas ou diferentes. Alguns ou todos os nucleotídeos podem ser modificados e osque são modificados podem conter a mesma modificação. Alguns ou todos os nucleotídeos po-dem ser modificados e os que são modificados podem conter modificações diferentes, por e-xemplo, todos os nucleotídeos contendo a mesma base podem ter um tipo de modificação, en-quanto que nucleotídeos contendo outras bases podem ter tipos diferentes de modificação. To-dos os nucleotídeos de purina podem ter um tipo de modificação (ou são não modificados), en-quanto que todos os nucleotídeos de pirimidina têm um outro tipo diferente de modificação (ousão não modificados). Desta maneira, transcrições ou grupos de transcrições são geradas u-sando qualquer combinação de modificações, incluindo por exemplo, ribonucleotídeos (2'-OH),deosoxirribonucleotídeos (2-deóxi), 2-amino nucleotídeos (2'-M2), 2'-flúor nucleotídeos (2'-F), e2'-OH-metila (2'-OMe) nucleotídeos. Uma mistura de transcrição contendo 2'-OH A e G e 2' F Ce U é referida como uma mistura de "rRfY" e aptâmero selecionado dela são referidos comoaptâmeros "rRfY'. Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe CeUe 2'-OH A e G é referidacomo uma mistura "rRmY" e aptâmeros selecionados dela são referidos como aptâmeros"rRmY". Uma mistura de transcrição contendo deóxi AeGe 2'-OMe U e C é referida como umamistura "dRmY" e aptâmeros selecionados dela são referidos como aptâmeros "dRmY'. Umamistura de transcrição contendo 2'-OMe A, C1 e U, e 2-OH G é referida como uma mistura "rG-mH" e aptâmeros selecionados dela são referidos como aptâmeros "rGmH°. Uma mistura detranscrição alternativamente contendo 2'-OMe A, C1 U e G e 2'-OMe A, U e C e 2'-F G é referidacomo uma "mistura alternativa" e aptâmeros selecionados dela são referidos como aptâmerosde "mistura alternativa". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, C1 e G1 onde até 10% dos G's são ribonucleotídeos é referida como uma mistura "r/mGmH" e aptâmeros seleciona-dos dela são referidos como aptâmeros "r/mGmH". Uma mistura de transcrição contendo 2-OMe A, U1 e C1 e 2'-F G é referida como uma mistura "fGmH" e aptâmeros selecionados dela sãoreferidos como aptâmeros "fGmH". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, e C1 edeóxi G é referida como uma mistura "dGmH" e aptâmeros selecionados dela são referidos co-mo aptâmeros "dGmH". Uma mistura de transcrição contendo deóxi A, e 2'-OMe C1 G e U é refe-rida como uma mistura "dAmB" e aptâmeros selecionados dela são referidos como aptâmeros"dAmB", e uma mistura de transcrição contendo todos os 2'-OH nucleotídeos é referida comouma mistura ΎΝ" e aptâmeros selecionados dela são referidos como aptâmeros "rN", "rRrY" ou "RNA". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OH adenosina trifosfato e guanosina trifosfato edeóxi citidina trifosfato e timidina trifosfato é referida como uma mistura rRdY e aptâmeros sele-cionados dela são referidos como aptâmeros "rRdY'. Um "mRmY' também referido como um ap- tâmero "MNA" é um contendo somente nucleotídeos Z-O-metila, exceto para o nucleotídeo departida, que é guanosina 2'-OH ou qualquier guanosina tipo selvagem, e pode ser derivado deum oligonucleotídeo r/mGmH por substituição pós-SELEX™, quando possível, de qualquer Gs2'-OH por Gs 2'-OMe. Alternativamente, aptâmeros mRmY podem ser identificados porSELEX™ de mRmY.
Uma modalidade preferida inclui qualquer combinação de nucleotídeos Z-OH1 2'-deóxi
e 2'-OMe. Uma modalidade mais preferida inclui qualquer combinação de nucleotídeos 2-deóxie 2'-OMe. Uma modalidade ainda mais preferida é com qualquer combinação de nucleotídeos2-deóxi e 2'-OMe em que as pirimidinas são 2'-OMe (tais como dRmY, mRmY ou dGmH).
A incorporação de nucleotídeos modificados em aptâmeros da invenção é acompa-nhada antes (pré-) do processo de seleção (por exemplo, uma modificação do processo pré-SELEX™). Opcionalmente, aptâmeros da invenção em que nucleotídeos modificados foramincorporados por processo de modificação pré-SELBX™ podem ser adicionalmente modificadospor um processo de modificação pós-SELEX™ (isto é, um processo de modificação pós-SELEX™ depois de SELEX™). Processos de modificação pré-SELEX™ produzem Iigantesde ácido nucléico modificados com especificidade para o alvo SELEX™ e também melhorestabilidade in vivo. Processo de modificação pós- SELEX™, isto é, modificação (por exem-plo, truncação, deleção, substituição ou modificações adicionais de nucleotídeo dos Iigantespreviamente identificados com nucleotídeos incorporados por processo de modificação pré-SELEX™) pode resultar em uma melhoria adicional da estabilidade in vivo sem afetar adver-samente a capacidade de ligação do Iigante de ácido nucléico com nucleotídeos incorporadospelo processo de modificação pré-SELEX™.
Para gerar grupos de transcrições de RNA 2'-modificadas (por exemplo, 2'-OMe)em condições em que uma polimerase aceita NTPs 2'-modificados as RNA polimerases T7mutantes Y693F, Y693F/ K378R, Y693F/H784A, Y693F/H784A/K378R, Y693L/H784A,Y693L/C784A1K378R, Y639L, Y639L/K378R, P266L/Y639L/H784A eP266L/Y639L/H784A/K378R podem todas ser usadas. Outras RNA polimerases T7, particu-larmente as que apresentam um alta tolerância para 2'-substituintes volumosos, tambémpodem ser usadas na presente invenção. Quando usadas em uma polimerização direciona-da ao molde usando as condições aqui descritas, a RNA polimerase T7 mutanteY639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, o P266L/Y639L/H784A ou oP266L/Y639L/H784A/K378R pode ser usada para a incorporação de todos os NTPs 2'-OMe,incluindo GTP 2'-OMe, com maiores rendimentos de transcrição que a obtida usando asRNA polimerases T7 mutantes Y639F, Y639F/K37SR, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R,Y639L, Y639L/K378R. As RNA polimerases T7 mutantes Y639L/H784A,Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A e o P266L/Y639L1H784A/ K378R podem serusadas, mas não requerem, com GTP 2'-OH para atingir altos rendimentos de 2'-modificado,por exemplo, oligonucleotídeos contendo 2'-OMe.
Outras polimerases, particularmente as que apresentam uma alta tolerância a 2'-substituintes volumosos, também podem ser usadas na presente invenção. Tais polimerasespodem ser selecionadas para sua capacidade ensaiando sua capacidade de incorporar nu-cleotídeos modificados nas condições de transcrição aqui descritas.
Inúmeros fatores foram determinados importantes para as condições de transcriçãousadas nos métodos aqui descritos. Por exemplo, uma seqüência líder incorporada na se-qüência fixa na extremidade 5' de um molde de transcrição de DNA pode ser importantepara aumentar os rendimentos de transcrições modificadas quando as RNA polimerases T7mutantes Y639F/K378R ou Y639F/H784A/K378R são usadas para transcrição, por exemplo,nas condições de transcrição de dRmY ou r/mGmH descritas a seguir. Adicionalmente, uma se-qüência líder pode ser usada, mas não é necessariamente para ajudar a aumentar o rendimentodas transcrições modificadas quando, por exemplo a RNA polimerase T7 mutante Y639L/H784Aou Y639LIH784A/K378R é usada para transcrição, por exemplo, nas condições de transcrição demRmY descritas a seguir. A seqüência líder tem tipicamente 6-15 nucleotídeos de comprimento epode ser composta de todas as purinas, ou uma mistura de nucleotídeos purina e pirimidina.
Um outro importante fator na obtenção de transcrições que incorporam nucleotídeos mo-dificados é a presença ou concentração de guanosina 2-OH (por exemplo, GMP, GTP, ou umoutro não-2-OMe não-trifosfato). A transcrição pode ser dividida em duas fases: a primeira fase éa iniciação, durante a qual um NTP é adicionado à extremidade 3'-hidroxila de GTP (ou GMP1 ouum outro não trifosfato não 2'-OMe) para render um dinucleotídeo que é então extendido em até10-12 nucleotídeos; a segunda fase é o alongamento, durante o qual a transcrição procede alémda adição dos promeiros cerca de 10-12 nucleotídeos. Observou-se que pequenas quantidadesde GTP 2'-OH (ou GMP1 ou um outro não trifosfato não 2'-OMe) adicionadas a uma mistura detranscrição contendo um excessi de Z-OMe GTP são suficientes para possibilitar que a polimera-se inicie a transcrição usanso GTP 2'-OH (ou GMP1 guanosina, ou um outro não trifosfato não 2'-OMe). Assim, por exemplo, uma mistura de transcrição de dRmY (contendo deóxi purinas e piri-midinas 2'OMe) requer a adição de uma pequena quantidade de GMP para possibilitar que a po-Iimerase inicie a transcrição, onde em uma mistura de transcrição r/mGmH (contendo até 10 %de GTP 2'-OH), uma pequena quantidade de GMP pode ser adicionada à mistura de transcrição,mas não é requerida para possibilitar que a polimerase inicie a transcrição, em virtude de o GTP2'-OH já estar presente na mistura de transcrição. Uma vez que a transcrição entra na fase de alon-gamento, a menor discriminação entre GTP 2'-OMe e 2'-OH, e o excesso de GTP 2'-OMe sobreGTP 2'-OH permite a incorporação principalmente do GTP 2'-OMe.
Da forma descrita imediatamente antes, transcrição de iniciação com guanosina 2-OH(por exemplo, GMP, GTP ou um outro não trifosfato não-2-OMe) é importante. Este efeito resultada especificidade da polimerase para o nucleotídeo de iniciação. Consequentemente, o nucleotí-deo 5'-terminal de qualquer transcrição gerado desta maneira é provável de ser G 2-OH. A con-centração preferida de GMP é 0,5 mM e ainda mais preferivelmente 1 mM. Também observou-seque a inclusão de PEG, preferivelmente PEG-8000, na reação de transcrição é usada para maxi-mizar a incorporação de nucleotídeos modificados.
Um outro fator importante na incorporação de nucleotídeos 2'-OMe substituídos emtranscrições é o uso tanto de magnésio quanto de manganês divalente na mistura de transcrição.Observou-se que combinações de concentração diferentes de cloreto de magnésio e cloreto demanganês afetam os rendimentos de transcrições 2-O-metiladas, a concentração ideal do clore-to de magnésio e manganês dependendo da concentração na mistura da reação de transcriçãode NTPs que complexa íons metálicos divalentes. Para obter os maiores rendimentos de todasas transcrições 2'-0-metiladas (isto é, todos 2'-OMe A, C, e U e cerca de 90 % de nucleotídeosG), concentrações de aproximadamente 5 mM de cloreto de magnésio e 1,5 nM de cloreto demanganês são preferidas quando cada NTP está presente a uma concentração de 0,5 mM.
Quando a concentração de cada NTP é 1,0 mM , concentrações de aproximadamente 6,5 mMde cloreto de magnésio e 2,0 mM de cloreto de manganês são preferidas. Quando a concentra-ção de cada NTP for 2,0 mM, concentrações de aproximadamente 9,6 mM de cloreto de magné-sio e 2,9 mM de cloreto de manganês são preferidas. Em qualquer caso, saídas destas concen-trações de até duas vezes ainda dão quantidades significativas de transcrições modificadas.Em alguma modalidade é vantajoso iniciar a transcrição com GMP ou guanosina. Esteefeito resulta da especificidade da polimerase para o nucleotídeo de iniciação. Consequente-mente, o nucleotídeo 5'-terminal de qualquer transcrição gerado desta maneira é provável de serG 2-OH. A concentração preferida de GMP (ou guanosina) é 0, mM e ainda mais preferivelmen-te 1 mM. Também observou-se que a inclusão de PEG, preferivelmente PEG-8000, na reaçãode transcrição é usada para maximizara incorporação de nucleotídeos modificados.
Para a incorporação máxima de ATP (100 %), UTP (100 %), CTP (100 %) e GTP(90%) 2'-OMe ("r/mGmH") nas transcrições as seguintes condições são preferidas: tampãoHEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 %(p/v), MgCI2 5 mM (6,5 mM onde a concentração de cada NTP 2'-OMe é 1,0 mM), CI2 1,5 mM(2,0 mM onde a concentração de cada NTP 2'-OMe é 1,0 mM), NTP 2'-OMe (cada) 500 μΜ(mais preferivelmente, 1, mM), GTP 2'-OH 30μΜ, GMP 2-OH 500 μΜ, pH 7,5, RNA polimeraseT7 Y639F/H784A 15 unidades/mL, fosfatase inorgânica 5 unidades/mL, e um seqüência líder todade purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento. Da forma aqui usada, uma unidade daRNA polimerase T7 mutante Y639F/H784A (ou qualquer outra RNA polimerase T7 mutante aquiespecificada) é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 1 nmol deNTPs 2'-OMe nas transcrições nas r/mGmH de condições. Da forma aqui usada, uma unidade defosfatase inorgânica é definida como a quantidade de enzima que liberará 1,0 mol de ortofosfatoinorgânico por minuto a pH 7,2 e 25 °C.
Para a incorporação máxima (100 %) de GTP 2'-OH e 2'-OMe ATP, UTP e CTP ("rG-mH") nas transcrições as seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI2 5 mM (9,6 mMonde a concentração de cada NTP é 2,0 mM), MnCI21,5 mM (2,9 mM onde a concentração decada NTP é 2,0 mM), NTP (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 2,0 mM), GMP 2'-OH 1 mM,pH 7,5, RNA polimerase T7 Y639F/K378R 200 nM, fosfatase inorgânica 5 unidades/mL, e umuma seqüência líder toda de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
Para a incorporação máxima de ATP 2'-OMe (100 %), UTP 2-OMe (100 %), CTP 2-OMe (100 %) e GTP 2'-OMe (100 %) ("mRmY" ou "MNA") nas transcrições as seguintes condi-ções são preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10 %(p/v), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI2 8 mM, MnCI2 2,5 mM, NTP 2'-OMe (cada) 1,5 mM, GMP2'-OH 1 mM, ρH 7,5, RNA polimerase T7 mutante Y639UH784A/K378R 200nM, fosfataseinorgânica 5 unidades/mL, e uma seqüência líder opcional qua aumenta o rendimento da trans-crição nas condições de transcrição derivadas. Em uma modalidade, a seqüência líder opcional éuma seqüência líder toda de purina. Em uma outra modalidade, a seqüência líder opcional é umamistura de purinas e pirimidinas.
Para a incorporação máxima (100 %) de ATP e GTP 2'-OH, e UTP e CTP 2-OMe ("r-RmY') nas transcrições as seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI2 5 mM (9,6mM onde a concentração de cada NTP é 2,0 mM), MgCI2 1,5 mM (2,9 mM onde a concentra-ção de cada NTP é 2,0 mM), NTP (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 2,0 mM), GMP 2'-OH 1mM, pH 7,5, RNA polimerase T7 Y639F/H784A/K378R 200 nM, fosfatase inorgânica 5 unida-des/mL, e uma seqüência líder toda de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100 %) de ATP, UTP e CTP 2'-OMe ("rGmH") nas trans-crições as seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, es-pemadina 2 mM, PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI 5 mM (9,6 mM onde aconcentração de cada NTP 2'-OMe é 2,0 mM), MnCI21,5 mM (2,9 mM quando a concentraçãode cada NTP 2'-OMe é 2,0 mM), NTT 2'-OMe (cada) 500 mM (mais preferivelmente, 2,0 mM),pH 7,5, RNA polimerase T7 Y639F 15 unidades/mL, fosfatase inorgânica 5 unidades/mL e umaseqüência Iider toda de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100 %) de UTP e CTP 2'-OMe ("rRmY") nas transcriçõesas seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2mM, PEG-8000 10 % (wlv), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI2 5 mM (9,6 mM onde a concentra-ção de cada NTP 2'-OMe é 2,0 mM), MnCI21,5 mM (2,9 mM onde a concentração de cada NTP2'-OMe é 2,0 mM), NTP 2'-OMe (cada) 500 mM (mais preferivelmente, 2,0 mM), pH 7,5, RNApolimerase T7 Y639F/H784A 15 unidades/mL, fosfatase inorgânica 5 unidades/mL, e uma se-qüência líder toda de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100 %) de deóxi ATP e GTP e UTP e CTP 2'-OMe("dRrY") nas transcrições as seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 mM,DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 %(p/v), MgCI2 9,6 mM, MnCI2 2,9 mM, NTP (cada) 2,0 mM, GMP 2'-OH 1 mM, pH 7,5,Y639F1K3787R RNA polimerase T7 200 uM, fosfatase inorgânica 5 unidades/mL, e uma seqüên-cia líder toda de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100 %) de ATP, UTP e CTP 2'-OMe e GTP 2'-F ("fGmH")nas transcrições as seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 r M , DTT 40 mM,espermidina 2 mM, PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI2 9,6 mM, MnCI2 2,9NTP 2'-OMe (cada) 2,0 mM, GMP 2-OH 1 mM, pH 7,5, RNA polimerase T7 Y639F/K378R200nM, fosfatase inorgânica 5 unidades/mL, e uma seqüência líder toda de purina de pelo me-nos 8 nucleotídeos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100 %) de deóxi ATP e UTP, GTP e CTP 2'-OMe nastranscrições as seguintes condições são preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, es-permidina 2 PEG-8000 10 % (p/v), Triton X-100 0,01 % (p/v), MgCI2 9,6 mM, MnCI2 2,9 mM,NTP (cada) 2,0 mM, GMP 2-OH 1 mM, pH 7,5, RNA polimerase T7 Y639F/K378R20, fosfataseinorgânica 5 unidades/mL, e uma seqüência líder toda de purina de pelo menos 8 nucleotídeosde comprimento.Cada uma das transcrições anteriores (a) é preferivelmente realizada a uma tempera-tura de cerca de 20°C a cerca de 50 °C, preferivelmente cerca de 30°C a 45 °C, e mais preferi-velmente a cerca de 37°C por um período de pelo menos duas horas e (b) 50-300 nM de ummolde de transcrição de DNA de fita dupla é usado (molde 200 nM é usado na rodada 1 paraaumentar a diversidade (molde de 300 nM é usado nas transcrições dRmY)), e para as rodadassubsequentes aproximadamente 50 mM, uma diluição 1/10 de uma reação de PCR otimizada,usando as condições aqui descritas, é ussado). Os moldes de transcrição de DNA preferidos sãodescritos a seguir (onde ARC254 e ARC256 5 transcrevem em todas as condições 2'-OMe eARC255 transcreve em condições rRmY).
ARC 254 SEQID NO: 99
AGTCGTATTA-3 *
ARC 255 SEQID NO: 100
SMÍATGCATCGCGACnOACTAGCeG^^AGTCGTATTA-3'
ARC 256 SEQID NO: 101
5'-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNÍWAGTCGTATTA-3*
Em condições de transcrição rN, a mistura da reação de transcrição compreende adeno-sinas trifosfato 2-OH (ATP), guanosinas trifosfato 2-OH (GTP)1 citidinas trifosfato 2-OH (CTP)1 euridinas trifosfato 2'-OH (UTP). Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturasde transcrição rN da presente invenção compreendem substancialmente todos adenosina 2'-OH,guanosina 2'-OH, citidina 2'-OH, e uridina 2'-OH. Em uma modalidade preferida da transcrição rN,os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-OH, pelo menos 80 % de todos nucleotí-deos guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos citidina são citidina2'-OH, e pelo menos 80 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2-OH. Em uma modalidademais preferida de transcrição rN, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente inven-ção compreendem uma seqüência onde pelo menos 90 % de todos os nucleotídeos adenosinasão adenosina 2'-OH, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-OH,pelo menos 90 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-OH, e pelo menos 90 % de todosnucleotídeos uridina são uridina 2'-OH. Em uma modalidade acima de tudo preferida de transcri-ção rN, os oligonucleotídeos modificados da presente invenção compreendem uma seqüênciaonde 100 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-OH, 100 % de todos nucleotí-deos guanosina são guanosina 2'-OH, 100 % de todos os nucleotídeos citidina são citidina 2'-OH,e 100 % de todos os nucleotídeos uridina são uridina 2'-OH.
Em condições de transcrição rRmY, a mistura da reação de transcrição compreende a-denosinas trifosfato 2'-OH, guanosinas trifosfato 2'-OH, citidinas trifosfato 2'-OMe, e uridina trifos-fato 2'-OMe. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcriçãorRmY da presente invenção compreendem substancialmente toda as adenosina 2'-OH, gua-nosina 2'-OH, citidina 2'-OMe e uridina 2'-OMe. Em uma modalidade preferida, os oligonu-cleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80 % detodos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-OH, pelo menos 80 % de todos nucleotí-deos guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos citidina sãocitidina 2'-OMe e pelo menos 80 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-OMe. Emuma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendemuma seqüência onde pelo menos 90 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina2'-OH, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-OH, pelo me-nos 90 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-OMe e pelo menos 90 % de todosnucleotídeos uridina são uridina 2'-OMe. Em uma modalidade acima de tudo preferida, osoligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde 100 % detodos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-OH, 100 % de todos nucleotídeos gua-nosina são guanosina 2-OH1 100 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-OMe e 100% de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-OMe.
Em condições de transcrição dRmY, a mistura da reação de transcrição compreen-de adenosinas trifosfato 2'-deóxi, guanosinas trifosfato 2'-deóxi, citosinas trifosfato 2-0-metila e uridinas trifosfato 2'-0-metila. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usandoas condições de transcrição dRmY da presente invenção compreendem substancialmentetodos adenosina 2'-deóxi, guanosina 2'-deóxi, citidina 2'-0-metila, e uridina 2'-0-metila. Emuma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente inven-ção compreendem uma seqüência onde pelo menos 80 % de todos os nucleotídeos adenosi-na são adenosina 2'-deóxi, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosi-na 2'-deóxi, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, e pelomenos 80 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila. Em uma modalidademais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compre-endem uma seqüência onde pelo menos 90 % de todos os nucleotídeos adenosina são a-denosina 2'-deóxi, pelo menos 90 % de todos os nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-deóxi, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, e pelo menos90 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila. Em uma modalidade acima detudo preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compre-endem uma seqüência onde 100 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-deóxi, 100 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-deóxi, 100 % de todos nu-cleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, e 100 % de todos nucleotídeos uridina são uridi-na 2'-0-metila.
Em condições de transcrição rGmH, a mistura da reação de transcrição compreen-de guanosinas trifosfato 2'-OH, citidinas trifosfato 2'-OMe, uridina trifosfato 2'-OMe, e ade-nosinas trifosfato 2'-0-Me. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturasde transcrição rGmH da presente invenção compreendem substancialmente todos guanosi-na 2'-OH, citidina 2'-OMe, uridina 2'-OMe, e adenosina 2'-OMe. Em uma modalidade prefe-rida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelomenos 80 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 80 % detodos nucleotídeos citidina são citidina 2'-OMe, pelo menos 80 % de todos nucleotídeosuridina são uridina 2'-OMe, e pelo menos 80 % de todos os nucleotídeos adenosina são a-denosina 2'-OMe. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificadosresultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90 % de todos nucleotídeosguanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos citidina são citidina2'-OMe, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-OMe, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-OMe. Em uma modalidade acimade tudo preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüên-cia onde 100 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-OH, 100 % de todos nu-cleotídeos citidina são citidina 2' - OMe1 100 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-OMe e 100 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-0-Metila.
Em condições de transcrição r/mGmH, a mistura da reação de transcrição compre-ende adenosina trifosfáto 2'-0-metila, citidina trifosfato 2'-0-metila, guanosina trifosfato 2-O-metila, uridina trifosfato 2'-0-metila e guanosina trifosfato 2'-OH. Os oligonucleotídeos modifi-cados resultantes produzidos usando as misturas de transcrição r/mGmH da presente inven-ção compreendem substancialmente todos adenosina 2'-0-Metila, citidina 2' - O-metila, gua-nosina 2'-0-metila, e uridina 2'-0-metila, em que a população de nucleotídeos guanosinatem um máximo de cerca de 10 % de guanosina 2'-OH. Em uma modalidade preferida, osoligonucleotídeos modificados r/mGmH resultantes da presente invenção compreendem umaseqüência onde pelo menos 80 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-0-Metila, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, pelo menos 80% de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-metila, pelo menos 80 % de todosnucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila, e não mais que cerca de 10 % de todos nucleo-tídeos guanosina são guanosina 2'-OH. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleo-tídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90 % detodos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-0-metila, pelo menos 90 % de todos nu-cleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos guanosi-na são guanosina 2'-0-metila, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos uridina são uridina2'-0-metila, e não mais que cerca de 10 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina2'-OH. Em uma modalidade acima de tudo preferida, os oligonucleotídeos modificados resul-tantes compreendem uma seqüência onde 100 % de todos os nucleotídeos adenosina sãoadenosina 2'-0-metila, 100 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, 90 % detodos nucleotídeos guanosina são guanosina 2-O-metila e 100 % de todos nucleotídeosuridina são uridina 2'-0-metila, e não mais que cerca de 10 % de todos nucleotídeos guano-sina são guanosina 2'-OH.
Em condições de transcrição mRmY (também referida aqui como MNA), a misturade transcrição compreende somente adenosina trifosfato 2'-0-metíla, citidina trifosfato 2'-0-metila, guanosina trifosfato 2'-0-metila, uridina trifosfato 2'-0-metila. Os oligonucleotídeosmodificados resultantes produzidos usando a mistura de transcrição mRmY da presenteinvenção compreendem uma seqüência onde 100 % de todos os nucleotídeos adenosinasão adenosina 2'-0-Metila, 100 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, 100% de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-0-metila (exceto para a primeira gua-nosina dos oligonucleotídeo), e 100 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila.
Em condições de transcrição fGmH, a mistura da reação de transcrição compreen-de adenosinase trifosfato 2-O-metila, uridinas trifosfato 2'-0-metila, citidina trifosfato 2'-0-metila, e guanosinas trifosfato 2'-F. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando ascondições de transcrição fGmH da presente invenção compreendem substancialmente to-dos adenosina 2'-0-metila, uridina 2'-0-metila, citidina 2'-0-metila, e guanosina 2'-F. Emuma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem umaseqüência onde pelo menos 80 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-0-Metila1 pelo menos 80 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila, pelo menos80 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, e pelo menos 80 % de todos- nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-F. Em uma modalidade mais preferida, os oligonu-cleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90 % detodos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-0-Metila, pelo menos 90 % de todos nu-cleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila, pelo menos 90 % de todos nucleotídeos citidinasão citidina 2'-0-metila, e pelo menos 90 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina2'-F. Em uma modalidade acima de tudo preferida, os oligonucleotídeos modificados resul-tantes compreendem uma seqüência onde 100 % de todos os nucleotídeos adenosina sãoadenosina 2'-0-metila, 100 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila, 100 %de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, e 100 % de todos nucleotídeos gua-nosina são guanosina 2'-F.
Em condições de transcrição dAmB, fosfatos, citidina trifosfato 2'-0-metila, guano-sinas trifosfato 2'-0-metila, e uridinas trifosfato 2'-0-metila. Os oligonucleotídeos modificadosproduzidos usando as misturas de transcrição dAmB da presente invenção compreendemsubstancialmente todos adenosina 2'-deóxi, citidina 2'-0-metila, guanosina 2'-0-metila, euridina 2'-0-metila. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resul-tantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80 % de todos os nucleotídeos ade-nosina são adenosina 2'-deóxi, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos citidina são citidina2'-O-metila, pelo menos 80 % de todos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'O-metila, epelo menos 80 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila. Em uma modalidademais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüênciaonde pelo menos 90 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-deóxi, pelomenos 90 % de todos nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, pelo menos 90 % detodos nucleotídeos guanosina são guanosina 2'-0-metila, e pelo menos 90 % de todos nu-cleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila. Em uma modalidade acima de tudo preferida, osoligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma se-qüência onde 100 % de todos os nucleotídeos adenosina são adenosina 2'-deóxi, 100 % detodos os nucleotídeos citidina são citidina 2'-0-metila, 100 % de todos nucleotídeos guano-sina são guanosina 2'-0-metila, e 100 % de todos nucleotídeos uridina são uridina 2'-0-metila.
Em cada caso, os produtos de transcrição podem então ser usados como a biblio-teca no processo SELEX™ para identificar aptâmeros e/ou para determinar um motivo con-servado de seqüências que têm especificidade de ligação a um dado alvo. As seqüênciasresultantes já são estabilizadas, eliminando esta etapa do processo para chegar a uma se-qüência de aptâmeros estabilizada e dando um aptâmero altamente estabilizado como re-sultado. Uma outra vantagem do processo SELEX™ de 2'-OMe é que as seqüências resul-tantes são prováveis de ter menos nucleotídeos 2'-OH necessários na seqüência, possivel-mente nenhum. Até o ponto em que os nucleotídeos 2ΌΗ permanecem eles podem ser re-áp movidos realizando modificações pós-SELEX™.
Da forma descrita a seguir, rendimentos baixos, mas ainda usados de transcriçõesque incorporam completamente nucleotídeos 2' substituídos podem ser obtidos em condi-ções a não ser as condições otimizadas descritas anteriormente. Por exemplo, variaçõesdas condições de transcrição anteriores incluem:
A concentração de tampão HEPES pode variar de 0 a 1 Μ. A presente invençãotambém contempla o uso de outros agentes de tamponamento com um pKa entre 5 e 10 in-cluindo, por exemplo, Tris(hidroximetil)aminometano.
A concentração DTT pode variar de 0 a 400 mM. Os métodos da presente invençãotambém fornece o uso de outros agentes de redução incluindo, por exemplo, mercaptoetanol.
A concentração de espermidina e/ou espermina pode variar de 0 a 20 mM.
A concentração de PEG-8000 pode variar de 0 a 50 % (p/v). Os métodos da pre-sente invenção também fornecem o uso de outros polímeros hidrofílicos incluindo, por e-xemplo, outros PEG de peso molecular ou outros polialquileno glicóis.
A concentração de Triton X-100 pode variar de 0 a 0,1 % (p/v). Os métodos da pre-sente invenção também fornecem uso de outros detergentes não iônicos incluindo, por e-xemplo, outros detergentes, incluindo outros detergentes de Triton-X.A concentração de MgCI2 pode variar de 0,5 mM a 50 mM. A concentração de Mn-Cl2 pode variar de 0,15 mM a 15 mM. Tanto MgCI2 quanto MnCI2 devem estar presentes nasfaixas descritas e em uma modalidade preferida são presentes em cerca de um a cerca de 3razões de MgCI2:MnCI2, preferivelmente, a razão é cerca de 3-5:1, mais preferivelmente, arazão é cerca de 3-4:1.
A concentração de NTP 2'-OMe (cada NTP) pode variar de 5 μΜ a 5 mM.
A concentração de GTP 2'-OH pode variar de 0 μΜ a 300 μΜ. Ε, algumas moda-lidades a transcrição ocorre na ausência de GTP 2'-OH (0 μΜ)
A concentração de GMP 2'-OH, guanosina ou outros G 2'-OH substituídos em umaposição a não ser a posição 2'açúcar, pode variar de 0 a 5 mM e onde, em algumas modali-dades, GTP 2'-OH não está incluído na reação GMP 2'-OH é necessário e pode variar de 5 μΜ a5 mM.
O concentração do molde de DNA pode variar de 5 nM a 5 μΜ.
A concentração de polimerase mutante pode variar de 2nM a 20 μΜ.
O fosfatase inorgânica pode variar de 0 a 100 unidades/mL.
O pH pode variar de pH 6 a pH 9. Os métodos da presente invenção podem ser pratica-dos na faixa de atividade de pH da maioria das polimerases que incorporam nucleotídeos modifi-cados.
A reação de transcrição pode ocorrer naturalmente cerca de uma hora a semanas, prefe-rivelmente cerca de 1 a cerca de 24 horas.
Os aptâmeros selecionados com a maior afinidade e ligação específicas, da forma de-monstrada por ensaios biológicos descritos nos exemplos a seguir, são terapêuticos adequadospara tratar condições em que a proteína do complemento C5 está envolvida na patogênese.
QUÍMICA MEDICINAL DO APTÂMERO
Uma vez que aptâmeros que se ligam a um alvo desejado são identificados, várias técni-cas podem ser opcionalmente realizadas para adicionalmente aumentar as características de liga-ção e/ou funcionais da seqüências de aptâmeros identificadas. Aptâmeros que se ligam a um alvodesejado identificado por meio do processo SELEX™ (incluindo SELEX™ 2'modificado) podemser opcionalmente truncados para obterá seqüência de aptâmeros mínima (também referida aquicomo "construtor minimizado") com as características de ligação e/ou funcionais desejadas. Ummétodo de realizar isto é usando programas de dobra e análise de seqüência (por exemplo, se-qüências clone de alinhamento resultante de uma seleção para procurar motivos e/ou covariaçãoconservados) para informar o projeto de construtores minimizados. Experimentos de sondagembioquímicos também podem ser realizados para determinar os limites 5' e 3' de uma seqüência deaptâmeros para informar o projeto de construtores minimizados. Construtores minimizados entãopodem ser quimicamente sintetizados e testados para as características de ligação e funcionaiscomparados à seqüência não minimizada da qual eles foram derivados. Variantes de uma se-qüência de aptâmeros contendo uma série de deleções 5', 3' e/ou internas também podem sersintetizados e testados quimicamente de forma direta para características de ligação e/ou funcio-nais comparados à seqüência de aptâmeros não minimizada da qual eles foram derivados.
Adicionalmente, re-seleções dopadas podem ser usadas para explorar as necessida-des da seqüência em uma seqüência de aptâmeros ativa simples (isto é, um aptâmero que seliga a um alvo desejado identificado por meio do processo SELEX™, (incluindo SELEX™2'modificado), ou uma seqüência de aptâmeros minimizada simples. Re-seleções dopadassão realizadas usando um grupos sintéticos, degenerados que foram projetados com base naúnica seqüência de interesse. O nível de degeneração normalmente varia 70 % a 85 % donucleotídeo tipo selvagem, isto é, a única seqüência de interesse. No geral, seqüências commutações neutras são identificadas por meio do processo de re-seleção dopada, mas em al-guns casos as mudanças na seqüência pode resultar em melhorias na afinidade. A informa-ção de seqüência compósita dos clones identificados usando re-seleções dopadas então podeser usada para identicar o motivo de ligação mínimo e auxiliar nos esforços de otimização.
Seqüências de aptâmeros identificadas usando o processo SELEX™ (incluindoSELEX™ 2'modificado e re-seleções dopadas) e/ou seqüências de aptâmeros minimizadastambém podem ser opcionalmente otimizados pós SELEX™ usando química medicinal deaptâmero para realizar mutagênese aleatória ou direcionada da seqüência para aumentar ascaracterísticas de afinidade ligação e/ou funcionais, ou alternativamente para determinar queposições na seqüência são essenciais para as características de afinidade ligação e/ou fun-cionais.
A química medicinal de aptâmero é uma técnica de melhoria de aptâmero em queconjuntos de aptâmeros variantes são quimicamente sintetizados. Os conjuntos de variantestipicamente diferem do aptâmero pai pela introdução de um único substituinte, e diferem umdo outro pela localização deste substituinte. Estes variantes são então comparados um aooutro e ao pai. Melhorias nas características podem ser profundas o suficiente que a inclusãode um único substituinte pode ser tudo que é necessário para atingir um critério terapêuticoparticular.
Alternativamente a informação compilada do conjunto de variantes únicas pode serusada para projetar conjuntos adicionais de variantes em que mais que um substituinte é in-troduzido simultaneamente. Em uma estratégia de projeto, todos dos varientes de substituinteúnico são classificados, os 4 maiores são escolhidos e todas as possíveis dupla (6), tripla (4) equádrupla (1) combinações destes 4 variantes de substituinte único são sintetizados e ensaia-dos. Em uma segunda estratégia de projeto, o melhor variante de substituinte único é conside-rado o pai inédito e todos os possíveis variantes de substituinte duplo que incluem este varian-te de substituinte único de maior classificação são sintetizados e ensaiados. Outras estraté-gias podem ser usadas e estas estratégias podem ser aplicadas, de maneira tal que inúmerossubstituintes sejam gradualmente maiores continuando ao mesmo tempo a identificar variantes adicio-nalmente melhores.
Química medicinal de aptâmero pode ser usada particularmente como um método para explo-rar a introdução local, em vez de global, de substituintes. Em virtude de os aptâmenos serem descobertosem bibliotecas que são geradas por transcrição, quaisquer substituintes que são introduzidos durante oprocesso SELEX™ devem ser introduzidos globalmente. Por exemplo, se deseja-se introduzir ligaçõesde fosforotioato entre nucleotídeos, então eles somente podem ser introduzidos em cada A (ou cada G1C, T, U etc.) (globalmente substituído). Aptâmeros que requerem fosforotioatos am alguns As (ou algunsG, C, T, U etc.) (localmente substituídos) mas não toleram-no em outros As não podem ser prontamentedescobertos por este processo.
Os tipos de substituinte que podem ser utilizados pelo processo da química medicinal de aptâ-mero são somente limitados pela capacidade de gerá-los como reagentes de síntese de fase sólida eintroduzi-los em um esquema de síntese de oligômero. O processo certamente não é limitado a nucleo-tídeos sozinhos. Esquemas de química medicinal de aptâmero podem incluir substituintes que intnodu-zem volume estérico, hidrofobicidade, hidrofilicidade, lipofílicidade, lipofobicidade, canga positiva, carganegativa, carga neutra, zwiterions, polarizabilidade, resistência à nuclease, rigidez conformacional, flexibi-lidade conformacional, características de ligação à proteína, massa etc. Esquemas de química medicinalde aptâmero podem incluir modificações de base, modificações de açúcar ou modificações de ligação defosfodiéster.
Considerando os tipos de substituintes que são prováveis de ser benéficos no contexto de umaptâmero terapêutico, pode ser desejável introduzir substituiçãos que caem em uma ou mais das seguintescategorias:
(1) Substituintes já presentes no corpo, por exemplo, purinas ou pirimidinas 2'-deóxi, 2'-ribo, 2'-O-metila ou citosina 5 -metila.
(2) Substituintes já parte de um terapêutico aprovado, por exemplo, oligonucleotídeos ligados afosforotioato.
(3) Substituintes que hidrolizam ou degradam a uma das duas categorias anteriores, por e-xemplo, oligonucleotídeos ligados a metilfosfonato.
Os aptâmenos da presente invenção incluem aptâmenos desenvolvidos por meio de químicamedicinal de aptâmero aqui descrita.
Afinidade de ligação ao alvo dos aptâmeros da presente invenção pode ser estimadapor meio de uma série de reações de ligação entre o aptâmero e alvo (por exemplo, uma pro-teína) em que traçso de aptâmero marcado 32P é incubado com uma diluição em série do alvoem um meio tamponado então analisado por filtração em nitrocelulose usando um dispositivode distribuição de filtração a vácuo. Referido aqui como o ensaio de ligação dot blot, este mé-todo usa um meio de filtração de três camadas consistindo (do topo para a base) de nitrocelu-lose, filtro de náilon e papel de gel blot. RNA que é ligado ao alvo é capturado no filtro de nitro-celulose em que o RNA ligado não-alvo é capturado no filtro de náilon. O papel de gel blot éincluído como um meio de suporte para os outros filtros. Depois da filtração, as camadas dofiltro são separadas, secas e expostas em uma tela de fósforo e quantificadas usando um sis-tema de fosforoimageamento delas. Os resultados quantificados podem ser usados para gerarcurvas de ligação ao aptâmero a partir das quais as constantes de dissociação (K0) podem sercalculadas. Em uma modalidade preferida, o meio tamponado usado para realizar as reaçõesde ligação é 1X PBS de Dulbecco (com Ca++ e Mg++) mais 0,1 mg/mL de BSA.
No geral, a capacidade de um aptâmero modular a atividade funcional de um alvo, is-to é, a atividade funcional do aptâmero, pode ser estimada usando modelos in vitro e in vivo,que variarão dependendo da função biológica do alvo. Em algumas modalidades, os aptâme-ros da presente invenção podem inibir uma função biológica conhecida do alvo, enquanto queem outras modalidades os aptâmeros da invenção podem estimular uma função biológicaconhecida do alvo. A atividade funcional de aptâmeros da presente invenção pode ser estima-da usando modelos in vitro e in vivo projetados para medir uma função conhecida de umcomponente do complemento alvo.
Os aptâmeros da presente invenção podem ser rotineiramente adaptados para pro-pósitos de diagnóstico de acordo com qualquer uma das inúmeras técnicas empregadas pelosversados na tecnologia. A utilização de diagnóstico pode incluir tanto aplicações de diagnósti-$ co in vivo quanto in vitro. Agentes de diagnóstico precisam somente ser capazes de permitir$0 que o usuário identifique a presença de um dado alvo em um local ou concentração particular.Simplesmente a capacidade de formar pares de ligação com o alvo pode ser suficiente paradisparar um sinal positivo para propósitos de diagnóstico. Versados na tecnologia também sãocapazes de adaptar qualquer aptâmero por procedimentos conhecidos na tecnologia paraincorporar um tag de marcação, de maneira a rastrear a presença de tal ligante. Um tag comoeste pode ser usado em inúmeros procedimentos de diagnóstico.
MODULAÇÃO DE FARMACOCINÉTICA E BIODISTRIBUICÂO DE TERAPÊUTICOSDE APTÂMERO
É importante que as propriedades farmacocinética para todos os terapêuticos a basede oligonucleotídeo, incluindo aptâmeros, sejam adequadas para atingir a aplicação farmacêuti-ca desejada. Embora aptâmeros direcionados contra alvos extracelulares não apresentemdificuldades associadas à distribuição intracelular (como é o caso com terapêuticos a base deantisentido e RNAi), tais aptâmeros ainda devem ser capazes de ser distribuídos aos órgãos etecidos alvo e permanecer no corpo (não modificados) por um período de tempo consistentecom o regime de dosagem desejado.
Assim, a presente invenção fornece materiais e métodos para afetar as farmacociné-tica da composição de aptâmeros e, em particular, a capacidade de regular a farmacocinéticado aptâmero. A tenabilidade da (isto é, a capacidade de modular) farmacocinética do aptâme-ro é alcançada por meio da conjugação das frações de modificação (por exemplo, polímerosPEG) ao aptâmero e/ou a incorporação de nucleotídeos modificados (por exemplo, 2'-flúor ou2'-0-metila) para alterar a composição química do ácido nucléico. A capacidade de modularda farmacocinética do aptâmero é usada namelhoria das aplicações terapêuticas já existen-tes, ou alternativamente, no desenvolvimento de aplicações terapêuticas inéditas. Por exem-plo, em algumas aplicações terapêuticas, por exemplo, em antineoplasticos ou montagens decuidado agudo onde rápida depuração do medicamento ou desligamento pode ser desejada,é desejável diminuir os tempos de residência de aptâmeros na circulação. Alternativamente,em outras aplicações terapêuticas, por exemplo, terapias de manutenção onde circulação sis-têmica de um terapêutico é desejada, pode ser desejável aumentar os tempos de residência deaptâmeros na circulação.
Além do mais, o tenabilidade da farmacocinética do aptâmero é usada para modificara biodistribuição de um aptâmero terapêutico em um sujeito. Por exemplo, em algumas apli-cações terapêuticas, pode ser desejável alterar a biodistribuição de um aptâmero terapêuticoem um esforço para alvejar um tipo particular de tecido ou um órgão específico (ou conjunto deórgãos). Nestas aplicações, o aptâmero terapêutico preferencialmente acumula em um tecidoou órgão(s) específico. Em outras aplicações terapêuticas, pode ser desejável alvejar tecidosque apresentam um marcador celular ou um sintoma associado a uma dada doença, lesãocelular ou outra patologia anormal, de maneira tal que o aptâmero terapêutico preferencialmen-te acumula no tecido afetado. Por exemplo, da forma descrita no pedido de patente provisóriodos Estados Unidos No. 601550790, depositado em 5 de março de 2004, e intitulado "Control-Ied Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribuição of Aptamer-Therapeutics, e no nopedido de patente não provisório dos Estados Unidos No. de série 11/075.648 depositado em7 de março de 2005, e intitulado "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistri-buição of Aptamer-Therapeutics", PEGuilação de um aptâmero terapêutico (por exemplo,PEGquilação com um polímero PEG 20 kDa) é usada para alvejar tecidos inflamados, de ma-neira tal que o aptâmero terapêutico PEGuiIado preferencialmente acumule no tecido infla-mado.
Para determinar os perfis farmacocinético e de biodistribuição de terapêuticos de ap-tâmero (por exemplo, aptâmeros conjugados ou aptâmeros com química alterada, tais comonucleotídeos modificados) uma variedade de parâmetros é monitorada. Tais parâmetros inclu-em, por exemplo, a meia-vida (ti/2), a depuraçxão plasmática (C1), o volume de distribuição(Vss), a área sobre a curva concentração-tempo (AUC), concentração sérica ou plasmáticamáxima observada (Cmax), e o tempo de residência médio (MRT) de uma composição de ap-tâmero. Da forma aqui usada, o termo "AUC refere-se à área sobre o gráfico da concentraçãoplasmática de um aptâmero terapêutico em função do tempo depois da administração do aptâ-mero. O valor de AUC é usado para estimar a biodisponibilidade (isto é, a porcentagem deaptâmero terapêutico administrada na circulação depois da administração do aptâmero) e/oudepuração total (C1) (isto é, a taxa na qual o aptâmero terapêutico é removido da circulação)de um dado aptâmero terapêutico. O volume de distribuição diz respeito à concentração plas-mática de um aptâmero terapêutico para a quantidade de aptâmero presente no corpo. Quan-to maior o Vss1 mais um aptâmero é encontrado fora do plasma (isto é, o mais extravasão).
A presente invenção fornece materiais e métodos para modular, de uma maneiracontrolada, a farmacocinética e biodistribuição de composições de aptâmero estabilizadas invivo conjugando um aptâmero a uma fração de modulação, tais como uma molécula peque-na, peptídeo, ou grupo terminal de polímero, ou incorporando nucleotídeos modificados emum aptâmero. Da forma aqui descrita, conjugação de uma fração de modificação e/ou umacomposição química de nucleotídeo(s) de alteração altera aspectos fundamentais do tempode residência do aptâmero na circulação e distribuição aos tecidos.
Além da depuração por nucleases, oligonucleotídeos terapêuticos são sujeitos à eli-minação por meio de filtração renal. Como tal, um oligonucleotídeo resistente à nuclease ad-ministrado intravenosamente tipicamente apresenta uma meia-vida in vivo < 10 a menos quea filtração possa ser bloqueada. Isto pode ser realizado tanto facilitando rápida distribuição dacorrente sangüínea nos tecidos quanto aumentando o peso molecular aparente do oligonucle-otídeo acima do tamanho efetivo cortado para os glomérulos. A conjugação de terapêuticospequenos a um polímero PEG (PEGuilação), descrita a seguir, pode drasticamente prolon-go gar o tempos de residência dos aptâmeros na circulação, diminuindo assim a freqüência dedosagem e melhorando a efetividade contra alvos vasculares.
Adicionalmente, a filtração de aptâmero do tecido ocular também pode ser modula-da, particularmente bloqueada, aumentando o apparent peso molecular do aptâmero da in-venção, tal como por conjugação a um polímero PEG.
Aptâmeros podem ser conjugados a uma variedade de frações de modificação, talcomo polímeros de alto peso molecular, por exemplo, PEG; peptídeos, por exemplo, Tat (umfragmento de 13-aminoácidos da proteína Tat do HIV (Vives, et al. (1997), J. Biol. Chem.272(25): 16010-7)), Ant (uma seqüência de 16 aminoácidos derivada da terceura hélice daproteína homoética da Drosophila antennapedia (Pietersz, et al. (2001), Vaccine 19(11-12):1397-405)) e Argo (um peptídeo pequeno, positivamente carregado que permeia na célulacomposto de poliarginina (Arg7) (Rothbard, et al. (2000), Nat. M . 6(11): 1253-7; Rothbard,J et al. (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); e moléculas pequenas, por exemplo, com-posto lipofílicos, tal como colesterol. Entre os vários conjugados aqui descritos, propriedadesin vivo dos aptâmeros são alteradas mais profundamente por conjugação com grupos PEG.
Por exemplo, descrita no pedido de patente não provisório referenciado anteriormente (Esta-dos Unidos No. de série 11/075.648 depositado em 7 de março de 2005, e intitulado "Con-trolled Modulation of the Phgarmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics"), aconjugação de um aptâmero terapêutico com um polímero PEG de 20 kDa impede a filtra-ção renal e promove a distribuição do aptâmero a tecidos tanto saudáveis quanto inflama-dos. Além disso, o conjugado polímero PEG 20 kDa-aptâmero mostra-se tão efetivo quantoum polímero PEG de 40 kDa na prevenção da filtração renal de aptâmeros. Embora um efei-to da PEGuilação seja na depuração do aptâmero, a exposição sistêmica prolongada disponi-bilizada pela presença da fração 20 kDa também facilita a distribuição do aptâmero aos teci-dos, particularmente os dos órgãos altamente perfundidos e os no local da inflamação. Oconjugado aptâmero- polímero PEG 20 kDa direciona a distribuição do aptâmero ao local dainflamação, de maneira tal que o aptâmero PEGuiIado preferencialmente acumule no tecidoinflamado. Em alguns exemplos, o conjugado aptâmero PEGuiIado de 20 kDa é capaz de a -cessar o interior das células, tais como, por exemplo, células renais.
No geral, os efeitos na farmacocinética do aptâmero e distribuição do tecido produ-zidos por frações de modificação de baixo peso molecular, incluindo colesterol e peptídeosque permeiam na célula são tipicamente menos pronunciados que os produzidos como umresultado de PEGuilação ou modificação de nucleotídeos (por exemplo, uma composiçãoquímica alterada). Embora não se deseje ficar preso à teoria, sugere-se que associaçõesmediadas por colesterol com lipoproteínas plasmáticas, postuladas para ocorrer no caso deconjugado antisentido, são excluídas no contexto particular da estrutura dobrada do conju-gado aptâmero-colesterol e/ou relacionam ao aspecto da natureza lipofílica do grupo coleste-rol. Como colesterol, a presença de um tag de peptídeo Tat promove a depuração de aptâ-mero da corrente sangüínea, com níveis comparativamente altos de conjugado que aparecenos rins em 48 horas. Outros peptídeos (por exemplo, Ant, Arg7) que foram reportados natecnologia para mediar a passagem de macromoléculas pelas membranas celulares in vitro,não parecem promover a depuração de aptâmero da circulação. Entretanto, como Tat, oconjugado Ant significativamente se acumula nos rins com relação a outros aptâmeros. Em-bora não se deseje ficar preso à teoria, é possível que a apresentação desvavorável de fra-ções de modificação de peptídeo Ant e Arg7 no contexto de aptâmeros dobrados tridimen-sionalmente in vivo confira a capacidade destes peptídeos de influenciar as propriedades detransporte de aptâmero.
Nucleotídeos modificados também podem ser usados para modular a depuraçãoplasmática de aptâmeros. Por exemplo, um aptâmero não conjugado que incorpora, por e-xemplo, químicas de estabilização de 2'-fluor, 2'-OMe, e/ou fosforotioato, que é tipicamentede aptâmeros de geração atual, uma vez que ele apresenta um alto grau de estabilidade pornuclease in vitro e in vivo, apresenta rápida perda de plasma (por exemplo, rápida depura-ção plasmática) e uma rápida distribuição nos tecidos, principalmente nos rins, quando com-parada a aptâmero não modificado.
Ácidos nucléicos derivatizados por PAGDa forma descrita anteriormente, derivatização de ácidos nucléicos com polímerosnão imunogênicos de alto peso molecular tem o potencial para alterar as propriedades far-macocinética e farmacodinâmica de ácidos nucléicos tornando-os agentes terapêuticos maisefetivos. Mudanças favoráveis na atividade podem incluir maior resistência à degradação pornucleases, menor filtração pelos rins, menos exposição ao sistema imune e distribuição alte-rada do terapêutico pelo corpo.
As composições de aptâmero da invenção podem ser derivatizadas com frações de poli-alquileno glicol ("PAG"). Exemplos de ácidos nucléicos derivatizados por PAG são encontradas nopedido de patente dos Estados Unidos No. de série 101/718.833, depositado em 21 de novembrode 2003, que está aqui incorporado pela referência na sua totalidade. Polímeros típicos usados nainvenção incluem polietileno glicol ("PEG'), também conhecido como poli(óxido de etileno) ("PEO")e polipropileno glicol (incluindo poli isopropileno glicol). Adicionalmente, copolímeros aleatórios oubloco de doferentes óxidos de alquileno (por exemplo, óxido de etileno e óxido de propileno) po-dem ser usados em muitas aplicaçãos. Na sua forma mais comum, um polialquileno glicol, tal co-mo PEG, é um polímero linear terminado em cada extremidade com grupos hidroxila: HO-CH2CH20-(CH2CH20)nCH2CH2-0H. Este polímero, alfa-, omega-diidroxilpoli(etileno glicol), tam-bém pode ser representado como HO-PEGOH, onde entende-se que o símbolo - PEG- repre-senta a seguinte unidade estrutural. - CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2- onde η tipicamente variacerca de 4 a cerca de 10.000.
Polímeros PAG adequados para indicações terapêuticas tipicamente têm as proprieda-des de solubilidade em água e em muitos solventes orgÂnicos, falta de toxicidade, e falta de imu-nogenicidade. Um uso de PAGs é para atacar covalentemente o polímero a moléculas ipsolúveispara preparar o "conjugado" PAG-molécula resultante solúvel. Por exemplo, mostrou-se que omedicamento insolúveo em água paclitaxel, quando acoplado ao PEG, se torna solúvel em água.Greenwald, et ai, J. Ora. Chem., 60:331-336 (1995). Conjugados PAG são freqüentemente u-sados não somente para melhorar a solubilidade e estabilidade, mas também para prolongar ameia-vida na circulação sangüínea das moléculas.
A capacidade de derivatização de PAG, por exemplo, conjugação de PEG, de alterar abiodistribuição de um terapêutico é relacionada a inúmeros fatores, incluindo o tamanho aparente(por exemplo, medido em termos de raio hidrodinâmico) do conjugado. Sabe-se que conjugadosmaiores (>10KDa) mais efetivamente bloqueiam a filtração pelos rins e consequentemente aumen-tam a meia-vida sérida de macromoléculas pequenas (por exemplo, peptídeos, oligonucleotídeosantisentido). A capacidade de conjugados PEG bloquearem a filtração mostrou aumentar com otamanho do PEG até aproximadamente 50 kDa (aumentos adicionais têm efeito benéfico mínimo,uma vez que a meia-vida se torna definida pelo metabolismo mediado por macrófago em vez deeliminação pelos rins.
Os compostos derivatizados por PAG da invenção têm tipicamente entre 5 e 80 kDa depela anexação de dois PEGs monometóxi a um núcleo de Iisina que é subseqüentemente ativadopara reação descrita (Harris et ai, Nature1 vol.2: 214-221, 2003).
Da forma apresentada na figura 6, a molécula de PEG linear é di-funcional e é algumasvezes referida como "PEG diol". As porções terminais da molécula de PEG são frações hidroxilarelativamente não reativas, os grupos -OH1 que podem ser ativados ou convertidos a fraçõesfuncionais, para anexação do PEG a outros compostos nos sítios reativos no composto. TaisPEG dióis ativados são referidos aqui como PEGs biativados. Por exemplo, as frações terminaisde PEG diol foram funcionalizadas como éster de carbonato ativo para reação de seleção comfrações amino pela substituição das frações hidroxila relativamente não reativas, -OH, com fraçõesde éster ativa de sucinimidila de N-hidróxi sucinimida. Alternativamente, os PEG dióis podem serativados com uma variedade de grupos incluindo, sem limitação ácidos σ-halo acéticos, epialohi-drinas, maleatos, tartratos e carboidratos que depois de manipulação apropriada renderiam umcarbonila ativado ou equivalente para conjugação. Outros métodos de ativar PEG são descritosem Roberts et ai, (2002) Advanced Drug Deliver Reviews 54:549-476, aqui incorporado pela refe-rência na sua totalidade. Além do mais para ativar PEG usando um dos métodos previamentedescritos, uma ou ambas das funcionalidades álcool terminal da molécula de PEG pode ser modi-ficada para permitir diferentes tipos de conjugação a um ácido nucléico. Por exemplo, a conversãodas funcionalidades de álcool terminal a uma amina, ou um tiol, permite o acesso a conjugados deuréia e tiouretano.
Em muitas aplicações é desejável capear a molécula de PEG em uma extremidade comuma fração essencialmente não reativa, de maneira tal que a molécula de PEG seja monofuncio-nal (ou monoativada). No caso de proteínas terapêuticas que geralmente apresentam múltiplos sí-tios de reação para PEGs ativados, PEGs ativados bifuncionais levam a reticulação extensiva,rendendo agregados fracamente funcionais. Para gerar PEGs monoativados, uma fração hidroxilano terminus da molécula de PEG diol tipicamente é substituída por uma fração de extremidademetóxi não reativa, -OCH3. A outra, terminus não encapado da molécula de PEG tipicamente éconvertida a uma fração de extremidade reativa que pode se ativada para anexação a um sítioreativo em uma superfície ou uma molécula, tal como uma proteína.
APTÂMEROS CONJUGADOS A UM OU MAIS PEGS
Mais comumente, a síntese de conjugados PAG de alto peso molecular-ácido nucléicofoi realizada pela adição de uma amina primária livre ao 5'-terminus (incorporada usando um mo-dificador de fosforamidita noa última etapa de acoplamento da síntese de fase sólida). Usandoesta abordagem, um PEG reativo (por exemplo, um que é ativado, de maneira tal que ele reaja eforme uma ligação com uma amina) é combinado com o oligonucleotídeo purificado e a reação deacoplamento é realizada em solução.
Além do mais, conjugados de PAG de alto peso molecular-ácido nucléico-PAG podemser preparados pela reação de um PEG ativado monofuncional com um ácido nucléico contendomais que um sítio reativo. Em uma modalidade, o ácido nucléico é birreativo e contém dois sítiosreativos: um grupo 5-amino e um grupo 3-amino introduzidos no oligonucleotídeo por meio dasíntese de fosforamidita convencional e iniciando com um suporte sólido de 3'-amina; por exem-plo: 3'-5'-di-PEGuilação, da forma ilustrada na figura 6. Em modalidades alternativas, sítios reati-vos podem ser introduzidos nas posições internas usando, por exemplo, a 5-posição de pirimidi-nas, a 8 -posição de purinas, ou a 2' posição de ribose como os sítios para anexação de aminasprimárias. Em tais modalidades, o ácido nucléico pode ter vários sítios ativados ou reativos e diz-seque é multiplamente ativado.
Para produzir um conjugado ácido nucléico-PEG-ácido nucléico, o ácido nucléico é ori-ginalmente sintetizado, de maneira tal que ele suporta um único sítio reativo (por exemplo, ele émonoativado). Em uma modalidade preferida, este sítio reativo é um grupo amino introduzido no5'-terminus pela adição de uma fosforamidita modificadora como a última etapa na síntese de fasesólida do oligonucleotídeo. Em uma outra modalidade preferida, a síntese é realizada usando ummodificador de 3'-amina, mais introduzindo uma amina na extremidade 5', levando a um oligonu-cleotídeo 3',5'-di-amina. Depois da deproteção e purificação dos oligonucleotídeo modificados, eleé reconstituído em alta concentração em uma solução que minimiza a hidrólise espontânea doPEG ativado. Em uma modalidade preferida, a concentração de oligonucleotídeo é 1 mM e a so-lução reconstituída contém 200 mM de NaHC03-tampão, pH 8,3. A síntese do conjugado é inicia-da pela adição lenta, em etapas de PEG ativado altamente purificado. Em uma modalidade prefe-rida, o PEG é ativado como carbonato de p-nitrofenila. Depois da reação, o conjugado PEG-ácidonucléico é purificado por eletroforese em gel ou cromatografia líquida para separar espéciescompleta, parcial e não conjugadas.
MÚLTIPLOS APTÂMEROS CONJUGADOS A UM PEG
A presente invenção também engloba composições de aptâmero de alto peso mo-Iecular em que duas ou mais frações de ácido nucléico são covalentemente conjugadas apelo menos uma fração de polialquileno glicol. As frações de polialquileno glicol servem co-mo frações de estabilização. Uma fração de estabilização é uma molécula, ou porção de umamolécula, que melhora as propriedades farmacocinética e farmacodinâmica das composiçõesde aptâmero de alto peso molecular da invenção. Em alguns casos, uma fração de estabili-zação é uma molécula ou porção de uma molécula que leva dois ou mais aptâmeros, oudomínios de aptâmero, na proximidade, ou fornece menor liberdade rotacional global dascomposições de aptâmero de alto peso molecular da invenção. Uma fração de estabilizaçãopode ser um polialquileno glicol, tal como um polietileno glicol, que pode ser linear ou ramifi-cado, um homopolímero ou um heteropolímero. Outras frações de estabilização incluempolímeros, tais como ácidos nucléicos de peptídeo (PNA). Oligonucleotídeos também podemser frações de estabilização; tais coligonucleotídeos podem incluir nucleotídeos modificados,e/ou ligações modificadas, tais como fosforotioatos.tamanho, entretanto qualquer tamanho pode ser usado, a escolha depende do aptâmero e aplica-ção. Outros compostos derivatizados por PAG da invenção têm entre 10 e 80 kDa de tamanho.Ainda outros compostos derivatizados por PAG da invenção têm entre 10 e 60 kDa de tama-nho. Em algumas modalidades, as frações PAG derivatizadas a composições da presenteinvenção são PEG que variam de 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kDa no tamanho. Em algumasmodalidades, o PEG é PEG linear, enquanto que em outras modalidades, o PEG é PEG ra-mificado. Ainda em outras modalidades o PEG é um PEG ramificado de 40 kDa da formaapresentada na figura 4. Em algumas modalidades o PEG ramificado de 40 kDa é anexadoà extremidade 5' do aptâmero da forma apresentada na figura 5.
A presente invenção fornece um via de custo efetivo para a síntese de conjugadosPEG de alto peso molecular-ácido nucléico (preferivelmente, aptâmero) incluindo multiplici-dade de ácidos nucléicos PEGuilados. A presente invenção também engloba oligonucleotí-deos multiméricos ligados ao PEG, por exemplo, aptâmeros dimerizados. Ao contrário deproteínas terapêuticas biologicamente expressas, ácidos nucléicos terapêuticos são tipica-mente sintetizados quimicamente de nucleotídeos de monômeros ativados. ConjugadosPEG-ácido nucléico podem ser preparados incorporando o PEG usando a mesma síntesede monômero iterativa. Por exemplo, PEGs ativados por conversão a uma forma de fosfo-ramidita podem ser incorporados na síntese de oligonucleotídeo de fase sólida. Alternativa-mente, a síntese de oligonucleotídeo pode ser completada com incorporação de sítio espe-cífico de um sítio de anexação de PEG reativo.
PEG ATIVADO
A produção de PEGs de alto peso molecular (>10 kDa) pode ser difícil, ineficiente ecara. Como uma via no sentido da síntese de conjugados de PEG-ácido nucléico de altopeso molecular, trabalhos anteriores focaram na geração de PEGs ativados de maior pesomolecular. Método para gerar tais moléculas envolvem a formação de um PEG linear ativa-do ou um PEG ramificado ativado em cujo caso dois ou mais PEGs são anexados a um nú-cleo central que carrega o grupo ativado. As porções terminais das moléculas de PEG demaior peso molecular, isto é, as frações hidroxila (-OH) relativamente não reativas, podemser ativadas, ou convertidas às frações funcionais, por anexação de um ou mais dos PEGs aoutros compostos em sítios reativos no composto. PEGs ramificados ativados terão maisque dois terminais e, em casos onde dois ou mais termin ais foram ativados, tais moléculasde PEG de maior peso molecular ativadas aqui referidas como PEGs multiplamente ativa-dos. Em alguns casos, nem todos os terminais em uma molécula de PEG ramificada sãoativados. Em casos onde quaisquer dos dois terminais de uma molécula de PEG ramificadasão ativados, tais moléculas de PEG são referidas como PEGs biativadas. Em alguns casosonde somente um terminal em uma molécula de PEG ramificada é ativado, tais moléculas de PEGsão referidas como monoativadas. Como um exemplo desta abordagem, PEG ativado preparadoUma fração de estabilização pode ser uma parte integral de uma composição deaptâmero, isto é, ela é covalentemente ligada ao aptâmero. Em composições onde uma fra-ção de polialquileno glicol é covalentemente ligada em ambas as extremidade a um aptâme-ro, de maneira tal que o polialquileno glicol uma as frações de ácido nucléico juntas em umamolécula, diz-se que o polialquileno glicol é uma fração de ligação. Em tais composições, aestrutura primária da molécula covalente inclui o ácido nucléico-PAG-ácido nucléico de ar-ranjo linear. Um exemplo de uma composição onde uma fração de estabilização de PEGserve como um Iigante que separa diferentes porções de um aptâmero, é uma composiçãoonde PEG é conjugado em uma única seqüência de aptâmeros, de maneira tal que o arranjolinear da composição de aptâmero de alto peso molecular seja, por exemplo, ácido nucléico- PEG - ácido nucléico (- PEG - ácido nucléico)n onde η é maior que ou igual a 1.
PAra produzir um conjugado ácido nucléico-PEG-ácido nucléico, o ácido nucléico éoriginalmente sintetizado de maneira tal que ele suporte um único sítio reativo (por exemplo,ele é monoativado). Em uma modalidade preferida, este sítio reativo é um grupo amino intro-duzido no 5'-terminus pela adição de uma fosforamidita modificadora na última etapa na sín-tese de fase sólida do oligonucleotídeo. Depois da deproteção e purificação do oligonucleo-tídeo modificado, ele é reconstituído em alta concentração em uma solução que minimiza ahidrólise espontânea do PEG ativado. Em uma modalidade preferida, a concentração deoligonucleotídeo é 1 mM e a solução reconstituída contém 200 mM de NaKCG3-tampão, pH8,3. Síntese do conjugado é iniciada pela adição lenta, em etapas de PEG bifuncional alta-mente purificado. Em uma modalidade preferida, o PEG diol é ativado em ambas as extrem-jidades (biativado) por derivatização como carbonato de p-nitrofenila. Depois da reação, oconjugado PEG-ácido nucléico é purificado por eletroforese em gel ou cromatografia líquidapara separar espécies completa, parcial ou não conjugadas. Múltiplas moléculas de PAGconcentradas (por exemplo, na forma de copolímeros aleatórios ou em bloco) ou cadeias dePAG menores podem ser ligadas para atingir vários comprimentos (ou pesos moleculares).Ligantes não-PAG podem ser usados entre cadeias PAG de variados comprimentos.
Os domínios de ligação também podem ter uma ou mais frações de polialquilenoglicol anexadas a eles. Tais PAGs podem ser de variados comprimentos e podem ser usa-dos em combinações apropriadas para atingir o peso molecular desejado da composição.
O efeito de um Iigante particular pode ser influenciado tanto por sua composiçãoquímica quanto comprimento. Um Iigante que é muito grande, muito pequeno ou forma inte-rações estéricas e/ou iônicas desfavoráveis com o componente do complemento alvo impe-dirá a formação de complexo entre aptâmero e o componente do complemento alvo. Umligante, que é maior que o necessário para transpor a distância entre ácidos nucléicos, podereduzir a estabilidade de ligação diminuindo a concentração efetiva do ligante. Assim, é fre-qüentemente necessário otimizar composições e comprimento de ligante, de maneira a ma-ximizar a afinidade de um aptâmero a um alvo
Aptâmeros com Afinidade de Ligação à Proteína C5 do Sistema Complemento
Em algumas modalidades, os materiais da presente invenção compreendem umasérie de aptâmeros de ácido nucléico de cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de com-primendo que se ligam especificamente à proteína C5 do complemento e que funcionalmen-te modulam, por exemplo, bloqueiam, a atividade da proteína C5 do complemento em en-saios in vivo e/ou com base em células.
Em algumas modalidades da presente invenção, aptâmeros que são capazes deespecificamente ligar e modular proteína C5 do complemento são descritos. Os aptâmerosfornecem uma baixa toxicidade, segurança, e modalidade efetiva de tratar, aliviar e/ou pre-venir uma variedade de doenças ou desordens relacionadas ao complemento incluindo, porexemplo, desordens do coração relacionadas ao complemento (por exemplo, lesão do mio-cárdio; Complicações do complemento mediadas por C5 com relação à cirurgia de enxertobaypass da artéria coronária (CABG), tais como sangramento pós operatório, ativação deneutrófilo e leucócito sistêmica, maior risco de infarto do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; restenose; e Complicações do complemento mediadas por C5 relacionadas à interven-ção coronária percutânea), lesão de isquemia-reperfusão (por exemplo, infarto do miocárdio,acidente vascular, frostbite), desordens inflamatórias relacionadas ao complemento (por e-xemplo, asma, artrite, sepse, e rejeição depois de transplante de órgão), e desordens autoi-munes relacionadas ao complemento (por exemplo, miastenia grave, Iupus eritematoso sis-têmico (SLE)). Outras indicações para que a inibição de C5 é desejável incluem, por exem-plo, inflamação dos pulmões (Mulligan et al. (1998) J. Clin. Invest. 98:503), ativação extra-corpórea do complemento (Kinder et W. (1995) J. C . Invest. 96:1564), ativação do com-plemento mediada por anticorpo (Biesecker et W. (1989) J. Ymrnunol. 142:2654), glomerulo-nefrite e outras doenças renais, indicações oculares, tais como dano do tecido ocular mediadopor C5, por exemplo retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade(AMD) tanto exudativa quanto não exudativa, e hemoglubinúria noturna paroxissomal. Es-tes aptâmeros também podem ser usados em diagnósticos.
Em algumas modalidades, aptâmeros da presente invenção podem ser usados co-mo uma baixa toxicidade, segurança, e modalidade efetiva de tratar, estabilizar e/ou preve-nir uma variedade de doenças ou desordens oculares relacionadas ao complemento nos mé-todos da invenção incluindo, por exemplo, uma desordem ocular aguda ou crônica inflamató-ria e/ou imuno mediada, conjuntivite inflamatória, incluindo conjuntivite alérgica e papilargigante, edema macular, uveíte, endoftalmite, esclerite, úlcera da córnea, síndrome do olhoseco, glaucoma, doença retinal isquêmica, rejeição de transplante de córnea, complicaçõesrelacionadas a cirurgia intraocular, tais como implante de lentes intraoculares e inflamaçãoassociada à cirurgia de catarata, doença de Behcet, vasculite do complexo imune, doença deFuch1 Vogt-Koyanagi Harada doença, fibrose sub-retinal, queratite, inflamação cítreo-retinal,infestação/migração parasítica ocular, retinite pigrnentosa, retinite de citomegalovírus e in-flamação coroidal, degeneração macular, degeneração macular relacionada à idade ("AMD"),não exudativa ("seca") tipo AMD, ou uma desordem de neurovascularização ocular, incluin-do retinopatia diabética ou AMD tipo exudativa ("úmida"). Estes aptâmeros também podemser usados em diagnósticos oculares.
O s aptâmeros podem incluir modificações da forma aqui descrita incluindo, porexemplo, conjugação a compostos lipofílicos ou de alto peso molecular (por exemplo, PEG),incorporação de uma fração de capeamento, incorporação de nucleotídeos modificados, emodificações na espinha dorsal de fosfato.
Em uma modalidade da invenção é fornecido um aptâmero isolado que ocorre nãonaturalmente que se liga à proteína do complemento C5. Em uma outra modalidade, umaptâmero isolado, que ocorre não naturalmente que se liga à proteína do complemento C5para uso nos métodos da invenção para tratar, estabilizar e/ou prevenir uma desordem ocularmediada pelo complemento é fornecido. Em algumas modalidades, o aptâmero isolado, queocorre não naturalmente tem uma constante de dissociação ("Kd") para proteína do com-plemento C5 menor que 10O μΜ, Menor que 1 μ M, menor que 500 nM, menor que 100 nM,menor que 50 nM , menor que 1 nM, menor que 500pM, menor que 100 pM, menor que 50pM. Em algumas modalidades da invenção, a constante de dissociação é determinada portitulação dot blot, da forma descrita no exemplo 1 a seguir.
Em uma outra modalidade, o aptâmero para uso nos métodos da invenção modu-lam uma função da proteína do complemento C5, particularmente inibem uma função da pro-teína do complemento C5 e/ou função variante da proteína do complemento C5. Uma varian-te da proteína do complemento C5, da forma aqui usada, engloba variantes que realizamessencialmente a mesma função que uma função da proteína do complemento C5. Umavariante da proteína do complemento C5 preferivelmente compreende substancialmente amesma estrutura e em algumas modalidades compreende pelo menos 80 % de identidadede seqüência, mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade de seqüência, e maispreferivelmente pelo menos 95 % de identidade de seqüência para a seqüência de aminoá-cidos da proteína do complemento C5 compreendendo a seqüência de aminoácidos a seguir(SEQ ID NO: 102) (citada em Haviland et ai, J Inununol. 1991 Jan 1;146(1):362-8).:1 mgllgilcf1 if IgJctwgqe qtyvisapki frvgaseniv iqvygyteaf datisiksyp61 dkkfsyssgh vhlssenkfq nsailtiqpk qlpggqnpva yvylewskh fskskrmpit121 ydngflfilit dkpvytpdqs vkvrvyslnd dlkpakretv ltfidpegse ydrnveeidhi181 giisfpdfki psnprygmwt ikaJcykedfs ttgtayfevk eyvlphfsve iepeynfigy241 knfknfeiti karyfynkw teadvyitfg iredlkddqk errtraqtamqnt mlingiaqvt301 fdsetavkel syysledlnn kylyiavtvi eetggfaeea eipgikyvls pyklnlvatp361 IflJqpgipyp ikvqvkdsld qlvggvpvtl naqtidvnqe tsdldpsksv tryddgrvasf421 vlnlpsgvtv lefnvktdap dlpeenqare gyraiayssl sqsylyidwt dnhkallvge481 hlniivtpks pyidkithyn ylilskgkii Ixfgtrekfsd asyqainipv tqxunvpssrl541 lvyyivtgeq taelvsdsvw lnieekcgnq lqvhlspdad ayspgqtvsl nmatgmdswv601 alaavdsavy gvqrgakkpl ervfqfleks dlgcgagggl nnanvfhlag ltfltnanad661 dsqendepck eilrprrtlq kkieeiaaky khswkkccy dgacvimdet ceqraarisl721 gprcikafte ccwasqlra niahkdmqlg rlhmktllpv skpeirayfp eswlwevhlv781 prrkqlqfal pdslttweiq gvgisntgic vadtvkakvf kdvflemnip yswrgeqiq841 lkgtvynyrt sgmqfcvkms avegictees pvidhqgtks skcvrqkveg ssshlvtftv901 lpleiglhni nf sletwfgk eilvktlrw pegvkresys gvtldprgiy gtiarrkefp961 yripldlvpK teikrilevk gllvgeilsa vlsqeginil thlpkgeaea elmswpvfy1021 vfhyletgnh wnifhsdpli ekqklkkklk egmlsimsyr nadyeysvwk ggsastwlta1081 falxvlgqvn kyveqnqnsi cnsllwlven yqldngsfke nsqyqpiJdq gtlpvearen1141 slyltaftvi girkafdicp lvkidtalik adnflíentl paqstftlai sayalalgdk1201 thpqfrsivs alkrealvkg nppiyrfwkd nlqhkdssvp ntgtarmvet tayalltsln1261 lkdinyvnpv ikwlseeqry gggfystqdt inaiegltey sllvkqlrls mdidvsykhk1321 galhnykmtd knflgrpvev llnddlivst gfgsglatvh vttwhktst seevcsfylk1381 idtqdieash yrgygnsdyk rivacasykp sreesssgss havmdislpt gisaneedlk1441 alvegvdqlf tdyqikdghv ilqlneipss d.flcrvrfrif elfevgflsp atftvyeyhr1501 pdkqctmfys tBniJciqkvc egaackcvea dcgqmqeeld ltisaetrkq tackpeiaya1561 ykvsitsitv envfvkykat lldiyktgea vaekdseitf ikkvtctnae lvkgrqylim1621 gkealqikyn fsfryiypld altwieywpr dttcsscqaf lanldefaed iflngc
Em algumas modalidades da invenção, a identidade de seqüência de variantes alvo édeterminada usando BLAST da forma descrita a seguir. Os termos "identidade de seqüência" nocontexto de duas ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou proteínas, refem-se a duas oumais seqüências ou subseqüências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificadade resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos, quando comparados e alinha-dos para a correspondência máxima, medida usando um dos seguintes algoritmos de compara-ção de seqüência ou por inspeção visual. Para a comparação de seqüência, tipicamente uma se-qüência age como uma seqüência referência com a qual seqüências de teste são comparadas. U-sando uma algoritmo de comparação de seqüência, seqüências de teste e referência são introduzi-das em um computador, coordenadas subsequentes são designadas se necessário, e parâmetrosdo programa de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo de comparação de seqüên-cia então calcula a porcentagem de identidade de seqüência para a seqüência(s) de teste comrelação à seqüência referência, com base nos parâmetros do programa designados. O alinhamen-to ideal de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de hoo-Iogia local de Smith & Águaman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento dehomologia de Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa do método desimilariedade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), por implemen-tações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou porinspeção visual (no geral ver, Ausubel et a1., infra).
Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identi-dade de seqüência é o algoritmo usado na ferramente de pesquisa de alinhamento local básica(daqui em diante "BLAST'), ver, por exemplo, Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) eAltschul et al., Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402 (1997). Software para realizar análise BLAST épublicamente disponível pelo National Center for Biotechnology Informação (daqui em diante"NCBI"). Os parâmetros default usados na determinação da identidade de seqüência usando osoftware disponível da NCBI, por exemplo, BLASTN (para seqüência de nucleotídeos) eBLASTP (para seqüência de aminoácidos) são descritos em McGinnis et al., Nucleic AcidsRes., 32: W20-W25 (2004).
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido aptâmero que tem substanci-almente a mesma capacidade de se ligar à proteína do complemento C5 que a de um aptâ-mero compreendendo qualquer um de: SEQ ID NOS: 1-2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98 é forne-cido. Em uma outra modalidade da invenção, o aptâmero tem substancialmente a mesmaestrutura e capacidade de se ligar à proteína do complemento C5 que a de um aptâmero com-preendendo qualquer um de: SEQ ID NOS: 1-2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98. Em uma outramodalidade, os aptâmeros da invenção têm uma seqüência, incluindo quaisquer modifica-ções químicas, de acordo com quaisquer uma de SEQ ID NOS: 2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98.Em uma outra modalidade, os aptâmeros da invenção são usados como um ingrediente ati-vo em composições farmacêuticas. Em uma outra modalidade, os aptâmeros ou composi-ções compreendendo os aptâmeros da invenção são usados para tratar uma variedade dedoenças ou desordens relacionadas ao complemento incluindo qualquer uma selecionadado grupo que consiste em: desordens do coração relacionadas ao complemento (por exem-plo, lesão do miocárdio; complicações do complemento mediadas por C5 com relação aoenxerto baypass da artéria coronária (CABG), tal como sangramento pós operatório, ativa-ção de neutrófilo e leucócito sistêmica, maior risco deinfarto do miocárdio e maior disfunção cognitiva; restenose; e complicações do complemento mediadas por C5 relacionadas à inter-venção coronária percutânea), lesão de isquemia-reperfusão (por exemplo, infarto do miocár-dio, acidente vascular, frostbite), desordens inflamatórias relacionadas ao complemento (porexemplo, asma, artrite, sepse, e rejeição depois de transplante de órgão), e desordens autoi-munes relacionadas so complemento (por exemplo, miastenia grave, Iupus eritematoso sis-têmico (SLE), inflamação dos pulmões, ativação extracorpórea do complemento, ativação docomplemento mediada por anticorpo e complemento related doenças oculares, tal comoretinopatia diabética, bem como degeneração macular relacionada à idade (AMD).
Em uma modalidade, os aptâmeros anti-C5 da invenção incluem uma mistura denucleotídeos modificados 2-flúor, nucleotídeos modificados 2'-OMe ("2'-OMe") e resíduosde purina 2'-OH. Uma seqüência genérica descritiva (SEQ ID NO: 1) para um aptâmero anti-C5 modificado é apresentada a seguir na tabela 1, e a estrutura é apresentada na figura 3A.A vasta amioria de purinas (A e G) foi modificada para 2'-OMe, excluindo somente os doisresíduos G que permanecem 2'-OH (resíduos mostrados grifados). Os resíduos circuladosrepresentam um subconjunto de pirimidinas que podem ser simultaneamente modificadaspara 2'-H sem substancialmente alterar a atividade anti-C5 do aptâmero (ver ARC330 natabela 1 a seguir (SEQ ID NO: 2, Figura 3B)). Os resíduos sublinhados apresentados nafigura 3A representam resíduos de pirimidina que podem conter tanto uma modificação 2'-fIúorquanto 2'-H (mas não 2'-OMe), enquanto que os resíduos em quadrados representam resíduos depirimidina que podem conter tanto uma modificação 2-flúor quanto 2-OMe (mas não 2'-H). Osresíduos indicados com uma seta (—») devem conter uma modificação 2-flúor. Sem uma modifica-ção 2-flúor nos resíduos indicados por uma seta (—>),. a atividade hemolítiça resultante do aptâme-ro resultante é substancialmente menor. Em uma modalidade preferida, um aptâmero anti-C5 dainvenção compreende uma seqüência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 1.
Um exemplo de um aptâmero anti-C5 de acordo com a invenção é ARC186 (SEQ IDNO: 4) que é mostrado na figura 3C e descrito na patente U.S. Ser. No. 6.395.888 que está aquiincorporada pela referência na sua íntegra. Todos os 21 resíduos de pirimidina de ARCI86 têmmodificações 2'-flúor. A maioria das purinas (14 resíduos) tem modificações 2'-0Me, exceto paraos três resíduos de purina 2'-OH (mostrados em sublinhado na figura 3C). Os aptâmeros anti-C5da invenção também podem incluir diferentes misturas de modificações 2'-flúor e 2-H. Por exem-plo, um outro aptâmero anti-C5 da invenção é o ARC334 (SEQ ID NO: 2) mostrado na figura 3B.ARC330 (SEQ ID NO: 2) contém sete modificações 2'-H (resíduos circulados na figura 3B), 14resíduos de pirimidina com modificações 2'-flúor, 14 resíduos de purina com modificações 2'-0Me,e três resíduos de purina 2'-0H (mostrados em sublinhado na figura 3B).
Outras combinações de aptâmeros contendo uma mistura de modificações 2'-flúor, modi-ficações 2-OMe, resíduos de purina 2'-0H e conjugação a compostos não imunogênicos de altopeso molecular (por exemplo, PEG) de vários tamanhos, cada um dos quais foram derivados deARC186 (SEQ ID NO: 4), são descritas na tabela I a seguir. A invenção compreende aptâmerosda forma descrita na tabela 1 a seguir. A invenção também compreende aptâmeros da forma des-crita a seguir, mas que não tem a capa 3' indicada (por exemplo, capa de desoxitimidina invertida)e/ou aptâmeros indicados a seguir, mas compreendendo uma capa 3' (por exemplo, dT invertido)onde uma capa 3' não é indicada.
Um aptâmero anti-C5 para uso nos métodos descritos por algumas modalidades da pre-sente invenção pode ser um aptâmero compreendendo qualquer uma de: SEQ ID NOS 1 a 69, 75,76, 81, 91, 95 e 96 descritas a seguir.
A menos que de outra forma indicado, a seqüência de nucleotídeoss na tabela 1 a seguiré listada na direção 5' para 3'. Para cada uma das seqüências individuais na tabela 1, todas asmodificações de purina ou pirimidina 2'-OMe são indicadas por um "m" antes do nucleotídeo cor-respondente; todas as modificações pirimidina 2'-fIúor são indicadas por um "f" antes do nucleotí-deo correspondente; todas as modificações purina ou pirimidina deóxi são indicadas por um "d"antes do nucleotídeo correspondente; e qualquer purina e pirimidina que aparece sem um "m", 'T1ou "d" antes do nucleotídeo indica um resíduo 2-OH. Adicionalmente um "3T" indica um timidinadeóxi invertida, "NH" indica um Iigante hexilamina, "NH2" indica um grupo terminal hexilamina,"PEG" indica um grupo polietileno glicol com o peso molecular indicado, e "biotina" indica um ap-tâmero com biotina conjugada à extremidade 5'.Tabela 1:
<table>table see original document page 78</column></row><table>
ARC330 (SEQID NO: 2)
íCmGíCfCGfCmGmGfUdCrrdCmAmGmGdCGfCfUmGinAinGTd
ARCl 85 (SEQ ID NO: 3) -
GAfCGAfUGiCGGfUfCWfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAiCfCfUfUfCGfUfCARCl 86 (SEQID NO: 4)íCmGfCfCXjfCmGmGfUfCfUfCmAmG^
ARC187 (SEQ DD NO: 5)4 OkDa PEG- NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGflra
Where the branched 40 EDa PEG is ,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propyl-2-{4'-butamide)
ARC188 (SEQ ID NO: 6)
AGGAfCGAfUGfCGGfüfCfUfCAfUGfCGíUíCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUíCGfUfCARCl 89 (SEQ ID NO: 7)
AGfCmGfCíCGfCmGmGfUfCfUfCniAmGirtôfCGfCARC250 (SEQ ID NO: 8)
GGfCGfCfCGfCGGfUíCfUfCAGGfCXjíCfUGAGfUfCfUGAGfUfUiUAlCfCfUGfCG
ARC296 (SEQ ID NO: 9)fCmGfCfCGfOmGmGfUdCTdCmAmGmGdC
ARC297 (SEQ ID NO: 10)
mCmGmCíCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGniAmG^3T
ARC331 (SEQ ID NO: 11)
dCmGdCICGiCmGmGmdCTdCniAmGmGdCGfCfUmARC332 (SEQ ID NO: 12)
dCmGfCfCGíCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmCTARC333 (SEQ ID NO: 13)
íCnrôdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGniAmGTdCARC334 (SEQ DD NO: 14)
íCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCXSíCfUmGmAmGTdCTi^
ARC411 (SEQ ID NO: 15)
fCmGmCfCGíCmGir^fUdCTdCmAmGmGdCGfCíUmARC412 (SEQ ID NO: 16)
fCmGíClCGfCrnGmGfUdCTdCmAmGnKjdCGíCfUmGmAmGTdCTARC413 (SEQ ID NO: 17)
mC^GfCfCGíCmGmGfUdCTdQnAmGmGdCGfCfUmGmAmGTCARC414 (SEQ ID NO: 18)
mCmGmCfCGfCxnGmGfUdCTdCmAmGmGdCXjíCfUmGmAmGTdCrmGmAmGíUARC415 (SEQ ID NO: 19)
^mGftdCGrcmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGrcfUmGmAmGTdCTmARC416 (SEQ ID NO: 20)
rcmGfCfCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGniAmGTdCTmGmAmGÍUfUíUArcARC417 (SEQ ID NO: 21)
fCmGfCdCGdCmGmGfUdCTdCmAniGmGdCOfC^ARC418 (SEQ DD NO: 22)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCfUmGmA^
ARC419 (SEQ ID NO: 23)fCmGfCfCGfthnGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCT
ARC420 (SEQ ID NO: 24)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCinAmGmGdCGdCTmGmAjnCTARC421 (SEQ BD NO: 25)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAxnGmGdCGfCfUmARC422 (SEQ BD NO: 26)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmARC423 (SEQ ID NO: 27)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCinAmGmGdCGfCfUmARC424 (SEQ DD NO: 28)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCrnAjiiGmGdCGfCfUmGinAmARC425 (SEQ ID NO: 29)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCniAjnGmGdCGíCíUmARC426 (SEQ ID NO: 30)
íCmGfCfCGfCmGmGmUdCTdCmAinGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfU
ARC427 (SEQ ID NO: 31)fCroGíCmCGfCmGniGfadCTdCniAii^
ARC428 (SEQ ID NO: 32)
fCmGfCíCGmCniGmGfUdCTdQsiAmGmGdCGfCflhnGmAmGTdCTmARC429 (SEQ ID NO: 33)
fCmGiCmCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGiCiUmGmAmCTARC430 (SEQ ID NO: 34)
íCmGICíCGfCmGmGfUdCfüdCinAiiiGmGdCXSnjCfUmGinAmGfUdCÍUARC431 (SEQ ID NO: 35)
íCmGfCíCGfCmGmGfUdCfUdCnLAmGmGdCGfCmUn^ARC432 (SEQ ID NO: 36)
fCmGíCíCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGnCmUmGmAmGfUdCfUmGniAm
ARC433 (SEQ ID NO: 37)fCmGfCfCGfCmGnKjfUdCTdCmAmGmGdC^
ARC434 (SEQ ED NO: 38)
fCmGíCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGd(X3fCíUmGiiiAixiGTdCrmGmAmARC435 (SEQID NO: 39)fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGra
ARC436 (SEQID NO: 40)
fCmGíCfCGfCmGraGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm
ARC437 (SEQ DD NO: 41)
íC^GfCfCGfCmGmGíUdCTdCmAmGmGdCGíCfUirKjARC438 (SEQ ID NO: 42)
fCmGfCfCdGfCmGmGíUdCTdCmAmGmGdCGíCíUmGmAmGTdCT^ARC439 (SEQ ID NO: 43)
fCmGíCfCGfCmGmGíUdCTdCmAmGmGdCdGíCfUmGmAxnGTdCTmGmAmGíU
AROMO (SEQ ID NO: 44)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGTOGdCGICfümGmAmGTdCTmGinAmGfUfUfUARC457 (SEQ ID NO: 45)
mGfCmGfUfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCíUmGnxAjnGTdCTmGmAmGfUfUC
ARC458 (SEQ ID NO: 46)
mGmGmGfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAm^ARC459 (SEQ ID NO: 47)
mGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGICíUmGmAmGTdCTmGmAjitGíUC
ARC473 (SEQ ID NO: 48)
mGrnGraA.fCraGfCrcGfCmGmGíUfCfUfCmAmGmGfCGíCfUn^fCmGfUfCfU-3T
ARC522 (SEQ ID NO: 49)
mGmGíC^GfClCGfCmGmGíUdCTdCmAjnGmGdCGmCmUmGraAmGTdCTmGGmCmC
ARC523 (SEQ ID NO: 50)
mGmGmCmGfCfCGfCiriGmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGm^GmCmC
ARC524 (SEQ ID NO: 51)
mGmGmCirKjdCMCGdCmGmGTdCTdCmAmGmGdC^mGmCmC
ARC525 (SEQ ID NO: 52)
inGmGmCmGdCtfCGdCmGmGTdCmUmCmAmGmGdCGmCmUmGmAmTmGdCmGmCmC
ARC532 (SEQ ID NO: 53)Biotin-
AGíCmGÍCfCGíCmGmGfUfCfUfCmAmGmGíCGfCfUmGmAmGfUfCfUniGmAmGf^ARC543 (SEQID NO: 54)
raGmGfCteGfCfCGíCmGmGfUdCTdCniAmGmGdCGfCfUmGGmCmC
ARC544 (SEQID NO: 55)
TnGmGíCrnGfCfCGfCmGmGfUmCmUmCin^mGfCmGmCmC
ARC550 (SEQ ID NO: 56)
íCmGíCiCGíCmGmGíüíCfüfCmÂinGnK3íC3T
ARC551 (SEQ ID NO: 57)
fCmGrcfCGfCmGmGfUíCfUfCmAmGmGfCX3^3T
ARC552 (SEQ ID NO: 58)
fCmGfCfCGíCmGmGfUlCfUfCmAmGmGfCGíCfUmGmAmGfUfCfUmGmAm
ARC553 (SEQ ID NO: 59)
íCmGfCfCGíCmGmGfUíCfUfCmAjnGmGíCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGm^3T
ARC554 (SEQ ID NO: 60)
fCmGfCfCGíCmGmGfUíCfUfCmAjnGniGfCGm3T
ARC 657 (SEQ ID NO: 61)20 kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGinAmGfUfCf^
ARC 658 (SEQ DD NO: 62)30 kDa PEG-NH-
£CmGfCíCGíCmGmGfUíCfUfCmAmGmGíCGfCfUmGmAinGfUfÇfUmGmAinGfU
ARC 672 (SEQ ID NO: 63)NH2-
fCmGfCfCGfCmGmGíUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUm
ARC706 (SEQ ID NO: 64)IOkDaPEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfüíCniAmGmGfCGfCfUmGmAmGíUrcARC1537 (SEQ ED NO: 65)
40kDa PEG-NH-
fCmGrcfCGfCmGmGfUfCfU JfCmAmGmGfCG ACfUmGmAm
ARCl730) (SEQID NO: 66)
PEG20K-NH-
fCmGfCftXJfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfU
PEG20K
ARCl905 (SEQ ID NO: 67)
40K PEG-NH- -
fCmGfCfCGfCmGiiK3fUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUrc
Where the branched 40 kDa PEG is 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propyl-l-carbanioyl
ARC243 (SEQ ID NO: 68)
GGfCGAfUfUAfCfUGGGAfCGGAfCmfCGfCGAfUGmGAGfCfCfCAGAfCGAfCfUfCGfCfC
ARC244 (SEQ ED NO: 69)
GGfCfUfUfCfUGAAGAfUfUAfUfUmfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCfCfC
A invenção adicionalmente compreende os aptâmeros na tabela 2 a seguir. Os aptâme-ros na tabela 2 são listados na direção 5' para 3' e representam a seqüência de ribonucleotídeosdos aptâmeros que foram selecionados nas ondições dRmY SELEX™ fornecidas. Em algumas5 modalidades da invenção derivadas desta seleção (e da forma refletida na listagem de seqüência)as purinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-OMe. Em algumas modalidades ap-tâmeros compreendem uma capa (por exemplo, um dT 3'-invertido). Em algumas modalidades osaptâmeros compreendem um PEG.
Tabela 2 / aptâmeros anti-C5 dRmY
SEQ ID N0 ARC N0 Seqüência75 ARC913 GGGAGAGGAaAGAACGUUCUACCUUGOUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGCGGUCGAUCG AUCGAÜCAUCGAUO76 ARC874 CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCACGG81 ARC954 CGUUCUACCUIKSGUUUGCjCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG91 — GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCCCAGGCAUAUAUACGCAGGGAUUGAUCC GUUACGACUAGCAUCGAUG95 — GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUAGGUUCGCACUGUCAUACAUACACACGGGCAAUCGG UUACOACUAGCAUCGAUG96 — GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCNCAGCJCAUANAUACGCACGGGUCGAUCG guuacgacuagcau
10 Outros aptâmeros da invenção que se ligam a proteína C5 do complemento são
descritos a seguir no exemplo 3. Aptâmeros específicos de C5 são adicionalmente descritosno pedido de patente provisório U.S. 601544.542, 601547.747, 601581.685 e 60/608.048cada um dos quais está aqui incorporado pela referência na sua totalidade.
Em algumas modalidades terapêuticos de aptâmero da presente invenção têm15 grande afinidade e especificidade a seus alvos reduzindo ao mesmo tempo os efeitos cola-terais prejudiciais das substituições de nucleotídeos que ocorrem não naturalmente dos tera-pêuticos de aptâmeros no corpo de pacientes ou sujeitos. Em algumas modalidades, ascomposições terapêuticas contendo os terapêuticos de aptâmero da presente invenção nãotêm ou têm menor quantidade de nucleotídeos fluorados.
Os aptâmeros da presente invenção podem ser sintetizados usando quaisquer téc-nicas de síntese de oligonucleotídeo conhecidas na tecnologia, incluindo técnicas de síntesede oligonucleotídeo de fase sólida bem conhecidas na tecnologia (ver, por exemplo, Froehler5 et al„ Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) e Froehler et ai, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986))e métodos de fase de solução, tais como métodos de síntese de triéster (ver, por exemplo,Sood eíal., Nucl. Acid Res. 4:2557(1977) e Hirose et ai, Tet. Lett., 28:2449 (1978)).
A invenção também inclui o uso de agentes anti-C5 da invenção com aptâmerosespecíficos para PDGF e /ou VEGF e/ou seus receptores PDGFR e VEGFR cognatos, res-10 pectivamente, nos métodos da invenção de estabilizar, tratar e/ou prevenir desordens ocula-res. Desta maneira, os métodos descritos imediatamente antes podem ser usados para ge-rar aptâmeros da invenção para bloquear a ligação de um Iigante (por exemplo PDGF ouVEGF) com seu alvo, tal como receptor cognato.
Exemplos de aptâmeros anti-PDGF para uso nos métodos da invenção são descri-15 tos no pedido de patente internacional No. PCT1US20051039975 depositado em 2 de no-vembro de 2005 e aqui incorporado pela referência na sua íntegra, particularmente ARC513,ARC594, ARC127 e ARC404 descritos nele.
Exemplos de aptâmeros específicos VEGF para uso nos métodos da invenção sãodescritos nas patentes U.S. Nos. 5.919.455, 5.932.462, 6.113.906, 6.011.020, 6.051.698 e20 6.147.204. Por exemplo, um aptâmero particularmente usado para uso no tratamento de de-sordens oculares em combinação com um agente anti-C5 da invenção seria be EYEO01 (pre-viamente NX1838) na sua forma peguilada e não peguilada, particularmente injeção de pe-gaptanib de sódio (Macugen®, Eyeteeh Pharmaceuticals, Inc. e Pfizer, Inc. NY, NY).
Agentes de Anticorpo anti-C525 Os agentes anti-C5 da invenção incluem anticorpos antagonistas direcionados contra
proteína C5 do complemento e seu uso no tratamento de desordens oculares mediadas porC5. Os anticorpos antagonistas C5 da invenção intimamente se ligam a C5 e previnem suaativação e clivagem. Em modalidades particulares, a invenção compreende administrar umagente de anticorpo anti-C5 a um sujeito em um método de reduzir, estabilizar e/ou prevenir30 pelo menos um sintoma de uma desordem ocular, particularmente um sintoma de retinopatiadiabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.
O anticorpos antagonistas da invenção incluem anticorpos inibitórios monoclonais.Anticorpos monoclonais, ou fragmentos destes, englobam todas as classes de imunoglobuli-na, tais como IgM1 IgG, IgD, IgE, 7gA, ou suas subclasses, tais como as subclasses de IgG35 ou misturas destes. IgG e suas subclasses são usadas, tais como IgGi, IgG2, IgG2, IgG2^IgG3 ou lgGM. Os subtipos de IgG lgG.sub.1/kapa e lgG.sub.2b/kapa são incluídos como mo-dalidades úteis. Fragmentos que podem ser mencionados são todos fragmentos de anticorpostruncados ou modificados com um ou dois sítios de ligação complementar ao antígeno quemostra alta atividade de ligação e neutralização em mamífero em mamífero C5, tais comopartes de anticorpos com um sítio de ligação que corresponde ao anticorpo e é formado porcadeias leves e pesadas, tais como fragmentos Fv1 Fab ou F(ab')2, ou fragmentos de fita sim-5 pies. Fragmentos de fita dupla truncados, tais como Fv1 Fab ou F(ab')2 são particularmenteusados. Estes fragmentos podem ser obtidos, por exemplo, por meios enzimáticos eliminandoa parte Fc do anticorpo com enzimas, tais como papaína ou pepsina, por oxidação química oupor manipulação genética dos genes do anticorpo. Também é possível e vantajoso usar frag-mentos geneticamente manipulados, não truncados.10 Os anticorpos, fragmento de anticorpos, misturas ou derivados destes inéditos van-
tajosamente têm uma afinidade de ligação para C5 em uma faixa de 1.X.10"7 M a 1.X.10"12 M,ou de 1 .x.104 M a 1.x.1(r11 M, ou de 1.X.10'9 M a 5.X.10"10 M.
Os genes de anticorpo para as manipulações genéticas podem ser isolados, porexemplo de células de hibridoma, de uma maneira conhecida por um versado na tecnologi-15 a. Com este propósito, células que produzem anticorpo são cultivadas e, quando a densida-de ótica das células é suficiente, o RNAm é isolado das células de uma maneira conhecidaIisando as células com tiocianato de guanidínio, acidificando com acetato de sódio, extraindocom fenol, clorofórmio/álcool isoamílico, precipitando com isopropanol e lavando com etanol.DNAc é então sintetizado a partir de RNAm usando transcriptase reversa. O DNAc sintetizado20 pode ser inserido, diretamente ou depois de manipulação genética, por exemplo, por muta-gênese de sítio dirigido, introdução de inserções, inversões, deleções ou trocas de base, emvetores animal, fúngico, bacteriano ou viral adequados a ser expressos em organismos hos-pedeiros apropriados. Vetores bacterianos ou de levedura usados são vetores BR322,pUC18/19, pACYC184, Iambda ou mu de levedura para a clonage, dos genes e expressão25 em bactérias, tal como E. coli ou em leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae.
A invenção além disso diz respeito a células que sintetizam anticorpos C5. Estasincluem células animais, fúngicas, bacterianas ou células de levedura depois da transforma-ção da forma mencionada anteriormente. Elas são vantajosamente células de hibridoma oucélulas de trioma, tipicamente células de hibridoma. Estas células de hibridoma podem ser30 produzidas, por exemplo, de uma maneira conhecida a partir de animais imunizados com C5e isolamento de suas células B que produzem anticorpo, seleção destas células por anticor-pos que ligam C5 e subseqüentemente fusão das células a, por exemplo, células humanas ouanimais, por exemplo, células de mieloma de camundongo, células linfoblastóides humanasou células de heterohibridoma (ver, por exemplo, Koehler et al., (1975) Nature 256: 490 ou35 infectando estas células com vírus apropriados para produzir linhas celulares imortalizadas.Linhas celulares de hibridoma produzidas por fusão são usadas e linhas celulares de hibri-doma de camundongo são particularmente usadas. As linhas celulares de hibridoma da in-venção secretam anticorpos usados do tipo IgG. A ligação dos anticorpos mAb da invençãoligam com alta afinidade e reduzem ou neutralizam a atividade biológica (por exemplo, cliva-gem de C5) da proteína C5 do complemento.
A invenção adicionalmente inclui derivados destes anticorpos anti-C5 que retêm5 sua atividade de inibir C5, alterando ao mesmo tempo uma ou mais outras propriedadesrelacionadas ao seu uso como um agente farmacêutico, por exemplo, estabilidade sérica oueficiência de produção. Exemplos de tais derivados de anticorpo anti-C5 incluem peptídeos,peptideomiméticos derivados das regiões de ligação ao antígeno dos anticorpos, e anticor-pos, fragmento de anticorpos ou peptídeos ligados a veículos sólidos ou líquidos, tais como10 polietileno glicol, vidro, polímeros sintéticos, tais como poliacrilamida, poliestireno, polipropi-leno, polietileno ou polímeros naturais, tais como celulose, Sepharose ou agarose, ou conju-gados com enzimas, toxinas ou marcadores radioativos ou não radioativos, tais como 3H,1231, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51 Cr, 36CI, 57Co1 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc75Seoufragmentos de anticorpos, ou peptídeos covalentemente ligados a marcas fluorescen-15 tes/quimioluminescentes, tais como rodamina, fluoresceína, isotiocianato, ficoeritrina, ficocia-nina, fluorescamina, quelatos de metal, avidina, estreptavidina ou biotina.
Os anticorpos, fragmento de anticorpos, misturas, e derivados destes inéditos po-dem ser usados diretamente, depois da secagem, por exemplo, secagem por congelamento,depois da anexação aos veículos mencionados anteriormente ou depois da formulação20 com outras substâncias ativas farmacêuticas e auxiliares para produzir preparações farma-cêuticas. Exemplos de substâncias ativas e auxiliares que podem ser mencionadas são ou-tros anticorpos, substâncias ativas antimicrobianas com uma ação microbiocida ou microbi-ostática, tais como antibióticos em geral ou sulfonamidas, agentes antitumorais, água, tam-pões, salinas, álcoois, gorduras, ceras, veículos inertes ou outras substâncias rotineiras para25 produtos parenterais, tais como aminoácidos, espessantes ou açúcares. Estas preparaçõesfarmacêuticas são usadas para tratar doenças, e são usadas para estabilizar, reduzir e/ouprevenir a ocorrência de pelo menos um sintoma de desordens e doenças oculares neovas-culares incluindo AMD (exudativa e/ou não exudativa) e retinopatia diabética.
Os anticorpos, fragmento de anticorpos, misturas ou derivados destes inéditos po-30 dem ser usados na terapia ou diagnose diretamente ou depois de acoplamento a veículossólidos ou líquidos, enzimas, toxinas, marcas radioativas ou não radioativas ou a marcasfluorescentes/quimioluminescentes da forma descrita anteriormente.
Os anticorpos monoclonais C5 humanos da presente invenção podem ser obtidospor qualquer meio conhecido na tecnologia. Por exemplo, um mamífero é imunizado com C535 humano. C5 humano purificado é comercialmente disponível (por exemplo, da Quidel Corpo-ration, San Diego, CA ou Advanced Research Technologies, San Diego, CA). Alternativa-mente, C5 humano pode ser prontamente purificado de plasma humano. O mamífero usadopara promover anticorpo C5 anti-humano não é restrito e pode ser um primata, um roedor(tais como camundongo, rato ou coelho), bovino, ovelha, cabra ou cachorro.
Em seguida, células que produzem anticorpo, tais como células do baço são remo-vidas do animal imunizado e são fundidas com células de mieloma. As células de mieloma5 são bem conhecidas na tecnologia (por exemplo, células p3x63-Ag8-653, NS-0, NS-1 ouP3U1 podem ser usadas). A operação de fusão celular pode ser realizada por qualquer mé-todo convencional conhecido na tecnologia.
As células, depois de ser submetidas à operação de fusão celular, são então culti-vadas em meio de seleção HAT de maneira a selecionar hibridomas. Hibridomas que produ-10 zem anticorpos monoclonais anti-humano são então selecionadas. Esta seleção pode serrealizada, por exemplo, por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima sandwich (ELISA) ousimilares em que os anticorpos monoclonais produzidos são ligados aos poços ao qual C5humano é imobilizado. Neste caso, como o anticorpo secundário, um anticorpo específicopara a imunoglobulina do animal imunizado, que é marcado com uma enzima, tais como pe-15 roxidase, fosfatase alcalina, oxido de glicose, beta-D-galactosidase, ou similares, pode serempregado. A marca pode ser detectada reagindo a enzima de marcação com seu substra-to e medindo a cor gerada. Como o substrato, 3,3-diaminobenzidina, 2,2-diaminobis-o-dianisidina, 4-cloronaftol, 4-aminoantipirina, o-fenilenodiamina ou similares podem ser pro-duzidos.
20 Pela operação descrita anteriormente, hibridomas que produzem anticorpos C5 an-
ti-humano podem ser selecionados. Os hibridomas selecionados são então clonados prlo mé-todo de diluição Iimitante convencional ou método ágar mole. Se desejado, os hibridomasclonados podem ser cultivados em uma grande escala usando um meio contendo soro ou ummeio sem soro, ou podem ser inoculados na cavidade abdominl de camundongos e recupera-25 dos de ascitos, assim um grande número de hibridomas clonados pode ser obtido.
Dentre os anticorpos C5 anti-humanos monoclonais selecionados, os que têm umacapacidade de prevenir clivagem de C5 (por exemplo, em um sistema de ensaio C5 de ba-se celular) são então escolhidos para análise e manipulação adicionais. Se o anticorpo blo-queia a clivagem de C5, significa que o anticorpo monoclonal testado tem uma capacidade30 de reduzir ou neutralizar a atividade C5 de C5 humano. Isto é, o anticorpo monoclonal espe-cificamente reconhece e/ou interfere com a clivagem e ativação de C5.
Os anticorpos monoclonais aqui adicionalmente incluem anticorpos híbridos e re-combinantes produzidos ligando um domínio variável (incluindo hipervariável) de um anti-corpo anti-C5 com um domínio constante (por exemplo, anticorpos "humanizados"), ou uma35 cadeia leve com uma cadeia pesada, ou uma cadeia de uma espécie com uma cadeia deuma outra espécie, ou fusões com proteínas heterólogas, independente da espécie de ori-gem ou designação de classe ou subclasse de imunoglobulina, bem como fragmentos denticorpos [por exemplo, Fab1 F(ab)2, e Fv], desde que eles apresentem a atividade biológi-ca desejada. [Ver, por exemplo, patente U.S. No. 4.816.567 e Mage & Lamoyi, in Mono-clonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Mareei Dekker, Inc.),New York (1987)].
Assim, o termo "monoclonal" indica que o caráter do anticorpo obtido é de uma po-pulação substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como exi-gência de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticor-pos monoclonais a ser usados de acordo com a presente invenção podem ser preparadospelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler & Milstein, Nature 256:49510 (1975), ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (patente U.S. No.4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de fagogeradas usando as técnicas descritas em McCafferty et ai., Nature 348:552-554 (1990), porexemplo.
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imu-15 noglobulinas quiméridas específicas, cadeias ou de imunoglobulina ou fragmentos destas(tais como Fv, Fab, Fab', F(ab)2 ou outras subseqüências de ligação ao antígeno de anticor-pos) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maiorparte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (receptor de anticorpo) em queresíduos das regiões que determinam complementariedade (CDRs) do receptor de anticorpo20 são substituídas das CDRs de uma espécie nãop humana (anticorpo doador) tais como ca-mundongo, ratoo ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Emalguns exemplos, resíduos da região do arcabouço (FR) Fv da imunoglobulina humana sãosubstituídos por res;iduos de FR não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpohumanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no receptor de anti-25 corpo nem nas seqüências CDR ou FR importadas. Estas modificações são feitas para refinare otmizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizadocompreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios va-riáveis, em que todas ou substancialmente todas das regiões de CDR correspondem às deuma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos dos resíduos de FR30 são os de uma seqüência consensus de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizadoidealmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imu-noglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.
Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na tecnologi-a. No geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos35 nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são fre-qüentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tomados de um do-mínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo ométodo de Winter e colaboradores (Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann etal., (1988) Nature 332: 323-327; e Verhoeyen et al., (1988) Science 239: 1534-1536), substitu-indo CDRs de roedores ou seqüências CDR pelas seqüências correspondentes de um anti-corpo humano. Desta maneira, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos, emque substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela se-qüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizadossão tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente algunsresíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a ser usadosno preparo dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. Deacordo com o método então denominado "melhor ajuste", a seqüência do domínio variável deum anticorpo de roedor é selecionada contra toda a biblioteca de seqüências de domínio vari-ável humanas conhecidas. A seqüência humana que é mair próxima à do roedor é então acei-ta como o arcabouço humano (FR) para o anticorpo humanizado (Sites et al., (1993) J. Inunn-nol.,151:2296; e Chothia e Leak (1987) J. Mol. Biol., 196:901). Another método uses um parti-cular arcabouço derived from o consensus seqüência of ali anticorpos humanos of um particu-lar subgroup of Iight ou heavy chains. O same arcabouço may be used for several differentanticorpos humanizados (Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 89: 4285; e Prestaet al., (1993) J. Immol., 151:2623).20 É adicionalmente importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de al-
ta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esta me-ta, de acordo com um método usado, anticorpos humanizados são preparados por um pro-cesso de análise das seqüências parenterais e vários produtos humanizados conceituais u-sando modelos tridimensionais das seqüências parenterais e humanizadas. MOdeIos de imu-25 noglobulina tridimensional são comumente disponíveis e são familiares aos versados na tecno-logia. Programas de computador são disponíveis que ilustram e apresentam estruturas con-formacionais tridimensionais prováveis de seqüência de imunoglobulinas candidata seleciona-da. A inspeção das apresentações permite a análise do provável papel dos resíduos na for-mulação da seqüência de imunoglobulinas candidata, isto é, a análise dos resíduos que in-30 fluenciam na capacidade da imunoglobulina candidata ligar ao seu antígeno. Desta maneira,resíduos de FR podem ser selecionados e combinados de seqüências consensus e de impor-tação, de maneira tal que a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidadepara o antígeno(s) alvo, seja alcançada, No geral, os resíduos de CDR são diretamente emais substancialmente envolvidos na influência da ligaçÃo do antígeno.35 Anticorpos humanos monoclonais direcionados contra C5 também estão incluídos
na invenção. Tais anticorpos podem ser preparados pelo método do hibridoma. Linhas celu-lares de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humano para a produção de anti-corpos humanos monoclonais foram descritas, por exemplo, por Kozbor (1984) J. Immunol.,133, 3001; Brodeur, et al., MOnocIonaI Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987); e Boemer et al., (1991) J. Jmmunol.,147:86-95.
Atualmente é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos)que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorposhumanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, descreveu-seque a deleção homozigota do gene da região que une a cadeia pesada do anticorpo(J.sub.H) em camundongos mutantes de linha quimérica e de germinação resulta na com-10 pleta inibição de produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo do gene deimunoglobulina de linha de germinação humanao em tal camundongo mutante de linha degerminação resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio do antígeno (ver,por exemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 90: 2551; Jakobovits et al.,(1993) Nature, 362:255-258; e Bruggermann et al., (1993) Year in Immuno., 7:33).15 Alternativamente, a tecnologia de apresentação de fago (McCafferty et aL, (1990)
Nature, 348: 552-553) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmento deanticorpos in vitro, a partir de repertórios do gene do domínio variável (V) de imunoglobulinade doadores imunizados (para revisão ver, por exemplo, Johnson et al., (1993) Current Opi-nion in Structural Biology, 3:564-571). Várias fontes de segmentos de gene-V podem ser20 usadas para apresentação de fago. Por exemplo, Clackson et al., ((1991) Nature, 352: 624-628) isolou um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona de uma biblioteca combinatorialaleatória pequena de genes V derivada dos baços de camundongos imunizados. Um reper-tório de genes V de doadores humanso imunizados pode ser construído e anticorpos para umdiverso arranjo de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados essencialmente25 depois das técnicas descritas por Marks et al., ((1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, ou Griffithet al., (1993) EMBO J., 12:725-734).
Em uma resposta imune natural, genes de anticorpo acumulam mutações em umaalta taxa (hipermutação somática). Algumas das mudanças introduzidas conferirão maior afi-nidade, e células B que apresentam imunoglobulina de siperfície de alta afinidade são prefe-30 rencialmente replicadas e diferenciadas durante subsequente desafio do antígeno. Este pro-cesso natural pode ser imitado empregando a técnica conhecida como "embaralhamento decadeia" (ver Marks et. al., (1992) Bio. Technol., 10:779-783). Neste método, a afinidade deanticorpos humanos "primários" obtidos pela apresentação de fago pode ser melhorada se-qüencialmente substituindo os genes de região V de cadeia pesada e leve por repertórios de35 variantes que ocorrem naturalmente (repertórios) de genes de domínio V obtidos de doadoresnão imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmento de anticorposcom afinidades na faixa de nM. Uma estratégia para preparar repertórios de anticorpo defago muito grande foi descrita por Águahouse et al., ((1993) Nucl. Acids Res., 21:2265-2266).
Embaralhamento de gene também pode ser usado para derivar anticorpos huma-nos de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidadessimilares aos anticorpo do roedor de partida. De acordo com este método, que também é refe-rido como " impressão de epítopo", o gene de domínio V de cadeia pesada ou leve de anti-corpos de roedores obtidos pela técnica de apresentação de fago é substituído por um reper-tório de genes de domínio V humanos, criando quimeras roedor-humano. A seleção do antí-geno resulta no isolamento de variável humana capaz de restaurar um sítio de ligação antíge-no funcioal, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha do par. Quando o processo é repe-tido de maneira a substituir o domínio V de roedor remanescente, um anticorpo humani é ob-tido (ver PCTWO 93106213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanizaçãotradicional de anticorpos de roedor por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorposcompletamente humanos, que não tem nenhum arcabouço ou resíduos CDR de origem de15 roedor.
Um exemplo de um anticorpo monoclonal e um fragmento de anticorpo que podeser usado como um agente anti-C5 nos métodos da invenção é Eculizumab (também co-nhecido como Soliris™, Alexion, Cheshire, CT) e Pexelizumrab (Alexion, Cheshire, CT), res-pectivamente, ambos descritos em USSN 6.355.245 aqui incorporado pela referência na sua20 íntegra.
A invenção também inclui o uso de agentes anti-C5 da invenção com anticorpos an-tagonistas direcionados contra PDGF e para VEGF e seus receptores PDGFR e/ou VEGFRcognatos, respectivamente nos métodos da invenção de estabilizar, tratar e/ou prevenir de-sordens oculares. Desta maneira, os métodos descritos imediatamente antes podem ser usa-25 dos para gerar antagonistas de anticorpo da invenção para bloquear a ligação de um Iigante(por exemplo PDGF ou VEGF) com seu alvo, tal como receptor cognato. Desta maneira, umanticorpo antagonista de PDGF da invenção inclui anticorpos direcionados contra um PDGF,bem como um alvo PDGFR.
Exemplos de anticorpos antagonistas direcionados contra VEGF para uso com a-30 gentes anti-C5 nos métodos da invenção são: bevacizumab (também conhecido como Avas-tin®, Genentech, San Francisco, CA) descrito na patente U.S. No. 6.054.297 aqui incorpora-da pela referência na sua íntegra; e ranibizumab (também conhecido como Lucentis®, Ge-nentech, San Francisco, CA).
Agentes anti-C5 Antisentido e Ribozima35 Os agentes anti-C5 da invenção incluem oligonucleotídeos antisentido e ribozimas
que são alvejados para C5 e efetuam a inibição de C5 inibindo a tradução da proteína a partirdo RNA mensageiro ou alvejando a degradação do RNAm de C5 correspondente. O uso dogentes anti-C5 antisentido e ribozima nos métodos de tratar desordens oculares também éfornecido. Em modalidades particulares, a invenção compreende administrar um agente anti-sentido ou ribozima anti-C5 a um sujeito em um método de reduzir, estabilizar e/ou prevenirpelo menos um sintoma de uma desordem ocular, particularmente um sintoma de retinopatiadiabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.
Métodos de projetar e sintetizar oligonucleotídeos e ribozimas antisentido são co-nhecidos na tecnologia. Direções adicionais são fornecidas aqui.
Um problema no projeto de oligonucleotídeos e ribozimas alvejados ao RNAm es-pecíficos e efetivos (ODNs antisentido) é o de identificar sítios acessíveis de pareamento anti-sentido no RNAm alvo (que é em si dobrado em uma estrutura secundária parcialmente au-to-pareada). Uma combinação de algoritmos auxiliados por computador para prever a aces-sabilidade do pareamento de RNA e seleção molecular permite a criação de ribozimas e/ouoligonucleotídeos antisentido específicos e efetivos contra a maioria dos RNAm alvos. Naverdade várias abordagens foram descritas para determinar a acessabilidade de uma molé- cuia de RNA alvo aos inibidores de antisentido ou ribozima. Uma abordagem usa um ensaiode seleção in vitro que aplica o máximo de oligodeoxynucleotídeos antisentido possível (verMonia et al., (1996) Nature Med., 2:668-675; e Milner et al., (1997) Nature Biotechnol., 15:537-541). Uma outra utiliza bibliotecas aleatórias de ODNs (Ho et al., (1996) Nucleic Acids Res.,24:1901-1907; Birikh et a1., (1997) RNA 3:429-437; e Lima et al., (1997) J. Biol. Chem., 272:626-638). Os sítios acessíveis podem ser monitorados por clivagem de RNase H (ver Birikh et al., su-pra; e Ho et al., (1998) Nature Biotechnol., 16:59-63). RNase H catalisa a clivagem hidrolítica daespinha dorsal do fosfodiéster da fita de RNA de um duplex de DNA-RNA.
Em uma outra abordagem que envolve o uso de um grupo de ODNs semi aleatórios,quimicamente sintetizados quiméricos, é usado para identicar sítios acessíveis clivados por RNase25 H em um RNA alvo sintetizado in vitro. Análises de extensão do iniciador são então usadas paraidentificar estes sítios na molécula alvo (ver Lima et al., supra). Outras abordagens para projetaralvos antisentido em RNA são com base em modelos de dobragem assistidos por computadorpara RNA. Vários registros foram publicados do uso de bibliotecas de ribozima aleatórias paraselecionar a clivagem efetiva (ver Campbell et al., (1995) RNA 1:598-609; Lieber et al., (1995) Mel.30 Cell Biol., 15: 540-551; e Vaish etal., (1997) Biochem., 36:6459-6501).
Outras abordagens in vitro, que utilizam bibliotecas aleatórias ou semi-aleatórias deODNs e RNase H podems er mais usada que as simulações em computador (Liana et al., supra).Entretanto, o uso de RNA sintetizado in vitro não prevê a acessabilidade de ODNs antisentido invivo em virtude de recentes observações sugerirem que interações de polinucleotídeos são influ-35 enciadas por proteínas de ligação ao RNA (ver Tsuchihashi et al., (1993) Science, 267:99-102;Portman et a1., (1994) EMBO J., 13:213-221; e Bertrand e Rossi (1994) EMBO L, 13:2904-2912).A patente U.S. No. 6.562.570, cujos conteúdos estão aqui incorporados pela referência, fornececomposições e métodos para determinar sítios acessíveis em um RNAm na presença de um ex-trato celular, que imita as condições in vivo.
Resumidamente, este método envolve a incubação de RNAs nativos ou sintetizados invitro com ODNs antisentido definidos, ribozimas ou DNAzimas ou com uma biblioteca de ODN5 aleatório ou semi-aleatório, ribozima ou DNAzima, em condições de hibridização em um meio dereação que inclui um extrato celular contendo proteínas que se ligam ao RNA endógenas ou queimita um extrato celular em virtude da presença de uma ou mais proteínas que se ligam ao RNA.Qualquer ODN, Ribozima, ou DNAzima antisentido, que é complementar a um sítio acessível noRNA alvo hibridizará para o sítio. Quando ODNs ou uma biblioteca de ODN definidos é usado,10 RNase H está presente durante hibridização ou é adicionado depois da hibridização para clivar oRNA onde hibridização ocorreu. RNase H pode estar presente quando ribozimas ou DNAzimassão usados, mas não é necessário, uma vez que os ribozimas e DNAzimas clivam RNA ondehibridização ocorreu. Em alguns exemplos, uma biblioteca de ODN aleatória ou semi-aleatória deextratos celulares contendo RNAm endógeno, proteínas que se ligam ao RNA e RNase H é usa-15 da.
Em seguida, vários métodos podem ser usados para identificar os sítios no RNA alvo aosquais ODNs, ribozimas ou DNAzimas antisentidos se ligaram e a clivagem ocorreu. Por exemplo,reação de cadeia de polimerase dependente de deoxinucleotidil transferase (TDPCR) pode serusada com este propósito (ver Komori e Riggs (1998) Nucleic Acids Res., 26:1807-11). Uma etapa20 de transcrição reversa é usada para converter o molde de RNA a DNA, depois de TDPCR. Nestainvenção, o 3' termini necessário para o método TDPCR é criado transcrevendo reversamente oRNA alvo de interesse com qualquer DNA polimerase dependente de RNA adequada (por e-xemplo, transcriptase reversa). Isto é atingido por hibridização de um primeiro iniciador de ODN(P1) para o RNA em uma região que é ajusante (isto é, na direção 5' para 3' na molécula de RNA)25 da porção da molécula de RNA alvo que está em estudo. A polimerase na presença de dNTPscopia o RNA no DNA da extremidade 3' de Pl e termina copiando no sítio de clivagem criado tantopor um ODN antisentido/RNase H, um ribozima quanto um DNAzima. A molécula de DNA inédita(referida como a primeira fita de DNA) serve como primeiro molde para a porção de PCR do mé-todo TDPCR, que é usado para identifica a seqüência alvo acessível correspondente presente no30 RNA.
Por exemplo, o procedimento TDPCR pode então ser usado, isto é, o DNA transcrito re-verso com guanosina trifosfato (rGTP) reage na presença de deoxinucleotidil transferase terminal(TdT) para adicionar uma cauda (rG)2-4 no 3' termini das moléculas de DNA. Em seguida é ligadoum ODN de fita dupla com uma projeção 3'24 em uma fita que pareia base com a cauda (rG)2-4.35 Então dois iniciadores de PCR são adicionados. O primeiro é um iniciador Iigante (12) que é com-plementar à fita do Iigante TDPCR que é ligado à cauda (rG)2-4 (algumas vezes referido como fitainferior). O outro iniciador (P2) pode ser o mesmo que P1, mas pode ser aninhado com relaçãoa Ρ1, isto é, ele é complementar ao RNA alvo em uma região que é pelo menos parcialmente amontante (isto é, na direção 3' para 5' na RNA de molécula) da região que é ligada por P1, mas éa jusante da porção da molécula de RNA alvo que está em estudo. Isto é, a porção da moléculade RNA alvo, que está em estudo para determinar se ela tem sítios de ligação acessíveis é a por-5 ção que é a montante da região que é complementar a P2. Então PCR é realizado de maneiraconhecida na presença de uma DNA polimerase e dNTPs para amplificar segmentos de DNAdefinidos por iniciadores LP e P2. O produto amplificado pode então ser capturado por quaisquerum dos vários métodos conhecidos e subseqüentemente sequenciados em um sequenciador aeDNA automatizado, fornecendo identificação precisa do sítio de clivagem. Uma vez que esta iden-10 tidade foi determinada, DNA antisentido ou ribozimas de seqüência definidos podem ser sintetiza-dos para uso in vitro ou in vivo.
A intervenção antisentido na expressão de genes específicos pode ser atingida pelo usode seqüências de oligonucleotídeos antisentido sintéticas (ver, por exemplo, Lefebvre-d'Heilencourt et al„ (1995) Eur. Cyokine Netw., 6:7; Agrawal (1996) TlBTECH1 14: 376; e Lev-15 Lehman et al., (1997) Antisense Therap. Cohen e Smicek, eds. (Plenum Press, New York)). Re-sumidamente, seqüências de oligonucleotídeos antisentido podem ser seqüências curtas de DNA,tipicamente 15-30mer, mas podem ser pequenas como 7mer (ver Wagner et al., (1994) Nature1372: 333) projetadas para complementar um RNAm alvo de interesse e formar um duplexRNA:AS. Esta formação de duplex pode prevenir o processamento, espaçamento, transporte ou20 tradução do RNAm relevante. Além disso, certas seqüências de nucleotídeos AS podem elicitaratividade de RNase H celular quando hibridizadas com seu RNAm alvo, resultando em degrada-ção de RNAm (ver Calabretta et at., (1996) Semin. Oncol., 23:78). Neste caso, RNase H clivará ocomponente RNA do duplex e pode potencialmente liberar o AS para hibridizar adicionalmentecom moléculas adicionais do RNA alvo. Um modo adicional de ação resulta da interação de25 AS com DNA genômico para formar uma tripla hélice que pode ser transcripcionalmente inativa.
Em as um exemplo não Iimitante de, além de, ou usado em substituição a, uma seqüên-cia antisentido aqui discutida anteriormente, ribozimas podem ser utilizadas para supressão dafunção genética. Isto é particularmente necessário em casos onde a terapia antisentido é limitadapor considerações estequimétricas. Ribozimas então podem ser usadas que alvejarão a mesma30 seqüência. Ribozimas são moléculas de RNA que possuem capacidade catalítica de RNA queclivam um sítio específico em um RNA alvo. O número de moléculas de RNA que são clivadas porum ribozima são maiores que o número previsto por uma estequimetria 1:1 (ver Hampel e Ttitz(1989) Biochem., 28: 4929-33; e Uhienbeck (1987) Nature, 328: 596-600). Desta forma, a presen-te invenção também permite o uso da seqüência de ribozimas alvejadas para um domínio acessí-35 vel de uma espécie de RNAm de PDGF ou VEGF e contendo o centro catalítico apropriado. Osribozimas são preparados e distribuídos da forma conhecida na tecnologia e discutidos adicional-mente aqui. Os ribozimas podem ser usados em combinação com as seqüências antisentido.Ribozimas catalizam a clivagem da ligação fosfodiéster do RNA. SVárias famílias estrutu-rais de ribozima foram identificadas, incluindo íntrons do grupo I, RNase P, a ribozima do vírusdelta da hepatite, ribozimas cabeça de martelo e o ribozima de grampo de cabelo originalmentederivado da fita negativa do RNA satélite do vírus de tobacco ringspot (sTRSV) (ver Sullivan5 (1994) investig. Dermatolog., (Suppl.) 103: 958; e patente U.S. No. 5.225.347). As duas últimasfamílias são derivadas de viróides e virusóides, em que acredita-se que o ribozima é separa mo-nômeros de oligômeros criados durante a replicação de círculo de rolagem (ver Symons (1989)TIBS1 14: 445-50; Symons (1992) Ann. Rev. Biochem., 61: 641-71). Motivos de ribozima cabeçade martelo e hairpin são os mais comumenta adaptados para clivagem trans de RNAms para te-10 rapia genética. O tipo de ribozima utilizado na presente invenção é selecionado da forma conheci-da na tecnologia. Ribozimas de grampo de cabelo estão atualmente em experimentos clínicos esão um tipo particularmente usado. No geral o ribozima tem de 30-100 nucleotídeos de compri-mento.
Embora ribozimas que clivam RNAm em seqüências de reconhecimento de sítios espe-15 cíficos possam ser usados para destruir RNAms particulares, o uso de ribozimas cabeça de mar-telo é particularmente usado. Ribozimas cabeça de martelo clivam RNAms em localizações im-postas por regiões de flanqueamento que formam pares de base complementares com o RNAmalvo. O único requerimento é que o RNAm alvo tenha a seguintes seqüência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozimas cabeça de martelo é bem conhecida na tecnologia e20 é descrita mais completamente em Haseloffe Gerlach ((1988) Nature, 334: 585).
Os ribozimas da presente invenção também incluem RNA endoribonucleases (daqui emdiante "ribozimas tipo Cech"), tal como a que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila(conhecido como IVS, ou L-19 IVS RNA), e que foi extensivamente descrito pos Thomas Cech ecolaboradores (ver Zaug et al., (1984) Science, 224:574-578; Zaug e Cech (1986) Science,25 231:470-475; Zaug1 et al., (1986) Nature1 324:429-433; pedido de patente internacional No.W088/04300; Been e Cech (1986) Cell1 47:207-210. Os ribozimas tipo Cech têm um sítio ativo deoito pares de base, que hibridiza para uma RNA seqüência de alvo onde depois a clivagem doRNA alvo acontece. A invenção engloba os ribozimas tipo Cech, que os oito pares de base al-vos ativam a seqüência de sítios. Embora a invenção não seja limitada a uma teoria particu-30 lar do mecanismo operativo, o uso de ribozimas cabeça de martelo na invenção pode ser umavantagem sobre o uso de antisentido dirigido ao PDGFA/EGF, uma vez que registros recen-tes indicam que ribozimas cabeça de martelo operam bloqueando a tradução de RNA e/ouclivadem específica do RNAm alvo.
Conforme na abordagem antisentido, os ribozimas podem ser compostos de oligo-35 nucleotídeos modificados (por exemplo, para melhor estabilidade, alvejamento, etc.) e sãodistribuídos às células que expressam o RNAm alvo. Um método usado de distribuição en-volve o uso de um construtor de DNA "que codifica" o ribozima mediante o controle de umforte promotor pol Ill ou pol Il constitutivo, de maneira tal que as células transfectadas pro-duzorão quantidades suficientes do ribozima para destruir as mensagens alvejadas e inibir atradução. Por causa dos ribozimas, ao contrário das moléculas antisentido, serem catalíticos,uma concentração intracelular inferior é necessária para a eficiência.
Da forma descrita anteriormente, resistência à nuclease, onde necessário, é forne-cida por qualquer método conhecido na tecnologia que não substancialmente interfere coma atividade biológica dos oligodeoxinucleotídeos antisentido ou ribozimas da forma necessá-ria para o método de usar e distribuir (iyer et ai., (1990) ü. Orq. Cnem., 55: 4693-99; Ecksiein(1985) Ann. Rev. Biochem., 54: 367-402; Spitzer e Eckstein (1988) Nucleic Acids Res., 18:10 11691-704; Woolf et at„ (1990) Nucleic Acids Res., 18: 1763-69; e Shaw et al:, (1991) Nu-cleic Acids Res., 18: 11691-704). Da forma descrita anteriormente para aptâmeros, modifi-cações representativas não Iimitantes que podem ser preparadas para oligonucleotídeosantisentido ou ribozimas, de maneira a melhorar a resistência à nuclease incluem modifica-ção do heteroátomo de fósforo ou oxigênio nas espinha dorsal do fosfato, ligações interaçú-15 car de alquila ou cicloalquila de cadeia pequena ou ligações interaçúcar heteroatômicas ouheterocíclicas de cadeia pequena. Estes incluem, por exemplo, preparar oligômeros 2'-fluorados, O-metilados, metil fosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos e morfolino. Por e-xemplo, o oligonucleotídeo antisentido ou ribozima pode ter ligações de fosforotioato queligam entre quatro a seis bases de nucleotídeo 3'-terminus. Alternativamente, ligações de20 fosforotioato podem ligar todas as bases de nucleotídeo. Oligonucleotídeos antisentido defosforotioato não apresentam normalmente toxicidade significativa em concentrações que sãoefetivas e apresentam meias-vidas farmacodinâmicas efetivas em animais (ver Agarwal etal., (1996) TIBTECH, 14: 376) e são resistentes à nuclease. Alternativamente a resistência ànuclease para o AS-ODN pode ser fornecida tendo uma seqüência que forma uma volta no25 nucleotídeo 9 no 3'-terminus tendo a seqüência de nucleotídeos CGCGAAGCG. O uso dereação de conjugação avidina-biotina também pode ser usda para melhorar a proteção de AS-ODNs contra a degradação de nuclease sérica (ver Boado e Pardridge (1992) Bioconj. Chem., 3:519-23). De acordo com este conceito os agentes AS-ODN são monobiotinilados em sua extremi-dade Y. Quando reagidos com avidina, eles formam complexos firmes, resistentes à nuclease30 com estabilidade 6 vezes melhorada sobre os ODNs não conjugados.
Outros estudos mostraram extensão in vivo de oligodeoxinucleotídeos antisentido (Agar-wai et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 88: 7595). Este processo, supostamente usado co-mo um mecanismo descontaminante para remover AS-oligonucleotídeos estrangeiros da circula-ção, depende da existência de 3'-termini livre nos oligonucleotídeos anexados no qual a extensão35 ocorre. Desta forma, fosforotioatoparcial, proteção da volta ou biotina-avidina nesta importanteposição deve ser suficiente para garantir a estabilidade destes AS-oligodeoxinucleotídeos.
Além de usar bases modificadas da forma descrita anteriormente, análogos de nucleotí-deos podem ser preparados em que a estrutura do nucleotídeo é fundamentalmente alterada eque são mais bem adequados como reagentes terapêuticos ou experimentais. Um exemplo deum análogo de nucleotídeo é um ácido nucléico de peptídeo (PNA) em que o a espinha dorsal defosfato da deoxirribose (ou ribose) no DNA (ou RNA) é substituída por uma espinha dosai de poli-5 amida, que é similar à encontrada em peptídeos. Análogos de PNA mostraram ser resistentes àdegradação por enzimas e ter maior vida in vivo e in vitro. Adicionalmente, PNAS mostraram ligarmair forte a uma seqüência de DNA complementar que uma molécula de DNA. Esta observação éatribuída à faita de repulsão de carga entre a fita de PNA e a fita de DNA. Outras modificaçõesque podem ser fitas nos oligonucleotídeos incluem espinhas dorsais de polímero, espinhas dor-10 sais de polímero morfolino (ver, por exemplo, U.S. Pat, No. 5.034.506, cujos conteúdos estão aquiincorporados pela referência), espinhas dorsais cíclicas, ou espinhas dorsais acíclicas, imitadoresde açúcar ou qualquer outra modificação incluindo a que pode melhorar as propriedades farmaco-dinâmicas do oligonucleotídeo.
Um aspectoo adicional da invenção diz respeito ao uso de enzimas de DNA para dimi-15 nuir a expressão de RNAm alvo uma vez que, por exemplo, enzimas C5 incorporam algumas dascaracterísticas mecanísticas de tecologias tanto antisentido quanto de ribozima. Enzimas de DNAsão projetadas de aneira tal que elas reconhecem uma seqüência alvo particular de ácidos nucléi-cos, muito parecida com um oligonucleotídeo antisentido, entretanto muito parecida com um ribo-zima elas são catalíticas e especificamente clivam o ácido nucléico alvo.20 Atualmente existem dois tipos básicos de enzimas de DNA, e ambos foram identificados
por Santoro e Joyce (ver, por exemplo, patente U.S. No. 6.110.462). A enzima de DNA 10-23compreende uma estrutura de laço que conecta dois braços. Os dois braços fornecem especifici-dade reconhecendo a seqüência alvo particular de ácidos nucléicos enquanto que a estrutura delaço fornece função catalítica em condições fisiológicas.25 Resumidamente, para projetar enzima de DNA que especificamente reconhece e cliva
um ácido nucléico alvo, um versado na tecnologia deve primeiramente identificar a única seqüên-cia alvo. Isto pode ser feito usando a mesma abordagem salientada para oligonucleotídeos antisen-tido. Em certos exemplos, a única ou substancialmente seqüência é rica em GIC de aproximada-mente 18 a 22 nucleotídeos. Alto teor de GIC ajuda a garantir uma interação mais forte entre a30 enzima de DNA e a seqüência alvo.
NA síntese da enzima de DNA, a seqüência de reconhecimento antisentido específicaque alveja a enzima para a mensagem é dividida de maneira tal que os dois braços da enzima deDNA, e o laço da enzima de DNA sejam colocados entre o dois braços específicos.
Métodos de preparar e administrar enzimas de DNA podem ser encontrados, por exem-35 pio, na patente U.S. No. 6.110.462. Similarmente, métodos de distribuir ribozimas de DNA in vitroou in vivo incluem métodos de distribuir ribozima de RNA, da forma salientada aqui. Adicionalmen-te, um versado na tecnologia perceberá que, oligonucleotídeos tipo antisentido, enzimas de DNApodem ser opcionalmente modificados para melhorar a estabilidade e melhorar a resistência àdegradação.
A invenção também inclui o uso de agentes anti-C5 da invenção com agentes antisenti-do, ribozima e/ou enzima de DNA direcionados contra expressão de PDGF e/ou VEGF nos méto-5 dos da invenção de estabilizar, tratar e/ou prevenir desordens oculares. Desta maneira, os méto-dos descritos imediatamente antes podem ser usados para gerar agentes antisentido, ribozimae/ou enzima de DNA para bloquear ou inibir a expressão de PDGF e/ou VEGF para uso com osagentes anti-C5 da invenção.
Agentes RNAi anti -C5
Algumas modalidades da invenção usam materiais e métodos para efetuar a repressãode C5 por meio da interferência de RNA (RNAi). Desta maneira, os agentes anti-C5 da invençãoincluem agentes RNAi anti-C5. A invenção engloba o uso dos agentes RNAi anti-C5 nos métodosde tratar desordens oculares da invenção. Em modalidades particulares, a invenção compreendeadministrar um agente RNAi anti-C5 a um sujeito em um método de reduzir, estabilizar e/ou preve-15 nir pelo menos um sintoma de uma desordem ocular, particularmente um sintoma de retinopatiadiabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.
RNAi é um processo de repressão genética pós-transcripcional de seqüência específicaque pode ocorrer em células eucarióticas. No geral, este processo envolve a degradação de umRNAm de uma seqüência particular induzida pode RNA de fita dula (RNAds) que é homóloga à20 seqüência. Por exemplo, oa expressão de um RNAds longo correspondente à seqüência de umRNAm de fita simples particular (RNAmss) labilizará a mensagem, "interferindo" assim na expres-são do gene correspondente. Desta maneira, qualquer gene selecionado pode ser reprimido intro-duzindo um RNAds que corresponde a todos oi uma parte substancial do RNAm para o gene. Pare-ce que quando um RNAds longo é expresso, ele é inicialmente processado por uma ribonuclease25 Ill em oligonucleotídeos de RNAds menores de poucos pares de base como 21 a 22 de compri-mento. Desta maneira, RNAi pode ser efetuado por introdução ou expressão de RNAdss homólo-gos relativamente pequenos. De fato o uso de RNAdss homólogos relativamente pequenos podeter ceertas vantagens discutidas a seguir.
Células de mamíferos têm pelo menos dois caminhos que são afetados por RNA de fita30 dupla (RNAds). No caminho RNAi (específico de seqüência), o RNAds de iniciação é primeira-mente quebrado em RNAs de intereferência pequenos (si), da forma descrita anteriormente. OsRNAsis têm fitas sentido e antisentido de cerca de 21 nucleotídeos que formam aproximadamenteRNAsis de 19 nucleotídeos com projeções de dois nucleotídeos em cada extremidade 3'. Acredita-se que RNAs de interferência pequenos fornecem a informação de seqüência queu permite que35 um RNA mensageiro específico seja alvejado para degradação. Ao contrário, o caminho não es-pecífico é disparado por RNAds de qualquer seqüência, desde que ele tenha pelo menos cerca de30 pares de base de comprimento. Os efeitos não específicos ocorrem em virtude de o RNAdsativar duas enzimas: PKR (proteína quinase ativada por RNA de fita dupla), que na sua formaativa fosforila o fator de iniciação de tradução elF2 para inicial a síntese de todas as proteínas, e 2',5' oligoadenilato sintetase (2', 5-AS), que sintetiza uma molécula que ativa RNase H, uma enzimanão específica que alveja todos os RNAms. O caminho não específico pode representar uma res-5 posta ao hoepedeiro ao estresse ou infecção viral e, no geral, os efeitos do caminho específicosão minimizados particularmente nos métodos usados da presente invenção. Significativamente,RNAdss maiores parecem ser necessários para induzir o caminho específico e, desta maneira,RNAdss menores que cerca de 30 pares de bases são particularmente usados para efetuar arepressão genética por RNAi (ver, por exemplo, Hunter et al., (1975) Jr. Biol. Chem., 250: 409-17;10 Manche et al., (1992) Mel. Cell Biol., 12: 5239-48; Minks et al., (1979) J. Biol. Chem., 254: 10180-3; e Elbashir et al., (2001) Nature, 411:494-8).
Certos oligonucleotídeos de fita dupla usados para efetuar RNAi são menores que 30 pa-res de base de comprimento e podem compreender cerca de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 ou 17pares de base de ácido ribonucléico. Opcionalmente, os oligonucleotídeos de RNAds da invenção15 podem incluir extremidades de projeção 3'. Projeções 3' de 2-nucleotídeo não Iimitantes exempla-res podem ser compostas de resíduos de ribonucleotídeo de qualquer tipo e podem ainda sercompostos de resíduos de 2'-deoxitimidina, que diminui o custo da síntese de RNA e pode melho-rar a resistência à nuclease de RNAsis em meio de cultura celular e em células transfectadas (verElbashi et at., (2001) Nature, 411: 4948).20 RNAdss maiores de 50, 75,100 ou ainda 500 pares de base ou mais também podem ser
utilizados em certas modalidades da invenção. Concentrações exemplares de RNAdss para efe-tuar RNAi são cerca de 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1,0 nM, 1,5 nM, 25 nM ou 100 nM, embora ou-tras concentrações possam ser utilizadas dependendo da natureza das células tratadas, do genealvo e de outros fatores prontamente discerníveis pelo versado. RNAdss exemplares podem ser25 sintetizados quimicamente ou produzidos in vitro ou in vivo usando vetores de expressão apropri-ados. RNAs sintéticos exemplares incluem RNAs de 21 nucleotídeos quimicamente sintetizadosusando métodos conhecidos na tecnologia (por exemplo, Expedite RNA phophoramidites andthymidine fosforamidita (Proligo, Germany)). Oligonucleotídeos sintéticos podem ser deprotegidose purificados em gel usando métodos conhecidos na tecnologia (ver, por exemplo, Elbashir et al.,30 (2001) Genes Dev., 15: 188-200). RNAs maiores podem ser transcritos de promotores, tais comopromotores de RNA polimerase T7, conhecidos na tecnologia. Um RNA alvo simples, colocado emambas as possíveis orientações a jusante de um promotor in vitro, transcreverá ambas as fitas doalvo para criar um oligonucleotídeo de RNAds da seqüência alvo desejada.
A seqüência específica utilizada no projeto dos oligonucleotídeos pode ser qualquer se-35 qüência contígua de nucleotídeos contidos na mensagem genética expressa do alvo (por exem-plo, de C5). Programas e algoritmos, conhecidos na tecnologia, podem ser usados para selecionarseqüências alvo apropriadas. Além do mais, seqüências ideais podem ser selecionadas, da formadescrita adicionalmente antes, utilizando programas projetados para prever a estrutura secundáriade uma seqüência de ácidos nucléicos de fita simples especificada e permitir seleção das seqüên-cias prováveis de ocorrer em regiões de fita simples expostas de um RNAm dobrado. Métodos ecomposições para projetar oligonucleotídeos apropriados podem ser encontrados em, por exem-5 pio, patente U.S. No. 6.251.588, cujos conteúdos estão aqui incorporados pela referência. Acredi-ta-se que RNAm geralmente é de uma molécula linear que contém a informação para síntese diri-gida de proteína na seqüência de ribonucleotídeos.
Entretanto, estudos revelaram inúmeras estruturas secundárias e terciárias que existem namaioria dos RNAms. Elementos de estrutura secundária em RNA são formados amplamente por10 interações tipo Watson-Crick entre diferentes regiões da mesma molécula de RNA. Elementosestruturais secundários importantes incluem regiões de fita dupla intramoleculares, laços de grampode cabelo, saliências em RNA duplex e laços internos. Elementos estruturais terciários são forma-dos quando elementos estruturais secundários entram em contato um com o outro ou com regiõesde fita simples para produzir uma estrutura tridimensional mais complexa. Inúmeros pesquisadores15 mediram as energias de ligação de um grande número de estruturas duplex de RNA e derivaramum conjunto de regras que podem ser usadas para prever a estrutura secundária de RNA (ver,por exemplo, Jaeger et ai., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86:7706 (1989); e Turner et al.,(1988) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 17:167). As regras são usadas na identificação deelementos estruturais de RNA e, em particular, para identificar regiões de RNA de fita simples, que20 podem representar segmentos particularmente usados do RNAm para o alvo para silenciar tecno-logias de RNAi, ribozima ou antisentido. Desta maneira, segmentos particulares do RNAm alvopodem ser identificados para projetar os oligonucleotídeos de RNAds que medeiam RNAi, bemcomo para projetar composições de ribozima e ribozima cabeça de martelo apropriadas da inven-ção.
25 Os oligonucleotídeos de RNAds podem ser introduzidos na célula por transfecção com
um gene alvo heterólogo usando composições de veículos, tais como lipossomas, que são co-nhecidos na tecnologia, por exemplo, Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Rockville Md.) daforma descrita pelo fabricante para linhas celulares aderentes. A transfecção de oligonucleotídeosde RNAds para alvejar genes endógenos pode ser realizada usando Oligofectamina (Life Techno-30 logies). A eficiência de transfecção pode ser checada usando microscopia de fluorescência paralinhas celulares de mamíferos depois da co-transfecção de pAD3 que codifica hGFP (Kehlenbacketat, (1998) J. Cell. Biol., 141: 863-74). A efetividade do RNAi pode ser estimada por qualquer umde inúmeros ensaios depois da introdução dos RNAdss. Estes incluem, mas sem limitações, aná-lise Westem blot usando anticorpos que reconhecem o produto do gene alvejado depois de tempo35 suficiente para a dobra do grupo endógeno depois da síntese de proteína inédita é reprimida, eanálise Northern blot para determinar o nível de RNAm alvo existente.
Composições, métodos e aplicações ainda adicionais da tecnologia RNAi para uso nainvenção são fornecidos nas patentes U.S. Nos. 6.278.039, 5.723.750 e 5.244.805, que estão aquiincorporadas pela referência.
A invenção também inclui o uso de agentes anti-C5 da invenção com agentes RNAipara repressão de PDGF e/ou VEGF nos métodos da invenção para estabilizar, tratar e/ou5 prevenir desordens oculares. Desta maneira, os métodos descritos imediatamente antes po-dem ser usados para gerar agentes RNAi para reprimir PDGF e/ou VEGF para uso com osagentes anti-C5 da invenção.
Agentes anti-C5 de proteína e poiipeptídeo
Em algumas modalidades da invenção, o agente anti-C5 é uma proteína ou polipep-10 tídeo. A invenção engloba o uso do agente anti-C5 de proteína ou poiipeptídeo nos métodosde tratar desordens oculares. Em modalidades particulares, a invenção compreende adminis-trar um agente anti-C5 de proteína ou poiipeptídeo a um sujeito em um método de reduzir,estabilizar e/ou prevenir pelo menos um sintoma de uma desordem ocular, particularmenteum sintoma de retinopatia diabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.15 Por exemplo, TP10 (Avant Immunotherapeutics, Inc. Needham, MA) um receptor
do complemento truncado solúvel tipo I e agente anti-C5 de proteína ou polipeptídeos descri-tos, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 5.212.071, 5.252.216, 5.256.642, 5.456.909,5.472.939, 5.840.858, 5.856.297, 5.858.969, 5.981.481, 6.057.131, 6.169.068 e 6.316.604cada uma das quais está aqui incorporada pela referência na sua totalidade, podem ser u-20 sados nos métodos da invenção. APT070 (também conhecido como Mirococept8), InflazymePharmaceuticals, LTD., Richmond, B.C. Canada) pode ser usado nos métodos da invenção.
A invenção também inclui o uso de agentes anti-C5 da invenção com agentes anti-PDGF e/ou anti- VBGF de proteína e/ou poiipeptídeo nos métodos da invenção para estabili-zar, tratar e/ou prevenir desordens oculares.25 Agentes anti-C5 de molécula pequena
Em algumas modalidades da invenção, o agente anti-C5 é uma molécula pequena,particularmente uma molécula pequena orgânica. A invenção engloba o uso de agentes demolécula pequena anti-C5 nos métodos de tratar desordens oculares. Em modalidades par-ticulares, a invenção compreende administrar um agente de molécula pequena anti-C5 a um30 sujeito em um método de reduzir, estabilizar e/ou prevenir pelo menos um sintoma de umadesordem ocular, particularmente um sintoma de retinopatia diabética, AMD exudativa e/ounão exudativa.
A invenção também inclui o uso de agentes anti-C5 da invenção com agentes anti-PDGF e/ou anti- VEGF de molécula pequena nos métodos da invenção para estabilizar,35 tratar e/ou prevenir desordens oculares. Por exemplo, um agente anti-C5 da invenção podeser usado com o agente anti-PDGF Imatinib Mesylate (Gleevece, Novartis Phaxmaceuticals,Inc. East Hanover, NJ). Um agente anti-C5 da invenção também pode ser usado com agen-te anti-VEGE, tais como sorafenib (Nexavar ® Onyx Pharmaceuticals, Inc. Emeryville1 CA eBayer Pharmaceuticals Corporation, West Haven1 CT); maleato de sunitnab (SutentO1 Pfi-zer, Inc. NY1 NY)
Aptâmeros anti-C3
5 Em algumas modalidades, os materiais da presente invenção compreendem uma
série de aptâmeros de ácido nucléico que se ligam com alta especificidade à proteína C3 docomplemento e que funcionalmente modulam, por exemplo, bloqueiam, a atividade da prote-ína C3 do complemento em ensaios in vivo e/ou com base em células. Estes aptâmerosfornecem uma baixa toxicidade, segurança, e modalidade efetiva de tratar, estabilizar e/ou10 prevenir uma variedade de doenças ou desordens oculares relacionadas ao complemento nosmétodos da invenção incluindo, por exemplo, uma desordem ocular aguda ou crônica infla-matória e/ou imuno mediada, conjuntivite inflamatória, incluindo conjuntivite alérgica e papi-Iar gigante, edema macular, uveíte, endoftalmite, esclerite, úlceras corneais, síndrome do olhoseco, glaucoma, doença retinal isquêmica, conceal rejeição à transplante, complicações rela-15 cionadas a cirurgia intraocular, tais como implante de lentes intraoculares e inflamação asso-ciada à cirurgia de catarata, doença de Behcet, vasculite do complexo imune, doença deFuch, Vogt-Koyanagi-Harada doença, fibrose sub-retinal, queratite, inflamação cítreo-retinal,infestação/migração parasítica ocular, retinite pignaentosa, retinite de citomegalovírus e clio-roidal inflamação, degeneração macular, degeneração macular relacionada à idade ("AMID"),20 AMD tipo não exudativa ("seca") ou uma desordem de neurovascularização ocular, incluindoretinopatia diabética ou AMD tipo exudativa ("úmida"). Estes aptâmeros também podem serusados em diagnósticos oculares.
Estes aptâmeros para uso nos métodos da invenção podem incluir modificações daforma aqui descrita incluindo, por exemplo, conjugação a compostos lipofílicos ou de alto25 peso molecular (por exemplo, PEG), incorporação de uma fração de capeamento, incorpo-ração de nucleotídeos modificados, e modificações na espinha dorsal de fosfato.
Em uma modalidade, um aptâmero isolado, que ocorre não naturalmente que se ligaà proteína C3 do complemento para uso nos métodos da invenção para tratar, estabilizare/ou prevenir uma desordem ocular mediada pelo complemento é fornecido. Em algumas30 modalidades, o aptâmero que ocorre naturalmente isolado para uso nos métodos da invençãotem uma constante de dissociação ("KD") para a proteína do complemento C3 menor que 100i/M, menor que 1 μΜ, menor que 500 nM, menor que 100 nM, menor que 50 nM, menor que 1nM, menor que 500 pM, menor que 100 pM, menor que 50 pM. Em algumas modalidades dainvenção, a constante de dissociação é determinada por titulação dot blot, da forma descrita35 no exemplo 2 a seguir.
Em uma outra modalidade, os aptâmeros para uso nos métodos da invenção modu-lam uma função da proteína do complemento C3, particularmente inibem uma função da pro-teína do complemento C3 e/ou função da variante da proteína do complemento C3. Uma vari-ante da proteína do complemento C3 da forma aqui usada engloba variantes que realizamessencialmente a mesma função que uma função da proteína do complemento C3. Uma vari-ante da proteína do complemento C3 preferivelmente compreende substancialmente a mesma5 estrutura e em algumas modalidades compreende pelo menos 80 % de identidade de se-qüência, mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade de seqüência, e mais preferi-velmente pelo menos 95 % de identidade de seqüência para a seqüência de aminoácidos daproteína do complemento C3 compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada emDe Bruijn1 MH e Fey1 GH (1985) Human complement component C3: cDNA coding sequence10 and derived primary estructure. Proc Nati Acad Sci USA 82, 708-12.
Outros aptâmeros da invenção que se ligam à proteína C3 do complemento são adi-cionalmente descritos nos pedidos de patente U.S. números de série 6.140.490, 6.395.888 e6.566.343 cada um dos quais está aqui incorporado pela referência na sua totalidade.
Aptâmeros anti-C1q
15 Em algumas modalidades, os materiais da presente invenção compreendem uma sé-
rie de aptâmeros de ácido nucléico que se ligam com alta especificidade à proteína C1q docomplemento e que funcionalmente modulam, por exemplo, bloqueiam, a atividade da proteí-na C1q do complemento em ensaios in vivo e/ou com base em células.
Estes aptâmeros fornecem uma baixa toxicidade, segurança, e modalidade efetiva de20 tratar, estabilizar e/ou prevenir uma variedade de doenças ou desordens oculares relaciona-das ao complemento nos métodos da invenção incluindo, por exemplo, uma desordem ocularaguda ou crônica inflamatória e/ou imuno mediada, conjuntivite inflamatória, incluindo allergice conjuntivite papilar gigante, edema macular, uveíte, endoftalmite, esclerite, úlceras corneais,síndrome do olho seco, glaucoma, doença retinal isquêmica, rejeição ao transplante de cór-25 nea, complicações relacionadas à intraocular cirurgia, tais como implante de lentes intraocula-res e inflamação associada à cirurgia de catarata, doença de Behcet, vasculite do complexoimune, doença de Fuch, Vogt-Koyanagi Harada doença, fibrose sub-retinal, queratite, infla-mação cítreo-retinal, infestação/migração parasítica ocular, retinite pigmentosa, retinite decitomegalovírus e inflamação coroidal, degeneração macular, degeneração macular relacio-30 nada à idade ("AMD"), AMD tipo não exudativa ("seca"), ou uma desordem de neurovascula-rização ocular, incluindo retinopatia diabética ou AMD tipo exudativa ("úmida"). Estes aptâ-meros também podem ser usados em diagnósticos oculares.
Estes aptâmeros para uso nos métodos da invenção podem incluir modificações daforma aqui descrita incluindo, por exemplo, conjugação a compostos lipofílicos ou de alto35 peso molecular (por exemplo, PEG), incorporação de uma fração de capeamento, incorpo-ração denucleotídeos modificados, e modificações para a espinha dorsal de fosfato.
Em uma modalidade, um aptâmero isolado, que ocorre não naturalmente que se Ii-ga à proteína do complemento C1q para uso nos métodos da invenção para tratar, estabilizare/ou prevenir uma desordem ocular mediada pelo complemento é fornecido. Em algumasmodalidades, o aptâmero isolado, que ocorre não naturalmente para uso nos métodos dainvenção tem uma constante de dissociação ("KD") para proteína do complemento C1q me-5 nor que 100 μΜ, menor que 1 μΜ, menor que 500 nM, menor que 100 nM, menor que 50nM, menor que 1 nM, menor que 500 pM, menor que 100 pM, menor que 50 pM. Em algu-mas modalidades da invenção, a constante de dissociação é determinada por titulação dotbiot, da forma descrita no exemplo 2 a seguir.
Em uma outra modalidade, os aptâmeros para uso nos métodos da invenção modu-10 Iam uma função da proteína do complemento C1q, particularmente inibem uma função daproteína do complemento C1q e/ou função da variante da proteína do complemento C1q.Uma variante da proteína do complemento C1q, da forma aqui usada, engloba variantes querealizam essencialmente a mesma função que uma função da proteína do complemento C1q.Uma variante da proteína do complemento C1q preferivelmente compreende substancial-15 mente a mesma estrutura e em algumas modalidades compreende pelo menos 80 % deidentidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade de seqüên-cia, e mais preferivelmente pelo menos 95 % de identidade de seqüência para a seqüênciade aminoácidos da proteína do complemento C1q compreendendo a seqüência de aminoá-cidos apresentada em Seltar, GC, Blake, DJ e Reid1 KB (1991) Characterization and organiza-20 tion of the genes encoding the A-, B- and C-chains of human complement subcomponenteC1q. The complete derived amino acid sequence of human C1q. Biochem 3.274, 481-90.
Outros aptâmeros da invenção que se ligam a proteína C1q do complemento sãoadicionalmente descritos nos pedidos de patente U.S. números de série 6.140.490,6.395.888 e 6.566.343 cada um dos quais está aqui incorporado pela referência na sua ín-25 tegra.
Em algumas modalidades terapêuticos de aptâmeros, incluindo anti-C5, C3 e/ouC1q da presente invenção têm excelente afinidade e alta especificidade a seus alvos, redu-zindo ao mesmo tempo os efeitos colaterais prejudiciais de substituições de nucleotídeo queocorre não naturalmente se os terapêuticos de aptâmero destriírem o corpo dos pacientes30 ou sujeitos.
O aptâmeros anti-complemento da presente invenção, incluindo aptâmeros anti-C5,C3 e/ou C1q da invenção, podem ser sintetizados usando quaisquer técnicas de síntese deoligonucleotídeo conhecidas na tecnologia, incluindo técnicas de síntese de oligonucleotídeode fase sólida bem conhecidas na tecnologia (ver, por exemplo, Froehler et al., Nucl. Acid35 Res. 14:5399-5467 (1986) e Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1985)) e métodos defase de solução, tais como métodos de síntese de triéster (ver, por exemplo, Sood et al.,Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hfrose at al., Tel Lett., 28:2449 (1978)).A invenção também inclui o uso de aptâmeros anti-complemento da invenção (inclu-indo aptâmeros anti-C5, C3 e/ou C1q) com aptâmeros para PDGF e /ou VEGF e/ou seus re-ceptores cognatos PDGFR e VEGFR1 respectivamente nos métodos da invenção de estabi-lizar, tratar e/ou prevenir desordens oculares.
Exemplos de aptâmeros anti-PDGF para uso nos métodos da invenção são descri-tos no pedido de patente internacional No. PCT/US2005/039975 depositado em 2 de novem-bro de 2005 e aqui incorporado pela referência na sua íntegra, particularmente ARC513,ARC594, ARC127 e ARC404 descritos nele.
Exemplos de aptâmeros específicos VEGF para uso nos métodos da invenção são10 descritos nas patentes U.S. Nos. 5.919.455, 5.932.462, 6.113.906, 6.011.020, 6.051.698 e6.147.204. Por exemplo, um aptâmero particularmente usado para uso no tratamento de de-sordens oculares em combinação com um aptâmero anticomplemento, particularmente umaptâmero anti-C5, da invenção seriaEYE001 (previamente NX1838) na sua forma peguiladae nã peguilada, particularmente injeção de pegaptanib de sódio (Macugen®, Eyetech Phar-15 maceuticals, Inc. e Pfizer, Inc. NY1 NY).
Composições farmacêuticas
A invenção também inclui composições farmacêuticas contendo um agente anti-C5,particularmente moléculas de aptâmero que se ligam à proteína C5 do complemento, parti-cularmente um aptâmero que se liga à proteína C5 do complemento e previne sua clivagem.20 Em algumas modalidades, as composições são adequadas para uso interno e incluem umaquantidade efetiva de um composto farmacologicamente ativo da invenção, sozinho ou emcombinação, com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos sãoespecialmente usados em que eles têm muito baixa, se presente, toxicidade.
Composições da invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir uma patologia,25 tal como uma doença ou desordem, ou aliviar os sintomas de tal doença ou desordem emum paciente. Por exemplo, composições da presente invenção podem ser usadas para tra-tar ou prevenir uma patologia associada a desordens do coração relacionadas ao comple-mento (por exemplo, lesão do miocárdio; Complicações do complemento mediadas por C5com relação à cirurgia de enxerto baypass da artéria coronária (CABG), tais como sangra-30 mento pós operatório, ativação de neutrófilo e leucócito sistêmica, maior risco deinfarto domiocárdio e maior disfunção cognitiva; resteaosis; e complicações mediadas por C5 relacio-nadas à intervenção coronária percutânea); lesão de isquemia-reperfusão (por exemplo,infarto do miocárdio, acidente vascular, frostbite); desordens inflamatórias relacionadas aocomplemento (por exemplo, asma, artrite, sepse, e rejeição depois de transplante de órgão);35 e desordens autoimunes relacionadas ao complemento (por exemplo, miastenia grave, Iu-pus eritematoso sistêmico (SLE, ou lupus); inflamação dos pulmões; ativação extracorpóreado complemento; ativação do complemento mediada por anticorpo; e indicações ocularesmediadas pelo complemento, tal como desordens de neovascularização ocular, particular-mente retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD). Em uma mo-dalidade particular, as composições da presente invenção são usadas para reduzir, estabili-zar e/ou prevenir um sintoma de desordem ocular mediada por C5, particularmente retinopa-tia diabética, AMD exudativa e/ou não exudativa.
Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser usadas para es-tabilizar, tratar e/ou prevenir uma patologia, tal como uma doença ou desordem ocular, emum paciente. Por exemplo, composições da presente invenção podem ser usadas para estabi-lizar, tratar e/ou prevenir uma patologia associada a desordens oculares relacionadas aocomplemento, tais como: inflamação aguda ou crônica e/ou desordem ocular imuno media-da, conjuntivite inflamatória, incluindo conjuntivite alérgica e papilar gigante, edema macular,uveíte, endophthalmitis, esclerite, úlceras corneais, síndrome do olho seco, glaucoma, doen-ça retinal isquêmica, rejeição de transplante de córnea, complicações relacionadas a cirurgiaintraocular, tais como implante de lentes intraoculares e inflamação associada à cirurgia de15 catarata, doença de Behcet, vasculite do complexo imune, doença de Fuch, Vogt-Koyanagi-Harada doença, fibrose sub-retinal, queratite, inflamação cítreo-retinal, infestação/migraçãoparasítica ocular, retinite pigmentosa, retinite de citomegalovírus e inflamação coroidal, de-generação macular, degeneração macular relacionada à idade tipo ADM não exudativa ("se-ca"), ou uma desordem de neurovascularização ocular, incluindo retinopatia diabética ou20 AMD exudativa ("úmida").
Composições da invenção são usadas para administração a um sujeito que sofreou é pré-disposto a uma doença ou desordem que é relacionada ou derivada de proteína C5do complemento cujos agentes anti-C5 da invenção inibem ou ao qual os agentes anti-C5 dainvenção especificamente se ligam. Em algumas modalidades, composições da invenção25 são especificamente usadas para administração a um sujeito que sofre ou é pré-disposto auma doença ou desordem ocular que é relacionada ou derivada da proteína do complemen-to que os aptâmeros anti-complemento da invenção inibem e/ou se ligam aos aptâmeros anti-complemento da invenção se ligam com alta especificidade.
Em algumas modalidades, composições para tratamento dos sujeitos que sofrem30 ou são pré-dispostos a uma desordem ocular mediada pelo complemento são fornecidas.Em modalidades particulares, composições para o tratamento de sujeitos que sofrem ouestão em risco de uma desordem ocular mediada pelo complemento, particularmente AMDtipo não exudativa e/ou uma desordem de neurovascularização ocular, particularmente reti-nopatia diabética e AMD tipo exudativa são fornecidas. Em algumas modalidades, sujeitos35 em risco são os com glândulas e/ou mudanças na pigmentação da retina, mas sem perdaclínica de acuidade visual. Gânglios são detectados usando um oftalmascópio, tipicamenteque aparece como manchas e partículas amarelas contra o fundo vermelho da retina. A perdaclínica de acuidade visual é a demonstração de uma redução de 1 a 3 linhas na visão usandoo tratamento precoce para carta de estudo da retinopatia diabética ("carta ETDRS"). Outrasmudanças na visão associadas à degeneração macular incluem distorções e/ou pontos ce-gos (escotoma) detectados usando uma grade Amsler, mudanças na adaptação ao escuro5 (diagnóstico de saúde da célula de bastão) ou mudanças na interpretação da cor (diagnósti-co de saúde da célula cônica). Em algumas modalidades, os sujeitos em risco são os comuma variação no fator H do complemento do sujeito comparado ao tipo selvagem. Ver, porexemplo, as variações descritas por Edwards et ai., Science vol 308, pp421- 422 (2005), Ha-geman, G. et al, PNAS, vol.102, pp. 7227-7231 (2005), e Haines, J. et ai., Science, vol. 308,10 pp 419-421 (2005). Em algumas modalidades os sujeitos em risco são os com uma combina-ção de gânglios, nenhuma perda de acuidade visual e uma variação no fator H do comple-mento. Em algumas modalidades, os sujeitos em risco são os em que gânglios são detecta-dos. Em algumas modalidades, os sujeitos em risco a ser tratados são os em que gânglios sãodetectados e existe uma perda clínica de acuidade visual e/ou outras mudanças na visão.15 Composições da invenção podems er usadas em um método para tratar um paciente
ou sujeito com um patologia que, em algumas modalidades preferidas, é uma patologia ocular.Os métodos da invenção envolvem administrar ao paciente ou sujeito um agente anti-C5, par-ticularmente um aptâmero específico de C5 ou uma composição compreendendo o mesmo,de maneira tal que o agente anti-C5 se ligue à proteína C5 do complemento, de maneira tal que20 a ligação à proteína C5 do complemento altere sua função biológica, por exemplo, prevenindosua clivagem in vivo, tratando assima patologia mediada por C5. Em modalidades particula-res, a ligação do agente anti-C5 da invenção, particularmente o aptâmero específico de C5 dainvenção reduz o nível de expressão de VEGF e/ou PDGF e/ou bFGF e/ou outros fatores decrescimento que estimulam crescimento celular endotelial, particularmente no tecido retinal,25 células RPE, vasos coroidais e/ou capilares retinais, em paciente, tratando assim desordensmediadas por VEGF e/ou PDGF, particularmente desordens de neovascularização ocular, taiscomo AMD e/ou retinopatia diabética.
Em uma modalidade, um aptâmero anticomplemento da invenção, particularmenteum aptâmero anti-C5 da invenção é administrado ocular ou peri-ocularmente a um sujeito em30 uma quantidade suficiente para reduzir o nível de expressão de VEGF e/ou PDGF ocular invivo. Em uma modalidade particular dos métodos da invenção, o sujeito ao qual o aptâmeroanticomplemento, particularmente um aptâmero anti-C5 da invenção, é administrado é identifi-cado como tendo a desordem de neurovascularização ocular ou em risco de ter onde a expres-são reduzida de VEGF e/ou PDGF auxilia na prevenção, estabilização e/ou redução de pelo35 menos um sintoma da desordem de neurovascularização ocular.
O paciente ou sujeito com uma patologia ocular, isto é, o paciente ou sujeito tratadopelos métodos desta invenção pode ser um vertebrado, mais particularmente um mamífero,ou mais particularmente, um humano.
Na prática, os agentes anti-C5 da invenção, particularmente aptâmeros específicosde C5 da invenção ou seus sais ou promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis são admi-nistrados em quantidades que serão suficientes para exercer sua atividade biológica desejada,5 por exemplo, inibição da ligação do aptâmero alvo ao seu receptor, prevenção da clivagem deuma proteína alvo.
Um aspecto da invenção compreende uma composição de aptâmero da invenção emcombinação com outros tratamentos para desordens do complemento mediadas por C5. Emuma modalidade a presente invenção descreve uma composição de aptâmero da invenção10 em combinação com outros tratamentos para desordens oculares mediadas pelo complemen-to. A composição de aptâmero da invenção pode conter, por exemplo, mais que um aptâmero.Em alguns exemplos, uma composição de aptâmero da invenção, contendo um ou mais com-postos da invenção, é administrada em combinação com uma outra composição usada, talcomo um agente antiinflamatório, um imunossupressor, um agente antiviral ou similares. Além15 disso, os compostos da invenção podem ser administrados em combinação com um agentecitotóxico, citostático ou quimioterapêutico, tais como um agente alquilante, anti-metabólito,inibidor mitótico ou antibiótico citotóxico, da forma descrita anteriormente. Em modalidadesparticulares, o agente anti-C5 da invenção, tal como no geral, as formas de dosagem atual-mente disponíveis dos agentes terapêuticos conhecidos para uso em tais combinações serão20 adequados.
"Terapia de combinação" (ou "co-terapia") inclui a administração de um agente anti-C5 da invenção, particularmente uma composição de aptâmero específico de C5 da invençãoe pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico desti-nado a fornecer o efeito benéfico da co-ação destes agentes terapêuticos. O efeito benéfico25 da combinação inclui, mas sem limitações, co-ações farmacocinéticas ou farmacodinâmicasresultantes da combinação de agentes terapêuticos. A administração dos agentes terapêuti-cos em combinação tipicamente é realizada por um período de tempo definido (normalmenteminutos, horas, dias ou semanas dependendo da combinação selecionada). Em algumas mo-dalidades, o segundo agente pode ser um agente anti-VEGE e/ou um agente anti-PDGF.30 Em modalidades dos métodos descritos anteriormente, onde o método adicionalmen-
te compreende a etapa de administrar ao sujeito um agente anti-VEGF, o agente anti-VEGEpode ser selecionado do grupo que consiste em: uma molécula de ácido nucléico, um aptâme-ro, uma molécula antisentido, uma molécula de RNA, uma proteína, um peptídeo, um peptídeocíclico, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um polímero, e uma molécula35 pequena.
Em modalidades dos métodos descritos anteriormente, onde o método adicionalmen-te compreende a etapa de administrar ao sujeito um agente anti-PDGF, o agente anti-PDGFpode ser selecionado do grupo que consiste em uma molécula de ácido nucléico, um aptâme-ro, uma molécula antisentido, uma molécula de RNAi1 uma proteína, um peptídeo, um peptí-deo cíclico, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um polímero, e uma moléculapequena.
Em algumas modalidades dos métodos descritos anteriormente, onde o método adi-cionalmente compreende administrar um agente anti-vascular ao sujeito o agente anti-vascular é um derivado de porfirina. Em algumas modalidades o derivado de porfirina, é ver-toporfina para injeção (Visudyne®, Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ).Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende a etapa de ativar o derivadode porfirina com luz de laser.
"Terapia de combinação" pode, mas geralmente não é, ser destinada a englobar aadministração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de regimes de mono-terapia separadas que incidental e arbitrariamente resultam nas combinações da presenteinvenção. "Terapia de combinação" se destina a abranger a administração destes agentes15 terapêuticos de uma maneira seqüencial, isto é, em que cada agente terapêutico é adminis-trado em diferentes tempos, bem como administração destes agentes terapêuticos, ou pelomenos dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea. Adminis-tração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, administrando ao sujeitouma cápsula adequada com uma razão fixa de cada agente terapêutico ou em cápsulas múl-20 tiplas, únicas para cada um dos agentes terapêuticos. Em uma outra modalidade, administra-ção substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, administrando ao sujeitouma seringa única com uma razão fixa de cada agente terapêutico ou em cápsulas múltiplas,únicas para cada um dos agentes terapêuticos.
Administração seqüencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêuti-25 co pode ser efetuada por qualquer via apropriada incluindo, mas sem limitações, vias tópicas,vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares, vias oculares e absorção direta por meiodos tecidos da membrana mucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pelamesma via ou por diferentes vias. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combina-ção selecionada pode ser administrado por injeção, enquanto que os outros agentes terapêu-30 ticos da combinação podem ser administrados topicamente.
Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser adminis-trados topicamenbte ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção.A seqüência em que os agentes terapêuticos são administrados não é estreitamente crítica, amenos que de outra forma notado. "Terapia de combinação" também pode abranger a admi-35 nistração dos agentes terapêuticos da forma descrita anteriormente em combinação adicio-nal com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapia de combinação adicio-nalmente compreende um tratamento não medicamentoso, o tratamento não medicamentosopode ser conduzido em qualquer tempo adequado, desde que um efeito benéfico da co-açãoda combinação dos agentes terapêuticos e tratamento não medicamentoso seja alcançado.Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico ainda é alcançado quando o trata-mento não medicamentoso é temporariamente removido da administração dos agentes te-rapêuticos, talvez dias ou mesmo semanas.
Composições terapêuticas ou farmacológicas da presente invenção geralmentecompreenderão uma quantidade efetiva dos componentes ativos da terapia, dissolvidos oudispersos em um meio farmaceuticamente aceitável. Meios e veículos farmaceuticamenteaceitáveis incluem qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentesantibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e que retardam a absorção e similares. Ouso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na tec-nologia. Ingrediente ativos suplementares também podem ser incorporados nas composi-ções terapêuticas da presente invenção.
A preparação de composições farmacêuticas e farmacológicas serão conhecidaspelos versados na tecnologia na luz da presente descrição. Tipicamente, tais composiçõespodem ser preparadas como injetáveis, tanto como soluçõe líquidas quanto suspensões;formas sólidas adequadas para solução ou suspensão, líquidas antes da injeção; na forma decomprimidos ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de liberação de tempo;ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo colírios, cremes, loções,pomadas, inalantes e similares. O uso de formulações estéreis, tais como águas a base desalina, por cirurgiões, médicos ou profissionais de saúde em uma área particular no campode operação também pode ser particularmente usada. Composições também podem serdistribuídas por meio de microdispositicos, micropartículas ou esponjas.
Na formulação, terapêuticos serão administrados de uma maneira compatível com a25 formulação da dosagem e em uma quantidade tal que seja farmacologicamente efetiva. Adformulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, taiscomo o tipo de soluções injetáveis descritos anteriormente, mas cápsulas de liberação de me-dicamento e similares também podem ser empregadas.
Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e volume da composição a ser ad-30 ministrada depende do animal hoepedeiro a ser tratado. Quantidades precisas de compostoativo necessárias para a administração dependem do julgamento do médico e são peculiarespara cada indivíduo.
Um volume mínimo de uma composição necessário para dispersar os compostos ati-vos é tipicamente utilizado. Regimes adequados para administração também são variáveis,35 mas podem ser tipificados administrando inicialmente o composto e monitorando os resulta-dos e então dando doses controladas adicionais em intervalos adicionais.
Por exemplo, para administração oral na forma de um comprimido ou cápsula (porexemplo, uma cápsula de gelatina), o componente do medicamento ativo pode ser combiandocom um veículo inerte oral, atóxico farmaceuticamente aceitável, tais como etanol, glicerol,água e similares. Além disso, quando desejado ou necessário agentes aglutinantes, lubrifican-tes, desintegrantes e corantes adequados também podem ser incorporados na mistura. Aglu-tinantes adequados incluem amido, silicato de magnésio e alumínio, pasta de amido, gelatina,metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares nanturais, taiscomo glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como a-cácia, tragacanto ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras e similares. Lubrificantes usa-dos nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato demagnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido esteárico,seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietilenoglicol e similares. Desintegrantes incluem, semlimitation, amido, metil celulose, ágar, bentonita, goma xantana, amidos, ágar, ácido algínicoou seu sal de sódio ou misturas efervescentes e similares. Diluentes, incluem, por exemplo,lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina.
Os compostos da invenção também podem ser administrados em formas de dosa-gem oral tais como comprimidos ou cápsulas de liberação cronometrada e sustentada, pílulas,pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões.
Composições injetáveis são preferivelmente soluções ou suspensões isotônicas a-quosas e supositórios são vantajosamente preparados de emulsões ou suspensões gorduro-20 sas. As composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como agentes con-servantes, estabilizantes, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais pararegular a pressão osmótica e/ou tampões. Além do mais, elas também podem conter outrassubstâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com mé-todos de mistura convencionais, de granulação ou de revestimento, respectivamente, e tipi-25 camente contêm cerca de 0,1 a 75 %, preferivelmente cerca de 1 a 50 % do ingrediente ativo.
Composições líquidas, particularmente injetáveis podem, por exemplo, ser prepara-das por dissolução, dispersão, etc. O composto ativo é dissolvido ou misturado com um sol-vente farmaceuticamente puro, tais como, por exemplo, água, salina, dextrose aquosa, glice-rol, etanol, e similares, para desta forma formar a solução ou suspensão injetável. Adicional-30 mente, formas sólidas adequadas para dissolver no líquido antes da injeção podem ser formu-ladas.
Os compostos da presente invenção podem ser administrados na forma intravenosa(tanto bolo quanto infusão), intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular, todas usando for-mas bem conhecidas por um versado na tecnologia farmacêutica. Injetáveis podem ser prepa-35 rados em formas convencionais, tanto como soluções quanto suspensões líquidas.
A administração injetável parenteral é geralmente usada para injeção e infusão sub-cutânea, intramuscular ou intravenosa. Adicionalmente, uma abordagem para administraçãoparenteral emprega a implantação de um sistema de liberação lenta ou prolongada, que ga-rante que nível de dosagem constante seja mantido, de acordo com a patente U.S. No.3.710.795, incorporada aqui pela referência.
Além disso, compostos preferidos para a presente invenção podem ser administradosna forma intranasal por meio de uso tópico de veículos intranasais adequados, ou por meio devias transdérmicas, usando as formas de adesivos de pele transdérmicos bem conhecidos porum versado na tecnologia. Para ser administrado na forma de um sistema de distribuiçãodérmico, a administração da dosagem será, certamente, contínua em vez de intermitente emtodo o regime de dosagem.
Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, unguentos, loções, jatos de ae-rossóis e géis, em que a concentração de ingrediente ativo pode tipicamente variar de 0,01 %a 15 % p/p ou p/v.
Para composições sólidas, excipientes incluem graus farmacêuticos de manitol, Iac-tose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, car-bonato de magnésio e similares podem ser usados. O composto ativo definido anteriormente,também pode ser formulado na forma de supositórios usando, por exemplo, polialquileno gli-cóis, por exemplo, propileno glicol, como o veículo. Em algumas modalidades, supositóriossão vantajosamente preparados de emulsões ou suspensões gordurosas.
Oa compostos da presente invenção também podem ser administrados na forma de sistemas de distribuição de lipossoma, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículaslamelares grandes e vesículas multilamelares. Lipossomas podem ser formados de uma vari-edade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumasmodalidades, uma película de componentes de lipídeo é hidratada com uma solução aquosado medicamento para uma forma de camada de lipídeo que encapsula o medicamento, da for-25 ma descrita na patente U.S. No. 5.262.564. Por exemplo, a molécula de aptâmero da formaaqui descrita pode ser fornecida como um complexo com um composto lipofílico ou não imu-nogênico, composto de alto peso molecular construído usando métodos conhecidos na tecno-logia. Um exemplo de complexos associados a ácido nucléico é fornecido na patente U.S. No.6.011.020.
Os compostos da presente invenção também podem ser acoplados com polímerossolúveis como veículos de medicamento alvejados. Tais polímeros podem incluir polivinilpirro-lidona, copolímero de pirano, poliidroxipropil-metacrilamida-fenol, poliidroxietilaspananidefenolou polietilenooxidepolilisina substituído por resíduos depalmitoíla. Além disso, os compostosda presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis para35 obter liberação controlada de um medicamento, por exemplo, ácido polilático, poliepsilon ca-proiactona, ácido poliidróxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidiidropiranos, policianoacri-Iamidas e copolímeros bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogéis.Em uma modalidade preferida, os compostos da presente invenção podem ser distri-buídos para o compartimento ocular por uma injeção intravitreal, pen -ocular, intracameral,subconjuntival ou trans-esclera na cavidade ocular ou diretamente no tecido(s) ocular ou peri-ocular. Os compostos da invenção podem ser injetados no espaço subtenon ou o espaço re-trobulbar. Os compostos da invenção também podem ser distribuídos para o compartimentoou tecido ocular por meio de fluído sistêmico e fluido para o olho e seus tecidos e então é ad-ministrado por injeção parenteral sistêmica, por vias intravenosa, intramuscular ou subcutâneade distribuição. Administração subconjuntival, intravitreal ou trans-escleral de composiçõesfarmacêuticas da invenção pode ser usada como um suplemento para a administração sistêmi-ca de um terapêutico para o tratamento de doenças oculares e/ou doenças sistêmicas commanifestações oculares. Em algumas modalidades dos métodos da invenção para estabilizar,tratar e/ou prevenir retinopatia diabética e/ou doença de Behcet, o aptâmero anticomplementonão é administrado sistemicamente, preferivelmente ele é administrado ocularmente.
Compostos da presente invenção também podem ser administrados ao comparti-mento ou tecido ocular na formulação gel ou polímero de liberação de depósito ou prolongadapor implante cirúrgico de um sistema de polímero de microtamanho biodegradável, por exem-plo, microdispositivo, micropartícula ou esponja, ou outros dispositivos transesclerais de libe-ração lenta, implantados durante o tratamento de uma doença oftálmica, ou por um dispositivode distribuição ocular, por exemplo, dispositivo de distribuição prolongada de lentes de contatode polímero. Compostos da invenção também podem ser administrados ao compartimento outecido ocular topicamente, por exemplo, na forma de colírio, na forma de uma lente de contatocarregada com o composto da invenção, ou por iontoforese usando corrente elétrica para gui-ar o medicamento da superfície para o posterior do olho.
Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada também pod econtermenores quantidades de substâncias auxiliares atóxicas, tais como agentes umectantes eemulsificantes, agentes de tamponamentode pH, e outras substâncias, tal como, por exemplo,acetato de sódio, e oleato de trietanolamina.
O regime de dosagem que utiliza os aptâmeros é selecionado de acordo com umavariedade de fatores, incluindo tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição médica do pacien-te; da severidade da condição a ser tratada; da via de administração; da função renal e hepá-tica do paciente; e do aptâmero particular ou sal deste empregado. Um médico ou veterinárioversado na tecnologia pode prontamente determinar e prescrever a quantidade efetiva do me-dicamento necessária para prevenir, conter ou interromper o progresso da condição.
Dosagens orais da composição de aptâmeros da presente invenção, quando usadas35 para os efeitos indicados, variarão entre cerca de 0,05 a 7500 mg/ddia oralmente. As compo-sições são preferivelmente fornecidas na forma de comprimidos classificados contendo 0,5,1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 e 1.000,0 mg de ingrediente ativo.Compostos da presente invenção podem ser administrados em uma dose diária única ou adose diária total pode ser administrada em doses divididas de duas, três ou quatro vezes aodia.
Dosagens infundidas, dosagens intranasais e dosagens transdérmicas da composi-5 ção de aptâmeros da presente invenção variarão entre 0,05 a 7.500 mg/dia. Dosagens subcu-tâneas, intravenosas e intraperineais da composição de aptâmeros da presente invenção vari-arão entre 0,05 a 3.800 mg/dia.
Dosagens oculares da composição de aptâmeros da presente invenção variarãoentre 0,001 a 10 mg/olho administrados ocularmente, por exemplo, por injeção intravitreal, de10 uma vez por semana até uma vez a cada três meses ou por dispositivo ou formulação deliberação prolongada.
Níveis plasmáticos efetivos dos compostos de aptâmero da presente invenção vari-am de 0,002 mg/mL a 50 mg/ml_. Níveis oculares efetivos dos compostos de aptâmero dainvenção podem variar de 20 nM a 250 μΜ.15 Efetividade do tratamento
Desordens neovasculares
Efetividade do tratamento de uma desordem neovascular, por exemplo AMD, parti-cularmente AMD tipo exudativa ou retinopatia diabética, é avaliada por qualquer métodoaceito de medir se a angiogênese é mais lenta ou diminuída. Isto inclui a observação direta20 e avaliação indireta, tais como avaliando sintomas subjetivos ou indicadores fisiológicos ob-jetivos. A eficácia do tratamento, por exemplo, pode ser avaliada com base na prevenção,estabilização e/ ou reverssão da neovascularização, microangiopatia, vazamento vascular ouedema vascular ou qualquer combinação destes. A eficácia do tratamento para avaliar asupressão de uma desordem neovascular ocular também pode ser definida em termos de25 estabilização ou melhora da acuidade visual.
Na determinação da efetividade de um agente anti-C5 sozinho ou em combinaçãocom um agente anti-VEGF e/ou agente anti-PDGF na estabilização, reduzindo um sintomae/ou prevenindo uma desordem neovascular ocular, pacientes também podem ser clinicamen-te avaliados por um oftalmologista vários dias depois da injeção e logo antes da próxima inje-30 ção. Acuidades visuais ETDRS, fotografia kodachrome e angiografia de fluoresceína tam-bém podem ser realizados mensalmente.
Na determinação da efetividade de um aptâmero anticomplemento sozinho ou emcombinação com um agente anti-VEGE e/ou agente anti-PDGF na estabilização, reduzindoum sintoma e/ou prevenindo uma desordem neovascular ocular, pacientes também podem35 ser clinicamente avaliados por um oftalmologista vários dias depois da injeção e logo antes dapróxima injeção. Acuidades visuais ETDRS, fotografia de fundo, tomografia de coerência óticae angiografia de fluoresceína também podem ser realizados mensalmente.Por exemplo, de maneira a estimar a efetividade de um agente anti-C5, particular-mente um aptâmero específico de C5 sozinho ou em combinação com um agente anti-VEGE e/ou um agente anti-PDGF, para tratar neovascularização ocular, estudos são condu-zidos envolvendo a administração de injeções intravitreais tanto únicas quanto múltiplas de5 um agente anti-C5, particularmente um aptâmero específico de C5 sozinho ou em combina-ção com um agente anti-VEGE e/ou um agente anti-PDGF em pacientes que sofrem de neo-vascularização subfoveal coroidal secundária à degeneração macular relacionada à idadede acordo com métodos padrão bem conhecidos na tecnologia oftalmológica. Pacientes comneovascularização subfoveal coroidal (CNV) secundária à degeneração macular relacionada10 à idade (AMD) podem receber uma única injeção intravitreal de um agente anti-C5, particu-larmente um aptâmero específico de C5 e/ou um aptâmero específico de VEGF e/ou umaptâmero específico de PDGF. A efetividade é monitorada, por exemplo, por avaliação of-talmológica e/ou angiografia de fluoresceína. Pacientes que apresentam a visão estável oumelhorada três meses depois do tratamento, por exemplo, que demonstram uma melhoria15 de 3-linhas ou mais na visão no quadro ETDRS1 são tomados como recebendo uma dosa-gem efetiva.
Outras desordens oculares
O tratamento de conjuntivite inflamatória, incluindo conjuntivite alérgica e papilar gi-gante, edema macular, uveíte, endoftalmite, esclerite, úlceras corneais, síndrome do olho20 seco, glaucoma, doença retinal isquêmica, retinopatia diabética, rejeição de transplante decórnea, complicações relacionadas a cirurgia intraocular, tais como implante de lente intrao-cular e inflamação associada à cirurgia de catarata, doença de Behcet, doença de Stargardt,vasculite do complexo imune, doença de Fuch, doença de Vogt Koyaniagi-Harada, fibrosesub-retinal, queratite, inflamação cítreo-retinal, infestação/migração parasítica ocular, retinite25 pigmentosa, retinite de citomegalovírus e inflamação coroidal avaliados pelos métodos acei-tos no campo. Na determinação da efetividade de um aptâmero anticomplemento sozinhoou em combinação com um outro agente na estabilização, reduzindo um sintoma e/ou pre-venindo uma desordem ocular, pacientes também podem ser clinicamente avaliados por umoftalmologista. A avaliação clínica pode ocorrer vários dias depois da injeção e logo antes da30 próxima injeção. A avaliação clínica pode incluir observação direta e avaliação indireta, taiscomo avaliação de sintomas subjetivos ou indicadores fisiológicos objetivos. A eficácia dotratamento, por exemplo, pode ser avaliada com base na prevenção, estabilização e/ oureversão do vazamento vascular ou edema vascular ou qualquer combinação destes. Ondea eficácia do tratamento, no caso de glaucoma, pode ser avaliada na estabilização da saúde35 na camada da fibra do nervo da retina ou nervo ótico que pode ser monitorado usando foto-grafia de fundo ou tomografia de coerência ótica.
Todos os pedidos de patente e documentos de patente aqui citados estão incorpo-rados aqui pela referência como se cada pedido de patente ou documento fosse especifica eindividualmente indicado para estar incorporado aqui pela referência. A citação de pedidosde patente e documentos de patente não se destina a admitir que qualquer tecnologia ante-rior pertinente, nem constitui nenhuma admissão como para os conteúdos ou data dos mes-5 mos. A invenção tendo agora sido descrita a título de descrição escrita, os versados na tec-nologia perceberão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades eque a descrição anterior e exemplos a seguir são para propósitos de ilustração e não delimitação das reivindicações que se seguem.
EXEMPLO 1
10 Atividade do aptâmero anti-C5 nos caminhos do complemento clássico ou alternati-
vo
Exemplo IA: Ensaio de hemólise
O teste CH50 mede a capacidade do sistema complemento em uma amostra deteste de soro de Iisar 50 % das células em uma suspensão padronizada de eritrócitos de15 ovelha revestidos com anticorpo. Uma solução de 0,2 % de soro humano foi misturada comeritrócitos de ovelha revestidos com anticorpo (Diarnedix EZ Complement CH50 Kit, Diame-dix Corp., Miami, FL) na presença ou ausência de vários aptâmeros anti-C5. O ensaio foirealizado de acordo com o protocolo do estojo em salina tamponada veronal contendo cál-cio, magnésio e 1 % de gelatina (tampão de complemento GVB++) e incubado por 30 minu-20 tos a 37 °C. Depois da incubação, as amostras foram centrifugadas para precipitar eritrócitosintactos. A densidade ótica a 412 nm (OD4i2) do sobrenadante foi lida para quantificar a libe-ração de hemoglobina solúvel, que é proporcional à extensão da hemólise (Green et ai,(1995) Chem. Biol. 2:683-95). Para verificar que aptâmeros bloquearam a ativação de C5,alguns sobrenadantes de hemólise foram analisados para a presença de C5a e CSb-9 por25 ELISA (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego,CA) seguindo o protocolo do estojo ELISA.
A adição de um aptâmero anti-C5 não PEGuiIado (ARC186) (SEQ ID NO: 4) à misturade reação inibiu hemólise de uma maneira dependente da dose, da forma apresentada no gráficoda figura 7A, com um IC50 de 0,5 ± 0,1 nM, (ver figura 73), um valor que é consistente com o KD30 determinado porfiltração com nitrocelulose. Em concentrações muito altas de aptâmero (>10 nM),a extesão da hemólise foi essencialmente indistinguível do fundo (nenhum soro adicionado), indi-cando que ARC186 (SEQ ID NO: 4) foi capaz de completamente bloquear a atividade do com-plemento. Conjugação do aptâmero ARC186 (SEQ ID NO: 4) com greupos PEG 20 kDa(ARC657; SEQ ID NO: 61), 30 kDa (ARC658; SEQ ID NO: 62), ramificado 40 kDa (1,3-bis(mPEG-35 [20 kDajJ-propil^-^-butamida) (ARC187; SEQ ID NO: 5), ramificado 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20kDa])-propil-1 -carbamoíla) (ARC1905; SEQ ID NO: 67), linear 40 kDa (ARC1537; SEQ ID NO:65), e linear 2x20 kDa (ARC1730; SEQ ID NO: 66) não teve nenhum efeito na atividade inibitóriao aptâmero no ensaio de hemólise CH50 (Figura 7A-Figura 7D).
In em um estudo adicional, a atividade inibitória do aptâmero PEGuiIado anti-C5ARC1905 (ramificado 40 kDa (2,3-bis(mPEG-(20 kDal)-propíl-1-carbamoíla); SEQ ID NO: 67) foicomparada ao seu precursor não PEGuilado, ARC672 (SEQ ID NO: 63) que contém uma 5-5 amina terminal, no ensaio de hemólise CH50 descrito anteriormente. Uma solução de soro huma-no (Innovative Research, Southfield, Ml) foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos comanticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, FL) na presença ou au-sência de várias concentrações de ARC1905 e ARC627, respectivamente, de maneira tal que aconcentração final do soro em cada ensaio fosse 0,1 %, e o ensaio foi realizado de acordo com o10 protocolo de recomendação do fabricante. As reações de hemólise foram incubadas por 1 hora a 30C com agitação para garantir que as células permanecessem em suspensão. No final da incuba-ção, células intactas foram precipitadas por centrifugação (2.000 rpm, 2 min., temperatura ambien-te), 200 μΙ_ de sobrenadante foram transferidos para uma placa de poliestireno de fundo reto(VWR, cat#62409-003). A densidade ótica a 415 nm (OD415) do sobrenadante foi lida para quan-15 tificar a liberação de hemoglobina solúvel. A % de inibição em cada concentração de aptâmeromedida foi calculada usando a equação % de inibição = 100 -100 X (Aam0Stra - Asem soro) / (Asemaptâmero - Asem soro), onde Aam0Stra é a absorbância da amostra em concentrações variadas de aptâ-mero, Asem soro é a absorbância em virtude da hemólise de fundo na ausência de soro (100 % decontrole de inibição) e Asem aptâmero é a absorbância em virtude da atividade do complemento basal20 na ausência de aptâmero (0 % de controle de inibição). Valores IC50 foram determinados a partirde um gráfico de % de inibição em função de [inibidor] usando a equação % de inib = ( % de i-nib)máxirT,a x pnibidor]" / (IC50n + [inibidor]") + fundo. Valores de IC90 e IC99 foram calculados a partirdos valores IC50 usando as equações IC90= IC50 χ [90/(100-90]1/n e IC90 = IC50X [99/(100-99]1/n. Os valores IC50 para ARC1905 e ARC627 neste estudo paralelo foram 0,648 ± 0,0521 e25 0,913 ± 0,0679 respectivamente (ver também figura 58) confirmando adicionalmente que a PEGui-lação teve pouco, se presente, efeito na função do aptâmero.
Análises de ELISA de sobrenadantes de hemólise indicaram que esta inibição funcionalcorrelacionou com o bloqueio da liberação de C5a. Assim, os dados de hemólise mostram queARC186 (SEQ ID NO: 4), e seus conjugados PEGuilados, são inibidores do complemento altamen-30 te potentes que funcionam bloqueando a ativação de C5catalizada por convertase.
Ensaios de hemólise com material não PEGuilados indicaram que o aptâmero anti-C5não reage cruzado com C5 de inúmeras espécies de primatas, incluindo rato, porco da índia, ca-chorro e porco. Entretanto, atividade inibitória significativa foi observada em seleções de soro deprimata, incluindo soro de macaco cinomólogo, macaco rhesus e chimpanzé. A eficácia in vitro35 do aptâmero anti-C5 foi adicionalmente investigada no soro de cinomólogo usando ARC658 (SEQID NO: 62), o análogo de PEG de 30 kDa de C186 (SEQ ID NO: 4). Em uma comparação lado-a-Iado (n = 3), ARC658 inibiu atividade do complemento humano com um IC50 de 0,21 ± 0,0 nM eatividade do complemento cinomólogo com um IC50 de 1,7 ± 0,4 nM (Figura 8). Assim ARC658(SEQ ID NO: 62) é 8 ± 3 vezes menos potente no soro de cinomólogo comparado ao humano poresta medida.
Em um estudo relacionado, os efeitos do aptâmero PEGuiIado anti-C5ramificado 40 kDa5 (2,3 bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoíla), ARC1905 (SEQ ID NO: 67) na ativação do caminhodo complemento clássico da forma ensaiada por hemólise de eritrócito de ovelha foram investiga-dos na presença de soro humano (Innovative Research, Southfield1 Mi), macaco cinomólogo (Bio-reclamation, Hicksville, NY), ou rato (Bioreclamation, Hlcksville, NY). Estes ensaios foram realiza-dos em soro altamente diluído, 0,1 % para humano e macaco cinomólogo e 0,3 % para rato, nas10 mesmas condições que as usadas para comparar os efeitos inibitórios de ARC 1905 contraARC672 na hemólise de eritrócito de ovelha da forma descrita diretamente antes. Em uma compa-ração lado a lado, a inibição completa (90-99 %) da atividade do complemento in vitro foi alcança-da com ARC1905 tanto em soros humanos quanto de macacos cinomólogos onde ARC1905 a -presentou pouca a nenhuma atividade inibitória específica na amostra de complemento de rato15 (Figura 59A). Similar ao ARC658, ARC1905 foi 10 vezes menos potente contra atividade do com-plemento de cinomólogo nas condições do ensaio, da forma refletida nos valores IC90 e IC99 repor-tados na figura 59B.
Ensaios de ligação de filtro de nitrocelulose. Aptâmeros individuais foram marcados com32P na extremidade 5' incubando com Y-32P-ATP e polinucleotídeo quinase (New England. Biolabs,20 Beverly, MA). Aptâmero radiomarcado foi purificado fora do ATP livre por filtração em gel depoisde eletroforese em gel de poliacrilamida. Para medir a afinidade do aptâmero anti-C5, aptâmeroradiomarcado (< 10 pM) foi incubado com concentrações crescentes (0,05 -100 nM) de proteínaC5 purificada (Quidel, San Diego, CA) em salina tamponada de fosfato contendo 1 mM de MgCI2a temperatura ambiente (23 °C) e 37 °C, por 15 minutos e intervalos de tempo de 4 horas. As rea-25 ções de ligação foram analizadas por filtração com nitrocelulose usando um tubo de distribuiçãode filtração a vácuo de 96 poços Manifold dot-blot (Schleicher & Schnell, Keene, NH). Um meio defiltração de três camadas foi usado, consistindo (do topo para a base) em Protran nitrocelulose(Schleicher & Schuell), náilon Hybond-P (Amersham Biosciences, Piscataway, N ]) e papel de gelblot GB002 (Schleicher & Schuell). A camada de nitrocelulose, que seletivamente liga proteína30 sobre ácido nucléico, preferencialmente reteve o aptâmero anti-C5 no complexo com uma proteí-na ligante, enquanto que aptâmero anti-C5 não complexado passou através da nitrocelulose eaderido ao náilon. O papel de gel blot foi incluído somplesmente como um meio de suporte paraos outros filtros. Depois da filtração, as camadas do filtro foram separadas, secas e expostas natela de fósforo (Amersham Biosciences) e quantificadas usando um sistema de imageamento35 Storm 860 Phosphorimager® blot (Amersham Biosciences).
Da forma apresentada na figura 9 e figura 10, concentrações crescentes de C5 melho-ram a proporção de ARC186 capturado na membrana de nitrocelulose. A dependência doARC186 ligado nas concentrações crescentes de C5 é bem descrita por um modelo de ligação deúnico sítio (C5 + ARC186<->C5.ARC186; % ligado = Cmax/( 1 + KD / [C5]); Cmax é a % ligada máxi-ma na saturação [C5); KD é a constante de dissociação). Curvas de ligação de ARC186 em duastemperaturas depois tanto de 15 minutos quanto de 4 horas de incubação são apresentadas nas5 figuras 9 e 10, respectivamente. Depois de 15 minutos de incubação, as curvas de ligação deARC 186 a 23 e 37 0C são essencialmente indistinguíveis em erro, ajustando com valores KD de0,5 - 0,6 nM (Figura 9). Diferenças entre as curvas de ligação a 23 e 37 0C se tomam mais pronun-ciadas quando o tempo de incubação é extendido. Depois de 4 horas de incubação (Figura 10), oKD observado a 23 0C diminui para 0,08 ± 0,01 nM, enquanto que o KD observado a 3710 0Cpermanece inalterado (0,6 ± 0,1 nM).
Para demonstrar a base para a necessidade de incubação longa em temperatura ambi-ente, a afinidade nesta temperatura foi adicionalmente explorada usando métodos cinéticos. Ataxa da reação reversa que descreve a dissociação de C5*ARC186 é ν = k-f[C5»ARC186], ondeν é a taxa (unidades de M min"1) e ki é a constante da taxa de dissociação de primeira ordem15 (unidades de M"1 min"1). A taxa da reação que descreve a formação do complexo C5*ARC186 éVfor = k1(C5]> > [ARC 186], onde vfor é a taxa (unidades de M1 min"1) e ki é a constante da taxa dedissociação de segunda ordem (unidades de M-1 min"1). Os dados foram analizados usando o su-posição de pseudo-primeira ordem, onde a concentração de um reagente (C5 enste caso) é man-tida em vasto excesso sobre a outra ([C5] » [ARC186], e assim permanece essencialmente inalte-20 rada durante o curso da reação. Nestas condições, a reação é descrita pela equação da taxapara um processo de primeira ordem, Vfor = /(,' [ARC 186], onde Zci' = /Ci[C5].
Para analisar a dissociação de C5-ARC186, ARC186 radiomarcado (-10 pM) foi pré-equilibrado com 5 nM de proteína C5 em salina tamponada de fosfato contendo 1 mM de MgCI2em temperatura ambiente (23 °C). A reação de dissociação foi iniciada pela adição de ARC18625 nào marcado (1 μΜ), que age como uma armadilha para C5 livre, e interrompida por filtração comparticionamento com nitrocelulose do ARC186 radiomarcado livre e ligado. Um curso de tempo dedissociação de ARC186 foi obtido variando a duração entre a iniciação da reação de dissociaçãoe filtração. O tempo de curso da dissociação, observado como uma diminuição na porcentagemde ARC186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose (igual à porcentagem ligada a C5), é30 bem descrito por um declínio exponencial único onde a % de ARC186 ligado = 100 χ e*"1 (ver Fi-gura 11). O valor da constante da taxa de dissociação, determinado por este método é 0,013 ±0,02 min"1, correspondendo a uma meia-vida (11/2=Ιη2/^) de 53 ± 8.
Para analisar a reação de associação, a constante da taxa de equilíbrio ( k ) para a for-mação de C5·ARC186 foi medida na presença de concentrações variadas de proteína C5 (1 - 535 nM). A formação do complexo foi iniciada misturando junto proteína C5 e ARC186 radiomarcadoem PBS contendo 1 mM de MgCI2 a temperatura ambiente (23 0C), e interrompida por filtraçãocom particionamento em nitrocelulose. Da forma descrita para as reações de dissociação, umcurso de tempo de formação de complexo foi obtido variando a duração entre a iniciação da rea-ção e filtração. O curso de tempo do equilíbrio, observado como um aumento na porcentagem deARC186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose, é bem descrito por um declínio expo-nencial único onde a % de ARC186 ligado =100 X (1 - e"k1t). Os cursos de tempode equilíbrio5 para 1, 2 e 4 nM de C5 são apresentados na figura 12. Conforme esperado, o valor de keq au-menta linearmente com [C5](keq(1 nM) = 0,19 ± 0,02 min';(2 nM) = 0,39±0,03 min"1;keq (3 nM) = 0,59 ± 0,05 min"1; keq (4 nM) = 0,77 ± 0,06 min"1; keq (5 nM) = 0,88 ± 0,06 min-1).Nas condições do experimento, a relação entre keq, ^ e Ic1 é keq = k^Cõ] + k1. Assim, umaestimatova de k1 é derivada da inclinação de um gráfico de keq em função de [C5] (ver inserção10 da figura 12), neste caso 0,18 ±0,01 nM^min"1.
Estes dados indicamque, em condições de baixa concentração de C5 (por exemplo, 0,1nM), uma incubação prolongada é necessária de maneira que a mistura de C5 e ARC186 radio-marcado alcance o equilíbrio. Nestas condições, keq = (0,18 ± 0,01 nM"1min"1) (0,1 nM) + 0,013min"10,03 mini1, correspondendo a uma meia-vida de 22 min. Assim, quase 2 horas de incubação15 em temperatura ambiente (~ 5 meias-vidas) são necessárias para o equilíbrio completo (> 95 %).Um curto tempo de incubação (por exemplo, 15 min) significativamente sobreestimarão a realafinidade do complexo, da forma apresentada anteriormente pela diferença nas afinidades obser-vadas por 15 min (KD = 0,5 nM) em função de 4 horas (KD = 0,08 nM) de incubação. Uma esti-mativa alternativa de kD em temperatura ambiente pode ser calculada a partir dos dados cinéticos20 de acordo com a relação KD =k"1/k1. Neste caso, o KD calculado é 0,07 ± 0,01 nM, que écompletamente consistente com o KD determinado anteriormente por métodos termodinâmicos.
A especificidade de ARC186 (SEQ ID NO: 4) para C5 também foi estimada nos ensaiosde filtração com nitrocelulose por comparação com componente dos complementos tanto a mon-tante quanto a jusante de C5 na cascata do complemento. Proteínas e complexos de proteína25 humanas purificadas foram adquiridas da Complement Technologies (Tyler, Tx) incluindo: C1q(cat. # A099.18; 2,3 μΜ), C3 (cat. # Al 13c.8; 27 μΜ), C5 (cat. # A120.14; 5,4 pM), C5a des Arg(cat. # A145.6; 60 μΜ), sCSb-9 (cat. # A127.6; 1 pM), fator B (cat. # A135.12; 11 pM) e fator H(cat. # A137.13P; 6,8 μΜ). Reações de ligação foram estabelecidas realizando diluições em sériede proteína em PBS mais 1 nM de MgCI2i 0,02 mg/nL de BSA e 0,002 ng/mL de RNAt, incubando30 por 1-4 horas a 25 0C ou 37 °C, e então aplicadas à filtração com aparelho de nitrocelulose daforma descrita anteriormente. Constantes de dissociação KD foram determinadas a partir de gráfi-cos de semi-log da % de ligação de nitrocelulose em função de [C5] por um ajuste dos dados paraa equação: % de ligação de nitrocelulose = amplitude χ [C5] /( KD + [C5]).
Os resultados apresentados na figura 13 mostram que o aptâmero essencialmente35 não reconhece C5a (KD » 3 μΜ), embora ele realmente apresente fraca afinidade para C5b-9solúvel (KD > 0,2 μΜ), presumivelmente em virtude das interações com o componente de C5b.Outros componentes do complemento apresentam moderada a fraca afinidade para o aptâmero. C3essencialmente não ativado não se liga ao aptâmero; entretanto, o fator H (KD -100 nM) e, comuma intensidade muito menor, C1q (KD > 0,3 μΜ) realmente se liga. Tomados juntos, os dadosindicam que ARC186 (SEQ ID NO: 4) se liga com alta afinidade ao C5 humano, principalmente pormeio do reconhecimento do domínio C5b. Assim, AAC1 S6 e seus derivados PEGuilados, porexemplo, ARC1905 não devem interferir com a geração de C3b, que é importante para a opsoni-zaçãp bacteriana, ou com controle inato de ativação de C' por fatores regulatórios.
A conjugação de aptâmeros com frações de PEG de alto peso molecular introduz a possi-bilidade de empedimento estérico levando a menor afinidade. Aptâmeros modificados por PEGnão são prontamente avaliados para ligação direta por ensaios de filtração com nitrocelulose emvirtude da tendência destes aptâmeros aderirem à nitrocelulose mesmo na ausência de proteínaalvo. Entretanto, as afinidades relativas destes aptâmeros podem ser estimadas a partir de suacapacidade comparativa de competir com aptâmero radimarcado, não PEGuiIado (< 10 pM) paraligação ao alvo, da forma medida por filtração com nitrocelulose conhecido como um ensaio deligação de competição, corre a 37 °C. A medida em que a concentração de competidor frio (isto é,não marcado) aumenta, a porcentagem de aptâmero radiomarcado ligado à proteína alvo diminui.Da forma apresentada na figura 14, concentrações crescentes de ARCI86 frio (SEQ ID NO: 4) ouaptâmero PEGuiIado (ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62), e ARC187 (SEQ IDNO: 5) (0,05 - 1.000 nM) prontamente compete com ARC186 radiomarcado (SEQ ID NO: 4) pelaligação na presença de 2 nM de proteína C5. Adicionalmente, as curvas de titulação para todos osquatror aptâmeros quase se sobrepõe, indicando que PEG-conjugação no caso de ARC657,ARC658 e ARC187 tem pouco ou nenhum efeito na afinidade do aptâmero para C5.
Em um estudo similar, o efeito de conjugação de PEG na ligação ao C5 foi testado com-parando ARC672 (ARC186 com uma amina 5'-terminal; SEQ ID NO: 63) com ARC1905 (ARC627conjugado com um (2,3-bis(mPEG-(20 kDa))-propil-1-carbamoíla) PEG) ramificado 40 kDa usan-25 do o ensaio de ligação de competição. Estoques de 10 μΜ de cada aptâmero foram preparadosem PBS mais 1 mM de MgCI2,0,01 mg/mL de BSA, 0,002 mg/ml_ de RNAt, e diluídos em série paragerar uma série de amostra de 10X que cobre uma faixa de concentração >100-vezes de aptâme-ro. 12 /yL de alíquotas de cada amostra foram então adicionados em uma placa de 96 poços a 96μ\_ de ARC186 radiomarcado com 32P para gerar uma solução 1,1X de competidor marcado e frio.30 90 μ\_ de solução marca/competidor foram então adicionados a 10 //L de 10X proteína C5 parainiciar as reações. A concentração final de ARC186 radiomarcado em cada reação foi mantidaconstante. Reações de ligação foram equilibradas por 15 - 30 min a 37 0C, e então filtradas em e-quipamento de filtro de nitrocelulose descrito anteriormente. Para os propósitos de análise de da-dos, aptâmeros competidores frios foram tratados como inibidores competitivos da interação35 ARC186/C5; % de inibição foi calculada normalizanso os dados para controlar reações que nãotêm competidor (0 % de controle de inibição). Os valores de IC50 foram determinados a partir degráfidos semi-log de % de inibição em função de [ARC672] ou [ARC1905] por um ajuste dos da-dos para a equação: % de inibição = amplitude X [competidor]" /(IC50" + [competidor]").
Da forma apresentada na figura 60, a adição de um PEG ramificado 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20 lcDa])-propil-1-carbamoíla) teve pouco ou nenhum efeito na afinidade do aptâmeromedida por ligação competitiva. Valores KD de 0,46+/- 0,149 nM e 0,31 +/- 0,130 nM foram apro-5 ximados para ARC672 e ARC 1905, respectivamente pela interceção γ do ajuste de linha paraIC50 em função dos dados C5 η competitive binding a figura 60. Ambos os valores são próximos aKD determinado para ARC186 a 37 0C.
A dependência da temperatura da interação entre ARC1905 e C5 também foi estimadapor ensaio de competição. ARC 1905 foi diluído em série para gerar séries de amostra de 10X da10 forma descrita anteriormente. Reações de ligação foram equilibradas por 1- 4 horas a 25 0Cou 37 °C, e então filtradas no equipamento de filtro de nitrocelulose. A porcentagem de inibição foicalculada normalizando os dados para controlar reações que não têm competidor (0 % de controlede inibição) ou não têm proteína C5 (100 % de controle de inibição). Os valores IC50 foram de-terminados a partir de gráficos semi-log de % de inibição em função de [ARC672] ou [ARC1905]15 por um ajuste dos dados para a equação: % de inibição = amplitude X [competidor]" /(IC50n +[competidor]"). Da forma apresentada na figura 61, ARC1905 se liga a C5 com alta afinidade tantoa 25 0C quanto a 37 °C. Valores de KD de 0,15 ± 0,048 nM e 0,69 ± 0,148 nM foram obtidos a25 0C e 37 °C, respectivamente, da interceção γ do IC50 em função dos dados de C5. Ambos osvalores são consistentes com os valores de KD determinados para a interação ARC186/C5 des-20 crita anteriormente.
Exemplo 1B: Ensaio de tempo total.
O efeito do aptâmero anti-C5 no caminho alternativo do sistema complemento foi anali-sado usando o seguinte ensaio de tempo total. Na ausência de um anticoagulante, sangue foiretirado de voluntários humanos normais. Alíquotas de sangue (contendo nenhum anti-25 coagulante) foram incubadas com concentrações crescentes de ARC186 (SEQ ID NO: 4) por 5horas a temperatura ambiente ou 37 0C. Amostras foram centrifugadas para isolar soro e a pre-sença de C5b no soro foi detectada por ELISA de sC5b-9 (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego,CA). Da forma apresentada na figura 15, a atividade anti-complemento, refletida na produção deC5b-9, entre amostras incubadas a diferentes temperaturas divergiu em 3 μΜ. Os dados de30 temperatura ambiente indicaram que a concentração de aptâmero necessária para a inibiçãoquantitatia é na faixa de 3-6 μΜ, onde a concentração reportada de C5 é aproximadamente 400nM. Os resultados sugerem que mais que 10-vezes de excesso molar de aptâmero anti-C5 (ClA R 8 6 ; SEQII) NO: 4) pode ser necessário para completa inibição da atividade de C5.
Exemplo 1C: Ativação do complemento por zvmosan35 Zymosan é um componente polissacarídeo da parede da célula de levedura e um po-
tente ativador da cascata alternativa do complemento. A adição de zyxnosan a amostras ex vivode sangue, plasma ou sosro resulta no acúmulo da ativação dos produtos do complemento, inclu-indo C5a e a versão solúvel de C5b-9 (sC5b-9). Amostras de soro humano não diluído (Centerfor Blood Research, Boston, MA), sangue total humano com citrato (Center for Sangue Rese-arch, Boston, MA) ou soro de cinomólogo (Charles River Labs, Wilmington, MA) foram espe-tados com concentrações crescentes de ARC658 (SEQ ID NO: 62), o PEG 30KDa análogo de5 ARC186 (SEQ ID NO: 4). Para ativar o complemento, zymosau (Sigma, St. Louis, MO) em umasuspensão 10X foi adicionado às amostras para uma concentração final de 5 mg/ml_. Depois de15 minutos de incubação a 37 0C, partículas de zymosan foram removidas por centrifugaçãoe a extensão da ativação do complemento foi determinada por ELISA de C5a e/ou sC5b-9 (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA).10 Na ausência de aptâmero, tratamento com zymosan ativa -50 % de C5 do soro ou
sangue total, comparado a -1 % de ativação na amostra não tratada. A adição de aptâmero anti-C5 até 50 nM (-10 % de concentração de C5 no sangue) teve pouco efeito na formação desC5b-9. Entretanto, titulação adicional de C5 com concentrações crescentes de ARC658 (SEQID NO: 62) inibiu a ativação de C5 de uma maneira dependente da dose, conforme visto na figura15 16. No soro ou sangue total humano, a inibição quantitativa (-99 %) foi observada a 0,8 - 1 μΜde ARC658 (SEQ ID NO: 62), correspondendo a -2 equivalentes molares de aptâmero para C5.Maiores concentrações de aptâmero foram necessárias para atingir inibição comparável no sorode cinomólogo. Neste caso, 99 % de inibição foi alcançada somente na presença de 10 μΜ deaptâmero, ou -20 equivalentes molares de aptâmero para C5.20 Em um estudo similar, os efeitos inibitórios de C1905 (o ramificado a versão peguilada de
ARC186 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoíla)) foram testados em amostras dehumano e macacos cinomólogo usando o zymosan para ativar o complemento por meio do cami-nho alternativo, como se segue. Zymosan A de Sacçharomyces cerevisiae foi fornecido pela Sig-ma-AIdrich, Inc. (cat. no. 24250-I G, St. Louis, MO). O zymosan A foi fornecido na forma de um pó25 e foi re-suspenso em PBS de Dulbecco (Gibco, Carlsbad, CA, cat. no. 14190-144) para renderuma suspensão de 50 mg/mL. Soro humano normal congelado, agrupado (cat. no. IPLA-SER) foiadquirido da Innovative Research (Southfield, W. Frozen, soro de macaco cinomólogo agrupado(cat. no. CYNSRM) foi adquirido da Bioreclamation (Hicksville, NY). Frascos de 5 -10 mL de sorofornecidos pelo fornecedor foram descongelados a 37 0C1 alicotados (-1 mL) e armazenados a -30 20 0C. Alíquotas foram descongeladas conforme necessário logo antes do uso incubando a 37 0Ce armazenadas em gelo durante os experimentos. A concentração final de soro em cada ensaiofoi -100 %. Um estoque de 20 μΜ de ARC1905 foi preparado em 0,9 % de salina e diluído emsérie para gerar uma série de amostras 10X que cobre uma faixa de concentração de 90 vezes deaptâmero. Uma amostra sem aptâmero (salina somente) também foi incluída como um controle35 negativo (0 % de inibição).
90 μί de soro foram pipetados em poços de uma placa de PCR de 96 poços (VWR, cat.no. 1442-9596). 10 μί de amostra de aptâmero foram diluídas diretamente no soro a temperaturaambiente e misturados. 8 μΥ. de 50 mg/mL de zymosan foram pipetados em poços de uma placade PCR de 96 poços separada. Ambas as placas foram simultaneamente pré-incubadas a 37 0Cpor 15 minutos. Imediatamente depois da pré-incubação, 80 μΙ_ da mistura soro/aptâmero foramadicionados a 8 pL de zymosan e misturados, rendendo 8 mg/mL de zymosan de concentração5 final. A placa de reação foi selada e incubada por 15 minutos a 37 °C. No final da incubação, areação foi temperada pipetando 8 pL de 0,5M de EDTA nos poços e misturando. O zymosan foiprecipitado por centrifugação (3.700 rpm, temperatura ambiente) e -80 μΙ_ de sobrenadante finali-zado foi transferido para uma placa de PCR de 96 poços nova e selado. Sobrenadantes foramcongelados frescos em nitrogênio líquido e armazenados a -20 °C. Para controlar a ativação de10 fundo independente de zymosan, amostras de soro foram preparadas e tratadas exatamente daforma descrita anteriormente, exceto que 8 μΙ_ de salina foram adicionados em vez de zymosan.
A extensão da ativação de C5 foi determinada a partir dos níveis relativos de C5agerados em cada amostra ativada por zymosan, medida por ELISA de C5a (A.LPCO Diag-nosis, Windham, NH1 cat. no. EIA-3327) seguindo oo protocolo do estojo do ELISA de C5a.15 O estojo de ELISA de C5a inclui reagentes específicos humanos e é formatado para análisede C5a de humano (hC5a) em amostras de plasma ou soro. Desta forma, foi necessáriocaracterizar a resposta do ELISA para C5a de macaco cinomólogo usando padrões de con-centração de cinomólogo. Para preparar um conjunto de padrões de uso, 0,5 mL de alíquo-tas de soro de humano e de macaco cinomólogo foi incubado com 5 mg/mL de zymosan por20 15 min a 37 °C, finalizado com 12,5 //L de 0,5 M de EDTA e centrifugado para remover o zy-mosan. A concentração de C5a na amostra de soro humano ativado por zymosan foi deter-minada aproximadamente 2 /yg/mL de hC5a por comparação a plasmas padrão de hC5afornecidos com o estojo. A concentração de C5a na amostra de macaco cinomólogo, ex-pressa em equivalentes de C5a de humano (hC5a eq), foi determinada para ser aproxima-25 damente 0,6 pg/mL de hC5a eq. Séries de padrões que cobrem uma faixa de 0,4 - 400ng/mL de hC5a ou 0,12 - 120 ng/mL de hC5a eq foram preparadas por diluição e, soro derato (que não interfere com o ELISA). Padrões foram pré-tratados com um reagente que pre-cipita proteína da forma direcionada no protocolo do estojo ELISA e aplicados sem diluiçãoadicional à placa de ELISA. A placa de ELISA fi lida em uma absorbância máxima de 45030 nm (A450) usando um leitor de placa de absorbância VersaMax UV/vis (Molecular Dynamics,Sunnyvale, CA). A A450Variou com a concentração de C5a de um inferior de 0,1 - 0.2 aa infe-rior C5a, em platô -3,5 em C5a superior. Para os propósitos de quantificar C5a em amostrasde ensaio, os limites superior e inferior da quantificação foram, respectivamente, 25 e 0,78ng/mL de hC5a para humano e 15 e 0,94 ng/mL de hC5a eq para macaco cinomólogo. A45035 em função de ng/mL de hC5a ou hC5a eq foi disposto em gráfico da forma apresentada nafigura 62, e uma curva padrão foi obtida de um ajuste de quatro parâmetros para os dadosusando a equação γ = ((A - D)/(1 + (x/C)8)) + D.Logo antes da análise de C5a, amostras de ensaio (incluindo os controles de salinasomente e nenhum zymosan) foram pré-tratadas com reagente que precipita proteína daforma direcionada no protocolo do estojo ELISA, então diluídas em série em 0,9 % de salina.Níveis de C5a em amostras de ensaio não diluídas (incluindo algumas dos controles sem5 zymosan) tipicamente excederam o limite superior de quantificação (ULQQ). Desta forma,diluições de 1/5, 1/50 e 1/250 foram testadas para acomodar a faixa de concentração da a-mostra de ensaio de C5a completa. Níveis de C5a foram quantificados por comparação coma curva padrão apropriada (humano ou macaco cinomólogo) e corrigidos para diluição. O %de inibição em cada concentração de aptâmero foi calculado usando a equação % de inib. =10 100 -100 X (C5aam0strsa — C5a sem zymosan )/(C5asa|jna somente — C5asem zymosan)· Valores IC50 foramdeterminados de um gráfico de % de inibição em função de [ARC 1905] usando a equação % de inib.= ( % de inib.)má>dmaX [ACR1905] n / (IC50 + (ARC1905]n)fundo. Valores de IC90 e IC99 foramcalculados de valores IC50 usando as equações IC50 = IC50 X [90/(100-90] 1/n e IC99 = IC50X [99/(100-99]1/n.
15 A extensão da ativação de C3 (a etapa no caminho do complemento comum logo a
montante do C5) foi determinada a partir de níveis relativos de C3a gerado em cada amostraativada por zymosin, medidos por ELISA de C3a (Becton Dickinson OptiBIA C3a ELISA kit,cat no. 550499, Frandklin Lakes, NJ) seguindo o protocolo do estojo ELISA de C3a.
Logo antes da análise de C3a, amostras (incluindo os controles de salina somente20 e sem zymosan) foram diluídas em serie em 0,9 % de salina. O ELISA de C3a é mais sensí-vel que o para C5a; desta forma, diluições de 1/500, 1/5.000 e 1/25.000 foram necessáriaspara acomodar a faixa de concentração na amostra de C3a completa. Padrões de estojo,derivados de soro humano, foram usados em vez dos padrões de uso preparados para aná-lise de C5a. Uma vez que níveis de C3a não variaram enormemente, os padrões específicos25 para humano forneceram uma indicação suficiente de seus níveis relativos.
Os dados gerados de ELISAs tanto de C5a quanto de C3 foram analisados usandoMicrosoft Excel, e os valores médios de % de inibição foram dispostos em gráfico usandoKaleidagraph (v. 3.51, Synergy Software). Valores de IC50, IC90 e IC99 foram determinadosusando o XLfit 4.1 plug-in para Excel. Os efeitos comparativos de ARCI905 na ativação do30 complemento humano e de macaco cinomólogo, medidos por esta abordagem, são resumi-dos na figura 63 e figura 64. Conforme pode ser visto a partir destas figuras, a completa ini-bição da ativação de C5 por meio do caminho alternativo é alcançada in vitro com ARC1905 tanto em soros humanos quanto de macacos cinomólogos. No soro humano, a con-centração de ARC 1905 necessária para 90 % de inibição da ativação de C5 em uma amostra35 não diluída foi 442 ± 23 nM, aproximadamente equivalente à concentração molar média deC5. Entretanto, ARC1905 foi 4 - 6-vezes menos potente contra atividade do complemento demacaco cinomólogo nas condições do ensaio, da forma refletida nos valores IC90 e IC9g.Os efeitos da ativação de C3 por ARC1905, medidos pelos níveis de C3a, estão re-sumidos na figura 65. A razão para especificamente alvejar a extremidade da cauda do ca-minho do complemento é bloquear as funções pró-inflamatórias de C5a e do complexo deataque à membrana (MAC) sem comprometer as funções de luta contra o patógeno dos fato-5 res a montante que acumulam na geração de C3a e C3b. Os dados na figura 65 demons-tram que ARC1905, até 2 μΜ, não inibe a geração de C3a e indica que a ativação a montantedo complemento não é negativamente impactada por ARC1905. O bloqueio essencialmente com-pleto do caminho de ativação de C5 alternativo foi a;cançado em amostras de soro tanto de hu-mano quanto de macaco cinomólogo usando ARC1905. ARC1905 foi aproximadamente uma10 ordem de magnitude menos potente na inibição da ativação de C5 de macaco cinomólogo queativação de C5 humano nas condições deste ensaio. Embora não seja desejável se prenderà teoria, o efeito inibitório de ARC1905 na ativação do complemento é específico para C5, umavez que a ativação de C3 não foi inibida.
Exemplo 1 D: Modelo de Iaco de tubo de ativação do complemento15 Para testar a capacidade do aptâmero anti-C5 bloquear a ativação do complemento in-
duzida pela exposição a materiais estranhos, da forma encontrada em um circuito de bypass car-diopulmonar, usou-se o modelo de laço de tubo descrito por Nilsson e colaboradores (Gong et al,(1996) Journal of Clinicai Immunology 16, 222-9; Nilsson et al, (1998) Blood 92, 1661-7). Tubomédico/cirúrgico Tygon 5-50 HL (1/4" de diâmetro interno) (United States Plastic Corp. ((Lima,20 OH), cat. # 00542) foi cortado em comprimentos de aproximadamente 300 mm (aproximadamente9 mL de volume) e preenchidos com 5 mL de sangue de doador humano contendo 0,4 unida-des/mL de heparina (CeIsus) e concentrações variadas de C658 (SEQ ID NO: 62) (0-5 μΜ).Cada comprimento de tubo Tygon foi fechado em um laço com seções curtas (-50 mm) de tuboIigante de silicone não cirúrgico (3/8" de diâmetro interno) (United States Plastic Corp. (formulação25 R-3603, cat. # 00271) da forma descrita em Gong et al. Laços do tubo foram girados por 1 hora aaproximadamente 30 rpm em um banho de água de 37 0C. Os conteúdos do laço foram entãovertidos nos tubos cônicos de polipropileno contendo EDTA (10 mM de concentração final) parafinalizar a ativação do complemento. Plasma fraco em plaqueta foi isolado por centrifugação eanalizado para C5a e C3a por ELISA (C3a ELISA Quidel, Sam Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Bi-30 osciences, San Diego, CA).
A ativação total do complemento na ausência de aptâmero foi pequena comparada aoensaio com zymosan. Tipicamente, níveis de C5a aumentaram em aproximadamente 6 ng/mLdepois de 1 hora de incubação, correspondendo à ativação de <1 % do C5 disponível. Entretanto,este aumento foi reprodutível e inibido por titulação com ARC658 (SEQ ID NO: 62). Da forma a -35 presentada na figura 17.300 - 400 nM de ARC658 (SEQ ID NO: 62) foram suficientes para atingir99 % de inibição da ativação de C5, um nível que é aproximadamente equivalente ou ligeiramentemenor que a concentração molar de C5 no sangue. Embora não seja desejável se prender à teo-ria, embora menos aptâmero seja necessário para obter 99 % de inibição de ativação de C5 nestemodelo que no modelo de zymosan, esta observação pode refletir as diferenças substanciais noestímulo de ativação do complemento usado nos dois ensaios. A geração de C3a também foi mo-nitorada como um controle para verificar que ARC658 (SEQ ID NO: 62) não bloqueou as etapas5 de ativação antes de C5 na cascata do complemento. Níveis de C3a aumentaram em aproxima-damente 4.000 ng/mL depois de 1 hora de incubação, correspondendo à ativação de cerca de 10% do C3 disponível. Ao contrário da geração de C5a, pouca inibição dependente da dose da ge-ração de C3a foi observada mediante titulação com ARC658 (SEQ ID NO: 62) demonstrando queARC658 (SEQ ID NO: 62) especificamente bloqueia a clivagem de C5.10 O estudo do modelo de laço de tubo foi repetido com o aptâmero anti-C5r ARC1905
(SEQ ID NO: 67). ARC1905 foi diluído em série em 0,9 % de salina para gerar uma série de a-mostra 20X que cobre uma faixa de concentrações de aptâmero de 100 vezes (10 - 1.000 nMfinal no ensaio). Amostras contendo aptâmero irrelevante (ARC127) foram incluídas para controlaros efeitos de oligonucleotídeo não específico. Uma amostra sem aptâmero (salina somente) tam-15 bém foi incluída como um controle negativo. Amostras de sangue de doador único foram retiradaspor métodos de flebotomia padrões em voluntários em casa. Sangue total foi retirado de 5 doado-res separados diretamente em uma seringa de 60 ml_ (Becton-Dickinson, (Franklin Lakes, NJ),cat. # 309653) e imediatamente aliquotados em bivalirudina (20 pM final) (Prospec-Tarry Techno-gene Ltd., (Israel), Iot # 105BIV01) +/- aptâmero. O anticoagulante bivalirudina, um inibidor direto20 de trombina, foi usado em vez de heparina que interfere na ativação do complemento.
O modelo de laço de tubo foi realizado essencialmente da forma descrita imediatamenteantes. Seções de ~ 300 mm de tubo (diâmetro de 1/4", volume de ~9 ml_) foram preenchidas com5 mL de amostras sangue/aptâmero/bivalirudina imediatamente depois que o sangue foi retiradodo doador. Os tubos foram então seguramente fechados em laços com seções curtas (-50 mm)25 de tubo Iigante de silicone, rendendo um volume de gás de 4 mL. Os laços do tubo foram giradosverticalmente a 32 rpm durante a incubação em um banho de água a 37 0C por 1 hora. Depois daincubação, todos os 5 mL da amostra foram transferidos para um tubo cônico de 15 mL (Corning,(Coring, NY), cat. # 430766) contendo 100 pL de 0,5 M de EDTA, dando uma concentração finalde EDTA de 10 mM. 1 mL de sobrenadante de plasma foi coletado de cada amostra finalizada30 depois da centrifugação (Centrífuga Eppendorf 5804) a 4 0C (3.300 rpm, 20 minutos). Sobrena-dantes foram congelados frescos em nitrogênio líquido e armazenados a - 20 °C. Para controlar aativação de fundo, uma amostra pré-CPB foi preparada adicionandoõ mL de sangue fresco dire-tamente para um tubo cônico de 15 mL em gelo contendo 100 μί. de 0,5 M de EDTA. Esta amos-tra foi processada para o plasma e armazenada da forma descrita anteriormente.35 A extensão da ativação de C5 foi determinada a partir de níveis relativos de C5a gerados
em cada amostra ativada, medida por ELISA de C5a da forma descrita imediatamente antes. OELISA C5a foi realizado em amostras de plasma não diluídas de acordo com o protocolo do estojode ELISA e níveis de C5a na amostra foram quantificados por comparação com os padrõesde C5a fornecidos pelo fabricante. A % de inibição de geração de C5a em cada concentração deaptâmero foi calculada usando a equação % de inib. =100 - 100 X (C5aamostra - C5apré-cPB) /(Cõasaiina somente - C5apré-cpB)· Valores IC50 foram determinados a partir de um gráfico de % de ini-5 bição em função de [ARC1905] usando a equação % de inib. = ( % de inib.)máXjma χ [ARC 1905]" /(IC50" + [ARC1905]") + fundo. Valores de IC90 e IC99 foram calculados a partir dos valoresIC50 usando a equaçãos IC90 = IC50 x [90/(100-90fne IC99 = IC50 χ [99/(100-99]1/n.
A extensão da ativação de C3 foi determinada a partir dos níveis relativos de C3a gera-dos em cada amostra ativada, medida por ELISA de C3a da forma descrita imediatamente antes.10 Logo antes da análise de C3a, amostras (incluindo os controles de salina somente e pré-CPB)foram diluídas em série em 0,9 % de salina. O ELISA de C3a é mais sensível que o para C5a;desta forma, uma diluição de 1/5.000 foi necessária para acomodar a faixa de concentrações deC3a na amostra. Níveis de C3a na amostra foram quantificados por comparação dos padrões doestojo, e a % de inibição foi calculada da forma descrita para C5a. Os dados foram analizados15 usando Microsoft Excel, e os valores de % de inibição média foram dispostos em gráfico usandoKaleidagraph (v3.5 Synergy Software). Valores de IC50, IC90 e IC99 foram determinados usando oXLfit 4.1 plug-in para Excel.
Os efeitos médios de ARC1905 e aptâmero irrelevante, ARC127, na ativação do com-plemento nos cinco doadores são resumidos na figura 66. Da forma apresentada na figura 67 o20 bloqueio completo da ativação de C5, refletido na geração de C5a, foi alcançado com <500 nM deARC1905, enquanto que o aptâmero irrelevante não teve nenhum efeito inibitório até 1 μΜ. Osvalores IC50, IC90 e IC99 médios do sangue total foram 119 ± 28,6 nM, 268 ± 39,2 nM e 694 ±241 nM, respectivamente (Figura 66). Embora não seja desejável prender-se à teoria, é razoávelassumir que ARC1905 é excluído do volume de sangue celular, que compreende aproximada-25 mente 45 % do total. Os valores de IC50, IC90 e IC99, ajustados para refletir inibição de C5 noplasma, desta forma, foram 216 ± 52,0 nM, 487 ± 71 nM e 1.261 ± 438 nM. Estes valores sãoconsistentes com os parâmetros calculados para inibição de ARC1905 de ativação do comple-mento induzida por zymosan em soro sugerindo que os componentes celulares do sangue nãointerferem significativamente na atividade anti-C5 de ARC1905. A geração de C3a não foi inibida30 por ARC1905 ou aptâmero irrelevante até 1 μΜ. Embora não seja desejável prender-se à teoria,isto sugere que ARC1905 nem inibe a reação de convertase do C3, nem bloqueia outras etapasque contribuem para ativação da cascata alternativa, tais como deposição de C3 e montagem daconvertase.
EXEMPLO 235 Seleções e Seqüências De Novo
Seleção de C5 com grupo dRmY
Duas seleções foram realizadas para identificar aptâmeros dRmY para proteína C5 decomprimento completo humana. A proteína C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA ou Advan-ced Research Technologies, San Diego, CA) foi usada na forma de comprimento total ("FL") eparcialmente tripsinizada ("TP") e ambas as seleções foram seleções diretas contra as proteínasalvo que foram imobilizadas em uma placa hidrofóbica. Ambas as seleções produziram grupos5 significativamente enriquecidos para ligação a C5 de comprimento em função de naive, gruponão selecionado. Todas as sequêncida apresentadas neste exemplo mostram 5' para 3'.
Preparação do grupo: Um molde de DNA com a seqüência
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GGTCGATCGATCGATCATCGATG (ARC520; SEQ ID NO: 70) foi sintetizado usando um sintetizador AB110 EXPEDITE DNA e desprotegido por métodos padrão. Os moldes foram amplificados com inicia-dor 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 71) e iniciador3' CATCGATGATCGATCGATCGACC (SEQ ID NO: 72) e então usados como um molde paratranscrição in vitro com RNA polimerase T7 mutante única de Y639F. Transcriçãos foram feitasusando 200 mM de HEPES, 40 mM de DTT1 2 mM de espermidina, 0,01 % de TritonX-100, 1015 % de PEG-8.000, 9,5 mM de MgCI2, 2,9 mM de MgCI2, 2 mM de NTPs, 2 mM de GMP, 2 mM desepermina, 0,01 de unidades///L de fosfatase inorgânica, e polimerase mutante únida deT7Y639F.
Seleção: Na rodada 1, uma etapa de seleção positiva foi conduzida nas colunas de li-gação do filtro de nitrocelulose. Resumidamente, 1 X 1015 moléculas (0,5 nmols) do grupo de20 RNA foram incubadas em 100 μΙ_ de tampão de ligação (1 X DPBS) com 3 uM de C5 de com-primento total ou 2,6 uM de C5 parcialmente tripsinizada por 1 hora a temperatura ambiente.Ccomplexos de RNA:proteína e RNA livre de moléculas foram separados usando 0,45 um decolunas de giro de nitrocelulose da Schleicher & Schnell (Keene, NH). As colunas foram pré-Iavadas com 1 mL de 1X DPBS, e então as soluções contendo RNAproteina foram adicionadas25 às colunas e giradas em uma centrífuga a 1.500 g por 2 minutos. Três lavagens de tampão de 1mL foram realizadas para remover aglutinantes não específicos dos filtros, então os complexosRNA:proteína anexados aos filtros foram eluídos duas vezes com 200 μΙ_ de lavagens de tampãode eluição (7 M de uréia, 100 mM de acetato de sódio, 3 mM de EDTA, pré-aquecido a 95 °C). ORNA eluído foi precipitado (2 μΙ_ glicogênio, 1 volume de isopropanol, 1/2 volume de etanol). O30 RNA foi transcrito reverso com o sistema ThermoScript RT-PCR™ (invitrogen, Carlsbad, CA) deacordo com as instruções do fabricante, usando o iniciador 3' descrito antes SEQ ID NO: 72, se-guido por amplificação de PCR (20 mM de Tris pH 8,4, 50 mM de KCI, 2 mM de MgCI2, 0,5 uM deiniciadores SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72, 0,5 mM de cada dNTP, 0,05 unidades///L de polime-rase Taq (New England Biolabs, Beveriy, MA)). Os moldes de PCR foram purificados usando co-35 Iunas Centeicep (Princeton Separaçãos, Princeton, NJ) e usados para transcrever o próximo gru-po de rodada.
Nas rodadas subsequentes de seleção, separação do RNA ligado e livre foi feita em pia-cas hidrofóbicas Nunc Maxisorp (Nunc, Rochester, NY). A rodada foi iniciada imobilizando 20pmols de C5 tanto de comprimento total quanto parcialmente tripsinizada na superfície da placapor 1 hora a temperatura ambiente em 100//L de 1X DPBS. O sobrenadante foi então removido eos poços foram lavados 4 vezes com 120 μΙ_ de tampão de lavado (1X DPBS). Os poços de prote-ína foram então bloqueados com um tampão de 1X DPBS contendo 0,1 mg/mL de RNAt de leve-dura e 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão como competidores. A concentração do grupousada foi sempre pelo menos em excesso de cinco vezes da concentração da proteína. O RNAdo grupo também foi incubado por 1 hora a temperatura ambiente em poços vazios para removeequaisquer seqüências de ligação plástica, e então incubados em um poço bloqueado sem nenhumaproteína para remover quaisquer seqüências de ligação competidoras do grupo antes da etapa deseleção positiva. O RNA do grupo foi então incubado por 1 hora a temperatura ambiente e o RNAligado ao C5 imobilizadao foi transcrito reverso diretamente na placa de seleção pela adição deRT mix (iniciador 3', SEQ ID NO:72 e. Thermoscript RT1 Invitrogen) depois incubando a 65 0C por1 hora. O DNAc resultante foi usado como um molde para PCR (polimerase Taq1 New EnglandBiolabs). DNA de molde de grupo amplificado foi desalgado com uma coluna Centrise (PrincetonSeparations) de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante e usado para programade transcrição do RNA do grupo para a próxima rodada de seleção. O grupo transcrito foi purifica-do em gel em um gel de 10 % de poliacrilamida a cada rodada.
O progresso da seleção foi monitorado usando um ensaio de ligação de filtro sandwich(dot blot). O RNA do grupo marcado com 5'- 32P (concentração traço) foi incubado com C5, 1XDPBS mais 0,1 mg/mL de RNAt e 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão, por 30 minutos atemperatura ambiente, e então aplicado a um sandwich de filtro de náilon e nitrocelulose e em umequipamento de dot blot (Schleicher e Schnell). A porcentagem de RNA de grupo ligado à nitroce-lulose foi calculada e monitorada aproximadamente a cada 3 rodadas com uma seleção de pontoúnico (+/-300 nM de C5). As medições de KD do grupo foram medidas usando uma titulação deproteína e o equipamento dot blot da forma descrita anteriormente.
Dados de seleções: Ambas as seleções foram enriquecidas depois de 10 rodadas sobreo grupo naive. Ver figura 18. Na rodada 10, o kD do grupo foi aproximadamente 115 nM para aseleção de comprimento total e 150 nM para a tripsinizada, mas a extensão da ligação foi somentecerca de 10 % no platô em ambas. Os grupos de R10 foram clonados usando estojo de clonagemTOPO TA (Invitrogen) e sequenciados.
Informação da seqüência: 45 clones de cada grupo foram sequenciados. O grupo decomprimento total de R10 foi dominado por um único clone ARC913 (SEQ ID NO: 75) que consti-tuiu 24 % do grupo, 2 conjuntos de duplicatas e seqüências únicas constituíram o restante. O grupotripsinizado de R10 continha 8 cópias da mesma seqüência ARC913 (SEQ ID NO: 75), mas o gru-po foi dominado por uma outra seqüência (AMX221 .A7; 46 %). O clone ARC913 (SEQ ID NO: 75)teve um KD de cerca de 140 nM e a extensão da ligação foi para 20 %. Verfigura 19.A seqüência individual listada na tabela 3 é listada na direção 5' para 3' e representa aseqüência de ribonucleotídeos do aptâmero que foi selecionada nas condições SELEX™ dedRmY fornecidas. Nas modalidades da invenção derivadas desta seleção (e refletidas na listagemde seqüência) as purinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-OMe. A seqüência Iis-tada na tabela 3 pode ou não conter capeamento (por exemplo, um dT 3'-invertido). A única se-qüência do aptâmero a seguir começa no nucleotídeo 23, imediatamente depois da seqüência fixaGGGAGAGGAGAGAACGWCUAC (SEQ ID NO: 73), e corre até que ele alcance a seqüência fixade ácidos nucléicos 3' GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG (SEQ ID NO: 74)Tabela 3: Seqüência de nucleotídeos do aptâmero dRmY de C5
RC9I3 (SEQ ID NO: 75)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUWGGCACGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCGAUCG AUCAUCGAUG
Ensaior de hemólise: O efeito de C913 (SEQ ID NO: 75) no caminho clássico do sistemacomplemento foi analizado usando um ensaio de hemólise previamente descrito, comparado tanto15 a ARC186 (SEQ ID NO: 4) (aptâmero anti-C5, controle positivo) quanto grupo de dRmY não sele-cionado (controle negativo). No ensaio de inibição hemolítica; uma solução de 0,2 % de soro totalhumano foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos com anticorpo (Diamedix Ez Comple-ment CH50 Test, Diarnedix Corporation, Miami, FL) na presença de ARC913 titulado (SEQ ID NO:75). O ensaio foi realizado em salina tamponada com veronal contendo cálcio, magnésio e 1 % de20 gelatina (tampão complemento GVB++) e incubado por 1 hora a 25 °C. Depois da incubação asamostras foram centrifugadas. A densidade ótica a 415 nm (OD415) do sobrenadante foi lida. Ainibição da atividade de hemólise é expressa como % da atividade de hemólise comparada aocontrole. Ver figura 20. O IC50 do aptâmero foi calculado para ser 30 nM.EXEMPLO 3
25 Otimização da Composição e Seqüência
Exemplo 3A: Minimizacão de ARC913:
Seis construtores a base de ARC913 (SEQ ID NO: 75) foram transcritos, purificados emgel, e testados em dot blots para ligação à C5. ARC954 foi similar ao clone pai com um KD de 130nM e extensão de ligação a 20 %, enquanto que ARC874 (SEQ ID NO: 76) foi o único outro clone30 que liga à C5 com um KD de 1 uM.
As seqüências individuais listadas na tabela 4 são listadas na direção de 5' para 3' e fo-ram derivadas de aptâmeros que foram selecionados nas condições SELEX™ de dRmY fornecidas.Nas modalidades da invenção derivadas desta seleção (e refletidas na listagem de seqüência) aspurinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas (U e C) são 2-OMe. Cada uma das seqüências listadas35 na tabela 4 pode ou não conter capeamento (por exemplo, um dT 3-invertido).
Tabela 4. Seqüências de nucleotídeos de clones minimizados de ARC913ARC874 (SEQ Π> NO: 76)CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG
ARC875 (SEQID NO: 77)CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG
ARC876 (SEQ ID NO: 78)GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC
ARC877 (SEQ ID NO: 79)GGGUUUGGCACAGGCAUACAAACCC
ARC878 (SEQ ID NO: 80)GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC
ARC954 (SEQ ED NO: 81)CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG
Exemplo 3B: Otimização de ARC913: Ré-selecão dopada
De maneira tanto a otimizar clone ARC913 (SEQ ID NO: 75) para afinidade de ligaçãoa C5 quanto a determinar os elementos de ligação chave, uma ré-seleção dopada foi conduzida.
Re-seleções dopadas são usadas para explorar as necessodades da seqüência em um clone ouminímero ativo. Seleções são realizadas com um grupo sintético, degenerado que foi projetadocom base em uma única seqüência. O nível de degeneração normalmente varia de 70 % a 85 %de nucleotídeo tipo selvagem. No geral, mutações neutras são observadas, mas em alguns ca-sos as mudanças na seqüência podem resultar em melhorias na afinidade. A informação deseqüência compósita pode então ser usada para identificar o motivo de ligação mínimo e auxiliarnos esforços de otimização.
Preparação do grupo: A seqüência molde taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGA-AcGTTCTACNtm1GTTACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO: 82) foi baseada na ARC913(SEQ ID NO: 75) e foi sintetizada com cada resíduo que origina da região aleatória dopada a umnível de 15 %, isto é, em cada posição ("N") aleatória, o resíduo teve uma chance de 85 % deser o nucleotídeo encontrado na seqüênciaCTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG (SEQ ID NO: 83) tipo selvagem euma chance de 15 % de ser uma de outros três nucleotídeos.
O molde e grupo de RNA para a ré-seleção dopada foram preparados essencialmenteda forma descrita anteriormente. Os moldes foram amplificados com os iniciadores taatacgactcac-tataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 84) e CATCGATGCTAGTCGTAAC (SEQID NO: 85). Duas seleções foram feitas com C5 de comprimento total, uma seleção usando umaconcentração maior de sal na etapa de lavagem. O protocol de seleção foi realizado da formadescrita anteriormente, com duas exceções: 1) A rodada 1 foi feita nas placas hidrofóbicas (bemcomo todas as rodadas subsequentes) com somente uma etapa positiva; e 2) nenhum competidorfoi usada de modo algum durante a seleção. A concentração de C5 e concentração do grupo deRNA foram mantidas constantes a 200 nM e 1 uM respectivamente.Dados de ré-seleções dopadas. Tanto seleções normais quanto ricas em sal foram enri-quecidas depois de 5 rodadas sobre o grupo naive. Na rodada 5 o kD do grupo foi aproximada-mente 165 nM para a seleção rica em sal e 175 nM para a seleção de sal normal. A extensão daligação foi cerca de 20 % no platô em ambas. Os grupos R4 foram clonados usando estojo declonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad1 CA), e 48 clones de cada grupo foram sequenciados.12 clones de cada grupo foram transcritos e ensaiados em um ensaio dot blot de único ponto a500 nM de C5. Constantes de dissociação (KdS) foram novamente medidas usando o ensaio dotblot previamente descrito. kDs foram estimados para os 11 melhores clones identificados na sele-ção de único ponto, ajustando os dados para a equação: fração de RNA ligado = amplitude*Kd/(Kd+ [C5]). Os clones com os três melhores Kds foram SEQ ID NO: 91 (73 nM), SEQ ID NO: 96 (84nM) e SEQ ID NO: 95 (92 nM). As seqüências para os 11 clones são listadas a seguir na tabela 5.
As seqüências listadas na tabela 5 são listadas na direção de 5' para 3' e representam aseqüência de nucleotídeoss do aptâmeros que foram selecionados nas condições de SELEX™ dedRmY fornecidas. Nas modalidades da invenção derivadas desta seleção (e da forma refletida nalistagem de seqüência), as seqüências correspondentes compreendendo as combinações de re-síduos dRmY, da forma indicada no texto, em que as purinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas(U e G) são 2'-OMe. Cada uma das seqüências listadas na tabela 5 podem ou não conter capea-mento (por exemplo, um dT 3'-invertido). As únicas seqüências de cada um dos aptâmeros a se-guir começa no nucleotídeo 23, imediatamente depois da seqüência fixaGGGAGAGGAGAGAACGWCUAC (SEQ ID NO: 86), e corre até que ela alcance aseqüência fixa de ácidos nucléicos 3' GUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 87).
Tabela 5. Seqüências de nucleotídeos de clones de ré-seleção dopada (SEQ YD NO: 88)(SEQID NO: 88)
gggagaggagagaacguucuaccuugguuu<kjcagaggcauac
(SEQID NO: 89)
gggagaggagagaacguücua<xlrkxnjulxxrcaca^
(SEQ ID NO: 90)
gggagaggagagaacguucuac^uixjguuuggcacaggcauaaauacgcagggcucgaucgguuacgacuagcaucgaug
(SEQ ID NO: 91)
gggagaggagagaacguucuac£uuggiaiuggcccaggcauauauacx3cagggauugaucccuuacgacuagcaucgaug
(SEQ ID NO: 92)
gggagagc^gagaacguucuaccuugguuuggcgcaggcauacauacgcaggucgaucgguuacgacuagcaucgaug
(SEQ ID NO: 93)
cckjagagoagaglaacguucuaccuuguugugg^cagccaacccu ajcgcac^
(SEQ ID NO: 94)
gggagaggagagaacguucuaocuugguuuggcacaggc^ua<^uacgcaggucgaíx:gguuacx!acua
(SEQ ID NO: 95)
gggagaggagagaacguucuaccuuagguucgcacugucauacauacacacgggcaaucgguuacgacuagcaucgaug
(SEQ ID NO: 96)
gggagaggagagaacguucuaccuugglnjuggcncaggcauanauacgcacgggucgaucgguuacgacuaccau
(SEQ ID NO: 97)
gchsagaggagagaacgixíCXJACCUUUCUCUGCCACAAGCAUACCUUCCH^
(SEQ ID NO: 98)
gggagaggagagaacouucuaccuugguljuggcacaggcauauauacxk^agggucgaucc^
Exemplo 3C: Modificação Ramificado de 40 kDa de ARC186
O oligonucleotídeo 5' NH2-fCmGEXGMmGmGfUfCftTfCmAmGmG GfCfUmG-mAmGfGfmCmAmGfUfUfUfUAfCfUmGfCmG-3T -3' (ARC672, SEQ ID NO: 63) foi sintetizado no5 sintetizador Expedite DNA (ABI, Foster City1 CA) de acordo com os procedimentos recomenda-dos pelo fabricante usando RNA 2'-OMe e RNA 2'-F e fosforamiditas de RNA protegidas porTBDMS padrão comercialmente disponíveis (Glen Research; Sterling1 VA) e um suporte de CPGde deoxitimidina invertido. A função amina terminal foi anexada a um modificador 5'-amino, 6-(trifluoracetilamino)hexil-(2-cianoetilHN,N-diisopropil)-fosforamidita,C6-TFA (Glen Research, Ster-10 ling, VA). Depois da deproteção, os oligonucleotídeos foram purificados por cromatografia de trocaiônica em resina Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences) e etanol precipitado.
O aptâmero modificado por amida foi conjugado a diferentes frações de PEG pós-sinteticamente. O aptâmero foi dissolvido em uma solução água/DMSO (1:1) para uma concentra-ção entre 1,5 e 3 mM. Tampão de carbonato de sódio, pH 8,5, foi adicionado a uma concentração15 final de 100 mM, e o oligo reagiu durante toda a noite com um excesso molar de 1,7 do reagentePEG desejado (por exemplo ARC1905 40 kDa Sunbright GL2-400NP éster de carbonato de p-nitrofenila [NOF Corp, Japan], ou ARC187 401 cDa mPEG2 NHS éster [Nektar, Huntsville AL])dissolvido em um volume igual de acetonitrola. Os produtos resultantes foram purificados por cro-matografia de troca iônica em resina Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences), e desalgados usan-do cromatografia de fase reversa realizada na resina Amberchrom CG300-S (Rohm e Haas), eliofilizados. A estrutura de ARC187 (SEQ ID NO: 5) é apresentada na figura 21, enquanto que aestrutura de ARC1905 (SEQ ID NO: 67) é apresentada na figura 22.
EXEMPLO 4
Modelo de Coração Perfundido Isolado
Exemplo 4A: Prova de princípio com ARC186
A concentração média do componente do complemento C5 no plasma humano é apro-ximadamente 500 nM. Mediante exposição de corações de camundongo isolados perfundidoscom tampoão Krebs Heinseleit para 6 % de plasma humano, a cascata do complemento humanoé ativada, levando à clivagem de C5 em C5a e C5b. O componente C5b subseqüentemente for-ma um complexo com componente dos complementos C6, C7, C8 e C9 também conhecidos co-15 mo o "complexo de ataque à membrana" ("MAC" ou C5b-9) que Iesiona vasos sangüíneos docoração e miócitos cardíacos, levando assim à disfunção do miocárdio (maior pressão diastólicafinal, arritmias) e assístole (Evans et. W., Molecular Immunology1 32, 1183-1195 (1995)). Previa-mente, anticorpos de cadeia monoclonal e simples que bloqueiam a clivagem de C5 humano(Pexelizumab ou uma versão scFv de cadeia simples de Pexelizumab) foram testados neste20 modelo e mostraram inibir a lesão e disfunção do miocárdio (Evans et al, 1995).
Este modelo foi usado para estabelecer que o aptâmero ARC186 que bloqueia C5(SEQ ID NO: 4), tipo Pexeluzimab, inibiu lesão ao complemento mediada por C5 humana acoraç~ioes de camundongo perfundidos isolados. Camundongos C57 B1/6 foram adquiridosda Charles River Laboratories, (Wilmington, MA). Resumidamente, depois da indução de a-25 nestesia profunda, o coração de cada camundongo foi removido e fixado em uma agulha deponta inserida na aorta, por meio do qual o coração foi continuamente perfundido com tampãode Krebs Heinseleit. Um transdutor de pressão (Mouse Specifics, Boston, MA) foi inserido noventrículo esquerdo permitindo contínua medição da taxa cardíaca e pressão intraventricular.Depois de um período de 15 minutos de equilíbrio durante os quais as medições da linha de30 base foram feitas, corações foram subseqüentemente perfundidos com tampão e 6 % deplasma humano +/- aptâmero em várias concentrações (Ver figura 23). Durante estes estudos eda forma descrita em Evans et al., demonstrou-se que corações que foram perfundidos comtampão de Krebs Heinseleit + 6 % de plasma humano falharam em 5 minutos da adição doplasma ao perfusato, enquanto que corações que foram continuamente perfundidos com tam-35 pão sozinho continuaram a bater em excesso de duas horas. Desta forma, o tamanho de cadaexperimento foi arbitrariamente definido como 15 minutos. O esquema deste estudo comARC186 é apresentado na figura 23.— Pressão intraventricular foi monitorada e registrada continuamente resultando em umsinal de onda de pressão (Figuras 24 e 25). O menor ponto de deflecção representa a pressãodiastólica dinal ("EDP") e o maior ponto de deflecção representa a pressão sistólica ("SP").
Ondas de pressão na linha de base aparecem para a esquerda da linha preta vertical marcada"0" mostrada em cada sinal. Conforme previamente publicado (Evans et al, 1995), coraçõesperfundidos com 6 % de plasma humano experimentaram um rápido aumento na pressãodiastólica final do ventrículo esquerdo, finalmente culminando na assístole (o coração para)em 5 minutos (Figura 24). Quando aptâmero irrelevante foi adicionado ao plasma humano emum excesso molar de 50 vezes, maior EDP e assístole foram foram observados (Figura 24).
Quando ARC186 foi adicionado ao sistema em equivalência molar, também houveum aumento precipitado em EDP, culminando em assístole (Figura 25). Em todos os três gru-pos de corações que experimentaram lesão mediada pelo complemento, maior EDP e assís-tole, o coração foi visivelmente edematoso e túrgido ao final do experimento. Quando ARC186foi adicionado ao plasma em excesso molar de 10 vezes ou 50 vezes (Figura 25), ondas depressão ventricular !permaneceram normal e assístole não foi observada. Além do mais, oedema e turgidez previamente descritos não foram aparentes nestes grupos.
Durante cada experimento, a taxa cardíaca foi registrada em intervalos de 5 minu-tos e a taxa cardíaca média para o grupo durante cada intervalo foi disposta em gráfico. Daforma apresentada na figura 26, corações perfundidos sem aptâmero ou com aptâmero irrele-vante desenvolveram assístole rapidamente, normalmene em 5 minutos. ARC186 adicionadoao sistema em equivalência molar ligeiramente atrasou o início da assístole. Corações nestegrupo finalmente falharam, entretanto. ARC186 adicionado ao plasma em excesso molar de10 vezes ou 50 vezes conservou a taxa cardíaca para a duração de cada experimento.
A porcentagem de aumento no peso do coração sobre a linha de base foi calculada25 para uma amostra representativa de corações que falharam (nenhum aptâmero ou excessomolar de 50 vezes de aptâmero irrelevante) e comparada aos corações protegidos comARC186 (excesso molar de 10 vezes e 50 vezes de C180. Da forma apresentada na figura27, corações protegidos com ARC186 ganharam significativamente menos peso que os cora-ções que falharam nos grupos de controle.30 Em virtude de ARC186 inibir C5, mas não clivar C3, produtos de clivagem de C3
(C3a), mas não produtos de clivagem de C5 (C5a ou C5b) devem ser encontrados no eflu-ente fluindo dos corações isolados protegidos por ARC186. Para mostrar diretamente queC186 inibiu a clivagem de C5 no plasma humano, os níveis relativos de proteínas do com-plemento C5a e C5b humano (produtos de clivagem de C5) e C3a (um produto de clivagem35 de C3) foram medidos no efluente tampão de vários grupos por estojos de ELISA comerci-almente disponíveis (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA.; C5a e C3a ELISA kit, BDBiosciences, San Diego, CA). ARC186 inibiu a clivagem de C5 no plasma humano e a pro-dução de C5a (Figura 28) e C5b-9 (Figura 29) de uma maneira dependente da dose. Aocontrário, ARC186 não teve nenhum efeito na clivagem de C3 humano em C3a e C3b (Figu-ra 30) demonstrando adicionalmente a especificidade para C5 da molécula.
Uma vez gerados, fragmentos C3b e C5b do complemento são depositados Iocal-mente nos tecidos na vicinidade do sítio de ativação do complemento. Depois de terminadosos experimentos, corações de camundongos foram congelados em meio OCT (Sakura Fine-tek, Torrance, CA), seccionados e então corados usando imunohistoquímica padrão para apresença de C3b humano (clone Hll1 Chemicon1 Temecula, CA), C5b-9 humano (clone a-E11, DAKO, Carpinteria, CA) ou IgG de camundongo controle (Vector Laboratories, Burlin-game, CA). Resultados do estudo são apresentados na figura 31.
Da forma descrita neste estudo, o aptâmero ARC186 que bloqueia C5 foi testadoem um modelo ex vivo de lesão de tecido mediada por componente do complemento C5 queusa corações de camundongo isolados perfundidos com tampão de Krebs Heinseleit e 6 %de plasma humano heparinizado, com base em um modelo descrito no estudo previamentepublicado que testou os efeitos do anticorpo anti-C5, Pexeluzimab no sistema complemento(Evans, Molecular Jmnmunol 32:1183, (1995). Usando este modelo, demonstrou-se que ap-tâmero que bloqueia C5 (a) inibiu clivagem de C5 no plasma humano (mas não de C3), (b)inibiu deposição de C5b humano (mas não de C3b) em tecido do coração de camundongose (c) inibiu disfunção miocárdica mediada por C5b-9 humano em concentrações clinicamenterelevantes (5 μΜ, um excesso molar de 10 vezes de aptâmero vs. C5). Estes dados mostramque quando a cascata do complemento humano é ativada de uma maneira fisiologicamenterelevante, aptâmeros que bloqueiam C5 são capazes de inibir a clivagem de C5 plasmáticoe prevenir lesão e disfunção do miocárdio.
Exemplo 4B: Eficácia do aptâmero PEGuilado
Os materiais e métodos usados neste estudo foram exatamente os mesmos descri-tos no exemplo 4A anterior. O projeto experimental e resultados são apresentados na figura32. A primeira metade do experimento usou plasma heparinizado humano (Center for BloodResearch, Harvard Medicai School, Boston, MA) como uma fonte de complemento e a se-gunda metade usou plasma de macaco cinomólogo heparinizado (Charles River Laboratories,Wilmington, MA) como uma fonte de complemento. Um aptâmero PEGuiIado (ARC658; SEQID NO:62) foi adicionado ao sistema em razões molares crescentes. Embora todos os sinaisde pressão ventricular relevantes tenham sido coletados, a tabela lista a presença ou ausên-cia de um aumento na pressão diastólica final (EDP), tenha a assístole ocorrido ou não e otempo até a falha do coração (definido como a presença de um EDP elevado e assístole).
Durante os experiments com plasma humano, a dose ideal de 658 (SEQ ID NO: 62)foi determinada para ser de equivalência molar (500 uM), enquanto que durante os experi-mentos com plasma de primata não humano, um excesso molar de 50 vezes (25 μΜ) tenhasido necessário para proteger coração da lesão mediada por C5b (ver Figura 32).
Estes dados são consistentes com a diferença na afinidade do aptâmero anti-C5para C5 humano v. primata não humano indicados pelos dados in vitro. Embora não sejadesejável se prender à teoria, durante estudos subsequentes com PK/PD de macaco cinomó-logo descritos no exemplo 5, adicionalmente demonstrou-se que um excesso molar de 30vezes de aptâmero foi necessário para inibir clivagem de C5 no plasma mediada por zymo-san, adicionalmente suportando a noção que o aptâmero se liga ao C5 primata com menorafinidade que C5 humano.
Coletivamente, estes estudos indicam que tanto aptâmeros ARC186 que bloqueiamC5 (SEQ ID NO: 4) quanto até ARC658 (SEQ ID NO: 62) são eficazes no modelo de cora-ção isolado, perfundido de camundongos. Este modelo também demonstrou que significati-vamente mais ARC658 (SEQ ID NO: 62) teve que ser usado para inibir lesão do coraçãomediada por C5 de plasma de macaco cinomólogo (excesso molar de 30 vezes), compara-da a lesão do coração mediada por C5 humano (equivalência molar), adicionalmente supor-tando dados in vitros que indicaram que o aptâmero teve menor afinidade para C5 de prima-ta. Finalmente, estes dados indicara que macacos cinomólogos precisam ser dosados emtorno de um excesso molar de 30 vezes de maneira a demonstrar bloqueio de C5 in vivodurante estudos PR/PRÓTESE DENTÁRIA
EXEMPLO 5
METABOLISMO & FARMACOCINÉTICA DO MEDICAMENTO DE APTÂMEROSANTI-C5 EM ANIMAIS
Nos exemplos 5A-5G, todos os dados de concentração baseados na massa refe-rem-se somente ao peso molecular da porção do aptâmero do oligonucleotídeo, indepen-dente da massa conferida pela conjugação do PEG.
Exemplo 5A: Estabilidade metabólica do ARC186 inibidor de C5 em plasma de pri-mata e rato
O precursor de oligonucleotídeo não PEGuiIado dos aptâmeros (isto é, ARC 186;SEQ ID NO: 4) foi testado em plasma de rato e macaco cinomólogo (Charles Iiver Labs,Wilmington, MA) de maneira a estimar sua estabilidade, taxa cinética e caminhos de de-gradação. O teste foi realizado usando aptâmero radiomarcado (32p) na extremidade 5' incu-bado a 37° C em 95 % de plasma agrupado (citratado) durante o curso de 50 horas. Empontos de tempo selecionados, alíquotas de plasma contendo aptâmero foram retiradas,imediatamente congeladas frescas em nitrogênio líquido, e armazenadas a -80° C. A detec-ção e análise do aptâmero e seus metabólitos no plasma foi realizada usando extração Ifqui-do-líquido (fenol-clorofórmio) seguida por eletroforese em gel (em 10 % de gel de sequenci-amento de poliacrilamida de desnaturação) e auto-radiografia de alta resolução.
A figura 33 mostra um gráfico Iog-Iinear da porcentagem restante de aptâmero decadeia completa como uma função de tempo de incubação em plasma tanto de rato quantode macaco cinomólogo. O perfil de degradação em ambas as espécies parece ser essencial-mente monofásico, com uma taxa constante de aproximadamente k ~ 0,002 hora"1.
Exemplo 5B: Farmacocinética de AR657, ARC658 e ARC187 em rato depois daadministração intravenosa
Para estimar o perfil farmacocinético de ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQID NO: 62) e ARC187 (SEQ ID NO: 5), e para estimar o nível de dosagem e freqüência ne-cessários em primatas e humanos, um estudo farmacocinético foi conduzido em ratos Spra-gue-Dawley caracterizados (Charles River Labs, Wilmington, MA). Aptâmeros foram formu-lados para injeção a 10 mg/mL (peso de oligo) em salina padrão e filtrados (0,2 //m) em umfrasco de dosagem pré-esterilizado em condições assépticas. A via de administração usadapara o estudo no rato foi uma via de bolo intravenoso na via da cauda em uma dosagem de10 mg/kg. Os ramos do estudo consistiram em 3 animais por grupo, a partir dos quais sangri-as em série foram realizadas pré-dosagem e em pontos de tempo especificados durante ocurso de 48 horas. O projeto do estudo é esboçado na figura 34. Amostras de sangue foramobtidas de catéteres da veia jugular cirurgicamente implantados, transferidos diretamente paraos tubos revestidos com EDTA, misturadas por inversão e colocadas em gelo até o proces-samento do plasma.
Plasma foi coletado por centrifugação de tubos de sangue-EDTA a 5.000 rpm por 5minutos e sobrenadante (plasma) foi transferido para um tubo pré-marcado fresco. Amostrasde plasma foram armazenadas a -80° C até a hora a análise. Análises de amostras deplasma para ARCI87 foram realizadas usando um formato de ensaio homogêneo utilizando aadição direta de alíquotas de plasma para ensaiar poços contendo o reagente de detecção deácido nucléico fluorescente comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Euge-ne, OU). Depois de um rápido período de incubação (5 min) a temperatura ambiente, prote-gido da luz, as placas do ensaio foram lidas por um leitor de placa por fluorescência (Spec-traMax Gemini XS1 Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O sinal fluorescente de cada poçofoi proporcional à concentração de aptâmero no poço e concentrações da amostra foramcalculadas por interpolação dos valores de fluorescência de uma curva padrão fluorescên-cia-concentração (valores médios de curvas em duplicata ou triplicata). Concentraçõesplasmáticas médias foram obtidas em cada ponto de tempo dos três animais em cada grupo.Dados de concentrações plasmáticas em função do tempo foram submetidos a análise nãocompartmental (NCA) usando o software de modelamento farmacocinético padrão na in-dústria WinNonLiu™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Estimativas foram obtidaspara os seguintes parâmetros farmacocinéticos primários: concentração plasmática máxima,Cmax; área sobre a curva concentração-tempo, AUC; meia-vida terminal, Xm2', depuraçãoterminal, C1; e volume de distribuição em estado estável, Vss.Dados de concentração plasmática média em função do tempo são mostrados na fi-gura 35 e são dispostos em gráfico na figura 36. Os dados de concentração em função dotempo foram submetidos a análise não compartmental (NCA) usando WinNonLin™ v.4.0.Esta análise rendeu os valores apresentados na figura 37.
Conforme previsto, o aptâmero ARC187 40 kDa (SEQ ID NO: 5) teve a maior meia-vida e o aptâmero ARC657 20 kDa (SEQ ID NO: 61), a menos. O Vss observado com rela-ção a volume plasmático conhecido (-40 mLVkg) sugeriu um grau moderado de Iiga-ção/sequestração de ARC187 (SEQ ID NO: 5) às proteínas e/ou matriz de tecido no espaçoextravascular. Assumindo-se uma necessidade de manter um excesso molar de 5 vezes deaptâmero, os resultados deste estudo sugeriram que ARC1S7 (SEQ ID NO: 5) fornece umavantagem significativa em termos de freqüência de dosagem e quantidade total de aptâmeronecessário para manter os níveis plasmáticos desejados.
Estudos anteriores (dados não apresentados) em roedores e primatas com aptâme-ros de composição similar mostraram proporcionalidade/linearidade de dosagem em dosesaté 30 mg/kg, então não previu-se que este nível de dosagem resulta em conduta farmaco-cinética não linear.
Exemplo 5C: Farmacocinética de ARC187 e ARC1905 em camundonqos depois daadministração intravenosa
Para estimar o perfil farmacocinético da espinha dorsal do oligonucleotídeoARC186 (SEQ ID NO: 4) conjugado a um diferente PEG ramificado 40 kDa que o ARC187(SEQ I NO:5), um estudo farmacocinético foi conduzido em camundongos CD-1 fêmeas (ob-tidos de Charles River Labs, Wilmington1 MA). Aptâmeros foram formulados para injeção a2,5 mg/mL (peso de oligo) em salina padrão e filtrados (0,2 μηη) em um frasco de dosagempré-esterilizado em condições assépticas. A via de administração usada para o estudo comcamundongo foi uma via de bolo intravenoso da veia na cauda em uma dosagem de 10mg/kg. Braços do estudo consistiram de 3 animais por grupo, a partir dos quais sangrias ter-minais foram tomadas pré-dosagem (isto é, o grupo de controle não dosado) e em pontos detempo especificados durante o curso de 72 horas. O projeto do estudo é esboçado na figura 38A.
Amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca terminal, transferidas dire-tamente para tubos revestidos com EDTA1 misturadas por inversão, e colocadas em gelo atéΌ processamento do plasma. Plasma foi coletado por centrifugação dos tubos sangue-EDTA a 5000 rpm por 5 minutos e sobrenadante (plasma) foi transferido para um tubo pré-marcado fresco. Amostras de plasma foram armazenadas a -80° C até a hora da análise. Aná-Iises de amostras de plasma para ARC187 e 1905 foram realizadas usando um formato deensaio homogêneo utilizando a adição direta de alíquotas de plasma aos poços do ensaiocontendo o reagente de detecção de ácido nucléico fluorescente comercialmente disponívelOligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OU). Depois de um rápido período de incubação (5min) a temperatura ambiente, protegido da luz, as placas de ensaio foram lidas por um leitorde placa por fluorescência (SpectraMax Gemini XS1 Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Osinal fluorescente de cada poço foi proporcional à concentração de aptâmero no poço e as5 concentrações da amostra foram calculadas por interpolação de valores de fluorescência apartir de uma curva padrão de fluorescência-concentração (valores médios de curvas em du-plicata ou triplicata). Concentrações plasmáticas médias foram obtidas em cada ponto detempo dos três animais em cada grupo. Dados de concentração plasmática em função dotempo foram submetidos a análise não compartmental (NCA) usando o software de mokde-10 lamento farmacocinético padrão da indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., MountainView, CA). Estimativas foram obtidas para os seguintes parâmetros farmacocinéticos primá-rios: concentração plasmática mácima, C m a x ; área sobre a curva concentração-tempo, AUC; meia-vida terminal, 11/2; depuração terminal, C1; e volume de distribuição noestado estável, Vss. DAdos de concentração plasmática média em função do tempo são dis-15 postos em gráfico na figura 38B.
Os dados de concentração em função do tempo foram submetidos a análise nãocompartmental (NCA) usando WinNonLin™ v.4.0. Esta análise rendeu os valores apresen-tados na figura 38C. Conforme previsto, os PEGS 40 kDa de ambos os vendedores apresen-taram equivalência farmacocinética em camundongos.20 As mesmas amostras de plasma para ARC187 e 1905 usadas para análise oligreen
descritas diretamente anteriormente foram analizadas usando um ensaio de cromatografialíquida de alto desempenho (HPLC) validado com detecção UV.
Valores de concentração plasmática média para ARC187 e ARC1905 foram calcu-lados usando 30 Microsoft Excel 2003. Quando valores de concentração plasmática foram25 abaixo de LLOQ do ensaio bioanalítico na pré-dosagem (tempo 0), um valor zero foi designado.Valores abaixo de LLOQ das amostras tomadas pós-dosagem foram omitidos do cálculo da con-centração plasmática média. Dados de concentração plasmática média foram usados em análisePK independente do modelo usando WinNonIin1 versão 5.1 (Pharsight Corporation, Mountainview,CA). O área sobre a curva concentração plasmática-tempo (AUQHMmo) foi estimada usando a re-30 gra trapezoidal linear. Para os cálculos, qualquer valor que foi abaixo de LLOQ do ensaio, exceto aamostra pré-dosagem, foi excluído dos cálculos para estimativas de parâmetros PK. A meia-vidaterminal aparente foi calculada usando a fórmula Ui2 = 0,693/λ2 onde 2 é a taxa de eliminaçãoconstante estimada a partir da regressão da inclinação terminal da curva de concentração emfunção dao tempo. Pelo menos três valores de concentração plasmática depois da concentração35 de pico na fase terminal foram usados para determinar Az eo coeficiente de determinação (r2) foirequerido para ser >0,85.
No geral, a análise de HPLC confirma a análise oligreen descrita imediatamente antesmostrando que encontrou-se que ARC1905 e ARC187 são bioequivalentes com base nas compa-rações das estimativas dos parâmetros de média Cmax, AUCtM e AUCo. Diferenças nos valores deAUC0-Uitimo e AUC0 para ARC1905 relativo a ARC187 (medidos por HPLC) foram bem nos critériosde aceitabilidade de bioequivalência de ± 20 %.
Exemplo 5D: Estudo de absorção pelo tecido dos ARC657, ARC658 e ARC187 inibido-res de C5 em camundonqos depois da administração de bolo intravenoso
CAmundongos CD-1 fêmeas foram obtidos de Charles River Labs (Wilmington1 MA).Formulações de ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187 (SEQ ID NO: 5)para injeção foram em salina a 5 mg/mL. Formulaç~eos de dosagem foram filtradas (0,2 pm) em10 frasco de dosagem pré-esterilizados em condições assépticas e animais foram dados uma via debolo intravenoso da veia na cauda em uma dosagem de 25 mg/kg. O estudo consistiu em gruposde 3 animais para cada um dos quatro pontos de tempo, t = pré-dosagem, 3, 6, 12 horas. Depoisda exsanguinação, a vasculatura de cada animal foi lavada extensivamente (V~3 0 mL) com sali-na para remover qualquer sangue deixado na vasculatura. Tecidos (coração, fígado, rins) foram15 coletados, pesados, então homogeneizados a 50 % p/v de salina padrão, e armazenados a -80° Caté a hora da análise.
Análise do tecido para ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62), e ARC187(SEQ ID NO: 5) foi realizada usando um ensaio tipo ELISA a base de hibridização. Neste ensaio,uma sonda de captura biotinilada foi pré-imobilizada nos poços de uma microplaca de 96 poços20 em uma concentração de solução de ligação de 125 uM por 3 horas. Os poços da placa foramlavados 5 vezes com 1X PBS. As placas foram então bloqueadas com 150 μ L/poço de um 1XSuperBIock em TBS (Pierce Chemical, Rockford, IL). Placas foram lavadas novamente, revestidase armazenadas a 4° C até o uso. Em tubos separados, a amostras(s) foi temperada em um tam-pão contendo uma sonda de detecção da amostra (5'-Fluoresceína) marcada com PAM a 200 nM25 a 90 0C para então finalizar em gelo. Padrões de concentração e amostras de controle de plas-ma/tecido também foram pré-temperadas com soluções de sonda de detecção da amostra e entãopipetadas em poços de placa de ensaio contendo sonda de captura de biotina imobilizada e tempe-radas a 45° C por 2,5 horas. Placas foram então lavadas novamente e preenchidas com 100pUpoços de uma solução contendo 1X PBS contendo 1 μg/mL de anticorpo monoclonal anti-30 fluoresceína conjugado a peroxidase de rábano silvestre (anti FITC MAb-HRP, Molecular Probes,Eugene, OU) em 1X PBS, e incubadas por aproximadamente 1 hora. Placas foram lavadas no-vamente como antes. Poços de placa de ensaio são foram então preenchidos com 100 pL deuma solução contendo um substrato HRP fluorogênico (QuantaBIu, Pierce Chemical, Rockford,IL), e incubadas por 20-30 min protegidas da luz. Depois de 45 minutos de incubação, 10035 μ L/poços de uma solução de parada foram adicionados para finalizar a reação que produz precipi-tado fluorescente. Placas foram lidas imediatamente em um leitor de microplaca fluorescente(SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale1 CA) com excitação fluorescente a 325 nme emissão detectada a 420 nm. Cada poço foi lido 10 vezes. Todos os três aptâmeros foram detec-táveis no tecido do coração nos três pontos de tempo (Figura 39).
Exemplo 5E: Farmacocinética e Farmacodinâmica dos ARC657. ARC658 e ARC187 ini-bidores de C5 em macaco cinomóloqo depois do estudo 1 de administração intravenosa5 Formulação de ARC657(SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARCI87 (SEQ ID
NO: 5) para injeção foi em salina padrão a 10 mg/mL e formulações de dosagem foram estéreis(0,2 μιτι) em frasco de dosagem pré-esteriIizados em condições assépticas. A via de administra-ção usada para o estudo em macaco foi uma via de bolo intravenoso em um catéter na veia femo-ral implantado cirurgicamente em uma dosagem de 30 mg/kg (aproximadamente excesso molar10 de 50 vezes). O projeto do estudo é esboçado na figura 40. Amostras de sangue foram obtidasdos catéteres da veia femoral, transferidas diretamente para tubos revestidos com citrato de sódio,misturadas por inversão, e colocadas em gelo até que elas foram centrifugadas para separarplasma (3.000 rpm por 5 minutos). Plasma foi então dividido em alíquotas de 250 //L que foramarmazenadas a -80° C e uma alíquota de cada amostra foi avaliada para a concentração de ap-15 tâmero usando o ensaio Oligreen a base fluorescência previamente descrito na seção de PK derato antes.
Os dados de concentração plasmática primária em função do tempo são apresentadosde forma tabular na figura 41. Conforme previsto, o aptâmero ARC187 de PEG 40 kDa (SEQ IDNO: 5) persistiu no plasma pelo maior período de tempo, enquanto que o aptâmero ARC657 de20 PEG 20 kDa (SEQ ID NO: 61) persistiu por menor quantidade de tempo. Inspeção dos dadosmostrados na figura 41 sugeriramque os dados seriam mais bem ajustados por um modelo dedois compartimentos. Assim, as estimativa do parâmetro farmacocinético reportada na figura 42foram derivadas do modelo de dois compartimentos usando o software de modelamento farmaco-cinético padrão da indústria WinNonLinTw v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View1 CA).25 Da forma apresentada na figura 42, todos os aptâmeros tiveram um valor de Cmax simi-
lar, entre 23 e 30 μΜ, indicando que a dosagem de aptâmero (30 mg/kg) foi suficiente para atingirum excesso molar de 50 vezes de plasma aptâmero vs concentração de C5 (excesso molar de 50vezes, cerca de 25 pM). Embora eles sejam diferentes em 10.000 peso molecular, ARC657 (20kDa PEG) (SEQ ID NO: 61) e ARC658 (30 kDa PEG) (SEQ ID NO: 62) tiveram valores de30 (AUC), 11/2(σ) e t1/2(/?) de exposição similares. Ao contrário, ARC187 (SEQ ID NO: 5) tiveram valo-res de (AUC) de exposição significativamente maiores, um maiort1/2 (a) e um t1/2(/?) ligeiramen-te meior que as outras moléculas.
Alíquotas adicionais das amostras de plasma coletadas durante o estudo farmacocinéticoforam subseqüentemente analizadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio deC5 em35 primata. O ensaio de ativação de zymosan foi corrido da forma descrita anteriormente para deter-minar a quantidade de C5b-9 e C5a primata gerado respectivamente. Os dados foram dispostosem gráfico em diferentes formatos, incluindo concentração de amostra de C5b-9 em função dotempo (Figura 43a), concentração de C5b-9 em função de concentração de aptâmero (Figura43b), concentração de C5a em função de tempo da amostra (Figura 43c), e concentração de C5aem função de concentração do aptâmero (Figura 43d).
O aptâmero ARC187 de PEG 40 kDa (SEQ ID NO: 5) inibiu a clivagem de C5 de prima-ta (concentração de C5b-9 e C5a) pelo maior período de tempo (Figuras 43a e 43c). Quando osdados de C5b-9 e C5a foram dispostos em gráfico em função da concentração de aptâmero, elesindicaram que a concentração de aptâmero que bloqueia C5 teve que exceder em excesso molarde 30 vezes, independente do tamanho da molécula de PEG, de maneira que a clivagem de C5seja completamente inibida (Figuras 43b e 43d).
Em resumo, os dados do estudo PK/PD de macaco cinomólogo demonstram que (a)conforme previsto, pelo menos um excesso molar de 30 vezes de aptâmero (cerca de 15 μΜ deconcentração plasmática de aptâmero) foi necessário para inibir a clivagem de C5 in vivo no ma-caco cinomólogo, independente do tamanho do grupo PEG, (b) aptâmeros que bloqueiam C5 nãocausam toxicidade premeditada nestas espécies, e (c) quando animais foram dosados em umnível relativamente alto (excesso molar de 50 vezes), níveis de aptâmero plasmático foram bemna faixa de ensaio aporopriada durante o período de amostragem para permitir o cálculo dos pa-râmetros farmacocinéticos.
Exemplo 5F: Farmacocinética e farmacodinâmica dos ARC658 e ARC187 inibidores deC5 no macaco cinomólogo depois da administração intravenosa - estudo 2
O estudo 2 foi similar no projeto ao estudo 1 descrito anteriormente, com as seguintesexceções a) somente dois compostos foram avaliados (ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187(SEQ ID NO: 5); b) o número de animais foi aumentado para quatro por grupo; e c) a amostraplasmática de 1-minuto foi deletada e substituída com uma amostra de 144 horas para garantir quea circulação da meia-vida terminal fosse baseada em mais pontos de dados. A formulação de do-sagem destes dois aptâmeros, técnicas de amostragem de sangue e isolamento de plasma foramidêncicos aos métodos descritos anteriormentee no estudo I. O projeto para o estudo está resumi-do na figura 44.
Depois de completar o estudo 2, alíquotas de plasma foram analizadas da forma descritano estudo I para determinar a) a concentração de aptâmero no plasma em vários pontos de tempodepois da administração intravenosa, e b) a eficácia do bloqueio de C5.
A concentração plasmática de aptâmero foi disposta em gráfico como uma função dotempo (Figura 45) e os dados primários para ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) são apresentados de forma tabular nas figuras 39 e 40, respectivamente. O aptâmeroARC187 de PEG 40 kDa (SEQ ID NO: 5) persistiu no plasma pelo maior período de tempo. A ins-peção da figura 45 indicou que os dados devem ser mais bem ajustados por um modelo de doiscompartimentos. Assim, as estimativas de parâmetro farmacocinético reportadas na figura 46 fo-ram derivadas d modelo de dois compartimentos usando WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp.,Mountain View1 CA).
Ctomparando os parâmetros farmacocinéticos gerados durante o estudo 1 e estudo 2PK/PD anteriores, os dados para ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187 (SEQ I NO: 5) foram simi-lares com a exceção da medição de t1/2 (a) para ARC187. Embora não seja desejável se prender5 à teoria, a discrepância nas medições de t1/2 (a) para ARC187 entre os dois estudos é prova-velmente em virtude do pequeno tamanho da amostra no estudo piloto.
Conforme demonstrado na figura 46, os valores de Cmax foram similares paraARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187 (SEQ ID NO: 5). Ao contrário, exposição ao medica-mento (AUC) foi significativamente maior em animais tratados com ARC187 (SEQ ID NO: 5).10 Também, ARC187 teve maiores valores t1/2(a) e W/3) comparados ao ARC658 (SEQ IDNO: 62). Estes dados, juntamente com os dados gerados durante o estudo PK/PD 1 indicamque os aptâmeros ARC187 que bloqueiam C5 podem fornecer o bloqueio mais efetivo invivo C5 para uma dada dosgem.
Alíquotas adicionais das amostras de plasma coletadas durante o estudo farmaco-15 cinético foram subseqüentemente analizadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueiode C5 primata. Conforme antes, o ensaio de ativação de zymosan foi realizado para deter-minar a quantidade de C5b-9 e C5a primata, respectivamente, gerados. Os dados foramdispostos em gráfico como concentração de C5b-9 em função de concentração de aptâmero(Figura 47) e concentração de C5a em função de concentração de aptâmero (Figura 48). Con-20 forme previamente demonstrado durante o estudo 1 PK/PD, a concentração do aptâmero debloqueio de C5 deve exceder um excesso molar de 30 vezes (concentração de aptâmeropara C5 plasmático), ou aproximadamente 15 μΜ, independente do tamanho da molécula dePEG, de maneira que a clivagem de C5 primata seja completamente inibida (Figuras 41 e42).
25 Inspecionando os dados nas tabelas das figuras 39 e 40, percebe-se que depois de
um bolo I.V. de 30 mg/kg, ARC658 (SEQ I NO: 62) permanece acima de 15 μΜ por aproxi-madamente 4 horas, enquanto que ARC187 permanece acima dee 15 μΜ por aproximada-mente 8 horas. Assim, dada uma dosagem similar de medicamento, o aptâmero ARC187 40K fornece eficácia clínica de aproximadamente duas vezes mais que o aptâmero ARC65830 30K (SEQ ID NO: 62).
Em resumo, macacos cinomólogos devem ser tratados com pelo menos um exces-so molar de 30 vezes de aptâmero vs C5 plasmático de maneira a bloquear a conversão deC5 in vivo. Estes dados são consistentes com estudos anteriores in vitro (hemólise) e ex-vivo (coração de camundongo perfundido isolado) que sugeriram que os aptâmeros de Iiga-35 ção ao C5 levam a uma menor afinidade para C5 primata em função de C5 humano. Mostrou-se que aptâmeros que bloqueiam C5 podem seguramente ser distribuídos como um bolo in-travenoso em uma dosagem de até 30 mg/kg, que iguala a aproximadamente um excessomolar de 50 vezes de concentração aptâmero vs C5.
Exemplo 5G: ARC1905 no macaco cinomóloqo depois da administração de bolo IV
A farmacodinâmica do ARC1905 inibidor de C5 foi avaliada no macaco cinomólogodepois da administração intravenosa. Formulação de ARC1905 para injeção foi em salinapadrão a 7,5 mg/mL e formulações de dosagem foram estéreis (0,2 μm) em frasco de do-sagem pré-esterilizados em condições assépticas. Macacos cinomólogos (n=4) foram dosa-dos a 0 (salina controle) ou 30 mg/kg por meio de administração de bolo intravenoso. Amos-tras de sangue foram obtidas de uma veia periférica ou da porta de acesso arterial e amostrasde sangue (0,5 mL) foram transferidas em tubos de EDTA dipotássico (K2), colocadas emgelo úmido e centrifugadas em 30 minutos de coleta a aproximadamente 4 °C.
As amostras de plasma foram analizadas in vitro para determinar a eficácia deARC1905 em bloqueio de C5 em primata. O ensaio de zymosan previamente descrito comrelação ao ARC1905 no exemplo IC foi usado para determinar a quantidade de C5a primatagerado. A diminuição nos valores de C5a pós-zymosan em 0,5 e 2 horas depois da dosa-gem indica que ARC1905 inibe a clivagem de C5 in vivo no macaco cinomólogode umamaneira similar ao ARC187 quando dosado aproximadamente na mesma concentração e namesma via de administração medida in vitro usando o ensaio de ativação de zymosan.
Exemplo 5H: Farmacocinética e farmacodinâmica do ARC187 inibidor de C5 no ma-caco cinomóloqo depois de administração IV de bolo e infusão
Os perfis farmacocinéticos (PK)e farmacodinâmicos (PD) de ARC187 (SEQID NO: 5) também foram avaliados em macacos cinomólogos depois de um bolo de cargaintravenosa seguido imediatamente pela iniciação de uma infusão intravenosa. Este projetodo estudo está apresentado na figura 49.
A dosagem do bolo de carregamento e taxa de infusão necessária para atingir aconcentração plasmática de estado estável alvo de 1 uM foram calculadas usando os parâ-metros farmacocinéticos derivados do estudo somente de bolo IV listado na figura 50.
A um total de três macacos cinomólogos foi administrado um bolo IV de ARC187 a1 mg/kg, seguido imediatamente pela iniciação de uma infusão IV a uma taxa de 0,0013mg/kg/min por um período de 48 horas. Amostras do sangue total foram coletadas de 0 a192 horas póst-tratamento, armazenadas em gelo úmido, processadas para plasma, e entãoarmazenadas congeladas a -80 0C. A concentração de ARC187 em amostras de plasma foideterminada usando tanto um ensaio de coloração de ácido nucléico fluorescenteo (descritono exemplo SB) quanto um ensaio de cromatografia líquida de alto desempenho validadaHPLA. O método de ensaio de HPLC para a determinação de ARC187 em plasma de maca-co foi validado por CIinTriaIs Bio-Research (Montreal, Canada). O estudo de validação quecumpre os regulamentos da United States Food and Drug Administration (FDA) Good Labo-ratory Practice (GLP) (21 CPR §58). O método de ensaio de HPLC foi validado com relaçãoa: selectividade, linearidade, limite inferior de quantificação (LLOQ)1 persistência, intra-ensaio de precisão e exatidão, inter-ensaio de precisão e exatidão, estabilidade da soluçãode estoque, meio de injeção, estabilidade, estabilidade da matriz a curto prazo, estabilidadede congelamento-descongelamento, estabilidade da matriz a longo prazo e integridade de5 diluição. A faixa de concentração dinâmica linear usável do ensaio foi determinada 0,080 a50,0 μΜ.
O perfil PK medido de ARC187 nestas condições foi de acordo bem com o perfilcalculado gerado usando somente os parâmetros PK de bolo IV (ver figura 51). A concentra-ção plasmática alvo de 1 uM foi estabelecida em < 5 min pós-dosagem e mantida por toda a10 duração da infusão. Deposi do término da infusão, o aptâmero mostrou uma meia-vida dedepuração terminal, t|/2 (β) - 40-60 horas.
A atividade farmacodinâmica de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) no macaco cinomólogofoi avaliada ex-vivo usando amostras de plasma coletadas durante o estudo PK no ensaio deativação de zymosan previamente descrito com a modificação que amostra plasmática de15 cinomólogo foi diluída 10 vezes em 10 % de plasma humano e então tratada com 5 mg/mL dezymosan. A ativação de C5, refletida pelo aparecimento do produto de clivagem C5a, foimedida por ELISA específico para C5a de humano (C5a ELISA kit, BD Biosciences, SantDiego, CA). A concentração de ARC187 ativo em cada amostra foi então quantificada porcomparação com uma curva padrão derivada de ensaios de zymosan usando amostras pre-20 paradas com níveis conhecidos de ARC187 (ver figura 52). Este estudo indicou que ARC187mantém sua atividade anti-complemento em toda a duração da seguinte infusão, em níveissubstancialmente consistentes com o perfil farmacocinético descrito anteriormente.
Exemplo 51: Previsão das necessidades de dosagem humana
Necessidades de dosagem humana para prevenção, alívio ou tratamento de com-25 plicações relacionadas à cirurgia de CABG são baseadas nas seguintes suposições: primei-ro, pacientes CABG serão administrados uma única dosagem de bolo intravenoso do aptâ-mero anti-C5 antes de iniciar a cirurgia, seguido por infusão contínua poara estabelecer emanter uma concentração plasmática de estado estável de 1,5 μΜ por 24-48 horas pós ci-rurgia de CABG. As estimativas da dosagem e taxa de bolo são baseadas nos cálculos u-30 sando os parâmetros farmacocinéticos derivados dos estudos de bololV somente e bolo maisinfusão previamente descritos em macacos cinomólogos. A dosagem de bolo estimada deARC187 é 1 mg/kg, e a taxa de infusão associada é 0,0013 mg/kg/min. Para este regime debolo mais 48 horas de infusão, a necesidade de medicamento total prevista é 0,4 g paraARC187, onde massa refere-se a peso de oligonucleotídeo somente (ver coluna 7 na tabela35 da figura 53). A coluna 2 da tabela mostrada na figura 53 refere-se ao peso do grupo PEGconjugado à porção do oligonucleotídeo de ARC187, a coluna três refere-se ao peso mole-cular da porção de oligonucleotídeo de ARC187 (e será o mesmo para todos os aptâmerosaqui que compreendem ARC186 (SEQ II3 NO: 4) como sua seqüência de oligonucleotí-deos), a coluna 4 refere-se ao peso molecular de PEG 40 kDa conjugado ao ARC186 (SEQID NO: 4) por meio de química reativa de amina descrita no exemplo 3C anterior, a coluna 5refere-se ca meia vida de fase a de ARC187 em um modelo de dois compartimentos, e colu-5 na seis refere-se à meia-vida de fase a de ARC187 em um modelo de dois compartimentos.
EXEMPLO 6
Interação de aptâmeros anti-C5 e heparina/protamina
Uma aplicação prevista do aptâmero anti-C5 é como uma profilaxia para a preven-ção ou mitigação dos efeitos colaterais inflamatórios associados à cirurgia enxerto de by-10 pass da artéria coronária (CABG). Altas concentrações do anticoagulante heparina (3-5,unidades/mL ou 1 - 2 μΜ) são tipicamente administradas durante CABG para prevenirtrombose e manter potência nos componentes da bomba de bypass; reversão do efeito daheparina depois do procedimento e restauração de homeostase normal é atingida pela admi-nistração de concentrações similarmente altas de protamina (5 μΜ). Dadooperigopoten-15 ciai a pacientes de qualquer interferência na efetividade de ambos os medicamentos, foinecessário demonstrar que aptâmeros anti-C5 (1) não alteram as atividades de ambos osmedicamentos e (2) não apresentam efeitos inerentes na hemeostase que podem complicar otratamento de anticoagulação do paciente.
Heparina é um polissacarídeo sulfatado com uma carga negativa de rede e uma20 massa molecular média de aproximadamente 15 kDa que exerce um efeito inibitório eminúmeras proteases na cascata de coagulação promovendo interações com antitrombina.Protamina, um polipeptídeo carregado altamente positivo, é capaz de bloquear a atividade daheparina por meio de uma interação fracamente caracterizada que é pelo menos parcialmenteelectrostática na sua natureza. O núcleo funcional de ARC187 (SEQ ID NO: 5), tipo heparina, é25 altamente aniônico. Assim, é concebível que ARC187 pode não especificamente se ligar aos sítiosde ligação de heparina ou protamina e interfere com as atividades das moléculas. Os seguintesestudos investigaram as propriedades anticoagulantes inerentes (isto é, tipo heparina) de ARC187, os efeitos de ARC187 na função da heparina, os efeitos de ARC187 na neutralização da he-parina pela protamina, e os efeitos da protamina nas propriedades de inibição do complemento de30 ARC187.
Exemplo 6A: Efeitos in vitro de ARC187 na coagulação
Os efeitos inerentes de ARC187 (SEQ I NO: 5) na coagulabilidade do plasma foram in-vestigados usando testes clínicos padrão dos braços extrínsecos e intrínsecos da cascata de coa-gulação, o tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), respecti-35 vãmente. Da forma apresentada na figura 54, a titulação de plasma humano com citrato com con-centrações bem em excesso de dosagens projetadas (até 20 μΜ) não resultou em nenhuma mu-dança no PT1 e somente uma ligeira elevação no aPTT.Para estimar os efeitos in vitro de ARC187 na função da heparina e protamina, sanguede 3 indivíduos foi retirado em 4-5 unidades/mL de heparina, dosagens associadas aos níveis deheparina usadas na cirurgia de CABG. A coagulabilidade destas amostras foi estimada usando otempo de coágulo ativado (ACT)1 um teste de coagulação do sangue rotineiramente usado paramonitorar a atividade da heparina durante a cirurgia. Nestas concentrações de heparina, na au-sência de outros aditivos, o ACT foi significativamente prolongado de um valor de linha de base de-150 segundos para -50 0 segundos na presença de 4 U/mL de heparina ou -800 segundos napresença de 5 U/mL de heparina. A adição de 10 μΜ de ARC187 a estas amostras teve poucoefeito no tempo de coágulo, demonstrando que ARC187 não interfere com a atividade anticoagu-Iante da heparina.
O efeito anticoagulante da heparina foi prontamente neutralizado por titulação com pro-tamina até 6-8 μΜ (4 U/mL de heparina) ou 12 //M (5 U/mL de heparina). Valores de ACT na pre-sença de concentrações de heparina e neutralizantes de protamina foram essencialmente indis-tinguíveis da linha de base. Uma vez que o núcleo do ácido nucléico de ARCI87 (12 kDa) é demaior peso molecular que protamina (5 kDa), deve-se esperar que concentrações equimolares deARC187 adicionadas à protamina são suficientes para completamente reverter a atividade neutra-Iizante de protamina.
Entretanto, pré-incubação de protamina com concentrações aproximadamente equiva-lentes de ARC187 teve pouco efeito no ACT. Amostras de sangue contendo concentrações neu-tralizantes de protamina apresentaram valores similares de ACT na presença ou ausência de 10μΜ de ARC187, indicando que ARC187 tem somente um ligeiro efeito, se presente, na atividadede pró-coagulação de protamina. Estes resultados são resumidos na figura 55.
Exemplo 6B: Efeitos in vivo de ARC187 na coagulação
As interações entre a função de heparina e protamina durante administração concomi-tante de aptâmero ARC187 anti-C5 (SEQ ID NO: 5), em dosagens clínicas de heparina e dosa-gens clínicas/subclínicas/superclínicas de protamina foram investigadas para determinar se a pre-sença de concentrações plasmáticas subclínicas/superclínicas de ARC187 interferem na reversãode anticoagulação da heparina por protamina. Os resultados do estudo estão resumidos na figura56. Resumidamente, os valores de ACT na linha de base foram inafetados por 10 uM (isto é, ex-cesso molar de 10 vezes da dosagem clínica) de ARC187 em toda as dosagens de heparina tes-tadas. Similarmente, a extensão da anticoagulação por heparina foi inafetada por 10 uM deARC187. Na ausência de ARC187, a dosagem eficaz mínima de protamina foi - 30 % (dosagemclínica=100 %). Além disso, a reversão da anticoagulação da heparina por 30 % de protamina foiinafetada por excesso molar de 10 vezes da dosagem clínica (isto é, 10 uM) de ARC187. Assim, ouso de ARC187 para inibição do complemento em um ajuste clínico (por exemplo, CABG) deveser inafetado pelo uso concomitante de heparina e protamina em dosagens típicas.
Exemplo 6C: Efeito de heparina e protamina na função do anti-complemento de ARC187Os efeitos de heparina e protamina na atividade anti-complemento de ARC 187 (SEQ IDNO: 5) foram examinadas em amostras de sangue total em citrato ativado com zymosan, da for-ma descrita no exemplo 1. Logo antes da ativação por zymosan, ARC187 foi titulado nas amostrasde sangue com citrato tratadas em quatro condições: 1) nenhum tratamento (sem heparina ou5 protamina); 2) 4 U/mL de heparina; 3) 6 μΜ de protamina; 4) 4 U/mL de heparina + 6 μΜ de pro-tamina. Depois da ativação com zymosan, ativação de C5 foi quantificada por medição em ELISAde sC5b-9 no plasma (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA). Para cada condição, os resulta-dos, expressos como porcentagem de inibição de ativação de C5 em função de concentração deARC187, foram indistinguíveis no erro (ver figura 57). Em todos os casos completa inibição foi10 alcançada com 1-2 μΜ de ARC187. Assim, heparina e protamina, separadamente ou combina-das em concentrações relevantes para seu uso na cirurgia de CABG, não parecem afetar aatividade anti-complemento de ARCI87.
EXEMPLO 7
Neovascularização coroidal15 Neovascularização coroidal induzida por laser é freqüentemente usada como um
modelo para degeneração macular relacionada à idade. Ela também pode ser usada comoum modelo para retinopatia diabética. O efeito de administrar os agentes anti-C5 que, emmodalidades preferidas da presente invenção são os aptâmeros anti-complemento aqui des-critos, na prevenção, bem como na estabilização e/ou regressão de neovascularização coroi-20 dal é estimado neste modelo da forma descrita a seguir e por Krzystolik, M.G. et al., ArchOpthalmol., vol. 120, pp 338-346 (2002).
Onde prevenção de neovascularização coroidal é estimada, o agente anti-C5, parti-cularmente um aptâmero específico de C5 que se liga e inibe a função de proteína C5 docomplemento de cinomólogo, é injetado intravitrealmente em um olho de cada macaco cino-25 mólogo, enquanto que o olho de controle recebe veículo. Dias a semanas depois da injeçãode aptâmero, fotocoagulação a laser é realizada em ambos os olhos de cada macaco cino-mólogo. Os olhos de cada animal são monitorados por exame oftálmico, fotografia colorida eangiografia de fluoresceína. Onde a incidência da neovascularização coroidal (estimada an-giograficamente) é significativamente menor no agente anti-C5, particularmente um aptâmero30 C5 específico, no olho tratado que no olho de controle, supões-se que o agente específicoanti-C5 é efetivo. Onde a prevenção da neovascularização coroidal é estimada para trata-mento com uma combinação de um agente anti-C5 e um agente anti-VEGE e/ou um agenteanti-PDGF, o procedimento anterior é seguido exceto que um olho de cada é tratado com oagente anti-C5 e agente anti-VEGE e/ou agente anti PDGFe dias a semanas antes de foto-35 coagulação a laser.
Em uma outra modalidade, onde prevenção da neovascularização coroidal é esti-mada, o aptâmero anticomplemento, particularmente um aptâmero que inibe a função de umaproteína de complemento de cinomólogo, tais como C5 ou C3, é injetado intravitrealmenteem um olho de cada macaco cinomólogo, emquanto que o olho de controle recebe veículo.Dias a semanas depois da injeção de aptâmero, fotocoagulação a laser é realizada em am-bos os olhos de cada macaco cinomólogo. Os olhos de cada animal são monitorados por5 exame oftálmico, fotografia colorida e angiografia de fluoresceína. Onde a incidência de ne-ovascularização coroidal (estimada angiograficamente) é significativamente menos no olhotratado com aptâmero anti-complemento que no olho de controle, supõe-se que o aptâmeroanticomplemento é efetivo. Onde prevenção de neovascularização coroidal é estimada paratratamento com uma combinação de um aptâmero anticomplemento e um agente anti-VEGE10 e/ou um agente anti-PDGF, o procedimento anterior é seguido, exceto que um olho de cadaanimal é tratado com o aptâmero anti complemento e agente anti-VEGE e/ou agente anti-PDGF dias a semanas antes da fotocoagulação a laser.
Onde estabilização e/ou regressão de neovascularização coroidal é estimada, foto-coagulação a laser é realizada em ambos os olhos de cada macaco cinomólogo. Dias a se-15 manas depois da fotocoagulação a laser, um agente anti-C5 da presente invenção é admi-nistrado por injeção intravitreal a um olho de cada animal, enquanto que o outro olho recebeveículo. Em uma modalidade este agente anti-C5 é um aptâmero anticomplemento. Em umamodalidade preferida, o dito aptâmero anti-complemento é um aptâmero que inibe C5 e / ouC3. Os ohos de cada animal são monitorados por exame oftálmico, fotografia colorida e an-20 giografia de fluoresceína. Onde a incidência de neovascularização coroidal (estimada angio-graficamente) é a mesma e/ou significativamente menor no olho tratado com agente anti-C5,particularmente tratado com aptâmero C5, que no olho de controle, supõe-se que o aptâme-ro é efetivo para estabilização e/ou regressão respectivamente. Onde estabilização e/ou re-gressão de neovascularização coroidal é estimada para tratamento com uma combinação de25 um agente anti-C5 e um agente anti-VEGE e/ou um agente anti-PDGF, o procedimento an-terior é seguido, exceto que um olho de cada animal é tratado com o anti-C5 agente e agen-te anti-VEGE e/ou agente anti PDGFe dias a semanas depois da fotocoagulação a laser.
Similar à estimativa do macaco cinomólogo descrita imediatamente antes, a eficáciade um agente anti-C5s e aptâmeros anti-complemento na prevenção, estabilização e/ou30 regressão da neovascularização coroidal sozinho ou em combinação com um agente anti-VEGFe e/ou agente anti-PDGF pode ser estimada em camundongos ou outras espéciesusando um agente anti-C5 que modula proteína do complemento C5 de murino, ou proteínado complemento C5 de outras espécies. Em uma outra modalidade, similar à mesma estima-tiva de macaco cinomólogo descrita antes, a eficácia de um aptâmero anticomplemento na35 prevenção, estabilização e/ou regressão de neovascularização coroidal sozinha ou em com-binação com um agente anti-VEGE e/ou agente anti-PDGFe pode ser estimada em camun-dongos ou outras espécies usando um aptâmero anticomplemento que modula, particular-mente inibe, a proteína do complemento de murino de interesse, ou proteína do complementode outras espécies de interessei. Ver, por exemplo, Bora et al., Journal of Inmaunolgy, 174:491-497 (2005).
EXEMPLO 8
Modelo murino de degeneração da retina para AMD não exudativa
Um modelo de camundongo com uma mutação tanto na proteína 1 quimioatrativade miócito (MCP-1 ou Ccl-2) quanto seu receptor de quimiocina C-C cognato (Ccr-2) imitasintomas de degeneração macular relacionada à idade humana, incluindo desenvolvimentode gânglios, atrofia fotorreceptora e neovasoularização coroidal. Ver Ambati et al, NatureMedicine. 2003 Nov 2003; 9(11): 1390-7. Este modelo de camundongo apresenta acúmulosignificativo de C5 no epitélio do pigmento retinal e coroidal, indicando que complemento éexpresso em associação com doença. Adicionalmente, CD46 (uma regulador do comple-mento ligado à membrana), vitronectina (um regulador de MAC) e C3c (um produto de de-gradação de C3b) estão presentes no epitélio do pigmento retinal e/ou coroidal sugerindoque a ativação do complemento está ocorrendo.
Onde estabilização e/ou regressão da degeneração retinal é estimada, o aptâmeroanticomplemento da invenção, um aptâmero que inibe C5 ou C3 de murino, por exemplo, éadministrado por injeção intravitreal a um olho de cada animal, enquanto que o outro olhorecebe veículo. Os olhos de cada animal são monitorados para degeneração retinal, incluin-do acúmulo de produto do complementono RPE/coróide, desencolcimento de eletrofisiologiaanormal e/ou atrofia localizada de RPE e/ou fotorreceptores, e incidência de neovasculari-zação coroidal. Onde a incidência de degeneração retinal é a mesma e/ou significativamentemenor no olho tratado com aptâmero anticomplemento, particularmente tratado com aptâmeroanti-C5 ou anti-C3, que no olho de controle, supõe-se que o aptâmero é efetivo para estabili-zação e/ou regressão respectivamente.
A invenção tendo agora sido descrita a título de descrição e exemplo, os versadosna tecnologia perceberão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modali-dades e que a descrição e exemplos anteriores são para propósitos de ilustração e não delimitação das seguintes reivindicações.

Claims (88)

1.) Método de tratar, estabilizar e/ou prevenir uma desordem ocular mediada pelocomplemento, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende a etapa de admi-nistrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um aptâmero anti-complemento a umsujeito em necessidade deste.
2.) Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem ocular a ser tratada é uma desordem de neurovascularização ocular.
3.) Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem ocular a ser tratada é degeneração macular.
4.) Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem ocular a ser tratada é retinopatia diabética.
5.) Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem ocular mediada pelo complemento a ser tratada é degeneração macular relacio-nada à idade.
6.) Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem ocular mediada pelo complemento a ser tratada é selecionada do grupo queconsiste em: conjuntivite. inflamatória, incluindo conjuntivite alérgica e papilar gigante, edemamacular, uveíte, endoftalmite, esclerite, úlceras corneais, síndrome do olho seco, glaucoma,doença retinal isquêmica, rejeição de transplante de córnea, complicações relacionadas acirurgia intraocular, tais como implante de lentes intraoculares e inflamação associada à ci-rurgia de catarata, doença de Behcet, doença de Stargardt, vasculite do complexo imune,doença de Fuch, doença de Vogt-Koyanagi-Há, fibrose sub-retinal, queratite, infla-mação cítreo-retinal, infestação/migração parasítica ocular, retinite pigmentosa, retinite decitomegalovírus e inflamação coroidal.
7.) Método de estabilizar uma desordem de neurovascularização ocular mediada pe-lo complemento, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar um aptâmeroanti-complemento a um sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente para es-tabilizar a desordem de neurovascularização ocular mediada pelo complemento.
8.) Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem de neurovascularização ocular a ser estabilizada é degeneração macular.
9.) Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que adesordem de neurovascularização ocular a ser estabilizada é retinopatia diabética.
10.) Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que adegeneração macular a ser estabilizada é degeneração macular relacionada à idade.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que adegeneração macular a ser estabilizada é AMD tipo exudativa.
12.) Método, de acordo com a reivindicação 7, 8, 9, 10 ou 11, CARACTERIZADO pe-lo fato de que o aptâmero anti-complemento é administrado em uma quantidade suficientepara manter pelo menos o mesmo nível de acuidade visual do sujeito comparado ao nível eacuidade visual do sujeito mediante a administração do aptâmero anti-complemento.
13. Método, de acordo com a reivindicação 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, CARACTERIZADOpelo fato de que o aptâmero anti-complemento é administrado em uma quantidade suficientepara manter cerca do mesmo nível de densidade do vaso retinal do sujeito que o do sujeitomediante a administração do aptâmero anti-complemento.
14. Método de tratar uma desordem de neurovascularização ocular mediada pelocomplemento, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar um aptâmeroanti-complemento a um sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente para re-duzir um sintoma da desordem de neurovascularização ocular mediada pelo complemento.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular a ser tratada é degeneração macular.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de quea degeneração macular a ser tratada é degeneração macular relacionada à idade.
17. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de quea degeneração macular a ser tratada é degeneração macular relacionada à idade tipo exuda-tiva.
18. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular a ser tratada é retinopatia diabética.
19. Método, de acordo com a reivindicação 14, 15, 16, 17 ou 18, CARACTERIZADOpelo fato de que o aptâmero anti-complemento é administrado em uma quantidade suficientepara melhorar o nível de acuidade visual no sujeito com relação ao nível de acuidade visual dosujeito mediante administração do aptâmero anti-complemento.
20. Método, de acordo com a reivindicação 14, 15, 16, 17, 18 ou 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é administrado em umaquantidade suficiente para reduzir o nível de densidade do vaso retinal no sujeito com rela-ção ao nível de densidade do vaso retinal do sujeito mediante administração do aptâmeroanti-complemento.
21. Método de prevenir uma desordem de neurovascularização ocular mediada pe-lo complemento clínica em um sujeito, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ad-ministrar um aptâmero anti-complemento a um sujeito em necessidade deste, em uma quan-tidade suficiente para prevenir um sintoma clínico da desordem de neurovascularização ocu-lar mediada pelo complemento.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular sintoma a ser prevenida é um sintoma de dege-neração macular.
23.) Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de queo sintoma de degeneração macular a ser prevenido é um sintoma de degeneração macularrelacionada à idade.
24.) Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de queo sintoma de degeneração macular relacionada à idade a ser prevenido é um sitoma de de-generação macular relacionada à idade tipo exudativa.
25.) Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de queo sintoma de desordem de neurovascularização ocular a ser prevenido é um sintoma deretinopatia diabética.
26.) Método, de acordo com a reivindicação 21, 22, 23, 24, 25 ou 26,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de identificar se osujeito está em risco de desordem de neurovascularização ocular mediada pelo complementoclínica.
27.) Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de quea etapa de identificação compreende detectar a presença de drusa no sujeito e não detectarnenhuma perda clínica de acuidade visual.
28.) Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de queadicionalmente compreende a etapa de identificar o sujeito em risco detectando uma varia-ção no fator H do complemento do sujeito com relação ao fator H do complemento tipo selvagem.
29.) Método, de acordo com a reivindicação 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é administrado em umaquantidade suficiente para prevenir a perda de acuidade visual em um sujeito com relação aonível de acuidade visual do sujeito mediante administração do aptâmero anti-complemento.
30.) Método, de acordo com a reivindicação 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é administrado em umaquantidade suficiente para prevenir um aumento substancial no nível de densidade do vasoretinal no sujeito com relação ao nível de densidade do vaso retinal do sujeito mediante admi-nistração de anti-complemento.
31.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que inibeum complemento alvo selecionado do grupo que consiste em: um componente de um cami-nho de complemento enzimático e um componente de um caminho de complemento nãoenzimático.
32.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que inibeum complemento alvo em que o complemento alvo é um componente do caminho que atacaa membrana.
33.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que inibeum complemento alvo selecionado do grupo que consiste em: um componente do caminho docomplemento clássico, um componente do caminho do complemento alternativo, e um com-ponente do caminho de lecitina.
34.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que seliga e inibe um componente do complemento alvo selecionado do grupo que consiste em: re-ceptor C1, C1q, C1r, C1s, C2, receptor C3, C3a, C3a, C4, C5, C5a, C5a, C5b, C6, C7, C8,C9, Fator B, Fator D, properdina, Mannan Binding Lectin (MBL)1 protease I de serina associa-da a MBL e protease 2 de serina associada a MBL.
35.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o componente do complemento alvo é uma proteínaalvo humana.
36.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que inibe C5.
37.) Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de queo aptâmero de ligação a C5 é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOS 1 a 69,- 75, 76, 81, 91, 95 e 96.
38.) Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de queo aptâmero de ligação a C5 é ARC 186, ARC 187, ARCI905.
39.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 35,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que seliga e inibe C3.
40.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 35,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que seliga e inibe C1q.
41.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 35,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é um aptâmero que seliga e inibe ρ fator B ou fator D.
42.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é distribuído por admi-nistração ocular.
43.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é distribuído por admi-nistração intravitreal.
44.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento é distribuído por admi-nistração pen-ocular.
45.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o aptâmero anti-complemento a ser administrado estácompreendido em uma formulação de depósito.
46.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é humano.
47.) Método de tratar uma desordem ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9,CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende a etapa de administrar um agen-te anti-C5 a um sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente para tratar adesordem ocular.
48.) Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fatode que a desordem ocular a ser tratada é uma desordem de neurovascularização ocular.
49.) Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem ocular a ser tratada é degeneração macular ou retinopatia diabética.
50.) Método, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de quea degeneração macular relacionada à idade a ser tratada é AMID tipo exudativa.
51.) Método de estabilizar uma desordem de neurovascularização ocular mediadapor C5, C5a e/ou C5b-9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar umagente anti-C5 a um sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente para esta-bilizar a desordem de neurovascularização ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9.
52.) Método, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular a ser estabilizada é degeneração macular.
53.) Método, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de quea degeneração macular a ser tratada é AlV117 tipo exudativa.
54.) Método, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular a ser estabilizada é retinopatia diabética.
55.) Método, de acordo com a reivindicação 51, 52, 53 ou 54, CARACTERIZADOpelo fato de que o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente para manterpelo menos o mesmo nível de acuidade visual do sujeito comparado ao nível e acuidadevisual do sujeito mediante a administração do agente anti-C5.
56.) Método, de acordo com a reivindicação 51, 52, 53 ou 54, CARACTERIZADOpelo fato de que o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente para mantero mesmo nível de densidade do vaso retinal do sujeito que o do sujeito mediante adminis-tração.
57.) Método de tratar uma desordem de neurovascularização ocular mediada porC5, C5a e/ou C5b-9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar um agen-te anti-C5 a um sujeito em necessidade deste em uma quantidade suficiente para reduzir umsintoma da desordem de neurovascularização ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9.
58.) Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular a ser tratada é degeneração macular.
59.) Método, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de quea degeneração macular a ser tratada é AMID tipo exudativa.
60.) Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular a ser tratada é retinopatia diabética.
61.) Método, de acordo com a reivindicação 57, 58, 59, ou 60, CARACTERIZADO pe-lo fato de que o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente para melhorar onível de acuidade visual no sujeito com relação ao nível de acuidade visual do sujeito median-te administração do agente ânti-C5.
62.) Método, de acordo com a reivindicação 57, 58, 59, ou 60, CARACTERIZADO pe-lo fato de que o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir onível de densidade do vaso retinal no sujeito com relação ao nível de densidade do vaso reti-nal do sujeito mediante administração do agente anti-C5.
63.) Método de prevenir uma desordem clínica de neurovascularização ocular media-da por C5, C5a e/ou C5b-9 em um sujeito, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeadministrar um agente anti-C5 a um sujeito, o método compreendendo a etapa de administrar oagente anti-C5 ao sujeito em uma quantidade suficiente para prevenir um sintoma clínico dadesordem de neurovascularização ocular mediada por C5, C5a e/ou C5b-9.
64.) Método, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de quea desordem de neurovascularização ocular sintoma a ser prevenida é um sintoma de degene-ração macular.
65.) Método, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADO pelo fato de queo sintoma de degeneração macular relacionada à idade a ser prevenido é um sintoma de AMIItipo exudativo.
66.) Método, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de queo sintoma da desordem de neurovascularização ocular a ser prevenido é um sintoma de reti-nopatia diabética.
67.) Método, de acordo com a reivindicação 63, 64, ou 65, CARACTERIZADO pelofato de que o sujeito está em risco de desenvolver a desordem de neurovascularização ocular.
68.) Método, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADO pelo fato de queadicionalmente compreende a etapa de identificar o sujeito em risco detectando a presença dedrusa no sujeito e não detectando nenhuma perda clínica de acuidade visual.
69.) Método, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, CARACTERIZADO pelo fatode que adicionalmente compreende a etapa de identificar o sujeito em risco detectando umavariação no fator H do complemento do sujeito.
70.) Método, de acordo com a reivindicação 63, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 é administrado em uma quantidade sufi-ciente para prevenir a perda de acuidade visual em um sujeito com relação ao nível de acui-dade visual do sujeito mediante administração do agente anti-C5.
71.) Método, de acordo com a reivindicação 63, 64, 65, 66, 67, 68 ou 69,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 é administrado em uma quantidadesuficiente para prevenir um aumento substancial no nível de densidade do vaso retinal nosujeito com relação ao nível de densidade do vaso retinal do sujeito mediante administraçãodo agente anti-C5.
72.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, 47 a 71,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de administrar aosujeito um agente anti-VEGE.
73.) Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de queo agente anti-VEGE é selecionado do grupo que consiste em: uma molécula de ácido nu-cléico, um aptâmero, uma molécula antisentido, uma molécula de RNAi, uma proteína, umpeptídeo, um peptídeo cíclico, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um po-límero, e uma molécula pequena.
74.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, 47 a 73,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende a etapa de administrar aosujeito são agente anti PDGF.
75.) Método, de acordo com a reivindicação 74, CARACTERIZADO pelo fato de queo agente anti-PDGF é selecionado do grupo que consiste em: uma molécula de ácido nu-cléico, um aptâmero, uma molécula antisentido, uma molécula de RNAi, uma proteína, umpeptídeo, um peptídeo cíclico, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um açúcar, um polí-mero, e uma molécula pequena.
76.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 75,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 é selecionado do grupo que consisteem: uma molécula de ácido nucléico, um aptâmero, uma molécula antisentido, uma molécu-la de RNAi, uma proteína, um peptídeo, um peptídeo cíclico, um anticorpo ou fragmento deanticorpo, um açúcar, um polímero, e uma molécula pequena.
77.) Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 76,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 é um Aptâmero específico de C5.
78.) Método, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de queo aptâmero específico de C5 é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs 1-67,-75-81 e 88-98.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADO pelo fato de queo aptâmero específico de C5 é SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 67.
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 79,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 a ser administrado é um promedica-mento.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 80,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-VEGF é um promedicamento.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 81,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-PDGF é um promedicamento.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 83,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende administrar um agenteanti-vascular.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de queo agente anti-vascular é um derivado de porfirina.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, CARACTERIZADO pelo fato de queo método adicionalmente compreende a etapa de ativar o derivado de porfirina com luz delaser.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 85,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 é distribuído por administração ocular.
87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a 86,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-C5 é distribuído por administração intravi-treal.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 47 a-87, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é humano.
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