CN103459415A - 设计的与血清白蛋白结合的重复蛋白 - Google Patents

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Abstract

描述了新设计的对血清白蛋白具有结合特异性的重复蛋白、以及编码这类血清白蛋白结合蛋白的核酸、包含这类蛋白的药物组合物、这类蛋白用于改变治疗相关多肽的药代动力学的用途、和这类蛋白用于治疗疾病的用途。与不结合血清白蛋白的蛋白相比，本发明的重复蛋白在血浆中具有大幅增加的半衰期。

Description

设计的与血清白蛋白结合的重复蛋白
技术领域
本发明涉及设计的对血清白蛋白具有结合特异性的重复蛋白、以及编码这类血清白蛋白结合蛋白的核酸、包含这类蛋白的药物组合物、这类蛋白用于改变生物活性化合物的药代动力学的用途、和这类蛋白在疾病治疗中的用途。  
背景技术
制药工业热烈渴求通过调节或增加生物活性化合物（诸如蛋白治疗剂）的体内药代动力学 (PK) 性质来增加它们的有效性。就通过肾清除从循环中快速地消除的生物活性化合物而言，尤其如此。肾脏通常会从循环中滤出具有低于 60 kDa 的表观分子量的分子。改善如此小的生物活性化合物的药代动力学性质的一个策略是，简单地增加它们的表观分子大小 ( 即增加它们的流体动力学半径 ) ，例如通过添加非蛋白性聚合物部分诸如聚乙二醇聚合物或糖残基，或添加蛋白性聚合物部分诸如球状蛋白或未结构化的多肽，诸如在 WO 2007/103515 和 WO 2008/155134 中描述的那些。
其它策略利用血清蛋白（诸如免疫球蛋白和血清白蛋白）的长循环半衰期。具有 67 kDa 分子量的血清白蛋白是血浆中的最丰富的蛋白，以约 50 mg/ml (0.6 mM) 存在，且在人类中具有 19 天的血清半衰期。血清白蛋白帮助维持血浆 pH ，有助于胶体血压（ colloidal blood pressure ），对许多代谢物和脂肪酸起载体的作用，并充当血浆的主要药物运输蛋白。已经描述了白蛋白中的几个主要的小分子结合位点。
已经证实，与血清白蛋白的非共价结合可以延长短寿命的小分子或多肽的半衰期 (WO 1991/001743) 。与血清白蛋白特异性地结合并由此可以延长与其偶联的其它分子的体内半衰期的多肽包括：细菌白蛋白结合域的变体 ( 例如 WO 2005/097202 和 WO 2009/016043) ，小肽 ( 例如 Dennis, M.S., 等人 , J. Biol. Chem. 277(3), 35035-43, 2002 和 WO 2001/045746) 和免疫球蛋白片段 ( 例如 WO 2008/043822 、 WO 2004/003019 、WO 2008/043821、WO 2006/040153 、 WO 2006/122787 和 WO 2004/041865) 。 WO 2008/043822 涉及除了免疫球蛋白片段以外的其它结合蛋白，诸如基于蛋白 A 结构域、淀粉酶抑肽（ tendamistat ）、纤连蛋白、脂质运载蛋白、 CTLA-4 、 T- 细胞受体、设计的锚蛋白重复序列和 PDZ 结构域的分子，可能制备它们来特异性地结合血清白蛋白。尽管如此， WO 2008/043822 既没有公开设计的对血清白蛋白 (SA) 具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的选择，也没有公开与 SA 特异性地结合的重复结构域的具体重复序列基序。此外，据称，通过多肽与血清白蛋白的遗传融合，可以延长所述多肽的体内半衰期 ( 例如 WO 1991/001743) 。药物的体内半衰期的这种改变可能积极地改变它们的药代动力学 (PK) 和 / 或药物动力学 (PD) 性质。在新的和有效的治疗剂和疾病治疗方法的开发中，这是一个关键问题。因此，本领域需要改变生物活性化合物的 PK 和 / 或 PD 的新途径。
除了抗体以外，新颖的结合蛋白或结合域也可以用于特异性地结合靶分子 ( 例如 Binz, H.K., Amstutz, P. 和 Pl ü ckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005) 。一类这样的新颖的结合蛋白或结合域是基于设计的重复蛋白或设计的重复结构域 (WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Gr ü tter, M.G., 和 Pl ü ckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K 和 Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008) 。 WO 2002/020565 描述了如何构建重复蛋白的大文库和它们的一般用途。尽管如此， WO 2002/020565 既没有公开对 SA 具有结合特异性的重复结构域的选择，也没有公开与 SA 特异性地结合的重复结构域的具体重复序列基序。此外， WO 2002/020565 没有提示，对 SA 具有结合特异性的重复结构域可以用于调节其它分子的 PK 或 PD 。这些设计的重复结构域利用重复蛋白的模块性质，并具有 N- 端和 C- 端加帽模块，以通过屏蔽所述结构域的疏水核心来防止设计的重复结构域发生聚集 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. 和 Pl ü ckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003) 。这些加帽模块是基于天然的鸟嘌呤 - 腺嘌呤 - 结合蛋白 (GA- 结合蛋白 ) 的加帽重复序列。经显示，通过改进从 GA- 结合蛋白衍生出的 C- 端加帽重复序列，可以进一步增加这些设计的锚蛋白重复结构域的热稳定性和热力学稳定性 (Interlandi, G., Wetzel, S.K, Settanni, G., Pl ü ckthun, A. 和 Caflisch, A., J. Mol. Biol. 375, 837-854, 2008; Kramer, M.A, Wetzel, S.K., Pl ü ckthun, A., Mittl, P.R.E, 和 Gr ü tter, M.G., J. Mol. Biol. 404, 381-391, 2010) 。所述作者将共 8 个突变引入了该加帽模块，并通过添加 3 个独特氨基酸来延长了它的 C- 端螺旋。尽管如此，这些修饰在 C- 端加帽模块中的引入，导致设计的携带该突变的 C- 端加帽模块的重复结构域的不希望的二聚化趋势。因而，需要制备锚蛋白重复结构域的进一步优化的 C- 端加帽模块或 C- 端加帽重复序列。
利用目前可得到的方案靶向 SA 来调节 PK 和 / 或 PD ，并非总是有效的。甚至日趋明显的是，通过结合（ hijacking ） SA 来调节分子的 PK 和 / 或 PD 是复杂的，且仍然没有被充分理解。
总之，需要改进的对 SA 具有特异性的结合蛋白，其能够改善用于治疗癌症和其它病理学状况的治疗相关分子或多肽的 PK 和 / 或 PD 。
本发明要解决的技术问题是，鉴定新颖的结合蛋白（诸如对 SA 具有结合特异性的重复结构域），其能够改变用于癌症和其它病理学状况的改善治疗的治疗相关分子的 PK 和 / 或 PD 。通过提供在权利要求书中表征的实施方案，实现了该技术问题的解决方案。
发明概述
本发明涉及包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性，且其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块具有选自下述的氨基酸序列： SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 ，和这样的序列，其中在 SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 中的最多 9 个氨基酸被任意氨基酸替换。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述重复结构域对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性，且其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自下述的一个锚蛋白重复结构域具有至少 70% 氨基酸序列同一性的氨基酸序列： SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 ，其中所述锚蛋白重复结构域的在 1 位处的 G 和 / 或在 2 位处的 S 任选地缺失。
具体地，本发明涉及如上文定义的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自下述的锚蛋白重复结构域竞争结合哺乳动物血清白蛋白： SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 。
此外，本发明涉及这样的包含生物活性化合物的结合蛋白，尤其是包含的生物活性化合物在哺乳动物中的终末血浆半衰期与所述未修饰的生物活性化合物的终末血浆半衰期相比高至少 2 倍的结合蛋白。
本发明另外涉及编码本发明的结合蛋白的核酸分子，以及包含一种或更多种上述结合蛋白或核酸分子的药物组合物。
本发明另外涉及使用本发明的结合蛋白治疗病理学状况的方法。  
附图说明
图 1 . 通过 SEC 对选择的 DARPin 的稳定性分析。
用 Superdex 200 柱 5/150 ( 图 1a 或图 1b) 或用 superdex200 10/300GL ( 图 1c) 分析的对 xSA 具有特异性的 DARPin 在下述情况下的尺寸排阻色谱法 (SEC) 运行的洗脱曲线：温育前（图 1a ），在 PBS 中在 40 ℃以 30 mg/ml ( 约 2 mM) 温育 28 天以后 ( 图 1b) ，或在 -80 ℃贮存 1 个月以后 ( 图 1c) 。如在实施例 1 中所述，表达和纯化所有样品。为了 SEC 分析，将样品稀释至 500µM 的浓度。用箭头指示了分子质量标准品抑酶肽 (AP) 6.5 kDa 、碳酸酐酶 (CA) 29 kDa 和伴清蛋白 (CO) 75 kDa 。
Figure 952892DEST_PATH_IMAGE001
，哺乳动物血清白蛋白， A ，在 280 nm 的吸光度； t ，按分钟计的保留时间；
DARPin #19 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:19) ；
DARPin #20 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:20) ；
DARPin #21 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:21) ；
DARPin #22 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:22) ；
DARPin #27 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:27) ；
DARPin #28 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:28) ；
DARPin #29 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:29) ；
DARPin #30 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:30) 。  
DARPin #43 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:43) 。  
DARPin #44 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:44) 。  
DARPin #45 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:45) 。  
DARPin #46 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:46) 。  
DARPin #47 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:47) 。  
DARPin #48 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:48) 。
图 2 . 选择的 DARPin 的热稳定性。  
对 xSA 具有特异性的 DARPin 在 pH 7.4 的 PBS 中 ( 图 2a) 和在 pH 5.8 的 MES 缓冲液 (250 mM (2-N- 吗啉代 )- 乙磺酸 pH 5.5) 、 150 mM NaCl 以 1:4 (v/v) 与 pH 7.4 的 PBS 混合，并将 pH 调至 5.8) 中 ( 图 2b) 的热变性迹线 ( 通过存在于缓冲液中的染料 SYPRO Orange 的荧光强度增加来跟踪 ) 。
Figure 870033DEST_PATH_IMAGE002
，相对荧光单位 (RFU) ，在 515-535 nm 激发，在 560-580 nm 检测； T ，按℃计的温度； DARPin 的定义参见上文。
图 3. 选择的 DARPin 在小鼠中的血浆清除率。  
在小鼠中评估了对 MSA ( 小鼠血清白蛋白 ) 具有特异性的 DARPin 和对照 DARPin 的血浆清除率。
（图 3a) 与对 MSA 没有结合特异性的 DARPin #32 ( 参见下文 ) 相比，包含仅一个对 MSA 具有结合特异性的重复结构域的 DARPin 。
（图 3b) 与对 MSA 没有结合特异性的 DARPin #32 相比，包含 2 个蛋白结构域 ( 其中之一是对 MSA 具有结合特异性的重复结构域 ) 的 DARPin 。
经由 His- 标签（ His-Tag ），用 99m Tc- 羰基化合物标记 DARPin ，并静脉内地注射给小鼠。在注射后的不同时间点测量被注射的小鼠的血液的放射性，并显示为针对 99m Tc 的放射性衰变校正过的注射剂量的比率 (%ID) 。拟合曲线显示了在不同时间点处测量的放射性的非线性回归的结果——两阶段衰变 (Graphpad Prism) 。每个数据点代表每组 2 只小鼠的平均值。
Figure 836721DEST_PATH_IMAGE003
，针对 99m Tc 的放射性衰变校正过的注射剂量百分比； t ，按小时计的时间；
DARPin #18 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:18) ；
DARPin #23 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:23) ；
DARPin #25 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:25) ；
DARPin #32 ( 对 xSA 没有结合特异性的阴性对照 DARPin ，具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:32) ；
DARPin #33 ( 包含 2 个重复结构域的 DARPin ，其中一个重复结构域对 xSA 具有结合特异性，具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:33) ；
DARPin #35 ( 包含 2 个重复结构域的 DARPin ，其中一个重复结构域对 xSA 具有结合特异性，具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:35) ；
DARPin #36 ( 包含 2 个重复结构域的 DARPin ，其中一个重复结构域对 xSA 具有结合特异性，具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:36) 。
图 4. 选择的 DARPin 在食蟹猴（ cynomolgus monkeys ）中的血浆清除率。  
在食蟹猴中评估了对 CSA ( 食蟹猴血清白蛋白 ) 具有特异性的 DARPin 和对照 DARPin 的血浆清除率。
（图 4a) 将 DARPin #26 与对 CSA 没有结合特异性的 DARPin #32 进行了对比。
（图 4b) 将 DARPin #24 、 34 和 17 与对 CSA 没有结合特异性的 DARPin #32 进行了对比。在 t = 0 小时，以 0.5 mg/ml (DARPin #26 、 DARPin #24 、 DARPin #17 和 DARPin #32) 或 1 mg/ml (DARPin #34) 的浓度，将下述 DARPin 静脉内地注射给食蟹猴：在注射后的不同时间点，通过 ELISA 测量猴血浆中的 DARPin 浓度。曲线显示了在不同时间点测得的浓度的非线性回归的结果——两阶段衰变 (Graphpad Prism) 。从第二阶段，可以确定 DARPin 的终末血浆半衰期。每个单独数据点代表同一血清样品的 2 次独立 ELISA 测量的平均值。  
Figure 231930DEST_PATH_IMAGE004
，按 nM 计的 DARPin 浓度； t ，按小时计的时间；
DARPin #17 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:17) ；
DARPin #24 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:24) ；
DARPin #26 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:26) ；
DARPin #32 ( 对 xSA 没有结合特异性的阴性对照 DARPin ，具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:32) ；
DARPin #34 ( 包含 2 个重复结构域的 DARPin ，其中一个重复结构域对 xSA 具有结合特异性，具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:34) 。  
具体实施方式
根据本发明的结合域对哺乳动物血清白蛋白 (xSA) 是特异性的。优选地，根据本发明的结合域对小鼠、大鼠、狗、兔、猴或人起源的血清白蛋白是特异性的。更优选地，根据本发明的结合域对人起源的血清白蛋白 (HSA) 是特异性的。
术语“蛋白”指多肽，其中多肽的至少部分具有或者能够在其多肽链内和 / 或之间通过形成二级、三级或四级结构获得限定的三维排列。如果蛋白包含两条或更多条多肽，则每条多肽链可非共价连接或者例如通过两条多肽之间的二硫键共价连接。各自具有或者能够通过形成二级或三级结构获得限定的三维排列的蛋白部分，称为“蛋白结构域”。此类蛋白结构域为本领域技术人员熟知。
在重组蛋白、重组蛋白结构域、重组结合蛋白等中使用的术语“重组”意指，所述多肽通过使用相关领域技术人员熟知的重组 DNA 技术制备。例如，可将编码多肽的重组 DNA 分子 ( 如通过基因合成制备 ) 克隆入细菌表达质粒 ( 例如 pQE30 ， Qiagen) 、酵母表达质粒或哺乳动物表达质粒内。当例如将这样构建的重组细菌表达质粒插入适当的细菌 ( 例如大肠杆菌（ Escherichia coli ） ) 时，该细菌可产生由这种重组 DNA 编码的多肽。相应产生的多肽称为重组多肽。
在本发明范围内，术语“多肽”是指由经肽键连接的多个 ( 即两个或更多个 ) 氨基酸的一条或多条链组成的分子。优选地，多肽由超过八个经肽键连接的氨基酸组成。
术语“多肽标签”指连接于多肽 / 蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或靶向所述多肽 / 蛋白，或者其中所述氨基酸序列改善多肽 / 蛋白的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具备效应子功能。结合蛋白的个别多肽标签、部分和 / 或结构域相互之间可直接或经多肽接头连接。这些多肽标签在本领域众所周知，本领域技术人员完全可获得。多肽标签的实例是允许检测所述多肽 / 蛋白的小的多肽序列，例如 His ( 例如 SEQ ID NO:15 的 His- 标签 ) 、 myc 、 FLAG 或者 Strep- 标签或部分诸如酶 ( 例如酶如碱性磷酸酶 ) ，或者可用于靶向 ( 诸如免疫球蛋白或其片段 ) 和 / 或作为效应分子的部分。
术语“多肽接头”指氨基酸序列，它能够连接例如两个蛋白结构域，多肽标签和蛋白结构域，蛋白结构域和非多肽部分诸如聚乙二醇，或两个序列标签。相关领域技术人员已知此类另外的结构域、标签、非多肽部分和接头。在专利申请 WO 2002/020565 的说明书中提供实例的列表。此类接头的具体实例是各种长度的甘氨酸 - 丝氨酸 - 接头和脯氨酸 - 苏氨酸 - 接头；优选所述接头具有 2 至 24 个氨基酸的长度；更优选所述接头具有 2 至 16 个氨基酸的长度。在 SEQ ID NO:16 中提供了甘氨酸 - 丝氨酸 - 接头的一个实例。
术语“聚合物部分”指蛋白性聚合物部分或者非蛋白性聚合物部分。“蛋白性聚合物部分”优选是这样的多肽，其在室温 (RT) 以约 0.1 mM 浓度在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中贮存 1 月时，不形成稳定的三级结构，同时不形成超过 10% ，优选不超过 5% ；还优选不超过 2% ；甚至更优选不超过 1% ；最优选没有可检测到的量的通过尺寸排阻色谱法 (SEC) 确定的寡聚体或聚集体。当使用球蛋白作为 SEC 的分子量标准时，此类蛋白性聚合物部分以高于其有效分子量的表观分子量在 SEC 中运行。优选通过 SEC 确定的所述蛋白性聚合物部分的表观分子量为用其氨基酸序列计算的其有效分子量的 1.5x 、 2x 或 2.5x 。还优选通过 SEC 确定的所述非蛋白性聚合物部分的表观分子量为用其分子组成计算的其有效分子量的 2x 、 4x 或 8x 。优选所述蛋白性聚合物部分超过 50% 、 70% 或甚至 90% 氨基酸以约 0.1 mM 浓度在 PBS 中在 RT 下不形成稳定的二级结构，通过圆二色性 (CD) 测量确定。最优选所述蛋白性聚合物显示无规卷曲构象的典型近 UV CD- 谱。本领域技术人员熟知此类 CD 分析。还优选的是，由超过 50 、优选超过 100 、 200 、 300 、 400 、 500 、 600 、 700 或最优选超过 800 个氨基酸组成的蛋白性聚合物部分。蛋白性聚合物部分的实例是 XTEN®(Amunix 的注册商标 ; WO 2007/103515) 多肽，或者包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基的多肽，如在 WO 2008/155134 中所述。通过用标准 DNA 克隆技术制备基因融合多肽，可将此类蛋白性聚合物部分共价连接于例如本发明的结合域，接着进行标准表达和纯化。
本发明的聚合物部分在分子量上可宽泛地变化 ( 即约 1 kDa 至约 150 kDa) 。优选所述聚合物部分具有至少 2 、更优选至少 5 、 10 、 20 、 30 、 50 、 70 或最优选至少 100 kDa 的分子量。优选所述聚合物部分通过多肽接头与结合域连接。
非蛋白性聚合物部分的实例是羟乙基淀粉 (HES) 、聚乙二醇 (PEG) 、聚丙二醇或聚氧化烯。术语“聚乙二醇化”意指 PEG 部分共价连接于例如本发明的多肽。
在具体实施方案中， PEG 部分或任何其它非蛋白性聚合物可以例如经马来酰亚胺接头与半胱氨酸巯基偶联，半胱氨酸经肽接头与本文所述结合域的 N- 或 C- 端偶联。
术语“结合蛋白”指包含一个或多个结合域、一个或多个生物活性化合物和一个或多个聚合物部分的蛋白，如下文进一步解释。优选所述结合蛋白包含至多四个结合域。更优选所述结合蛋白包含至多两个结合域。最优选所述结合蛋白只包含一个结合域。而且，任何此类结合蛋白可包含非结合域的另外的蛋白结构域、多聚化部分、多肽标签、多肽接头和 / 或单个 Cys 残基。多聚化部分的实例是免疫球蛋白重链恒定区 ( 其配对以提供功能性免疫球蛋白 Fc 域 ) ，和亮氨酸拉链或者包含在两条此类多肽之间形成分子间二硫键的游离巯基的多肽。单个 Cys 残基可用于使其它部分与多肽缀合，例如通过使用本领域技术人员熟知的马来酰亚胺化学。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。也优选地，结合蛋白的结合域具有不同的靶标特异性。
术语“结合域”意指表现与蛋白支架相同的“折叠” ( 三维排列 ) 且具有如下文限定的预定性质的蛋白结构域。此类结合域可通过合理的，或者最通常是组合的蛋白工程技术的本领域已知的技术获得（ Binz 等 , 2005, 在上述引文中）。例如，具有预定性质的结合域可通过包含以下步骤的方法获得： (a) 提供表现与如下文进一步限定的蛋白支架相同的折叠的不同蛋白结构域集合；和 (b) 筛选所述不同的集合和 / 或从所述不同集合选择以获得至少一种具有所述预定性质的蛋白结构域。不同的蛋白结构域集合可根据所用筛选和 / 或选择系统通过几种方法提供，并可包括使用本领域技术人员熟知的方法，诸如噬菌体展示或核糖体展示。优选地，所述结合域是重组结合域。
术语“蛋白支架”意指具有其中高度耐受氨基酸插入、取代或缺失的暴露表面区域的蛋白。可用于产生本发明结合域的蛋白支架实例是抗体或其片段诸如单链 Fv 或 Fab 片段，来自金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的蛋白 A ，来自大菜粉蝶 (Pieris brassicae) 的后胆色素结合蛋白或其它脂质运载蛋白，锚蛋白重复蛋白或其它重复蛋白，和人纤连蛋白。本领域技术人员已知蛋白支架 (Binz 等 , 2005, 在上述引文中 ; Binz 等 , 2004, 在上述引文中 ) 。
术语“预定性质”指诸如结合靶标、阻断靶标、激活靶标介导的反应、酶活性和相关其它性质等性质。根据期望的性质类型，普通技术人员将能够鉴定用于进行筛选和 / 或选择具有期望性质的结合域的格式和必需步骤。优选所述预定性质是结合靶标。
下文关于重复蛋白的定义基于专利申请 WO 2002/020565 。专利申请 WO 2002/020565 进一步含有重复蛋白特征、技术和应用的一般描述。
术语“重复蛋白”指包含一个或多个重复结构域的蛋白。优选每个所述重复蛋白包含至多四个重复结构域。更优选每个所述重复蛋白包含至多两个重复结构域。最优选每个重复蛋白只包含一个重复结构域。而且，所述重复蛋白可包含另外的非重复蛋白结构域、多肽标签和 / 或多肽接头。
术语“重复结构域”指包含两个或更多个连续重复单元 ( 模块 ) 作为结构单元的蛋白结构域，其中所述结构单元具有相同的折叠，并紧密堆叠以产生例如具有接合疏水核心的超螺旋结构。优选地，重复结构域另外包含 N- 端和 / 或 C- 端加帽单元 ( 或模块 ) 。甚至更优选地，所述 N- 端和 / 或 C- 端加帽单元 ( 或模块 ) 是加帽重复序列。
术语“设计的重复蛋白”和“设计的重复结构域”分别指通过专利申请 WO 2002/020565 中解释的发明程序获得的重复蛋白或重复结构域。设计的重复蛋白和设计的重复结构域是合成的，并非出于天然。它们分别是通过对应设计的核酸的表达所得的人造蛋白或结构域。优选表达是在真核或原核细胞诸如细菌细胞中进行，或者通过使用无细胞体外表达系统进行。因此，设计的锚蛋白重复蛋白 ( 即 DARPin) 与包含至少一个锚蛋白重复结构域的本发明的结合蛋白对应。
术语“结构单元”指局部有序的多肽部分，其通过沿多肽链相互靠近的两个或更多个二级结构区段之间的三维相互作用形成。此类结构单元表现结构基序。术语“结构基序”指存在于至少一个结构单元中的二级结构元件的三维排列。本领域技术人员熟知结构基序。单独的结构单元不能获得限定的三维排列；但是，它们的连续排列，例如作为重复结构域的重复模块，导致相邻单元的相互稳定，产生超螺旋结构。
术语“重复单元”指包含一种或多种天然存在的重复蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”以多个拷贝出现，且其表现确定蛋白折叠的所有所述基序共同的限定的折叠拓扑学。这样的重复单元对应于： Forrer 等人（ 2003, 在上述引文中）所述的重复蛋白的“重复结构单元 ( 重复序列 ) ”，或 Binz 等人（ 2004, 在上述引文中）所述的重复蛋白的“连续同源结构单元 ( 重复序列 ) ”。此类重复单元包含框架残基和相互作用残基。此类重复单元的实例是犰狳重复单元、富亮氨酸重复单元、锚蛋白重复单元、三十四肽重复单元、 HEAT 重复单元和富亮氨酸变体重复单元。含有两个或更多个此类重复单元的天然存在的蛋白称为“天然存在的重复蛋白”。重复蛋白的各重复单元的氨基酸序列相互之间比较时可具有显著数量的突变、取代、添加和 / 或缺失，但仍然基本保留重复单元的一般模式或基序。
术语“锚蛋白重复单元”是指这样的重复单元，它是例如 Forrer 等人（ 2003, 在上述引文中）所述的锚蛋白重复序列。锚蛋白重复序列是本领域技术人员熟知的。
术语“框架残基”是指重复单元的氨基酸残基，或重复模块的相应氨基酸残基，其参予折叠拓扑学，即其参予所述重复单元 ( 或模块 ) 的折叠或其参予与相邻单元 ( 或模块 ) 的相互作用。这类参予可以是与重复单元 ( 或模块 ) 中的其它残基的相互作用，或对α - 螺旋或β - 折叠中存在的多肽主链构象或形成线型多肽或环的氨基酸段的影响。
术语“靶标相互作用残基”是指重复单元的氨基酸残基，或重复模块的相应氨基酸残基，其参予与靶物质的相互作用。这类参予可以是与靶物质的直接相互作用，或对其它直接相互作用残基的影响，例如通过稳定重复单元 ( 或模块 ) 的多肽构象以允许或增强直接相互作用残基与所述靶标的相互作用。这类框架和靶标相互作用残基可以通过以下方法鉴定：对通过物理化学方法 ( 诸如 X- 射线晶体学、 NMR 和 / 或 CD 光谱法 ) 获得的结构数据进行分析，或与结构生物学和 / 或生物信息学领域的技术人员公知的已知的和相关的结构信息进行比较。
优选地，用于推断重复序列基序的重复单元是同源重复单元，其中所述重复单元包括相同的结构基序，并且其中所述重复单元的超过 70% 的框架残基是彼此同源的。优选地，所述重复单元的超过 80% 的框架残基是同源的。最优选地，所述重复单元的超过 90% 的框架残基是同源的。用于确定多肽之间同源性百分比的计算机程序 ( 诸如 Fasta 、 Blast 或 Gap) 是本领域技术人员已知的。进一步优选地，用于推断重复序列基序的重复单元是从靶标上选择的重复结构域获得 ( 如实施例 1 所述 ) 并具有相同靶标特异性的同源重复单元。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复单元或重复模块推断得出的氨基酸序列。优选地，所述重复单元或重复模块来自于对相同靶标具有结合特异性的重复结构域。这类重复序列基序包括框架残基位置和靶标相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复单元 ( 或模块 ) 的框架残基的位置。同样，所述靶标相互作用残基位置对应于重复单元 ( 或模块 ) 的靶标相互作用残基的位置。重复序列基序包括固定位置和随机化位置。术语“固定位置”是指这样的重复序列基序中的氨基酸位置，其中所述位置被设置为特定氨基酸。最常见的是，这类固定位置对应于框架残基的位置和 / 或对某靶标特异性的靶标相互作用残基的位置。术语“随机化位置”表示这样的重复序列基序中的氨基酸位置，其中在所述氨基酸位置允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许任意的常见的二十种天然存在的氨基酸，或其中允许二十种天然存在氨基酸的大部分，诸如除了半胱氨酸以外的氨基酸，或除了甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸以外的氨基酸。最常见的是，这类随机化位置对应靶标相互作用残基的位置。但是，框架残基的一些位置也可以是随机化的。
术语“折叠拓扑学”指所述重复单元或重复模块的三级结构。折叠拓扑学取决于形成α - 螺旋或β - 折叠的至少部分的氨基酸段，或者形成线型多肽或环，或者α - 螺旋、β - 折叠和 / 或线型多肽 / 环的任何组合的氨基酸段。
术语“连续”指这样的排列，其中重复单元或重复模块串联排列。在设计的重复蛋白中，有至少 2 个，通常为约 2 至 6 个，特别是至少约 6 个，经常是 20 个或更多个重复单元 ( 或模块 ) 。在大多数情况下，重复结构域的重复单元 ( 或模块 ) 将表现高度的序列同一性 ( 在对应位置的相同氨基酸残基 ) 或序列相似性 ( 氨基酸残基不同，但具有相似的物理化学性质 ) ，以及一些氨基酸残基可能是非常保守的关键残基。但是，在重复结构域的不同重复单元 ( 或模块 ) 之间因氨基酸插入和 / 或缺失和 / 或取代所致的高度序列变异性将是可能的，只要维持重复单元 ( 或模块 ) 的共同折叠拓扑学。
本领域技术人员熟知通过物理化学方式诸如 X- 射线晶体学、 NMR 或 CD 光谱学直接确定重复蛋白的折叠拓扑学的方法。在生物信息学领域充分建立了且本领域技术人员熟知鉴定和确定重复单元或重复序列基序或者鉴定包含此类重复单元或基序的相关蛋白家族的方法，诸如同源性检索 (BLAST 等 ) 。精化初始重复序列基序的步骤可包含迭代过程。
术语“重复模块”指设计的重复结构域的重复氨基酸序列，它们最初来自天然存在重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的各重复模块来自天然存在重复蛋白家族或亚家族 ( 如犰狳重复蛋白或锚蛋白重复蛋白的家族 ) 的一种或多种重复单元。
“重复模块”可包含具有存在于对应重复模块的所有拷贝中的氨基酸残基的位置 ( “固定位置” ) 和具有不同或“随机化”氨基酸残基的位置 ( “随机化位置” ) 。
根据本发明的结合蛋白包含至少一个锚蛋白重复结构域，其中所述重复结构域对哺乳动物血清白蛋白 (xSA) 具有结合特异性。
术语“对靶标具有结合特异性”、“特异性地结合靶标”或“靶标特异性”等是指，结合蛋白或结合域在 PBS 中与靶标结合的解离常数低于与诸如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白 (MBP) 等无关蛋白结合的解离常数。优选地，在 PBS 中对靶标的解离常数比对 MBP 的相应解离常数低至少 10 倍、更优选 102 倍、甚至更优选 103 倍或最优选 104 倍。
本发明的结合蛋白不是抗体或其片段，诸如 Fab 或 scFv 片段。本领域技术人员熟知抗体及其片段。
并且，本发明的结合域不包含免疫球蛋白折叠（如存在于抗体中）和 / 或 III 型纤连蛋白结构域。免疫球蛋白折叠是常见的全β蛋白折叠，由排列在两个β折叠中的约 7 条反向平行β - 链的 2 层夹心组成。本领域技术人员熟知免疫球蛋白折叠。例如，此类包含免疫球蛋白折叠的结合域描述于 WO 2007/080392 或 WO 2008/097497 。
具体地，本发明涉及包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性，且其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块具有选自下述的氨基酸序列： SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 ，和这样的序列，其中在 SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 中的最多 9 个氨基酸被任意氨基酸替换。
优选地，在 SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 中的最多 8 个氨基酸被其它氨基酸替换，在 SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 中更优选最多 7 个氨基酸、更优选最多 6 个氨基酸、更优选最多 5 个氨基酸、甚至更优选最多 4 个氨基酸、更优选最多 3 个氨基酸、更优选最多 2 个氨基酸、更优选最多 1 个氨基酸，和最优选零个氨基酸被替换。
优选地，当 SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 中的氨基酸被替换时，这些氨基酸选自： A 、 D 、 E 、 F 、 H 、 I 、 K 、 L 、 M 、 N 、 Q 、 R 、 S 、 T 、 V 、 W 和 Y ；更优选地选自： A 、 D 、 E 、 H 、 I 、 K 、 L 、 Q 、 R 、 S 、 T 、 V 和 Y 。也优选地，氨基酸被同源氨基酸替换；即氨基酸被含有具有类似生物物理性质的侧链的氨基酸替换。例如，带负电荷的氨基酸 D 可以被带负电荷的氨基酸 E 替换，或者疏水氨基酸诸如 L 可以被 A 、 I 或 V 替换。同源氨基酸对氨基酸的替换是本领域技术人员熟知的。
优选的结合蛋白包含至少一个锚蛋白重复结构域，其中所述重复结构域在 PBS 中与 xSA 结合的解离常数 (Kd) 低于 10-4M 。优选地，所述重复结构域在 PBS 中与 xSA 结合的 Kd 低于 10-4M ，更优选地低于 10-5M 、 10-6M 、 10-7M ，或最优选地低于 10-8M 。
用于确定蛋白 - 蛋白相互作用的解离常数的方法，诸如基于表面等离子体共振 (SPR) 的技术 ( 例如 SPR 平衡分析 ) 或等温滴定量热法 (ITC) ，是本领域技术人员熟知的。如果在不同条件 ( 例如，盐浓度、 pH) 下测量，测得的特定蛋白 - 蛋白相互作用的 Kd 值可以变化。因而，优选地用标准化的蛋白溶液和标准化的缓冲液（诸如 PBS ），进行 Kd 值的测量。
在实施例中显示了包含锚蛋白重复结构域的结合蛋白，所述锚蛋白重复结构域在 PBS 中以低于 10-4M 的 Kd 与 xSA 结合。
本发明的结合蛋白的锚蛋白重复结构域会结合 xSA 。优选的是，包含与人血清白蛋白 (HSA) 结合的锚蛋白重复结构域的结合蛋白。
进一步优选的是，包含 70-300 个氨基酸、尤其是 100-200 个氨基酸的结合域。
进一步优选的是，不含游离 Cys 残基的结合蛋白或结合域。“游离 Cys 残基”不参与二硫键的形成。甚至更优选的是，不含任何 Cys 残基的结合蛋白或结合域。
本发明的结合域是锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域 (Binz 等人 , 2004, 在上述引文中 ) ，优选地如在 WO 2002/020565 中所述。设计的锚蛋白重复结构域的实例显示在实施例中。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述重复结构域对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性，且其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自下述的一个锚蛋白重复结构域具有至少 70% 氨基酸序列同一性的氨基酸序列： SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 ，其中所述锚蛋白重复结构域的在 1 位处的 G 和 / 或在 2 位处的 S 任选地缺失。
优选地，在本发明的结合蛋白中的这种锚蛋白重复结构域包含与选自下述的一个锚蛋白重复结构域具有至少 70% 氨基酸序列同一性的氨基酸序列： SEQ ID NO: 21 、 27 和 46 ；优选地 27 和 46 。如上所定义的，所述锚蛋白重复结构域在 PBS 中与 xSA 结合的解离常数 (Kd) 低于 10-4M 。优选地，所述重复结构域在 PBS 中与 xSA 结合的 Kd 低于 10-4M ，更优选地低于 10-5M 、 10-6M 、 10-7M ，或最优选地低于 10-8M 。
优选地，在本发明的结合蛋白中的这种锚蛋白重复结构域包含与在选自下述的锚蛋白重复结构域中的“随机化重复单元”或“随机化位置”具有至少 70% 氨基酸序列同一性的氨基酸序列： SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 。
优选地，作为 70% 氨基酸序列同一性的替代，在本发明的结合蛋白中的这种锚蛋白重复结构域具有至少 75% 、更优选至少 80% 、更优选至少 85% 、更优选至少 90% 或最优选至少 95% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性的结合蛋白（通过替换 SEQ ID NO:49 、 50 、 51 和 52 的锚蛋白重复模块中的最多 9 个氨基酸来定义，或者通过与选自 SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 的一个锚蛋白重复结构域具有至少 70% 氨基酸序列同一性来定义）在哺乳动物中的终末血浆半衰期比不与哺乳动物血清白蛋白结合的对应结合蛋白（例如 SEQ ID NO:32 的锚蛋白重复结构域）高至少 5 倍。在这样的优选的结合蛋白中，在人类中的最小终末血浆半衰期是至少 1 天，更优选至少 3 天，甚至更优选至少 5 天。
在另一个实施方案中，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块： X1DX2X3X4X5TPLHLAAX6X7GHLX8IVEVLLKX9GADVNA (SEQ ID NO:53)
其中 X1 、 X2 、 X3 、 X4 、 X5 、 X6 、 X7 、 X8 和 X9 、彼此独立地代表选自下述的氨基酸残基： A 、 D 、 E 、 F 、 H 、 I 、 K 、 L 、 M 、 N 、 Q 、 R 、 S 、 T 、 V 、 W 和 Y ；
优选地，其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： A 、 D 、 M 、 F 、 S 、 I 、 T 、 N 、 Y 和 K ；更优选 K 和 A ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 K 、 D 、 F 、 M 、 N 、 I 和 Y ；更优选 I 、 E 和 Y ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： W 、 R 、 N 、 T 、 H 、 K 、 A 和 F ；更优选 W 、 R 和 F ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： G 和 S ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： N 、 T 和 H ；
X6 代表选自下述的氨基酸残基： N 、 V 和 R ；
X7 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 Y 、 N 、 D 、 H 、 S 、 A 、 Q 、 T 和 G ；更优选 E 、 Y 和 N ；
X8 代表选自下述的氨基酸残基： E 和 K ；
X9 代表选自下述的氨基酸残基： S 、 A 、 Y 、 H 和 N ；更优选 Y 和 H ；且
其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:53 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
具体地，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块： X1DX2X3GX4TPLHLAAX5X6GHLEIVEVLLKX7GADVNA (SEQ ID NO:10)
其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： A 、 D 、 M 、 F 、 S 、 I 、 T 、 N 、 Y 和 K ；优选 K 和 A ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 K 、 D 、 F 、 M 、 N 、 I 和 Y ；优选 I 、 E 和 Y ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： W 、 R 、 N 、 T 、 H 、 K 、 A 和 F ；优选 W 、 R 和 F ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： N 、 T 和 H ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： N 、 V 和 R ；
X6 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 Y 、 N 、 D 、 H 、 S 、 A 、 Q 、 T 和 G ；优选 E 、 Y 和 N ；
X7 代表选自下述的氨基酸残基： S 、 A 、 Y 、 H 和 N ；优选 Y 和 H ；且
其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:10 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
在另一个实施方案中，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO:11)
其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： D 、 K 和 A ；优选地 K 和 A ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： D 、 G 和 S ；优选地 G 和 S ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 N 、 D 、 H 、 S 、 A 、 Q 、 T 和 G ；优选地 Q 、 D 和 N ；更优选 Q 和 N ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： G 和 D ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 K 和 G ；优选地 E 和 K ；
X6 代表选自下述的氨基酸残基： H 、 Y 、 A 和 N ；优选地 H 、 A 和 Y ；更优选 A 和 Y ；且
其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:11 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
在另一个实施方案中，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DFX2G X3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO:54)
其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： F 、 S 、 L 和 K ；优选 S 和 K ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： V 和 A ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： R 和 K ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： S 和 N ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： N 、 D 、 Q 、 S 、 A 、 T 和 E ；优选地 D 和 Q ；
X6 代表选自下述的氨基酸残基： A 、 H 、 Y 、 S 和 N ；优选 A 和 H ；且
其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:54 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
具体地，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DFX2G X3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO:12)
其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： F 、 S 、 L 和 K ；优选地 S 和 K ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： V 和 A ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： R 和 K ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： S 和 N ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： A 、 H 、 Y 、 S 和 N ；优选地 A 和 H ；且
其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:12 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
优选的是这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有 SEQ ID NO:12 的锚蛋白重复序列基序的重复模块，该重复模块前面是具有 SEQ ID NO:11 的锚蛋白重复序列基序的重复模块。
在另一个实施方案中，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO:13)
其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： K 、 A 、 D 、 M 、 F 、 S 、 I 、 T 、 N 和 Y ；优选地 K 和 A ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： E 、 K 、 D 、 F 、 M 、 N 和 Y ；优选地 E 、 D 和 Y ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： R 、 N 、 T 、 H 、 K 、 A 和 F ；优选地 R 和 F ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： I 和 M ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： H 、 Y 、 K 、 A 和 N ；优选地 K 和 A ；且
其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:13 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
在另一个实施方案中，本发明涉及这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEQ ID NO:14)
其中
X1 代表选自下述的氨基酸残基： Q 和 K ；
X2 代表选自下述的氨基酸残基： L 和 P ；
X3 代表选自下述的氨基酸残基： H 、 N 、 Y 和 A ；优选地 H 和 A ；
X4 代表选自下述的氨基酸残基： G 和 S ；
X5 代表选自下述的氨基酸残基： A 、 V 、 T 和 S ；优选地 S 和 A ；
X6 代表选自下述的氨基酸残基： V 和 F ；和其中任选地最多 5 个在 SEQ ID NO:14 中用 X 表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
优选的是这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有 SEQ ID NO:14 的锚蛋白重复序列基序的重复模块，该重复模块前面是具有 SEQ ID NO:13 的锚蛋白重复序列基序的重复模块。
术语“加帽模块”指与重复结构域的 N- 端或 C- 端重复模块融合的多肽，其中所述加帽模块与所述重复模块形成紧密的三级相互作用 ( 即三级结构相互作用 ) ，从而提供帽，其将所述重复模块的疏水核心在不与连续重复模块接触的侧部与溶剂隔开。所述 N- 端和 / 或 C- 端加帽模块可以是，或者可来自，存在于天然存在的重复蛋白中邻近重复单元的加帽单元或其它结构单元。术语“加帽单元”指天然存在的折叠多肽，其中所述多肽限定在 N- 端或 C- 端与重复单元融合的特定结构单元，其中所述多肽与所述重复单元形成紧密的三级结构相互作用，从而提供帽，其将所述重复单元的疏水核心在一侧与溶剂隔开。优选地，加帽模块或加帽单元是加帽重复序列。术语“加帽重复序列”表示这样的加帽模块或加帽单元：其具有与所述邻近重复单元 ( 或模块 ) 类似或相同的折叠、和 / 或与所述邻近重复单元 ( 或模块 ) 的序列相似性。加帽模块和加帽重复序列参见： WO 2002/020565 ，和 Interlandi 等人 , 2008 ( 在上述引文中 ) 。例如， WO 2002/020565 描述了具有下述氨基酸序列的 N- 端加帽模块 ( 即加帽重复序列 ) ：
GSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNA (SEQ ID NO:1) ，和
具有下述氨基酸序列的 C- 端加帽模块 ( 即加帽重复序列 )
QDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (SEQ ID NO:2) 。
等人 , 2008 ( 在上述引文中 ) 描述了具有下述氨基酸序列的 C- 端加帽模块： QDKFGKTPFDLAIREGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO:3) 和 QDKFGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO:4) 。
例如， SEQ ID NO:17 的 N- 端加帽模块由 1-32 位的氨基酸编码， SEQ ID NO:17 的 C- 端加帽模块由 99-126 位的氨基酸编码。
一种优选的 N- 端加帽模块包含下述序列基序
X1LX2KKLLEAARAGQDDEVRILX3AX4GADVNA (SEQ ID NO:5)
其中 X1 代表氨基酸残基 G 、 A 或 D ；
其中 X2 代表氨基酸残基 G 或 D ；
其中 X3 代表氨基酸残基 L 、 V 、 I 、 A 或 M ；优选地， L 或 M ；且
其中 X4 代表氨基酸残基 A 、 H 、 Y 、 K 、 R 或 N ；优选地， A 或 N 。
进一步优选的是，任意这样的包含 N- 端加帽重复序列的 N- 端加帽模块，其中所述加帽重复序列中的一个或多个氨基酸残基被特定氨基酸残基替换，所述特定氨基酸残基在比对相应加帽单元或重复单元时存在于对应位置处。
一种优选的 C- 端加帽模块包含下述序列基序
X1DKX2GKTX3X4D X5X6X7DX8GX9EDX10AEX11LQKAA (SEQ ID NO:6)
其中 X1 代表氨基酸残基 Q 或 K ；
其中 X2 代表氨基酸残基 A 、 S 或 F ；优选地， S 或 F ；
其中 X3 代表氨基酸残基 A 或 P ；
其中 X4 代表氨基酸残基 A 或 F ；
其中 X5 代表氨基酸残基 I 或 L ；
其中 X6 代表氨基酸残基 S 或 A ；
其中 X7 代表氨基酸残基 I 或 A ；
其中 X8 代表氨基酸残基 A 、 E 或 N ；优选地， A 或 N ；
其中 X9 代表氨基酸残基 N 或 H ；
其中 X10 代表氨基酸残基 L 或 I ；
其中 X11 代表氨基酸残基 I 或 V ；且
其中如果 X4 代表 F 、且 X7 代表 I 、且 X8 代表 N 或 E ，那么 X2 不代表 F 。
另一种优选的 C- 端加帽模块包含下述序列基序
X1DKX2GKTX3ADX4X5X6DX7GX8EDX9AEX10LQKAA (SEQ ID NO:7)
其中 X1 代表氨基酸残基 Q 或 K ；
其中 X2 代表氨基酸残基 A 、 S 或 F ；优选地， S 或 F ；
其中 X3 代表氨基酸残基 A 或 P ；
其中 X4 代表氨基酸残基 I 或 L ；
其中 X5 代表氨基酸残基 S 或 A ；
其中 X6 代表氨基酸残基 I 或 A ；
其中 X7 代表氨基酸残基 A 、 E 或 N ；优选地， A 或 N ；
其中 X8 代表氨基酸残基 N 或 H ；
其中 X9 代表氨基酸残基 L 或 I ；且
其中 X10 代表氨基酸残基 I 或 V 。
另一种优选的 C- 端加帽模块包含下述序列基序
X1DKX2GKTX3ADX4X5ADX6GX7EDX8AEX9LQKAA (SEQ ID NO:8)
其中 X1 代表氨基酸残基 Q 或 K ；
其中 X2 代表氨基酸残基 A 、 S 或 F ；优选地， S 或 F ；
其中 X3 代表氨基酸残基 A 或 P ；
其中 X4 代表氨基酸残基 I 或 L ；
其中 X5 代表氨基酸残基 S 或 A ；
其中 X6 代表氨基酸残基 A 、 E 或 N ；优选地， A 或 N ；
其中 X7 代表氨基酸残基 N 或 H ；
其中 X8 代表氨基酸残基 L 或 I ；且
其中 X9 代表氨基酸残基 I 或 V 。
优选地，这样的包含 SEQ ID NO:6 、 7 或 8 的序列基序的 C- 端加帽模块在与所述序列基序的 3 位相对应的位置处具有氨基酸残基 A 、 I 或 K ；优选， I 或 K 。
也优选地，这样的包含 SEQ ID NO:6 、 7 或 8 的序列基序的 C- 端加帽模块在与所述序列基序的 14 位相对应的位置处具有氨基酸残基 R 或 D 。
一种优选的 C- 端加帽模块是具有下述氨基酸序列的 C- 端加帽模块： QDKSGKTPADLAADAGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO:9) 。
进一步优选的是，具有 SEQ ID NO:9 的氨基酸序列的 C- 端加帽模块，其中
在 1 位的氨基酸残基是 Q 或 K ；
在 4 位的氨基酸残基是 S 或 F ；
在 9 位的氨基酸残基是 A 或 F ；
在 13 位的氨基酸残基是 A 或 I ；
在 15 位的氨基酸残基是 A 、 E 或 N ；且
其中所述 C- 端加帽模块不具有 SEQ ID NO:2 、 3 或 4 的氨基酸序列。
进一步优选的是这样的 C- 端加帽模块，其具有在与 SEQ ID NO:9 或 2 比对时具有至少 70% 、优选至少 75% 、 80% 、 85% 、 90% 或最优选至少 95% 氨基酸序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述 C- 端加帽模块在比对时在与 SEQ ID:9 的 4 位相对应的位置处的氨基酸残基是 S ，所述 C- 端加帽模块在比对时在与 SEQ ID:9 的 9 位相对应的位置处的氨基酸残基是 A ，所述 C- 端加帽模块在比对时在与 SEQ ID:9 的 13 位相对应的位置处的氨基酸残基是 A ，和 / 或所述 C- 端加帽模块在比对时在与 SEQ ID:9 的 15 位相对应的位置处的氨基酸残基是 A 。进一步优选地，所述 C- 端加帽模块在比对时在与 SEQ ID:9 的 9 位相对应的位置处的氨基酸残基是 A ，和 / 或所述 C- 端加帽模块在比对时在与 SEQ ID:9 的 13 位相对应的位置处的氨基酸残基是 A 。也优选地，所述 C- 端加帽模块包含 28 个氨基酸。
进一步优选的是这样的 C- 端加帽模块，其具有 SEQ ID NO:2 或 9 的氨基酸序列，其中
所述 C- 端加帽模块的一个或多个氨基酸残基被特定氨基酸替换，所述特定氨基酸在比对对应的 C- 端加帽重复序列或加帽单元时存在于对应位置处，且其中
在 4 位的氨基酸残基是 S ；
在 9 位的氨基酸残基是 A ；
在 13 位的氨基酸残基是 A ；和 / 或者
在 15 位的氨基酸残基是 A 。
优选地，所述 C- 端加帽模块的最多 30% 的氨基酸残基被替换，更优选最多 20% 和甚至更优选最多 10% 的氨基酸残基被替换。也优选地，这样的 C- 端加帽模块是天然存在的 C- 端加帽重复序列。
还优选的是这样的 C- 端加帽模块，其包含基于 SEQ ID NO:9 的任意上述 C- 端加帽模块的 1-25 位或 1-26 位的氨基酸。
进一步优选的是这样的 C- 端加帽模块，其具有不包含氨基酸 N 和随后的 G 的氨基酸序列。
还优选的是这样的 C- 端加帽模块，其与基于 SEQ ID NO:9 的任意上述 C- 端加帽模块或与 SEQ ID NO:9 本身具有至少 70% 、优选至少 75% 、 80% 、 85% 、 90% 、或最优选至少 95% 氨基酸序列同一性。
进一步优选的是这样的 C- 端加帽模块，其与 SEQ ID NO:2 或 9 具有至少 70% 、优选至少 75% 、 80% 、 85% 、 90% 或最优选至少 95% 氨基酸序列同一性，且其中所述 C- 端加帽模块具有在 9 位处的氨基酸 A ；优选地，所述 C- 端加帽模块具有在 9 和 13 位处的氨基酸 A ；更优选地，所述 C- 端加帽模块具有在 9 、 13 和 15 位处的氨基酸 A ；最优选地，所述 C- 端加帽模块具有在 9 、 13 和 15 位处的氨基酸 A 和在 4 位处的氨基酸 S 。
进一步优选的是这样的 C- 端加帽模块，其不具有在 14 位处的氨基酸 R ，和 / 或不具有在 15 位处的氨基酸 E 。
还优选的是这样的 C- 端加帽模块，其不具有与 SEQ ID NO:2 、 3 或 4 相同的氨基酸序列。
进一步优选的是这样的 C- 端加帽模块，其具有基于 SEQ ID NO:9 的氨基酸序列，其中所述 C- 端加帽模块具有在 26 、 27 和 28 位处的选自下述的氨基酸： A 、 L 、 R 、 M 、 K 和 N ；更优选 A 、 L 、 R 和 K ；且最优选 K 、 A 和 L 。
通过组合本领域技术人员已知的技术（诸如氨基酸序列比对、诱变和基因合成），可以用本发明的加帽模块替换重复结构域的加帽模块。例如，可以如下用 SEQ ID NO:9 的 C- 端加帽重复序列替换 SEQ ID NO:17 的 C- 端加帽重复序列： (i) 通过与 SEQ ID NO:9 进行序列比对，确定 SEQ ID NO:17 的 C- 端加帽重复序列 ( 即序列位置 99-126) ， (ii) 用 SEQ ID NO:9 的序列替换确定的 SEQ ID NO:17 的 C- 端加帽重复序列的序列， (iii) 制备编码重复结构域的基因，所述重复结构域编码替换的 C- 端加帽模块， (iv) 在大肠杆菌的细胞质中表达修饰的重复结构域，和 (v) 通过标准方式纯化修饰的重复结构域。
此外，可以如下遗传地构建本发明的重复结构域：借助于基因合成，装配 N- 端加帽模块 ( 即 SEQ ID NO:1 的 N- 端加帽重复序列 ) ，继之以一个或多个重复模块 ( 即包含 SEQ ID NO:17 的 33-98 位氨基酸残基的重复模块 ) 和 C- 端加帽模块 ( 即 SEQ ID NO:9 的 C- 端加帽重复序列 ) 。然后可以如上所述在大肠杆菌中表达遗传地装配的重复结构域基因。
还优选的是这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域包含具有 SEQ ID NO:6 、 7 或 8 的序列基序的 C- 端加帽模块，其中所述加帽模块具有在 3 位处的氨基酸 I ，且其中所述重复模块的前面是具有 SEQ ID NO:12 的锚蛋白重复序列基序的重复模块。
进一步优选的是，具有不含氨基酸 C 、 M 或 N 的氨基酸序列的结合蛋白、重复结构域、 N- 端加帽模块或 C- 端加帽模块。
进一步优选的是，具有不含氨基酸 N 和随后的 G 的氨基酸序列的结合蛋白、重复结构域、 N- 端加帽模块或 C- 端加帽模块。
进一步优选的是，任意这样的包含 C- 端加帽重复序列的 C- 端加帽模块，其中所述加帽重复序列中的一个或多个氨基酸残基被特定氨基酸残基替换，所述特定氨基酸残基在比对相应加帽单元或重复单元时存在于对应位置处。
进一步优选的是，包含任意这样的 N- 端或 C- 端加帽模块的结合蛋白。
这样的 C- 端加帽模块的氨基酸序列的实例是，在 SEQ ID NO:19 、 21 、 27 、 28 、 38 、 40 和 42 中的 99-126 位的氨基酸序列。实施例 6 证实，通过用本发明的加帽模块替换它们的 C- 端加帽模块，可以增加重复结构域的热稳定性。
术语“靶标”指个别分子诸如核酸分子、多肽或蛋白、碳水化合物，或者任何其它天然存在的分子，包括此类个别分子的任何部分，或者两个或更多个此类分子的复合物。靶标可以是整个细胞或组织样品，或者可以是任何非天然的分子或部分。优选靶标是天然存在或非天然的多肽或者含有化学修饰的多肽，例如通过天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化修饰。在本发明的特定应用中，靶标是 xSA 。
术语“ xSA ”表示哺乳动物血清白蛋白，诸如得自小鼠、大鼠、兔、狗、猪、猴或人的血清白蛋白。术语“ MSA ”表示小鼠血清白蛋白 (UniProtKB/Swiss-Prot 基本登录号 P07724) ，术语“ CSA ”表示食蟹猴 ( 即成束猴（ macaca fascicularis ） ) 血清白蛋白 (UniProtKB/Swiss-Prot 基本登录号 A2V9Z4) ，术语“ HSA ”表示人血清白蛋白 (UniProtKB/Swiss-Prot 基本登录号 P02768) 。
术语“共有序列”指氨基酸序列，其中所述共有序列通过多个重复单元的结构和 / 或序列比对获得。使用两个或更多个经结构和 / 或序列比对的重复单元并且在比对时允许空位，可以确定各位置最常见的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置最常出现的氨基酸的序列。在其中两种或更多种氨基酸超过平均数地出现在单个位置的情况下，共有序列可包括那些氨基酸的子集。所述两个或更多个重复单元可取自包含在单种重复蛋白中或者来自两种或更多种不同的重复蛋白的重复单元。
本领域技术人员熟知共有序列及其确定方法。
“共有氨基酸残基”是见于共有序列的特定位置的氨基酸。如果两种或更多种，如三、四或五种氨基酸残基以相似概率见于所述两个或更多个重复单元中，共有氨基酸可以是最常见的氨基酸之一或者所述两种或更多种氨基酸残基的组合。
进一步优选非天然存在的加帽模块、重复模块、结合蛋白或结合域。
术语“非天然存在的”意指合成的或不来自天然，更具体来讲，术语意指用人手制造。术语“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合域”意指所述结合蛋白或所述结合域是合成的 ( 即通过化学合成用氨基酸制备 ) 或重组的且不来自天然。“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合域”分别是通过对应设计的核酸表达获得的人造蛋白或结构域。优选表达在真核或细菌细胞中进行，或者通过使用无细胞体外表达系统进行。而且，术语意指所述结合蛋白或所述结合域的序列不作为非人造序列条目存在于序列数据库，例如 GenBank 、 EMBL-Bank 或 Swiss-Prot 中。本领域技术人员熟知这些数据库及其它相似的序列数据库。
本发明涉及包含结合域的结合蛋白，其中所述结合域是锚蛋白重复结构域且特异性地结合 xSA ，其中所述结合蛋白和 / 或结合域在 PBS 中热解折叠以后具有高于 40 ℃的中点变性温度 (Tm) ，并在最高 10 g/L 的浓度在 PBS 中在 37 ℃温育 1 天时形成小于 5% (w/w) 的不溶性聚集体。
术语“ PBS ”意指含有 137 mM NaCl 、 10 mM 磷酸盐和 2.7 mM KCl 且具有 pH 7.4 的磷酸盐缓冲水溶液。
优选地，所述结合蛋白和 / 或结合域在 pH 7.4 的 PBS 中或在 pH 5.8 的 MES 缓冲液中热解折叠以后具有高于 45 ℃，更优选高于 50 ℃，更优选高于 55 ℃，和最优选高于 60 ℃的中点变性温度 (Tm) 。本发明的结合蛋白或结合域在生理条件下具有确定的二级和三级结构。这样的多肽的热解折叠会导致它的三级和二级结构的丧失，这可以通过例如圆二色性 (CD) 测量来跟踪。结合蛋白或结合域在热解折叠以后的中点变性温度与这样的温度相对应：通过将温度从 10 ℃缓慢地升高至约 100 ℃使所述蛋白或结构域热变性以后，在生理缓冲液中的协同转变的中点处的温度。在热解折叠以后的中点变性温度的确定，是本领域技术人员熟知的。结合蛋白或结合域在热解折叠以后的该中点变性温度会指示所述多肽的热稳定性。
还优选的是这样的结合蛋白和 / 或结合域，其在最高 20 g/L 、优选地最高 40 g/L 、更优选最高 60 g/L 、甚至更优选最高 80 g/L 和最优选最高 100 g/L 的浓度，当在 PBS 中在 37 ℃温育超过 5 天、优选地超过 10 天、更优选地超过 20 天、更优选地超过 40 天和最优选地超过 100 天时，形成小于 5% (w/w) 的不溶性聚集体。通过肉眼可见沉淀的出现、凝胶过滤或动态光散射（其在不溶性聚集体形成后强烈增加），可以检测不溶性聚集体的形成。通过在 10 ’ 000 x g 离心 10 分钟，可以从蛋白样品中除去不溶性聚集体。优选地，结合蛋白和 / 或结合域在 PBS 中在 37 ℃的所述温育条件下形成小于 2% 、更优选地小于 1% 、 0.5% 、 0.2% 、 0.1% 或最优选地小于 0.05% (w/w) 的不溶性聚集体。可以如下确定不溶性聚集体的百分比：使不溶性聚集体与可溶性蛋白分离，随后通过标准定量方法确定在可溶性级分和不溶性级分中的蛋白量。
还优选的是，在含有 100 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 的 PBS 中在 37 ℃温育 1 或 10 小时后不丧失其自然三维结构的结合蛋白和 / 或结合域。
在一个特定实施方案中，本发明涉及包含结合域的结合蛋白，所述结合域是锚蛋白重复结构域，其特异性地结合 xSA ，并具有如上文限定的所示或优选的中点变性温度和非聚集性质，其中所述结合蛋白在哺乳动物中的终末血浆半衰期比不结合血清蛋白（诸如 xSA ）的结合域高至少 5 倍。
优选地，所述结合域在哺乳动物中的终末血浆半衰期比不结合血清蛋白（诸如 xSA ）的结合域高至少 10 倍、更优选至少 20 倍、 40 倍、 100 倍、 300 倍或最优选至少 103 倍。
也优选地，所述结合域不结合 xSA ，这表现为与 xSA 结合的 Kd 高于 10-4M 、更优选高于 10-3M 或最优选高于 10-2M 。不结合 xSA 的结合域的一个实例是 SEQ ID NO:32 的重复结构域。
进一步优选地，所述结合域是重复结构域，且与 SEQ ID NO:32 的重复结构域相比，或者与 DARPin #32 、 DARPin #41 或 DARPin #42 相比，其在哺乳动物中的终末血浆半衰期高 ( 即长 ) 至少 5 倍、更优选至少 10 倍、 20 倍、 40 倍、 100 倍、 300 倍或最优选至少 103 倍。
一种优选的结合蛋白包含对 HSA 具有结合特异性的结合域，其在人类中具有超过 1 天、更优选超过 3 天、 5 天、 7 天、 10 天、 15 天或最优选超过 20 天的终末血浆半衰期。
通过本领域技术人员熟知的测定 (Toutain, P.L., 和 Bousquet-M é lou, A., J. Vet. Pharmacol. Ther. 27(5), 427-439, 2004) ，可以确定结合域的终末血浆半衰期。在实施例中给出了确定终末血浆半衰期的实例。
术语药物（诸如本发明的结合蛋白或结合域）的“终末血浆半衰期”表示，施用给哺乳动物的药物在达到假平衡以后，达到血浆浓度的半数所需的时间。该半衰期没有被定义为消除施用给哺乳动物的药物的半数剂量所需的时间。
在一个具体实施方案中，本发明涉及包含结合域的结合蛋白，所述结合域是锚蛋白重复结构域，特异性地结合 xSA ，且所述结合蛋白包含生物活性化合物。
术语“生物活性化合物”表示，当施用给具有疾病的哺乳动物时，会改变所述疾病的化合物。生物活性化合物可以具有拮抗或激动性质，且可以是蛋白性生物活性化合物或非蛋白性生物活性化合物。
通过用标准 DNA 克隆技术制备基因融合多肽，可将这样的蛋白性生物活性化合物共价连接至例如本发明的结合域，接着进行标准表达和纯化。例如， DARPin #36 包含对人生长因子 ( 即生物活性化合物 ) 具有结合特异性的重复结构域和随后的对 HSA 具有结合特异性的重复结构域。
通过化学方法，例如，经由马来酰亚胺接头与半胱氨酸巯基偶联，其中半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的 N- 或 C- 端偶联，可以将这样的非蛋白性生物活性化合物共价连接至例如本发明的结合域。
蛋白性生物活性化合物的实例是，具有独特靶标特异性的结合域 ( 例如通过结合生长因子来中和它 ) 、细胞因子 ( 例如白介素 ) 、生长因子 ( 例如人生长激素 ) 、抗体及其片段、激素 ( 例如 GLP-1) 和任何可能的蛋白性药物。
非蛋白性生物活性化合物的实例是，毒素 ( 例如得自免疫原（ ImmunoGen ）的 DM1) 、靶向 GPCR 的小分子、抗生素和任何可能的非蛋白性药物。
在一个具体实施方案中，本发明涉及包含锚蛋白重复结构域的结合蛋白，所述锚蛋白重复结构域特异性地结合 xSA ，且所述结合蛋白另外包含生物活性化合物，其中所述结合蛋白在哺乳动物中的终末半衰期比所述未修饰的生物活性化合物的终末半衰期高至少 2 倍，其中所述更高的终末半衰期由所述重复结构域赋予给所述结合蛋白。
优选地，所述结合蛋白在哺乳动物中的终末血浆半衰期比所述未修饰的生物活性化合物高至少 5 倍、更优选至少 10 倍、 20 倍、 40 倍、 100 倍、 300 倍或最优选至少 103 倍。
另一个优选的实施方案是这样的重组结合蛋白，其包含特异性地结合 xSA 的结合域，且其中所述结合域是锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域。这类锚蛋白重复结构域可以包含 1 个、 2 个、 3 个或更多个内部重复模块，所述重复模块将参与结合 xSA 。优选地，这类锚蛋白重复结构域包含 N- 端加帽模块、 2-4 个内部重复模块和 C- 端加帽模块。优选地，所述结合域是锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域。也优选地，所述加帽模块是加帽重复序列。
具体地，本发明涉及如上文定义的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自下述的锚蛋白重复结构域竞争结合哺乳动物血清白蛋白： SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 ；优选 SEQ ID NO: 17-31 ；更优选 SEQ ID NO:19 、 21 、 27 和 28 ，尤其是 SEQ ID NO:19 和 27 。
最优选的是这样的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域选自： SEQ ID NO: 17-31 和 43-48 ，其中所述锚蛋白重复结构域的在 1 位处的 G 和 / 或在 2 位处的 S 任选地缺失。
也优选地，所述重复结构域与选自 DARPin #17-31 和 43-48 的结合蛋白竞争结合 xSA 。优选地，所述重复结构域与选自 DARPin #19 、 21 、 27 、 28 、 45 、 46 、 47 和 48 的结合蛋白竞争结合 xSA 。更优选地，所述重复结构域与结合蛋白 DARPin #19 、 45 、 46 、 48 或 27 竞争结合 xSA ；甚至更优选地，所述重复结构域与结合蛋白 DARPin #46 或 27 竞争结合 xSA 。
术语“竞争结合”意指本发明的两种不同结合域不能同时与相同靶标结合，但两者各自能够与相同靶标结合。因此，这样的两种结合域竞争结合所述靶标。优选地，所述两种竞争性结合域会结合在所述靶标上的重叠或相同结合表位。本领域技术人员熟知确定两种结合域是否竞争结合靶标的方法，诸如竞争性酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或竞争性 SPR 测量 ( 如通过使用 BioRad 的 Proteon 仪器 ) 。
另一个优选的实施方案是这样的结合蛋白，其包含选自下述的对 xSA 具有结合特异性的重复结构域： SEQ ID NO:17-31 的重复结构域。优选地，所述重复结构域是 SEQ ID NO:19 、 21 、 27 或 28 的重复结构域。更优选地，所述重复结构域是 SEQ ID NO:19 的重复结构域。还更优选地，所述重复结构域是 SEQ ID NO:21 的重复结构域。还更优选地，所述重复结构域是 SEQ ID NO:27 的重复结构域。还更优选地，所述重复结构域是 SEQ ID NO:28 的重复结构域。
进一步优选的是这样的结合蛋白，其中所述对 xSA 具有结合特异性的重复结构域具有与所述重复结构域集合的重复结构域具有至少 70% 氨基酸序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述氨基酸序列同一性是至少 75% 、更优选至少 80% 、更优选至少 85% 、更优选至少 90% 和最优选至少 95% 。
进一步优选的是这样的结合蛋白，其中所述对 xSA 具有结合特异性的重复结构域包含这样的重复模块，其与所述重复结构域集合的重复结构域的重复模块具有至少 70% 氨基酸序列同一性。优选地，所述氨基酸序列同一性是至少 75% 、更优选至少 80% 、更优选至少 85% 、更优选至少 90% 和最优选至少 95% 。
进一步优选的是这样的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含 2 个或更多个所述对 xSA 具有结合特异性的重复结构域。优选地，所述结合蛋白包含 2 个或 3 个所述重复结构域。所述 2 个或更多个重复结构域具有相同的或不同的氨基酸序列。
在根据本发明的包含重复结构域的结合蛋白的另一个优选的实施方案中，所述重复结构域的重复模块的一个或多个氨基酸残基被比对重复单元时在对应位置上发现的氨基酸残基替换。优选地，最多 30% 的氨基酸残基被替换，更优选地，最多 20% ，和甚至更优选地，最多 10% 的氨基酸残基被替换。最优选地，这类重复单元是天然存在的重复单元。
在根据本发明的包含重复结构域的结合蛋白的另一个优选的实施方案中，所述重复结构域的 N- 端加帽模块的一个或多个氨基酸残基被比对 N- 端加帽单元时在对应位置上发现的氨基酸残基替换。优选地，最多 30% 的氨基酸残基被替换，更优选地，最多 20% ，和甚至更优选地，最多 10% 的氨基酸残基被替换。最优选地，这类 N- 端加帽单元是天然存在的 N- 端加帽单元。
在根据本发明的包含重复结构域的结合蛋白的另一个优选的实施方案中，所述重复结构域的 C- 端加帽模块的一个或多个氨基酸残基被比对 C- 端加帽单元时在对应位置上发现的氨基酸残基替换。优选地，最多 30% 的氨基酸残基被替换，更优选地，最多 20% ，和甚至更优选地，最多 10% 的氨基酸残基被替换。最优选地，这类 C- 端加帽单元是天然存在的 C- 端加帽单元。
在另一个具体实施方案中，最多 30% 的氨基酸残基，更优选地，最多 20% ，和甚至更优选地，最多 10% 的氨基酸残基被不是在重复单元、 N- 端加帽单元或 C- 端加帽单元的对应位置发现的氨基酸替换。
在其它实施方案中，本文描述的任一种 xSA 结合蛋白或结构域可以与一个或多个额外部分共价结合，所述额外部分包括例如结合不同靶标以产生双特异性结合剂的部分、生物活性化合物、标记部分 ( 例如荧光标记诸如荧光素，或放射性示踪剂 ) 、促进蛋白纯化的部分 ( 例如小肽标签，诸如 His- 或 strep- 标签 ) 、提供改善的治疗效果的效应物功能的部分 ( 例如提供抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体 Fc 部分，毒性蛋白部分诸如铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 外毒素 A (ETA) 或小分子毒性剂诸如美登木素生物碱或 DNA 烷化剂 ) 或提供改善的药代动力学的部分。可以根据感知的治疗需要评估改善的药代动力学。经常希望增加生物利用度和 / 或增加给药之间的时间，其可能通过增加给药后血清中的蛋白维持可用的时间实现。在一些情况下，希望改善蛋白血清浓度随时间的连续性 ( 例如，减少在施用后不久的浓度和下次施用前不久的浓度之间的蛋白血清浓度差异 ) 。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码特定结合蛋白、特定 N- 端加帽模块或特定 C- 端加帽模块的核酸分子。此外，还涉及包含所述核酸分子的载体。
此外，涉及药物组合物，其包含一种或更多种上述结合蛋白 ( 尤其是包含重复结构域的结合蛋白 ) 、或编码特定结合蛋白的核酸分子、以及任选的药学上可接受的载体和 / 或稀释剂。药学上可接受的载体和 / 或稀释剂是本领域技术人员已知的，将在下文更详细的解释。更进一步，涉及包括一种或更多种上述结合蛋白 ( 尤其是包含重复结构域的结合蛋白 ) 的诊断组合物。
药物组合物包含如上所述的结合蛋白和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂例如如在 Remington's Pharmaceutical Sciences 第 16 版 , Osol, A. 编 [1980] 中所述。技术人员已知的合适载体、赋形剂或稳定剂是盐水、林格溶液、葡萄糖（ dextrose ）溶液、汉克氏（ Hank's ）溶液、非挥发油、油酸乙酯、 5% 葡萄糖盐水、提高等渗性和化学稳定性的物质、缓冲剂和防腐剂。其它合适载体包括本身不引起产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体，诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含另外的活性剂，诸如抗癌剂或抗血管生成剂。
将用于体内给药的制剂必须消毒或无菌。这通过过滤用无菌过滤膜容易完成。
药物组合物可通过技术人员知识范围内的任何合适方法给药。优选的给药途径是胃肠外。在胃肠外给药中，将本发明的药物配制成与如上文限定的与药学上可接受的赋形剂组合的单位剂量可注射形式，诸如溶液剂、混悬剂或乳剂。给药的剂量和方式将取决于将治疗的个体和具体疾病。一般而言，施用药物组合物，使得以 1 μ g/kg 至 20 mg/kg 、更优选 10 μ g/kg 至 5 mg/kg 、最优选 0.1 至 2 mg/kg 的剂量施用本发明的结合蛋白。优选其以推注剂量 (bolus dose) 给药。也可使用连续输注，包括经渗透性微型泵连续皮下递送。如果这样的话，可将药物组合物以 5 至 20 μ g/kg/ 分钟、更优选 7 至 15 μ g/kg/ 分钟的剂量输注。
此外，考虑将任一种上述药物组合物用于病症的治疗。
本发明另外提供了治疗方法。所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的结合蛋白。
此外，考虑到治疗哺乳动物（包括人类）的病理学状况的方法，所述方法包括：给有此需要的患者施用有效量的上述药物组合物。
根据本发明的结合蛋白可通过几种方法获得和 / 或进一步进化，诸如在噬菌体 (WO 1990/002809 、 WO 2007/006665) 或细菌细胞 (WO 1993/010214) 表面上展示、核糖体展示 (WO 1998/048008) 、质粒展示 (WO 1993/008278) 、或者通过使用共价的 RNA- 重复蛋白杂合构建体 (WO 2000/032823) ，或者例如通过蛋白互补测定 (WO 1998/341120) 进行的细胞内表达和选择 / 筛选。本领域技术人员已知此类方法。
用于选择 / 筛选根据本发明的结合蛋白的锚蛋白重复蛋白文库，可根据本领域技术人员已知的方案获得 (WO 2002/020565, Binz, H.K., 等人 , J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003, 和 Binz 等人 , 2004, 在上述引文中 ) 。在实施例 1 给出了此类文库用于选择 xSA 特异性的 DARPin 的用途。类似地，如上文提出的锚蛋白重复序列基序可用于建立可用于选择或筛选 xSA 特异性的 DARPin 的锚蛋白重复蛋白文库。此外，使用标准重组 DNA 技术 ( 例如 WO 2002/020565, Binz 等人 , 2003, 在上述引文中和 Binz 等人 , 2004, 在上述引文中 ) ，可以从本发明的重复模块和适当的加帽模块或加帽重复序列模块地（ modularly ）装配本发明的重复结构域 (Forrer, P., 等人 , FEBS letters 539, 2-6, 2003) 。
本发明不限于在实施例描述的特定实施方案。按照下文描述的概要可使用和处理其它来源。
实施例
下文公开的所有起始原料和试剂已为本领域技术人员所知，且可商购得到或者可用众所周知的技术制备。
材料
化学品购自 Fluka ( 瑞士 ) 。寡核苷酸来自 Microsynth ( 瑞士 ) 。除非另外说明， DNA 聚合酶、限制酶和缓冲液来自 New England Biolabs ( 美国 ) 或 Fermentas ( 立陶宛 ) 。克隆和蛋白制备株是大肠杆菌 XL1-blue (Stratagene, 美国 ) 或 BL21 (Novagen, 美国 ) 。购买得自不同物种的纯化的血清白蛋白和血清 ( 例如从 Sigma-Aldrich, 瑞士或 Innovative Research, 美国 ) 。使用标准的生物素化试剂和方法 (Pierce, 美国 ) ，将生物素部分与纯化的血清白蛋白的伯胺偶联，以化学方式获得不同物种的生物素化的血清白蛋白。
分子生物学
除非另外说明，根据所述方案 (Sambrook J., Fritsch E.F. 和 Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York) ，执行方法。
设计的锚蛋白重复蛋白文库
描述了 N2C 和 N3C 设计的锚蛋白重复蛋白文库 (WO 2002/020565; Binz 等人 . 2003, 在上述引文中 ; Binz 等人 . 2004, 在上述引文中 ) 。在 N2C 和 N3C 中的数字描述了存在于 N- 端和 C- 端加帽模块之间的随机化重复模块的数目。用于定义重复单元和模块内的位置的命名法是基于： Binz 等人 . 2004, 在上述引文中，修改是，将锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边缘移动一个氨基酸位置。例如， Binz 等人 . 2004 ( 在上述引文中 ) 的锚蛋白重复模块的 1 位对应于本公开内容的锚蛋白重复模块的 2 位，因此， Binz 等人 . 2004 （在上述引文中）的锚蛋白重复模块的 33 位对应于本公开内容的下一锚蛋白重复模块的 1 位。
所有 DNA 序列都通过测序确认，所有所述蛋白的计算分子量都通过质谱确认。
实施例 1: 包含对 xSA 具有结合特异性的重复结构域的结合蛋白的选择
使用核糖体展示 (Hanes, J. 和 Pl ü ckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997) ，从由 Binz 等人 . 2004 ( 在上述引文中 ) 描述的 N2C 或 N3C DARPin 文库选择出许多对 xSA 具有结合特异性的设计的锚蛋白重复蛋白 (DARPin) 。通过粗提取 ELISA ，评估了所选克隆对特异性的 (xSA ；即 MSA 、 HSA 或 CSA) 和非特异性的 (MBP ，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白 ) 靶标的结合，提示成功选择 xSA 结合蛋白。 SEQ ID NO:17-31 的重复结构域构成所选结合蛋白的氨基酸序列，所述结合蛋白包含对 xSA 具有结合特异性的重复结构域。所选结合剂（ binder ）的序列分析揭示了某些所选结合剂家族固有的特异性锚蛋白重复序列基序。在 SEQ ID NO:11-14 中提供了存在于对 xSA 具有结合特异性的重复结构域中的这类锚蛋白重复序列基序。
通过核糖体展示选择血清白蛋白特异性的锚蛋白重复蛋白
用 HSA 、 CSA 或 MSA 作为靶蛋白，使用如描述的设计的锚蛋白重复蛋白文库 (WO 2002/020565, Binz 等人 , 2003, 在上述引文中和 Binz 等人 , 2004, 在上述引文中 ) 和建立的方案 (Zahnd, C., Amstutz, P. 和 Pl ü ckthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007) ，通过核糖体展示 (Hanes 和 Pl ü ckthun, 在上述引文中 ) 进行了血清白蛋白特异性的锚蛋白重复蛋白的选择。使用建立的方案 (Binz 等人 . 2004, 在上述引文中 ) ，用 N2C 和 N3C DARPin 文库两者对 HSA 、 CSA 或 MSA( 包括用 Neutravidin 或抗生蛋白链菌素固定的 HSA 或 MSA 的生物素化变体 ) 进行核糖体展示选择循环。每个选择循环后的反转录 (RT)-PCR 循环数恒定地从 40 减至 30 ，因应富含结合剂的收率作出调节。对 HSA 、 CSA 或 MSA 的 4 个选择循环得到了微摩尔至纳摩尔 - 亲和力 DARPin 库，如通过对单一克隆的 ELISA 和 SPR 测量所揭示的。通过本领域技术人员熟知的方法 ( 例如通过易错 PCR 使 DARPin 克隆多样化，并如上所述选择和筛选改进的结合剂 ) ，使用亲和力成熟，进一步提高某些 DARPin 的亲和力。
如通过粗提取 ELISA 所示，经选择的克隆特异性地结合血清白蛋白
利用标准方案，用 DARPin 表达细胞的粗制大肠杆菌提取物，通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 鉴定各种所选特异性地结合 xSA 的 DARPin 。通过核糖体展示，将所选克隆克隆入 pQE30 (Qiagen) 表达载体内，转化入大肠杆菌 XL1-Blue (Stratagene) 内，然后在装有 1 ml 生长培养基 (2YT ，含有 1% 葡萄糖和 100µg/ml 氨苄西林 ) 的 96 深孔板 ( 每个克隆在单个孔内 ) 中，在 37 ℃培养过夜。在新的 96 深孔板中，用 100µl 过夜培养物接种 1 ml 含有 50µg/ml 氨苄西林的新鲜 2YT 。在 37 ℃温育 2 小时后，用 IPTG (1 mM 终浓度 ) 诱导表达，并继续 3 小时。将细胞收集，再悬浮于 100µl B-PERII (Pierce) 中，在室温振荡温育 15 分钟。然后加入 900µl PBS-TC ( 补充了 0.25% 酪蛋白水解物、 0.1% 吐温 20® 、 pH 7.4 的 PBS) ，离心除去细胞碎片。将 100µl 各裂解的克隆施加于 NeutrAvidin 包被的 MaxiSorp 板的孔内，所述孔装有通过其生物素部分固定的 xSA 或不相关 MBP ，并在室温温育 1 小时。用 PBS-T ( 补充了 0.1% 吐温 20® 、 pH 7.4 的 PBS) 充分洗涤后，用标准 ELISA 程序使板显影，所述程序使用单克隆抗 -RGS(His)4 抗体 (34650, Qiagen) 作为第一抗体，并使用与碱性磷酸酶缀合的多克隆山羊抗小鼠抗体 (A3562, Sigma) 作为第二试剂。然后用 4- 硝基苯基磷酸二钠 (4NPP, Fluka) 作为碱性磷酸酶的底物，检测结合。在 405 nm 测量颜色显影。通过此类粗制细胞提取物 ELISA 对几百个克隆的筛选，揭示了超过一百种对 xSA 具有特异性的不同 DARPin 。选择这些结合蛋白用于进一步分析。在 SEQ ID NO:17-31 、 37-40 和 43-48 中提供了特异性地结合 xSA 的所选重复结构域的氨基酸序列实例。
从对 xSA 具有结合特异性的所选重复结构域推断重复序列基序（ motives ）
通过本领域技术人员已知的序列分析工具 (WO 2002/020565; Forrer 等人 , 2003, 在上述引文中 ; Forrer, P., Binz, H.K., Stumpp, M.T. 和 Pl ü ckthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004) ，进一步分析对 xSA 具有结合特异性的所选重复结构域的氨基酸序列。但是，与其中使用天然存在的重复基序来推断重复序列基序的 WO 2002/020565 相反，这里从对 xSA 具有结合特异性的所选重复结构域的重复单元推断重复序列基序。从而确定了包含共同重复序列基序的所选重复结构域家族。在 SEQ ID NO:11-14 中提供了对 xSA 具有结合特异性的重复结构域中存在的这类重复序列基序。
DARPin 的高水平和可溶性表达
为了进一步分析，将如上所述在粗制细胞提取 ELISA 中显示出特异性 xSA 结合的所选克隆在大肠杆菌 BL21 或 XL1-Blue 细胞中表达，并用标准方案利用其 His- 标签纯化。用 25 ml 静止过夜的培养物 (LB ， 1% 葡萄糖， 100 mg/l 的氨苄西林； 37 ℃ ) 接种 1 l 培养物 ( 相同培养基 ) 。在 600 nm 吸光度为 0.7 时，用 0.5 mM IPTG 诱导培养物，并在 37 ℃温育 4 小时。将培养物离心，使所得沉淀再悬浮于 40 ml TBS500 (50 mM Tris – HCl, 500 mM NaCl, pH 8) 中，并超声处理。将裂解物再次离心，将甘油 (10% (v/v) 终浓度 ) 和咪唑 (20 mM 终浓度 ) 加入所得上清液中。根据生产商的说明书 (QIAgen, 德国 ) ，用 Ni- 次氮基三乙酸柱 (2.5 ml 柱体积 ) 纯化蛋白。可替换地，根据本领域技术人员已知的标准树脂和方案，通过阴离子交换色谱法和随后的尺寸排阻色谱法，纯化不含 6xHis- 标签的 DARPin 或所选重复结构域。从 1 升大肠杆菌培养物中可纯化至多 200 mg 对血清白蛋白具有结合特异性的高度可溶性 DARPin ，根据 SDS-15% PAGE 估计的纯度 > 95% 。这样纯化的 DARPin 用于进一步表征。
实施例 2: 对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 的稳定性分析和尺寸排阻色谱法
如上所述使用它们的 His- 标签将对 xSA 具有结合特异性的 DARPin #19-22 和 DARPin #27-30 纯化至接近同质，并以 30 mg/ml ( 约 2 mM) 在 PBS 中在 40 ℃储存 28 天 ( 稳定性研究 ) 。在第 0 天 ( 图 1a) 和第 28 天 ( 图 1b) ，取出样品，稀释至 500µM ，并通过尺寸排阻色谱法 (SEC) 进行分析，以评估它们的表观分子量和随时间的稳定性 ( 即它们的聚集、多聚化或降解趋势 ) 。
在另一个实验 ( 图 1c) 中，如上所述使用它们的 His- 标签将对 xSA 具有结合特异性的 DARPin #19 和 43-48 纯化至接近同质，并以约 100 mg/ml 在 PBS 中在 -80 ℃储存 28 天，稀释至 500µM ，并通过尺寸排阻色谱法 (SEC) 进行分析，用于表征 ( 即它们的聚集、多聚化或降解趋势 ) 。值得注意的是，与第一个分析系列相比，使用更大的柱 ( 参见下文 ) 。
尺寸排阻色谱法 (SEC)
使用 HPLC 系统 (Agilent 1200 系列 ) ，使用 Superdex 200 5/150 柱 ( 图 1a 和图 1b) 或 Superdex 200 10/300GL 柱 ( 图 1c) (GE Healthcare) ，在 20 ℃进行分析型 SEC 。 Superdex 200 5/150 柱具有 3.0 ml 的床体积和 1.08 ml 的外水体积 ( 使用蓝葡聚糖经实验确定 ) 。 Superdex 200 10/300GL 柱具有 24 ml 的床体积和约 8 ml 的外水体积。根据本领域技术人员已知的标准规程，进行测量。在 0.2 ml/min 的流速和 15 巴的最大压力 (Superdex 200 5/150) ，或者在 0.6 ml/min 的流速和 18 巴的最大压力 (Superdex 200 10/300GL) ，在 PBS 中运行。将蛋白样品在 PBS 中稀释至约 20-500µM ，过滤 (0.22µm) ，并将 20-100µl 稀释的样品注射到柱上进行分离。通过读出在 280 nm 的吸光度，记录蛋白样品的洗脱曲线。使用分子量为 6.5 kDa 的抑酶肽 (AP) 、分子量为 29 kDa 的碳酸酐酶 (CA) 和分子量为 75 kDa 的伴清蛋白 (CO) 作为标准蛋白来得到校正曲线，从该校正曲线可以确定样品蛋白的表观分子量。
结果显示在图 1 中。 DARPin #19-22 和 27-30 在稳定性研究的第 0 天和第 28 天显示出不能辨别的 SEC 色谱图 ( 即不能辨别的洗脱曲线 ) 。结论是，所有 DARPin 在测定条件下作为单体洗脱，且 DARPin #19-23 和 27-30 在 PBS 中在 40 ℃稳定至少 1 个月 ( 即它们的洗脱曲线没有揭示任何聚集、多聚化或降解趋势 ) 。
实施例3: 对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 的热稳定性
用基于荧光的热稳定性测定 (Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221, 2007) ，分析了对 xSA 具有特异性的 DARPin 的热稳定性。由此，通过对蛋白的疏水部分（其随着蛋白解折叠而暴露）具有亲和力的染料 ( 例如 SYPRO Orange; Invitrogen, 目录号 S6650) 的荧光的增加，测量蛋白 ( 即这样的 DARPin) 解折叠时的温度。在由此得到的荧光转变中点 ( 从较低荧光强度至较高荧光强度 ) 处的温度则对应于分析的蛋白的中点变性温度 (Tm) 。
基于荧光的热稳定性测定
使用实时 PCR 仪器 ( 即与 CFX96 光学系统 (BioRad) 相组合的 C1000 热循环仪 (BioRad)) ，使用 SYPRO Orange 作为荧光染料，测量了 DARPin 的热变性。在含有 1x SYPRO Orange ( 从 5 ’ 000x SYPRO Orange 储备溶液稀释 , Invitrogen) 的 pH 7.4 的 PBS 或 pH 5.8 的 MES 缓冲液中，制备了 80µM 浓度的 DARPin ，并将 50µl 这样的蛋白溶液或仅缓冲液加入白色 96- 孔 PCR 板 (Bio-Rad) 中。用 Microseal 'B' Adhesive Seals (Bio-Rad) 密封所述板，并在实时 PCR 仪器中以 0.5 ℃的增量从 20 ℃加热至 95 ℃，包括在每个温度增量以后的 25 秒保温步骤，在 DARPin 的热变性之后，测量样品在每个温度增量处的相对荧光单位。使用实时 PCR 仪器的通道 2( 即在 515-535 nm 激发和在 560-580 nm 检测 ) ，测量板孔中的相对荧光单位，并减去用仅缓冲液得到的对应值。从由此得到的热变性转变中点，可以确定分析的 DARPin 的 Tm 值。
在图 2 和图 3 中显示了 DARPin 在 pH7.4 的 PBS 或 pH 5.8 的 MES- 缓冲液中的热变性结果，所述热变性通过 SYPRO Orange 的荧光强度增加来跟踪。测得的热变性转变证实，分析的所有对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 都具有远高于 40 ℃的 Tm 值 ( 在 pH 7.4 和 pH 5.8 两者 ) 。
实施例4：通过表面等离子体共振分析表征对 xSA 具有结合特异性的 DARPin
经由它们的 His- 标签，在流动池中将对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 固定至包被的α -RGS-His 抗体 (Qiagen, 目录号 34650) 上，并分析人、食蟹猴 (cyno) 、小鼠、大鼠、兔和狗血清白蛋白与固定的 DARPin 的相互作用。
表面等离子体共振 (SPR) 分析
使用 ProteOn 仪器 (BioRad) 测量 SPR ，并根据本领域技术人员已知的标准规程进行测量。运行缓冲液为 pH 7.4 的 PBS ，其含有 0.01% 吐温 20® 。将抗 -RGS-His 抗体共价地固定至 GLC 芯片 (BioRad) 上，达到约 2000 共振单位 (RU) 的水平。然后通过在 300 s 中注射 150µl 1µM DARPin 溶液 ( 流速 = 30µl/min) ，进行 DARPin 在抗体包被的芯片上的固定化。然后如下测量与不同物种的血清白蛋白的相互作用：在 60 秒中注射 100µl 体积的运行缓冲液 ( 含有 0.01% 吐温 ® 的 PBS) ，其含有浓度为 400 nM 、 200 nM 、 100 nM 、 50 nM 的不同血清白蛋白 ( 结合速率测量 ) ，随后让运行缓冲液流动 10-30 分钟 ( 流速 = 100µl/min) ( 解离速率测量 ) 。从注射血清白蛋白以后得到的 RU 迹线减去未包被的参考池和参考注射 ( 即仅注射运行缓冲液 ) 的信号 ( 即共振单位 (RU) 值 )( 双重参考 ) 。从得自结合速率和解离速率测量的 SRP 迹线，可以确定对应的 DARPin 血清白蛋白相互作用的结合速率和解离速率。
结果总结在表 1 和表 2 中。使用本领域技术人员已知的标准规程，从估测的结合速率和解离速率计算出解离常数 (Kd) ，并发现是在约 3nM 至约 300 nM 范围内。尽管分析的所有 DARPin 都结合人和食蟹猴血清白蛋白，兔、小鼠、大鼠和狗血清白蛋白仅被这些 DARPin 的子集结合。
Figure 806448DEST_PATH_IMAGE007
实施例 5: 对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 的终末血浆半衰期
根据本领域技术人员已知的标准规程 (Toutain, 等人 , 在上述引文中 ) ，确定 DARPin 在小鼠和食蟹猴 ( 成束猴 , 也缩写为“ cyno ” ) 中的终末血浆半衰期。将一定量的 DARPin 静脉内地注射进哺乳动物中，并通过跟踪 DARPin 的血浆浓度，跟踪 DARPin 随时间而变化的从血浆清除。 DARPin 浓度最初下降，直到达到假平衡 ( α - 期 ) ，随后是 DARPin 血浆浓度的指数式进一步下降 ( β - 期 ) 。然后可以从该β - 期计算出 DARPin 终末血浆半衰期。
DARPin 在小鼠中的血浆清除的确定
为了评估对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 的血浆清除，将试验蛋白进行放射性标记，并注射进首次用于实验的 Balb/c 小鼠的尾静脉中。注射下述的 DARPin ： DARPin#19 、 DARPin#21 、 DARPin #23 、 DARPin #25 、 DARPin #18 、、 DARPin #32 、 DARPin #35 、 DARPin #36 、 DARPin #33 、 DARPin #34 、 DARPin #37 、 DARPin #38 、 DARPin #43 、 DARPin#44 、 DARPin#45 、 DARPin#46 、 DARPin#47 和 DARPin#48 。如以前所述 (Waibel, R., 等人 , Nature Biotechnol. 17(9), 897-901, 1999) ，用 99m Tc- 羰基复合物对 DARPin 进行放射性标记。将 DARPin (40µg) 与 99m Tc- 羰基 (0.8-1.6 m Ci) 一起温育 1 h ，然后在 PBS (pH 7.4) 中稀释至 400µl 。给每只小鼠静脉内注射 100µl 由此得到的标记的 DARPin 溶液 ( 相当于 10µg 蛋白和 0.2-0.4 m Ci) 。在初次注射以后 1 h 、 4 h 、 24 h 和 48 h ，采集小鼠的血液样品，并测量样品的放射性。在特定时间点测得的放射性水平，是在该时间点时在血浆中仍然存在的 DARPin 的量的直接量度。 % 注射剂量是，在特定时间点测得的小鼠全血 ( 就 18 g 小鼠而言， 1.6 ml) 的总放射性相对于针对 99m Tc 的放射性衰变校正过的注射样品的总放射性的百分比。
与对 xSA 没有结合特异性的 DARPin #32 相比，对 MSA 具有结合特异性的 DARPin 在小鼠中具有大幅增加的终末血浆半衰期 ( 图 4) 。 DARPin#19 、 DARPin#21 、 DARPin#23 、 DARPin#33 、 DARPin #37 、 DARPin #43 、 DARPin#44 、 DARPin#45 、 DARPin#46 、 DARPin#47 和 DARPin#48 在小鼠中具有约 2 – 2.5 天的终末血浆半衰期。
DARPin 在食蟹猴中的血浆清除的确定
将在 PBS 中稀释的 DARPin 作为快速推注注射进食蟹猴的头静脉中。注射下述 DARPin ： DARPin #26 (0 ， 5 mg/kg) 、 DARPin #24 (0.5 mg/kg) 、 DARPin #17 (0.5 mg/kg) 、 DARPin #34 (1 mg/kg) 和 DARPin #32 (0.5 mg/kg) 。在注射后的不同时间点，从采自动物股静脉的血液制备血浆。然后使用本领域技术人员已知的标准方案和具有已知 DARPin 浓度的适当 DARPin 标准曲线，通过夹心 ELISA 确定血浆样品中的 DARPin 浓度。
在用抗 -DARPin 的特异性兔单克隆抗体包被的 MaxiSorp ELISA 平板上，在 PBS-C ( 含有 0.25% 酪蛋白的 PBS, pH 7.4) 中对食蟹猴的血浆样品进行系列稀释。在用 PBS-T ( 补充了 0.1% 吐温 20® 的 PBS ， pH 7.4) 充分洗涤以后，用被辣根过氧化物酶 HRP 标记的单克隆抗 -RGS(His)4 抗体 (Qiagen) 使平板显影。然后使用 100µl BM-Blue POD 底物 (Roche Diagnostics) ，检测结合。通过加入 50µl 1 M H2SO4 ，停止反应，并测量在 450 nm 的吸光度 ( 和减去在 620 nm 的吸光度 ) 。通过对在猴血清中稀释的 DARPin 的标准曲线进行单指数回归 (GraphPad Prism) ，计算血浆样品中的 DARPin 的浓度。通过对注射最多 240 h 测得的浓度值进行非线性回归 ( 两阶段衰变 ) ，计算 DARPin 的血浆终末半衰期。第二 ( β ) 阶段的半衰期对应于终末血浆半衰期。
与对 xSA 没有结合特异性的 DARPin #32 相比，对 xSA 具有结合特异性的 DARPin 在食蟹猴中具有增加的终末血浆半衰期 ( 图 5 、表 3) 。 DARPin#19 、 DARPin#21 、 DARPin #43 、 DARPin#44 、 DARPin#45 、 DARPin#46 、 DARPin#47 和 DARPin#48 在食蟹猴中具有约 10-15 天的终末血浆半衰期。
Figure 73481DEST_PATH_IMAGE008
实施例6：具有改进的 C- 端加帽模块的 DARPin 的较高热稳定性
如在实施例 3 中所述，用基于荧光的热稳定性测定来分析 DARPin 的热稳定性。可替换地，通过 CD 光谱测定法分析 DARPin 的热稳定性；即通过本领域技术人员熟知的技术跟踪它在 222 nm 的圆二色性 (CD) 信号，从而测量它的热变性。在 Jasco J-715 仪器 (Jasco, 日本 ) 中在 222 nm 记录样品的 CD 信号，同时使用 1 ℃ /min 的温度增量，将浓度为 0.02 mM 的蛋白（在 pH 7.4 的 PBS 中）缓慢地从 20 ℃加热至 95 ℃。这是跟踪 DARPin 的变性的有效方式，因为 DARPin 主要由α螺旋组成，所述α螺旋在解折叠后在 222 nm 处表现出它们的 CD 信号的强烈变化。观察到的 DARPin 的这样测量的 CD 信号迹线的转变中点对应于它的 Tm 值。
使用基于荧光的热稳定性测定，将 DARPin #37 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:37) 的热稳定性与 DARPin #38 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:38) 的热稳定性进行了对比。除了它们的重复结构域的 C- 端加帽模块以外，这 2 种 DARPin 具有相同的氨基酸序列。 DARPin #38 的重复结构域包含如本文所述的改进的 C- 加帽模块，但是 DARPin #37 不包含。测得的 DARPin #37 和 DARPin #38 在 pH 7.4 的 PBS 中的 Tm 值分别为约 63 ℃和约 73 ℃。测得的 DARPin #37 和 DARPin #38 在 pH 5.8 的 MES 缓冲液中的 Tm 值分别为约 54.5 ℃和约 66 ℃。
使用基于荧光的热稳定性测定，将 DARPin #39 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:39) 的热稳定性与 DARPin #40 ( 具有融合在它的 N- 端处的 His- 标签 (SEQ ID NO:15) 的 SEQ ID NO:40) 的热稳定性进行了对比。除了它们的重复结构域的 C- 端加帽模块以外，这 2 种 DARPin 具有相同的氨基酸序列。 DARPin #40 的重复结构域包含如本文所述的改进的 C- 加帽模块，但是 DARPin #39 不包含。测得的 DARPin #39 和 DARPin #40 在 pH 5.8 的 MES 缓冲液中的 Tm 值分别为约 51 ℃和约 55 ℃。
使用CD光谱法，将DARPin #41 (SEQ ID NO:41)的热稳定性与DARPin #42 (SEQ ID NO:42)的热稳定性进行了对比。除了它们的重复结构域的C-端加帽模块以外，这2种DARPin具有相同的氨基酸序列。DARPin #42的重复结构域包含如本文所述的改进的C-加帽模块，但是DARPin #41不包含。测得的DARPin #41和DARPin #42在pH 7.4的PBS中的Tm值分别为约59.5℃和约73℃。
序列表
<110> Molecular Partners AG
Steiner, Daniel
Binz, Hans Kaspar
Gulotti-Georgieva, Maya
Merz, Frieder W.
Phillips, Douglas
Sonderegger, Ivo
<120> 设计的与血清白蛋白结合的重复蛋白
<130> P393A
<150> EP10192711.9
<151> 2010-11-26
<160> 54
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly
1 5 10 15
Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ile Arg Glu Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ile Asp Asn Gly
1 5 10 15
Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<400> 5
Xaa Leu Xaa Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Xaa Ala Xaa Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 6
Xaa Asp Lys Xaa Gly Lys Thr Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Glu Asp Xaa Ala Glu Xaa Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
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<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 7
Xaa Asp Lys Xaa Gly Lys Thr Xaa Ala Asp Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Glu Asp Xaa Ala Glu Xaa Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 8
Xaa Asp Lys Xaa Gly Lys Thr Xaa Ala Asp Xaa Xaa Ala Asp Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Glu Asp Xaa Ala Glu Xaa Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 10
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 10
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 11
Xaa Asp Tyr Phe Xaa His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Xaa Xaa
1 5 10 15
His Leu Xaa Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 12
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 12
Xaa Asp Phe Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Asp Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 13
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 13
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Xaa Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 14
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 14
Xaa Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly
1 5 10 15
His Xaa Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Asn
20 25 30
Ala
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
Met Arg Gly Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 17
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 20
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 21
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 22
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 23
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 24
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Ser Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asp
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Asp Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 25
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 25
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Glu Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Ala Phe Glu Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 26
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Phe Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Gln Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 29
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 29
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 30
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 31
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Val Asp Ile Trp Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Leu Asp His Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met Trp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Leu Asp Asn Asn Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Gly Tyr Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn
130 135 140
Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
145 150 155
<210> 32
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Arg Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly
35 40 45
His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ala Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 33
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 33
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly
145 150 155 160
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn
165 170 175
Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu
180 185 190
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
195 200 205
Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg
210 215 220
Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
225 230 235 240
Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile
245 250 255
Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
260 265 270
<210> 34
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 34
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly
145 150 155 160
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn
165 170 175
Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu
180 185 190
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
195 200 205
Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg
210 215 220
Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
225 230 235 240
Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile
245 250 255
Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
260 265 270
<210> 35
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 35
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly
145 150 155 160
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
165 170 175
Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn
180 185 190
Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
195 200 205
Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn
210 215 220
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp
225 230 235 240
Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala
245 250 255
Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
260 265 270
<210> 36
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 36
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Arg Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly
35 40 45
His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ala Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly
145 150 155 160
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn
165 170 175
Ala Val Asp Ile Trp Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu
180 185 190
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
195 200 205
Asn Ala Leu Asp His Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met
210 215 220
Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp
225 230 235 240
Val Asn Ala Leu Asp Asn Asn Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Gly Tyr
245 250 255
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
260 265 270
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
275 280 285
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
290 295 300
<210> 37
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 37
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 38
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 38
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Asn Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 39
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 39
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Gln Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 40
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 40
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Ala Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Gln Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Asn Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 41
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 41
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys
1 5 10 15
Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile
20 25 30
Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr
35 40 45
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu
50 55 60
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly
65 70 75 80
Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala
85 90 95
Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn
100
<210> 42
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 42
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys
1 5 10 15
Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile
20 25 30
Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr
35 40 45
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu
50 55 60
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly
65 70 75 80
Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Asn Gly His Glu Asp Ile Ala
85 90 95
Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
100
<210> 43
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 43
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 44
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 44
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 45
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 45
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 46
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 46
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 47
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 48
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 48
Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
115 120 125
<210> 49
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 49
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
1 5 10 15
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 50
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 50
Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 51
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 51
Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 52
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 52
Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 53
Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Xaa Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 54
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 54
Xaa Asp Phe Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala

Claims (16)

1.一种包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性，且其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:49、50、51和52，和这样的序列，其中在SEQ ID NO:49、50、51和52中的最多9个氨基酸被任意氨基酸替换。
2.一种包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述重复结构域对哺乳动物血清白蛋白具有结合特异性，且其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自下述的一个锚蛋白重复结构域具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO: 17-31和43-48，其中所述锚蛋白重复结构域的在1位处的G和/或在2位处的S任选地缺失。
3.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在哺乳动物中的终末血浆半衰期比SEQ ID NO:32的锚蛋白重复结构域高至少5倍。
4.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在人类中具有至少1天的终末血浆半衰期。
5.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，所述结合蛋白另外包含生物活性化合物，且其中所述结合蛋白在哺乳动物中的终末血浆半衰期比所述未修饰的生物活性化合物的终末血浆半衰期高至少2倍，其中所述更高的终末半衰期由所述锚蛋白重复结构域赋予所述结合蛋白。
6.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：X1DX2X3X4X5TPLHLAAX6X7GHLX8IVEVLLKX9GADVNA (SEQ ID NO:53)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：A、D、M、F、S、I、T、N、Y和K；
X2代表选自下述的氨基酸残基：E、K、D、F、M、N、I和Y；
X3代表选自下述的氨基酸残基：W、R、N、T、H、K、A和F；
X4代表选自下述的氨基酸残基：G和S；
X5代表选自下述的氨基酸残基：N、T和H；
X6代表选自下述的氨基酸残基：N、V和R；
X7代表选自下述的氨基酸残基：E、Y、N、D、H、S、A、Q、T和G；
X8代表选自下述的氨基酸残基：E和K；
X9代表选自下述的氨基酸残基：S、A、Y、H和N；且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:53中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
7.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：X1DX2X3GX4TPLHLAAX5X6GHLEIVEVLLKX7GADVNA (SEQ ID NO:10)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：A、D、M、F、S、I、T、N、Y和K；
X2代表选自下述的氨基酸残基：E、K、D、F、M、N、I和Y；
X3代表选自下述的氨基酸残基：W、R、N、T、H、K、A和F；
X4代表选自下述的氨基酸残基：N、T和H；
X5代表选自下述的氨基酸残基：N、V和R；
X6代表选自下述的氨基酸残基：E、Y、N、D、H、S、A、Q、T和G；
X7代表选自下述的氨基酸残基：S、A、Y、H和N；更优选地，Y或H，且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:10中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
8.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO:11)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：D、K和A；
X2代表选自下述的氨基酸残基：D、G和S；
X3代表选自下述的氨基酸残基：E、N、D、H、S、A、Q、T和G；
X4代表选自下述的氨基酸残基：G和D；
X5代表选自下述的氨基酸残基：E、K和G；
X6代表选自下述的氨基酸残基：H、Y、A和N；且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:11中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
9.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DFX2G X3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO:54)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：F、S、L和K；
X2代表选自下述的氨基酸残基：V和A；
X3代表选自下述的氨基酸残基：R和K；
X4代表选自下述的氨基酸残基：S和N；
X5代表选自下述的氨基酸残基：N、D、Q、S、A、T和E；
X6代表选自下述的氨基酸残基：A、H、Y、S和N；且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:54中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
10.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DFX2G X3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO:12)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：F、S、L和K；
X2代表选自下述的氨基酸残基：V和A；
X3代表选自下述的氨基酸残基：R和K；
X4代表选自下述的氨基酸残基：S和N；
X5代表选自下述的氨基酸残基：A、H、Y、S和N；且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:12中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
11.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO:13)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：K、A、D、M、F、S、I、T、N和Y；
X2代表选自下述的氨基酸残基：E、K、D、F、M、N和Y；
X3代表选自下述的氨基酸残基：R、N、T、H、K、A和F；
X4代表选自下述的氨基酸残基：I和M；
X5代表选自下述的氨基酸残基：H、Y、K、A和N；且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:13中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
12.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有下述锚蛋白重复序列基序的重复模块：
X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEQ ID NO:14)
其中
X1代表选自下述的氨基酸残基：Q和K；
X2代表选自下述的氨基酸残基：L和P；
X3代表选自下述的氨基酸残基：H、N、Y和A；
X4代表选自下述的氨基酸残基：G和S；
X5代表选自下述的氨基酸残基：A、V、T和S；
X6代表选自下述的氨基酸残基：V和F；且
其中任选地最多5个在SEQ ID NO:14中用X表示的位置以外的氨基酸被任意氨基酸替换。
13.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自SEQ ID NO: 17-31和43-48的锚蛋白重复结构域竞争结合哺乳动物血清白蛋白。
14.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO: 17-31和43-48，其中所述锚蛋白重复结构域的在1位处的G和/或在2位处的S任选地缺失。
15.一种核酸，其编码权利要求1-14中的任一项所述的结合蛋白。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-14中的任一项所述的结合蛋白或权利要求15所述的核酸，和任选的药学上可接受的载体和/或稀释剂。
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