ES2842105T3 - Polipéptidos estables que se unen a C5 de complemento humano - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido capaz de unirse a componente (C5) de complemento humano, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos: [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q donde, de forma independiente unos de otros, [BM] es una estructura de unión a C5 que comprende la secuencia de aminoácidos EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35; donde, de forma independiente unos de otros, X9 se selecciona entre H, Q, S, T y V; X10 se selecciona entre I, L, M y V; X11 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y; X13 se selecciona entre N y W; X14 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T; X18 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y; X23 se selecciona entre N y T; X24 se selecciona entre I, L y V; X25 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T; X28 se selecciona entre I, L y V; X32 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T; X33 se selecciona entre K y S; y X35 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; [L2] se selecciona entre DDPS y RQPE; X42 se selecciona entre A y S; X43 se selecciona entre N y E; X46 se selecciona entre A, S y C; X52 se selecciona entre E, N y S; X53 se selecciona entre D, E y S, siempre que X53 no sea D cuando X52 es N; y X54 se selecciona entre A y S.
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptidos estables que se unen a C5 de complemento humano
Campo técnico
La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen a componente 5 (C5) de complemento humano y al uso de dichos polipéptidos en terapia.
Antecedentes de la técnica
La proteína C5 de complemento humano es un componente central del sistema de complemento; una parte clave del sistema inmune innato. El sistema de complemento es un sistema de vigilancia inmune intrincado con numerosas tareas en diversos procesos, estrechamente controlados. Funciona como una primera línea de defensa del hospedante contra infecciones de otros organismos, y también en la discriminación de tejidos de hospedante sanos de residuos celulares y células apoptóticas y necróticas. Adicionalmente, está implicado en la eliminación de complejos inmunes, la regulación de la respuesta inmune adaptativa, la promoción de la regeneración de tejidos, la angiogénesis, la movilización de células madre y el desarrollo del sistema nervioso central (Woodruff et al. Mol Immunol 2011,48 (14): 1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11 (9): 785-795). Cualquier acción, por ejemplo, una activación errónea o no restringida o una regulación insuficiente, que altere el delicado equilibrio de la activación y regulación de complemento puede conducir a afecciones patológicas que incluyen el auto-ataque de células del hospedante, que conduce a un daño extenso a los tejidos.
El sistema de complemento consiste en aproximadamente 30 proteínas. Existen tres rutas para iniciar el complemento; la ruta clásica que emplea C1q para reconocer complejos inmunes sobre la superficie de las células; la ruta de lectina que se inicia cuando la lectina de unión a manosa (MBL) reconoce determinados azúcares; y la ruta alternativa que es iniciada espontáneamente por la hidrólisis del factor 3 (C3) de complemento, un proceso suprimido por determinadas moléculas de la superficie celular en mamíferos no presentes en los patógenos invasores. La ruta alternativa también actúa como bucle de amplificación para el sistema de complemento. Las tres rutas convergen en el nivel de C3. La división de C3 en C3a y C3b conduce a la formación de una convertasa que a su vez divide el factor 5 (C5) de complemento en C5a y C5b. C5a es un atractor muy potente de varias células inmunes mientras que C5b oligomeriza con C6-9 para formar un poro conocido como el complejo de ataca a membrana (MAC) o a veces complejo de complemento terminal (TCC). La activación del sistema de complemento conduce a una serie de mecanismos con el propósito de neutralizar el patógeno; la formación de MAC sobre la superficie de una célula tal como una bacteria invasora conduce a la lisis, la deposición de productos de división de C3 y C4, C3b y C4b, ayuda a la opsonización que conduce a la fagocitosis del patógeno por parte de los macrófagos y anafilatoxinas tales como C3a y C5a atraen a monocitos y neutrófilos al sitio de activación, regula al alza marcadores que conducen a un aumento de la susceptibilidad inmunológica y a la liberación de citocinas.
C5 es una glicoproteína de 190 kDa compuesta de 2 cadenas de polipéptido enlazadas mediante disulfuro, alfa y beta, con una masa molecular de 115 y 75 kDa, respectivamente (Tack et al. Biochem 1979, 18: 1490-1497). Haviland et al. (J Immun 1991, 146: 362-368) construyeron la secuencia de ADNc completa de pro-C5 de complemento humano, que se predice que codifica una pro-molécula de 1.676 aminoácidos que contiene un péptido líder de 18 aminoácidos y un ligando de 4 aminoácidos que separa las cadenas beta y alfa (SEQ ID NO: 251). Puesto que C5 es común a todas las rutas de activación de complemento, el bloqueo de C5 detendrá la progresión de la cascada independientemente de los estímulos y de este modo evitará las propiedades negativas de la activación de complemento terminal, a la vez que deja intactas las funciones inmunoprotectoras e inmunorreguladoras de la cascada de complemento proximal.
El papel clave del sistema de complemento en la defensa contra patógenos en general lo convierte en una diana interesante para intervención farmacéutica. Esto queda enfatizado por el hecho de que muchas mutaciones o la regulación dañada de complemento están implicadas en diversas enfermedades y afecciones. Estas incluyen una susceptibilidad acrecentada a enfermedades autoinmunes tales como el lupus sistémico eritematoso (SLE), donde la deposición de complejos inmunes activa la ruta clásica (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22: 431-456). Adicionalmente, las mutaciones de las proteínas de complemento C1-C5 a menudo dan como resultado SLE o síntomas de tipo SLE. Otras enfermedades autoinmunes con una fuerte implicación del sistema de complemento son la artritis reumatoide (RA), en la que los complejos inmunes pueden activar complemento en la articulación de RA, el síndrome de Sjogren, la dermatomiositis y otras enfermedades gobernadas por autoanticuerpos tal como el síndrome de Guillain-Barré (GBS), el síndrome de Fisher (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223: 5-12), diferentes tipos de vasculitis, esclerosis sistémica, membrana de base anti-glomerular (anti-GBM) y síndrome anti-fosfolípido (APS) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34: J276-J286). Además, se ha demostrado que la inhibición de complemento es efectiva en modelos animales de afecciones diferentes tales como la periodontitis (Abe et al. J Immunol 2012, 189: 5442-5448), la curación de heridas (Cazender et al. Clin Dev Immunol 2012, publicación on-line), el crecimiento de tumores (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235) y enfermedades oculares como la uveítis y la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159: 303-314).
Los anticuerpos dirigidos a C5 de complemento humano son conocidos a partir de, p.ej., los documentos WO 95/29697; WO 02/30985 y WO 2004/007553. Eculizumab (Soliris™) es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína C5 y evita la división de C5 en C5a y C5b. Se ha demostrado que el Eculizumab es efectivo en el tratamiento de la hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH), una enfermedad rara, y que a veces supone una amenaza para la vida, de la sangre que se caracteriza por una anemia hemolítica intravascular, trombofilia y fallo de la médula ósea, y está aprobado para esta indicación. El Eculizumab también ha sido aprobado recientemente por la FDA para el tratamiento del síndrome hemolítico atípico (aHUS), una enfermedad rara, pero que supone una amenaza para la vida, provocada por la pérdida del control de la ruta de complemento alternativa, que conduce a una sobre activación manifestada como microangiopatía trombótica (TMA), que conduce a un riesgo constante de daño a órganos vitales como el riñón, el corazón y el cerebro. En aHUS, el trasplante del órgano dañado solo ayuda temporalmente al paciente, ya que el hígado continúa produciendo la forma mutada de la proteína controlante (lo más habitualmente el factor H de complemento u otras proteínas de la ruta alternativa). Una enfermedad relacionada con una patofisiología aguda transitoria es la HUS causada por infección E. coli positiva en toxina Shiga (STEC-HUS) y existen datos clínicos prometedores que sugieren la eficacia también en esta afección (Lapeyraque et al, N Engl J Med 2011, 364: 2561 -2563). Finalmente, el anticuerpo bloqueante de C5 Eculizumab ha demostrado ser eficaz en la prevención del rechazo mediado por anticuerpo (AMR) en receptores de riñones altamente incompatibles (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11: 2405-2413), y en el tratamiento de neuropatías autoinmunes tales como la neuromielitis óptica y la miastenia grave (Pittock et al. Lancet Neurol 2013, 12: 554-562; Howard et al. Muscle Nerve 2013, 48: 76-84).
Además de anticuerpos de longitud completa, en la bibliografía se describen fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), minicuerpos y aptámeros dirigidos a C5. Estos inhibidores de C5 pueden unirse a diferentes sitios (epítopos) sobre la molécula de C5 y pueden adoptar diferentes modos de acción. Por ejemplo, mientras que el Eculizumab interacciona con C5 a cierta distancia del sitio de división de convertasa, el minicuerpo Mubodina® interacciona con el sitio de división de C5. Se ha propuesto la hipótesis de que la proteína inhibidora de C5 de ürnithodoros moubata Inhibidor de Complemento (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174: 2084-2091) procedente de la garrapata blanda ürnithodoros moubata se une al extremo distal del superdominio CUB-C5d-MG8, que está cerca del sitio de división de convertasa (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7): 753-760). Al contrario que las tres proteínas mencionadas anteriormente que inhiben la división de C5, el anticuerpo monoclonal TNX-558 se une a un epítopo de C5a presente tanto en el C5 intacto como en el C5a liberado sin inhibir la división de C5. (Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2): 160-169).
Los polipéptidos de unión a C5, que comprenden una estructura de unión a C5, se describen en la Solicitud de Patente Internacional n° PCT/SE2013/050139, publicada como WO 2013/126006. En concreto, WO 2013/126006 describe una estructura de unión a C5, BM, que consiste en la secuencia de aminoácidos
EX2X3X4A XsX/ EID X11 LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D,
donde, independientemente unos de otros,
X2 se selecciona entre H, Q, S, T y V;
X3 se selecciona entre I, L, M y V;
X4 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X6 se selecciona entre N y W;
X7 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X11 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X16 se selecciona entre N y T;
X17 se selecciona entre I, L y V;
X18 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X21 se selecciona entre I, L y V;
X25 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T;
X26 se selecciona entre K y S; y
X28 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y.
Los ejemplos de estructuras de unión a C5 específicos, como se ha discutido previamente en el documento WO 2013/126006, se muestran en las SEQ ID NO: 1 -248 en la presente solicitud de patente.
A partir del documento WO 2013/126006 se sabe que otros péptidos y polipéptidos pueden mejorar la estabilización de los polipéptidos de unión a C5. Un ejemplo de dicho polipéptido es el dominio de unión a albúmina (ABD) mostrado en la SEQ ID NO: 250 en la presente descripción. Otros ejemplos de dominios de unión de albúmina adecuados se describen en los documentos WO 2009/016043 y WO 2012/004384. Un polipéptido extendido de ABD se une a albúmina de suero in vivo, y se beneficia de su mayor vida media, lo que aumenta la vida media neta del propio polipéptido (véase, p.ej., WO 91/01743).
La provisión continuada de agentes con actividad bloqueante de C5 comparable sigue siendo objeto de un interés sustancial dentro del campo. En particular, existe una necesidad continuada de moléculas que eviten la cascada de complemento terminal, así como la formación de la molécula pro-inflamatoria C5a. También es de gran interés una provisión de usos de dichas moléculas en el tratamiento de una enfermedad.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: ilustra un gel de SDS-PAGE en el que las bandas representan el compuesto de unión a C5 PSI0242 (SEQ ID NO: 249) (0) antes del test de estabilidad; y (2w) después del test de estabilidad de 2 semanas.
Figura 2: es un cromatograma de HPLC de fase inversa de PSI0242 (SEQ ID NO: 249) antes del test de estabilidad (línea continua) y después del test de estabilidad de 2 semanas (línea discontinua).
Figura 3: ilustra un gel de SDS-PAGE donde la primera banda contiene el marcador de tamaño SeeBlue 2P y las bandas representan (0) las muestras iniciales; y (2w) las muestras después del test de estabilidad de 2 semanas. Fig. 3A: SEQ ID NO: 249; Fig. 3B: SEQ ID NO: 261; Fig. 3C: SEQ ID NO: 262; Fig. 3D: SEQ ID NO: 264.
Figura 4: es un cromatograma de HPLC de fase inversa de un compuesto de unión a C5 (SEQ ID NO: 253) antes del test de estabilidad (línea continua) y después del test de estabilidad de 2 semanas (línea discontinua).
Figura 5: es un cromatograma de HPLC de fase inversa de un compuesto de unión a C5 (SEQ ID NO: 264) antes del test de estabilidad (línea continua) y después del test de estabilidad de 2 semanas (línea discontinua).
Figura 6A-D: muestra imágenes de geles de SDS-PAGE que comparan variantes de polipéptidos originales y modificadas (0) antes y (2w) después del ensayo de estabilidad de 2 semanas. El marcador de tamaño molecular (Mw) fue Novex® Sharp Pre-stained Protein Standard (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3,5 kDa). La Fig. 6A muestra un gel de polipéptidos de unión a HER2 donde las bandas muestran la banda 1: Mw, banda 2: (0) Z02891 (SEQ ID NO: 272), banda 3: (2w) Z02891 (SEQ ID NO: 272), banda 4: Mw, banda 5: (0) Z17341 (SEQ ID NO: 273), banda 6: (2w) Z17341 (SEQ ID NO: 273), banda 7: (0) Z17342 (SEQ ID NO: 274), banda 8: (2w) Z17342 (SEQ ID NO: 274). La Fig. 6B es un gel de polipéptidos de unión a PDGF-Rp donde las bandas muestran: banda 1: Mw, banda 2: (0) Z15805 (SEQ ID NO: 275), banda 3: (2w) Z15805 (SEQ ID NO: 275), banda 4: Mw, banda 5: (0) Z17343 (SEQ ID NO: 276), banda 6: (2w) Z17343 (SEQ ID NO: 276), banda 7: (0) Z17344 (SEQ ID NO: 277), banda 8: (2w) Z17344 (SEQ ID NO: 277). La Fig. 6C muestra un gel de polipéptidos de unión a FcRn donde las bandas muestran: banda 1: (0) Z10103 (SEQ ID NO: 278), banda 2: (2w) Z10103 (SEQ ID NO: 278), banda 3: Mw, banda 4: (0) Z17347 (SEQ ID NO: 279), banda 5: (2w) Z17347 (SEQ ID NO: 279), banda 6: (0) Z17348 (SEQ ID NO: 280), banda 7: (2w) Z17348 (SEQ ID NO: 280). Las bandas diagonales observadas en la Figura 6C son un artefacto resultante de una imprimación de un segundo gel teñido en el mismo recipiente. La Fig. 6D es un gel de polipéptidos de unión a CAIX donde las bandas muestran banda 1: Mw, banda 2: (0) Z09782 (SEQ ID NO: 281), banda 3: (2w) Z09782 (SEQ ID NO: 281), banda 4: Mw, banda 5: (0) Z17351 (SEQ ID NO: 282), banda 6: (2w) Z17351 (SEQ ID NO: 282), banda 7: (0) Z17352 (SEQ ID NO: 283), banda 8: (2w) Z17352 (SEQ ID NO: 283); banda 9: (0) Z17355 (SEQ ID NO: 284), banda 10: (2w) Z17355 (SEQ ID NO: 284), banda 11: (0) Z17357 (SEQ ID NO: 285), banda 12: (2w) Z17357 (SEQ ID NO: 285), banda 13: (0) Z17359 (SEQ ID NO: 286), banda 14: (2w) Z17359 (SEQ ID NO: 286), banda 15: (0) Z17360 (SEQ ID NO: 287), banda 16: (2w) Z17360 (SEQ ID NO: 287).
Figura 7: es una tabla que muestra las secuencias de aminoácidos de:
- ejemplos de estructuras de unión a C5 (SEQ ID NO: 1-248);
- el compuesto de unión a C5 designado como PSI0242 (SEQ ID NO: 249);
- un dominio de unión a albúmina (SEQ ID NO: 250);
- la entrada de Swiss-Prot de P01031 de C5 humana (SEQ ID NO: 251) donde la cadena a corresponde a los residuos de aminoácido 678-1676 y la cadena p corresponde a los residuos de aminoácido 19-673;
- ejemplos de polipéptidos de unión a C5 modificados (SEQ ID NO: 260, 265-267);
- ejemplos de compuestos de unión a C5 modificados (SEQ ID NO: 252-259, 261-264, 268-270);
- ejemplos de variantes de polipéptidos con alta afinidad por otras moléculas diana (SEQ ID NO: 272, 275, 278, 281);
- ejemplos de variantes de polipéptido mejorados en estabilidad con una alta afinidad por otras dianas con (SEQ ID N=: 273-274, 276-277, 279-280, 282-287).
Descripción de la invención
Se ha descubierto sorprendentemente que los polipéptidos y compuestos de unión a C5, en los que las secuencias de aminoácidos han sido modificadas en posiciones específicas, presentan una estabilidad mejorada en comparación con los polipéptidos y compuestos de unión a C5 conocidos previamente.
Por consiguiente, esta invención proporciona un polipéptido capaz de unirse a componente 5 (C5) de complemento humano, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos:
[fíM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
donde, de forma independiente unos de otros,
[BM] es una estructura de unión a C5 que comprende la secuencia de aminoácidos
EX9X10X11 A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35 ;
donde, de forma independiente unos de otros,
X9 se selecciona entre H, Q, S, T y V;
X10 se selecciona entre I, L, M y V;
X11 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X13 se selecciona entre N y W;
X14 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X18 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X23 se selecciona entre N y T;
X24 se selecciona entre I, L y V;
X25 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X28 se selecciona entre I, L y V;
X32 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T;
X33 se selecciona entre K y S; y
X35 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[L2] se selecciona entre DDPS y RQPE;
X42 se selecciona entre A y S;
X43 se selecciona entre N y E;
X46 se selecciona entre A, S y C;
X52 se selecciona entre E, N y S;
X53 se selecciona entre D, E y S, siempre que X53 no sea D cuando X52 es N;
y
X54 se selecciona entre A y S.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que la modificación o la sustitución de residuo(s) de aminoácido en determinada(s) posición(es) de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de unión a C5, tal como se describen en WO 2013/126006, mejora la estabilidad de los polipéptidos de unión a C5 a la vez que la actividad biológica, tal como la afinidad de unión a componente 5 (C5) de complemento humano y la inhibición de la función de ruta de complemento, es mantenida esencialmente. Por tanto, la actividad biológica del polipéptido de unión a C5 modificado es comparable a la actividad biológica de los polipéptidos de unión a C5 conocidos. La evaluación de la estabilidad de los polipéptidos de unión a C5 de la presente invención demuestra que la sustitución en X52, de N a E o S, o en X53, de D a E o S, mejora la estabilidad. Además, se ha descubierto que la sustitución de aminoácido específica en [L2] puede promover de forma independiente la estabilidad.
Los términos “unión a C5” y “afinidad de unión a C5” tal como se usan en la presente especificación se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede ser evaluada por ejemplo mediante el uso de una tecnología de resonancia de
plasmón superficial, tal como un instrumento Biacore (GE Healthcare). La afinidad de unión a C5, p.ej., puede evaluarse en un experimento en el que se inmoviliza C5 sobre un chip sensor de un instrumento Biacore, y la muestra que contiene el polipéptido que va a ser evaluado se hace pasar sobre el chip. Alternativamente, el polipéptido a evaluar se inmoviliza sobre un chip sensor del instrumento, y una muestra que contiene C5, o un fragmento del mismo, se hace pasar sobre el chip. El especialista en la técnica puede interpretar entonces los resultados obtenidos en dichos experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la unión del polipéptido a C5. Si se desea una medida cuantitativa, por ejemplo, para determinar la constante aparente de equilibrio de disociación Kd de la interacción, también se puede usar resonancia de plasmón superficial. Los valores de unión pueden definirse por ejemplo en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). C5 es inmovilizado sobre un chip sensor de la medida, y las muestras de polipéptido cuya afinidad se va a determinar son preparadas mediante dilución en serie y son inyectadas sobre el chip. A continuación, se pueden calcular los valores de KD a partir de los resultados que usan por ejemplo el modelo de unión de Langmuir 1:1 del software BIAevaluation proporcionado por el fabricante del instrumento. El C5, o fragmento del mismo, usado en la determinación de Kd puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 251. En la presente memoria se proporcionan ejemplos de cómo se puede evaluar la afinidad de unión a C5, ver los Ejemplos 3 y 5.
En una forma preferida de la invención, dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos:
AEAKYAK-[fíMHL2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
donde, de forma independiente unos de otros,
[BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53 y X54 son como se ha definido anteriormente.
Tal como se ha descrito previamente en WO 2013/126006, el polipéptido de unión a C5 según la invención puede formar parte de un dominio de proteína de ramo de triple hélice. Dicha estructura de unión a C5 [BM] puede formar parte esencialmente de dos hélices alfa, con un bucle de interconexión, dentro de dicho ramo de triple hélice. Un segundo bucle de interconexión, referido en la presente memoria como [L2], conecta la estructura de unión a C5 con la tercera hélice alfa, referida como “cadena principal”.
En una realización, la estructura de unión a C5 [BM] es esencialmente como se describe en WO 2013/126006. Sin embargo, de acuerdo a la presente invención la estructura de unión a C5 preferiblemente consiste en 28, en lugar de 29, aminoácidos, y puede además portar otras sustituciones de aminoácido.
En una realización preferida, la estructura de unión a C5 [BM] es esencialmente como se describe en WO 2013/126006. Dicha [BM] es por consiguiente un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos:
EX9X10X11 A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35 ;
donde, de forma independiente unos de otros,
X9 se selecciona entre H, Q, S, T y V;
X10 se selecciona entre I, L, M y V;
X11 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X13 se selecciona entre N y W;
X14 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X18 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X23 se selecciona entre N y T;
X24 se selecciona entre I, L y V;
X25 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X28 se selecciona entre I, L y V;
X32 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T;
X33 se selecciona entre K y S; y
X35 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y.
En un aspecto preferido adicional, [BM] comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 1 -28 de las SEQ ID NOs: 1 -248. Más preferiblemente, [BM] comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-28 de la SEQ ID NO: 1.
En un aspecto adicional, el polipéptido de unión a C5 según la invención comprende la secuencia de aminoácidos:
A E A K Y A K E X 9X 10X 11A X 13X 14E I D X 18L P N L X 23X 24X 25Q W X 28A F I X 32X 33L
X 35 - [ L 2 ] - Q S X 42 X 43 L L X 46 E A K K L X 52 X 53X 54 Q A P ;
donde, de forma independiente unos de otros,
X9 se selecciona entre H, Q, S, T y V;
X10 se selecciona entre I, L, M y V;
X11 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X13 se selecciona entre N y W;
X14 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X18 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X23 se selecciona entre N y T;
X24 se selecciona entre I, L y V;
X25 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X28 se selecciona entre I, L y V;
X32 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T;
X33 se selecciona entre K y S;
X35 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[L2] se selecciona entre DDPS y RQPE;
X42 se selecciona entre A y S;
X43 se selecciona entre N y E;
X46 se selecciona entre A, S y C;
X52 se selecciona entre E, N y S;
X53 se selecciona entre D, E y S, siempre que X53 no sea D cuando X52 es N;
y
X54 se selecciona entre A y S.
En las formas preferidas de la invención, se cumple al menos una de las siguientes dieciocho, opcionalmente diecinueve, condiciones:
X9 es V,
X10 es L,
X11 es E,
X13 es W,
X14 es D,
opcionalmente X17 es D,
X18 es R,
X23 es T,
X24 es I,
X25 es E,
X28 es L,
X32 es N,
X33 es K,
X35 es D,
[L2] es DDPS,
X42 es S,
X43 es E,
X46 es S,
X54 es S.
Más preferiblemente, se cumplen al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho o diecinueve de las anteriores condiciones.
En una realización, X52 y X53 se seleccionan de forma independiente entre E y S. Preferiblemente, (a) X52 es S y X53 es E, o (b) X52 es E y X53 es S.
En una realización, X52 es S y X53 es D.
En otra realización, X52 es N y X53 es E.
En un aspecto adicional, el polipéptido según la invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, o SEQ ID NO: 267.
En un aspecto adicional, se proporciona un compuesto capaz de unirse a C5, comprendiendo dicho compuesto: a. al menos un polipéptido de unión a C5 como se ha definido anteriormente;
b. al menos un dominio de unión a albúmina de proteína G de estreptococo, o un derivado de la misma; y c. opcionalmente, al menos un grupo funcional de unión para unir dicho al menos un dominio de unión de albúmina o derivado de la misma al extremo C o N de dicho al menos un polipéptido de unión a C5.
Preferiblemente, dicho dominio de unión a albúmina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 250.
Preferiblemente, dicho grupo funcional de unión es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KVX60GS, donde X60 se selecciona entre D, E y A. Cuando X60 es D, un compuesto preferido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 253. Cuando X60 es E, los compuestos preferidos comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 269 o SEQ ID NO: 270. Cuando X60 es A, un compuesto preferido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 262. En las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente de los compuestos de unión a C5, los residuos de aminoácido 1-57 representan la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de unión a C5, los residuos 58-62 representan la secuencia de aminoácidos de un ligando, y los residuos 63-108 representan la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión de albúmina.
En una realización, el grupo funcional de unión está ausente.
Tal como se ha discutido anteriormente, los polipéptidos de unión a C5 según la invención incluyen aquellos en los que X52 y X53 se seleccionan de forma independiente entre E y S. Específicamente, los compuestos según la invención pueden derivarse de PSI0242 (SEQ ID NO: 249) pero tienen modificaciones en al menos una de las posiciones 52, 53 y 60. Por ejemplo, tal como se muestra en la Fig. 7 y en el listado de secuencias, el compuesto preferido designado como PSI0378 (SEQ ID NO: 261) porta las sustituciones de aminoácido N52S, D53E y D60E; el compuesto preferido designado como PSI0379 (SEQ ID NO: 262) porta las sustituciones de aminoácido N52s , D53E y D60A; el compuesto preferido designado como PSI0381 (SEQ ID NO: 263) porta las sustituciones de aminoácido N52E, D53S y D60E; y el compuesto preferido designado como PSI0383 (SEQ ID NO: 264) porta las sustituciones de aminoácido N52S, D53E y D60E. Además, la SEQ ID NO: 264 también porta sustituciones en el bucle [L2], a saber, D36R, D37Q y S39E. Además, el compuesto preferido designado como PSI0403 (SEQ ID NO: 269) porta las sustituciones de aminoácido D53E y D60E, y el compuesto preferido designado como PSI0404 (SEQ ID NO: 270) porta las sustituciones de aminoácido N52S y D60E.
Como se ha indicado anteriormente, los inventores han descubierto de forma sorprendente que las sustituciones de aminoácidos en determinadas posiciones de la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de unión a C5, como se describe en WO 2013/126006, pueden mejorar la estabilidad. Dichas sustituciones mejoran la estabilidad de los compuestos de unión a C5, a la vez que se mantiene la actividad biológica, tal como la capacidad de unión a C5 y la
inhibición de hemolisis in vitro. La evaluación de estabilidad de los compuestos de unión a C5 de la presente invención demuestra que, por ejemplo, cada uno de N52S (X52) y D53E (X53) (SEQ ID NO: 253) individualmente, así como la eliminación de D60 (X60) (SEQ ID NO: 259 que carece de grupo funcional de unión), mejoran la estabilidad. La combinación de las sustituciones N52S, D53E y D60E o D60A mejora adicionalmente la estabilidad (SEQ ID NO: 261 y SEQ ID NO: 262). Cada una de las sustituciones combinadas de N52S y D60E (SEQ ID NO: 270) y D53E y D60E (SEQ ID NO: 269) se ha observado de forma similar que mejoran la estabilidad. Esto indica que cada una de las sustituciones de aminoácidos mencionadas está implicada en la mejora de la estabilidad del polipéptido, y por tanto que cada una de dichas sustituciones proporcionará polipéptidos y compuestos de unión a C5 más estabilizados en comparación con los polipéptidos y compuestos de unión a C5 conocidos previamente.
Sin embargo, el especialista en la técnica será capaz de identificar polipéptidos y/o compuestos que presentan modificaciones en al menos una de las posiciones 52, 53 y 60, y/o en el bucle [L2], pero que también portan modificaciones adicionales como sustituciones, pequeñas eliminaciones, inserciones o inversiones, y que aun así presentan sustancialmente las actividades biológicas descritas y una estabilidad mejorada. Además, un polipéptido y/o compuesto de unión a C5 según la invención podría comprender otros aminoácidos C terminales y/o N terminales que mejoren la producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, el acoplamiento o la detección del polipéptido. Se ha descubierto que la eliminación de D60 o una sustitución de aminoácido en la posición 60 de la SEQ ID NO: 249 solo mejora la estabilidad de los compuestos de unión a C5 de la invención en comparación con los compuestos de unión a C5 previamente conocidos. Preferiblemente, el grupo funcional de unión es KVEGS (X60=E) mientras que X52X53 puede ser ND, y un ejemplo de un compuesto preferido que porta dicho grupo funcional de unión es PSI0410 (SEQ ID NO: 268). En otra realización preferida, D60 y el grupo funcional de unión entero están ausentes y un ejemplo de dicho compuesto es el compuesto preferido designado PSI0369 (SEQ ID NO: 259).
Se ha descubierto que las sustituciones de aminoácido específicas del bucle [L2] mejoran la estabilidad de los compuestos de unión a C5 (p.ej., SEQ ID NO: 252) de la invención en comparación con los compuestos de unión a C5 conocidos.
En la invención se incluyen polipéptidos y compuestos de unión a C5 como los descritos anteriormente, para uso en terapia. En particular, los polipéptidos y compuestos de unión a C5 según la invención son útiles en métodos para el tratamiento y/o la profilaxis de afecciones relacionadas con C5, tal como enfermedades inflamatorias; enfermedades autoinmunes; enfermedades infecciosas; enfermedades cardiovasculares; trastornos neurodegenerativos; lesión de injerto; enfermedades oculares; enfermedades renales; enfermedades pulmonares; enfermedades hematológicas tales como hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH); enfermedades alérgicas y enfermedades dermatológicas. En los métodos de tratamiento y/o profilaxis, dicho polipéptido o compuesto de unión a C5 puede ser administrado preferiblemente intravenosamente, subcutáneamente, por inhalación, nasalmente, oralmente, intravitrealmente o tópicamente.
Ejemplos
Ejemplo 1: Test de estabilidad de inhibidor de C5 conocido
El compuesto de unión a C5 designado PSI0242 (SEQ ID NO: 249) se formuló en NaP 25 mM / NaCl 125 mM pH 7,0 y se sometió a un estudio de estabilidad acelerado durante 2 semanas a 37°C. La estabilidad se midió a través de la aparición de nuevas variantes después del ensayo de estabilidad mediante SDS-PAGE y HPLC de fase inversa (RPC). En ambos análisis la muestra inicial y la sometida al estudio de estabilidad fueron analizadas en paralelo. Para el SDS-PAGE, se cargaron 7,5 pg de proteína en cada pocillo. La RPC se llevó a cabo en un HPLC Agilent 1100 usando una fase móvil A que consiste en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua, y usando una fase móvil B que consiste en TFA al 0,1% / MeOH al 45% / isopropilamina (IPA) al 45% / agua al 10%.
Los resultados demuestran que se forman nuevas formas de la proteína durante la incubación, estas nuevas formas se visualizan como bandas en SDS-PAGE (Fig. 1) y como nuevos picos en los cromatogramas de HPLC de fase inversa (RPC) (Fig. 2). En la Fig. 2, el pico principal después de 2 semanas de incubación corresponde a un 57% de la muestra de proteína original.
Las posiciones 1-60 en SEQ ID NO: 249 corresponden al polipéptido Z06175a, descrito previamente en WO 2013/126006 como SEQ ID NO: 753. El PSI0242 (SEQ ID NO: 249) fue producido básicamente como se describe en el documento WO 2013/126006.
Ejemplo 2: Estabilidad de polipéptidos y compuestos de unión a C5 modificados.
Los polipéptidos y compuestos de unión a C5 modificados fueron sintetizados y purificados básicamente como se describe en el documento WO 2013/126006.
Resumidamente, el ADN que codifica las variantes Z de unión a C5 fue optimizado con codón de E. coli y sintetizado por GeneArt, GmbH. Los genes sintéticos que representan las variantes Z de unión a C5 fueron subclonadas y expresadas en E. coli.
Las variantes Z expresadas intracelularmente fueron purificadas usando métodos de cromatografía convencionales. La homogenización y clarificación se llevaron a cabo mediante sonicación seguida de centrifugación y filtración. Se usó cromatografía de intercambio aniónico como etapa de captura. Se obtuvo una purificación adicional mediante cromatografía de interacción hidrofóbica. Las purificaciones fueron ejecutadas en condiciones ácidas (pH 5,5). El acabado y el cambio de disolución tamponante se llevaron a cabo mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Las proteínas purificadas fueron formuladas en NaP 25 mM / NaCl 125 mM pH 7,0 y se sometieron a un estudio de estabilidad acelerado durante 2 semanas a 37°C. La estabilidad se midió a través de la aparición de nuevas variantes tras el ensayo de estabilidad mediante SDS-PAGE y HPLC de fase inversa (RPC). En ambos análisis, la muestra inicial y la sometida al estudio de estabilidad fueron analizadas en paralelo. Para el SDS-PAGE, se cargaron 7,5 gg de proteína en cada pocillo. Un ejemplo de un gel resultante se muestra en la Fig. 3.
La RPC se llevó a cabo en un HPLC Agilent 1100 usando una fase móvil A que consiste en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua, y usando una fase móvil B que consiste en TFA al 0,1% / MeOH al 45% / isopropilamina (IPA) al 45% / agua al 10%. Un ejemplo de cromatograma resultante se muestra en la Fig. 4 para la SEQ ID NO: 253. Los resultados del ensayo de estabilidad se resumen en la Tabla I a continuación.
Tabla I
Se puede concluir a partir de la Tabla I que determinados polipéptidos o compuestos de unión a C5 modificados presentan propiedades mejoradas, tal como una estabilidad incrementada, en comparación con PSI0242. Dichos polipéptidos o compuestos de unión a C5 mejorados incluyen PSI0334 (SEQ ID NO: 253), PSI0340 (SEQ ID NO: 258), PSI0369 (SEQ ID NO: 259), PSI0377 (SEQ ID NO: 260), PSI0378 (SEQ ID NO: 261), PSI0379 (SEQ ID NO: 262), PSI0381 (SEQ ID NO: 263), PSI0383 (SEQ ID NO: 264), PSI0400 (SEQ ID NO: 267), PSI0410 (SEQ ID NO: 268), PSI0403 (SEQ ID NO: 269) y PSI0404 (SEQ ID NO: 270). En seis de las variantes mencionadas (SEQ ID NO: 253, 260, 261,262, 264 y 267), los residuos de aminoácido de las posiciones 52-53 han sido sustituidos de ND (cf PSI0242) a s E . En la s E q ID NO: 263, la sustitución correspondiente es de ND a ES. En la SEQ ID NO: 269 solo se ha sustituido el residuo de aminoácido de la posición 53 de D a E, mientras que en la SEQ ID NO: 270 el residuo de aminoácido de la posición 52 ha sido sustituido de N a S.
Además, PSI0378 (SEQ ID NO: 261), PSI0381 (SEQ ID NO: 263), PSI0383 (SEQ ID NO: 264), PSI0410 (SEQ ID NO: 268), PSI0403 (SEQ ID NO: 269) y PSI0404 (SEQ ID NO: 270) tienen en común una sustitución de residuo de aminoácido de D a E en la posición 60.
El beneficio combinado de sustituciones que potencian la estabilidad en la posición 52 o 53 y la posición 60 se puede ver en la Fig. 5, que muestra el cromatograma de PSI0383 (SEQ ID NO: 264). En PSI0379 (SEQ ID NO: 262) la sustitución de la posición 60 es de D a A.
En PSI0369 (SEQ ID NO: 259) el grupo funcional ligando (que incluye D60) es eliminado completamente, dando lugar a un compuesto de unión a C5 más estable e indicando la influencia de la posición 60 en la estabilidad de los compuestos de unión a C5.
Ejemplo 3: Unión de compuestos modificados a C5 humano.
Se inmovilizó albúmina de suero humano en Amine Reactive de 2a generación (AR2G) Dip y Read Biosensors (Pall Life sciences (ForteBio) Cat. n° 18-5092) mediante acopamiento de amina. Se cargó PSI0242 (SEQ ID NO: 249; 1 pM) y compuestos de unión a C5 (1 pM) en tampón de lectura (tampón HBS-EP listo-para-usar 200 mL, GE Healthcare n° BR100188), cada uno en un sensor separado con HSA, durante 120 segundos seguido de un registro de línea base durante 60 segundos en tampón de lectura antes de ser sometida a C5 humano (Quidel Cat. n° 403) en concentraciones que oscilan entre 0,79 nM y 25 nM en tampón de lectura con un ciclo de regeneración y un registro de línea base entre cada concentración. Las condiciones de regeneración para los sensores fueron glicina 10 mM, pH 2 (tres pulsos con 30 segundos y tampón de elución durante 60 segundos). A cada espectograma se le restó la referencia de una construcción análoga que contenía un domino de unión a albúmina (SEQ ID NO: 250) pero sin la capacidad de unión a C5. Los datos fueron analizados según el modelo de Langmuir 1:1 usando ForteBio Analysis 7.1 (software de cinética de Pall Life sciences (ForteBio)).
La Kd de la interacción con C5 respecto a PSI0242 (SEQ ID NO: 249) se muestra en la Tabla II. La Kd de PSI0242 varió en 1-3 nM en diferentes análisis.
Los resultados de la Tabla II indican que los compuestos de unión a C5 según la invención tienen una capacidad de unión a C5 humano que es similar a la del polipéptido PSI0242 (SEQ ID NO: 249) descrito en el documento WO 2013/126006.
Tabla II
Ejemplo 4: Estabilidad de polipéptido de unión a C5 sintetizado químicamente
Se encargó un PSI0400 (SEQ ID NO: 267) sintetizado químicamente a BACHEM AG. Se evaluó la estabilidad del polipéptido según la misma metodología del Ejemplo 2. Los resultados del test de estabilidad se muestran a continuación en la Tabla III.
Tabla III
La estabilidad del PSI0400 fue comparable a la de los polipéptidos producidos en E. coIí del Ejemplo 2.
Se comparó la integridad del pliegue de PSI0400 (SEQ ID NO: 267) con un polipéptido recombinante de unión a C5 (PSI0257, SEQ ID NO: 271), producido de acuerdo a los métodos del Ejemplo 2, usando espectros de dicroísmo circular (CD) de UV lejano.
Los espectros CD fueron registrados mediante un espectropolarímetro CD J-720 (Jasco, Japón). Las muestras se diluyeron a 0,17 mg/mL de concentración de proteína usando tampón Pi (Na-K-PO45 mM, pH 7,0). Primero se registró un espectro CD de tampón Pi, después se registraron para cada una de las muestras y finalmente para el tampón Pi otra vez. Dado que los dos espectros de tampón coinciden, se usó el primer espectro registrado como espectro del tampón. El espectro del tampón se suavizó mediante un procedimiento Savitzky-Golay con una anchura de convolución de 25. Los otros espectros fueron suavizados según el mismo procedimiento con una anchura de convolución de 15. El espectro de tampón suavizado fue restado entonces de cada uno de los otros espectros
suavizados. Se usó el programa CDNN para estimar el contenido de estructura secundaria de las proteínas, y las estimaciones resultantes se presentan en la Tabla IV. Los resultados mostraron que ninguna de las dos sustituciones de aminoácido en la posición 52 y 53, ni la producción de polipéptido mediante síntesis química, influyen en el contenido de estructura secundaria del polipéptido sintetizado químicamente. Se comparó la integridad del contenido de estructura secundaria con el PSI0257 producido recombinantemente (SEQ ID NO: 271).
Tabla IV
Ejemplo 5: Unión de los compuestos y polipéptidos modificados a C5 humano.
Se analizó la afinidad de unión de los compuestos de unión a C5 PSI0242 (SEQ ID NO: 249), PSI0340 (SEQ ID NO: 258), PSI0378 (SEQ ID NO: 261) y PSI0410 (SEQ ID NO: 268) y el polipéptido de unión a C5 PSI0400 (SEQ ID NO: 267) por C5 humano usando un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). Se acopló C5 humano (A403, Quidel Corporation) a un chip sensor CM5 (900 RU) usando química de acoplamiento de aminas según el protocolo del fabricante. El acoplamiento se llevó a cabo inyectando hC5 en una concentración de 7,5 pg/mL en tampón de acetato-Na 10 mM pH = 5 (GE Healthcare). La celda de referencia se trató con los mismos reactivos pero sin inyectar C5 humano. La unión de los ligandos de C5 a hC5 inmovilizado se estudió mediante el método de cinética de ciclo sencillo, en el que se inyectaron cinco concentraciones de muestra, típicamente 25, 12,5, 6,25, 3,12 y 1,56 nM en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% de tensioactivo P20, GE Healthcare) una detrás de la otra con un caudal de 30 pL/min a 25°C en el mismo ciclo sin regeneración entre inyecciones. Los datos de la celda de referencia fueron restados para compensar cambios del índice de refracción en masa. En la mayoría de los casos, también se incluyó una inyección de HBS-EP como control de tal modo que los sensogramas tenían un doble blanco. Las superficies fueron regeneradas en tampón HBS-EP. Se calcularon las constantes cinéticas a partir de los sensogramas usando el modelo de analito de Langmuir 1:1 del software Biacore T200 Evaluation versión 1.0. Los valores de Kd resultantes de las interacciones están tabulados en la Tabla V.
Tabla V
Las sustituciones de aminoácido que mejoran la estabilidad no son perjudiciales para la capacidad de las moléculas para unirse a C5, y por tanto no influyen en sus actividades biológicas.
Ejemplo 6: Inhibición de hemolisis.
Para los estudios de la función de ruta de complemento clásica y de la inhibición de la misma por parte de los compuestos de unión a C5 PSI0378 (SEQ ID NO: 261) y PSI0410 ( S e Q ID NO: 268), y del polipéptido de unión a C5 PSI0400 (SEQ ID NO: 267), se prepararon eritrocitos de oveja a partir de sangre entera fresca de oveja en una disolución de Alsever (Instituto Veterinario Nacional de Suecia) y después fueron tratados con antisuero de eritrocito anti-oveja (Sigma) para convertirse en eritrocitos de oveja sensibilizados a anticuerpo (EA). El proceso completo se llevó a cabo en condiciones asépticas. El resto de reactivos procedían de fuentes comerciales.
El ensayo in vitro se llevó a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocillos en forma de U mediante adiciones consecutivas de una proteína de ensayo, un suero de complemento y suspensión de EA. Las concentraciones finales de todos los reactivos, en un volumen de reacción total de 50 pL por pocillo y un pH de 7,3-7,4, fueron: CaCl20,15 mM; MgCl20,5 mM; NaN33 mM; NaCl 138 mM; 0,1% de gelatina; barbital sódico 1,8 mM; ácido barbitúrico 3,1 mM; EA 5 millones; suero de proteína C5 de complemento a la dilución adecuada, y compuesto o polipéptido de unión a C5 a las concentraciones deseadas.
Los compuestos y el polipéptido de unión a C5 fueron pre-incubados con el suero de complemento descrito antes durante 20 minutos en hielo antes de comenzar la reacción mediante la adición de la suspensión de EA. Se dejó que la reacción hemolítica progresara a 37 °C con agitación durante 45 minutos y a continuación se detuvo opcionalmente mediante la adición de 100 pL de salino enfriado en hielo que contenía 0,02% de Tween 20. Las células fueron centrifugadas al fondo y la porción superior, que correspondía a 100 pL de sobrenadante, se transfirió a una microplaca transparente que tenía pocillos de media-área y fondo plano. Los resultados de reacción se analizaron a través de la densidad óptica usando un lector de placas de microtitulación a una longitud de onda de 415 nm.
En todas las ocasiones de ensayo, se incluyó una muestra de control (PSI0242, SEQ ID NO: 249) y vehículo en cada placa para definir los valores correspondientes a reacciones sin inhibir y completamente inhibidas, respectivamente. Estos valores fueron usados para calcular el % de inhibición de hemolisis de complemento para cualquier concentración de muestra dada. Las potencias inhibidoras (valores de IC 50) de los compuestos y el polipéptido de unión a C5 evaluados fueron definidas aplicando el mismo ensayo en presencia de una concentración controlada de C5 humano añadido a suero sin C5. Para los inhibidores altamente potentes (de bajo nanomolar a sub-nanomolar), una concentración de C5 final de la mezcla de reacción se controló a 0,1 nM, que fue establecida opcionalmente usando sueros agotados o deficientes en C5. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla VI.
Tabla VI
Los resultados del ensayo de hemolisis demuestran que los compuestos de unión a C5 mejorados SEQ ID NO: 261 y 268 son comparables al compuesto de referencia. El polipéptido de unión a C5 SEQ ID NO: 267 fue funcional en el ensayo, pero dado que no contiene un dominio de unión a albúmina los resultados no pueden compararse directamente con el compuesto de referencia.
Ejemplo 7: Unión a albúmina humana
Para la evaluación de la afinidad de unión a albúmina de los compuestos de unión a C5, se usó un ELISA de albúmina humana que utiliza albúmina humana recombinante (recubrimiento) y anticuerpos disponibles comercialmente (primario y de detección) adquiridos en Novozymes, Affibody AB y DakoCytomation, respectivamente. Para la cuantificación de las muestras se usó un método estándar preparado a partir de PSI0242 (SEQ ID NO: 249), que comprende un polipéptido de unión a C5 y un dominio de unión a albúmina de proteína G de estreptococo. Se recubrió una microplaca de 96 pocillos con albúmina humana recombinante. La placa se lavó entonces con salino tamponado con fosfato que contenía un 0,05% de Tween 20 (PBST) y se bloqueó durante 1-2 horas con 1% de caseína en PBS. Después de un lavado de placa, se añaden a la placa el patrón, los controles del método, la muestra de control y las muestras de ensayo. Tras incubación durante 2 horas, el material no ligado fue eliminado mediante un lavado. Se añadió IgG Anti-Affibody® de cabra (Affibody AB, cat. n° 20.1000.01.0005) a los pocillos y la placa se incubó durante 1,5 horas para permitir la unión a los compuestos de unión a C5 ligados. Después de un lavado, se dejó que uniera HRP de IgG anti-cabra de conejo a los anticuerpos de cabra durante 1 h. Después de un lavado final, se detectó la cantidad total de HRP ligada mediante la adición de sustrato de TMB, que se convirtió en un producto azul por acción de la enzima. La adición de ácido clorhídrico 1 M pasados 30 minutos detuvo la reacción y el color del contenido del pocillo cambió de azul a amarillo. Se midió fotométricamente la absorbancia a 450 nM, usando la absorbancia a 650 nm como longitud de onda de referencia. La intensidad de color era proporcional a la cantidad de PSI0242 (SEQ ID NO: 249) y las concentraciones de muestra se determinaron a partir de la curva de calibrado con patrón.
Los compuestos de unión a C5 que comprenden un dominio de unión a albúmina de proteína G de estreptococo, se mostró capaz de unirse a albúmina humana y los datos se presentan en la Tabla VII a continuación.
Tabla VII
Los resultados del ensayo demostraron que ambos compuestos de unión a C5 mejorados en estabilidad investigados mantienen su capacidad para unirse a albúmina humana.
Ejemplo 8: test de estabilidad de 3 meses de polipéptidos/compuestos de unión a C5
Los polipéptidos/compuestos de unión a C5 que mostraron una estabilidad mejorada en comparación con PSI0242 en el ensayo de estabilidad de 2 semanas a 37 °C (Ejemplo 2) fueron sometidos a un test de estabilidad más largo, de 3 meses, a 37 °C. La instalación para el test de estabilidad fue como se describe en el Ejemplo 2 y la evaluación de la estabilidad se llevó a cabo midiendo el pico principal del porcentaje de cromatograma del contenido de proteína total mediante HPLC de fase inversa (RPC), el método RPC se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 2. Los datos de 2 semanas del ejemplo 2 se incluyen en la Tabla VIII a continuación para facilitar la interpretación.
Tabla VIII
Los compuestos de unión a C5 con sustituciones de aminoácido en la posición 52, 53 de ND a SE y un cambio en la posición 60 de D a E o A (SEQ ID NO: 261,264 y 262) en comparación con PSI0242 presentaron una mayor proporción de proteína en la forma original después de 3 meses a 37 °C que la que tenía el PSI0242 (SEQ ID NO: 249) después de 2 semanas en las mismas condiciones. Los otros compuestos también presentaron una estabilidad mejorada. Ejemplo 9: Estabilidad de polipéptidos modificados de forma similar
Variantes de polipéptido conocidas previamente derivadas de proteína Z (Grondwall et al. J Biotechnol 2007, 128: 162 183) con afinidad de unión por otras moléculas diana diferentes a C5 fueron modificadas de forma similar en posiciones específicas de la secuencia de aminoácido a fin de mejorar la estabilidad. La selección y producción de las variantes de polipéptido originales con afinidad de unión por el receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), el receptor beta de factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF-Rp), el receptor Fc neonatal (FcRn), y la anhidrasa carbónica IX (CAIX) se describe, p.ej., en los documentos WO 2009/080810, WO 2009/077175, PCT/EP2014/055299 y WO 2014/096163. Las variantes de polipéptido de estabilidad mejorada fueron producidas mediante mutagénesis sito-dirigida en posiciones seleccionadas de la secuencia de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácido mejoradoras de la estabilidad en las variantes de polipéptido Z02891 (SEQ ID NO: 272), dirigido a HER2; Z15805 (SEQ ID NO: 275), dirigido a PDGF-Rp; Z10103 (SEQ ID NO: 278), dirigido a FcRn; y Z09782 (SEQ ID NO: 281), dirigido a CAIX, se especifican a continuación en la Tabla IX. Estas variantes de polipéptido de estabilidad mejorada difieren de los polipéptidos de unión a C5 de la presente invención por ejemplo en que pueden presentar una estructura de unión [BM] con afinidad de unión a HER2, PDGF-Rp, FcRn y CAIX.
Todas las variantes fueron clonadas con cola de histidina 6 x (His6) N-terminal y las construcciones obtenidas codificaban polipéptidos en el formato MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]. Se introdujeron mutaciones en los plásmidos de las variantes de polipéptido usando pares de oligonucleótidos cebadores solapantes que codifican las sustituciones de aminoácidos deseadas y aplicando técnicas de biología molecular establecidas. Las secuencias de plásmido correctas fueron verificadas mediante secuenciamiento de ADN.
Se transformaron células de E. coIí (cepa T7E2) (GeneBridge) con plásmidos que contenían los fragmentos génicos que codifican los polipéptidos originales y los modificados. Las células fueron cultivadas a 37 °C en medio TSB-YE suplementado con 50 pg/mL de canamicina y a continuación se indujo la expresión de proteína mediante la adición de IPTG. Las células peletizadas fueron alteradas usando un homogeneizador FastPrep®-24 (Nordic Biolabs) y se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación. Cada sobrenadante que contenía la variante de polipéptido como proteína etiquetada con His6 fue purificado mediante cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado (IMAC) usando columnas His GraviTrapTM (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. Las variantes de polipéptido purificadas fueron cambiadas de tampón a salino tamponado de fosfato (PBS; KH2 PO41,47 mM, Na2HPO4 8,1 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, pH 7,4) usando columnas desalinizadoras PD-10 (GE Healthcare). La identidad correcta de cada polipéptido se verificó mediante SDS-PAGE y HPLC-MS.
Tabla X
Aparte de las sustituciones de uno de (SEQ ID NO: 284-287) o ambos de (SEQ ID NO: 273-274, 276-277, 279-280, 282-283) N52 y D53, también se llevaron a cabo sustituciones en las posiciones correspondientes al bucle [L2]. Por tanto, en las variantes de polipéptido de SEQ ID NO: 274, 277, 280, 283, 285 y 287, [L2] es RQPE.
Para llevar a cabo los ensayos de estabilidad, las variantes de polipéptido, formuladas en PBS pH 7,4, fueron diluidas a 1 mg/mL y se incubaron alícuotas de 200 pL a 37 °C durante 2 semanas. Muestras tomadas antes y después del test de estabilidad fueron analizadas mediante SDS-PAGE usando geles de 10% de Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen) y cargando 5 pg de proteína en cada pocillo. Los geles teñidos con azul de Coomassie resultantes se muestran en la Fig. 6. La estabilidad se determinó a través de la aparición de nuevas variantes tras la incubación a la temperatura elevada y las variantes mutadas fueron comparadas con el respectivo polipéptido original.
Todas las variantes de polipéptido con las modificaciones esbozadas en la Tabla IX mostraron una estabilidad mejorada en comparación con el respectivo polipéptido original en el sentido de que una segunda banda justo por encima de la banda principal observada para las muestras del polipéptido original no era visible en las muestras de los polipéptidos modificados con la sustitución D53E y/o N52S, ver la Fig. 6. Los polipéptidos con las sustituciones D53E y/o N52S combinadas con las sustituciones D36R, D37Q y S39E mostraron perfiles similares en el gel de SDS-PAGE. La sustitución D53E sola o en combinación con las sustituciones D36R, D37Q y S39E parecieron reducir la cantidad de especie con una conformación alternativa observada como una segunda banda en el gel de SDS-PAGE, pero no pudieron evitar completamente la formación de dicha especie.
Adicionalmente, se evaluó la capacidad de unión de las variantes de polipéptido modificadas. Todas las variantes de polipéptido retuvieron su capacidad de unión por su diana tras ser modificadas (resultados no mostrados).
Los resultados presentados antes para las variantes de polipéptido que tienen afinidad de unión por otras moléculas diana diferentes a C5 se correlacionan bien con los resultados presentados para los polipéptidos y compuestos de unión a C5 de la presente invención (véase, p.ej., el Ejemplo 2 y el Ejemplo 4). Por tanto, las modificaciones de aminoácidos específicas descritas en la presente memoria parecen tener un efecto estabilizante independientemente de la secuencia de aminoácidos del [BM]. Las modificaciones o sustituciones de aminoácidos descritas en la presente memoria, por tanto, se considera que mejoran la estabilidad de todos los polipéptidos y compuestos de unión a C5 descritos en la presente memoria y en el documento WO 2013/126006.
Claims (14)
1. Un polipéptido capaz de unirse a componente 5 (C5) de complemento humano, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos:
[fíMHL2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
donde, de forma independiente unos de otros,
[BM] es una estructura de unión a C5 que comprende la secuencia de aminoácidos
EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35;
donde, de forma independiente unos de otros,
X9 se selecciona entre H, Q, S, T y V;
X10 se selecciona entre I, L, M y V;
X11 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X13 se selecciona entre N y W;
X14 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X18 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X23 se selecciona entre N y T;
X24 se selecciona entre I, L y V;
X25 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X28 se selecciona entre I, L y V;
X32 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T;
X33 se selecciona entre K y S; y
X35 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[L2] se selecciona entre DDPS y RQPE;
X42 se selecciona entre A y S;
X43 se selecciona entre N y E;
X46 se selecciona entre A, S y C;
X52 se selecciona entre E, N y S;
X53 se selecciona entre D, E y S, siempre que X53 no sea D cuando X52 es N;
y
X54 se selecciona entre A y S.
2. El polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos:
AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
donde, de forma independiente unos de otros,
[BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53 y X54 son como se ha definido en la reivindicación 1.
3. El polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en el que
X52 y X53 se seleccionan de forma independiente entre E y S;
X52 es S y X53 es E;
X52 es E y X53 es S;
X52 es S y X53 es D; o
X52 es N y X53 es E.
4. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la secuencia de aminoácidos:
A E A K Y A K E X 9X 10X 11 A X i 3X 14E I D X 18L P N L X 23X 24X 25Q W X 28 A F I X 32X 33L
X 35 -[ L 2 ] - Q S X 42 X 43 L L X 46 E A K K L X 52 X 53 X 54Q A P ;
donde, de forma independiente unos de otros,
X9 se selecciona entre H, Q, S, T y V;
X10 se selecciona entre I, L, M y V;
X11 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
X13 se selecciona entre N y W;
X14 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, R, S y T;
X18 se selecciona entre A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
X23 se selecciona entre N y T;
X24 se selecciona entre I, L y V;
X25 se selecciona entre A, D, E, H, K, N, Q, R, S y T;
X28 se selecciona entre I, L y V;
X32 se selecciona entre D, E, G, H, N, S y T;
X33 se selecciona entre K y S;
X35 se selecciona entre A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[L2] se selecciona entre DDPS y RQPE;
X42 se selecciona entre A y S;
X43 se selecciona entre N y E;
X46 se selecciona entre A, S y C;
X52 se selecciona entre E, N y S;
X53 se selecciona entre D, E y S, siempre que X53 no sea D cuando X52 es N;
y
X54 se selecciona entre A y S.
5. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se cumple al menos una de las siguientes condiciones:
X9 es V,
X10 es L,
X11 es E,
X13 es W,
X14 es D,
X18 es R,
X23 es T,
X24 es I,
X25 es E,
X28 es L,
X32 es N,
es K,
X35 es D,
[L2] es DDPS,
X42 es S,
X43 es E,
X46 es S,
X54 es S.
6. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que [BM] comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 1-28 de las SEQ ID NOs: 1-248, preferiblemente en el que [BM] comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como las posiciones 1-28 de la SEQ ID NO: 1.
7. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , seleccionado de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266 y s Eq ID NO: 267.
8. Un compuesto capaz de unirse a C5, comprendiendo dicho compuesto:
a. al menos un polipéptido de unión a C5 según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes;
b. al menos un dominio de unión a albúmina de proteína G de estreptococo; y
c. opcionalmente, al menos un grupo funcional de unión para unir dicho al menos un dominio de unión de albúmina al extremo C o N de dicho al menos un polipéptido de unión a C5, siendo dicho grupo funcional de unión preferiblemente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos KVX60GS, en la que X60 se selecciona entre D, E y A.
9. El compuesto según la reivindicación 8, en el que X60 es E y dicho compuesto es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID nO: 264, SEQ ID NO: 269 o SEQ ID NO: 270.
10. El compuesto según la reivindicación 8, en el que X60 es A dicho compuesto es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 262.
11. El polipéptido de unión a C5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el compuesto de unión a C5 según una cualquiera de las reivindicaciones 8 -10 para uso en terapia.
12. El polipéptido de unión a C5 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el compuesto de unión a C5 según una cualquiera de las reivindicaciones 8 -10 para uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección relacionada con C5.
13. El polipéptido de unión a C5 para uso según la reivindicación 12 o el compuesto de unión a C5 para uso según la reivindicación 12, donde dicha afección relacionada con C5 es una afección seleccionada entre enfermedades inflamatorias; enfermedades autoinmunes; enfermedades infecciosas; enfermedades cardiovasculares; trastornos neurodegenerativos; lesión de injerto; enfermedades oculares; enfermedades renales; enfermedades pulmonares; enfermedades hematológicas tales como la hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH); enfermedades alérgicas y enfermedades dermatológicas.
14. El polipéptido de unión a C5 para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13 o el compuesto de unión a C5 para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde dicho polipéptido o compuesto de unión a C5 se administra intravenosamente, subcutáneamente, por inhalación, nasalmente, oralmente, intravitrealmente o tópicamente.
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