JP6979577B2 - アルツハイマーaベータペプチド結合ポリペプチド - Google Patents
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Description
本開示は、アミロイドβ(Aβ)ペプチド(以後、Aβと称する)に対する結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関する。本開示はまた、治療、予後及び/又は診断剤としてのそのようなAβペプチド結合ポリペプチドの使用に関する。
多くの異なる疾患、例えばアルツハイマー病、II型糖尿病、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、並びに家族性アミロイドポリニューロパチー1は、アミロイド疾患の増加するファミリーに属するものとして認識されている。全てのアミロイド疾患は、原繊維であってもなくてもよい細胞外タンパク質凝集物の存在を共通して有する。
本開示の目的は、例えば治療、予後及び診断用途のために使用され得る、新規なAβペプチド結合剤を提供することである。
−第2のAβペプチド結合モチーフBM2を含む第2の部分、及び
−リンカー、
を含み、
ここで、当該モチーフは、同一又は異なってもよく、
ここで、当該結合モチーフBM1及びBM2の各々が、以下、
i)EX2X3YX5X6NLX9A X11QLCAX16IX18X19X20 ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M、Q、R、T及びYから選択され;
X3は、H及びVから選択され;
X5は、F、I及びLから選択され;
X6は、P及びTから選択され;
X9は、N及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X16は、F及びIから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;
X19は、K及びSから選択され;そして
X20は、F、I、L及びRから選択される)
並びに、
ii)i)で定義された配列と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、Aβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
X2は、I、Q、及びRからさらに選択され;
X5は、F及びLからさらに選択され;
X16は、Fであり;そして
X20は、I及びLからさらに選択される、
Aβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
EX2X3YX5X6NLX9A X11QLCAFIX18X19L ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M、Q、R及びYから選択され;
X3は、H及びVから選択され;
X5は、F、I及びLから選択され;
X6は、P及びTから選択され;
X9は、N及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;そして
X19は、K及びSから選択される)
からなる、Aβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
EX2VYX5X6NLNA X11QLCAFIX18SL ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M及びRから選択され;
X5は、F、I及びLから選択され;
X6は、P及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;そして
X18は、N、Q及びRから選択される)
からなる。
EX2VYX5PNLX9A X11QLCAX16IX18X19X20 ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M、Q、R及びTから選択され;
X5は、F及びLから選択され;
X9は、N及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X16は、F及びIから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;
X19は、K及びSから選択され;そして
X20は、F、I、L及びRから選択される)
からなる、Aβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
EX2VYX5X6NLNA X11QLCAFIX18SX20 ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M及びRから選択され;
X5は、F、I及びLから選択され;
X6は、P及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;そして
X20は、I及びLから選択される)
からなる。
第1の態様による一実施形態では、配列i)のアミノ酸残基「Xn」が、「可能性のある残基」から選択される、ポリペプチドが提供される。したがって、表1は、本開示の第1の態様のいくつかの特定の個別化された実施形態を開示する。例えば、第1の態様による一実施形態では、配列i)のX2がI、M、Q、R及びYから選択されるポリペプチドが提供され、そして第1の態様による別の実施形態では、配列i)のX2が、M、Q、R及びTから選択されるポリペプチドが提供される。疑義を避けるために、列挙された実施形態は、さらに他の実施形態において自由に組み合わせることができる。例えば、そのような組み合わせ実施形態の1つは、X2が、I、M、Q、R及びYから選択され、一方でX6がTであり、そしてX18が、Q及びRから選択される、ポリペプチドである。
XAGXB−[BM]
(式中、BMは、本明細書で定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
XAは、A及びSから選択され;そして
XBは、G及びRから選択される)
を含む、Aβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
iii)[BM]−DXaSQXbXcXdLLXe EAKKLXfXgXhQA PXi
(式中、BMは、上記で定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
Xaは、P、Q、R及びSから選択され;
Xbは、N、Q、R及びSから選択され;
Xcは、A及びSから選択され;
Xdは、K、N及びEから選択され;
Xeは、A、S及びCから選択され;
Xfは、E、N及びSから選択され;
Xgは、D、E及びSから選択され;
Xhは、A及びSから選択され;そして
Xiは、アミノ酸なし、A及びKから選択される)
並びに、
iv)iii)で定義された配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される結合モジュールアミノ酸配列、Bmodを含む、Aβペプチド結合ポリペプチドが提供される。
[BM]−DXaSQXbAXdLLA EAKKLNDAQA PXi
(式中、[BM]は、上記で定義された[BM1]又は[BM2]であり、そして
Xaは、P、Q、R及びSから選択され;
Xbは、N、Q、R及びSから選択され;
Xdは、K及びNから選択され;そして
Xiは、アミノ酸なし、A及びKから選択される)
からなる。
[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAP;及び
[BM]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAP、
から選択されるアミノ酸配列からなる。
[BM1]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPA;及び
[BM1]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAPA、
から選択されるアミノ酸配列である、Bmodを含む。
[BM2]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;及び
[BM2]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPK、
から選択されるアミノ酸配列である、Bmodを含む。
XAGXB−[BMod]
(式中、Bmodは上記で定義したとおりであり、そして、互いに独立して、
XAは、A及びSから選択され;そして
XBは、G及びRから選択される)
を含む、Aβペプチド結合ポリペプチドを提供する。
AGG−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
SGG−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;及び
AGR−[BM]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAP、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
AGG−[BM1]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGR−[BM1]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAPA;及び
AGG−[BM1]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGR−[BM1]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM1]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;及び
AGR−[BM1]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAP、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
AGR−[BM2]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGG−[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
SGG−[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGG−[BM2]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;及び
AGG−[BM2]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPK、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
第1の態様による一実施形態では、アミノ酸残基「Xy」が、「可能性のある残基」から選択される、ポリペプチドが提供される。したがって、表2は、本開示の第1の態様のいくつかの特定の個別化された実施形態を開示する。
VDNKFNKEGK GAPGEIHYLP NLNADQLCAF IRSLEDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK(配列番号554)
及び
VDNKFNKEIE VATGEIVYLP NLNADQLCAF INSLEDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK(配列番号555)
から選択されるアミノ酸配列を含まないことを条件とする。
−保護された反応性側鎖を有する第1の態様によるポリペプチドを形成するための、アミノ酸及び/又はアミノ酸誘導体の段階的カップリング、
−ポリペプチドの反応性側鎖からの保護基の除去、並びに
−水溶液中でのポリペプチドのフォールディング、
を含む。
−対象、又は対象から単離した試料を、本明細書に記載されたAβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物と接触させ、そして
−前記対象又は前記試料に結合した、Aβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の量に対応する値を得ること、
を含む。
a)ヒト由来の体液の一部分を提供し;
b)当該一部分を本明細書に記載された親和性マトリックスに、当該親和性マトリックスへのAβペプチドの結合を許容する環境下で適用し、それによって体液の一部分におけるAβペプチドの含量の減少を引き起こし;そして
c)当該ヒトに、体液の当該一部分の少なくとも一部を戻すこと、
を含む、方法である。
概要
以下の実施例は、ブドウ球菌ディスプレイ技術に基づく新規なAβペプチド結合ポリペプチドの開発を開示する。本明細書に記載されたAβペプチド結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、そして対応するアミノ酸配列を図1に列挙し、識別子配列番号1〜106及び118〜553で示している。本実施例はまた、Aβペプチド結合ポリペプチドの生成、特性評価及び機能性を記載する。
親和性成熟ライブラリーの設計及びクローニング
概要
本実施例は、先に同定された第1世代Aβペプチド結合ポリペプチド変異体ZAβ3(配列番号111)の二量体に基づく、2つの親和性成熟ライブラリー、ZASlib及びZSYMlibの設計及びクローニングを記載する。
二本鎖DNAの2つのSlonoMax(登録商標)頭−尾二量体ライブラリーを、Sloning BioTechnology GmbH(プッフハイム(Pucheim)、ドイツ)から購入した。ライブラリーオリゴヌクレオチドは、Aβペプチド結合ポリペプチドの第1及び第2の部分を構成する、第1のZ変異体ユニットの切断されたヘリックス1プラスヘリックス2及び3、並びに第2のZ変異体ユニットのヘリックス1及び2をコードした(非対称ライブラリー:5’−GCG GGT GGG GAG NNN NNN TAT NNN NNN AAC TTA AAC GCG NNN CAA CTG TGT GCC TTC ATC NNN AGT TTA GAA GAT GAC CCA AGC CAA NNN GCT AAC TTG TTG GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG GCG AGC AGC AGC AGC GGG AGC AGC AGC AGC GGG CGC GCG AGT GCG GGT CGC GAG NNN GTT TAT TTA NNN AAC TTA AAC GCG NNN CAA CTG TGT GCC NNN ATC NNN AGT NNN GAA GAT GAC NNN AGC CAA NNN GCT AAC TT −3’(配列番号556;ランダム化コドンはNNNで示す);対称ライブラリー: 5’−GCG GGT NNN GAG NNN GTT TAT NNN NNN AAC TTA AAC GCG NNN CAA CTG TGT GCC TTC ATC NNN AGT TTA GAA GAT GAC NNN AGC CAA NNN GCT AAC TTG TTG GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG GCG AGC AGC AGC AGC GGG AGC AGC AGC AGC GGG CGC GCG AGT GCG GGT NNN GAG NNN GTT TAT NNN NNN AAC TTA AAC GCG NNN CAA CTG TGT GCC TTC ATC NNN AGT TTA GAA GAT GAC NNN AGC CAA NNN GCT AAC TT −3’(配列番号557;ランダム化コドンはNNNで示す)。当該遺伝子を、ブドウ球菌ベクターへのサブクローニングのためのXhoI及びNheI制限部位に隣接させた。ライブラリーをPhusion DNAポリメラーゼ(Finnzymes、エスポー、フィンランド)を用いて8サイクルでPCR増幅し、最終PCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen GmbH)を使用して精製した。精製したPCR産物をXhoI及びNheI−HF(New England Biolabs)制限酵素によって消化し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen GmbH)を用いて調製用ゲル電気泳動(2%アガロースゲル)によって精製した。S.カルノーサス(S.carnosus)発現ベクターpSCZ1(Lofblomら(2007)J Appl Microbiol 102(3):736~747)を同じ酵素で消化し、上述の調製用ゲル電気泳動によって精製した。精製したライブラリーフラグメントを、ベクターとインサートとの1:5モル比でT4DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いてベクターに連結し、DNAフラグメントの精製及び濃縮のためのフェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱に続く。次に、ライブラリーをコードするプラスミドを、エレクトロポレーションによってエレクトロコンピテント大腸菌SS320細胞(Lucigen Corporation、ミドルトン、USA)に形質転換した。個々のクローンを、BigDye Thermo Cycle シークエンシング反応及びABI Prism 3700装置(Applied Biosystems、フォスターシティ、CA)を用いて後続のライブラリー配列検証のためにPCR増幅した。その後ライブラリープラスミドをJetstar Maxi Kit(Genomed)を用いて調製し、フェノール−クロロホルム抽出により精製し、イソプロパノール沈澱によって濃縮した。最後に、当該ライブラリー(以後、Sc:ZASlib及びSc:ZSYMlibと称する)を前述のようにエレクトロコンピテントS.カルノーサスに形質転換した(Lofblomら(2007)、上記参照)。
Aβペプチドに対する親和性を向上するために、Aβペプチド結合ポリペプチドの親和性成熟を行った。2つの親和性成熟ライブラリーを、第1世代Aβペプチド結合ポリペプチドZAβ3(配列番号111)の頭−尾二量体に基づいて設計した。当該ライブラリーを、各ドメインの独立した操作を可能にし、並びに還元条件の影響をより受けにくくするために、一本鎖二量体として設計した。先のデータは、第1世代Aβペプチド結合ポリペプチドZAβ3の二量体のN末端から最初の構造化されていない11アミノ酸残基を切断することが、Aβペプチドに対する親和性に有利な効果を有することを示している(Lindgrenら(2010)Protein Sci 19(12):2319~2329; Lindbergら(2013)Biotechnol J 8(1):139~145)。それゆえ、第1のZ変異体ユニットのこの一部分は、ライブラリーから除外した。第2のZ変異体ユニットにおいて、二量体コンストラクトの正しいフォールディングを可能にするために、対応する一部分は代わりに柔軟性(S4G)2リンカーによって置換された。両方のライブラリーにおけるランダム化の設計は、第1世代Aβペプチド結合ポリペプチドのAβペプチドとの相互作用の構造解析に基づき、並びに第1世代Aβペプチド結合ポリペプチドの選択からの配列出力に基づく(Gronwallら(2007)、上記参照;Hoyerら(2008)、上記参照)。
親和性成熟ライブラリーのフローサイトメトリーソーティング及び単離されたポリペプチドのシークエンシング
概要
本実施例は、ブドウ球菌ディスプレイのためのベクターへの実施例1の親和性成熟ライブラリーのクローニング、並びに、各ソーティングサイクルで増加したストリンジェンシー条件(increased stringency conditions)を用いるフローサイトメトリーによるその後のAβペプチド結合ポリペプチドのソーティング及び選択を記載する。単離された変異体のシークエンシングは、非対称ライブラリーからの51個のユニークな変異体(配列番号1〜51)、及び対称ライブラリーからの55個のユニークな変異体(配列番号52〜106)の同定につながる。
いずれかのライブラリーの少なくとも10倍のライブラリーサイズを、酵母抽出物(TSB+Y; Merck、ダルムシュタット、ドイツ)及び20μg/mlのクロラムフェニコールで補充したトリプシン大豆ブロスに接種し、37℃及び150rpmで一晩増殖させた。翌日、細胞を遠心分離(6000rpm、6分、4℃)によって回収し、C−末端ビオチン化Aβ1~40ペプチド(配列番号110;AnaSpec)の添加前に、0.1%のPluronic(登録商標)F108 NF界面活性剤(PBSP;pH7.4;BASF Corporation)で補充したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。細胞を、平衡に達するまで、穏やかに混合しながら室温で45分間インキュベートした。その後、細胞を氷冷PBSPで洗浄し、そしてフィコエリトリンとコンジュゲートしたストレプトアビジン(SAPE;Invitrogen)並びにAlexa Fluor 647とコンジュゲートしたHSAで、30分間氷上でそれぞれ5μg/ml及び150nMの濃度で標識した。氷冷PBSPでの最終洗浄ステップ後、細胞をソーティング前に氷冷PBSPに再懸濁した。細胞を、MoFlo(登録商標)Astriosフローサイトメーター(Beckman Coulter)を使用して、各サイクルで増加したストリンジェンシーにより4サイクルでソートした。選択の第1サイクルでは、ライブラリー細胞を、50nMのC−末端ビオチン化Aβ1~40ペプチドと、そして第2及び第3サイクルではそれぞれ20nM及び10nMとインキュベートした。最後のサイクルでは、細胞をオフ・レート(off-rate)選択手順に供した。
蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)と組み合わせたブドウ球菌ディスプレイ技術は、個々のライブラリーメンバー間での微細な親和性の差別化が可能であるため、親和性成熟目的に十分適している(Lofblom(2007)上記参照;Kronqvist(2008)Protein Eng Des Sel 21(4):247~255; Malmら(2013)PLoS One 8(5):e62791)。高親和性Aβペプチド結合ポリペプチドを単離するために、2つの表示されたライブラリーをFACSの4サイクルに供した。ブドウ球菌細胞を、ビオチン化Aβ1~40ペプチドと、45分間室温で結合平衡に達するまで、インキュベートした。その後細胞を、以前に記載された細胞表面発現レベルでの標的結合の検出及び正規化のために、洗浄し、蛍光標識されたHSA及びストレプトアビジン−コンジュゲートフィコエリトリンと氷上でインキュベートした(Kronqvistら(2008)上記参照)。追加の洗浄後、フローサイトメーターにおける表面−発現比に最も高い標的−結合を示すライブラリー細胞をゲーティングし(図4に概説されるように)、増幅及びその後のソーティングのラウンドのために単離した。各サイクルでは、ソーティングパラメーター及びゲートを変更することによって、並びに標的濃度をサイクル1、2及び3においてそれぞれ50nM、20nM及び10nMに低下させることによって、選択ストリンジェンシーが増加した。第4及び最終サイクルでは、最も遅い解離を有する結合剤に有利なように、オフ・レート選択アプローチを使用した。選択の各サイクル後のフローサイトメトリー分析によって示されたように、ソーティングはAβ結合クローンの富化をもたらした(図4A及び4B)。ソーティングの4サイクル後に、個々のコロニーを同定のために配列決定した。192個の配列の合計のうち(ライブラリーあたり96個)、51個のユニークなポリペプチド変異体(配列番号1〜51)が非対称ライブラリーからの出力において同定され、及び55個のユニークなポリペプチド変異体(配列番号52〜106)が対称ライブラリーからの出力において同定された(図1)。興味深いことに、非対称ライブラリーから単離された1つのクローン(ABPP018、配列番号18)は、設計により意図された2つの代わりに、3つのS4Gリピートからなるリンカーを含んだ。
Aβ結合のためのオン・セルスクリーニング
概要
本実施例では、Aβペプチドに対する37個の単離されたポリペプチド変異体の親和性をフローサイトメトリーによって分析した。
実施例2の選択結果において各々2回以上出現した37個のクローン(配列番号1、5、9、13、14、16、18、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49及び50にそれぞれ対応する、ABPP001、005、009、013、014、016、018、020、021、025、026、028、033、035、037、040、042、048、049及び050;並びに配列番号53、54、59、60、61、62、70、75、78、84、89、90、95、96、97、100及び104にそれぞれ対応する、ABPP053、054、059、060、061、062、070、075、078、084、089、090、095、096、097、100及び104)を、クロラムフェニコール(10μg/ml)を含むTSB+Yに個々に接種し、37℃及び150rpmで一晩増殖させた。106の一晩培養細胞を遠心分離によってペレット化し、そして、1nMのビオチン化Aβ1~40(AnaSpec)に再懸濁する前に、PBSP中で洗浄した。室温で穏やかに混合しながら45分のインキュベーション後に、細胞を氷冷PBSPで洗浄し、30分間氷上でSAPE及びHSA−Alexa Fluor 647で標識した。次に、細胞を洗浄し、氷冷PBSPに再懸濁し、そしてフローサイトメトリー分析に供した。Aβ1~40結合及び細胞表面発現からの平均蛍光強度(MFI)をGalliosフローサイトメーター(Beckman Coulter)で測定した。第1世代結合剤の頭−尾ホモ二量体(ZAβ3)2(配列番号112)、並びに11個のN−末端アミノ酸残基が切断された頭−尾ホモ二量体(ZAβ3A12)2(配列番号113)を、比較のために分析に含めた。実験を、異なる日に新たに調製された溶液を用いて二連で実施した。
実施例2に記載されたようにライブラリーから単離された37個の候補を、最も高いAβ結合シグナルをスクリーニングするために、個々にフローサイトメトリー分析に供した。合計で、配列分析において複数回出現する、ZASlibからの19個の変異体(それぞれABPP001、005、009、013、014、016、020、021、025、026、028、033、035、037、040、042、048、049及び050)、並びにZSYMlibからの17個(それぞれABPP053、054、059、060、061、062、070、075、078、084、089、090、095、096、097、100及び104)、並びに、より長いリンカーを含む非対称ライブラリーからの変異体ABPP018(配列番号18)が、アッセイに含まれた。組換え細菌を1nMのビオチン化Aβ1~40及び上述された二次試薬とインキュベートした。その後試料をフローサイトメーターでAβペプチド結合について分析し、そして、表面発現レベルからのシグナルに対するAβペプチド結合からのシグナルの比(FL−2/FL−6)を決定した。N−末端切断を有するZAβ3の頭−尾ホモ二量体(ZAβ3A12)2(配列番号113)を比較のために分析に含めた。全ての変異体は対照よりも高い結合−シグナルを示し、Aβペプチドに対する向上された親和性を示した。
オン・セル、オフ・レートランキング及び結合の決定
概要
本実施例では、ブドウ球菌細胞表面上に発現され、実施例3で試験された、37個のポリペプチド変異体を、それらのオフ・レートによって測定された、Aβペプチドに対するそれらの親和性に基づいてランク付けした。
個々のブドウ球菌クローン(ABPP001、005、009、013、014、016、018、020、021、025、026、028、033、035、037、040、042、048、049、050、053、054、059、060、061、062、070、075、078、084、089、090、095、096、097、100及び104)を、クロラムフェニコール(10μg/ml)を含むTSB+Yに接種し、37℃及び150rpmで一晩増殖させた。106個の細胞を一晩培養し、遠心分離によってペレット化し、そして、PBSP中の100nMの非標識Aβ1~40に再懸濁する前に、PBSP中で洗浄した。室温で穏やかに混合しながら6時間のインキュベーション後、細胞を氷冷PBSPで洗浄し、室温で45分間PBSP中の25nMのC−末端ビオチン化Aβ1~40ペプチド(AnaSpec)とインキュベートした。その後、細胞を氷冷PBSPで洗浄し、そして30分間氷上でSAPE及びHSA−Alexa Fluor 647で標識した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に氷冷PBSPに再懸濁した。Aβ1~40結合及び細胞表面発現からの平均蛍光強度(MFI)をGalliosフローサイトメーター(Beckman Coulter)で測定した。頭−尾ホモ二量体(ZAβ3A12)2(配列番号113)を比較のために分析に含めた。実験を、異なる日に新たに調製された溶液を用いて二連で実施した。
さらなる分析に向けてAβペプチド結合変異体の数を制限するために、37個のユニークなクローンがオフ・レート測定によってランク付けされ、ブドウ球菌細胞表面上に発現された。ビオチン化Aβ1~40との結合変異体のインキュベーション後、非標識Aβペプチドを4倍過剰で加え、解離させた。次に、Aβペプチド結合と表面発現レベルとの間の比を決定した(FL−2/FL−6)。全てのクローンは(ZAβ3A12)2(配列番号113)と比較して、Aβペプチドからのかなり遅い解離を示した(図6)。
可溶性Aβペプチド結合ポリペプチドの発現及び精製
概要
本実施例では、実施例4で選択された8つのポリペプチド、すなわちABPP070、084、095、018、028、035、049及び050、を発現し、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって精製した。
8つの親和性成熟Aβ結合ポリペプチド及び(ZAβ3A12)2(配列番号113)を生成し、さらなる特性評価のために精製した。ポリペプチドをコードするDNA配列を、上流NdeI及び下流XhoI制限部位を導入するプライマーを用いて、PCRによってコロニーから増幅した。その後DNA配列をNdeI及びXhoI消化した発現ベクターpET26b+(Novagen)にサブクローニングし、C−末端His6タグを有するコンストラクトを生成した。プラスミドをヒートショックによってBL21大腸菌細胞に形質転換した。細胞を37℃でTSB中で培養し、OD600が約1に達したら、1mMの最終濃度までのIPTGの添加によって発現を誘導した。25℃での一晩のインキュベーション後、細胞を遠心分離によって回収した(4000rpm、8分、4℃)。次に細胞を超音波処理によって溶解させ、細胞残屑を遠心分離によって除去した(16,000rpm、20分、4℃)。Aβペプチド結合ポリペプチドを、ネイティブ条件下(洗浄緩衝液:20mMのNaHPO4、300mMのNaCl、15mMのイミダゾール、pH7.4、0.45μm濾過;溶出緩衝液:20mMのNaHPO4、300mMのNaCl、150mMのイミダゾール、pH7.4、0.45μm濾過)で、HisPur(商標)Cobalt resin(Thermo Scientific)を用いてIMACによって精製した。次に、潜在的な多量体を、Superdex 75ゲル濾過カラム(GE Healthcare)及びランニング緩衝液としてPBSを使用してAKTAexplorer 10上で、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって除去した。その後Aβペプチド結合ポリペプチドの分子量及び純度を、LC/MS(Agilent Technologies 6520 ESI-Q-TOF)及びSDS−PAGEによって、還元及び非還元条件下の両方で、確認した。タンパク質濃度を、280nmでの吸光度測定によって決定した。
オン・セルランキングからの8つのAβペプチド結合ポリペプチド(配列番号70、84、95、18、28、35、49及び50にそれぞれ対応する、ABPP070、084、095、018、028、035、049及び050)を発現ベクターにサブクローニングし、C−末端His6タグ化ポリペプチドとして大腸菌で産生した。ポリペプチドをIMACにより精製し、続くSECによって潜在的な多量体複合体を除去した。還元及び酸化条件両方の下での溶出画分のSDS−PAGE分析は、約14kDaの正確なサイズを有する純粋なタンパク質を示した(図7)。
Aβペプチド結合ポリペプチドの特性評価
概要
本実施例では、実施例5で発現されたポリペプチド、すなわちABPP070、084、095、018、028、035、049及び050のAβペプチドに対する親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて分析し、そしてABPP095をさらに円二色性(CD)分光法によって特性評価した。
オフ・レート及び親和性のバイオセンサー分析:精製されたAβペプチド結合ポリペプチドの親和性をProteOn XPR36装置(Bio Rad Laboratories、CA、USA)でSPR−ベースのバイオセンサーアッセイを用いて決定した。N−末端ビオチン化Aβ1~40ペプチド(AnaSpec)を、固定化(固定化レベルは約50RUであった)のためにニュートラアビジンセンサーチップ(Bio Rad Laboratories)上に注入した。各ポリペプチドの二連の試料を、固定化されたAβペプチド上に、6.25nM〜50nMの範囲の濃度で注入した。流速は50μl/分であり、会合及び解離をそれぞれ300秒間及び2時間続けた。HBS−EPをランニング緩衝液として使用し、0.5%のSDSを再生に使用した。全ての実験において、ブランク表面上の各試料からの応答を差し引いて、緩衝液の寄与を最小化した。オン及びオフ・レートを、Proteon Manager Software(BioRad Laboratories)を使用して、ラングミュア1:1モデルに対する非線形回帰によって決定した。
オフ・レート及び親和性のバイオセンサー分析:8つの精製したAβペプチド結合ポリペプチドをSPR−ベースのバイオセンサーアッセイを用いる親和性及びオフ・レート決定に供した(表4)。各結合剤の4つの異なる濃度の希釈系列を、固定化されたビオチン化Aβペプチドを有するニュートラアビジンチップ表面上に注入した。相互作用の速度定数を、1サイト(one-site)結合モデルを使用し非線形回帰によって全ての候補について決定し、次にKD値の計算のために使用した。ABPP095はAβ1~40に対して最も高い親和性を示し、340pMの近似解離定数KDを示し、第1世代結合剤について報告された17nMの親和性と比較して50倍改善された親和性に対応する(Hoyer、2008、上記参照)。解離を2時間続け、ABPP095についてのオフ・レートを3.2×10-5秒-1と決定した(図8)。
スパイクされた大腸菌溶解物からのAβペプチドの捕捉
概要
本実施例では、複合体溶液中のAβペプチドを捕捉するABPP095(配列番号95)の能力を、親和性分析を用いて試験した。
ABPP095は、PP013(配列番号107)と称される46アミノ酸のアルブミン結合ドメインに、10アミノ酸の柔軟性リンカーを介してC−末端で遺伝的に融合された。遺伝子をT7プロモーターの制御下でカナマイシン耐性の遺伝子を含むPETベースの発現ベクターに連結した。DNA配列の確認、プラスミド調製及び培養は基本的に上述のとおりに行った。タンパク質精製を基本的に以前に記載されたとおり行ったが(Jonssonら(2008)Prot Eng Des Sel 21(8):515~527)、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスにはヒト血清アルブミンの代わりに抗[アルブミン結合ドメイン]リガンド(社内で作製)を使用した。
Aβペプチドを捕捉するABPP095−PP013(配列番号115)の能力を、親和性分析を用いて試験した。Aβペプチド結合ポリペプチドの効力は長いイン・ビボでの半減期から利益を得る可能性があり、そして、アルブミン結合ドメインへの分子の融合が血清アルブミンへの結合によって循環における時間を劇的に改善することが以前に示されている(Andersenら(2011)J Biol Chem 286(7):5234~5241; Orlovaら(2013)J Nucl Med 54(6):961~968)。それゆえABPP095をPP013に融合し、ポリペプチドが同時にアルブミンと相互作用しながら、Aβを捕捉することができるかどうかを評価するためにアッセイを設計した。ABPP095−PP013を最初にHSA−Sepharoseに結合させ、次いでAβ1~42を含有するPBS(50pg/ml)とインキュベートした。レベルは患者間で有意に変化することが報告されているが、Aβ1~42ペプチドのこの濃度は血液中のAβ1~42ペプチドの生理学的レベルを反映するように選択された(Kouら(2000)、上記参照;Duら(2005)、上記参照;Pesiniら(2012)、上記参照)。捕捉物からの溶出液のSDS−PAGE分析は、ABPP095がAβ1~42ペプチドの効率的かつ選択的な捕捉が可能であることを示した(図10)。溶出液中のより高い分子範囲のバンドはおそらく、HSA−Sepharoseへのタンパク質の非特異的な結合によるものであった。それにもかかわらず、非特異的結合は、Aβに結合するAβペプチド結合ポリペプチドの能力に有意に影響しないようであった。
Aβペプチド結合ポリペプチドで処置したアルツハイマー病モデルマウスの自発運動及び認知試験
概要
本実施例では、アルブミン結合ドメインに融合したABPP095(配列番号95)で処置されたアルツハイマー病モデルマウスの感覚運動及び認知能力を、前記アルブミン結合ドメインに融合した対照ポリペプチドZTaq(配列番号108)の二量体で処置したアルツハイマー病モデルマウスと比較する。
タンパク質生成:ABPP095−PP013(配列番号115)及び(ZTaq)2−PP013(配列番号116)を、実施例7に記載したように調製した。多量体を除去するために、追加の精製を、AKTAシステムにおけるHiLoad 16/60カラム(GE Healthcare)及びランニング緩衝液としてPBSを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。供給業者の推奨に従って、タンパク質を1mlのEndoTrapカラム(Hyglos)を通過させることによって、潜在的な残留エンドトキシンを除去した。タンパク質を1mg/mlの濃度でDPBS(Gibco、Life Technologies)中に溶出させた。その後タンパク質の分子量及び純度を、還元及び非還元条件両方の下で、LC/MS及びSDS−PAGEによって確認した。潜在的な多量体を検出するために、還元並びに非還元形態の多量のタンパク質(20μg)をSDS−PAGEゲル上にロードした。タンパク質濃度を、280nmでの吸光度測定によって決定した。
タンパク質生成:治療剤としてのAβペプチド結合ポリペプチドの効力は長いイン・ビボでの半減期から利益を得るであろうことが期待された。他の非関連標的に対する親和性を有するZ変異体分子を、親和性成熟アルブミン結合ドメインに融合させると、血清アルブミンへの結合によってイン・ビボでの半減期が有意に改善されることが以前に示されている。それゆえ、イン・ビボでの分析のための調製において、高親和性Aβ特異的ABPP095ポリペプチド及び対照ポリペプチドZTaqの二量体をサブクローニングし、C−末端脱免疫化(deimmunized)高親和性アルブミン結合ドメインPP013との融合で発現させた。ポリペプチドとアルブミン結合ドメインとを区切る10アミノ酸リンカーを使用した。ZTaqをABPP095のフォーマットを模倣する頭−尾二量体としてクローニングした。約300mgの各タンパク質をイン・ビボでの試験のために生成し、精製した。多量体をサイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、潜在的なエンドトキシンをEndoTrapカラムを使用して除去した。タンパク質の分子量及び純度をLC/MS及びSDS−PAGEによって確認し(図11)、タンパク質濃度を決定した。
Aβペプチド結合ポリペプチドで処置されたアルツハイマー病モデルマウスの組織学的分析
概要
本実施例は、Aβペプチド結合ポリペプチドABPP095−PP013又は対照ポリペプチドで処置され、実施例8に記載された行動試験後に屠殺した、(2xTg)sweAPP/PS1マウスの組織学的分析について記載する。結果は、ABPP095−PP013が脳アミロイド負荷を実質的に減少させ、この効果が処置された(2xTg)sweAPP/PS1マウスにおける行動改善と関連することを示した。
マウスをペントバルビタールナトリウム(150mg/kg i.p.)で麻酔し、経皮的にかん流し、脳を直ちに取り出して処理した。右半球を過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬固定した。固定後、脳を20%のグリセロール及び2%のジメチルスルホキシド(DMSO)を含有するリン酸緩衝液に移し、切片化するまで4℃で保存した。連続冠状脳切片(40μm)を切断し、エチレングリコール凍結保護剤に入れ、使用するまで−20℃で保存した。切片を免疫組織化学分析のために、i)抗Aβモノクローナル抗体6E10及び4G8の混合物(Covagen Research Products Inc)、ii)アストロサイトを検出するためのポリクローナル抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)抗体(DAKO)で、染色した。染色を以前に記載されたように行った(Boutajangoutら(2009)J Alzheimers Dis18:961~72; Scholzovaら(2009)J Neuroscience 29:1846~54; Liuら(2014)J Neurochem 128:577~91)。
アミロイド負荷の組織学的定量化:ABPP095−PP013処置マウス、対、(ZTaq)2−PP013(対照)処置マウスの皮質及び海馬の歯状回における総アミロイド負荷を、6E10及び4G8抗体の混合物で免疫染色された連続切片に、ランダム不偏サンプリングを用いて立体解析学的技法によって定量した。Aβ免疫染色は、対照群と比較してABPP095−PP013処置マウスの皮質(図14A−C)及び海馬(図15A−C)切片両方におけるAβ蓄積の有意な減少を示した(皮質及び海馬においてそれぞれp=0.03及びp=0.05)。
Aβペプチド結合ポリペプチドで処置したアルツハイマー病モデルマウスからの可溶性及び不溶性Aβの抽出
概要
本実施例は、実施例8に記載された行動試験の後に屠殺され、実施例9に記載されたように組織学的に試験された、(2xTg)sweAPP/PS1マウスの脳における全可溶性Aβ及びAβ凝集体/オリゴマーの評価について記載する。
各脳の左半球を秤量し、均質化のすぐ前に加えた100mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(phenylmethylsulphonyl fluoride)、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル及びPhosSTOPホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche)を含む、組織均質化緩衝液(20mMのTris塩基、pH7.4、250mMのスクロース、1mMのEDTA、1mMのEGTA)にホモジナイズした(10%w/v)。可溶性Aβ及び全Aβの抽出を以前に公開された方法に従って行った(Boutajangoutら(2009)上記参照; Scholtzovaら(2009)上記参照; Goniら(2010)PLoS One 5:e13391; Yangら 2011 上記参照; Liuら 2014、上記参照)。
結果は、対照ポリペプチド(ZTaq)2−PP013で処置されたマウスからの脳と比較したABPP095−PP013処置マウスからの脳における全Aβ及び可溶性Aβのレベルの減少、並びにAβ凝集体/オリゴマーのレベルの減少を示すことが期待される。
Aβペプチド結合ポリペプチドの血漿レベルの測定
概要
本実施例は、実施例8で試験された(2xTg)sweAPP/PS1マウスにおけるABPP095−PP013及び(ZTaq)2−PP013の血漿レベルの評価を記載する。
マウスは、実施例8に記載された行動試験の開始の前に、並びに試験を通じて定期的に採血された。ABPP095−PP013及び(ZTaq)2−PP013の血漿レベルを、0.5μg/ウェルのAβ1-40ペプチド(Yale UniversityのKeck Foundationで合成された)でコーティングされたプレート(Immulon 2HB; Thermo Electron Corp)を用いてELISAによって検出する。1/1000の希釈度で一次ポリクローナルヤギ抗ZIgG(社内で作製)を使用し、続いて標識された二次抗体、例えば抗ヤギIgG−HRP(Jackson)によって、検出を行う。プレートをTMB基質で展開し、反応を2MのH2SO4で停止させ、450nmでの吸光度測定に続く。
結果は、処置された(2xTg)sweAPP/PS1マウスから得られた血漿試料中で経時的にABPP095−PP013及び(ZTaq)2−PP013のレベルを示すことが期待される。
チオフラビン蛍光アッセイによって試験されたAβペプチド結合ポリペプチドによるAβ凝集の阻害
概要
アルツハイマー病(AD)では、Aβペプチドが凝集する傾向がある。事象の経過はイン・ビトロで、例えばチオフラビンT(ThT)蛍光アッセイなどの方法で試験することができる(Hellstrandら(2009)、ACS Chem. Neurosci. 1:13~18)。このアッセイは、アミロイドフィブリルへの結合時のThTの蛍光強度の変化を測定する。増強された蛍光は蛍光分光法によって観察することができる。Aβペプチド凝集を阻害する本明細書に開示されたAβペプチド結合ポリペプチドの能力をThTアッセイで試験する。
様々な濃度の単量体Aβ1~40又はAβ1~42を、200μMのEDTAで補充した20mMのリン酸ナトリウム緩衝液中の20μMのThT(Sigma)と混合する。調製を、透明な底を有する黒色ポリスチレンELISAプレート中で、氷上で行う。96ウェルプレートを37℃に置き、100rpmで振とうすることによって凝集が引き起こされる。ThT蛍光を、Enspireプレートリーダー(Perkin Elmer)で、440及び480nmの励起及び発光フィルターをそれぞれ使用して測定する。蛍光を最初に一定時間にわたって測定し、最適なAβペプチド濃度及び最大凝集に達するのに必要な時間を見出す。凝集を阻害する本明細書に開示されたAβペプチド結合ポリペプチドの能力は、最適化されたAβ:ThT比とともに様々な濃度でAβペプチド結合ポリペプチドを混合し、次に上述された蛍光を読み取ることによって試験される。
結果は、本明細書に開示されたAβペプチド結合ポリペプチドが、ThT凝集アッセイによって測定されるように、イン・ビトロでのAβペプチドの凝集を阻害することが示されると期待される。
蛍光相関分光法(FCS)によって試験されたAβペプチド結合ポリペプチドによるAβ凝集の阻害
材料及び方法
試料調製:Aβ40(AlexoTech AB、Umea、Sweden)を、ペプチド粉末を氷上で10mMのNaOHに1.0mg/mlの濃度に溶解することによって新たに調整し、必要に応じて20mMのHEPES、pH7.0での希釈に続く。蛍光標識されたオピオイドペプチド(カスタム合成及び精製された>98%)(Biomatik)を、非標識Aβ40の新たに調製した溶液に添加し、混合直後に濃度をFCSによって確認した。20μMのAβ結合ポリペプチドABPP095(配列番号95)の存在又は非存在下で、20mMのHEPES、pH7.0、T=20℃中に、10μMの非標識Aβ40、100nMのAβ40−Alexa488及び100nMのAβ40−Alexa647を含有する溶液中で、Aβ40凝集の時間経過をモニターした。
蛍光相関分光法を適用して、Aβ結合ポリペプチドABPP095の存在下又は非存在下での経時的な溶液中におけるAβ40凝集を調べた。結果は、凝集するAβ40の傾向がABPP095の存在下で減少することを示した。拡散時間の分布の変化をモニタリングする拡散時間分析は、凝集サイズの変化を反映し、図17に示されている。ABPP095の非存在下では、拡散時間(τD)のひろがりが約1時間後に現れたのに対し、ABPP095の存在下では拡散時間は低いままだった。
Aβペプチド結合ポリペプチドの鼻腔内投与
概要
鼻腔内薬物投与は、中枢神経系(CNS)への化合物の送達に魅力的な経路である。鼻腔内投与されたタンパク質の有効性は様々なげっ歯類疾患モデル(Thorneら,(2004),Neuroscience、127:481~496; De Rosaら(2005)、Proc. Natl. Acad. Sci. 102:3811−3816; Topkuruら(2013)、Stroke、44:3189~3194; Lochheadら,(2015)、J Cereb. Blood Flow Met. 35:371~381)並びにヒト(reviewed in Lochhead及びThorne(2012)、Adv. Drug Deliv. Rev. 64:614~628)において実証されている。それゆえ鼻腔内投与は脳及び脳脊髄液(CSF)へのAβペプチド結合ポリペプチドの送達について評価される。さらに、全身注射とは対照的に、鼻腔内投与はまた、血液循環における高い曝露を回避し、したがって全身性の副作用の可能性を低下させる。
全ての動物、例えばSprague Dawleyラット(認可された業者からのもの)のプレブリード(Prebleeds)を、投薬の10日前に採取する。鼻腔内投与をイソフルラン麻酔下で行う。動物を仰臥位に置き、合計60μl(1000μg)のAβペプチド結合ポリペプチド(単独で、又はアルブミン結合ドメインPP013(配列番号107)とあわせて)を、ピペットにより10μlの滴下で投与し、各鼻腔を2.5分毎に合計10分かけて処置する。3mMのPz−ペプチド(4−フェニルアゾベンゾキシ−カルボニル−Pro−Leu−Gly−Pro−DArg;Bachem)がAβペプチド結合ポリペプチド製剤に浸透増強剤として含まれ得る。動物を麻酔し、第1の鼻腔内点滴の0.5、2、6、及び24時間後に屠殺する。血液試料を採取し、次いでラットをCSFの採取のためにケタミン+キシラジン/メデトミジンを用いて麻酔する。安楽死させた後、ラットを氷冷PBSでかん流し、嗅球を慎重に採取する。組織を秤量し、ドライアイス上で凍結させ、分析まで−80℃で保存した。脳組織を溶解緩衝液の添加によって調製し、超音波処理に続く。細胞残屑を遠心分離によって除去し、上清及びCSFを、例えば実施例11に記載されたように、Aβペプチド結合ポリペプチド濃度のELISAベースの測定に供する。同じELISA法を適用し、血液試料から回収された血清を分析して、全身曝露を評価する。
結果は、嗅球においてAβペプチド結合ポリペプチドの有意な濃度を示すと期待される。CSF及び血液中の濃度は、Furrerら(2009、J Neuroimmunol 215:65−72)及びThorneら(上記参照)と一致して低いと予想される。嗅球は嗅覚系を介して鼻腔に接続され、脳幹は末梢三叉神経系を介して鼻孔に接続される。CNSへのAβペプチド結合ポリペプチドの送達は、血液脳関門を越えた浸透が必要である用量調整された(例えば同じ系の曝露を得るように調整された)静脈内注射後よりも、鼻腔内投与後にさらに効率的であると期待される。
代替足場を有するAβペプチド結合ポリペプチドの特性評価
概要
本実施例は、代替足場配列におけるAβペプチド結合ポリペプチドABPP095の結合部位の適合、並びに円二色性(CD)分光法及び表面プラズモン共鳴(SPR)によるそのような代替配列の分析について記載する。
ABPP095の足場突然変異変異体のクローニング:C−末端His6タグを有するABPP095(実施例5及び6で使用された)を、両方の部分内で対称的に足場位置でさらに改変した。導入された突然変異を表5に列挙する。合成遺伝子をDNA2.0から注文した。送達されたプラスミドから、ポリペプチドをコードするDNA配列を切断し、続いてNdeI及びXhoI制限部位を用いて発現ベクターpET26b+(Novagen)に連結した。C−末端His6タグを有する生成したコンストラクトは、一般的なフォーマットABPP095#−LEHHHHHHであった。
ABPP095の足場突然変異変異体の生成:全ての変異体は、大腸菌で可溶性遺伝子産物として発現された。各最終タンパク質調製物のSDS−PAGE分析は>98%の純度を示した。正確な酸化単量体の同一性をHPLC−MS分析によって確認した。
追加のAβペプチド結合ポリペプチドの分析
材料及び方法
スクリーニングのためのAβペプチド結合ポリペプチドのサブクローニング:実施例2に記載された細胞ソーティングの第3ラウンドから得られた各ライブラリー(すなわちそれぞれ対称及び非対称ライブラリー)からのクローンの別個の混合物を、PCR増幅し、エンドヌクレアーゼAccI及びXhoIを用いて制限し、同じエンドヌクレアーゼを用いて制限したファージミドベクターpAY02592に連結した(基本的にGronwallら、上記参照に記載されたとおり)。連結物の形質転換をエレクトロコンピテント大腸菌ER2738(Lucigen)に行った。
スクリーニングのためのAβペプチド結合ポリペプチドのサブクローニング:実施例2に記載された細胞ソーティングの第3ラウンドから、クローンをバルクでベクターpAY02592にサブクローニングした。2つの異なるライブラリーの結果を別々に保持し、クローンを大腸菌ER2738に形質転換した。
1.Aβペプチド結合ポリペプチドであって、以下、
−第1のAβペプチド結合モチーフBM1を含む第1の部分、
−第2のAβペプチド結合モチーフBM2を含む第2の部分、及び
−リンカー、
を含み、
ここで、当該モチーフは、同一又は異なってもよく、
ここで、当該結合モチーフBM1及びBM2の各々が、以下、
i)EX2X3YX5X6NLX9A X11QLCAX16IX18X19X20 ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M、Q、R、T及びYから選択され;
X3は、H及びVから選択され;
X5は、F、I及びLから選択され;
X6は、P及びTから選択され;
X9は、N及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X16は、F及びIから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;
X19は、K及びSから選択され;そして
X20は、F、I、L及びRから選択される)
並びに、
ii)i)で定義された配列と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、Aβペプチド結合ポリペプチド。
EX2X3YX5X6NLX9A X11QLCAFIX18X19L ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M、Q、R及びYから選択され;
X3は、H及びVから選択され;
X5は、F、I及びLから選択され;
X6は、P及びTから選択され;
X9は、N及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;そして
X19は、K及びSから選択される)
からなる、項目1に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
EX2VYX5PNLX9A X11QLCAX16IX18X19X20 ED
(式中、互いに独立して、
X2は、I、M、Q、R及びTから選択され;
X5は、F及びLから選択され;
X9は、N及びTから選択され;
X11は、D及びHから選択され;
X16は、F及びIから選択され;
X18は、N、Q及びRから選択され;
X19は、K及びSから選択され;そして
X20は、F、I、L及びRから選択される)
からなる、項目1から4のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
XAGXB−[BM]
(式中、BMは、項目1〜7のいずれか1つで定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
XAは、A及びSから選択され;そして
XBは、G及びRから選択される)
を含む、項目1から7のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
iii)[BM]−DXaSQXbXcXdLLXe EAKKLXfXgXhQA PXi
(式中、BMは、項目1〜7のいずれか1つで定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
Xaは、P、Q、R及びSから選択され;
Xbは、N、Q、R及びSから選択され;
Xcは、A及びSから選択され;
Xdは、K、N及びEから選択され;
Xeは、A、S及びCから選択され;
Xfは、E、N及びSから選択され;
Xgは、D、E及びSから選択され;
Xhは、A及びSから選択され;そして
Xiは、アミノ酸なし、A及びKから選択される)
並びに
iv)iii)で定義された配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される結合モジュールアミノ酸配列、Bmodを含む、項目1〜7のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
[BM]−DXaSQXbAXdLLA EAKKLNDAQA PXi
(式中、BMは、項目1〜7のいずれか1つで定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
Xaは、P、Q、R及びSから選択され;
Xbは、N、Q、R及びSから選択され;
Xdは、K及びNから選択され;そして
Xiは、アミノ酸なし、A及びKから選択される)
からなる、項目9に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
[BM]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAP;及び
[BM]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAP、
から選択されるアミノ酸配列からなる、項目10に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
[BM1]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAPA;
[BM1]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPA;及び
[BM1]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAPA、
から選択されるアミノ酸配列である、Bmodを含む、項目10に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
[BM2]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
[BM2]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;及び
[BM2]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPK、
から選択されるアミノ酸配列である、Bmodを含む、項目10に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
XAGXB−[BMod]
(式中、BModは項目9〜13のいずれか1つで定義したとおりであり、そして、互いに独立して、
XAは、A及びSから選択され;そして
XBは、G及びRから選択される)
を含む、項目8〜13のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
AGG−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAP;
AGG−[BM]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
SGG−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;及び
AGR−[BM]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAP、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目14に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
AGG−[BM1]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGR−[BM1]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQQAKLLAEAKKLNDAQAPA;
AGG−[BM1]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPA;
AGR−[BM1]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAP;
AGR−[BM1]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAP;及び
AGR−[BM1]−DRSQNANLLAEAKKLNDAQAP、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目14に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
AGR−[BM2]−DPSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DRSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DQSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DQSQQANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DPSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DRSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGG−[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
SGG−[BM2]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGR−[BM2]−DRSQRANLLAEAKKLNDAQAPK;
AGG−[BM2]−DSSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;及び
AGG−[BM2]−DPSQNANLLAEAKKLNDAQAPK、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目14に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
(GnSm)p及び(SnGm)p、
(式中、独立して、
n=1〜7、
m=0〜7、
n+m≦8、そして
p=1〜10である)
から選択される一般式を有する、項目19に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
−BM1の配列i)が、配列番号1〜106及び118〜553のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号1〜17、19〜106及び118〜553のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜85に、又は、配列番号18におけるアミノ酸残基69〜90に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−BM1の配列i)が、配列番号1、5、9、13、14、16、18、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号1、5、9、13、14、16、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜85に、又は配列番号18におけるアミノ酸残基69〜90に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−BM1の配列i)が、配列番号18、28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜85に、又は配列番号18におけるアミノ酸残基69〜90に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−BM1の配列i)が、配列番号18、70及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号70及び95におけるアミノ酸残基64〜85のいずれか1つに、又は配列番号18におけるアミノ酸残基69〜90に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−BM1の配列i)が、配列番号95におけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号95におけるアミノ酸残基64〜85に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分が、配列番号1〜106及び118〜553のいずれか1つにおけるアミノ酸残基1〜25を含み、そして
−第2の部分が、配列番号1〜17、19〜106及び118〜553のいずれか1つにおけるアミノ酸残基61〜85、又は配列番号18におけるアミノ酸残基66〜90を含む、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分が、配列番号1、5、9、13、14、16、18、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基1〜25を含み、そして
−第2の部分が、配列番号1、5、9、13、14、16、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基61〜85、又は配列番号18におけるアミノ酸残基66〜90を含む、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分が、配列番号18、28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基1〜25を含み、そして
−第2の部分が、配列番号28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基61〜85、又は配列番号18におけるアミノ酸残基66〜90を含む、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分が、配列番号18、70及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基1〜25を含み、そして
−第2の部分が、配列番号70及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基61〜85、又は配列番号18におけるアミノ酸残基66〜90を含む、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分が、配列番号95におけるアミノ酸残基1〜25を含み、そして
−第2の部分が、配列番号95におけるアミノ酸残基61〜85を含む、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号1〜106及び118〜553のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号1〜17、19〜106及び118〜553のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜107に、又は、配列番号18におけるアミノ酸残基69〜112に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号1、5、9、13、14、16、18、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号1、5、9、13、14、16、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜107、又は、配列番号18におけるアミノ酸残基69〜112に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号18、28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜107、又は、配列番号18におけるアミノ酸残基69〜112に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号18、70及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号70及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜107、又は、配列番号18におけるアミノ酸残基69〜112に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号95におけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号95におけるアミノ酸残基64〜107に対応する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−第1の部分が、配列番号1〜106及び118〜553のいずれか1つからのアミノ酸残基4〜25、1〜25、4〜47又は1〜47に対応するアミノ酸配列を含み;及び
−第2の部分が、配列番号1〜17、19〜106及び118〜553のいずれか1つからのアミノ酸残基64〜85、61〜85、64〜107又は61〜107に、あるいは配列番号18からのアミノ酸残基69〜90、66〜90、69〜112又は66〜112に対応するアミノ酸配列を含み;
ここで、第1及び第2の部分のそれぞれに含まれる両方の前記アミノ酸配列が同じ配列番号に由来する、Aβペプチド結合ポリペプチド。
−項目1から55のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチドからなる第1の部位;及び
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第2の部位、
を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。
−前記発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で項目77に記載の宿主細胞を培養し、そして
−前記ポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
−Aβペプチドを含むことが疑われる試料を提供し、
−前記試料を、項目1〜74のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目80〜82のいずれか1つに記載の組成物と、接触させ、そして
−Aβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の結合を検出すること、
を含み、
ここで、結合の検出が試料中のAβペプチドの存在を示す、方法。
−対象、又は対象から単離された試料を、項目1〜74のいずれか1つに記載のAβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは項目80〜82のいずれか1つに記載の組成物と接触させ、そして
−前記対象又は前記試料に結合した、Aβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の量に対応する値を得ること、
を含む、方法。
−親和性マトリックスへのAβペプチドの結合を許容する条件下で、項目101に記載の親和性マトリックスに試料を適用し;
−親和性マトリックスに結合していない物質の除去のために親和性マトリックスを洗浄し;そして
−親和性マトリックスから結合Aβペプチドを溶出させ、したがって富化Aβペプチド含量を有するAβペプチド画分を得て;そして
−前記Aβペプチド画分を回収すること、
を含む、方法。
−親和性マトリックスへのAβペプチドの結合を許容する条件下で、項目101に記載の親和性マトリックスに試料を適用し;
−親和性マトリックスに結合していない物質の回収のために親和性マトリックスを洗浄し、したがって実質的に減少したAβペプチド含量を有する枯渇画分を得て;そして
−前記枯渇画分を回収すること、
を含む、方法。
−ヒト由来の体液の一部分を提供し;
−体液の一部分を項目101に記載の親和性マトリックスに、親和性マトリックスへのAβペプチドの結合を許容する条件下で適用し、それによって体液の一部分におけるAβペプチドの含量の減少を引き起こし;そして
−当該ヒトに、体液の当該一部分の少なくとも一部を戻すこと、
を含む、方法。
Claims (15)
- Aβペプチド結合ポリペプチドであって、以下、
−第1のAβペプチド結合モチーフBM1を含む第1の部分、
−第2のAβペプチド結合モチーフBM2を含む第2の部分、及び
−リンカー、
を含み、
ここで、当該モチーフは、同一又は異なってもよく、
ここで、当該結合モチーフBM1及びBM2の各々が、以下、
i)EX2X3YX5X6NLX9A X11QLCAX16IX18X19X20 ED
ここで、
−BM1の配列i)が、配列番号18、28、35、49、50、70、84及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号28、35、49、50、70、84及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜85に、又は配列番号18におけるアミノ酸残基69〜90に対応する、
から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここで、当該BM1及びBM2が、同一の配列番号に由来する、Aβペプチド結合ポリペプチド。 - 第1及び第2の部分の少なくとも1つが、以下、
iii)[BM]−DXaSQXbXcXdLLXe EAKKLXfXgXhQA PXi
(式中、BMは、請求項1で定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
Xaは、P、Q、R及びSから選択され;
Xbは、N、Q、R及びSから選択され;
Xcは、A及びSから選択され;
Xdは、K、N及びEから選択され;
Xeは、A、S及びCから選択され;
Xfは、E、N及びSから選択され;
Xgは、D、E及びSから選択され;
Xhは、A及びSから選択され;そして
Xiは、アミノ酸なし、A及びKから選択される)
並びに、
iv)iii)で定義された配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される結合モジュールアミノ酸配列、Bmodを含む、請求項1に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。 - 配列iii)が、以下のアミノ酸配列、
[BM]−DXaSQXbAXdLLA EAKKLNDAQA PXi
(式中、BMは、請求項1で定義されたBM1又はBM2であり、そして、互いに独立して、
Xaは、P、Q、R及びSから選択され;
Xbは、N、Q、R及びSから選択され;
Xdは、K及びNから選択され;そして
Xiは、アミノ酸なし、A及びKから選択される)
からなる、請求項2に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。 - −BM1の配列i)が、配列番号18、28、35、49、50、70、84及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号28、35、49、50、70、84及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜85に、又は配列番号18におけるアミノ酸残基69〜90に対応する、
請求項1から3のいずれか一項に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。 - −BM1の配列i)が、配列番号95におけるアミノ酸残基4〜25に対応し、そして
−BM2の配列i)が、配列番号95におけるアミノ酸残基64〜85に対応する、
請求項4に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。 - −第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号18、28、35、49、50、70、84及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号28、35、49、50、70、84及び95のいずれか1つにおけるアミノ酸残基64〜107、又は、配列番号18におけるアミノ酸残基69〜112を含む、
請求項2に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。 - −第1の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号95におけるアミノ酸残基4〜47に対応し、そして
−第2の部分のBmodにおける配列iii)が、配列番号95におけるアミノ酸残基64〜107に対応する、
請求項6に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。 - Aβペプチド結合ポリペプチドであって、配列番号1、5、9、13、14、16、18、20、21、25、26、28、33、35、37、40、42、48、49、50、51、53、54、55、59、60、61、62、64、65、70、72、75、78、84、89、90、95、96、97、100、104及び118〜159からなる群から;例えば、配列番号18、28、35、49、50、51、55、59、64、65、70、72、78、84、95及び118〜159からなる群から、例えば、配列番号18、70及び95からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、例えばアミノ酸配列の配列番号95を含む、Aβペプチド結合ポリペプチド。
- 相互作用のKD値が、多くとも1×10-7M、例えば多くとも1×10-8M、例えば多くとも1×10-9M、例えば多くとも1×10-10Mであるように、Aβペプチドに結合することができる、請求項1から8のいずれか一項に記載のAβペプチド結合ポリペプチド。
- −請求項1から9のいずれか一項に記載のAβペプチド結合ポリペプチドからなる第1の部位;並びに、
−所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第2の部位、
を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。 - 前記所望の生物学的活性が、結合活性、例えば、Tau、アポリポタンパク質E(ApoE)、ベータ−セクレターゼ1(BACE1)、ガンマ−セクレターゼ、トランスフェリン受容体(TfR)、補体因子C1s、プレセニリン1、プレセニリン2、ニカストリン、アルファ−シヌクレイン及びBriからなる群から選択される標的への結合である、請求項10に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
- 前記第2の部位が、抗体及びその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項10又は11に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のAβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、並びに少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含有し、例えば少なくとも1つの追加の活性薬剤をさらに含有する、組成物であって、ここで、当該追加の活性薬剤が、例えば、神経伝達物質分解の阻害剤、神経伝達物質、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、NMDA受容体アンタゴニスト、TNF阻害剤、抗ヒスタミン剤、抗ウイルス剤、アルファ−セクレターゼ活性化剤、ベータ−又はガンマ−セクレターゼの阻害剤、α−シヌクレイン凝集の阻害剤、タウ凝集の阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、酸化ストレスに対して有効な化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、DNA修復の阻害剤、例えばピレンゼピン及び代謝産物、Aβを除去/枯渇させる細胞成分のための誘引剤、ピログルタミン酸化された(pyroglutamated)Aβ3~42を含むN−末端切断Aβの阻害剤、抗炎症性分子、非定型抗精神病薬、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール及びオランザピン、コリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)、例えばタクリン、リバスチグミン、ドネペジル及びガランタミン、M1アゴニスト及び任意のアミロイド又はタウ修飾薬(tau modifying drug)を含む他の薬剤及び栄養補助食品、例えばビタミンB12、システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、イチョウ(Ginkgo biloba)、アセチル−L−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、及びキサンチン誘導体、からなる群から選択されてもよい、組成物。
- 薬剤として、診断剤として、又は予後剤としての使用のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のAβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート、あるいは請求項13に記載の組成物。
- Aβペプチド関連症状の治療、診断又は予後における使用のための、請求項14に記載のAβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物であって、当該Aβペプチド関連症状は例としてアミロイドーシスからなる群から選択され、当該アミロイドーシスとは、続発性アミロイドーシス及び加齢に伴うアミロイドーシスを含む、アミロイドプラークの形成に関連する疾患及び障害の群を意味し、例としては、これらに限定されるものではないが、認知記憶能力(cognitive memory capacity)の喪失を特徴とする神経障害又は状態、例えば、アルツハイマー病(AD)、軽度認知障害(MCI)、レビー小体認知症(Lewybody dementia)、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型)、グアムパーキンソン認知症複合(Guam Parkinson-dementia complex);並びに、アミロイド様タンパク質に基づくか、又は関連する他の疾患、例えば脳アミロイド血管症、原発性及び続発性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー1、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病(Creutzfeld Jacob disease)、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、封入体筋炎(IBM)、II型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス;並びに、緑内障、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症(drusen-related optic neuropathy)、及びベータアミロイド沈着による白内障を含む、様々な眼疾患等が挙げられる、Aβペプチド結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
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