CN116635072A - 异二聚性iga fc构建体及其使用方法 - Google Patents

异二聚性iga fc构建体及其使用方法 Download PDF

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CN116635072A CN202180081207.4A CN202180081207A CN116635072A CN 116635072 A CN116635072 A CN 116635072A CN 202180081207 A CN202180081207 A CN 202180081207A CN 116635072 A CN116635072 A CN 116635072A
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E·埃斯科巴-卡布雷拉
F·海因克尔
T·斯普雷特·冯克罗登斯泰恩
M·M·弗斯特雷特
S·B·迪克西特
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Abstract

异二聚性IgA Fc(IgA HetFc)构建体在CH3结构域中包含一个或多个氨基酸突变，所述突变允许形成具有高纯度和热稳定性的异二聚性Fc。IgA HetFc构建体可包含一个或多个靶标结合结构域。可以制备包含多个IgA HetFc构建体的更高阶IgA HetFc多聚体，其中所述IgA HetFc构建体中的两个IgA HetFc构建体通过J链联接。

Description

异二聚性IGA FC构建体及其使用方法
技术领域
本公开涉及基于IgA的免疫治疗剂的领域，并且具体地涉及包含一个或多个结合结构域的异二聚性IgA Fc(IgA HetFc)构建体以及这些构建体作为治疗剂的用途。
背景技术
通常，基于抗体的治疗剂含有IgG衍生的框架。Ig亚型是稳定的，以高亲和力与靶标结合，具有良好的药代动力学行为，并且由于数十年的重点研究，对靶标和效应细胞的功能性影响已广为人知。然而，就IgG能够激活的效应细胞和可以获得的价态而言，基于IgG的功能性是有限的。
嗜中性粒细胞是免疫系统的不可或缺的部分，并且是人血液中最普遍的白细胞(参见表1)。IgA是唯一一种经由Fc的Cα2/Cα3(IgA CH2/CH3)界面中的残基与嗜中性粒细胞上的FcαRI相互作用的Ig同种型。IgA与嗜中性粒细胞上的FcαRI的相互作用引发多种促炎反应，包括嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)的释放、脱颗粒和趋化因子释放(Heineke，2017，Eur J Clin Invest.，47(2)：184-192)。IgA还可以介导离体细胞毒性。由IgA激活的嗜中性粒细胞已被证明能够杀伤Her2+++BT474细胞(Borrok等人，2015年，MAbs 7：743-751)。IgA介导的经由Her2和其他靶标的肿瘤细胞杀伤已由嗜中性粒细胞离体证明(Brandsma等人，2019年，Front Immunol，10：704)。此外，IgA可以在体内介导肿瘤生长抑制。具体地，IgA已被证明在Fcα RI转基因(Tg)小鼠模型中体内抑制肿瘤生长(Boross等人，2013，EMBO MolMed，5：1213-1226)。
表1：人血液中的免疫细胞*
*从291名成人收集的数据(参见Orfanakis，等人，1970，Am J Clin Pathol，53：647-651)
经由IgA募集和激活嗜中性粒细胞为基于抗体的免疫疗法提供了新的生物学功能。
发明内容
本文描述了异二聚性IGA Fc构建体及其使用方法。本公开的一个方面涉及包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚性IgA Fc(IgA HetFc)构建体，所述第一Fc多肽包含第一CH3结构域序列，并且所述第二Fc多肽包含第二CH3结构域序列，所述第一和第二CH3结构域序列形成经修饰的CH3结构域，其中所述第一和第二CH3结构域序列包含促进异二聚性Fc的形成超过同二聚性Fc的形成的氨基酸突变，其中：所述第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH的位于位置A6085Y处的氨基酸取代，以及选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H的位于位置T6086处的氨基酸取代，并且所述第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I的位于位置W6081处的氨基酸取代，其中所述异二聚性Fc是以70％或更高的纯度形成，并且其中氨基酸位置的编号是根据IMGT编号。
本公开的另一个方面涉及包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的异二聚性IgA Fc(IgAHetFc)构建体，所述第一Fc多肽包含第一CH3结构域序列，并且所述第二Fc多肽包含第二CH3结构域序列，所述第一和第二CH3结构域序列形成经修饰的CH3结构域，其中所述第一和第二CH3结构域序列包含促进异二聚性Fc超过同二聚性Fc的形成的氨基酸突变，其中：
(a)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YY和T6086L，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079T、W6081L和I6088L；或者
(b)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YY和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079T、W6081L和I6088L；或者
(c)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081L和I6088L；或者
(d)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(e)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：T6022V、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(f)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：T6022L、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(g)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：T6022I、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(h)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6007F、L6079V、W6081T和I6088L
(i)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005Y、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005Y、L6079V、W6081T和I6088L；或者
(j)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：P6010C、L6079V、W6081T和I6088L；或者
(k)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：P6010C、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、L6079V、W6081T和I6088L；或者
(l)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、P6010C、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、P6010C、L6079V、W6081T和I6088L，
其中所述异二聚性Fc以70％或更高的纯度形成，并且其中氨基酸位置的编号是根据IMGT编号。
本公开的另一个方面涉及包含如本文所述的IgA HetFc构建体和一种或多种治疗剂、诊断剂或标记剂的缀合物。
本公开的另一个方面涉及一种IgA HetFc多聚体，所述IgA HetFc多聚体包含J链和两个或更多个如本文所述的IgA HetFc构建体，其中所述IgA HetFc构建体中的两个IgAHetFc构建体通过J链联接。
本公开的另一个方面涉及包含如本文所述的IgA HetFc构建体和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物。
本公开的另一个方面涉及包含缀合物和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物，所述缀合物包含IgA HetFc构建体和一种或多种如本文所述的治疗剂、诊断剂或标记剂。
本公开的另一个方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含IgA HetFc多聚体和药学上可接受的载剂或稀释剂，所述IgA HetFc多聚体包含两个或更多个IgA HetFc构建体和如本文所述的J链。
本公开的另一个方面涉及编码如本文所述的IgA HetFc构建体的一种经分离的多核苷酸或多核苷酸的集合。
本公开的另一个方面涉及包含一种或多种编码如本文所述的IgA HetFc的多核苷酸的载体集合或载体的集合。
本公开的另一个方面涉及包含一种或多种编码如本文所述的IgA HetFc的多核苷酸的宿主细胞。
本公开的另一个方面涉及制备如本文所述的IgA HetFc构建体的方法，所述方法包括用一种或多种编码IgA HetFc构建体的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适于使所述IgAHetFc构建体表达的条件下培养宿主细胞。
本公开的另一个方面涉及制备如本文所述的IgA HetFc多聚体的方法，所述方法包括用编码J链的多核苷酸和一种或多种编码包含α-尾部的IgA HetFc构建体的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适于使所述IgA HetFc构建体和所述J链表达的条件下培养宿主细胞。
附图说明
图1呈现了一副卡通图，其描绘了驱动IgA Fc异二聚化的突变的阴性和阳性设计概念。
图2呈现了以下在CaptureSelectTM IgA亲和纯化之后的IgA Fc单臂抗体(OAA)构建体的非还原CE-SDS图谱：(A)包含WT IgA CH3的IgA Fc OAA构建体(变体编号32595)或包含空间设计1、2、3、4或6的IgA Fc OAA构建体(变体编号分别为32516、32517、32518、32519和32521)，(B)包含空间设计7、8、9、10或11(变体编号分别为33330、33331、33332、33333和33334)的IgA Fc OAA构建体。
图3呈现了以下在CaptureSelectTM IgA亲和纯化之后的IgA Fc OAA构建体的UPLC-SEC色谱图：(A)包含WT IgA CH3的IgA Fc OAA构建体(变体编号32595)的UPLC-SEC色谱图；(B-K)包含空间设计1、2、3、4、6、7、8、9、10或11的IgA OAA构建体(变体编号分别为32516、32517、32518、32519、32521、33330、33331、33332、33333和33334)的UPLC-SEC色谱图。
图4呈现了以下在通过制备型SEC纯化之后的IgA Fc OAA构建体的UPLC-SEC色谱图：(A)包含WT IgA CH3的IgA OAA构建体(变体编号32595)，(B-J)包含空间设计1、2、3、6、7、8、9、10或11的IgA OAA构建体(变体编号分别为32516、32517、32518、32521、33330、33331、33332、33333和33334)。
图5呈现了以下在通过制备型SEC纯化之后的IgA Fc OAA构建体的非还原和还原CE-SDS图谱：(A)包含WT IgA CH3的IgA OAA构建体(变体32595)或包含空间设计1、2、3或6的IgA OAA构建体(变体编号分别为32516、32517、32518和32521)，(B)包含空间设计7、8、9、10或11的IgA OAA构建体(变体编号分别为33330、33331、33332、33333和33334)。
图6呈现了以下在通过制备型SEC纯化之后的IgA Fc OAA构建体的DSC热分析图的叠加：(A)包含WT IgA CH3的IgA Fc构建体(变体编号32595)或包含空间设计1、2、3或6的IgA Fc构建体(变体编号分别为32516、32517、32518和32521)，(B)包含空间设计7-11的IgAFc构建体(变体编号33330-33334)。
图7描绘以下IgA HetFc结合单元的组分和构型的实例：(A)IgA HetFc支架，结合结构域与其融合形成IgA HetFc结合单元；(B)例示性IgA HetFc结合单元，其显示出附接有两个示例性结合结构域的IgA HetFc支架；(C-H)例示性IgA HetFc结合单元，其具有1至4个以不同构型与IgA HetFc支架融合的结合结构域。结合结构域出于说明目的而被示出为Fab，但可以是各种其他结合结构域(例如scFv)和结合结构域的组合。所提供的形式是用于说明目的，而不以任何方式限制本公开。
图8描绘例示性的更高阶IgA HetFc多聚体，其包含两个、四个和五个通过J链(点划线)联接的IgA HetFc结合单元。IgA HetFc的两条链以灰色点划线示出。指示了每个结构中心的尾部组件。为每个组件示出了单个取向，但可能有许多取向。由于J链和Fc：Fc相互作用对链A或链B没有选择性，因此每个结合单元的结合结构域的取向可被反转。(A)包含两个由J链联接的双特异性IgA HetFc结合单元的二聚性IgA HetFc多聚体，(B)包含四个由J链联接的双特异性IgA HetFc结合单元的四聚性IgA HetFc多聚体，以及(C)包含五个由J链联接的双特异性IgA HetFc结合单元的五聚性IgA HetFc多聚体。
图9呈现了IgA HetFc设计(空间6)的结构图示，其中指示出了链A和链B。蛋白质主链以卡通图示描绘，并且侧链被示出为线条表示。未显示非极性氢。(A)示出完整的IgA异二聚性Fc，以及(B)呈现了以核心位置A6085、T6086(两者均为链A)和W6081(链B)为中心的突变残基的放大视图。
图10呈现了IgA1、IgA2m1和IgA2m2 Fc区的氨基酸序列的比对。
图11呈现了基于IgA HetFc的IgA OAA变体，其具有消除了Fc的一条或两条链中FcαR的结合的突变。
图12呈现了基于IgA HetFc的经修饰的IgA mAb，其能够结合FcαR和FcRn。
具体实施方式
本公开涉及IgA Fc区的工程改造，以将促进异二聚性IgA Fc(IgA HetFc)的形成的氨基酸突变引入到CH3结构域中。IgA HetFc允许构建基于IgA的双特异性或多特异性结合蛋白，以及基于IgA的多聚性结合蛋白。根据本公开，IgA HetFc构建体所包含的一个或多个氨基酸突变允许形成具有至少约70％纯度的异二聚性Fc。本公开的IgA HetFc构建体也是热稳定的。例如，在某些实施方案中，IgA HetFc的CH3结构域具有约60℃或更高的解链温度(Tm)。在一些实施方案中，IgA Het Fc的CH3结构域的Tm在野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)范围内。
本公开的IgA HetFc构建体包括IgA HetFc支架，其包含IgA Fc区连同铰链区；IgAHetFc结合单元，其包含IgA支架和一个或多个结合结构域；以及IgA HetFc多聚体，其包含多个(例如两个或更多个)IgA HetFc结合单元。
本公开的IgA HetFc构建体向具有未被IgG利用的功能性的IgA同种型中引入多特异性潜力。例如，在某些实施方案中，IgA HetFc有助于创建能够经由FcαRI募集嗜中性粒细胞的多特异性的多聚性生物制品。由于嗜中性粒细胞是免疫系统的不可或缺的部分，并且是人血液中发现的最普遍的白细胞，因此经由IgA募集和激活嗜中性粒细胞为基于抗体的免疫疗法提供了新的生物学功能。本公开的某些实施方案涉及使用IgA HetFc结合单元和IgA HetFc多聚体作为治疗剂的方法。本公开的某些实施方案涉及使用IgA HetFc结合单元和IgA HetFc多聚体作为诊断剂的方法。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
如本文所用，除非另有指示，否则术语“约”是指与给定值相比的大约±10％的变化。应当理解，无论是否特别提及，此种变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
当在本文中结合术语“包含”一起使用时，词语“一个/种(a或an)”可以意指“一个/种”，但在某些实施方案中它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素和/或方法步骤。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“基本上由……组成”表示可以存在附加的要素和/或方法步骤，但是这些附加不会实质性影响所列举的组合物、方法或用途起作用的方式。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“由……组成”排除了附加的要素和/或方法步骤的存在。本文描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法也可以在某些实施方案中基本上由那些要素和/或步骤组成，而在其它实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否特别提及了这些实施方案。
“融合”意指本文所述多聚体的组分(例如抗体或其抗原结合片段和Fc结构域多肽)通过肽键直接连接或通过一个或多个肽接头连接。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性地连接的氨基酸单体的分子。例如，抗体的抗原结合片段可包含单链可变区(scFv)。
如本文所用，“IgA HetFc构建体”意在包括本文描述的IgA HetFc构建体中的任一种IgA HetFc构建体，包括IgA HetFc支架(异二聚性IgA Fc)、IgA HetFc结合单元(异二聚性IgA结合单元)和IgA HetFc多聚体。
与经修饰的J链相关的术语“功能性(的)”意指J链保留原生J链(例如，原生人J链)的主要功能，具体地，使IgA能够高效聚合(二聚化、四聚化)并且使此类聚合物(二聚体、四聚体)与分泌成分(SC)/聚合性(p)Ig结合的能力。
如本文在提及材料时所使用的术语“(经)分离”意指该材料从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，则为天然环境)中被移出。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同的多核苷酸或多肽是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分并且/或者此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，且仍然是经分离的，因为此种载体或组合物不是其自然环境的一部分。
当本文在提及氨基酸序列(诸如肽、多肽或蛋白质序列)时使用时，术语“经保守修饰的变体”意指该氨基酸序列已在不显著影响该序列的功能的情况下通过取代、添加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸而改变。例如，经保守修饰的变体可以是已被一个或多个保守氨基酸取代改变的氨基酸序列。提供功能性地相似的氨基酸的保守性取代表是本领域普通技术人员已知的。例如，以下八个组各自含有彼此为保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月))。在某些实施方案中，用作IgA HetFc构建体的基础序列的IgA序列可以是经保守修饰的变体。
如本文所用的关于氨基酸序列的术语“基本上同一”是指，当例如使用下文描述的方法进行最佳比对时，该序列与限定的第二氨基酸序列(或“参考序列”)共有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在某些实施方案中，基本上同一的氨基酸序列与参考序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。“基本同一性”可用于指代各种类型和长度的序列，诸如全长序列或功能性结构域。两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以本领域中众所周知的各种方式来确定，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147：195-7)；如并入GeneMatcher PlusTM中的“BestFit”(Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics，482-489 10(1981))，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequenceand Structure，Dayhof，M.O.，编著，第353-358页；BLAST程序(Basic Local AlignmentSearch Tool(Altschul，S.F.，W.Gish，等人(1990)J Mol Biol 215：403-10)及其变体，包括BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL和Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的长度上实现最大比对所需的算法。通常，对于氨基酸序列，比较序列的长度将为至少10个氨基酸。本领域技术人员将理解，实际长度将取决于所比较序列的总长度，并且可以是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个或至少200个氨基酸，或者它可以是氨基酸序列的全长。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含与如本文中一个或多个表格中所列的参考氨基酸序列或其片段至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。
当在提及重组氨基酸序列时使用时，术语“源自”和“基于”意指该重组氨基酸序列与相应的野生型氨基酸序列的序列是基本上同一的。例如，源自(或基于)野生型IgA Fc序列的IgA Fc氨基酸序列与野生型IgA Fc序列是基本上同一的(例如，共有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)。
如本文所用的术语“受试者”是指动物，在一些实施方案中是指哺乳动物，其是治疗、观察或实验的对象。动物可以是人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，母牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
如本文所用的术语“敲除(knock-out)或敲除(knockout)”是指变体中各种位置内的导致消除或减少与结合靶标的结合的突变或突变的集合。
在本说明书中，除非另有指示，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所列举范围内的任何整数的值，并且在适当时包括它的分数(诸如，整数的十分之一和百分之一)。
预期本文讨论的任何实施方案可以按照本文公开的任何方法、用途或组合物来实施。
结合本文公开的一个实施方案描述的特定特征、结构和/或特性可以与结合本文公开的另一个实施方案描述的特征、结构和/或特性以任何合适的方式组合以提供一个或多个其它实施方案。
还应理解的是，在一个实施方案中对特征的肯定陈述是在另一个实施方案中排除该特征的基础。例如，在为给定实施方案或权利要求提出选项列表的情况下，应当理解，可以从该列表中删除一个或多个选项，并且缩短的列表可以形成替代实施方案，而不管此种替代实施方案是否被具体提及。
抗体技术领域的技术人员所理解的术语各自被赋予在本领域中获得的含义，除非在本文中被明确不同地定义。已知抗体具有可变区、铰链区和恒定结构域。免疫球蛋白的结构和功能在例如Harlow等人(编者)，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)中进行了综述。
除非本文另有规定，否则IgA Fc区和IgA尾部中氨基酸残基的编号是根据IMGT编号系统(参见Lefranc，等人，2003，Dev Comp Immunel，27：55-77；Lefranc，等人，2005，DevComp Immunel，29：185-203)。表2提供IgA2ml Fc CH2和CH3结构域的IMGT编号和氨基酸序列，连同等效的EU编号(通过比对)。其他IgA Fc序列的编号可由本领域技术人员使用已知技术通过与表2中所示序列的简单序列比对容易地确定。表3提供IgA尾部的IMGT编号和氨基酸序列。
表2：IgA2m1＊Fc CH2和CH3结构域序列、IMGT和EU编号
/>
*Chintalacharuvu，等人，1994，J Iimmunol 152：5299-5304
表3：IgA尾部序列和IMGT编号
IMGT编号 氨基酸
7001 K
7002 P
7003 T
7004 H
7005 V
7006 N
7007 V
7008 S
7009 V
7010 V
7011 M
7012 A
7013 E
7014 V
7015 D
7016 G
7017 T
7018 C
7019 Y
本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不被解读为限制所描述的主题。
异二聚性IGA FC(IGA HETFC)构建体
本公开涉及异二聚性IgA Fc(IgA HetFc)构建体。IgA HetFc构建体包含源自IgAFc区的异二聚体Fc区。异二聚体Fc区包含含有一个或多个促进异二聚体形成的不对称氨基酸突变的经修饰CH3结构域。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体所包含的异二聚体Fc区可充当支架(IgA HetFc支架)，一个或多个结合结构域可与该支架融合以提供IgA HetFc结合单元。在某些实施方案中，多个(例如两个或更多个)IgA结合单元可以例如经由J链融合在一起，以提供IgA HetFc多聚体。在某些实施方案中，其他剂(例如，治疗剂或诊断剂)可以任选地缀合至IgA HetFc构建体。
IgA以两种亚型IgA1和IgA2以及各种同种异型变体(IgA2m1、IgA2m2、IgA2(n))存在。在这两种亚型中，IgA2比IgAl更稳定，因为它的更短的铰链区使它对某些细菌蛋白酶具有抗性。这种更短的铰链还导致刚性的非平面结构，这有助于lgA2与细胞表面上的抗原更好地以多价结合。出于本公开的目的，IgA HetFc构建体的异二聚体Fc区可源自IgAl或IgA2Fc区，包括其同种异型变体。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的异二聚体Fc区可源自IgAl Fc区。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的异二聚体Fc区可源自IgA2 Fc区或其同种异型变体。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体的异二聚体Fc区可源自人IgA Fc区。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体的异二聚体Fc区可源自人IgA2或IgA2ml Fc区。
在一些实施方案中，IgA HetFc构建体的异二聚体Fc区可源自人IgA2m1 Fc区。表4提供野生型人IgA2m1 Fc序列的氨基酸序列以及被截短成去除了尾部并且被突变成去除了游离半胱氨酸和糖基化位点的IgA2m1 Fc序列的经修饰形式的氨基酸序列。Fc序列对应于人IgA2m1重链的IMGT编号5001-6129。IgA2m1的CH3序列(加下划线)包含全长人IgA1重链的氨基酸6097-6129(IMGT编号)(参见例如，Chintalacharuvu，等人.，1994，J Immunol，152：5299-5304)。还示出了IgA尾部的序列。IgA1和IgA2m2 Fc区的氨基酸序列在序列表B中是作为SEQ ID NO：44和45提供的。Fc序列的比对提供在图10中。
表4：IgA2m1 Fc氨基酸序列
1Chintalacharuvu，等人，1994，JImmunol，152：5299-5304
2Lohse等人，2016，Cancer Res，76：403-417。突变以粗体和下划线示出。
术语“Fc区”、“Fc结构域”和“Fc”可互换地被用于定义免疫球蛋白重链的C末端区。Fc区通常包含CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc区还可以被视为涵盖铰链区。如本文所用的二聚性Fc的“Fc多肽”是指形成二聚性Fc结构域的两个多肽中的一个，即包含能够稳定地自我缔合的免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽。例如，二聚性IgA Fc区的Fc多肽包含IgA CH3结构域，并且还可以包含IgA CH2结构域。
因此，IgA HetFc构建体的Fc区由以下两个Fc多肽组成：第一Fc多肽和第二Fc多肽，它们在本文中还可被称为链A和链B。术语第一Fc多肽和第二Fc多肽(或链A和链B)可以互换使用，条件是每个Fc区均包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽(或一个链A多肽和一个链B多肽)。第一Fc多肽和第二Fc多肽在“界面”处相遇。“界面”包含第一Fc多肽中的“接触”氨基酸残基，该氨基酸残基与第二Fc多肽中的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用。
Fc区的CH3结构域包含分别来自二聚性Fc的第一和第二Fc多肽的两个CH3结构域序列。所述CH2结构域包含分别来自二聚性Fc的第一和第二Fc多肽的两个CH2结构域序列。
本公开的IgA HetFc构建体包含已被不对称地修饰成产生了异二聚体Fc区的IgACH3结构域。具体而言，以不对称方式将一个或多个氨基酸突变引入到IgA CH3结构域中，从而产生异二聚体Fc。如本文所用，不对称氨基酸突变是这样的突变，其导致一个Fc多肽中特定位置处的氨基酸不同于第二Fc多肽中相同位置处的氨基酸。这可能是第一和第二Fc多肽中的两个氨基酸中仅一个氨基酸发生突变或者这两个氨基酸都突变为两个不同氨基酸的结果。本文公开的IgA HetFc构建体包含位于CH3结构域中的一个或多个不对称氨基酸突变。
来自野生型同二聚体的IgA HetFc区的设计是在通过平衡稳定性与特异性的蛋白质工程改造的背景下通过正负设计的概念来说明，其中引入突变的目的是当多肽在细胞培养条件下被表达时驱动异二聚体形成超过同二聚体形成。这些正设计和负设计的一般设计概念示意性地展示在图1中。
负设计策略通过如下方式使对同二聚体形成不利的相互作用最大化：在一条链上引入庞大的侧链而在另一条链上引入小侧链，例如突起入孔(knobs-into-holes)策略(Ridgway，等人，1996，Protein Eng.，9(7)：617-21；Atwell，等人，1997，J Mol Biol.，270(1)：26-35)，或者进行导致同二聚体形成遭到排斥的静电工程改造，例如由Gunasekaran，等人21010，J Biol Chem.，285(25)：19637-19646开发的静电转向策略。
在正设计策略中，将氨基酸突变引入到多肽中以使蛋白质内或蛋白质之间的有利相互作用最大化。此类策略假设当引入多个特异性地使所需异二聚体稳定而忽略对同二聚体影响的突变时，净影响将为与同二聚体相比对所需异二聚体相互作用具有更好的特异性，并且因此具有更大的异二聚体特异性。据了解，在蛋白质工程改造的背景下，正设计策略优化所需蛋白质相互作用的稳定性，但很少达到大于90％的特异性(Havranek&Harbury，2003，Nat Struct Biol.，10(1)：45-52；Bolon，等人，2005，Proc Natl Acad Sci USA，102(36)：12724-9；Huang，等人，2007，Protein Sci.，16(12)：2770-4)。
本文公开了用于设计IgA Fc异二聚体的方法，该方法导致稳定且高度特异性的异二聚体形成。该设计方法组合了负设计和正设计两者连同结构和计算建模指导的蛋白质工程改造技术(参见本文的实施例1)。在该方法中被用于生成本文的IgA HetFc构建体的计算工具和结构-功能分析可包括例如分子动力学分析(MD)、侧链/主链再填充(re-packing)、知识库潜力(Knowledge Base Potential(KBP))、空腔(疏水)填充分析(LJ、AMBER、SASA、dSASA(碳/全原子))、静电-GB计算和偶联分析。国际专利公布号WO 2012/058768、WO 2015/021540、WO 2014/201566、WO 2014/138994、WO 2014/026296、WO 2013/188984、WO 2013/138923、WO 2012/040833、WO 2012/037659和WO 2011/063518中也描述了用于生成变异Fc区的计算方法。
在某些实施方案中，由这种方法的实施产生的IgA HetFc构建体具有70％或更高的纯度，以及60℃或更高的稳定性(如由CH3结构域的解链温度(Tm)来衡量的)。在某些实施方案中，由这种方法的实施产生的IgA HetFc构建体具有70％或更高的纯度，以及在相应的野生型IgA Fc的CH3结构域Tm的10℃内的稳定性CH3结构域Tm(稳定性)。
根据本公开，被引入到IgA Fc的CH3结构域中的氨基酸突变如与同二聚体形成相比促进异二聚体形成。这种与同二聚体形成相比的异二聚体形成在本文中可互换地称为“纯度”、“特异性”、“异二聚体纯度”或“异二聚体特异性”。应当理解，这种异二聚体纯度是指所形成的所需异二聚体与在标准细胞培养条件下溶液中形成的同二聚体物质相比的百分比。异二聚体纯度是在选择性地纯化异二聚体物质之前评估的。在某些实施方案中，纯度可以在对同二聚体/异二聚体纯化没有选择性的IgA亲和纯化步骤之后(例如，在CaptureSelectTM IgA亲和纯化之后)进行评估。例如，70％的异二聚体纯度指示在IgA亲和纯化步骤后从细胞培养物中分离的Fc二聚体的70％是所需的Fc异二聚体。
在某些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％，例如，大于约71％、或大于约72％、或大于约73％、或大于约74％、或大于约75％、或大于约76％、或大于约77％、或大于约78％、或大于约79％的纯度。在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约80％，例如，大于约81％、或大于约82％、或大于约83％、或大于约84％、或大于约85％、或大于约86％、或大于约87％、或大于约88％、或大于约89％的纯度。在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约90％，例如，大于约91％、或大于约92％、或大于约93％、或大于约94％、或大于约95％、或大于约96％、或大于约97％、或大于约98％、或大于约99％的纯度。
在某些实施方案中，IgA HetFc具有介于约70％和100％之间的纯度。在一些实施方案中，IgA HetFc具有介于约70％和约98％之间、或介于约70％和约97％之间、或介于约70％和约96％之间的纯度。在一些实施方案中，IgA HetFc具有介于约72％和约98％之间、或介于约74％和约98％之间、或介于约75％和约98％之间的纯度。
IgA HetFc样本中异二聚体和同二聚体的相对量以及因此IgA HetFc的纯度可以使用本领域已知的各种技术来确定，该技术包括但不限于分子排阻色谱法(SEC)、非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、非还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)和液相色谱质谱(LC-MS)。
在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％的纯度，如通过非还原CE-SDS所确定。在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％的纯度，如由通过使用CE-SDSGXII(Perkin Elmer，Waltham，MA)运行高通量蛋白质表达测定来进行的非还原CE-SDS所确定。在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％的纯度，如通过如本文实施例4中所述的那样进行的非还原CE-SDS所确定。
在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％的纯度，如通过UPLC-SEC所确定。在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％的纯度，如通过在25℃下在使用AgilentTechnologies AdvanceBio SEC 300A柱的Agilent Technologies 1260Intinity LC系统上进行的UPLC-SEC所确定。在一些实施方案中，IgA HetFc具有大于约70％的纯度，如通过如本文实施例4中所述的那样进行的UPLC-SEC所确定。
根据本公开的IgA HetFc构建体是热稳定的。在本文所公开的IgA HetFc构建体的上下文中，“热稳定(的)”意指IgA HetFc构建体具有约60℃或更高的CH3结构域解链温度(Tm)，或具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域Tm。
在某些实施方案中，IgA HetFc具有约60℃或更高的CH3结构域Tm。在一些实施方案中，IgA HetFc具有约62℃或更高，例如，约63℃或更高、或约64℃或更高、或约65℃或更高、或约66℃或更高、或约67℃或更高、或约68℃或更高、或约69℃或更高的CH3结构域Tm。在一些实施方案中，IgA HetFc具有约70℃或更高，例如，约71℃或更高、或约72℃或更高、或约73℃或更高的CH3结构域Tm。
在某些实施方案中，IgA HetFc具有介于约60℃和约74℃之间的CH3结构域Tm。在一些实施方案中，IgA HetFc具有介于约62℃和约74℃之间，或介于约63℃和约74℃之间，或约64℃和约74℃，或介于约65℃和约74℃之间的CH3结构域Tm。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域TM。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体具有在相应野生型IgA CH3结构域的Tm的9℃(±9℃)内，例如，在相应野生型IgA CH3结构域的Tm的8℃(±8℃)内、或7℃(±7℃)内、或6℃(±6℃)内、或5℃(±5℃)内的CH3结构域Tm。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体在CH3结构域中不存在任何另外的二硫键的情况下具有约60℃或更高的CH3结构域Tm，或具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域Tm。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体与野生型IgA CH3结构域相比在CH3结构域中包含一个或多个另外的二硫键，但具有约60℃或更高的CH3结构域Tm，或者在不存在该一个或多个二硫键的情况下具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域Tm。
以Tm衡量的稳定性可以使用本领域已知的技术，诸如通过差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光法(DSF)、圆二色光谱(CD)和氢交换(HX)来确定。在某些实施方案中，Tm是通过DSC确定。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体具有约60℃或更高的CH3结构域Tm，或具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域Tm，其中Tm是通过DSC确定。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体具有约60℃或更高的CH3结构域Tm，或具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域Tm，其中Tm是通过使用NanoDSC(TA Instruments，New Castle，DE，USA)的DSC确定。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体具有约60℃或更高的CH3结构域Tm，或具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内的CH3结构域Tm，其中Tm是通过遵照本文实施例6中所述的方案的DSC确定。
在某些实施方案中，IgA HetFc：
(i)具有大于约70％，例如，大于约71％、或大于约72％、或大于约73％、或大于约74％、或大于约75％、或大于约76％、或大于约77％、或大于约78％、或大于约79％、或大于约80％、或大于约81％、或大于约82％、或大于约83％、或大于约84％、或大于约85％、或大于86％、或大于约87％、或大于约88％、或大于约89％、或大于约90％、或大于91％、或大于约92％、或大于约93％、或大于约94％、或大于约95％、或大于约96％、或大于约97％、或大于约98％、或大于约99％的纯度，并且
(ii)具有介于约60℃和约74℃之间，例如，介于约62℃和约74℃之间、或介于约63℃和约74℃之间、或介于约64℃和约74℃之间、或约介于约65℃和约74℃之间的CH3结构域Tm。
在某些实施方案中，IgA HetFc：
(i)具有大于约70％，例如，大于约71％、或大于约72％、或大于约73％、或大于约74％、或大于约75％、或大于约76％、或大于约77％、或大于约78％、或大于约79％、或大于约80％、或大于约81％、或大于约82％、或大于约83％、或大于约84％、或大于约85％、或大于86％、或大于约87％、或大于约88％、或大于约89％、或大于约90％、或大于91％、或大于约92％、或大于约93％、或大于约94％、或大于约95％、或大于约96％、或大于约97％、或大于约98％、或大于约99％的纯度，并且
(ii)具有在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的10℃(±10℃)内，例如，在相应的野生型IgA CH3结构域的Tm的9℃(±9℃)内、或8℃(±8℃)内、或7℃(±7℃)内、或6℃(±6℃)内、或5℃(±5℃)内的CH3结构域Tm。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含用于消除与结合靶标的结合的一个或多个突变，或用于引入与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个突变，或二者。
经修饰CH3结构域
本文所述的IgA HetFc构建体包含含有不对称氨基酸突变的经修饰CH3结构域。具体地说，该IgA HetFc构建体包含以下两种Fc多肽：包含第一CH3结构域序列的第一Fc多肽，所述第一CH3结构域序列包含一个或多个氨基酸突变；以及包含第二CH3结构域序列的第二Fc多肽，所述第二CH3结构域序列包含一个或多个氨基酸突变，其中所述第一CH3结构域序列中的氨基酸突变中的至少一个氨基酸突变不同于所述第二CH3结构域序列中的氨基酸突变。第一和第二CH3结构域序列一起形成经修饰的CH3结构域。不对称地被引入到第一和第二CH3结构域序列中的氨基酸突变在该两个CH3结构域序列二聚化时导致异二聚性Fc的形成而不是同二聚性Fc的形成。
如本文所指出的，在此上下文中的“不对称氨基酸突变”是指第一CH3结构域序列中特定位置处的氨基酸与第二CH3结构域序列中相同位置处的氨基酸不同的突变。不对称突变可以是每个CH3结构域序列中相同的相应氨基酸位置处两个氨基酸中仅一个氨基酸突变的结果，或者是第一和第二CH3结构域序列中的每一者上相同的相应氨基酸位置处两个氨基酸的不同突变的结果。IgA HetFc的CH3结构域序列可包含一个或多于一个不对称氨基酸突变。
通过采用本文公开的计算策略，鉴定出了IgA CH3结构域的核心不对称突变集合以用于提供促进异二聚体Fc的形成的所需特性。这个核心突变集合如表5中所示。
表5：IgA HetFc核心突变
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH的位于位置A6085Y处的氨基酸取代以及选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H的位于位置T6086处的氨基酸取代；并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I的位于位置W6081处的氨基酸取代。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域包含针对表7中所示的设计中的任一设计列出的氨基酸突变。
在一些实施方案中，第一CH3结构域序列中位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF、A6085YY或A6085YW。在一些实施方案中，第一CH3结构域序列中位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF或A6085YY。
在一些实施方案中，第一CH3结构域序列中位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y、T6086F或T6086W。在一些实施方案中，第一CH3结构域序列中位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y。
在一些实施方案中，第二CH3结构域序列中位置W6081处的氨基酸取代是W6081T或W6081L。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括氨基酸取代A6085YF和T6086W，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括氨基酸取代W6081T或W6081L。
在一些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括氨基酸取代A6085YF和T6086W，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括氨基酸取代W6081T。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的第一CH3结构域序列可任选地进一步包含以下中的一者或多者：
(i)选自T6022V、T6022I、T6022L和T6022A的位于位置T6022处的氨基酸取代；和/或
(ii)选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的第二CH3结构域序列可任选地进一步包含以下中的一者或多者：
(i)选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代；和/或
(ii)选自L6079V、L6079T、L6079A和L6079I的位于位置L6079处的氨基酸取代；和/或
(iii)选自I6088L、I6088A、I6088V和I6088T的位于位置I6088处的氨基酸取代；和/或
(IV)选自L6007F、L6007Y、L6007M、L6007W、L6007H和L6007I的位于位置L6007处的氨基酸取代。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH的位于位置A6085Y处的氨基酸取代以及选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H的位于位置T6086处的氨基酸取代；并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I的位于位置W6081处的氨基酸取代；并且
(i)第一CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自T6022V、T6022I、T6022L和T6022A的位于位置T6022处的氨基酸取代；并且/或者
(ii)第一CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代；并且/或者
(iii)第二CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代；并且/或者
(iv)第一CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代；并且/或者
(v)第二CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自L6079V、L6079T、L6079A和L6079I的位于位置L6079处的氨基酸取代；并且/或者
(vi)第二CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自I6088L、I6088A、I6088V和I6088T的位于位置I6088处的氨基酸取代；并且/或者
(vii)第二CH3结构域序列中的氨基酸突变进一步包括选自L6007F、L6007Y、L6007M、L6007W、L6007H和L6007I的位于位置L6007处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，第一CH3结构域序列中位置T6022处的氨基酸突变选自T6022V、T6022I和T6022L。
在一些实施方案中，第一CH3结构域序列中位置H6005处的氨基酸突变是H6005Y。
在一些实施方案中，第二CH3结构域序列中位置H6005处的氨基酸突变是H6005Y。
在一些实施方案中，第二CH3结构域序列中位置L6079处的氨基酸突变是L6079V或L6079T。
在一些实施方案中，第二CH3结构域序列中位置I6088处的氨基酸突变是I6088L。
在一些实施方案中，第二CH3结构域序列中位置L6007处的氨基酸突变是L6007F。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的经修饰的CH3结构域进一步包含用于引入能够形成二硫键的半胱氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体的经修饰的CH3结构域进一步包含将一个二硫键引入到CH3结构域中的两个半胱氨酸取代。在一些实施方案中，IgA HetFc构建体的经修饰的CH3结构域进一步包含将两个二硫键引入到CH3结构域中的四个半胱氨酸取代。在一些实施方案中，半胱氨酸取代包括位于一个CH3结构域序列中的突变H6005C和位于另一个CH3结构域序列中的突变P6010C。在一些实施方案中，半胱氨酸取代包括位于一个CH3结构域序列中的突变H6005C和P6010C以及位于另一个CH3结构域序列中的突变P6010C和H6005C。
因此，在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含含有一个或两个引入的(即非天然的)二硫键的经修饰的CH3结构域，其中：
(i)一个CH3结构域序列包含突变H6005C并且另一个CH3结构域序列包含突变P6010C；或者
(ii)一个CH3结构域序列包含突变H6005C和P6010C，并且另一个CH3结构域序列包含突变P6010C和H6005C。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH的位于位置A6085Y处的氨基酸取代以及选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H的位于位置T6086处的氨基酸取代；并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I的位于位置W6081处的氨基酸取代；其中
(i)IgA HetFc构建体的第一CH3结构域可任选地进一步包含选自T6022V、T6022I、T6022L和T6022A的位于位置T6022处的氨基酸取代；并且
(ii)IgA HetFc构建体的第二CH3结构域可任选地进一步包含以下中的一者或多者：选自L6079V、L6079T、L6079A和L6079I的位于位置L6079处的氨基酸取代；和/或选自I6088L、I6088A、I6088V和I6088T的位于位置I6088处的氨基酸取代；和/或选自L6007F、L6007Y、L6007M、L6007W、L6007H和L6007I的位于位置L6007处的氨基酸取代，并且
(iii)经修饰的CH3结构域包含一个或两个引入的(即，非天然的)如上所述的二硫键。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包括位于位置A6085Y和T6086处的氨基酸取代，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包括位于位置W6081处的氨基酸取代和任选的位于位置L6079和I6088中的一者或两者处的氨基酸突变，其中
位于位置A6085处的氨基酸取代选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH；
位于位置T6086处的氨基酸取代选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H；
位于位置W6081处的氨基酸取代选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I；
任选的位于位置L6079处的氨基酸取代选自L6079V、L6079T、L6079A和L6079I；并且
任选的位于位置I6088处的氨基酸取代选自I6088L、I6088A、I6088V和I6088T；
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含含有如针对表8中所示设计中的任一设计列出的氨基酸突变的经修饰的CH3结构域。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含含有如针对表9中所示设计中的任一设计列出的氨基酸突变的经修饰的CH3结构域。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含含有如针对表10中所示设计中的任一设计列出的氨基酸突变的经修饰的CH3结构域。
在一些实施方案中，位于位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF、A6085YY或A6085YW。在一些实施方案中，位于位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF或A6085YY。在一些实施方案中，位于位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y、T6086F或T6086W。在一些实施方案中，位于位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y。在一些实施方案中，位于位置W6081处的氨基酸取代是W6081T或W6081L。在一些实施方案中，任选的位于位置L6079处的氨基酸取代是L6079V或L6079T。在一些实施方案中，任选的位于位置I6088处的氨基酸取代是I6088L。
在一些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包含位于位置A6085Y和T6086处的氨基酸取代，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包含位于位置W6081处的氨基酸取代和任选的位于位置L6079和I6088中的一者或两者处的氨基酸取代，如以上实施方案中的任一个实施方案中所述，并且第一CH3结构域序列或第二CH3结构域序列或者第一和第二CH3结构域序列两者进一步包含选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代。在一些实施方案中，第一CH3结构域序列或第二CH3结构域序列或者第一和第二CH3结构域序列两者进一步包含氨基酸取代H6005Y。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包含位于位置A6085Y和T6086处的氨基酸取代，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包含位于位置W6081处的氨基酸取代和任选的位于位置L6007、L6079和I6088中的一者或两者处的氨基酸取代，其中
位于位置A6085处的氨基酸取代选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH；
位于位置T6086处的氨基酸取代选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H；
位于位置W6081处的氨基酸取代选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I；
任选的位于位置L6007处的氨基酸取代选自L6007F、L6007Y、L6007M、L6007W、L6007H和L6007I；
任选的位于位置L6079处的氨基酸取代选自L6079V、L6079T、L6079A和L6079I；并且
任选的位于位置I6088处的氨基酸取代选自I6088L、I6088A、I6088V和I6088T。
在一些实施方案中，位于位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF、A6085YY或A6085YW。在一些实施方案中，位于位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF或A6085YY。在一些实施方案中，位于位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y、T6086F或T6086W。在一些实施方案中，位于位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y。在一些实施方案中，位于位置W6081处的氨基酸取代是W6081T或W6081L。在一些实施方案中，位于位置L6007处的氨基酸取代是L6007F。在一些实施方案中，位于位置L6079处的氨基酸取代是L6079V或L6079T。在一些实施方案中，位于位置I6088处的氨基酸取代是I6088L。
在一些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3结构域序列中的氨基酸突变包含位于位置A6085Y和T6086处的氨基酸取代，并且第二CH3结构域序列中的氨基酸突变包含位于位置W6081处的氨基酸取代和任选的位于位置L6007、L6079和I6088中的一者或多者处的氨基酸取代，如以上实施方案中的任一个实施方案中所述，并且第一CH3结构域序列或第二CH3结构域序列或者第一和第二CH3结构域序列两者进一步包含选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代。在一些实施方案中，第一CH3结构域序列或第二CH3结构域序列或者第一和第二CH3结构域序列两者进一步包含氨基酸取代H6005Y。
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中氨基酸突变是表6中针对变体v32516、v32517、v32518、v32521、v33330、v33331、v33332、v33333、v33334、v34688、v34689或v34690中的任一者列出的氨基酸取代。在一些实施方案中，IgAHetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，其中氨基酸突变是表6中针对变体v32521、v33333或v33334中的任一者列出的氨基酸取代。
表6：说明性IgA HetFc变体
在某些实施方案中，本公开的IgA HetFc构建体包含经修饰的CH3结构域，该结构域具有如在被以下所包含的CH3结构域序列中列出的氨基酸序列：SEQ ID NO.15和20；SEQID NO.16和20；SEQ ID NO.17和21；SEQ ID NO.17和23；SEQ ID NO.24和23；SEQ ID NO.25和23；SEQ ID NO.26和23；SEQ ID NO.17和27；SEQ ID NO.28和29；SEQ ID NO.30和31；SEQID NO.32和33；或SEQ ID NO.34和35。IgA CH2和CH3结构域能够通过与本文的表2和表4中所提供的IgA序列比较而容易地在指定的SEQ ID NO内鉴定出。
经修饰的CH2结构域
在某些实施方案中，IgA HetFc构建体进一步包含经修饰的CH2结构域，该经修饰的CH2结构域包含一个或多个氨基酸突变，例如，改变CH2结构域的一个或多个功能的突变。例示性突变包括但不限于位于位置C5092(其附接于WT IgA中的分泌区室)处的突变和位于位置N5120处的糖基化位点处的突变。
在某些实施方案中，经修饰的CH2包含位于位置C5092处的突变。在一些实施方案中，位于C5092位置处的突变是选自C5092S、C5092A、C5092T、C5092N和C5092Q的氨基酸取代。在一些实施方案中，位于位置C5092处的突变是C5092S。在某些实施方案中，经修饰的CH2结构域包含位于位置N5120处的糖基化位点处的突变，其中该突变阻止糖基化。在一些实施方案中，位于位置N5120处的突变是氨基酸取代N5 120T。
在某些实施方案中，HetFc IgA构建体包含经修饰的CH2结构域，该经修饰的CH2结构域包含位于位置C5092、N5120、I5121和T5122中的一者或多者处的突变。在一些实施方案中，HetFc IgA构建体包含经修饰的CH2结构域，该经修饰的CH2结构域包含一个或多个选自C5092S、N5120T、I5121L和T5122S的氨基酸取代。在一些实施方案中，HetFc IgA构建体包含经修饰的CH2结构域，该经修饰的CH2结构域包含氨基酸取代C5092S、N5120T、I5121L和T5122S。
在一些实施方案中，经修饰的CH2结构域包含位于第一和/或第二Fc多肽链中的不对称氨基酸取代。在一些实施方案中，经修饰的CH2结构域包含允许CH2结构域的一条链选择性结合Fc受体的不对称氨基酸取代。在某些实施方案中，经修饰的CH2结构域包含促进与Fcα受体的选择性结合的不对称氨基酸突变。
本领域技术人员将理解，本公开的IgA HetFc构建体可能已改变了配体(例如FcαRI)结合特性(结合特性的实例包括但不限于结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和缔合速率(分别为kotf和kon)、结合亲和力和/或亲合力)并且某些改变可能或多或少是期望的，这取决于IgA HetFc构建体的最终用途。众所周知在本领域中平衡解离常数(KD)被定义为koff/kon。对于某些应用，一般理解的是，具有低KD的IgA HetFc构建体与具有高KD的IgAHetFc构建体相比可能是优选的。然而，在一些情况下，kon或koff的值可能比KD的值更相关。本领域技术人员可以确定哪个动力学参数对于给定的IgA HetFc构建体应用最重要。
在某些实施方案中，IgA HetFc包含减少或消除与Fca受体的结合的取代(参见例如Carayannopoulos，1996，JEM,183：1579-1586；Bakema，2006，J Immunol，176：3603-3610，https：//www.pnas.org/content/115/38/E8882)。与Fcα受体的结合减少或消除的IgAHetFc构建体可用于例如不需要激活嗜中性粒细胞的环境，诸如细胞因子释放综合征的环境，在该环境下IgA HetFc构建体可以在避免激活嗜中性粒细胞的同时结合并清除有此需要的受试者中的细胞因子。只有一个FcαRI结合位点的IgA HetFc可用于探究IgA依赖性嗜中性粒细胞激活对FcαRI接合价态的依赖性。
IgA HetFc可用于创建能够与FcαRI以及单个Fc中的新生儿Fc受体(FcRn)结合的分子。由于FcαRI和FcRn的结合位点分别位于IgA和IgG的结构等效区域(Kelton，W.等人，2014，Chem Biol 21：1603-1609，https：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074552114004098？via％3Dihub)，因此它们在Fc中的链上的引入是互相排斥的，并且需要异二聚性Fc。接枝到一条链上的具有FcRn结合位点的IgA HetFc是有用的，因为它能够经由FcαRI激活嗜中性粒细胞并且由于引入与FcRn的相互作用而具有增加的半衰期，从而解决使用IgA来获得治疗益处时已知的半衰期限制。
IgA HetFc还可用于创建能够以单价方式与受体或纯化树脂或检测分子结合的分子。同样，它可用于创建具有原本位于Fc的相互排斥的区域中的受体结合位点、纯化或检测位点的组合的基于IgA HetFc的分子。一个这样的实例将是给先前描述的IgG/A杂交分子(Kelton，W.等人，2014，Chem Biol 21：1603-1609，Borrok，M.J.等人，2015，mAbs，7：4，743-751，DOI：10.1080/19420862.2015.1047570)在Fc的两条链上配备不同的Fcγ受体结合位点以创建具有独特生物活性的Fcγ受体结合谱。受体结合位点包括FcαR、FcRn、Fcγ受体、C1q、分泌成分、SSL7、链球菌IgA结合蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌2型IgA1蛋白酶、流感嗜血杆菌2型IgA1蛋白酶。纯化和检测位点包括蛋白A、多组氨酸标签、FLAG标签和Myc标签。例如，引入蛋白A结合位点可被用于使用因缺乏蛋白A结合而不适合于WT IgA Fc的已确立并且广泛用于基于IgG的治疗剂的技术纯化基于IgA HetFc的分子。
靶标结合结构域
本文所述的IgA HetFc可起到异二聚性支架的作用，多种不同的结合结构域或其他部分可与该支架融合。在某些实施方案中，本公开涉及IgA HetFc构建体，该构建体是包含一个或多个与IgA HetFc融合的靶标结合结构域的IgA HetFc结合单元。用于IgA HetFc结合单元的靶标结合结构域包括与目标靶标特异性地结合的各种蛋白质部分。在此上下文中的“特异性地结合”意指该结合对所需靶标有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。结合结构域与靶标特异性地结合的能力可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcoreTM器械上分析)(Liljeblad，等人，2000，Glyco J.，17：323-329)或传统的结合测定(Heeley，2002，Endocr Res.，28：217-229)进行测量。
靶标结合结构域的实例包括但不限于受体、受体片段(诸如细胞外部分)、配体、细胞因子和抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含一个或多个结合结构域，该结合结构域为抗原结合结构域，例如受体或抗体片段。
在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含一个或多个靶标结合结构域，该靶标结合结构域为抗原结合抗体片段。此类抗原结合抗体片段可源自IgA或源自其他抗体同种型，诸如IgG、IgM、IgD或IgE。在一些实施方案中，抗原结合抗体片段可以是合成的、嵌合的或人源化的。抗原结合抗体片段包括但不限于抗体的轻链和/或重链的可变区或高变区(VL、VH)、可变片段(Fv)、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fab片段、单链抗体(scAb)、单链可变区(scFv)、VHH、互补决定区(CDR)、结构域抗体(dAb)、单结构域重链免疫球蛋白和单结构域轻链免疫球蛋白。抗体的抗原结合位点通常含有六个CDR，这些CDR在不同程度上促成结合位点对抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和框架区(FR)的范围是通过与汇编的氨基酸序列数据库比较来确定，在该数据库中这些区域已根据序列之间的变异性和/或来自抗体/抗原复合物的结构信息进行了定义。本公开的范围内还包括由较少CDR组成的功能性抗原结合位点(即其中结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。少于完整的6个CDR的集合可能足以与一些结合靶标结合。因此，在一些情况下，单独的VH或VL结构域的CDR将足以进行特异性结合。此外，某些抗体可能具有针对抗原的非CDR相关结合位点。本文中特别考虑了此类结合位点。抗原结合抗体片段可以来自单一物种或可以是嵌合的或人源化的。
在某些实施方案中，结合结构域包含抗原结合受体片段，例如，T细胞受体(TCR)的MHC-肽复合物结合片段。用于本文IgA HetFc构建体的TCR片段可包含αβTCR或γδTCR异二聚体的抗原结合片段。在一些实施方案中，本文的IgA HetFc构建体可包含αβTCR异二聚体的抗原结合片段，该抗原结合片段至少包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域，使得αβTCR片段能够与其同源MHC/肽结合。在一些实施方案中，抗原结合TCR片段是单链TCR(scTCR)或可溶性TCR结构域(参见，例如，国际专利公开号WO 1999/018129和WO 2009/117117)。其他TCR抗原结合片段是本领域已知的，并描述于例如Wilson&Garcia，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7：839-848；van Boxel，等人，2009，J.Immunol.Methods，350：14-21；Stone，等人，2012，MethodsEnzymol.，503∶189-222和Li，等人，2005，Nat.Biotechnol.，23：349-354)中。
其他靶标结合结构域包括免疫调节性Ig结构域、非Ig病毒受体诱饵、模拟抗体结合和结构的非免疫球蛋白蛋白质，诸如抗运载蛋白(anticalin)、遍在蛋白(affilin)、亲和体(affibody)分子、亲和性多聚体(affimer)、亲和素(affitin)、阿尔法体、亲合体(avimer)、DARPin、菲诺体(tynomer)、库尼茨型结构域肽、单体(monobodies)以及基于其他经工程改造支架(诸如SpA、GroEL、纤连蛋白、脂质运载蛋白和CTLA4支架)的结合结构域。靶标结合结构域的进一步的实例包括所需受体的配体、受体的配体结合部分、凝集素以及与一种或多种靶抗原特异性地结合的肽。
在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含结合结构域，该结合结构域包含治疗性或诊断性抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元所包含的靶标结合结构域特异性地结合至细胞表面分子，诸如蛋白质、脂质或多糖。在一些实施方案中，IgAHetFc结合单元所包含的结合结构域特异性地结合肿瘤细胞、病毒感染细胞、细菌感染细胞、受损的红细胞、动脉斑块细胞、发炎组织或纤维化组织细胞上表达的靶抗原。
在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元所包含的靶标结合结构域是免疫反应调节剂。在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元所包含的靶标结合结构域特异性地结合细胞因子受体。在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元所包含的靶标结合结构域特异性地结合至肿瘤抗原。在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元所包含的靶标结合结构域是免疫检查点蛋白或与免疫检查点蛋白特异性地结合。
由于IgA HetFc的异二聚性性质，不同的结合结构域可以与Fc异性二聚体的一条或两条链融合，以生成范围广泛的功能性多特异性IgA HetFc结合单元。此类多特异性IgAHetFc结合单元的非限制性例示性实例示于图7中。此外，更高阶的IgA HetFc多聚体可以通过将多个IgA HetFc结合单元联接在一起，例如通过与J链联接来生成。多聚性IgA结构通常包含由J链和尾部-尾部相互作用连接的呈尾-尾构型的IgA二聚体，其中另外的IgA单体仅经由尾部-尾部介导的二硫键与该二聚体连接，并且与复合体中的J链没有直接接触(参见，例如，Kumar，等人，2020，Science，10.1126/science.aaz5807)。此类IgA HetFc多聚体的非限制性例示性实例示于图8中。
根据本公开的IgA HetFc结合单元可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的、四特异性的或具有更高的多特异性。多特异性IgA HetFc结合单元可与所需靶分子的不同表位特异性地结合，或者可与不同靶分子特异性地结合，或者可结合靶分子以及异源表位，诸如异源多肽或固体支持材料。
在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含两个或更多个靶标结合结构域，每个靶标结合结构域均具有不同的结合特异性。在这方面，结合结构域可结合同一靶标但与同一靶标上的不同表位结合，或者它们可以各自与不同的靶标结合。
在某些实施方案中，IgA Fc结合单元包含与一个Fc多肽(例如，链A)融合的靶标结合结构域，并且不含与另一个Fc多肽(例如，链B)融合的靶标结合结构域或不同的靶标结合结构域。因此，IgA HetFc的链A和链B的差异在于它们的Fc区(如上所述，在CH3结构域中具有用于驱动异二聚体形成的突变)，并且它们的结合特异性也可能不同。
术语IgA HetFc结合单元在本文中用于指代具有如本文所述的异二聚体Fc的IgAHetFc构建体(例如，一对IgA Fc多肽，每个IgA Fc多肽均包含至少一个IgA CH3结构域)，其中至少一个IgA Fc多肽与靶标结合结构域融合。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的两个Fc多肽各自独立地与靶标结合结构域融合。如图7所示，IgA HetFc结合单元可包含一到四个以多种不同构型与HetFc融合的靶标结合结构域。在某些实施方案中，通过将一个或多个另外的靶标结合结构域与融合到IgA HetFc的靶标结合结构域融合，可以将另外的靶标结合结构域包括在IgA HetFc结合单元中。
根据本公开的IgA HetFc结合单元可以源自单一物种，或者可以是嵌合的或人源化的。例如，IgA Fc多肽可以是人的并且靶标结合结构域可以源自另一个物种，诸如另一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)。
图7是示出包含靶标结合结构域的IgA HetFc构建体(IgA HetFc结合单元)的例示性构型的图。在某些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含一个、两个、三个或四个与IgAHetFc融合的靶标结合结构域。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元具有单臂形式，其中一个Fc多肽与靶标结合结构域融合，并且另一个Fc多肽不与靶标结合结构域融合。
在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含一个与一个Fc多肽(例如，链A)的N末端融合的靶标结合结构域和一个与另一个Fc多肽(例如，链B)的N末端融合的靶标结合结构域(参见例如图7B、图7C)。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含一个与一个Fc多肽(例如链A)的N末端融合的靶标结合结构域和一个与另一个Fc多肽(例如，链B)的C-末端融合的靶标结合结构域(参见，例如，图7F)。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含一个与一个Fc多肽(例如，链A)的C末端融合的靶标结合结构域和一个与另一个Fc多肽(例如，链B)的C末端融合的靶标结合结构域(参见，例如，图7D)。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含与一个Fc多肽的两端(例如与链A的N末端和C末端)融合的靶标结合结构域(参见，例如，图7E)。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含与一个Fc多肽的两端(例如与链A的N末端和C末端)融合的靶标结合结构域和与另一个Fc多肽(例如，链B)的一端(N末端或C末端)融合的靶标结合结构域(参见，例如，图7G)。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元包含与一个Fc多肽的两端(例如与链A的N末端和C末端)融合的靶标结合结构域和与另一个Fc多肽的两端(例如，链B的N末端和C末端)融合的靶标结合结构域(参见，例如，图7H)。还考虑了其他构型，包括串联融合的另外的靶标结合单元。
在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元是双特异性的，即包含两个靶标结合结构域，每个靶标结合结构域均具有不同的特异性。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元是三特异性的，即包含三个靶标结合结构域，每个靶标结合结构域均具有不同的特异性。在一些实施方案中，IgA HetFc结合单元是四特异性的，即包含四个靶标结合结构域，每个靶标结合结构域均具有不同的特异性。通过包含一些串联的靶标结合结构域可以实现更大的特异性。在一些实施方案中，双特异性、三特异性或四特异性IgA HetFc结合单元中的靶标结合结构域中的至少一些靶标结合结构域与同一靶标结合，但是与该靶标上的不同表位结合。在一些实施方案中，双特异性、三特异性或四特异性IgA HetFc结合单元中的靶标结合结构域中的至少一些靶标结合结构域与不同的靶分子结合。
应当注意，IgA HetFc结合单元的特异性不一定与它所含有的靶标结合结构域的数目相关，例如，IgA HetFc结合单元可包含两个靶标结合结构域，但如果这两个靶标结合结构域结合同一靶标，则该IgA HetFc结合单元仍然是单特异性的。
在某些实施方案中，本公开提供包含两个或更多个IgA HetFc结合单元的更高阶IgA HetFc多聚体。在某些实施方案中，本公开的更高阶IgA HetFc多聚体包含两个、四个或五个IgA HetFc结合单元。在某些实施方案中，IgA HetFc多聚体所包含的IgA HetFc结合单元中的至少两个IgA HetFc结合单元是通过它们的尾部由J链连接的。在本文公开的IgAHetFc多聚体中，J链可以是全长的原生J链，但也可以含有氨基酸改变，诸如取代、插入、缺失、截短，具体地包括J链片段，只要J链保持功能性。在某些实施方案中，IgA HetFc多聚体所包含的J链是经修饰的J链，如国际专利公布号WO 2015/153912中所述。在某些实施方案中，J链具有SEQ ID No：48中列出的氨基酸序列。
如上所指出的，本文所述的IgA HetFc结合单元允许组装IgA HetFc多聚体，该多聚体是多聚性且多特异性的。IgA Het Fc多聚体具有微调可增加低亲和力靶标结合结构域的表观亲和力并且增加聚类和特异性以及与价态增加相关的相关功能性的亲合力影响的潜力。图8是示出IgA HetFc多聚体的例示性构型的图。
在一些实施方案中，IgA HetFc多聚体可以是“二聚性的”，因为它包含两个通过J链联接的IgA HetFc结合单元。IgA HetFc结合单元可以是单特异性的，或者它们可以是双特异性的(参见，例如，图8A)，或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的二聚性IgAHetFc多聚体包含两个双特异性IgA HetFc结合单元，每个结合单元均具有相同的结合特异性(AB、AB)。在一些实施方案中，本公开的二聚性IgA HetFc多聚体包含两个双特异性IgAHetFc结合单元，其中该两个结合单元中的至少一个具有不同的结合特异性(例如AB、BC或AC、BC或AB、CD)。因此，在某些实施方案中，该两个结合单元中的每一个均都具有两种特异性，该两种特异性可以相同的(AB、AB)或不同的(例如AB、CD或AB、AC)。
在一些实施方案中，IgA HetFc多聚体可以是“四聚性的”，因为它包含四个IgAHetFc结合单元，其中的至少两个IgA HetFc结合单元是通过J链联接。IgA HetFc结合单元可以是单特异性的，或者它们可以是双特异性的(参见，例如，图8B)，或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的四聚性IgA HetFc多聚体包含四个双特异性结合单元，每个结合单元具有相同的结合特异性(AB、AB、AB、AB)。在一些实施方案中，还考虑了包含呈单特异性或双特异性并具有不同结合特异性的IgA HetFc结合单元的四聚性IgA HetFc多聚体。
在一些实施方案中，IgA HetFc多聚体可以是“五聚性的”，因为它包含五个IgAHetFc结合单元，其中的至少两个IgA HetFc结合单元是通过J链联接。IgA HetFc结合单元可以是单特异性的，或者它们可以是双特异性的(参见，例如，图8C)，或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的五聚性IgA HetFc多聚体包含五个双特异性结合单元，每个结合单元均具有相同的结合特异性(AB、AB、AB、AB、AB)。在一些实施方案中，还考虑了包含呈单特异性或双特异性并且具有不同结合特异性的IgA HetFc结合单元的五聚性IgA HetFc多聚体。
如本文所用的术语“价”表示在IgA HetFc构建体中存在指定数量的结合位点。例如，术语“二价”、“四价”、“六价”、“八价”和“十价”分别表示存在两个结合位点、四个结合位点、六个结合位点、八个结合位点和十个结合位点。因此，参考本文的图8，图8A中所示的包含两个双特异性结合单元的二聚性IgA HetFc多聚体是四价的；图8B中所示的四聚性IgAHetFc多聚体是八价的(即包含四个双特异性结合单元)，并且图8C中所示的五聚性IgAHetFc多聚体是十价的(即包含五个双特异性结合单元)。类似地，参考图7，图7B、7C、7D、7E和7F中所示的IgA HetFc结合单元是二价的，图7G中所示的IgA HetFc结合单元是三价的，并且图7H中所示的IgA HetFc结合单元是四价的。
在IgA HetFc结合单元和多聚体中，不同的组分或结构域可以彼此直接融合(即殳有接头)，或者该组分或结构域中的一个或多个组分或结构域可以经由肽接头间接地与邻接的组分或结构域融合。适用于连接多组分蛋白质的组分的肽接头在本领域中是众所周知的，并且被选择为使得该组分能够排列成使得每个组分仍然可以执行其预期的功能。
肽接头的长度通常介于约2个和约150个氨基酸之间。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸(GlySer)接头，其是本领域众所周知的并且包含以不同顺序组合的甘氨酸和丝氨酸单元。实例包括但不限于(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少为一的整数，通常是介于1和约10之间，例如，介于1和约8之间、介于1和约6之间或介于1和约5之间的整数；(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)n、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)n，其中n是1至5的整数。其他有用的接头包括衍生自免疫球蛋白铰链序列的序列。该接头可以包含来自四种IgG类别中的任何一种类别或来自TCR的铰链序列中的全部或部分铰链序列，并且可以任选地包括另外的序列。例如，接头可包括免疫球蛋白铰链序列和甘氨酸-丝氨酸序列的一部分。非限制性实例是这样的接头，该接头包括IgGl铰链的大约前15个残基，接着是长度为约10个氨基酸的GlySer接头序列(诸如上面描述的那些序列)。
缀合物
本公开的某些实施方案涉及缀合物，其包含与一种或多种活性剂诸如治疗剂、诊断剂或标记剂缀合的如本文所述的IgA HetFc构建体(例如IgA HetFc支架、IgA HetFc结合单元或IgA HetFc多聚体)。
治疗剂的实例包括但不限于抗代谢药、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、毒素、细胞凋亡剂、血栓形成剂、抗血管生成剂、生物反应调节剂、生长因子、放射性材料和用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂。诊断剂的实例包括但不限于各种显像剂，诸如荧光材料、发光材料和放射性材料。标记剂的实例包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。
所选活性剂与IgA HetFc构建体的缀合可以多种方式完成，并且可以是直接缀合或通过接头缀合。用于缀合活性剂的接头是能够将一种或多种活性剂连接至IgA HetFc构建体的双功能性或多功能性部分。双功能性(或单价)接头将单种活性剂连接到构建体上的单个位点，而多功能(或多价)接头将多于一种活性剂连接到构建体上的单个位点。能够将一种活性剂连接至IgA HetFc构建体上的多于一个位点的接头也被认为是多功能性的。
缀合可以例如通过IgA HetFc构建体上的表面赖氨酸、与IgA HetFc构建体上的经氧化碳水化合物还原偶联，或通过IgA HetFc构建体上的由还原链间二硫连键释放的半胱氨酸残基来实现。替代地，缀合可以通过以下方式实现：将IgA HetFc构建体修饰成包含另外的半胱氨酸残基(参见，例如，美国专利号7,521,541、8,455,622和9,000,130)或提供反应性把手(reactive handle)的非天然氨基酸，诸如硒代蛋氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(参见，例如，Hofer等人，2009，Biochemistry，48：12047-12057；Axup等人，2012，PNAS，109：16101-16106；Wu等人，2009，PNAS，106：3000-3005；Zimmerman等人，2014，Bioconj.Chem.，25：351-361)，以允许位点特异性缀合。
用于将各种剂与蛋白质(包括免疫球蛋白)缀合的方法是本领域已知的(参见，例如，Bioconjugate Techniques(GT Hermanson，2013，Academic Press))。
制备IGA HETFC构建体的多核苷酸和方法
本文所述的IgA HetFc构建体可使用标准重组方法来制备。IgA HetFc构建体的重组生产一般涉及合成一种或多种编码IgA HetFc构建体的多核苷酸，将所述一种或多种多核苷酸克隆到一个或多个适当的载体中，以及将所述一个或多个载体引入到合适的宿主细胞中以用于表达所述IgA Fc构建体。蛋白质的重组生产在本领域是众所周知的，并且可使用如例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，(1987年及更新版本)，John Wiley&Sons，New York，NY；以及Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1990)中描述的标准技术来实现。
因此，本公开的某些实施方案涉及编码如本文所述的IgA HetFc构建体的一种经分离的多核苷酸或多核苷酸的集合。在这个背景下的多核苷酸可编码IgA HetFc构建体中的全部或部分IgA HetFc构建体。
术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且指代任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物)的多聚性形式。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源的，或它们的任何组合。
“编码”IgA HetFc构建体的多核苷酸是当置于适当调控性序列的控制下时在体内转录(在DNA的情况下)或翻译(在mRNA的情况下)成多肽的多核苷酸。编码序列的边界由在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3’处。
可使用标准连结技术直接或在一个或多个亚克隆步骤之后将编码IgA HetFc构建体的一种或多种多核苷酸插入到一种或多种合适的表达载体中。合适载体的实例包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或DNA病毒。载体通常被选择为在将被采用的特定宿主细胞中具有功能性，即载体与宿主细胞机制相容，从而允许该一种或多种多核苷酸的扩增和/或表达。在这方面选择适当的载体和宿主细胞组合完全在本领域技术人员的普通技能范围内。
因此，本公开的某些实施方案涉及载体(诸如表达载体)，该载体包含一种或多种编码IgA HetFc构建体的多核苷酸。该一种或多种多核苷酸可被包含在单一载体中，或者包含在多于一种载体中。在一些实施方案中，多核苷酸被包含在多顺反子载体中。
通常，表达载体将含有用于质粒维持以及用于克隆和表达外源性多核苷酸序列的一种或多种调控性元件。此类调控性元件的实例包括启动子、增强子序列、复制起点、转录终止序列、供体和受体剪接位点、多肽分泌的前导序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的多核苷酸的多接头区和选择性标记物。
调控性元件可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即来自除宿主细胞物种或品系以外的物种)、杂交的(即来自多于一种来源的调控性元件的组合)或合成的。因此，调控性元件的来源可以是任何原核或真核生物体，只要侧翼序列在所采用的宿主细胞的机构(machinery)中具有功能性并且可通过所采用的宿主细胞的机构激活。
任选地，载体还可以含有“标签”编码序列。标签编码序列是位于编码异源肽序列的编码序列的5’或3’端的核酸序列，诸如多聚His(例如，6xHis)、HA(血凝素流感病毒)、myc、金属亲和力、亲和素/链霉亲和素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或生物素标签。此标签通常与所表达的多肽保持融合，并且可充当亲和纯化或检测多肽的手段。任选地，可随后通过各种手段，诸如使用某些肽酶进行裂解来从经纯化多肽除去标签。
各种表达载体可容易地从商业来源获得。或者，当无法获得含有所有所需调控性元件的商业载体时，可使用市售载体作为起始载体来构建表达载体。当所需调控性元件中的一种或多种所需调控性元件尚未存在于载体中时，可单独地获得它们并且将它们连接至载体中。用于获得各种调控性元件的方法和来源是本领域技术人员众所周知的。
在构建包含一种或多种编码IgA HetFc构建体的多核苷酸的一种或多种表达载体后，所述一种或多种载体可被插入到合适的宿主细胞中以用于扩增和/或蛋白质表达。将表达载体转化至选定宿主细胞中可通过众所周知的方法来完成，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术。选定的方法将部分地随待使用的宿主细胞的类型而变化。这些方法和其他合适的方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook等人，同上)。
当在适当条件下培养时，宿主细胞表达由载体编码的多肽，并且随后可从培养基(如果宿主细胞分泌该多肽)或直接从产生该多肽的宿主细胞(如果多肽未被分泌)中收集该多肽。宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，酵母、真菌、植物或哺乳动物细胞)。适当宿主细胞的选择可容易地由熟练的技术人员考虑各种因素做出，所述因素如所需表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。
因此，本公开的某些实施方案涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含编码IgA HetFc构建体的一种或多种多核苷酸或一种或多种包含所述一种或多种多核苷酸的载体。在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。
例如，真核微生物如丝状真菌或酵母可用作宿主细胞，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株(参见例如，Gerngross，(2004)，Nat.Biotech.，22：1409-1414和Li等人，(2006)，Nat.Biotech.，24：210-215)。植物细胞也可以用作宿主细胞(参见例如，描述PLANTIBODIESTM技术的美国专利号5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978和6,417,429)。
在一些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。各种哺乳动物细胞系可用作宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚肾系293(如例如在Graham等人，(1977)，J.Gen Virol.，36：59中描述的HEK293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如例如Mather，(1980)，Biol.Reprod.，23：243-251中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HeLa)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如例如Mather等人，1982，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383：44-68中所述)；MRC 5细胞；FS4细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括如在Urlaub等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216中所述的DHFR-CHO细胞)和骨髓瘤细胞系(如Y0、NS0和Sp2/0)。还参见，Yazaki和Wu，2003，Methods in Molecular Biology，第248卷，第255-268页(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，N.J.)。
本公开的某些实施方案涉及制备本文所述的IgA HetFc构建体的方法，其包括用一种或多种编码所述IgA HetFc构建体的多核苷酸(例如呈一种或多种包含一种或多种多核苷酸的载体的形式的多核苷酸)转染宿主细胞，以及在适合于使所编码的IgA HetFc构建体表达的条件下培养所述宿主细胞。
通常，在表达后从宿主细胞分离出IgA HetFc构建体并且可任选地对其进行纯化。用于分离和纯化所表达的蛋白质的方法是本领域中众所周知的。标准纯化方法包括，例如色谱技术，如离子交换、疏水相互作用、亲和、尺寸排阻、凝胶过滤或反相色谱，这些技术可使用诸如FPLC、MPLC和HPLC的系统在常压下或在中等或高压下进行。其他纯化方法包括电泳、免疫学、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩结合也可能是有用的。
本领域中已知多种天然蛋白质结合抗体的Fc区，并且这些蛋白质因此可用于纯化含Fc的蛋白质。例如，细菌蛋白质A和G结合至Fc区。纯化通常可通过如上所述的特定融合配偶体或亲和标签来实现。例如，如果采用GST融合物，可使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His标签，则可以使用Ni+2亲和色谱纯化抗体，或者如果使用Flag标签，则可以使用固定化抗Flag抗体纯化抗体。有用的纯化技术的实例在Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1990)和Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Scopes，Springer-Verlag，NY(1994)中有描述。必要的纯化程度将根据所述IgA HetFc构建体的用途而变化。在一些情况下，可能不需要纯化。
在某些实施方案中，本文的IgA HetFc构建体使用一种或多种本领域已知的纯化方法纯化，该方法包括但不限于亲和色谱、通过非还原CE-SDS进行的亲和色谱、亲和纯化(蛋白A纯化柱、CaptureSelectTM IgA亲和纯化)和分子排阻色谱，例如UPLC-SEC(也参见实施例1-6)。
翻译后等饰
在某些实施方案中，本文所述的IgA HetFc构建体可以经翻译后修饰的。
术语“经翻译后修饰的”及其语法变形诸如“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸的任何这样的修饰，该修饰是在天然或非天然氨基酸已被掺入到多肽链中后发生于此种氨基酸上的。仅举例来说，该术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
翻译后修饰的具体实例包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基团/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解切割或它们的组合。其他实例包括通过已知技术进行的化学修饰，所述已知技术包括但不限于用溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或NaBH4进行的特异性化学切割；乙酰化；甲酰化；氧化；还原或在衣霉素存在下的代谢合成。
另外的翻译后修饰包括化学部分与氨基酸主链的附接、N-连接或O-连接碳水化合物链的化学修饰，以及由原核宿主细胞表达引起的N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。
在某些实施方案中，本文所述的IgA HetFc构建体可任选地用可检测标记诸如酶、荧光、同位素或亲和标记进行修饰，以允许检测和分离蛋白质。合适的酶标记的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母素；并且合适的放射性材料的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙和氟的放射性同位素。
在一些实施方案中，本文所述的IgA HetFc构建体可以任选地附接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
在那些通过自然过程(诸如翻译后加工)或通过化学修饰技术对IgA HetFc构建体进行修饰的实施方案中，相同类型的修饰可以任选地以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点处。
在某些实施方案中，所述IgA HetFc构建体可附接至固体支持物，所述固体支持物特别可用于被本文所述的蛋白质结合或结合至本文所述的蛋白质或与本文所述的蛋白质缔合的多肽的免疫测定或纯化。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯。
IGA HETFC构建体的表征
如本文所述的IgA HetFc构建体可以多种方式表征。例如，IgA HetFc构建体的纯度可使用本领域众所周知的技术来评估，该技术包括但不限于SDS-PAGE凝胶、蛋白质印迹、光密度法、质谱法、尺寸排阻色谱法(SEC)或非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的纯度通过SEC或CE-SDS来评估。
蛋白质稳定性还可以使用一系列本领域已知的技术来表征，该技术包括但不限于分子排阻色谱(SEC)；紫外、可见或圆二色光谱；质谱；微分光散射(DLS)；台面稳定性测定；冻融与其他表征技术相结合；差示扫描量热法(DSC)；差示扫描荧光法(DSF)；疏水相互作用色谱(HIC)；等电聚焦；受体结合测定或相对蛋白表达水平。在某些实施方案中，IgA HetFc构建体的稳定性是通过使用本领域众所周知的技术(诸如DSC或DSF)与野生型CH3结构域解链温度(Tm)相比较地测量CH3结构域Tm来评估。
在适当的情况下，还可以测定本公开的IgA HetFc构建体与配体、受体或靶抗原(例如与FcαRI或与IgA HetFc构建体所包含的结合结构域的靶抗原)特异性地结合的能力。可以采用本领域已知的各种免疫测定来分析特异性结合和交叉反应性，包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定的技术的竞争性和非竞争性测定系统。此类测定在本领域是常规且众所周知的(参见，例如，Ausubel，等人，编著，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，New York)。
还可以任选地测定经证实与靶配体、受体或抗原特异性地结合的IgA HetFc构建体对配体、受体或抗原的亲和力。结合亲和力和诸如相互作用的结合率和解离率的参数可以例如通过竞争性结合测定来确定。IgA HetFc构建体的动力学参数也可以使用本领域已知的基于表面等离子共振(SPR)的测定，诸如BIAcoreTM动力学分析来确定。各种基于SPR的测定是本领域已知的(参见，例如，Mullet，等人，2000，Methods，22：77-91；Dong，等人，2002，Rev.Mol.Biotech.，82：303-23；Fivash，等人，1998，Curr Opinion inBiotechnology，9：97-101；Rich，等人，2000，Curr Opinion in Biotechnology，11：54-61，以及美国专利号6,373,577、6,289,286、5,322,798、5,341,215和6,268,125)。使用本领域技术人员已知的技术的荧光激活细胞分选(FACS)也可用于表征IgA HetFc构建体与细胞表面上表达的分子(例如Fc受体或细胞表面抗原)的结合。用于分选和检查生物细胞的流式细胞仪是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利号4,347,935、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796和6,211,477)。其他已知的流式细胞仪是由Becton Dickinson andCompany(Franklin Lakes，NJ)制造的FACS VantageTM系统和由Union Biometrica(Holliston，MA)制造的COPASTM系统。结合亲和力和动力学的详细描述可见于Paul，WE，编者，1999，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia中，该书专注于抗体-免疫原相互作用。
IgA HetFc构建体的结合特性也可以通过用于确定一种或多种FcαRI下游功能的体外功能性测定来表征(参见，例如，Bakema，2006，J Immunol，176：3603-3610)。
使用方法
本公开的某些实施方案涉及本文所述的IgA HetFc构建体在治疗或诊断方法中的用途。例如，IgA构建体可用于经由FcαRI接合嗜中性粒细胞的方法，以及经由FcαRI激活嗜中性粒细胞的方法。
包含一个或多个结合结构域的IgA HetFc构建体和缀合至治疗剂的IgA HetFc构建体可用于例如治疗患有癌症、自身免疫性疾病、免疫或炎性病症或感染性疾病的受试者的治疗方法。同样地，包含一个或多个结合结构域的IgA构建体和与标记剂或诊断剂缀合的IgA HetFc构建体可用于例如诊断患有癌症、自身免疫性疾病、免疫或炎性病症或感染性疾病的受试者的诊断方法。
当用于治疗方法时，IgA HetFc构建体以治疗有效量施用于受试者。如本文所用的术语“治疗有效量”是指将实现所叙述的方法的目标，例如，一定程度上减轻正在治疗的疾病或病症的症状中的一种或多种症状的所施用的本文所述的IgA HetFc构建体或包含本文所述的IgA HetFc构建体的组合物的量。将有效治疗所讨论的疾病或病症的本文所述组合物的量可以通过标准临床技术来确定。另外，可任选地采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。要在制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和所述疾病或病症的严重性，并应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。
在IgA HetFc构建体被用于治疗方法的一些实施方案中，IgA HetFc构建体可以与治疗有效量的一种或多种本领域技术人员已知用于治疗所讨论的疾病或病症的另外的治疗剂组合施用。
期望的治疗效果包括但不限于以下中的一者或多者：缓和症状、削减疾病或病症的任何直接或间接的病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或缓减疾病状态、提高存活率、缓解、改善预后或延迟疾病复发。
药物组合物
对于治疗或诊断用途，IgA HetFc构建体可以包含IgA HetFc构建体和药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物的形式提供。所述组合物可使用众所周知的和容易获得的成分通过已知程序制备，并且可被配制用于通过例如经口(包括例如经颊或舌下)、局部、胃肠外、直肠或阴道途径、或通过吸入或喷雾施用于受试者。如本文所用的术语“胃肠外”包括通过皮下、真皮内、关节内、静脉内、肌内、血管内、胸骨内或鞘内途径注射或输注。
所述组合物通常将配制成适于通过选择的途径施用于受试者的形式，例如呈糖浆剂、酏剂、片剂、糖锭剂、锭剂、硬胶囊或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性悬浮液、可分散性粉剂或颗粒剂、乳液、注射剂或溶液的形式。组合物可作为单位剂量制剂提供。
药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒。此类载剂的实例包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量(小于约10个氨基酸)多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物，如Zn-蛋白质络合物；和非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，所述组合物可呈无菌可注射水性或油性溶液或悬浮液的形式。可使用本领域已知的合适的分散剂或润湿剂和/或助悬剂配制此类溶液或悬浮液。无菌注射溶液或悬浮液可包含在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的IgA HetFc构建体。可采用的可接受的稀释剂和溶剂包括例如1，3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液。另外，可采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸在可注射制剂中获得使用。如本领域中已知的佐剂，如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂也可包含在可注射溶液或悬浮液中。
其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如在“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”(原名“RemingtonsPharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA(2000)中进行了描述。
药盒和制品
本公开的某些实施方案涉及药盒，其包括一种或多种本文所述的IgA HetFc构建体。药盒的各个组分将被包装在单独的容器中，并且此类容器可以随附有监管药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了该机构对制造、使用或销售的批准。所述药盒可任选地含有概述所述IgA HetFc构建体的使用方法或施用方案的说明或指南。
当药盒的一种或多种组分以溶液(例如水溶液或无菌水溶液)的形式提供时，容器装置本身可以是所述溶液可从中被施用于受试者或施加于药盒的其他组分中并与药盒的其他组分混合的吸入器、注射器、移液管、滴眼管或其他此类类似的器具。
所述药盒的组分还可以以干燥的或冻干的形式提供，并且所述药盒可以另外地含有用于重构冻干组分的合适溶剂。不管容器的数量或类型如何，本文所述的药盒还可以包括用于帮助将组合物施用于患者的器械。此类器械可以是吸入器、鼻喷雾装置、注射器、移液管、镊子、量匙、滴眼管或类似的医学上批准的递送媒介物。
某些实施方案涉及含有可用于治疗如本文所述的患者的材料的制品。所述制品包括容器和位于所述容器上或所述容器随附的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和静脉内溶液袋等。该容器可由各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有自身或与另一种组合物组合可有效治疗患者的包含IgA HetFc构建体的组合物，并且可以具有无菌接入端口(access port)(例如，该容器可以是具有用皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。该标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选的病状。制品还可以包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer′s)溶液或右旋糖溶液。该制品还可以任选地包括在商业和使用者看来所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
提供以下实施例是为了说明的目的而非意图以任何方式限制本发明的范围。
表7：包含核心突变的IgA HetFc设计
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表8：包含核心突变与链B中位置6079处的突变的组合的IgA HetFc设计
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表9：包含核心突变与链B中位置6088处突变组合的IgA HetFc设计
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表10：包含核心突变与链B中位置6079和6088处的突变的组合的IgA HetFc设计
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实施例
实施例1：先手IGA异二聚体设计的经由电脑模拟选择
此实施例描述用于驱动IgA Fc二聚体的异二聚化超过同二聚化的潜在IgA Fc Cα3(CH3)突变的经由电脑模拟分析和选择。
方法
在IgA Fc的CH3：CH3界面的广泛结构分析中(PDB ID：2QEJ，Ramsland等人，2007，Proc Natl Acad Sci USA 104：15051-15056)，界面中的残基是根据它们对二聚化的能量贡献进行表征。为此，将用于分析连通性以及根据基于知识和基于物理的电位的结构能量学(energetics)的专有工具用于静态结构以及50ns显式分子动力学轨迹。在这一初步分析结果的指导下以及在第一轮“负设计”中，选择残基以用于引入预计会破坏二聚化的突变。这些突变是根据图1所示的两个主要设计概念选择的。负静电设计依赖于跨界面引入相同电荷对和相关排斥，而负空间设计则基于在界面中引入空腔或空间冲突(steric clash)。使用专有的经由电脑模拟工具对这些负设计进行建模和评价。在第二个“正设计”步骤中，引入了另外的突变，目的是恢复异二聚化。异二聚性复合物的稳定化是基于跨界面经由相反电荷引入盐桥或由界面另一侧上的空腔容纳具有大侧链的残基。选择同二聚体和异二聚体之间具有最大能量差异的设计进行表达和评价。
结果
基于所分析度量的先导设计的突变在表11中示出。选定的用于同二聚性和异二聚性先导设计模型的经由电脑模拟度量集合在表12中示出。能量是相对于野生型的。负能量表示有利的相互作用，正能量表示不受欢迎的相互作用。
值得注意的是，同二聚体和异二聚体之间具有最大能量差异的空间设计集中在链A中位置A6085Y和T6086处的大型疏水侧链的突变以及W6081与相对的链B上小型残基的交换。先导设计(空间6)的实例示于图9，其中大型疏水残基是在链A中位置6085Y和6086处引入的，而空腔则是通过W6081与链B中苏氨酸的交换创建的。虽然空间6包括两个另外的链B突变，但是是位置6081处的色氨酸被具有较小侧链的残基取代导致产生用于容纳在链A中位置6085Y和6086处引入的大型疏水残基的空腔。这三个突变一起被认为产生了有利于异二聚体形成的主要空间设计。因此，位于这三个位置处的突变(A：6085Y和6086，B：6081)被认为构成了用于促进IgA Fc异二聚体形成的最小核心突变集合。具体而言，核心突变集合是：含有更大且/或更疏水的侧链的残基对链A中的A6085Y和T6086中的每一者的取代与具有更小侧链的残基对链B中的W6081的取代的组合。通过经由电脑模拟分析预测适合于在位置6085Y和6086处引入的更大且/或更疏水的残基包括F、Y、M、W和H，而通过经由电脑模拟分析预测适合于在位置6081处引入的更小残基包括T、L、A、V和I。
表11：先导设计中的突变
表12：用于先导设计选择的示例性度量
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1是指如表11中所定义的那样探究的复合体中使用的链。A/A和B/B是被设计为不受欢迎的同二聚体，A/B和B/A是指被设计为受欢迎复合体的异二聚体。
2Δ是指所报告的度量与野生型(WT)IgA CH3同二聚体相比的差异。
3与WT复合体相比链A和链B相互作用的能量学的度量报告。负值表示与WT复合体相比更有利的相互作用，正值表示与WT复合体相比不太有利的相互作用。
4SASA＝溶剂可及表面积。负值表示与WT复合体相比SASA的损失，其一般与更好的填充和更有利的相互作用有关。正值表示与WT复合体相比SASA的增加，其一般与更差的填充和不太有利的相互作用有关。
5最大范德华(vdW)冲突范围的度量报告。高值一般与较差的结构模型质量相关，并且不太可能产生稳定的复合体，而低值与良好的模型质量和其他度量的高预测能力相关。
实施例2：使用异二聚性IGA FC生成单臂抗体(OAA)构建体
将如实施例1中所述的那样预测会驱动异二聚化的突变引入到含有IgA Fc的单臂抗体构建体中以评估它们的功能性。
方法
为了评估旨在驱动IgA Fc异二聚性配对的突变的有效性，设计了两个半部之间具有显著重量差异的IgA单臂抗体形式。一个半抗体由基于IgG1的抗Her2 Fab(重链：SEQ IDNO：38，轻链：SEQ ID NO：39，Carter，等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA，89：4285-4289)组成，该基于IgG1的抗Her2 Fab在重链中与IgA Fc融合。包含N末端附接到IgA2铰链(SEQID NO：41)的上IgG1铰链(SEQ ID NO：40)的嵌合铰链被用于将IgG1 Fab连接至IgA2 Fc。IgA Fc的序列类似于IgA2ml同种异型的CH2和CH3结构域的序列(Chintalacharuvu，等人，1994，JImmunol，152：5299-5304)。使与WT IgA中的分泌区室附接的位置C5092(如表2所示的IMGT编号)以及N5120糖基化位点发生突变，并且移除α-尾部，从而使构建体以G6129结尾，如Lohse等人，2016，Cancer Res，76：403-417中所述(参见表4中的SEQ ID NO：43)。
单臂抗体形式的另一半仅由与没有Fab的IgA2ml CH2和CH3融合的IgA2铰链(SEQID NO：41)组成。还包括与上面的重链中相同的Fc突变。在实施例1中预测驱动异二聚性配对并且在表11中列出的突变被引入到单臂抗体构建体的Fc的CH3结构域中，并且产生表13中描述的变体。在包括VH和CH1的重链(H1)中引入链A突变，并且在仅Fc的重链中引入链B突变。
表13：OAA形式的异二聚性IgA变体
实施例3：异二聚性IGA单臂抗体的生产
将实施例1和2中设计的经修饰的IgA OAA变体的重链和轻链序列克隆到表达载体中，并且如下所述的那样对该序列进行表达和纯化。
方法
将包含信号肽(EFATMRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO：49])(Barash等人.，2002，Biochem and Biophys Res.Comm.，294：835-842)和实施例2中所述重链和轻链序列的载体插入物连结到pTT5载体中以产生重链和轻链表达载体。对载体进行测序以确认编码DNA的正确阅读框和序列。
使经修饰的IgA OAA变体的重链和轻链以及仅含Fc的链在25mL Expi293FTM细胞(Thermo Fisher，Waltham，MA)的培养物中共表达。将Expi293TM细胞在以125rpm转动的定轨振荡器上在Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)中在8％CO2的增湿气氛中在37℃下进行培养。将总细胞计数为7.5×107个细胞的25ml体积以H1∶L1∶H2为30∶40∶30的转染比用总计25μg DNA转染。在转染之前，将DNA稀释于1.5mL Opti-MEMTM I还原血清培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)中。在体积为1.42mL的Opti-MEMTM I还原血清培养基中稀释80μL ExpiFectamineTM 293试剂(Thermo Fisher，Waltham，MA)，并在温育五分钟后，将该试剂与DNA转染混合物合并至总体积3mL。在10至20分钟后，将DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物添加到细胞培养物中。在37℃下温育18-22小时后，将150μL ExpiFectamineTM 293增强剂1和1.5mL ExpiFectamineTM 293增强剂2(Thermo Fisher，Waltham，MA)添加到每种培养物中。将细胞培养5至7天并收获上清液用于蛋白质纯化。
将经澄清的上清液样本用PBS 1：1稀释，并且施加于AKTATM Pure FPLC System(GELife Sciences)上Millipore Vantage L x 250柱中内部填充的2mL CaptureSelectTM IgA亲和基质(ThermoFisher，Waltham，MA)上。将该柱在PBS中平衡。加载后，用PBS洗涤该柱并用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱蛋白质。通过添加10％(v/v)1M Tris，pH 9调节经洗脱的样本的pH值以产生6-7的最终pH值。如实施例4中所述的那样在通过非还原CE-SDS和UPLC-SEC进行亲和色谱后评估变体的异二聚性纯度。
在浓缩并将异二聚性Fc物质与同二聚性Fc物质和其他杂质分离后，将具有大量异二聚性物质的变体材料注入到AKTATM Pure FPLC系统(GE Life Sciences)中并且在用PBSpH 7.4预平衡的Superdex 200Increase 10/300GL(GE Life Sciences)柱上运行。将蛋白质以0.75mL/min的速率从柱中洗脱，并以0.5mL的级分收集。汇集靶蛋白浓度为>0.5mg/mL并且CD-SDS纯度为>95％的峰值级分，并使用VivaspinTM 20，30kDa MWCO聚醚砜浓缩器(MilliporeSigma，Burlington，MA)对该峰值级分进行浓缩。通过含有SuporTM膜的0.2μmPALL AcrodiscTM注射器式过滤器无菌过滤后，基于A280nm(Nanodrop)对蛋白质进行定量，将该蛋白质冷冻并储存在-80℃直至进一步使用。
结果
静电设计突变的纳入没有导致具有可检测表达的变体，这表明这些突变具有破坏性。相反，所有空间设计在所测试条件下都显示出表达，并且十种设计被纯化并被进一步探究(空间1至4、空间6至11)。虽然这些变体的一些样本在亲和色谱后显示出高纯度的异二聚性物质，但由于存在同二聚性Fc物质以及诸如半抗体和聚集体的其他杂质，因此大多数情况下需要制备型SEC来获得高纯度样本(参见实施例4)。在对空间1至3和空间6至11设计以及WT IgA Fc OAA进行制备型SEC后，得到30-200mg/L的表达培养物。样本纯度和稳定性的评估描述于实施例4、实施例5和实施例6中。
实施例4：亲和色谱后先导设计的异二聚性纯度评估
在CaptureSelect IgA亲和纯化之后并且在SEC纯化之前，通过非还原CE-SDS和UPLC-SEC评估OAA变体的异二聚性纯度和样本同质性。
方法
纯化后，使用CaliperGXII(Perkin Elmer，Waltham，MA)通过非还原和还原高通量蛋白表达测定法评估样本纯度。根据HT Protein Express/>用户指南第2版执行程序，并进行了以下修改。向96孔板(BioRad，Hercules，CA)中的不同孔添加2ul或5ul(浓度范围5-2000ng/ul)的抗体样本以及7ul HT Protein Express样本缓冲液(Perkin Elmer#760328)。然后将样本在90℃下变性5分钟，并向每个样本孔中加入35μl水。使用HT Protein Express Chip(Perkin Elmer#760499)和HT Protein Express 200检测设置(14kDa-200kDa)运行/>器械。
在Agilent Technologies 1260Infinity LC系统上使用Agilent TechnologiesAdvanceBio SEC 300A柱在25℃下进行UPLC-SEC。进样之前，将样本在10000g下离心5分钟，并进样5μL到柱中。在PBS，pH 7.4中以1mL/min的流速运行样本7分钟，并通过190-400nm处的UV吸光度监测洗脱。提取280nm处的色谱图。峰积分是使用OpenLAB CDS ChemStation软件进行。
结果
WT IgA OAA(v32595)的非还原CE-SDS分析显示出同二聚性全尺寸抗体(FSA)与Fc和异二聚性OAA物质的混合物(图2)。异二聚性物质最突出，存在的每种同二聚性物质均较少。这是在不存在任何促进异二聚体形成的突变的情况下两个Fc链以等摩尔表达的物质预期分布(Ridgway，等人，1996，Protein Eng，9：617-621)并且也通过UPLC-SEC观察到了这种分布(图3A)。
包含促进异二聚体形成的突变的变体如与WT IgA OAA相比在非还原CE-SDS(图2)和UPLC-SEC(图3)中显示出明显不同的物质分布。虽然图2和图3中所示的空间设计中的任一空间设计不存在FSA同二聚体，但除了OAA异二聚体之外，还可以发现不同水平的Fc同二聚体和半抗体物质。最值得注意的是，空间3(v32518；图3D)和空间6(v32521；图3F)设计显示具有空间6的OAA异二聚性物质的纯度显著增加，达到根据CE-SDS和UPLC-SEC都>95％的异二聚性纯度。相反，空间4(v32519；图3E)不含OAA异二聚体或FSA同二聚体物质，而仅含有Fc同二聚体和相应的半抗体，这表明另一条重链的表达的问题可能是引入的突变所致。在保留时间＜3min处存在小峰指示在所有样本中都存在少量高分子量物质，诸如低聚物和聚集体。
实施例5；分子排阻色谱后先导设计的异二聚性纯度的评估
在对选定设计进行SEC纯化后，如下所述通过非还原以及还原CE-SDS和UPLC-SEC评估样本的同质性。
方法
非还原CE-SDS和UPLC-SEC如实施例4中所述的那样进行。对于还原条件下的电泳分析，通过将3.5μL DTT(1M)添加到100μL HT蛋白表达样本缓冲液中来修改CE-SDS方案.
结果
如实施例3所述的那样通过SEC纯化的异二聚性OAA样本的UPLC-SEC迹线和CE-SDS电泳图谱(还原和非还原)分别示于图4和图5中。UPLC-SEC分析显示样本高度均匀，含有90％-100％的异二聚性OAA物质。与主要物质相比在较低保留时间处存在小峰和在较高保留时间处存在肩峰表明在WT IgA(图4A)、空间1(图4B)和空间2(图4C)设计中存在少量同二聚体。在SEC纯化后，非还原CE-SDS显示所有所探究的变体都有单个主要物质。通过还原CE-SDS仅观察到对应于所有变体的三个完整链的条带。值得注意的是，轻链和仅含Fc的重链具有相似的分子量(23.4kDa和23.7kDa)，并且在还原CE-SDS谱中以一个条带出现。
实施例6：先导IGA异二聚体设计的热稳定性
如下所述的那样通过差示扫描量热法(DSC)评估制备型SEC之后异二聚性OAA变体的经纯化样本的热稳定性。
方法
在如实施例3所述的制备型SEC之后，将异二聚性OAA设计的样本在PBS中稀释至0.5-1mg/ml。对于使用NanoDSC(TA Instruments，New Castle，DE，USA)的DSC分析，将950ul样本和匹配缓冲液(PBS)分别添加到样本和参考96孔板中。在DSC运行开始时，进行缓冲液(PBS)空白进样以稳定基线。然后进样每个样本，并使用60psi氮气压力以1℃/min速率从25℃扫描至95℃。使用NanoAnalyze软件分析热分析图。将匹配缓冲液热分析图从样本热分析图和使用S形曲线的基线拟合中减去。然后用两态缩放DSC模型对数据进行拟合。
结果
具有未经修饰的IgA CH3-CH3界面的WT IgA OAA(v32595)的DSC热分析图显示在74℃和81℃处有两个转变(图6A)。在81℃处更显著的转变在所有所探究的设计中都存在，并且归因于Fab的展开与CH2结构域的展开的重叠，这两者在设计中都没有发生突变。相反，观察到跨设计变化的转变，其被归因于CH3结构域的展开(图6A至图6B)。虽然空间2(v32517)中经修饰的CH3与WT相比显著去稳定化(Tm为55℃对比74℃)，但具有最高异二聚性纯度的设计显示出接近WT的CH3稳定性。对于空间3(v32518)和空间6(v32521)，分别在65.9℃和71.9℃处观察到转变。显示出最高热稳定性的两种设计是空间10(v33333)和空间11(v33334)，它们分别具有在72.0℃和73.6℃处观察到的CH3展开转变。虽然观察到这种更高的热稳定性，但如在实施例4中通过CE-SDS和UPLC-SEC所评估，这两种设计的异二聚性纯度低于空间3和空间6的异二聚性纯度。
总之，在IgA CH3结构域中鉴定出了显著推动IgA Fc的异二聚体形成的突变组合。对于空间6(v32521)、空间10(v33333)和空间11(v33334)设计，携带这些突变的异二聚性变体的CH3结构域的热稳定性在WT IgA CH3的约2℃范围内。所测试的空间设计的特性总结于表14。
实施例7；IGA HETFC设计的进一步稳定化
为了经由跨界面的共价二硫键增加先导IgA HetFc设计的热稳定性和异二聚性纯度，在IgA Fc的CH3界面中引入了半胱氨酸突变。
方法
IgA Fc界面中的残基对是根据被确定为足以容纳二硫键几何结构的Cα和Cβ距离来选择的。然后将选定的残基用半胱氨酸残基取代，并且对所得共价二硫键进行建模。使用专有的经由电脑模拟工具对所得结构进行了能量评价。
结果
半胱氨酸取代被引入到空间6设计中，并通过专有的经由电脑模拟工具进行评价。选定设计的示例性度量示于表15。然后将半胱氨酸取代作为空间6的OAA形式中的单二硫化物设计和双二硫化物设计以及WT OAA中的单二硫化物设计引入(表16)。
将对表16中所示的变体进行表达并评价它们的异二聚性纯度和热稳定性。虽然如通过UPLC-SEC和CE-SDS评估的基于空间6的设计(34688至34690)的高异二聚性纯度与空间6的异二聚性纯度相比有望得以保留(如在CaptureSelect IgA纯化后通过UPLC-SEC和CE-SDS评估的>90％，参见实施例6)，但由于界面中添加了一个或两个共价二硫键，预计如通过DSC所测量的这些设计的热稳定性与空间6相比时显著增加(>71℃，参见实施例6)。当在其他方面无变化的WT IgA Fc(34691)中以不对称方式引入单二硫化物设计时，如通过UPLC-SEC和CE-SDS所评估的异二聚性纯度与WT IgA相比有望显著提高(如CaptureSelect IgA纯化后通过UPLC-SEC和CE-SDS评估的>50％，参见实施例6)，并且预测热稳定性等于或高于WT(>74℃，参见实施例6)。
也可以将所鉴定出的二硫化物设计与实施例1至6中鉴定出的其他先导HetFc设计组合，如实施例2至6中所述的那样使该二硫化物设计以OAA形式表达，对该二硫化物设计进行纯化并且评估它的异二聚性纯度以及热稳定性。
表15：用于二硫键设计选择的示例性度量
1Δ是指所报告的度量与WT IgA CH3同二聚体相比的差异。
2与WT复合体相比的链A和链B相互作用的非共价能量学的度量报告。负值表示与WT复合体相比更有利的相互作用，正值表示与WT复合体相比不太有利的相互作用。不包括由共价二硫桥的形成所提供的能量差异。
3二硫键中二面角应变的度量报告。较小的值指示较小的角应变。
4对于低于针对不同类型相互作用所定义的距离截止值的重原子之间的距离，标记为冲突。
表16：包含二硫键的选定异二聚性IgA变体
实施例8：基于IGA HETFC的多聚性多特异性形式
可使用实施例1至7中描述的驱动IgA Fc异二聚性配对的突变构建多聚性多特异性变体，然后可测试这些变体的靶标结合和功能性。
方法
包含C末端尾部(SEQ ID NO：46或47)的IgA1、IgA2m1或IgA2m2Fc的两条链在CH3结构域中配备有如实施例1至6和表11中所述的驱动异二聚体形成的突变，以形成核心IgAHetFc支架。将对一个靶标具有特异性的结合结构域(例如Fab、scFv、VHH、免疫调节Ig结构域、非Ig病毒受体诱饵以及如本文别处所述)经由IgA1、IgA2或IgG1/IgA2嵌合铰链连接到其中一条IgA HetFc链的N末端，同时使用相同的铰链将对另一个靶标具有特异性的第二结合结构域连接到IgA HetFc的另一条链的N末端。然后将得到的两条链连同联接链(J链)以及完成IgA HetFc构建体所需的任何另外的多肽链(例如用于完成用作靶向结构域的Fab的其他链)一起在哺乳动物表达系统中进行瞬时表达。根据用于Fc的IgA同种异型和J链与IgAFc链的比率，这导致二聚性、四聚性或五聚性分子的形成(Lombana等人，2019，MAbs，11：1122-1138，Kumar，等人，2020，Science，367：1008-1014)，其中二聚性、四聚性或五聚性IgAHetFc多聚体的每个IgA HetFc结合单元具有两个结合结构域(参见图8)。在通过CaptureSelectTM IgA亲和色谱纯化后，通过非还原和还原SDS-PAGE或CE-SDS、UPLC-SEC、多角度光散射(MALS)或动态光散射(DLS)中的一者或多者评估样本的纯度和粒径同质性。如果需要，如实施例3中所述的那样通过SEC对样本进行进一步纯化，并且如前所述的那样评估它们的样本质量。然后通过表面等离子共振(SPR)、流式细胞术或对靶标具有特异性的功能性测定中的一者或多者来测试样本的靶标结合。
结果
虽然基于IgA1和IgA2ml HetFc的IgA HetFc多聚体变体将主要是二聚性的，但基于IgA2m2 HetFc的那些将显示出可通过SEC分离的二聚性的、四聚性的和五聚性的物质。在针对单个靶标的结合研究中，与单价结合相比的表观亲和力增加预计是由多聚性支架所提供的亲合力所致。当两个靶标都存在于结合测定中时，预计这种亲合力对表观亲和力的影响会进一步增强。当与基于IgG的单体性双特异性抗体相比时，具有不断增加的价态的IgAHetFc多聚体(单体＜二聚体＜四聚体＜五聚体)应该展现出依次增强的表观亲和力。总而言之，这种亲合力影响预计会导致对结合靶标的高特异性和高有效性，这在如前面所见的功能性研究中得到反映(Slaga等人，2018，Sci Transl Med，10(463)：eaat5775；国际专利公布号WO 2016/141303和WO 2016/118641)。当用于靶向病毒或细菌病原体时，IgA HetFc多聚体的高价态预计会导致一个或多个靶标的凝集和清除，而多特异性会限制突变逃逸并确保始终如一的高水平中和。
实施例9：包含用于消除与FCαRI结合的突变的异二聚性IGA FC
为了评估FcαRI经由IgA Fc的接合的价态对其功能性的影响，使用基于实施例1至7中描述的突变的异二聚性IgA Fc来构建具有单个FcαRI结合位点的IgA Fc。
方法
将已被鉴定为破坏IgA Fc：FcαRI相互作用的突变(F6116A，Posgai，M.T.等人，2018，Proc NatlAcad Sci USA 115：E8882-E8891)引入到空间6设计的OAA变体的一条或两条重链中(表17)。然后如实施例3至6中所述的那样表达和纯化这些变体以及野生型空间6OAA(32521)。其他构建体可包括突变的组合，从而在异二聚性IgA Fc的两条链上实现不同的FcαRI亲和力。可能的组合示于表18。可以评价这些变体与FcαRI的结合和嗜中性粒细胞活化。含有两个、一个FcαRI结合位点或不含FcαRI结合位点的变体的示意图示于图11中。
表17：基于在FcαR结合位点中包含突变的空间6OAA的异二聚性IgA变体
表18：IgA HetFc中FcαRI亲和力的可能组合
链A FcαRI亲和力 链B FcαR亲和力
与WT相比增大 与WT相比增大
与WT相比增大 WT
与WT相比增大 与WT相比减小
与WT相比增大 消除
WT 与WT相比增大
WT WT
WT 与WT相比减小
WT 消除
与WT相比减小 与WT相比增大
与WT相比减小 WT
与WT相比减小 与WT相比减小
与WT相比减小 消除
消除 与WT相比增大
消除 WT
消除 与WT相比减小
消除 消除
结果
具有旨在增加、降低或消除结合的经修饰的FcαRI结合位点的变体预计与WT IgAFc相比会显示出一系列与FcαRI的亲和力以及一系列在嗜中性粒细胞活化测定中的活性。虽然两条链中的敲除突变预计会消除结合和嗜中性粒细胞活化，但两条链中旨在增加FcαRI结合的突变预计会增加结合和嗜中性粒细胞活化并且构成最高可能的活性。示于表18中的所有其他组合预计会显示出介于这些限值之间的水平的结合和嗜中性粒细胞活化。
实施例10：包含FCARI和FCRN结合位点的异二聚性IGA FC
使用实施例1至7中描述的驱动异二聚性IgA Fc的组装的突变构建能够经由FcαRI激活嗜中性粒细胞并且由于存在FcRn结合位点而具有增加的半衰期的基于IgA的变体。
方法
将对IgG Fc与新生儿Fc受体(FcRn)结合重要的残基(Oganesyan，V.等人，2014，JBiol Chem 289：7812-7824)接枝到异二聚性IgA变体上，以创建能够与FcRn以及FcαRI结合的构建体。异二聚性Fc是必需的，因为FcαRI和FcRn结合位点分别位于IgA和IgG中CH2/CH3界面处结构等效的位置处(Kelton，W.等人，2014，Chem Biol 21：1603-1609)。FcRn结合位点的接枝是通过IgA和IgG Fc的肽主链原子的叠加以及IgA中与IgG：FcRn结合补丁在结构上等同的残基的鉴定来实现的。然后将这些结合位点交换成它们的IgG对应物。可替代地，可以包括已知改变IgG中的FcRn亲和力的突变(Robbie，G.J.等人，2013，AntimicrobAgents Chemother 57：6147-6153；Yeung，Y.A.等人，2009，J Immunol 182：7663-7671；Hinton，P.R.等人，2006，J Immunol 176：346-356；Hinton，P.R.等人，2004，J Biol Chem279：6213-6216；1Dall′Acqua，W.F.，Kiener，P.A.&Wu，H.，2006，J Biol Chem 281：23514-23524)。使用专有的经由电脑模拟工具对多种设计进行能量评价。对它们进行表达、纯化，然后评估它们与FcαRI和FcRn的结合以及体外嗜中性粒细胞活化和体内半衰期。此种变体的示意图示于图12中。
结果
与不含FcRn结合位点的IgA Fc相比时，实现与FcαRI和FcRn结合的变体预计会在嗜中性粒细胞ADCC测定中显示出活性以及在体内模型中显示出显著增加的FcRn半衰期。
序列表
本文所述的克隆的SEQ ID NO的简要说明提供于表A中。每个SEQ ID NO的氨基酸序列提供于表B中。
表A：用于制备IgA HetFc构建体的克隆的简要说明(另见表13和表16)
*Tras-曲妥珠单抗
表B：氨基酸序列
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应当理解，本文所述的方法和组合物不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，并且因此可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并非旨在限制本文所述的方法和组合物的范围，本文所述的方法和组合物的范围只受所附权利要求书限定。
本说明书中提及的所有专利、专利申请、出版物和数据库条目的公开内容特此明确地以引用的方式整体并入，其并入程度就如同明确且单独地指示每个这种单独专利、专利申请、出版物和数据库条目以引用的方式并入一般。

Claims (47)

1.一种IgA异二聚性Fc(IgA HetFc)构建体，其包含第一Fc多肽和第二Fc多肽，所述第一Fc多肽包含第一CH3结构域序列，并且所述第二Fc多肽包含第二CH3结构域序列，所述第一和第二CH3结构域序列形成经修饰的CH3结构域，
其中所述第一和第二CH3结构域序列包含促进异二聚性Fc的形成超过同二聚性Fc的形成的氨基酸突变，
其中：
所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括选自A6085YF、A6085YY、A6085YM、A6085YW和A6085YH的位于位置A6085Y处的氨基酸取代，以及选自T6086Y、T6086F、T6086M、T6086W和T6086H的位于位置T6086处的氨基酸取代，并且
所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括选自W6081T、W6081L、W6081A、W6081V和W6081I的位于位置W6081处的氨基酸取代，
其中所述异二聚性Fc是以70％或更高的纯度形成，
并且其中氨基酸位置的编号是根据IMGT编号。
2.根据权利要求1所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的CH3结构域具有60℃或更高的解链温度(Tm)。
3.根据权利要求1所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的CH3结构域具有为相应的野生型IgA CH3结构域的所述Tm的+10℃的解链温度(Tm)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述位于位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF、A6085YY或A6085YW。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述位于位置A6085Y处的氨基酸取代是A6085YF或A6085YY。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述位于位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y、T6086F或T6086W。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述位于位置T6086处的氨基酸取代是T6086Y。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述位于位置W6081处的氨基酸取代是W6081T或W6081L。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括氨基酸取代A6085YF和T6086W，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括氨基酸取代W6081T或W6081L。
10.根据权利要求9所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括氨基酸取代W6081T。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自L6079V、L6079T、L6079A和L6079I的位于位置L6079处的氨基酸取代。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自L6079V和L6079T的位于位置L6079处的氨基酸取代。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自I6088L、I6088A、L6088V和L6088T的位于位置I6088处的氨基酸取代。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括氨基酸取代I6088L。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自T6022V、T6022I、T6022L和T6022A的位于位置T6022处的氨基酸取代。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自T6022V、T6022I和T6022L的位于位置T6022处的氨基酸取代。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自L6007F、L6007Y、L6007M、L6007W、L6007H和L6007I的位于位置L6007处的氨基酸取代。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括氨基酸取代L6007F。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括氨基酸取代H6005Y。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括选自H6005Y、H6005F、H6005M和H6005W的位于位置H6005处的氨基酸取代。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变进一步包括氨基酸取代H6005Y。
23.根据权利要求1至10中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的CH3结构域进一步包含用于引入半胱氨酸残基的氨基酸取代，所述半胱氨酸残基能够形成二硫键。
24.根据权利要求23所述的IgA Het Fc构建体，其中所述经修饰的CH3结构域包含用于引入在所述经修饰的CH3结构域中形成一个二硫键的半胱氨酸残基的两个氨基酸取代，或用于引入在所述经修饰的CH3结构域中形成两个二硫键的半胱氨酸残基的四个氨基酸取代。
25.根据权利要求23所述的IgA Het Fc构建体，其中所述用于引入半胱氨酸残基的氨基酸取代包括位于一个CH3结构域序列中的突变H6005C以及位于另一个CH3结构域序列中的突变P6010C。
26.根据权利要求23所述的IgA HetFc构建体，其中所述用于引入半胱氨酸残基的氨基酸取代包括位于一个CH3结构域序列中的突变H6005C和P6010C以及位于另一个CH3结构域序列中的突变P6010C和H6005C。
27.一种IgA异二聚性Fc(IgA HetFc)构建体，其包含第一Fc多肽和第二Fc多肽，所述第一Fc多肽包含第一CH3结构域序列，并且所述第二Fc多肽包含第二CH3结构域序列，所述第一和第二CH3结构域序列形成经修饰的CH3结构域，
其中所述第一和第二CH3结构域序列包含促进异二聚性Fc的形成超过同二聚性Fc的形成的氨基酸突变，
其中：
(a)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YY和T6086L，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079T、W6081L和I6088L；或者
(b)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YY和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079T、W6081L和I6088L；或者
(c)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081L和I6088L；或者
(d)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(e)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：T6022V、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(f)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：T6022L、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(g)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：T6022I、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6079V、W6081T和I6088L；或者
(h)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：L6007F、L6079V、W6081T和I6088L
(i)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005Y、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005Y、L6079V、W6081T和I6088L；或者
(j)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：P6010C、L6079V、W6081T和I6088L；或者
(k)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：P6010C、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、L6079V、W6081T和I6088L；或者
(l)所述第一CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、P6010C、A6085YF和T6086Y，并且所述第二CH3结构域序列中的所述氨基酸突变包括所述氨基酸取代：H6005C、P6010C、L6079V、W6081T和I6088L，
其中所述异二聚性Fc是以70％或更高的纯度形成，
并且其中氨基酸位置的编号是根据IMGT编号。
28.根据权利要求27所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的CH3结构域具有60℃或更高的解链温度(Tm)。
29.根据权利要求27所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的CH3结构域具有为相应的野生型IgA CH3结构域的所述Tm的±10℃的解链温度(Tm)。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的IgA HetFc构建体，其进一步包含一个或多个靶标结合结构域。
31.根据权利要求30所述的IgA HetFc构建体，其中所述一个或多个靶标结合结构域是抗原结合抗体片段。
32.根据权利要求31所述的IgA HetFc构建体，其中所述一个或多个抗原结合抗体片段中的每一者均独立地选自Fab和scFv。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述IgA HetFc构建体包含两个靶标结合结构域并且是双特异性的。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的IgA CH3结构域包含α-尾部。
35.根据权利要求1至33中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述经修饰的IgA CH3结构域缺乏α-尾部。
36.一种缀合物，其包含根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc构建体和一种或多种治疗剂、诊断剂或标记剂。
37.一种IgA HetFc多聚体，所述IgA HetFc多聚体包含J链和两个或更多个根据权利要求1至34中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述IgA HetFc构建体中的两个IgA HetFc构建体通过J链联接。
38.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc构建体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
39.一种药物组合物，其包含根据权利要求36所述的缀合物和药学上可接受的载剂或稀释剂。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求37所述的IgA HetFc多聚体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
41.一种经分离的多核苷酸或多核苷酸的集合，其编码根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc构建体。
42.载体集合或载体的集合，其包含一种或多种编码根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc的多核苷酸。
43.一种宿主细胞，其包含一种或多种编码根据权利要求1至35中任一项所述的IgAHetFc的多核苷酸。
44.一种制备根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc构建体的方法，其包括用一种或多种编码所述IgA HetFc构建体的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适于使所述IgAHetFc构建体表达的条件下培养所述宿主细胞。
45.一种制备根据权利要求37所述的IgA HetFc多聚体的方法，其包括用编码J链的多核苷酸和一种或多种编码根据权利要求34所述的IgA HetFc构建体的多核苷酸转染宿主细胞，以及在适合使所述IgA HetFc构建体和所述J链表达的条件下培养所述宿主细胞。
46.根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述IgA Het Fc包含用于消除与结合靶标的结合的一个或多个突变。
47.根据权利要求1至35中任一项所述的IgA HetFc构建体，其中所述IgA HetFc包含用于引入与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个突变。
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