JP6105479B2 - 血清アルブミンに結合する設計リピートタンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、血清アルブミンについての結合特異性を伴う設計リピートタンパク質、ならびにそのような血清アルブミン結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、生物活性化合物の薬物動態を改変するためのそのようなタンパク質の使用、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用に関する。
それらの薬物動態(PK)のインビボ特性を調節又は増加させることにより、生物活性化合物(例えばタンパク質治療法など)の有効性を増加させる医薬品業界の強い関心がある。これは、特に、腎クリアランスにより循環から迅速に排除される生物活性化合物について当てはまる。腎臓は、一般的に、見掛けの分子量60kDa未満を有する分子を循環からろ過排泄する。そのような小さな生物活性化合物の薬物動態特性を改善するための1つの戦略は、例えば、非タンパク質性ポリマー部分(例えばポリエチレングリコールポリマー又は糖残基など)の付加あるいはタンパク質性ポリマー部分(例えば球状タンパク質など)又は非構造ポリペプチド(例えばWO 2007/103515及びWO 2008/155134に記載されるものなど)の付加を通じて、単純に見掛けの分子量を増加させること(即ち、それらの流体力学半径を増加させること)である。
本発明は、少なくとも1つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号49、50、51、及び52、ならびに、配列番号49、50、51、及び52中の9つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により置換されている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む。
本発明に従った結合ドメインは、哺乳動物の血清アルブミン(xSA)について特異的である。好ましくは、本発明に従った結合ドメインは、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、サル、又はヒト由来の血清アルブミンについて特異的である。より好ましくは、本発明に従った結合ドメインは、ヒト由来の血清アルブミン(HSA)について特異的である。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、及びX9は、互いに独立して、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、及びYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
好ましくは、ここで、
X1は、A、D、M、F、S、I、T、N、Y、及びK;より好ましくは、K及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、E、K、D、F、M、N、I、及びY;より好ましくは、I、E、及びYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、W、R、N、T、H、K、A、及びF;より好ましくは、W、R、及びFからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、G及びSからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、N、T、及びHからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、N、V、及びRからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X7は、E、Y、N、D、H、S、A、Q、T、及びG;より好ましくは、E、Y、及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X8は、E及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X9は、S、A、Y、H、及びN;より好ましくは、Y及びHからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号53においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
X1は、A、D、M、F、S、I、T、N、Y、及びK;好ましくは、K及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、E、K、D、F、M、N、I、及びY;好ましくは、I、E及びYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、W、R、N、T、H、K、A、及びF;好ましくは、W、R、及びFからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、N、T、及びHからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、N、V、及びRからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、E、Y、N、D、H、S、A、Q、T、及びG;好ましくは、E、Y、及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X7は、S、A、Y、H、及びN;好ましくは、Y及びHからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号10においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
X1は、D、K、及びA;好ましくは、K及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、D、G、及びS;好ましくは、G及びSからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、E、N、D、H、S、A、Q、T、及びG;好ましくは、Q、D、及びN;より好ましくは、Q及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、G及びDからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、E、K、及びG;好ましくは、E及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、H、Y、A、及びN;好ましくは、H、A、及びY;より好ましくは、A及びYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号11においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
X1は、F、S、L、及びK;好ましくは、S及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、V及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、R及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、S及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、N、D、Q、S、A、T、及びE;好ましくは、D及びQからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、A、H、Y、S、及びN;好ましくは、A及びHからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号54においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
X1は、F、S、L、及びK;好ましくは、S及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、V及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、R及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、S及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、A、H、Y、S、及びN;好ましくは、A及びHからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号12においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
X1は、K、A、D、M、F、S、I、T、N、及びY;好ましくは、K及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、E、K、D、F、M、N、及びY;好ましくは、E、D、及びYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、R、N、T、H、K、A、及びF;好ましくは、R及びFからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、I及びMからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、H、Y、K、A、及びN;好ましくは、K及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号13においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を伴うリピートモジュールを含み、
ここで、
X1は、Q及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、L及びPからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、H、N、Y、及びA;好ましくは、H及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、G及びSからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、A、V、T、及びS;好ましくは、S及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、V及びFからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
ここで、場合により、配列番号14においてXを用いて表示される位置以外における5までのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される。
を有するN末端キャッピングモジュール(即ち、キャッピングリピート)及びアミノ酸配列
を有するC末端キャッピングモジュール(即ち、キャッピングリピート)が記載される。Interlandi et al., 2008(前掲文献)には、アミノ酸配列
及び
を有するC末端キャッピングモジュールが記載される。
を含み、
ここで、X1はアミノ酸残基G、A、又はDを表し;
ここで、X2はアミノ酸残基G又はDを表し;
ここで、X3はアミノ酸残基L、V、I、A、又はM;好ましくは、L又はMを表し;そして、
ここで、X4はアミノ酸残基A、H、Y、K、R、又はN;好ましくは、A又はNを表す。
を含み、
ここで、X1はアミノ酸残基Q又はKを表し;
ここで、X2はアミノ酸残基A、S、又はF;好ましくは、S又はFを表し;
ここで、X3はアミノ酸残基A又はPを表し;
ここで、X4はアミノ酸残基A又はFを表し;
ここで、X5はアミノ酸残基I又はLを表し;
ここで、X6はアミノ酸残基S又はAを表し;
ここで、X7はアミノ酸残基I又はAを表し;
ここで、X8はアミノ酸残基A、E、又はN;好ましくは、A又はNを表し;
ここで、X9はアミノ酸残基N又はHを表し;
ここで、X10はアミノ酸残基L又はIを表し;
ここで、X11はアミノ酸残基I又はVを表し;そして、
ここで、X4がFを表し、X7がIを表し、X8がN又はEが表す場合、X2はFを表さない。
を含み、
ここで、X1はアミノ酸残基Q又はKを表し;
ここで、X2はアミノ酸残基A、S、又はF;好ましくは、S又はFを表し;
ここで、X3はアミノ酸残基A又はPを表し;
ここで、X4はアミノ酸残基I又はLを表し;
ここで、X5はアミノ酸残基S又はAを表し;
ここで、X6はアミノ酸残基I又はAを表し;
ここで、X7はアミノ酸残基A、E、又はN;好ましくは、A又はNを表し;
ここで、X8はアミノ酸残基N又はHを表し;
ここで、X9はアミノ酸残基L又はIを表し;そして、
ここで、X10はアミノ酸残基I又はVを表す。
を含み、
ここで、X1はアミノ酸残基Q又はKを表し;
ここで、X2はアミノ酸残基A、S、又はF;好ましくは、S又はFを表し;
ここで、X3はアミノ酸残基A又はPを表し;
ここで、X4はアミノ酸残基I又はLを表し;
ここで、X5はアミノ酸残基S又はAを表し;
ここで、X6はアミノ酸残基A、E、又はN;好ましくは、A又はNを表し;
ここで、X7はアミノ酸残基N又はHを表し;
ここで、X8はアミノ酸残基L又はI;そして、
ここで、X9はアミノ酸残基I又はVを表す。
ここで、
位置1のアミノ酸残基は、Q又はKであり;
位置4のアミノ酸残基は、S又はFであり;
位置9のアミノ酸残基は、A又はFであり;
位置13のアミノ酸残基は、A又はIであり;
位置15のアミノ酸残基は、A、E、又はNであり;そして、
ここで、前記C末端キャッピングモジュールは、配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列を有さない。
位置4のアミノ酸残基はSであり;
位置9のアミノ酸残基はAであり;
位置13のアミノ酸残基はAであり;及び/又は、
位置15のアミノ酸残基はAである。
下に開示される出発材料及び試薬の全てが、当業者に公知であり、商業的に利用可能である、又は、周知の技術を使用して調製することができる。
化学薬品はFluka(スイス)から購入した。オリゴヌクレオチドはMicrosynth(スイス)からであった。特記なき場合、DNAポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、New England Biolabs(USA)又はFermentas(リトアニア)からであった。クローニング及びタンパク質産生株は、大腸菌XL1−blue(Stratagene、USA)又はBL21(Novagen、USA)であった。異なる種からの精製血清アルブミン及び血清を購入した(例、Sigma-Aldrich、Switzerland又はInnovative Research、USAから)。異なる種のビオチン化血清アルブミンを、標準的なビオチン化試薬及び方法を使用して、精製血清アルブミンの1級アミンへのビオチン部分の結合を介して化学的に得た。
特記なき場合、方法は、記載されるプロトコールに従って実施する(Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory 1989, New York)。
N2C及びN3C設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーが記載されている(WO 2002/020565; Binz et al. 2003、前掲文献;Binz et al. 2004、前掲文献)。N2C及びN3C中の桁は、N末端とC末端キャッピングモジュールの間に存在する無作為化リピートモジュールの数を記載する。リピート単位及びモジュール内部の位置を定義するために使用される命名法は、Binz et al. 2004、前掲文献に基づき、アンキリンリピートモジュール及びアンキリンリピート単位の境界が、1つのアミノ酸位置だけシフトしているという改変を伴う。例えば、Binz et al. 2004(前掲文献)のアンキリンリピートモジュールの位置1は、本開示のアンキリンリピートモジュールの位置2に対応する。結果的に、Binz et al. 2004(前掲文献)のアンキリンリピートモジュールの位置33は、以下の本開示のアンキリンリピートモジュールの位置1に対応する。
リボソームディスプレイ(Hanes, J. and Pluckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997)を使用し、xSAについての結合特異性を伴う多くの設計アンキリンリピートタンパク質(DARPin)を、Binz et al.2004(前掲文献)により記載されるN2C又はN3C DARPinより選択した。特異的(xSA;即ち、MSA、HSA、又はCSA)及び非特異的(MBP、大腸菌マルトース結合タンパク質)標的に向けた、選択されたクローンの結合を、粗抽出物ELISAにより評価し、xSA結合タンパク質が成功裏に選択されたことを示す。配列番号17〜31のリピートドメインは、xSAについての結合特異性を伴うリピートドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。選択された結合剤の配列解析によって、選択された結合剤の特定のファミリーに固有の特定のアンキリンリピート配列モチーフが明らかになった。xSAについての結合特異性を伴うリピートドメイン中に存在する、そのようなアンキリンリピート配列モチーフを、配列番号11〜14に提供する。
血清アルブミンに特異的なアンキリンリピートタンパク質の選択は、リボソームディスプレイ(Hanes and Pluckthun、前掲文献)により、標的タンパク質としてのHSA、CSA、又はMSA、記載される設計アンキリンリピートタンパク質のライブラリー(WO 2002/020565、Binz et al., 2003、前掲文献、及びBinz et al., 2004、前掲文献)、及び確立されたプロトコール(Zahnd, C., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007)を使用して実施した。リボソームディスプレイ選択ラウンドを、HSA、CSA、又はMSA(ニュートラアビジン又はストレプトアビジン上に固定化されたHSA又はMSAのビオチン化変異体を含む)上で、N2C及びN3C DARPinライブラリーの両方を用いて、確立されたプロトコール(Binz et al. 2004、前掲文献)を使用して実施した。各々の選択ラウンド後の逆転写(RT)−PCRサイクルの数を、40から30に、一定に低下させ、結合剤の濃縮に起因する収率に調整した。HSA、CSA、又はMSA上での4つの選択ラウンドは、マイクロモルからナノモルの親和性DARPinのプールをもたらし、単一クローンのELISA及びSPR測定により明らかにされた通りである。特定のDARPinの親和性を、さらに、当業者に周知の方法による親和性成熟を使用して、改善した(上に記載する通りに、改善された結合剤についてのエラープローンPCRならびに選択及びスクリーニングによりDARPinクローンを多様化することによる)。
xSAに特異的に結合する個々の選択されたDARPinを、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により、DARPin発現細胞の大腸菌粗抽出物を使用して、標準的なプロトコールを使用して同定した。リボソームディスプレイにより、選択されたクローンを、pQE30(Qiagen)発現ベクター中にクローン化し、大腸菌XL1−Blue(Strategene)中に形質転換し、次に、37℃で、1mlの成長培地(1%グルコース及び100μg/mlアンピシリンを含む2YT)を含む96深底ウェルプレート(単一ウェル中に各々のクローン)中で一晩成長させた。50μg/mlアンピシリンを含む1mlの新鮮2YTに、新たな96深底ウェルプレートにおいて、100μlの一晩培養物を用いて接種した。2時間にわたる37℃でのインキュベーション後、発現を、IPTG(1mM最終濃度)を用いて誘導し、3時間にわたり継続させた。細胞を収集し、100μlのB−PERII(Pierce)中に再懸濁し、室温で振盪しながら15分間にわたりインキュベートした。次に、900μlのPBS−TC(0.25%カゼイン加水分解物、0.1% Tween20(登録商標)、pH7.4を添加したPBS)を加え、細胞細片を遠心により除去した。100μlの各々の溶解クローンを、xSA又はそれらのビオチン部分を介して固定化された無関係のMBPのいずれかを含む、NeutrAvidinコーティングしたMaxiSorpプレートのウェルに適用し、1時間にわたり室温でインキュベートした。PBS−T(0.1% Tween 20(登録商標)を添加したPBS、pH7.4)を用いた十分な洗浄後、プレートを、モノクローナル抗RGS(His)4抗体(34650、Qiagen)を一次抗体として、アルカリフォスファターゼと共役させたポリクローナルヤギ抗マウス抗体(A3562、Sigma)を二次試薬として使用した標準的なELISA手順を使用して開発した。結合を、次に、2ナトリウム4−ニトロフェニルリン酸(4NPP、Fluka)をアルカリフォスファターゼのための基質として使用することにより検出した。色の発生を、405nmで測定した。そのような細胞粗抽出物ELISAによる数百のクローンのスクリーニングによって、xSAについての特異性を伴う百を上回る異なるDARPinが明らかになった。これらの結合タンパク質を、さらなる解析のために選んだ。xSAに特異的に結合する、選択されたリピートドメインのアミノ酸配列の例を、配列番号17〜31、37〜40、及び43〜48において提供する。
xSAについての結合特異性を伴う、選択されたリピートドメインのアミノ酸配列を、さらに、当業者に公知の配列解析ツールにより解析した(WO 2002/020565; Forrer et al., 2003、前掲文献;Forrer, P., Binz, H.K., Stumpp, M.T.及びPluckthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004)。しかしながら、天然リピートモチーフを使用し、リピート配列モチーフを推定したWO 2002/020565とは対照的に、本明細書において、リピート配列モチーフを、xSAについての結合特異性を伴う、選択されたリピートドメインのリピート単位から推定した。それにより、共通のリピート配列モチーフを含む、選択されたリピートドメインのファミリーを決定した。xSAについての結合特異性を伴うリピートドメイン中に存在する、そのようなリピート配列モチーフを、配列番号11〜14に提供する。
さらなる解析のために、上に記載する通りの細胞粗抽出物ELISAにおいて特異的なxSA結合を示す、選択されたクローンを、大腸菌BL21又はXL1−Blue細胞において発現させ、標準的なプロトコールを使用し、それらのHisタグを使用して精製した。25mlの一晩静置培養物(LB、1%グルコース、100mg/Lアンピシリン;37℃)を使用し、1Lの培養物(同じ媒質)に接種した。600nmでの吸光度0.7で、培養物を、0.5mMのIPTGを用いて誘導し、37℃で4時間にわたりインキュベートした。培養物を遠心し、結果として得られたペレットを、40mlのTBS500(50mM Tris−HCl、500mM NaCl、pH8)中に再懸濁し、超音波処理した。ライセートを再遠心し、グリセロール(10%(v/v)最終濃度)及びイミダゾール(20mM最終濃度)を、結果として得られた上清に加えた。タンパク質を、製造業者(QIAgen、ドイツ)の指示に従い、Niニトリロ三酢酸カラム(2.5mlカラム容積)上で精製した。あるいは、6xHisタグを欠くDARPin又は選択されたリピートドメインを、陰イオン交換クロマトグラフィー、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより、標準的な樹脂及び当業者に公知のプロトコールに従って精製した。血清アルブミンへの結合特異性を伴う、高度に可溶性のDARPinの200mgまでを、1リットルの大腸菌培養物から精製することができ、SDS−15% PAGEから推定した通り、純度>95%を伴う。そのような精製DARPinを、さらなる特徴付けのために使用する。
xSAについての結合特異性を伴うDARPin#19〜22及びDARPin#27〜30を、上に記載する通り、それらのHisタグを使用して、均質近くまで精製し、28日間にわたり、30mg/ml(〜2mM)で、40℃でPBS中に保存した(安定性試験)。0日目(図1a)及び28日目(図1b)に、サンプルを取り、500μMまで希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により解析し、それらの見掛けの分子量及び安定性(即ち、それらの凝集、多量体化、又は分解傾向)を経時的に評価した。
分析的SECを、Superdex 200 5/150カラム(図1a及び図1b)又はSuperdex 200 10/300GLカラム(図1c)(GE Healthcare)のいずれかを使用したHPLCシステム(Agilent 1200シリーズ)を使用して、20℃で行った。Superdex 200 5/150カラムは、床容積3.0ml、及び空隙容積1.08mlを有する(ブルーデキストランを使用して実験的に決定)。Superdex 20010/300GLカラムは、床容積24ml、及び空隙容積約8mlを有する。測定は、当業者に公知の標準的手順に従って実施した。泳動を、流速0.2ml/分及び最高圧力15バール(Superdex 200 5/150)又は0.6ml/分及び最高圧力18バール(Superdex 200 10/300GL)で、PBS中で行った。タンパク質のサンプルを、PBS中で約20〜500μMまで希釈し、ろ過し(0.22μm)、希釈サンプルの20〜100μlを、分離のために、カラム上に注入した。タンパク質サンプルの溶出プロファイルを、280nmでの吸光度を読むことにより記録した。分子量6.5kDaを伴うアプロチニン(AP)、分子量29kDaを伴う炭酸脱水酵素(CA)、及び分子量75kDaを伴うコンアルブミン(CO)を標準タンパク質として使用し、サンプルタンパク質の見掛けの分子量を決定することができる較正曲線を得た。
xSAについての特異性を伴うDARPinの熱的安定性を、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて解析した(Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221, 2007)。それにより、タンパク質(即ち、そのようなDARPin)がアンフォールディングする温度を、タンパク質の疎水性部分(タンパク質がアンフォールディングする時に露出される)についての親和性を伴う色素(例、SYPRO Orange; Invitrogen、カタログ番号S6650)の蛍光における増加により測定する。それにより得られた蛍光遷移の中点(より低い蛍光強度からより高い蛍光強度まで)での温度は、次に、分析したタンパク質の中点変性温度(Tm)に対応する。
SYPROオレンジを蛍光色素として使用したDARPinの熱的変性を、リアルタイムPCR機器(即ち、CFX96光学システム(BioRad)との組み合わせにおけるC1000サーマルサイクラー(BioRad))を使用して測定した。DARPinを、80μM濃度で、1xSYPRO Orange(5’000x SYPRO Orange原液から希釈、Invitrogen)を含むPBS(pH7.4)又はMES緩衝液(pH5.8)のいずれかにおいて調製し、50μlのそのようなタンパク質溶液又は緩衝液だけを、白色96ウェルPCRプレート(Bio-Rad)中に加えた。プレートを、Microseal 'B' Adhesive Seals(Bio-Rad)を用いてシールし、リアルタイムPCR機器において20℃から95℃まで、0.5℃増分(各々の温度増分後の25秒の保持段階を含む)で加熱した。DARPinの熱的変性の後に、各々の温度増分でのサンプルの相対蛍光単位の測定が続いた。プレートのウェル中の相対蛍光単位を、リアルタイムPCR機器のチャネル2(即ち、励起は515〜535nmであり、検出は560〜580nmであった)を使用して測定した。緩衝液だけについて得られた、対応する値を減算した。それにより得られた熱的変性転移の中点から、分析されたDARPin についてのTm値を決定することができる。
xSAについての結合特異性を伴うDARPinを、フローセル中で、それらのHisタグを介して、コーティングされたα−RGS−His抗体(Qiagen、カタログ番号34650)に固定化し、ヒト、カニクイザル(cyno)、マウス、ラット、ウサギ、及びイヌの血清アルブミンと固定化DARPinとの相互作用を解析した。
SPRを、ProteOn機器(BioRad)を使用して測定した。測定は、当業者に公知の標準的な手順に従って実施した。泳動緩衝液は、0.01% Tween 20(登録商標)を含むPBS(pH7.4)であった。抗RGS His抗体を、約2000共鳴単位(RU)のレベルまで、GLCチップ(BioRad)上に共有結合的に固定した。抗体コーティングされたチップ上でのDARPinの固定化を、次に、300秒において150μlの1μM DARPin溶液を注射することにより実施した(流速=30μl/分)。異なる種の血清アルブミンとの相互作用を、次に、60秒間で、濃度400、200、100、50nmで異なる血清アルブミンを含む容積100μl泳動緩衝液(0.01% Tween(登録商標)を含むPBS)(オン速度測定)、それに続く、10〜30分間にわたる泳動緩衝液流(流速=100μl/分)(オフ速度測定)を注入することにより測定した。非コーティングレファレンスセル及びレファレンス注入(即ち、泳動緩衝液だけの注入)のシグナル(即ち、共鳴単位(RU)値)を、血清アルブミンの注入後に得られたRUトレースから減算した(ダブルレファレンス)。オン速度及びオフ速度の測定値から得られたSRPトレースから、対応するDARPin血清アルブミン相互作用のオン及びオフ速度を決定することができる。
マウス及びカニクイザル(Macaca fascicularis、また、「cyno」として省略される)におけるDARPinの血漿中終末相半減期を、当業者に公知の標準的な手順に従って決定した(Toutain, et al.、前掲文献)。特定の量のDARPinを、哺乳動物中に静脈内注射し、血漿からのDARPinクリアランスを、その血漿中濃度を追跡することにより経時的に追跡した。DARPin濃度は、最初に、偽平衡に達するまで減少し(アルファ相)、血漿中でのDARPin濃度の指数関数的なさらなる減少が続いた(ベータ相)。このベータ相から、DARPinの血漿中終末相半減期を、次に、算出することができる。
xSAについての結合特異性を伴うDARPinの血漿クリアランスを評価するために、テストタンパク質を放射標識し、未感作Balb/cマウスの尾静脈中に注射した。以下のDARPinを注射した:DARPin#19、DARPin#21、DARPin#23、DARPin#25、DARPin #18, 、DARPin#32、DARPin#35、DARPin#36 、DARPin#33、DARPin#34、DARPin#37、DARPin#38、DARPin#43、DARPin#44、DARPin#45、DARPin#46、DARPin#47、及びDARPin#48。DARPinを、以前に記載された通りに、99mTcカルボニル複合体を用いて放射標識した(Waibel, R., et al., Nature Biotechnol.17(9), 897-901, 1999)。DARPin(40μg)を、PBS(pH7.4)中の400μlに希釈する前に、1時間にわたり、99mTcカルボニル(0.8〜1.6mCi)を用いてインキュベートした。各々のマウスに、それにより得られた標識DARPin溶液(10μgタンパク質及び0.2〜0.4mCiと等価)の100μlを用いて静脈内注射した。マウスの血液サンプルを、初回注射後1時間、4時間、24時間、及び48時間目に採取し、サンプルの放射活性を測定した。特定の時間点で測定した放射活性のレベルは、その時間点で血漿中に依然として存在するDARPinの量についての直接的な測定値である。%注射用量は、99mTcの放射活性崩壊について補正された注射サンプルの全放射活性と比べた、特定の時間点で測定されたマウスの全血液(18gのマウスについて1.6ml)での全放射活性のパーセンテージである。
PBS中で希釈したDARPinを、カニクイザルの橈側皮静脈内にボーラス注射として注射した。以下のDARPinを注射した:DARPin#26(0.5mg/kg)、DARPin#24(0.5mg/kg)、DARPin#17(0.5mg/kg)、DARPin#34(1mg/kg)、及びDARPin#32(0.5mg/kg)。注射後の異なる時間点で、血漿を、動物の大腿静脈から採取した血液から生成した。血漿サンプル中のDARPinの濃度を、次に、当業者に公知の標準的なプロトコールを使用したサンドイッチELISA及び公知のDARPin濃度を伴う適切なDARPin標準曲線により決定した。
DARPinの熱的安定性を、実施例3に記載する通り、蛍光ベースの熱的安定性アッセイを用いて分析した。あるいは、DARPinの熱的安定性を、CD分光法により、即ち、当業者に周知の技術による222nmでのその円偏光二色性(CD)シグナルに従うことによる、その熱変性の測定により分析した。サンプルのCDシグナルを、1℃/分の温度勾配を使用して、PBS(pH7.4)中で濃度0.02mMのタンパク質を20℃から95℃までゆっくり加熱しながら、Jasco J-715機器(Jasco、日本)において222nmで記録した。これは、DARPinの変性を追跡するための効果的な手段である。なぜなら、それらは、主に、アンフォールディング時に、222nmでのそれらのCDシグナルにおける強い変化を示すアルファヘリックスからなるからである。DARPinについてのそのような測定されたCDシグナルトレースの観察された転移の中点は、そのTm値に対応する。
Claims (22)
- 少なくとも1つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、該アンキリンリピートドメインは、下記:
(1)配列番号49、及び
(2)(a)配列番号49における5つまでのアミノ酸が別のアミノ酸により交換され、かつ、(b)アンキリンリピート配列モチーフ
を有するアミノ酸配列であって、
ここで、
X1は、D、K、及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、D、G、及びSからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、E、N、D、H、S、A、Q、T、及びGからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、G及びDからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、E、K、及びGからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、H、Y、A、及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
配列番号11においてXを用いて表示される位置以外における0〜2のアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、結合タンパク質。 - 少なくとも1つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該リピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、該アンキリンリピートドメインは、(1)配列番号19、20、23及び43〜48、(2)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置1のGが欠損している、(3)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置1のG及び位置2のSが欠損している、及び(4)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置2のSが欠損しているからなる群より選択される1つのアンキリンリピートドメインと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。
- アンキリンリピートドメインが、配列番号32のアンキリンリピートドメインと比較して、哺乳動物において少なくとも5倍長い血漿中終末相半減期を有する、請求項1の結合タンパク質。
- アンキリンリピートドメインが、ヒトにおいて、少なくとも1日の血漿中終末相半減期を有する、請求項1の結合タンパク質。
- 生物活性化合物をさらに含む請求項1の結合タンパク質であって、ここで、該結合タンパク質が、未修飾の生物活性化合物での血漿中終末相半減期と比較して、哺乳動物において少なくとも2倍長い血漿中終末相半減期を有し、ここで、より長い終末相半減期が、アンキリンリピートドメインにより、該結合タンパク質に与えられ、ここで該生物活性化合物が、タンパク質性生物活性化合物であり、該タンパク質性生物活性化合物が、血清アルブミンとは異なる標的特異性を有する結合ドメイン、サイトカイン、成長因子、抗体又はその断片、又はホルモンである、結合タンパク質。
- 請求項1の結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートモジュールが、(a)配列番号49における5つまでのアミノ酸が別のアミノ酸により交換され、かつ、(b)アンキリンリピート配列モチーフ
を有するアミノ酸配列であって、
ここで、
X1は、D、K、及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、D、G、及びSからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、E、N、D、H、S、A、Q、T、及びGからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、G及びDからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、E、K、及びGからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、H、Y、A、及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
配列番号11においてXを用いて表示される位置以外における0〜2のアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されるアミノ酸配列
を有する、結合タンパク質。 - 請求項1の結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインが、さらに、下記:
(1)配列番号50、及び
(2)(a)配列番号50における6つまでのアミノ酸が、別のアミノ酸により交換され、かつ、(b)アンキリンリピート配列モチーフ
を有するアミノ酸配列であって、
ここで、
X1は、F、S、L、及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、V及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、R及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、S及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、N、D、Q、S、A、T、及びEからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X6は、A、H、Y、S、及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
配列番号54においてXを用いて表示される位置以外における0〜5のアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、結合タンパク質。 - 請求項1の結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインが、さらに、下記:
(1)配列番号50、及び
(2)(a)配列番号50における6つまでのアミノ酸が、別のアミノ酸により交換され、かつ、(b)アンキリンリピート配列モチーフ
を有するアミノ酸配列であって、
ここで、
X1は、F、S、L、及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X2は、V及びAからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X3は、R及びKからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X4は、S及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
X5は、A、H、Y、S、及びNからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;そして、
配列番号12においてXを用いて表示される位置以外における0〜5のアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、結合タンパク質。 - 該アンキリンリピートドメインが、哺乳動物の血清アルブミンへの結合について配列番号19、20、23及び43〜48からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合する、請求項1の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、(1)配列番号19、20、23及び43〜48、(2)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置1のGが欠損している、(3)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置1のG及び位置2のSが欠損している、(4)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置2のSが欠損している、からなる群より選択される、請求項2記載の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、配列番号32のアンキリンリピートドメインと比較して、哺乳動物において少なくとも5倍長い血漿中終末相半減期を有する、請求項2の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、ヒトにおいて、少なくとも1日の血漿中終末相半減期を有する、請求項2の結合タンパク質。
- 生物活性化合物をさらに含む請求項2の結合タンパク質であって、ここで、該結合タンパク質が、未修飾の生物活性化合物での血漿中終末相半減期と比較して、哺乳動物において少なくとも2倍長い血漿中終末相半減期を有し、ここで、より長い終末相半減期が、アンキリンリピートドメインにより、該結合タンパク質に与えられ、ここで該生物活性化合物が、タンパク質性生物活性化合物であり、該タンパク質性生物活性化合物が、血清アルブミンとは異なる標的特異性を有する結合ドメイン、サイトカイン、成長因子、抗体又はその断片、又はホルモンである、結合タンパク質。
- 請求項2の結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインは、(1)配列番号19、20、23及び43〜48、(2)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置1のGが欠損している、(3)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置1のG及び位置2のSが欠損している、(4)配列番号19、20、23及び43〜48、ここで、該アンキリンリピートドメインの位置2のSが欠損している、結合タンパク質。
- 少なくとも1つのアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、ここで、該アンキリンリピートドメインは、哺乳動物の血清アルブミンについての結合特異性を有し、ここで、該アンキリンリピートドメインは、下記:
(1)配列番号49、及び
(2)配列番号49における5つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されているアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、結合タンパク質。 - 該アンキリンリピートドメインが、配列番号49における4つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されているアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項15の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、配列番号49のアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項15の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、配列番号49における3つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されているアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項15の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、配列番号49における2つまでのアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項15の結合タンパク質。
- 該アンキリンリピートドメインが、配列番号49における1つまでのアミノ酸が任意のアミノ酸により交換されているアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項15の結合タンパク質。
- 請求項1〜5、6〜10、11〜13、及び14〜20記載の結合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項1〜5、6〜10、11〜13、及び14〜20記載の結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体及び/又は希釈剤を含む医薬的組成物。
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