JP2021533203A

JP2021533203A - Ｃｄ１３７とｐｄ−ｌ１に特異的な新規融合タンパク質

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Publication number: JP2021533203A
Application number: JP2021529519A
Authority: JP
Inventors: マリーナパブリドウ; ルシアパッタリーニ; アリックススカラー−ダヒレル; クリスティーヌローテ; シェーンオルヴィル; アイバラシダベル; マーロンヒンナー; ジャネットペペル
Original assignee: ピエリスファーマシューティカルズゲーエムベーハー; レラボラトリエセルヴィエ
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-12-02
Also published as: EP4249064A3; WO2020025659A1; RS64343B9; PL3830120T3; US20210363257A1; EP4249064A2; MX2021000401A; IL279541A; ZA202100125B; TW202019967A; CN112789292A; BR112020025263A2; HUE062320T2; EP3830120B1; MD3830120T3; EP3830120B9; ES2948717T3; HRP20230590T1; SI3830120T1; MD3830120T2

Abstract

本開示は、PD-L1ターゲット依存的にリンパ球活性化を共刺激するために使用することができる、CD137とPD-L1の両方に特異的な融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質は、例えば抗がん剤および/または免疫調節剤などとして、さまざまな腫瘍などのヒト疾患の処置または予防のために、多くの薬学的応用において使用することができる。本開示は、本明細書記載の融合タンパク質を作製する方法、ならびにそのような融合タンパク質を含む組成物にも関する。本開示はさらに、そのような融合タンパク質をコードする核酸分子ならびにそのような融合タンパク質および核酸分子を生成させるための方法に関する。加えて、本願は、そのような融合タンパク質の、およびそのような融合タンパク質のうちの1つまたは複数を含む組成物の、治療的および/または診断的使用を開示する。

Description

I. 背景
プログラム細胞死リガンド1（Programmed death-ligand 1）、すなわちPD-L1（分化抗原群（cluster of differentiation）274、すなわちCD274、およびB7ホモログ1、すなわちB7-H1としても公知である）は、抗原提示の共刺激/共阻害分子のB7ファミリーに属する一回貫通I型膜タンパク質である。PD-L1の細胞外部分は、2つのドメイン、すなわちN末端のIgV型ドメインとIgC型ドメインとを含有する。PD-L1の短い細胞質ドメインには明白なシグナル伝達モチーフがないことから、当初は、受容体としてのPD-L1による固有のシグナリングはないと考えられていた。しかし最近のデータは、PD-L1の細胞質ドメインは、インターフェロン（IFN）伝達を阻害し、がん細胞をIFNの毒性から保護する能力を有する、非古典的な保存されたシグナル伝達モチーフを含有することを示している（Gato-Canas et al.,Cell Rep,2017）。

PD-L1は、妊娠、慢性感染、組織同種移植、自己免疫疾患およびがんに際して、免疫系の抑制に決定的な役割を果たす。PD-L1は、B細胞、T細胞、マクロファージ、骨髄樹状細胞、肥満細胞、上皮細胞および血管内皮細胞を含むさまざまな細胞タイプ上に発現する。これは、限定するわけではないが、例えば黒色腫、肺がん、膀胱がん、大腸がんおよび乳がんを含む、いくつかのがんタイプにも発現する。高いPD-L1発現レベルは、腫瘍浸潤T細胞の疲弊およびアネルギー、免疫抑制性サイトカインの分泌、ならびに細胞傷害性T細胞による溶解からの保護を媒介することにより、腫瘍攻撃性の増加と関連する。

PD-L1は、プログラム細胞死タンパク質1（programmed cell death protein 1:PD-1）のリガンドであり、PD-1は、主に活性化T細胞上に発現するが、B細胞および単球を含む免疫系の他の細胞にも発現するキー免疫チェックポイント阻害性受容体である。PD-1は、IgV様細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、ITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif:免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）およびITSM（immunoreceptor tyrosine-based switch motif:免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を持つ細胞質テールとを含有する免疫グロブリンファミリーのメンバーである。PD-L1によるPD-1の会合は、PD-1の細胞内スイッチモチーフへのsrcホモロジー2ドメイン含有チロシンホスファターゼ（src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase）1および2（SHP1およびSHP2）の動員と、CBLファミリーのE3ユビキチンリガーゼの発現とにつながる。これらのユビキチンリガーゼは、次いでキーTCRシグナル伝達メディエーターをユビキチン化し、不活化することで、細胞表面からのTCRの除去をもたらす（Karwacz et al.,EMBO Mol Med,2011）。SHP1ホスファターゼおよびSHP2ホスファターゼは、ZAP70およびPI3Kのリン酸化を終結させることにより、TCRシグナリングを直接的に阻害する。加えて、PD-L1と会合したPD-1は、CK2およびサイクリン依存性キナーゼ（cyclin-dependent kinase:CDK）の発現および活性に影響を及ぼすことにより、TCRシグナリング経路の阻害を引き起こすことができる（Arasanz et al.,Oncotarget,2017）。PD-1会合が、エフェクター機能のためのエネルギーを産生するのに必要な解糖の増加から、長寿命細胞に関連する脂肪酸β酸化への、T細胞代謝の再プログラミングにつながることも示された。これは、慢性感染およびがんを持つ患者における高PD-1発現細胞の生残および存続の説明にもなりうる（Patsoukis et al.,Nat Commun,2015）。

抗PD-1または抗PD-L1ターゲティング作用物質でPD-1/PD-L1相互作用を遮断すれば、免疫チェックポイント機能を反転させ、T細胞応答のブレーキを解除することができる。現在、3つのPD-L1抗体、アテゾリズマブ（テセントリク、MPDL3280A、RG7466）、アベルマブ（バベンチオ、MSB0010718C）およびデュルバルマブ（イミフィンジ、MEDI4736）が、がんの処置用として承認されている。これらの抗体を使って成功したたいくつかの臨床試験では、膀胱がん、皮膚がんおよび肺がんにおいて、高い奏効率、効果の持続性、または生存率の改善が示されている（Xu-Monette et al.,Front Immunol,2017）。

分化抗原群137、すなわちCD137（4-1BBまたはTNFRS9としても公知である）は、共刺激免疫受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーのメンバーである。これは、主に活性化CD4＋T細胞および活性化CD8＋T細胞、活性化B細胞ならびにナチュラルキラー（NK）細胞上に発現するが、休止状態の単球および樹状細胞（Li and Liu,Clin Pharmacol,2013）または内皮細胞（Snell et al.,Immunol Rev,2011）にも見いだすことができる。CD137は免疫応答の制御において重要な役割を果たし、したがってがん免疫治療のターゲットである。CD137リガンド（CD137L）はCD137の唯一公知の天然リガンドであり、活性化B細胞、単球、および脾臓樹状細胞などといった数タイプの抗原提示細胞上に構成的に発現しており、Tリンパ球上に誘導される場合もある。

CD137Lは、膜結合型としても可溶性変異体としても存在する三量体タンパク質である。しかし、可溶性CD137Lの、CD137、例えばCD137発現リンパ球上のCD137を活性化する能力は限定的であり、効果を誘発するには高い濃度が必要である（Wyzgol et al.,J Immunol,2009）。CD137の活性化の自然な経路は、CD137陽性細胞とCD137L陽性細胞との会合によるものである。CD137活性化は、反対側の細胞上のCD137Lによるクラスター化によって誘導され、それがCD137陽性T細胞におけるTRAF1、TRAF2およびTRAF3を介したシグナリング（Yao et al.,Nat Rev Drug Discov,2013、Snell et al.,Immunol Rev,2011）ならびにそれに付随するさらなる下流効果につながると考えられている。それぞれのコグネイトターゲットの認識によって活性化されたT細胞の場合、CD137の共刺激によって誘発される効果は、活性化のさらなる強化、生残および増殖の強化、炎症誘発性サイトカインの産生ならびに殺滅能の改良である。

がん細胞の排除に関するCD137共刺激の利益はいくつかのインビボモデルで実証されている。例えば腫瘍上でCD137Lの発現を強制すると腫瘍拒絶につながる（Melero et al.,Eur J Immunol,1998）。同様に、腫瘍上で抗CD137 scFvの発現を強制するとCD4^＋T細胞およびNK細胞依存的な腫瘍の排除につながる（Yang et al.,Cancer Res,2007、Zhang et al.,Mol Cancer Ther,2006、Ye et al.,Nat Med,2002）。全身性に投与された抗CD137抗体が腫瘍成長の遅滞につながることも実証されている（Martinet et al.,Gene Ther,2002）。

CD137は、ヒト腫瘍において天然に存在する腫瘍反応性T細胞の優れたマーカーであること（Ye et al.,Clin Cancer Res,2014）、および抗CD137抗体は、養子T細胞治療に応用されるCD8^＋黒色腫腫瘍浸潤リンパ球の拡大および活性を改良するために使用できることが示されている（Chacon et al.,PLoS One,2013）。

CD137共刺激の潜在的治療利益の前臨床的実証は、BMS-663513（米国特許第7,288,638号に記載）およびPF-05082566（Fisher et al.,Cancer Immunol Immunother,2012）を含む、CD137をターゲットとする治療用抗体の開発に拍車をかけた。

本開示は、なかんずく、CD137に対する結合特異性およびPD-L1に対する結合特異性という特性を有する1つまたは複数の融合タンパク質を介して、CD137とPD-L1に同時に会合するための新規なアプローチを提供する。

II. 定義
以下のリストでは、本明細書全体を通して使用される用語、語句および略号を定義する。本明細書において列挙され定義される用語はすべて、あらゆる文法形を包含するものとする。

本明細書において使用される場合、別段の指定がある場合を除き、「CD137」とはヒトCD137（huCD137）を意味する。ヒトCD137とは、UniProt Q07011によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメントまたはその変異体を意味する。CD137は、4-1BB、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9:TNFRSF9）、およびILA（induced by lymphocyte activation）としても公知である。いくつかの特定態様では、非ヒト種のCD137、例えばカニクイザルCD137およびマウスCD137が使用される。

本明細書において使用される場合、別段の指定がある場合を除き、「プログラム細胞死1リガンド1」（programmed cell death 1 ligand 1）、すなわち「PD-L1」は、ヒトPD-L1（huPD-L1）を意味する。ヒトPD-L1とは、UniProt Q9NZQ7によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメントまたはその変異体を意味する。ヒトPD-L1はCD274遺伝子によってコードされている。PD-L1は、分化抗原群274（CD274）またはB7ホモログ1（B7 homolog 1:B7-H1）としても公知である。いくつかの特定態様では、非ヒト種のPD-L1、例えばカニクイザルPD-L1およびマウスPD-L1が使用される。

本明細書にいう「結合アフィニティー」とは、本開示の生体分子（例えばポリペプチドまたはタンパク質）（例えばリポカリンムテイン、抗体、融合タンパク質、または他の任意のペプチドもしくはタンパク質）の、選択されたターゲットに結合して複合体を形成する能力を表す。結合アフィニティーは、当業者には公知のいくつかの方法によって、例えば限定するわけではないが蛍光滴定、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA）ベースのアッセイ、例えば直接ELISAおよび競合ELISA、熱量測定法、例えば等温滴定熱量測定（isothermal titration calorimetry:ITC）および表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance:SPR）などといった方法によって、測定される。これらの方法は当技術分野では確立されており、本明細書には、そのような方法のいくつかの例を、さらに記載する。それにより、結合アフィニティーは、これらの方法を使って測定される解離定数（K_D）、50％有効濃度（half maximal effective concentration）（EC₅₀）または50％阻害濃度（half maximal inhibitory concentration）（IC₅₀）の値として報告される。低いK_D値、EC₅₀値またはIC₅₀値は、良好な（高い）結合能（アフィニティー）を表す。したがって、ある選択されたターゲットに対して、2種の生体分子の結合アフィニティーを測定し、比較することができる。選択されたターゲットに対する2種の生体分子の結合アフィニティーを比較する場合、「ほぼ同じ」、「実質的に同じ」または「実質的に類似する」という用語は、一方の生体分子が、結合アフィニティー測定の実験的変動の範囲内で他方の分子と同一であるか類似するK_D値、EC₅₀値またはIC₅₀値として報告される結合アフィニティーを有することを意味する。結合アフィニティー測定の実験的変動は使用する具体的方法に依存し、当業者には公知である。

本明細書において使用される「実質的に」という用語は、関心対象の特徴または特性を完全なまたはほぼ完全な程度または度合で呈する定性的状態も指しうる。生物学的現象および化学的現象が完結することおよび/もしくは完全に進行することまたは絶対的結果を達成もしくは回避することは、たとえあったとしてもごくまれであることは、生物学分野の当業者には理解されるであろう。そえゆえに「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的現象および化学的現象に内在する潜在的な完全性の欠如をとらえるために使用される。

本明細書において使用される「検出する」、「検出」、「検出可能な」または「検出すること」という用語は、量的レベルでも、質的レベルでも、またそれらの組合せでも理解される。したがってこれは、本開示の生体分子に対して行われる定量的、半定量的および定性的な測定を包含する。

本明細書にいう「検出可能なアフィニティー」とは、一般に、K_D値、EC₅₀値またはIC₅₀値によって報告される生体分子とそのターゲットとの間の結合能力を意味し、最大でも約10^-5M以下である。10^-5Mより高いK_D値、EC₅₀値またはIC₅₀値によって報告される結合アフィニティーは、一般的には、ELISAおよびSPRなどといった普通の方法ではもはや測定可能でなく、それゆえにその重要性は二次的でしかない。

本開示の生体分子とそのターゲットとの間の複合体形成は、それぞれのターゲットの濃度、競合物質の存在、使用される緩衝系のpHおよびイオン強度、結合アフィニティーの決定に使用される実験方法（例えば蛍光滴定、競合的ELISA（competitive ELISA）（競合ELISA（competition ELISA）ともいう）、および表面プラズモン共鳴）、さらには実験データの評価に使用される数学的アルゴリズムなど、多種多様な因子の影響を受けることに留意されたい。それゆえに、K_D値、EC₅₀値またはIC₅₀値によって報告される結合アフィニティーは、方法および実験設定に依存して、一定の実験的範囲内で変動しうることは、当業者には明白である。これは、例えばELISA（直接ELISAまたは競合ELISAを含む）によって決定されたか、SPRによって決定されたか、別の方法によって決定されたかに依存して、測定されたK_D値、EC₅₀値またはIC₅₀値にはわずかな変動、すなわち許容差範囲がありうることを意味する。

本明細書にいう「に対して特異的」、「特異的結合」または「結合特異性」は、生体分子の、所望のターゲット（例えばCD137およびPD-L1）と1つまたは複数のリファレンスターゲット（例えば好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンに対する細胞受容体）とを区別する能力に関する。そのような特異性は、絶対的ではなく相対的な特性であり、例えばSPR、ウェスタンブロット、ELISA、蛍光活性化細胞選別（FACS）、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay:RIA）、電気化学ルミネセンス（electrochemiluminescence:ECL）、イムノラジオメトリックアッセイ（immunoradiometric assay:IRMA）、免疫組織化学（ImmunoHistoChemistry:IHC）およびペプチドスキャンに従って決定することができると理解される。

CD137とPD-L1に結合する本開示の融合タンパク質に関連して本明細書において使用される場合、「に特異的」、「特異的結合」、「特異的に結合する」または「結合特異性」という用語は、融合タンパク質が、本明細書に記載するとおり、CD137とPD-L1に結合し、それらと反応し、またはそれらを指向するが、別のタンパク質には本質的に結合しないことを意味する。「別のタンパク質」という用語は、CD137ではなくPD-L1でもなく、CD137またはPD-L1と近縁または相同であるタンパク質でもない任意のタンパク質を包含する。しかし、ヒト以外の種からのCD137またはPD-L1ならびにCD137またはPD-L1のフラグメントおよび/もしくは変異体が、「別のタンパク質」という用語によって除外されることはない。「本質的に結合しない」という用語は、本開示の融合タンパク質が、CD137および/またはPD-L1ではない別のタンパク質に低い結合アフィニティーでしか結合しないこと、すなわち30％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、特に好ましくは9、8、7、6または5％未満の交差反応性を示すことを意味する。融合タンパク質が上に定義したように特異的に反応するかどうかは、なかんずく本開示の融合タンパク質とCD137および/またはPD-L1との反応を、該融合タンパク質と（1種または複数種の）別のタンパク質との反応と比較することなどによって、容易に試験することができる。

本明細書において使用される「リポカリン」という用語は、円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量がおよそ18〜20kDaの単量体タンパク質であって、前記円柱状のβプリーツシート超二次構造領域は複数のβストランド（好ましくはA〜Hと呼ばれる8本のβストランド）を含み、それらが一端において複数の（好ましくは4つの）ループによってペアワイズに接続されることでリガンド結合ポケットを構成しリガンド結合ポケットへの入口を規定しているものを指す。好ましくは、本発明において使用されるリガンド結合ポケットを構成するループは、βストランドAとB、CとD、EとFおよびGとHの開口端を接続するループであり、それらはループAB、CD、EFおよびGHと呼ばれる。他の点では剛直なリポカリンスキャフォールドにおける該ループの多様性が、リポカリンファミリーメンバーの間に、サイズ、形状および化学的特徴が異なるターゲットを収容する能力をそれぞれが有するさまざまな異なる結合様式を生じさせることは、確立されている（例えばSkerra,Biochim Biophys Acta,2000、Flower et al.,Biochim Biophys Acta,2000、Flower,Biochem J,1996に総説がある）。リポカリンファミリーのタンパク質は、全体の配列保存率が並外れて低レベルであるにも関わらず（配列同一性は20％未満であることが多い）高度に保存された全体的フォールディングパターンを保って、広範なリガンドに結合するように自然進化したと理解される。さまざまなリポカリンにおける位置同士の対応も、当業者には周知である（例えば米国特許第7,250,297号参照）。本明細書にいう「リポカリン」の定義に包含されるタンパク質としては、ヒトリポカリン、例えば涙液リポカリン（Tlc、Lcn1）、リポカリン-2（Lcn2）または好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（neutrophil gelatinase-associated lipocalin:NGAL）、アポリポタンパク質D（ApoD）、アポリポタンパク質M、α₁-酸性糖タンパク質1、α₁-酸性糖タンパク質2、α₁-ミクログロブリン、補体成分8γ、レチノール結合タンパク質（RBP）、精巣上体レチノイン酸結合タンパク質、グリコデリン、匂い物質結合タンパク質IIa、匂い物質結合タンパク質IIb、リポカリン15（Lcn15）およびプロスタグランジンDシンターゼが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において使用される場合、別段の指定がある場合を除き、「涙液リポカリン」とは、ヒト涙液リポカリン（hTlc）を指し、さらに成熟ヒト涙液リポカリンを指す。タンパク質を特徴づけるために使用される場合、「成熟」という用語は、本質的にシグナルペプチドを含まないタンパク質を意味する。本開示の「成熟hTlc」は、シグナルペプチドを含まない成熟型のヒト涙液リポカリンを指す。成熟hTlcは、SWISS-PROTデータバンクにアクセッション番号P31025として登録されている配列の残基19〜176によって記載され、そのアミノ酸配列をSEQ ID NO:1に示す。

本明細書にいう「リポカリン-2」または「好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」は、ヒトリポカリン-2（hLcn2）またはヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）を指し、さらに成熟ヒトリポカリン-2または成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンを指す。タンパク質を特徴づけるために使用される場合、「成熟」という用語は、本質的にシグナルペプチドを含まないタンパク質を意味する。本開示の「成熟hNGAL」は、シグナルペプチドを含まない成熟型の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンを指す。成熟hNGALは、SWISS-PROTデータバンクにアクセッション番号P80188として登録されている配列の残基21〜198によって記載され、そのアミノ酸配列をSEQ ID NO:2に示す。

本明細書にいう「ネイティブ配列」は、自然に存在する配列を有するか、または野生型配列を有する、タンパク質またはポリペプチドを指し、その調製方式は問わない。そのようなネイティブ配列タンパク質またはネイティブ配列ポリペプチドは、自然から単離するか、他の手段によって、例えば組換え法または合成法などによって生産することができる。

「ネイティブ配列リポカリン」とは、自然由来の対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するリポカリンを指す。したがって、ネイティブ配列リポカリンは、任意の生物、特に哺乳動物からの、それぞれの天然（野生型）リポカリンのアミノ酸配列を有することができる。リポカリンに関連して使用される場合、「ネイティブ配列」という用語は、リポカリンの天然の切断型または分泌型、リポカリンの天然の変異体型、例えば選択的スプライス型および天然のアレル変異体を、特に包含する。用語「ネイティブ配列リポカリン」と「野生型リポカリン」は、本明細書では相互可換的に使用される。

本明細書にいう「ムテイン」、「突然変異（mutated）」実体（タンパク質であるか核酸であるかを問わない）または「突然変異体（mutant）」は、天然（野生型）のタンパク質または核酸と比較して、1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの交換、欠失または挿入を指す。この用語には本明細書記載のムテインのフラグメントも含まれる。本開示は、円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する本明細書記載のリポカリンムテインであって、前記円柱状のβプリーツシート超二次構造領域は8本のβストランドを含み、それらが一端において4つのループによってペアワイズに接続されることでリガンド結合ポケットを構成しリガンド結合ポケットへの入口を規定しており、前記4つのループのうちの少なくとも3つのループのそれぞれの少なくとも1つのアミノ酸がネイティブ配列リポカリンと比較して突然変異しているものを、明示的に包含する。本発明のリポカリンムテインは、好ましくは、本明細書に記載するようにCD137に結合する機能を有する。

本開示のリポカリンムテインに関連して本明細書において使用される「フラグメント」という用語は、完全長成熟hTlcもしくは完全長成熟hNGALまたはリポカリンムテインに由来するタンパク質またはポリペプチドであって、N末端および/またはC末端が切断されているもの、すなわちN末端および/またはC末端アミノ酸を少なくとも1つは欠くものを指す。そのようなフラグメントは、成熟hTlcもしくは成熟hNGALまたはリポカリンムテインの一次配列のうちの少なくとも10個またはそれ以上、例えば20個もしくは30個またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができ、通常は、成熟hTlcまたはhNGALのイムノアッセイにおいて検出可能である。そのようなフラグメントは、最大2個、最大3個、最大4個、最大5個、最大10個、最大15個、最大20個、最大25個または最大30個（その間の数をすべて含む）のN末端および/またはC末端アミノ酸を欠きうる。具体的一例として、そのようなフラグメントは、成熟hTlcの1つ、2つ、3つもしくは4つのN末端（His-His-Leu-Leu）および/または1つもしくは2つのC末端アミノ酸（Ser-Asp）を欠きうる。フラグメントは、好ましくは、元の成熟hTlcもしくは成熟hNGALまたはリポカリンムテインの機能的フラグメントであると理解される。これは、そのフラグメントが、元の成熟hTlc/hNGALまたはリポカリンムテインの結合特異性、好ましくはCD137に対する結合特異性を保っていることを意味する。具体的一例として、そのような機能的フラグメントは、少なくとも、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列に対応する位置5〜153、5〜150、9〜148、12〜140、20〜135または26〜133のアミノ酸を含みうる。別の具体的一例として、そのような機能的フラグメントは、少なくとも、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列に対応する位置13〜157、15〜150、18〜141、20〜134、25〜134、または28〜134のアミノ酸を含みうる。

本開示の融合タンパク質の対応するターゲットCD137またはPD-L1に関して「フラグメント」とは、N末端および/もしくはC末端が切断されたCD137もしくはPD-L1またはCD137もしくはPD-L1のタンパク質ドメインを指す。本明細書に記載するCD137のフラグメントまたはPD-L1のフラグメントは、完全長CD137または完全長PD-L1の、本開示の融合タンパク質によって認識されかつ/または結合される能力を保っている。具体的一例として、フラグメントはCD137またはPD-L1の細胞外ドメインでありうる。具体的一例として、そのような細胞外ドメインはCD137の細胞外サブドメインのアミノ酸、例えばドメイン1（UniProt Q07011の残基24〜45）、ドメイン2（残基46〜86）、ドメイン3（87〜118）およびドメイン4（残基119〜159）の個々のまたは組み合わされたアミノ酸配列を含みうる。別の具体的一例として、そのような細胞外ドメインは、UniProt Q9NZQ7のアミノ酸残基19〜238を含みうる。

本明細書において使用される「変異体」という用語は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の置換、欠失、挿入および/または化学修飾などによる突然変異を含む、タンパク質またはポリペプチドの誘導体に関する。いくつかの態様において、そのような突然変異および/または化学修飾は、当該タンパク質またはペプチドの機能性を低減しない。そのような置換は保存的でありうる。すなわち、アミノ酸残基は、化学的に類似するアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、スレオニン、およびバリン、2）アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、およびアスパラギン、およびヒスチジン、3）アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、およびヒスチジン、4）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、スレオニン、およびプロリン、ならびに5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。そのような変異体には、1つまたは複数のアミノ酸がそれぞれのD-立体異性体によって置換されているか、20種の天然アミノ酸以外のアミノ酸、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどで置換されているタンパク質またはポリペプチドが含まれる。そのような変異体には、例えば、N末端および/またはC末端において1つまたは複数のアミノ酸残基が付加または除去されたタンパク質またはポリペプチドも含まれる。一般に変異体は、ネイティブ配列のタンパク質またはポリペプチドに対して、少なくとも約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％または少なくとも約98％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体は、好ましくは、元のタンパク質またはポリペプチドの生物学的活性、例えば同じターゲットへの結合を保っている。

本開示の融合タンパク質の対応するタンパク質リガンドCD137またはPD-L1に関して本明細書において使用される「変異体」という用語は、CD137またはPD-L1のネイティブ配列（野生型CD137またはPD-L1）、例えば本明細書に記載するようにUniProt Q07011に登録されているCD137またはUniProt Q9NZQ7に登録されているPD-L1との比較で、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80個またはそれ以上の、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有する、それぞれCD137もしくはPD-L1またはそのフラグメントに関する。CD137変異体またはPD-L1変異体は、それぞれ、好ましくは、野生型CD137または野生型PD-L1に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％のアミノ酸同一性を有する。本明細書記載のCD137変異体またはPD-L1変異体は、本発明において開示されるCD137とPD-L1に特異的な融合タンパク質に結合する能力を保っている。

リポカリンムテインに関して本明細書において使用される「変異体」という用語は、配列が、置換、欠失および挿入を含む突然変異ならびに/または化学修飾を有する、本開示のリポカリンムテインまたはそのフラグメントに関する。本明細書記載のリポカリンムテインの変異体は、元のリポカリンムテインの生物学的活性、例えばCD137への結合を保っている。一般に、リポカリンムテイン変異体は、元のリポカリンムテインに対して少なくとも約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％のアミノ酸配列同一性を有する。

本明細書において使用される「突然変異導入」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列への突然変異の導入を指す。突然変異は、好ましくは、タンパク質またはポリペプチド配列の所与の位置に天然に存在するアミノ酸が改変されうるような、例えば少なくとも1つのアミノ酸によって置換されうるような、実験条件下で導入される。「突然変異導入」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（付加的）修飾も包含する。したがって、例えば選ばれた配列位置にある1つのアミノ酸が、一続きになった3つのアミノ酸で置き換えられて、ネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドのアミノ酸配列のそれぞれのセグメントの長さと比較して2つのアミノ酸残基が付加されたことになるのは、本開示の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本開示において突然変異導入の対象となりうる配列セグメントのいずれにおいても、互いに独立して導入されうる。例示的な本開示の一態様では、ネイティブ配列リポカリンのループABに対応するアミノ酸配列セグメントに、挿入が導入されうる（国際特許出願WO 2005/019256参照。この特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。

本明細書において使用される「ランダム突然変異導入」という用語は、前もって決定された突然変異（アミノ酸の改変）が一定の配列位置に存在するのではなく、突然変異導入中に所定の配列位置に少なくとも2種のアミノ酸が一定の確率で組み込まれうることを意味する。

本明細書において使用される「配列同一性」または「同一性」という用語は、配列間の類似性または関係性を測る配列の一特性を表す。本開示において使用される「配列同一性」または「同一性」という用語は、本開示のタンパク質またはポリペプチドの配列を問題の配列と（相同）アラインメントした後の、それら2つの配列のうちの長い方の残基数を基準とした、ペアごとの同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって測られる。

本明細書において使用される「配列相同性」または「相同性」という用語は、その通常の意味で使用され、相同なアミノ酸には、本開示のタンパク質またはポリペプチド（例えば本開示の任意の融合タンパク質またはリポカリンムテイン）の直鎖アミノ酸配列において等価な位置にある同一アミノ酸および保存的置換とみなされるアミノ酸が含まれる。

標準的なパラメータを使って配列相同性または配列同一性を決定するために利用することができる、例えばBLAST（Altschul et al.,Nucleic Acids Res,1997）、BLAST2（Altschul et al.,J Mol Biol,1990）、およびSmith-Waterman（Smith and Waterman,J Mol Biol,1981）などのコンピュータプログラムは、当業者にはわかるであろう。配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、本明細書では、例えばプログラムBLASTPバージョン2.2.5（2002年11月16日;（Altschul et al.,Nucleic Acids Res,1997）を使って決定することができる。この態様において、相同性のパーセンテージは、プロペプチド配列を含む全タンパク質配列または全ポリペプチド配列のアラインメントに基づき（行列:BLOSUM 62;ギャップコスト:11.1;カットオフ値は10^-3に設定）、好ましくは野生型タンパク質スキャフォールドを、ペアワイズ比較におけるリファレンスとして使用する。これは、BLASTPプログラム出力に結果として示される「ポジティブ（positive）」（相同アミノ酸）の数を、プログラムがアラインメントのために選択したアミノ酸の総数で割ったパーセンテージとして計算される。

具体的には、リポカリンムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型リポカリンのアミノ酸配列中の一定の位置に対応する野生型リポカリンとは異なるかどうかを決定するために、当業者は、例えば手作業によるアラインメント、またはBLAST2.0（これはBasic Local Alignment Search Toolの略である）もしくはClustalWなどのコンピュータプログラム、または配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の適切なプログラムを使ったアラインメントなど、当技術分野において周知の手段および方法を使用することができる。したがって、リポカリンの野生型配列が「対象配列」または「リファレンス配列」として役立ちうるのに対し、本明細書記載の野生型リポカリンとは異なるリポカリンムテインのアミノ酸配列は「クエリー配列」として役立つ。「野生型配列」、「リファレンス配列」および「対象配列」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。リポカリンの好ましい野生型配列は、SEQ ID NO:1に示すhTLcの配列またはSEQ ID NO:2に示すhNGALの配列である。

「ギャップ」とは、アミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメント中の空白をいう。したがって、厳密に同じ配列である2つのコピーは100％の同一性を有するが、それほど高度には保存されていなくて、欠失、付加、または置き換えを有する配列は、それより程度の低い配列同一性を有しうる。

本開示において使用される「位置」という用語は、本明細書に示すアミノ酸配列内でのアミノ酸の位置、または本明細書に示す核酸配列内でのヌクレオチドの位置を意味する。「対応する」または「対応」という用語が1つまたは複数のリポカリンムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される場合、対応位置は、先行するヌクレオチドまたはアミノ酸の数だけでは決定されないことを理解すべきである。したがって本開示によれば、所与のアミノ酸の絶対的位置は、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにあるアミノ酸の欠失または付加ゆえに、対応位置から変動しうる。同様に本開示によれば、所与のヌクレオチドの絶対的位置も、ムテインまたは野生型リポカリンの5’-非翻訳領域（UTR）、例えばプロモーターおよび/もしくは他の任意の制御配列中または遺伝子（エクソンおよびイントロンを含む）中の他のどこかにある欠失または追加ヌクレオチドゆえに、対応位置から変動しうる。

本開示による「対応位置」は、本開示によるペアワイズアラインメントまたは多重配列アラインメントにおいてそれが対応する配列位置にアラインメントする配列位置でありうる。好ましくは、本開示による「対応位置」に関して、ヌクレオチドまたはアミノ酸の絶対的位置は、隣接ヌクレオチドまたは隣接アミノ酸とは異なっていて、交換、欠失または付加されたそれら隣接ヌクレオチドまたは隣接アミノ酸が同じ1つまたは複数の「対応位置」に含まれる場合もありうると理解すべきである。

加えて、本開示によるリファレンス配列に基づくリポカリンムテイン中の対応位置については、好ましくは、リポカリン間で高度に保存された全体的フォールディングパターンに照らして当業者には理解されるとおり、リポカリンムテインのヌクレオチドまたはアミノ酸の位置は、たとえそれらが絶対的位置番号の点で異なりうるとしても、リファレンスリポカリン（野生型リポカリン）または別のリポカリンムテイン中の他のどこかにある位置と、構造的に対応しうると理解すべきである。

本明細書では相互可換的に使用される「コンジュゲートする」、「コンジュゲーション」、「融合する」、「融合」または「連結された」という用語は、例えば遺伝子融合、化学的コンジュゲーション、リンカーまたは架橋剤によるカップリング、および非共有結合的会合などの手段による、あらゆる形態の共有結合または非共有結合を介した、2つ以上のサブユニットの互いの繋ぎ合わせを指す。

本明細書において使用される「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、2つ以上のサブユニットを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。いくつかの態様において、本明細書記載の融合タンパク質は、2つ以上のサブユニットを含み、それらのサブユニットのうちの少なくとも1つはCD137に特異的に結合する能力を有し、さらに別のサブユニットはPD-L1に特異的に結合する能力を有する。融合タンパク質内では、これらのサブユニットが共有結合または非共有結合によって連結されうる。好ましくは、融合タンパク質は、2つ以上のサブユニット間の翻訳融合物である。翻訳融合物は、あるサブユニットのコード配列を別のサブユニットのコード配列と読み枠を合わせて遺伝子操作することによって作成しうる。両サブユニットの間には、リンカーをコードするヌクレオチド配列を介在させうる。ただし、本開示の融合タンパク質のサブユニットは、化学的コンジュゲーションによって連結することもできる。融合タンパク質を形成するサブユニットは、典型的には、互いに、あるサブユニットのC末端が別のサブユニットN末端に、またはあるサブユニットのC末端が別のサブユニットのC末端に、またはあるサブユニットのN末端が別のサブユニットのN末端に、またはあるサブユニットのN末端が別のサブユニットのC末端に連結される。融合タンパク質のサブユニットは任意の順序で連結することができ、構成サブユニットのいずれかを2つ以上含んでもよい。サブユニットのうちの1つまたは複数が2つ以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質（複合体）の一部であるなら、「融合タンパク質」という用語は、融合された配列を含むタンパク質とそのタンパク質（複合体）の他のすべてのポリペプチド鎖も指しうる。具体的一例として、完全長免疫グロブリンが免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を介してリポカリンムテインに融合されている場合、「融合タンパク質」という用語は、リポカリンムテインを含む単一のポリペプチド鎖と免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を指しうる。「融合タンパク質」という用語は、免疫グロブリン全体（軽鎖と重鎖の両方）ならびにその重鎖および/もしくは軽鎖の一方または両方に融合されたリポカリンムテインも指しうる。

本明細書において使用される場合、本明細書において開示する融合タンパク質の「サブユニット」という用語は、単独で安定したフォールディング構造を形成して、ターゲットに対する結合モチーフを与えるというユニークな機能を規定しうる、単一のタンパク質または独立したポリペプチド鎖を指す。いくつかの態様において、好ましい本開示のサブユニットはリポカリンムテインである。他のいくつかの態様において、好ましい本開示のサブユニットは、完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインである。

本開示の融合タンパク質に含まれうる「リンカー」は、本明細書記載の融合タンパク質の2つ以上のサブユニットを互いに繋ぎ合わせる。結合は共有結合または非共有結合であることができる。好ましい共有結合は、アミノ酸間のペプチド結合などのペプチド結合による。好ましいリンカーはペプチドリンカーである。したがって好ましい一態様において、リンカーは、1つまたは複数のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸を含む。本明細書には、グリシン-セリン（GS）リンカー、グリコシル化GSリンカー、およびプロリン-アラニン-セリンポリマー（PAS）リンカーなどといった、好ましいペプチドリンカーを記載する。いくつかの好ましい態様において、GSリンカーはSEQ ID NO:13に記載の（G₄S）₃であり、融合タンパク質のサブユニット同士を繋ぎ合わせるために使用される。他の好ましいリンカーとして化学的リンカーが挙げられる。

本明細書において使用される「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラット血清アルブミンなど、あらゆる哺乳動物アルブミンを包含する。

本明細書において使用される「有機分子」または「小有機分子」という用語は、少なくとも2つの炭素原子を含むが、好ましくは7個以下または12個以下の回転可能な炭素結合を含み、100〜2,000ダルトン、好ましくは100〜1,000ダルトンの範囲の分子量を有し、任意で1つまたは2つの金属原子を含む、有機分子を表す。

「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または腫瘍組織を含む組織が包含されるが、それらに限定されるわけではない。

「対象」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「哺乳動物」という用語は、本明細書では、哺乳動物に分類される任意の動物を指すために使用され、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、サル、例えばカニクイザルなどを含むが、ここでは具体例をいくつか挙げただけで、それらに限定されるわけではない。好ましくは、本明細書にいう「哺乳動物」はヒトである。

「有効量」とは、有益な結果または所望の結果を得るのに十分な量である。有効量は1回または複数回の個別投与または1つまたは複数の個別用量で投与することができる。

本明細書にいう「抗体」には、全抗体またはその任意の抗原結合性フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）もしくは単一の鎖が含まれる。全抗体とは、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも2つの重鎖（HC）と2つの軽鎖（LC）とを含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（V_HまたはHCVR）と重鎖定常領域（C_H）とで構成される。重鎖定常領域は3つのドメインC_H1、C_H2およびC_H3で構成される。各軽鎖は軽鎖可変ドメイン（V_LまたはLCVR）と軽鎖定常領域（C_L）とで構成される。軽鎖定常領域は1つのドメインC_Lで構成される。V_H領域およびV_L領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる保存度の高い領域が間に挿入された相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域に、さらに細分することができる。各V_HおよびV_Lは、アミノ末からカルボキシ末に向かって以下の順序で配置された3つのCDRと4つのFRとで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原（例えばPD-L1）と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、任意で、宿主組織または宿主因子、例えば免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第1成分（C1q）などへの、免疫グロブリンの結合を媒介しうる。

本明細書にいう抗体の「抗原結合性フラグメント」とは、抗原（例えばPD-L1）に特異的に結合する能力を保っている、抗体の1つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントによって履行されうることは示されている。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含される結合性フラグメントの例としては、（i）V_H、V_L、C_LおよびC_H1ドメインからなるFabフラグメント、（ii）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含むF（ab’）₂フラグメント、（iii）V_H、V_L、C_LおよびC_H1ドメインならびにC_H1ドメインとC_H2ドメインの間の領域からなるFab’フラグメント、（iv）V_HドメインとC_H1ドメインとからなるFdフラグメント、（v）抗体の単一アームのV_HドメインとV_Lドメインとからなる一本鎖Fvフラグメント、（vi）V_HドメインからなるdAbフラグメント（Ward et al.,Nature,1989）、および（vii）単離された相補性決定領域（CDR）または任意で合成リンカーによって結合されていてもよい2つ以上の単離されたCDRの組合せ、（viii）同じポリペプチド鎖中で短いリンカーを使って接続されたV_HとV_Lとを含む「ダイアボディ」（例えば特許文書EP 404,097、WO 93/11161、およびHolliger et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,1993参照）、（ix）V_HまたはV_Lだけを含有する「ドメイン抗体フラグメント」であって、場合によっては、2つ以上のV_H領域が共有結合で繋ぎ合わされているものが挙げられる。

抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、異種、同種異系もしくは同系、またはそれらの修飾型（例えばヒト化、キメラまたは多重特異性）であってよい。また、抗体は完全にヒト抗体であってもよい。

本明細書にいう「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域（CDR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。

「フラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region）」または「Fc領域」とは、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を指し、ネイティブ配列Fc領域と変異体Fc領域とを包含する。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界はさまざまでありうるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常は、KabatのEUインデックスによるナンバリングで位置Cys226またはPro230のアミノ酸残基からそのカルボキシル末までと定義される（Johnson and Wu,Nucleic Acids Res,2000）。Fc領域のC末端リジン（KabatのEUインデックスで残基447）は、例えば抗体の生産もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に作製することにより、除去されうる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、すべてのK447が除去されている抗体集団、K447残基が1つも除去されていない抗体集団、およびK447残基を持つ抗体と持たない抗体の混合物を有する抗体集団を含みうる。本発明の抗体における使用に適したネイティブ配列Fc領域としては、ヒトIgG1、IgG2（IgG2A、IgG2B）、IgG3およびIgG4が挙げられる。

「Fc受容体」または「FcR」とは抗体のFc領域に結合する受容体を指す。

本明細書にいう「単離された抗体」とは、その自然環境を本質的に含まない抗体を指す。例えば、単離された抗体は、それが由来する細胞源または組織源からの細胞性の物質および他のタンパク質を本質的に含まない。「単離された抗体」とは、さらに、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。本件の場合、PD-L1に特異的に結合する単離された抗体は、PD-L1以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。ただし、PD-L1に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種からのPD-L1分子に対する交差反応性を有しうる。

本明細書にいう「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、ある特定エピトープに対して単一の結合特異性およびアフィニティーを呈する。

本明細書にいう「ヒト化抗体」は、ヒト以外の哺乳動物に由来する抗体のCDRと、ヒト抗体のまたはヒト抗体由来のFR領域および定常領域とからなる抗体を指す。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、Ehrenmannら（2010）が記載しているようにImmunogenetics Information System（IMGT）DomainGapAlignツールを使って評価した場合に、全体として分析すると、他の種よりもヒトに近い可変領域アミノ酸配列を有する可変ドメインを含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、免疫原性が低減しているので、治療用作用物質における有効成分として役立ちうる。「治療用作用物質」または「治療活性作用物質」という用語は、本明細書において使用される場合、治療上有用な作用物質を指す。治療用作用物質は、疾患、生理的状態、症状を予防、改善または処置するための、またはそれらを評価もしくは診断するための、任意の作用物質でありうる。

本明細書にいう「ヒト抗体」には、フレームワーク領域とCDR領域がどちらもヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれる。さらにまた、抗体が定常領域を含有する場合、その定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダム突然変異導入もしくは部位特異的突然変異導入によって導入される突然変異またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含みうる。ただし、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなど別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を包含しないものとする。

III. 図面の説明
ターゲットCD137およびPD-L1に対して二重特異性である本願記載の代表的融合タンパク質の設計の概略を示す。代表的融合タンパク質は、PD-L1に特異的な抗体（例えば重鎖がSEQ ID NO:86によって与えられるか、SEQ ID NO:77の重鎖可変ドメインを含むか、GFSLSNYD (HCDR1、SEQ ID NO: 60)、IWTGGAT (HCDR2、SEQ ID NO: 61)、およびVRDSNYRYDEPFTY (HCDR3、SEQ ID NO: 62)のCDR配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:87によって与えられるか、SEQ ID NO:82の重鎖可変ドメインを含むか、QSIGTN (LCDR1、SEQ ID NO: 63)、YAS (LCDR2)、およびQQSNSWPYT (LCDR3、SEQ ID NO: 64)のCDR配列を含む抗体）と、CD137に特異的な1つまたは複数のリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:42のリポカリンムテイン）とに基づいて作製された。図1A〜図1Iに示すように、1つまたは複数のリポカリンムテインをPD-L1特異的抗体の重鎖または軽鎖のいずれかのC末端および/またはN末端に遺伝子融合することにより、融合タンパク質、例えばSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91を得た。生成した融合タンパク質は、（例えば図1A〜図1Dに示すように）CD137に対して二価であるか、（例えば図1E〜図1Hに示すように）CD137に対して四価であるか、または（例えば図1Iに示すように）CD137に対してさらに高い価数を有することができる。（例えば図1J〜図1Kに示すように）1つまたは複数のCD137特異的リポカリンムテインを、本明細書に記載するように提供される抗体のFc領域のC末端に、ペプチドリンカーを介して融合することにより、さらなる単一特異性融合タンパク質を生成させた。その結果得られた単一特異性融合タンパク質を、例えばSEQ ID NO:88およびSEQ ID NO:89に掲載する。図2は、PD-L1またはCD137への代表的融合タンパク質の結合を実施例4に記載するように決定したELISA実験の結果を表す。PD-L1またはCD137（C末端HisまたはFcタグを持つもの）をマイクロタイタープレート上にコーティングし、100nMの最高濃度から出発して、被験作用物質をタイトレートした。結合した研究対象の作用物質を、抗ヒトIgG Fc-HRPまたは抗NGAL-HRPでそれぞれ検出した。EC₅₀値と最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、データを1:1結合モデルに当てはめた。その結果得られたEC₅₀値を表4に掲載する。図2Aの説明を参照のこと。図2Aの説明を参照のこと。図2Aの説明を参照のこと。代表的融合タンパク質の、両方のターゲットPD-L1およびCD137に同時に結合する能力を、実施例5で述べるように決定したELISA実験の結果を図解している。組換えhuPD-L1-HisまたはhuCD137-Hisをマイクロタイタープレート上にコーティングした後、100nMの最高濃度から出発して、融合タンパク質のタイトレーションを行った。次に、それぞれ、一定の濃度のビオチン化huCD137-Hisまたはビオチン化huPD-L1-Hisを加え、それをExtrAvidine-ペルオキシダーゼで検出した。図4は、実施例6で述べるようにヒトまたはカニクイザルCD137（図4A〜図4B）およびヒトまたはカニクイザルのPD-L1（図4C〜図4D）を発現するFlp-In-CHO細胞を用いるフローサイトメトリーによる融合タンパク質のターゲット結合の評価の結果を表す。モックトランスフェクトFlp-In-CHO細胞を用いた場合には結合は観察されなかった（図4E）。蛍光強度の幾何平均を使用し、非線形回帰（シェアードボトム（shared bottom）、SLOPE＝1）を使って、EC₅₀値を算出した。EC₅₀値を表6に掲載する。図4-1の説明を参照のこと。実施例7で述べるようにRKO細胞と融合タンパク質とをインキュベートすることにより、フローサイトメトリーを使って評価した、PD-L1陽性腫瘍細胞への融合タンパク質の結合を表す。図6は、実施例8で述べるように、融合タンパク質とCD137との相互作用がCD137へのCD137Lの結合によって阻止されるかどうかを調べるために計画された、多重結合（multi-binding）SPRに基づく実験の例である。これは、huCD137（C末端Fc融合物）とhuCD137L（C末端Hisタグを持つもの）との複合体をSPRセンサーチップ上で生成させ、融合タンパク質がhuCD137とCD137Lとの複合体に依然として結合できるかどうかをチェックすることによって評価される。リファレンスとして、huCD137を、huCD137Lの非存在下でも、被験融合タンパク質と共にインキュベートする。huCD137単独へのそれぞれの融合タンパク質の結合に関するSPRトレースに、実線の矢印で印をつける。huCD137Lで飽和させておいたhuCD137へのそれぞれの融合タンパク質の結合に関するSPRトレースに、破線の矢印で印をつける。対照として、融合タンパク質を含まないブランク注入を使用した。これらの実験は、試験した融合タンパク質がすべて、CD137Lの存在下でCD137に結合できたことを示している。図6-1の説明を参照のこと。実施例9で述べる競合ELISA研究において示されるように、融合タンパク質がPD-1への結合に関してPD-L1と競合することを表す。一定の濃度のhuPD-1-Hisをマイクロタイタープレート上にコーティングしてから、さまざまな濃度の試験分子と固定濃度のトレーサーhuPD-L1-Fcとの混合物を加えた。結合したトレーサーは、HRP標識抗IgG Fc抗体を使って検出した。CD137およびPD-L1二重特異性融合タンパク質またはPD-L1特異的抗体による、PD-1へのhuPD-L1-Fc結合の用量依存的阻害が観察された。図8: PD-L1ターゲット依存的にT細胞活性化を共刺激する代表的融合タンパク質の潜在能力を、CD137バイオアッセイを使って評価した。NFκB-luc2/CD137 Jurkat細胞を、さまざまな濃度の融合タンパク質または対照の存在下で、PD-L1発現腫瘍細胞株RKOと共培養した。4時間後に、ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光シグナルを測定した。EC₅₀値を算出するためにGraphPad Prism（登録商標）を使って4パラメータロジスティック曲線解析を行った（表9参照）。融合タンパク質は、PD-L1の存在下でのみ、T細胞活性化を共刺激し（図8Aおよび図8C）、PD-L1の非存在下ではT細胞活性化を共刺激しない（図8Bおよび図8D）。対照的に、リファレンス抗CD137 mAb（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）は、PD-L1陽性RKO細胞の存在下でも非存在下でも、類似する活性化を呈した。図8-1の説明を参照のこと。選択された融合タンパク質の、T細胞活性化を誘導する能力を調べた、代表的実験の結果を表す。各PD-L1抗体ビルディングブロックを含むPD-L1抗体、Fc融合物としてのCD137結合性リポカリンムテイン、および抗CD137ベンチマーク抗体を、単独で、および抗PD-L1/抗CD137カクテルとして組み合わせて、試験した。この実験では、ヒト末梢血単核球（PBMC）を、1ng/mLブドウ球菌エンテロトキシンB（staphylococcal enterotoxin B:SEB）の存在下で、融合タンパク質、抗体、リポカリンムテインFc融合物、カクテル、または対照と共にインキュベートした。実施例11で述べるように、T細胞活性化を反映する分泌されたインターロイキン2（IL-2）のレベルを、T細胞活性化に関するリードアウトとして、電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定し、対応するIgG4対照のレベルに対して正規化した。融合タンパク質はすべて、T細胞活性化を、単一のビルディングブロックまたはベンチマーク抗PD-L1/抗CD137抗体のカクテルよりも強く、または少なくとも同等に、誘導する能力を有する。図10は、代表的融合タンパク質の、PD-L1ターゲット依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を表す。各PD-L1抗体ビルディングブロックを含むPD-L1抗体、Fc融合物としてのCD137結合性リポカリンムテイン、および抗CD137ベンチマーク抗体を、単独で、および抗PD-L1/抗CD137カクテルとして組み合わせて、試験した。PD-L1の発現レベルが異なるさまざまな腫瘍細胞株（高:RKO;中:HCC827;陰性:HepG）を抗ヒトCD3被覆プレートに播種した。汎T細胞（pan T cells）とさまざまな濃度の融合タンパク質および単一ビルディングブロックとを加え、3日間インキュベートした。分泌されたIL-2のレベルは、実施例12で述べるように、電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定した。融合タンパク質はすべて、PD-L1依存的にIL-2分泌を増加させる能力を有する。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。図11は、1mg/mlまたは20mg/mLの濃度で、37℃または40℃における、1週間、2週間、3週間または4週間のインキュベーション後の、PBSまたは25mMヒスチジン、60mM NaCl、200mMアルギニン、pH6における、融合タンパク質の貯蔵安定性を図解している。安定性は、実施例13で述べるように、分析用サイズ排除からの単量体の回収率によって評価されるか、定量的ELISAからの機能的タンパク質の回収率によって評価される。図11A-1の説明を参照のこと。図11A-1の説明を参照のこと。図12は、CD4^＋T細胞を用いる混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction:MLR）における、代表的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）の、IL-2分泌を刺激する能力を表す。実施例14で述べるように、融合タンパク質、PD-L1抗体ビルディングブロック（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）、Fc融合物としてのCD137結合性リポカリンムテイン（SEQ ID NO:89）、および抗CD137ベンチマーク抗体または抗PD-L1ベンチマーク抗体を単独でまたは抗PD-L1/抗CD137カクテルとして組み合わせて、等モル濃度で試験した。異なる健常ドナーからの全ヒトCD4^＋T細胞および単球由来樹状細胞（moDC）との6日間のインキュベーション後に、上清においてIL-2分泌を測定した。図12Aは、融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87が、等モル濃度（10μg/mlまたは0.1μg/mlの被験融合タンパク質と等価）のビルディングブロック単独（PD-L1抗体SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87またはCD137特異的リポカリンムテインSEQ ID NO:89）およびリファレンス抗PD-L1または抗CD137抗体（それぞれSEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27またはSEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）と比較して、IL-2分泌の有意な増加を示したことを図解している。8回の独立した実験からのデータが示されている。図12Bは、融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87が、0.001μg/mLから20μg/mLまでの範囲の濃度にわたって、IL-2の用量依存的な分泌を誘導できたことを表している。融合タンパク質によって誘導されるIL-2レベルは、等モル濃度のリファレンス抗PD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とリファレンス抗CD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とのカクテルと比較すると高かった。代表的ドナーからのデータが示されている。図12Aの説明を参照のこと。例示的な融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）の、CD8^＋T細胞エフェクター分子の分泌を誘導する能力を表している。融合タンパク質を不適合健常ドナーからのmoDCおよびCD8^＋T細胞と共に6日間培養した後、上清におけるIL-2およびCD8^＋T細胞エフェクター分子の分泌を、実施例15で述べるようにルミネックス（Luminex）アッセイを使って定量した。融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87は、単独で使用するかカクテルとして使用した場合のリファレンス抗PD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）およびリファレンス抗CD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）と比べると、10μg/mLで、IL-2および細胞傷害性因子（パーフォリン、グランザイムBおよびグランザイムA）の分泌の増加を示した。実施例17で述べるように、競合ELISA研究で示される、融合タンパク質が、臨床的に活性なCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とオーバーラップするエピトープに結合することを表す。一定の濃度のSEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29をマイクロタイタープレート上にコーティングしてから、さまざまな濃度の試験分子と固定濃度のビオチン化huCD137-Fcのトレーサーとの混合物を加えた。結合したトレーサーはExtrAvidin-ペルオキシダーゼによって検出した。融合タンパク質は、CD137結合に関して、CD137抗体と競合する。実施例18で述べるように、PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイを使って評価した、PD-1/PD-L1相互作用によって媒介される阻害シグナルを遮断する、代表的融合タンパク質の潜在能力を表す。PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞（PD-1およびNFATプロモーター制御下のNFAT媒介ルシフェラーゼ遺伝子を発現するJurkat細胞株）を、さまざまな濃度の試験分子の存在下で、PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞と共培養した。6時間後に、ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光シグナルを測定した。バックグラウンドシグナルはPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞のみと共培養したPD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞である。SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87の融合タンパク質は、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87に示されるビルディングブロックPD-L1抗体およびSEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27に示されるリファレンスPD-L1抗体を含む被験PD-L1抗体と同等に、PD-1/PD-L1経路を遮断する。図16は、代表的融合タンパク質の、T細胞活性化を誘導する能力を表す。PD-L1抗体ビルディングブロックおよび単独でまたはPD-L1抗体との組合せで使用した場合のリファレンスCD137抗体も試験した。この実験では、ヒトPBMCを、0.1ng/mL SEBの存在下で、融合タンパク質、抗体、カクテル、または対照と共にインキュベートした。実施例19に記載し、図16Aに図示するように、T細胞活性化に関するリードアウトとして、分泌されたIL-2のレベルを電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定した。図16Bは、バックグラウンドIL-2分泌（試験分子なしの0.1ng/mL SEBで刺激されたPBMC）のレベルと比較した場合の、試験分子によって誘導されるIL-2分泌レベルの増加倍率を示している。融合タンパク質は、PD-L1抗体または単独のもしくは組み合わされたCD137抗体よりも強い、IL-2分泌の用量依存的増加につながる。図16A-1の説明を参照のこと。図16A-1の説明を参照のこと。図16A-1の説明を参照のこと。図17は、代表的融合タンパク質の、PD-L1の存在下でT細胞活性化を共刺激する能力を実証している。PD-L1抗体ビルディングブロック、リファレンスCD137抗体、およびCD137抗体とリファレンスPD-L1抗体のカクテルを並行して試験した。ヒトPD-L1をトランスフェクトするか（図17A）またはモックトランスフェクトした（ヒトPD-L1陰性、図17B）CHO細胞を、抗ヒト抗CD3被覆プレートに播種した。汎T細胞およびさまざまな濃度の試験分子を加え、2日間インキュベートした。実施例20で述べるように、上清中の分泌されたIL-2のレベルを電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定した。ヒトPD-L1発現CHO細胞（図17C）またはモックトランスフェクトCHO細胞（図17D）の存在下でのIL-2分泌の増加倍率を表すために、IL-2分泌レベルをバックグラウンドレベル（汎T細胞＋抗CD3＋CHO細胞）に対して正規化した。融合タンパク質は、PD-L1の存在下でのみ、リファレンスCD137抗体単独またはリファレンスPD-L1抗体と組み合わされたリファレンスCD137抗体よりも強く、IL-2分泌の強い用量依存的増加を誘導する。図17Aの説明を参照のこと。図17Aの説明を参照のこと。図17Aの説明を参照のこと。実施例21で述べる、マウスにおける二重特異性融合タンパク質およびビルディングブロックPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）の薬物動態の結果である。雄CD-1マウス（1時点あたり3匹）に融合タンパク質を10mg/kgの用量で静脈内注射した。薬物レベルは、ターゲットPD-L1およびCD137によって完全分子を検出するサンドイッチELISAを使って検出した。抗PD-L1抗体の血清中レベルは、ターゲットPD-L1およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。実施例22で述べるように、マウスにおける、以前に記載された2種のCD137およびPD-L1結合性融合タンパク質（SEQ ID NO:147およびSEQ ID NO:148）と比較した、代表的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）の薬物動態解析の結果である。雄CD-1マウス（1時点あたり2匹）に試験分子を2mg/kgの用量で静脈内注射した。表示の時点でELISAを使って薬物レベルを検出した。データを時間対濃度のグラフにプロットした。本明細書記載のSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87は、好ましい薬物動態プロファイルまたは抗体様薬物動態を呈するが、SEQ ID NO:147やSEQ ID NO:148はそうではない。

IV. 本開示の詳細な説明
本明細書に記載するとおり、本開示は、抗体などの二価CD137結合物質は、三価可溶性CD137Lの活性の欠如と同様に、それだけでは、T細胞上またはNK細胞上のCD137をクラスター化して効率的な活性化をもたらすには十分でない場合があるという認識を包含する。前臨床マウスモデルを利用する最近の刊行物では、他の抗TNFR抗体の作用様式には、抗体と、そのFc部を介した、Fc-ガンマ受容体発現細胞上のFc-ガンマ受容体との相互作用が必要であるというインビボでの証拠が提示されている（Bulliard et al.,Immunol Cell Biol,2014、Bulliard et al.,J Exp Med,2013）。それゆえに、これらの抗TNFR抗体の作用様式は、正常組織と比較して、標的とする腫瘍微小環境において必ずしも過剰に発現しているわけではないFc-ガンマ受容体発現細胞の存在に依存する、Fc-ガンマ受容体を介した非標的型のクラスター化に支配されうる。

したがって、特異的な腫瘍標的型の作用様式でCD137をクラスター化し活性化する治療薬の生成には、未充足のニーズがある。

この未充足ニーズを満たすために、本開示は、なかんずく、CD137に対する結合特異性とPD-L1に対する結合特異性とを有する1つまたは複数の融合タンパク質を介して、CD137とPD-L1に同時に会合するための新規なアプローチを提供する。提供される融合タンパク質は、腫瘍微小環境において発現するPD-L1を使ってCD137陽性T細胞を橋かけすることによってCD137のクラスター化を促進するように設計されている。そのような二重特異性分子は、CD137が誘導するT細胞の活性化および拡大を抗PD-L1媒介姓免疫チェックポイント遮断と組み合わせることで、単剤治療の一定の制限を克服し、例えば抵抗性または不応性の患者に利益を与えうる。融合タンパク質は、一分子でのコンビナトリアル治療の可能性を提供すると同時に、腫瘍微小環境における抗原特異的T細胞の限局的誘導を可能にして、末梢毒性を潜在的に低減するようにも設計されている。

いくつかの局面において、本開示は、CD137とPD-L1に結合する融合タンパク質、ならびにそのための方法および有用な応用を提供する。本開示は、本明細書記載のCD137およびPD-L1結合性融合タンパク質を作製する方法、ならびにそのようなタンパク質を含む組成物も提供する。本開示のCD137およびPD-L1結合性融合タンパク質ならびにその組成物は、試料中のCD137および/またはPD-L1を検出する方法、対象におけるCD137および/またはPD-L1の結合方法、または対象における免疫応答を調節する方法において使用しうる。本開示が提供する用途に付随するこれらの特徴を有する上述の融合タンパク質は、今までに記載されてことがなかった。本明細書において提供される融合タンパク質とは対照的に、CD137とPD-L1の両方をターゲットとする従来公知の融合タンパク質には、1つまたは複数の好ましくない薬物動態、許容できない程度のオフターゲット結合、特定融合タンパク質のターゲットの一方または両方（例えばPD-L1および/またはCD137）に結合する能力の低減またはその他の劣化、および/または例えば免疫系などの許容できない程度の非特異的（例えばPD-L1非依存的）活性化という問題点があった。

A. 本開示のCD137とPD-L1に特異的な例示的融合タンパク質
いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、少なくとも2つのサブユニット、すなわち（1）PD-L1に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む第1サブユニット、および（2）CD137に特異的なリポカリンを含む第2サブユニットを、任意の順序で含有する。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、少なくとも1つの追加サブユニット、例えば第3のサブユニットも含有しうる。例えば融合タンパク質は、CD137に特異的な第3サブユニットを含有しうる。いくつかの態様において、第3サブユニットは、CD137に特異的なリポカリンムテインであるか、それを含みうる。例えば、2つのリポカリンムテインを第1免疫グロブリンサブユニットに、1つは免疫グロブリンのC末端に、1つは免疫グロブリンのN末端に融合しうる。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖に融合しうる。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、1つまたは複数の追加サブユニット（例えば第4、第5または第6サブユニット）を含みうる。

いくつかの態様では、少なくとも1つのサブユニットが、そのN末端および/またはそのC末端において、別のサブユニットに融合されうる。

いくつかの態様では、少なくとも1つのサブユニットを、別のサブユニットにリンカーを介して連結することができる。いくつかのさらなる態様において、リンカーはペプチドリンカー、例えば構造不定（unstructured）のグリシン-セリン（GS）リンカー、グリコシル化GSリンカー、またはプロリン-アラニン-セリンポリマー（PAS）リンカーである。いくつかの態様において、SEQ ID NO:13に示すGSリンカーは（Gly₄Ser）₃リンカー（（G₄S）₃）である。他の例示的リンカーをSEQ ID NO:14〜23に示す。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、1〜50個のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17 18、19、20、25、30、35、40、45または50個のアミノ酸を有しうる。例えば、第1サブユニットが完全長免疫グロブリンを含む場合、第2サブユニットは、第2サブユニットのN末端と該免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末端との間のペプチドリンカーを介して連結されうる。いくつかのさらなる態様では、第3サブユニットのN末端と該免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末端との間のペプチドリンカーを介して、第3サブユニットが連結されうる。

いくつかの態様では、1つのサブユニットを、本質的に図1に記載するように、別のサブユニットに連結することができる。一般に、1つのサブユニットは、そのN末端および/またはそのC末端において、別のサブユニットに融合されうる。例えばいくつかの態様では、リポカリンムテインサブユニットを、そのN末端および/またはそのC末端において、免疫グロブリンサブユニットに融合することができる。さらなる例では、1つのリポカリンムテインを、免疫グロブリン重鎖ドメイン（HC）のC末端、HCのN末端、免疫グロブリン軽鎖（LC）のC末端、および/またはLCのN末端に、好ましくはペプチド結合を介して連結することができる（図1A〜図1D）。

いくつかの態様では、リポカリンムテインサブユニットは、そのN末端および/またはそのC末端において、免疫グロブリンフラグメントに連結することができる。例えばいくつかの態様において、リポカリンムテインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末端または軽鎖定常領域（CL）のC末端に、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されうる。

いくつかの態様において、あるサブユニットが完全長免疫グロブリンを含む場合は、第2サブユニットのN末端と該免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末端との間で、第2サブユニットが連結されうる。

いくつかの態様では、第3サブユニットのN末端と該免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末端との間で、第3サブユニットが連結されうる。

いくつかの態様では、少なくとも1つのサブユニットが完全長免疫グロブリンであるか完全長免疫グロブリンを含みうる本開示の融合タンパク質に関して、融合タンパク質はCD137とPD-L1に同時に会合しつつ、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能も同時に保存されていてよい。

提供される融合タンパク質の少なくとも1つのサブユニットが完全長免疫グロブリンであるか完全長免疫グロブリンを含みうるいくつかの態様において、融合タンパク質はCD137とPD-L1に同時に会合しつつ、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能は、タンパク質工学によって低減されまたは完全に抑制されていてもよい。いくつかの態様において、これは、例えばIgG1バックボーンからIgG4へと転換することによって達成されうる。IgG4は、IgG1と比べて低減したFc-ガンマ受容体相互作用を呈することが公知だからである。いくつかの態様では、Fc-ガンマ受容体への残存する結合をさらに低減するために、F234AおよびL235Aなどの突然変異を、IgG4バックボーン中に導入してもよい。いくつかの態様では、IgG4半抗体の交換を最小限に抑えるために、S228P突然変異をIgG4バックボーン中に導入してもよい（Silva et al.,J Biol Chem,2015）。いくつかの態様では、ADCCおよびADCPを減少させるためにF234AおよびL235A突然変異を導入し（Glaesner et al.,Diabetes Metab Res Rev,2010）、かつ/または血清中半減期を延ばすためにM428LおよびN434S突然変異またはM252Y、S254TおよびT256E突然変異を導入してもよい（Dall’Acqua et al.,J Biol Chem,2006、Zalevsky et al.,Nat Biotechnol,2010）。いくつかの態様では、天然のグリコシル化モチーフを除去するために、さらにN297A突然変異が融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖に存在してもよい。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンのFc部は、融合タンパク質の血清中レベルの維持に寄与しうる。例えば、Fc部が内皮細胞上および食細胞上のFc受容体に結合すると、融合タンパク質は細胞内に移行して、血流へと再循環されることで、体内でのその半減期を向上させうる。

一局面において、本開示の融合タンパク質は高いアフィニティーでCD137に結合する。別の一局面において、提供される融合タンパク質は高いアフィニティーでPD-L1に結合する。いくつかの好ましい態様において、提供される融合タンパク質はCD137とPD-L1に同時に結合する。いくつかの態様において、CD137およびPD-L1への同時結合は、提供される融合タンパク質が耐久性のある抗腫瘍応答または抗感染応答を呈することを可能にする。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、最大でも約2nMまたはそれ未満、例えば約1.5nM以下、約1nM以下、約0.6nM以下、または約0.4nM以下のK_D値で、PD-L1に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、当該融合タンパク質に含まれているPD-L1に特異的な免疫グロブリン、例えばSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87とによって提供される重鎖および軽鎖を有する抗体のK_D値と同等か、それより低いK_D値で、PD-L1に結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のK_D値は、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）アッセイにおいて、例えば本質的に実施例3に記載するSPRアッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、最大でも約10nMまたはそれ未満、例えば約7nM、約6nM、または約5nM、約4nM、約3nM、約2nMまたはそれ未満のK_D値で、CD137に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、特定融合タンパク質に含まれるCD137に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:42、または抗体のFc領域に融合されたリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:89のK_D値と同等か、それより低いK_D値で、CD137に結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のK_D値は、例えばSPRアッセイにおいて、例えば本質的に実施例3に記載するSPRアッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、最大でも約0.5nMまたはそれ未満、例えば約0.3nM以下、約0.2nM以下、約0.15nM以下、または約0.1nM以下のEC₅₀値で、PD-L1に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、特定融合タンパク質に含まれているPD-L1に特異的な免疫グロブリン、例えばSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87とによって提供される重鎖および軽鎖を有する抗体のEC₅₀値と同等か、それより低いEC₅₀値で、PD-L1に結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のEC₅₀値は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）アッセイにおいて、例えば本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、最大でも約0.6nMまたはそれ未満、例えば約0.5nM以下、約0.2nM以下、約0.15nM以下、または約0.1nM以下のEC₅₀値で、CD137に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、特定融合タンパク質に含まれるCD137に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:42、または抗体のFc領域に融合されたリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:89のEC₅₀値と同等か、それより低いEC₅₀値で、CD137に結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のEC₅₀値は、例えばELISAアッセイにおいて、例えば本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質はカニクイザルPD-L1と交差反応する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、最大でも約0.5nMまたはそれ未満、例えば約0.2nM以下、約0.1nM以下、または約0.05nM以下のEC₅₀値で、カニクイザルPD-L1に結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のEC₅₀値は、例えばELISAアッセイにおいて、例えば本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質はカニクイザルCD137と交差反応する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、最大でも約15nMまたはそれ未満、例えば約10nM以下、約8nM以下、約6nM以下、約3nM以下、約1nM以下、約0.5nM以下、約3nM以下、または約0.1nM以下のEC₅₀値でカニクイザルCD137に結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のEC₅₀値は、例えばELISAアッセイにおいて、例えば本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて、測定されうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質の、カニクイザルCD137への結合は、実施例22で述べるように、アビディティ効果によって強化されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質はCD137とPD-L1に同時に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、最大でも約1nMまたはそれ未満、例えば0.8nM以下、0.6nM以下、または0.4nM以下のEC₅₀値で、CD137とPD-L1に同時に結合することが可能でありうる。いくつかの別の態様において、提供される融合タンパク質は、最大でも約10nMまたはそれ未満、例えば8nM以下、6nM以下、または3nM以下または2nM以下のEC₅₀値で、CD137とPD-L1に同時に結合することが可能でありうる。同時結合は、例えばELISAアッセイにおいて、例えば本質的に実施例5に記載するELISAアッセイにおいて、決定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、細胞上に発現したCD137に、最大でも約60nMまたはそれ未満、例えば約50nMまたはそれ未満、約40nMまたはそれ未満、約30nM以下、約10nM以下、約7nM以下、約5nM以下、約3nM以下、または約1nMもしくはそれ未満のEC₅₀値で結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のEC₅₀値は、例えば本質的に実施例6に記載するフローサイトメトリー分析において、測定されうる。CD137を発現する細胞は、例えばヒトCD137またはカニクイザルCD137がトランスフェクトされたCHO細胞でありうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、細胞上に発現したPD-L1に、最大でも約10nMまたはそれ未満、例えば約8nM以下、約6nM以下、約4nM以下、約2nM以下、または約1もしくはそれ未満のEC₅₀値で結合することが可能でありうる。提供される融合タンパク質のEC₅₀値は、例えば本質的に実施例6に記載するフローサイトメトリー分析において、測定されうる。PD-L1を発現する細胞は、例えばヒトPD-L1またはカニクイザルPD-L1がトランスフェクトされたCHO細胞でありうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、腫瘍細胞上に発現したPD-L1に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、腫瘍細胞上に発現したPD-L1に、最大でも約2nMまたはそれ未満、例えば約1.5nM以下、約1nM以下、約0.6nM以下、または約0.3nMもしくはそれ未満のEC₅₀値で結合することが可能でありうる。PD-L1発現腫瘍細胞に結合する融合タンパク質のEC₅₀値は、例えば本質的に実施例7に記載するフローサイトメトリー分析において、測定されうる。PD-L1を発現する腫瘍細胞は例えばRKO細胞でありうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD137LへのCD137の結合には、本質的に影響しない。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD137Lとの複合体を形成しているCD137に結合することが可能でありうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、SEQ ID NO:28およびSEQ ID NO:29によって提供される重鎖および軽鎖を有する抗CD137抗体と類似する様式でCD137に結合することが可能でありうる。CD137への融合タンパク質の結合様式は、例えばSPRアッセイによって、例えば本質的に実施例8に記載するSPRアッセイによって、決定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、PD-L1への結合に関してPD-1と競合することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1への結合に関して、最大でも約5nMまたはそれ未満、例えば約3nM以下、約2nM以下、または約1もしくはそれ未満のIC₅₀値で、PD-1と競合することが可能でありうる。阻害作用様式は、例えばELISAアッセイによって、例えば本質的に実施例9に記載するELISAアッセイによって、決定することができる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD137への結合に関して、SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29とに示す抗CD137抗体と競合することが可能でありうる。そのような競合は、本質的に実施例17に記載するELISAアッセイによってアッセイされうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29とに示す抗CD137抗体とオーバーラップするエピトープを有しうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、T細胞応答を共刺激することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1抗体、例えばビルディングブロックPD-L1抗体SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87またはリファレンスPD-L1抗体SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27、またはCD137抗体、例えばリファレンス抗体SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29と比較して、同等か、それより強いT細胞活性化をもたらす。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、抗PD-L1抗体とCD137ターゲティング分子、例えば抗CD137抗体または従来公知のCD137特異的リポカリンムテインとの組合せと比較して、同等か、またはそれより良好な効力で、T細胞活性化をもたらす。刺激されたT細胞応答またはT細胞活性化は、例えば本質的に実施例10に記載するCD137バイオアッセイにおいて、実施例18に記載するPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイにおいて、または本質的に実施例11、実施例12、実施例19および実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、IL-2分泌の増加を誘導することが可能でありうる。いくつかの好ましい態様において、提供される融合タンパク質は、濃度依存的なIL-2分泌を誘導すること、および/またはより高濃度で、好ましくはコーティング濃度で、強化されたIL-2分泌を誘導する傾向を呈することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、抗PD-L1抗体とCD137ターゲティング分子、例えば抗CD137抗体または従来公知のCD137特異的リポカリンムテインとの組合せと比較して、同等か、またはそれより良好な効力で、IL-2分泌の増加をもたらしうる。IL-2分泌は、例えば本質的に実施例11および実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、PD-L1依存的にT細胞応答を共刺激することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1トランスフェクト細胞またはPD-L1陽性腫瘍細胞などのPD-L1陽性細胞の近傍において、T細胞によるIL-2生産の局所的誘導をもたらしうる。「PD-L1陽性細胞の近傍において」とは、本明細書において使用される場合は、CD137とPD-L1に同時に結合する提供される融合タンパク質によって、T細胞とPD-L1陽性細胞とが互いに接近していることを指す。提供される融合タンパク質によるT細胞のPD-L1依存的活性化は、例えば本質的に実施例10に記載するCD137バイオアッセイにおいて、本質的に実施例18に記載するPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイにおいて、または本質的に実施例12および実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、決定されうる。

いくつかの好ましい態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1発現腫瘍細胞の存在下および/または腫瘍微小環境下で、T細胞応答を共刺激することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1陽性腫瘍細胞の存在下、約1nM以下、約0.5nM以下、約0.3nM以下、約0.1nM以下、または約0.05nM以下のEC₅₀値で、T細胞応答を共刺激することが可能でありうる。PD-L1発現腫瘍細胞の存在下および/または腫瘍微小環境下での、提供される融合タンパク質によるT細胞活性化は、例えば本質的に実施例10に記載するCD137バイオアッセイまたは本質的に実施例12に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、アッセイされうる。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1の非存在下では、T細胞応答を共刺激することができない。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1発現細胞の非存在下では、T細胞応答を共刺激することができない。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-L1の存在を識別し、SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29とに示されるCD137抗体よりも良好に、対応するT細胞活性化をもたらすことが可能でありうる。融合タンパク質のPD-L1依存的作用は、例えば本質的に実施例10に記載するCD137バイオアッセイにおいて、本質的に実施例18に記載するPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイにおいて、または本質的に実施例12および実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、決定されうる。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-1またはPD-L1の結合によって媒介される阻害シグナルを遮断することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、PD-1/PD-L1相互作用を遮断することによってT細胞活性化のブレーキを解除しまたはT細胞活性化の成功をもたらすことが可能でありうる。PD-1阻害シグナルの遮断は、例えば実施例18に記載するPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイにおいて、測定されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、T細胞の増殖および/または活性化を刺激することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、CD4^＋T細胞の増殖および/または活性化を刺激することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、IL-2分泌、好ましくは用量依存的IL-2分泌を誘導することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、抗PD-L1抗体とCD137ターゲティング分子、例えば抗CD137抗体または従来公知のCD137特異的リポカリンムテインとの組合せと比較して、より高いIL-2分泌を誘導することが可能でありうる。本明細書にいうIL-2分泌は、T細胞活性化の尺度でありうる。提供される融合タンパク質によるCD4^＋T細胞の増殖および/または活性化は、例えば本質的に実施例14に記載する混合リンパ球反応（MLR）アッセイによって評価されうる。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD8^＋T細胞の増殖および/または活性化を刺激することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、IL-2ならびにエフェクター分子、例えばパーフォリン、グランザイムAおよびグランザイムBの生産を誘導することが可能でありうる。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、抗PD-L1抗体とCD137ターゲティング分子、例えば抗CD137抗体または従来公知のCD137特異的リポカリンムテインとの組合せと比較して、IL-2および細胞傷害性因子、例えばパーフォリン、グランザイムBおよびグランザイムAなどの生産の増加を誘導することが可能でありうる。提供される融合タンパク質によって刺激されるCD8^＋T細胞の増殖および/または活性化は、例えば本質的に実施例15に記載するMLRアッセイによって評価されうる。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、好ましい安定性および薬物動態プロファイルを有する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、ビルディングブロック抗体SEQ ID NO:86およびSEQ ID NO:87と同等な薬物動態プロファイルを有する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は抗体様の薬物動態を有する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、約200時間以上、約250時間以上、約300時間以上、約350時間以上、約400時間以上の、またはさらに長い、終末半減期を有する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:147よりも好ましい薬物動態プロファイルを有する。いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:148よりも好ましい薬物動態プロファイルを有する。提供される融合タンパク質の薬物動態プロファイルは、実施例21および実施例22で述べるように解析されうる。いくつかの態様において、好ましい薬物動態プロファイルまたは抗体様の薬物動態は、336時間後にc_maxの％が10％超であれば、達成されたとみなされうる。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:88〜94のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:88〜94のいずれか1つに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、またはそれよりさらに高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、またはSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、提供される融合タンパク質は、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、またはSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、またはそれよりさらに高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

B. 融合タンパク質に含まれる例示的免疫グロブリン
いくつかの態様において、提供される融合タンパク質に関して、第1サブユニットは、PD-L1に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインであるか、それを含みうる。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、例えばIgG1、IgG2またはIgG4でありうる。いくつかの態様において、免疫グロブリンはIgG4であるか、IgG4を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンはPD-L1に対するモノクローナル抗体である。

本開示のPD-1結合性抗体の具体例は、アテゾリズマブ（MPDL3280AまたはRG7446としても公知である;商標名Tecentriq（登録商標））、アベルマブ（MSB0010718Cとしても公知である;商標名Bavencio（登録商標））、デュルバルマブ（MEDI4736として従来公知である;商標名Imfinzi（登録商標））およびBMS-936559（MDX-1105としても公知である）、5C10（ヒト化5C10を含む）、5F10（ヒト化5F10を含む）および9F6（ヒト化9F6を含む）などといった公知の抗体の重鎖可変ドメイン（V_H）領域と軽鎖可変ドメイン（V_L）領域とを含むPD-L1結合性抗体と同じエピトープを交差ブロックしまたは同じエピトープに結合する抗原結合領域を含みうる。いくつかの態様において、本開示のPD-L1結合性抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、BMS-936559、5C10、5F10および9F6からなる群より選択された抗体からの抗原結合領域、例えば3つの重鎖相補性決定領域（CDR）（HCDR1、HCDR2およびHCDR3）および3つの軽鎖CDR（LCDR1、LCDR2およびLCDR3）のうちのいずれか1つなどを含みうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:75〜79からなる群より選択される重鎖可変領域（HCVR）、および/またはSEQ ID NO:80〜84からなる群より選択される軽鎖可変領域（LCVR）を有しうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:85〜86のいずれか1つである重鎖および/またはSEQ ID NO:87である軽鎖を有しうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインの重鎖と軽鎖のペアは、それぞれ以下のHCVRおよびLCVRであるか、またはそれらを含む:SEQ ID NO:75とSEQ ID NO:80、SEQ ID NO:76とSEQ ID NO:81、SEQ ID NO:77とSEQ ID NO:82、SEQ ID NO:78とSEQ ID NO:83、またはSEQ ID NO:79とSEQ ID NO:84。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体の重鎖と軽鎖のペアは、SEQ ID NO:85とSEQ ID NO:87またはSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87に示されるアミノ酸配列であるか、またはそれらを含む。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:75〜79からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくはそれよりさらに高い配列同一性を持つHCVR、および/またはSEQ ID NO:80〜84からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくはそれよりさらに高い配列同一性を持つLCVRを有しうる。別の態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:85〜86からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくはそれよりさらに高い配列同一性を持つ重鎖、および/またはSEQ ID NO:87のアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくはそれよりさらに高い配列同一性を持つ軽鎖を有しうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つのCDRを有しうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つのCDRを有しうる:GFDIKDTY（HCDR1、SEQ ID NO:65）、IDPADGNT（HCDR2、SEQ ID NO:66）、ARGLGAWFAS（HCDR3、SEQ ID NO:67）。いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、以下の配列を有する3つのCDRを有しうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、以下の配列を有する3つのCDRを有しうる。

いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインは、以下の配列:

を有する3つのCDRを有する重鎖可変領域と、以下の配列:

を有する3つのCDRを有する軽鎖可変領域とを含む。いくつかの態様において、提供されるPD-L1抗体またはその抗原結合ドメインは、以下の配列:

を有する3つのCDRを有する重鎖可変領域と、以下の配列:

を有する3つのCDRを有する軽鎖可変領域とを含む。

別段の表示がある場合を除き、本明細書において開示するCDR配列はいずれも、Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136（1999）に記載されているように、IMGT法に従って定義される。CDR1は位置27〜38からなり、CDR2は位置56〜65からなり、生殖細胞系V遺伝子の場合、CDR3は位置105〜116、再配列されたV-J遺伝子またはV-D-J遺伝子の場合、CDR3は位置105〜117（J-PHEまたはJ-TRP118の前の位置）からなって、13アミノ酸未満の再配列CDR3-IMGTの場合はループの最上部にギャップを、また13アミノ酸超の再配列CDR3-IMGTについては追加位置112.1、111.1、112.2、111.2などを伴う。このパラグラフに記載する位置は、Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136（1999）に記載のIMGTナンバリングに従う。

本開示の融合タンパク質に含まれるPD-L1に特異的に結合する抗体は、本開示の二重特異性結合分子のインビボ半減期を延ばすことを可能にするFc部を含みうる。いくつかの態様において、そのようなFc部は、好ましくはヒト由来であり、より好ましくはIgG1抗体またはIgG4抗体のヒトFc部であり、さらに好ましくはエフェクター機能が活性化または無効化されているIgG1またはIgG4の工学的に操作されたヒトFc部である。いくつかの態様では、エフェクター機能を無効化することの方がエフェクター機能を活性化することより好まれうる。いくつかの態様において、そのようなFc部は、KabatのEUインデックスによるナンバリング（Johnson and Wu,Nucleic Acids Res,2000）で位置234および/または位置235における突然変異によってエフェクター機能を無効化するように操作されている。いくつかの態様では、エフェクター機能を無効化するために、提供される抗PD-L1抗体の位置F234および位置L235に突然変異を導入しうる。別の態様では、エフェクター機能を無効化するために、提供される抗PD-L1抗体の位置D265および位置P329に突然変異を導入しうる。これら突然変異候補のどちらのセットについても、ナンバリングはKabatのEUインデックスによる（Shields et al.,J Biol Chem,2001）。

抗体およびそのフラグメントを生産するためのさまざまな技法が当技術分野では周知であり、それらは例えばAltshulerら（2010）に記載されている。したがって、例えばポリクローナル抗体は、添加剤およびアジュバントと混合された抗原による免疫化後に、動物の血液から得ることができ、モノクローナル抗体は連続継代性細胞株培養物によって産生される抗体を与える任意の技法によって生産することができる。そのような技法の例は、例えばHarlow and Lane（1999）,（1988）に記載されており、Koehler and Milstein,1975によって最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（例えばLi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2006、Kozbor and Roder,Immunol Today,1983参照）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブリドーマ技法（Cole et al.,Cancer Res,1984）などがある。さらにまた、組換え抗体はモノクローナル抗体から得ることも、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、または細胞ディスプレイなどのさまざまなディスプレイ方法を使って新規に調製することもできる。いくつかの態様において、組換え（ヒト化）抗体またはそのフラグメントの発現に適した系は、例えば細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞株またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物などから選択されうる（例えば米国特許第6,080,560号、Holliger and Hudson,Nat Biotechnol,2005参照）。さらに、一本鎖抗体の生産に関して記載された技法（なかんずく米国特許第4,946,778号参照）を、本発明のターゲットに特異的な一本鎖抗体を生産するために適合させることができる。ファージ抗体の効率を増加させるために、BIAcoreシステムにおいて利用されている表面プラズモン共鳴を使用することができる。

C. 例示的な本開示のリポカリンムテイン
リポカリンは、リガンドに結合するように自然に進化したタンパク質性結合分子である。リポカリンは、脊椎動物、昆虫、植物および細菌を含む多くの生物に見いだされる。リポカリンタンパク質ファミリーのメンバー（Pervaiz and Brew,FASEB J,1987）は、典型的には、小さな分泌タンパク質であり、単一のペプチド鎖を有する。それらは一連の異なる分子認識特性、すなわち、主として疎水性のさまざまな低分子（レチノイド、脂肪酸、コレステロール、プロスタグランジン、ビリベルジン、フェロモン、味物質、および匂い物質など）へのそれらの結合、特異的細胞表面受容体へのそれらの結合、およびそれらの高分子複合体形成によって特徴づけられる。リポカリンは以前は主に輸送タンパク質として分類されていたが、現在では、リポカリンがさまざまな生理学的機能を果たすことが明らかになっている。それらには、レチノール輸送、嗅覚、フェロモンシグナリング、およびプロスタグランジンの合成における役割が含まれる。リポカリンは、免疫応答の制御および細胞ホメオスタシスの媒介にも関係づけられている（例えばFlower et al.,Biochim Biophys Acta,2000、Flower,Biochem J,1996に総説がある）。

リポカリンが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低く、多くの場合、配列同一性は20％未満である。それとは著しく対照的に、それらの全体的フォールディングパターンは高度に保存されている。リポカリン構造の中心的部分は、一周して閉じることで途切れなく水素結合したβバレルを形成する単一の8ストランド逆平行βシートからなる。このβバレルは中心に空洞を形成する。バレルの一端は、その底を横切るN末端ペプチドセグメントおよびβストランドを接続する3つのペプチドループによって、立体的にブロックされている。βバレルの他端は溶媒に向かって開いており、4つのフレキシブルなペプチドループ（AB、CD、EFおよびGH）によって形成されるターゲット結合部位を包含する。サイズ、形状、および化学的特徴が異なるターゲットを収容する能力をそれぞれが有するさまざまな異なる結合様式を生じさせるのは、他の点では剛直なリポカリンスキャフォールドにおける、ループのこの多様性である（例えばSkerra,Biochim Biophys Acta,2000、Flower et al.,Biochim Biophys Acta,2000、Flower,Biochem J,1996に総説がある）。

本開示によるリポカリンムテインは、任意のリポカリンのムテインであってよい。ムテインの形で使用しうる適切なリポカリン（「リファレンスリポカリン」、「野生型リポカリン」、「リファレンスタンパク質スキャフォールド」または単に「スキャフォールド」と呼ぶ場合もある）の例としては、涙液リポカリン（リポカリン-1、Tlcまたはフォン・エブネル腺タンパク質）、レチノール結合タンパク質、好中球リポカリン型プロスタグランジンDシンターゼ、β-ラクトグロブリン、ビリン結合タンパク質（bilin-binding protein:BBP）、アポリポタンパク質D（APOD）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、α2-ミクログロブリン関連タンパク質（A2m）、24p3/ウテロカリン（24p3）、フォン・エブネル腺タンパク質1（von Ebner’s gland protein 1:VEGP1）、フォン・エブネル腺タンパク質2（VEGP2）、および主要アレルゲンCan f1（ALL-1）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。関連態様では、リポカリンムテインが、ヒト涙液リポカリン（hTlc）、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）、ヒトアポリポタンパク質D（hAPOD）およびオオモンシロチョウ（Pieris brassicae）のビリン結合タンパク質からなるリポカリン群から誘導される。

本開示によるリポカリンムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比較すると、その由来となったリファレンス（または野生型）リポカリン、例えばhTlcまたはhNGALとの比較において、高い配列同一性を有しうる（上記も参照されたい）。この一般的状況において、本開示によるリポカリンムテインのアミノ酸配列は、対応するリファレンス（野生型）リポカリンのアミノ酸配列に、少なくとも実質的に類似している。ただし、アラインメントには、アミノ酸の付加または欠失の結果である（本明細書に定義する）ギャップが存在しうる。対応するリファレンス（野生型）リポカリンの配列に実質的に類似している本開示のリポカリンムテインのそれぞれの配列は、いくつかの態様において、対応するリポカリンの配列に対して少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも95％の同一性を有する。この点に関して、本開示のリポカリンムテインは、もちろん、CD137に結合する能力を当該リポカリンムテインに与える本明細書記載の置換を含有しうる。

典型的には、リポカリンムテインは、野生型またはリファレンスリポカリン、例えばhTlcおよびhNGALとの比較で、リガンド結合ポケットを構成しリガンド結合ポケットの入口を規定する開口端にある4つのループ（上記参照）に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含有する。上で説明したとおり、これらの領域は、所望のターゲットに対するリポカリンムテインの結合特異性を決定するのに不可欠である。いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、4つのループ以外にも変異アミノ酸残基領域を含有しうる。いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、リポカリンの閉鎖端においてβストランドを接続する3つのペプチドループ（BC、DEおよびFGと呼ばれるもの）のうちの1つまたは複数に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含有しうる。いくつかの態様において、涙液リポカリン、NGALリポカリンまたはそのホモログから誘導されたムテインは、N末端領域中ならびに/または天然リポカリン結合ポケットとは反対側にあるβバレル構造の端部に配された3つのペプチドループBC、DEおよびFG中の任意の配列位置に、1、2、3もしくは4個またはそれ以上の変異アミノ酸残基を有しうる。いくつかの態様において、涙液リポカリン、NGALリポカリンまたはそのホモログから誘導されるムテインは、涙液リポカリンの野生型配列と比較して、βバレル構造の端部に配されたペプチドループDE中に変異アミノ酸残基を有さなくてもよい。

いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、そのようなリポカリンムテインがCD137に結合する能力を有するという条件の下で、対応するリファレンス（野生型）リポカリンのアミノ酸配列と比較して、1つまたは複数の、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上の、変異アミノ酸残基を含みうる。いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、対応するリファレンス（野生型）リポカリンのネイティブアミノ酸残基がアルギニン残基で置換されている、少なくとも2つ、例えば2、3、4もしくは5個またはそれ以上の変異アミノ酸残基を含む。

提供されるリポカリンムテインがCD137に結合するというその能力を保ち、かつ/またはリファレンス（野生型）リポカリン、例えば成熟hTlcまたは成熟hNGALのアミノ酸配列に対して、少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の同一性である配列同一性を有する限り、任意のタイプおよび数の突然変異、例えば置換、欠失および挿入が想定される。

いくつかの態様において、置換は保存的置換である。いくつかの態様において、置換は非保存的置換、または以下の例示的置換からの1つもしくは複数である。

具体的には、リポカリンムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、リファレンス（野生型）リポカリンのアミノ酸配列中の一定の位置に対応するリファレンス（野生型）リポカリンと異なるかどうかを決定するために、当業者は、例えば手作業によるアラインメント、またはBLAST2.0（これはBasic Local Alignment Search Toolの略である）もしくはClustalWなどのコンピュータプログラム、または配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の適切なプログラムを使ったアラインメントなど、当技術分野において周知の手段および方法を使用することができる。したがって、リファレンス（野生型）リポカリンのアミノ酸配列が「対象配列」または「リファレンス配列」として役立ちうるのに対し、リポカリンムテインのアミノ酸配列は「クエリー配列」として役立つ（上記も参照されたい）。

保存的置換とは一般的には以下の置換であり、ここでは、変異させるアミノ酸別に列挙して、それぞれの後に、保存的であると解釈することができる1つまたは複数の置き換えが記されている:Ala→Ser、ThrまたはVal;Arg→Lys、Gln、AsnまたはHis;Asn→Gln、Glu、AspまたはHis;Asp→Glu、Gln、AsnまたはHis;Gln→Asn、Asp、GluまたはHis;Glu→Asp、Asn、GlnまたはHis;His→Arg、Lys、Asn、Gln、AspまたはGlu;Ile→Thr、Leu、Met、Phe、Val、Trp、Tyr、AlaまたはPro;Leu→Thr、Ile,Val、Met、Ala、Phe、Pro、TyrまたはTrp;Lys→Arg、His、GlnまたはAsn;Met→Thr、Leu、Tyr、Ile、Phe、Val、Ala、ProまたはTrp;Phe→Thr、Met、Leu、Tyr、Ile、Pro、Trp、ValまたはAla;Ser→Thr、AlaまたはVal;Thr→Ser、Ala、Val、Ile、Met、Val、Phe、ProまたはLeu;Trp→Tyr、Phe、Met、IleまたはLeu;Tyr→Trp、Phe、Ile、LeuまたはMet;Val→Thr、Ile、Leu、Met、Phe、Ala、SerまたはPro。他の置換も許容され、それらは実験的に決定することができるか、または他の公知の保存的もしくは非保存的置換に一致しうる。さらなる指針として、以下の群は、それぞれが、互いにとっての保存的置換を規定すると典型的に解釈することができるアミノ酸を含んでいる:
（a）アラニン（Ala）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、バリン（Val）
（b）アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、ヒスチジン（His）
（c）アルギニン（Arg）、リジン（Lys）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、ヒスチジン（His）
（d）イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、バリン（Val）、アラニン（Ala）、フェニルアラニン（Phe）、スレオニン（Thr）、プロリン（Pro）
（e）イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）。

そのような保存的置換が生物学的活性の変化をもたらすのであれば、例えば以下のような、またはアミノ酸クラスに関してさらに後述するような、より実質的な変化を導入して、その生成物を所望の特徴についてスクリーニングしてもよい。そのようなより実質的な変化の例は、Ala→LeuまたはPhe;Arg→Glu;Asn→Ile、ValまたはTrp;Asp→Met;Cys→Pro;Gln→Phe;Glu→Arg;His→Gly;Ile→Lys、GluまたはGln;Leu→LysまたはSer;Lys→Tyr;Met→Glu;Phe→Glu、GlnまたはAsp;Trp→Cys;Tyr→GluまたはAsp;Val→Lys、Arg、Hisである。

いくつかの態様において、リポカリン（ムテイン）の物理的および生物学的特性の実質的改変は、（a）置換領域における例えばシートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーションなどとしてのポリペプチド主鎖の構造の維持、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性の維持、または（c）側鎖の嵩高さの維持に及ぼすその効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。

天然残基は、共通する側鎖の特性に基づいてグループ分けすることができる:（1）疎水性:メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン;（2）中性親水性:システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン;（3）酸性:アスパラギン酸、グルタミン酸;（4）塩基性:ヒスチジン、リジン、アルギニン;（5）鎖配向に影響を及ぼす残基:グリシン、プロリン;および（6）芳香族:トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。いくつかの態様において、置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを必然的に伴いうる。

各リポカリンの適正なコンフォメーションの維持に関与していないシステイン残基はいずれも、その分子の酸化安定性を改良し異常な架橋を防ぐために、一般的にはセリンで、置換しうる。逆に、リポカリンには、その安定性を改良するために、システイン結合を加えてもよい。

D. 例示的な本開示のCD137特異的リポカリンムテイン
上記のとおり、リポカリンは、その超二次構造、すなわち4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域によって規定されるポリペプチドである。本開示は、本明細書において具体的に開示するリポカリンムテインに限定されない。この点に関して、本開示は、4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有するリポカリンムテインであって、前記4つのループのうちの少なくとも3つのそれぞれの少なくとも1つのアミノ酸が突然変異していて、CD137に検出可能なアフィニティーで結合するのに有効であるリポカリンムテインに関する。

いくつかの態様において、本明細書に開示するリポカリンムテインは、成熟ヒト涙液リポカリン（hTlc）のムテインであるか、それを含みうる。成熟hTlcのムテインを本明細書では「hTlcムテイン」と呼ぶことがある。他のいくつかの態様において、本明細書に開示するリポカリンムテインは、成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）のムテインである。成熟hNGALのムテインを本明細書では「hNGALムテイン」と呼ぶことがある。

一局面において、本開示は、リファレンス（野生型）リポカリンから誘導される、好ましくは成熟hTlcまたは成熟hNGALから誘導される、リポカリンムテインであって、CD137に検出可能なアフィニティーで結合するものを数多く包含する。関連する一局面において、本開示は、CD137に結合することによってCD137の下流シグナリング経路を活性化する能力を有するさまざまなリポカリンムテインを包含する。この意味において、CD137は、リファレンス（野生型）リポカリンの、好ましくはhTlcまたはhNGALの、非天然ターゲットとみなすことができ、ここで「非天然ターゲット」とは、生理的条件下でリファレンス（野生型）リポカリンに結合しない物質を指す。リファレンス（野生型）リポカリンを一定の配列位置における1つまたは複数の突然変異で工学的に操作することによって、非天然ターゲットであるCD137に対する高いアフィニティーおよび高い特異性が可能であることを、本発明者らは実証した。いくつかの態様では、CD137に結合する能力を有するリポカリンムテインを生成させる目的で、野生型リポカリン上の一定の配列位置をコードする1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12個またはそれ以上のヌクレオチドトリプレットにおいて、ヌクレオチドトリプレットの部分集合でこれらの位置における置換を行うことによって、ランダム突然変異導入を実行しうる。

いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、リファレンスリポカリンの、好ましくはhTlcまたはhNGALの、直鎖ポリペプチド配列に対応する1つまたは複数の配列位置におけるアミノ酸残基が、置換、欠失および挿入を含む突然変異を起こしていてもよい。いくつかの態様において、リファレンスリポカリンの、好ましくはhTlcまたはhNGALの、アミノ酸配列との比較で突然変異している本開示のリポカリンムテインのアミノ酸残基の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20またはそれ以上、例えば25、30、35、40、45もしくは50であり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11は好ましく、9、10または11はさらに好ましい。ただし本開示のリポカリンムテインはCD137に結合する能力を依然として有することが好ましい。

いくつかの態様において、例えばSEQ ID NO:34〜40など、本開示のリポカリンムテインは、それぞれのリファレンス（野生型）リポカリンと比較して、そのN末端の1、2、3もしくは4個、またはそれ以上のアミノ酸、および/またはそのC末端の1もしくは2個またはそれ以上のアミノ酸を欠いてもよい。いくつかの態様において、本開示は、成熟hTlcの最初の1つ、2つ、3つもしくは4つのN末端アミノ酸残基（His-His-Leu-Leu;位置1〜4）および/または成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列の最後の1個もしくは2個のC末端アミノ酸残基（Ser-Asp;位置157〜158）が欠失している、上に定義したhTlcムテインを包含する（例えばSEQ ID NO:34〜40）。いくつかの態様において、本開示は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列のアミノ酸残基（Lys-Asp-Pro、位置46〜48）が欠失している、上に定義したhNGALムテインを包含する（SEQ ID NO:45）。さらに、本開示のリポカリンムテインは、変異アミノ酸配列位置以外に、リファレンス（野生型）リポカリンの、好ましくはhTlcまたはhNGALの、野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。

いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインに組み入れられる1つまたは複数の変異アミノ酸残基は、指定されたターゲットへの結合活性およびムテインのフォールディングを、実質的に阻止または妨害しない。置換、欠失および挿入を含むそのような突然変異は、確立された標準的方法を使って、DNAレベルで達成することができる（Sambrook and Russell,2001,Molecular cloning:a laboratory manual）。いくつかの態様において、リファレンス（野生型）リポカリンの、好ましくはhTlcまたはhNGALの、直鎖ポリペプチド配列に対応する1つまたは複数の配列位置における変異アミノ酸残基は、ランダム突然変異導入により、リファレンスリポカリンの対応する配列位置をコードするヌクレオチドトリプレットをヌクレオチドトリプレットの部分集合で置換することによって導入される。

いくつかの態様において、CD137に検出可能なアフィニティーで結合する提供されるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸、例えばセリン残基による、アミノ酸置換を少なくとも1つは含みうる。いくつかの態様において、CD137に検出可能なアフィニティーで結合するリポカリンムテインは、リファレンス（野生型）リポカリンの、好ましくはhTlcまたはhNGALの、1つまたは複数のアミノ酸を置換する、1つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含みうる。いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブアミノ酸の、システイン残基によるアミノ酸置換を少なくとも2つは含み、これにより、1つまたは複数のシステイン架橋を形成する。いくつかの態様において、該システイン架橋は少なくとも2つのループ領域を接続しうる。これらの領域の定義は、本明細書では、（Biochim Biophys Acta,2000）、Flower（1996）およびBreustedtら（2005）による。

一般に、本開示のリポカリンムテインは、成熟hTlc（SEQ ID NO:1）または成熟hNGAL（SEQ ID NO:2）のアミノ酸配列に対して、およそ少なくとも70％、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有しうる。

いくつかの局面において、本開示はCD137結合性hTlcムテインを提供する。これに関して、本開示は、約300nM、200nM、150nM、100nM、またはそれ未満の、K_Dによって測定されるアフィニティーでCD137に結合する能力を有する、1つまたは複数のhTlcムテインを提供する。いくつかの態様において、提供されるhTlcムテインは、約250nM、150nM、100nM、50nM、20nM、またはそれ未満のEC₅₀値でCD137に結合する能力を有する。他のいくつかの態様において、CD137結合性hTlcムテインはカニクイザルCD137（cyCD137）と交差反応しうる。

いくつかの態様において、本開示のhTlcムテインは、CD137へのCD137Lの結合を妨害しうる。

いくつかの態様において、提供されるhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。

いくつかの態様において、提供されるhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置26〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106および108に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。

いくつかの態様において、提供されるhTlcムテインは、さらに、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置101、111、114および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。

いくつかの態様において、提供されるhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくは26個またはそれ以上の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。いくつかの好ましい態様において、提供されるhTlcムテインは、CD137、特にヒトCD137に結合する能力を有する。

いくつかの態様において、提供されるhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置26〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106および108に対応する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12個またはそれ以上の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。いくつかの好ましい態様において、提供されるhTlcムテインは、CD137、特にヒトCD137に結合する能力を有する。

いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を少なくとも1つは含みうる。いくつかの態様において、本開示によるhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置61および/または位置153に対応する位置にあるネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を含む。これに関連して、システイン残基61とシステイン残基153とによって形成される野生型hTlcの構造的ジスルフィド結合（Breustedt,et al.,J Biol Chem,2005参照）の（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルでの）除去が、安定にフォールディングされるだけでなく、所与の非天然ターゲットに高いアフィニティーで結合することもできるhTlcムテインを与えうることが見いだされている点に注目されたい。いくつかの態様において、構造的ジスルフィド結合の排除は、本開示のムテインにおける非天然ジスルフィド結合の生成または計画的導入を可能にし、それによってムテインの安定性を増加させるという、さらなる利点を提供しうる。ただし、CD137に結合し、Cys61とCys153の間に形成されたジスルフィド架橋を有するhTlcムテインも、本開示の一部である。

いくつかの特定態様において、本開示のhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置61および/または位置153に対応する位置に、アミノ酸置換Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、ProもしくはTrpおよび/またはCys153→SerもしくはAlaのうちの1つまたは複数を含みうる。

いくつかの態様では、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置61、101および153に対応する位置のシステインコドンのうちの2つまたは3つすべてが、別のアミノ酸のコドンで置き換えられる。さらに、いくつかの態様では、本開示によるhTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置101に対応する位置にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基またはヒスチジン残基によるアミノ酸置換を含む。

いくつかの態様において、本開示によるムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置28または位置105に対応する位置における、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む。さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置111に対応する位置における、ネイティブアルギニン残基の、プロリン残基によるアミノ酸置換を含む。さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置114に対応する位置における、ネイティブリジン残基の、トリプトファン残基またはグルタミン酸によるアミノ酸置換を含む。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含みうる:Ala5→ValまたはThr;Arg26→Glu;Glu27→Gly;Phe28→Cys;Pro29→Arg;Glu30→Pro;Met31→Trp;Leu33→Ile;Glu34→Phe;Thr42→Ser;Gly46→Asp;Lys52→Glu;Leu56→Ala;Ser58→Asp;Arg60→Pro;Cys61→Ala;Lys65→ArgまたはAsn;Thr71→Ala;Val85→Asp;Lys94→ArgまたはGlu;Cys101→Ser;Glu104→Val;Leu105→Cys;His106→Asp;Lys108→Ser;Arg111→Pro;Lys114→Trp;Lys121→Glu;Ala133→Thr;Arg148→Ser;Ser150→Ile;およびCys153→Ser。いくつかの態様において、本開示のhTlcムテインは、成熟hTlc（SEQ ID NO:1）のこれらの配列位置に、2つまたはそれ以上の、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくは26個またはそれ以上の、さらにはすべての、変異アミノ酸残基を含む。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hTlcムテインは、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して、以下の変異アミノ酸残基のセットのうちの1つを含みうる。

いくつかの態様において、本開示のhTlcムテインの残りの領域、すなわち成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する位置以外の領域は、変異アミノ酸配列位置以外に、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列の野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。

いくつかの態様において、本開示のhTlcムテインは、成熟hTlcの配列（SEQ ID NO:1）に対して、少なくとも70％の配列同一性または少なくとも70％の配列相同性を有する。具体的一例として、SEQ ID NO:34のムテインは、成熟hTlcのアミノ酸配列に対して、およそ84％のアミノ酸配列同一性またはアミノ酸配列相同性を有する。

いくつかの態様において、本開示のhTlcムテインは、SEQ ID NO:34〜40のいずれか1つに示すアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。

いくつかの態様において、本開示のhTlcムテインは、SEQ ID NO:34〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはそれより高い配列同一性を有する。

本開示は、SEQ ID NO:34〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するhTlcムテインの構造ホモログであって、該hTlcムテインとの関係において約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性またはアミノ酸配列同一性を有する構造ホモログも包含する。

いくつかの局面において、本開示はCD137結合性hNGALムテインを提供する。これに関して、本開示は、約800nM、700nM、200nM、140nM、100nM以下、好ましくは約70nM、50nM、30nM、10nM、5nM、2nM、またはそれ未満の、K_Dによって測定されるアフィニティーでCD137に結合する能力を有する、1つまたは複数のhNGALムテインを提供する。いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、約1000nM、500nM、100nM、80nM、50nM、25nM、18nM、15nM、10nM、5nM、またはそれ未満のEC₅₀値で、CD137に結合する能力を有する。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインはカニクイザルCD137と交差反応しうる。いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、約50nM、20nM、10nM、5nM、2nM、またはそれ未満の、K_Dによって測定されるアフィニティーでカニクイザルCD137に結合する能力を有する。いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、約100nM、80nM、50nM、30nM、またはそれ未満のEC₅₀値で、カニクイザルCD137に結合する能力を有する。

いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、CD137へのCD137Lの結合を妨害するか、CD137へのCD137Lの結合と競合しうる。他のいくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、CD137Lの存在下でCD137に結合する能力および/またはCD137/CD137L複合体に結合する能力を有しうる。

いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。

いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくは21個またはそれ以上の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。いくつかの好ましい態様において、提供されるhNGALムテインは、CD137、特にヒトCD137に結合する能力を有する。

いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。いくつかの好ましい態様において、提供されるhNGALムテインはCD137、特にヒトCD137に結合する能力を有する。

いくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、87および96に対応する1つまたは複数の位置と、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置とに、変異アミノ酸残基を含みうる。

他のいくつかの態様において、提供されるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、28、33、36、40〜41、44、49、52、59、68、70〜73、77〜82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含みうる。

別の態様において、提供されるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置と、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101および122に対応する1つまたは複数の位置とに、変異アミノ酸残基を含みうる。

いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を、少なくとも1つは含みうる。いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置76および/または位置175に対応する位置にあるネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を含みうる。これに関連して、システイン残基76とシステイン残基175とによって形成される野生型hNGALの構造的ジスルフィド結合（Breustedt,et al.,J Biol Chem,2005参照）の（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルでの）除去が、安定にフォールディングされるだけでなく、所与の非天然ターゲットに高いアフィニティーで結合することもできるhNGALムテインを与えうることが見いだされている点に注目されたい。いくつかの態様において、構造的ジスルフィド結合の排除は、本開示のムテインにおける非天然ジスルフィド結合の生成または計画的導入を可能にし、それによってムテインの安定性を増加させるという、さらなる利点を提供しうる。ただし、CD137に結合し、Cys76とCys175の間に形成されたジスルフィド架橋を有するhNGALムテインも、本開示の一部である。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含みうる:Gln28→His;Leu36→Gln;Ala40→Ile;Ile41→ArgまたはLys;Gln49→Val、Ile、His、SerまたはAsn;Tyr52→Met;Asn65→Asp;Ser68→Met、AlaまたはGly;Leu70→Ala、Lys、SerまたはThr;Arg72→Asp;Lys73→Asp;Asp77→Met、Arg、ThrまたはAsn;Trp79→AlaまたはAsp;Arg81→Met、TrpまたはSer;Phe83→Leu;Cys87→Ser;Leu94→Phe;Asn96→Lys;Tyr100→Phe;Leu103→His;Tyr106→Ser;Lys125→Phe;Ser127→Phe;Tyr132→GluおよびLys134→Tyr。いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGAL（SEQ ID NO:2）のこれらの配列位置に、2つまたはそれ以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12個、またはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23もしくは24個の、またはすべての変異アミノ酸残基を含む。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、28、33、36、40〜41、44、49、52、59、68、70〜73、77〜82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含みうる:Gln20→Arg;Asn25→TyrまたはAsp;Gln28→His;Val33→Ile;Leu36→Met;Ala40→Asn;Ile41→Leu;Glu44→ValまたはAsp;Gln49→His;Tyr52→SerまたはGly;Lys59→Asn;Ser68→Asp;Leu70→Met;Phe71→Leu;Arg72→Leu;Lys73→Asp;Asp77→GlnまたはHis;Tyr78→His;Trp79→Ile;Ile80→Asn;Arg81→TrpまたはGln;Thr82→Pro;Cys87→Ser;Phe92→LeuまたはSer;Asn96→Phe;Lys98→Arg;Tyr100→Asp;Pro101→Leu;Leu103→HisまたはPro;Phe122→Tyr;Lys125→Ser;Ser127→Ile;Tyr132→Trp;およびLys134→Gly。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含みうる:Leu36→Met;Ala40→Asn;Ile41→Leu;Gln49→His;Tyr52→SerまたはGly;Ser68→Asp;Leu70→Met;Arg72→Leu;Lys73→Asp;Asp77→GlnまたはHis;Trp79→Ile;Arg81→TrpまたはGln;Asn96→Phe;Tyr100→Asp;Leu103→HisまたはPro;Lys125→Ser;Ser127→Ile;Tyr132→Trp;およびLys134→Gly。いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101および122に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数をさらに含みうる:Gln20→Arg;Asn25→TyrまたはAsp;Val33→Ile;Glu44→ValまたはAsp;Lys59→Asn;Phe71→Leu;Tyr78→His;Ile80→Asn;Thr82→Pro;Phe92→LeuまたはSer;Lys98→Arg;Pro101→Leu;およびPhe122→Tyr。

いくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）と比較して、以下の変異アミノ酸残基のセットのうちの1つを含みうる。

いくつかのさらなる態様では、残りの領域、すなわち、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134以外の領域において、本開示のhNGALムテインは、変異アミノ酸配列位置以外に、成熟hNGALの野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。

他のいくつかの態様において、提供されるCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）と比較して、以下の変異アミノ酸残基のセットのうちの1つを含みうる。

いくつかの態様では、残りの領域、すなわち、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、28、33、36、40〜41、44、49、52、59、68、70〜73、77〜82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132および134以外の領域において、本開示のhNGALムテインは、変異アミノ酸配列位置以外に、成熟hNGALの野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。

いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの配列（SEQ ID NO:2）に対して、少なくとも70％の配列同一性または少なくとも70％の配列相同性を有する。具体的一例として、SEQ ID NO:42のムテインは、成熟hNGALのアミノ酸配列に対して、およそ87％のアミノ酸配列同一性またはアミノ酸配列相同性を有する。

いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、SEQ ID NO:41〜59のいずれか1つに示すアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。

いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、SEQ ID NO:41〜59からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはそれより高い配列同一性を有する。

本開示は、SEQ ID NO:41〜59からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するhNGALムテインの構造ホモログであって、該hNGALムテインとの関係において約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性またはアミノ酸配列同一性を有する構造ホモログも包含する。

いくつかの態様において、本開示は、約5nM以下の、K_Dによって測定されるアフィニティーでCD137に結合するリポカリンムテインであって、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも98％の、またはそれより高い配列同一性を有するリポカリンムテインを提供する。

いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、リポカリンムテインの生物学的活性（そのターゲット、例えばCD137への結合）に影響を及ぼすことなく、そのN末端またはC末端に、好ましくはC末端に、異種アミノ酸配列、例えばStrep IIタグ（SEQ ID NO:12）または一定の制限酵素のための切断部位配列を、含むことができる。

いくつかの態様では、ムテインの一定の特徴を調節するために、例えばフォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質の耐性もしくは水溶性を改良するために、または凝集傾向を低減するために、またはムテインに新しい特徴を導入するために、リポカリンムテインのさらなる改変を導入しうる。いくつかの態様において、改変は、提供されるムテインの2つ以上の（例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の）特徴の調節をもたらしうる。

例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）、ビオチン、ペプチドまたはタンパク質などの他の化合物へのコンジュゲーションのために、または非天然のジスルフィド結合を形成させるために、新しい反応性基を導入する目的で、リポカリンムテインの1つまたは複数のアミノ酸配列位置を突然変異させることが可能である。コンジュゲートされる化合物、例えばPEGおよびHESは、場合によっては、対応するリポカリンムテインの血清中半減期を増加させる。

いくつかの態様では、リポカリンムテインの反応性基は、そのアミノ酸配列中の天然のシステイン残基など、該アミノ酸配列中に天然に存在しうる。他のいくつかの態様では、そのような反応性基を、突然変異導入によって導入しうる。反応性基が突然変異導入によって導入される場合、1つの可能性は、適当な位置にあるアミノ酸の、システイン残基による突然変異である。hTlcムテインのアミノ酸配列にシステイン残基を導入するためのそのような突然変異の例示的な可能性としては、hTlcの野生型配列（SEQ ID NO:1）の置換Thr40→Cys、Glu73→Cys、Arg90→Cys、Asp95→CysおよびGlu131→Cysが挙げられる。hNGALムテインのアミノ酸配列にシステイン残基を導入するためのそのような突然変異の例示的な可能性としては、hNGALの野生型配列（SEQ ID NO:2）の配列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146または158に対応する配列位置のうちの1つまたは複数におけるシステイン残基の導入が挙げられる。生成するチオール部分は、例えばそれぞれのリポカリンムテインの血清中半減期を増加させる目的で、ムテインをPEG化またはHES化するために使用しうる。

いくつかの態様では、上記の化合物のうちの1つをリポカリンムテインにコンジュゲートするための新しい反応性基として適切なアミノ酸側鎖を提供するために、人工的アミノ酸をリポカリンムテインのアミノ酸配列に導入しうる。一般に、そのような人工的アミノ酸は、より一層反応性であり、それゆえに所望の化合物へのコンジュゲーションが容易になるように設計される。例えば人工tRNAを使った突然変異導入によって導入されうるそのような人工的アミノ酸は、パラ-アセチル-フェニルアラニンである。

いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、そのN末端またはそのC末端において、例えば抗体、シグナル配列および/またはアフィニティータグなどのタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドに融合される。他のいくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインは、そのN末端またはそのC末端において、例えば抗体、シグナル配列および/またはアフィニティータグなどのタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドであるパートナーにコンジュゲートされる。

Strep-tagまたはStrep-tag II（Schmidt et al.,J Mol Biol,1996）、c-mycタグ、FLAGタグ、HisタグまたはHAタグなどのアフィニティータグ、または容易な検出および/または組換えタンパク質の精製を可能にするグルタチオン-S-トランスフェラーゼなどのタンパク質が、適切な融合パートナーの例である。発色性または蛍光性を持つタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein:GFP）または黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein:YFP）も、本開示のリポカリンムテインにとって適切な融合パートナーである。一般に、本開示のリポカリンムテインは、化学的、物理的、光学的、または酵素的反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する任意の適当な化学物質または酵素で、標識することが可能である。例えば、検出可能なシグナルとして蛍光またはx線を生成するように、リポカリンムテインに蛍光ラベルまたは放射性ラベルをコンジュゲートすることができる。アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼは、発色反応生成物の形成を触媒する酵素ラベル（それと同時に光学的ラベル）の例である。一般に、抗体によく使用されるラベルは（もっぱら免疫グロブリンのFc部の糖部分と共に使用されるものを除けば）すべて、本開示のリポカリンムテインへのコンジュゲーションにも使用することができる。

いくつかの態様では、ムテインの血清中半減期を延ばす部分に、本開示のリポカリンムテインを融合またはコンジュゲートしうる（これについては、国際特許公報WO 2006/056464も参照されたい。この文献では、CTLA-4に対する結合アフィニティーを有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）のムテインに関連して、そのような戦略が記載されている）。血清中半減期を延ばす部分は、PEG分子、HES分子、脂肪酸分子、例えばパルミチン酸（Vajo and Duckworth,Pharmacol Rev,2000）、免疫グロブリンのFc部、免疫グロブリンのC_H3ドメイン、免疫グロブリンのC_H4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、またはトランスフェリンでありうるが、これらはほんの一例にすぎない。

いくつかの態様において、コンジュゲーションパートナーとしてPEGを使用する場合、そのPEG分子は置換、無置換、線状または分枝状であることができる。それは活性化ポリエチレン誘導体であることもできる。適切な化合物の例は、インターフェロンに関して国際特許公報WO 1999/64016、米国特許第6,177,074号または米国特許第6,403,564号に記載されているPEG分子、または他のタンパク質、例えばPEG修飾アスパラギナーゼ、PEG-アデノシンデアミナーゼ（PEG-ADA）もしくはPEG-スーパーオキシドジスムターゼ（Fuertges and Abuchowski,Journal of Controlled Release,1990）に関して記載されているPEG分子である。そのようなポリマー、例えばポリエチレングリコールの分子量は、例えば分子量約10,000、約20,000、約30,000または約40,000ダルトンのポリエチレングリコールなど、約300〜約70,000ダルトンの範囲に及びうる。さらに、例えば米国特許第6,500,930号または同第6,620,413号に記載されているように、HESなどの糖質オリゴマーおよび糖質ポリマーを、血清中半減期を延ばす目的で、本開示のムテインにコンジュゲートすることができる。

いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインの血清中半減期を延ばす目的で免疫グロブリンのFc部を使用する場合は、Syntonix Pharmaceuticals,Inc（米国マサチューセッツ州）から市販されているSynFusion（商標）技術を使用しうる。このFc融合技術の使用は、より長時間作用する生物製剤の作出を可能にし、例えば、薬物動態、溶解度、および生産効率を改良するために抗体のFc領域に連結された2コピーのムテインからなりうる。

リポカリンムテインの血清中半減期を延ばすために使用することができるアルブミン結合ペプチドの例は、例えば、米国特許公開第20030069395号またはDennisら（2002）に記載されているように、Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cysコンセンサス配列を有するものであり、ここで、Xaa₁はAsp、Asn、Ser、ThrまたはTrpであり、Xaa₂はAsn、Gln、His、Ile、LeuまたはLysであり、Xaa₃はAla、Asp、Phe、TrpまたはTyrであり、Xaa₄はAsp、Gly、Leu、Phe、SerまたはThrである。血清中半減期を延ばすためにリポカリンムテインに融合またはコンジュゲートされるアルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体フラグメント（例えば米国特許第6,696,245号参照）、またはアルブミンに対する結合活性を持つリポカリンムテインでありうる。細菌のアルブミン結合タンパク質の例としては連鎖球菌プロテインGが挙げられる（Konig and Skerra,J Immunol Methods,1998）。

いくつかの態様において、アルブミン結合タンパク質が抗体フラグメントである場合、それはドメイン抗体でありうる。ドメイン抗体（dAb）は、生物物理学的特性およびインビボ半減期を精密に制御して製品の安全性プロファイルおよび効力プロファイルを最適化することが可能になるように、工学的に操作される。ドメイン抗体は例えばDomantis Ltd.（英国ケンブリッジおよび米国マサチューセッツ州）から市販されている。

いくつかの態様では、アルブミンそのもの（Osborn et al.,J Pharmacol Exp Ther,2002）またはアルブミンの生物学的に活性なフラグメントを、血清中半減期を延ばすための本開示のリポカリンムテインのパートナーとして使用することができる。「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラットアルブミンなど、すべての哺乳動物アルブミンを包含する。アルブミンまたはそのフラグメントは、米国特許第5,728,553号または欧州特許公報EP0330451および同EP0361991に記載されているように、組換え生産することができる。したがって、組換えヒトアルブミン（例えばNovozymes Delta Ltd.（英国ノッティンガム）のRecombumin（登録商標））を、本開示のリポカリンムテインにコンジュゲートまたは融合することができる。

いくつかの態様において、本開示のリポカリンムテインの血清中半減期を延ばすためのパートナーとしてトランスフェリンを使用する場合は、ムテインを非グリコシル化トランスフェリンのN末端もしくはC末端またはその両方に遺伝子融合することができる。非グリコシル化トランスフェリンは14〜17日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質も同様に延長された半減期を有するであろう。トランスフェリン担体は、高いバイオアベイラビリティ、体内分布および循環安定性も提供する。この技術は、BioRexis（BioRexis Pharmaceutical Corporation、米国ペンシルバニア州）から市販されている。タンパク質安定剤/半減期延長パートナーとして使用するための組換えヒトトランスフェリン（DeltaFerrin（商標））も、Novozymes Delt Ltd.（英国ノッティンガム）から市販されている。

本開示のリポカリンムテインの半減期を延ばすためのさらに別の代替策は、ムテインのN末端またはC末端に、構造不定のフレキシブルな長いグリシンリッチ配列（例えば約20〜80個の連続するグリシン残基を持つポリグリシン）を融合することである。例えば国際公報WO2007/038619に開示されているこのアプローチは、「rPEG」（組換えPEG）とも呼ばれている。

E. CD137とPD-L1に特異的な融合タンパク質の例示的な使用および応用
いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD137とPD-L1の二重ターゲティングによる相乗効果を生じうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD137共刺激とPD-1/PD-L1経路遮断とによる相乗効果を生じうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、CD137とPD-L1の二重ターゲティングによる限局的抗腫瘍効果を生じうる。したがって医学では本開示の融合タンパク質の応用が数多く考えられる。

いくつかの態様において、本開示は、CD137とPD-L1の同時結合のための、本明細書に開示する1つもしくは複数の融合タンパク質の使用またはそのような融合タンパク質を含む1つもしくは複数の組成物の使用を包含する。

本開示は、CD137および/またはPD-L1との複合体形成のための、1つまたは複数の記載の融合タンパク質の使用も伴う。

それゆえに本開示の一局面において、提供される融合タンパク質は、CD137およびPD-L1の検出に使用されうる。そのような使用は、1つまたは複数の融合タンパク質を、CD137および/またはPD-L1を含有すると疑われる試料と、適切な条件下で接触させ、それによって融合タンパク質とCD137および/またはPD-L1との間の複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって前記複合体を検出する工程を含みうる。検出可能なシグナルは、上に説明したようにラベルによって引き起こされるか、結合そのものによる、すなわち複合体形成そのものによる、物理的特性の変化によって引き起こされうる。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、結合パートナー（そのうちの1つが金箔などの表面に固定化されているもの）の結合時に変化する。

本開示の融合タンパク質は、CD137および/またはPD-L1の分離にも使用されうる。そのような使用は、1つまたは複数の融合タンパク質を、CD137および/またはPD-L1を含有すると思われる試料と、適切な条件下で接触させ、それによって融合タンパク質とCD137および/またはPD-L1との間の複合体の形成を可能にする工程、および前記複合体を前記試料から分離する工程を含みうる。

いくつかの局面において、本開示は、本開示による1つまたは複数の融合タンパク質を含む診断キットおよび/または分析キットを提供する。

さらなる別の一局面において、本開示では、診断薬におけるそれらの使用に加えて、1つまたは複数の本開示の融合タンパク質と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物も考えられる。

さらにまた、いくつかの態様において、本開示は、抗腫瘍および/または抗感染作用物質ならびに免疫調節剤として使用するための、CD137および/またはPD-L1に同時に結合する融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、PD-L1陽性がんを含むさまざまながんなどのヒト疾患を予防、改善、または処置する方法において使用されることが想定される。したがって、PD-L1陽性がんを含むさまざまながんなどのヒト疾患を、その予防、改善または処置を必要とする対象において、予防、改善または処置する方法であって、治療有効量の1つまたは複数の本開示の融合タンパク質を該対象に投与する工程を含む方法も提供される。

本開示の融合タンパク質を使って処置されうるがんの例としては、肝がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、腎がん、子宮がん、卵巣がん、結腸直腸がん、大腸がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系（CNS）の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮細胞がん、アスベストが誘発するがんを含む環境誘発がん、血液悪性疾患、例えば多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫/原発性縦隔B細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、ならびに前記がんの任意の組合せが挙げられる。いくつかの態様において、本発明は転移がんの処置にも応用可能である。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、PD-L1が発現している腫瘍細胞のターゲティングと、そのような腫瘍細胞に近接する宿主免疫系のリンパ球の活性化とを同時に行いうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、標的抗腫瘍T細胞活性を増加させ、抗腫瘍免疫を強化し、かつ/または腫瘍成長に対して直接的阻害効果を有し、それによって相乗的な抗腫瘍結果を生じうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、腫瘍微小環境における免疫応答を活性化しうる。いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、健常細胞に対するエフェクターリンパ球の副作用、すなわちオフターゲット毒性を、例えばがん遺伝子活性を局所的に阻害し、リンパ球活性化を誘導することなどによって、低減しうる。

いくつかの態様において、本開示は、PD-L1陽性腫瘍細胞の近傍における限局的リンパ球応答を誘導するための、本開示の融合タンパク質の使用、または提供される融合タンパク質を含む組成物の使用を包含する。したがっていくつかの態様において、本開示は、PD-L1陽性腫瘍細胞の近傍において限局的リンパ球応答を誘導する方法であって、1つもしくは複数の本開示の融合タンパク質またはそのような融合タンパク質を含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む方法を提供する。「限局的」とは、CD137を介したT細胞の結合およびPD-L1陽性腫瘍細胞との会合が同時に起きたときに、PD-L1陽性細胞の近傍において、T細胞がサイトカイン、特にIL-2および/またはIFNガンマを生産することを意味する。そのようなサイトカインは、T細胞の活性化を反映し、それは結果として、PD-L1陽性細胞を直接的に、またはT細胞もしくはNK細胞などの他のキラー細胞を誘引することによって間接的に、殺すことが可能でありうる。

いくつかの態様において、本開示は、T細胞を共刺激し、かつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化するための、本開示の融合タンパク質の使用、またはそのような融合タンパク質を含む組成物の使用を包含する。好ましくは、提供される融合タンパク質は、PD-L1が発現している腫瘍細胞と会合したときに、T細胞を共刺激し、かつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化する。したがって本開示は、好ましくはPD-L1が発現している腫瘍細胞と会合したときに、Tリンパ球増殖を誘導しかつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化する方法であって、1つもしくは複数の本開示の融合タンパク質および/またはそのような融合タンパク質を含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む方法を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、T細胞上でのCD137のクラスター化および活性化を誘導し、そのようなT細胞をPD-L1が発現している腫瘍細胞に向かわせるための、本開示の融合タンパク質の使用、またはそのような融合タンパク質を含む組成物の使用を包含する。

この開示のさらなる目的、利点、および特徴は、限定を意図しない以下の実施例および添付するその図面を検討すれば、当業者には明白になるであろう。したがって、例示的態様および随意の特徴によって本開示を具体的に開示するが、当業者は、本明細書に開示する、そこに体現されている開示の変更態様および変形態様を採用することができ、そのような変更態様および変形態様はこの開示の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。

F. CD137とPD-L1に特異的である、例示的な、提供される融合タンパク質の生産
いくつかの態様において、本開示は、提供される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（DNAおよびRNA）を提供する。いくつかの態様において、本開示は、提供される核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸を指定する別のコドンによる一定のコドンの置換を許すので、本開示は、融合タンパク質をコードする本明細書記載の具体的核酸分子に限定されず、機能的融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を包含する。これに関して、本開示は、提供される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列にも関係する。

DNAなどの核酸分子は、それが、転写制御および/または翻訳制御に関する情報を含有する配列エレメントを含み、そのような配列がタンパク質をコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ているのであれば、「核酸分子を発現する能力を有する」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にすることができる」という。機能的連結とは、制御配列エレメントと発現されるべき配列とが遺伝子発現を可能にするような形で接続されている連結である。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は種間でさまざまでありうるが、一般にこれらの領域はプロモーターを含み、原核生物の場合、それは、プロモーターそのもの、すなわち転写の開始を指示するDNAエレメントと、RNAに転写されたときに翻訳開始のシグナルを出すことになるDNAエレメントとの両方を含有する。そのようなプロモーター領域は通常、転写および翻訳の開始に関与する5’非コード配列、例えば原核生物における-35/-10ボックスおよびシャイン・ダルガノ配列、または真核生物におけるTATAボックス、CAAT配列、および5’キャッピングエレメントを含む。これらの領域は、エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメント、ならびにネイティブタンパク質を宿主細胞の特定コンパートメントにターゲティングするための、翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列も含むことができる。

加えて、3’非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する制御エレメントを含有しうる。ただし、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能しない場合には、それらをその細胞において機能的なシグナルで置換しうる。

それゆえに、本開示の核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするために、プロモーター配列などの1つまたは複数の制御配列に「機能的に連結され」うる。いくつかの態様において、本開示の核酸分子はプロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターは、例えばtetプロモーター、lacUV5プロモーターまたはT7プロモーターである。真核細胞における発現に役立つプロモーターの例は、SV40プロモーターまたはCMVプロモーターである。

いくつかの態様において、本願に開示するリポカリンムテインをコードする核酸分子は、本明細書において開示する融合タンパク質の発現を可能にするように、本開示の免疫グロブリンをコードする別の核酸分子に「機能的に連結され」うる。

いくつかの態様において、提供される方法は、提供される融合タンパク質に含まれるリポカリンムテインを得るために、成熟hTlcをコードする少なくとも1つの核酸分子を、hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置をコードするヌクレオチドトリプレットにおける突然変異導入に付す工程を含みうる。いくつかの態様において、提供される方法は、提供される融合タンパク質に含まれるリポカリンムテインを得るために、成熟hNGALをコードする少なくとも1つの核酸分子を、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置をコードするヌクレオチドトリプレットにおける突然変異導入に付す工程を含みうる。いくつかの態様において、提供される方法は、提供される融合タンパク質に含まれるリポカリンムテインを得るために、成熟hNGALをコードする少なくとも1つの核酸分子を、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、28、33、36、40〜41、44、49、52、59、68、70〜73、77〜82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置をコードするヌクレオチドトリプレットにおける突然変異導入に付す工程を含みうる。

加えて、融合タンパク質に含まれる本開示のhTlcムテインまたはhNGALムテインに関して、いくつかの態様では、Cys61とCys153の間またはCys76とCys175の間の天然のジスルフィド結合を除去しうる。したがってそのようなムテインは、還元的レドックス環境を有する細胞コンパートメントにおいて、例えばグラム陰性菌の細胞質において、生産することができる。

さらに、融合タンパク質に含まれる本開示の提供されるhTlcムテインまたはhNGALムテインに関して、本開示は、いくつかの態様では表示した実験的突然変異導入の配列位置以外に1つまたは複数の追加突然変異を含んでもよいそのようなムテインをコードする核酸分子も包含する。そのような突然変異は許容されることが多く、例えばそれらがリポカリンムテインおよび/または融合タンパク質のフォールディング効率、血清中安定性、熱安定性またはリガンド結合アフィニティーの改良に寄与するのであれば、有利であると判明する場合さえある。

いくつかの態様において、提供される核酸分子は、ベクター、または他の任意の種類のクローニング媒体、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部であることもできる。

いくつかの態様において、提供される核酸分子は、ファージミド中に含まれうる。この文脈において使用される場合、ファージミドベクターとは、関心対象のcDNAに融合された、M13またはf1などの溶原性ファージの遺伝子間領域またはそれらの機能的部分をコードするベクターを表す。例えばいくつかの態様では、そのような提供されるファージミドベクターと適当なヘルパーファージ（例えばM13K07、VCS-M13またはR408）とによる細菌宿主細胞の重感染後に、インタクトなファージ粒子が生産され、それによって、コードされている異種cDNAを、ファージ表面にディスプレイされたその対応ポリペプチドに物理的にカップリングすることが可能になる（Lowman,Annu Rev Biophys Biomol Struct,1997、Rodi and Makowski,Curr Opin Biotechnol,1999）。

さまざまな態様によれば、クローニング媒体は、上述の制御配列および本明細書記載の融合タンパク質をコードする核酸配列の他にも、発現に使用される宿主細胞に適合する種に由来する複製配列および制御配列、ならびに形質転換細胞またはトランスフェクト細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。当技術分野では数多くの適切なクローニングベクターが公知であり、市販されている。

本開示は、いくつかの態様において、遺伝子工学的方法を使って、融合タンパク質またはその中の任意のサブユニットをコードする核酸から出発して、本開示の融合タンパク質を生産するための方法にも関係する。いくつかの態様において、提供される方法は、インビボで実行することができ、この場合、提供される融合タンパク質は、例えば細菌宿主生物または真核宿主生物において産生され、次にこの宿主細胞またはその培養物から単離することができる。本開示の融合タンパク質をインビトロで、例えばインビトロ翻訳系を使って生産することも可能である。

融合タンパク質をインビボで生産する場合、そのような融合タンパク質をコードする核酸は、当技術分野において周知の組換えDNA技術を使って、適切な細菌宿主生物または真核宿主生物に導入しうる。いくつかの態様において、本明細書記載の融合タンパク質をコードするDNA分子（例えばSEQ ID NO:138〜144）、特にそのような融合タンパク質のコード配列を含有するクローニングベクターを、その遺伝子を発現させる能力を有する宿主細胞に形質転換することができる。形質転換は標準的技法を使って行うことができる。したがって本開示は、本明細書に開示する核酸分子を含有する宿主細胞にも向けられる。

いくつかの態様において、形質転換された宿主細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養されうる。いくつかの態様において、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）（E.coli）もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）、または真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、SF9またはHigh5昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株（例えばHeLa細胞またはCHO細胞）または初代哺乳動物細胞であることができる。

本明細書に開示する融合タンパク質に含まれるものを含めて、本開示のリポカリンムテインが分子内ジスルフィド結合を含むいくつかの態様では、適当なシグナル配列を使って、酸化性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメントに新生タンパク質を向かわせることが好ましいかもしれない。そのような酸化性環境は、大腸菌などのグラム陰性菌のペリプラズムによって、またはグラム陽性菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体の内腔において提供されうるものであり、通常は構造的ジスルフィド結合の形成に有利である。

いくつかの態様では、宿主細胞のサイトゾル、好ましくは大腸菌のサイトゾルにおいて、本開示の融合タンパク質を生産することも可能である。この場合、提供される融合タンパク質は、折り畳まれた可溶性の状態で直接得られるか、または封入体の形で回収された後、インビトロで復元することができる。さらなる選択肢は、酸化性の細胞内環境を有し、それゆえに、サイトゾルにおけるジスルフィド結合の形成を許しうる、特別な宿主株の使用である（Venturi et al.,J Mol Biol,2002）。

いくつかの態様において、本明細書に記載する本開示の融合タンパク質は、必ずしも、その全部または一部が、遺伝子工学を使って生成または生産されるとは限らない。むしろ、そのようなタンパク質は、数多くの周知の従来技法、例えば普通の有機合成戦略、固相支援合成技法、市販の自動合成装置、またはインビトロでの転写および翻訳によって得ることもできる。例えば、分子モデリングを使って有望な融合タンパク質またはそのような融合タンパク質に含まれるリポカリンムテインを同定し、インビトロで合成し、関心対象のターゲットに対する結合活性について調べることが可能である。タンパク質の固相合成および/または液相合成の方法は当技術分野において周知である（例えばBruckdorfer et al.,Curr Pharm Biotechnol,2004を参照されたい）。

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、当業者に公知の確立された方法を使用するインビトロ転写/翻訳によって生産されうる。

いくつかのさらなる態様において、本明細書記載の融合タンパク質は、従来の組換え技法だけによって、または従来の組換え技法と従来の合成技法との併用によっても調製されうる。

さらにまた、いくつかの態様において、本開示による融合タンパク質は、個々のサブユニット、例えば融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンおよびムテインを1つにコンジュゲートすることによって得られうる。そのようなコンジュゲーションは、例えば、あらゆる形態の共有結合または非共有結合により、従来の方法を使って達成することができる。

本開示によって考慮されているがそのタンパク質配列または核酸配列が本明細書において明示的には開示されていない融合タンパク質を調製するのに役立つ方法は、当業者には理解されるだろう。概要として、アミノ酸配列のそのような改変には、例えば、一定の制限酵素のための切断部位を組み入れることによってタンパク質遺伝子またはその一部のサブクローニングを簡略化するための、単一アミノ酸位置の指向的突然変異導入が含まれる。また、融合タンパク質のそのターゲット（例えばCD137およびPD-L1）に対するアフィニティーをさらに改良するために、これらの突然変異を組み入れることもできる。さらにまた、必要であれば、タンパク質の1つまたは複数の特徴を調節するために、例えばフォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質の耐性もしくは水溶性を改良するために、または凝集傾向を低減するために、突然変異を導入することができる。

V. 実施例
実施例1:代表的融合タンパク質の発現および分析
この実施例では、PD-L1とCD137に同時に会合するために、SEQ ID NO:86によって与えられる重鎖、またはSEQ ID NO:77の重鎖可変ドメインを含む重鎖、または

のCDRを含む重鎖およびSEQ ID NO:87によって与えられる軽鎖、またはSEQ ID NO:82の重鎖可変ドメインを含む軽鎖、または

のCDRを含む軽鎖を有するPD-L1特異的抗体と、SEQ ID NO:42のCD137特異的リポカリンムテインとを、リンカー、例えばSEQ ID NO:13の構造不定な（G₄S）₃リンカーなどを介して1つに融合することにより、代表的な抗体-リポカリンムテイン融合タンパク質を生成させた。生成させたさまざまなフォーマットを図1に示す。例えば、1つまたは複数のSEQ ID NO:42のリポカリンムテインを、SEQ ID NO:86によって与えられる重鎖、またはSEQ ID NO:77の重鎖可変ドメインを含む重鎖、または

のCDRを含む重鎖と、SEQ ID NO:87によって与えられる軽鎖、またはSEQ ID NO:82の重鎖可変ドメインを含む軽鎖、または

のCDRを含む軽鎖とを含む抗体の4つの末端のうちの1つまたは複数に融合することによって、上述の融合タンパク質、例えばSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91を生成させた。生成した融合タンパク質は、（例えば図1A〜図1Dに示すように）CD137に対して二価であるか、（例えば図1E〜図1Hに示すように）CD137に対して四価であるか、または（例えば図1Iに示すように）CD137に対してさらに高い価数を有することができる。

この実施例で述べるPD-L1特異的抗体およびすべての抗体リポカリンムテイン融合タンパク質は、インビトロおよびインビボでのIgG4半抗体交換を最小限に抑えるためのS228P突然変異を含有する工学的に操作されたIgG4バックボーンを有した（Silva et al.,J Biol Chem,2015）。ここで述べるすべての抗体および融合タンパク質において、IgG4バックボーンには、例えば突然変異F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254TおよびT256Eのうちの任意の1つまたは複数などといった、追加の突然変異も存在しうる。ADCCおよびADCPを減少させるために、F234AおよびL235A突然変異を導入しうる（Glaesner et al.,Diabetes Metab Res Rev,2010）。血清中半減期を延ばすためにM428LおよびN434S突然変異またはM252Y、S254TおよびT256E突然変異を導入しうる（Dall’Acqua et al.,J Biol Chem,2006、Zalevsky et al.,Nat Biotechnol,2010）。不均一性を回避するために、抗体はすべてカルボキシ末のリジンなしで発現させた。

加えて、図1J〜図1Kに示すように、1つまたは複数のSEQ ID NO:42のCD137特異的リポカリンムテインを、リンカー、例えばSEQ ID NO:13の構造不定な（G4S）3リンカーを介して、SEQ ID NO:30記載の抗体のFc領域のC末端に融合することによって、単一特異性リポカリンムテインFc融合物を生成させた。その結果得られたコンストラクトをSEQ ID NO:88〜89に記載する。

本発明は、例えば、抗体の一方の軽鎖はリポカリンムテインと融合されていてもよいが、他方はそうでない、非対称な抗体-リポカリンムテイン融合物フォーマットも体現する。

融合タンパク質のコンストラクトを遺伝子合成によって生成させ、哺乳類発現ベクターにクローニングした。次に、Expi293FTM細胞（Life Technologies）中で、それらを一過性に発現させた。細胞培養培地中の融合タンパク質の濃度は、POROS（登録商標）プロテインAアフィニティーカラム（Applied Biosystems）を使用するHPLC（Agilent Technologies）によって測定した。融合タンパク質の力価を表1に要約する。

融合タンパク質は、プロテインAクロマトグラフィーを使って精製した後、リン酸緩衝食塩水（PBS）でのサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography:SEC）を使って精製した。SEC精製後に、単量体型タンパク質を含有するフラクションをプールし、分析用SECで再び分析した。

（表１）一過性発現力価

実施例2:融合タンパク質の発現
コドン最適化を含む遺伝子合成によって例示的な融合タンパク質のコンストラクトを生成させ、哺乳類発現ベクターにクローニングした。次に、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中で、それらを安定に発現させた。細胞培養培地中の融合タンパク質の濃度は、Octet（ForteBio、Pall Corp.）を使ってプロテインAセンサーで測定し、ヒトIgG1標準を使って定量した。融合タンパク質の力価を表2に要約する。このデータは、融合タンパク質のジオメトリが産物の収率と細胞の生産性に影響を及ぼしうることを示唆している。

（表２）安定発現力価

実施例3:表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定されるPD-L1またはCD137に対する融合タンパク質の結合
huPD-L1-HisまたはhuCD137-His（C末端ポリヒスチジンタグを持つヒトPD-L1またはヒトCD137、R＆D Systems）に対する例示的融合タンパク質の結合速度およびアフィニティーを、表面プラズモン共鳴（SPR）により、Biacore 8KまたはBiacore T200（GE Healthcare）を使って決定した。

標準的アミンケミストリーを使って抗ヒトIgG Fc抗体（GE Healthcare）をCM5センサーチップ上に固定化した。すなわち、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を使って、チップ上のカルボキシル基を活性化した。次に、10mM酢酸ナトリウム（pH5.0）中、濃度25μg/mLの抗ヒトIgG Fc抗体溶液（GE Healthcare）を、6000〜10000レゾナンスユニット（RU）の固定化レベルが達成されるまで、5μL/分の流速で適用した。その表面を横切って1Mエタノールアミンの溶液を通すことにより、反応していない残存NHS-エステルをブロックした。リファレンスチャンネルも同様に処理した。次に、HBS-EP＋緩衝液中、0.25μg/mlまたは0.5μg/mLの試験融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89）を、10μL/分の流速で、チップ表面の抗ヒトIgG-Fc抗体によって180秒間、捕捉した。各捕捉工程後に、ニードルを洗浄した。リファレンス抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）および融合タンパク質に含まれる抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）を含む抗PD-L1抗体ならびにリファレンス抗CD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）も、対照として試験した。

アフィニティー決定のために、huPD-L1-Hisの希釈液（10nM、5nMおよび2.5nM）またはhuCD137-Hisの希釈液（900nM、300nMおよび100nM）を、HBS-EP＋緩衝液中に調製し、調製済チップ表面に適用した。結合アッセイは接触時間180秒、解離時間900秒および流速30μL/分で実行した。すべての測定を25℃で行った。チップ表面の再生は120秒にわたる3M MgCl₂の注入で達成した。タンパク質測定に先だって、コンディショニング目的で、3回のスタートアップサイクルを実施した。データはBiacore T200評価ソフトウェア（v2.0）またはBiacore 8K評価ソフトウェア（V1.1.1）で評価した。二重リファレンスを使用し、1:1結合モデルを使って生データの当てはめを行った。

代表的融合タンパク質のk_on、k_offおよびその結果得られる平衡解離定数（K_D）について決定された値を表3に要約する。すべての二重特異性融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）が、PD-L1にもCD137にも、ナノモル濃度未満〜低ナノモル濃度のアフィニティーで結合する。単一特異性CD137特異的リポカリンムテイン-Fc融合物（SEQ ID NO:88およびSEQ ID NO:89）はCD137にのみ、低ナノモル濃度のアフィニティーで結合する。

（表３）SPRによって決定された融合タンパク質の速度定数およびアフィニティー

実施例4. 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）におけるPD-L1またはCD137に対する融合タンパク質の結合
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を使って、ヒトPD-L1およびカニクイザルPD-L1に対する例示的融合タンパク質の結合能を決定した。

PBS中、濃度1μg/mLの組換えhuPD-L1-HisまたはcyPD-L1-His（C末端ポリヒスチジンタグを持つヒトまたはカニクイザルのPD-L1、R＆D SystemsまたはSino Biologics）をマイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングした。PBS-0.05％T（0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS）で洗浄した後、プレートをPBS-0.1％T（0.1％（v/v）Tween 20を補足したPBS）中の2％BSA（w/v）で室温において1時間ブロックした。100μLのPBS-0.05％Tで5回洗浄した後、例示的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）、Fc融合物CD137特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO:88およびSEQ ID NO:89）、および抗PD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）を、さまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、さらに1回洗浄工程を行った。結合した研究対象の分子は、PBS-0.1％T-2％BSA中で、1:5000希釈した抗ヒトIgG Fc-HRP（Jackson Laboratory）と共にインキュベートすることによって検出した。追加の洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。

同じELISA設定を使用して、CD137に対する融合タンパク質の結合能も決定した。ただしこの場合は、huCD137-His（C末端ポリヒスチジンタグを持つヒトCD137、R＆D Systems）またはcyCD137-Fc（FcにC末端融合されたカニクイザルCD137）をマイクロタイタープレート上にコーティングした。試験作用物質を同様にタイトレートし、結合した作用物質を抗NGAL-HRPで検出した。

例示的実験の結果を図2A〜図2Dに、EC₅₀値および最大シグナルを自由パラメータとし傾きを1に固定した1:1結合シグモイドフィットによるフィット曲線と共に示す。その結果得られたEC₅₀値を表4に掲載する。

提供される融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89）の、2つのヒトターゲットに対する観察されたEC₅₀値は、試験したPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27のリファレンスPD-L1抗体および融合タンパク質に含まれているSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87のPD-L1抗体）および/または融合タンパク質に含まれているCD137特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO:42）と、非常に似ているか、同等であった。

試験した融合タンパク質はいずれも、リファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）または融合タンパク質に含まれるPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）と同等なEC₅₀値で、カニクイザルPD-L1に対する交差反応性を示す。CD137に対して四価である融合タンパク質（SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、およびSEQ ID NO:88）だけが、ヒトCD137と同等なレベルで、カニクイザルCD137に対する交差反応性を示す。すなわちそれらはヒトCD137に関する対応するEC₅₀と同じ範囲のEC₅₀値でカニクイザルCD137に結合する。

（表４）PD-L1結合またはCD137結合に関するELISAデータ

実施例5. ELISAにおけるPD-L1およびCD137への融合タンパク質の同時結合
PD-L1およびCD137への例示的融合タンパク質の同時結合を実証するために、二重結合ELISAフォーマットを使用した。

PBS中の組換えhuPD-L1-His（R＆D Systems）（1μg/mL）を、マイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングした。各インキュベーション工程後に100μLのPBS-0.05％Tでプレートを5回洗浄した。プレートを室温においてPBS-0.1％T中の2％BSA（w/v）で1時間ブロックした後、再び洗浄した。さまざまな濃度の被験融合タンパク質をウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。次に、ビオチン化huCD137-His（huCD137-His-Bio、Sino Biological）を、PBS-0.1％T-2％BSA中、1μg/mLの一定濃度で、1時間加えた。洗浄後に、PBS-0.1％T-2％BSA中のExtrAvidin-HRP（Sigma-Aldrich）の1:5000希釈液をウェルに加え、1時間インキュベートした。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。

組換え1μg/mlのhuCD137-His（R＆D Systems）をマイクロタイタープレート上にコーティングし、結合した融合タンパク質をビオチン化huPD-L1-His（R＆D Systems）の添加によって検出する逆の設定でも、例示的融合タンパク質の二重結合を試験した。

融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）の二重結合データを、図3Aおよび図3Bに、EC₅₀値および最大シグナルを自由パラメータとし傾きを1に固定した1:1結合シグモイドフィットによるフィット曲線と共に示す。EC₅₀値を表5に要約する。二重特異性融合タンパク質はいずれも明確な結合シグナルを示すことから、融合タンパク質はPD-L1とCD137に同時に会合できることが実証される。さらに、このデータから、PD-L1特異的抗体のC末端へのCD137特異的リポカリンムテインの融合は、N末端への融合よりも有利でありうることも示唆された。

（表５）PD-L1とCD37の両方の同時ターゲット結合に関するELISAデータ

実施例6. ヒトおよびカニクイザルのCD137およびPD-L1を発現する細胞への融合タンパク質結合のフローサイトメトリー分析
ヒトおよびカニクイザルPD-L1発現細胞ならびにヒトおよびカニクイザルCD137発現細胞への融合タンパク質のターゲット特異的結合をフローサイトメトリーによって評価した。

Flp-Inシステム（Life technologies）を製造者の説明書に従って使用することにより、ヒトPD-L1、カニクイザルPD-L1、ヒトCD137、カニクイザルCD137またはモック対照をCHO細胞に安定にトランスフェクトした。

トランスフェクトされたCHO細胞は、10％ウシ胎児血清（Biochrom）と500μg/mlハイグロマイシンB（Roth）とを補足したハムF12培地（Life technologies）において維持された。細胞を製造者の説明書に従って細胞培養フラスコ中で培養した（37℃、5％CO2雰囲気）。

フローサイトメトリー分析のために、それぞれの細胞株を融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89）と共にインキュベートし、以下に説明するFACS分析において、蛍光標識抗ヒトIgG抗体を使って検出した。

氷冷した5％ウシ胎児血清含有PBS（PBS-FCS）中で、1ウェルあたり5×10⁴細胞を1時間インキュベートした。融合タンパク質および対照抗体の希釈系列を細胞に加え、氷上で1時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄した後、ヤギ抗hIgG Alexa647標識抗体と共に、氷上で30分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、iQueフローサイトメーター（Intellicyte Screener）を使って分析した。平均幾何（mean geometric）蛍光シグナルをプロットし、非線形回帰（シェアードボトム、SLOPE＝1）を使ってGraphpadソフトウェアで当てはめを行った。

ヒトおよびカニクイザルのPD-L1およびCD137に結合する融合タンパク質の能力を図4に示す。ヒトおよびカニクイザルPD-L1発現細胞に対する二重特異性融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）の結合アフィニティー（EC₅₀）は一桁ナノモル濃度域にあって、完全なカニクイザル交差反応性を呈する（表6に要約する）。ヒトCD137発現細胞に対する融合タンパク質の結合アフィニティーは低ナノモル濃度域にある。被験融合タンパク質はカニクイザルCD137に対して完全に交差反応性であるか（SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、およびSEQ ID NO:88）、ヒトCD137に対する対応する結合アフィニティーと比べると6分の1〜13分の1のアフィニティーでカニクイザルCD137に結合するか（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、およびSEQ ID NO:89）、またはカニクイザルCD137に結合しない（SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93）。融合タンパク質はいずれもモックトランスフェクト細胞には結合しない。

（表６）ヒトおよびカニクイザルのPD-L1またはCD137を発現する細胞に対する融合タンパク質の結合アフィニティー

実施例7. PD-L1陽性腫瘍細胞に対する融合タンパク質の結合アフィニティー
PD-L1を発現する腫瘍細胞への融合タンパク質の結合をフローサイトメトリーによって評価した。

10％FCSを補足したRPMI1640（Life technologies）中、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で、PD-L1を発現する結腸直腸がん細胞株RKOを維持した。

フローサイトメトリー分析のために、RKO細胞を融合タンパク質と共にインキュベートし、実施例6で述べたように、蛍光標識抗ヒトIgG抗体を使って検出した。

PD-L1陽性腫瘍細胞に結合する融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）の能力を図5に示し、対応する結合アフィニティー（EC₅₀）を表7に要約する。PD-L1発現RKO細胞に対する融合タンパク質の結合アフィニティーは、融合タンパク質に含まれるPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）と同等な、低ナノモル濃度またはナノモル濃度未満の領域にあった。

（表７）PD-L1陽性腫瘍細胞に対する融合タンパク質の結合アフィニティー

実施例8. CD137への結合におけるCD137Lと融合タンパク質との間の競合の、SPRによる決定
SPRアッセイを利用して、ヒトCD137に対するヒトCD137L（huCD137L-His、R＆D Systems）と例示的融合タンパク質との間の競合を調べた。競合アッセイはBiacore T200機器（GE Healthcare）で25℃において行った。

BiotinCAPture試薬（GE Healthcare）を、濃度50μg/mlおよび流速2μL/分で300秒間、CAPセンサーチップ上に固定化した。リファレンスチャンネルも同様に処理した。別のチャンネルではビオチン化huCD137-Fc（R＆D systems）を300秒間、濃度1μg/mLおよび流速5μL/分で、チップ表面上に固定化した。

試験融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89）がCD137への結合についてCD137Lと競合するかどうかを分析するために、ランニング緩衝液（HBS-EP＋緩衝液）または500nM huCD137L-Hisを、30μL/分の流速で180秒間、チップ表面に適用した。次に、試験融合タンパク質を、HBS-EP＋緩衝液中、1μMの固定濃度で、調整済チップ表面に適用した。結合アッセイは接触時間180秒、解離時間15秒および流速30μL/分で実行した。対照として、同じパラメータでの緩衝液の注入を含めた。チップ表面の再生は、流速10μL/分で120秒間の6M Gua-HCl、0,25M NaOHの注入と、それに続くH₂Oによる追加洗浄工程（120秒、10μl/分）によって達成した。

結果として得られたセンサーグラムの関連セグメントの代表例を、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89の融合タンパク質について、図6に示す。huCD137-Fc単独へのそれぞれの融合タンパク質の結合に関するSPRトレースに、実線の矢印で印をつける。huCD137L-Hisで飽和させておいたhuCD137-Fcへの融合タンパク質の結合に関するSPRトレースに、破線の矢印で印をつける。このデータは、すべての融合タンパク質が、huCD137Lの存在下でhuCD137に結合するが、CD137L非存在下でのCD137への結合と比べるとシグナルはわずかに低減することを示している。これは、試験した融合タンパク質が、CD137へのCD137Lの結合によって、ある程度は立体障害を受けうることを示唆している。融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89）のこの結合挙動は、抗CD137抗体SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29のそれと類似している。

実施例9. ELISAを使って決定された、PD-1への結合における融合タンパク質とPD-L1との競合
PD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する融合タンパク質の能力を実証するために、競合ELISAフォーマットを使用した。

PBS中の組換えhuPD-1-His（Acrobiosystems）（1μg/mL）を、マイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングした。各インキュベーション工程後に100μLのPBS-0.05％T（0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS）でプレートを5回洗浄した。プレートを室温においてPBS-0.1％T（0.1％（v/v）Tween 20を補足したPBS）中の2％BSA（w/v）で1時間ブロックした後、再び洗浄した。さまざまな濃度の融合タンパク質をトレーサーとしての15nMの組換えhuPD-L1-Fc（R＆D systems）と混合し、室温で1時間インキュベートした。融合タンパク質とトレーサーとの混合物をプレートに加え、室温で20分間インキュベートした後、100μLのPBS-0.05％Tによる洗浄工程を5回行った。次に、ヤギ抗ヒトIgG-Fc HRP（Jackson）の1:5000希釈液をウェルに加え、1時間インキュベートした。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。

例示的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）の競合データを、図7に、IC₅₀値および最大シグナルを自由パラメータとし傾きを1に固定した1:1結合シグモイドフィットによるフィット曲線と共に示す。IC₅₀値を表9に要約する。二重特異性融合タンパク質はいずれも、抗体ビルディングブロック（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）およびリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）と同等なIC₅₀値で、PD-1/PD-L1相互作用の明確な阻害を示した。

（表８）PD-1への結合に関する融合タンパク質とPD-L1との競合

実施例10. CD137バイオアッセイを用いるPD-L1依存的T細胞共刺激
選択された融合タンパク質の、PD-L1の存在下でCD137シグナリング経路の活性化を誘導する潜在能力を、CD137とluc2遺伝子（ヒト化型のホタルルシフェラーゼ）とを発現し、luc2発現がNFκB応答エレメントによって駆動される、市販の二重安定トランスフェクトJurkat細胞株を使って評価した。このバイオアッセイでは、CD137会合が、NFκB媒介性ルミネセンスにつながるCD137細胞内シグナリングをもたらす。

PD-L1を発現する結腸直腸がん細胞株RKOは実施例7で述べたように培養した。アッセイの1日前に、1ウェルあたり1.25×10⁴細胞のRKO細胞をプレーティングし、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃一晩接着させた。

翌日、3.75×10⁴個のNF-kB-Luc2/CD137 Jurkat細胞を各ウェルに加え、次に、さまざまな濃度の、典型的には0.001nM〜5nMの範囲の、融合タンパク質またはリファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）を加えた。プレートをガス透過性シールで覆い、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃でインキュベートした。4時間後に、30μLのBio-Glo（商標）試薬を各ウェルに加え、生物発光シグナルをルミノメーター（PHERAstar）を使って定量した。GraphPad Prism（登録商標）で4パラメータロジスティック曲線分析を行って、EC₅₀値を算出した（シェアードボトム、傾き固定）。それらを表9に要約する。融合タンパク質によるCD137会合のPD-L1依存性を実証するために、並行して、RKO細胞の非存在下で同じ実験を行った。アッセイは三重に行った。

代表的実験の結果を図8A〜図8Dに示す。このデータは、試験したすべての融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93）が、強いCD137媒介性T細胞共刺激を誘導したことを実証している。図8Bおよび図8Dは、融合タンパク質によるCD137の活性化がPD-L1依存的であることを示している。PD-L1発現腫瘍細胞の非存在下ではNF-kB-Luc2/CD137 Jurkat細胞の活性化が検出されなかったからである。対照的に、リファレンス抗CD137 mAb（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）は、ターゲット細胞の有無にかかわらず、CD137媒介性T細胞共刺激を示した。

（表９）CD137バイオアッセイを用いたT細胞活性化の評価

実施例11. ヒト末梢血単核球（PBMC）を使ったT細胞活性化の評価
T細胞アッセイを使って、選択された融合タンパク質の、T細胞応答を共刺激する能力、およびPD-1へのPD-L1の結合によって媒介される共阻害を防止する能力を評価した。この目的のために、さまざまな濃度の融合タンパク質を、ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）で刺激したヒト末梢血単核球（PBMC）に加え、37℃で4日間インキュベートした。上清におけるIL-2分泌レベルを測定した。

ポリスクロース密度勾配（Biocoll、1.077g/mL、Biochrom）での遠心分離により、Biochromのプロトコールに従って、健常ボランティアドナーのPBMCをバフィーコートから単離した。精製されたPBMCを、90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、直ちに凍結し、さらなる使用時まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、PBMCを融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で16時間、休ませた。

以下の手順を各実験条件について三重に行った:2.5×10⁴個のPBMCを、384ウェル平底組織培養プレートの各ウェルにおいて、培養培地中でインキュベートした。融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）、ビルディングブロックPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）、リファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87またはSEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とのカクテル、またはアイソタイプ対照（SEQ ID NO:24とSEQ ID NO:25）の、典型的には10nMから0.002nMまでの範囲の希釈系列と、0.1ng/mlのSEBとを、それぞれのウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で4日間インキュベートした。次に、以下の手順で述べるように、ヒトIL-2 DuoSetキット（R＆D Systems）を使って、上清中のIL-2レベルを評価した。

384ウェルプレートを、PBS中の1μg/mL「Human IL-2 Capture Antibody（ヒトIL-2捕捉抗体）」で、室温において2時間コーティングした。次に、ウェルを0.05％Tweenを補足したPBS（PBS-T）80μlで5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を含有するPBS-0.05％Tでの1時間のブロッキング後に、アッセイ上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列をそれぞれのウェルに移し、4℃で終夜インキュベートした。翌日、0.5％カゼインを含有するPBS-T中の100ng/mLヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R＆D Systems）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読取り緩衝液（reading buffer）（Mesoscale Discovery）を各ウェルに加え、結果として生じた電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルをMesoscale Discoveryリーダーによって検出した。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。

代表的実験の結果を図9に示す。SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91の二重特異性融合タンパク質は、T細胞活性化を誘導する能力を有し、それは、アイソタイプ対照（hIgG4、Sigma）と比較したときのIL-2分泌レベルの増加によって実証される。IL-2分泌の最も大きな増加はCD137に対して四価である融合タンパク質（SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）で観察され、PD-L1特異的抗体のC末端にリポカリンムテインが融合されている、CD137に対して二価の融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91）がそれに続く。最も小さな増加は、PD-L1特異的抗体のN末端にリポカリンムテインが融合されている、CD137に対して二価の融合タンパク質（SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93）で観察されるが、それでもなお、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とのカクテルと同等である。融合タンパク質はいずれも、単一のビルディングブロック、すなわちCD137特異的リポカリンムテイン-Fc（SEQ ID NO:88またはSEQ ID NO:89）またはビルディングブロックPD-L1 mAb（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）よりも高いIL-2分泌レベルを示す。

実施例12. さまざまなレベルのPD-L1を発現する腫瘍細胞の存在下でのT細胞活性化の評価
さらに別のT細胞アッセイを使って、PD-L1ターゲット依存的にT細胞活性化を共刺激する融合タンパク質の能力を評価した。さまざまなPD-L1発現レベルを持つ腫瘍細胞株の存在下で、抗CD3刺激T細胞に、融合タンパク質をさまざまな濃度で適用した。試験した腫瘍細胞株には、RKO（PD-L1高発現（PD-L1 high））、HCC827（PD-L1中発現（PD-L1 moderate））およびHep-G2（PD-L1陰性（PD-L1 negative））が含まれる。上清におけるIL-2分泌レベルを測定した。

健常ボランティアドナーのPBMCを実施例11で述べたようにバフィーコートから単離した。汎T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）を製造者の説明書に従って使用することにより、Tリンパ球を、磁気細胞選別法で、PBMCからさらに精製した。精製された汎T細胞を、90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、直ちに凍結し、さらなる使用時まで液体窒素中で保存した。

アッセイのために、T細胞を融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で16時間、休ませた。

以下の手順を各実験条件について三重に行った。平底培養プレートを37℃において1時間、0.25μg/mL抗CD3抗体でプレコーティングしてから、PBSで2回洗浄した。増殖を阻止するために、腫瘍細胞株RKO、HCC827またはHep-G2を30μg/mlマイトマイシンC（Sigma Aldrich）で30分間処理した。マイトマイシン処理した腫瘍細胞を次にPBSで2回洗浄し、培養培地中に1ウェルあたり2.5×10⁴細胞の密度でプレーティングして、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で一晩、接着させた。ターゲット細胞は、事前に標準条件下で成長させ、Accutase（PAA Laboratories）で剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。

翌日、プレートをPBSで2回洗浄した後、1ウェルあたり1.25×10⁴個のT細胞を腫瘍細胞に加えた。融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93）、単独で使用するか組み合わせて使用するリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）およびリファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）、またはアイソタイプ対照（SEQ ID NO:24とSEQ ID NO:25）の、典型的には0.005nM〜10nMの範囲の希釈系列を、対応するウェルに加えた。プレートをガス透過性シールで覆い、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。

3日間の共培養後に、上清中のIL-2レベルを実施例11で述べたように評価した。

例示的データを図10に示す。PD-L1特異的抗体のC末端にリポカリンムテインが融合されている融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91）の存在下で汎T細胞をRKO細胞（PD-L1高発現）またはHCC827（PD-L1中発現）と共培養すると、hIgG4アイソタイプ対照と比較して、IL-2分泌の明確な増加につながる。PD-L1特異的抗体のN末端にリポカリンムテインが融合されている融合タンパク質（SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93）によって誘導されるIL-2分泌の増加は弱かったが、それでもなお、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とのカクテルよりは大きかった。IL-2分泌の増加は、ビルディングブロックであるCD137特異的リポカリンムテイン（Fc融合物、SEQ ID NO:89）とPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）とのカクテルでは観察されなかった。加えて、Hep-G2（PD-L1陰性）との共培養は、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とのカクテルを除いて、どの融合タンパク質でもIL-2分泌レベルを増加させなかった。

このデータは、T細胞を活性化する能力またはIL-2分泌を増加させる能力によって測定される融合タンパク質の機能的活性がPD-L1依存的であることを示している。対照的に、リファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）と併用した場合に、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）によって誘導されるT細胞活性化またはIL-2分泌は、必ずしもPD-L1依存的ではなく、予測が難しい。さらにまたこのデータは、PD-L1とCD137とを標的とする二重特異性フォーマットが、PD-L1発現ターゲット細胞の存在下でCD137およびPD-L1を標的とする2種の別々の分子のカクテルよりも優れていることを示している。

実施例13. 融合タンパク質の貯蔵安定性評価
貯蔵安定性を評価するために、例示的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:89）を、PBS中、1mg/mlの濃度で、37℃において1週間インキュベートした。次に、20μgの試料を、0.15ml/分の流速で、PBSをランニング緩衝液として、Superdex 200,3.2/300 Increase（GE Healthcare）カラムに適用することにより、分析用サイズ排除を使って単量体型融合タンパク質を決定した。試験融合ペプチドはすべて、PBS中、37℃で1週間のインキュベーション後に安定であった。例示的な結果を図11Aに示す。

選択された融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87について、さらに貯蔵安定性評価を行った。20mg/mlの融合タンパク質を、25mMヒスチジン、60mM NaCl、200mMアルギニンpH6中、40℃で4週間インキュベートした。実施例5で述べた同時結合アッセイを利用して、機能的融合タンパク質含量を定量的ELISA設定で測定した。例示的な結果を図11Bに示す。

実施例14. CD4^＋T細胞による混合リンパ球反応（MLR）評価
混合リンパ球反応（MLR）アッセイを利用して、抗原提示細胞の存在下でCD4^＋T細胞活性化を誘導する例示的融合タンパク質の能力を評価した。不適合健常ドナーからの単球由来樹状細胞（moDC）およびCD4^＋T細胞の存在下で、さまざまな濃度の融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）を試験した。被験分子の存在下で6日間の培養後に、上清においてIL-2およびIFN-ガンマの分泌を定量した。

Lymphoprep溶液を製造者の説明書（StemCell）に従って使用することにより、血小板アフェレーシス血液パックからPBMCを精製した。Miltenyiキットを使ってPBMCから全CD4^＋Tリンパ球を精製し、90％FBS、10％DMSOの溶液中で凍結した。CD14^＋ビーズキット（Miltenyi）を使ってCD14^＋単球を精製し、そのまま使用した。

moDCは、CD14^＋単球を、RPMI1640＋10％FBSおよびPen/Strep（LifeTech）中、50ng/mLのIL-4および100ng/mLのGMCSF（Miltenyi）の存在下、2×10⁶細胞/mLで6日間培養することによって得た。3日目に、サイトカインを含有する新鮮培地10mlを加えた。分化7日目に表現型（CD14、CD1a、HLADR、PD-L1）をFACSで評価した。

10000個のmoDCを、U底96ウェル中、完全RPMI培地中のCD4 T^＋細胞50000個の存在下、被験分子の存在下で、三重ウェルにおいてRPMI中で6日間培養した。培養が終了したら、上清を直ちに凍結し、サイトカイン定量のために保存した。

上清中のIL-2レベルをルミネックス（Luminex）技術によって測定し、例示的データを図12に示す。図12Aは、融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）が、10μg/mLおよび0.1μg/mLでは、対応するビルディングブロック（SEQ ID NO:89およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）単独またはリファレンスCD137抗体もしくはリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）と比較して、数セットのMLR実験（N＝8）において、IL-2誘導に関して有意に優れていることを示す。図12Bは、融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）が、アイソタイプ抗体対照と比較して、IL-2の分泌を用量依存的に誘導したことを示している。融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87によって誘導されるIL-2レベルは、等モル濃度のリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とリファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とのカクテルと比較すると、0.001μg/mLから20μg/mLまでにわたる濃度で高かった。

実施例15. CD8^＋T細胞による混合リンパ球反応評価
ヒトCD8^＋T細胞におけるCD137の発現と活性が報告されていることから、抗原提示細胞の存在下でCD8^＋T細胞活性化を誘導する例示的融合タンパク質の能力をMLRアッセイで評価した。融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）を、不適合健常ドナーからのmoDCと全CD8^＋T細胞との存在下で試験した。被験分子の存在下での6日間の培養後に、上清におけるIL-2およびCD8エフェクター分子（パーフォリン、グランザイムBおよびグランザイムA）の分泌を定量した。

Lymphoprep溶液を製造者の説明書（StemCell）に従って使用することにより、血小板アフェレーシス血液パックからPBMCを精製した。Miltenyiキットを使ってPBMCから全CD8^＋Tリンパ球を精製し、そのまま使用した。CD14^＋ビーズキット（Miltenyi）を使ってCD14陽性単球を精製し、そのまま使用した。

10000個のmoDCを、U底96ウェル（三つ一組のウェル）において、完全RPMI培地中、被験分子の存在下で、50000 CD8^＋T細胞と共に、6日間培養した。培養が終了したら、上清を直ちに凍結し、分泌された因子の定量のために保存した。

ルミネックス技術を使って、上清中のIL-2、パーフォリン、グランザイムAおよびグランザイムBを定量した。例示的データを図13に示す。

図13は、融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）が、リファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）またはそれら2つのカクテルと比べると、10μg/mLで、IL-2、パーフォリン、グランザイムBおよびグランザイムAの分泌量の増加を示したことを示している（N＝4）。データは、融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）が細胞傷害性CD8^＋T細胞に対する活性を有することを、さらに示唆している。

実施例16. ヒトPBMCが移植された異種移植片マウスモデルにおける機能的インビボ活性の評価
提供される融合タンパク質のインビボ活性を調べるために、細胞株由来異種移植片マウスモデルを使用する。したがって、4〜6週齢で配送され少なくとも1週間は隔離しておいた免疫不全雌NOGマウスの皮下にヒトがん細胞株を移植する。腫瘍がおよそ80〜100mm³の体積に到達した後、マウスをヒトPBMCで置換する。試験化合物を少なくとも3回注入し、腫瘍の成長および活性を定期的に測定する。研究終了後に、マウスを屠殺する。CD3、CD4およびCD8陽性細胞の腫瘍内浸潤を免疫組織化学によって評価する。IFN-ガンマRNAscopeをさらなるリードアウトとして行う。

実施例17. 融合タンパク質のエピトープ分析
融合タンパク質が認識するエピトープを評価して、それらが臨床的に妥当であるかどうかを評価するために、競合ELISAフォーマットを使って、融合タンパク質とリファレンスCD137抗体との間の競合を決定した。

マイクロタイタープレートを、PBS（4μg/mL）中、4℃で一晩、リファレンスCD137抗体SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29でコーティングした。各インキュベーション工程後に100μLのPBS-0.05％T（0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS）でプレートを5回洗浄した。プレートを室温においてPBS-0.1％T（0.1％（v/v）Tween 20を補足したPBS）中の2％BSA（w/v）で1時間ブロックした後、再び洗浄した。さまざまな濃度の融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91）、CD137特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO:42）、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）、および対照抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）を、トレーサーとしての1nMのビオチン化ヒトCD137 Fc融合物（huCD137-Fc-bio）と混合し、室温で1時間インキュベートした。試験分子とトレーサーの混合物をプレートに加え、室温で20分間インキュベートした後、100μLのPBS-0.05％Tによる洗浄工程を5回行った。次に、PBS-0.1％T-2％BSA中のExtrAvidin-HRP（Sigma-Aldrich）の1:5000希釈液をウェルに加え、1時間インキュベートした。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。

競合データを例示的実験について図14に示す。ここでは、x軸が試験分子濃度を表し、y軸は測定されたトレース分子濃度を表す。IC₅₀値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、データを1:1シグモイド曲線に当てはめた。その結果、例示的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91）はCD137への結合に関してCD137抗体SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29と競合することが実証され、融合タンパク質はこの抗体とオーバーラップするエピトープに結合することが示唆される。

（表１０）融合タンパク質の競合

実施例18. PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイを使ったT細胞活性化の評価
PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞（ヒトPD-L1と、抗原非依存的にコグネイトTCRを活性化するように設計された工学的に操作された細胞表面タンパク質とを発現するCHO-K1細胞）と共培養されたPD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞（PD-1と、NFAT応答エレメント（NFAT-RE）によって駆動されるluc遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子）とを発現するように工学的に操作されたJurkat細胞株）を使って、選択された融合タンパク質の、PD-1/PD-L1が媒介する抑制を遮断する潜在能力を評価した。このバイオアッセイでは、PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞とPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞とを共培養した場合に、PD-1/PD-L1相互作用が、TCRシグナリングおよびNFAT-RE媒介性ルミネセンスを阻害する。本明細書に記載するCD137とPD-L1に特異的な融合タンパク質などのPD-1/PD-L1遮断性作用物質の添加は阻害シグナルを解除し、TCR活性化およびNFAT-RE媒介性ルミネセンスをもたらす。

10％FCSを補足したハムF12培地でPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞を成長させ、1ウェルあたり8.00×10³個の細胞をプレーティングし、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で一晩接着させた。翌日、培養培地を捨てた。1.00×10⁴個のPD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞を各ウェルに加え、次に、さまざまな濃度の、典型的には0.005nM〜50nMの範囲の、融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）またはPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87またはSEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）を加えた。プレートをガス透過性シールで覆い、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃でインキュベートした。6時間後に、30μLのBio-Glo（商標）試薬を各ウェルに加え、生物発光シグナルをルミノメーターを使って定量した。GraphPad Prism（登録商標）で4パラメータロジスティック曲線分析を行って、EC₅₀値を算出した。それらを表11に要約する。アッセイは三重に行った。

代表的実験の結果を図15に示す。このデータは、被験融合タンパク質がPD-1/PD-L1遮断を阻害し、PD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87またはSEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）のEC50値と同等のEC50値で、T細胞を用量依存的に活性化することを実証している。陰性対照として、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）または/およびアイソタイプ対照抗体（SEQ ID NO:24とSEQ ID NO:25）はどちらも、ルミネセンスシグナルの増加にはつながらなかった。

（表１１）PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイを使ったT細胞活性化の評価

実施例19. ヒトPBMCを使ったT細胞活性化の評価
さらに別のT細胞アッセイを使って、選択された融合タンパク質の、T細胞応答を共刺激する能力をアッセイした。このアッセイでは、さまざまな濃度の融合タンパク質をSEB刺激ヒトPBMCに加え、37℃で3日間インキュベートした。上清におけるIL-2分泌レベルを測定した。

健常ボランティアドナーのPBMCを実施例11で述べたように単離し、保存した。アッセイのために、PBMCを融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で24時間、休ませた。

以下の手順を各実験条件について三重に行った:2.5×10⁴個のPBMCを、384ウェル平底組織培養プレートの各ウェルにおいて、培養培地中でインキュベートした。選択された融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87）、ビルディングブロックPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）、単独で使用するかリファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）と組み合わせて使用するリファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）、またはアイソタイプ対照（SEQ ID NO:24とSEQ ID NO:25）の、典型的には0.0002nMから10nMの範囲の、希釈系列と、0.1ng/mlのSEBとを、それぞれのウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、上清中のIL-2を実施例11で述べたように評価した。

代表的実験の結果を図16に示す。IL-2分泌の誘導に関する試験分子のEC₅₀値を表12に要約する。SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87の二重特異性融合タンパク質は、ビルディングブロックPD-L1抗体、リファレンスCD137抗体およびリファレンスPD-L1とCD137抗体とのカクテルと比べて、より高いレベルへのIL-2分泌の強い用量依存的増加を誘導すると共に、単独でまたは組み合わせて使用されるPD-L1抗体およびCD137抗体との比較で有効EC₅₀値を減少させる。

（表１２）ヒトPBMCを使ったT細胞活性化の評価

実施例20. 融合タンパク質によって誘導されるPD-L1依存的T細胞活性化の評価
融合タンパク質によるPD-L1ターゲット依存的T細胞共刺激を、T細胞活性化アッセイを使って、さらに分析した。融合タンパク質をさまざまな濃度で抗CD3刺激T細胞に適用し、ヒトPD-L1トランスフェクトまたはモックトランスフェクトFlp-In-CHO細胞と共に培養した。上清におけるIL-2分泌レベルを測定した。

健常ボランティアドナーのPBMCを実施例11で述べたようにバフィーコートから単離した。Tリンパ球を、実施例12で述べたようにさらに精製し、保存した。

アッセイのために、T細胞を融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で一晩、休ませた。

以下の手順を各実験条件について三重に行った。平底培養プレートを37℃において2時間、0.25μg/mL抗CD3抗体でプレコーティングしてから、PBSで2回洗浄した。増殖を阻止するために、ヒトPD-L1がトランスフェクトされたCHO細胞またはモックトランスフェクトされたCHO細胞を30μg/mlマイトマイシンC（Sigma Aldrich）で30分間処理した。マイトマイシン処理した細胞を次にPBSで2回洗浄し、培養培地中に1ウェルあたり1.0×10⁷細胞の密度でプレーティングして、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で一晩、接着させた。CHO細胞は、事前に標準条件下で成長させ、Accutase（PAA Laboratories）で剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。

翌日、1ウェルあたり8.33×10³個のT細胞をCHO細胞に加えた。例示的融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、ビルディングブロックPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）、リファレンスPD-L1抗体（SEQ ID NO:26とSEQ ID NO:27）とリファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）とのカクテル、またはアイソタイプ対照（SEQ ID NO:24とSEQ ID NO:25）の、典型的には0.003nMから50nMの範囲の、希釈系列を、対応するウェルに加えた。プレートをガス透過性シールで覆い、加湿5％CO₂雰囲気下、37℃で2日間インキュベートした。

2日間の共培養後に、上清中のIL-2レベルを実施例11で述べたように評価した。

例示的データを図17に示す。汎T細胞をヒトPD-L1がトランスフェクトされたCHO細胞と共に融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91）の存在下で共培養すると、hIgG4アイソタイプ対照と比較して強い用量依存的IL-2分泌につながった。そしてそれは、リファレンス抗体よりもはるかに強く、リファレンスCD137抗体またはリファレンスCD137抗体とリファレンスPD-L1抗体とのカクテルでは、IL-2分泌のわずかな増加しか観察されなかった。モックトランスフェクトしたCHO細胞（PD-L1陰性）と共培養した場合は、リファレンスCD137抗体およびリファレンスCD137抗体とリファレンスPD-L1抗体とのカクテルだけが、IL-2分泌のわずかな用量依存的増加を示した。これらの結果は、融合タンパク質によるT細胞の活性化がPD-L1依存的であること、それに対して、リファレンスCD137抗体（SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29）は、ターゲット細胞の有無とは関係なく、CD137媒介性T細胞共刺激を示したことを例証している。

実施例21. マウスにおける融合タンパク質の薬物動態
代表的融合タンパク質（SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91）の薬物動態の分析をマウスで行った。およそ5週齢の雄CD-1マウス（1時点につき3匹、Charles River Laboratories,Research Models and Services,Germany GmbH）の尾静脈に、10mg/kgの用量で融合タンパク質を注射した。試験物は5mL/kgの体積を使ってボーラスとして投与した。マウスからの血漿試料を、5分、1時間、4時間、8時間、24時間、48時間、4日、8日、14日、21日および28日の時点で得た。1匹あたり1時点あたり少なくとも100μLのLi-ヘパリン血漿が得られるように、十分な全血（イソフルラン麻酔下で採取）を収集した。薬物レベルは、ターゲットPD-L1およびCD137によって完全二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って検出した。データの当てはめは、Prism GraphPad5ソフトウェアを使用し、2コンパートンメントモデルを使って行った。

図18は、リファレンスとしてのビルディングブロックPD-L1抗体（SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87）について得られた値と共にプロットした、融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91に関する血漿中濃度のプロットを示す。薬物動態はいずれの場合も類似しているようだった。200μg/mL前後の血漿中濃度から出発して、48時間以内に血清中レベルは50μg/mL前後のレベルまで低下した後、はるかに遅い速度で、28日後の実験終了時におけるおよそ10μg/mLのレベルまで減少する。非コンパートメント分析をこのデータに適用した。終末半減期を表13に要約する。

このデータは、融合タンパク質がマウスにおいて抗体様の長い終末半減期を有することを実証している。融合タンパク質の血漿中濃度を決定するために使用したアッセイは、PD-L1およびCD137の両方に対する活性の保持を要求するので、この結果は、二重特異性分子が28日間の時間経過にわたって無傷のままであることも実証している。

（表１３）非コンパートメント分析を使って決定されたマウスにおける終末半減期

実施例22. マウスにおける融合タンパク質の薬物動態
代表的融合タンパク質SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87の薬物動態の分析をマウスで行い、既述の2種のCD137およびPD-L1結合性融合タンパク質（SEQ ID NO:147およびSEQ ID NO:148）と比較した。およそ5週齢の雄CD-1マウス（1時点につき2匹、Charles River Laboratories,Research Models and Services,Germany GmbH）の尾静脈に、2mg/kgの用量でそれぞれの分子を注射した。マウスからの血漿試料を、5分、24時間、168時間および336時間の時点で得た。1匹あたり1時点あたり少なくとも30〜50μLのLi-ヘパリン血漿が得られるように、十分な全血（イソフルラン麻酔下で採取）を収集した。

次に、血漿中薬物レベルをELISAで分析した。huCD137-His（C末端ポリヒスチジンタグを持つヒトCD137）をPBSに溶解し（1μg/mL）、マイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングした。プレートを各インキュベーション工程後に、0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS 80μLで5回洗浄した。PBS/BSA/Tween（2％BSA（w/v）と0.1％（v/v）Tween 20とを含有するPBS）でプレートを室温において1時間ブロックした後、洗浄した。血漿試料を20％の血漿濃度になるようにPBS/BSA/Tweenに希釈し、ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。続いてさらに一回の洗浄工程を行った。結合した研究対象の作用物質は、2％BSA（w/v）および0.1％（v/v）Tween 20を含有するPBSに希釈されたそれぞれ1μg/mLのビオチン化ヒトPD-L1とストレプトアビジンSULFO-TAG（Mesoscale Discovery）との混合物と共に、1時間インキュベートした後に検出した。追加の洗浄工程後に、35μLの読取り緩衝液を各ウェルに加え、各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルをMesoscale Discoveryリーダーを使って読み取った。分析と定量のためにデータをエクセルに移した。標準タンパク質希釈液による検量線を調製した。

図19に、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:147、およびSEQ ID NO:148について、経時的な血漿中濃度のプロットを示す。SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87は、好ましい薬物動態プロファイルまたは抗体様の薬物動態を呈し、一方、SEQ ID NO:147およびSEQ ID NO:148はそうではなかった。本明細書において述べるように、好ましい薬物動態プロファイルまたは抗体様の薬物動態は、336時間後にc_maxの％が10％超であれば、達成されたとみなされうる。

本明細書に例示的に記載された態様は、本明細書に具体的に開示されていない1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限が存在しなくても、適切に実施されうる。したがって、例えば「を含む」（comprising、including、containing）などの用語は、限定されることなく、拡張的に読解されるものとする。加えて、本明細書で使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用に、表示され説明された特徴またはその一部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、請求項に係る発明の範囲内でさまざまな変更が考えられると認識される。したがって、例示的な態様および随意の特徴によって本態様を具体的に開示したが、当業者であれば、その変更および変形に頼ることができ、そのような変更および変形が本開示の範囲内とみなされることは、理解すべきである。本明細書に記載する特許、特許出願、教科書およびピアレビューされた刊行物はいずれも、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる。さらにまた、参照により本明細書に組み入れられる参考文献における用語の定義および使用が、本明細書において与えられるその用語の定義と一致しないか矛盾する場合は、本明細書において与えられるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。上位概念の開示に包含される下位概念および下位分類のそれぞれも、本開示の一部を形成する。これには、削除される事項が本明細書において具体的に言明されているか否かにかかわらず、上位概念からいずれかの対象事項を除外する但し書きまたは消極的限定を伴う、上位概念による本発明の説明が包含される。加えて、特徴がマーカッシュ群によって記載されている場合、本開示が、それにより、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群によっても記載されていることは、当業者にはわかるだろう。さらなる態様は以下の請求項から明らかになるであろう。

均等物:本明細書に記載する本発明の具体的態様の数多くの均等物は、当業者にはわかるか、通常行われる程度の実験を使って確かめることができるだろう。そのような均等物は、下記特許請求の範囲に包含されるものとする。この明細書において言及する刊行物、特許、および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願について参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

VI. 非特許文献

Claims

少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットが完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含みかつPD-L1に特異的であり、第2サブユニットがリポカリンムテインを含みかつCD137に特異的である、CD137とPD-L1の両方に結合する能力を有する融合タンパク質。
第3サブユニットをさらに含み、第3サブユニットがCD137に特異的なリポカリンムテインを含む、請求項1記載の融合タンパク質。
最大でも約2nMのK_D値で、または第1サブユニットに含まれる免疫グロブリンもしくはその抗原結合ドメインの単独でのK_D値と同等かそれより低いK_D値で、PD-L1に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
最大でも約7nMのK_D値で、または第2サブユニットに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインの単独でのK_D値と同等かそれより低いK_D値で、CD137に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
K_D値が表面プラズモン共鳴（SPR）アッセイによって決定される、請求項3または請求項4記載の融合タンパク質。
最大でも約0.5nMのEC₅₀値で、または第1サブユニットに含まれる免疫グロブリンもしくはその抗原結合ドメインの単独でのEC₅₀値と同等かそれより低いEC₅₀値で、PD-L1に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
最大でも約0.6nMのEC₅₀値で、または第2サブユニットに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインの単独でのEC₅₀値と同等かそれより低いEC₅₀値で、CD137に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
EC₅₀値が酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）アッセイによって決定される、請求項6〜7のいずれか一項記載の融合タンパク質。
カニクイザルPD-L1と交差反応する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
カニクイザルCD137と交差反応する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
ELISAアッセイにおいて測定した場合に、最大でも約10nMのEC₅₀値で、CD137とPD-L1に同時に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
細胞上に発現したCD137に最大でも約60nMのEC₅₀値で結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
フローサイトメトリー分析において測定した場合に、細胞上に発現したPD-L1に、最大でも約10nMのEC₅₀値で結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
PD-L1発現腫瘍細胞に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
CD137リガンドの存在下でCD137に結合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
PD-L1への結合に関してPD-1と競合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
CD137への結合に関して、SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29とに示す抗体と競合する能力を有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
SEQ ID NO:28とSEQ ID NO:29とに示す抗体とオーバーラップするCD137結合性エピトープを有する、請求項1または請求項2記載の融合タンパク質。
T細胞の増殖および/または応答を刺激する能力を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の融合タンパク質。
CD4＋および/またはCD8＋T細胞の増殖を刺激する能力を有する、請求項1〜19のいずれか一項記載の融合タンパク質。
IL-2および/またはIFN-ガンマの分泌の増加を誘導する能力を有する、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合タンパク質。
細胞傷害性因子の分泌の増加を誘導する能力を有する、請求項1〜21のいずれか一項記載の融合タンパク質。
T細胞応答をPD-L1依存的に共刺激する能力を有する、請求項1〜22のいずれか一項記載の融合タンパク質。
腫瘍微小環境におけるT細胞応答を共刺激する能力を有する、請求項1〜23のいずれか一項記載の融合タンパク質。
PD-L1の非存在下ではT細胞応答を共刺激しない、請求項1〜24のいずれか一項記載の融合タンパク質。
PD-1の阻害シグナルを遮断する能力を有する、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合タンパク質。
抗体様の薬物動態プロファイルを有する、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合タンパク質。
SEQ ID NO:147またはSEQ ID NO:148よりも好ましい薬物動態プロファイルを有する、請求項1〜27のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する位置に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hTlcの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含む、請求項29記載の融合タンパク質:
Ala5→ValまたはThr;Arg26→Glu;Glu27→Gly;Phe28→Cys;Pro29→Arg;Glu30→Pro;Met31→Trp;Leu33→Ile;Glu34→Phe;Thr42→Ser;Gly46→Asp;Lys52→Glu;Leu56→Ala;Ser58→Asp;Arg60→Pro;Cys61→Ala;Lys65→ArgまたはAsn;Thr71→Ala;Val85→Asp;Lys94→ArgまたはGlu;Cys101→Ser;Glu104→Val;Leu105→Cys;His106→Asp;Lys108→Ser;Arg111→Pro;Lys114→Trp;Lys121→Glu;Ala133→Thr;Arg148→Ser;Ser150→IleおよびCys153→Ser。
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して、リポカリンムテインのアミノ酸配列が、以下の変異アミノ酸残基のセットのうちの1つを含む、請求項29または請求項30記載の融合タンパク質:

。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:34〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む、請求項29〜32のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:34〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項29〜32のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインが、成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）の直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する位置に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）の直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含む、請求項34記載の融合タンパク質:
Gln28→His;Leu36→Gln;Ala40→Ile;Ile41→ArgまたはLys;Gln49→Val、Ile、His、SerまたはAsn;Tyr52→Met;Asn65→Asp;Ser68→Met、AlaまたはGly;Leu70→Ala、Lys、SerまたはThr;Arg72→Asp;Lys73→Asp;Asp77→Met、Arg、ThrまたはAsn;Trp79→AlaまたはAsp;Arg81→Met、TrpまたはSer;Phe83→Leu;Cys87→Ser;Leu94→Phe;Asn96→Lys;Tyr100→Phe;Leu103→His;Tyr106→Ser;Lys125→Phe;Ser127→Phe;Tyr132→GluおよびLys134→Tyr。
リポカリンムテインが、成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）の直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、28、33、36、40〜41、44、49、52、59、68、70〜73、77〜82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132および134に対応する位置に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置20、25、28、33、36、40〜41、44、49、52、59、68、70〜73、77〜82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132および134に対応する位置に、以下の変異アミノ酸残基のうちの1つまたは複数を含む、請求項36記載の融合タンパク質:
Gln20→Arg;Asn25→TyrまたはAsp;Gln28→His;Val33→Ile;Leu36→Met;Ala40→Asn;Ile41→Leu;Glu44→ValまたはAsp;Gln49→His;Tyr52→SerまたはGly;Lys59→Asn;Ser68→Asp;Leu70→Met;Phe71→Leu;Arg72→Leu;Lys73→Asp;Asp77→GlnまたはHis;Tyr78→His;Trp79→Ile;Ile80→Asn;Arg81→TrpまたはGln;Thr82→Pro;Cys87→Ser;Phe92→LeuまたはSer;Asn96→Phe;Lys98→Arg;Tyr100→Asp;Pro101→Leu;Leu103→HisまたはPro;Phe122→Tyr;Lys125→Ser;Ser127→Ile;Tyr132→Trp;およびLys134→Gly。
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）と比較して、リポカリンムテインのアミノ酸配列が、以下の変異アミノ酸残基のセットのうちの1つを含む、請求項34〜37のいずれか一項記載の融合タンパク質:

。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:41〜59からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む、請求項34〜38のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:41〜59からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項34〜38のいずれか一項記載の融合タンパク質。
1つのサブユニットが別のサブユニットにリンカーを介して連結されている、請求項1〜40のいずれか一項記載の融合タンパク質。
第2サブユニットがN末端において、リンカーを介して、第1サブユニットの各重鎖定常領域（CH）のN末端もしくはC末端または第1サブユニットの各軽鎖定常領域（CL）のN末端もしくはC末端に連結されている、請求項1〜41のいずれか一項記載の融合タンパク質。
第3サブユニットが、N末端において、リンカーを介して、第1サブユニットの各重鎖定常領域（CH）のN末端もしくはC末端、第1サブユニットの各軽鎖定常領域（CL）のN末端もしくはC末端、または各第2サブユニットのC末端に連結されている、請求項1〜42のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リンカーが、構造不定の（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₃リンカー（SEQ ID NO:13）である、請求項41〜43のいずれか一項記載の融合タンパク質。
リンカーが、構造不定のグリシン-セリンリンカー、ポリプロリンリンカー、プロリン-アラニン-セリンポリマー、またはSEQ ID NO:13〜23からなる群より選択されるリンカーである、請求項41〜43のいずれか一項記載の融合タンパク質。
第1サブユニットが抗体である、請求項1〜45のいずれか一項記載の融合タンパク質。
抗体の重鎖可変領域がSEQ ID NO:75〜79からなる群より選択され、モノクローナル抗体の軽鎖可変領域がSEQ ID NO:80〜84からなる群より選択される、請求項46記載の融合タンパク質。
抗体が、SEQ ID NO:85〜86のいずれか1つである重鎖と、SEQ ID NO:87の軽鎖とを含む、請求項46記載の融合タンパク質。
抗体がそれぞれ以下の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、請求項46記載の融合タンパク質:
SEQ ID NO:75とSEQ ID NO:80、SEQ ID NO:76とSEQ ID NO:81、SEQ ID NO:77とSEQ ID NO:82、SEQ ID NO:78とSEQ ID NO:83、またはSEQ ID NO:79とSEQ ID NO:84。
抗体がそれぞれ以下の重鎖と軽鎖とを含む、請求項46記載の融合タンパク質:
SEQ ID NO:85とSEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:86とSEQ ID NO:87。
抗体の重鎖が以下のCDR配列のセットのうちの1つを含む、請求項46記載の融合タンパク質:

。
抗体の軽鎖が以下のCDR配列のセットのうちの1つを含む、請求項46記載の融合タンパク質:

。
抗体の重鎖が以下のCDR配列のセット:

を含み、抗体の軽鎖が以下のCDR配列のセット:

を含む、請求項46記載の融合タンパク質。
モノクローナル抗体がIgG4バックボーンを有する、請求項46記載の融合タンパク質。
IgG4バックボーンが以下の突然変異のうちの1つまたは複数を有する、請求項54記載の融合タンパク質:
S228P、N297A、F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254TおよびT256E。
SEQ ID NO:86〜94のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:88〜94のいずれか1つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜55のいずれか一項記載の融合タンパク質。
SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87とに示されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91とに示されるアミノ酸、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87とに示されるアミノ酸、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93とに示されるアミノ酸、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87とに示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91とに示されるアミノ酸を含む、請求項1〜56のいずれか一項記載の融合タンパク質。
融合タンパク質が、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92とSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:86とSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94とSEQ ID NO:87、またはSEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91とに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜56のいずれか一項記載の融合タンパク質。
請求項1〜58のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
前記核酸分子の発現を可能にするための制御配列に機能的に連結されている、請求項59記載の核酸分子。
ベクター中またはファージミドベクター中に含まれている、請求項59または請求項60記載の核酸分子。
請求項58〜60のいずれか一項記載の核酸分子を含有する、宿主細胞。
請求項1〜62のいずれか一項記載の融合タンパク質を生産する方法であって、該融合タンパク質が、該融合タンパク質をコードする核酸から出発して生産される、前記方法。
融合タンパク質が細菌宿主生物中または真核宿主生物中で生産され、かつこの宿主生物またはその培養物から単離される、請求項63記載の方法。
CD137の下流シグナリング経路の活性化およびPD-L1陽性腫瘍細胞との会合を同時に行うための、請求項1〜58のいずれか一項記載の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む組成物の使用。
CD137の下流シグナリング経路の活性化およびPD-L1陽性腫瘍細胞との会合を同時に行う方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
T細胞の共刺激およびPD-L1陽性腫瘍細胞との会合を同時に行う方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
リンパ球活性の誘導およびPD-L1陽性腫瘍細胞との会合を同時に行う方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
T細胞上でのCD137のクラスター化および活性化を誘導し、該T細胞をPD-L1陽性腫瘍細胞に向かわせる方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
PD-L1陽性腫瘍細胞の近傍において限局的リンパ球応答を誘導する方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
PD-L1陽性腫瘍細胞の近傍においてT細胞によるIL-2分泌および/または細胞傷害性因子分泌の増加を誘導する方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
細胞傷害性因子が、パーフォリン、グランザイムBおよびグランザイムAからなる群より選択される、請求項71記載の方法。
PD-L1陽性腫瘍細胞の近傍においてT細胞による細胞傷害性因子の分泌の増加を誘導する方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の1つもしくは複数の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
請求項1〜58のいずれか一項記載の1つまたは複数の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
PD-L1陽性がんを予防、改善または処置する方法であって、腫瘍を含む組織に、請求項1〜58のいずれか一項記載の融合タンパク質または該融合タンパク質を含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む、前記方法。
治療に使用するための請求項1〜58のいずれか一項記載の融合タンパク質。
がんの処置における使用である請求項70記載の使用のための融合タンパク質。
医薬を製造するための請求項1〜58のいずれか一項記載の融合タンパク質の使用。
医薬ががんの処置用である、請求項78記載の使用。