JP2023547340A - 新規ｉｉ型コラーゲン結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新しいＩＩ型コラーゲンαＩ鎖特異的結合タンパク質に関する。本発明はさらに、さらに治療上又は診断上有効な成分に融合又は結合されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質に関する。本発明のさらなる態様は、それらのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の医学における使用を包含する。【選択図】 図２Ａ

Description

本発明は、新しいＩＩ型コラーゲンαＩ鎖特異的結合タンパク質に関する。本発明はさらに、本発明はさらに、さらに治療上又は診断上有効な成分に融合又は結合されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質に関する。本発明のさらなる態様は、医学におけるこれらのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の使用を包含する。
コラーゲンは、３次元の網目構造を形成する構造タンパク質である。ＩＩ型コラーゲンはホモ三量体を形成し、線維構造をもたらす。様々な種類の多くのコラーゲンのなかで、ＩＩ型コラーゲンは関節軟骨及び硝子軟骨の基盤を形成する。関節軟骨のコラーゲンの８５～９０％、眼の硝子体液のコラーゲンの６５％を構成している。ＩＩ型コラーゲンは、特に眼疾患や関節疾患などの重要な臨床標的である。
細菌タンパク質又は他の天然のコラーゲン相互作用タンパク質由来の短いコラーゲン結合ドメインが、膠原病、組織再生、心疾患、又はがんを含む特定の医学的適用に向けて提案された。
しかし、細菌タンパク質又は他の天然のコラーゲン相互作用タンパク質由来のコラーゲン結合ドメインの欠点は、異なる種類のコラーゲンに対して広い交差反応性である。
眼及び関節の構造に関連する疾患は、薬がアクセスしにくいという難点がある。潅流が低いため、非経口又は経口で投与された診断薬及び治療薬は関節の軟骨又は眼の硝子体に十分な量が到達しない。これらの構造への局所適用は可能であるが、局所適用の欠点は、一般的に、特に治療薬が時間の経過とともにあまりにも早く体内から排出されることである、おそらくその物質が有意な薬学的効果を示す前でさえも排出される。
眼の硝子体又は関節への注射による治療的又は診断的介入は、患者にとっても医師にとっても同じように不便である。そのような介入は患者にとってリスクが高く、苦痛を伴う。
言うまでもなく、特に眼疾患及び関節疾患において、患者及び診療所（clinics）を、頻度が高く、且つ負担の大きい不可避の治療から解放することが強く求められている。
したがって、より効果的な治療及び診断、特に眼及び関節へのより効果的な薬物送達に向けた手順を見つける必要がある。本発明の１つの目的は、治療薬剤を病変組織の近くに留めて、その有益な影響を長持ちさせるための分子を提供することである。
眼疾患及び関節疾患、並びに他の疾患を治療するための現在知られている戦略の欠点を克服するために、新規なコラーゲン特異的結合タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対する特異的親和性などの特性を含むべきである。特に、眼疾患及び関節疾患に関しては、とりわけ負担が大きく危険な適用を考慮すると、より効果的な治療のためには、より長い滞留時間が望ましいことになる。したがって、適用された物質をより長く局所的に保持することが、介入の頻度を減らして処置の負担を軽減するために非常に望ましい。
Ｈｕｌｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７，Ｖｏｌ．３６（４），ｐｐ．１２３８－１２４７）には、ＩＩ型コラーゲン結合Ａｖｉｍｅｒ（商標）ドメインが記述されている。Ｒｏｔｈｅｎｆｌｕ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００８，Ｖｏｌ．７（３），ｐｐ．２４８－２５４）には、６つのアミノ酸の配列「ＷＹＲＧＲＬ」を有するＩＩ型コラーゲンリガンドが記述されている。Ｆｏｒｍｉｃａ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１９，Ｖｏｌ．２９５，ｐｐ．１１８－１２９）は、軟骨を標的とするデキサメタゾンプロドラッグの「ＷＹＲＧＲＬ」リガンドに関する。Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０１９，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．２３９－２５７）は、変形性関節症の治療に向けたナノマテリアルの関節内ターゲティングに関する総説論文である。
本発明は、様々な疾患の治療及び診断における改良された新しい戦略のための、新規ＩＩ型コラーゲン結合分子を提供する。ＩＩ型コラーゲンに対する特異性をもつ結合タンパク質は、いくつかの重症疾患において、より少ない医学的介入及びより安全な治療を可能にし、クオリティ・オブ・ライフを向上させることができる。
上記の目的及び利点は、同封の特許請求の範囲の主題によって達成される。本発明は、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の例を提供することによって、上記に提示したニーズに応えるものである。上記の概要は、必ずしも本発明によって解決されるすべての課題を記載しているわけではない。
本開示は、特にこれらに限定されることなく、以下の項目［１］～［１２］を提供する：
［１］配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含めて、配列番号１～４４の群から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン結合タンパク質であって、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質。
［２］２、３、４、５、又は６つのＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質が、互いに連結した項目［１］に記載のＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質。
［３］ホモ多量体又はヘテロ多量体である項目［２］に記載のＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質。
［４］配列番号２７～４２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む項目［３］に記載のＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質。
［５］ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する項目［１］～［４］にいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質。
［６］項目［１］～［５］にいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む二量体又は多量体タンパク質。
［７］モノクローナル抗体及びその断片、結合タンパク質、受容体及び受容体ドメイン、受容体結合リガンド及びアンタゴニスト、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリン結合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、並びに放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される、少なくとも１つの治療上有効な部分にさらに融合又は結合された項目［１］～［５］にいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は項目６に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
［８］放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリン結合タンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される少なくとも１つの診断用部分にさらに融合された又は結合された項目［１］～［５］及び［７］にいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は項目［６］若しくは［７］に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
［９］医学に使用するため、好ましくは、眼疾患又は関節の疾患などの疾患の診断又は治療に使用するための項目［１］－［５］、［７］及び［８］のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質。
［１０］項目［１］－［５］、［７］及び［８］のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は項目［６］～［８］のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を含む組成物。
［１１］前述の態様のいずれかに画定されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は二量体若しくは多量体タンパク質並びに治療上又は診断上許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物。
［１２］ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を得るために好適な条件下で宿主細胞を培養すること及び任意選択で前記ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、前述の態様のいずれかに画定されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は二量体若しくは多量体タンパク質を製造するための方法。
この概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明するものではない。他の実施形態は、後に続く詳細な説明の検討から明らかになる。
図１Ａは、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質のアミノ酸配列である。最上段の数字は、Ｉｇ結合タンパク質中の対応するアミノ酸の位置を意味する。図１Ｂは、モチーフ２５Ｑ－２９Ｙ－３３Ｗを有する配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５の参照配列である。図１Ｃは、モチーフ２５Ｑ－２９Ｙ－３３Ｗを有する二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質「単量体１」はＮ末端に位置する部分を意味し、「単量体２」はＣ末端に位置する部分を意味する。モチーフ２５Ｑ－２９Ｙ－３３Ｗを保有する単量体ドメインはグレースケールで示されている。 図２は、ＥＬＩＳＡによるコラーゲン結合解析から、ＩＩ型コラーゲンに高度に特異的な結合が示された。Ｉ型、ＩＩＩ型又はＶ型コラーゲン及び関連のないフィブロネクチンドメインＥＤＢ（６７Ｂ８９）への結合は観察されなかった。図２Ａは、配列番号２の二量体（ＣＩＤ２１１９９９）（直接連結単量体の二量体）の結合解析である。図２Ｂは、配列番号２の二量体（ＣＩＤ２１２０００）（単量体間にリンカーをもつ二量体）の結合解析である。図２Ｃは、配列番号２の四量体（ＣＩＤ２１２００１）の結合解析である。図２Ｄは、配列番号１５の二量体（ＣＩＤ２１２７０５）の結合解析である。図２Ｅは、配列番号１５の四量体（ＣＩＤ２１２７０４）の結合解析である。 図３は、配列番号２の四量体（ＣＩＤ２１２００１）のＳＰＲによる結合解析から、ＩＩ型コラーゲンに高い親和性で結合することが示された。 図４は、ＳＰＲによる２１１５１９（配列番号１１の二量体）の結合解析である。図４Ａは、２１１５１９（配列番号３７）の濃度系列である。マルチサイクルビアコア測定から、一過性の結合シグナルによりＩＩ型コラーゲンへの結合が確認された。図４Ｂは、ＩＩ型コラーゲンの７８０ｎＭの振幅－ＫＤ（amplitudes-KD）の平衡フィッティング（Equilibrium fit）である。図４Ｃは、２１１５１９（配列番号１１のホモ二量体）はＩＩ型コラーゲンに特異的である。Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンに対する結合は観察されなかった（ＳＰＲによる解析）。 図５は、ブタ眼切片の免疫組織化学染色である。配列番号３９のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質（配列番号２の二量体、単量体間のリンカー、ＣＩＤ２１２０００）は、ブタの眼の網膜、内境界膜（矢印）及び硝子体の染色を示す。
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質は、非免疫グロブリン結合タンパク質によって眼ＩＩ型コラーゲンに特異的に結合している。本発明の発明者らは、配列番号１～２６、４３、４４の群から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン特異的タンパク質を提供することによって、当該技術分野における継続的な必要性を満たす解決策を生み出した。本明細書で定義されるＩＩ型コラーゲン特異的タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対する高い親和性によって機能的に特徴付けられる。特に、本発明は、配列番号１～４４から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を提供する。新規ＩＩ型コラーゲン特異的タンパク質は、治療及び診断の選択肢を広げることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は互いに連結して、例えば配列番号２７～４２に示される多量体を生成する。
以下に本発明をより詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール及び試薬は変化する可能性があるので本発明はそれらに限定されないことを理解すべきである。また、ここで使用される用語は、特定の態様及び実施形態を説明する目的のためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によって反映される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解すべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。それには、タンパク質工学及び精製の分野の当業者が含まれるが、技術的用途並びに治療及び診断に使用するための新しい標的特異的結合分子の開発の分野の当業者も含まれる。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ推奨）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ バーゼル、スイス）に記載の通りに定義される。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の解釈を必要としない限り、「含む（comprise）」という単語、及び「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、記述された整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップのグループを含むことを意味するが、他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップのグループを除外することは意味しないと理解されたい。「comprise(s)」又は「comprising」という用語は、「からなる（consists of）」又は「からなる（consisting of）」の限定を包含できるが、そのような限定が何らかの理由で、ある程度必要である場合に限る。
いくつかの文書（例えば、特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列登録など）が本明細書を通じて引用される場合がある。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利を有していないことを認めるものとして解釈すべきではない。本書に引用された文献の中には、「参照により組み込まれる」ことを特徴としうるものがある。そのような組み込まれた文献の定義及び教示と、本明細書に記載された定義及び教示が矛盾する場合は、本明細書の本文が優先される。
本明細書で言及される配列はすべて、その全体の内容及び開示とともに、本明細書の開示内容の一部を形成する添付の配列表に開示されている。
本出願で使用される重要な用語の一般的な定義
本明細書で使用される「ＩＩ型コラーゲンαＩ鎖」又は「ＩＩ型コラーゲン」という用語は、ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２４５８．２、アミノ酸１８２～１２４１（配列番号５１）を意味する。「ＩＩ型コラーゲン」という用語は、配列番号５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％若しくは９７％以上、又は１００％の配列同一性を示し、ＩＩ型コラーゲンの機能性（functionality）を有するすべてのポリペプチドを含む。特に、この用語は、配列番号５１と少なくとも少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％若しくは９７％以上、又は１００％のアミノ酸配列同一性をもつ他の哺乳類種由来のＩＩ型コラーゲンを含む。ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２４５８．２の下で特定されるＩＩ型コラーゲンへの参照に従って、好ましい実施形態では好ましい実施形態では、本明細書で使用される「ＩＩ型コラーゲン」という用語はヒトＩＩ型コラーゲンを意味する。
「ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質」又は「ＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質」又は「Ｃｏｌ２ ＢＰ」という用語は、高い親和性でＩＩ型コラーゲンに結合するタンパク質を意味する。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合で連結された２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を意味し、生成物の特定の長さを意味しない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「タンパク質」の定義内に含まれ、「タンパク質」という用語はこれらの用語のいずれかの代わりに、又は交換可能に使用することができる。また、「タンパク質」という用語は、当技術分野で周知のポリペプチドの翻訳後修飾の生成物を意味することを意図する。
「改変」又は「アミノ酸改変」という用語は、親ポリペプチド配列の特定の位置における、他のアミノ酸による参照アミノ酸の置換、欠失、又は挿入を意味する。既知の遺伝暗号並びに組換えＤＮＡ技術及び合成ＤＮＡ技術があれば、熟練した科学者（the skilled scientist）はアミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
「結合親和性」及び「結合活性」という用語は、本明細書において交換可能に使用することができ、これらは、ポリペプチドが別のタンパク質、ペプチド、又はそれらの断片若しくはドメインに結合する能力を意味する。典型的には、結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）で測定及び報告され、二分子間相互作用の強さを評価及び順序付けするために使用される。
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第２のタンパク質に遺伝子工学的に（genetically）連結された少なくとも第１のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子をつなげることによって作り出される。融合タンパク質は、限定されないが、例えば、多量体化部位、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、半減期延長部位など、標的との結合に関与しない追加のドメインをさらに含みうる。
「アミノ酸配列同一性」という用語は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（又は違い）を定量的に比較したものを意味する。参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大のパーセントの配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセント割合と定義される。配列同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列は、参照タンパク質又はポリペプチドの配列、例えば、配列番号１～４４のいずれかのポリペプチドにアライメントされる。配列アライメントの方法及び配列比較アルゴリズムは、当該技術分野で周知である。例えば、任意のポリペプチドの、例えば配列番号１～４４のいずれかのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性の程度を決定するために、当該技術分野で公知のＳＩＭ Ｌｏｃａｌ類似度プログラム（similarity program）が好ましく採用される。マルチプルアライメント解析には、当業者に公知のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用することが好ましい。
この発明の実施の形態の詳細な説明
本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４の群から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。特に、本明細書で提供されるのは、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン結合タンパク質であり、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；且つそのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。様々な好ましい実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８５％又は８９．５％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。様々な他の好ましい実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。そのようなＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対して特異的な結合親和性を示し、すなわち、図２に示されるように、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン又はフィブロネクチンのドメイン（６７Ｂ８９）への非特異的な結合は検出されなかった。様々な実施形態では、本開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載の結合親和性を測定するための方法で測定して、Ｉ型コラーゲン、及び／又はＩＩＩ型コラーゲン、及び／又はＶ型コラーゲン及び／又はフィブロネクチンのドメイン（６７Ｂ８９）に対して検出可能な結合親和性を有しない。好ましい実施形態では、Ｉ型コラーゲン、及び／又はＩＩＩ型コラーゲン、及び／又はＶ型コラーゲン及び／又はフィブロネクチンのドメイン（６７Ｂ８９）に対する結合親和性を測定するための方法は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＢＬＩ、ＫｉｎＥｘＡアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光分光法、ＩＴＣ、超遠心分析、ＲＩＡ又はＩＲＭＡ、及びＥＣＬのいずれか、より好ましくはＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＢＬＩ、ＫｉｎＥｘＡアッセイ、及びフローサイトメトリーのいずれか、さらに（even）より好ましくはＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、及びＫｉｎＥｘＡアッセイのいずれか、さらに（still）より好ましくはＥＬＩＳＡ又はＳＰＲ、最も好ましくはＥＬＩＳＡである。様々な実施形態では、本開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンに対して検出可能な結合親和性を有しない。様々な他の実施形態では、本開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲン、及び／又はＶ型コラーゲンに対して検出可能な結合親和性を有しない。様々な好ましい実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；ＩＩ型コラーゲンに対して１μＭ未満、より好ましくは５００ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。他の実施形態では、上記のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ＩＩ型コラーゲンに対して２００ｎＭ未満、又は１００ｎＭ未満、さらには５０ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＸ１０ＡＡＤＸ１４ＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＸ２８ＹＦＲＸ３２ＷＬＸ３５ＤＤＰＳＶＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６Ｘ４７ＡＱＸ５０ＬＮＤＸ５４ＱＡＰＫ（配列番号５２）（式中、互いに個別に（individually of each other）、Ｘ１０はＳ及びＱから選択され、Ｘ１４はＳ及びＫから選択され、Ｘ２８はＨ及びＮから選択され、Ｘ３２はＲ及びＱから選択され、Ｘ３５はＳ及びＲから選択され、Ｘ４２はＴ及びＰから選択され、Ｘ４３はＨ及びＴから選択され、Ｘ４４はＩ及びＶから選択され、Ｘ４６はＴ及びＧから選択され、Ｘ４７はＱ及びＴから選択され、Ｘ５０はＨ及びＱから選択され、且つＸ５４はＳ及びＤから選択される）
と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、互いに個別に、２５番目がＱであり、２９番目がＹであり、３３番目がＷである配列番号５２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＸ１０ＡＡＤＸ１４ＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＸ２８ＹＦＲＸ３２ＷＬＸ３５ＤＤＰＳＶＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６Ｘ４７ＡＱＸ５０ＬＮＤＸ５４ＱＡＰＫ（配列番号５２）（式中、Ｘ１０はＳ及びＱから選択され、Ｘ１４はＳ及びＫから選択され、Ｘ２８はＨ及びＮから選択され、Ｘ３２はＲ及びＱから選択され、Ｘ３５はＳ及びＲから選択され、Ｘ４２はＴ及びＰから選択され、Ｘ４３はＨ及びＴから選択され、Ｘ４４はＩ及びＶから選択され、Ｘ４６はＴ及びＧから選択され、Ｘ４７はＱ及びＴから選択され、Ｘ５０はＨ及びＱから選択され、且つＸ５４はＳ及びＤから選択される）
と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、２５番目がＱであり、２９番目がＹであり、３３番目がＷである配列番号５２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＳＡＡＤＳＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＨＹＦＲＲＷＬＳＤＤＰＳＶＳＴＨＩＬＴＱＡＱＨＬＮＤＤＱＡＰＫ（配列番号２、ＣＩＤ２１１２６１）
と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
本明細書に開示の本発明のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の本発明のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、２５番目がＱであり、２９番目がＹであり、且つ３３番目がＷである配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１５、ＣＩＤ２１１５１９ｄｅｌＦｃと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書に開示の本発明のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、
配列番号１５のＩＡＡＫＦＤＥＡＱＱＡＡＤＫＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＮＹＦＲＱＷＬＲＤＤＰＳＶＳＰＴＶＬＧＴＡＱＱＬＮＤＳＱＡＰＫ
のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の本発明のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、２５番目がＱであり、２９番目がＹであり、且つ３３番目がＷであることを条件として、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
機能的な特徴。１つの実施形態は、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）をもつＩＩ型コラーゲン結合タンパク質に言及する。ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、又は５０ｎＭ未満の測定可能な結合親和性でＩＩ型コラーゲンに結合する。適切な方法は、当業者に公知である、又は文献に記述されている。結合親和性を測定するための方法はそれ自体知られており、例えば、当該技術分野で公知の以下の方法から選択することができる：酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、動力学排除分析（ＫｉｎＥｘＡアッセイ）、フローサイトメトリー、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、超遠心分析、放射免疫測定法（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、及び増強化学発光（ＥＣＬ）。該方法の一部は後述の実施例で説明される。典型的には、解離定数ＫＤは、２０℃、２５℃、又は３０℃で測定される。別段の具体的に指示のない限り、本明細書に記載のＫＤ値はＳＰＲで２５℃にて測定される。ＫＤ値が低いほど、生体分子の結合相手に対する結合親和性が大きい。ＫＤ値が高いほど、結合相手は互いに弱く結合する。
ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の構造的特徴
様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４のいずれか１つアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％の配列同一性を有する。
本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１（ＣＩＤ２１１１９０）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２（ＣＩＤ２１１２６１）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２０（ＣＩＤ２１０９７０）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１５（ＣＩＤ２１１５１９ｄｅｌＦｃ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列：
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＱＬＡＦＹＱＩＬＨＬＥＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＸ４２ＥＶＬＧＥＡＸ４９ＫＬＮＸ５３ＳＱＡＰＫ（式中、Ｘはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｘ４２はＬ及びＡ及びＴから選択され、Ｘ４９はＩ、Ｒ、及びＥから選択され、Ｘ５３はＬ、Ｋ、及びＹから選択される）
と少なくとも８０％の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号６、７、８、又は配列番号３２、３３、３６の二量体に示されている。
いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列：
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＱＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＮＹＦＩＱＷＬＲＤＤＰＳＶＳＸ４２Ｘ４３ＶＬＧＸ４７ＡＱＸ５０ＬＮＤＳＱＡＰＫ（式中、Ｘはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｘ４２はＬ及びＰから選択され、Ｘ４３はＥ及びＴから選択され、Ｘ４７はＨ及びＴから選択され、Ｘ５０はＱ、Ｌ、及びＲから選択される）
と少なくとも８０％の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号１０～１２、２５、又は配列番号２７、３２～３７の二量体に示されている。
いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列：
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＱＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＮＹＦＩＱＷＬＲＤＤＰＳＶＳＸ４２Ｘ４３ＶＬＧＸ４７ＡＱＸ５０ＬＮＤＳＱＡＰＫ（式中、Ｘはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｘ４２はＬ及びＰから選択され、Ｘ４３はＥ及びＴから選択され、Ｘ４７はＨ及びＴから選択され、Ｘ５０はＱ、Ｌ、及びＲから選択される）
と少なくとも８０％の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号１４、１５、２３、配列番号２８、２９、３０、３１、３０の二量体、及び配列番号４２の四量体に示されている。
いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列：
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＷＡＡＸ１３ＬＥＩＶＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＬＸ２９ＦＸ３１ＹＳＬＲＤＤＰＳＶＳＬＥＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ（式中、Ｘはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｘ１３はＤ及びＦから選択され、Ｘ２９はＫ及びＡから選択され、Ｘ３１はＲ及びＩから選択される）
と少なくとも８０％の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が、配列番号１７～２１、又は配列番号２８、２９、３０、３１、３５の二量体に示されている。
いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号４３のアミノ酸配列：
ＮＡＡＸＸＤＸＡＱＸＳＡＸＸＥＩＸＸＬＰＮＬＴＴＲＱＫＱＫＦＩＹＳＬＱＲＤＰＳＶＳＫＥＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ
と少なくとも８０％の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が配列番号１及び２６に示されている。
いくつかの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号４４のアミノ酸配列：
ＩＡＡＫＦＤＥＡＱＳＡＡＤＳＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＱＱＲＨＹＦＲＲＷＬＳＤＤＰＳＶＳＸＸＸＬＸＸＡＱＸＬＮＤＸＱＡＰＫ
と少なくとも８０％の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が、配列番号２、２４、配列番号３８、３９の二量体、及び配列番号４１の四量体に示されている。
本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４のいずれかのＮ末端において、１つ又は複数、好ましくは２つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２２～２６で例示される配列番号１～２６、４３、及び４４の単量体配列のいずれかのＮ末端において、１つ又は複数、好ましくは２つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本明細書に開示の二量体及び多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の好ましい実施形態では、二量体又は多量体のＮ末端に位置する単量体のみ、その単量体のＮ末端において１つ又は複数、好ましくは２つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも４７個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な他の実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも４８又は４９個のアミノ酸残基を含む。本発明のさらに他の実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも５０又は５１個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも５２個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な他の好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも５３個のアミノ酸残基を含む。より好ましくは、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも５４又は５５個のアミノ酸残基を含む。本発明の特に好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも５６個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかの少なくとも５７個又はさらには５８個のアミノ酸残基を含む。
本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２２～２６で例示される配列番号１～２６、４３、及び４４の単量体配列のいずれかのＮ末端において、１つ又は複数、好ましくは２つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本明細書に開示の二量体及び多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の好ましい実施形態では、二量体又は多量体のＮ末端に位置する単量体のみが、１つ又は複数、好ましくは２つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。
図１Ｃは、２つの単量体ドメインの少なくとも１つがモチーフ２５Ｑ－２９Ｙ－３３Ｗを特徴とする、本発明の二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を例示している。したがって、様々な実施形態では、本発明の二量体又は多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である少なくとも１つの単量体を含み、その単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有する。様々な好ましい実施形態では、本発明の二量体又は多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。本発明の二量体又は多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、二量体又は多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質のＮ末端に位置してもよく、又はＣ末端に位置してもよい。
本発明の多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、１つ又は複数の、配列番号１～２６、４３及び４４のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含むことができ、１つ又は複数の、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつ単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含むことができ、その単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；その単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。
本発明の多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置してもよく、そこに位置しなくてもよい。
様々な実施形態では、本発明によって提供されるＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質は、配列番号２７～４０の二量体のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その２つの単量体の少なくとも１つは、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である。その少なくとも１つの単量体は、配列番号２７～４０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつ二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置しうる。様々な好ましい実施形態では、二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２７～４０のいずれか１つと少なくとも８５％又は８９．５％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その２つの単量体の少なくとも１つは、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である。さらに他の好ましい実施形態では、二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２７～４０のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、その２つの単量体の少なくとも１つは、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である。
様々な実施形態では、本発明によって提供されるＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質は、配列番号４１又は４２の四量体と少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その４つの単量体の１つ、２つ、３つ、又はすべては、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である。最大４つの単量体のうちの１つは、配列番号４１又は４２と少なくとも８０％の配列同一性をもつ四量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置しうる。様々な好ましい実施形態では、四量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号４１又は４２と少なくとも８５％又は８９．５％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その４つの単量体の１つ、２つ、３つ、又はすべては、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である。さらに他の好ましい実施形態では、四量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号４１又は４２と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、その４つの単量体の１つ、２つ、３つ、又はすべては、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である。
本明細書でさらに開示されるように、様々な実施形態では、本発明の二量体又は多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、二量体又は多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を連結する１つ又は複数のリンカー配列を含むことができる。様々な実施形態では、リンカー配列はアミノ酸配列ＧＧＧＳ（配列番号４５）を含む。様々な他の実施形態では、リンカー配列はアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号４６）を含む。さらに他の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）を含む、又はアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４８）を含む。
本発明はさらに、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない（免疫グロブリンのＦｃドメインに対する結合親和性を欠く）ＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質を提供し、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～４４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、本発明は、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質を提供し、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；（ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない本発明のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１～２１のいずれかの以下のアミノ酸残基の１つ又は複数、好ましくは２又は３つを含む：配列番号１～２１のいずれかの１３番目に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）（１３Ｄ）；配列番号１～２１のいずれかの１４番目に対応する位置のリジン（Ｋ）（１４Ｋ）；及び／又は配列番号１～２１のいずれかの３１番目に対応する位置のアルギニン（Ｒ）（３１Ｒ）。好ましい実施形態では、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない本発明のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの以下のアミノ酸残基の１つ又は複数、好ましくは２又は３つを含む：配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかんの１３番目に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）（１３Ｄ）；配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれか１４番目に対応する位置のリジン（Ｋ）（１４Ｋ）；及び／又は配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３１番目に対応する位置のアルギニン（Ｒ）（３１Ｒ）。特に好ましいのは、配列番号１５の以下のアミノ酸残基の１つ又は複数、好ましくは２又は３つを含む免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないＩＩ型コラーゲン結合タンパク質である：配列番号１５のいずれかの１３番目に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）（１３Ｄ）；配列番号１５の１４番目に対応する位置のリジン（Ｋ）（１４Ｋ）；及び／又は配列番号１５の３１番目に対応する位置のアルギニン（Ｒ）（３１Ｒ）。したがって、本発明は、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質を提供し、そのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、配列番号１５の以下のアミノ酸残基の１つ又は複数、好ましくは２又は３つを含む：配列番号１５のいずれかの１３番目に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）（１３Ｄ）；配列番号１５の１４番目に対応する位置のリジン（Ｋ）（１４Ｋ）；及び／又は配列番号１５の３１番目に対応する位置のアルギニン（Ｒ）（３１Ｒ）。様々な好ましい実施形態では、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５の２５番目に対応する位置のグルタミン（Ｑ）；（ｉｉ）配列番号１５の２９番目に対応する位置のチロシン（Ｙ）；及び（ｉｉｉ）配列番号１５の３３番目に対応する位置のトリプトファン（Ｗ）をさらに含み；本明細書の他の箇所に記載のように、ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。
本発明の様々な実施形態では、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない（又は免疫グロブリンのＦｃドメインに対する結合親和性を欠く）ＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載の結合親和性を測定するための方法で測定して、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する検出可能な結合親和性を有しない（又は免疫グロブリンのＦｃドメインに対する結合親和性を欠く）。好ましい実施形態では、免疫グロブリンのＦｃドメインに対する結合親和性を測定するための方法は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＢＬＩ、ＫｉｎＥｘＡアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光分光法、ＩＴＣ、超遠心分析、ＲＩＡ又はＩＲＭＡ、及びＥＣＬのいずれか、より好ましくはＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＢＬＩ、ＫｉｎＥｘＡアッセイ、及びフローサイトメトリーのいずれか、さらに（ｅｖｅｎ）より好ましくはＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、及びＫｉｎＥｘＡアッセイのいずれか、さらに（ｓｔｉｌｌ）より好ましくはＥＬＩＳＡ又はＳＰＲ、最も好ましくはＳＰＲである。
「Ｆｃ領域」及び「Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書において交換可能に使用することができる。Ｆｃ領域は、例えばＦｃ受容体と呼ばれる細胞表面の受容体と相互作用する免疫グロブリン、特に抗体の尾部領域である。したがって、Ｆｃ領域又はＦｃドメインは、免疫グロブリン、特に抗体のＦｃ領域又はＦｃドメインを意味する。様々な実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウシＩｇＧ、モルモットＩｇＧ、及びウサギＩｇＧを含む哺乳類ＩｇＧ（抗体）に由来する。Ｆｃ領域はまた、ヒトＩｇＭ又はヒトＩｇＡ由来であることができる。様々な実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１（抗体）、ヒトＩｇＧ２（抗体）、又はヒトＩｇＧ４（抗体）由来など、ヒトＩｇＧ（抗体）に由来し、さらにより好ましくはヒトＩｇＧ１（抗体）に由来する。
Ａｖｉｍｅｒ（商標）ドメインは、特にジスルフィド結合によって安定化された剛直な構造を有する３０～３５個のアミノ酸の人工タンパク質である。本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質においてジスルフィド結合を生じさせるアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。したがって、本発明の様々な実施形態において、本明細書に開示されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質においてジスルフィド結合を生じさせることになるシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。より具体的には、本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質において１つ又は複数のジスルフィド結合を生じさせることになる２つ以上のシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。様々な実施形態では、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、システイン（Ｃｙｓ）残基（単数又は複数）を含まないアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。
多量体。好ましい実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、複数の本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む多量体である。多量体は、２つ、３つ、４つ、又はより多くのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含みうる。１つの実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、互いに連結した２つ、３つ、４つ、又はより多くのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む、すなわち、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、二量体、三量体、又は四量体などであることができる。いくつかの実施形態では、多量体は、上記で画定されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の二量体である。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質はホモ－二量体である。ホモ－二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、同一のアミノ酸配列をもつ２つのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質が互いに連結したタンパク質である。いくつかの実施形態では、ホモ多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１１の少なくとも２つのモジュール（module）を含むことができ、配列番号３７（２１１５１９）のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ホモ多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号１５の少なくとも２つのモジュールを含むことができ、配列番号４０（２１２７０５）のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。例えば、ホモ－二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ヘッドトゥーテールの方向（head-to-tail orientation）で互いに連結した２つの配列番号１５の単量体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ホモ多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号２の少なくとも２つのモジュールを含むことができ、配列番号３８（２１１９９９）のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。例えば、ホモ－二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ヘッドトゥーテールの方向で互いに連結した２つの配列番号２の単量体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ホモ多量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、少なくとも２つの配列番号１のモジュールを含むことができる。例えば、ホモ－二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ヘッドトゥーテールの方向で互いに連結した２つの配列番号１（２１１１９０）の単量体を含むことができる。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質はホモ－四量体である。四量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、同一のアミノ酸配列をもつ４つのＩＩ型コラーゲン結合タンパク質が互いに連結したタンパク質である（例えば、限定されないが、配列番号４１及び配列番号４２を参照）。
他の実施形態では、多量体はヘテロ－二量体であり、例えば、ＩＩ型コラーゲンに特異的なタンパク質の２つのアミノ酸配列は、異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ－二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は配列番号１０を含むことができ、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する（例えば、配列番号３６（２１０９８７）、配列番号３２（２１０９９２）、又は配列番号３３（２１１０２７）のヘテロ二量体のＮ末端単量体）。
いくつかの実施形態では、ヘテロ－二量体結合タンパク質は配列番号１４を含むことができ、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する（例えば、配列番号２８（２１０９７０）、配列番号２９（２１０９７１）のヘテロ二量体のＮ末端単量体、又は配列番号３０（２１０９７２）若しくは配列番号３１（２１０９７３）のヘテロ二量体のＣ末端単量体）。
例えば、配列番号２７（２０９１３０）のヘテロ－二量体結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール（Ｎ末端からＣ末端）の方向で互いに連結した配列番号４及び配列番号１１を含む。例えば、配列番号３５（２０８５８５）のヘテロ－二量体結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール（Ｎ末端からＣ末端）の方向で互いに連結した配列番号１７及び配列番号１２を含む。例えば、配列番号３６（２１０９８７）のヘテロ－二量体結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール（Ｎ末端からＣ末端）の方向で互いに連結した配列番号１０及び配列番号６を含む。二量体ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の例を図１Ｃに示す。
いくつかの実施形態では、２つ以上のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は直接連結している。いくつかの実施形態では、２つ以上のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して連結している。様々な実施形態では、２つ以上のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、最大３０個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して連結している。他の実施形態では、２つ以上のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して連結している。リンカーの例を配列番号４５～４８に示す。
結合タンパク質の多量体は、一般に当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によって人工的に生成される。
ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、さらなる部分に融合される。様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、治療上有効な部分に融合又は結合される。他の実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、１つより多くの治療上有効な部分に融合又は結合される。いくつかの実施形態では、そのような治療上有効な部分は、モノクローナル抗体及びその断片、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリンスキャフォールドタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから選択することができる。
様々な実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、診断用部分に融合又は結合される。他の実施形態では、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、１つより多くの診断用部分に融合又は結合される。いくつかの実施形態では、そのような診断用部分は、放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリンスキャフォールドタンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから選択することができる。
様々な実施形態は、治療上有効なタンパク質又は診療上有効なタンパク質に融合されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質に関する。
医学における使用。様々な実施形態は、医学に使用するための本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質に関する。特定の実施形態は、眼疾患及び関節疾患の診断又は治療に使用するための前記ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、眼疾患は血管新生眼疾患でありうる。血管新生眼疾患は、限定されないが、血管新生を伴う加齢黄斑変性、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、脈絡膜血管新生、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、糖尿病黄斑浮腫の群から選択されうる。いくつかの実施形態では、眼疾患は炎症性眼疾患でありうる。炎症性眼疾患は、限定されないが、非感染性後部ぶどう膜炎、非感染性中間ぶどう膜炎、非感染性前部ぶどう膜炎、特発性ぶどう膜炎、非感染性汎ぶどう膜炎、ベーチェット、サルコイド、ループス、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症などの原発性炎症性全身性疾患に合併するぶどう膜炎、強膜炎、及び眼窩炎症性疾患の群から選択されうる。関節関連疾患の例には、関節リウマチ、関節症、及び他の関節関連疾患がある。
組成物。様々な実施形態は、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む組成物に関する。
様々な実施形態は、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、並びに薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物に関する。医薬組成物は、任意選択で、それ自体既知のさらなる補助剤及び賦形剤を含むことができる。それらには、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などが含まれるが、これらに限定されない。組成物は、液体製剤の形態、凍結乾燥物、クリーム、局所塗布用ローション、エアロゾル、粉末の形態、顆粒、乳剤の形態、又はリポソーム製剤の形態であることができる。
本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む医薬組成物は、上記のように、眼疾患及び関節疾患の治療のために使用することができる。
様々な実施形態は、本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質並びに診断的上許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む疾患の診断のための診断用組成物に関する。それらには、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などが含まれるが、これらに限定されない。組成物は、液体製剤の形態、凍結乾燥物、顆粒、エマルションの形態又はリポソーム製剤であることができる。
本明細書に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む診断用組成物は、上記のように、眼疾患及び関節疾患の診断のために使用することができる。
組成物は、本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の治療上又は診断上有効な量を含有する。投与されるタンパク質の量は、治療される生物、疾患の種類、患者の年齢及び体重、さらにそれ自体が周知の要因に依存する。ガレノス製剤に応じて、これらの組成物は、注射又は点滴による非経口投与、全身投与、硝子体内投与、関節内投与、又は他の従来から採用されている適用方法によって投与することができる。医薬製剤の種類は、治療すべき疾患の種類、投与経路、疾患の重症度、治療を受ける患者、及び医学の当業者に公知の他の要因に依存する。
様々な実施形態は、対象の眼に、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の治療有効量を投与することを含む、眼疾患をもつ対象を治療又は診断する方法に関する。好ましいのは、血管新生を伴う加齢黄斑変性（ＡＭＤ）や、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管新生疾患から選択される眼疾患をもつ対象を治療するための方法である。
ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の調製。本明細書に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、平易な有機合成戦略、固相補助合成技術、フラグメントライゲーション技術、又は市販の自動合成装置などの多くの従来から周知の技術のいずれかによって調製することができる。一方、それらタンパク質は、従来の組換え技術単独で、又は従来の合成技術と組み合わせて調製することもできる。さらに、無細胞インビトロ転写／翻訳によって調製してもよく、通常の合成技術と組み合わせて調製してもよい。
様々な実施形態は、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
様々な実施形態は、前記ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の発現を可能にする好適な条件下で宿主細胞を培養すること、及び任意選択で前記ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、本明細書に開示のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の作製方法に関する。
例えば、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを好適な宿主で発現させることができ、生成したＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を単離することができる。前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、本明細書に包含される。さらなる実施形態は、前記核酸分子を含むベクターに関する。ベクターとは、宿主細胞にタンパク質コード情報を移すために使用できる任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。さらに、前記核酸分子又は前記ベクターを含む単離細胞が開示される。好適な宿主細胞には、原核生物又は真核生物が含まれる。また、様々な哺乳類細胞又は昆虫細胞の培養系を組換えタンパク質の発現に採用することもできる。
一実施形態はまた、前記ベクターを保有する宿主細胞又は非ヒト宿主に関する。宿主細胞は、核酸配列で形質転換され、それによって目的の遺伝子を発現する細胞である。
原核生物又は真核生物の宿主細胞を培養する好適な条件は、当業者に周知である。タンパク質の生産を目的とした細胞の培養及びタンパク質の発現は、当業者に周知の技術を適用して、小容量の振盪フラスコから大型の発酵槽まで、任意のスケールで行うことができる。
１つの実施形態は、上記で詳述した結合タンパク質の調製方法を対象とし、前記方法は以下のステップを含む：（ａ）本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質をコードする核酸を調製すること；（ｂ）前記核酸を発現ベクターに導入すること；（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入すること；（ｄ）宿主細胞を培養すること；（ｅ）宿主細胞をＩＩ型コラーゲン結合タンパク質が発現する培養条件に供し、それによって、本明細書で画定されるＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を産生させること；（ｆ）任意選択で、ステップ（ｅ）で作られたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を単離すること；及び（ｇ）任意選択で、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を、本明細書で画定されるさらなる機能部分と結合させること。
一般に、培養混合物からの精製ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の単離は、遠心分離や、沈殿、凝集、クロマトグラフィーの異なる実施形態、濾過、透析、濃縮、それらの組み合わせなど、当該技術分野で周知の従来の方法及び技術を適用して行うことができる。クロマトグラフィーの方法は当該技術分野で周知であり、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。
精製を簡便にするために、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質は、分離材料に対する増加した親和性を有する他のペプチド配列と融合させることができる。好ましくは、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質の機能性に対して有害な影響を与えない、又は特異的なプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離できるそのような融合体が選択される。このような方法も当業者に公知である。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために示される。本発明は、上記のようにＩＩ型コラーゲン結合タンパク質によって特に例示される。しかし、本発明はそれに限定されず、以下の実施例は、上記の説明に基づいて本発明の実施可能性を示すに過ぎない。本発明の完全な開示のために、本出願で引用される文献も参照され、その文献は参照により本出願に完全に組み込まれる。
実施例１ ＩＩ型コラーゲンαＩ鎖結合タンパク質の選択及びスクリーニング
ライブラリー。ランダムな位置でシステインや他のアミノ酸残基を同時に排除して、バランスの良い（well-balanced）アミノ酸分布を達成するように、合成トリヌクレオチドホスホラミダイト（ELLA Biotech）で生成したランダム化オリゴヌクレオチドを使って独自のｃＤＮＡライブラリーを自社内（in house）で合成した。対応するｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲで増幅し、ｐＣＤ３３－ＯｍｐＡファージミドにライゲーションした。大腸菌ＳＳ３２０（Lucigen）のエレクトロポレーションに、ライゲーション混合物のアリコートを使用して、ファージライブラリーを作製及び精製し、その凍結ストックを保存した。別段の指示のない限り、確立された組換え遺伝学工学的方法を使用した。
ファージディスプレイによる選択。ファージディスプレイを選択系として用いて、それぞれのオンターゲット（ON-target）（免疫グレードヒトＩＩ型コラーゲン、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社より購入）に対してネイティブライブラリーを濃縮した。各ラウンドにおいて、オフターゲット（OFF-target）としてＳｉｇｍａｂｌｏｃｋｅｒでブロックした空のビーズを用いた事前選択（pre-selection）ステップを行った。ＡＩＴ法を適用した。これは各ラウンドで標的タンパク質を磁性Ｅｐｏｘｙ Ｍ－２７０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓに固定化したことを意味する。大腸菌ＥＲ２７３８（Lucigene）を、クライオファージライブラリーの感染及び各ラウンド後のファージプールの再増幅に使用した。ファージの増幅及び精製は、当業者に公知の標準的な方法を使用して実施した。自動化されたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ－Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャー）を用いて４回の選択ラウンドを行い、所望のファージ－ターゲット複合体を単離及び捕捉した。標的をカップリングさせたビーズの量を少なくすることによって、ラウンドごとに標的量を減らした。結合したファージをトリプシンで溶出し、再増幅した。選択の成功を、免疫グレードヒトＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社、５μｇ／ｍｌ）、ブタコラーゲンＩＩ型（ブタの目から自社内で調製、５μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（５μｇ／ｍｌ）又はＳｉｇｍａｂｌｏｃｋｅｒをコートした中結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）でのファージプールＥＬＩＳＡで分析した。結合したファージは、α－Ｍ１３ ＨＲＰ結合抗体（ＧＥヘルスケア）を使用して検出した。
標的結合ファージプールの発現ベクターへのクローニング ファージプールＥＬＩＳＡにおいてヒト及び／又はブタコラーゲンタイプＩＩ型に特異的な結合を示す選択プールを、当該技術分野で公知の方法に従ってＰＣＲで増幅し、適切な制限ヌクレアーゼで切断し、Ｃ末端ｓｔｒｅｐ－タグを含む発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（メルク、ドイツ）の誘導体にライゲーションした。
結果：様々なファージディスプレイ選択プールは、それぞれのオンターゲットに対して特異的なシグナルをもたらした。ＢＳＡ及びＳｉｇｍａｂｌｏｃｋｅｒを用いた対照は、ほとんどのプールに対して結合を示さなかった。選択したプールを配列決定し、サブクローニングし、ハイスループットスクリーニングに進めた。
一次スクリーニング：直接固定化した免疫グレードヒトＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）［ｃ＝１μｇ／ｍｌ］に対する単一バリアントの一次スクリーニングを行った。Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＨＲＰコンジュゲートを使用して、結合バリアントを検出した。ヒットは次のように選択した：試料のシグナルが陰性対照のシグナルより大きいこと。
二次スクリーニング。免疫グレード（Immunization Grade）ヒトＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社；オンターゲット）［ｃ＝１μｇ／ｍｌ］及びＢＳＡ（オフターゲット）［ｃ＝１μｇ／ｍｌ］に対する二次スクリーニングを行った。ヒットは次のように同定した：オンターゲットに対するバリアントのシグナルがオフターゲットに対するシグナルより１０倍大きい。
ＰｈｙＮｅｘｕｓ／ＳＰＲ。ヒットをμスケールで作製及び精製し（PhyNexus）、ＳＰＲ測定で解析した。免疫グレードヒトＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）をアミンカップリングによってＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア）に固定化した。結合すると、分析対象物（ヒットの可能性があるもの）が表面に蓄積し、屈折率を増加させる。屈折率の変化をリアルタイムに測定し、時間に対する応答単位としてプロットした。ヒットしたバリアントを、配列解析及びラボスケール生産作製に向けて選択した。
実施例２ ２型コラーゲン結合タンパク質の発現
アフィニティータグをもつバリアントを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）でＴ７プロモーターの制御のもと、低コピープラスミド系を使用して発現させた。タンパク質を、培地（自己誘導培地）に含まれるラクトースによって誘導した後、可溶性の形態で産生させた。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを発現プラスミドで形質転換し、選択寒天培地プレート（カナマイシン）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーから５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した３ｍｌの２×ＹＴ培地に単一コロニーを播種して前培養とし、培養管中で、通常のオービタルシェーカーで３７℃、２００ｒｐｍで６時間培養した。１Ｌ容三角フラスコ中で、アフィニティータグをもつバリアントの場合、３５０ｍｌのＺＹＭ－５０５２（０．５％グリセロール、０．２％ラクトース、０．０５％グルコース、０．５％酵母エキス、１．０％カザミノ酸、２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４及び微量元素）に、又はアフィニティータグをもたないバリアントの場合、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した、３５０ｍｌのＨ１５培地（０．８９％グリセロール、０．７６％ラクトース、２．２％グルコース、５％酵母エキス、２５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び微量元素）に、０．３／ＯＤの前培養を播種し、主培養とした。培養物をオービタルシェーカーに移し、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。グルコースを代謝させ、その後ラクトースを細胞内に取り込ませることによって、組換えタンパク質の発現を誘導した。細胞を一晩、約１７時間培養して、約２～４の最終ＯＤ６００に達した。収集前にＯＤ６００を測定し、０．６／ＯＤ６００に調整した試料を取り出し、ペレット化し、－２０℃で凍結した。バイオマスを集めるため、細胞を１２０００×ｇ、２２℃で１５分間遠心分離した。ペレットの重量（湿重量）を測定した。細胞を－２０℃で保存した後、処理した。
実施例３ ２型コラーゲン結合タンパク質の精製
アフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除によって、アフィニティータグをもつタンパク質を精製した。Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ高容量カートリッジ（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してアフィニティークロマトグラフィー精製した後、Ａｋｔａ システム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｈｉｌｏａｄ １６／６００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔとの融合バリアントは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ）アフィニティークロマトグラフィー、それに続くＡｋｔａシステム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｈｉｌｏａｄ １６／６００カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製した。クロマトグラフィー処理ステップはすべて、Ｃｙｔｉｖａのマトリックスを使用したＡＫＴＡシステムで実施した。すべての精製したリガンドについて均一な種（Homogenous species）が得られ、凝集は検出されなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析後、陽性（positive）画分をプールし、そのタンパク質濃度を測定した。さらなる分析には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣを含めた。タンパク質濃度、モル吸光係数を用いた２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム及びＰＬＲＰ－Ｓ（５μｍ、３００Å）カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を行った。Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を行った。ビアコア３０００システムを用いたＳＰＲ測定によって、コラーゲンＩＩの結合を評価した。Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社から精製コラーゲンＩＩを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからＶＥＧＦ－１６５を入手した。ターゲットをＮＨＳ／ＥＤＣ化学によってＣＭ５－Ｓｅｎｓｏｒ上に固定化した（固定化レベル～１０００ＲＵ）。結合分子を異なる濃度で注入し、ラングミュア１：１結合モデルによって親和性を計算した。表２に、選択した２型コラーゲン結合タンパク質（又はそのようなタンパク質を含む多量体）の発現及び精製の結果を示す。
Figure 2023547340000002
実施例４ ＳＰＲによるタンパク質の結合解析
精製したタンパク質を、ＰＤＥＡ活性化後にＮＨＳ／ＥＤＣを用いてＣＭ－５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）に固定化し、ビアコア３０００システム（ＧＥヘルスケア）で１１０～１４０ＲＵを得た。チップをＳＰＲランニングバッファー（ＰＢＳ ０．０５％ツイーン ｐＨ７．３）で平衡化した。
結合すると、標的分析物が表面に蓄積され、屈折率を増加させた。この屈折率の変化をリアルタイムに測定し、時間に対する応答又はレゾナンスユニットとしてプロットした。分析物を連続希釈して３０μｌ／分の流速でチップに塗布した。結合を１２０秒間、解離を１２０秒間行った。各ランの後、チップ表面を３０μｌの再生バッファ（１０ｍＭグリシン ｐＨ２．０）で再生し、ランニングバッファーで平衡化した。
ビアコア３０００（ＧＥヘルスケア）を使用して結合試験を実施した。ラングミュア１：１モデル（ＲＩ＝０）を使用して、製造業者提供のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを介してデータ評価を行った。評価した解離定数（ＫＤ）は、固定化したタンパク質に対して標準化して示した。リアルタイムに測定し、時間［秒］に対する応答又はレゾナンスユニット［ＲＵ］としてプロットした屈折率の変化を示す。結果を表３並びに図３及び図４に示す。２１１１９０（配列番号１）は、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンへの追加の結合（ＩＩ型コラーゲンへの追加結合）を示したが、Ｖ型コラーゲンへの追加の結合を示さなかった（対照、ＢＳＡ又はフィブロネクチンのエクストラドメインＢへの追加の結合も示さなかった）。
Figure 2023547340000003
実施例５． 結合タンパク質のＫＤの測定（ＥＬＩＳＡ）
高結合プレート（グレーナー、７８１０６１）を、２．５μｇ／ｍｌの組換えヒトコラーゲンＩＩ型（ｈ Ｃｏｌ ＩＩ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、ＣＨＸ－２００５１）、ウサギコラーゲンＩＩ型（ウサギの眼から調製したｒｂＣｏｌ ＩＩ）、ブタコラーゲンＩＩ型（ｐ Ｃｏｌ ＩＩ、ブタの眼から調製）、ヒトコラーゲンＩ型、（ｈ Ｃｏｌ Ｉ、シグマ、Ｃ５４８３－１ＭＧ）、ヒトコラーゲンＶ型（ｈ Ｃｏｌ Ｖ、アブカム、ａｂ７５３７）ヒトコラーゲンＩＩＩ型（ｈ Ｃｏｌ ＩＩＩ、アブカム、ａｂ７５３５）、及び６７Ｂ８９（大腸菌で産生されるフィブロネクチンのドメイン）で、それぞれ４℃で一晩固定化した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ツイーン）で３回洗浄し、３％ ＢＳＡ／０．５％ツイーン／ＰＢＳで室温にて２時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、１．１μＭ～７×１０－４ｎＭの二量体（ＣＩＤ２１１９９９、ＣＩＤ２１２０００）の希釈系列、１００ｎＭ～７×１０－６ｎＭの四量体（ＣＩＤ２１２００１及びＣＩＤ２１２７０４）の希釈系列、並びに１０μＭ～２ｎＭの二量体（ＣＩＤ２１２７０５）の希釈系列を、ＥＬＩＳＡプレート上で室温にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ビオチン標識抗ＳｔｒｅｐＴａｇ抗体（Ａｎｔｉｋｏｒｐｅｒ－ｏｎｌｉｎｅ、ＡＢＩＮ１５７３８９５）で１：１０．０００の希釈物とともに室温で１時間インキュベートした。結合は、１：１０．０００希釈のａ－ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（シグマ、Ａ９１６９）と、及び基質としてＴＭＢ Ｐｌｕｓ ｖｏｎ ＫＥＭ ＥＮ ＴＥＣ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｋａｔ－Ｎｒ．４３９５を用いて可視化した。
結果。ＥＬＩＳＡ分析から、ＩＩ型コラーゲンに対する特異的結合が明確に確認された。配列番号２のホモ二量体（ＣＩＤ２１１９９９及びＣＩＤ２１２０００）並びに配列番号１５のホモ二量体（ＣＩＤ２１２７０５）は高い結合親和性（１～２桁ｎＭのＫＤ）を示す。配列番号１５の四量体（ＣＩＤ２１２７０４）及び配列番号２の四量体（ＣＩＤ２１２００１）は高い結合親和性、例えば異なる種のＩＩ型コラーゲンに対して３桁ピコモルの結合親和性を示す。Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン又はフィブロネクチンのドメイン（６７Ｂ８９）に対して非特異的な結合は検出されなかった（図２）。
さらに、ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を結合についてＥＬＩＳＡで分析した。例えば、２０９１３０（配列番号２７）は、ヒトＩＩ型コラーゲンに対して０．２２μＭ、ブタＩＩ型コラーゲンに対して０．１１μＭの特異的結合を示した。２１１１３８（配列番号３４）は、ヒトＩＩ型コラーゲンに対して０．４５μＭ、ブタＩＩ型コラーゲンに対して０．８１μＭの特異的結合を示した。２１０９８７（配列番号３６）は、ヒトＩＩ型コラーゲンに対して０．４６μＭの特異的結合を示した。２１１５１９（配列番号３７）は、ヒトＩＩ型コラーゲン及びブタＩＩ型コラーゲンに対して０．７μＭの特異的結合を示した。２１１１９０（配列番号１）は、ヒトＩＩ型コラーゲン、さらにはヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲンの特異的結合を示したが、ヒトＶ型コラーゲンに対しては示さなかった。
実施例６：ＩＨＣによるタンパク質の特異的結合の解析 ホルマリン固定したパラフィン包埋ブタ眼の切片をキシロールで脱パラフィンし、エタノールを用いて、その濃度を下げていく系列で再水和した。抗原賦活化のため、スライスを、ＴＥバッファー、ｐＨ９．０で、１１０℃にて５分間インキュベートした。ペルオキシダーゼブロッキング溶液（Ｎｏｖｏｌｉｎｋ ＰｏｌｙｍｅｒＴＭ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ、ＲＥ７１４０－Ｋ）で内在性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、スライスを５μＭ又は５００ｎＭのＣＩＤ２１１９９９（二量体）、ＣＩＤ２１２０００（二量体）、ＣＩＤ２１２００１（四量体）とともに室温で４５分間インキュベートした。次に、１：５００希釈のウサギ抗ＳｔｒｅｐＴａｇ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ａ０００２６）及びＮｏｖｏｌｉｎｋ ＰｏｌｙｍｅｒＴＭ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてタンパク質の結合を検出した。１：１０希釈の抗コラーゲンＩＩ型抗体（アブカム、＃ａｂ３４７１２）を陽性対照とした。組織スライスを抗体と３０分間インキュベートした。洗浄ステップをＴＢＳ ｐＨ７．６で行った。可視化には、ＡＥＣ染色（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６１）を用い、水で洗浄後、マイヤーヘマトキシリン溶液（メルク、１．０９２４９．０５００）で核を染色した。結果は図５を参照されたい。図５に示すものと同様の結果が、配列番号３８（二量体配列番号２、ＣＩＤ２１１９９９）及び配列番号４１（配列番号２の四量体、ＣＩＤ２１２００１）で得られた。

Claims (11)

  1. 配列番号２、１０、１１、１２、１４、及び１５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＩＩ型コラーゲン結合タンパク質であって、
    （ｉ）グルタミン（Ｑ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２５番目に対応する位置に；
    （ｉｉ）チロシン（Ｙ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの２９番目に対応する位置に；且つ
    （ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）を、配列番号２、１０、１１、１２、１４及び１５のいずれかの３３番目に対応する位置に有し；ＩＩ型コラーゲンに対して１０μＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する
    ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質。
  2. ２、３、４、５、又は６つのＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質が、互いに連結した、請求項１に記載のＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質。
  3. ホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項２に記載のＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質。
  4. 配列番号２７～４２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＩＩ型コラーゲンに対する結合タンパク質。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を含む二量体又は多量体タンパク質。
  6. モノクローナル抗体及びその断片、結合タンパク質、受容体及び受容体ドメイン、受容体結合リガンド及びアンタゴニスト、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリン結合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、並びに放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される、少なくとも１つの治療上有効な部分にさらに融合又は結合された、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項５に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
  7. 放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリン結合タンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される少なくとも１つの診断用部分にさらに融合された又は結合された、請求項１～４及び６のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項５又は６に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
  8. 医学に使用するため、好ましくは、眼疾患又は関節の疾患などの疾患の診断又は治療に使用するための、請求項１～４、６及び７のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
  9. 請求項１～４、６及び７のいずれか一項に記載のＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を含む組成物。
  10. 請求項１～４、６及び７のいずれか一項に画定されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質、並びに治療上又は診断上許容可能な担体並びに／又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物。
  11. ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を得るために好適な条件下で宿主細胞を培養すること及び任意選択で前記ＩＩ型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、請求項１～４、６及び７のいずれか一項に画定されたＩＩ型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を製造するための方法。
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